RU2816638C1 - Способ получения децеллюляризованного матрикса из паренхиматозных органов для тканевой инженерии и регенеративной медицины - Google Patents
Способ получения децеллюляризованного матрикса из паренхиматозных органов для тканевой инженерии и регенеративной медицины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816638C1 RU2816638C1 RU2023127913A RU2023127913A RU2816638C1 RU 2816638 C1 RU2816638 C1 RU 2816638C1 RU 2023127913 A RU2023127913 A RU 2023127913A RU 2023127913 A RU2023127913 A RU 2023127913A RU 2816638 C1 RU2816638 C1 RU 2816638C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- matrix
- tissue
- decellularized
- decellularization
- decellularized matrix
- Prior art date
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 22
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 claims description 5
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 5
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 claims description 5
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 abstract description 4
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 55
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 24
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 12
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 8
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- JRMSLDWZFJZLAS-UHFFFAOYSA-M [7-(dimethylamino)-1,9-dimethylphenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC(C)=C3N=C21 JRMSLDWZFJZLAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N actrapid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@H](C)CC)[C@H](C)CC)[C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C(N)=O)C1=CNC=N1 YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012094 cell viability reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229950004152 insulin human Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клеточной трансплантологии и регенеративной медицине, может быть использовано для изготовления тканевых эквивалентов паренхиматозных органов. Изобретение заключается в получении децеллюляризированного матрикса путем фрагментации, замораживания биологического материала, его последующего измельчения, децеллюляризации. Изобретение эффективно для накопления биологического материала для проведения последующей децеллюляризации; увеличения выхода конечного продукта из-за сокращения стадий и длительности обработки ткани без изменения эффективности процесса децеллюляризации; обеспечения сохранения компонента ВКМ - ГАГ за счет исключения использования гипертонического раствора. 3 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 9 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной трансплантологии и регенеративной медицине, может быть использовано для изготовления тканевых эквивалентов паренхиматозных органов как средство замены части поврежденного паренхиматозного органа пациента или индуцированного восстановления нормальной функции паренхиматозного органа.
Предлагаемый способ может быть использован в клиниках, занимающихся восстановительной и регенеративной медициной при лечении или коррекции недостаточности функций паренхиматозных органов, таких как печень, поджелудочная железа, почки, селезенка и других; а также в специализированных лабораториях при исследованиях клеточно- и тканеинженерных конструкций или тканевых эквивалентов паренхиматозных органов.
Целью тканевой инженерии является создание тканевого эквивалента органа/ткани, оказывающего, как стимулирующее действие на процессы внутренней регенерации поврежденного органа, так и способствующего частичной или полной замене его функции. Тканевые эквиваленты формируют на основе функционального клеточного компонента, сигнальных молекул и биосовместимого матрикса (синонимы: носитель, каркас, скаффолд) - биомиметика внеклеточного матрикса (ВКМ), обеспечивающего более длительное выживание и эффективное функционирование клеток.
Одна из ключевых проблем при разработке тканевого эквивалента - получение оптимального матрикса, способного имитировать для клеток микроокружение биологической среды. Наиболее подходящим для клеток является тканеспецифический матрикс с характерными особенностями структуры и состава. Для получения такого матрикса органы и ткани подвергают децеллюляризации - максимально полному удалению клеточного и ядерного материала [Zhang X, Chen X, Hong Н, Hu R, Liu J, Liu С. DecellularizedExtracellular Matrix Scaffolds: Recent Trends and Emerging Strategies in TissueEngineering. Bioactive Mater. 2021. 10, 15-31]. Учитывая, насколько существенную роль играет ВКМ в обеспечении жизнеспособности и функционировании клеток, в процессе децеллюляризации важно не только освободить ткань/орган от клеточного компонента, но и, по возможности, максимально сохранить неизменными структуру и состав ВКМ. Децеллюляризованный матрикс может быть рецеллюляризован соответствующими типами клеток для формирования тканевого эквивалента с определенными функциональными свойствами.
Для оценки эффективности протокола децеллюляризации используют различные методы определения оставшихся в матриксе клеточных компонентов. Например, остаточное количество ДНК служит индикатором сохранившегося в децеллюляризованном матриксе ядерного материала, несущего большую долю антигенов, которые обеспечивают реакцию отторжения трансплантата. Критериями оценки эффективности децеллюляризации является отсутствие видимого ядерного материала в срезах ткани, окрашенных ДНК-связывающим флуоресцентным красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) или содержание ДНК менее 50 нг на мг сухого веса матрикса [Crapo РМ, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011. 32(12):3233-3243].
