JP2023506763A - 組換えペプチド－ｍｈｃ複合体結合タンパク質並びにそれらの生成及び使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質を製造する方法に関する。本発明はまた、１個、２個又はそれより多数の設計された反復ドメイン、好ましくは設計されたアンキリン反復ドメインを含む、ｐＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質と、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を更に含むこのような結合タンパク質とに関する。加えて、本発明は、このような結合タンパク質又は反復ドメインをコードする核酸、このような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びこのような結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の、癌、感染症及び自己免疫疾患を含む疾患を処置又は診断するための方法における使用に関する。
Description
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年１２月１１日に出願された欧州特許第１９２１５４３６．７号明細書に対する優先権の利益を主張する。この特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１２月１１日に出願された欧州特許第１９２１５４３６．７号明細書に対する優先権の利益を主張する。この特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示の分野
本発明は、ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質を生産する方法に関する。本発明はまた、１個、２個又はそれより多数の設計された反復ドメイン、好ましくは設計されたアンキリン反復ドメインを含む、ｐＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質と、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を更に含むこのような結合タンパク質とに関する。加えて、本発明は、このような結合タンパク質又は反復ドメインをコードする核酸、このような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びこのような結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の、癌、感染症及び自己免疫疾患を含む疾患を処置又は診断するための方法における使用に関する。
本発明は、ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質を生産する方法に関する。本発明はまた、１個、２個又はそれより多数の設計された反復ドメイン、好ましくは設計されたアンキリン反復ドメインを含む、ｐＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質と、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を更に含むこのような結合タンパク質とに関する。加えて、本発明は、このような結合タンパク質又は反復ドメインをコードする核酸、このような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びこのような結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の、癌、感染症及び自己免疫疾患を含む疾患を処置又は診断するための方法における使用に関する。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、細胞内の異常なタンパク質又は外来タンパク質の監視において重要な役割を担っている。内在性タンパク質に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝へと装填され、次いで細胞表面上に現れる。このようなＭＨＣクラスＩ複合体は、悪性細胞を含む全ての有核細胞において発現する。ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体は、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ペプチド－ＭＨＣ複合体の提示は、細胞内環境のスナップショットを循環ＣＴＬに提供する（Ｒｅｅｖｅｓ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５０：１６－２４（２０１６））。ＣＴＬは、異常な抗原又は外来抗原、例えば、癌タンパク質又は細菌タンパク質若しくはウイルスタンパク質を検出することに応答して活性化され、提示細胞の破壊をもたらす。ＣＴＬはまた、「自己」抗原を誤認識するとある特定の自己免疫疾患においても活性化される（Ｂｏｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：５－２０（２０１８））。
腫瘍特異的ペプチド又は感染因子特異的ペプチドを提示するＭＨＣクラスＩ複合体は、癌及び感染症の免疫療法のための独特なかつ有望なクラスの細胞表面標的として機能する。ワクチン、養子細胞療法、及びＴＣＲ様抗体を含む、この標的クラスを利用する試みにおいて、異なるアプローチが開発されてきた。感染因子特異的ペプチドのうち、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ヌクレオカプシド抗原の配列１８～２７は、急性自己制限ＨＢＶ感染症に罹患しているＨＬＡ－Ａ２陽性患者のＣＴＬによって広く認識されており、慢性Ｂ型肝炎患者における抗ウイルスＣＴＬ応答を刺激することを目的としたペプチド系治療ワクチンの主要な構成要素として機能する（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９７ Ｏｃｔ；２６（４）：１０２７－３４．ｃ）。
ウイルス特異的又は腫瘍特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体の治療上の利用に対する１つの障害は、胸腺選択後のペプチド－ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの本質的に低い親和性であった。この低い親和性は、特にウイルス特異的又は腫瘍特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体が、典型的には低密度でウイルス感染細胞又は腫瘍細胞の表面上に存在することを考慮して、制限を提示する。この障害を克服するために、親和性増強ＴＣＲが開発され、このような親和性増強ＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞が臨床試験において検査された。親和性増強ＴＣＲは、特異性を欠く可能性があり、いくつかの例では、親和性増強ＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は、無関係なタンパク質に由来するエピトープのＴＣＲによる予想外の認識により、深刻な、時には死に至る可能性が高い医学的合併症を引き起こした（例えば、Ｌｉｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２（６）：８６３－８７１（２０１３））。親和性増強ＴＣＲはまた、可溶性ＴＣＲとしても開発されているが、可溶性ＴＣＲ発現は困難である。
ウイルス特異的又は腫瘍特異的ペプチドを提示するＭＨＣクラスＩ複合体に対する結合特異性を有するいくつかのＴＣＲ様抗体が報告されている。このＴＣＲ様抗体のうちのいくつかは、ハイブリドーマ技術を使用して単離された。しかしながら、ハイブリドーマ技術によるｐＭＨＣ特異的ＴＣＲ様抗体の単離は、数百又は数千さえのクローンをスクリーニングする必要性、低い免疫原性、免疫優性によるいくつかの独特なクローン、及び微細な特異性の不十分な制御を含むいくつかの因子によって妨げられている（例えば、Ｐｏｒｇａｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：７１５－７２６（１９９７）、Ｂｅｒｎａｒｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（１０）：２８６４－２８７５（２００５）、Ｓｋｏｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１２（３２）：９９６７－９９７２（２０１５）を参照されたい）。より多くのＴＣＲ様抗体は、ファージディスプレイを用いて単離された。しかしながら、ファージディスプレイライブラリーから単離されたＴＣＲ様抗体の親和性は一般に、比較的低く、治療目的にとって十分ではないことが多い（例えば、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７９６９－７９７４（２０００）を参照されたい）。十分に高い親和性を有するＴＣＲ様抗体を生成するために、親和性成熟のためのシステムが開発されている。例えば、ＴＣＲ様抗体の親和性成熟のための１つのこのようなシステムは、突然変異誘発、ライブラリー及び酵母表示、並びに構造決定及び分子モデリングを組み合わせる（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２９（１１）：２２３８－２２４７（２０１５））。このような複合体及び労働集約的な親和性成熟アプローチのみで、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．は、十分な親和性を有するｐＭＨＣ特異的結合タンパク質を得るために、ＴＣＲ様抗体の結合親和性を約１００倍改善することができた。まとめると、十分な親和性を有する疾患関連ペプチド－ＭＨＣ複合体を特異的に結合する分子を開発することはこれまでのところ困難であり、現行のアプローチは、一般に、多数のハイブリドーマクローン又は親和性成熟のスクリーニングなどの困難な発現システム及び／又は手間のかかる手順を包含する。
したがって、ｐＭＨＣ特異的結合タンパク質を生産する新たな方法に対する必要性、新たなｐＭＨＣ特異的結合タンパク質の必要性、並びに癌、自己免疫疾患及び感染症を含む、ｐＭＨＣ特異的結合から利益を得る疾患の処置及び特性評価のための治療上及び診断上のアプローチに対する必要性が依然として存在する。
本発明は、ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質を生産する方法を提供する。本発明はまた、１個、２個又はそれより多数の設計された反復ドメイン、好ましくは設計されたアンキリン反復ドメインを含む、ｐＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質と、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を更に含むこのような結合タンパク質とを提供する。加えて、本発明は、このような結合タンパク質又は反復ドメインをコードする核酸、このような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びこのような結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の、ヒトを含む哺乳動物における、例えば、癌、自己免疫疾患及び感染症などの疾患を処置又は診断するための方法における使用を提供する。
ｐＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する組換え結合タンパク質を生産する本発明の方法は、選択された標的ｐＭＨＣ複合体に対して高い親和性及び／又は特異性で結合する結合タンパク質を生成する上で驚くほど効率的でありかつ有効である。これまでのところ、十分な親和性を有する疾患関連ｐＭＨＣ複合体を特異的に結合する分子を開発することは困難であり、現行のアプローチは、一般に、多数のハイブリドーマクローン又は親和性成熟のスクリーニングなどの困難な発現システム及び／又は手間のかかる手順を包含する。本明細書に開示される本発明の方法は、困難な発現系を包含することも、先に記載したような時間及び労力のかかる手順を必要とすることもない。更に、本発明の結合タンパク質と標的ペプチド－ＭＨＣ複合体との間の結合相互作用は、予想外に、標的ペプチド中の比較的多数のアミノ酸残基を包含する。標的ペプチド中の多数の相互作用残基は、異なるｐＭＨＣ複合体の大きな領域の中の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体との非常に選択的な又は特異的結合相互作用を反映すると考えられている。本発明の結合タンパク質のｐＭＨＣ特異的反復ドメインは、特異的結合相互作用において複合ペプチド－ＭＨＣ表面に非常に良好に立体的にフィットする結合表面を提供し得るようである。本発明の方法及び結合タンパク質は、同じ及び／又は異なるｐＭＨＣ特異的反復ドメインのうちの２つ以上が１つの結合タンパク質（例えば、二価、バイパラトープな（biparatopic）又は二重特異性結合タンパク質）において容易に組み合わされることができ、それによって結合タンパク質の結合力、結合親和性、結合特異性及び／又は力価を適合させかつ最適化することを可能にするという利点を更に提供する。その上、本発明の結合タンパク質は、例えば、細胞障害性Ｔ細胞において発現するＴ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質など、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子でさえも更に含み得る。このような免疫細胞エンゲージャー形式（例えば、Ｔ細胞エンゲージャー形式）における本発明の結合タンパク質は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化するための、並びに／又は限局的な及び標的化された様式で免疫系と係合するための方法において有利に使用されることができる。更に、本発明の方法及び結合タンパク質は、とりわけ、細胞内タンパク質を特異的に標的とすることを可能にし、それによって、例えば、癌、感染症及び自己免疫疾患のための多くの新たな診断及び治療の機会を促す。一態様では、本発明は、ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）特異的結合タンパク質を生産する方法であって、当該結合タンパク質が、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計された反復ドメインを含む方法であって、
（ａ）設計された反復ドメインの集合体を提供することと、
（ｂ）組換え標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を提供することと、
（ｃ）当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への特異的結合のための設計された反復ドメインの当該集合体をスクリーニングして、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する少なくとも１つの設計された反復ドメインを得ることと、を含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、当該設計された反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。
（ａ）設計された反復ドメインの集合体を提供することと、
（ｂ）組換え標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を提供することと、
（ｃ）当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への特異的結合のための設計された反復ドメインの当該集合体をスクリーニングして、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する少なくとも１つの設計された反復ドメインを得ることと、を含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、当該設計された反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。
別の態様では、本発明は、先の方法によって得られることができる設計された反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、第１の設計された反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を提供し、当該第１の反復ドメインは、第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。好ましい実施形態では、当該第１の標的ペプチドは、疾患又は障害と関係するタンパク質に由来する。例として、１つの特定の好ましい実施形態では、当該第１の標的ペプチドは、（ｉ）腫瘍細胞において発現するタンパク質に由来するペプチド、（ｉｉ）感染因子、好ましくはウイルス感染因子のタンパク質に由来するペプチド、及び（ｉｉｉ）自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチドからなる群から選択される。
１つの特定の態様では、当該第１の標的ペプチドは、ウイルス感染因子のタンパク質、好ましくは、例えば、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）などのウイルス特異的タンパク質に由来する。１つの好ましい態様では、ＨＢｃＡｇに由来する標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
１つの好ましい態様では、本発明は、第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第１の設計された反復ドメインを含むこのような組換え結合タンパク質を提供し、当該第１の反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。１つの特定の態様では、本発明は、第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第１のアンキリン反復ドメインを含むこのような組換え結合タンパク質を提供し、当該第１の標的ペプチドは、ＨＢｃＡｇに由来し、当該第１のアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。１つの特定の実施形態では、本発明は、第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第１のアンキリン反復ドメインを含むこのような組換え結合タンパク質を提供し、当該第１の標的ペプチドは、ＨＢｃＡｇに由来し、当該第１のアンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
１つの特定の態様では、本発明は、第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第２の設計された反復ドメインを更に含む、このような組換え結合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、疾患又は障害と関係するタンパク質に由来する。例として、１つの特定の好ましい実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、（ｉ）腫瘍細胞において発現するタンパク質に由来するペプチド、（ｉｉ）感染因子、好ましくはウイルス感染因子のタンパク質に由来するペプチド、及び（ｉｉｉ）自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチドからなる群から選択される。
１つの特定の態様では、当該第２の標的ペプチドは、当該第１の標的ペプチドと同じタンパク質に由来する。一実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、当該記第１の標的ペプチドと同じアミノ酸配列を有する。一実施形態では、当該第２の反復ドメインは、当該第１の反復ドメインと同じアミノ酸配列を有する。一実施形態では、当該第２の反復ドメインは、当該第１の反復ドメインと比較して、異なるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、当該第１の標的ペプチドと比較して異なるアミノ酸配列を有する。
１つの特定の態様では、当該第２の標的ペプチドは、当該第１の標的ペプチドが由来するタンパク質とは異なるタンパク質に由来する。
１つの好ましい態様では、本発明は、第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第２の設計された反復ドメインを更に含むこのような組換え結合タンパク質を提供し、当該第２の反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。１つの特定の態様では、本発明は、第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第２のアンキリン反復ドメインを更に含むこのような組換え結合タンパク質を提供し、当該第２の標的ペプチドは、ＨＢｃＡｇに由来し、当該第２のアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。１つの特定の実施形態では、本発明は、第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第２のアンキリン反復ドメインを更に含むこのような組換え結合タンパク質を提供し、当該第２の標的ペプチドは、ＨＢｃＡｇに由来し、当該第２のアンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
１つの好ましい態様において、反復ドメインのその標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと、当該標的ペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、反復ドメインのその標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、それに代わるものとして又は更に、当該反復ドメインと当該ＭＨＣの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む。
１つの特定の態様では、本発明は、このようなｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質を提供し、結合タンパク質は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を更に含む。一実施形態では、Ｔ細胞の表面上に発現する当該タンパク質は、Ｔ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である。一例として、１つの特定の実施形態では、本発明は、このようなｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質を提供し、結合タンパク質は、ＣＤ３に対する結合特異性を有する結合因子を更に含む。
１つの好ましい態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を更に含み、当該結合因子が、設計された反復ドメイン、好ましくは設計されたアンキリン反復ドメインである、このような組換え結合タンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の設計された反復ドメインをコードする核酸、又は本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質又は核酸と、医薬として許容され得る担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、Ｔ細胞の感染症限局性活性化の方法であって、本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質又は核酸を哺乳動物に投与するステップを含む方法であって、当該結合タンパク質は、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を更に含み、当該第１の標的ペプチド及び／又は、当該結合タンパク質が当該第２の反復ドメインを含む場合、当該第２の標的ペプチドは、感染因子のタンパク質に由来する。
別の態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、Ｔ細胞の感染症限局性活性化の方法において使用するための本発明によるｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質又は核酸を提供し、当該結合タンパク質は、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を更に含み、当該第１の標的ペプチド及び／又は、当該結合タンパク質が当該第２の反復ドメインを含む場合、当該第２の標的ペプチドは、感染因子のタンパク質に由来する。
別の態様では、本発明は、医学的状態を処置するための方法であって、医学的状態を処置することを必要とする患者に、治療有効量の本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、医学的状態を処置する方法において使用するための、本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける医学的状態を診断する方法であって、
（ｉ）当該哺乳動物から得られた細胞試料又は組織試料を本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）当該細胞試料又は組織試料への当該結合タンパク質の特異的結合を検出するステップと、を含む、方法を提供する。
（ｉ）当該哺乳動物から得られた細胞試料又は組織試料を本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）当該細胞試料又は組織試料への当該結合タンパク質の特異的結合を検出するステップと、を含む、方法を提供する。
１つの特定の態様では、当該医学的状態は、癌、感染症、好ましくはウイルス感染症、又は自己免疫疾患である。一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。一実施形態では、当該医学的状態は、感染症、好ましくはウイルス感染症である。一実施形態では、当該医学的状態は、自己免疫疾患である。
別の態様では、本発明は、感染細胞の破壊のために、ウイルス感染症に罹患している患者における感染細胞を標的とする方法であって、患者に治療有効量の本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法であって、当該第１の標的ペプチド及び／又は、当該結合タンパク質が当該第２の反復ドメインを含む場合、当該第２の標的ペプチドが、感染細胞において発現するタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する、方法を提供する。一実施形態では、当該結合タンパク質は、感染細胞を殺滅することができる毒性因子を更に含む。
