RU2816638C1 - Method of obtaining decellularized matrix from parenchymal organs for tissue engineering and regenerative medicine - Google Patents
Method of obtaining decellularized matrix from parenchymal organs for tissue engineering and regenerative medicine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816638C1 RU2816638C1 RU2023127913A RU2023127913A RU2816638C1 RU 2816638 C1 RU2816638 C1 RU 2816638C1 RU 2023127913 A RU2023127913 A RU 2023127913A RU 2023127913 A RU2023127913 A RU 2023127913A RU 2816638 C1 RU2816638 C1 RU 2816638C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- matrix
- tissue
- decellularized
- decellularization
- decellularized matrix
- Prior art date
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 22
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 claims description 5
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 5
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 claims description 5
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 abstract description 4
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 55
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 24
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 12
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 8
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- JRMSLDWZFJZLAS-UHFFFAOYSA-M [7-(dimethylamino)-1,9-dimethylphenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC(C)=C3N=C21 JRMSLDWZFJZLAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N actrapid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@H](C)CC)[C@H](C)CC)[C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C(N)=O)C1=CNC=N1 YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012094 cell viability reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229950004152 insulin human Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной трансплантологии и регенеративной медицине, может быть использовано для изготовления тканевых эквивалентов паренхиматозных органов как средство замены части поврежденного паренхиматозного органа пациента или индуцированного восстановления нормальной функции паренхиматозного органа.The invention relates to medicine, namely to cell transplantology and regenerative medicine, and can be used for the production of tissue equivalents of parenchymal organs as a means of replacing part of a damaged parenchymal organ of a patient or induced restoration of the normal function of a parenchymal organ.
Предлагаемый способ может быть использован в клиниках, занимающихся восстановительной и регенеративной медициной при лечении или коррекции недостаточности функций паренхиматозных органов, таких как печень, поджелудочная железа, почки, селезенка и других; а также в специализированных лабораториях при исследованиях клеточно- и тканеинженерных конструкций или тканевых эквивалентов паренхиматозных органов.The proposed method can be used in clinics engaged in restorative and regenerative medicine in the treatment or correction of dysfunction of parenchymal organs, such as the liver, pancreas, kidneys, spleen and others; as well as in specialized laboratories when studying cell and tissue engineered structures or tissue equivalents of parenchymal organs.
Целью тканевой инженерии является создание тканевого эквивалента органа/ткани, оказывающего, как стимулирующее действие на процессы внутренней регенерации поврежденного органа, так и способствующего частичной или полной замене его функции. Тканевые эквиваленты формируют на основе функционального клеточного компонента, сигнальных молекул и биосовместимого матрикса (синонимы: носитель, каркас, скаффолд) - биомиметика внеклеточного матрикса (ВКМ), обеспечивающего более длительное выживание и эффективное функционирование клеток.The goal of tissue engineering is to create a tissue equivalent of an organ/tissue that has both a stimulating effect on the processes of internal regeneration of a damaged organ and contributes to the partial or complete replacement of its function. Tissue equivalents are formed on the basis of a functional cellular component, signaling molecules and a biocompatible matrix (synonyms: carrier, frame, scaffold) - a biomimetic of the extracellular matrix (ECM), which ensures longer survival and efficient functioning of cells.
Одна из ключевых проблем при разработке тканевого эквивалента - получение оптимального матрикса, способного имитировать для клеток микроокружение биологической среды. Наиболее подходящим для клеток является тканеспецифический матрикс с характерными особенностями структуры и состава. Для получения такого матрикса органы и ткани подвергают децеллюляризации - максимально полному удалению клеточного и ядерного материала [Zhang X, Chen X, Hong Н, Hu R, Liu J, Liu С. DecellularizedExtracellular Matrix Scaffolds: Recent Trends and Emerging Strategies in TissueEngineering. Bioactive Mater. 2021. 10, 15-31]. Учитывая, насколько существенную роль играет ВКМ в обеспечении жизнеспособности и функционировании клеток, в процессе децеллюляризации важно не только освободить ткань/орган от клеточного компонента, но и, по возможности, максимально сохранить неизменными структуру и состав ВКМ. Децеллюляризованный матрикс может быть рецеллюляризован соответствующими типами клеток для формирования тканевого эквивалента с определенными функциональными свойствами.One of the key problems in developing a tissue equivalent is obtaining an optimal matrix capable of simulating the microenvironment of a biological environment for cells. The most suitable matrix for cells is a tissue-specific matrix with characteristic features of structure and composition. To obtain such a matrix, organs and tissues are subjected to decellularization - the most complete removal of cellular and nuclear material [Zhang X, Chen X, Hong N, Hu R, Liu J, Liu C. Decellularized Extracellular Matrix Scaffolds: Recent Trends and Emerging Strategies in TissueEngineering. Bioactive Mater. 2021. 10, 15-31]. Considering the significant role the ECM plays in ensuring the viability and functioning of cells, during the decellularization process it is important not only to free the tissue/organ from the cellular component, but also, if possible, to keep the structure and composition of the ECM unchanged as much as possible. The decellularized matrix can be recellularized by appropriate cell types to form a tissue equivalent with defined functional properties.
Для оценки эффективности протокола децеллюляризации используют различные методы определения оставшихся в матриксе клеточных компонентов. Например, остаточное количество ДНК служит индикатором сохранившегося в децеллюляризованном матриксе ядерного материала, несущего большую долю антигенов, которые обеспечивают реакцию отторжения трансплантата. Критериями оценки эффективности децеллюляризации является отсутствие видимого ядерного материала в срезах ткани, окрашенных ДНК-связывающим флуоресцентным красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) или содержание ДНК менее 50 нг на мг сухого веса матрикса [Crapo РМ, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011. 32(12):3233-3243].To evaluate the effectiveness of the decellularization protocol, various methods are used to determine the remaining cellular components in the matrix. For example, the residual amount of DNA serves as an indicator of the nuclear material preserved in the decellularized matrix, which carries a large proportion of antigens that mediate the graft rejection reaction. Criteria for assessing the effectiveness of decellularization are the absence of visible nuclear material in tissue sections stained with the DNA-binding fluorescent dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) or a DNA content of less than 50 ng per mg of dry weight of the matrix [Crapo RM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011. 32(12):3233-3243].
В литературе описаны матриксы, полученные путем децеллюляризации целых паренхиматозных органов мыши, крысы, свиньи и человека [Peloso A, Urbani L, Cravedi Р, Katari R, Maghsoudlou P, Fallas MEA, Sordi V, Citro A, Purroy C, Niu G, McQuilling JP, Sittadjody S, Farney AC, Iskandar SS, Rogers J, Stratta RJ, Opara EC, Piemonti L, Furdui C, Soker S, De Coppi P, Orlando G. The human pancreas as a source of pro-tolerogenic extracellular matrix scaffold for a new generation bio-artificial endocrine pancreas, Ann Surg. 2016. 264(1): 169-179]. Однако получение децеллюляризованного матрикса из целого органа сопровождается высоким процентом его неполной децеллюляризации из-за возникающих в нем нарушений микроциркуляции в процессе перфузии органа. Кроме того, полноценная рецеллюляризация всего объема такого матрикса, а также доставка кислорода и питательных веществ ко всем донорским клеткам, особенно в глубине органного матрикса, является сложной задачей.The literature describes matrices obtained by decellularization of whole parenchymal organs of mice, rats, pigs and humans [Peloso A, Urbani L, Cravedi P, Katari R, Maghsoudlou P, Fallas MEA, Sordi V, Citro A, Purroy C, Niu G, McQuilling JP, Sittadjody S, Farney AC, Iskandar SS, Rogers J, Stratta RJ, Opara EC, Piemonti L, Furdui C, Soker S, De Coppi P, Orlando G. The human pancreas as a source of pro-tolerogenic extracellular matrix scaffold for a new generation bio-artificial endocrine pancreas, Ann Surg. 2016. 264(1): 169-179]. However, obtaining a decellularized matrix from a whole organ is accompanied by a high percentage of its incomplete decellularization due to microcirculation disturbances that occur during organ perfusion. In addition, complete recellularization of the entire volume of such a matrix, as well as the delivery of oxygen and nutrients to all donor cells, especially deep in the organ matrix, is a difficult task.