В литературе описаны матриксы, полученные путем децеллюляризации целых паренхиматозных органов мыши, крысы, свиньи и человека [Peloso A, Urbani L, Cravedi Р, Katari R, Maghsoudlou P, Fallas MEA, Sordi V, Citro A, Purroy C, Niu G, McQuilling JP, Sittadjody S, Farney AC, Iskandar SS, Rogers J, Stratta RJ, Opara EC, Piemonti L, Furdui C, Soker S, De Coppi P, Orlando G. The human pancreas as a source of pro-tolerogenic extracellular matrix scaffold for a new generation bio-artificial endocrine pancreas, Ann Surg. 2016. 264(1): 169-179]. Однако получение децеллюляризованного матрикса из целого органа сопровождается высоким процентом его неполной децеллюляризации из-за возникающих в нем нарушений микроциркуляции в процессе перфузии органа. Кроме того, полноценная рецеллюляризация всего объема такого матрикса, а также доставка кислорода и питательных веществ ко всем донорским клеткам, особенно в глубине органного матрикса, является сложной задачей.
Альтернативный подход заключается в получении матрикса в результате децеллюляризации фрагментов тканей или органов. Такая стратегия может быть перспективной для тканевой инженерии из-за более простой технологии получения децеллюляризованного матрикса и его рецеллюляризации. Кроме того, использование децеллюляризированного матрикса в виде мелкодисперсной суспензии позволит осуществлять менее инвазивное введение тканевого эквивалента.
Однако при создании аллогенных тканевых эквивалентов паренхиматозных органов не удастся избежать той же проблемы дефицита донорских органов, как и при трансплантации органов посмертных доноров, поэтому при соблюдении критериев эффективной децеллюляризации может быть перспективным применение ксеногенных источников, например свиньи.
Большинство протоколов описывают комбинированное и последовательное применение различных физических, химических и ферментативных методов для достижения эффективной децеллюляризации паренхиматозных органов и их фрагментов. При этом наиболее актуальным вопросом усовершенствования технологии децеллюляризации паренхиматозных органов остается снижение длительности обработки поверхностно-активными веществами (ПАВ) на ткань и уменьшение их концентрации для максимального сохранения естественной морфологии, структуры и состава. Чаще всего для децеллюляризации используют ПАВ, такие как додецилсульфат натрия (SDS) и Triton Х-100, которые необходимо удалять после децеллюляризации [Porzionato A, Stocco Е, Barbon S, Grandi F, Macchi V, De Caro R. Tissue-Engineered Grafts from Human Decellularized Extracellular Matrices: A Systematic Review and Future Perspectives. Int J Mol Sci. 2018. 19(12): 4117].
В качестве аналога предлагаемого способа нами выбран известный способ изготовления тканеспецифического децеллюляризированного матрикса из фрагментов паренхиматозных органов [RU 2693432, С2].
Сущность способа-аналога заключается в следующем.
1. Извлечение и фрагментация (от 10 мм до 15 мм) донорского материала.
2. Последовательное замораживание (от -30°С до -80°С) и оттаивание фрагментов (от 35°С до 40°С), повторяют, по меньшей мере, однократно.
3. Механическое измельчение фрагментов до частиц от 0,5 мм до 5 мм.
4. Децеллюляризацию измельченных частиц паренхиматозных органов проводят путем последовательной обработки ткани в растворах ПАВ с повышающейся концентрацией при перемешивании компонентов со скоростью 2-500 оборотов в минуту.
В качестве ПАВ используют:
а) раствор фосфатно-солевого буфера (PBS, рН = 7,35), содержащий 1% Triton X-100 и 0,1% SDS;
б) раствор PBS, содержащий 2% Triton Х-100 и 0,1% SDS;
в) раствор PBS, содержащий 3% Triton Х-100 и 0,1% SDS.
5. Децеллюляризованные частицы ткани отмывают от ПАВ в условиях перемешивания при скорости, которая применялась в процессе децеллюляризации, в растворе PBS в течение 3 суток. Раствор меняют на свежий с периодичностью один раз в сутки.
6. Лиофилизацию предварительно замороженных (от -40°С до - 50°С) в течение 4-8 часов децеллюляризованных фрагментов проводят при давлении от 2 Па до 100 Па с повышением температуры до 30-35°С в течение 18-48 часов
7. Замораживание (-196°С) и измельчение частиц с помощью криомельницы до размера в диапазоне от 50 до 300 мкм.