別の態様では、本発明は、感染細胞の破壊のために、ウイルス感染症に罹患している患者において感染細胞を標的とする方法において使用するための、本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を提供し、当該第１の標的ペプチド及び／又は、当該結合タンパク質が当該第２の反復ドメインを含む場合、当該第２の標的ペプチドは、感染細胞において発現するタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する。一実施形態では、当該結合タンパク質は、感染細胞を殺滅することができる毒性因子を更に含む。
本明細書に開示及び例示されるように、本開示は、ペプチド－ＭＨＣ複合体を特異的に標的とする、設計されたリピートタンパク質、好ましくは設計されたアンキリンリピートタンパク質を提供する。設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリー（国際公開第２００２／０２０５６５号，Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，５７５－５８２，２００４；Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８）を含む設計されたリピートタンパク質ライブラリーは、高い親和性で標的に結合する標的特異的に設計された反復ドメインの選択に使用することができる。このような標的特異的に設計された反復ドメインは、ひいては疾患の処置のための組換え結合タンパク質の有益な構成要素として使用することができる。設計されたリピートタンパク質ライブラリーを使用して、ペプチド－ＭＨＣ複合体によって提示されるタンパク質など、特異的にかつ高い親和性で複合エピトープに結合するタンパク質を同定することができるかどうかは示されていなかった。疾患関連ペプチド－ＭＨＣ複合体を十分な親和性で特異的に結合する分子を生成することは、明らかに困難であった。
設計されたアンキリンリピートタンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規な治療的アプローチを可能にする。このようなアンキリンリピートタンパク質は、単一の設計されたアンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は２個、３個、４個、５個若しくはそれより多数の設計された、同一又は異なる標的特異性を有するアンキリン反復ドメインの組み合わせを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８；米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計されたアンキリン反復ドメインのみを含むアンキリンリピートタンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る小タンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特徴、及び１個のタンパク質における２個、３個、４個、５個又はそれより多数の設計されたアンキリン反復ドメインを組み合わせる可能性は、設計されたアンキリンリピートタンパク質を理想的なアゴニスト薬、アンタゴニスト薬及び／又は阻害薬の候補とする。更に、そのようなアンキリンリピートタンパク質は、様々なエフェクター機能、例えば細胞傷害性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。まとめると、設計されたアンキリンリピートタンパク質は、既存の抗体薬物を超える可能性を有するタンパク質治療薬の次世代の例である。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって所有される商標である。
一態様では、本発明は、ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）特異的結合タンパク質を生産する方法であって、当該結合タンパク質が、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計された反復ドメインを含む方法であって、
（ａ）設計された反復ドメインの集合体を提供することと、
（ｂ）組換え標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を提供することと、
（ｃ）当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への特異的結合のための設計された反復ドメインの当該集合体をスクリーニングして、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する少なくとも１個の設計された反復ドメインを得ることと、を含む、方法を提供する。
（ａ）設計された反復ドメインの集合体を提供することと、
（ｂ）組換え標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を提供することと、
（ｃ）当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への特異的結合のための設計された反復ドメインの当該集合体をスクリーニングして、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する少なくとも１個の設計された反復ドメインを得ることと、を含む、方法を提供する。
一実施形態では、当該設計された反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインであり、当該設計された反復ドメインの集合体は、設計されたアンキリン反復ドメインの集合体である。
一実施形態では、当該集合体は、固定された位置とランダム化された位置とを含む設計された反復ドメインを含み、当該集合体の設計された反復ドメインは、ランダム化された位置のうちの少なくとも１つにおいて互いに異なる。
一実施形態では、当該設計されたリピートタンパク質の集合体は、リボソームディスプレイによって提供される。
一実施形態では、方法は更に、（ｉ）第２の組換えペプチド－ＭＨＣ複合体を提供するステップであって、当該第２のペプチド－ＭＨＣ複合体の当該ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸残基だけ当該標的ペプチドとは異なるアミノ酸配列を含む、提供するステップと、（ｉｉ）当該第２の組換えペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する負の選択設計反復ドメインによって当該集合体から除去するステップと、を含む。
一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインは、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る、又は５×１０-9Ｍを下回る、又は３×１０-9Ｍを下回る、又は２×１０-9Ｍを下回る、又は１０-9Ｍを下回る、又は５×１０-10Ｍを下回る、又は３×１０-10Ｍを下回る、又は２×１０-10Ｍを下回る、又は１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合する。一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。
一実施形態では、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの結合は、当該反復ドメインと、当該標的ペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸残基との相互作用を含む。したがって、一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと当該標的ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと当該標的ペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと当該標的ペプチドの少なくとも３個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと当該標的ペプチドの少なくとも４個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと当該標的ペプチドの少なくとも５個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと当該標的ペプチドの少なくとも６個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと当該標的ペプチドの少なくとも７個のアミノ酸残基との相互作用を含む。更なる又は代替的な実施形態では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該反復ドメインと当該ＭＨＣの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む。
タンパク質間又はタンパク質と、例えば、アラニン走査突然変異誘発などの、ペプチドとの間の結合相互作用に関与するアミノ酸残基を決定する方法は、当業者に周知である。例として、結合タンパク質又は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計された反復ドメインと、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体との結合相互作用に関与する標的ペプチドのアミノ酸残基は、アラニン走査突然変異誘発によって決定され得る。
本発明の文脈において、結合タンパク質又は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計された反復ドメインと、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体との結合相互作用に関与する標的ペプチドのアミノ酸残基の典型的かつ好ましい決定は、実施例４において説明されるようなアラニン走査突然変異誘発によって行われる。したがって、一実施形態では、結合タンパク質又は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計された反復ドメインと、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体との結合相互作用に関与する標的ペプチドの当該アミノ酸残基は、アラニン走査突然変異誘発によって決定される。一実施形態では、結合タンパク質又は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計された反復ドメインと、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体との結合相互作用に関与する標的ペプチドの当該アミノ酸残基は、実施例４において説明されるようなアラニン走査突然変異誘発によって決定される。
本発明の文脈において、「標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該反復ドメインの、当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、当該標的ペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個のアミノ酸残基との当該反復ドメインの相互作用を含む」という句又は同様の句は、アラニンへと突然変異すると、実施例４において説明されるようなアラニン走査突然変異誘発におけるＴ細胞活性化が、野生型ペプチドと比較して少なくとも５０％ほど低減する、標的ペプチドの何らかのアミノ酸残基を指す。
本発明の発明者らは、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む本発明の結合タンパク質と、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ複合体におけるＨＢＶｃ１８標的ペプチドとの特異的相互作用にとって驚くほど多数のペプチド残基が重要であることを発見した。例えば、添付の実施例では、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む本発明の結合タンパク質とＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ複合体におけるＨＢＶｃ１８標的ペプチドとの特異的相互作用にとって重要であるいくつかのペプチド残基が同定されている（図３Ａ～図３Ｊを参照されたい）。本発明者らは、この発見が、本発明の設計されたアンキリン反復ドメインによって形成される結合表面及び抗体などの他の結合タンパク質によって形成される結合表面と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との構造の違いを反映しているかもしれないことを理論化している。いかなる理論にも拘束されるものではないが、反復ドメインとその標的ペプチドとの結合に関与するアミノ酸残基の数が多いほど、結合特異性が高いと考えられている。
一実施形態では、当該標的ペプチドは、（ｉ）腫瘍細胞において発現するタンパク質に由来するペプチド、（ｉｉ）細菌感染因子又はウイルス感染因子などの感染因子、好ましくはウイルス感染因子のタンパク質に由来するペプチド、及び（ｉｉｉ）自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチドからなる群から選択される。一実施形態では、当該標的ペプチドは、ウイルス感染因子のタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する。一実施形態では、当該標的ペプチドは、ＨＢｃＡｇに由来する。一実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、当該ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。一実施形態では、当該ＭＨＣクラスＩはＨＬＡ－Ａ*０２である。一実施形態では、当該ＨＬＡ－Ａ*０２は、ＨＬＡ－Ａ*０２０１である。一実施形態では、当該ＨＬＡ－Ａ*０２０１は、配列番号６９のアミノ酸配列を有する。或いは、別の実施形態では、当該ＭＨＣはＨＬＡ－Ａ*０２ではない。
別の態様では、本発明は、本明細書に説明される本発明の方法のうちの１つによって得ることができる設計された反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関する。
別の態様では、本発明は、第１の設計された反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、当該第１の反復ドメインは、第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。
好ましい実施形態では、本発明の結合タンパク質は、第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第１の設計された反復ドメインを含み、当該第１の標的ペプチドは、（ｉ）腫瘍細胞において発現するタンパク質に由来するペプチド、（ｉｉ）細菌感染因子又はウイルス感染因子などの感染因子のタンパク質に由来するペプチド、好ましくはウイルス感染因子、及び（ｉｉｉ）自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチドからなる群から選択される。
一実施形態では、当該第１の標的ペプチドは、ウイルス感染因子のタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する。一実施形態では、当該第１の標的ペプチドは、ウイルス特異的タンパク質に由来する。一実施形態では、当該第１の標的ペプチドは、ＨＢｃＡｇに由来する。一実施形態では、当該第１の標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態では、第１のＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。一実施形態では、当該第１のＭＨＣクラスＩはＨＬＡ－Ａ*０２である。一実施形態では、当該ＨＬＡ－Ａ*０２は、ＨＬＡ－Ａ*０２０１である。一実施形態では、当該ＨＬＡ－Ａ*０２０１は、配列番号６９のアミノ酸配列を有する。或いは、別の実施形態では、当該第１のＭＨＣは、ＨＬＡ－Ａ*０２ではない。
一実施形態では、当該第１の反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。
一実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの当該結合は、当該第１の標的ペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸残基との当該第１の反復ドメインの相互作用を含む。したがって、一実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの結合は、当該第１の反復ドメインと当該第１の標的ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの結合は、当該第１の反復ドメインと当該第１の標的ペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの結合は、当該第１の反復ドメインと当該第１の標的ペプチドの少なくとも３個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの結合は、当該第１の反復ドメインと当該第１の標的ペプチドの少なくとも４個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの結合は、当該第１の反復ドメインと当該第１の標的ペプチドの少なくとも５個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの結合は、当該第１の反復ドメインと当該第１の標的ペプチドの少なくとも６個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの結合は、当該第１の反復ドメインと当該第１の標的ペプチドの少なくとも７個のアミノ酸残基との相互作用を含む。更なる又は代替的な実施形態では、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第１の反復ドメインの結合は、当該第１の反復ドメインと当該第１のＭＨＣの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む。
好ましい実施形態では、当該第１の設計された反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。特に好ましい実施形態では、当該第１の設計されたアンキリン反復ドメインは、本明細書の態様又は実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインである。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、アンキリン反復モジュールを含む。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号２７～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０、並びに（２）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０のうちのいずれかにおける９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０並びに（２）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０のうちのいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０並びに（２）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０のうちのいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０並びに（２）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０のうちのいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号３７、３８、４２及び４３、並びに（２）配列番号３７、３８、４２及び４３のうちのいずれかにおける９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７、３８、４２及び４３、並びに（２）配列番号３７、３８、４２及び４３のうちのいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７、３８、４２及び４３、並びに（２）配列番号３７、３８、４２及び４３のうちのいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７、３８、４２及び４３、並びに（２）配列番号３７、３８、４２及び４３のうちのいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号３７、３８、４２及び４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールとを含む。一実施形態では、この第１のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールと、第３のアンキリン反復モジュールとを含む。一実施形態では、この第１のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、この第２のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、第１、第２、及び場合により第３のアンキリン反復モジュールを含み、当該第１、当該第２、及び存在する場合、当該第３のアンキリン反復モジュールの各々は独立して、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１、当該第２、及び存在する場合、当該第３のアンキリン反復モジュールの各々は独立して、（１）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０並びに（２）配列番号２９、３０、３７～４３及び４８～５０のうちのいずれかにおける９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１、当該第２、及び存在する場合、当該第３のアンキリン反復モジュールの各々は独立して、（１）配列番号３７、３８、４２及び４３、並びに（２）配列番号３７、３８、４２及び４３のうちのいずれかにおける９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと第２のアンキリン反復モジュールとを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７及び（２）配列番号３７における９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３８及び（２）配列番号３８の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７及び（２）配列番号３７における６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３８及び（２）配列番号３８の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７及び（２）配列番号３７における５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３８及び（２）配列番号３８の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７及び（２）配列番号３７における４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３８及び（２）配列番号３８の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７及び（２）配列番号３７における３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３８及び（２）配列番号３８の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７及び（２）配列番号３７における２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３８及び（２）配列番号３８の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３７及び（２）配列番号３７における１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３８及び（２）配列番号３８の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと第２のアンキリン反復モジュールとを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４２及び（２）配列番号４２の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４３及び（２）配列番号４３の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４２及び（２）配列番号４２の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４３及び（２）配列番号４３の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４２及び（２）配列番号４２の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４３及び（２）配列番号４３の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４２及び（２）配列番号４２の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４３及び（２）配列番号４３の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４２及び（２）配列番号４２の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４３及び（２）配列番号４３の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４２及び（２）配列番号４２の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４３及び（２）配列番号４３の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４２及び（２）配列番号４２における１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４３及び（２）配列番号４３の