RU2821926C1 - Способ получения и ведения мезенхимальных стволовых клеток из костного материала млекопитающих - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к областям медицины, биотехнологии и биофармакологии и представляет собой универсальную методику получения и культивирования линий мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из различного костного материала человека и млекопитающего. Изобретение позволяет получить МСК с высокой однородностью клеточной популяции, выделенные из костного материала независимо от возраста донора, с минимальными затратами времени, энергии, реагентов и материалов. 4 ил., 1 пр.

Description

Изобретение относится к областям медицины, биотехнологии и биофармакологии, и представляет собой универсальную методику получения и культивирования линий мезенхимальных стволовых клеток, в том числе пациент-специфичных, из различного костного материала человека. Изобретение может быть использовано в медицине, как приложение клеточно-заместительной терапии, и лечения различных заболеваний, а также в биофизических и биологических лабораториях для осуществления различных исследований прикладного и фундаментального характера. При использовании костного мозга животных (млекопитающих) разработанные методики могут применяться в ветеринарии.

Клеточная терапия является подвидом регенеративной медицины. Клеточная терапия на основе стволовых клеток является процессом любого вида введения стволовых клеток в ткань для лечения заболевания с добавлением или без добавления генной терапии. Стволовые клетки представляют собой неспециализированные клетки, обладающие способностью к длительному самообновлению без существенного изменения своих общих свойств. Они могут дифференцироваться в различные специализированные типы клеток при определенных физиологических или экспериментальных условиях. Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) широко используются для аллогенной клеточной терапии. Успешная изоляция плюрипотентных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток из внутренней клеточной массы ранних эмбрионов предоставила мощный инструмент для биологических исследований и для регенеративной медицины. Этические проблемы, связанные с их изоляцией, способствовали развитию индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток, которые имеют много общих свойств с клетками ЭС без этических соображений. Однако одним из ключевых свойств ЭС-клеток и ИПС-клеток, которое может серьезно подорвать их полезность, является их способность к образованию тератом и других раковых опухолей.

Из-за ограничений использования ЭС и ИПС-клеток в клинике возник большой интерес к мезенхимальным стволовым клеткам (МСК), которые свободны как от этических проблем, так и от образования тератом. Эти клетки были впервые выделены и охарактеризованы Фриденштейном и его коллегами в 1974 г. МСК, также называемые мезенхимальными стромальными клетками, представляют собой подмножество некроветворных взрослых стволовых клеток, происходящих из мезодермы. Они обладают способностью к самообновлению и многолинейной дифференцировкой не только в мезодермальные клоны, такие как хондроциты, остеоциты и адипоциты, но и в эктодермические и энтодермические клетки. МСК существуют практически во всех тканях. Количество клинических испытаний с клеточной терапией МСК растет с 2004 года. Плюрипотентная природа МСК делает их потенциально ценным инструментом в терапии, особенно в областях лечения заболеваний (например, сердечно-сосудистых заболеваний, иммунодефицита и др.), восстановления и регенерации тканей. Они могут быть выделены из костного мозга, жировой ткани, пуповины, печени плода, мышц и легких и могут быть успешно размножены in vitro.

Представляемый нами метод позволяет легко выделять аутологичные МСК из костного материала человека и других млекопитающих для последующей клеточной терапии ими любого вида. Аутологичные клетки имеют преимущества, схожие с ЭС и ИПС-клетками, т.к. представляют собой фракцию высокоочищенных собственных стволовых клеток. При введении пациенту его же МСК, выращенных в in vitro среде, исключаются возможные аллергические реакции и другие побочные эффекты.

