RU2625882C2 - Сконструированные белки повторов, которые связываются с сывороточным альбумином - Google Patents
Сконструированные белки повторов, которые связываются с сывороточным альбумином Download PDFInfo
- Publication number
- RU2625882C2 RU2625882C2 RU2013128896A RU2013128896A RU2625882C2 RU 2625882 C2 RU2625882 C2 RU 2625882C2 RU 2013128896 A RU2013128896 A RU 2013128896A RU 2013128896 A RU2013128896 A RU 2013128896A RU 2625882 C2 RU2625882 C2 RU 2625882C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- group
- acid residue
- residue selected
- seq
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 150
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 124
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 120
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title description 6
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 claims abstract description 145
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 claims abstract description 145
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 203
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 131
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 130
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 100
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 89
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 83
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 40
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 28
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 27
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 15
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 108700022150 Designed Ankyrin Repeat Proteins Proteins 0.000 description 235
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 111
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 88
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 67
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 64
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 63
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 39
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 description 35
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 24
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 18
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 16
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 16
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 16
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 15
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 10
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 101000920778 Homo sapiens DNA excision repair protein ERCC-8 Proteins 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 8
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 5
- 101000677856 Stenotrophomonas maltophilia (strain K279a) Actin-binding protein Smlt3054 Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 102000048696 human ERCC8 Human genes 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000005258 radioactive decay Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical compound SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000016904 Armadillo Domain Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010014223 Armadillo Domain Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 2
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000289632 Dasypodidae Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 102000005664 GA-Binding Protein Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010045298 GA-Binding Protein Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 2
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KQLXBKWUVBMXEM-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 KQLXBKWUVBMXEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000012624 DNA alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 1
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000000470 PDZ domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008994 PDZ domains Proteins 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101900161471 Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000718541 Tetragastris balsamifera Species 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 108091012373 adenine binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- VIYFPAMJCJLZKD-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 VIYFPAMJCJLZKD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012804 iterative process Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001048 orange dye Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003157 protein complementation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229950001790 tendamistat Drugs 0.000 description 1
- 108010037401 tendamistate Proteins 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N triacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CC(O)=O ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
- C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению новых сконструированных белков со связывающей специфичностью для сывороточного альбумина, что может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают белки, включающие домен анкиринового повтора, а также нуклеиновые кислоты, которые кодируют такие белки и фармацевтические композиции, включающие такие белки для лечения заболеваний. Изобретение позволяет существенно увеличить период полувыведения в плазме крови по сравнению с белками, которые не связывают сывороточный альбумин. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 6 пр.
Description
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к сконструированным белкам повторов со связывающей специфичностью для сывороточного альбумина, а также к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие белки, которые связывают сывороточный альбумин, фармацевтическим композициям, включающим такие белки, применению таких белков для модификации фармакокинетических характеристик биоактивных соединений и к применению таких белков в лечении заболеваний.
Предпосылки создания изобретения
Фармацевтическая промышленность является весьма заинтересованной в повышении эффективности биоактивных соединений, таких как белковые терапевтические агенты, путем модуляции или повышения их фармакокинетических (РК) in vivo свойств. Это, в частности, является правдой для биоактивных соединений, которые быстро выводятся из системы циркуляции путем почечного клиренса. В общем случае почки отфильтровывают из системы циркуляции молекулы, которые имеют средний молекулярный вес ниже 60 кДа. Одна стратегия для улучшения фармакокинетических свойств таких малых биоактивных соединений заключается в простом повышении их среднего молекулярного размера (то есть, повышении их гидродинамического радиуса), например, посредством прибавления небелковых полимерных остатков, таких как полимеры полиэтиленгликоля или остатки сахара, или прибавления белковых полимерных остатков, таких как глобулярные белки или неструктурированные полипептиды, такие как те, что описаны в WO 2007/103515 и WO 2008/155134.
Другие стратегии используют длительный период полувыведения из системы циркуляции сывороточных белков, таких как иммуноглобулины и сывороточный альбумин. Сывороточный альбумин, который имеет молекулярный вес 67 кДа, представляет собой белок, который находится в плазме крови в избыточном количестве и присутствует при концентрации 50 мг/мл (0,6 мМ), а также имеет период полувыведения из сыворотки крови 19 дней у людей. Сывороточный альбумин помогает поддерживать значение рН в плазме крови, осуществляет свой вклад в давление коллоидной крови, функционирует как носитель для многих метаболитов и жирных кислот и служит в качестве основного транспортного белка для лекарственных агентов в плазме крови. Существует несколько основных сайтов связывания малых молекул в альбумине, которые были описаны.
Было показано, что нековалентная ассоциация с сывороточным альбумином может удлинить период полувыведения малых молекул или полипептидов с коротким периодом полураспада (WO 1991/001743). Полипептиды, являющиеся такими, которые специфически связываются с сывороточным альбумином, и которые, таким образом, могут продлевать in vivo период полувыведения других молекул, слитых с ними, включают варианты альбуминсвязывающих доменов (например, WO 2005/097202 и WO 2009/016043), малые пептиды (например, Dennis, M.S., и др., J. Biol. Chem. 277(3), 35035-43, 2002 и WO 2001/045746) и фрагменты иммуноглобулинов (например, WO 2008/043822, WO 2004/003019; WO 2008/043821; WO 2006/040153; WO 2006/122787 и WO 2004/041865). WO 2008/043822 относится к связывающим белкам, отличным от фрагментов иммуноглобулинов, таких как молекулы на основе доменов белка А, тендамистат, фибронектин, липокалин, CTLA-4, рецепторы Т-клеток, сконструированные анкириновые повторы и PDZ домены, которые могут быть получены для специфического связывания с сывороточным альбумином. Тем не менее, WO 2008/043822 не раскрывает ни селекцию доменов сконструированного анкиринового повтора со связывающей специфичностью для сывороточного альбумина (SA), ни конкретных последовательностей мотивов повторяемых доменов, которые специфически связываются с SA. Кроме того, было описано, что in vivo период полувыведения полипептидов может быть удлинен путем их генетического слияния с сывороточным альбумином (например, WO 1991/001743). Такое изменение in vivo периода полураспада лекарственных средств может позитивно изменить их фармакокинетические (РК) и/или фармакодинамические (PD) свойства. В этом заключается ключевая проблема разработки новых и эффективных терапевтических агентов и способов лечения заболеваний. Таким образом, существует потребность в области техники в новых путях изменения РК и/или PD биоактивных соединений.
Кроме антител существуют новые связывающие белки или связывающие домены, которые могут использоваться для специфического связывания с целевой молекулой (например, Binz, H.K., Amstutz, P. и Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). Один такой новый класс связывающих белков или связывающих доменов основывается на сконструированных белковых повторах или сконструированных повторяемых доменах (WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, С., Forrer, P., Grütter, M.G., и Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K и Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008). WO 2002/020565 описывает, как могут быть сконструированы большие библиотеки белковых повторов и их общее применение. Тем не менее, WO 2002/020565 не раскрывает ни селекцию повторяемых доменов со связывающей специфичностью для сывороточного альбумина SA, ни конкретные последовательности мотивов повторяемых доменов, которые специфически связываются с SA. Кроме того, WO 2002/020565 не предполагает, что повторяемые домены со связывающей специфичностью для SA могут использоваться для модуляции РК или PD других молекул. Такие сконструированные повторяемые домены используют модулярную природу белковых повторов и имеют N-терминальные и С-терминальные кэппинг модули для предотвращения агрегации сконструированных повторяемых доменов путем экранирования гидрофобного ядра домена (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, Н.К. и Plückthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003). Эти кэппинг модули основываются на кэппирующих повторах природного гуанин-аденин-связывающего белка (GA-связывающего белка). Было показано, что термальная и термодинамическая стабильность этих доменов сконструированных анкириновых повторов может быть дополнительно повышена путем усовершенствования С-терминального кэппирующего повтора, который имеет происхождение от GA-связывающего белка (Interlandi, G., Wetzel, S.K, Settanni, G., Plückthun, А. и Caflisch, A., J. Mol. Biol. 375, 837-854, 2008; Kramer, M.A, Wetzel, S.K., Plückthun, A., Mittl, P.R.E, и Grütter, M.G., J. Mol. Biol. 404, 381-391, 2010). Авторы вводили в общей сложности восемь мутаций в этот кэппинг модуль и удлиняли его С-терминальную спираль путем прибавления трех различных аминокислот. Тем не менее, введение этих модификаций в С-терминальный кэппинг модуль приводило к тенденции нежелательной димеризации сконструированного повторяемого домена, который несет этот мутированный С-терминальный кэппинг модуль. Таким образом, существует необходимость в получении дополнительных оптимизированных С-терминальных кэппинг модулей или С-терминальных кэппирующих повторов доменов анкиринового повтора.
Нацеливание SA для модуляции РК и/или PD с помощью доступных в настоящее время подходов не всегда является эффективным. При этом также стало более отчетливо видно, что модуляция РК и/или PD молекул путем захвата SA является сложной и все еще не совсем понятной.
В общем случае, существует потребность в улучшенных связывающих белках со специфичностью для SA, способных улучшать РК и/или PD терапевтически релевантных молекул или полипептидов для лечения рака и других патологических состояний.
Техническая проблема, которая лежит в основе настоящего изобретения, заключается в идентификации новых связывающих белков, таких как повторяемые домены, со связывающей специфичностью для SA, способных к модификации РК и/или PD терапевтически релевантных молекул для улучшенного лечения рака и других патологических состояний. Решение этой технической проблемы достигается путем обеспечения воплощений, охарактеризованных в формуле изобретения.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к связывающим белкам, включающим, по крайней мере один домен анкиринового повтора, где указанный домен анкиринового повтора имеет связывающую специфичность для сывороточного альбумина млекопитающих и где указанный домен анкиринового повтора включает модуль анкиринового повтора, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52, а также последовательностей, в которых вплоть до 9 аминокислот SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 являются замененными какой-либо аминокислотой.
В дополнительном воплощении изобретение относится к связывающим белкам, включающим, по крайней мере, один домен анкиринового повтора, где указанный повторяемый домен имеет связывающую специфичность для сывороточного альбумина млекопитающих, и где указанный домен анкиринового повтора включает аминокислотную последовательность, которая имеет, по крайней мере, 70%-ную идентичность аминокислотной последовательности с одним доменом анкиринового повтора, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-31 и 43-48, где G в положении 1 и/или S в положении 2 указанного домена анкиринового повтора являются необязательно отсутствующими.
В частности, изобретение относится к связывающим белкам, как определяется в данной заявке выше, где домен анкиринового повтора конкурирует за связывание с сывороточным альбумином млекопитающих с доменом анкиринового повтора, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-31 и 43-48.
Кроме того, изобретение относится к таким связывающим белкам, включающим биоактивное соединение, в частности, к связывающим белкам, включающим биоактивное соединение, которое обладает, по крайней мере, в два раза более высоким конечным периодом полувыведения у млекопитающего по сравнению с конечным периодом полувыведения указанного немодифицированного биоактивного соединения.
Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют связывающие белки в соответствии с настоящим изобретением, и к фармацевтической композиции, включающей один или или более упомянутых выше связывающих белков или молекул нуклеиновой кислоты.
Изобретение также относится к способу лечения патологического состояния при использовании связывающих белков в соответствии с изобретением.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Анализ стабильности выбранных DARPin с помощью SEC.
Профили элюирования прогонов эксклюзионной хроматографии размеров (SEC) DARPin со специфичностью для xSA перед инкубацией (Фиг.1а), после инкубации при концентрации 30 мг/мл (~2 мМ) в PBS в течение 28 дней при 40°С (Фиг.1b) или после хранения в течение 1 месяца при -80°С (Фиг.1с), проанализированные с помощью Superdex 200 колонки 5/150 (Фиг.1а или Фиг.1b), или с помощью колонки Superdex 200 10/300GL (Фиг.1с). Все образцы подвергали экспрессии и очищали так, как описано в Примере 1. Для проведения SEC анализа образцы разводили до концентрации 500 мкМ. Стандарты молекулярной массы Апротинин (АР) 6,5 кДа, Карбоангидраза (СА) 29 кДа и Кональбумин (СО) 75 кДа обозначены стрелками.
xSA, сывороточный альбумин млекопитающих, А, поглощение при 280 нм; t, время удержания в минутах;
DARPin #19 (SEQ ID NO: 19 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #20 (SEQ ID NO: 20 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #21 (SEQ ID NO: 21 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #22 (SEQ ID NO: 22 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #27 (SEQ ID NO: 27 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #28 (SEQ ID NO: 28 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #29 (SEQ ID NO: 29 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #30 (SEQ ID NO: 30 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
DARPin #43 (SEQ ID NO: 43 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
DARPin #44 (SEQ ID NO: 44 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
DARPin #45 (SEQ ID NO: 45 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
DARPin #46 (SEQ ID NO: 46 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
DARPin #47 (SEQ ID NO: 47 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
DARPin #48 (SEQ ID NO: 48 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
Фигура 2. Термальная стабильность выбранных DARPin.
Запись для термальной денатурации DARPin со специфичностью для xSA (которая сопровождается повышением интенсивности флуоресценции красителя SYPRO оранжевого, присутствующего в буфере) в PBS при значении рН 7,4 (Фиг.2а) и в MES буфере при значении рН 5,8 (Фиг.2b) (250 мМ (2-N-морфолино)этансульфоновая кислота рН 5,5), 150 мМ NaCl, смешанный с PBS рН 7,4 1 к 4 (об./об.) и доведенный до значения рН 5,8).
F, относительные единицы флуоресценции (RFU), возбуждение при 515-535 нм, определение при 560-580 нм; Т, температура в °С; определение DARPin смотри выше.
Фигура 3. Выведение выбранных DARPin из плазмы крови у мышей.
Выведение из плазмы крови DARPin со специфичностью для MSA (мышиный сывороточный альбумин) и контрольных DARPin оценивали у мышей.
(Фиг.3а) DARPin, включающие только один повторяемый домен со связывающей специфичностью для MSA по сравнению с DARPin #32 (смотри ниже), не имеющим связывающей специфичности для MSA.
(Фиг.3b) DARPin, включающие два белковых домена (один из которых представляет собой повторяемый домен со связывающей специфичностью для MSA) по сравнению с DARPin #32, не имеющим связывающей специфичности для MSA.
DARPin метили с помощью His-Tag при использовании соединения 99mTc-карбонил и вводили внутривенно мышам. Радиоактивность у мышей, которым делали инъекцию, измеряли в различные моменты времени после инъекции и представляли в виде соотношения инъецируемой дозы, скорректированной для радиоактивного распада 99mTc (% ID). Апроксимированные кривые нелинейных регрессий радиоактивности, измеренной в различные моменты времени - двухфазный распад (Graphpad Prism). Каждая точка данных показывает среднее значение двух мышей на группу.
% ID, процент введенной дозы, скорректированный для радиоактивного распада 99mTc; t, время в часах;
DARPin #18 (SEQ ID NO: 18 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #23 (SEQ ID NO: 23 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #25 (SEQ ID NO: 25 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #32 (негативный контроль DARPin без связывающей специфичности по отношению к xSA, SEQ ID NO: 32 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #33 (DARPin, включающий два домена повтора, один со связывающей специфичностью для xSA, SEQ ID NO: 33 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #35 (DARPin, включающий два домена повтора, один со связывающей специфичностью для xSA, SEQ ID NO: 35 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #36 (DARPin, включающий два домена повтора, один со связывающей специфичностью для xSA, SEQ ID NO: 36 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
Фигура 4. Выведение выбранных DARPin из плазмы крови у обезьян циномолгус.
Выведение DARPin со специфичностью для CSA (сывороточный альбумин обезьян циномолгус) и контрольных DARPin из плазмы крови оценивали у обезьян циномолгус.
(Фиг.4а) DARPin #26 сравнивали с DARPin #32, не имеющим связывающей специфичности по отношению к CSA.
(Фиг.4b) DARPin #24, 34 и 17 сравнивали с DARPin #32, не имеющим связывающей специфичности по отношению к CSA. Следующие DARPin внутривенно вводили обезьянам циномолгус в момент времени t=0 часов в концентрации 0,5 мг/мл (DARPin #26, DARPin #24, DARPin #17 и DARPin #32) или 1 мг/мл (DARPin #34): Концентрацию DARPin в плазме крови обезьян измеряли с помощью ELISA в различные моменты времени после инъекции. Кривые показывают результат нелинейных регрессий концентраций, измеренных в различные моменты времени - двухфазный распад (Graphpad Prism). Из второй фазы может быть определен конечный период полувыведения DARPin. Каждая единичная точка данных указывает среднее значение двух независимых измерений ELISA того же образца сыворотки.
С, концентрация DARPin в нМ; t, время в часах;
DARPin #17 (SEQ ID NO: 17 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #24 (SEQ ID NO: 24 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #26 (SEQ ID NO: 26 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #32 (негативный контроль DARPin без связывающей специфичности по отношению к xSA, SEQ ID NO: 32 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом);
DARPin #34 (DARPin, включающий два домена повтора, один со связывающей специфичностью для xSA, SEQ ID NO: 34 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом).
Подробное описание изобретения
Связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для сывороточного альбумина млекопитающих (xSA). Предпочтительно, связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для сывороточного альбумина, который имеет происхождение от мышей, крыс, собак, кролей, обезьян или человека. Более предпочтительно, связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для сывороточного альбумина человеческого происхождения (HSA).
Термин "белок" относится к полипептиду, в котором, по крайней мере, часть полипептида имеет, или обладает способностью приобретать определенное пространственное расположение путем формирования вторичных, третичных или четвертичных структур в пределах полипептидного(ых) цепи(ей) и/или между ними. В том случае, если белок включает два или более полипептидов, то индивидуальные полипептидные цепи могут быть связаны нековалентно или ковалентно, например, с помощью дисульфидной связи между двумя полипептидами. Часть белка, которая индивидуально имеет или обладает способностью приобретать определенное пространственное расположение путем формирования вторичных или третичных структур, называется "белковым доменом". Такие белковые домены являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники.
Термин "рекомбинантный", как используется в словосочетании рекомбинантный белок, рекомбинантный белковый домен, рекомбинантный связывающий белок и тому подобное, означает, что указанные полипептиды получают с помощью методик рекомбинантной ДНК, хорошо известных квалифицированному специалисту в релевантной области техники. Например, рекомбинантная молекула ДНК (например, полученная с помощью синтеза генов), которая кодирует полипептид, может быть клонирована в бактериальную экспрессионную плазмиду (например, pQE30, Qiagen), дрожжевую экспрессионную плазмиду или экспрессионную плазмиду млекопитающих. Когда, например, такая сконструированная рекомбинантная бактериальная экспрессионная плазмида встраивается в приемлемую бактерию (например, Escherichia coli), эта бактерия может продуцировать полипептид, который кодируется этой рекомбинантной ДНК. Соответствующим образом полученный полипептид называется рекомбинантным полипептидом.
В контексте настоящего изобретения термин "полипептид" относится к молекуле, которая состоит из одной или более цепей многочисленных, то есть, из двух или более, аминокислот, связанных с помощью пептидных связей. Предпочтительно, полипептид состоит из более, чем восемь аминокислот, связанных с помощью пептидных связей.