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと第２のアンキリン反復モジュールとを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９及び（２）配列番号２９の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３０及び（２）配列番号３０の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９及び（２）配列番号２９における６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３０及び（２）配列番号３０の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９及び（２）配列番号２９における５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３０及び（２）配列番号３０の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９及び（２）配列番号２９における４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３０及び（２）配列番号３０の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９及び（２）配列番号２９における３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３０及び（２）配列番号３０の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９及び（２）配列番号２９における２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３０及び（２）配列番号３０の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号２９及び（２）配列番号２９における１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３０及び（２）配列番号３０の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールと、第３のアンキリン反復モジュールとを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９及び（２）配列番号３９の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４０及び（２）配列番号４０の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４１及び（２）配列番号４１の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９及び（２）配列番号３９における６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４０及び（２）配列番号４０の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４１及び（２）配列番号４１の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９及び（２）配列番号３９における５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４０及び（２）配列番号４０の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４１及び（２）配列番号４１の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９及び（２）配列番号３９における４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４０及び（２）配列番号４０の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４１及び（２）配列番号４１の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９及び（２）配列番号３９における３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４０及び（２）配列番号４０の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４１及び（２）配列番号４１の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９及び（２）配列番号３９における２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４０及び（２）配列番号４０の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４１及び（２）配列番号４１の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９及び（２）配列番号３９における１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４０及び（２）配列番号４０の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４１及び（２）配列番号４１の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールと、第３のアンキリン反復モジュールとを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８及び（２）配列番号４８の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４９及び（２）配列番号４９の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５０及び（２）配列番号５０の９個までの、又は８個までの、又は７個までの、又は６個までの、又は５個までの、又は４個までの、又は３個までの、又は２個までの、又は１個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８及び（２）配列番号４８の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４９及び（２）配列番号４９の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５０及び（２）配列番号５０の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８及び（２）配列番号４８の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４９及び（２）配列番号４９の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５０及び（２）配列番号５０の５個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８及び（２）配列番号４８の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４９及び（２）配列番号４９の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５０及び（２）配列番号５０の４個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８及び（２）配列番号４８の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４９及び（２）配列番号４９の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５０及び（２）配列番号５０の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８及び（２）配列番号４８の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４９及び（２）配列番号４９の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５０及び（２）配列番号５０の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８及び（２）配列番号４８における１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４９及び（２）配列番号４９の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５０及び（２）配列番号５０の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの好ましい実施形態では、本明細書に説明及び言及されるような当該アンキリン反復モジュールの当該のアミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュールのフレームワーク位置において起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。
１つの好ましい実施形態では、本明細書に説明及び言及されるような当該アンキリン反復モジュールの当該のアミノ酸置換の全ては、配列番号２７～５０の当該アンキリン反復モジュールのランダム化された位置３、４、６、１４及び１５以外の位置において生じる。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号１６～１８及び２０～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～１８及び２０～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～１８及び２０～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～１８及び２０～２６の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６のうちのいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１７、２１、２２、２３及び２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２１及び２３のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２１及び２３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２１及び２３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２１及び２３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１及び２３のうちのいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２１及び２３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２１及び２３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２１及び２３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１及び２３のうちのいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１及び２３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１及び２３のうちのいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１及び２３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１及び２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１及び２３から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号２１及び２３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２１及び２３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２１及び２３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１７の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１７の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１７の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１７の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１７の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１７の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態において、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、配列番号１７の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１７の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１７の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２１の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２１の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２１の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２１の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２１の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２１の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態において、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、配列番号２１の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２１の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２１の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２２の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２２の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２２の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２７の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態において、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、配列番号２２の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２２の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態において、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、配列番号２３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
１つの特定の実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態において、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、配列番号２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る、又は５×１０-9Ｍを下回る、又は３×１０-9Ｍを下回る、又は２×１０-9Ｍを下回る、又は１０-9Ｍを下回る、又は５×１０-10Ｍを下回る、又は３×１０-10Ｍを下回る、又は２×１０-10Ｍを下回る、又は１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を結合する。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、５×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、３×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、２×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、５×１０-9Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、３×１０-9Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、２×１０-9Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-9Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、５×１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、３×１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、２×１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１６～１８及び２０～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～１８及び２０～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～１８及び２０～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～１８及び２０～２６の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、５×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、５×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、２×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、２×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る、又は５×１０-9Ｍを下回る、又は３×１０-9Ｍを下回る、又は２×１０-9Ｍを下回る、又は１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１７の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１７の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１７の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る、又は５×１０-9Ｍを下回る、又は３×１０-9Ｍを下回る、又は２×１０-9Ｍを下回る、又は１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、配列番号１７の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１７の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１７の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号２１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２１の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２１の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２１の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、配列番号２１の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２１の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２１の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号２２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２２の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２２の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、配列番号２２の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２２の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２２の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、配列番号２３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２３の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２３の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号２６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合し、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、配列番号２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号２６の最後の位置のＡは、Ｎによって場合により置換されている。１つの好ましい実施形態では、当該標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。
本発明の文脈において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質又は設計された反復ドメインの解離定数（ＫD）の典型的かつ好ましい決定は、実施例２に説明されている。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質又は設計された反復ドメインの標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する当該結合特異性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質又は設計された反復ドメインの標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する当該結合特異性は、実施例２において説明されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。
本発明の一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は更に、第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第２の設計された反復ドメインを含む。
好ましい実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、（ｉ）腫瘍細胞において発現するタンパク質に由来するペプチド、（ｉｉ）細菌感染因子又はウイルス感染因子などの感染因子、好ましくはウイルス感染因子のタンパク質に由来するペプチド、及び（ｉｉｉ）自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチドからなる群から選択される。
一実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、感染因子、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する。一実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、ウイルス特異的タンパク質に由来する。
一実施形態では、第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該第２の反復ドメインは、１０-7Ｍを下回る、又は５×１０-8Ｍを下回る、又は３×１０-8Ｍを下回る、又は２×１０-8Ｍを下回る、又は１０-8Ｍを下回る、又は５×１０-9Ｍを下回る、又は３×１０-9Ｍを下回る、又は２×１０-9Ｍを下回る、又は１０-9Ｍを下回る、又は５×１０-10Ｍを下回る、又は３×１０-10Ｍを下回る、又は２×１０-10Ｍを下回る、又は１０-10Ｍを下回る解離定数（ＫD）で、ＰＢＳ中の当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合する。一実施形態では、第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する当該第２の反復ドメインは、ＰＢＳ中の当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する。