Альтернативный подход заключается в получении матрикса в результате децеллюляризации фрагментов тканей или органов. Такая стратегия может быть перспективной для тканевой инженерии из-за более простой технологии получения децеллюляризованного матрикса и его рецеллюляризации. Кроме того, использование децеллюляризированного матрикса в виде мелкодисперсной суспензии позволит осуществлять менее инвазивное введение тканевого эквивалента.An alternative approach is to obtain a matrix by decellularizing tissue or organ fragments. This strategy may be promising for tissue engineering due to the simpler technology for obtaining a decellularized matrix and its recellularization. In addition, the use of a decellularized matrix in the form of a fine suspension will allow for less invasive administration of tissue equivalent.
Однако при создании аллогенных тканевых эквивалентов паренхиматозных органов не удастся избежать той же проблемы дефицита донорских органов, как и при трансплантации органов посмертных доноров, поэтому при соблюдении критериев эффективной децеллюляризации может быть перспективным применение ксеногенных источников, например свиньи.However, when creating allogeneic tissue equivalents of solid organs, it will not be possible to avoid the same problem of donor organ shortage as with transplantation of organs from posthumous donors, therefore, if the criteria for effective decellularization are met, the use of xenogeneic sources, such as pigs, may be promising.
Большинство протоколов описывают комбинированное и последовательное применение различных физических, химических и ферментативных методов для достижения эффективной децеллюляризации паренхиматозных органов и их фрагментов. При этом наиболее актуальным вопросом усовершенствования технологии децеллюляризации паренхиматозных органов остается снижение длительности обработки поверхностно-активными веществами (ПАВ) на ткань и уменьшение их концентрации для максимального сохранения естественной морфологии, структуры и состава. Чаще всего для децеллюляризации используют ПАВ, такие как додецилсульфат натрия (SDS) и Triton Х-100, которые необходимо удалять после децеллюляризации [Porzionato A, Stocco Е, Barbon S, Grandi F, Macchi V, De Caro R. Tissue-Engineered Grafts from Human Decellularized Extracellular Matrices: A Systematic Review and Future Perspectives. Int J Mol Sci. 2018. 19(12): 4117].Most protocols describe the combined and sequential use of various physical, chemical and enzymatic methods to achieve effective decellularization of parenchymal organs and their fragments. At the same time, the most pressing issue for improving the technology of decellularization of parenchymal organs remains reducing the duration of treatment with surfactants on the tissue and reducing their concentration to maximize the preservation of the natural morphology, structure and composition. Most often, surfactants are used for decellularization, such as sodium dodecyl sulfate (SDS) and Triton X-100, which must be removed after decellularization [Porzionato A, Stocco E, Barbon S, Grandi F, Macchi V, De Caro R. Tissue-Engineered Grafts from Human Decellularized Extracellular Matrices: A Systematic Review and Future Perspectives. Int J Mol Sci. 2018. 19(12): 4117].
В качестве аналога предлагаемого способа нами выбран известный способ изготовления тканеспецифического децеллюляризированного матрикса из фрагментов паренхиматозных органов [RU 2693432, С2].As an analogue of the proposed method, we have chosen a well-known method for producing a tissue-specific decellularized matrix from fragments of parenchymal organs [RU 2693432, C2].
Сущность способа-аналога заключается в следующем.The essence of the analogue method is as follows.
1. Извлечение и фрагментация (от 10 мм до 15 мм) донорского материала.1. Extraction and fragmentation (from 10 mm to 15 mm) of donor material.
2. Последовательное замораживание (от -30°С до -80°С) и оттаивание фрагментов (от 35°С до 40°С), повторяют, по меньшей мере, однократно.2. Sequential freezing (from -30°C to -80°C) and thawing of fragments (from 35°C to 40°C) is repeated at least once.
3. Механическое измельчение фрагментов до частиц от 0,5 мм до 5 мм.3. Mechanical grinding of fragments to particles from 0.5 mm to 5 mm.
4. Децеллюляризацию измельченных частиц паренхиматозных органов проводят путем последовательной обработки ткани в растворах ПАВ с повышающейся концентрацией при перемешивании компонентов со скоростью 2-500 оборотов в минуту.4. Decellularization of crushed particles of parenchymal organs is carried out by sequentially treating the tissue in surfactant solutions with increasing concentrations while mixing the components at a speed of 2-500 rpm.
В качестве ПАВ используют:The following are used as surfactants:
а) раствор фосфатно-солевого буфера (PBS, рН = 7,35), содержащий 1% Triton X-100 и 0,1% SDS;a) a solution of phosphate-buffered saline (PBS, pH = 7.35) containing 1% Triton X-100 and 0.1% SDS;
б) раствор PBS, содержащий 2% Triton Х-100 и 0,1% SDS;b) PBS solution containing 2% Triton X-100 and 0.1% SDS;
в) раствор PBS, содержащий 3% Triton Х-100 и 0,1% SDS.c) PBS solution containing 3% Triton X-100 and 0.1% SDS.
5. Децеллюляризованные частицы ткани отмывают от ПАВ в условиях перемешивания при скорости, которая применялась в процессе децеллюляризации, в растворе PBS в течение 3 суток. Раствор меняют на свежий с периодичностью один раз в сутки.5. Decellularized tissue particles are washed from the surfactant under stirring conditions at the speed that was used during the decellularization process in a PBS solution for 3 days. The solution is changed to fresh one once a day.
6. Лиофилизацию предварительно замороженных (от -40°С до - 50°С) в течение 4-8 часов децеллюляризованных фрагментов проводят при давлении от 2 Па до 100 Па с повышением температуры до 30-35°С в течение 18-48 часов6. Lyophilization of pre-frozen (from -40°C to -50°C) decellularized fragments for 4-8 hours is carried out at a pressure from 2 Pa to 100 Pa with an increase in temperature to 30-35°C for 18-48 hours
7. Замораживание (-196°С) и измельчение частиц с помощью криомельницы до размера в диапазоне от 50 до 300 мкм.7. Freezing (-196°C) and grinding particles using a cryomill to a size in the range from 50 to 300 microns.
8. Измельченный тканеспецифический матрикс стерилизуют γ-облучением в дозе 15 кГр.8. The crushed tissue-specific matrix is sterilized by γ-irradiation at a dose of 15 kGy.