Термин "полипептидная метка" относится к аминокислотной последовательности, которая присоединяется к полипептиду/белку, где указанная аминокислотная последовательность является полезной для очистки, определения или мечения указанного полипептида/белка, или где указанная аминокислотная последовательность улучшает физико-химическое поведение полипептида/белка, или где указанная аминокислотная последовательность обладает эффекторной функцией. Индивидуальные полипептидные метки, остатки и/или домены связывающего белка могут быть связаны друг с другом непосредственно или с помощью полипептидных линкеров. Эти полипептидные метки являются хорошо известными в области техники и полностью доступны квалифицированному специалисту в данной области техники. Примеры полипептидных меток представляют собой малые полипептидные последовательности, например, His (например, His-метка последовательности SEQ ID NO: 15), myc, FLAG или Strep-метки или остатки, такие как ферменты (например, ферменты, подобные щелочной фосфатазе), которые позволяют осуществлять определение указанного полипептида/белка, или остатки, которые могут использоваться для мечения (такие как иммуноглобулины или их фрагменты) и/или в качестве эффекторных молекул.
Термин "полипептидный линкер" относится к аминокислотной последовательности, которая является способной к связыванию, например, двух белковых доменов, полипептидной метки и белкового домена, белкового домена и остатка, отличного от полипептида, такого как полиэтиленгликоль или двух последовательностей метки. Такие дополнительные домены, метки, остатки, отличные от полипептидов, и линкеры являются хорошо известными квалифицированному специалисту в релевантной области техники. Список примеров обеспечивается в описании к патентной заявке WO 2002/020565. Частные примеры таких линкеров представляют собой глицин-серин линкеры и пролин-треонин линкеры варьирующей длины; является предпочтительным, когда указанные линкеры имеют длину от 2 до 24 аминокислот; более предпочтительно, когда указанные линкеры имеют длину от 2 до 16 аминокислот. Пример глицин-серин линкера обеспечивается в SEQ ID NO: 16.
Термин "полимерный остаток" относится либо к остатку белкового полимера, либо к остатку небелкового полимера. Термин "остаток белкового полимера" предпочтительно представляет собой полипептид, который не формирует стабильной третичной структуры не более чем в 10%, предпочтительно, не более чем в 5%; также предпочтительно не более чем в 2%; даже более предпочтительно, не более чем в 1%; и наиболее предпочтительно, в неспособных к определению количествах, как определяется с помощью эксклюзионной хроматографии размеров (SEC), олигомеров или агрегатов при хранении в концентрации приблизительно 0,1 мМ в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) при комнатной температуре (RT) в течение одного месяца. Такие белковые полимерные остатки разгоняют при среднем молекулярном весе в SEC, который является выше, чем их эффективный молекулярный вес при использовании глобулярных белков в качестве стандартов молекулярного веса для SEC. Предпочтительно, когда средний молекулярный вес указанных белковых полимерных остатков, определяемый с помощью SEC, является в 1,5 раза, 2 раза или 2,5 раза выше, чем их эффективный молекулярный вес, подсчитанный из их аминокислотной последовательности. Также является предпочтительным, когда средние молекулярные массы указанных небелковых полимерных остатков, определенные с помощью SEC, являются в 2 раза, 4 раза или 8 раз выше, чем их эффективный молекулярный вес, подсчитанный из их молекулярного состава. Предпочтительно, когда более чем 50%, 70% или даже 90% аминокислот указанных остаток белкового полимера не формируют стабильных вторичных структур при концентрации приблизительно 0,1 мМ в PBS при комнатной температуре, как определяется с помощью измерений циркулярного дихроизма (CD). Наиболее предпочтительно, когда указанный белковый полимер демонстрирует типичный спектр циркулярного дихроизма вблизи УФ статистической спиральной конформации. Такие CD являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Также предпочтительными являются остатки белковых полимеров, которые состоят более чем из 50, предпочтительно более чем из 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, или наиболее предпочтительно более чем из 800 аминокислот. Примеры белковых полимерных остатков представляют собой XTEN® (зарегистрированный товарный знак Amunix; WO 2007/103515) полипептиды или полипептиды, включающие остатки пролина, аланина и серина, как описывается в WO 2008/155134. Такие белковые полимерные остатки могут быть ковалентно присоединены, например, к связывающему домену в соответствии с изобретением, путем получения полипептидов генетическим слиянием при использовании стандартных методик клонирования ДНК, после чего осуществляют их стандартную экспрессию и очистку.
Полимерный остаток в соответствии с изобретением может варьировать в широких пределах по своей молекулярной массе (то есть, от приблизительно 1 кДа до приблизительно 150 кДа). Предпочтительно, полимерный остаток имеет молекулярный вес, по крайней мере, 2, более предпочтительно, по крайней мере, 5, 10, 20, 30, 50, 70, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, 100 кДа. Предпочтительно, когда указанный полимерный остаток соединяется с помощью полипептидного линкера со связывающим доменом.
Примеры небелковых полимерных остатков представляют собой гидроксиэтил крахмал (HES), полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль или полиоксиалкилен. Термин "ПЭГилированный" означает, что остаток ПЭГ является ковалентно присоединенным, например, к полипептиду в соответствии с изобретением.
В специфическом воплощении остаток ПЭГ или любого другого небелкового полимера может, например, может быть слитым с тиолом цистеина с помощью малеимидного линкера, при этом цистеин является слитым с помощью пептидного линкера с N- или С-терминальным концом связывающего домена, как описывается в данной заявке.
Термин "связывающий белок" относится к белку, включающему один или более связывающих доменов, одно или более биоактивных соединений и один или более полимерных остатков, как дополнительно объясняется ниже. Предпочтительно, когда указанный связывающий белок включает вплоть до четырех связывающих доменов. Более предпочтительно, когда указанный связывающий белок включает вплоть до двух связывающих доменов. Наиболее предпочтительно, когда указанный связывающий белок включает только один связывающий домен. Кроме того, любой такой связывающий белок может включать дополнительные белковые домены, которые не являются связывающими доменами, остатки мультимеризации, полипептидные метки, полипептидные линкеры и/или единичный остаток Cys. Примеры остатков мультимеризации представляют собой константные участки тяжелой цепи иммуноглобулина, которые спариваются с обеспечением функциональных Fc доменов иммуноглобулина, и лейциновые "застежки" или полипептиды, включающие свободный тиол, который образует межмолекулярную дисульфидную связь между двумя такими полипептидами. Единичный остаток Cys может использоваться для конъюгации других остатков к полипептиду, например, путем использования малеимидной связи, которая является хорошо известной квалифицированному специалисту в данной области техники. Предпочтительно, когда указанный связывающий белок представляет собой рекомбинантный связывающий белок. Также является предпочтительным, когда связывающие домены связывающего белка обладают различными целевыми специфичностями.
Термин "связывающий домен" означает белковый домен, который демонстрирует такую же сборку (пространственное размещение), что и белковый каркас и обладает предварительно определенным свойством, как определяется ниже. Такой связывающий домен может быть получен с помощью целесообразных, или в наиболее общем случае, комбинаторных методик конструирования белка, методов, которые являются известными в области техники (Binz и др., 2005, в приведенном выше месте). Например, связывающий домен, имеющий предварительно определенное свойство, может быть получен с помощью способа, включающего этапы (а) обеспечения разнообразной коллекции белковых доменов, которые демонстрируют такую же сборку, что и белковый каркас, как определено дополнительно ниже; и (b) скрининга указанной разнообразной коллекции и/или селекции из указанной разнообразной коллекции для получения, по крайней мере, одного белкового домена, обладающего указанным предварительно определенным свойством. Разнообразная коллекция белковых доменов может обеспечиваться с помощью нескольких способов в соответствии с используемой системой скрининга и/или селекции и может включать применение способов, хорошо известных квалифицированному специалисту в данной области техники, таких как фаговый дисплей или рибосомальный дисплей. Предпочтительно, указанный связывающий домен представляет собой рекомбинантный связывающий домен.
Термин "белковый каркас" означает белок с внешними участками, в которых аминокислотные инсерции, замены или делеции являются в высокой степени допустимыми. Примеры белковых каркасов, которые могут использоваться для получения связывающих доменов настоящего изобретения, представляют собой антитела или их фрагменты, такие как одноцепочечные Fv или Fab фрагменты, белок А из Staphylococcus aureus, связывающий билин белок из Pieris brassicae или другие липокалины, белки анкириновых повторов или другие повторяемые белки, а также человеческий фибронектин. Белковые каркасы являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники (Binz и др., 2005, в приведенном выше месте; Binz и др., 2004, в приведенном выше месте).
Термин "предварительно определенное свойство" относится к свойству, такому как, связывание с мишенью, блокирование мишени, активация опосредованной мишенью реакции, ферментативная активность и другие близкие свойства. В зависимости от типа желаемого свойства, средний специалист в данной области техники будет способен идентифицировать формат и необходимые этапы для осуществления скрининга и/или селекции связывающего домена с желаемым свойством. Предпочтительно, указанное предварительно определенное свойство представляет собой связывание с мишенью.
Определения, приведенные в данной заявке ниже для белков повторов, основываются на таких, которые описаны в патентной заявке WO 2002/020565. Патентная заявка WO 2002/020565 дополнительно содержит общее описание характеристик белковых повторов, методик и применений.
Термин "повторяемый белок" относится к белкам, включающим один или более повторяемых доменов. Предпочтительно, каждый указанный белок повторов включает вплоть до четырех повторяемых доменов. Более предпочтительно, когда каждый указанный белок повторов включает вплоть до двух повторяемых доменов. Наиболее предпочтительно, когда каждый указанный повторяемый белок включает только один повторяемый домен. Кроме того, указанный белок повторов может включать дополнительные небелковые повторяемые домены, полипептидные метки и/или полипептидные линкеры.
Термин "повторяемый домен" относится к белковым доменам, включающим две или более последовательных повторяемых единиц (модулей) в качестве структурных единиц, где указанные структурные единицы имеют такую же сборку и плотно упаковываются с образованием, например, сферической структуры, имеющей соединительное гидрофобное ядро. Предпочтительно, повторяемый домен дополнительно включает N-терминальную и/или С-терминальную кэппирующую единицу (или модуль). Даже более предпочтительно, когда указанные N-терминальные и/или С-терминальные кэппирующие единицы (или модули) представляют собой кэппирующие повторы.
Термин "сконструированные повторяемый белок" и "сконструированный повторяемый домен" относится к повторяемому белку или повторяемому домену, соответственно, полученному в результате изобретательской процедуры, которая объясняется в патентной заявке WO 2002/020565. Сконструированные повторяемые белки и сконструированные повторяемые домены являются синтетическими, а не природными. Они могут представлять собой созданные человеком белки или домены, соответственно, полученные путем экспрессии соответственным образом сконструированных нуклеиновых кислот. Предпочтительно, экспрессию осуществляют в прокариотических или эукариотических клетках, таких как бактериальные клетки, или путем использования бесклеточной экспрессионной системы in vitro. В соответствии с этим, сконструированный белок с анкириновым повтором (то есть, DARPin) соответствует связывающему белку в соответствии с изобретением, включающему, по крайней мере, один домен анкиринового повтора.
Термин "структурная единица" относится к локально упорядоченной части полипептида, образованной пространственными взаимодействиями между двумя или более сегментами вторичной структуры, которые находятся рядом друг с другом в полипептидной цепи. Такая структурная единица демонстрирует структурный мотив. Термин "структурный мотив" относится к пространственному расположению элементов вторичной структуры, присутствующих, по крайней мере, в одной структурной единице. Структурные мотивы являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Структурные единицы, взятые отдельно, не являются способными приобретать определенное пространственное расположение; однако их последовательное расположение, например, в виде повторяемых модулей в повторяемом домене, приводит к взаимной стабилизации соседних единиц, что вызывает образование сферической структуры.
Термин "повторяемая единица" относится к аминокислотной последовательности, включающей мотивы повторяемой последовательности одного или более существующих в природе повторяемых белков, где указанные "повторяемые единицы" обнаруживаются во множественных копиях, и которые демонстрируют определенную топологию сборки, общую для всех указанных мотивов, определяющих сборку этого белка. Такие повторяемые единицы соответствуют "повторяемым структурным единицам (повторам)" повторяемых белков, как описывается Forrer и др., 2003, в приведенном выше месте, или "последовательным структурным единицам (повторам)" повторяемых белков, как описывается Binz и др., 2004, в приведенном выше месте. Такие повторяемые единицы включают каркасные остатки и остатки взаимодействия. Примеры таких повторяемых единиц представляют собой повторяемые единицы армадилло, обогащенные лейцином повторяемые единицы, единицы анкиринового повтора, повторяемые единицы тетратрикопептида, повторяемые единицы HEAT и вариантные повторяемые единицы, обогащенные лейцином. Существующие в природе белки, содержащие две или более таких повторяемых единиц, называются "существующими в природе повторяемыми белками". Аминокислотные последовательности индивидуальных повторяемых единиц повторяемых белков могут иметь значительное количество мутаций, замен, инсерций и/или делеций по сравнению с каждым другим, в то время как все еще существенно сохраняют общую модель, или мотив повторяемой единицы.
Термин "единица анкиринового повтора" будет означать повторяемую единицу, которая представляет собой анкириновый повтор, как описывается, например, Forrer и др., 2003, в приведенном выше месте. Анкириновые повторы являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники.
Термин "каркасные участки" относится к аминокислотным остаткам повторяемой единицы, или соответствующим аминокислотным остаткам повторяемых модулей, которые осуществляют свой вклад в топологию сборки, то есть те, которые осуществляют свой вклад в сборку указанной повторяемой единицы (или модуля), или те, которые осуществляют свой вклад во взаимодействие с соседней единицей (или модулем). Такой вклад может представлять собой взаимодействие с другими остатками в повторяемой единице (или модуле), или влияние на конформацию полипептидного скелета, как обнаруживается в α-спиралях или β-складках, или аминокислотных цепочках, которые формируют линейные полипептиды или петли.
Термин "целевые остатки взаимодействия" относится к аминокислотным остаткам повторяемой единицы, или к соответствующим аминокислотным остаткам повторяемых модулей, которые осуществляют свой вклад во взаимодействие с целевыми веществами. Такой вклад может представлять собой непосредственное взаимодействие с целевыми веществами, или влияние на другие непосредственно взаимодействующие остатки, например, путем стабилизации конформации полипептида повторяемой единицы (или модуля) для того, чтобы позволить осуществить или улучшить взаимодействие непосредственно взаимодействующих остатков с указанной целью. Такие каркасные остатки и целевые остатки взаимодействия могут быть идентифицированы с помощью анализа структурных данных, полученных с помощью физико-химических методов, таких как рентгеноструктурная кристаллография, ЯМР и/или спектроскопия циркулярного дихроизма, или путем сравнения с известной и близкой структурной информацией, которая является хорошо известной практикующим специалистам в структурной биологии и/или биоинформатике.
Предпочтительно, когда повторяемые единицы, используемые для дедукции мотива повторяемой последовательности, являются гомологичными повторяемыми единицам, где повторяемые единицы включают тот же структурный мотив и в которых более чем 70% каркасных участков указанных повторяемых единиц являются гомологичными друг другу. Предпочтительно, более чем 80% каркасных участков указанных повторяемых единиц являются гомологичными. Наиболее предпочтительно, когда более чем 90% каркасных участков указанных повторяемых единиц являются гомологичными.
Компьютерные программы для определения процента гомологии между полипептидами, такие как Fasta, Blast или Gap, являются известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Также является предпочтительным, когда повторяемые единицы, используемые для дедукции мотива повторяемой последовательности, являются гомологичными повторяемыми единицам, полученным из повторяемых доменов, отобранных на мишени, например, так, как описывается в Примере 1, и имеют такую же целевую специфичность.
Термин "мотив повторяемой последовательности" относится к аминокислотной последовательности, которая выводится из одной или более повторяемых единиц или повторяемых модулей. Предпочтительно, когда указанные повторяемые единицы или повторяемые модули являются такими из повторяемых доменов, имеющих связывающую специфичность для той же мишени. Такой мотив повторяемых последовательностей включает положения остатков каркасного участка и положения остатков целевого взаимодействия. Указанные положения остатков каркасного участка соответствуют положениям каркасных участков повторяемых единиц (или модулей). Подобно этому, указанные положения остатков целевого взаимодействия соответствуют положениям остатков целевого взаимодействия повторяемых единиц (или модулей). Мотив повторяемых последовательностей включает фиксированные положения и случайные положения. Термин "фиксированное положение" относится к аминокислотному положению в мотиве повторяемой последовательности, где указанное положение принимается за определенную аминокислоту. Наиболее часто, такие фиксированные положения соответствуют положениям каркасных участков и/или положениям остатков целевого взаимодействия, которые являются специфическими для определенной мишени. Термин "рандомизированное положение" относится к аминокислотному положению в мотиве повторяемой последовательности, в котором две или более аминокислот допускаются в указанном аминокислотном положении, например, в котором допускаются любые из обычных двадцати существующих в природе аминокислот, или в котором допускаются более двадцати существующих в природе аминокислот, таких, как аминокислоты, отличные от цистеина, или аминокислоты, отличные от глицина, цистеина и пролина. Наиболее часто, такие рандмизированные положения соответствуют положениям остатков целевого взаимодействия. Однако некоторые положения каркасных участков также могут быть рандомизированы.
Термин "топология сборки" относится к третичной структуре указанных повторяемых единиц или повторяемых модулей. Топология сборки будет определяться цепочками аминокислот, формирующими, по крайней мере, части α-спиралей или β-складок, или цепочками аминокислот, формирующими линейные полипептиды или петли, или любой комбинацией α-спиралей, β-складок и/или линейных полипептидов/петель.
Термин "последовательный" относится к размещению, в котором повторяемые единицы или повторяемые модули размещаются последовательно друг за другом. В сконструированных повторяемых белках, существует, по крайней мере, 2, обычно приблизительно от 2 до 6, в частности, по крайней мере, приблизительно 6, часто 20 или более повторяемых единиц (или модулей). В большинстве случаев повторяемые единицы (или модули) повторяемого домена будут демонстрировать высокую степень идентичности последовательности (одинаковые аминокислотные остатки в соответствующих положениях) или подобия последовательности (аминокислотные остатки являются различными, но имеют подобные физико-химические свойства), и некоторые из аминокислотных остатков могут представлять собой ключевые остатки, которые являются строго консервативными. Однако высокая степень вариабельности последовательности благодаря аминокислотным инсерциям и/или делециям, и/или заменам между различными повторяемыми единицами (или модулями) повторяемого домена может быть возможной при условии, что поддерживается общая топология сборки повторяемых единиц (или модулей).
Способы непосредственного определения топологии сборки белков повторов при использовании физико-химических средств, таких как рентгеновская кристаллография, ЯМР или спектроскопия циркулярного дихроизма, являются хорошо известными практикующему специалисту в данной области техники. Способы идентификации и определения повторяемых единиц или мотивов повторяемых последовательностей или идентификации семейств родственных белков, включающих такие повторяемые единицы или мотивы, такие, как поиски гомологии (BLAST и т.д.), являются хорошо установленными в области биоинформатики и хорошо известны практикующему специалисту в данной области техники. Этап уточнения исходного мотива повторяемой последовательности может включать итеративный процесс.
Термин "повторяемые модули" относится к повторяемой аминокислотной последовательности сконструированных повторяемых доменов, которые исходно имеют происхождение от повторяемой единицы существующих в природе повторяемых белков. Каждый повторяемый модуль, который содержится в повторяемом домене, имеет происхождение от одной или более повторяемых единиц семейства или подсемейства существующих в природе повторяемых белков, например, семейства белковых повторов армадилло или белков с анкириновым повтором.