8. Измельченный тканеспецифический матрикс стерилизуют γ-облучением в дозе 15 кГр.
К недостаткам рассмотренного способа можно отнести:
- применение высоких концентраций Triton Х-100 может привести к вымыванию из ткани помимо клеточного и ядерного материала ценных компонентов ВКМ, например, гликозаминогликанов (ГАГ);
- многостадийность рассмотренного способа децеллюляризации повышает длительность контакта ткани с растворами ПАВ, что может привести к повреждению белков и общей структуры матрикса;
- для получения тканеспецифического матрикса рассмотренным способом требуется достаточное количество исходной донорской ткани, поскольку многостадийность процесса может приводить к значительным потерям материала;
- введенная в протокол стадия лиофилизации приводит к нарушениям архитектоники и структуры ВКМ, что может способствовать снижению пролиферативной и функциональной активности клеток при последующей рецеллюляризации матрикса.
В качестве прототипа предлагаемого нами способа был выбран известный протокол получения децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы крысы [Баранова Н.В., Кирсанова Л.А., Пономарева А.С, Немец Е.А., Басок Ю.Б., Бубенцова Г.Н., Сургученко В.А., Севастьянов В.И. Сравнительный анализ секреторной способности островков Лангерганса, культивированных с биополимерным коллагенсодержащим гидрогелем и тканеспецифическим матриксом. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2019;21(4):45-53] (1).
Способ заключается в следующем:
Субтотально удаленную поджелудочную железу крысы непосредственно после извлечения механически измельчают до фрагментов не более 1×1×2 мм.
Фрагменты панкреатической ткани при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости 5 об/мин обрабатывают последовательно в 0,1% растворе SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов, в 0,1% растворе SDS на IN NaCl в течение 3 часов и в 0,1% растворе SDS на PBS в течение 18 часов.
Децеллюляризованные фрагменты панкреатической ткани отмывают от ПАВ в течение 72 часов в трех сменах раствора PBS, содержащего антибиотик и антимикотик, вносят в криопробирки и стерилизуют (γ-стерилизация, 1,5 Мрад).
Стерильный тканеспецифический матрикс хранят при температуре 4-6°С.
В результате проведения децеллюляризации по описанному протоколу получают тканеспецифический матрикс, способный поддерживать жизнеспособность и инсулинпродуцирующую функцию островков Лангерганса крысы.
К недостаткам прототипа можно отнести:
- получение матрикса из непосредственно извлеченного органа без возможности хранения исходной ткани до осуществления процесса децеллюляризации;
- обработка ткани гипотоническим и гипертоническим растворами и применение SDS могут привести к потере компонентов ВКМ, например, гликозаминогликанов (ГАГ);
- двойное воздействие на ткань осмотическим шоком (обработка ткани и гипотоническим, и гипертоническим растворами) может привести низкому выходу конечного продукта.
Техническая проблема заключается в разработке доступного и эффективного способа получения достаточного количества децеллюляризованного матрикса из паренхиматозных органов млекопитающих, который может быть использован для формирования клеточно- и тканеинженерных конструкций или тканевых эквивалентов паренхиматозных органов.
Технический результат, достигаемый при осуществлении заявленного способа, заключается в следующем:
- применение стандартизованного режима хранения исходных тканей (от -30°С до -80°С, до 1 года), что обеспечивает возможность накопления биологического материала для проведения последующей децеллюляризации;
- сокращение стадий и длительности обработки ткани без изменения эффективности процесса децеллюляризации, что позволяет избежать дополнительных потерь матрикса и приводит к увеличению выхода конечного продукта;
- обеспечение сохранения компонента ВКМ - ГАГ за счет исключения использования гипертонического раствора при сохранении эффективности децеллюляризации и отсутствия цитотоксического действия полученного матрикса.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Полученный биологический материал (паренхиматозные органы/фрагменты млекопитающих) подвергают фрагментации до размера 10-50 мм, замораживают при температуре от -30°С до -80°С и хранят до 1 года. Перед децеллюляризацией фрагменты оттаивают при комнатной температуре и механически измельчают до размеров не более 1×1×2 мм. Далее проводят децеллюляризацию при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1-300 об/мин путем обработки последовательно в растворах:
- 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов (гипотонический раствор);
- 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, в течение 18 часов.