К недостаткам рассмотренного способа можно отнести:The disadvantages of the considered method include:
- применение высоких концентраций Triton Х-100 может привести к вымыванию из ткани помимо клеточного и ядерного материала ценных компонентов ВКМ, например, гликозаминогликанов (ГАГ);- the use of high concentrations of Triton X-100 can lead to the leaching of valuable components of the ECM, for example, glycosaminoglycans (GAGs), from the tissue in addition to cellular and nuclear material;
- многостадийность рассмотренного способа децеллюляризации повышает длительность контакта ткани с растворами ПАВ, что может привести к повреждению белков и общей структуры матрикса;- the multi-stage nature of the considered decellularization method increases the duration of tissue contact with surfactant solutions, which can lead to damage to proteins and the general structure of the matrix;
- для получения тканеспецифического матрикса рассмотренным способом требуется достаточное количество исходной донорской ткани, поскольку многостадийность процесса может приводить к значительным потерям материала;- to obtain a tissue-specific matrix using the considered method, a sufficient amount of initial donor tissue is required, since the multi-stage process can lead to significant losses of material;
- введенная в протокол стадия лиофилизации приводит к нарушениям архитектоники и структуры ВКМ, что может способствовать снижению пролиферативной и функциональной активности клеток при последующей рецеллюляризации матрикса.- the lyophilization stage introduced into the protocol leads to disturbances in the architectonics and structure of the ECM, which can contribute to a decrease in the proliferative and functional activity of cells during subsequent recellularization of the matrix.
В качестве прототипа предлагаемого нами способа был выбран известный протокол получения децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы крысы [Баранова Н.В., Кирсанова Л.А., Пономарева А.С, Немец Е.А., Басок Ю.Б., Бубенцова Г.Н., Сургученко В.А., Севастьянов В.И. Сравнительный анализ секреторной способности островков Лангерганса, культивированных с биополимерным коллагенсодержащим гидрогелем и тканеспецифическим матриксом. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2019;21(4):45-53] (1).As a prototype of the method we propose, we chose the well-known protocol for obtaining a decellularized matrix from the rat pancreas [Baranova N.V., Kirsanova L.A., Ponomareva A.S., Nemets E.A., Basok Yu.B., Bubentsova G. N., Surguchenko V.A., Sevastyanov V.I. Comparative analysis of the secretory ability of islets of Langerhans cultured with a biopolymer collagen-containing hydrogel and a tissue-specific matrix. Bulletin of transplantology and artificial organs. 2019;21(4):45-53] (1).
Способ заключается в следующем:The method is as follows:
Субтотально удаленную поджелудочную железу крысы непосредственно после извлечения механически измельчают до фрагментов не более 1×1×2 мм.The subtotally removed rat pancreas is mechanically crushed immediately after extraction to fragments no larger than 1×1×2 mm.
Фрагменты панкреатической ткани при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости 5 об/мин обрабатывают последовательно в 0,1% растворе SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов, в 0,1% растворе SDS на IN NaCl в течение 3 часов и в 0,1% растворе SDS на PBS в течение 18 часов.Fragments of pancreatic tissue at room temperature under constant stirring at a speed of 5 rpm are treated sequentially in a 0.1% SDS solution in distilled water for 3 hours, in a 0.1% SDS solution in IN NaCl for 3 hours and in 0 .1% SDS solution in PBS for 18 hours.
Децеллюляризованные фрагменты панкреатической ткани отмывают от ПАВ в течение 72 часов в трех сменах раствора PBS, содержащего антибиотик и антимикотик, вносят в криопробирки и стерилизуют (γ-стерилизация, 1,5 Мрад).Decellularized fragments of pancreatic tissue are washed from surfactants for 72 hours in three changes of a PBS solution containing an antibiotic and an antimycotic, added to cryovials and sterilized (γ-sterilization, 1.5 Mrad).
Стерильный тканеспецифический матрикс хранят при температуре 4-6°С.The sterile tissue-specific matrix is stored at a temperature of 4-6°C.
В результате проведения децеллюляризации по описанному протоколу получают тканеспецифический матрикс, способный поддерживать жизнеспособность и инсулинпродуцирующую функцию островков Лангерганса крысы.As a result of decellularization according to the described protocol, a tissue-specific matrix is obtained that is capable of maintaining the viability and insulin-producing function of the rat islets of Langerhans.
К недостаткам прототипа можно отнести:The disadvantages of the prototype include:
- получение матрикса из непосредственно извлеченного органа без возможности хранения исходной ткани до осуществления процесса децеллюляризации;- obtaining a matrix from a directly extracted organ without the possibility of storing the original tissue until the decellularization process is carried out;
- обработка ткани гипотоническим и гипертоническим растворами и применение SDS могут привести к потере компонентов ВКМ, например, гликозаминогликанов (ГАГ);- treatment of tissue with hypotonic and hypertonic solutions and the use of SDS can lead to the loss of ECM components, for example, glycosaminoglycans (GAGs);
- двойное воздействие на ткань осмотическим шоком (обработка ткани и гипотоническим, и гипертоническим растворами) может привести низкому выходу конечного продукта.- double exposure of tissue to osmotic shock (treatment of tissue with both hypotonic and hypertonic solutions) can lead to a low yield of the final product.
Техническая проблема заключается в разработке доступного и эффективного способа получения достаточного количества децеллюляризованного матрикса из паренхиматозных органов млекопитающих, который может быть использован для формирования клеточно- и тканеинженерных конструкций или тканевых эквивалентов паренхиматозных органов.The technical challenge is to develop an affordable and effective method for obtaining a sufficient amount of decellularized matrix from mammalian parenchymal organs, which can be used to form cell- and tissue-engineered constructs or tissue equivalents of parenchymal organs.
Технический результат, достигаемый при осуществлении заявленного способа, заключается в следующем:The technical result achieved by implementing the claimed method is as follows:
- применение стандартизованного режима хранения исходных тканей (от -30°С до -80°С, до 1 года), что обеспечивает возможность накопления биологического материала для проведения последующей децеллюляризации;- use of a standardized storage regime for source tissues (from -30°C to -80°C, up to 1 year), which provides the possibility of accumulating biological material for subsequent decellularization;
- сокращение стадий и длительности обработки ткани без изменения эффективности процесса децеллюляризации, что позволяет избежать дополнительных потерь матрикса и приводит к увеличению выхода конечного продукта;- reduction of stages and duration of tissue processing without changing the efficiency of the decellularization process, which avoids additional losses of the matrix and leads to an increase in the yield of the final product;
- обеспечение сохранения компонента ВКМ - ГАГ за счет исключения использования гипертонического раствора при сохранении эффективности децеллюляризации и отсутствия цитотоксического действия полученного матрикса.- ensuring the preservation of the ECM component - GAG by eliminating the use of a hypertonic solution while maintaining the effectiveness of decellularization and the absence of the cytotoxic effect of the resulting matrix.
Сущность изобретения заключается в следующем.The essence of the invention is as follows.
Полученный биологический материал (паренхиматозные органы/фрагменты млекопитающих) подвергают фрагментации до размера 10-50 мм, замораживают при температуре от -30°С до -80°С и хранят до 1 года. Перед децеллюляризацией фрагменты оттаивают при комнатной температуре и механически измельчают до размеров не более 1×1×2 мм. Далее проводят децеллюляризацию при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1-300 об/мин путем обработки последовательно в растворах:The resulting biological material (mammalian parenchymal organs/fragments) is fragmented to a size of 10-50 mm, frozen at a temperature from -30°C to -80°C and stored for up to 1 year. Before decellularization, the fragments are thawed at room temperature and mechanically crushed to sizes of no more than 1 × 1 × 2 mm. Next, decellularization is carried out at room temperature under conditions of constant stirring at a rotation speed of 1-300 rpm by processing sequentially in solutions:
- 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов (гипотонический раствор);- 50-400 ml of a solution of 0.05-0.1% SDS in distilled water for 3 hours (hypotonic solution);
- 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, в течение 18 часов.- 50-400 ml of a solution of 0.05-0.1% SDS in PBS, obtained from the composition of 138 mm NaCl, 2.67 mm KCl, 1.47 mm KH 2 PO 4 , 8.1 mm Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 liter, with pH 7.4, for 18 hours.