"Повторяемые модули" могут включать положения с аминокислотными остатками, присутствующими во всех копиях соответствующих повторяемых модулей ("фиксированные положения"), и положения с отличающимися или "рандомизированными" аминокислотными остатками ("рандомизированные положения").
Связывающий белок в соответствии с изобретением включает, по крайней мере один домен анкиринового повтора, где указанный повторяемый домена имеет связывающую специфичность для сывороточного альбумина млекопитающих (xSA).
Термины "имеет связывающую специфичность для мишени", "которые специфически связываются с мишенью" или "целевая специфичность" и тому подобные означают, что связывающий белок или связывающий домен связываются в PBS с мишенью с более низкой константой диссоциации, чем с неродственным белком, например, таким как связывающий мальтозу белок Е.coli (МВР). Предпочтительно, когда константа диссоциации в PBS для мишени является, по крайней мере в 10, более предпочтительно в 102, даже более предпочтительно в 103, или наиболее предпочтительно в 104 раз ниже, чем соответствующая константа диссоциации для МВР.
Связывающий белок в соответствии с изобретением не является антителом или его фрагментом, таким как Fab или scFv фрагменты. Антитела и их фрагменты являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники.
Кроме того, связывающий домен в соответствии с изобретением не включает специфической укладки цепи иммуноглобулинов, которая присутствует в антителах и/или домене фибронектина типа III. Специфическая укладка цепи иммуноглобулинов является общей для всех - это β-укладка белков, которая состоит из приблизительно 7 параллельных β-цепей, размещенных в двух β-складках. Укладки иммуноглобулинов являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Например, такие связывающие домены, включающие иммуноглобулиновую укладку, описываются в WO 2007/080392 или WO 2008/097497.
В частности, изобретение относится к связывающему белку, включающему, по крайней мере, один домен анкиринового повтора, где указанный домен анкиринового повтора имеет связывающую специфичность для сывороточного альбумина млекопитающих и где указанный домен анкиринового повтора включает модуль анкиринового повтора, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 и последовательностей, в которых вплоть до 9 аминокислот в SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 являются замененными какой-либо аминокислотой.
Предпочтительно, когда вплоть до 8 аминокислот в SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 заменены другой аминокислотой, более предпочтительно вплоть до 7 аминокислот, более предпочтительно вплоть до 6 аминокислот, более предпочтительно вплоть до 5 аминокислот, даже более предпочтительно вплоть до 4 аминокислот, более предпочтительно вплоть до 3 аминокислот, более предпочтительно вплоть до 2 аминокислот, более предпочтительно вплоть до 1 аминокислоты, и наиболее предпочтительно ни одна аминокислота в SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 не является замененной.
Предпочтительно, когда аминокислоты заменяются в SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52, эти аминокислоты являются выбранными из группы, состоящей из A, D, Е, F, Н, I, К, L, M, N, Q, R, S, Т, V, W и Y; более предпочтительно из группы, состоящей из А, D, Е, Н, I, К, L, Q, R, S, Т, V и Y. Также предпочтительно, когда замещение аминокислоты гомологичной аминокислотой; то есть, аминокислота заменяется аминокислотой, которая имеет боковую цепь с подобными биофизическими свойствами. Например, негативно заряженная аминокислота D может быть заменена негативно заряженной аминокислотой Е, или гидрофобная аминокислота, такая как L, может быть заменена А, I или V. Замещение аминокислоты гомологичной аминокислотой является хорошо известным квалифицированному специалисту в данной области техники.
Предпочтительный связывающий белок включает, по крайней мере, один домен анкиринового повтора, где указанный повторяемый домен связывает xSA с константой диссоциации (Kd) в PBS ниже 10-4 М. Предпочтительно, указанный повторяемый домен связывает xSA с Kd в PBS ниже 10-4 М, более предпочтительно ниже 10-5 М, 10-6 М, 10-7 М, или наиболее предпочтительно 10-8 М.
Способы определения констант диссоциации белок-белковых взаимодействий, такие как методики, которые основываются на поверхностном плазменном резонансе (SPR) (например, SPR равновесный анализ) или изотермическая титрационная калориметрия (ITC), являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Измеренные значения Kd конкретного белок-белкового взаимодействия могут варьировать, если измеряются при различных условиях (например, концентрации соли, рН). Таким образом, измерение значений Kd предпочтительно осуществляют при использовании стандартизированных растворов белка и стандартизированного буфера, такого как PBS.
Связывающие белки, включающие домен анкиринового повтора, которые связывают xSA со значением Kd PBS ниже 10-4 М, являются показанными в разделе Примеры.
Домен анкиринового повтора связывающего белка в соответствии с изобретением связывает xSA. Предпочтительным является связывающий белок, включающий домен анкиринового повтора, который связывает человеческий сывороточный альбумин (HSA).
Также предпочтительным является связывающий домен, включающий от 70 до 300 аминокислот, в частности, от 100 до 200 аминокислот.
Также предпочтительным является связывающий белок или связывающий домен, в котором отсутствуют свободный Cys остаток. "Свободный Cys остаток" не вовлекается в образование дисульфидной связи. Даже более предпочтительным является связывающий белок или связывающий домен, который не содержит никакого Cys остатка.
Связывающий домен в соответствии с изобретением представляет собой домен анкиринового повтора или сконструированный домен анкиринового повтора (Binz и др., 2004, в приведенном выше месте), предпочтительно такой, как описывается в WO 2002/020565. Примеры сконструированных доменов анкиринового повтора являются показанными в разделе Примеры.
В дополнительном воплощении изобретение относится к связывающему белку, включающему, по крайней мере, один домен анкиринового повтора, где указанный повторяемый домен имеет связывающую специфичность для сывороточного альбумина млекопитающих и где указанный домен анкиринового повтора включает аминокислотную последовательность, которая имеет, по крайней мере, 70%-ную идентичность аминокислотной последовательности с одним доменом анкиринового повтора, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 17-31 и 43-48, в котором G в положении 1 и/или S в положении 2 указанного домена анкиринового повтора являются необязательно отсутствующими.
Предпочтительно, когда такой домен анкиринового повтора в связывающем белке в соответствии с изобретением включает аминокислотную последовательность, которая имеет, по крайней мере, 70% идентичности с аминокислотной последовательностью с одним доменом анкиринового повтора, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 27 и 46; предпочтительно 27 и 46. Как определяется выше, указанный домен анкиринового повтора связывает xSA с константой диссоциации (Kd) в PBS ниже 10-4 М. Предпочтительно, указанный повторяемый домен связывает xSA с Kd в PBS ниже 10-4 М, более предпочтительно ниже 10-5 М, 10-6 М, 10-7 М, или наиболее предпочтительно 10-8 М.
Предпочтительно, такой домен анкиринового повтора в связывающием белке в соответствии с изобретением включает аминокислотную последовательность, которая имеет, по крайней мере, 70% идентичности с аминокислотной последовательностью с "рандомизированной повторяемой единицей" рандомизированными положениями" в домене анкиринового повтора, выбранном из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 17-31 и 43-48.
Предпочтительно, вместо 70%-ной идентичности аминокислотной последовательности такой домен анкиринового повтора в связывающем белке в соответствии с изобретением включает аминокислотную последовательность, которая имеет, по крайней мере, 75%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 85%, более предпочтительно, по крайней мере, 90%, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% идентичности аминокислотной последовательности.
В частном воплощении связывающий белок со связывающей специфичностью для сывороточного альбумина млекопитающих, который характеризуется замещением вплоть до 9 аминокислот в модулях анкиринового повтора последовательности SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52, или характеризуется, по крайней мере, 70% идентичности аминокислотной последовательности с одним доменом анкиринового повтора, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-31 и 43-48, имеет, по крайней мере, в 5 раз более высокий конечный период полувыведения у млекопитающего по сравнению с соответствующими связывающими белками, которые не связываются с сывороточным альбумином млекопитающих, например, доменом анкиринового повтора последовательности SEQ ID NO: 32. В таком предпочтительном связывающем белке минимальный конечный период полувыведения у человека составляет, по крайней мере, 1 день, более предпочтительно, по крайней мере, 3 дня, даже более предпочтительно, по крайней мере, 5 дней.
В дополнительном воплощении изобретение относится к связывающему белку, где указанный домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора
X1DX2X3X4X5TPLHLAAX6X7GHLX8IVEVLLKX9GADVNA (SEQ ID NO: 53)
в котором X1, X2, Х3, Х4, X5, Х6, Х7, Х8 и Х9, представляют собой независимо друг от друга, аминокислотные остатки, выбранные из группы, состоящей из A, D, Е, F, Н, I, К, L, M, N, Q, R, S, Т, V, W и Y;
в котором предпочтительно
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, D, M, F, S, I, Т, N, Y и К; более предпочтительно К и А;
X2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, К, D, F, M, N, I и Y; более предпочтительно I, E и Y;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из W, R, N, Т, Н, К, А и F; более предпочтительно W, R и F;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и S;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, Т и Н;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, V и R;
Х7 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, Y, N, D, Н, S, А, Q, Т и G; более предпочтительно Е, Y и N;
Х8 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е и К;
Х9 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S, A, Y, Н и N; более предпочтительно Y и Н; и
в котором необязательно вплоть до 5 аминокислот в другом положении, отличном от положений, обозначенных как Х в SEQ ID NO: 53, заменены какой-либо аминокислотой.
В частности, изобретение относится к связывающему белку, где домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора
X1DX2X3GX4TPLHLAAX5X6GHLEIVEVLLKX7GADVNA (SEQ ID NO: 10),
в котором
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из A, D, M, F, S, I, Т, N, Y и К; предпочтительно К и А;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, К, D, F, M, N, I и Y; предпочтительно I, E и Y;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из W, R, N, Т, Н, К, А и F; предпочтительно W, R и F;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, Т и Н;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, V и R;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, Y, N, D, Н, S, A, Q, Т и G; предпочтительно Е, Y и N;
Х7 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S, А, Y, Н и N; предпочтительно Y и Н; и
в котором необязательно вплоть до 5 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 10, заменены какой-либо аминокислотой.
В дополнительном воплощении изобретение относится к связывающему белку, в котором домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO: 11),
в котором
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, К и А; предпочтительно К и А;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, G и S; предпочтительно G и S;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, N, D, H, S, A, Q, Т и G; предпочтительно Q, D и N; более предпочтительно Q и N;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и D;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, К и G; предпочтительно Е и К;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из H, Y, А и N; предпочтительно H, А и Y; более предпочтительно А и Y; и
в котором необязательно вплоть до 5 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 11, заменены какой-либо аминокислотой.
Еще в одном воплощении изобретение относится к связывающему белку, в котором домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора
X1DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO: 54),
в котором
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из F, S, L и К; предпочтительно S и К;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и А;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и К;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S и N;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, D, Q, S, А, Т и Е; предпочтительно D и Q;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, Н, Y, S и N; предпочтительно А и Н; и
в котором необязательно вплоть до 5 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 54, заменены какой-либо аминокислотой.
В частности, изобретение относится к связывающему белку, где домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора
X1DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO: 12),
в котором
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из F, S, L и К; предпочтительно S и К;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и А;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и К;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S и N;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, Н, Y, S и N; предпочтительно А и Н; и
в котором необязательно вплоть до 5 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 12, заменены какой-либо аминокислотой.
Предпочтительным является связывающий белок, где указанный домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора SEQ ID NO: 12, с предшествующим повторяемым модулем с мотивом последовательности анкиринового повтора SEQ ID NO: 11.
Еще в одном воплощении изобретение относится к связывающему белку, где домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора
X1DX2X3GTTPLHLAAVYGHLEX4VEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO: 13),
в котором
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из К, A, D, M, F, S, I, Т, N, и Y; предпочтительно К и А;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, К, D, F, M, N и Y; предпочтительно Е, D и Y;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R, N, Т, Н, К, А и F; предпочтительно R и F;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из I и M;
X5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Н, Y, К, А и N; предпочтительно К и А; и
в котором необязательно вплоть до 5 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 13, заменены какой-либо аминокислотой.
Еще в одном воплощении изобретение относится к связывающему белку, где домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора
X1NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEQ ID NO: 14),
в котором
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Q и К;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из L и Р;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Н, N, Y и А; предпочтительно Н и А;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и S;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, V, Т и S; предпочтительно S и А;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и F; и в котором необязательно вплоть до 5 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 14, заменены какой-либо аминокислотой.
Предпочтительным является связывающий белок, где указанный домен анкиринового повтора включает повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора SEQ ID NO: 14 с предшествующим повторяемым модулем с мотивом последовательности анкиринового повтора SEQ ID NO: 13.
Термин "кэппирующий модуль" относится к полипептиду, слитому с N- или С-терминальным повторяемым модулем повторяемого домена, где указанный кэппирующий модуль формирует плотные третичные взаимодействия (то есть, взаимодействия третичной структуры) с указанным повторяемым модулем, обеспечивая, таким образом, колпачок, который защищает гидрофобное ядро указанного повторяемого модуля со стороны, которая не находится в контакте с последовательным повторяемым модулем, от растворителя. Указанный N- и/или С-терминальный кэппирующий модуль может представлять собой, или может иметь происхождение от, кэппирующей единицы или другой структурной единицы, которая обнаруживается в существующих в природе белковых повторах, соседствующих с повторяемой единицей. Термин "кэппирующая единица" относится к существующему в природе собранному полипептиду, где указанный полипептид определяет конкретную структурную единицу, которая является N- или С-терминально слитой с повторяемой единицей, где указанный полипептид формирует плотные взаимодействия третичной структуры с указанной повторяемой единицей, обеспечивая, таким образом, колпачок, который защищает гидрофобное ядро указанной повторяемой единицы с одной стороны, от растворителя. Предпочтительно, кэппинг модули или кэппирующие единицы представляют собой кэппирующие повторы. Термин "кэппирующий повтор" относится к кэппирующему модулю или кэппирующей единице, которая имеет подобную или такую же сборку, что и указанная соседняя повторяемая единица (или модуль), и/или подобность последовательности указанной соседней повторяемой единицы (или модуля). Кэппинг модули и кэппирующие повторы описываются в WO 2002/020565 и Interlandi и др., 2008 (в приведенном выше месте). Например, WO 2002/020565 описывает N-терминальный кэппирующий модуль (то есть, кэппирующий повтор), который имеет аминокислотную последовательность GSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNA (SEQ ID NO: 1) и С-терминальный кэппирующий модуль (то есть, кэппирующий повтор), имеющий аминокислотную последовательность QDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (SEQ ID NO: 2).
Interlandi и др., 2008 (в приведенном выше месте) описывают С-терминальные кэппинг модули, имеющие аминокислотные последовательности QDKFGKTPFDLAIREGHEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO: 3) и QDKFGKTPFDLAIDNGNEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO: 4).
Например, N-терминальный кэппирующий модуль последовательности SEQ ID NO: 17 кодируется аминокислотами от положения 1 до 32, а С-терминальный кэппирующий модуль последовательности SEQ ID NO: 17 кодируется аминокислотами от положения 99 до 126.
Предпочтительный N-терминальный кэппирующий модуль включает мотив последовательности
X1LX2KKLLEAARAGQDDEVRILX3AX4GADVNA (SEQ ID NO: 5),
в котором X1 представляет собой аминокислотный остаток G, А или D;
в котором Х2 представляет собой аминокислотный остаток G или D;
в котором Х3 представляет собой аминокислотный остаток L, V, I, А или М; предпочтительно, L или М; и
в котором Х4 представляет собой аминокислотный остаток А, Н, Y, К, R или N; предпочтительно, А или N.
Дополнительно предпочтительным является любой такой N-терминальный кэппирующий модуль, включающий N-терминальный кэппирующий повтор, в котором одна или более аминокислотных остатков в указанном кэппирующем повторе заменены аминокислотным остатком, который обнаруживается в соответствующем положении на выравнивании соответствующей кэппирующей единицы или повторяемой единицы.
Предпочтительный С-терминальный кэппирующий модуль включает мотив последовательности
X1DKX2GKTX3X4DX5X6X7DX8GX9EDX10AEX11LQKAA (SEQ ID NO: 6),
в котором X1 представляет собой аминокислотный остаток Q или К;
в котором Х2 представляет собой аминокислотный остаток A, S или F; предпочтительно, S или F;
в котором Х3 представляет собой аминокислотный остаток А или Р;
в котором Х4 представляет собой аминокислотный остаток А или F;
в котором Х5 представляет собой аминокислотный остаток I или L;
в котором Х6 представляет собой аминокислотный остаток S или А;
в котором Х7 представляет собой аминокислотный остаток I или А;
в котором Х8 представляет собой аминокислотный остаток А, Е или N; предпочтительно, А или N;
в котором Х9 представляет собой аминокислотный остаток N или Н;
в котором Х10 представляет собой аминокислотный остаток L или I;
в котором Х11 представляет собой аминокислотный остаток I или V; и
в котором Х2 не является F, если Х4 представляет собой F и Х7 представляет собой I, и Х8 представляет собой N или Е.
Еще один предпочтительный С-терминальный кэппирующий модуль включает мотив последовательности
X1DKX2GKTX3ADX4X5X6DX7GX8EDX9AEX10LQKAA (SEQ ID NO: 7),
в котором X1 представляет собой аминокислотный остаток Q или К;
в котором Х2 представляет собой аминокислотный остаток А, S или F; предпочтительно, S или F;
в котором Х3 представляет собой аминокислотный остаток А или Р;
в котором Х4 представляет собой аминокислотный остаток I или L;
в котором Х5 представляет собой аминокислотный остаток S или А;
в котором Х6 представляет собой аминокислотный остаток I или А;
в котором Х7 представляет собой аминокислотный остаток А, Е или N; предпочтительно, А или N;
в котором Х8 представляет собой аминокислотный остаток N или Н;
в котором Х9 представляет собой аминокислотный остаток L или I; и
в котором Х10 представляет собой аминокислотный остаток I или V.
Еще один предпочтительный С-терминальный кэппирующий модуль включает мотив последовательности
X1DKX2GKTX3ADX4X5ADX6GX7EDX8AEX9LQKAA (SEQ ID NO: 8),
в котором X1 представляет собой аминокислотный остаток Q или К;
в котором Х2 представляет собой аминокислотный остаток A, S или F; предпочтительно, S или F;
в котором Х3 представляет собой аминокислотный остаток А или Р;
в котором Х4 представляет собой аминокислотный остаток I или L;
в котором X5 представляет собой аминокислотный остаток S или А;
в котором Х6 представляет собой аминокислотный остаток А, Е или N; предпочтительно, А или N;
в котором Х7 представляет собой аминокислотный остаток N или Н;
в котором Х8 представляет собой аминокислотный остаток L или I; и
в котором Х9 представляет собой аминокислотный остаток I или V.
Предпочтительно, такой С-терминальный кэппирующий модуль, включающий мотив последовательности SEQ ID NO: 6, 7 или 8, имеет аминокислотный остаток А, I или К; предпочтительно, I или К; в положении, которое соответствует положению 3 указанного мотива последовательности.
Также предпочтительно, когда такой С-терминальный кэппирующий модуль, включающий мотив последовательности SEQ ID NO: 6, 7 или 8, имеет аминокислотный остаток R или D в положении, которое соответствует положению 14 указанного мотива последовательности.
