RU2694729C2 - Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать L-лизин, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма - Google Patents
Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать L-лизин, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694729C2 RU2694729C2 RU2016141594A RU2016141594A RU2694729C2 RU 2694729 C2 RU2694729 C2 RU 2694729C2 RU 2016141594 A RU2016141594 A RU 2016141594A RU 2016141594 A RU2016141594 A RU 2016141594A RU 2694729 C2 RU2694729 C2 RU 2694729C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microorganism
- activity
- lysine
- acetate
- acka
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 106
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 93
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 61
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 37
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 108010049926 Acetate-CoA ligase Proteins 0.000 claims description 14
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 14
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 102000008146 Acetate-CoA ligase Human genes 0.000 claims 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 81
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 53
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 48
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 48
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 45
- 101150006213 ackA gene Proteins 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 29
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 28
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 17
- 101150108780 pta gene Proteins 0.000 description 16
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 12
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 12
- 102100035709 Acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 101100433987 Latilactobacillus sakei subsp. sakei (strain 23K) ackA1 gene Proteins 0.000 description 8
- 101150047711 acs gene Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 5
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 150000002763 monocarboxylic acids Chemical class 0.000 description 4
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N calcium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound [Ca].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- -1 glucose Chemical class 0.000 description 2
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100242035 Bacillus subtilis (strain 168) pdhA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100350224 Bacillus subtilis (strain 168) pdhB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100439426 Bradyrhizobium diazoefficiens (strain JCM 10833 / BCRC 13528 / IAM 13628 / NBRC 14792 / USDA 110) groEL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 101100236536 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) glcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000901842 Escherichia coli W Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101100123255 Komagataeibacter xylinus aceC gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010049977 Peptide Elongation Factor Tu Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100134871 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100406344 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceF gene Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 101150094017 aceA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150036393 aceB gene Proteins 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 101150070136 axeA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Substances [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01008—Phosphate acetyltransferase (2.3.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
- C12Y207/02001—Acetate kinase (2.7.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий усиленной способностью продуцировать L-лизин по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью, в котором ацетаткиназа имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. Предложен способ получения L-лизина с использованием микроорганизма рода Corynebacterium, обладающего усиленной способностью продуцировать L-лизин по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью. Предложено применение микроорганизма рода Corynebacterium, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью, для усиленного продуцирования L-лизина. Группа изобретений позволяет продуцировать L-лизин с высоким выходом по сравнению с исходным немодифицированным микроорганизмом. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 7 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему L-лизин, и способу получения L-лизина с использованием этого микроорганизма.
Предшествующий уровень техники
Микроорганизм рода Corynebacterium может использовать органические кислоты, такие как глюконат, ацетат и пируват, а также глюкозу, сахарозу и фруктозу в качестве источника углерода. Среди них ацетат, который представляет собой органическую кислоту, относящуюся к монокарбоновым кислотам, поступает в клетки путем пассивной диффузии или посредством переносчика монокарбоновых кислот (MctC), когда его использует микроорганизм рода Corynebacterium, фосфорилируется ацетаткиназой (аскА) с превращением в ацетилфосфат и включается в ацетил-КоА с помощью фосфотрансацетилазы (pta). Образованный таким образом ацетил-КоА непосредственно включается в цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) и глиоксилатный цикл (J. Bacterid. 2009. 191: 940-948), и таким образом образуется оксалоацетат, который является предшественником лизина.
Тем не менее, когда штамм рода Corynebacterium культивируют с использованием ацетата в качестве единственного источника углерода или в составе смешанного источника углерода, существует проблема, которая заключается в том, что может проявляться феномен ингибирования роста в соответствии с его концентрацией. Известно, что применение ацетата имеет ограничения в том, что скорость его метаболизма является низкой по сравнению с сахаридами, такими как глюкоза, а также, поскольку ацетат может ингибировать рост клеток, когда он присутствует в определенной концентрации в клетке, увеличение концентрации ацетата в культуральной среде может увеличивать лаг-фазу, тем самым увеличивая общее время культивирования (Arch. Microbiol. 1991. 155: 505-510). Соответственно, существует потребность в разработке способа для быстрого превращения ацетата в культуральной среде в ацетил-КоА в клетке.
Однако, ацетаткиназа и фосфотрансацетилаза, которые используются в пути активации ацетата, обладают двунаправленностью (обратимым действием), и поэтому существует проблема в том, что ацетил-КоА может быть превращен обратно в ацетат, и также сообщалось, что это может оказывать отрицательное действие на продуцирование L-лизина. Следовательно, разработка способа эффективного использования ацетата все еще актуально.
Описание
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения приложили много усилий для создания микроорганизма для эффективного потребления ацетата, который вырабатывается во время культивирования или предоставляется в качестве нового источника углерода, и в результате они подтвердили, что микроорганизм, обладающий усиленной активностью ацетаткиназы пути активации ацетата, может увеличивать способность потреблять ацетат и продуцировать L-лизин, тем самым создав настоящее изобретение.
Техническое решение
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью.
Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ продуцирования L-лизина с использованием вышеупомянутого организма.
Полезные эффекты изобретения
Микроорганизм по настоящему изобретению, являясь штаммом, обладающим повышенной способностью потреблять ацетат благодаря усиленному пути активации ацетата, представляет собой микроорганизм, который может продуцировать L-лизин с высоким выходом. Полученный таким образом L-лизин можно использовать в различных продуктах, включая не только корма для животных или добавки к кормам для животных, но также продукты питания и пищевые добавки для людей, лекарственные средства и так далее.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1а и 1б показаны графики, иллюстрирующие анализ способности КССМ11016Р (контрольный штамм) и модифицированного КССМ11016Р (модифицированный штамм с введенными pta и pta-ackA) потреблять ацетат в среде с ацетатом (Фиг. 1а) и в среде без ацетата (Фиг. 1б).
На Фиг. 2 показана схематическая диаграмма pDZTn-lysCP1-ackA, вектора для сверхэкспрессии ackA с промотора LysCPI, который представляет собой сильный промотор.
На Фиг. 3 показан график, иллюстрирующий анализ способности КССМ11016Р (контрольный штамм) и модифицированного КССМ11016Р (модифицированный штамм с введенными pta, pta-ackA и acs) потреблять ацетат.
Наилучшее воплощение изобретения
В одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, в котором усилена активность ацетаткиназы. Более конкретно, миркоорганизм представляет собой микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью.
Как его используют здесь, термин "L-лизин" относится к типу L-аминокислоты, которая представляет собой основную а-аминокислоту и незаменимую аминокислоту, не синтезируемую in vivo, имеющую химическую формулу NH2(CH2)4CH(NH2)COOH.
Ацетат представляет собой органическую кислоту, относящуюся к монокарбоновым кислотам, которая поступает в клетки путем пассивной диффузии или посредством переносчика монокарбоновых кислот, когда его использует микроорганизм рода Corynebacterium, фосфорилируется ацетаткиназой с превращением в ацетилфосфат и включается в ацетил-КоА с помощью фосфотрансацетилазы. Образованный таким образом ацетил-КоА непосредственно включается в цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) и глиоксилатный цикл, и таким образом образуется оксалоацетат, предшественник лизина. Микроорганизм рода Corynebacterium может использовать ацетат в качестве источника углерода. Однако, когда этот микроорганизм культивируют с использованием ацетата в качестве единственного источника углерода или в составе смешанного источника углерода, существует проблема в том, что проявляется феномен ингибирования роста в соответствии с его концентрацией (Arch. Microbiol. 1991. 155: 505-510).