Затем проводят отмывку децеллюляризованного матрикса от ПАВ, ополасткивая 200-400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 Р04, 8,1 мМ Na2 НР04, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и выдерживая в условиях постоянного перемешивания в течение 72 часов в трех сменах 50-400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 PO4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и содержащего антибиотик гентамицин из расчета 20-30 мкг/мл и антимикотик амфотерицин из расчета 1-3 мкг/мл. При этом трехкратную замену раствора на свежий того же состава и количества проводят с периодичностью один раз в сутки.Then the decellularized matrix is washed from the surfactant by rinsing with 200-400 ml of PBS solution obtained from the composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4 , 8.1 mM Na2HP04 , distilled water up to 1 l , with a pH of 7.4 and kept under conditions of constant stirring for 72 hours in three shifts of 50-400 ml of PBS solution obtained from the composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8, 1 mM Na 2 HPO4, distilled water up to 1 liter, with pH 7.4 and containing the antibiotic gentamicin at a rate of 20-30 μg/ml and the antimycotic amphotericin at a rate of 1-3 μg/ml. In this case, the solution is replaced three times with a fresh one of the same composition and quantity once a day.
Полученный матрикс хранят при температуре от -30°С до -80°С.The resulting matrix is stored at temperatures from -30°C to -80°C.
Децеллюляризованный матрикс стерилизуют у-облучением при 1,5 Мрад и хранят при температуре 4-8°С.The decellularized matrix is sterilized by γ-irradiation at 1.5 Mrad and stored at a temperature of 4-8°C.
Способ поясняется следующими фигурами.The method is illustrated by the following figures.
На фиг.1 представлено флуоресцентное окрашивание DAPI нативной панкреатической ткани человека; Ув. × 100; флуоресцентная микроскопия.Figure 1 shows DAPI fluorescent staining of native human pancreatic tissue; Uv. × 100; fluorescence microscopy.
На фиг.2 представлено флуоресцентное окрашивание DAPI децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека; Ув. × 100; флуоресцентная микроскопия.Figure 2 shows DAPI fluorescent staining of decellularized matrix from human pancreas; Uv. × 100; fluorescence microscopy.
На фиг.3 представлено окрашивание на общий коллаген по методу Массона децеллюляризованного матрикса из непосредственно извлеченной поджелудочной железы свиньи; Ув. × 100.Figure 3 shows Masson staining for total collagen of a decellularized matrix from a directly removed porcine pancreas; Uv. × 100.
На фиг.4 представлено окрашивание на общий коллаген по методу Массона децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы свиньи, хранившейся при -30°С в течение одного года; Ув. × 100.Figure 4 shows Masson staining for total collagen of a decellularized matrix from a porcine pancreas stored at -30°C for one year; Uv. × 100.
На фиг.5 представлено окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного способом-прототипом; Ув. × 100.Figure 5 shows Alcian blue staining of a decellularized matrix from the human pancreas obtained by the prototype method; Uv. × 100.
На фиг.6 представлено окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного заявленным способом; Ув. × 100.Figure 6 shows Alcian blue staining of a decellularized matrix from the human pancreas obtained by the claimed method; Uv. × 100.
На фиг.7 представлена микрофотография островков Лангерганса с децеллюляризованным матриксом. Фазово-контрастная микроскопия. Ув. × 100.Figure 7 shows a micrograph of the islets of Langerhans with a decellularized matrix. Phase contrast microscopy. Uv. × 100.
Способ осуществляется следующим образом:The method is carried out as follows:
1. Паренхиматозную ткань подвергают фрагментации до размера 10-50 мм хирургическим скальпелем или медицинскими ножницами.1. Parenchymal tissue is fragmented to a size of 10-50 mm with a surgical scalpel or medical scissors.
2. Фрагменты замораживают и хранят при температуре от -30°С до -80°С до проведения децеллюляризации в период до 1 года.2. Fragments are frozen and stored at temperatures from -30°C to -80°C until decellularization is carried out for a period of up to 1 year.
3. Фрагменты тканей оттаивают до комнатной температуры.3. Tissue fragments are thawed to room temperature.
4. Фрагменты механически измельчают до размера не более 1×1×2 мм с помощью хирургического скальпеля или медицинских ножниц.4. The fragments are mechanically crushed to a size of no more than 1×1×2 mm using a surgical scalpel or medical scissors.
5. Децеллюляризацию проводят при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1-300 об/мин путем обработки последовательно в растворах:5. Decellularization is carried out at room temperature under conditions of constant stirring at a rotation speed of 1-300 rpm by processing sequentially in solutions:
а) 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов (гипотонический раствор);a) 50-400 ml of a solution of 0.05-0.1% SDS in distilled water for 3 hours (hypotonic solution);
б) 50-400 мл раствора 0,05-0,1% SDS на PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, в течение 18 часов.b) 50-400 ml of a solution of 0.05-0.1% SDS in PBS, obtained from a composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 liter, with pH 7.4, for 18 hours.
6. Отмывка децеллюляризованного матрикса включает следующие этапы:6. Washing of the decellularized matrix includes the following steps:
а) ополаскивание 200-400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4;a) rinsing with 200-400 ml of PBS solution obtained from the composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 l, with pH 7 ,4;
б) выдержка в 50-400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 Р04, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и содержащего антибиотик гентамицин из расчета 20-30 мкг/мл и антимикотик амфотерицин из расчета 1-3 мкг/мл условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1-300 об/мин в течение 24 часов;b) exposure to 50-400 ml of PBS solution obtained from the composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 P04, 8.1 mM Na 2 HPO4, distilled water up to 1 l, with pH 7, 4 and containing the antibiotic gentamicin at a rate of 20-30 μg/ml and the antimycotic amphotericin at a rate of 1-3 μg/ml under conditions of constant stirring at a rotation speed of 1-300 rpm for 24 hours;
в) ополаскивание и выдержку повторяли дважды каждые 24 часа.c) rinsing and holding were repeated twice every 24 hours.
7. Децеллюляризованный матрикс переносят в криопробирки объемом 2 мл и хранят до момента стерилизации при температуре от - 30°С до -80°С.7. The decellularized matrix is transferred into cryovials with a volume of 2 ml and stored until sterilization at a temperature from -30°C to -80°C.
8. Стерилизацию децеллюляризованного матрикса проводят у-облучением при 1,5 Мрад.8. Sterilization of the decellularized matrix is carried out by γ-irradiation at 1.5 Mrad.
9. Стерильный децеллюляризированный матрикс хранят при температуре 4-6°С до проведения последующей рецеллюляризации функциональными клетками.9. The sterile decellularized matrix is stored at a temperature of 4-6°C until subsequent recellularization with functional cells.
Для доказательства возможности достижения заявленного назначения -получение децеллюляризованного матрикса для формирования тканевого эквивалента паренхиматозных органов/тканей, и достижения указанного технического результата приводим следующие примеры.To prove the possibility of achieving the stated purpose - obtaining a decellularized matrix for the formation of the tissue equivalent of parenchymal organs/tissues, and achieving the specified technical result, we provide the following examples.