Предпочтительный С-терминальный кэппирующий модуль представляет собой С-терминальный кэппирующий модуль, имеющий аминокислотную последовательность QDKSGKTPADLAADAGHEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO: 9).
Также предпочтительным является С-терминальный кэппирующий модуль, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в которой
аминокислотный остаток в положении 1 представляет собой Q или К;
аминокислотный остаток в положении 4 представляет собой S или F;
аминокислотный остаток в положении 9 представляет собой А или F;
аминокислотный остаток в положении 13 представляет собой А или I;
аминокислотный остаток в положении 15 представляет собой А, Е или N; и
где указанный С-терминальный кэппирующий модуль не имеет аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 3 или 4.
Дополнительный предпочтительный С-терминальный кэппирующий модуль, имеет аминокислотную последовательность, которая имеет, по крайней мере, 70%, предпочтительно, по крайней мере, 75%, 80%, 85%, 90%, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% идентичности аминокислотной последовательности на выравнивании с SEQ ID NO: 9 или 2. Предпочтительно, аминокислотный остаток указанного С-терминального кэппирующего модуля в положении, которое соответствует положению 4 SEQ ID: 9 на выравнивании, представляет собой S, аминокислотный остаток указанного С-терминального кэппирующего модуля в положении, которое соответствует положению 9 SEQ ID: 9 на выравнивании, представляет собой А, аминокислотный остаток указанного С-терминального кэппирующего модуля в положении, которое соответствует положению 13 SEQ ID: 9 на выравнивании, представляет собой А, и/или аминокислотный остаток указанного С-терминального кэппирующего модуля в положении, которое соответствует положению 15 SEQ ID: 9 на выравнивании, представляет собой А. Также предпочтительно, когда аминокислотный остаток указанного С-терминального кэппирующего модуля в положении, которое соответствует положению 9 SEQ ID: 9 на выравнивании, представляет собой А и/или аминокислотный остаток указанного С-терминального кэппирующего модуля в положении, которое соответствует положению 13 SEQ ID: 9 на выравнивании, представляет собой А. Также предпочтительно, когда указанный С-терминальный кэппирующий модуль включает 28 аминокислот.
Предпочтительным также является С-терминальный кэппирующий модуль, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или 9, в котором один или более аминокислотных остатков, указанного С-терминального кэппирующего модуля являются замененными с помощью аминокислоты, которая обнаружена в соответствующем положении выравнивания соответствующего С-терминального кэппирующего повтора или кэппирующей единицы и в котором
аминокислотный остаток в положении 4 представляет собой S;
аминокислотный остаток в положении 9 представляет собой А;
аминокислотный остаток в положении 13 представляет собой А; и/или
аминокислотный остаток в положении 15 представляет собой А.
Предпочтительно, вплоть до 30% аминокислотных остатков указанного С-терминального кэппирующего модуля являются замененными, более предпочтительно, вплоть до 20% и даже более предпочтительно, вплоть до 10% аминокислотных остатков являются замененными. Также является предпочтительным, когда такой С-терминальный кэппирующий модуль представляет собой существующий в природе С-терминальный кэппирующий повтор.
Также предпочтительным является С-терминальный кэппирующий модуль, включающий аминокислоты от положения 1 до 25 или от положения 1 до 26 любого из упомянутых выше С-терминальных кэппинг модулей на основе последовательности SEQ ID NO: 9.
Также предпочтительным является такой С-терминальный кэппирующий модуль, имеющий аминокислотную последовательность, которая не включает аминокислоты N, после которой располагается G.
Также предпочтительным является С-терминальный кэппирующий модуль, который имеет, по крайней мере, 70%, предпочтительно, по крайней мере, 75%, 80%, 85%, 90%, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% идентичности аминокислотной последовательности с каким-либо из упомянутых выше С-терминальных кэппинг модулей на основе последовательности SEQ ID NO: 9 или с самой SEQ ID NO: 9.
Дополнительно предпочтительным является С-терминальный кэппирующий модуль, который имеет, по крайней мере, 70%, предпочтительно, по крайней мере, 75%, 80%, 85%, 90%, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или 9 и где указанный С-терминальный кэппирующий модуль имеет аминокислоту А в положении 9; предпочтительно, указанный С-терминальный кэппирующий модуль имеет аминокислоту А в положениях 9 и 13; более предпочтительно, указанный С-терминальный кэппирующий модуль имеет аминокислоту А в положениях 9, 13 и 15; и наиболее предпочтительно, указанный С-терминальный кэппирующий модуль имеет аминокислоту А в положениях 9, 13 и 15 и S в положении 4.
Дополнительно предпочтительным является такой С-терминальный кэппирующий модуль, который не имеет аминокислоты R в положении 14, и/или который не имеет аминокислоты Е в положении 15.
Также предпочтительным является такой С-терминальный кэппирующий модуль, который не имеет аминокислотной последовательности, идентичной таковой SEQ ID NO: 2, 3 или 4.
Дополнительно предпочтительным является такой С-терминальный кэппирующий модуль, который имеет аминокислотную последовательность на основе SEQ ID NO: 9, где указанный С-терминальный кэппирующий модуль имеет аминокислоты в положениях 26, 27 и 28, выбранные из группы, состоящей из A, L, R, М, К и N; более предпочтительно, A, L, R и К; и наиболее предпочтительно, К, А и L.
Кэппирующий модуль повторяемого домена может быть заменен на кэппирующий модуль в соответствии с изобретением путем комбинирования методик, таких как выравнивание аминокислотной последовательности, мутагенез и синтез генов, известных квалифицированному специалисту в данной области техники. Например, С-терминальный кэппирующий повтор SEQ ID NO: 17 может быть заменен на С-терминальный кэппирующий повтор SEQ ID NO: 9 с помощью (i) определения С-терминального кэппирующего повтора последовательности SEQ ID NO: 17 (то есть, положения последовательности от положения 99 до 126) путем выравнивания последовательности с SEQ ID NO: 9, (ii) замещения последовательности определенного С-терминального кэппирующего повтора последовательности SEQ ID NO: 17 последовательностью SEQ ID NO: 9, (iii) получения гена, который кодирует повторяемый домен, кодирующего замененный С-терминальный кэппирующий модуль, (iv) экспрессии модифицированного повторяемого домена в цитоплазме Е.coli и (v) очистки модифицированного повторяемого домена с помощью стандартных способов.
Кроме того, повторяемый домен в соответствии с изобретением может быть сконструирован генетически путем объединения N-терминального кэппирующего модуля (то есть, N-терминального кэппирующего повтора последовательности SEQ ID NO: 1), после которого идут один или более повторяемых модулей (то есть, повторяемых модулей, включающих аминокислотные остатки от положения 33 до 98 последовательности SEQ ID NO: 17), и С-терминального кэппирующего модуля (то есть, С-терминального кэппирующего повтора последовательности SEQ ID NO: 9) с помощью методов генетического синтеза. Генетически сконструированный ген повторяемого домена может потом экспрессироваться в Е.coli так, как описано выше.
Также предпочтительным является связывающий белок, где домен анкиринового повтора или сконструированный домен анкиринового повтора включает С-терминальный кэппирующий модуль с мотивом последовательности SEQ ID NO: 6, 7 или 8, где указанный кэппирующих модуль имеет аминоислоту I в положении 3 и где указанному повторяемому модулю предшествует повторяемый модуль с мотивом последовательности анкиринового повтора последовательности SEQ ID NO: 12.
Дополнительно предпочтительным является связывающий белок, повторяемый домен, N-терминальный кэппирующий модуль или С-терминальный кэппирующий модуль, имеющий аминокислотную последовательность, в которой отсутствуют аминокислоты С, М или N.
Дополнительно предпочтительным является связывающий белок, повторяемый домен, N-терминальный кэппирующий модуль или С-терминальный кэппирующий модуль, имеющий аминокислотную последовательность, в которой отсутствует аминокислота N, после которой следует G.
Дополнительно предпочтительным является любой такой С-терминальный кэппирующий модуль, включающий С-терминальный кэппирующий повтор, в котором один или более аминокислотных остатков в указанном кэппирующем повторе заменены аминокислотным остатком, который обнаруживается в соответствующем положении в выравнивании соответствующей кэппирующей единицы или повторяемой единицы.
Дополнительно предпочтительным является связывающий белок, включающий любой такой N-терминальный или С-терминальный кэппирующий модуль.
Примеры аминокислотных последовательностей таких С-терминальных кэппинг модулей представляют собой аминокислотные последовательности от положения 99 до 126 в SEQ ID NO: 19, 21, 27, 28, 38, 40 и 42. Пример 6 демонстрирует, что термальная стабильность повторяемого домена может быть повышена путем замещения его С-терминальных кэппинг модулей кэппирующим модулем в соответствии с изобретением.
Термин "мишень" относится к индивидуальной молекуле, такой как молекула нуклеиновой кислоты, полипептида или белка, углевода, или любой другой существующей в природе молекуле, включая любую часть такой индивидуальной молекулы, или к комплексам двух или более таких молекул. Мишень может представлять собой цельную клетку или образец ткани, или она может представлять собой любую не существующую в природе молекулу или остаток. Предпочтительно, когда мишень представляет собой существующий в природе или неприродный полипептид или полипептид, содержащий химические модификации, например, модифицированный с помощью природного или неприродного фосфорилирования, ацетилирования или метилирования. В конкретном применении в соответствии с настоящим изобретением мишень представляет собой xSA.
Термин "xSA" относится к сывороточному альбумину млекопитающих, такому как сывороточный альбумин, полученный из мыши, крысы, кролика, собаки, свиньи, обезьяны или человека. Термин "MSA" относится к мышиному сывороточному альбумину (UniProtKB/Swiss-Prot первичной номер депонирования Р07724), термин "CSA" относится к сывороточному альбумину обезьяны циномолгус (то есть, Масаса fascicularis) (UniProtKB/Swiss-Prot первичной номер депонирования A2V9Z4) и термин "HSA" относится к человеческому сывороточному альбумину (UniProtKB/Swiss-Prot первичной номер депонирования Р02768).
Термин "консенсусная последовательность" относится к аминокислотной последовательности, где указанную консенсусную последовательность получают с помощью структурного выравнивания и/или выравнивания последовательности множественных повторяемых единиц. При использовании двух или более структурно выровненных и/или выровненных по последовательности повторяемых единицы, и разрешая пробелы в выравнивании, является возможным определить наиболее часто встречаемый аминокислотный остаток в этом положении. Консенсусная последовательность представляет собой последовательность, которая включает аминокислоты, которые являются наиболее часто представленными в каждом положении. В случае, когда две или более аминокислоты являются представленными на уровне показателей выше среднего значения в одном положении, то консенсусная последовательность может включать набор таких аминокислот. Указанные две или более повторяемые единицы могут быть взяты из повторяемой единицы, которая входят в состав единичного повторяемого белка, или из двух или более различных повторяемых белков.
Коненсусные последовательности и способы их определения являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники.
"Консенсусный аминокислотный остаток" представляет собой аминокислоту, которая обнаруживается в определенном положении в консенсусной последовательности. Если два или более, например, три, четыре или пять, аминокислотных остатка обнаруживаются с одинаковой вероятность в указанных двух или более повторяемых единицах, то консенсусная аминокислота может представлять собой одну из наиболее часто встречаемых аминокислот или комбинацию указанных двух или более аминокислотных остатков.
Также предпочтительными являются несуществующие в природе кэппирующие модули, повторяемые модули, связывающие белки или связывающие домены.
Термин "несуществующий в природе" означает синтетический или, в частности, неприродный, термин означает такой, который создан человеком. Термин "несуществующий в природе связывающий белок" или "несуществующий в природе связывающий домен" означает, что указанный связывающий белок или указанный связывающий домен является синтетическим (то есть, полученным с помощью химического синтеза из аминокислот) или рекомбинантным, а не природным. "Несуществующий в природе связывающий белок" или "несуществующий в природе связывающие домен" представляет собой созданный человеком белок или домен, соответственно, полученный путем экспрессии соответственно сконструированных нуклеиновых кислот. Предпочтительно, экспрессию осуществляют в эукариотических или бактериальных клетках, или путем использования бесклеточной in vitro экспрессионной системы. Кроме того, термин означает, что последовательность указанного связывающего белка или указанного связывающего домена не является присутствующей в виде неискусственной последовательности в базе данных последовательностей, например, в GenBank, EMBL-Bank или Swiss-Prot. Эти базы данных и другие базы данных последовательностей являются хорошо известными специалисту в данной области техники.
Изобретение относится к связывающему белку, включающему связывающий домен, где указанный связывающий домен представляет собой домен анкиринового повтора и специфично связывается с xSA и где указанный связывающий белок и/или связывающий домен имеет среднюю температуру денатурации (Tm) выше 40°С при термальном развертывании в PBS и формирует менее 5% (вес./вес.) нерастворимых агрегатов при концентрациях вплоть до 10 г/л при инкубации при температуре 37°С в течение 1 дня в PBS.
Термин "PBS" означает забуференный фосфатом водный раствор, содержащий 137 мМ NaCl, 10 мМ фосфата и 2,7 мМ KCl и имеющий значение рН 7,4.
Предпочтительно, когда связывающий белок и/или связывающий домен имеет среднюю температуру денатурации (Tm) выше 45°С, более предпочтительно выше 50°С, более предпочтительно выше 55°С, и наиболее предпочтительно выше 60°С при термальном развертывании в PBS при рН 7,4 или в MES буфере при рН 5,8. Связывающий белок или связывающий домен в соответствии с изобретением обладает определенной вторичной и третичной структурой при физиологических условиях. Термальное развертывание такого полипептида приводит к потере его третичной и вторичной структуры, что может быть продемонстрировано, например, с помощью измерений циркулярного дихроизма (CD). Среднее значение температуры денатурации связывающего белка или связывающего домена при термальном развертывании соответствует температуре в средней точке согласованного перехода в физиологическом буфере при тепловой денатурации указанного белка или домена путем медленного повышения температуры от 10°С до приблизительно 100°С. Определение средней точки температуры денатурации при термальном развертывании является хорошо известным квалифицированном специалисту в данной области техники. Эта средняя точка температуры денатурации связывающего белка или связывающего домена при термальном развертывании является показательной для термальной стабильности указанного полипептида.
Также предпочтительным является связывающий белок и/или связывающий домен, формирующий менее чем 5% (вес./вес.) нерастворимых агрегатов при концентрациях вплоть до 20 г/л, предпочтительно вплоть до 40 г/л, более предпочтительно вплоть до 60 г/л, даже более предпочтительно вплоть до 80 г/л, и наиболее предпочтительно вплоть до 100 г/л при инкубации в течение 5 дней, предпочтительно в течение 10 дней, более предпочтительно в течение 20 дней, более предпочтительно в течение 40 дней, и наиболее предпочтительно в течение 100 дней при 37°С в PBS. Образование нерастворимых агрегатов может определяться с помощью возникновения визуальной преципитации, гель-фильтрации или динамического рассеяния света, которое сильно повышается при образовании нерастворимых агрегатов. Нерастворимые агрегаты могут быть удалены из образца белка путем центрифугирования при 10'000×g в течение 10 минут. Предпочтительно, связывающий белок и/или связывающий домен образует менее чем 2%, более предпочтительно менее чем 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1%, или наиболее предпочтительно менее чем 0,05% (вес./вес.) нерастворимых агрегатов при упомянутых выше условиях инкубации при 37°С в PBS. Процентное содержание нерастворимых агрегатов может определяться с помощью отделения нерастворимых агрегатов от растворимого белка, после чего осуществляют определение количеств белка в растворимой и нерастворимой фракции с помощью стандартных способов количественной оценки.
Также предпочтительным является связывающий белок и/или связывающий домен, который не утрачивает своей нативной пространственной структуры при инкубации в PBS, содержащем 100 мМ дитиотреитол (DTT) в течение 1 или 10 часов при 37°С.
В одном частном воплощении изобретение относится к связывающему белку, включающему связывающий домен, который является доменом анкиринового повтора, в частности, который связывается с xSA и имеет указанное или предпочтительное среднее значение температуры денатурации неагрегирующие свойства, как определяется выше, где указанный связывающий белок обладает, по крайней мере, в 5 раз более высоким конечным периодом полувыведения у млекопитающего по сравнению со связывающим доменом, который не связывается с сывороточным белком, таким как xSA.
Предпочтительно, указанный связывающий домен имеет, по крайней мере, в 10 раз, более предпочтительно, по крайней мере, в 20 раз, в 40 раз, в 100 раз, в 300 раз, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, в 103 раз более высокий конечный период полувыведения у млекопитающего по сравнению со связывающим доменом, который не связывается с сывороточным белком, таким как xSA.
Также предпочтительно, когда указанный связывающий домен не связывает xSA при Kd выше 10-4 М, более предпочтительно выше 10-3 М или наиболее предпочтительно выше 10-2 М для связывания xSA. Пример связывающего домена, который не связывает xSA, представляет собой повторяемый домена последовательности SEQ ID NO: 32.
Также предпочтительным является, когда указанный связывающий домен представляет собой повторяемый домен и имеет, по крайней мере, в 5 раз, более предпочтительно, по крайней мере, в 10 раз, более предпочтительно, по крайней мере, в 20 раз, в 40 раз, в 100 раз, в 300 раз, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, в 103 раз более высокий (то есть, более длительный) конечный период полувыведения у млекопитающего по сравнению повторяемым доменом последовательности SEQ ID NO: 32 или по сравнению с DARPin #32, DARPin #41 или DARPin #42.
Предпочтительный связывающий белок включает связывающий домен со связывающей специфичностью для HSA, который обладает конечным период полувыведения выше 1, более предпочтительно выше 3, 5, 7, 10, 15, или наиболее предпочтительно выше 20 дней у людей.
Конечный период полувыведения связывающего домена может быть определен с помощью анализов, хорошо известных квалифицированному специалисту в данной области техники (Toutain, P.L., и Bousquet-Mélou, A., J. Vet. Pharmacol. Ther. 27(5), 427-439, 2004). Примеры определения конечного периода полувыведения являются приведенными в разделе Примеры.
Термин "конечный период полувыведения из плазмы крови" лекарственного агента, такого как связывающий белок или связывающий домен в соответствии с изобретением, относится ко времени, которое требуется для достижения половины концентрации в плазме крови лекарственного средства, которое применяется к млекопитающему после достижения псевдоравновесия. Этот период полувыведения не определяется как время, необходимое для выведения половины дозы лекарственного средства, которое было введено млекопитающему.
В одном частном воплощении изобретение относится к связывающему белку, включающему связывающий домен, которой представляет собой домен анкиринового повтора, в частности, такому, который связывается с xSA и включает биоактивное соединение.
Термин "биоактивное соединение" относится к соединению, которое изменяет заболевание, когда применяется к млекопитающему, которое имеет указанное заболевание. Биоактивное соединение может иметь агонистические или антагонистические свойства и может представлять собой белковое биоактивное соединение или небелковое биоактивное соединение.
Такие белковые биоактивные соединения могут быть ковалентно присоединены, например, к связывающему домену в соответствии с изобретением путем получения генетически слитых полипептидов при использовании стандартных методик клонирования ДНК, после чего осуществляют их стандартную экспрессию и очистку. Например, DARPin #36 включает повторяемый домен со связывающей специфичностью для человеческого фактора роста (то есть, биоактивное соединение), после которого следует повторяемый домен со связывающей специфичностью для HSA.