В общих чертах, существуют два пути активации ацетата для превращения ацетата в ацетил-КоА в клетке. Как описано выше, два фермента (то есть ацетаткиназа и фосфотрансацетилаза) действуют последовательно у штамма рода Corynebacterium. Известно, что ген ackA кодирует ацетаткиназу, а ген pta кодирует фосфотрансацетилазу (Microbiol. 1999 145: 503-513). В другом пути у штамма рода Escherichia задействована ацетил-КоА-синтетаза, и известно, что ген acs кодирует ацетил-КоА-синтетазу (Appl Microbiol Biotechnol. 2006. 71: 870-874). Однако, поскольку путь активации в штамме рода Escherichia происходит посредством обратимой реакции, не проводились попытки просто усилить этот путь.
Неожиданно, однако, авторы настоящего изобретения подтвердили не только то, что усиление ацетаткиназы может привести к быстрому превращению ацетата в ацетил-КоА в клетке, но также и то, что отрицательное действие по ингибированию роста, описанное выше, можно преодолеть для увеличения способности продуцирования L-аминокислоты. Следовательно, авторам настоящего изобретения удалось предоставить новый микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью.
В примере воплощения по настоящему изобретению было подтверждено, что микроорганизм, в котором активность гена ackA была усилена, демонстрировал высокую скорость потребления ацетата и также значительное уменьшение лаг-фазы при росте микроорганизма. Напротив, было подтверждено, что когда активность гена pta была усилена, микроорганизм не демонстрировал какого-либо существенного различия в скорости потребления ацетата по сравнению с таковой в контрольной группе (Фиг. 1а и 1б), и таким образом было подтверждено, что белок, важный для увеличения способности потреблять ацетат путем активации ацетата и увеличения способности продуцировать L-лизин без ингибирования роста, представляет собой ацетаткиназу. То есть было подтверждено, что микроорганизм, который может продуцировать L-лизин с высоким выходом и обладает повышенной способностью потреблять ацетат без ингибирования роста, может быть получен путем усиления активности ацетаткиназы с помощью различных способов на основании вышеприведенных результатов.
Микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению, который обладает повышенной способностью потреблять ацетат и повышенной способностью продуцировать L-лизин, может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, который может продуцировать L-лизин и обладает усиленной активностью ацетаткиназы по сравнению с ее эндогенной активностью.
Дополнительно микроорганизм рода Corynebacterium, который обладает повышенной способностью потреблять ацетат и повышенной способностью продуцировать L-лизин, может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий усиленной активностью ацетаткиназы по сравнению с ее эндогенной активностью, в котором дополнительно: (1) активность фосфотрансацетилазы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью; (2) активность ацетил-КоА-синтетазы введена или усилена; или (3) активность фосфотрансацетилазы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью и активность ацетил-КоА-синтетазы введена или усилена.
Авторы настоящего изобретения подтвердили, что у микроорганизма, обладающего активностью ацетаткиназы, которая является наиболее важной для увеличения способности потреблять ацетат и способности продуцировать L-лизин, усиленной по сравнению с ее эндогенной активностью, когда активность фосфотрансацетилазы дополнительно усилена по сравнению с ее эндогенной активностью и/или активность ацетил-КоА-синтетазы дополнительно введена или усилена, способность потреблять ацетат дополнительно увеличивается, и в данном изобретении авторы настоящего изобретения предложили такой новый микроорганизм. В примере воплощения по настоящему изобретению было подтверждено, что дополнительное введение гена acs, который имеет происхождение от микроорганизма рода Escherichia и кодирует ацетил-КоА, может увеличивать скорость потребления ацетата (Фиг. 3), и результаты подтверждают, что введение или усиление активности ацетил-КоА-синтетазы также может увеличивать скорость потребления ацетата, тем самым увеличивая способность продуцировать L-лизин.
Как его используют здесь, термин "ацетаткиназа (ЕС 2.7.2.1)" относится к ферменту, имеющему функцию продуцирования ацетилфосфата путем фосфорилирования ацетата. Гены, кодирующие ацетаткиназу, можно обобщенно отнести к ackA, и последовательности белка и гена ацетаткиназы можно получить из известной базы данных (например, GenBank от NCBI), но не ограничиваясь этим. Ацетаткиназа может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, но любая последовательность белка, обладающая активностью ацетаткиназы, может быть включена без ограничения.
Как его используют здесь, термин "фосфотрансацетилаза (ЕС 2.3.1.8)" относится к ферменту, имеющему функцию превращения ацетилфосфата в ацетил-КоА путем реакции, приведенной ниже.
КоА + ацетилфосфат ↔ ацетил-КоА + фосфат
Как его используют здесь, термин "фосфотрансацетилаза" можно применять взаимозаменяемо в отношении ферментов, таких как фосфат-ацетилтрансфераза и фосфоацилаза. Ген, кодирующий фосфотрансацетилазу, можно обобщенно отнести к pta, и последовательности белка и гена фосфотрансацетилазы можно получить из известной базы данных (например, GenBank от NCBI), но не ограничиваясь этим. Фосфотрансацетилаза может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, но может быть включена без ограничения любая последовательность белка, обладающая активностью фосфотрансацетилазы.
Как его используют здесь, термин "ацетил-КоА-синтетаза (ЕС 6.2.1.1)" относится к ферменту, имеющему функцию превращения ацетата в ацетил-КоА путем реакции, приведенной ниже.
ацетат + КоА ↔ ацетил-КоА
Ген, кодирующий ацетил-КоА-синтетазу, можно обобщенно отнести к acs, и последовательности белка и гена ацетил-КоА-синтетазы можно получить из известной базы данных (например, GenBank от NCBI), но не ограничиваясь этим. Ацетил-КоА-синтетаза может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, но может быть включена без ограничения любая последовательность белка, обладающая активностью ацетил-КоА-синтетазы.
Каждый из описанных выше белков может включать, без ограничения, в дополнение к аминокислотным последовательностям, представленным в перечне последовательностей с помощью SEQ ID NO, любую аминокислотную последовательность, которая имеет гомологию 80% или больше, в особенности 90% или больше, более конкретно 95% или больше и еще более конкретно 97% или больше с перечисленными выше аминокислотными последовательностями, при условии, что эти аминокислотные последовательности кодируют белки, которые обладают действием по существу таким же или соответствующим каждому из этих белков. Кроме того, очевидно, что любой модифицированный белок, имеющий гомологию, описанную выше, может попадать в объем настоящего изобретения, несмотря на то, что этот белок может иметь аминокислотную последовательность с частичной делецией, модификацией, заменой или вставкой в нее.