Пример 1.Example 1.
Децеллюляризованный матрикс получают предложенным способом из фрагментов поджелудочной железы человека, полученных в результате резекции органа (операционный материал).The decellularized matrix is obtained using the proposed method from fragments of the human pancreas obtained as a result of organ resection (surgical material).
1. Панкреатическую ткань подвергали фрагментации до размера 10 мм хирургическим скальпелем или медицинскими ножницами.1. Pancreatic tissue was fragmented to a size of 10 mm with a surgical scalpel or medical scissors.
2. Фрагменты замораживали и хранили 1 год при температуре -80°С до проведения децеллюляризации.2. The fragments were frozen and stored for 1 year at -80°C until decellularization.
3. Фрагменты панкреатической ткани оттаивали до комнатной температуры.3. Pancreatic tissue fragments were thawed to room temperature.
4. Фрагменты механически измельчали до размера не более 1×1×2 мм с помощью хирургического скальпеля или медицинских ножниц.4. The fragments were mechanically crushed to a size of no more than 1×1×2 mm using a surgical scalpel or medical scissors.
5. Децеллюляризацию проводили при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1 об/мин путем обработки последовательно в растворах:5. Decellularization was carried out at room temperature under conditions of constant stirring at a rotation speed of 1 rpm by processing sequentially in solutions:
а) 400 мл раствора 0,1% SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов (гипотонический раствор);a) 400 ml of a solution of 0.1% SDS in distilled water for 3 hours (hypotonic solution);
б) 400 мл раствора 0,1% SDS на PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, в течение 18 часов.b) 400 ml of a solution of 0.1% SDS in PBS, obtained from a composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 l, with pH 7.4, for 18 hours.
6. Отмывка децеллюляризованного матрикса включала следующие этапы:6. Washing of the decellularized matrix included the following steps:
а) ополаскивание 400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4;a) rinsing with 400 ml of PBS solution obtained from the composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 l, with pH 7.4 ;
б) выдержку в 400 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 PO4, 8,1 мМ Na2 HPO4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и содержащего антибиотик гентамицин из расчета 20 мкг/мл и антимикотик амфотерицин из расчета 1 мкг/мл условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 1 об/мин в течение 24 часов;b) exposure to 400 ml of PBS solution obtained from the composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO4, distilled water up to 1 l, with pH 7.4 and containing the antibiotic gentamicin at a rate of 20 μg/ml and the antimycotic amphotericin at a rate of 1 μg/ml under conditions of constant stirring at a rotation speed of 1 rpm for 24 hours;
в) ополаскивание и выдержку повторяли дважды каждые 24 часа.c) rinsing and holding were repeated twice every 24 hours.
7. Децеллюляризованный матрикс переносили в криопробирки объемом 2 мл и хранили до момента стерилизации при температуре от -80°С.7. The decellularized matrix was transferred into 2 ml cryovials and stored until sterilization at a temperature of -80°C.
8. Стерилизацию децеллюляризованного матрикса проводили у-облучением при 1,5 Мрад.8. Sterilization of the decellularized matrix was carried out by γ-irradiation at 1.5 Mrad.
9. Стерильный децеллюляризированный матрикс хранили при температуре 4°С до проведения последующей рецеллюляризации функциональными клетками.9. The sterile decellularized matrix was stored at 4°C until subsequent recellularization with functional cells.
Для проверки эффективности децеллюляризации образцы децеллюляризованного матрикса фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (60%, 70%, 80%, 96%), выдерживали в смеси хлороформа и этанола, хлороформе и заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм получали с помощью микротома RM2245 (Leica, Германия) и окрашивали флуоресцентным красителем DAPI (Sigma, США) для визуалиазации ядер клеток.To test the effectiveness of decellularization, samples of the decellularized matrix were fixed in 10% buffered formalin, dehydrated in alcohols of increasing concentration (60%, 70%, 80%, 96%), kept in a mixture of chloroform and ethanol, chloroform and embedded in paraffin. Sections 4-5 µm thick were prepared using an RM2245 microtome (Leica, Germany) and stained with the fluorescent dye DAPI (Sigma, USA) to visualize cell nuclei.
На фиг.1 представлено флуоресцентное окрашивание DAPI нативной панкреатической ткани человека; Ув. × 100; флуоресцентная микроскопия.Figure 1 shows DAPI fluorescent staining of native human pancreatic tissue; Uv. × 100; fluorescence microscopy.
На фиг.2 представлено флуоресцентное окрашивание DAPI децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека; Ув. × 100; флуоресцентная микроскопия.Figure 2 shows DAPI fluorescent staining of decellularized matrix from human pancreas; Uv. × 100; fluorescence microscopy.
Практически полное отсутствие ядерного материала в децеллюляризованном матриксе, в отличие от нативной ткани свидетельствовало об эффективности процесса децеллюляризации, проведенного заявленным способом.The almost complete absence of nuclear material in the decellularized matrix, in contrast to native tissue, indicated the effectiveness of the decellularization process carried out by the claimed method.
Пример 2.Example 2.
Для подтверждения достаточного удаления ядерного материала в децеллюляризованном матриксе из поджелудочной железы человека, полученном по заявленному способу (см. пример 1), определяли остаточное количество ДНК.To confirm sufficient removal of nuclear material in the decellularized matrix from the human pancreas obtained according to the claimed method (see example 1), the residual amount of DNA was determined.
Выделение ДНК проводили с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя.DNA extraction was performed using the DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Germany) according to the manufacturer's instructions.
Для количественного определения двухцепочечной ДНК использовали флуоресцентный краситель ™Picogreen Quant-iT (Invitrogen, США).To quantify double-stranded DNA, the fluorescent dye ™Picogreen Quant-iT (Invitrogen, USA) was used.
Показания регистрировали на ридере для микропланшет Spark 10 М (Tecan Trading AG, Швейцария) при длине волны 520 нм.Readings were recorded on a Spark 10 M microplate reader (Tecan Trading AG, Switzerland) at a wavelength of 520 nm.
Количественный анализ показал, что в децеллюляризованном матриксе, полученном по заявленному способу, содержание ДНК составило 13,8±0,7 нг/мг ткани, что соответствует общепринятому критерию эффективности децеллюляризации -содержание ДНК менее 50 нг на мг сухого веса матрикса, при этом содержание ДНК в нативной ткани составило 13693,1±327,5 нг/мг ткани.Quantitative analysis showed that in the decellularized matrix obtained according to the claimed method, the DNA content was 13.8 ± 0.7 ng/mg of tissue, which corresponds to the generally accepted criterion for the effectiveness of decellularization - DNA content is less than 50 ng per mg of dry weight of the matrix, while the content DNA in native tissue was 13693.1±327.5 ng/mg tissue.
Пример 3.Example 3.
Для подтверждения возможности хранения исходных тканей до проведения процедуры децеллюляризации непосредственно извлеченную и хранившуюся в замороженном состоянии в течение года поджелудочную железу свиньи подвергали децеллюляризации заявленным способом.To confirm the possibility of storing the original tissues before the decellularization procedure, the pig pancreas, directly extracted and stored frozen for a year, was subjected to decellularization using the stated method.
