SK279048B6

SK279048B6 - Spôsob génovotechnologickej výroby s-(+)-2,2--dime

Info

Publication number: SK279048B6
Application number: SK2323-92A
Authority: SK
Inventors: Thomas Zimmermann; Karen Robins; Olwen M. Birch; Elisabeth B�Hlen
Original assignee: Lonza A.G.
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1998-06-03
Also published as: HUT67687A; DE59209523D1; EP0524604A2; PL295408A1; CZ279498B6; JP3217859B2; CA2074681C; SK232392A3; ES2124714T3; HU9202439D0; HU215231B; IL102643A0; JPH05236993A; PL170598B1; RO114152B1; RU2126450C1; CZ232392A3; EP0524604B1; MX9204350A; ATE172248T1

Description

Vynález sa týka nového spôsobu výroby S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamidu pomocou nových, na postup vhodných mikroorganizmov.

V nasledujúcom texte sa 2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid skrátene označuje ako 2,2-DMCPCA a kyselina 2,2-dimetylcyklopropánkarboxylová ako 2,2-DMCPCS.

Doterajší stav techniky

Opticky čistý MS-(+)-2,2-DMCPCA slúži ako východisková látka na výrobu inhibítora dehydropeptidázy cilastínu, ktorý sa pri terapii podáva spolu s penemovými prípadne karbapenomovými antibiotikami, aby sa zabránilo dezaktivácii antibiotík renálnou dehydropcptidázou v ľadvine (EP 048 301).

Ako príklady mikroorganizmov, ktoré tvoria stereošpecifickú hydrolázu pre R-(-)-2,2-DMCPCA, sú mikroorganizmy druhu Comamonas acidovorans A: 18 (DSM č. 6351), Bakterium jp.VIILII (DSM č. 6316), Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM č. 6433) a Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552) ako i ich descedenty a mutanty. Tieto mikroorganizmy sú už podrobne opísané v Európskej patentovej prihláške 92103780.0.

Podstata vynálezu

Úlohou predloženého vynálezu je poskytnúť pomocou rekombinantných DNA - techník nové mikroorganizmy ako produkčné kmene, v ktorých je možné výrazne zvýšiť katalytickú schopnosť ako i expresiu tohto hydrolazového génu oproti známemu postupu.

Táto úloha bola vyriešená pomocou novej DNA, ktorá kóduje gén hydrolázy, pomocou nových hybridných plazmidov, ktoré obsahujú túto DNA, pomocou nových mikroorganizmov, ktoré sú týmto hybridným plazmidom transformované a pomocou nového postupu.

Obr. 1 ukazuje reštrikčnú mapu génu

Obr. 2 ukazuje schému hybridného plazmidu pCAR6 Obr. 3 ukazuje tak aminokyselinovú sekvenciu, ako aj DNA sekvenciu génu, ktorá kóduje stereošpecifickú hydrolázu.

Spôsob podľa vynálezu sa uskutočňuje tak, že sa v racemickom R,S-(+)-2,2-DMCPCA biotransformuje R-(-)-2,2-DMCPCA pomocou mikroorganizmov transformovaných génom, ktorý tvorí stereošpecifickú hydrolýzu, za vzniku R-(-)-2,2-DMCPCS, pričom sa získa opticky aktívny S-(+)-2,2-DMCPCA a ten sa izoluje.

Príprava transformovaných mikroorganizmov

Príprava mikroorganizmov podľa vynálezu, ktoré tvoria stereošpecifickú hydrolázu, sa môže uskutočniť tak, že sa

a) izoluje DNA kódujúca hydrolázu podľa vynálezu

b) vnesie táto špecifická génová sekvencia do expresného vektora, pričom vznikne hybridný plazmid, prípadne môže byť výhodné uskutočniť ďalšie modifikácie v hybridnom plazmide, ktoré umožnia efektívnejšiu expresiu

c) tento hybridný plazmid sa

d) vnesie (transformácia e) do vhodného mikroorganizmu (hostiteľský' kmeň), pričom tento transformovaný mikroorganizmus potom

e) tvorí produkčný kmeň pre spôsob (biotransformácia g) podľa vynálezu

a) izolácia DNA stereošpecifickej hydrolázy

Ako zdroj DNA hydrolázy, ktorá je ďalej označovaná ako hydroláza - DNA (rad), prípadne hydroláza-gén (rad) môže slúžiť napríklad chromozomálna DNA mikroorganizmov Comamonas acidovorans A: 18 (DSM č. 6315) alebo Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552), ktoré sú už opísané v Európskej patentovej prihláške 92103780.0. Ako zdroj výhodne slúži Comamonas acidovorans A: 18. DNA hydrolázy je možné izolovať z lineárnej génovej banky z Comamonas acidovorans A: 18 v Escherichia coli (E. coli) XLl-Blue^R pomocou BLUESCRIPT^r (BLUESCRIPT-KS+ alebo BLUESCRIPTSK+) (je možné ju získať od Stratagene Co., dodávateľ Genofit SA, Ženeva) ako komerčne dostupný vektor génovej banky.

Na tento účel sa napríklad najprv izoluje chromozonálna DNA z Comamonas acidovorans A: 18 použitím metódy R. H. Chesneyho a spol., J. Mol. Biol. 130, 1979, str. 161-173. Táto DNA sa potom pomocou zvyčajných molekulámobiologických metód štiepi reštrikčným enzýmom EcoRI a potom sa inzeruje do vopred rovnako rozštiepených častí expresný vektor-DNA pBLUESCRIPT+^r . Potom sa môže táto ligovaná zmes (zmes hybridných plazmidov) transforomovať napríklad postupom podľa S. Fiedlera a R. Wirtha Analyt. Biochem. 170, 1988, str. 38-44 do komponentov komerčne bežných mikroorganizmov E. coli XL1-BLUE^R.