Кроме того, гены, кодирующие каждый из белков по настоящему изобретению, также могут включать, без ограничения, дополнительно к полинуклеотидным последовательностям, описанным в перечне последовательностей с помощью SEQ ID NO, любую последовательность гена, кодирующую белки, которая имеет гомологию 80% или больше, в особенности 90% или больше, более конкретно 95% или больше, еще более конкретно 98% или больше и наиболее конкретно 99% или больше с каждой из перечисленных выше полинуклеотидных последовательностей, при условии, что эта последовательность гена кодирует белок, который обладает действием по существу таким же или соответствующим каждому из этих белков. Кроме того, очевидно, что любая полинуклеотидная последовательность, имеющая вышеупомянутые гомологии, может попадать в объем настоящего изобретения, несмотря на то, что эта последовательность может иметь частичную делецию, модификацию, замену или вставку в нее.
Как его используют здесь, термин "гомология" относится к степени идентичности между полипептидными последовательностями или аминокислотными последовательностями, кодирующими белки, и когда присутствует достаточно высокий процент гомологии, продукты экспрессии соответствующих генов могут обладать одинаковыми или сходными активностями.
Как его используют здесь, термин "эндогенная активность" относится к активному состоянию полипептида в микроорганизме в немодифицированном состоянии, то есть в природном состоянии.
Как его используют здесь, термин "усиление активности белка по сравнению с его эндогенной активностью" относится к повышению внутриклеточной активности белка в микроорганизме путем модифицирования белка для улучшения внутриклеточной активности по сравнению с активностью белка, которой он обладал в своем природном состоянии. Дополнительно, как его используют здесь, термин "усиление активности белка" относится не только к усилению активности белка по сравнению с его эндогенной активностью, но также к повышению внутриклеточной активности определенного белка путем модифицирования микроорганизма, который первоначально не обладал активностью этого определенного белка, для придания ему активности этого определенного белка и модифицирования для улучшения его внутриклеточной активности.
"Усиление" включает не только достижение более сильного действия, чем первоначальное действие благодаря повышению активности самого белка, но оно может быть выполнено по меньшей мере одним способом, выбранным из группы, состоящей из способа увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего белок, способа введения модификации в регуляторную последовательность гена, кодирующего белок, способа замены регуляторной последовательности гена, кодирующего белок, в хромосоме последовательностью, имеющую высокую активность, способа замены гена, кодирующего белок, мутированным геном для повышения активности белка и способа введения модификации в ген, кодирующий белок, на хромосоме для усиления активности белка, однако может быть включен, без ограничения, любой известный способ, который может усиливать активность белка по сравнению с его эндогенной активностью или усиливать введенную активность.
Как его используют здесь, термин "введение активности белка" относится к обеспечению активности определенного белка у микроорганизма, который не обладает активностью определенного белка.
"Введение активности белка" может быть выполнено различными способами, известными в данной области техники, например, способом вставки полинуклеотида, включающего полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, в хромосому; способом увеличения числа копий полинуклеотида путем такого способа как введение полинуклеотида в микроорганизм путем введения в векторную систему; способом введения промотора, способного проявлять улучшенную активность, или введения белка с модификацией в промоторе в область, лежащую выше по ходу транскрипции от полинуклеотидной последовательности, кодирующей белок; способом введения модификации в полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, и так далее, однако может быть включен, без ограничения, любой известный способ, которым можно вводить активность белка.
В вышеизложенном, увеличение числа копий полинуклеотида может быть выполнено в форме, в которой полинуклеотид функционально связан с вектором, или путем вставки полинуклеотида в хромосому или клетку-хозяин, хотя способ специально не ограничен этим. В частности, увеличение числа копий полинуклеотида может быть выполнено путем введения вектора, который способен реплицироваться и функционировать независимо от клетки-хозяина, и с которым полинуклеотид, кодирующий белок по настоящему изобретению, функционально связан, или может быть выполнено путем введения в клетку-хозяин вектора, который может вставлять полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина и с которым полинуклеотид функционально связан.
Вектор представляет собой ДНК-конструкцию, включающую полинуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего белок-мишень, которая функционально связана с подходящей регуляторной последовательностью, обеспечивающей возможность экспрессии белка-мишени в клетке-хозяине. Регуляторная последовательность включает промотор, способный запускать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящую мРНК рибосом-связывающего домена, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. Вектор после трансформации им подходящей клетки-хозяина, может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может сам интегрироваться в геном хозяина.
Вектор, используемый в настоящем изобретении, может не быть специально ограничен, при условии, что этот вектор способен реплицироваться в клетке-хозяине, и он может быть сконструирован с использованием любого вектора, известного в данной области техники. Примеры вектора могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве вектора-фага или вектора-космиды можно применять pWE15, М13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, Charon21A и так далее; и в качестве плазмидного вектора можно применять основанные на pBR, pUC, pBluescriptll, pGEM, pTZ, pCL, pET и так далее. Векторы, которые можно использовать в настоящем изобретении, специально не ограничены, но может быть использован любой известный вектор экспрессии, например вектор pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCCIBAC и так далее.
Дополнительно полинуклеотид, кодирующий эндогенный белок-мишень, может быть заменен модифицированным полинуклеотидом в хромосоме с помощью вектора для вставки хромосомы в клетку-хозяин. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий чужеродный белок-мишень для введения в хромосому, может быть заменен модифицированным полинуклеотидом. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть выполнена с использованием любого способа, известного в данной области техники, например, путем гомологичной рекомбинации. Поскольку вектор по настоящему изобретению может быть вставлен в хромосому путем гомологичной рекомбинации, дополнительно может быть включен маркер селекции для подтверждения вставки в хромосому. Маркер селекции применяют для отбора трансформированной клетки, то есть для подтверждения того, что полинуклеотид-мишень был вставлен, и можно использовать маркеры, способные обеспечивать отбираемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственному средству, потребность в питательном веществе, устойчивость к цитотоксическим агентам и экспрессия поверхностных белков. В условиях, где происходит обработка агентами селекции, только клетки, способные экспрессировать маркеры селекции, могут выжить или проявлять другие фенотипические признаки, и таким образом трансформированные клетки могут быть отобраны.
Как его используют здесь, термин "трансформация" относится к процессу введения вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий белок-мишень, в клетку-хозяин, тем самым обеспечивая возможность экспрессии полинуклеотида, кодирующего белок, в клетке-хозяине. Для полинуклеотида, которым трансформируют, не имеет значения, вставляется ли он в хромосому клетки-хозяина и локализуется в ней, или он локализуется за пределами хромосомы, при условии, что он может экспрессироваться в клетке-хозяине. Дополнительно, полинуклеотид включает ДНК и РНК, которые кодируют белок-мишень. Полинуклеотид может быть вставлен в любой форме при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все основные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, домен связывания с рибосомой и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме вектора экспрессии, способного к саморепликации. Дополнительно полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина как есть и функционально связан с последовательностью, необходимой для его экспрессии в клетке-хозяине.
Дополнительно, как его используют здесь, термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между промоторной последовательностью, которая запускает и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего белок-мишень по настоящему изобретению, и вышеупомянутой последовательностью гена.
Способ трансформации вектором по настоящему изобретению может включать любой способ, которым можно вводить полинуклеотид в клетку, и трансформация может быть выполнена с помощью подходящей методики, известной в данной области техники, выбранной в соответствии с клеткой-хозяином. Например, способ может включать электропорацию, осаждение фосфатом кальция (CaPO4), осаждение хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, способ с полиэтиленгликолем (ПЭГ), способ с ДЭАЭ-декстраном, способ с катионными липосомами и способ с ацетатом лития/ДМСО и так далее, но не ограничиваясь ими.