Затем проводят отмывку децеллюляризованного матрикса от ПАВ, ополасткивая 200-400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 Р04, 8,1 мМ Na2 НР04, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и выдерживая в условиях постоянного перемешивания в течение 72 часов в трех сменах 50-400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 PO4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и содержащего антибиотик гентамицин из расчета 20-30 мкг/мл и антимикотик амфотерицин из расчета 1-3 мкг/мл. При этом трехкратную замену раствора на свежий того же состава и количества проводят с периодичностью один раз в сутки.
Полученный матрикс хранят при температуре от -30°С до -80°С.
Децеллюляризованный матрикс стерилизуют у-облучением при 1,5 Мрад и хранят при температуре 4-8°С.
Способ поясняется следующими фигурами.
На фиг.1 представлено флуоресцентное окрашивание DAPI нативной панкреатической ткани человека; Ув. × 100; флуоресцентная микроскопия.
На фиг.2 представлено флуоресцентное окрашивание DAPI децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека; Ув. × 100; флуоресцентная микроскопия.
На фиг.3 представлено окрашивание на общий коллаген по методу Массона децеллюляризованного матрикса из непосредственно извлеченной поджелудочной железы свиньи; Ув. × 100.
На фиг.4 представлено окрашивание на общий коллаген по методу Массона децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы свиньи, хранившейся при -30°С в течение одного года; Ув. × 100.
На фиг.5 представлено окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного способом-прототипом; Ув. × 100.
На фиг.6 представлено окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного заявленным способом; Ув. × 100.
На фиг.7 представлена микрофотография островков Лангерганса с децеллюляризованным матриксом. Фазово-контрастная микроскопия. Ув. × 100.
Способ осуществляется следующим образом:
1. Паренхиматозную ткань подвергают фрагментации до размера 10-50 мм хирургическим скальпелем или медицинскими ножницами.
2. Фрагменты замораживают и хранят при температуре от -30°С до -80°С до проведения децеллюляризации в период до 1 года.
3. Фрагменты тканей оттаивают до комнатной температуры.
4. Фрагменты механически измельчают до размера не более 1×1×2 мм с помощью хирургического скальпеля или медицинских ножниц.
5. Децеллюляризацию проводят при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1-300 об/мин путем обработки последовательно в растворах:
а) 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов (гипотонический раствор);
б) 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, в течение 18 часов.
6. Отмывка децеллюляризованного матрикса включает следующие этапы:
а) ополаскивание 200-400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4;
б) выдержка в 50-400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 Р04, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и содержащего антибиотик гентамицин из расчета 20-30 мкг/мл и антимикотик амфотерицин из расчета 1-3 мкг/мл условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1-300 об/мин в течение 24 часов;
в) ополаскивание и выдержку повторяли дважды каждые 24 часа.
7. Децеллюляризованный матрикс переносят в криопробирки объемом 2 мл и хранят до момента стерилизации при температуре от - 30°С до -80°С.
8. Стерилизацию децеллюляризованного матрикса проводят у-облучением при 1,5 Мрад.
9. Стерильный децеллюляризированный матрикс хранят при температуре 4-6°С до проведения последующей рецеллюляризации функциональными клетками.
Для доказательства возможности достижения заявленного назначения -получение децеллюляризованного матрикса для формирования тканевого эквивалента паренхиматозных органов/тканей, и достижения указанного технического результата приводим следующие примеры.
Пример 1.
Децеллюляризованный матрикс получают предложенным способом из фрагментов поджелудочной железы человека, полученных в результате резекции органа (операционный материал).
1. Панкреатическую ткань подвергали фрагментации до размера 10 мм хирургическим скальпелем или медицинскими ножницами.
2. Фрагменты замораживали и хранили 1 год при температуре -80°С до проведения децеллюляризации.
3. Фрагменты панкреатической ткани оттаивали до комнатной температуры.
4. Фрагменты механически измельчали до размера не более 1×1×2 мм с помощью хирургического скальпеля или медицинских ножниц.
5. Децеллюляризацию проводили при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1 об/мин путем обработки последовательно в растворах:
а) 400 мл раствора 0,1% SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов (гипотонический раствор);
б) 400 мл раствора 0,1% SDS на PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, в течение 18 часов.
6. Отмывка децеллюляризованного матрикса включала следующие этапы:
а) ополаскивание 400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4;
б) выдержку в 400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 PO4, 8,1 мМ Na2 HPO4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и содержащего антибиотик гентамицин из расчета 20 мкг/мл и антимикотик амфотерицин из расчета 1 мкг/мл условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1 об/мин в течение 24 часов;
в) ополаскивание и выдержку повторяли дважды каждые 24 часа.