1. Непосредственно извлеченную или замороженную в виде фрагментов 50 мм при -30°С в течение года и оттаянную до комнатной температуры поджелудочную железу свиньи измельчали до размеров не более 1×1×2 мм с помощью хирургического скальпеля или медицинских ножниц.1. The pig's pancreas, directly removed or frozen in the form of 50 mm fragments at -30°C for a year and thawed to room temperature, was crushed to sizes of no more than 1 × 1 × 2 mm using a surgical scalpel or medical scissors.
2. Децеллюляризацию проводили при комнатной температуре в условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 300 об/мин путем обработки последовательно в растворах:2. Decellularization was carried out at room temperature under conditions of constant stirring at a rotation speed of 300 rpm by processing sequentially in solutions:
а) 50 мл раствора 0,05% SDS на дистиллированной воде в течение 3 часов (гипотонический раствор);a) 50 ml of a solution of 0.05% SDS in distilled water for 3 hours (hypotonic solution);
б) 50 мл раствора 0,05% SDS на PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 PO4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4, в течение 18 часов.b) 50 ml of a solution of 0.05% SDS in PBS, prepared from a composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 l, with pH 7.4, for 18 hours.
3. Отмывка децеллюляризованного матрикса включала следующие этапы:3. Washing of the decellularized matrix included the following steps:
а) ополаскивание 200 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 РО4, 8,1 мМ Na2 НРО4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4;a) rinsing with 200 ml of PBS solution obtained from the composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 l, with pH 7.4 ;
б) выдержка в 50 мл раствора PBS, полученного из состава 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2 PO4, 8,1 мМ Na2 HPO4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 и содержащего антибиотик гентамицин из расчета 30 мкг/мл и антимикотик амфотерицин из расчета 3 мкг/мл условиях постоянного перемешивания при скорости вращения 300 об/мин в течение 24 часов;b) exposure in 50 ml of PBS solution obtained from the composition of 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO4, distilled water up to 1 l, with pH 7.4 and containing the antibiotic gentamicin at a rate of 30 μg/ml and the antimycotic amphotericin at a rate of 3 μg/ml under conditions of constant stirring at a rotation speed of 300 rpm for 24 hours;
в) ополаскивание и выдержку повторяли дважды каждые 24 часа.c) rinsing and holding were repeated twice every 24 hours.
4. Децеллюляризованный матрикс переносили в криопробирки объемом 2 мл и хранили до момента стерилизации при температуре от -30°С.4. The decellularized matrix was transferred into 2 ml cryovials and stored until sterilization at a temperature of -30°C.
5. Стерилизацию децеллюляризованного матрикса проводили γ-облучением при 1,5 Мрад.5. Sterilization of the decellularized matrix was carried out by γ-irradiation at 1.5 Mrad.
6. Стерильный децеллюляризированный матрикс хранили при температуре 6°С до проведения последующей рецеллюляризации функциональными клетками.6. The sterile decellularized matrix was stored at 6°C until subsequent recellularization with functional cells.
Сохранность структуры децеллюляризованного матрикса проверяли с помощью гистологической оценки. Образцы децеллюляризованного матрикса фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (60%, 70%, 80%, 96%), выдерживали в смеси хлороформа и этанола, хлороформе и заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм получали с помощью микротома RM2245 (Leica, Германия) и окрашивали по методу Массона для визуализации коллагеновых волокон.The integrity of the structure of the decellularized matrix was checked using histological evaluation. Samples of the decellularized matrix were fixed in 10% buffered formalin, dehydrated in alcohols of increasing concentration (60%, 70%, 80%, 96%), kept in a mixture of chloroform and ethanol, chloroform and embedded in paraffin. Sections 4-5 μm thick were obtained using a microtome RM2245 (Leica, Germany) and stained using the Masson method to visualize collagen fibers.
На фиг.3 представлено окрашивание на общий коллаген по методу Массона децеллюляризованного матрикса из непосредственно извлеченной поджелудочной железы свиньи; Ув. × 100.Figure 3 shows Masson staining for total collagen of a decellularized matrix from a directly removed porcine pancreas; Uv. × 100.
На фиг.4 представлено окрашивание на общий коллаген по методу Массона децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы свиньи, хранившейся при -30°С в течение одного года; Ув. × 100.Figure 4 shows Masson staining for total collagen of a decellularized matrix from a porcine pancreas stored at -30°C for one year; Uv. × 100.
После децеллюляризации свежевыделенной и хранившейся в заморозке (-30°С, 1 год) панкреатической ткани свиньи оба образца децеллюляризованного матрикса характеризовались полностью волокнистой пористой структурой.After decellularization of freshly isolated and frozen (-30°C, 1 year) porcine pancreatic tissue, both samples of decellularized matrix were characterized by a completely fibrous porous structure.
Пример 4.Example 4.
Для доказательства сохранения в децеллюляризованном матриксе компонента ВКМ - ГАГ, проводили децеллюляризацию фрагментов поджелудочной железы человека (операционный материал) заявленным способом (см. пример 1) и способом-прототипом (1). Для качественной оценки содержания ГАГ в образцах децеллюляризованных матриксов, полученных двумя способами, проводили окрашивание гистологических препаратов специфическим красителем альциановым синим (Sigma, США).To prove the preservation of the ECM component - GAG - in the decellularized matrix, fragments of the human pancreas (surgical material) were decellularized using the claimed method (see example 1) and the prototype method (1). To qualitatively assess the GAG content in samples of decellularized matrices obtained by two methods, histological preparations were stained with a specific Alcian blue dye (Sigma, USA).
На фиг.5 представлено окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного способом-прототипом; Ув. × 100.Figure 5 shows Alcian blue staining of a decellularized matrix from the human pancreas obtained by the prototype method; Uv. × 100.
На фиг.6 представлено окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного заявленным способом; Ув. × 100.Figure 6 shows Alcian blue staining of a decellularized matrix from the human pancreas obtained by the claimed method; Uv. × 100.
Гистологическое окрашивание альциановым синим децеллюляризованного матрикса из поджелудочной железы человека, полученного способом-прототипом, выявило слабое окрашивание на ГАГ по сравнению с децеллюляризованным матриксом из поджелудочной железы человека, полученного заявленным способом, где отмечали выраженное окрашивание на ГАГ.Histological staining with Alcian blue of the decellularized matrix from the human pancreas obtained by the prototype method revealed weak staining for GAG compared to the decellularized matrix from the human pancreas obtained by the claimed method, where pronounced staining for GAG was noted.
Пример 5.Example 5.
Цитотоксичность образцов децеллюляризованных матриксов, полученных по заявленному способу из фрагментов поджелудочной железы человека (см. пример 1), оценивали in vitro методом прямого контакта в соответствии с межгосударственным стандартом ГОСТ ISO 10993-5-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro» на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3.The cytotoxicity of samples of decellularized matrices obtained according to the claimed method from fragments of the human pancreas (see example 1) was assessed in vitro by the direct contact method in accordance with the interstate standard GOST ISO 10993-5-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effects of medical devices. Part 5. Cytotoxicity study: in vitro methods" on a culture of mouse fibroblasts of the NIH 3T3 line.
В качестве отрицательного контрольного образца использовали культуральную среду с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, США), в качестве положительного контрольного образца - стандарт цинка одноэлементный водный 10000 мкг/мл (Sigma-Aldrich, США).A culture medium with 10% fetal calf serum (HyClone, USA) was used as a negative control sample, and a single-element aqueous zinc standard 10,000 μg/ml (Sigma-Aldrich, USA) was used as a positive control sample.