Такие небелковые биоактивные соединения могут быть ковалентно присоединены, например, к связывающему домену в соответствии с изобретением, химическим путем, например, путем слияния тиола цистеина через малеимидный линкер с цистеином, слитым с помощью пептидного линкера с N- или С-терминальным концом связывающего домена, как описывается в данной заявке.
Примеры белковых биоактивных соединений представляют собой связывающие домены, которые обладают отличной специфичностью по отношению к мишени (например, нейтрализация фактора роста с помощью его связывания), цитокинам (например, интерлейкинам), фактору роста (например, человеческому гормону роста), антителам и их фрагментам, гормонам (например, GLP-1) и любому возможному белковому лекарственному средству.
Примеры небелковых биоактивных соединений представляют собой токсины (например, DM1 от ImmunoGen), малые молекулы, нацеливающие GPCR, антибиотики и любое возможное белковое лекарственное средство.
В одном частном воплощении изобретение относится к связывающему белку, включающему домен анкиринового повтора, в частности, такой, который связываются с xSA, и дополнительно включающий биоактивное соединение, где указанный связывающий белок имеет, по крайней мере, в 2 раза более высокий период полувыведения у млекопитающего по сравнению с конечным периодом полувыведения указанного немодифицированного биоактивного соединения, где указанный более высокий конечный период полувыведения указанного связывающего белка обеспечивается с помощью указанного повторяемого домена.
Предпочтительно, когда указанный связывающий белок имеет, по крайней мере, в 10 раз, более предпочтительно, по крайней мере, в 20 раз, в 40 раз, в 100 раз, в 300 раз, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, в 103 раз более высокий конечный период полувыведения у млекопитающего по сравнению по сравнению с указанным немодифицированным биоактивным соединением.
Другое предпочтительное воплощение представляет собой рекомбинантный связывающий белок, включающий связывающий домен, который специфически связывается с xSA, и где указанный связывающий домен представляет собой домен анкиринового повтора или сконструированный домен анкиринового повтора. Такой домен анкиринового повтора может включать один, два, три или более внутренних повторяемых модулей, которые будут участвовать в связывании с xSA. Предпочтительно, такой домен анкиринового повтора включает N-терминальный кэппирующий модуль, от двух до четырех повторяемых модулей и С-терминальный кэппирующий модуль. Предпочтительно, указанный связывающий домен представляет собой домен анкиринового повтора или сконструированные домен анкиринового повтора. Также предпочтительно, когда указанные кэппинг модули представляют собой кэппирующие повторы.
В частности, изобретение относится к связывающему белку, как определяется в данной заявке выше, где домен анкиринового повтора конкурирует за связывание с сывороточным альбумином млекопитающих с доменом анкиринового повтора, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-31 и 43-48; предпочтительно SEQ ID NO: 17-31; более предпочтительно SEQ ID NO: 19, 21, 27 и 28, в частности SEQ ID NO: 19 и 27.
Наиболее предпочтительным является связывающий белок, в котором домен анкиринового повтора является выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-31 и 43-48, в котором G в положении 1 и/или S в положении 2 указанного домена анкиринового повтора являются необязательно отсутствующими.
Также предпочтительно, когда указанный повторяемый домен конкурирует за связывание с xSA со связывающим белком, выбранным из группы DARPin #17-31 и 43-48. Предпочтительно, указанный повторяемый домен конкурирует за связывание с xSA со связывающим белком из группы DARPin #19, 21, 27, 28, 45, 46, 47 и 48. Более предпочтительно, указанный повторяемый домен конкурирует за связывание с xSA со связывающим белком DARPin #19, 45, 46, 48 или 27; даже более предпочтительно, указанный повторяемый домена конкурирует за связывание с xSA со связывающим белком DARPin #46 или 27.
Термин "конкурирует за связывание" означает неспособность двух различных связывающих доменов в соответствии с изобретением связываться одновременно с той же мишенью, в то время как они оба являются способными связываться с той же мишенью индивидуально. Таким образом, такие два связывающих домена конкурируют за связывание с указанной мишенью. Предпочтительно, когда указанные два конкурирующих связывающих домена связываются с перекрывающимся эпитопом или тем же связывающим эпитопом на указанной мишени. Способы, такие как конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или конкурентные SPR измерения (например, при использовании аппарата Proteon от BioRad), для определения, будут ли связывающие домены конкурировать за связывание с мишенью, являются хорошо известными практикующему специалисту в данной области техники.
Другое предпочтительное воплощение представляет собой связывающий белок, включающий повторяемый домен со связывающей специфичностью для xSA, выбранный из группы, состоящей из повторяемых доменов SEQ ID NO: 17-31. Предпочтительно, указанный повторяемый домен представляет собой повторяемый домен последовательности SEQ ID NO: 19, 21, 27 или 28. Более предпочтительно, указанный повторяемый домен представляет собой повторяемый домен SEQ ID NO: 19. Также более предпочтительно, когда указанный повторяемый домен представляет собой повторяемый домен SEQ ID NO: 21. Также более предпочтительно, когда указанный повторяемый домен представляет собой повторяемый домен SEQ ID NO: 27. Также более предпочтительно, когда указанный повторяемый домен представляет собой повторяемый домен SEQ ID NO: 28.
Дополнительно предпочтительным является связывающий белок, в котором указанный повторяемый домен со связывающей специфичностью для xSA включает аминокислотную последовательность, которая имеет, по крайней мере, 70% идентичности аминокислотной последовательности с повторяемым доменом указанной группы повторяемых доменов. Предпочтительно, указанная идентичность аминокислотной последовательности составляет, по крайней мере, 75%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 85%, более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95%.
Дополнительно предпочтительным является связывающий белок, где указанный повторяемый домен со связывающей специфичностью для xSA включает повторяемый модуль, который имеет, по крайней мере, 70% идентичности аминокислотной последовательности с повторяемым модулем повторяемого домена указанной группы повторяемых доменов. Указанная идентичность аминокислотной последовательности составляет, по крайней мере, 75%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 85%, более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95%. Дополнительно предпочтительным является связывающий белок, где указанный связывающий белок включает два или более указанных повторяемых доменов со связывающей специфичностью для xSA. Предпочтительно, указанный связывающий белок включает 2 или 3 указанных повторяемых домена. Указанные два или более повторяемых доменов имеют ту же или отличную аминокислотную последовательность.
В дополнительном предпочтительном воплощении связывающий белок включает повторяемый домен в соответствии с настоящим изобретением, а один или более аминокислотных остатков повторяемых модулей указанного повторяемого домена являются замененными аминокислотными остатками, которые обнаруживаются в соответствующих положениях на выравнивании повторяемой единицы. Предпочтительно, вплоть до 30% аминокислотных остатков являются измененными, более предпочтительно, вплоть до 20%, и даже более предпочтительно, вплоть до 10% аминокислотных остатков являются измененными. Наиболее предпочтительно, когда такая повторяемая единица представляет собой существующую в природе повторяемую единицу.
В дополнительном предпочтительном воплощении связывающий белок включает повторяемый домен в соответствии с настоящим изобретением, а один или более аминокислотных остатков N-терминального кэппирующего модуля указанного повторяемого домена являются замененными аминокислотными остатками, которые обнаруживаются в соответствующих положениях на выравнивании N-терминальной кэппирующей единицы. Предпочтительно, вплоть до 30% аминокислотных остатков являются измененными, более предпочтительно, вплоть до 20%, и даже более предпочтительно, вплоть до 10% аминокислотных остатков являются измененными. Наиболее предпочтительно, когда такая N-терминальная кэппирующая единица представляет собой существующую в природе N-терминальную кэппирующую единицу.
В дополнительном предпочтительном воплощении связывающий белок включает повторяемый домен в соответствии с настоящим изобретением, а один или более аминокислотных остатков С-терминального кэппирующего модуля указанного повторяемого домена являются замененными аминокислотными остаткками, которые обнаруживаются в соответствующих положениях на выравнивании С-терминальной кэппирующей единицы. Предпочтительно, когда вплоть до 30% аминокислотных остатков являются измененными, более предпочтительно, вплоть до 20%, и даже более предпочтительно, вплоть до 10% аминокислотных остатков являются измененными. Наиболее предпочтительно, такая С-терминальная кэппирующая единица представляет собой существующую в природе С-терминальную кэппирующую единицу.
Еще в одном частном воплощении вплоть до 30% аминокислотных остатков, более предпочтительно, вплоть до 20%, и даже более предпочтительно, вплоть до 10% аминокислотных остатков заменяются аминокислотами, которые не обнаруживаются в соответствующих положениях в повторяемых единицах, N-терминальных кэппирующих единицах или С-терминальных кэппирующих единицах.
В дополнительных воплощениях любой из белков, связывающих xSA, или доменов, описанных в данной заявке, может быть ковалентно связан одним или более дополнительных остатков, включая, например, остаток, который связывается с различными мишенями для создания связывающего агента с двойной специфичностью, биоактивного соединения, остатка для мечения (например, флуоресцентной метки, такой как флуоресцеин, или радиоактивной метки), остатка, который способствует очистке белка (например, небольшая пептидная метка, такая как His- или strep-метка), остаток, который обеспечивает эффекторные функции для улучшенной терапевтической эффективности (например, Fc часть антитела для обеспечения зависимой от антитела клеточной цитотоксичности, токсический белковый остаток, такой как экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (ETA) или небольшой молекулярный токсический агент, такой как майтансиноиды или ДНК алкилирующие агенты) или остатка, который обеспечивает улучшенные фармакокинетические характеристики. Улучшенные фармакокинетические характеристики могут быть оценены в соответствии с имеющейся терапевтической необходимостью. Часто является желательным повысить биодоступность и/или увеличить время между дозами, возможно, посредством увеличения времени, в течение которого белок остается доступным в сыворотке крови после введения дозы. В некоторых случаях является желательным улучшить непрерывность концентрации белка в сыворотке крови в течение периода времени (например, снизить различия в сывороточной концентрации белка между концентрацией непосредственно после введения и концентрацией непосредственно перед последующим введением).
В дополнительном воплощении изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют конкретные связывающие белки, конкретные N-терминальные кэппинг модули или конкретные С-терминальные кэппирующие модули. Кроме того, рассматривается вектор, включающий указанные молекулы нуклеиновой кислоты.
Кроме того, рассматривается также фармацевтическая композиция, включающая один или более из упомянутых выше связывающих белков, в частности, связывающих белков, включающих повторяемые домены, или молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют конкретные связывающие белки, и необязательно, фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. Фармацевтически приемлемые носители и/или разбавители являются известными квалифицированному специалисту в данной области техники и рассматриваются более подробно ниже. Кроме того, рассматривается также диагностическая композиция, включающая один или более из упомянутых выше связывающих белков, в частности, связывающие белки, включающие повторяемые домены.
Фармацевтическая композиция включает связывающие белки так, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор, например, такой, как описывается в Remington's Pharmaceutical Sciences 16ое издание, Osol, А. ред. [1980]. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, известные специалисту, представляют собой физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнкса, жирные растительные масла, этилолеат, 5% декстрозу в физиологическом растворе, вещества, которые улучшают изотоничность и химическую стабильность, буферы и консервирующие агенты. Другие приемлемые носители включают любой носитель, который сам по себе не индуцирует выработку антител, которые являются вредными для индивидуума, получающего композицию, такой, как белки, полисахариды, полимеры молочной кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты и сополимеры аминокислот. Фармацевтические композиции могут также представлять собой комбинационные композиции, включающие дополнительный активный агент, такой как противораковый агент или антиангиогенный агент.
Композиции, используемые для введения in vivo, должны быть асептическими или стерильными. Это может легко осуществляться с помощью фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.
Фармацевтические композиции могут вводиться с помощью любого приемлемого способа, который является известным специалисту в данной области техники. Предпочтительный путь введения представляет собой парентеральный. При парентеральном введении лекарственное средство в соответствии с изобретением будет рецептироваться в виде единичной дозированной формы, которая вводится путем инъекции, такой как раствор, суспензия или эмульсия, в сочетании с фармацевтически приемлемыми наполнителями, как определяется выше. Дозированная форма и способ введения будут зависеть от индивидуума, которого подвергают лечению, и частного заболевания. В общем случае фармацевтические композиции вводятся так, что связывающий белок в соответствии с настоящим изобретением вводится при дозе от 1 мкг/кг до 20 мг/кг, более предпочтительно от 10 мкг/кг и 5 мг/кг, наиболее предпочтительно от 0,1 до 2 мг/кг. Предпочтительно, композицию вводят в виде болюсной дозы. Беспрерывная инфузия может также использоваться и включает беспрерывную подкожную доставку с помощью осмотического мининасоса. В этом случае фармацевтические композиции могут вводиться путем инфузии при дозе от 5 до 20 мкг/кг/минута, более предпочтительно от 7 до 15 мкг/кг/минута.
Кроме того, любая из упомянутых выше фармацевтических композиций предполагается для лечения заболевания.
Изобретение также обеспечивает способы лечения. Такой способ включает введение пациенту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества связывающего белка в соответствии с изобретением.
Также предполагается способ лечения патологического состояния у млекопитающего, включая человека, включающий введение пациенту, который в этом нуждается, эффективного количества упомянутых выше фармацевтических композиций.
Связывающий белок в соответствии с изобретением может также быть получен и/или выделен с помощью нескольких способов, таких как дисплей на поверхности бактериофагов (WO 1990/002809, WO 2007/006665) или бактериальных клеток (WO 1993/010214), рибосомальный дисплей (WO 1998/048008), дисплей на плазмидах (WO 1993/008278) или путем использования гибридных конструкций на основе ковалентных РНК-белковых повторов (WO 2000/032823), или внутриклеточной экспрессии и селекции/скрининга, например, комплементационного анализа белка (WO 1998/341120). Такие способы являются известными квалифицированному специалисту в данной области техники.
Библиотека белков анкириновых повторов, которая используется для селекции/скрининга связывающих белков в соответствии с изобретением, может быть получена в соответствии с прописями, известными квалифицированному специалисту в области техники (WO 2002/020565, Binz, Н.К., и др., J. Mol. Biol., 332, 489-503, 2003, и Binz и др., 2004, в упомянутом выше месте). Применение такой библиотеки для селекции специфических для xSA DARPin является приведенным в Примере 1. Аналогично, последовательность мотивов анкиринового повтора, как представлено выше, может использоваться для построения библиотек белков с анкириновым повтором, которые могут использоваться для селекции или скрининга специфических для xSA DARPin. Кроме того, повторяемые домены в соответствии с настоящим изобретением могут быть модульно собраны из повторяемых модулей в соответствии с настоящим изобретением и приемлемых кэппинг модулей или кэппирующих повторов (Forrer, P., и др., FEBS letters 539, 2-6, 2003) при использовании стандартных методик рекомбинантной ДНК (например, WO 2002/020565, Binz и др., 2003, в приведенном выше месте и Binz и др., 2004, в приведенном выше месте).
Изобретение не является ограниченным частными воплощениями, описанными в Примерах. Все источники могут использоваться и подвергаться развитию в соответствии с общей процедурой, описанной выше.
Примеры
Все исходные материалы и реагенты, раскрытые ниже, являются известными квалифицированному специалисту в данной области техники и являются коммерчески доступными или могут быть получены при использовании хорошо известных методик.
Материалы
Реактивы закупали от Fluka (Швейцария). Олигонуклеотиды были такими от Microsynth (Швейцария). Если не указано иное, то ДНК полимеразы, рестрикционные ферменты и буферы были такими от New England Biolabs (USA) или E.coli XL1-blue (Stratagene, USA) или BL21 (Novagen, USA). Очищенный сывороточный альбумин и сыворотку, полученную от различных видов, закупали (например, у Sigma-Aldrich, Швейцария или Innovative Research, США). Биотинилированный сывороточный альбумин различных видов получали химическим путем с помощью слияния остатка биотина с первичными аминами очищенных сывороточных альбуминов при использовании стандартных реагентов и способов для биотинилирования (Pierce, USA).
Молекулярная биология
Если не указано иное, то способы осуществляли в соответствии с описанными прописями (Sambrook J., Fritsch E.F. и Maniatis Т., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York).
Сконструированные библиотеки белков с анкириновым повтором
Описываются библиотеки N2C и N3C сконструированных белков с анкириновым повтором (WO 2002/020565; Binz и др. 2003, в приведенном выше месте; Binz и др. 2004, в приведенном выше месте). Символ в N2C и N3C описывает количество рандомизированных повторяемых модулей, которые присутствуют между N-терминальным и С-терминальным кэппирующими модулями. Номенклатура, которая используется для определения положений внутри повторяемых единиц и модулей, основывается на Binz и др. 2004, в приведенном выше месте, с модификацией, которая граничит с модулями анкиринового повтора, а единицы анкиринового повтора смещаются на одно положение аминокислоты. Например, положение 1 модуля анкиринового повтора в соответствии с Binz и др. 2004 (в приведенном выше месте) соответствует положению 2 модуля анкиринового повтора в соответствии с настоящей заявкой и, следовательно, положению 33 модуля анкиринового повтора в соответствии Binz и др. 2004, в приведенном выше месте, соответствует положению 1 следующего модуля анкиринового повтора в соответствии с настоящей заявкой.
Все последовательности ДНК были подтверждены секвенированием, а подсчитанный молекулярный вес для всех описанных белков был подтвержден с помощью масс-спектометрии.
Пример 1: Селекция связывающих белков, включающих повторяемый домен со связывающей специфичностью для xSA
При использовании рибосомального дисплея (Hanes, J. и Plückthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997) были подвергнуты селекции многочисленные сконструированные белки с анкириновыми повторами (DARPin) со связывающей специфичностью для xSA из библиотек N2C или N3C DARPin, описанных Binz и др. 2004 (в приведенном выше месте). Оценивали связывание отобранных клонов со специфическими (xSA; то есть MSA, HSA или CSA) и неспецифическими (МВР, белок, связывающий мальтозу Е.coli) мишенями при использовании сырьевого экстракта ELISA, что свидетельствовало о том, что специфические для xSA связывающие белки были успешно отобраны. Повторяемые домены SEQ ID NO: 17-31 составляли аминокислотные последовательности отобранных связывающих белков, включающих повторяемый домен со связывающей специфичностью для xSA. Анализ последовательностей отобранных связывающих агентов выявил специфическую последовательность мотивов анкиринового повтора, присущую некоторым отобранным семействам связывающих агентов. Такие мотивы последовательностей анкиринового повтора, которые присутствовали в повторяемых доменах со связывающей специфичностью для xSA, обеспечиваются в SEQ ID NO: 11-14.
Селекция белков с анкириновыми повторами, специфичных для сывороточного альбумина, с помощью рибосомального дисплея
Селекцию белков с анкириновыми повторами, специфичных для сывороточного альбумина, осуществляли с помощью рибосомального дисплея (Hanes и Plückthun, в приведенном выше месте) при использовании HSA, CSA или MSA в качестве белков-мишеней, библиотеки сконструированных белков с анкириновыми повторами, как описывается в литературе (WO 2002/020565, Binz и др., 2003, в приведенном выше месте и Binz и др., 2004, в приведенном выше месте) и установленных прописей (Zahnd, С., Amstutz, P. и Plückthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007). Селекцию с использованием циклов рибосомального дисплея осуществляли на HSA, CSA или MSA (включая биотинилированные варианты HSA или MSA, иммобилизованные на нейтравидине и стрептавидине) для обоих библиотек N2C и N3C DARPin при использовании установленных прописей (Binz и др. 2004, в приведенном выше месте). Количество циклов обратной транскрипции (ОТ)-ПЦР после каждого круга селекции уменьшали с 40 до 30, осуществляя подгонку выхода благодаря повышению количества связывающих агентов. Четыре цикла селекции на HSA, CSA или MSA обеспечивали получение пулов DARPin с микромолярной - наномолярной аффинностью, как было выявлено с помощью измерений ELISA и SPR единичных клонов. Аффинность определенных DARPin дополнительно повышали при использовании аффинного созревания с помощью способов, хорошо известных квалифицированному специалисту в данной области техники (например, путем диверсификации клонов DARPin при использовании склонной к ошибкам ПЦР, а также селекции и скрининга на усовершенствованные связывающие агенты так, как описано выше).