Хотя основным источником МСК в клинических испытаниях является пуповина и костный мозг пациента. Недавние исследования показали, что аллогенность МСК, которые демонстрируют МСК пуповины, не оказывает существенного неблагоприятного влияния на приживление МСК при заживлении ран (Chen L., Tredget Е.Е., Liu С., Wu Y. Analysis of allogenicity of mesenchymal stem cells in engraftment and wound healing in mice. PLoS One 2009; 4: e7119.). Лучше использовать свежевыделенные МСК, поскольку было показано, что 5 молекул главного комплекса гистосовместимости могут быть увеличены во время размножения этих клеток in vitro (Tarte K., Gaillard J., Lataillade J.J., Fouillard L., Becker M., Mossafa H. et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood 2010; 115: 1549-53.). Основные источники МСК делятся на два типа источников: взрослые МСК, которые включают костный мозг, жировую ткань, периферическую кровь и пульпу зуба, и МСК, полученные из неонатальной ткани, полученные из плаценты, амниона и пуповины. Тем не менее, в зависимости от источника, МСК имеют иммунофенотипические различия, которые объясняют некоторые различия в их дифференцировке и реакций в организме реципиента. Сходство взрослых МСК заключается в положительной экспрессии CD44, CD90, CD105 (SH2) и CD166 и отрицательной экспрессии CD14, CD34 и CD45. Отличительной чертой МСК пульпы зуба является преобладание дифференцировки in vitro в нейроны. МСК, полученные в результате родов, имеют более примитивный профиль маркеров поверхностной экспрессии. МСК пуповины не обладают способностью in vitro достигать адипогенной дифференцировки, а МСК плацентарного происхождения экспрессируют гены гемопоэтических факторов роста, которые придают им способность поддерживать экспансию гемопоэтических стволовых клеток. МСК костного материала не имеют таких особенностей, были показаны успешные дифференцировки из таких в МСК почти во все терминальные клетки органов (Rodríguez-Fuentes D. Е. et al. Mesenchymal stem cells current clinical applications: a systematic review //Archives of medical research. - 2021. - T. 52. - №. 1. - C. 93-101). В представляемом способе по эти причинам будет выбран именно костный материал пациента, как источник МСК.

Известен способ получения МСК в составе остепластического материала для имплантации с целью направленной остеорегенерации (Патент РФ №2210352 от 20.08.2003). Данный метод представляет собой выделение из искусственных остеопластин клеток с добавлением авторского штамма диплоидных клеток легкого эмбриона человека. Недостатком метода является получение в результате гетерогенной популяции МСК с низким процентом выхода клеток.

Известен способ получения биотрансплантата, состоящего из клеток МСК, для лечения остепороза (Патент РФ №2265442 от 10.12.2005). Стволовые клетки (МСК) для биотрансплантата получают из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде ДМЕМ/F12, содержащей 15 % эмбриональной телячьей сыворотки, трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин. Клетки содержат таким образом до накопления в культуре клеток зрелой стромы. Посев осуществляют на пластиковые чашки Петри при удалении через 1 сутки неприкрепившихся клеток. Инкубирование проводят при 37°С в атмосфере 5 % CO₂ с последующей трипсинизацией и пересевом культуры. В результате нескольких пересевов получают культуру клеток МСК с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке, но эта культура также является гетерогенной клеточной популяцией, сфокусированная на получении необходимого количества клеточного материала (до 500 тыс. клеток) для внутривенного введения трансплантата.

Известен способ получения МСК, основанный на способности клеток прикрепляться к поверхности посуды, в которой выращивают культуру клеток (Bone, 1995, vol. 13, p. 81-95). В процессе используют эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС). В работе были получены клетки с высокой адгезивной способностью, скоростью пролиферации и временем сохранения мультипотентности. К недостаткам этого способа относится трудоемкость анализа бычьей сыворотки, применяемой для выращивания клеток. Основной недостаток же метода заключается в его плохой воспроизводимости, из-за чего наблюдается большой разброс результатов получения и выхода МСК. Почти все известные патенты базируются на способности МСК адгезироваться к пластику и добавлении ЭБС, поэтому протоколы получают меньший выход МСК, чем могли бы.