Vyhľadávanie (sereening) génovej banky je možné rovnako uskutočňovať známymi metódami. K tomu sa klony hybridných plazmidov testujú na ich rastovú schopnosť, účelne vo vhodnom médiu s R,S-(+)-2,2-DMCPCA ako jediným zdrojom dusíka, so zvyčajným zdrojom uhlíka, s vhodným induktorom a s vhodným antibiotikom. Týmto vyhľadávaním (sereening) sa potom účelne oddelia klony hybridných plazmidov, ktoré obsahujú aktívny hydroláza-gén (rad) na DNA hybridného plazmidu a tým sú schopné použiť predovšetkým R-(-)-2,2-DMCPCA ako jediný zdroj dusíka. Tieto klony hybridných plazmidov potom môžu hydrolyzovať R-(-)-2,2-DMCPCA na zodpovedajúcu kyselinu.

Lokalizácia hydroláza-génu (rad) sa potom účelne uskutoční v hybridnom plazmide pCARl (zvolený z klonov hybridných plazmidov), ktorý sa skladá z expresného vektora pBLUESCRIPT-KS+^R a EcoRI-,, inzertu,, s ca 23 kb. Vlastná lokalizácia hydroláza-génu (rad) sa potom účelne uskutoční sebe známou hybridizáciou „SouthernBlot„ (Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New Yourk, 1987, odstavec 2. 9). K tomu sa najprv štiepi hybridný plazmid pCARl reštrikčnými enzýmami BamHl, Pstl, PvuII a EcoRI. Fragmenty DNA pritom vzniknuté sa potom účelne hybridizujú proti rádioaktívne značeným oligomérom DNA, ktoré zodpovedajú N-koncovej proteínovej sekvencii hydrolázy. Takto je možné na hybridnom plazmide pCARl označiť štep EcoRI-BahmHI-DNA veľký 3, 2 kb, prípadne štep PvuII-BamHI-DNA veľký· 1, 85 kb. Oligoméry DNA na hybridizáciu sa získajú v odbore známymi metódami. Napríklad stereošpecifická hydroláza sa chromatograficky obohatí, určia sa N-koncové aminokyseliny a potom sa syntetizuje zodpovedajúca sekvencia DNA a rádioaktívne sa značí. Teraz známy štep DNA, ktorý kóduje stereošpecifíckú hydrolázu (rad), a ktorého reštrikčná mapa je charakterizovaná na obr. 1, je tiež súčasťou vynálezu. Potom je ho možné izolovať reštrikčnými enzýmami BamHI a EcoRI, prípadne BamHI a PvuII z hybridného plazmidu pCARl v odbore známymi metódami. Tým sa okrem iného určí celková sekvencia aminokyselín podľa analýzy sekvencie nukleotidov cez genetický kód a pripravia sa mikroorganizmy, ktoré sú vhodné na postup. Súčasťou vynálezu je preto tak fragment DNA, ktorý kóduje polypeptid s aktivitou stereošpecifickej hydrolázy, ktorého sekvencia aminokyselín je uvedená na obr. 3, ako aj fragment DNA, ktorý hybridizuje s fragmentom DNA uvedeným na obr. 3 a tento polypeptid kóduje.

b) Ligácia špecifickej génovej sekvencie (hydroláza-gén; rad) do expresných vektorov

Takto získaná génová sekvencia sa môže ligovať zvyčajnými molekulámobiologickými metódami s vopred rovnako štiepenou DNA expresného vektora za vzniku hybridného plazmidu.

Expresné vektory zvyčajne obsahujú vhodný, väčšinou regulovateľný promótor (sekvencia kontroly expresie). Za týmto promótorom je vhodne v smere transkripcie jedno alebo viac zvláštnych miest štiepenia pre reštrikčné enzýmy. Do týchto miest štiepenia sa potom zvyčajným spôsobom inzeruje požadovaný génový štep, o ktorého expresiu má záujem.

Na spôsob podľa vynálezu sa môžu používať buď expresné vektory so širokým hostiteľským spektrom („broad host range,,), alebo sa môže použiť napríklad komerčne dostupný expresný vektor pBLUESCRIPTKS+^R. Výhodne sa ako expresný vektor používa pBLU-ESCRIPT-KS+^r s promótorom Plač (laktózapromótor). Expresný vektor pBLUESCRIPT-KS+^R sa účelne štiepi reštrikčnými enzýmami EcoRI a BamHI alebo PvuII a BamHI. Vzniknuté reštrikčné konce s izolovaným štepom DNA (EcoRI - BamHI alebo PvuII - BamHI), ktorý kóduje stereošpecifickú hydrolázu, sa ligujú napríklad pomocou T4-DNA-ligázou.

c) Hybridné plazmidy

Vynález sa ďalej týka takto vzniknutých hybridných plazmidov, ktoré obsahujú génovú sekvenciu stereošpecifickej hydrolázy (rad),

V podstate sú vhodné všetky hybridné plazmidy, ktoré majú schopnosť replikovať a exprimovať sekvenciu DNA podľa vynálezu, ktorá kóduje hydrolázu , vo zvolenom mikroorganizme (produkčnom kmeni).

Vhodné hybridné plazmidy obsahujú od svojho pôvodného expresného vektora intaktný replikón a značkovací gén, ktorý umožňuje selekciu a identifikáciu mikroorganizmov transformovaných hybridným plazmidom na základe fenotypového znaku. Vhodný značkovací gén prepožičiava mikroorganizmu napríklad rezistenciu proti antibiotikám.