Отобранные клоны специфически связываются с сывороточным альбумином, как показано при использовании сырьевого экстракта ELISA
Индивидуальные отобранные DARPin, специфически связывающиеся с xSA, были идентифицированы с помощью с помощью твердофазного иммуно-ферментного анализа (ELISA) при использовании сырьевых экстрактов клеток Escherichia coli, экспрессирующих DARPin, при использовании стандартных прописей. С помощью рибосомального дисплея отобранные клоны клонировали в pQE30 (Qiagen) экспрессионный вектор, трансформировали в Е.coli XL1-Blue (Stratagene) и потом выращивали в течение ночи при 37°С в планшете, содержащем 96 глубоких ячеек (каждый клон в одной ячейке), при этом каждая ячейка содержала 1 мл ростовой среды (2YT, содержащая 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина). 1 мл свежей среды 2YT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, инокулировали в 100 мкл ночной культуры в новый планшет, содержащий 96 глубоких ячеек. После инкубации в течение 2 часов при 37°С, экспрессию индуцировали с помощью IPTG (заключительная концентрация 1 мМ) и продолжали инкубацию в течение 3 часов. Собирали клетки, ресуспендировали их в 100 мкл B-PERII (Pierce) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре при встряхивании. Потом прибавляли 900 мкл PBS-TC (PBS с добавкой 0,25% гидролизата казеина, 0,1% Твин 20®, рН 7,4), и удаляли клеточные дебрисы путем центрифугирования. 100 мкл каждого лизированного клона применяли к ячейке MaxiSorp планшета, покрытого нейтравидином, содержащей либо xSA или неродственный МВР, иммобилизованный с помощью остатка биотина, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После экстенсивного промывания с использованием PBS-T (PBS с добавкой 0,1% Твин 20®, рН 7,4) планшет подвергали обработке при использовании стандартной процедуры ELISA с использованием моноклонального анти-RGS(His)4 антитела (34650, Qiagen) в качестве первичного антитела и поликлонального козьего анти-мышиного антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой (А3562, Sigma), в качестве вторичного реагента. Потом определяли связывание при использовании динатрий 4-нитрофенил фосфата (4NPP, Fluka) в качестве субстрата для щелочной фосфатазы. Развитие окраски измеряли при 405 нм. Скрининг нескольких сотен клонов с помощью такого анализа сырьевого экстракта ELISA выявил более сотни различных DARPin со специфичностью для xSA. Эти связывающие белки были выбраны для дальнейшего анализа. Примеры аминокислотных последовательностей выбранных повторяемых доменов, которые специфически связываются с xSA, обеспечиваются в SEQ ID NO: 17-31, 37-40 и 43-48.
Дедукция мотивов повторяемой последовательности из отобранных повторяемых доменов со связывающей специфичностью для xSA
Аминокислотные последовательности выбранных повторяемых доменов со связывающей специфичностью для xSA подвергали дальнейшему анализу с помощью инструментов для анализа последовательности, которые являются известными практикующему специалисту в данной области техники (WO 2002/020565; Forrer и др., 2003, в приведенном выше месте; Forrer, P., Binz, H.K., Stumpp, M.T. и Plückthun, A., ChemBioChem, 5(2), 183-189, 2004). Тем не менее, в противовес WO 2002/020565, где существующие в природе мотивы повторов использовали для выведения мотивов повторяемых последовательностей, в данном случае мотивы повторяемых последовательностей были выведены из повторяемой единицы отобранных повторяемых доменов со связывающей специфичностью для xSA. Таким образом, определяли семейства отобранных повторяемых доменов, включающих общий мотив повторяемой последовательности. Такие мотивы повторяемых последовательностей, присутствующих в повторяемых доменах со связывающей специфичностью для xSA, обеспечиваются в SEQ ID NO: 11-14.
Высокий уровень и экспрессия растворимых DARPin
Для дальнейшего анализа отобранные клоны, демонстрирующие xSA связывание в сырьевом клеточном экстракте ELISA так, как описано выше, экспрессировали в клетках Е.coli BL21 или XL1-Blue и очищали с помощью их His-метки при использовании стандартных прописей. 25 мл стационарных ночных культур (LB, 1% глюкозы, 100 мг/л ампициллина; 37°С) использовали для инокуляции 1 л культур (та же среда). При значении поглощения 0,7 при 600 нм культуры индуцировали с помощью 0,5 мМ IPTG и инкубирвоали при 37°С в течение 4 часов. Центрифугировали культуры и полученные осадки ресуспендировали в 40 мл TBS500 (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, pH 8) и подвергали обработке ультразвуком. Лизаты повторно центрифугировали и прибавляли глицерин (заключительная концентрация 10% (об./об.)) и имидазол (заключительная концентрация 20 мМ) к полученному супернатанту. Белки очищали при использовании колонки с Ni-нитрилтрехуксусной кислотой (2,5 мл объема колонки) в соответствии с инструкциями производителя (QIAgen, Germany). Альтернативно, DARPin или отобранные повторяемые домены, не содержащие 6×His-метки, очищали с помощью анионобменной хроматографии, после чего проводили эксклюзионную хроматографию размеров при использовании стандартной смолы и прописей, известных квалифицированному специалисту в данной области техники. Вплоть до 200 мг высоко растворимых DARPin со связывающей специфичностью по отношению к сывороточному альбумину могут быть очищены из 1 л культуры Е.coli со степенью чистоты >95%, как оценивается с помощью SDS - 15% ПАГЭ. Такие очищенные DARPin использовались для дальнейшей характеристики.
Пример 2: Анализ стабильности и эксклюзионная хроматография размеров DARPin со связывающей специфичностью для xSA
DARPin #19-22 и DARPin #27-30 со связывающей специфичностью для xSA очищали почти до полной гомогенности при использовании их His-метки так, как описано выше, и хранили в PBS в течение 28 дней при концентрации 30 мг/мл (~2 мМ) при 40°С (изучение стабильности). В день 0 (Фигура 1а) и день 28 (Фигура 1b) брали образцы, разводили до концентрации 500 мкМ и анализировали при использовании эксклюзионной хроматографии размеров (SEC) для оценки их среднего молекулярного веса и стабильности (то есть, их агрегации, мультимеризации или тенденции к деградации) в течение периода времени.
В дополнительном эксперименте (Фиг.1с), DARPin #19 и 43-48 со связывающей специфичностью для xSA очищали почти до полной гомогенности при использовании их His-метки так, как описано выше, и хранили в PBS в течение 28 дней при концентрации приблизительно 100 мг/мл при -80°С, разводили до концентрации 500 мкМ и анализировали при использовании эксклюзионной хроматографии размеров (SEC) для их характеристики (то есть, агрегации, мультимеризации или тенденции к деградации). В частности, использовали большую колонку по сравнению с сериями первого анализа (смотри ниже).
Эксклюзионная хроматография размеров (SEC)
Аналитическую SEC осуществляли при использовании HPLC системы (Agilent 1200 series) при использовании либо колонки Superdex 200 5/150 (Фиг.1а и Фиг.1b), либо колонки Superdex 200 10/300GL (Фиг.1с) (GE Healthcare) при 20°С. Колонка Superdex 200 5/150 имела объем поглощающего слоя 3,0 мл, и свободного объема 1,08 мл (определен экспериментально при использовании голубого декстрана). Колонка Superdex 200 10/300GL имела объем поглощающего слоя 24 мл, и свободный объем приблизительно 8 мл. Измерения осуществляли в соответствии со стандартными процедурами, известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Прогоны осуществляли при скорости истечения 0,2 мл/мин. и максимальном давлении 15 бар (Superdex 200 5/150) или 0,6 мл/мин. и максимальном давлении 18 бар (Superdex 200 10/300GL) в PBS. Образцы белков разводили в PBS до концентрации приблизительно 20-500 мкМ, фильтровали (0,22 мкМ), и 20-100 мкл разведенных образцов наносили на колонку для разделения. Профили элюирования образцов белка регистрировали путем считывания поглощения при 280 нм. Апротинин (АР) с молекулярным весом 6,5 кДа, карбоангидразу (СА) с молекулярным весом 29 кДа и кональбумин (СО) с молекулярным весом 75 кДа использовали в качестве стандартных белков для получения калибровочной кривой, из которой могут быть определены средние молекулярные массы белков образцов.
Эти результаты являются представленными на Фигуре 1. DARPin #19-22 и 27-30 продемонстрировали неразличимые SEC хроматограммы (то есть, неразличимые профили элюирования) в день 0 и день 28 исследования стабильности. Следовательно, все DARPin элюируются как мономеры при условиях анализа и DARPin #19-23 и 27-30 являются стабильными в течение, по крайней мере, 1 месяца при 40°С в PBS (то есть, их профили элюирования не выявляли какой-либо агрегации, мультимеризации или тенденции к деградации).
Пример 3: Термальная стабильность DARPin со связывающей специфичностью для xSA
Термальную стабильность DARPin со специфичностью для xSA анализировали с помощью анализа стабильности на основе флуоресценции (Niesen, F.H., Nature Protocols 2(9): 2212-2221, 2007). Таким образом, температуру, при которой белок (то есть, белок, такой как DARPin) развертывается, измеряли путем повышения флуоресценции красителя (например, SYPRO оранжевый; Invitrogen, кат. номер S6650) с аффинностью для гидрофобных частей белка, которые подвергаются развертыванию белка. Полученное таким образом среднее значение перехода флуоресценции (от более низкой интенсивности флуоресценции до более высокой интенсивности флуоресценции) соответствует среднему значению температуры денатурации (Tm) анализируемого белка.
Анализ термальной стабильности на основе флуоресценции
Термальную денатурацию DARPin при использовании SYPRO оранжевого как флуоресцентного красителя измеряли при использовании способа ПЦР в реальном времени (то есть, С1000 термоблока для проведения реакций (BioRad) в комбинациии с CFX96 оптической системой (BioRad)). DARPin получали при концентрации 80 мкМ либо в PBS при рН 7,4, либо в MES буфере при рН 5,8, содержащем 1× SYPR оранжевого (разведенного из маточного раствора 5'000× SYPRO оранжевого, Invitrogen), и 50 мкл таких белковых растворов или только буфер прибавляли к содержимому ячеек белого планшета на 96 ячеек для проведения ПЦР (Bio-Rad). Планшеты закрывали при использовании Microseal ’В’ Adhesive изоляционной прокладки (Bio-Rad) и нагревали в устройстве для проведения ПЦР в реальном времени от 20°С до 95°С при приращениях 0,5°С включая этап выдерживания в течение 25 секунд после каждого приращения температуры, и после проведения термальной денатурации DARPin осуществляли измерение относительных единиц флуоресценции образцов при каждом приращении температуры. Относительные единицы флуоресценции в ячейках планшета измеряли при использовании канала 2 аппарата для проведения ПЦР в реальном времени (то есть, возбуждение осуществляли при 535 нм, а определение проводили при длине волны 560-580 нм), и вычитали соответствующие значения, полученные при использовании только буфера. Из полученных таким образом срединных значений перехода термальной денатурации, могут быть определены Tm значения для анализируемых DARPin.
Результаты термальной денатурации DARPin либо в PBS при рН 7,4, либо в MES буфере при рН 5,8, после которой осуществляли повышение я интенсивности флуоресценции SYPRO оранжевого, являются представленными на Фигуре 2 и Фигуре 3. Измеренные переходы термальной денатурации демонстрируют, что все проанализированные DARPin со связывающей специфичностью для xSA имеют Tm значения выше 40°С (как при рН 7,4, так и при рН 5,8).
Пример 4: Характеристика DARPin со связывающей специфичностью для xSA с помощью поверхностного плазмонного резонанса
DARPin со связывающей специфичностью для xSA при использовании их His-метки иммобилизировали в проточной кювете, покрытой α-RGS-His антителом (Qiagen, кат. номер 34650), и анализировали взаимодействие сывороточного альбумина человека, обезьяны циномолгус (cyno), мыши, крысы, кролика и собаки с иммобилизованными DARPin.
Анализ с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR)
SPR измеряли при использовании ProteOn устройства (BioRad), и измерения осуществляли в соответствии со стандартными процедурами, известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Буфер для разгона представлял собой PBS, рН 7,4, содержащий 0,01% Твин 20®. Анти-RGS-His антитело ковалентно имммобилизовали на GLC чипе (BioRad) до уровня приблизительно 2000 резонансных единиц (RU). Потом проводили иммобилизацию DARPin на чипе, покрытом антителом, путем введения 150 мкл 1 мкМ раствора DARPin в течение 300 секунд (скорость истечения = 30 мкл/мин.). Взаимодействие сывороточного альбумина различных видов потом измеряли путем введение в течение 60 секунд буфера для разгона объемом 100 мкл (PBS, содержащий 0,01% Твин®), который содержал отличный сывороточный альбумин при концентрации 400, 200, 100, 50 нМ (измерение скорости ассоциации), после чего пропускали буфер для разгона в течение от 10 до 30 минут (скорость истечения = 100 мкл/мин.) (измерение скорости диссоциации). Сигналы (то есть, количественное значение резонансных единиц (RU)) стандартной ячейки без покрытия и эталонного введения (то есть, введение только буфера для разгона) вычитали из RU значений, полученных после введения сывороточных альбуминов (то есть, при использовании двух эталонов). Из значений SRP, полученных из измерений скорости диссоциации и скорости ассоциации, могут быть определены скорости диссоциации и скорости ассоциации взаимодействия соответствующих DARPin сывороточного альбумина.
Результаты подытожены в Таблице 1 и Таблице 2. Константы диссоциации (Kd) подсчитывали из оцененных скоростей диссоциации и ассоциации при использовании стандартных процедур, известных квалифицированному специалисту в данной области техники, и они оказывались в интервале от приблизительно 3 до приблизительно 300 нМ. В то время как сывороточный альбумин человека и обезьяны циномолгус связывался со всеми проанализированными DARPin, сывороточный альбумин кролика, мыши, крысы и собаки связывался только с поднабором этих DARPin.
| Таблица 1: | |||||||
| Константы диссоциации взаимодействий DARPin и сывороточного альбумина | |||||||
| Kd [нМ] (человек) | Kd [нМ] (циномолгус) | Kd [нМ] (мышь) | Kd [нМ] (крыса) | Kd [нМ] (кролик) | Kd [нМ] (собака) | ||
| DARPin #29 | 15 | 7 | о.с. | о.с. | 17 | о.с. | |
| DARPin #20 | 27 | 110 | 124 | 242 | о.с. | 185 | |
| DARPin #27 | 11 | 6 | о.с. | о.с. | 19 | о.с. | |
| DARPin #22 | 13 | 74 | 68 | 109 | о.с. | 81 | |
| DARPin #28 | 6 | 3 | о.с. | о.с. | 9 | о.с. | |
| DARPin #19 | 14 | 63 | 56 | 91 | о.с. | 77 | |
| DARPin #21 | 26 | 110 | 142 | 266 | о.с. | 180 | |
| DARPin #30 | 7 | 4 | о.с. | о.с. | 8 | о.с. | |
| Константы диссоциации для взаимодействий различных DARPin с сывороточным альбумином (из различных видов, как указано в наименовании каждой колонки) измеряли при использовании SPR. (о.с. = отсутствие способного к измерению связывания). | |||||||
| Таблица 2: | |||||||
| Константы диссоциации взаимодействий DARPin и сывороточного альбумина | |||||||
| Kd [нМ] (человек) | |||||||
| DARPin #43 | 30 | ||||||
| DARPin #44 | 39 | ||||||
| DARPin #45 | 35 | ||||||
| DARPin #46 | 43 | ||||||
| DARPin #47 | 96 | ||||||
| DARPin #48 | 68 | ||||||
| Константы диссоциации для взаимодействий различных DARPin и человеческого сывороточного альбумина измеряли при использовании SPR. | |||||||
Пример 5: Конечный период полувыведения DARPin со связывающей специфичностью для xSA
Конечный период полувыведения DARPin у мышей и обезьян циномолгус (Масаса fascicularis, также имеет аббревиатуру "cyno") определяли в соответствии со стандартными процедурами, известными квалифицированному специалисту в данной области техники (Toutain, и др., в приведенном выше месте). Определенное количество DARPin внутривенно вводили млекопитающим, и выведение DARPin из плазмы крови оценивали в течение периода времени в соответствии с его концентрацией в плазме крови. Концентрация DARPin сначала снижается до достижения псевдоравновесия (альфа-фаза), после чего происходит экспоненциальное дальнейшее снижение концентрации DARPin в плазме крови (бета-фаза). Из этой бета-фазы может быть подсчитан конечный период полувыведения DARPin.
Определение выведения DARPin из плазмы крови у мышей
Для того чтобы оценить выведение DARPin со связывающей специфичностью для xS из плазмы крови А, исследуемые белки метили радиоактивной меткой и вводили в хвостовую вену несенсибилизированных Balb/c мышей. При этом вводили следующие DARPin: DARPin #19, DARPin #21, DARPin #23, DARPin #25, DARPin #18, DARPin #32, DARPin #35, DARPin #36, DARPin #33, DARPin #34, DARPin #37, DARPin #38, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 и DARPin #48. DARPin радиоактивно метили с помощью комплекса 99mTc-карбонил, как описано ранее (Waibel, R., и др., Nature Biotechnol. 17(9), 897-901, 1999). DARPin (40 мкг) инкубировали с 99mTc-карбонилом (0,8-1,6 мКи) в течение 1 часа перед разведением до 400 мкл в PBS (рН 7,4). Каждой мыши внутривенно вводили 100 мкл меченного таким образом раствора DARPin (эквивалентный 10 мкг белка и 0,2-0,4 мКи). Образцы крови мышей собирали через 1 час, 4 часа, 24 часа и 48 часов после исходной инъекции и измеряли радиоактивность образцов. Уровень радиоактивности, измеренный в определенные моменты времени, является непосредственной мерой для количества DARPin, которые все еще присутствуют в плазме крови в этот момент времени. % введенной путем инъекции дозы представляет собой процент общей радиоактивности крови у мыши (1,6 мл для 18 г мыши), измеренной в определенный момент времени, по отношению к общей радиоактивности введенного образца, скорректированной для радиоактивного распада 99mTc.
DARPin со связывающей специфичностью для MSA обладают значительно повышенным конечным периодом полувыведения у мышей по сравнению с DARPin #32, не имеющим связывающей специфичности для xSA (Фигура 4). DARPin #19, DARPin #21, DARPin #23, DARPin #33, DARPin #37, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 и DARPin #48 имели конечный период полувыведения у мышей приблизительно 2-2,5 дня.