Лучше, чтобы клетка-хозяин, предназначенная для использования, имела высокую эффективность введения ДНК и высокую эффективность экспрессии введенной ДНК, и для целей настоящего изобретения клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium.
Затем может быть выполнено введение модификации в последовательность контроля экспрессии для увеличения экспрессии полинуклеотида, хотя специально не ограничиваясь этим, путем индуцирования модификации в полинуклеотидной последовательности посредством делеции, вставки, консервативной замены или неконсервативной замены или их комбинации с целью дополнительно усилить активность последовательности контроля экспрессии; или путем замены полинуклеотидной последовательности на полинуклеотидную последовательность с усиленной активностью. Последовательность контроля экспрессии, хотя специально не ограничена ими, может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую домен связывания с рибосомой, последовательность для регуляции терминации транскрипции и трансляции и так далее.
Сильный экзогенный промотор может быть присоединен вместо исходного промотора в области выше по ходу транскрипции от экспрессионной единицы полинуклеотида. Примеры сильных экзогенных промоторов могут включать промотор pcj7, промотор lysCP1, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асеА, промотор асеВ и так далее, и предпочтительно промотор, имеющий происхождение из Corynebacterium, такой как промотор pcj7 или промотор lysCP1. Последовательность промотора lysCP1 и способ его получения описаны в патенте Кореи No. 10-0930203, и вышеупомянутый патент Кореи включен сюда посредством ссылочного примера во всей своей полноте. В примере воплощения по настоящему изобретению было подтверждено, что присоединение гена ackA к промотору lysCP1, который представляет собой сильный промотор, приводит к улучшенной способности потреблять ацетат по сравнению с таковой у контрольной группы (Фиг. 3), и этот результат подтверждает, что с повышением уровня экспрессии гена ackA увеличивается скорость потребления ацетата.
Кроме того, модификация полинуклеотидной последовательности в хромосоме может быть выполнена путем индуцирования модификации в последовательности контроля экспрессии путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации для дополнительного усиления активности полинуклеотидной последовательности или путем замены на улучшенную полинуклеотидную последовательность для обеспечения более сильной активности.
Как правило, введение или усиление активности белка может увеличивать активность или концентрацию соответствующего белка относительно активности или концентрации белка дикого типа или в штамме микроорганизма на начальной стадии от по меньшей мере 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% или 500% максимально до 1000% или 2000%, но не ограничиваясь этим.
Как его используют здесь, термин "микроорганизм, продуцирующий L-лизин" относится к штамму микроорганизма, который способен продуцировать L-лизин для целей настоящего изобретения, и он представляет собой штамм, который способен эффективно потреблять ацетат в культуральной среде и накапливать L-ацетат без ингибирования роста. Микроорганизм может включать все микроорганизмы рода Corynebacterium, обладающие усиленной активностью ацетаткиназы по сравнению с ее эндогенной активностью, например, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium fermentum и так далее, но не ограничиваясь ими. В примере воплощения микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum, и примеры Corynebacterium glutamicum могут включать КССМ11016Р (патент Кореи No. 10-0397322), КССМ10770Р (патент Кореи No. 10-0924065), КССМ11347Р (патент Кореи No. 10-0073610) и CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40), но не ограничиваясь ими.
В примере воплощения по настоящему изобретению было подтверждено, что когда ген ackA сверхэкспрессировался в Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р, используемом в качестве родительского штамма репрезентативного микроорганизма рода Corynebacterium, способность потреблять ацетат была повышена, и количество полученного L-лизина было увеличено без ингибирования роста (Примеры 2-6). Более того, сверхэкспрессия гена ackA у различных микроорганизмов рода Corynebacterium (КССМ10770Р, КССМ11347Р или CJ3P) также показала увеличение их способности продуцировать L-лизин (пример 7), и результаты подтверждают, что способность продуцировать L-лизин увеличивается вследствие усиления активности белка у микроорганизма рода Corynebacterium, который использует ацетаткиназу, кодируемую геном ackA, для утилизации ацетата. Дополнительно было подтверждено, что дальнейшее добавление активности фосфотрансацетилазы и/или введение или усиление активности ацетил-КоА, в дополнение к усилению активности ацетаткиназы, кодируемой геном ackA, также может увеличивать способность потреблять ацетат и способность продуцировать L-лизин.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения L-лизина, включающий: (1) культивирование нового микроорганизма рода Corynebacterium, обладающего повышенной способностью продуцировать L-лизин благодаря повышенной способности потреблять ацетат из среды; и (2) выделение L-лизина из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.
Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий повышенной способностью продуцировать L-лизин, является таким как описано выше.
Как его используют здесь, термин "культивирование" относится к выращиванию микроорганизма в условиях окружающей среды, контролируемых подходящим образом и искусственно. Согласно настоящему изобретению процесс получения L-лизина путем культивирования микроорганизма рода Corynebacterium может быть выполнен с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. В частности, культивирование может проводиться непрерывно в периодическом процессе (процессе с подпиткой или повторяющемся процессе с подпиткой), но не ограничиваясь этим.
Среда, используемая для культивирования, должна подходящим образом соответствовать требованиям для конкретных штаммов. Культуральная среда для штаммов Corynebacterium уже известна (например, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). Примеры источников углерода для использования в этой среде могут включать сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как глюконовая кислота, уксусная кислота и пировиноградная кислота, но не ограничиваясь этим. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации. Примеры источников азота для использования в среде могут включать пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота также можно использовать по отдельности или в комбинации. Примеры источников фосфора для использования в среде могут включать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия или соответствующие натрий-содержащие соли. Дополнительно соли металлов, таких как сульфат магния или сульфат железа, необходимые для роста, могут содержаться в среде. Наконец, необходимые вещества для роста, такие как аминокислоты и витамины, также могут содержаться в дополнение к веществам, описанным выше. Дополнительно можно использовать предшественники, подходящие для культуральной среды. Эти источники можно добавлять в культуру подходящим способом во время культивирования путем периодического культивирования или непрерывного культивирования. Эти различные способы раскрыты в ссылках (например, "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, 138-176).
Значение pH культуры может быть подведено подходящим образом с использованием такого соединения, как гидроксид натрия, гидроксид калия и аммония, или кислоты, такой как фосфорная кислота и серная кислота. Дополнительно можно применять пеногаситель, такой как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты, для предупреждения образования пены. Дополнительно для поддержания аэробного состояния культуры в культуру может быть введен кислород или газ, содержащий кислород (например, воздух). Температура в культуре обычно может составлять от 20°С до 45°С, в частности, от 25°С до 40°С, но может варьировать в зависимости от условий. Дополнительно, культивирование можно продолжать до тех пор, пока не будет получено максимальное количество желаемой L-аминокислоты, которое может быть достигнуто в течение периода от 10 часов до 100 часов. L-лизин может секретироваться в культуральную среду или может оставаться в клетках.