Na dosiahnutie efektívnej expresie v hybridnom plazmide je účelné, aby bol hydroláza-gén (rad) správne usporiadaný (vo „fáze,,) s promótorom. Takými hybridnými plazmidmi, ktoré sú vhodné na expresiu hydroláza-génu v kmeni E. coli, sú napríklad hybridné plazmidy pCAR5 a pCARó, so značkovým génom bla (prepožičiava rezistenciu proti ampicilínu: Ap^R ) a promótorom Plač. Účelne sa hybridný plazmid pCAR5 skladá z fragmentu EcoRl-BamHI-DNA s veľkosťou 2, 3 kb (reštrikčná mapa obr. 1) a expresného vektora pBLUESCRIPT

-KS+^R. Hybridný plazmid pCARó sa účelne skladá z fragmentu PvuII-BamHI-DNA s veľkosťou 1, 85 kb (reštrikčná mapa obr. 1) a expresného vektora pBLUESCRIPT-KS+^R. Účelne sa používa hybridný plazmid pCARó s promótorom Plač, pričom je expresia hydroláza-génu (rad) indukovaná vždy podľa hostiteľského kmeňa izopropyltiogalaktozidom (IPTG). Hybridný plazmid pCARó bol uložený 06. 06. 1991 pod DSM č. 6551 v E. coli XLl-Blue^R , ako aj 21. 04. 1992 pod DSM č. 7053 v E. coli DH5 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH (DSM), Mascherorderweg lb, D-3300 Braunschweig. Obr. 2 ilustruje schému hybridného plazmidu pCARó,

d) Hostiteľské kmene

Takto získané hybridné plazmidy sa účelne vsadia do hostiteľských kmeňov. V prípade hybridných plazmidov so širokým hostiteľským spektrom (,,broad-host-range„) sa účelne použijú hostiteľské kmene s vysokou substrátovou a eduktovou toleranciou, ako napríklad mikroorganizmy rodu Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Rhizobiu, Agrobacterium alebo Escherichia. V prípade hybridných plazmidov, ktoré majú vlastné hostiteľské spektrum, ako napríklad hybridný plazmid pCARó, sa zvyčajne použijú špecifické hostiteľské kmene, v ktoiých sa replikujú.

Ako hostiteľské kmene sa pre hybridný plazmid pCAR6 podľa toho výhodne použijú mikroorganizmy rodu Escherichia, najmä rodu E. coli, ktoré sú uvedené v tabuľke 1.

e) Transformácia

Transformácia hostiteľských kmeňov hybridnými plazmidmi podľa vynálezu sa uskutoční známymi spôsobmi. Izolácia transformovaných hostiteľských kmeňov sa potom výhodne uskutoční zo selektívneho živného média, ku ktorému sa pridá antibiotikum, proti ktorému značkovací gén obsiahnutý v hybridnom plazmide prepožičiava rezistenciu. Ak sa výhodne použije hybridný plazmid pCARó, ktorý obsahuje Μα-gén, pridá sa do živného média ampicilín.

f) Produkčný kmeň

Ako produkčné kmene sa môžu použiť podľa vynálezu všetky hostiteľské kmene, ktoré sú transformované hybridným plazmidom obsahujúcom gén stereošpecifickej hydrolázy. Výhodne sa ako produkčné kmene používajú mikroorganizmy druhu E. coli, ktoré sú uvedené v tabuľke 1, a ktoré sú transformované hybridným plazmidom pCARó, ako i ich descedenty a mutanty. Mikroorganizmy E. coli XLl-Blue (DSM č. 6551) a E. coli DH5 (DSM č. 7053) boli uložené, ako už bolo uvedené.

Ak sa napríklad použije z tabuľky 1 E. coli MC4100 (opísaný v Mol. Gen. Genet. 192, 1983, str. 293-294) ako hostiteľský kmeň, uskutoční sa expresia génu stereošpecifickej hydrolázy (rad) pod kontrolou promótora Plač konštitutívne (permanentne). Je to na základe delécie v Zac-operóne (laktóza-operón) (delécia (arg - lac) U169). Preto sa netvorí Zac-represerový gén lacl (represerový gén-negatívny mikroorganizmus). Ak sa napríklad použijú z tabuľky 1 E. coli KÍ 2 (možné získať pod DSM č. 498) alebo E. coli HB101 (H. W. Boyer a D. RoullandDussoix, J. Mol. Bio. 41, 1969, str. 459-472) ako hostiteľské kmene, indikuje sa expresia hydroláza-génu (rad) pomocou IPTG na základe prítomnosti receptorového génu lacl (receptorový gén-pozitívny mikroorganizmus).

g) Biotransformácia

Podľa vynálezu je možné použiť k biotransformácii všetky mikroorganizmy (produkčné kmene), ktoré sú transformované génom, ktorý tvorí stereošpeciflckú hydrolázu, a tým stereošpecificky hydrolyzujú R-(-)-2,2-DMCPCA za vzniku kyseliny. Biotransformácia sa účelne uskutočňuje s mikroorganizmami, ktoré sú transformované hydroláza-génom (rad), ktorého reštrikčná mapa je uvedená na obr. 1. Vhodné sú tiež mikroorganizmy, ktoré sú transformované fragmentom DNA, ktorý kóduje polypeptid s aktivitou stereošpecifickej hydrolázy, ktorého sekvencia aminokyselín je uvedená na obr. 3. Rovnako vhodné sú mikroorganizmy, ktoré sú transformované fragmentom DNA, ktorý hybridizuje s fragmentom DNA uvedeným na obr. 3, a ktorý kóduje polypeptid s aktivitou stereošpecifickej hydrolázy.

Ako už bolo opísané, sú vhodné najmä mikroorganizmy druhu E. coli (tabuľka 1), transformované hybridný plazmidom pCAR5 alebo pCARó, najmä hybridným plazmidom pCARó. Vhodné sú tiež bezbunkové enzýmy (stereošpecifické hydrolázy) z týchto mikroorganizmov. Tieto bezbunkové enzýmy je možné získať v odbore bežnými metódami, rozrušením buniek mikroorganizmov. K tomuto účelu je možné použiť napríklad metódu s ultrazvukom, Frenchovým tlakovým zariadením alebo lysozymom. Tieto bezbunkové enzýmy je možné po uskutočnení postupu imobilizovať na vhodnom nosičovom materiáli v odbore bežnými metódami.