Определение выведения DARPin из плазмы крови у обезьян циномолгус
DARPin, разведенные в PBS, вводили в виде болюсной инъекции в подкожную латеральную вену конечности. Вводили следующие DARPin: DARPin #26 (0,5 мг/кг), DARPin #24 (0,5 мг/кг), DARPin #17 (0,5 мг/кг), DARPin #34 (1 мг/кг) и DARPin #32 (0,5 мг/кг). В различные моменты времени после инъекции получали плазму из крови, собранной из бедренной вены животных. Концентрацию DARPin в образцах плазмы крови потом определяли с помощью сэндвич ELISA при использовании стандартных прописей, известных квалифицированному специалисту в данной области техники, и приемлемой стандартной кривой DARPin с известными концентрациями DARPin.
Образцы плазмы крови обезьян циномолгус серийно разводили в PBS-C (PBS, содержащий 0,25% казеина, рН 7,4) на планшетах MaxiSorp ELISA, которые были покрыты специфическим для DARPin кроличьим моноклональным антителом. После экстенсивного промывания с помощью PBS-T (PBS с добавкой 0,1% Твин 20®, рН 7,4) планшеты инкубировали с моноклональным анти-RGS(His)4 антителом, меченным пероксидазой хрена HRP (Qiagen). Связывание определяли при использовании 100 мкл BM-Blue POD субстрата (Roche Diagnostics). Реакцию останавливали путем прибавления 50 мкл 1 М H2SO4 и измеряли поглощение при 450 нм (вычитая при этом поглощение при 620 нм). Концентрацию DARPin в образцах плазмы крови подсчитывали путем осуществления моноэкспоненциальной регрессии на стандартной кривой DARPin, разведенного в сыворотке крови обезьян (GraphPad Prism). Конечный период полувыведения из плазмы крови DARPin подсчитывали путем проведения нелинейных регрессий (двухфазный распад) на определенных значениях концентрации вплоть до 240 часов после инъекции. Период полувыведения второй (бета) фазы соответствует конечному периоду полувыведения из плазмы крови.
DARPin со связывающей специфичностью для xSA имеют повышенный конечный период полувыведения у обезьяны циномолгус по сравнению с DARPin #32, который не имеет связывающей специфичности для xSA (Фигура 5, Таблица 3). DARPin #19, DARPin #21, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 и DARPin #48 имели конечный период полувыведения у обезьян циномолгус приблизительно от 10 до 15 дней.
| Таблица 3: | |
| Оценки конечного периода полувыведения DARPin у обезьяны циномолгус (cyno) | |
| t1/2 [час.] | |
| DARPin #32 | 0,2 |
| DARPin #26 | 129 |
| DARPin #34 | 111 |
| DARPin #17 | 40 |
| DARPin #24 | 126 |
| DARPin #19 | 288 |
| DARPin #21 | 384 |
| DARPin #28 | 144 |
| Оценки фармакокинетического параметра t1/2: конечный период полувыведения из плазмы крови | |
Пример 6: Более высокая термальная стабильность DARPin с улучшенными С-терминальными кэппирующими модулями
Термальную стабильность DARPin подвергали анализу с помощью анализа стабильности на основе флуоресценции так, как описывается в Примере 3. Альтернативно, термальную стабильность DARPin анализировали при использовании CD спектрометрии; то есть путем измерения их тепловой денатурации в соответствии с их сигналом циркулярного дихроизма (CD) при 222 нм с помощью методик, хорошо известных квалифицированному специалисту в данной области техники. CD сигнал образца регистрировали при 222 нм в устройстве Jasco J-715 (Jasco, Japan) при медленном нагревании белка при концентрации 0,02 мМ в PBS рН 7,4 от 20°С до 95°С при использовании скорости изменения 1°С за минуту. Этот способ представляет собой эффективное средство отслеживать денатурацию DARPin, поскольку они в основном состоят из альфа-спиралей, которые демонстрируют сильное изменение своего CD сигнала при 222 нм при развертывании. Срединная точка наблюдаемого перехода такого измеренного CD сигнала для DARPin соответствует их значению Tm.
Термальная стабильность DARPin #37 (SEQ ID NO: 37 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом) сравнивали с термальной стабильностью DARPin #38 (SEQ ID NO: 38 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом) при использовании анализа термальной стабильности на основе флуоресценции. Эти два DARPin обладают идентичной аминокислотной последовательностью за исключением С-терминальных кэппирующих модулей своих повторяемых доменов. Повторяемый домен DARPin #38, но не DARPin #37, включает улучшенный С-кэппирующий модуль, как описывается в данной заявке. Значения Tm в PBS рН 7, определенные для DARPin #37 и DARPin #38, составляли приблизительно 63°С и приблизительно 73°С, соответственно. Значения Tm в MES буфере рН 5,8, определенные для DARPin #37 и DARPin #38, составляли приблизительно 54,5°С и приблизительно 66°С, соответственно.
Термальную стабильность DARPin #39 (SEQ ID NO: 39 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом) сравнивали с термальной стабильностью DARPin #40 (SEQ ID NO: 40 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 15), слитой с его N-терминальным концом) при использовании анализа термальной стабильности на основе флуоресценции. Эти два DARPin обладают идентичной аминокислотной последовательностью за исключением С-терминальных кэппирующих модулей своих повторяемых доменов. Повторяемый домен DARPin DARPin #40, но не DARPin #39, включает улучшенный С-кэппирующий модуль, как описывается в данной заявке. Значения Tm в MES буфере рН 5,8, определенные для DARPin #39 и DARPin #40, составляли приблизительно 51°С и приблизительно 55°С, соответственно.
Термальную стабильность DARPin #41 (SEQ ID NO: 41) сравнивали с термальной стабильностью DARPin #42 (SEQ ID NO: 42) при использовании CD спектроскопии. Эти два DARPin обладают идентичной аминокислотной последовательностью за исключением С-терминальных кэппирующих модулей своих повторяемых доменов. Повторяемый домен DARPin #42, но не DARPin #41, включает улучшенный С-кэппирующий модуль, как описывается в данной заявке. Значения Tm в PBS рН 7,4, определенные для DARPin #41 и DARPin #42, составляли приблизительно 59,5°С и приблизительно 73°С соответственно.
Claims (118)
1. Связывающий белок, включающий один домен анкиринового повтора, где указанный домен анкиринового повтора имеет связывающую специфичность для сывороточного альбумина млекопитающих и где указанный домен анкиринового повтора включает
(а) N-терминальный кэппинг модуль, (б) С-терминальный кэппинг модуль и (в) модуль анкиринового повтора, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
1) SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52,
(2) последовательностей, где вплоть до 3 аминокислот в SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 заменены другими аминокислотами,
(3) аминокислотную последовательность
X1DX2X3X4X5TPLHLAAX6X7GHLX8IVEVLLKX9GADVNA (SEQ ID NO: 53),
где X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из A, D, М, F, S, I, Т, N, Y и K;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, K, D, F, М, N, I и Y;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из W, R, N, Т, Н, K, А и F;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и S;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, Т и Н;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, V и R;
Х7 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, Y, N, D, Н, S, A, Q, Т и G;
Х8 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е и K;
Х9 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S, A, Y, Н и N; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как X в SEQ ID NO: 53, заменены какой-либо аминокислотой;
(4) аминокислотную последовательность
X1DX2X3GX4TPLHLAAX5X6GHLEIVEVLLKX7GADVNA (SEQ ID NO: 10),
где X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из A, D, М, F, S, I, Т, N, Y и K;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, K, D, F, М, N, I и Y;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из W, R, N, Т, Н, K, А и F;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, Т и Н;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, V и R;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, Y, N, D, Н, S, A, Q, Т и G;
Х7 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S, A, Y, Н и N; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 10, заменены какой-либо аминокислотой;
(5) аминокислотную последовательность
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO: 11),
где X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, K и А;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, G и S;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, N, D, Н, S, A, Q, Т и G;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и D;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, K и G;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Н, Y, А и N; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как X в SEQ ID NO: 11, заменены какой-либо аминокислотой.
(6) аминокислотную последовательность
X1DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO: 54),
где Х1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из F, S, L и K;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и А;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и K;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S и N;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, D, Q, S, А, Т и Е;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, Н, Y, S и N; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как X в SEQ ID NO: 54, заменены какой-либо аминокислотой;
(7) аминокислотную последовательность
X1DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO: 12),
где X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из F, S, L и K;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и А;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и K;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S и N;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, Н, Y, S и N; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как X в SEQ ID NO: 12, заменены какой-либо аминокислотой;
(8) аминокислотную последовательность
X1DX2X3GTTPLHLAAVYGHLEX4VEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO: 13),
где X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из K, A, D, М, F, S, I, Т, N, и Y;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, K, D, F, М, N и Y;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R, N, Т, Н, K, А и F;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из I и М;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Н, Y, K, А и N; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как X в SEQ ID NO: 13, заменены какой-либо аминокислотой;
(9) аминокислотную последовательность
X1NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEQ ID NO: 14),
где X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Q и K;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из L и Р;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Н, N, Y и А;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и S;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, V, Т и S;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и F; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как X в SEQ ID NO: 14, заменены какой-либо аминокислотой.
2. Связывающий белок, включающий один домен анкиринового повтора, где указанный домен анкиринового повтора содержит N-терминальный кэппинг модуль, С-терминальный кэппинг модуль и модуль анкиринового повтора, где указанный домен анкиринового повтора имеет связывающую специфичность для сывороточного альбумина млекопитающих и где указанный домен анкиринового повтора включает аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 90%-ную идентичность аминокислотной последовательности с одним доменом анкиринового повтора, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-31 и 43-48, в котором G в положении 1 и/или S в положении 2 указанного домена анкиринового повтора необязательно отсутствует.
3. Связывающий белок по п. 1 или 2, где аминокислотная последовательность указанного модуля анкиринового повтора выбрана из группы, состоящей из (1) SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 и (2) последовательностей, где вплоть до 2 аминокислот в SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 заменены какой-либо аминокислотой.
4. Связывающий белок по п. 1 или 2, где указанный модуль анкиринового повтора содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49.
5. Связывающий белок, содержащий домен анкиринового повтора, где указанный домен анкиринового повтора имеет связывающую специфичность к сывороточному альбумину млекопитающих и где указанный домен анкиринового повтора содержит (а) N-терминальный кэппинг модуль, (б) С-терминальный кэппинг модуль и (в) модуль анкиринового повтора, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (1) SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 и (2) последовательностей, где вплоть до 3 аминокислот в SEQ ID NO: 49, 50, 51 и 52 заменены какой-либо аминокислотой и где указанный связывающий белок дополнительно включает биоактивное соединение и где указанный связывающий белок обладает по крайней мере в 2 раза более высоким конечным периодом полувыведения из плазмы у млекопитающего по сравнению с конечным периодом полувыведения указанного немодифицированного биоактивного соединения, где указанный более высокий конечный период полувыведения придается указанному связывающему белку с помощью указанного домена анкиринового повтора.
6. Связывающий белок п. 1 или 2, где указанный модуль анкиринового повтора имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (1) SEQ ID NO: 50 и (2) последовательностей, где вплоть до 2 аминокислот в SEQ ID NO: 50 заменены другими аминокислотами.
7. Связывающий белок по п. 1 или 2, где указанный домен анкиринового повтора включает аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с доменом анкиринового повтора SEQ ID NO: 46, где G в положении 1 и/или S в положении 2 указанного домена анкиринового повтора необязательно пропущены.
8. Связывающий белок по п. 1 или 2, где указанный модуль анкиринового повтора содержит аминокислотную последовательность
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO: 11), в которой
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, K и А;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, G и S;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, N, D, Н, S, A, Q, Т и G;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и D;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, K и G;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Н, Y, А и N; и
необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены X в SEQ ID NO: 11, заменены какой-либо аминокислотой.
9. Связывающий белок по п. 1 или 2, где указанный модуль анкиринового повтора содержит аминокислотную последовательность
X1DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO: 54), в которой
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из F, S, L и K;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и А;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и K;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S и N;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из N, D, Q, S, А, Т и Е;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, Н, Y, S и N; и
необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены X в SEQ ID NO: 54, заменены какой-либо аминокислотой.
10. Связывающий белок по п. 1 или 2, где указанный модуль анкиринового повтора содержит аминокислотную последовательность
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO: 11),
где X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из K и А;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и S;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Q и N;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и D;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е и K;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А и Y; и
необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 11, заменены какой-либо аминокислотой.
11. Связывающий белок по п. 1 или 2, где указанный модуль анкиринового повтора имеет аминокислотную последовательность
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEQ ID NO: 11),
где X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, K и А;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, G и S;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, N, D, Н, S, A, Q, Т и G;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из G и D;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Е, K и G;
Х6 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Н, Y, А и N; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как X в SEQ ID NO: 11, заменены какой-либо аминокислотой;
и где указанный домен анкиринового домена дополнительно содержит модуль анкиринового повтора, имеющий аминокислотную последовательность
X1DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEQ ID NO: 12), в котором
X1 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из F, S, L и K;
Х2 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и А;
Х3 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R и K;
Х4 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из S и N;
Х5 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А, Н, Y, S и N; и необязательно вплоть до 2 аминокислот в положениях, отличных от тех, которые обозначены как Х в SEQ ID NO: 12, заменены какой-либо аминокислотой,
и где модулю анкиринового повтора, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, предшествует модуль анкиринового повтора, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
12. Связывающий белок, содержащий домен анкиринового повтора, где указанный домен анкиринового повтора содержит N-терминальный кэппинг модуль, С-терминальный кэппинг модуль и модуль анкиринового повтора, где указанный домен анкиринового повтора имеет связывающую специфичность к сывороточному альбумину млекопитающих и где указанный домен анкиринового повтора содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности с одним доменом анкиринового повтора, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NOs - 17 до 31 и 43 до 48, где G в положении 1 и/или S в положении 2 указанного домена анкиринового повтора необязательно отсутствует и где указанный связывающий белок дополнительно включает биоактивное соединение и где указанный связывающий белок обладает по меньшей мере в два раза более высоким конечным периодом полувыведения из плазмы у млекопитающего по сравнению с конечным периодом полувыведения указанного немодифицированного биоактивного соединения, где указанный высокий конечный период полувыведения придается указанном связывающему белку с помощью указанного домена анкиринового повтора.
13. Связывающий белок в по любому из пп. 1, 2, 5 и 12, где указанный домен анкиринового повтора конкурирует за связывание с сывороточным альбумином млекопитающих с доменом анкиринового повтора, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-31 и 43-48.
14. Связывающий белок по п. 1 или 2, где указанный домен анкиринового повтора включает аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью домена анкиринового повтора выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-31 и 43-48, в котором G в положении 1 и/или S в положении 2 указанного домена анкиринового повтора являются необязательно отсутствующими.
15. Связывающий белок по любому из пп. 1-14, где указанный домен анкиринового повтора обладает по меньшей мере в пять раз более высоким конечным периодом полувыведения из плазмы у млекопитающего по сравнению с доменом анкиринового повтора SEQ ID NO: 32.
16. Связывающий белок по любому из пп. 1-14, где указанный домен анкиринового повтора обладает конечным периодом полувыведения из плазмы у человека по меньшей мере 1 день.
17. Нуклеиновая кислота, которая кодирует молекулу анкиринового повтора по любому из пп. 1, 3, 4, 6 и 8-10, два модуля анкиринового повтора по п. 11 или домен анкиринового повтора по любому из пп. 2, 7 и 14.