Близок к предлагаемому методу способ получения по патенту РФ №2303632 С1 от 27.07.2007. Метод представляет собой выделение МСК из гепаринизированного пунктата костного мозга, наслоенного на фиколл. В работе после центрифугирования отбирают клеточную фракцию на границе фиколла и верхний слой супернатанта. К недостаткам способа можно в первую очередь отнести плохую воспроизводимость метода, как и в предыдущем описании (Bone, 1995, vol. 13, р. 81-95). В методе аналогично не используется дополнительное покрытие поверхности, что дает нестабильный выход клеток в зависимости от исходного объема пунктата и времени, прошедшего от его забора. В методе также предлагается забор верхнего слоя супернатанта, который может содержать жировые структуры, что дает большую примесь других видов МСК по экспрессии CD44, CD90, CD105 (SH2) и CD166 и не дает считать культуру чистой раньше 4 пассажа.

Известна работа Majumdar М.K. et al. (J. Cell. Physiol., 2000, Oct., 185(1), p. 98-106). В работе происходит выделение, характеристика и хондрогенный потенциал мультиплетных стромальных клеток из костного мозга человека. Клетки выращивали в среде без сыворотки с добавлением трансформирующего фактора роста-бета (TGF-beta). Для ускорения клеточного роста использовались трехмерные матриксы альгинатных шариков. Клетки были охарактеризованы маркером CD34+. Данная работа показывает новый специфичный метод выделения МСК, не имея универсальный характер.

В работе Feldmann R.E. et al. (Electrophoresis, 2005, v. 26, п. 14, p. 2749-2758) МСК наиболее полно охарактеризованы по фенотипу. Источником МСК выступала пуповинная кровь. Важно заметить, что поверхность культуральной посуды проходила предобработку, хотя материал пуповинной крови не является оптимальным источником МСК, так как не способны in vitro достигать терминальной стадии дифференцировки. Недостатком метода еще является инкубация клеток в весьма специфичной коммерческой среде MSCGM medium (MSCGM Cell Systems, St. Katharinen, Germany), высевая клетки в крайне высокой плотности 1106/см².

Известен способ получения МСК из костного мозга человека, по которому выделяли мононуклеарные клетки путем центрифугирования в градиенте фиколла с последующей селекцией на антитела к поверхностному антигену CD105+, экспрессирующемуся на поверхности МСК. Клетки отбирали по адгезии МСК на пластике, затем осуществляли их культивирование (J. Cell. Physiol. 2000. vol. 185, р. 98-106). В результате была выделена фракция клеток CD105+, обогащенная МСК. Выход клеток не был высоким, а способ оказался достаточно затратным.

Известен способ выделения мезенхимальных стволовых клеток по патенту РФ №2252252 от 20.05.2005 г. Жировую ткань человека согласно способу измельчают, обрабатывают раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, центрифугируют. Полученную в результате суспензию очищают от эритроцитов с помощью лизирующего раствора с последовательной фильтрацией разными размерами пор. Выращивают клетки посевом во флаконы без дополнительной обработки. Клетки получают однородными и жизнеспособными. Недостатком метода является многоступенчатость очистки, связанная с исходным материалом для выделения МСК, это -жировая ткань или плацента.

Отдельно существуют способы снятия МСК и их ведения, примером является Патент № 2391400С1 от 6.10.2010. В методе вместо стандартного ведения культуры с помощью трипсина, снятие клеток осуществляют в парах аккутазы. Это более мягкий, но более дорогой и трудоемкий метод ведения культуры МСК.

Наиболее близким к представленному является способ, рассказанный в статье: Ferrero I. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells from healthy donors and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients //Cell transplantation. - 2008. - T. 17. - №. 3. - C. 255-266. Метод представляет собой последовательное наслаивание костного мозга на раствор Перкола с последующим центрифугированием. Брали костный мозг из гребня подвздошной кости под эпидуральной анестезией. Полученные МСК высеиваются в самой низкой из предлагаемых методов концентрации: 800,000 на см², рассадка клеток происходит согласно методу примерно каждые 7 дней. Недостатком этого способа является опять же является отсутствие факторов способствующих адгезии, из-за чего рост клеток более длительный после посадки (более 15 дней).