Процедуры проводили в асептических условиях. Культуру клеток визуально оценивали с помощью инвертированного микроскопа Eclipse TS 100 (Nikon, Япония).The procedures were carried out under aseptic conditions. The cell culture was visually assessed using an Eclipse TS 100 inverted microscope (Nikon, Japan).
С помощью витального красителя prestoBlue™ Cell Viability Reagent (Invitrogen™, США) оценивали метаболическую активность фибробластов через 24 ч после прямого контакта с образцами матрикса. Изменение оптической плотности регистрировали с использованием ридера для микропланшет Spark 10 М (Tecan Trading AG, Швейцария) с программным обеспечением Spark Control™Magellan VI.2.20 на длинах волн 570 нм и 600 нм.Using the vital dye prestoBlue™ Cell Viability Reagent (Invitrogen™, USA), the metabolic activity of fibroblasts was assessed 24 hours after direct contact with matrix samples. Changes in optical density were recorded using a Spark 10 M microplate reader (Tecan Trading AG, Switzerland) with Spark Control™Magellan VI.2.20 software at wavelengths of 570 nm and 600 nm.
После прямого контакта с образцами жизнеспособность фибробластов оставалась выше 90% (96,8±4,7), что соответствует степени реакции 0 и подтверждает отсутствие цитотоксического действия образцов полученного децеллюляризованного матрикса.After direct contact with the samples, the viability of fibroblasts remained above 90% (96.8±4.7), which corresponds to a reaction degree of 0 and confirms the absence of cytotoxic effect of the samples of the resulting decellularized matrix.
Пример 6.Example 6.
Для доказательства обеспечения снижения потерь децеллюляризованного матрикса получали децеллюляризованный матрикс из печени свиньи по предложенному способу (см. пример 1). В таблице 1 представлены данные о весе децеллюляризованных матриксов, полученных в соответствии с предлагаемым способом и способом-прототипом. Исходная ткань была взвешена после удаления лишней влаги с использованием нейлонового фильтра и фильтровальной бумаги. Децеллюляризованный матрикс был взвешен после инкубации в течение суток в вакуумном шкафу. Выход децеллюляризованного матрикса рассчитывали как отношение веса децеллюляризованного матрикса (мг) к весу нативной ткани (г).To prove the reduction of losses of the decellularized matrix, a decellularized matrix was obtained from pig liver according to the proposed method (see example 1). Table 1 presents data on the weight of decellularized matrices obtained in accordance with the proposed method and the prototype method. The original fabric was weighed after removing excess moisture using a nylon filter and filter paper. The decellularized matrix was weighed after incubation for 24 hours in a vacuum oven. The yield of decellularized matrix was calculated as the ratio of the weight of the decellularized matrix (mg) to the weight of the native tissue (g).
Значительное увеличение выхода децеллюляризованного матрикса в 1,6 раза указывает на снижение потерь децеллюляризованного матрикса при использовании предлагаемого способа по сравнению со способом-прототипом.A significant increase in the yield of decellularized matrix by 1.6 times indicates a reduction in the loss of decellularized matrix when using the proposed method compared to the prototype method.
Пример 7.Example 7.
Для доказательства обеспечения сохранения ГАГ в децеллюляризованном матриксе получали децеллюляризованный матрикс из печени крысы по предложенному способу (см. пример 1). Было определено содержание ГАГ в децеллюляризованных матриксах, полученных в соответствии с предлагаемым способом и способом-прототипом. Для определения содержания ГАГ образцы лиофилизовали и растворяли в растворе папаина при +65°С. После инкубации с красителем 1,9-диметилметиленовым синим на планшетном спектрофлуориметре Tecan Spark 10М (Tecan Trading AG, Switzerland) определяли оптическую плотность при длине волны 525 нм. Содержание ГАГ в децеллюляризованном матриксе, полученном в соответствии с предложенным способом, составило 4,18±1,02 мкг/ мг ткани, а при использовании способа-прототипа 1,41±0,32 мкг/ мг ткани, что подтверждает сохранение ГАГ при использовании предложенного способа.To prove the preservation of GAGs in the decellularized matrix, a decellularized matrix was obtained from rat liver according to the proposed method (see example 1). The GAG content in decellularized matrices obtained in accordance with the proposed method and the prototype method was determined. To determine the GAG content, samples were lyophilized and dissolved in papain solution at +65°C. After incubation with the dye 1,9-dimethylmethylene blue, the optical density was determined at a wavelength of 525 nm on a Tecan Spark 10M plate spectrofluorimeter (Tecan Trading AG, Switzerland). The GAG content in the decellularized matrix obtained in accordance with the proposed method was 4.18±1.02 μg/mg of tissue, and when using the prototype method 1.41±0.32 μg/mg of tissue, which confirms the preservation of GAGs when used the proposed method.
Пример 8.Example 8.
Для доказательства обеспечения сохранения ГАГ в децеллюляризованном матриксе получали децеллюляризованный матрикс из селезенки крысы по предложенному способу (см. пример 1). Для определения содержания ГАГ образцы лиофилизовали и растворяли в растворе папаина при +65°С. После инкубации с красителем 1,9-диметилметиленовым синим на планшетном спектрофлуориметре Tecan Spark 10M (Tecan Trading AG, Switzerland) определяли оптическую плотность при длине волны 525 нм. Содержание ГАГ составило 6,87±1,29 мкг/ мг ткани (n=5).To prove the preservation of GAGs in the decellularized matrix, a decellularized matrix was obtained from the rat spleen according to the proposed method (see example 1). To determine the GAG content, samples were lyophilized and dissolved in papain solution at +65°C. After incubation with 1,9-dimethylmethylene blue dye, the optical density at a wavelength of 525 nm was determined on a Tecan Spark 10M plate spectrofluorimeter (Tecan Trading AG, Switzerland). The GAG content was 6.87±1.29 µg/mg tissue (n=5).
Пример 9.Example 9.
Для подтверждения пригодности децеллюляризованного матрикса для формирования тканевого эквивалента проводили культивирование островков Лангерганса человека с децеллюляризованным матриксом, полученным по заявленному способу из фрагментов поджелудочной железы человека (см. пример 1).To confirm the suitability of the decellularized matrix for the formation of a tissue equivalent, human islets of Langerhans were cultivated with a decellularized matrix obtained according to the claimed method from fragments of the human pancreas (see example 1).
Для выделения островков Лангерганса механически измельченные фрагменты поджелудочной железы человека (операционный материал) инкубировали в растворе коллагеназы NB1 (активность 20 PZ U/g ткани) с нейтральной протеазой NP (активность 1,5 DMC U/g ткани) (Serva, Германия) в течение 10-15 мин при 37°С. К переваренной ткани добавляли трехкратный объем холодного (4°С) раствора Хэнкса для остановки действия ферментов и фильтровали через металлическое сито с диаметром ячеек 0,4-0,6 мм. Островки очищали центрифугированием при следующих режимах: 1 мин при скорости 900 об/мин, затем 2 мин при скорости 1300 об/мин.To isolate the islets of Langerhans, mechanically crushed fragments of the human pancreas (surgical material) were incubated in a solution of collagenase NB1 (activity 20 PZ U/g tissue) with neutral protease NP (activity 1.5 DMC U/g tissue) (Serva, Germany) for 10-15 min at 37°C. A threefold volume of cold (4°C) Hanks solution was added to the digested tissue to stop the action of the enzymes and filtered through a metal sieve with a mesh diameter of 0.4-0.6 mm. The islets were purified by centrifugation at the following conditions: 1 min at 900 rpm, then 2 min at 1300 rpm.