18. Фармацевтическая композиция для лечения рака и других патологических состояний, включающая эффективное количество связывающего белка по любому из пп. 1-16 или нуклеиновую кислоту по п. 17 и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP10192711.9 | 2010-11-26 | ||
| EP10192711 | 2010-11-26 | ||
| PCT/EP2011/071083 WO2012069654A1 (en) | 2010-11-26 | 2011-11-25 | Designed repeat proteins binding to serum albumin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013128896A RU2013128896A (ru) | 2015-01-10 |
| RU2625882C2 true RU2625882C2 (ru) | 2017-07-20 |
Family
ID=43858162
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013128896A RU2625882C2 (ru) | 2010-11-26 | 2011-11-25 | Сконструированные белки повторов, которые связываются с сывороточным альбумином |
| RU2013128895A RU2636552C2 (ru) | 2010-11-26 | 2011-11-25 | Улучшенные n-терминальные кэппинг модули для сконструированных белков с анкириновым повтором |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013128895A RU2636552C2 (ru) | 2010-11-26 | 2011-11-25 | Улучшенные n-терминальные кэппинг модули для сконструированных белков с анкириновым повтором |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US9284361B2 (ru) |
| EP (3) | EP2643348A2 (ru) |
| JP (3) | JP6105479B2 (ru) |
| KR (3) | KR101782790B1 (ru) |
| CN (3) | CN103403024B (ru) |
| AU (2) | AU2011333666B2 (ru) |
| BR (3) | BR112013012786B1 (ru) |
| CA (2) | CA2818969C (ru) |
| DK (1) | DK2643349T3 (ru) |
| ES (2) | ES2981441T3 (ru) |
| PL (1) | PL2643349T3 (ru) |
| RU (2) | RU2625882C2 (ru) |
| WO (2) | WO2012069655A2 (ru) |
Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR081361A1 (es) | 2010-04-30 | 2012-08-29 | Molecular Partners Ag | Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a |
| KR101782790B1 (ko) | 2010-11-26 | 2017-09-28 | 몰리큘라 파트너스 아게 | 혈청 알부민에 결합하는 설계된 반복 단백질 |
| PT2846836T (pt) | 2012-05-07 | 2019-10-29 | Allergan Inc | Método de tratamento de dmi em doentes refratários à terapia anti-vegf |
| KR20150023957A (ko) * | 2012-06-28 | 2015-03-05 | 몰리큘라 파트너스 아게 | 혈소판-유래 성장인자에 결합하는 설계된 안키린 반복 단백질 |
| WO2014060365A1 (en) * | 2012-10-15 | 2014-04-24 | Universität Zürich Prorektorat Mnw | Bispecific her2 ligands for cancer therapy |
| WO2020074469A1 (en) | 2018-10-08 | 2020-04-16 | Universität Zürich | Her2-binding tetrameric polypeptides |
| EP2738180A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-04 | Molecular Partners AG | Binding proteins comprising at least two binding domains against HER2. |
| CN105143270B (zh) * | 2013-02-26 | 2019-11-12 | 罗切格利卡特公司 | 双特异性t细胞活化抗原结合分子 |
| US11453708B2 (en) | 2013-05-31 | 2022-09-27 | Molecular Partners Ag | Designed ankyrin repeat proteins binding to hepatocyte growth factor |
| KR20150097304A (ko) | 2014-02-18 | 2015-08-26 | 삼성전자주식회사 | 항 EGFR DARPin을 포함하는 EGFR/HER2 이중 특이 항체 |
| ES2834849T3 (es) | 2014-07-07 | 2021-06-18 | Yeda Res & Dev | Método de diseño computacional de proteínas |
| EP4272838A3 (en) | 2015-04-02 | 2024-01-10 | Molecular Partners AG | Designed ankyrin repeat domains with binding specificity for serum albumin |
| CN109790206A (zh) | 2016-09-22 | 2019-05-21 | 分子组合公司 | 重组结合蛋白及其用途 |
| CN117285626A (zh) * | 2016-11-01 | 2023-12-26 | 箭头药业股份有限公司 | αvβ6整联蛋白配体及其应用 |
| US11127483B2 (en) | 2017-03-07 | 2021-09-21 | Igc Bio, Inc. | Computational pipeline for antibody modeling and design |
| EP3623382A1 (en) | 2018-09-14 | 2020-03-18 | Universität Zürich | Ligands to gm-csf or gm-csf-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-hct |
| US11655293B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-05-23 | Universitat Zurich | Ligands to GM-CSF or GM-CSF-receptor for use in leukemia in a patient having undergone allo-HCT |
| CA3094176A1 (en) | 2018-03-22 | 2019-09-26 | Charite-Universitatsmedizin Berlin | Crispr associated protein reactive t cell immunity |
| WO2019238966A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Universität Bern | LIGANDS TO LIGHT OR ITS RECEPTOR LTßR FOR USE IN HAEMATOLOGIC MALIGNANCIES |
| US20220017433A1 (en) | 2018-11-21 | 2022-01-20 | Universität Zürich | Photochemically induced conjugation of radiometals to small molecules, peptides and nanoparticles in a simultaneous one-pot reaction |
| EP3677911A3 (en) | 2019-01-03 | 2020-07-29 | Universität Basel | Use of non-agonist ligands for suppression of metastasis |
| WO2020144378A1 (en) | 2019-01-11 | 2020-07-16 | Universitätsspital Basel | Sglt-2 inhibitors or il-1r antagonists for reduction of hypoglycaemia after bariatric surgery |
| WO2020207771A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Universität Zürich | A method for determining the likelihood of a patient being responsive to cancer immunotherapy |
| BR112021024231A2 (pt) * | 2019-06-04 | 2022-04-26 | Molecular Partners Ag | Proteínas de ligação fap recombinantes e uso da mesma |
| CN114206908A (zh) * | 2019-06-04 | 2022-03-18 | 分子伴侣公司 | 具有改善的稳定性的经设计的锚蛋白重复结构域 |
| AR119080A1 (es) | 2019-06-04 | 2021-11-24 | Molecular Partners Ag | Proteínas multiespecíficas |
| EP4025693A1 (en) | 2019-09-05 | 2022-07-13 | Genome Biologics UG | Inhibition of mthfd1l for use in hypertrophic heart disease and heart failure |
| JP2023506763A (ja) | 2019-12-11 | 2023-02-20 | モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト | 組換えペプチド－ｍｈｃ複合体結合タンパク質並びにそれらの生成及び使用 |
| BR112022011456A2 (pt) | 2019-12-11 | 2022-08-23 | Molecular Partners Ag | Proteínas recombinantes de ligação a complexo de peptídeo-mhc e geração e uso das mesmas |
| WO2021122813A1 (en) | 2019-12-16 | 2021-06-24 | Universität Basel | Angiogenesis promoting agents for prevention of metastatic cancer |
| WO2021176008A1 (en) | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Cornell University | Agents targeting baf155 or brg1 for use in treatment of advanced prostate cancer |
| US20230151118A1 (en) | 2020-04-06 | 2023-05-18 | Universität Zürich | Artc1 ligands for cancer treatment |
| US11466062B2 (en) | 2020-05-06 | 2022-10-11 | Molecular Partners Ag | Ankyrin repeat binding proteins and their uses |
| CA3178478A1 (en) * | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Valerie Perrine Calabro | Recombinant cd40 binding proteins and their use |
| CA3178785A1 (en) | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Nicolo RIGAMONTI | Multispecific proteins |
| KR20230012559A (ko) | 2020-05-19 | 2023-01-26 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 암 치료를 위한 결합 분자 |
| WO2021239844A1 (en) | 2020-05-27 | 2021-12-02 | Universitätsspital Basel | Sglt-2 inhibitors or il-1r antagonists for reduction of hypoglycaemia in prediabetes |
| WO2021239999A1 (en) | 2020-05-28 | 2021-12-02 | Universität Zürich | Il-12 pd-l1 ligand fusion protein |
| EP3957649A1 (en) * | 2020-08-18 | 2022-02-23 | Athebio AG | Improved n-terminal capping modules of ankyrin repeat domains |
| US20230303680A1 (en) | 2020-08-18 | 2023-09-28 | Universität Zürich | A cd25-biased anti-il-2 antibody |
| US11981710B2 (en) | 2020-08-18 | 2024-05-14 | Athebio Ag | N-terminal capping modules of ankyrin repeat domains |
| CN114106194B (zh) * | 2020-08-31 | 2024-01-16 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种用于治疗糖尿病和/或肥胖症的融合蛋白 |
| WO2022098745A1 (en) | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Indi Molecular, Inc. | Compositions, delivery systems, and methods useful in tumor therapy |
| WO2022098743A1 (en) | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Indi Molecular, Inc. | Compositions, imaging, and therapeutic methods targeting folate receptor 1 (folr1) |
| JP2023554379A (ja) | 2020-12-16 | 2023-12-27 | モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト | 組換えｃｄ３結合タンパク質及びそれらの使用 |
| JP2023554351A (ja) | 2020-12-16 | 2023-12-27 | モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト | 新規の徐放性プロドラッグ |
| WO2022171831A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-18 | Universität Zürich | Use of markers found on lymph node metastatic samples for the prognosis of breast cancer |
| EP4043481A1 (en) | 2021-02-15 | 2022-08-17 | Affilogic | Compounds and methods for extending half life of biomolecules |
| KR20230155464A (ko) | 2021-03-09 | 2023-11-10 | 몰리큘라 파트너스 아게 | 신규한 DARPin-기반 다중특이성 T-세포 인게이저 |
| JP2024509241A (ja) | 2021-03-09 | 2024-02-29 | モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト | 新規のＤＡＲＰｉｎに基づくＣＤ１２３エンゲージャ |
| JP2024509890A (ja) | 2021-03-09 | 2024-03-05 | モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト | プロテアーゼ切断可能なプロドラッグ |
| AU2022231913A1 (en) | 2021-03-09 | 2023-09-28 | Molecular Partners Ag | Novel darpin based cd33 engagers |
| WO2022219185A1 (en) | 2021-04-16 | 2022-10-20 | Athebio Ag | N-terminal capping modules of ankyrin repeat domains |
| CA3227299A1 (en) | 2021-08-05 | 2023-02-09 | Immunos Therapeutics Ag | Pharmaceutical compositions comprising hla fusion proteins |
| JP2024530040A (ja) | 2021-08-05 | 2024-08-14 | イムノス セラピューティクス アーゲー | Ｈｌａ融合タンパク質を含む併用医薬 |
| WO2023021006A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Universität Zürich | Il-1 targeting agents for treatment of pitiyriasis rubra pilaris |
| WO2023021050A1 (en) | 2021-08-17 | 2023-02-23 | Athebio Ag | Variants of ankyrin repeat domains |
| EP4137508A1 (en) | 2021-08-17 | 2023-02-22 | Athebio AG | Variants of ankyrin repeat domains |
| WO2023036849A1 (en) | 2021-09-07 | 2023-03-16 | ETH Zürich | Identifying and predicting future coronavirus variants |
| EP4163380A1 (en) | 2021-10-08 | 2023-04-12 | ETH Zurich | Device and method for manipulation of extracellular vesicles |
| WO2023110983A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-22 | Molecular Partners Ag | Designed repeat domains with dual binding specificity and their use |
| WO2023110942A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-22 | Charité-Universitätsmedizin Berlin | Prevention of impaired fracture healing |
| EP4260907A1 (en) | 2022-04-11 | 2023-10-18 | Universität Zürich | Agents for treatment of endometriosis and other benign gynecological neoplasms |
| WO2024002914A1 (en) | 2022-06-27 | 2024-01-04 | Charité-Universitätsmedizin Berlin | Prediction of, and composition to improve, tendon healing |
| WO2024028278A1 (en) | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Molecular Partners Ag | Charge modified designed repeat domains and their use |
| WO2024037743A1 (en) | 2022-08-16 | 2024-02-22 | Athebio Ag | Variants of ankyrin repeat domains |
| WO2023194628A2 (en) | 2022-08-16 | 2023-10-12 | Athebio Ag | Variants of ankyrin repeat domains |
| WO2024038307A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Novartis Ag | Dosing regimens for sars-cov-2 binding molecules |
| WO2024064200A2 (en) * | 2022-09-20 | 2024-03-28 | The Texas A&M University System | Darpin-containing compositions and methods thereof |
| WO2024133013A1 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. | Means and methods to target endogenous condensates |
| WO2024165671A1 (en) | 2023-02-08 | 2024-08-15 | Immunos Therapeutics Ag | FUSION PROTEINS OF ß2 MICROGLOBULIN, HLA HEAVY CHAIN POLYPEPTIDES, AND INHIBITOR OF CD47-SIRPA |
| US20240368250A1 (en) | 2023-02-17 | 2024-11-07 | Ablynx N.V. | Polypeptides binding to the neonatal fc receptor |
| WO2024179981A1 (en) | 2023-02-27 | 2024-09-06 | Molecular Partners Ag | Darpins for use in reducing renal accumulation of drugs |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005087797A1 (en) * | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Microbia, Inc. | Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders |
| RU2299208C2 (ru) * | 2001-05-08 | 2007-05-20 | Шеринг Акциенгезельшафт | Антраниламидпиридинамиды избирательного действия в качестве ингибиторов vegfr-2 и vegfr-3 |
| WO2008043822A2 (en) * | 2006-10-11 | 2008-04-17 | Ablynx N. V. | Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner |
| WO2009115919A2 (en) * | 2008-03-19 | 2009-09-24 | Institut Pasteur | Reagentless fluorescent biosensors comprising a designed ankyrin repeat protein module, rational design methods to create reagentless fluorescent biosensors and methods of their use |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0768377A1 (en) | 1988-09-02 | 1997-04-16 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of recombinant varied binding proteins |
| SE509359C2 (sv) | 1989-08-01 | 1999-01-18 | Cemu Bioteknik Ab | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel |
| US5270170A (en) | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
| US5348867A (en) | 1991-11-15 | 1994-09-20 | George Georgiou | Expression of proteins on bacterial surface |
| CA2196496A1 (en) | 1997-01-31 | 1998-07-31 | Stephen William Watson Michnick | Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions |
| EP0975748B1 (en) | 1997-04-23 | 2006-03-29 | Universität Zürich | Methods for identifying nucleic acid molecules encoding (poly)peptides that interact with target molecules |
| IL143238A0 (en) | 1998-12-02 | 2002-04-21 | Phylos Inc | Dna-protein fusions and uses thereof |
| DE60041564D1 (de) | 1999-12-24 | 2009-03-26 | Genentech Inc | Verfahren und Zusammensetzungen zur Verlängerung der Entsorgungshalbwertszeit von biowirksamen Verbindungen |
| US20060228364A1 (en) | 1999-12-24 | 2006-10-12 | Genentech, Inc. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
| WO2002020565A2 (en) | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Universität Zürich | Collections of repeat proteins comprising repeat modules |
| US9321832B2 (en) | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
| DE60305919T2 (de) | 2002-06-28 | 2007-01-18 | Domantis Limited, Cambridge | Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit |
| US7696320B2 (en) | 2004-08-24 | 2010-04-13 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor |
| CN102584997A (zh) | 2002-11-08 | 2012-07-18 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 针对肿瘤坏死因子-α的单结构域抗体及其用途 |
| EP2258392A1 (en) | 2002-11-08 | 2010-12-08 | Ablynx N.V. | Method of administering therapeutic polypeptides |
| EP2380594B1 (en) | 2004-04-06 | 2019-12-04 | Affibody AB | Use of a serum albumin binding peptide to reduce the immunogenicity of a protein |
| AU2005293752A1 (en) | 2004-10-13 | 2006-04-20 | Ablynx N.V. | Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as Alzheimer's disease |
| DK1888640T3 (da) | 2005-05-18 | 2012-06-18 | Ablynx Nv | Forbedrede nanobodies mod tumornekrosefaktor-alfa |
| ES2335136T3 (es) | 2005-07-08 | 2010-03-22 | University Of Zurich | Expresion fagica mediante translocacion cotraduccional de polipeptidos de fusion. |
| DK2402754T4 (da) | 2006-03-06 | 2023-08-28 | Amunix Operating Inc | Ustrukturerede rekombinante polymerer og anvendelser deraf |
| EP2069402A2 (en) | 2006-09-08 | 2009-06-17 | Ablynx N.V. | Serum albumin binding proteins with long half-lives |
| JP2010505435A (ja) | 2006-10-11 | 2010-02-25 | アブリンクス エン．ヴェー． | 本質的にｐＨに非依存的に血清タンパク質に結合するアミノ酸配列、それを含む化合物、およびその使用 |
| WO2008097497A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-14 | Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R & D Company | Vegf pathway blockade |
| EP2369005B1 (en) | 2007-06-21 | 2013-04-03 | Technische Universität München | Biological active proteins having increased in vivo and/or in vitro stability |
| EP2546261A3 (en) | 2007-07-31 | 2013-08-14 | Affibody AB | New compositions, methods and use |
| EP2198022B1 (en) | 2007-09-24 | 2024-03-06 | University Of Zurich | Designed armadillo repeat proteins |
| CN102272148A (zh) * | 2008-11-03 | 2011-12-07 | 分子组合公司 | 抑制vegf-a受体相互作用的结合蛋白 |
| AR081361A1 (es) | 2010-04-30 | 2012-08-29 | Molecular Partners Ag | Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a |
| US9154968B2 (en) * | 2010-11-03 | 2015-10-06 | Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) | Radio base station and a method therein |
| KR101782790B1 (ko) | 2010-11-26 | 2017-09-28 | 몰리큘라 파트너스 아게 | 혈청 알부민에 결합하는 설계된 반복 단백질 |
| EP2702069A4 (en) | 2011-04-29 | 2015-04-29 | Janssen Biotech Inc | IL4 / IL13 BINDING REPEAT PROTEINS AND USES THEREOF |
| KR20150023957A (ko) * | 2012-06-28 | 2015-03-05 | 몰리큘라 파트너스 아게 | 혈소판-유래 성장인자에 결합하는 설계된 안키린 반복 단백질 |
| EP2738180A1 (en) * | 2012-11-30 | 2014-06-04 | Molecular Partners AG | Binding proteins comprising at least two binding domains against HER2. |
| EP4272838A3 (en) * | 2015-04-02 | 2024-01-10 | Molecular Partners AG | Designed ankyrin repeat domains with binding specificity for serum albumin |
-
2011
- 2011-11-25 KR KR1020137014067A patent/KR101782790B1/ko active IP Right Grant
- 2011-11-25 CA CA2818969A patent/CA2818969C/en active Active
- 2011-11-25 EP EP11788152.4A patent/EP2643348A2/en active Pending
- 2011-11-25 KR KR1020177010815A patent/KR101838037B1/ko active IP Right Grant
- 2011-11-25 CN CN201180066084.3A patent/CN103403024B/zh active Active
- 2011-11-25 US US13/989,174 patent/US9284361B2/en active Active
- 2011-11-25 BR BR112013012786-4A patent/BR112013012786B1/pt active IP Right Grant
- 2011-11-25 WO PCT/EP2011/071084 patent/WO2012069655A2/en active Application Filing
- 2011-11-25 PL PL11788815T patent/PL2643349T3/pl unknown
- 2011-11-25 JP JP2013540386A patent/JP6105479B2/ja active Active
- 2011-11-25 RU RU2013128896A patent/RU2625882C2/ru active
- 2011-11-25 AU AU2011333666A patent/AU2011333666B2/en active Active
- 2011-11-25 CN CN202110301133.2A patent/CN113278077A/zh active Pending
- 2011-11-25 AU AU2011333665A patent/AU2011333665B2/en active Active
- 2011-11-25 CA CA2818990A patent/CA2818990C/en active Active
- 2011-11-25 US US13/989,181 patent/US9221892B2/en active Active
- 2011-11-25 BR BR112013013043A patent/BR112013013043A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-11-25 JP JP2013540387A patent/JP6173216B2/ja active Active
- 2011-11-25 KR KR1020137014339A patent/KR20140032356A/ko active Application Filing
- 2011-11-25 ES ES19160342T patent/ES2981441T3/es active Active
- 2011-11-25 ES ES11788815T patent/ES2758352T3/es active Active
- 2011-11-25 CN CN201180066086.2A patent/CN103459415B/zh active Active
- 2011-11-25 WO PCT/EP2011/071083 patent/WO2012069654A1/en active Application Filing
- 2011-11-25 DK DK11788815T patent/DK2643349T3/da active
- 2011-11-25 RU RU2013128895A patent/RU2636552C2/ru active
- 2011-11-25 EP EP11788815.6A patent/EP2643349B1/en active Active
- 2011-11-25 EP EP19160342.2A patent/EP3514169B1/en active Active
- 2011-11-25 BR BR122020011428-2A patent/BR122020011428B1/pt active IP Right Grant
-
2015
- 2015-11-20 US US14/947,148 patent/US9717802B2/en active Active
-
2016
- 2016-02-02 US US15/013,092 patent/US9775912B2/en active Active
- 2016-10-28 JP JP2016211658A patent/JP2017048216A/ja active Pending
-
2017
- 2017-06-23 US US15/631,028 patent/US10322190B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2299208C2 (ru) * | 2001-05-08 | 2007-05-20 | Шеринг Акциенгезельшафт | Антраниламидпиридинамиды избирательного действия в качестве ингибиторов vegfr-2 и vegfr-3 |
| WO2005087797A1 (en) * | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Microbia, Inc. | Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders |
| WO2008043822A2 (en) * | 2006-10-11 | 2008-04-17 | Ablynx N. V. | Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner |
| WO2009115919A2 (en) * | 2008-03-19 | 2009-09-24 | Institut Pasteur | Reagentless fluorescent biosensors comprising a designed ankyrin repeat protein module, rational design methods to create reagentless fluorescent biosensors and methods of their use |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BRADLEY C.M. et al, Limits of cooperativity in a structurally modular protein: response of the Notch ankyrin domain to analogous alanine substitutions in each repeat, J. Mol. Biol., 2002, v.324, p.373-386. * |
| BRADLEY C.M. et al, Limits of cooperativity in a structurally modular protein: response of the Notch ankyrin domain to analogous alanine substitutions in each repeat, J. Mol. Biol., 2002, v.324, p.373-386. INTERLANDI G. et al., Characterization and Further Stabilization of Designed Ankyrin Repeat Proteins by Combining Molecular Dynamics Simulations and Experiments J. Mol. Biol., 2008, v.375, p.837-854. * |
| INTERLANDI G. et al., Characterization and Further Stabilization of Designed Ankyrin Repeat Proteins by Combining Molecular Dynamics Simulations and Experiments J. Mol. Biol., 2008, v.375, p.837-854. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2625882C2 (ru) | Сконструированные белки повторов, которые связываются с сывороточным альбумином | |
| CN107614514B (zh) | 利用IgG结合肽的抗体特异性修饰 | |
| JP6486908B2 (ja) | 肝細胞増殖因子に結合する設計アンキリン反復タンパク質 | |
| US20240100129A1 (en) | Serum Albumin-Binding Fibronectin Type III Domains | |
| JP2022535106A (ja) | 改善された安定性を有する設計されたアンキリン反復ドメイン | |
| JP2016027801A (ja) | 改良された抗血清アルブミン結合変異体 | |
| JP2023507884A (ja) | 半減期が延長した薬物およびそのライブラリー、ならびに製造方法と使用 | |
| US10550158B2 (en) | Antigen peptide complex for improved production of anti-peptide antibodies | |
| TWI787151B (zh) | 藉由ＩｇＧ結合肽之抗體之特異性裝飾 |