Способ получения L-лизина по настоящему изобретению может включать выделение лизина из культивируемого микроорганизма или из культуральной среды. Способ выделения L-лизина из культивируемого микроорганизма или из культуральной среды может быть выполнен с использованием способа, известного в данной области техники, например, центрифугирования, фильтрования, анионообменной хроматографии, кристаллизации, высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ) и так далее, но способ не ограничивается ими.
Выделение может включать процесс очистки.
Подробное описание изобретения
Здесь и далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры и экспериментальные примеры. Однако, следующие примеры и экспериментальные примеры приведены исключительно для иллюстративных целей и не предназначены никаким образом ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1: Получение вектора для вставки ackA, pta или pta и ackA в хромосому
Для получения вектора для последующей независимой или одновременной вставки гена ackA и гена pta в хромосому Corynebacterium вектор pDZTN (патент Кореи No. 10-1126041), сконструированный из вектора pDZ, использовали в качестве основного вектора для вставки генов-мишеней в область транспозона. Поскольку эти два гена образуют оперон в форме pta-ackA, для сверхэкспрессии только гена ackA для последующей вставки промоторный участок оперона pta-ackA был функционально связан с расположенной выше по ходу транскрипции открытой рамкой считывания (ОРС) гена ackA. Последовательности праймеров, использованные в Примерах, показаны в Таблице 1 ниже.
Для получения вектора для последующей вставки гена ackA были синтезированы праймеры (SEQ ID NO: 1 и 2) для амплификации гена ackA на основе полинуклеотидных последовательностей, опубликованных ранее, и участок ОРС гена ackA размером примерно 1300 п. н. амплифицировали путем ПЦР с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы. В частности, ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 56°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 90 сек и полимеризация при 72°С в течение 7 мин. Подчеркнутые участки полинуклеотидных последовательностей представляют собой сайты рестрикции.
Кроме того, синтезировали праймеры (SEQ ID NO: 3 и 4) для амплификации промоторного участка оперона pta-ackA и промоторный участок размером примерно 350 п. н. амплифицировали путем ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы. В частности, ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 56°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 90 сек; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин. Подчеркнутые участки полинуклеотидных последовательностей представляют собой сайты рестрикции.
Амплифицированные путем ПЦР фрагменты ДНК обрабатывали ферментами рестрикции SpeI и NdeI для получения соответствующих сегментов ДНК. Полученные таким образом сегменты ДНК лигировали в вектор pDZTN, имеющий сайт для SpeI, трансформировали клетки Е. coli DH5α и высевали на твердую среду LB (Лурия-Бертани), содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором, в которых произошла вставка гена-мишени, отбирали, плазмиду получали известным традиционным способом выделения празмид, и полученная таким образом плазмида получила название pDZTN-Ppta_ackA.
Для получения вектора для последующей вставки гена pta был синтезирован праймер (SEQ ID NO: 5) к участку ОРС гена pta, и участок гена pta размером примерно 1750 п.н. амплифицировали путем ПЦР с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы наряду с праймерами (SEQ ID NO: 3 и 5) для амплификации участка, охватывающего область от промотора до конца ОРС гена pta. В частности, ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации 94°С в течение 30 сек, отжига при 56°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 90 сек; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин.
Амплифицированные путем ПЦР фрагменты ДНК обрабатывали ферментом рестрикции SpeI для получения сегментов DNA. Полученные таким образом сегменты ДНК лигировали в вектор pDZTN, имеющий сайт для SpeI, для получения плазмиды, и плазмида получила название pDZTN-pta.
Для получения вектора для одновременной вставки двух генов в форме оперона участок гена pta-ackA размером примерно 3000 п.н. был получен путем ПЦР с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы наряду с праймерами (SEQ ID NO: 3 и 2), которые служили для амплификации участка, охватывающего область от предсказанного промоторного участка оперона генов pta-ackA (SEQ ID NO: 10) до конца ОРС гена ackA. В частности, ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 56°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 3 мин; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин. Амплифицированные путем ПЦР фрагменты ДНК обрабатывали ферментом рестрикции SpeI для получения сегментов ДНК. Полученные таким образом сегменты ДНК лигировали в вектор pDZTN, имеющий сайт для SpeI, для получения плазмиды, и плазмида получила название pDZTN-pta-ackA.
Пример 2: Анализ способности потреблять ацетат штамма с вставленным в хромосому геном ackA и/или геном pta
Векторами трех типов, полученными в примере 1, т.е. pDZTN-Ppta_ackA, pDZTN-pta и pDZTN-pta-ackA, трансформировали Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р (первоначально микроорганизм был раскрыт как KFCC10881, повторно депонирован в международный орган депонирования в соответствии с Будапештским договором под присвоенным номером доступа No. КССМ11016Р; патенты Кореи No. 10-0159812 и 10-0397322) способом электрического импульса, и штаммы, в которых гены-мишени были вставлены в хромосому путем гомологичной рекомбинации, были селективно выделены путем ПЦР и названы KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn), KCCM11016P::pta(Tn) и KCCM11016P::pta-ackA(Tn).
Штаммы трех типов и контрольной группы инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл посевной культуральной среды, и культивировали с встряхиванием при 200 об/мин при 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл раствора посевной культуры инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 24 мл продукционной среды, и культивировали с встряхиванием при 200 об/мин при 37°С в течение 96 часов. Культуральную среду собирали каждые 12 часов во время культивирования и анализировали количества глюкозы и ацетата, оставшихся в культуральной среде, и поглощение при 562 нм, и результаты показаны на Фиг. 1а и 1б.
Посевная культуральная среда (рН 7,0)
Глюкоза (20 г), (NH4)2SO4 (10 г), пептон (10 г), дрожжевой экстракт (5 г), мочевина (1,5 г), KH2PO4 (4 г), K2HPO4 (8 г), MgSO4⋅7H2O (0,5 г), биотин (100 мкг), тиамин HCl (1000 мкг), кальций-пантотеновая кислота (2000 мкг) и никотинамид (2000 мкг) (в расчете на 1 л дистиллированной воды).
Продукционная среда (рН 7,0)
Глюкоза (100 г), ацетат аммония (7,1 г) (с добавлением или без), (NH4)2SO4 (40 г), соевый белок (2,5 г), твердый кукурузный экстракт (5 г), мочевина (3 г), KH2PO4 (1 г), MgSO4⋅7H2O (0,5 г), биотин (100 мкг), тиамин HCl (1000 мкг), кальций-пантотеновая кислота (2000 мкг), никотинамид (3000 мкг) и СаСО3 (30 г) (в расчете на 1 л дистиллированной воды).
Как показано на Фиг. 1а, штамм KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) продуцировал ацетат в среду без ацетата, в то же время потребляя глюкозу, и потреблял ацетат после того, как использовал всю глюкозу, в отличие от родительского штамма КССМ11016Р. На основании этих результатов было подтверждено, что ацетаткиназа вовлечена в продуцирование ацетата. Дополнительно, наблюдали, что скорость роста культуры была замедлена при продуцировании ацетата.