一実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の標的ペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸残基との当該第２の反復ドメインの相互作用を含む。したがって、一実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の反復ドメインと当該第２の標的ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の反復ドメインと当該第２の標的ペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の反復ドメインと当該第２の標的ペプチドの少なくとも３個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の反復ドメインと当該第２の標的ペプチドの少なくとも４個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の反復ドメインと当該第２の標的ペプチドの少なくとも５個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の反復ドメインと当該第２の標的ペプチドの少なくとも６個のアミノ酸残基との相互作用を含む。一実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の反復ドメインと当該第２の標的ペプチドの少なくとも７個のアミノ酸残基との相互作用を含む。更なる又は代替的な実施形態では、当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への当該第２の反復ドメインの当該結合は、当該第２の反復ドメインと当該第２のＭＨＣの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む。
一実施形態では、当該第２のＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。一実施形態では、当該第２のＭＨＣはＨＬＡ－Ａ*０２である。一実施形態では、当該ＨＬＡ－Ａ*０２は、ＨＬＡ－Ａ*０２０１である。一実施形態では、当該ＨＬＡ－Ａ*０２０１は、配列番号６９のアミノ酸配列を有する。或いは、別の実施形態では、当該第２のＭＨＣは、ＨＬＡ－Ａ*０２ではない。
一実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、当該第１の標的ペプチドと同じタンパク質に由来する。一実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、当該記第１の標的ペプチドと同じアミノ酸配列を有する。更なる実施形態では、当該第２の反復ドメインは、当該第１の反復ドメインと同じアミノ酸配列を有する。或いは、別の更なる実施形態では、当該第２の反復ドメインは、当該第１の反復ドメインと比較して、異なるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、当該第１の標的ペプチドと比較して異なるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、当該第２の標的ペプチドは、当該第１の標的ペプチドが由来するタンパク質とは異なるタンパク質に由来する。
好ましい実施形態では、当該第２の設計された反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。特に好ましい実施形態では、当該第２の設計されたアンキリン反復ドメインは、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインである。
本発明の一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は更に、第３の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第３の設計された反復ドメインを含む。好ましい実施形態では、当該第３の設計された反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。特に好ましい実施形態では、当該第３の設計されたアンキリン反復ドメインは、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインである。
本発明の文脈において、本発明の組換え結合タンパク質が第１及び第２の設計された反復ドメインを含み、当該第１及び当該第２の反復ドメインが同じ標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する、すなわち、第２の標的ペプチドが第１の標的ペプチドと同じアミノ酸配列を有するとき、並びに第１及び第２の反復ドメインが配列中で同一であるとき、当該組換え結合タンパク質は二価である。本発明の文脈において、本発明の組換え結合タンパク質が第１及び第２の設計された反復ドメインを含み、当該第１及び当該第２の反復ドメインが同じ標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する、すなわち、第２の標的ペプチドが第１の標的ペプチドと同じアミノ酸配列を有するとき、並びに第１及び第２の反復ドメインが配列中で異なるとき、当該組換え結合タンパク質はバイパラトープである（biparatopic）。本発明の文脈において、本発明の組換え結合タンパク質が第１及び第２の設計された反復ドメインを含み、当該第１及び当該第２の反復ドメインが異なる標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する、すなわち、第２の標的ペプチドが第１の標的ペプチドと比較して異なるアミノ酸配列を有するとき、当該組換え結合タンパク質は二重特異性である。異なる標的ペプチドは、同じタンパク質又は異なるタンパク質に由来してもよい。本発明の文脈において、同じ定義は、第１及び第２及び第３の設計された反復ドメインを含む本発明の組換え結合タンパク質と同様に適用され、第１、第２、及び第３の設計された反復ドメインの各々は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、一価、二価、三価、多価、モノパラトープ（monoparatopic）、バイパラトープ（biparatopic）、トリパラトープ（triparatopic）、マルチパラトープ（multiparatopic）、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は一価である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は二価である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は三価である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は多価である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質はモノパラトープである（monoparatopic）。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、バイパラトープ（biparatopic）であり、１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、トリパラトープ（triparatopic）であり、１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、マルチパラトープ（multiparatopic）である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、単一特異性である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、二重特異性である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、三重特異性である。１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、多重特異性である。先の実施形態は互いに組み合わせ可能であることは理解されるべきである。一例として、第１のｐＭＨＣ複合体に対して特異性を有する２つの同一の反復ドメインを含み、かつ第２の異なるｐＭＨＣ複合体に対して特異性を有する第３の反復ドメインを更に含む、本発明の組換え結合タンパク質は、同時に二価かつ二重特異性であろう。したがって、１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、一価、二価、三価、若しくは多価であり、かつ、モノパラトープ（monoparatopic）、バイパラトープ（biparatopic）、トリパラトープ（triparatopic）、若しくはマルチパラトープ（multiparatopic）であり、かつ／又は単一特異性、二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性である。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質が２個以上のアンキリン反復ドメインを含むとき、例えば、本発明の組換え結合タンパク質が２個又は３個のアンキリン反復ドメインを含むとき、当該２個以上のアンキリン反復ドメイン、例えば、当該２個又は３個のアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカーと連結されることができる。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該２個以上のアンキリン反復ドメイン、例えば、当該２個又は３個のアンキリン反復ドメインは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。別の実施形態では、当該ペプチドリンカーは、高グリシン－セリンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、配列番号３の高グリシン－セリンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該２個以上のアンキリン反復ドメイン、例えば、当該２個又は３個のアンキリン反復ドメインは、配列番号３の高グリシン－セリンペプチドリンカーと連結されている。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質が３個以上のアンキリン反復ドメインを含む場合、当該３個以上のアンキリン反復ドメインは、異なるペプチドリンカー、例えば、高プロリン－トレオニンペプチドリンカー及び高セリン－グリシンペプチドリンカー、例えば、配列番号１～３のぺプチドリンカーなどと連結されることができる。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、２個又は３個のアンキリン反復ドメインを含み、当該２個又は３個のアンキリン反復ドメインの各々は独立して、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、アンキリン反復モジュールを含む。
一実施形態では、組換え結合タンパク質は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する２個のアンキリン反復ドメインを含み、当該２個のアンキリン反復ドメインの各々は独立して、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、アンキリン反復モジュールを含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する２個のアンキリン反復ドメインを含み、当該２個のアンキリン反復ドメインの各々は、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールとを含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する２個のアンキリン反復ドメインを含み、当該２個のアンキリン反復ドメインの各々は、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールと、第３のアンキリン反復モジュールとを含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する２個又は３個のアンキリン反復ドメインを含み、当該２個又は３個のアンキリン反復ドメインの各々は独立して、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有するちょうど２個のアンキリン反復ドメインを含み、当該２個のアンキリン反復ドメインの各々は独立して、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する３個のアンキリン反復ドメインを含み、当該３個のアンキリン反復ドメインの各々は独立して、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有するちょうど３個のアンキリン反復ドメインを含み、当該３個のアンキリン反復ドメインの各々は独立して、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する単一の設計されたアンキリン反復ドメインを含むか、又は本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する２個、３個、４個、５個若しくはそれより多数の設計されたアンキリン反復ドメインの組み合わせを含む。
本発明の一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は更に、結合因子を含む。
１つの特定の実施形態では、当該結合因子は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、更により好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する。更なる実施形態では、Ｔ細胞の表面上に発現する当該タンパク質は、Ｔ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である。一例として、１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は更に、分化クラスター３（ＣＤ３）に対して結合特異性を有する結合因子を含む。
本発明の文脈において、結合因子は、抗体、足場タンパク質（scaffold protein）若しくはリピートタンパク質を含む抗体模倣物、設計された反復ドメイン、好ましくは設計されたアンキリン反復ドメイン、又は当該技術分野で公知のいずれかの他の適切な結合分子であることができる。一実施形態では、当該結合因子は抗体である。別の実施形態では、当該結合因子は、設計された反復ドメイン、好ましくは設計されたアンキリン反復ドメインである。
１つの特定の実施形態では、当該結合因子は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、更により好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する抗体を含むか又はそれからなる。更なる実施形態では、Ｔ細胞の表面上に発現する当該タンパク質は、Ｔ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である。一例として、１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は更に、ＣＤ３に対して結合特異性を有する抗体を含む。
１つの特定の実施形態では、当該結合因子は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、更により好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する設計された反復ドメイン、好ましくは設計されたアンキリン反復ドメインを含むか、又はそれからなる。更なる実施形態では、Ｔ細胞の表面上に発現する当該タンパク質は、Ｔ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である。一例として、１つの特定の実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は更に、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む。
一実施形態では、当該結合因子は、当該ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２個、３個若しくはそれより多数のｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインに、連結され、共役し、融合し又は別様に物理的に結合している。一実施形態では、当該結合因子は、当該ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２個、３個若しくはそれより多数のｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインに、共有結合している。一実施形態では、当該結合因子は、当該ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２個、３個若しくはそれより多数のｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインに、ペプチドリンカーを用いて共有結合している。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該結合因子は、当該ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２個、３個若しくはそれより多数のｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインに、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーを用いて共有結合している。別の実施形態では、当該ペプチドリンカーは、高グリシン－セリンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、配列番号３の高グリシン－セリンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該結合因子は、当該ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２個、３個若しくはそれより多数のｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインに、配列番号３の高いグリシン－セリンペプチドリンカーを用いて共有結合している。
当該結合因子と当該ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン（又は当該２個、３個若しくはそれより多数のｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン）との間のリンカーが短ければ短いほど、Ｔ細胞エンゲージャー形式における構築物の力価は高いことが本発明の発明者らによって、驚くべきかつ予想外に発見された（実施例５を参照されたい）。したがって、更に好ましい実施形態では、本明細書に説明するペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さは、アミノ酸で３８個未満、好ましくは最大で３７個、より好ましくは最大で２４個、更により好ましくは最大で１８個、更により好ましくは最大で１１個、最も好ましくは最大でアミノ酸で６個である。別の好ましい実施形態では、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さは、アミノ酸残基で１～３７、１～２４、１～２３、１～１８、１～１７、１～１１、１～１０、１～６、６～３７、６～２４、６～２３、６～１８、６～１７、又は６～１１である。好ましくは、当該ペプチドリンカーは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。更に好ましい実施形態では、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さは、アミノ酸で１８個未満、アミノ酸で少なくとも１個であり、すなわち、ペプチドリンカーの長さは、アミノ酸で１～１７個である。一実施形態では、当該リンカーのアミノ酸配列は、配列番号１及び７４～７７のいずれか１つにおいて提供されるとおりである。好ましい実施形態では、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号７５において提供されるとおりである。より好ましい実施形態では、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号７６において提供されるとおりである。最も好ましい実施形態では、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号７７において提供されるとおりである。
本発明の一態様では、本発明の組換え結合タンパク質であって、当該結合タンパク質が、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるような１個、２個、３個又はそれより多数のｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質が、ＣＤ３特異的結合因子を更に含む、当該結合タンパク質は、Ｔ細胞の感染症限局性又は腫瘍限局性活性化を促進することができる。そのような場合、本発明の組換え結合タンパク質は、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体提示腫瘍細胞及び／又は標的ペプチド－ＭＨＣ複合体提示感染細胞に対してＴ細胞を局所的に活性化するためにＴ細胞エンゲージャー形式で使用されてもよい。
本発明の一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、当該第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体の認識を阻害することができ、かつ／又は、当該結合タンパク質が当該第２の反復ドメインを含む場合、Ｔ細胞受容体による当該第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体の認識を阻害することができる。言い換えれば、本発明の組換え結合タンパク質は、免疫系が標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を認識する能力を阻害することができる。そのような場合、本発明の組換え結合タンパク質は、自己免疫疾患の処置に使用されてもよい。Ｔ細胞受容体による標的ペプチド－ＭＨＣ複合体の認識を測定することは、当業者に公知のいずれかの適切な方法によって、又は適切なＴ細胞活性化アッセイによって実施することができる。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。本発明の文脈において、ポリペプチドタグは、ポリペプチド／タンパク質に結合したアミノ酸配列であって、当該アミノ酸配列は、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくはターゲティングに有用であり、又は、当該アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、又は、当該アミノ酸配列はエフェクター機能を有する。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、結合タンパク質の他の部分に、直接又はペプチドリンカーを介して結合することができる。ポリペプチドタグは当技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えばアルカリホスファターゼ）等のポリペプチドであり、これらにより、このポリペプチド／タンパク質、又は標的化に使用できるポリペプチド（免疫グロブリン又はそれらのフラグメント等）及び／若しくはエフェクター分子として使用できるポリペプチドの検出が可能となる。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカーを更に含む。本発明の文脈において、ペプチドリンカーは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコールなどのポリマー、タンパク質ドメインと生物活性のある分子、タンパク質ドメインとＴ細胞特異的アンキリン反復ドメイン、又は２つの配列タグ、を連結させることができるアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、特許出願、国際公開第２００２／０２０５６５号の記載に提供されている。そのようなリンカーの具体例は、グリシン－セリン－リンカー及び可変長のプロリン－トレオニン－リンカーである。グリシン－セリン－リンカーの例は、アミノ酸配列ＧＳ及び配列番号３のアミノ酸配列であり、プロリン－トレオニン－リンカーの例は、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列である。
別の態様では、本発明は、本発明の設計された反復ドメインのアミノ酸配列又は本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、本発明の設計された反復ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１６～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１６～１８及び２０～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１７、２１、２２、２３及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１及び２３からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２３のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２６のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌（E.coli）で生産するために使用した。
別の態様では、本発明は、本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質、及び／又は本発明の核酸と、場合により、医薬として許容され得る担体及び／又は希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。
医薬として許容され得る担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。また更に、上述の組換え結合タンパク質及び／又は核酸、特に本発明の組換え結合タンパク質のうちの１つ以上を含む、診断用組成物が提供される。
医薬組成物は、組換え結合タンパク質及び／又は核酸、好ましくは、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかにおいてより具体的に説明されるような組換え結合タンパク質及び／又は核酸と、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６th ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に説明されるような、医薬として許容され得る担体、賦形剤又は安定剤とを含む。