Задачей предлагаемого изобретения является получение мезенхимальных стволовых клеток высокой однородности клеточной популяции, выделенных из костного материала человека или млекопитающего, независимого от его возраста, с минимальными затратами времени, энергии, реагентов и материалов, которые могут быть легко выделены и трансплантированы, как непосредственно перед терапией, так и после криоконсервации.

Для решения поставленной задачи предлагается представленный метод выделения однородной культуры МСК из дезагрегированной костной ткани млекопитающего или человека. Выделение МСК из костного мозга осуществляют с помощью центрифугирования от 30 мин при скорости не ниже 1000 g в растворе фиколла. Сбор на границе сред из кольца мононуклеарной фракции костного мозга приводит к получению популяции МСК, пригодной для дальнейшего культивирования.

Выделение МСК из костной ткани возможно, как отдельно, так и одновременно с выделением из костного мозга. Объем костной ткани, полученной от пациента, должен быть не менее 1 см³. Оно происходит путем инкубирования измельченной ткани с раствором Трипсина (0,25 %) и коллагеназы 2 типа (10 мг в мл при силе 237 Ед/мл) от 15 до 40 мин при 37°С и последующего центрифугирования суспензии при оборотах от 1000 до 2000 g от 5 до 10 мин. В результате в осадке получаются МСК, готовые к дальнейшей посадке.

Ингибирование ферментов и дальнейшее культивирование происходит в питательной среды ДМЕМ содержанием сыворотки (FBS) от 10 %. Для ускорения клеточной пролиферации и стимуляции клеток к восстановлению после стрессовых условий выделения непосредственно после посадки в среду добавляют Y-27632, то есть ингибитор rho-ассоциированной протеинкиназы или ингибитор ROCK. В течение всего времени культивации полученных МСК питательная среда содержит набор незаменимых аминокислот (NEAA), и фактор роста фибробластов 2 типа (bFgF или FgF2). Добавление этих факторов показало гораздо большую эффективность при выращивании МСК, в отличие от увеличения процента содержания FBS, как в других методах выделения. На фиг. 1 представлен анализ роста клеточных культур МСК при содержании в такой среде. Представленное на фиг. 1 выделение из костного мозга состоялось из материала объемом 1 мл при изначальном расчете посева 25-50 клеток на см². Замена среды на RPMI ухудшала показатели клеточного роста, как и замена сыворотки на ее искусственный заменитель.

Дальнейшее культивирование всех полученных из костного материала МСК производят путем пассирования на матрасах при контроле посевного материала по посеву клеток и при контроле полноты снятия клеточной массы, охарактеризованной методами иммунофенотипирования с помощью маркеров МСК: CD 45-, CD 34-, CD 90+, CD106+, CD 44+, CD105+, CD14 -. Уже после 2 пассажа культура МСК дает от 80 до 99,9 % чистоты популяции. В предыдущих методах было проведено исследование только 6 маркеров, что не дает считать их культуру МСК однородной и принадлежащей к взрослому фенотипу. Стоит отметить, что согласно данному изобретению уже на стадии выделения клеток на границе сред костный мозг- фиколл среда раздела содержит однородные клетки МСК, охарактеризованные перечисленными маркерами.