Однако, как показано на Фиг. 16, штамм KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) демонстрировал свойство более быстрого потребления ацетата на начальной стадии культивирования при культивировании в среде с ацетатом по сравнению со штаммом КССМ11016Р (контрольная группа), и в результате лаг-фаза роста штамма значительно сокращалась по сравнению с таковой в контрольной группе. Штамм KCCM11016P::pta(Tn) не показал существенной разницы в скорости потребления ацетата по сравнению с таковой контрольной группы. Однако было подтверждено, что штамм KCCM11016P::pta-ackA(Tn), в котором два гена были оба введены в форме оперона, демонстрировал небольшое увеличение скорости потребления ацетата по сравнению с таковой штамма KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn), в котором был введен только ген ackA.
Вышеприведенные результаты подтверждают, что ацетаткиназа, которую кодирует ген ackA, представляет собой основной фермент в продуцировании или активации ацетата, и он вовлечен в продуцирование ацетата, когда ацетат не присутствует в среде, тогда как при присутствии ацетата в среде он используется в пути активации ацетата. Дополнительно было подтверждено, что сверхэкспрессия ackA может существенно повышать способность утилизировать ацетат вследствие усиления пути активации, в то же время уменьшая ингибирование роста, тем самым возможно сокращая лаг-фазу.
Пример 3: Получение штамма, сверхэкспрессирующего ген ackA посредством сильного промотора, и подтверждение его эффекта
Для повторного подтверждения способности потреблять ацетат и его действия при сверхэкспрессии гена ackA, была сделана попытка индуцировать экспрессию гена ackA, который был дополнительно вставлен с использованием промотора lysCP1 (патент Кореи No. 10-0930203), который представляет собой сильный промотор, как сообщалось ранее. Праймеры, используемые в Примерах по настоящему изобретению, представлены в Таблице 2 ниже.
Вектор для вставки в хромосому был получен с использованием вектора pDZTn, описанного в Примере 1, в качестве базового вектора. Праймеры (SEQ ID NO: 6 и 7) для амплификации промоторного участка lysCP1 синтезировали на основе полинуклеотидных последовательностей, описанных ранее, и сегмент ДНК размером примерно 450 п. н. был получен путем ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-lysCP1 (патент Кореи No. 10-0930203) в качестве матрицы. В частности, ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 56°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 30 сек; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин.
Фрагменты ДНК, амплифицированные путем ПЦР, обрабатывали ферментами рестрикции XhoI и NdeI для получения соответствующих сегментов ДНК. Полученные таким образом участки ДНК лигировали в вектор pDZTN, имеющий сайты для XhoI и SpeI, наряду с фрагментами ДНК вокруг участка ОРС гена ackA, имеющего сайты для NdeI и SpeI, полученный в Примере 1, которым трансформировали Е. coli DH5α, и высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором, в который был вставлен ген-мишень, отбирали, плазмиду получали известным традиционным способом выделения плазмид, и полученная таким образом плазмида была названа pDZTN-lysCP1_ackA (Фиг. 2).
Полученным таким образом вектором pDZTN-lysCP1_ackA трансформировали Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р, который продуцирует L-лизин, путем гомологичной рекомбинации. Затем колонии, в которых pDZTN-lysCP1_ackA был интегрирован в хромосому путем ПЦР, селективно выделяли, и они получили название KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn).
Штамм KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn), штамм
KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) и штамм КССМ11016Р (контрольная группа) культивировали таким же образом как в Примере 2, и количество оставшегося в культуральной среде ацетата анализировали каждые 12 часов. Результаты показаны на Фиг. 3.
В результате штамм KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) демонстрировал улучшенную способность потреблять ацетат по сравнению с таковой у контрольной группы, как показано в результатах Примера 2. Дополнительно было подтверждено, что штамм KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) демонстрировал увеличенную скорость потребления ацетата, чем таковая у штамма KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn).
Вышеприведенные результаты показывают, что скорость потребления ацетата увеличивается с увеличением экспрессии гена ackA, и результаты повторно подтверждают, что сверхэкспрессия гена ackA является главной причиной повышения способности потреблять ацетат.
Пример 4: Анализ лизин-продуцирующей способности штамма, сверхэкспрессирующего ген ackA
Для подтверждения способности штамма Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn), полученного в Примере 3, продуцировать лизин штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) культивировали наряду со штаммом КССМ11016Р (контрольная группа) таким же образом, как в Примере 2. После завершения культивирования концентрацию L-лизина анализировали путем ВЭЖХ, и эти результаты показаны в Таблице 3 ниже.
В результате, когда штаммы культивировали с использованием глюкозы в качестве единственного источника углерода без добавления ацетата, штамм КССМ11016Р::lysCP1_аскА(Tn) демонстрировал такой же уровень способности продуцировать лизин, как и у контрольной группы, как показано в Таблице 3. Однако, было подтверждено, что когда штаммы культивировали в среде, содержащей ацетат, штамм KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) демонстрировал среднее увеличение выхода лизина на 12% (полный выход источника углерода = концентрация лизина/(добавленное количество (глюкоза + ацетат)) по сравнению с таковым контрольной группы.
Вышеприведенные результаты подтверждают, что усиление пути активации ацетата увеличивает не только способность потреблять ацетат, но также способность продуцировать L-лизин. Дополнительно, эти результаты подтверждают, что когда ацетат используют в качестве источника углерода, применение штамма с усиленным геном ackA по настоящему изобретению может приводить к продуцированию лизина с высоким выходом, в то же время уменьшая время культивирования без ингибирования роста клеток.
В этих условиях авторы настоящего изобретения назвали штамм KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) с увеличенными способностями потреблять ацетат и продуцировать L-лизин Corynebacterium glutamicum "СА01-2278", который депонирован в Корейском центре культивирования микроорганизмов (КССМ) под депозитарным номером КССМ11480Р.
Пример 5: Получение штамма с введенным геном acs и анализ эффекта этого штамма
Для вставки пути активации ацетата, имеющего происхождение из Escherichia, в хромосому Corynebacterium был получен вектор для вставки в хромосому с использованием вектора pDZTn, упомянутого в Примере 1, в качестве базового вектора после получения гена acs (SEQ ID NO: 11), который известен как путь активации ацетата, имеющий происхождение из Escherichia. Экспрессию индуцировали путем функционального связывания промотора гена pta-ackA, полученного из Corynebacterium, в участок, расположенный выше по ходу транскрипции от кодона инициации гена acs. Праймеры, используемые в настоящем изобретении, показаны в Таблице 4 ниже.
Праймеры (SEQ ID NO: 8 и 9) для амплификации участка гена acs синтезировали на основе полинуклеотидных последовательностей, описанных ранее, и участок ОРС гена acs размером примерно 2000 п. н. амплифицировали путем ПЦР с использованием хромосомы штамма Е. coli W (АТСС9637) в качестве матрицы. В частности, ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 5 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжига при 56°С в течение 30 сек, и полимеризации при 72°С в течение 2 мин; и полимеризация при 72°С в течение 7 мин.
Фрагменты ДНК, амплифицированные путем ПЦР, обрабатывали ферментами рестрикции SpeI and NdeI, наряду с фрагментами ДНК промотора оперона pta_ackA, который был получен в Примере 5, для получения сегмента ДНК. Полученные таким образом сегменты ДНК лигировали в вектор pDZTN, имеющий сайт для SpeI, которым трансформировали Е. coli DH5α, и высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Колонии, трансформированные вектором, в который был вставлен ген-мишень, отбирали, плазмиду получали известным традиционным способом выделения плазмид, и полученная таким образом плазмида была названа pDZTN-Ppta-acs.