当業者に既知の、好適な担体、賦形剤又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の生産を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生物活性化合物等の、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に説明されるような少なくとも１つの組換え結合タンパク質と、例えば、非イオン性洗剤などの洗剤、例えば、リン酸緩衝液などの緩衝液、及びショ糖などの糖とを含む。一実施形態において、このような組成物は、上記のような組換え結合タンパク質及びＰＢＳを含む。
別の態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の感染症限局性活性化の方法であって、第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第１の反復ドメインを含み、場合により第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する第２の反復ドメインを含み、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する結合因子を更に含む、本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質を哺乳動物に投与するステップを含む方法であって、当該第１の標的ペプチド及び／又は、当該結合タンパク質が当該第２の反復ドメインを含む場合、当該第２の標的ペプチドが、感染因子のタンパク質に由来する、方法を提供する。一実施形態では、当該感染は、ウイルス感染である。一実施形態では、当該第１の及び／又は、存在する場合、当該第２の標的ペプチドは、ウイルス感染因子のタンパク質に由来する。一実施形態では、当該第１の及び／又は、存在する場合、当該第２の標的ペプチドは、ウイルス特異的タンパク質に由来する。一実施形態では、当該第１の及び／又は、存在する場合、当該第２の標的ペプチドは、ＨＢｃＡｇに由来する。一実施形態では、当該第１の及び／又は、存在する場合、当該第２の標的ペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、当該結合因子は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、更により好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する。一実施形態では、当該結合因子は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、更により好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する抗体である。一実施形態では、当該結合因子は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、更により好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する設計された反復ドメインである。一実施形態では、当該結合因子は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、更により好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインである。好ましい実施形態では、免疫細胞の表面上に発現する当該タンパク質は、例えば、ＣＤ３などのＴ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復ドメイン及び／又は、存在する場合、当該第２のアンキリン反復は独立して、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるような、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する独立して設計されたアンキリン反復ドメインである。
本明細書に説明する免疫細胞の感染症限局性活性化の方法において使用するための、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、更により好ましくはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する結合因子を含む本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物が、更に提供される。
別の態様では、本発明は、医学的状態を処置するための方法であって、医学的状態を処置することを必要とする患者に、治療有効量の本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
本明細書に説明するような医学的状態を処置する方法において使用するための、本発明のｐＭＨＣ特異的組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物が更に提供される。
別の態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける医学的状態を診断する方法であって、
（ｉ）当該哺乳動物から得られた細胞試料又は組織試料を本発明の組換え結合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）当該細胞試料又は組織試料への当該結合タンパク質の特異的結合を検出するステップと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、当該組織は、腫瘍組織である。
（ｉ）当該哺乳動物から得られた細胞試料又は組織試料を本発明の組換え結合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）当該細胞試料又は組織試料への当該結合タンパク質の特異的結合を検出するステップと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、当該組織は、腫瘍組織である。
本発明の文脈において、用語「医学的状態」、「疾患」、及び「障害」は、相互交換可能に使用され、癌、感染症、及び自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、当該医学的状態は、癌、感染症、好ましくはウイルス感染症、又は自己免疫疾患である。一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。一実施形態では、そのような癌は、肺癌、大腸癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌及び乳癌を含むがこれらに限定されない上皮性悪性腫瘍（原発性及び転移性）と、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫を含むがこれらに限定されない血球悪性腫瘍と、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含むこれらに限定されない肉腫と、黒色腫とからなる群から選択される。１つの好ましい実施形態では、そのような癌は、脂肪肉腫、神経芽腫、滑膜肉腫、黒色腫及び卵巣癌からなる群から選択される。別の最も好ましい実施形態では、そのような癌は、黒色腫、肺癌、肝癌、胃癌、皮膚癌、神経芽腫、軟部組織肉腫、膀胱癌、精巣癌及び卵巣癌からなる群から選択される。一実施形態では、当該医学的状態は、感染症、好ましくはウイルス感染症である。１つの好ましい実施形態では、そのような感染症は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされるウイルス感染症である。別の好ましい実施形態では、そのような感染症は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって引き起こされるウイルス感染症である。一実施形態では、当該医学的状態は、自己免疫疾患である。１つの好ましい実施形態では、そのような自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ及びＩ型糖尿病からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明は、疾患の処置のための、本発明による医薬組成物、核酸又は組換え結合タンパク質の、使用に関する。その目的のため、本発明による医薬組成物、核酸又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。非経口投与において、本発明の医薬組成物は、上記で定義したような医薬として許容され得る賦形剤とともに、溶液、懸濁液又はエマルション等の単位用量の注射剤形で製剤化されている。用量及び投与方法は、治療される個体及び特定の疾患によって異なる。
更に、上述の医薬組成物又は組換え結合タンパク質のいずれかは、障害の処置のためとみなされる。
一実施形態では、本明細書に説明するような当該組換え結合タンパク質又は医薬組成物は、静脈内に適用される。非経口適用のために、当該組換え結合タンパク質又は医薬組成物は、ボーラス注入として又は緩徐な点滴注入により、治療有効量で注入することができる。
一実施形態では、本発明は、医学的状態の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の処置のための、本発明の組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、使用に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の処置において使用するための、本発明の組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の処置のための医薬品としての、本発明の医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸の、使用に関する。一実施形態では、本発明は、医薬品の製造のための、本発明の医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸の、使用に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の処置のための医薬品の製造のための、本発明の医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸の、使用に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の処置のための医薬品の製造のためのプロセスであって、本発明の医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子が、医薬品の有効成分である、プロセスに関する。一実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子を使用して、医学的状態を処置するプロセスに関する。
更なる実施形態では、本発明は、医学的状態、好ましくは感染症、より好ましくはウイルス感染症の処置のために使用される医薬品の製造のための、本発明の組換え結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の、使用に関する。
一実施形態では、本発明は、治療目的のための、上述の設計されたアンキリン反復ドメインのうちのいずれかを含む組換え結合タンパク質に関する。
一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質、及び／又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又は本発明の医薬組成物、を含む、キットに関する。一実施形態では、本発明は、本発明の１個以上のペプチド－ＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２６のアミノ酸配列を独立して有する１個以上のペプチド－ＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質、及び／又は、本発明の１個以上のペプチド－ＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２６のアミノ酸配列を独立して有する１個以上のペプチド－ＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を含む核酸、及び／又は、例えば、本発明の１個以上のペプチド－ＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメイン、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２６のアミノ酸配列を独立して有する１個以上のペプチド－ＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を含む医薬組成物、を含むキットに関する。
別の態様では、本発明は、感染細胞の破壊のために、ウイルス感染症に罹患している患者における感染細胞を標的とする方法であって、患者に治療有効量の本発明の結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法であって、当該第１の標的ペプチド及び／又は、当該結合タンパク質が当該第２の反復ドメインを含む場合、当該第２の標的ペプチドが、感染細胞において発現するタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する、方法を提供する。一実施形態では、当該結合タンパク質は、感染細胞を殺滅することができる毒性因子を更に含む。
感染細胞の破壊のために、ウイルス感染症に罹患している患者において感染細胞を標的とする方法において使用するための、本発明の組換え結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物が更に提供され、当該第１の標的ペプチド及び／又は、当該結合タンパク質が当該第２の反復ドメインを含む場合、当該第２の標的ペプチドは、感染細胞において発現するタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する。一実施形態では、当該結合タンパク質は、感染細胞を殺滅することができる毒性因子を更に含む。
好ましい実施形態では、本発明の処置方法によって、又は本発明の結合タンパク質、核酸若しくは医薬組成物によって処置される医学的状態は、Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされるウイルス感染症である。
本明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、添付の配列表に開示されている多くのアミノ酸配列、核酸配列、及び配列番号を参照する。
定義
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
本発明の文脈において、用語「集合体」は、少なくとも２つの異なる実体又はメンバーを含む、集団を指す。好ましくは、そのような集合体は、少なくとも１０5個、より好ましくは１０7個超、及び最も好ましくは１０9個超の異なるメンバーを含む。「集合体」はまた、「ライブラリー」又は「複数」と称することもできる。
用語「核酸分子」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかのリボ核酸（ＲＮＡ）分子又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であることができるポリヌクレオチド分子を指し、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾形態及び人工形態を含む。核酸分子は、単離された形態で存在するか、又は組換え核酸分子又はベクターに含まれているかのいずれかであることができる。
本発明の文脈において、用語「タンパク質」はポリペプチドを含む分子を指し、ここで、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間で二次、三次、及び／又は四次構造を形成することにより、明確な三次元配置を有する、又は、とることができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。個々に二次及び／又は三次構造を形成することにより、明確な三次元配置を有する、又は、とることができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
用語「組換え」は、組換えタンパク質、組換えポリペプチドなどで使用する場合、このタンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって生産されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって生産される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli））に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを生産することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。
本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、この結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。より好ましくは、本発明の結合タンパク質は、ｐＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。
更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質性ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素、小分子、抗生物質などへのカップリングなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する結合因子を更に含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は更に、腫瘍細胞及び／又は感染細胞を殺滅することができる毒性因子を含む。毒性因子の例としては、ビンブラスチン、ドキシルビシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、カリケアマイシン、デュオカルマイシン－ヒドロキシベンズアミド－アザインドール（ＤＵＢＡ）、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）、並びに、アウリスタチン及びメイタンシンなどの微小管阻害剤ファミリーの誘導体、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、薬物メイタンシノイド１（ＤＭ１）及び薬物メイタンシノイド４（ＤＭ４）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「結合ドメイン」は、標的に対する結合特異性を呈するタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、この結合ドメインは、組換え結合ドメインである。
用語「標的」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又はそのような個々の分子のいずれかの部分を含むいずれかの他の天然に存在する分子などの個々の分子、或いはそのような分子の２個以上からなる複合体、或いは細胞全体の試料又は組織試料、或いはいずれかの非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。本発明の文脈において、ペプチド－ＭＨＣ複合体並びにペプチド－ＭＨＣ提示細胞及び組織は、ｐＭＨＣ特異的結合タンパク質の標的である。更に、例えば、Ｔ細胞などのＣＤ３及びＣＤ３発現細胞は、ＣＤ３などの免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する結合因子を更に含む、本発明のｐＭＨＣ特異的結合タンパク質の標的である。
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。
国際公開第２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６）は、リピートタンパク質の特徴と反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明を含む。用語「リピートタンパク質」は、１つ以上の反復ドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、リピートタンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、このリピートタンパク質は、更なる非リピートタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ及び／又はペプチドリンカーを含む場合がある。反復ドメインは、結合ドメインである場合がある。
用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインはまた、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールも含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９－５０３，２００３、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１２／０６９６５５号）、高ロイシン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７－５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の例から当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。
用語「アンキリン反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続するアンキリン反復モジュールを含む反復ドメインを指し、当該アンキリン反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。
設計されたリピートタンパク質、設計された反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのようなリピートタンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界では生じないという特性を指す。本発明の結合タンパク質は、設計されたリピートタンパク質であり、これらは少なくとも１つの設計された反復ドメインを含む。好ましくは、設計された反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。
用語「標的相互作用残基」は、標的との直接的な相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。
用語「フレームワーク残基」又は「フレームワーク位置」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、フォールディングトポロジーに寄与する、すなわち、当該反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα－ヘリックス若しくはβ－シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。
そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。
用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じるリピートタンパク質の反復単位から誘導される、設計された反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在するリピートタンパク質のファミリー又はサブファミリー、好ましくは、アンキリンリピートタンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、標的上で選択された反復ドメインから得られた、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。
したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリンリピートタンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリンリピートタンパク質は、当業者に周知である。
反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（本明細書で相互交換可能に使用される「非ランダム化された位置」又は「固定された位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化された位置」）を含み得る。非ランダム化された位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化された位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可され、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。この特許出願の目的のために、配列番号２７～５０のアミノ酸残基３、４、６、１４、及び１５は、本発明のアンキリン反復モジュールのランダム化された位置である。
用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、この反復モジュールは、同じ標的に対する結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基の位置及び標的相互作用残基位置を含む。このフレームワーク残基の位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、この標的相互作用残基の位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化された位置及びランダム化された位置を含む。
用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、この「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全てのこのモチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富む変異体反復単位が挙げられる。