Также в изобретении в отличие от предыдущих патентов проводилась дополнительная обработка посуды. Ряд экспериментов показал, что без обработки клетки хуже выживают и их рост замедлен. Наша задача была оптимизировать протокол для костного мозга и костной ткани от пациентов всех возрастов и для малого забора материала, чтобы создать универсальный метод выделения и ведения культуры МСК. Мы протестировали необработанную посуду, посуду, обработанную различными агентами: желатином, белком человеческого фибронектина, матриксом Matrigel, матриксом Geltrex. Любой из приведенных агентов показал лучший клеточный рост и выживаемость клеток по сравнению с выделением без дополнительного покрытия, что наглядно продемонстрировано на фиг. 2. При дальнейшем пассажировании обработка поверхности каким-либо агентом, повышающим адгезивность является желательной, но не необходимой. Таким образом при обработке поверхности, конечный продукт в виде МСК получается стабильно по изобретению с высоким выходом и однородностью независимо от исходного костного материала.

Данное изобретение по сути описывает общую методику выделения МСК из любого костного материала (фиг. 3). В изобретении представлены методики выделения из костной ткани путем ее ферментирования и из костного мозга путем пропускания материала через градиент плотности раствора. Одним из отличий данного изобретения также является отсутствие добавления питательных сред к костному материалу в процессе выделения. Раствор гепарина и костного материала наслаивался сразу на градиентный раствор фиколла.

Согласно изобретению, способ осуществляют следующим образом для костного мозга. Костный мозг человека получают путем пунктирования из грудины (1-10 мл) или из крыла подвздошной кости таза (1-30 мл) в условиях операционной в процессе операции или под местной анестезией. Пунктат для дальнейшей работы помещают в стерильный контейнер объемом от 10 мл с герметической крышкой и содержащий 500 ЕД гепарина. Пунктат перемещают в термосумке с поддерживающей температурой от 0 до 4°С, что позволяет сохранять образец без выделения до 10 ч. Образец после доставки к месту выделения в стерильных условиях в соотношении 3 к 2 или 1 к 1 наслаивается, не допуская перемешивания, на раствор фиколла (плотность 1,077 или 1,115 г/мл) или раствор перколла (1,073 г/мл) в любой соответствующей пробирке. Полученный образец центрифугируется при оборотах от 1000g до 1500g в течение 30-40 мин. После центрифугирования в отдельный фалькон собирается полученное в середине кольцо клеток, то есть срединный слой в градиенте плотности, разделяющийся с нижним мутным осадком и верхним жировым. Фракцию промывают в PBS, затем снова центрифугируется и в нем при оборотах от 1000g до 1500g в течение 5-10 мин. Общее время выделения из костного мозга занимает менее 60 мин.

Согласно изобретению, протокол выделения МСК из костной ткани выглядит следующим образом. Полученный в результате биопсии или открытой полостной операции биоптат костной ткани предварительно обрабатывается раствором PBS, измельчается с помощью глазных ножниц до состояния кусочков ткани порядка 5 мм³. Затем измельченная костная ткань подвергается ферментированию в растворе трипсина (0,25 %) или в растворе Трипсина (0,25 %) и коллагеназы 2 типа (10 мг в мл при силе 237 Ед/мл) типа в течение 15-30 мин при температуре 37°С. После ферментирования к полученной жидкости добавляется среда DMEM с содержанием сыворотки FBS 10 % и антибиотиков пенициллина 0,1 % и стрептомицина 0,1 % для инактивации ферментов. Образец центрифугируется на 1000-1200g в течение 5-10 мин. Супернатант сливается, а полученный осадок разбивается необходимым количеством питательной среды.