Полученным таким образом вектором трансформировали Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn), полученный в Примере 2, методом электрического импульса, и отбирали штаммы, в которых ген acs был вставлен в хромосому путем гомологичной рекомбинации. В частности, те колонии, в которых ген acs был вставлен в транспозон, отличный от транспозона, в котором ген Ppta_ackA был вставлен предварительно, селективно выделяли путем ПЦР и называли KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn).
Штамм KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn) и штамм KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) (контрольная группа) культивировали таким же образом, как в Примере 2, и количество ацетата, оставшегося в культуральной среде, анализировали каждые 12 часов.
В результате было подтверждено, что штамм KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn) демонстрировал небольшое увеличение скорости потребления ацетата по сравнению с таковой в контрольной группе (Фиг. 3).
Эти результаты подтверждают, что не только сверхэкспрессия гена ackA, но также введение гена acs, который представляет собой чужеродный ген, имеющий происхождение из Escherichia, в микроорганизм рода Corynebacterium может увеличивать скорость потребления ацетата и способность продуцировать L-лизин.
Пример 7: Сравнение L-лизин-продуцирующей способности штаммов. которые сверхэкспрессируют ген ackA, имеющий происхождение из штамма, продуцирующего L-лизин
Для подтверждения эффекта усиления продукции лизина штаммами, сверхэкспрессирующими ackA, сравнивали способность продуцировать L-лизин различными штаммами, продуцирующими лизин, имеющими происхождение от Corynebacterium.
Ген ackA вводили в три репрезентативных штамма, продуцирующих лизин, Corynebacterium glutamicum КССМ10770Р (патент Кореи No. 10-0924065), КССМ11347Р (первоначально микроорганизм был раскрыт как KFCC10750 и повторно депонирован в международный орган депонирования в соответствии с Будапештским договором под присвоенным номером доступа No. КССМ11347Р; патент Кореи No. 10-0073610) и CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40) и сравнивали их способность продуцировать L-лизин.
Вектором pDZTN-lysCP1_ackA, полученным в Примере 3, трансформировали Corynebacterium glutamicum КССМ10770Р, КССМ11347Р и CJ3P, соответствующим образом, путем встраивания в хромосому посредством гомологичной рекомбинации. Затем колонии селективно выделяли путем ПЦР, и каждый из штаммов получил название KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn), KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn) и CJ3P::lysCP1_ackA(Tn), соответственно.
Для сравнения способности вышеупомянутых штаммов продуцировать лизин штаммы культивировали наряду с каждой из контрольных групп таким же образом, как в Примере 2. По завершении культивирования концентрацию L-лизина анализировали путем ВЭЖХ, и результаты показаны в Таблице 5 ниже.
В результате, как показано в Таблице 5, все штаммы, сверхэкспрессирующие ackA, с происхождением из штамма, продуцирующего лизин, демонстрировали повышение способности продуцировать L-лизин. Штамм KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn) демонстрировал повышение концентрации лизина примерно на 11% по сравнению с таковой у штамма КССМ10770Р (контрольная группа). Штамм KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn) демонстрировал повышение концентрации лизина примерно на 10% по сравнению с таковой у штамма КССМ11347Р (контрольная группа). Штамм CJ3P::lysCP1_ackA(Tn) демонстрировал повышение концентрации лизина примерно на 11% по сравнению с таковой у штамма CJ3P (контрольная группа).
Соответственно, вышеприведенные результаты подтверждают, что повышение активности ацетаткиназы у различных типов штаммов, продуцирующих L-лизин, имеющих происхождение от Corynebacterium glutamicum, в результате приводит к повышению способности продуцировать L-лизин.
Из вышеизложенного специалист в области техники, к которой относится данное изобретение, будет способен понять, что настоящее изобретение может быть реализовано в других специфических формах без модификации технических концепций или существенных характеристик настоящего изобретения. В этом отношении примеры воплощений, раскрытые здесь, служат только для иллюстративных целей, и их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, настоящее изобретение предназначено охватывать не только примеры воплощений, но также различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в пределах сущности и объема настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
Claims (14)
1. Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий усиленной способностью продуцировать L-лизин по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью,
в котором ацетаткиназа имеет аминокислотную последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 12.
2. Микроорганизм по п. 1, в котором дополнительно
(1) активность фосфотрансацетилазы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью,
(2) активность ацетил-КоА-синтетазы введена или усилена или
(3) активность фосфотрансацетилазы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью и активность ацетил-КоА-синтетазы введена или усилена.
3. Микроорганизм по п. 2, в котором фосфотрансацетилаза имеет аминокислотную последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 13.
4. Микроорганизм по п. 2, в котором ацетил-КоА-синтетаза имеет аминокислотную последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 14.
5. Микроорганизм по п. 1, где микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.
6. Способ получения L-лизина, включающий:
(1) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium,
обладающего усиленной способностью продуцировать L-лизин по сравнению с немодифицированным микроорганизмом, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью, в среде и
(2) выделение L-лизина из культивируемого микроорганизма или из культуральной среды.