用語「結合特異性」、「標的に対する結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「標的に高い特異性で結合する」、「標的に対して特異的」又は「標的特異性」等は、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等の非関連タンパク質に結合するよりも低い解離定数で、ＰＢＳ中で標的に結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「ＫD」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０2倍、より好ましくは少なくとも１０3倍、より好ましくは少なくとも１０4倍、又はより好ましくは少なくとも１０5倍低い。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫDの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、ＫD値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。ｐＭＨＣに対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（ＫD）の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による典型的かつ好ましい決定は、実施例２に説明されている。
用語「約」は、言及した値の＋／－２０％を意味し、例えば、「約５０」は、４０～６０を意味するものとする。
用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、免疫系が外来物質を認識するのを助ける細胞の表面上に見られるタンパク質をコードする遺伝子の群である。主要組織適合性複合体又はそのようなタンパク質の複合体によってコードされるタンパク質は、［ＭＨＣタンパク質」又は「ＭＨＣ分子」と呼ばれる。ＭＨＣタンパク質は、全てのより高次の脊椎動物に見られる。最も注目すべきことは、Ｔ細胞受容体などの免疫細胞受容体にペプチドを呈するＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ糖タンパク質である。ヒトにおいて、主要組織適合性複合体はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系とも呼ばれる。
本明細書で使用される用語「ＭＨＣ」は、主要組織適合性複合体、好ましくは哺乳動物の主要組織適合性複合体、更により好ましくはヒトの主要組織適合性複合体を指す。本明細書で使用される用語「ＨＬＡ」は、ヒト白血球抗原系を指す。ＭＨＣ分子はペプチドを示し、脊椎動物の免疫系に提示する。用語「ペプチド抗原」及び「ＭＨＣペプチド抗原」は、本明細書で相互交換可能に使用され、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝において結合することができるＭＨＣリガンドを指す。ペプチド抗原は、典型的には、ペプチド結合を介して連結された８～２５のアミノ酸を有する。ＭＨＣペプチド抗原は、自己ペプチド又は非自己ペプチドのいずれかであることができる。ペプチド抗原は、典型的には、ＭＨＣ分子によって免疫系に提示されることができる。ＭＨＣクラスＩ分子は、典型的には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞にペプチド抗原を呈するのに対し、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、典型的には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞にペプチド抗原を呈する。本発明の文脈において、ペプチド抗原がＭＨＣ分子に結合したときに、本発明の結合タンパク質によって特異的に結合されるペプチド抗原は、「標的ペプチド」とも呼ばれる。したがって、用語「ペプチド－ＭＨＣ複合体」、「ｐＭＨＣ複合体」、「ペプチド－ＭＨＣ」、及び「ｐＭＨＣ」は、本出願において相互交換可能に使用され、ＭＨＣ分子へのペプチド抗原の結合によって形成される複合体を指す。好ましくは、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子である。また好ましくは、ペプチドは、腫瘍細胞において発現するタンパク質に由来するペプチド、感染因子のタンパク質に由来するペプチド、例えば、ウイルス感染因子、又は自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチドである。１つの好ましい実施形態では、腫瘍細胞において発現する当該タンパク質は、腫瘍特異的タンパク質である。
用語「腫瘍特異的タンパク質」は、腫瘍細胞において発現し、かつ多くの若しくは全ての非腫瘍形成組織において発現しないか又はより低いレベルでのみ発現するか、又は腫瘍組織に加えて限られた数の非腫瘍形成組織においてのみ発現するタンパク質を意味する。好ましくは、腫瘍特異的タンパク質は、癌特異的である免疫応答を誘発する能力を有する。腫瘍特異的タンパク質の例は、当業者に公知であり、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＣＴ８３、ＳＳＸ２などを含むが、これらに限定されない。
１つの好ましい実施形態では、感染因子の当該タンパク質又は当該感染細胞において発現する当該タンパク質は、ウイルス特異的タンパク質である。
用語「ウイルス特異的タンパク質」は、ウイルス感染細胞においてウイルスゲノムから発現し、かつ非感染宿主細胞においては発現しないタンパク質を意味する。ウイルス特異的タンパク質の例は、当業者に公知であり、ＥＢＮＡ－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３、ＬＭＰ－１、ＬＭＰ－２、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ４、ＮＳＰ５、ＮＳＰ６、Ｅ１、Ｅ２、ＨＢｘ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇなどを含むが、これらに限定されない。自己免疫障害と関係するタンパク質の例は、当業者に公知であり、カルボキシペプチダーゼＨ、クロモグラニンＡ、インスリン、β－アレスチン、アクアポリン－４、シトルリン化タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
「標的ペプチド－ＭＨＣ複合体」は、ペプチド抗原が標的ペプチドであるペプチド－ＭＨＣ複合体を指す。
より好ましくは、ペプチド抗原は、感染因子のタンパク質、更により好ましくはウイルス感染因子のタンパク質に由来する。更により好ましくは、ウイルス感染因子は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。最も好ましくは、ＨＢＶの当該タンパク質は、ウイルス特異的タンパク質である。
最も好ましくは、ペプチド抗原は、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）に由来する。好ましくは、ＨＢｃＡｇに由来するペプチド抗原は、本明細書で「ＨＢＶｃ１８」又は「ｃ１８ペプチド」と略される、ＨＢＶコア抗原の配列１８～２７であり、アミノ酸配列ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号５１）を有する。
「腫瘍特異的タンパク質に由来するペプチド」、「細胞内タンパク質に由来するペプチド」、「感染因子のタンパク質に由来するペプチド」、「自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチド」などにおいて使用されるような用語「に由来するペプチド」は、個々のタンパク質の分子画分又はペプチドフラグメントを指す。そのようなペプチドフラグメントは、Ｔ細胞などのある特定のリンパ球による認識に対して、細胞の表面上のＭＨＣ分子との関係で提示される、すなわち示されるために、正常タンパク質又は病原性タンパク質の分解に起因し得る。提示されたペプチドは、自己又は非自己のいずれかであることができ、生物体の免疫系は、通常、自己と非自己を区別することができ、したがって生物の免疫系がそれ自体の細胞を標的とすることを防止することができる。或いは、そのようなペプチドフラグメントは、当該技術分野において公知の方法によって生産され得る。好ましくは、ペプチドは、細胞内タンパク質に由来する。
用語「結合因子」は、標的分子を特異的に結合することができるいずれかの分子を指し、例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：５１８２－５１９０（１９９１））、抗体模擬体、リピートタンパク質、例えば、設計されたアニクリンリピートタンパク質、受容体タンパク質、及び標的分子のいずれかの他の天然に存在する相互作用パートナーを含み、天然タンパク質と、例えば、非天然残基を含むように、及び／又は天然残基を欠いているように修飾され又は遺伝子操作されたタンパク質とを含むことができる。
結合ドメインの用語「負の選択」又は「選択解除」は、結合ドメインの集合体からの本発明の目的に適切ではないか又はあまり適していない結合ドメインの選択的除去を意味する。本発明の文脈において、負の選択又は選択解除は、好ましくは、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体以外のペプチド－ＭＨＣ複合体に対して結合特異性を有する、又は異なるｐＭＨＣ複合体の共通ＨＬＡ－Ａ足場に対して結合特異性を有する望ましくない設計された反復ドメインの、設計された反復ドメインの集合体からの選択的除去を意味する。例えば、結合ドメインの集合体の望ましくない結合ドメインなどの、集合体の望ましくないメンバーを負に選択するか又は選択解除するための方法は、当業者に公知である。
本明細書で使用される用語「ペプチド－ＭＨＣ提示細胞」は、細胞表面上にペプチド－ＭＨＣを発現することができるか又は示すことができるいずれかの細胞を指す。これには、腫瘍細胞、感染細胞、自己免疫障害と関係する細胞、樹枝細胞、マクロファージ、及びＢ細胞などの従来からの抗原提示細胞、並びにペプチドをパルス処理したＴ２細胞など、外側から投与されたペプチドに結合したＭＨＣ分子を示すために作製された細胞が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で使用される用語「ＣＤ３発現細胞」は、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）及びＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）などのＴ細胞を含むがこれらに限定されない、細胞表面上にＣＤ３（分化クラスター３）を発現するいずれかの細胞を指す。
用語「Ｔ細胞の腫瘍限局性活性化」は、非腫瘍組織と比較して、Ｔ細胞が腫瘍組織において優先的に活性化されることを意味する。
用語「Ｔ細胞の感染症限局性活性化」は、非感染組織と比較して、Ｔ細胞が感染組織において優先的に活性化されることを意味する。
用語「医学的状態」（又は「障害」又は「疾患」）には、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に説明する組換え結合タンパク質のいずれかを、そのような障害、特に、自己免疫障害、炎症性障害、感染症（例えば、ウイルス性感染症又は細菌性感染症）、及び腫瘍性疾患を含む群から選択される障害の処置のための医薬品の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換え結合タンパク質又は医薬組成物を投与するステップを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、当該医学的状態は腫瘍性疾患である。用語「腫瘍性疾患」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態（state or condition）を指す。一実施形態では、当該医学的状態は、悪性腫瘍性疾患である。一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。別の好ましい実施形態では、当該医学的状態は、感染症である。別の好ましい実施形態では、当該医学的状態は、自己免疫疾患である。用語「治療有効量」は、患者において所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。
用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の任意のフラグメント及び変異体も意味する。そのようなフラグメント及び変異体もまた、当技術分野において周知であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で常時使用されている。したがって、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、及び単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗体フラグメント、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合ポリペプチド、並びに非従来型抗体を包含する。
用語「癌」及び「癌性」は、本明細書では、典型的には、調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。癌は、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移性を包含する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。癌の例としては、原発癌及び転移癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、骨髄腫黒色腫及び白血病、並びにいずれかの他の上皮悪性腫瘍及び血球系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例としては、脳癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、腎癌、大腸癌、胃癌、頭頚部癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、癌腫、扁平上皮細胞癌、明細胞腎癌、頭頚部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、三重陰性乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、頭頚部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、悪性中皮腫、脂肪肉腫、神経芽腫、又は滑膜肉腫が挙げられる。
用語「治療有効量」は、対象において所望の生物学的、薬理学的、又は治療上の結果を誘導するのに十分な量を指す。本発明の文脈における治療有効量は、いずれかの医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で疾患又は障害を処置又は予防するための結合タンパク質の十分量を意味する。
用語「処置」又は「処置すること」は、治療手段と、予防手段又は防止手段とをいずれも指す。処置を必要とするものとしては、既に障害に罹患しているもの、及び障害が防止されるべきものが挙げられる。
処置の目的のための用語「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農場動物、非ヒト霊長類、並びにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような、動物園動物、スポーツ動物、又はペット動物を含む哺乳動物として分類されるいずれかの動物を指す。用語「自己免疫疾患」及び「自己免疫障害」は、哺乳動物の免疫系が、哺乳動物自体の組織に対する又は哺乳動物に対して本質的に有害ではない抗原に対する体液性又は細胞性の免疫応答を開始し、それによりそのような哺乳動物において組織損傷を生じる障害を指すか又は説明するために本明細書で使用される。自己免疫障害の例は多く、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ及びＩ型糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患としてはまた、急性糸球体腎炎、アジソン病、成人発症特発性副甲状腺機能不全（ＡＯＩＨ）、完全脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、ベーチェット病、セリアック病、慢性活動性肝炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、皮膚筋炎、拡張型心筋症、好酸球増多・筋痛症候群、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、ヘモクロマトーシス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、特発性ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、若年性関節リウマチ、ランバート・イートン症候群、線状ＩｇＡ皮膚症、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、ナルコレプシー、壊死性血管炎、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、ネフローゼ症候群、類天疱瘡、天疱瘡、多発性筋炎、原発性硬化性胆管炎、乾癬、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身強直症候群、甲状腺炎、及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。
用語「感染症」及び「感染」は、特に病理学的症状を引き起こす、体組織における微生物の浸潤及び増殖を指すか又は説明するために、本明細書で使用される。感染症の例としてはとりわけ、例えば、ＨＩＶ感染症、ウェストナイル熱ウイルス感染症、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型肝炎、痘瘡、結核、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）感染症、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、ＳＡＲＳ、インフルエンザ、エボラウイルス病、ウイルス性髄膜炎、疱疹、炭疽、ライム病、及び大腸菌感染症などのウイルス性疾患及び細菌性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
以下に開示される出発材料及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を使用して調製することができる。
材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、クローニング及びタンパク質生産に使用した。例えば、大腸菌のＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）。
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、クローニング及びタンパク質生産に使用した。例えば、大腸菌のＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）。
分子生物学
特に明記しない限り、方法は既知のプロトコルに従って行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
特に明記しない限り、方法は既知のプロトコルに従って行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリー
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．に記載されている。そのような方法により、ランダム化されたアンキリン反復モジュール及び／又はランダム化されたキャッピングモジュールを有する設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号５、６又は７のＮ末端キャッピングモジュール）、又は配列番号８によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、配列番号９、１０又は１１の配列モチーフによる１個以上のランダム化反復モジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号１２、１３又は１４のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号１５によるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができた。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有さないように組み立てられる。加えて、配列番号９、１０、又は１１の配列モチーフによるランダム化反復モジュールは、位置１０及び／又は位置１７で更にランダム化することができ、配列番号８の配列モチーフによるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュールは、位置７及び／又は位置９で更にランダム化することができ、配列番号１５の配列モチーフによるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置１０、１１、及び／又は１７において更にランダム化することができた。
設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．に記載されている。そのような方法により、ランダム化されたアンキリン反復モジュール及び／又はランダム化されたキャッピングモジュールを有する設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号５、６又は７のＮ末端キャッピングモジュール）、又は配列番号８によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、配列番号９、１０又は１１の配列モチーフによる１個以上のランダム化反復モジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号１２、１３又は１４のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号１５によるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができた。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有さないように組み立てられる。加えて、配列番号９、１０、又は１１の配列モチーフによるランダム化反復モジュールは、位置１０及び／又は位置１７で更にランダム化することができ、配列番号８の配列モチーフによるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュールは、位置７及び／又は位置９で更にランダム化することができ、配列番号１５の配列モチーフによるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置１０、１１、及び／又は１７において更にランダム化することができた。
そのようなライブラリー内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体の補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリー又は新規に生成されたペプチドライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、誘導として、ヒトリボヌクレアーゼＬ（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ，Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ，Ｇｏｔｏ，Ｙ．，Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２３（３０），３９２９－３９３８，２００４）のＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を使用して設計することができる。２個のアンキリン反復の境界近くに存在するベータターンの中に１０個のアミノ酸が挿入されているこのアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリンリピートタンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの１個以上のベータターンの中に挿入された可変長（例えば、１個～２０個のアミノ酸）のランダム化されたループ（固定された位置及びランダム化された位置を有する）を含有することができる。
アンキリンリピートタンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＲＥＬＬＫＡモチーフ、ＲＩＬＬＫＡモチーフ、又はＲＩＬＬＡＡモチーフを有し（例えば、配列番号１６の位置２１～２６に存在）、アンキリンリピートタンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＫＬＮモチーフ、ＫＬＡモチーフ、又はＫＡＡモチーフを有する（例えば、配列番号１６における最後の３個のアミノ酸に存在）。
そのようなアンキリンリピートタンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の独自の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。
Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃで設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーなどの、設計されたアンキリンリピートタンパク質ライブラリーの例が説明されている（米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端キャッピングモジュールとＣ末端キャッピングモジュールの間に存在するランダム化された反復モジュールの数を記載している。
反復単位及びモジュールの内側の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．に基づいており、アンキリン反復モジュール及びアンキリン反復単位の境界が１つのアミノ酸位置によってシフトされる変更を有する。例えば、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．のアンキリン反復モジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に相当する。
全てのＤＮＡ配列は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって確認された。
実施例１：ＨＢＶｃ１８ペプチド－ＭＨＣ複合体（ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ）に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
概要