Postup sa výhodne uskutočňuje s bunkami mikroorganizmov v pokoji (nerastúce bunky), ktoré sa najprv indikujú podľa svojho expresného systému. To znamená, že ak sa na postup použijú represorové gén-pozitívne mikroorganizmy, ako napríklad E. coli XLl-Blue alebo E. coli DH5, ktoré sú transformované hybridným plazmidom pCARó, uskutoční sa indukcia pomocou IPTG. Ak sa na postup použijú napríklad represorové gén-negatívne mikroorganizmy (tzn. represerový gén chýba) druhu E. coli, ako napríklad E. coli MC4100, uskutočňuje sa expresia hydrolazového génu (rad) permanentne (konštitutívne).

Pri zvlášť výhodnej forme uskutočnenia sa špecificky hydrolázová aktivita mikroorganizmov zvyšuje pomocou C,-C₄ -alkoholov. Ako C| - C₄ - alkoholy sa môžu používať napríklad metanol, etanol, propanol, izopropanol alebo butanol. Výhodne sa používa metanol alebo etanol.

Ako média sa môžu použiť v odbore bežne používané média, ako napríklad nízkomolekulové fosfátové tlmivé roztoky, minerálne médium obsahujúce soli podľa Kulla a spol., Árch. Microbiol. 135, 1983, str. 1-7, alebo tiež HEPES-tlmivý roztok (kyselina Ν-2-hydroxyetylpiperazin-2'-etánsulfonová). Postup sa výhodne uskutočňuje v nízkomolárnom fosfátovom tlmivom roztoku.

Médium na biotransformáciu obsahuje účelne racemický R,S-(+)-2,2-DMCPCA v množstve od 0. 2 do 5% hmotnostných, výhodne 0, 2 až 2 % hmotnostné.

Biotransformácia sa účelne uskutočňuje v rozmedzí pH od 6 do 11, výhodne v rozmedzí pH od 6, 5 do 10.

Teplota pre biotransformáciu leží účelne medzi 15 až 55 °C, výhodne medzi 20 až 40 °C.

Po reakčnom čase zvyčajne od 1 do 30 hodín, výhodne od 5 do 25 hodín, sa R-(-)-2,2-DPCMCA úplne premení na zodpovedajúcu kyselinu, pričom sa získa opticky čistý S-(+)-2,2-DMCPCA. Takto získaný S-(+)-2,2-DMCPCA je možné potom získať napríklad extrakciou, elektrodialýzou alebo sušením.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

1. 1 Príprava chromozomálnej DNA z Comamonas acidovorans A: 18

Chromozomálna DNA čerstvej kultúry Comamonas acidovorans A: 18 pestovanej cez noc (100 ml kvasinkového živného prostredia, 30 °C) sa izoluje podľa modifikovanej metódy R. H. Chesneyho a spol., J. Mol. Biol. 130, 1979, 161-173: odstredené bunky (15 min., 6'500 Xg, 4 °C) sa resuspendujú v Tris-HCl tlmivom roztoku (2, 25 ml, 0, 05 mol/1), pH 8, 0, 10 % hmotn./obj. sacharózy. Po pridaní 375 μΐ roztoku lyzozýmu (10 mg/ml 0, 25 mol/1 Tris-HCl tlmivý roztok, pH 8, 0) a 900 μΐ 0, 1 mol/1 EDTA, pH 8, 0 sa suspenzia ochladí na ľade počas 10 min. Potom nasleduje pridanie 450 μΐ 5 % hmotn.obj. SDS a 50 μΐ ribonukleázy (lOmg/ml H₂ O) a inkubácia pri 37 °C počas 30 min. Inkubácia pokračovala po pridaní proteinázy K v množstve na špičku špachtličky a 400 μΐ pronázy (200ml/ml H₂O) počas 2 hod. Po miešaní s 4, 3 g CsCl sa zmes odstredí (30 min., 40 '000 X g, 20 °C), zmieša s 250 μΐ etídiumbromidu (10 mg/ml) a odstredí v ultracentrifuge (Vti 65, 2 -trubička) / viac ako 8 hod., 246'000 X g, 20 °C). Pod dlhovlnným ultrafialovým svetlom sa z trubičky odsaje skupina DNA. Po pridaní štvornásobného objemu TE-tlmivého roztoku (10 mmol/Tris-HCl, pH 8, 0 1 mmol /1 EDTA) sa etídiumbromid extrahuje n-butanolom trikrát sýtený vodou. DNA sa precipituje izopropanolom, zriedi v TE-tlmivom roztoku a 15 min. inkubuje pri 65 °C. Preparát sa môže uchovávať pri 4 °C.

1. 2 Reštrikcia a ligácia chromozomálnej DNA pg Comamonas acidovorans A: 18 (DSM č. 6315)-DNA a 4, 5ug vektor-DNA (pBLUESCRIPT-KS+^R) sa teraz štiepi 20 jednotkami reštrikčného enzýmu EcoRI v celkovom objeme reštrikčného tlmivého roztoku 100 μΐ (65 hod. pri 37 °C). DNA sa precipitujú etanolom a sušia v rýchlovákuovom odpaľovacom zariadení (Speed Vac^RConcentrator). Zrazeniny sa zriedia ligačným tlmivým roztokom (20 mmol/1 Tris-tlmivý roztok, 10 mmol/1 DTT (ditiotreitol), 10 mmol/1 MgCl₂ , 0, 6 mol/L ATP (adenozíntrifosfát, pH 7, 2) a spoja (ligačný objem 100 μΐ). Po pridaní jednej jednotky T4-DNA-ligázy sa inkubuje cez noc pri 13 °C. DNA ligačnej zmesi sa precipituje izopropanolom a zriedi 30 μΐ vody na transformáciu.