7. Применение микроорганизма рода Corynebacterium, в котором активность ацетаткиназы усилена по сравнению с ее эндогенной активностью, для усиленного продуцирования L-лизина.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2014-0042397 | 2014-04-09 | ||
| KR1020140042397A KR101601404B1 (ko) | 2014-04-09 | 2014-04-09 | Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 |
| PCT/KR2015/003478 WO2015156583A1 (ko) | 2014-04-09 | 2015-04-07 | Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016141594A RU2016141594A (ru) | 2018-05-10 |
| RU2016141594A3 RU2016141594A3 (ru) | 2018-05-10 |
| RU2694729C2 true RU2694729C2 (ru) | 2019-07-16 |
Family
ID=54288096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016141594A RU2694729C2 (ru) | 2014-04-09 | 2015-04-07 | Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать L-лизин, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10179903B2 (ru) |
| EP (1) | EP3130663B1 (ru) |
| JP (2) | JP6495940B2 (ru) |
| KR (1) | KR101601404B1 (ru) |
| CN (1) | CN106574232B (ru) |
| BR (1) | BR112016023337B1 (ru) |
| ES (1) | ES2855048T3 (ru) |
| HU (1) | HUE053437T2 (ru) |
| MY (1) | MY195658A (ru) |
| PL (1) | PL3130663T3 (ru) |
| RU (1) | RU2694729C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015156583A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2793405C1 (ru) * | 2021-04-12 | 2023-03-31 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант белка и способ получения L-лизина с его применением |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3613850A1 (en) * | 2018-08-22 | 2020-02-26 | Evonik Operations GmbH | Amino acid production |
| KR20210132042A (ko) | 2019-02-20 | 2021-11-03 | 바스프 에스이 | 열가소성 성형 화합물 |
| KR20210132145A (ko) | 2019-02-25 | 2021-11-03 | 바스프 에스이 | 열가소성 성형 조성물 |
| KR102314883B1 (ko) * | 2021-01-29 | 2021-10-19 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 변이체 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2316588C1 (ru) * | 2004-01-30 | 2008-02-10 | Адзиномото Ко., Инк. | Бактерия - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты (варианты) |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR940001307B1 (ko) | 1991-12-27 | 1994-02-19 | 제일제당 주식회사 | L-라이신을 생산하는 신규 미생물 |
| KR0159812B1 (ko) | 1995-12-20 | 1998-11-16 | 손경식 | 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법 |
| KR100397322B1 (ko) | 2000-12-30 | 2003-09-06 | 씨제이 주식회사 | 엘-라이신의 제조방법 |
| KR100789271B1 (ko) * | 2005-11-30 | 2008-01-02 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법 |
| JP5157180B2 (ja) | 2006-01-27 | 2013-03-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2007086608A1 (en) | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid |
| JP2009060791A (ja) | 2006-03-30 | 2009-03-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR100924065B1 (ko) | 2006-09-15 | 2009-10-27 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법 |
| KR100838035B1 (ko) * | 2006-12-29 | 2008-06-12 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 |
| KR100930203B1 (ko) | 2008-01-28 | 2009-12-07 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법 |
| KR101126041B1 (ko) | 2008-04-10 | 2012-03-19 | 씨제이제일제당 (주) | 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법 |
-
2014
- 2014-04-09 KR KR1020140042397A patent/KR101601404B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-04-07 JP JP2016561009A patent/JP6495940B2/ja active Active
- 2015-04-07 EP EP15776058.8A patent/EP3130663B1/en active Active
- 2015-04-07 BR BR112016023337-9A patent/BR112016023337B1/pt active IP Right Grant
- 2015-04-07 HU HUE15776058A patent/HUE053437T2/hu unknown
- 2015-04-07 MY MYPI2016703580A patent/MY195658A/en unknown
- 2015-04-07 PL PL15776058T patent/PL3130663T3/pl unknown
- 2015-04-07 ES ES15776058T patent/ES2855048T3/es active Active
- 2015-04-07 WO PCT/KR2015/003478 patent/WO2015156583A1/ko active Application Filing
- 2015-04-07 RU RU2016141594A patent/RU2694729C2/ru active
- 2015-04-07 US US15/302,738 patent/US10179903B2/en active Active
- 2015-04-07 CN CN201580030811.9A patent/CN106574232B/zh active Active
-
2018
- 2018-10-12 JP JP2018193381A patent/JP2019030316A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2316588C1 (ru) * | 2004-01-30 | 2008-02-10 | Адзиномото Ко., Инк. | Бактерия - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты (варианты) |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| REINSCHEID DIETER J. et al., Cloning, sequence analysis, expression and inactivation of the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase and acetate kinase, Microbiology Vol. 145,Issue 2, pp. 503-513, 1999. * |
| REINSCHEID DIETER J. et al., Cloning, sequence analysis, expression and inactivation of the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase and acetate kinase, Microbiology Vol. 145,Issue 2, pp. 503-513, 1999. UniProtKB - P77845 (ACKA_CORGL), 01.02.1997, Найдено в Интернет 13.11.2017 по адресу: www.uniprot.org/uniprot/P77845. Genbank Accession No. WP_011015350 (phosphotransacetylase [Corynebacterium glutamicum]), 15.05.2013, Найдено в Интернет 13.11.2017 по адресу: www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/499324858?sat=5&satkey=37369746;. UniProtKB - P27550 (ACSA_ECOLI), 01.10.1993, Найдено в Интернет 13.11.2017 по адресу: www.uniprot.org/uniprot/P27550. * |
| UniProtKB - P27550 (ACSA_ECOLI), 01.10.1993, Найдено в Интернет 13.11.2017 по адресу: www.uniprot.org/uniprot/P27550. * |
| UniProtKB - P77845 (ACKA_CORGL), 01.02.1997, Найдено в Интернет 13.11.2017 по адресу: www.uniprot.org/uniprot/P77845. Genbank Accession No. WP_011015350 (phosphotransacetylase [Corynebacterium glutamicum]), 15.05.2013, Найдено в Интернет 13.11.2017 по адресу: www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/499324858?sat=5&satkey=37369746;. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2793435C1 (ru) * | 2021-01-29 | 2023-04-03 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант мембранного белка TERC и способ получения L-лизина с его применением |
| RU2795053C1 (ru) * | 2021-01-29 | 2023-04-28 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | НОВЫЙ ВАРИАНТ КОМПОНЕНТА СИСТЕМЫ ОТТОКА Со/Zn/Cd И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ |
| RU2793405C1 (ru) * | 2021-04-12 | 2023-03-31 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант белка и способ получения L-лизина с его применением |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112016023337A2 (pt) | 2018-01-16 |
| US10179903B2 (en) | 2019-01-15 |
| RU2016141594A (ru) | 2018-05-10 |
| EP3130663A1 (en) | 2017-02-15 |
| WO2015156583A1 (ko) | 2015-10-15 |
| HUE053437T2 (hu) | 2021-06-28 |
| BR112016023337B1 (pt) | 2023-10-17 |
| MY195658A (en) | 2023-02-03 |
| EP3130663A4 (en) | 2017-08-30 |
| KR101601404B1 (ko) | 2016-03-09 |
| CN106574232B (zh) | 2020-03-20 |
| JP2017510280A (ja) | 2017-04-13 |
| RU2016141594A3 (ru) | 2018-05-10 |
| EP3130663B1 (en) | 2020-11-18 |
| JP2019030316A (ja) | 2019-02-28 |
| KR20150117337A (ko) | 2015-10-20 |
| US20180135031A1 (en) | 2018-05-17 |
| CN106574232A (zh) | 2017-04-19 |
| ES2855048T3 (es) | 2021-09-23 |
| JP6495940B2 (ja) | 2019-04-03 |
| PL3130663T3 (pl) | 2021-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102013873B1 (ko) | 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 | |
| KR101592140B1 (ko) | 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법 | |
| CA3073180C (en) | Microorganism having increased glycine productivity and method for producing fermented composition using the same | |
| KR101721722B1 (ko) | L-발린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 l-발린 생산방법 | |
| KR101372635B1 (ko) | 오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 오르니틴을 생산하는 방법 | |
| RU2759956C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий путресцин или орнитин, и способ получения путресцина или орнитина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2681475C1 (ru) | Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием | |
| ES2752181T3 (es) | Microorganismo Escherichia sp que tiene productividad de l-triptofano y procedimiento para preparar l-triptofano mediante el uso del mismo | |
| RU2694729C2 (ru) | Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать L-лизин, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2668830C2 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-лизина и способ получения L-лизина с его помощью | |
| ES2643442T3 (es) | Microorganismo que presenta productividad de L-triptófano y método para la producción del L-triptófano mediante la utilización del mismo | |
| RU2720522C1 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-лизин, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2672323C2 (ru) | Микроорганизм для продуцирования диамина и способ получения диамина с его использованием | |
| KR102285951B1 (ko) | 시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 신규한 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 | |
| RU2716573C1 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-аргинин, и способ получения L-аргинина с использованием этого микроорганизма | |
| JP7475408B2 (ja) | Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法 | |
| KR101526047B1 (ko) | 아미노트랜스퍼라제 활성 강화를 통하여 ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 | |
| KR20150035931A (ko) | L-발린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 l-발린 생산방법 |