Изолированные островки ресуспендировали в культуральной среде с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, США) и культивировали одни сутки в стандартных условиях (при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2).Isolated islets were resuspended in a culture medium with 10% fetal calf serum (HyClone, USA) and cultured for one day under standard conditions (at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 ).
Через сутки культивирования островки собирали центрифугированием в течение 2 мин при скорости 1200 об/мин, соединяли с децеллюляризованным матриксом и культивировали до 7 суток в культуральной среде с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, США) в стандартных условиях (при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2).After a day of cultivation, the islets were collected by centrifugation for 2 min at a speed of 1200 rpm, combined with a decellularized matrix and cultured for up to 7 days in a culture medium with 10% fetal calf serum (HyClone, USA) under standard conditions (at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 ).
На фиг.7 представлена световая микрофотография островков Лангерганса с децеллюляризованным матриксом. Ув. × 100.Figure 7 shows a light micrograph of the islets of Langerhans with a decellularized matrix. Uv. × 100.
Для определения функциональной активности островков Лангерганса, культивированных с децеллюляризованным матриксом на 3 сутки инкубации проводили измерение содержания инсулина при стимуляции глюкозой. Ростовую среду заменяли свежей с низким содержанием глюкозы 2,8 ммоль/л и отбирали пробы культуральной среды через 60 минут инкубации в стандартных условиях. Затем удаляли ростовую среду и заменяли свежей с высокой концентрацией глюкозы 25 ммоль/л и отбирали пробы культуральной среды через 60 минут инкубации в стандартных условиях. Концентрацию инсулина в пробах определяли методом иммуноферментного анализа, используя набор ELISA Kit for insulin Human CEA448 Hu-96 (Cloud-Clone Copr., США) согласно инструкции производителя.To determine the functional activity of islets of Langerhans cultured with a decellularized matrix, insulin content was measured upon stimulation with glucose on day 3 of incubation. The growth medium was replaced with fresh one with a low glucose content of 2.8 mmol/L, and samples of the culture medium were taken after 60 minutes of incubation under standard conditions. The growth medium was then removed and replaced with fresh medium containing a high glucose concentration of 25 mmol/L, and the culture medium was sampled after 60 minutes of incubation under standard conditions. The concentration of insulin in the samples was determined by enzyme immunoassay using the ELISA Kit for insulin Human CEA448 Hu-96 (Cloud-Clone Copr., USA) according to the manufacturer's instructions.
Показатели концентраций инсулина до и после стимуляции в пробах составили 48,3±2,8 пкг/мл и 101,4±4,1 пкг/мл соответственно, что подтверждает функциональную активность островков Лангерганса, культивированных с децеллюляризованным матриксом, полученным по заявленному способу.The insulin concentrations before and after stimulation in the samples were 48.3±2.8 pg/ml and 101.4±4.1 pg/ml, respectively, which confirms the functional activity of the islets of Langerhans cultured with the decellularized matrix obtained according to the claimed method.
Claims (10)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2816638C1 true RU2816638C1 (en) | 2024-04-02 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2461622C2 (en) * | 2007-11-28 | 2012-09-20 | Огенодженесис, Инк. | Bioengineered construct for tissue implantation and method for making said bioengineered construct (versions) |
| RU2539918C1 (en) * | 2013-11-29 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ |
| WO2017114902A1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Fundacion Tecnalia Research & Innovation | Method for producing a decellularized tissue matrix |
| RU2653489C2 (en) * | 2016-09-02 | 2018-05-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ "ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России") | Method for obtaining decellularized matrices of parenchymal organs of laboratory animals |
| WO2018127554A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Novahep Ab | Methods of preparing bioengineered or bioprinted organ or tissue, and uses thereof |
| RU2693432C2 (en) * | 2016-11-16 | 2019-07-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymal organ and a method for preparing it |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2461622C2 (en) * | 2007-11-28 | 2012-09-20 | Огенодженесис, Инк. | Bioengineered construct for tissue implantation and method for making said bioengineered construct (versions) |
| RU2539918C1 (en) * | 2013-11-29 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ |
| WO2017114902A1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Fundacion Tecnalia Research & Innovation | Method for producing a decellularized tissue matrix |
| RU2653489C2 (en) * | 2016-09-02 | 2018-05-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ "ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России") | Method for obtaining decellularized matrices of parenchymal organs of laboratory animals |
| RU2693432C2 (en) * | 2016-11-16 | 2019-07-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymal organ and a method for preparing it |
| WO2018127554A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Novahep Ab | Methods of preparing bioengineered or bioprinted organ or tissue, and uses thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101056069B1 (en) | Method for producing porous three-dimensional scaffold using animal tissue powder | |
| CA2419817C (en) | Decellularized tissue engineered constructs and tissues | |
| RU2392287C2 (en) | Matrix, cellular implant and methods of obtainment and application thereof | |
| Parmaksiz et al. | Decellularization of bovine small intestinal submucosa and its use for the healing of a critical‐sized full‐thickness skin defect, alone and in combination with stem cells, in a small rodent model | |
| Spina et al. | Isolation of intact aortic valve scaffolds for heart‐valve bioprostheses: extracellular matrix structure, prevention from calcification, and cell repopulation features | |
| Baiguera et al. | Dynamic decellularization and cross-linking of rat tracheal matrix | |
| CN105963785B (en) | Acellular matrix material based on adipose-derived stem cell membrane and preparation method thereof | |
| EP1698358A1 (en) | Transplantable biomaterial and method of preparing the same | |
| EP2471902B9 (en) | Production of artificial tissues by means of tissue engineering using agarose-fibrin biomaterials | |
| AU729787B2 (en) | Hyaluronic acid derivative based cell culture and biodegradable three-dimensional matrix | |
| AU2001284968A1 (en) | Decellularized tissue engineered constructs and tissues | |
| RU2816638C1 (en) | Method of obtaining decellularized matrix from parenchymal organs for tissue engineering and regenerative medicine | |
| EP4393523A1 (en) | Cellular matrix nerve graft for repairing peripheral nerve injury and preparation method therefor | |
| Zivari‐Ghader et al. | Recent scaffold‐based tissue engineering approaches in premature ovarian failure treatment | |
| Łabuś et al. | Own experience from the use of a substitute of an allogeneic acellular dermal matrix revitalized with in vitro cultured skin cells in clinical practice | |
| Kumar et al. | Extraction techniques for the decellularization of rat dermal constructs | |
| CN114686421B (en) | Preparation method and application of lung tissue extracellular matrix-free microcarrier | |
| RU2716577C1 (en) | Method of producing tissue-specific matrix for tissue engineering of cartilage | |
| CN1294254C (en) | Method for removing cells for heterogeneous cardiovascular transplant | |
| RU2586952C1 (en) | Method of treating hepatic failure | |
| CN114028613A (en) | Functional bone repair composite scaffold, preparation method and application | |
| Fadeeva et al. | Study of Biointegration and Elastic-Strength Properties of a New Xenopericardium-Based Biomaterial for Reconstructive Cardiovascular Surgery. | |
| Macagonova et al. | The effectiveness of the tissue engineering in the obtaining of the biological materials from the extracellular matrix | |
| Sokol et al. | Prospects for application of bovine pericardial scaffold for cardial surgery | |
| KR20110011199A (en) | Dermal substite material of artificial skin for wound healing and method for production thereof |