1. 3 Transformácia E. coli XLl-Blue^R a selekcia

Kompetentné bunky E. coli XLl-Blue^R sa transformujú pomocou elektroporácie s ligačnou zmesou podľa opísanej metódy S. Fiedlera a R. Wirtha (Analyt. Biochem. 170, 1988, 38-44). Na dôkaz plazmidov sa podrobí selekcii na živnom agare s ampicilínom (100 pg/ml) a na dôkaz inzercie sa podrobí selekcii s 0, 5 mmol/1 IPTG (izopropyl-3-D-tiogalaktozid) a x-gal (30 pg/ml, 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-P-D-galaktopyranozid) pri inkubácii pri 37 °C. Pri frekvencii transformácie 1, 7 X 10⁸ cfu/ml („colony forming units,, = živé bunky) mali takmer všetky klony EcoRI-„inzert„.

Príklad 2

2. Vyhľadanie génu R-špecifickej amidázy v génovej banke Comamonas acidovorans A: 18

Klony s hybridnými plazmidmi (EcoRI-„inzert„) sa testujú na ich rastovej schopnosti na agare s minimálnym médiom. Postupuje sa zhodne s H. Kuliom a spol. (Árch. Microbiol.135, 1983, 1-7) s 0, 2 % obj./obj. glycerínu ako zdroja uhlíka, 0, 15 % hmotn./obj. R,S-(±)-2,2-DPCMCA ako jediným zdrojom dusíka a 0, 5 mmol/1 IPTG ako induktorom lac-promótora. Ďalej sa použije ampicilín v množstve 5 pg/ml na stabilizáciu plazmidu. Jedine klony, ktoré obsahujú v plazmide intakntý hydroláza-gén (rad) na DNA-„inzerte,„ sú schopné zužitkovať R-(-)-2,2-DPCMPA ako zdroj dusíka, ten premeniť na požadovanú kyselinu a rásť na tomto minimálnom médiu. Takto vybrané klony všetky obsahujú hybridný plazmid z vektora p-BLUESCRIPT-KS+^R s EcoRI-„inzertom„ s ca 23 kb. Plazmid p CÁRI sa izoluje a bližšie charakterizujePríklad 3

3. 1 Izolácia R-špecifickej hydrolázy z Comamonas acidovorans A: 18 a N-koncová peptidová analýza

a) Príprava bezbunkového extraktu

1 bunkovej suspenzie z Comamonas acidovorans A: 18 (DSM č. 6315) s hydrolázovou aktivitou pri 37 °C s hodnotou 0, 6 g R-(-)-2,2-DMCPCS/l/hod/optická hustota pri 650 nm (OD₆₅₀) = 1, ktoré sa najprv indikujú pomocou R,S-(±)-2,2-DMCPCA, sa zahustia na 700 ml (OD₆₅₀ = 33, 5). Potom sa bunky niekoľkokrát odstredia, resuspendujú v HEPES-tlmivom roztoku sa potom suspendujú v 40 ml HEPES-tlmivého roztoku. Objem celkovej bunkovej suspenzie je potom 95 ml (OD₆5o = 210). Hydrolázová aktivita sa stanoví pri 30 °C a má hodnotu 0, 34 g produkt/l/hod/OD₆₅₀ = 1. Potom sa bunky dvakrát rozrušia vo Frenchovom tlakovom zariadení pri tlaku 120 MPa. Táto suspenzia sa odstredí pri 2000 x g 20 minút, aby sa získal bezbunkový extrakt. Získa sa 50 ml extraktu s množstvom proteínu (merané metódou Bradforda) 39, 3 mg/ml a s hydrolázovou aktivitou 12, 5 g R-(-)2,2-DMCPS/l/hod/mg proteínu pri 30 °C.

b) Chromatografia ml tohto surového bunkového extraktu sa nanesie na stĺpec plnený Q-Sepharózou (Pharmacia), ktorý bol ekvilibrovaný proti HEPES-tlmivého roztoku (0, 1 mol/1, pH 7, 5). Tento stĺpec sa ešte dvakrát premyje rovnakým tlmivým roztokom a potom sa proteíny eluujú gradientom HEPES-tlmivého roztoku (0, 1- 1 mol/1). Celkom sa pomocou HEPES-tlmivého roztoku (1 mol/1) eluuje 140 ml proteínového roztoku s hydrolázovou aktivitou. Roztok sa potom zahustí ultrafiltráciou (Amicon-membrána YM 10). Množstvo proteinov tohto enzýmového roztoku je 131 mg/ml, pričom hydrolázová aktivita je 1 μ mol/min/ng proteínu. Potom sa 2 ml tohto proteínového roztoku nanesú na stĺpec Superózy-12 (Pharmacia), ktorý bol ekvilibrovaný HEPES-tlmivým roztokom (0, 1 mol/1, pH 7, 5). Celkove sa týmto tlmivým roztokom eluuje 36 ml proteínového roztoku. Tento roztok sa potom taktiež zahustí ultrafiltráciou (Amicon.membrána YM10). Množstvo proteínu je 20, 1 mg/ml, pričom hydrolázová aktivita je 1, 2 pmol/min/ng proteínu. Takto získaný proteínový roztok sa potom nanesie na stĺpec anexu Li Chirospher 2000 TMAE (trimetylamóniumetylová soľ) (Merck), ktorý bol ekvilibrovaný proti HEPES-tlmivému roztoku (0, 1 mol/1, pH 7, 5). Po premytí stĺpca rovnakým tlmivým roztokom sa eluuje roztok proteinov gradientom NaCl (0, 1 mol/1) v rovnakom tlmivom roztoku. Koncentrácia proteinov je 15 mg/ml, pričom hydrolázová aktivita je 1, 2 pmol/min/ng proteínu.