7. Децеллюляризованный матрикс переносили в криопробирки объемом 2 мл и хранили до момента стерилизации при температуре от -80°С.
8. Стерилизацию децеллюляризованного матрикса проводили у-облучением при 1,5 Мрад.
9. Стерильный децеллюляризированный матрикс хранили при температуре 4°С до проведения последующей рецеллюляризации функциональными клетками.
Для проверки эффективности децеллюляризации образцы децеллюляризованного матрикса фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (60%, 70%, 80%, 96%), выдерживали в смеси хлороформа и этанола, хлороформе и заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм получали с помощью микротома RM2245 (Leica, Германия) и окрашивали флуоресцентным красителем DAPI (Sigma, США) для визуалиазации ядер клеток.
На фиг.1 представлено флуоресцентное окрашивание DAPI нативной панкреатической ткани человека; Ув. × 100; флуоресцентная микроскопия.
На фиг.2 представлено флуоресцентное окрашивание DAPI децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека; Ув. × 100; флуоресцентная микроскопия.
Практически полное отсутствие ядерного материала в децеллюляризованном матриксе, в отличие от нативной ткани свидетельствовало об эффективности процесса децеллюляризации, проведенного заявленным способом.
Пример 2.
Для подтверждения достаточного удаления ядерного материала в децеллюляризованном матриксе из поджелудочной железы человека, полученном по заявленному способу (см. пример 1), определяли остаточное количество ДНК.
Выделение ДНК проводили с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя.
Для количественного определения двухцепочечной ДНК использовали флуоресцентный краситель ™Picogreen Quant-iT (Invitrogen, США).
Показания регистрировали на ридере для микропланшет Spark 10 М (Tecan Trading AG, Швейцария) при длине волны 520 нм.
Количественный анализ показал, что в децеллюляризованном матриксе, полученном по заявленному способу, содержание ДНК составило 13,8±0,7 нг/мг ткани, что соответствует общепринятому критерию эффективности децеллюляризации -содержание ДНК менее 50 нг на мг сухого веса матрикса, при этом содержание ДНК в нативной ткани составило 13693,1±327,5 нг/мг ткани.
Пример 3.
Для подтверждения возможности хранения исходных тканей до проведения процедуры децеллюляризации непосредственно извлеченную и хранившуюся в замороженном состоянии в течение года поджелудочную железу свиньи подвергали децеллюляризации заявленным способом.
1. Непосредственно извлеченную или замороженную в виде фрагментов 50 мм при -30°С в течение года и оттаянную до комнатной температуры поджелудочную железу свиньи измельчали до размеров не более 1×1×2 мм с помощью хирургического скальпеля или медицинских ножниц.
2. Децеллюляризацию проводили при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 300 об/мин путем обработки последовательно в растворах:
а) 50 мл раствора 0,05% SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов (гипотонический раствор);
б) 50 мл раствора 0,05% SDS на PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 PO4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, в течение 18 часов.
3. Отмывка децеллюляризованного матрикса включала следующие этапы:
а) ополаскивание 200 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4;
б) выдержка в 50 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 PO4, 8,1 мМ Na2 HPO4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и содержащего антибиотик гентамицин из расчета 30 мкг/мл и антимикотик амфотерицин из расчета 3 мкг/мл условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 300 об/мин в течение 24 часов;
в) ополаскивание и выдержку повторяли дважды каждые 24 часа.
4. Децеллюляризованный матрикс переносили в криопробирки объемом 2 мл и хранили до момента стерилизации при температуре от -30°С.
5. Стерилизацию децеллюляризованного матрикса проводили γ-облучением при 1,5 Мрад.
6. Стерильный децеллюляризированный матрикс хранили при температуре 6°С до проведения последующей рецеллюляризации функциональными клетками.
Сохранность структуры децеллюляризованного матрикса проверяли с помощью гистологической оценки. Образцы децеллюляризованного матрикса фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (60%, 70%, 80%, 96%), выдерживали в смеси хлороформа и этанола, хлороформе и заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм получали с помощью микротома RM2245 (Leica, Германия) и окрашивали по методу Массона для визуализации коллагеновых волокон.
На фиг.3 представлено окрашивание на общий коллаген по методу Массона децеллюляризованного матрикса из непосредственно извлеченной поджелудочной железы свиньи; Ув. × 100.
На фиг.4 представлено окрашивание на общий коллаген по методу Массона децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы свиньи, хранившейся при -30°С в течение одного года; Ув. × 100.