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を用いて、ＨＢＶｃ１８ペプチド－ＭＨＣ複合体（ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ）に対して結合特異性を有する複数のアンキリン反復ドメインを、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって説明されているものと同様の方法で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択し、具体的な条件及び追加の選択解除ステップは以下に説明するとおりであった。組換えＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ及び他のｐＭＨＣ複合体に対する選択されたクローンの結合及び特異性を、大腸菌の粗抽出物の均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって評価し、複数のＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号１６～２６のアンキリン反復ドメインは、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインからの個々のアンキリン反復モジュールは、例えば、配列番号２７～５０に提供されている。
概要
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を用いて、ＨＢＶｃ１８ペプチド－ＭＨＣ複合体（ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ）に対して結合特異性を有する複数のアンキリン反復ドメインを、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって説明されているものと同様の方法で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択し、具体的な条件及び追加の選択解除ステップは以下に説明するとおりであった。組換えＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ及び他のｐＭＨＣ複合体に対する選択されたクローンの結合及び特異性を、大腸菌の粗抽出物の均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって評価し、複数のＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号１６～２６のアンキリン反復ドメインは、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインからの個々のアンキリン反復モジュールは、例えば、配列番号２７～５０に提供されている。
標的及び選択材料としてのビオチン化ｐＭＨＣ複合体の生産
ＨＬＡ－Ａ*０２０１のビオチン化した３成分複合体（配列番号６９）、ヒトベータ２－ミクログロブリン（ｈβ２ｍ、配列番号７０）及び表１に列挙したペプチドのうちの１つを、確立されたプロトコル（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９２、Ｃｅｌｉｅ ｅｔ ａｌ，２００９）によって生産した。
ＨＬＡ－Ａ*０２０１のビオチン化した３成分複合体（配列番号６９）、ヒトベータ２－ミクログロブリン（ｈβ２ｍ、配列番号７０）及び表１に列挙したペプチドのうちの１つを、確立されたプロトコル（Ｇａｒｂｏｃｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９２、Ｃｅｌｉｅ ｅｔ ａｌ，２００９）によって生産した。
ＨＢＶｃ１８ペプチドに対して相同性を有するアミノ酸には下線が付されている。
実験で使用される全てのｐＭＨＣ複合体は、事前の品質管理試験を受けた。
リボソームディスプレイによるＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的アンキリンリピートタンパク質の選択
ｐＭＨＣ特異的アンキリンリピートタンパク質の選択を、標的としてのＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ複合体、先に説明したようなアンキリンリピートタンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルを用いるリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって行った（例えば、Ｚａｈｎｄ、Ｃ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，６９－７９，２００７を参照されたい）。各選択回の後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数を、結合剤の濃縮により、収率に合わせて調整して、一定に減少させた。最初の４回又は５回の選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を低下させ、洗浄ストリンジェンシーを上昇させて、第１の回から第４の回への選択圧力を上昇させた（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。以下に説明するように、異常な選択解除ステップを選択戦略へと組み込んだ。
ｐＭＨＣ特異的アンキリンリピートタンパク質の選択を、標的としてのＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ複合体、先に説明したようなアンキリンリピートタンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルを用いるリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって行った（例えば、Ｚａｈｎｄ、Ｃ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，６９－７９，２００７を参照されたい）。各選択回の後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数を、結合剤の濃縮により、収率に合わせて調整して、一定に減少させた。最初の４回又は５回の選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を低下させ、洗浄ストリンジェンシーを上昇させて、第１の回から第４の回への選択圧力を上昇させた（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。以下に説明するように、異常な選択解除ステップを選択戦略へと組み込んだ。
リボソームディスプレイの回の間、選択解除（又は負の選択）ステップが組み込まれ、この中で、三元複合体を、別のペプチドを含有する対応するアイソタイプＨＬＡ分子とともにプレインキュベートし、次いで、共通のＨＬＡ－Ａ足場から離れて、ペプチドを埋め込まれたエピトープへとアンキリンリピートタンパク質を結合させるよう特定するために、標的ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ複合体へと移した。言い換えれば、埋め込まれたペプチド組み込みペプチドによって提供される特異的エピトープではなく、ｐＭＨＣ複合体の共通のＨＬＡ－Ａ足場に主に結合するアンキリンリピートタンパク質を選択解除するために、選択解除（又は負の選択）を行った。更に、選択解除に使用される埋め込まれたペプチドによって提供されるエピトープと交差反応するアンキリンリピートタンパク質もまた、選択解除した。ここで、ペプチドＨＢｅ１８３（ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ）、ＨＢｅ１８３ｍｕｔ（ＦＬＬＲＩＬＴＩ）、ＥＢＮＡ－１（ＦＭＶＦＬＱＴＨＩ）及びＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）を選択解除に使用した。
詳細には、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ＰＢＳ中６６ｎＭニュートラビジンの１００μｌ溶液でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルマイクロプレートを、１ウェルあたり３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、３００μｌのＰＢＳＴ－ＢＳＡで４℃で１時間ブロッキングし、選択解除ステップの前に７００ｒｐｍで回転させた。ウェルを空にした後、ＰＢＳＴ－ＢＳＡ中の５０ｎＭのビオチン化ｐＭＨＣ選択解除標的溶液１００μｌを各ウェルに入れ、４℃、７００ｒｐｍで１時間回転させた。このインキュベーションステップ中、ｍＲＮＡインビトロ翻訳を行った。翻訳及び三元複合体混合物の生成直後に、ｐＭＨＣ－ＰＢＳＴ－ＢＳＡ溶液を廃棄し、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロプレートウェルを３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、最後にＷＢＴ－ＢＳＡとともにインキュベートした。実際の選択解除ステップについては、ＷＢＴ－ＢＳＡ溶液を廃棄し、１００μｌの一定分量（２～５の選択回向け、第１の選択回についてはそれぞれ１５０μｌ）の翻訳三元複合体をその後、固定された選択解除ｐＭＨＣ標的を含有する調製したＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐウェルへ３回移し、３つのウェルの各々において４℃で２０分間インキュベートした。選択解除プロセスの終了時に、各選択プールの１００μｌの三元複合体の一定分量を再度合わせ、一致している体積を、実際の標的の選択へと進めた。
４回目及び５回目のリボソームディスプレイ選択回の後、このプールをＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで細菌発現ベクターへとクローン化し、大腸菌ＸＬ－１ブルーに形質転換し、ＬＢ／Ｇｌｕ／Ａｍｐ寒天プレート上に播種した。
選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって決定されるＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ複合体に特異的に結合する（データ非表示）。
更に、タンパク質を従来のクロマトグラフィー法で精製した。
実施例２：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリンリピートタンパク質の解離定数（ＫD）の決定
免疫細胞エンゲージャー形式で機能しかつ、当該フォーマットでＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに結合する、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインの能力を試験するために、選択されたアンキリン反復ドメインを、従来のクローン化法を使用して、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する結合因子へ遺伝的に連関させた。この手順によって、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含みかつ、ＣＤ３に対して結合特異性を有する結合因子を更に含む結合タンパク質を生成した。これらのタンパク質を従来のクロマトグラフィー法で精製した。
免疫細胞エンゲージャー形式で機能しかつ、当該フォーマットでＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに結合する、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインの能力を試験するために、選択されたアンキリン反復ドメインを、従来のクローン化法を使用して、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する結合因子へ遺伝的に連関させた。この手順によって、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含みかつ、ＣＤ３に対して結合特異性を有する結合因子を更に含む結合タンパク質を生成した。これらのタンパク質を従来のクロマトグラフィー法で精製した。
ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ標的上の精製されたアンキリンリピートタンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）機（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に公知の標準的な手順に従って測定を行った。
簡単に説明すると、ビオチン化ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）含有）中に希釈し、ＮＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に、約１０００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまで被覆した。次いで、アンキリンリピートタンパク質とｐＭＨＣ複合体との相互作用を、マルチトレースＳＰＲ測定については１．２ｎＭ～１００ｎＭ、２．５ｎＭ～２００ｎＭ、又は６．２ｎＭ～５００ｎＭの濃度範囲を網羅する連続希釈のアンキリンリピートタンパク質を含有する１５０μＬの泳動用緩衝液（０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）を注入すること（オンレート測定）、続いて１００μＬ／分の一定流量で少なくとも６０分間、泳動用緩衝液流を注入すること（オフレート測定）によって測定した。標的再生は行わなかった。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）を、アンキリンリピートタンパク質の注入後に得られたＲＵトレースから減算した。オンレート測定及びオフレート測定から得られたＳＰＲトレースに基づいて、対応するアンキリンリピートタンパク質の、ｐＭＨＣ複合体に対するオンレート及びオフレートを決定した。
代表的な例として、図１Ａ～図１Ｊは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１６～＃１８及び＃２０～＃２６のＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣへの結合についてそれぞれ得られたＳＰＲトレースを示す。
解離定数（ＫD）を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣによる選択されたアンキリンリピートタンパク質の結合相互作用のＫD値を、低ナノモル濃度範囲以下にあると決定した。これらの選択されたアンキリンリピートタンパク質のいずれも、対照ペプチドとの測定可能な結合相互作用を示さなかった。表２は、いくつかの選択されたアンキリンリピートタンパク質のＫD値を例として提供している。
これらの実験データは、特異的ｐＭＨＣ複合体に対して高い結合親和性及び特異性を有する設計されたアンキリンリピートタンパク質、すなわちＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ複合体が、実施例１に説明されるように、スクリーニング及び選択手順を使用して生成されたことを実証している。
実施例３：パルス処理Ｔ２細胞を使用して、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むタンパク質を結合することによるＴ細胞の活性化
免疫細胞エンゲージャー形式で機能するＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインの能力を試験するために、選択されたアンキリン反復ドメインを、従来のクローン化法を使用して、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する結合因子へ遺伝的に連関させた。この手順によって、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含みかつ、ＣＤ３に対して結合特異性を有する結合因子を更に含む結合タンパク質を生成した。
免疫細胞エンゲージャー形式で機能するＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインの能力を試験するために、選択されたアンキリン反復ドメインを、従来のクローン化法を使用して、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対して結合特異性を有する結合因子へ遺伝的に連関させた。この手順によって、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含みかつ、ＣＤ３に対して結合特異性を有する結合因子を更に含む結合タンパク質を生成した。
ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ表示標的細胞への結合時にＴ細胞を活性化する、Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）形式のＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインの能力を、Ｔ細胞活性化アッセイで分析した。
ＨＢＶｃ１８ペプチドでパルス処理したＴ２細胞を、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ表示標的細胞として使用した。エフェクター細胞は、ＢＫ１１２ Ｔ細胞であったが、これは健康なドナーから増殖したモノクローナルＣＤ８+Ｔ細胞である（Ｌｅｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５９４－６０１（１９９８））。Ｔ細胞活性化アッセイについて、Ｔ２細胞を１０μＭのペプチドとともに３７℃で一晩パルス処理した。エフェクターＢＫ１１２ Ｔ細胞を、異なる濃度（例えば、１ｐＭ）のＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の存在下で、１：５のエフェクター対標的細胞比で添加し、３７℃で４～５時間インキュベートした。次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮ－γを、Ｔ細胞活性化の手段として蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定した。ＦＡＣＳに使用される試薬は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＡＰＣマウス抗ヒトＩＦＮ－γ及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）マウス抗ヒトＣＤ８を含んでいた。
図２Ａ～図２Ｊは、このＴ細胞活性化アッセイにおいて、ＴＣＥ形式（１ｐＭ、１００ｐＭ及び１０’０００ｐＭ）で異なるＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインのパネルを試験した結果を示す。ＴＣＥ形式のＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインは（図２の図面番号に対応しており）、（Ａ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１６、（Ｂ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１７、（Ｃ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、（Ｄ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２０、（Ｅ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２１、（Ｆ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２２、（Ｇ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２３、（Ｈ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４、（Ｉ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５、及び（Ｊ）ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６であった。対照として、本実験はまた、非パルス処理Ｔ２細胞及びＴ細胞のみ（ＨＬＡ－Ａ*０２＋）を用いても実施した。４時間のインキュベーション後、Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮ－γをＦＡＣＳによって決定した。
１０個のＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は全て、パルス処理Ｔ２細胞において標的ペプチド－ＭＨＣ複合体の存在下でＴ細胞活性化に特異的に介在したが、非パルス処理Ｔ２細胞では又はＴ細胞のみの存在下では、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体の非存在下で介在しなかった（又ははるかに少なかった）。ＴＣＥ形式のこれらのＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインの全ては、非パルス処理Ｔ２細胞と比較して、パルス処理Ｔ２細胞の存在下で、エフェクターＴ細胞の少なくとも１００倍高い活性化を達成した。したがって、ＴＣＥ形式のこれらのＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインの全ては、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ表示標的細胞の存在に依存するエフェクターＴ細胞を特異的に活性化することができた。
実施例４：アラニン走査突然変異誘発によって分析される、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質による標的ペプチド結合の特異性
ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインとＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ標的の間の特異的相互作用を分析するために、アラニン走査突然変異誘発を行った。この目的のために、ＨＢＶｃ１８（ＨＢＶコア抗原タンパク質１８－２７）（配列番号５１）ペプチド及び、各々においてＨＢＶｃ１８ペプチドの１個のアミノ酸をアラニンで置き換えた当該ペプチドの一連の変異体を、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。本アッセイは、本質的に実施例３に説明したように、パルス処理Ｔ２細胞を標的細胞として、ＢＫ１１２Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。ＨＢＶｃ１８ペプチドにおけるアミノ酸残基がＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインと、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ標的の間の結合相互作用にとって重要である場合、このアミノ酸残基がアラニンと置き換えられていれば、Ｔ細胞活性化が低減したり又はなかったりすることが観察される。
ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインとＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ標的の間の特異的相互作用を分析するために、アラニン走査突然変異誘発を行った。この目的のために、ＨＢＶｃ１８（ＨＢＶコア抗原タンパク質１８－２７）（配列番号５１）ペプチド及び、各々においてＨＢＶｃ１８ペプチドの１個のアミノ酸をアラニンで置き換えた当該ペプチドの一連の変異体を、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。本アッセイは、本質的に実施例３に説明したように、パルス処理Ｔ２細胞を標的細胞として、ＢＫ１１２Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。ＨＢＶｃ１８ペプチドにおけるアミノ酸残基がＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインと、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ標的の間の結合相互作用にとって重要である場合、このアミノ酸残基がアラニンと置き換えられていれば、Ｔ細胞活性化が低減したり又はなかったりすることが観察される。
アラニン突然変異ペプチドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから入手し、以下の配列を有した。ＡＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６１、位置１におけるＦ→Ａ）、ＦＬＡＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６２、位置３におけるＰ→Ａ）、ＦＬＰＡＤＦＦＰＳＶ（配列番号６３、位置４におけるＳ→Ａ）、ＦＬＰＳＡＦＦＰＳＶ（配列番号６４、位置５におけるＤ→Ａ）、ＦＬＰＳＤＡＦＰＳＶ（配列番号６５、位置６におけるＦ→Ａ）、ＦＬＰＳＤＦＡＰＳＶ（配列番号６６、位置７におけるＦ→Ａ）、ＦＬＰＳＤＦＦＡＳＶ（配列番号６７、位置８におけるＰ→Ａ）、及びＦＬＰＳＤＦＦＰＡＶ（配列番号６８、位置９におけるＳ→Ａ）。Ｔ２細胞をＨＢＶｃ１８ペプチド及び突然変異したペプチド（１０μＭ）の各々でパルス処理した。パルス処理Ｔ２細胞を、ＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の存在下で、１：５のエフェクター対標的細胞比で、エフェクターＢＫ１１２Ｔ細胞とともにインキュベートした。
アラニン走査突然変異誘発分析は、どのペプチド残基がＴＣＥ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質とＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ標的の間の結合相互作用にとって重要であるかを示した（図３Ａ～図３Ｊ）。これらのデータは、各場合において、この結合相互作用にとって少なくとも２個のペプチド残基が重要であったので、アラニンに突然変異したときのＨＢＶｃ１８ペプチドと比較して、Ｔ細胞活性化の少なくとも５０％の低下を引き起こしたことを実証している。驚くべきことに、いくつかの場合において、少なくとも４個のペプチド残基との相互作用が、アンキリン反復ドメインの標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合にとって重要であり、すなわち、そのアラニンへの突然変異は、野生型ペプチドと比較してＴ細胞活性化を少なくとも５０％の低減をもたらした。一例として、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２３について、ＨＢＶｃ１８標的ペプチドの少なくとも位置５、６、７、及び８は、Ｔ細胞活性化につながる機能的結合相互作用にとって重要であった（図３Ｇ）。別の例として、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２１について、ＨＢＶｃ１８標的ペプチドの少なくとも位置５、６、７、及び８は、Ｔ細胞活性化につながる機能的結合相互作用にとって重要であった（図３Ｅ）。別の例として、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２２について、ＨＢＶｃ１８標的ペプチドの少なくとも位置３、６、７、及び８は、Ｔ細胞活性化につながる機能的結合相互作用にとって重要であった（図３Ｆ）。