Для любого из описанных в изобретении выделений МСК полученные клеточные осадки разбивают в среде ресуспензируют в питательной среде и рассаживают на обработанные заранее факторами адгезии поверхности (Желатин, Matrigel и др.) для клеточного культивирования. В изобретении рекомендуется использовать желатин, как наиболее дешевый агент для повышения адгезии. Высев клеток производят с начальной плотностью 25-200 клеток на см² и помещают в СО₂ инкубатор на 24-48 ч. Затем тщательно отбирают среду культивирования, а клеточную культуру промывают стерильным физиологическим раствором и покрывают свежей питательной средой для культивирования, подогретой до +37°С. Далее клетки помещаются в СО₂ инкубатор и каждые два-три дня требуют смены питательной среды. Питательная среда содержит: DMEM, 10 % FBS, пенициллина 0,1 % и стрептомицина 0,1 %, незаменимых аминокислот NEAA, 1 мкг/мл базового фактора роста фибробластов bFgf. При малом количестве клеточного осадка (менее 1 млн клеток при подсчете с помощью камеры Горяева) согласно изобретению рекомендуется добавить в питательную среду фактор Y-27632, как ингибитор ROCK, в концентрации 1 нг/мл. После того, как клетки достигнут необходимой конфлюэнтности (около 90 %), они рассаживаются с помощью раствора TrypLE или трипсина. Для получения чистой популяции МСК нужно проделать от 2 до 4 пассажей. Полученные МСК характеризуются высокой однородностью и зрелостью по следующим маркерам МСК: CD45-, CD34-, CD90+, CD106+, CD44+, CD105+, CD14-. Выход чистой популяций МСК составляет до 99,9 %.

Оценку качества МСК осуществляют с помощью покраски для иммунофлуоресцентного анализа или клеточного сортера на следующие маркеры и антитела: DAPI, актиновые филаменты, поликлональное антитело к молекуле клеточной адгезии, ассоциированной с самонаведением (НСАМ), поликлональное антитело к антигену клеточной поверхности Thy1 (Thy1), Моноклональное антитело к молекуле адгезии активированных лейкоцитов (ALCAM), Поликлональные антитела к эндоглину (ENG). Покраска на перечисленные антитела должна носить положительный характер, то есть клетки должны иметь такие маркеры. Таким образом, определяют клетки с фенотипом CD45-, CD34-, CD90+, CD106+, CD44+, CD105+, которые являются мезенхимальными.

Предлагаемый способ позволяет получить пациент-специфичные МСК из костного мозга и костной ткани человека или млекопитающего для дальнейшего использования их в исследованиях и в клеточной терапии, а также разрешающий:

• вносить корректировки в постановку диагноза пациентов;

• осуществлять подбор пациент-специфичной терапии, в том числе регенеративной клеточной терапии;

• тестировать влияние на структуру полученных пациент-специфичных клеток лекарственных соединений;

• проводить фундаментальные исследования и изучения влияния различных препаратов на структуру пациент-специфичных клеток;

• проводить фундаментальные исследования, касающиеся регенеративной медицины, дифференцировки клеток и лечения стволовыми клетками.

Пример. МСК человека

Из грудины в процессе операции по коронарному шунтированию пунктировали от 0,5 до 1 мл костного мозга в шприц, стерильный, содержащий 500 ЕД гепарина. Пунктат для дальнейшей работы перенесли в стерильный контейнер, представляющий собой пробирку объемом 10 мл с герметической крышкой. При вскрытии грудины одновременно с костным мозгом забрали костную ткань пациента общим объемом 1 см³ в эту же пробирку, аналогично содержащую раствор гепарина. Пунктат и биоптат переместили в термосумке с поддерживающей температурой от 0 до 4°С.

К выделению образцы были доставлены через 6 ч после забора. Процедуру фракционирования костного мозга (фенотипирования) осуществляли в стерильных помещениях, в ламинарном шкафу 2-ого класса защиты. МСК из костной ткани выделяли одновременно с костным мозгом. Сначала костный мозг в гепарине наслоили на раствор фиколла плотностью 1,073 г/мл в соотношении 1:1. Полученный образец ставили центрифугироваться при 1100 g в течение 30 мин. В это время костную ткань промыли раствором фосфатно-солевого буфера (PBS) и измельчили при помощи глазных ножниц до кусочков объемом примерно 0,5 см³. Полученные кусочки ткани поставили в растворе Трипсина (0,25 %) и коллагеназы 2 типа (10 мг в мл при силе 237 Ед./мл) ферментироваться на 37°С в течение 15 мин.