После децеллюляризации свежевыделенной и хранившейся в заморозке (-30°С, 1 год) панкреатической ткани свиньи оба образца децеллюляризованного матрикса характеризовались полностью волокнистой пористой структурой.
Пример 4.
Для доказательства сохранения в децеллюляризованном матриксе компонента ВКМ - ГАГ, проводили децеллюляризацию фрагментов поджелудочной железы человека (операционный материал) заявленным способом (см. пример 1) и способом-прототипом (1). Для качественной оценки содержания ГАГ в образцах децеллюляризованных матриксов, полученных двумя способами, проводили окрашивание гистологических препаратов специфическим красителем альциановым синим (Sigma, США).
На фиг.5 представлено окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного способом-прототипом; Ув. × 100.
На фиг.6 представлено окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного заявленным способом; Ув. × 100.
Гистологическое окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного способом-прототипом, выявило слабое окрашивание на ГАГ по сравнению с децеллюляризованным матриксом из поджелудочной железы человека, полученного заявленным способом, где отмечали выраженное окрашивание на ГАГ.
Пример 5.
Цитотоксичность образцов децеллюляризованных матриксов, полученных по заявленному способу из фрагментов поджелудочной железы человека (см. пример 1), оценивали in vitro методом прямого контакта в соответствии с межгосударственным стандартом ГОСТ ISO 10993-5-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro» на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3.
В качестве отрицательного контрольного образца использовали культуральную среду с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, США), в качестве положительного контрольного образца - стандарт цинка одноэлементный водный 10000 мкг/мл (Sigma-Aldrich, США).
Процедуры проводили в асептических условиях. Культуру клеток визуально оценивали с помощью инвертированного микроскопа Eclipse TS 100 (Nikon, Япония).
С помощью витального красителя prestoBlue™ Cell Viability Reagent (Invitrogen™, США) оценивали метаболическую активность фибробластов через 24 ч после прямого контакта с образцами матрикса. Изменение оптической плотности регистрировали с использованием ридера для микропланшет Spark 10 М (Tecan Trading AG, Швейцария) с программным обеспечением Spark Control™Magellan VI.2.20 на длинах волн 570 нм и 600 нм.
После прямого контакта с образцами жизнеспособность фибробластов оставалась выше 90% (96,8±4,7), что соответствует степени реакции 0 и подтверждает отсутствие цитотоксического действия образцов полученного децеллюляризованного матрикса.
Пример 6.
Для доказательства обеспечения снижения потерь децеллюляризованного матрикса получали децеллюляризованный матрикс из печени свиньи по предложенному способу (см. пример 1). В таблице 1 представлены данные о весе децеллюляризованных матриксов, полученных в соответствии с предлагаемым способом и способом-прототипом. Исходная ткань была взвешена после удаления лишней влаги с использованием нейлонового фильтра и фильтровальной бумаги. Децеллюляризованный матрикс был взвешен после инкубации в течение суток в вакуумном шкафу. Выход децеллюляризованного матрикса рассчитывали как отношение веса децеллюляризованного матрикса (мг) к весу нативной ткани (г).
Значительное увеличение выхода децеллюляризованного матрикса в 1,6 раза указывает на снижение потерь децеллюляризованного матрикса при использовании предлагаемого способа по сравнению со способом-прототипом.
Пример 7.
Для доказательства обеспечения сохранения ГАГ в децеллюляризованном матриксе получали децеллюляризованный матрикс из печени крысы по предложенному способу (см. пример 1). Было определено содержание ГАГ в децеллюляризованных матриксах, полученных в соответствии с предлагаемым способом и способом-прототипом. Для определения содержания ГАГ образцы лиофилизовали и растворяли в растворе папаина при +65°С. После инкубации с красителем 1,9-диметилметиленовым синим на планшетном спектрофлуориметре Tecan Spark 10М (Tecan Trading AG, Switzerland) определяли оптическую плотность при длине волны 525 нм. Содержание ГАГ в децеллюляризованном матриксе, полученном в соответствии с предложенным способом, составило 4,18±1,02 мкг/ мг ткани, а при использовании способа-прототипа 1,41±0,32 мкг/ мг ткани, что подтверждает сохранение ГАГ при использовании предложенного способа.
Пример 8.