結論として、これらのデータは、ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質とＨＢＶｃ１８標的ペプチドの間の特異的相互作用にとって驚くほど多数のペプチド残基が重要であることを示す。このことは、設計されたアンキリン反復ドメインによって形成される結合表面と、抗体及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの他の結合タンパク質によって形成される結合表面の間の構造的な違いを反映し得る。
実施例５：ＮＹＥＳＯｐＭＨＣに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むタンパク質を結合することによる免疫細胞の活性化に対するリンカー長の影響
Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）形式での本発明の結合タンパク質における、ＴＣＥ形式におけるそのような結合タンパク質の力価に対するｐＭＨＣ特異的結合ドメインとＣＤ３特異的結合因子の間のリンカー長の長さの影響を試験するために、様々な長さのリンカーでＣＤ３結合ドメインに接続されたＮＹＥＳＯｐＭＨＣ結合ドメインを含む異なる構築物を、異なる腫瘍細胞株を用いたＴ細胞活性化アッセイにおいて試験した。
Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）形式での本発明の結合タンパク質における、ＴＣＥ形式におけるそのような結合タンパク質の力価に対するｐＭＨＣ特異的結合ドメインとＣＤ３特異的結合因子の間のリンカー長の長さの影響を試験するために、様々な長さのリンカーでＣＤ３結合ドメインに接続されたＮＹＥＳＯｐＭＨＣ結合ドメインを含む異なる構築物を、異なる腫瘍細胞株を用いたＴ細胞活性化アッセイにおいて試験した。
リンカー長設計及び略語
ＴＣＥ形式における以下の結合タンパク質を、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７８（配列番号７８）又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７９（配列番号７９）をＮＹＥＳＯｐＭＨＣ特異的結合ドメインとして含んで、生成した。
ＴＣＥ形式における以下の結合タンパク質を、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７８（配列番号７８）又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７９（配列番号７９）をＮＹＥＳＯｐＭＨＣ特異的結合ドメインとして含んで、生成した。
Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＴＣＥ形式での結合タンパク質の力価及び特異性
異なるリンカーで生成されたＴＣＥ形式における結合タンパク質の力価及び特異性を、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて異なる腫瘍細胞株を使用して試験した。腫瘍細胞株（ＩＭ９及びＵ２６６Ｂ１）のいくつかは、ＮＹ－ＥＳＯ－１を内在的に発現し、それらの細胞表面上のｐＭＨＣ複合体においてＮＹ－ＥＳＯ－１標的ペプチドを提示する。他の腫瘍細胞株（ＭＣＦ７及びＣｏｌｏ２０５）は、ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現せず、この故に、それらの細胞表面上のｐＭＨＣ複合体中にＮＹ－ＥＳＯ－１標的ペプチドを提示しない。
異なるリンカーで生成されたＴＣＥ形式における結合タンパク質の力価及び特異性を、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて異なる腫瘍細胞株を使用して試験した。腫瘍細胞株（ＩＭ９及びＵ２６６Ｂ１）のいくつかは、ＮＹ－ＥＳＯ－１を内在的に発現し、それらの細胞表面上のｐＭＨＣ複合体においてＮＹ－ＥＳＯ－１標的ペプチドを提示する。他の腫瘍細胞株（ＭＣＦ７及びＣｏｌｏ２０５）は、ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現せず、この故に、それらの細胞表面上のｐＭＨＣ複合体中にＮＹ－ＥＳＯ－１標的ペプチドを提示しない。
Ｔ細胞活性化アッセイは、当該技術分野で公知の方法によって実施した。簡潔には、標的腫瘍細胞及びエフェクターＰＢＭＣを、５：１のエフェクター対標的細胞比で組み合わせ、ＴＣＥ形式のＮＹＥＳＯｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインを異なる濃度で添加し（表３の構築物を参照されたい）、この混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーＣＤ２５のレベルを、ＦＡＣＳ（ＣＤ２５モノクローナル抗体（ＢＣ９６）、ＰｅｒＣＰ－シアニン５．５，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８マウス抗ヒトＣＤ８を使用）によって決定した。免疫細胞の活性化を、ＨＬＡ－Ａ２及びＮＹ－ＥＳＯ－１を内在的に発現し、その表面上にＮＹＥＳＯｐＭＨＣを示す腫瘍細胞株（ＩＭ９）と、ＨＬＡ－Ａ２を発現するがＮＹ－ＥＳＯ－１を発現せず、その表面上にＮＹＥＳＯｐＭＨＣを示さない腫瘍細胞株（ＭＣＦ－７）とを用いて比較した。ドナーから単離されたＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。同様のＴ細胞活性化アッセイはまた、ＨＬＡ－Ａ２及びＮＹ－ＥＳＯ－１を内在的に発現し、かつＮＹＥＳＯｐＭＨＣをその表面上に示す別の腫瘍細胞株（Ｕ２６６Ｂ１）と、ＨＬＡ－Ａ２を発現するがＮＹ－ＥＳＯ－１を発現せず、かつＮＹＥＳＯｐＭＨＣをその表面に示さない別の腫瘍細胞株（Ｃｏｌｏ２０５）とを用いて行った。対照として、エフェクターＰＢＭＣを同じように処理したが、例外は、標的細胞を添加しなかったことであった。
結合タンパク質の存在下で得られたＴ細胞活性化のレベルを、図４～図７に示す。リンカー長が短くなると、力価の増強が観察された。最も高い力価は、最短のリンカー（ＸＸＳ）で設計された構築物について観察され、２番目に最短のリンカー（ＸＳ）で設計された構築物の力価も、より長いリンカーで設計された構築物と比較して強く増強された。試験した細胞株のいずれについても、非特異的活性化のレベルの上昇は観察されなかった。
図４に示すデータから得られたＥＣ５０値を以下の表５に列挙する。
図５に示すデータから得られたＥＣ５０値を以下の表６に列挙する。
図６に示すデータから得られたＥＣ５０値を以下の表７に列挙する。
図７に示すデータから得られたＥＣ５０値を以下の表８に列挙する。
本データから、ＴＣＥ形式におけるｐＭＨＣ特異的結合ドメインについて、好ましくは、Ｌリンカーと少なくとも同じように短い、より好ましくは、少なくとも標準リンカーと同じように短い、より好ましくは、少なくともＳリンカーと同じように短い、より好ましくは、少なくともＸＳリンカーと同じように短い、より好ましくは、少なくともＸＸＳリンカーと同じように短い、最も好ましくは、ＸＸＳリンカーと同じように短いリンカーが使用されると結論付けることができる。この実施例で提供される特定のリンカーは、好ましい長さを有するそのようなリンカーの例である。
ＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣと、本発明のＴＣＥ形式（ＴＣＥ結合タンパク質）におけるＨＢＶｃ１８ｐＭＨＣ特異的アンキリン反復ドメインとを用いて実施した同様の実験では、リンカー長の同様の効果が観察される。
Claims (67)
- ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）特異的結合タンパク質を生産する方法であって、前記結合タンパク質が、標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する設計された反復ドメインを含む、方法であって、
（ａ）設計された反復ドメインの集合体を提供するステップと、
（ｂ）組換え標的ペプチド－ＭＨＣ複合体を提供するステップと、
（ｃ）前記標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する特異的結合について前記設計された反復ドメインの集合体をスクリーニングして、前記標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する少なくとも１個の設計された反復ドメインを得るステップと、を含む、方法。 - 前記設計された反復ドメインが、設計されたアンキリン反復ドメインである、請求項１に記載の方法。
- 前記集合体が、固定された位置とランダム化された位置とを含む設計された反復ドメインを含み、前記集合体の設計された反復ドメインが、前記ランダム化された位置のうちの少なくとも１つにおいて互いに異なる、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記設計されたリピートタンパク質の集合体が、リボソームディスプレイによって提供される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が更に、（ｉ）第２の組換えペプチド－ＭＨＣ複合体を提供するステップであって、前記第２のペプチド－ＭＨＣ複合体の前記ペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ前記標的ペプチドとは異なるアミノ酸配列を含む、提供するステップと、（ｉｉ）前記第２の組換えペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する負の選択設計反復ドメインによって前記集合体から除去するステップと、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する前記反復ドメインが、ＰＢＳ中の前記標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する前記反復ドメインの前記標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合が、前記標的ペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸残基との前記反復ドメインの相互作用を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する前記反復ドメインの、前記標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合が、前記反復ドメインと前記ＭＨＣの少なくとも１つのアミノ酸残基との相互作用を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ペプチドが、ウイルス感染因子のタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＭＨＣが、ＭＨＣクラスＩである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる設計された反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質。
- 第１の設計された反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記第１の反復ドメインが、第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有し、好ましくは、前記第１の標的ペプチドが、（ｉ）腫瘍細胞において発現するタンパク質に由来するペプチド、（ｉｉ）感染因子、好ましくはウイルス感染因子のタンパク質に由来するペプチド、及び（ｉｉｉ）自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチドからなる群から選択される、組換え結合タンパク質。
- 前記第１の標的ペプチドが、ウイルス感染因子のタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する、請求項１２に記載の結合タンパク質。
- 前記第１の反復ドメインが、ＰＢＳ中の前記第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する、請求項１２又は１３に記載の結合タンパク質。
- 前記第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への前記第１の反復ドメインの結合が、前記第１の標的ペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸残基との前記第１の反復ドメインの相互作用を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への前記第１の反復ドメインの結合が、前記第１の反復ドメインと前記第１のＭＨＣの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第１のＭＨＣが、ＭＨＣクラスＩである、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記ＭＨＣクラスＩが、ＨＬＡ－Ａ*０２である、請求項１７に記載の結合タンパク質。
- 前記第１の標的ペプチドが、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）に由来する、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第１の標的ペプチドが、配列番号５１のアミノ酸配列を有する、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第１の反復ドメインが、設計されたアンキリン反復ドメインである、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第１のアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、請求項２１に記載の結合タンパク質。
- 前記第１のアンキリン反復ドメインが、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている、請求項２１又は２２に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が更に、第２の設計された反復ドメインを含み、前記第２の反復ドメインが、第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有し、好ましくは前記第２の標的ペプチドが、（ｉ）腫瘍細胞において発現するタンパク質に由来するペプチド、（ｉｉ）感染因子、好ましくはウイルス感染因子のタンパク質に由来するペプチド、及び（ｉｉｉ）自己免疫障害と関係するタンパク質に由来するペプチドからなる群から選択される、請求項１１～２３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の標的ペプチドが、ウイルス感染因子のタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する、請求項２４に記載の結合タンパク質。
- 第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する前記第２の反復ドメインが、ＰＢＳ中の前記第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に、１０-7Ｍを下回る解離定数（ＫD）で結合する、請求項２４又は２５に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への前記第２の反復ドメインの結合が、前記第２の標的ペプチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸残基との前記第２の反復ドメインの相互作用を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体への前記第２の反復ドメインの結合が、前記第２の反復ドメインと前記第２のＭＨＣの少なくとも１個のアミノ酸残基との相互作用を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２のＭＨＣが、ＭＨＣクラスＩである、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の標的ペプチドが、前記第１の標的ペプチドと同じタンパク質に由来する、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の標的ペプチドが、前記第１の標的ペプチドと同じアミノ酸配列を有する、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の反復ドメインが、前記第１の反復ドメインと同じアミノ酸配列を有する、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の反復ドメインが、前記第１の反復ドメインと比較して異なるアミノ酸配列を有する、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の標的ペプチドが、前記第１の標的ペプチドと比較して異なるアミノ酸配列を有する、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の標的ペプチドが、前記第１の標的ペプチドが由来するタンパク質とは異なるタンパク質に由来する、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２のＭＨＣが、ＨＬＡ－Ａ*０２である、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２のＭＨＣが、ＨＬＡ－Ａ*０２ではない、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２の反復ドメインが、設計されたアンキリン反復ドメインである、請求項２４～３７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記第２のアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２７～５０及び（２）配列番号２７～５０のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、請求項３８に記載の結合タンパク質。
- 前記第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号１６～２６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが場合により失われており、かつ配列番号１６～２６の最後から２番目の位置のＡは、場合によりＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６～２６の最後の位置のＡは、場合によりＮによって置換されている、請求項３８又は３９に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が更に、免疫細胞の表面上に発現するタンパク質に対する結合特異性を有する結合因子を含む、請求項１１～４０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項４１に記載の結合タンパク質。
- 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞である、請求項４２に記載の結合タンパク質。
- 前記免疫細胞の表面上に発現するタンパク質が、前記Ｔ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記Ｔ細胞受容体複合体の一部である前記タンパク質が、分化クラスター３（ＣＤ３）である、請求項４４に記載の結合タンパク質。
- 前記結合因子が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、リピートタンパク質、又は設計された反復ドメインである、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記結合因子が、設計されたアンキリン反復ドメインである、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記結合因子が、前記第１の反復ドメイン及び／又は、存在する場合、前記第２の反復ドメインにペプチドリンカーを用いて共有結合している、請求項４１～４７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーが、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである、請求項４８に記載の結合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、１～１７個のアミノ酸の長さを有する、請求項４８又は４９に記載の結合タンパク質。
- 前記結合タンパク質が、前記第１の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体の認識を阻害することができ、かつ／又は前記結合タンパク質が前記第２の反復ドメインを含む場合、Ｔ細胞受容体による前記第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体の認識を阻害することができる、請求項１１～５０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
- 請求項１１～５１のいずれか一項に定義されるような、第１若しくは第２の標的ペプチド－ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する前記設計された反復ドメイン、をコードする、又は請求項１１～５１のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードする、核酸。
- 請求項１１～５１のいずれか一項に記載の結合タンパク質又は請求項５２に記載の核酸と、医薬として許容され得る担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
- 哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＴ細胞の感染症限局性活性化の方法であって、前記哺乳動物に、請求項１１～５０のいずれか一項に記載の結合タンパク質又は請求項５２に記載の核酸を投与するステップを含む方法であって、前記第１の標的ペプチド及び／又は、前記結合タンパク質が前記第２の反復ドメインを含む場合、前記第２の標的ペプチドが、感染因子のタンパク質に由来する、方法。
- 前記第１の標的ペプチド及び／又は、前記結合タンパク質が前記第２の反復ドメインを含む場合、前記第２の標的ペプチドが、感染因子のタンパク質に由来する、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＴ細胞の感染症限局性活性化の方法における使用のための、請求項１１～５０のいずれか一項に記載の結合タンパク質又は請求項５２に記載の核酸。
- 医学的状態を処置する方法であって、医学的状態を処置することを必要とする患者に、治療有効量の請求項１１～５１のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項５２に記載の核酸、又は請求項５３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- 医学的状態を処置する方法における使用のための、請求項１１～５１のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項５２に記載の核酸、又は請求項５３に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物、好ましくはヒトにおける医学的状態を診断する方法であって、
（ｉ）前記哺乳動物から得られた細胞試料又は組織試料を請求項１１～５１のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）前記細胞試料又は組織試料への前記結合タンパク質の特異的結合を検出するステップと、を含む、方法。 - 前記医学的状態が、癌、感染症、好ましくはウイルス感染症、又は自己免疫疾患である、請求項５６若しくは５８に記載の方法、又は請求項５７に記載の使用のための結合タンパク質。
- 前記医学的状態が癌である、請求項５６若しくは５８に記載の方法、又は請求項５７に記載の使用のための結合タンパク質。
- 前記医学的状態が、感染症、好ましくはウイルス感染症である、請求項５６若しくは５８に記載の方法、又は請求項５７に記載の使用のための結合タンパク質。
- 前記医学的状態が自己免疫疾患である、請求項５６若しくは５８に記載の方法、又は請求項５７に記載の使用のための結合タンパク質。
- 感染細胞の破壊のために、ウイルス感染症に罹患している患者における感染細胞を標的とする方法であって、前記患者に治療有効量の請求項１１～５１のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項５２に記載の核酸、又は請求項５３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法であって、前記第１の標的ペプチド及び／又は、前記結合タンパク質が前記第２の反復ドメインを含む場合、前記第２の標的ペプチドが、前記感染細胞において発現するタンパク質、好ましくはウイルス特異的タンパク質に由来する、方法。
- 前記結合タンパク質が更に、感染細胞を殺滅することができる毒性因子を含む、請求項６３に記載の感染細胞を標的とする方法。
- 前記第１の標的ペプチド及び／又は、前記結合タンパク質が前記第２の反復ドメインを含む場合、前記第２の標的ペプチドが、感染細胞において発現するタンパク質、好ましくは前記感染細胞において発現するウイルス特異的タンパク質に由来する、前記感染細胞の破壊のために、ウイルス感染症に罹患している患者において前記感染細胞を標的とする方法において使用するための、請求項１１～５１のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項５２に記載の核酸、又は請求項５３に記載の医薬組成物。
- 前記結合タンパク質が更に、感染細胞を殺滅することができる毒性因子を含む、請求項６５に記載の使用のための結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物。
- 前記医学的状態が、Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされるウイルス感染症である、請求項５６、５８～６０、６２及び６３のいずれか一項に記載の方法、又は請求項５７、６５及び６６のいずれか一項に記載の結合タンパク質、核酸若しくは医薬組成物。
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