После центрифугирования костного мозга в градиенте фиколла в отдельный фалькон собирали кольцо клеток на разделе градиента, то есть средний слой. Фракцию переносили и промывали в растворе PBS и затем центрифугировали при 1200g в течение 10 минут. Полученный осадок разбивали в среде питательной среде ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина 0,1 % и стрептомицина 0,1 %, незаменимых аминокислот NEAA, 1 мкг/мл базового фактора роста фибробластов bFgf и 1 нг/мл фактора Y-27632. Подсчет выхода клеток костного мозга показал общее количество в 0,7 млн. Клетки высевались на обработанные желатином культуральные флаконы Т25 и чашки Петри в расчете 25 клеток на 1 см².

После ферментирования костной ткани к полученному образцу добавлялась среда ДМЕМ с содержанием сыворотки 10 % для инактивации трипсина в пропорции 1 к 1 по объему жидкости. Далее образец центрифугировался на 1200g в течение 10 мин. Супернатант сливался, полученный осадок разбивался необходимым для рассадки количеством питательной среды для культивирования на основе ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной бычей сыворотки (FBS), пенициллина 0,1 % и стрептомицина 0,1 %, незаменимых аминокислот NEAA, 1 мкг/мл базового фактора роста фибробластов bFgf. Клетки высаживались на культуральные флаконы Т25, покрытые подложкой из желатина. Выход клеток в данном случае составил 1,5 млн. Все посаженные клетки поместились в CO₂ инкубатор на 24 ч.

Через 24 ч клетки были промыты с помощью фосфатно-солевого буфера. Среда была заменена на питательную среду для культивирования: ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина 0,1 % и стрептомицина 0,1 %, незаменимых аминокислот NEAA, 1 мкг/мл базового фактора роста фибробластов bFgf. Клетки были поставлены назад в инкубатор для дальнейшего роста. Смена сред в культуральных флаконах с клетками происходила каждые 2 дня. На 10 день клетки достигли конфлюэнтности слоя в 90 %. Поэтому на 10 день для костной ткани и на 11 день костного мозга клетки были пересажены с помощью раствора TrypLE (рекомбинантный фермент не животного происхождения, аналог трипсина). После 2 пассажа была сделана характеризация клеток МСК с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания (фиг. 4). Клетки были охарактеризованы, как характеризуются высокой однородные и зрелые по следующим маркерам МСК: CD45-, CD34-, CD90+, CD106+, CD44+, CD105+, CD14 -. Выход чистой популяции МСК составил 98 % для костного мозга и 90 % для костной ткани.

Claims (1)

1. Способ получения и ведения мезенхимальных стволовых клеток из костного материала млекопитающих, включающий этапы: выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из костного мозга, выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из костной ткани, ведения получаемых МСК, отличающийся тем, что жизнеспособные мезенхимальные стволовые клетки выделяют одновременно из двух типов материала человека или млекопитающего - костного мозга и костной ткани; выделение из костного мозга происходит на границе сред: жидкость костного мозга с гепарином - раствор Фиколла или жидкость костного мозга с гепарином - раствор Перколла; для выделения из костного мозга используется двойное центрифугирование, в совокупности не превышающее 40 мин; выделение жизнеспособных клеток осуществляют в течение 24 часов после забора клеточного материала при изолированном хранении при температуре от 0 до +4°С; выделение и дальнейшие манипуляции с клетками осуществляют с количеством костного мозга менее 1 мл; выделение из костной ткани происходит путем измельчения, ферментирования с помощью Трипсина или его аналогов и центрифугирования образца ткани до получения клеточного осадка; выращивание клеточной массы осуществляют из полученных МСК в стандартной посуде с использованием среды ДМЕМ с добавлением 10% FBS путем высева клеток с плотностью от 40 клеток на 1 см²; поддержание полученных МСК и ускорение наращивания клеточной массы происходит за счет добавления дополнительно незаменимых аминоксилот и (или) фактора роста фибробластов человека - 2.