Для доказательства обеспечения сохранения ГАГ в децеллюляризованном матриксе получали децеллюляризованный матрикс из селезенки крысы по предложенному способу (см. пример 1). Для определения содержания ГАГ образцы лиофилизовали и растворяли в растворе папаина при +65°С. После инкубации с красителем 1,9-диметилметиленовым синим на планшетном спектрофлуориметре Tecan Spark 10M (Tecan Trading AG, Switzerland) определяли оптическую плотность при длине волны 525 нм. Содержание ГАГ составило 6,87±1,29 мкг/ мг ткани (n=5).
Пример 9.
Для подтверждения пригодности децеллюляризованного матрикса для формирования тканевого эквивалента проводили культивирование островков Лангерганса человека с децеллюляризованным матриксом, полученным по заявленному способу из фрагментов поджелудочной железы человека (см. пример 1).
Для выделения островков Лангерганса механически измельченные фрагменты поджелудочной железы человека (операционный материал) инкубировали в растворе коллагеназы NB1 (активность 20 PZ U/g ткани) с нейтральной протеазой NP (активность 1,5 DMC U/g ткани) (Serva, Германия) в течение 10-15 мин при 37°С. К переваренной ткани добавляли трехкратный объем холодного (4°С) раствора Хэнкса для остановки действия ферментов и фильтровали через металлическое сито с диаметром ячеек 0,4-0,6 мм. Островки очищали центрифугированием при следующих режимах: 1 мин при скорости 900 об/мин, затем 2 мин при скорости 1300 об/мин.
Изолированные островки ресуспендировали в культуральной среде с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, США) и культивировали одни сутки в стандартных условиях (при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2).
Через сутки культивирования островки собирали центрифугированием в течение 2 мин при скорости 1200 об/мин, соединяли с децеллюляризованным матриксом и культивировали до 7 суток в культуральной среде с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, США) в стандартных условиях (при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2).
На фиг.7 представлена световая микрофотография островков Лангерганса с децеллюляризованным матриксом. Ув. × 100.
Для определения функциональной активности островков Лангерганса, культивированных с децеллюляризованным матриксом на 3 сутки инкубации проводили измерение содержания инсулина при стимуляции глюкозой. Ростовую среду заменяли свежей с низким содержанием глюкозы 2,8 ммоль/л и отбирали пробы культуральной среды через 60 минут инкубации в стандартных условиях. Затем удаляли ростовую среду и заменяли свежей с высокой концентрацией глюкозы 25 ммоль/л и отбирали пробы культуральной среды через 60 минут инкубации в стандартных условиях. Концентрацию инсулина в пробах определяли методом иммуноферментного анализа, используя набор ELISA Kit for insulin Human CEA448 Hu-96 (Cloud-Clone Copr., США) согласно инструкции производителя.
Показатели концентраций инсулина до и после стимуляции в пробах составили 48,3±2,8 пкг/мл и 101,4±4,1 пкг/мл соответственно, что подтверждает функциональную активность островков Лангерганса, культивированных с децеллюляризованным матриксом, полученным по заявленному способу.
Claims (10)
1. Способ получения децеллюляризованного матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа млекопитающего, в котором последовательно проводят следующие этапы:
а) получение донорского материала в виде донорского паренхиматозного органа или его части;
б) фрагментацию донорского материала с формированием фрагментов размером 10-50 мм;
в) замораживание полученных фрагментов при температуре от -30°С до -80°С и хранение до 1 года с последующим оттаиванием;
г) измельчение фрагментов до получения частиц размерами не более 1×1×2 мм;
д) децеллюляризацию полученных частиц при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1-300 об/мин путем последовательной обработки сначала в 50-400 мл раствора 0,05-0,1% додецилсульфат натрия (SDS) на дистиллированной воде в течение 3 часов, а затем в 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на растворе фосфатно-солевого буфера, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 в течение 18 часов;
е) отмывку полученного материала путем ополаскивания 200-400 мл раствора фосфатно-солевого буфера, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 с последующей выдержкой в 50-400 мл раствора фосфатно-солевого буфера, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, содержащего гентамицин из расчета 20-30 мкг/мл и амфотерицин из расчета 1-3 мкг/мл условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1-300 об/мин в течение 24 часов, повторяя ополаскивание и выдержку дважды каждые 24 часа с получением искомого матрикса.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученный матрикс хранят при температуре от -30°С до -80°С.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стерилизацию полученного матрикса проводят γ-облучением при 1,5 Мрад.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после стерилизации децеллюляризированный матрикс хранят при температуре 4-6°С.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2816638C1 true RU2816638C1 (ru) | 2024-04-02 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2461622C2 (ru) * | 2007-11-28 | 2012-09-20 | Огенодженесис, Инк. | Биоинженерный конструкт для имплантации ткани и способ изготовления названного биоинженерного конструкта (варианты) |