c) Identifikácia hydrolázy pomocou jedno- a dvojdimenzionálnej elektroforézy

V surovom bunkovom extrakte sa identifikuje proteín hydrolázy pomocou SDS-PAGE. Pritom sa zrovnáva neindukovaný bunkový extrakt s indukovaným extraktom na SDS-PAGE (indukcia pomocou R,S-(±)-2,2-DCMPCA). V indukovanom bunkovom extrakte sa dokáže skupina proteinov s molekulovou hmotnosťou okolo 46000. Proteínové frakcie s hydrolázovou aktivitou získané chromatografiou sa taktiež analyzujú pomocou SDS-PAGE. Proteín s molekulovou hmotnosťou okolo 46000 sa týmto chromatografickým čistením obohatí, pričom sa po tretej chromatografii obohatí ca na 80 %. Tento vzorok 80 % čistoty sa potom analyzuje bidimenzionálnou elektroforézou (2-D SDS-PAGE). Touto metódou sa dokázala proteínová škvrna s molekulovou hmotnosťou okolo 46 000, ktorá zodpovedá hydroláze.

d) Sekvenovanie

Proteínová škvrna získaná pomocou 2-D SDS-PAGE sa potom absorbuje na PVDF membráne (polyvinylidéndifluorid) a z membrány sa vyreže. Potom sa tento proteín sekvenuje priamo podľa metódy Hochstrassera a spol. (Applied and Theoretical Electrophoresis 1, str. 73-76, 1988, „HDL častice- združené proteíny v plazme a cerebrospinálnej tekutine „). Touto metódou sa identifikovalo 21 aminokyselín (AS) N-koncovej sekvencie aminokyselín.

Príklad 4

4. Lokalizácia génov hydrolázy (rad) na klonovanom fragmente EcoRI

4. 1 Hrubá reštrikčná mapa pCARl

Pomocou reštrikčnej analýzy podľa zvyčajného postupu (Current Protocols Molecular Biology, John Willey and Sons, New Yourk, 1987, odstavec 2) sa zostaví hrubá reštrikčná mapa pCARl vzťahujúca sa naEcoRV, PvuII, KspI, Smal, PstI, Stul, BamHI.

4. 2 Formulácia zmesných DNA-oligomérov na základe N-koncovej peptidovej sekvencie hydrolázy

Na základe genetického kódu sa môžu formulovať a pomocou stroja na syntézu DNA syntetizovať dva zmesné DNA-oligoméry pre N-koncovú peptidovú sekvenciu hydrolázy Comamonas acidovorans A: 18.

DNA-oligomér (zmes)

		T T TCT A T T	T
5'	ATG	AAC GAC AGC GAG CTC	CAC	CA	3'
		C C A A
AS	Met	Asn Asp Ser Glu Leu	His		AS
DNA-,,	nezmyselný,, oligomér (zmes)
		A C T T T	T
5'	TG	GAT TTC CCG CCC CAC	CTC	3'
		G G G
		A A
AS		íle Glu Arg Gly Val	Glu	AS

4. 3 Hybridizácia „southem blot„ reštrikčných fragmentov plazmidu pCARl

Fragmenty DNA rozdelené elektroforézou na agarózovom géli (0, 6 %), ktoré sa získali rozdielnymi reštrikciami (BamHI, PstI, EcoRI) pCARl, sa prenesú na nitrocelulózu známym postupom, označovaným ako „southem blot„ (Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New Yourk, 1987, odst. 2.9 a ďalšie).

Oligoméry DNA sa rovnako koncovo označia s [³² Pj-gama-ATP: 400 ng oligomérov DNA, 22 pCi³² P-gama-ATP, 11 jednotiek bezfosfátovej polynukleotidkinázy, v celkových 25 μΐ polynukleotidkinázovom tlmivom roztoku) 0, 05 mol/L Tris-HCl, pH 7, 5, 0, 01 mol/1 Mg Cl₂, 5 mmol/1 DTT) sa inkubuje pri 37 °C počas 30 min. Potom nasleduje čistenie pomocou gélovej filtrácie na Sephadexe G-25 (Pharmacia) a hybridizácia proti „southem blots,, podľa známeho postupu (pozri uvedenú citáciu literatúry).

Hybridizáciou proti nukleotidovým oligomérom zodpovedajúcim N-koncovej proteínovej sekvencii sa môže na hybridnom plazmide pCARl označiť fragment EcoRI-BamHI-DNA s veľkosťou 2,3 kb alebo fragment PvuII-BamHI-DNA s veľkosťou 1, 85.

4. 4 Subklonovanie hydrolázového génu (rad)

Fragment EcoRI-BamHI-DNA s veľkosťou 2, 3 kb alebo fragment PvuII-BamHI-DNA s veľkosťou 1, 85, ktorý kóduje R-špecifickú hydrolázu z Comamonas acidovorans A: 18 sa inzeruje do rovnako štiepenej vektorovej DNA pBLUESCRIPT-KS+^R alebo pBLUESCRlPT-SK+^R. Len jedna orientácia „inzertu „ k promótoru Plač mala v klonoch po indukcii IPTG hľadanú hydrolázovú aktivitu.

Vektor pBLUESCRIPT-KS+^R s fragmentom EcoRI-BamHI-DNA s veľkosťou 2, 3 kb sa označuje ako hybridný plazmid pCARó. Vektor pBLUESCRIPT-KS+^R s fragmentom PvuII-BamHI-DNA s veľkosťou 1, 85 sa označuje ako hybridný plazmid pCAR5.