| RU2539918C1 (ru) * | 2013-11-29 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа |
| WO2017114902A1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Fundacion Tecnalia Research & Innovation | Method for producing a decellularized tissue matrix |
| RU2653489C2 (ru) * | 2016-09-02 | 2018-05-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ "ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России") | Способ получения децеллюляризированных матриксов паренхиматозных органов лабораторных животных |
| WO2018127554A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Novahep Ab | Methods of preparing bioengineered or bioprinted organ or tissue, and uses thereof |
| RU2693432C2 (ru) * | 2016-11-16 | 2019-07-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Тканеспецифический матрикс для тканевой инженерии паренхиматозного органа и способ его получения |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2461622C2 (ru) * | 2007-11-28 | 2012-09-20 | Огенодженесис, Инк. | Биоинженерный конструкт для имплантации ткани и способ изготовления названного биоинженерного конструкта (варианты) |
| RU2539918C1 (ru) * | 2013-11-29 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа |
| WO2017114902A1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Fundacion Tecnalia Research & Innovation | Method for producing a decellularized tissue matrix |
| RU2653489C2 (ru) * | 2016-09-02 | 2018-05-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ "ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России") | Способ получения децеллюляризированных матриксов паренхиматозных органов лабораторных животных |
| RU2693432C2 (ru) * | 2016-11-16 | 2019-07-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Тканеспецифический матрикс для тканевой инженерии паренхиматозного органа и способ его получения |
| WO2018127554A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Novahep Ab | Methods of preparing bioengineered or bioprinted organ or tissue, and uses thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101056069B1 (ko) | 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 | |
| CA2419817C (en) | Decellularized tissue engineered constructs and tissues | |
| RU2392287C2 (ru) | Матрица, клеточный имплантат и способы их получения и применения | |
| Parmaksiz et al. | Decellularization of bovine small intestinal submucosa and its use for the healing of a critical‐sized full‐thickness skin defect, alone and in combination with stem cells, in a small rodent model | |
| Spina et al. | Isolation of intact aortic valve scaffolds for heart‐valve bioprostheses: extracellular matrix structure, prevention from calcification, and cell repopulation features | |
| Baiguera et al. | Dynamic decellularization and cross-linking of rat tracheal matrix | |
| CN105963785B (zh) | 一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法 | |
| EP1698358A1 (en) | Transplantable biomaterial and method of preparing the same | |
| EP2471902B9 (en) | Production of artificial tissues by means of tissue engineering using agarose-fibrin biomaterials | |
| AU729787B2 (en) | Hyaluronic acid derivative based cell culture and biodegradable three-dimensional matrix | |
| AU2001284968A1 (en) | Decellularized tissue engineered constructs and tissues | |
| RU2816638C1 (ru) | Способ получения децеллюляризованного матрикса из паренхиматозных органов для тканевой инженерии и регенеративной медицины | |
| EP4393523A1 (en) | Cellular matrix nerve graft for repairing peripheral nerve injury and preparation method therefor | |
| Zivari‐Ghader et al. | Recent scaffold‐based tissue engineering approaches in premature ovarian failure treatment | |
| Łabuś et al. | Own experience from the use of a substitute of an allogeneic acellular dermal matrix revitalized with in vitro cultured skin cells in clinical practice | |
| Kumar et al. | Extraction techniques for the decellularization of rat dermal constructs | |
| CN114686421B (zh) | 一种肺组织脱细胞外基质微载体的制备方法及其应用 | |
| RU2716577C1 (ru) | Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии хряща | |
| CN1294254C (zh) | 异种心血管移植物的脱细胞方法 | |
| RU2586952C1 (ru) | Способ лечения печеночной недостаточности | |
| CN114028613A (zh) | 一种功能性骨修复复合支架、制备方法及应用 | |
| Fadeeva et al. | Study of Biointegration and Elastic-Strength Properties of a New Xenopericardium-Based Biomaterial for Reconstructive Cardiovascular Surgery. | |
| Macagonova et al. | The effectiveness of the tissue engineering in the obtaining of the biological materials from the extracellular matrix | |
| Sokol et al. | Prospects for application of bovine pericardial scaffold for cardial surgery | |
| KR20110011199A (ko) | 창상치유용 인공피부 대용물질 및 그 제조방법 |