Príklad 5

5. Stanovenie aktivity R-(-)-2,2-DMCPCA-hydrolázy

Na stanovenie aktivity hydrolázy sa suspenzia mikroorganizmov nastaví na hodnotu optickej hustoty 0, 5 pri 650 nm. Ako médium sa použije fosfátový tlmivý roztok (10 mmol/1), pH 7, 0 s 0, 2 % hmotn. R,S-(±)-2,2-DMCPCA . Táto suspenzia sa inkubuje počas trepania 4 hod. pri 30 °C. Meria sa NH₄ ⁺ uvoľnený hydrolázou alebo R-(-)-2,2-DMCPCS. Aktivita sa vyjadruje ako g R-(-)-2,2-DMCPCA premenená na 1/hod/optickú hustotu pri 650 nm, za predpokladu, že 1 mmol vytvoreného NH₄ ⁺= 1 mmol R-(-)-2,2-DMCPA.

Príklad 6

Príprava S-(+)-2,2-DMCPCA

E. coli K12 s hybridným plazmidom pCAR6 má v médiu obsahujúcom minerálne soli, 0, 2 % (obj./obj.) glycerínu a 0, 15 % hmotn. R,S-(±)-2,2-DMCPCA aktivitu špecifickej hydrolázy s hodnotou 1, 2g R-(-)-2,2-DMCPCS/l/hod/OD₆₅₀ po indukciu IPTG. Premena R-(-)-2,2-DMCPCA na R-(-)-kyselinu sa stanoví uvoľnením NH₄ ⁺ a analýzou pomocou plynovej chromatografle. Cieľový produkt S-(+)-2,2-DMCPCA zostane nezmenený v racemickej zmesi.

Rovnako ako E. coli K12 sa kultivujú mikroorganizmy uvedené v tabuľke 1. Výsledky premeny sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Aktivita stereošpecifickej hydrolázy v rôznych kmeňoch

E. coli

kmeň	špec aktivita g/WVOD	faktor	stabilita v%<)	max. vr	celková aktivita g/l/h
Comamonas acidovorans (nie podľa vynálezu) A:18 Ώ	0,5	1		0	3,0
E. coli K12/oCAR6^)	1.2	2,4	90	nt
E. coli HBIOV0CAR6-Í	0,25	0,5	nt	nt
E. coli MC410tUoCARs3)	0,53	1	89	nt	-
E, coli XL1BLUE/pCAR6 ⁵) (DSM ô. 6551)	0.5	1	90	30	15.0
E. eoh DH5/pCAR6 5) (DSM Č. 7053)	2.1	4.2	100	30	63.0

1) indukcia amidom, 2) indukcia ITPG, 3) konštitutívna,

4) stabilita plazmidu po 24 hod. bez selekcie antibiotikami, nt = netestované, 5) bez indukcie

Príklad 7

Test aktivity C] - C₄-alkoholom

Testy aktivity sa najskôr uskutočňovali s Comamonas acidovorans A: 18 pri 37 °C s 0, 5 % R, S-2,2-DMCPCA v 10 mM tlmivého roztoku fosforečnanu draselného pri pH 7, 0. Kontrolné pokusy sa uskutočňovali bez rozpúšťadla, testovacie pokusy sa uskutočňovali s 5 až 16 % obj. rozpúšťadla. Výpočet špecifickej aktivity sa robí podľa príkladu 5.

rozpúšťadlo reakčná aktivita (% obj.) g R-2,2-DMCPCA/l/h/OD₆₅₀

-	0,64
etanol (10)	1,24
izopropanol(10)	1,85
metanol (5)	1, 79
metanol (10)	1,54
metanol (16)	1,66

Pri biotransformácii v 20 1 fermentore s 2 až 3 %R,S-2,2-DMCPCA (37 °C, 10 mM tlmivého roztoku fosforečnanu draselného, pH 7, 0) sa pridaním 5-7, 5 % obj. metanolu alebo etanolu dosiahne skrátenie reakčného času a vyšších výťažkov S-(+)-2,2-DMCPCA (zvýšenie selektivity). Rovnaký efekt sa pozoruje pri kmeni E. coli XLl-Blue s hydrolázovým génom. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2 (od každého kmeňa sa použije rovnaká aktivita vo vode)

kmeň	R.S-2.2-DMCPCA t%)	rozpúšťadlo	čas (hod)	ee (%)	výťažok (%)‘>
A:18	2,0		22	99	41,5
A:18	2.3	metanol (7,5)	15	99,2	47
Xl1/pCAR6	2,8		24	100	36
XL1/pCAR6	2,8	metanol (7.5)	7	98,2	46
XL1/pCAR6	2,8	etanol (5)	7	98.6	44

⁺) S-(+}2,2-DMCPCA vzťažené na vnesený R.S-OMCPCA

Príklad 8

Imobilizácia stereošpecifickej hydrolázy s E. coli XLl-Blue/pCAR6

Bezbunkový extrakt (288 ml) E. coli XLl-Blue/pCAR6 obsahujúci 28 mg proteínu/ml s hydrolázovou aktivitou pri 37 °C 0, 29 pmol R-(-)-2,2-DMCPCA/min.mg proteínu sa najskôr predčistí stĺpcovou chromatografiou na Q-Sephyróze (Pharmacia). Proteín hydrolázy sa eluuje gradientom NaCl (0-lmol/l) v Tris-HCl tlmivom roztoku (0, 1 molárny, pH 7, 5). Proteín s hydrolázovou aktivitou, ktorý· sa eluuje medzi 40 % a 80 % gradientu NaCl, sa potom zahustí ultrafiltráciou (membrána Amicon YM10) a odsolí sa gélovou filtráciou (PD-10, Sephadex G-25, Pharmacia LKB). Konečný objem je potom 47 ml. Pritom sa 67 mg proteínu/ml s hydrolázovou aktivitou pri 37 °C 0, 69 pmol R-(-)-2,2-DMCPCA/min.mg proteínu nachádza v tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (0, 1 molárny, pH 7, 0). Potom sa táto predčistená stereošpecifická hydroláza imobilizuje na Eupergite C (Rôhm Pharma GmbH, Weiterstadt, BRD) ako nosičovom materiáli. Oxiránové skupiny nerozpustného nosičového materiálu sa kovalentne viažu na voľné aminokyseliny hydrolázového proteínu. Imobilizácia sa uskutočňuje 90 hod. pri teplote miestnosti v tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (lmolámy, pH 8, 5). Získa sa 10, 2 mg imobilizovaného proteínu/g vlhkého Eupergitu C, s hydrolázovou aktivitou pri 37 °C 1, 5 μπιοί R-(-)-2,2-DMCPCA/min.g vlhkého Eupergitu C. Stabilita imobilizovanej hydrolázy pri 37 °C v tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (10 mmolámy, pH 8, 5), ktorý obsahuje 0, 5 % hmotn.R,S-(+)-2,2-DMCPCA, je uvedená v tabuľke 3.

Tabuľka 3

Čas (hod.) Aktivita imobilizovanei hydrolázy (pmol R-f-^č-DMCPCA/min. g vlhkého Eupergitu C)

0-90 1,5

90-185 0,68

Claims

1. Spôsob génovotechnologickej výroby S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamidu, vyznačujúci sa tým, že sa v racemickom R, S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamide biotransformuje R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid pomocou mikroorganizmov, ktoré sú transformované génom tvoriacim stereošpecifickú hydrolázu a ktorý je charakterizovaný reštrikčnou mapou uvedenou na obr. 1 na kyselinu R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxylovú, pričom vznikne opticky aktívny S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid a ten sa izoluje.

2. Spôsob podľa nároku lvyznačujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje s mikroorganizmami, ktoré sú transformované fragmentom DNA, ktorý kóduje polypeptid s aktivitou stereošpecifickcj hydrolázy, ktorého sekvencia aminokyselín je uvedená na obr. 3.

3. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 2, vyznačujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje s mikroorganizmami, ktoré sú transformované fragmentom DNA, ktorý' hybriduje s frag mentom DNA uvedeným na obr. 3 , a ktorý kóduje polypeptid s aktivitou stereošpecifickej hydrolázy.

4. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje s mikroorganizmami rodu Escherichia, Pseudomonas, Camamonas, Acinetobacter, Rhizobium alebo Agrobacterium.

5. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje s mikroorganizmami druhu Escherichia coli.

6 . Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa biotrasformácia uskutočňuje s mikroorganizmami druhu Escherichia coli XLl-Blue DSM č, 6551, ktoré sú transformované hybridným plazmidom pCAR6, a/alebo a ich spontánnymi mutantmi, ktoré si zachovávajú funkčnú schopnosť materského mikroorganizmu.

7. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že biotransformácia sa uskutočňuje s mikroorganizmami druhu Escherichia coli DH5 DSM č. 7053, ktorc sú transformované hybridným plazmidom pCAR6, a/alebo s ich spontánnymi mutantmi, ktoré si zachovávajú funkčnú schopnosť materského mikroorganizmu.

8. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 7, v y značujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje s imobilizovanou stereošpecifickou hydrolázou.

9. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje v médiu, ktoré obsahuje racemický R,S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid v množstve od 0,2 do 5% hmotnostných.

10. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje pri hodnote pH od 6 do 11 pri teplote od 15 do 55 °C.

11. DNA kódujúca stereošpecifickú hydrolázu, charakterizovaná reštrikčnou mapu uvedenou na obr. 1.

12. Fragment DNA kódujúci polypeptid s aktivitou stereošpecifickej hydrolázy, ktorého sekvencia aminokyselín je uvedená na obr. 3.

13. Fragment DNA, ktorý hybridizuje s fragmentom DNA uvedeným na obr. 3, a ktorý kóduje polypeptid a aktivitou stereošpecifickej hydrolázy.

14. DNA alebo fragment DNA podľa nároku 11, 12 alebo 13 v hybridnom plazmide pCAR6, uložené v Escherichia coli XLl-Blue DSM č. 6551.

15. DNA alebo fragment DNA podľa nároku 11, 12 alebo 13 v hybridnom plazmide pCAR6, uložené v Escherichia coli DH5 DSM č. 7053.

16. Hybridný plazmid uložený z expresného vektora s DNA, alebo s fragmentom DNA podľa nárokov 11, 12 alebo 13, do neho vloženými.

17. Hybridný plazmid pCAR6 zložený z DNA alebo fragmentu DNA podľa nároku 11, 12 alebo 13 a expresného vektora pBLUESCRIPT-KS+ , uložený v Escherichia coli XLl-Blue DSM č. 6551.

18. Hybridný plazmid pCAR6 zložený z DNA alebo fragmentu DNA podľa nároku 11, 12 alebo 13 a expresného vektora pBLUESCRIPT-KS+ uložený v Escherichia co/í DH5 DSM č. 7053.

19. Mikroorganizmy, ktoré sú transformované hybridným plazmidom podľa nároku 16, 17 alebo 18.

20. Mikroorganizmy podľa nároku 19 druhu Escherichia coli XLl-Blue DSM č. 6551, ktoré sú transformované hybridným plazmidom pCAR6, ako i ich spontánne mutanty, ktoré si zachovávajú funkčnú schopnosť materského organizmu.

21. Mikroorganizmy podľa nároku 19 druhu Escherichia coli DH5 DSM č. 7053, ktoré sú transformované hybridným plazmidom pCAR6, ako i ich spontánne mutanty, ktoré si zachovávajú funkčnú schopnosť materského organizmu.