RU2644671C2 - ИММУНОЦИТОКИНЫ НА ОСНОВЕ IL-15 И IL-R[альфа] ДОМЕНА SUSHI - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуноцитокинам, и может быть использовано в медицине для лечения рака. Получают иммуноцитокин, содержащий: конъюгат интерлейкина 15 и домена sushi IL-15Rα, ковалентно связанный с антителом или его фрагмент, направленным против антигена, имеющего отношение к неоваскуляризации опухоли или к внеклеточному матриксу опухоли, или опухолевого антигена. При этом аминокислотная последовательность конъюгата находится в С-концевом положении относительно аминокислотной последовательности антитела или его фрагмента. Изобретение обеспечивает получение суперагонистов IL-15, демонстрирующих повышенную активность (т.е. в 10-100 раз) по сравнению с RLI в отдельности, с высоким выходом в клетках СНО. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 12 ил.

Description

В настоящей заявке на международный патент испрашивается приоритет заявки на европейский патент 11358005.4, поданной 24 июня 2011, включенной сюда путем ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым иммуноцитокинам и их применению в качестве лекарственного препарата, в частности для лечения рака.

Предшествующий уровень техники

Иммунотерапия в медицине обозначает ряд подходов к лечению, в основе которых лежит принцип иммунной модуляции для достижения профилактических и/или терапевтических целей.

В последние несколько лет иммунотерапию использовали для лечения или предупреждения нескольких видов патологии, в частности, рака. С момента развития технологии клеточного слияния для получения моноклональных антител, исследователями получено большое количество моноклональных антител. С тех пор для создания моноклональных антител разработаны другие технологии, включая гибридомную технологию с использованием В-клеток и технологию получения человеческих моноклональных антител с использованием вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ).

Можно создать моноклональные антитела (Mab), направленные практически против любого эпитопа. Свойство моноклональных антител специфически распознавать и связывать конкретные клетки/молекулы послужило толчком для их усовершенствования с целью использования в качестве реагентов для диагностики и лечения различных заболеваний. Технологии рекомбинантной ДНК использовали для продукции химерных или гуманизированных антител, адаптированных для введения человеку. В настоящее время коммерциализировано и доступно для лечения рака, инфекционных заболеваний, заболеваний иммунной системы и т.д., несколько моноклональных антител, таких как Ритуксан®, Герцептин®, Авастин®. Моноклональные антитела представляют собой молекулы направленного действия и способны локализоваться в определенных зонах (клетках, тканях), таких как опухолевые ткани. Это свойство позволило разработать моноклональные антитела, конъюгированные с различными веществами (целевой нагрузкой), способные нацеленно взаимодействовать со специфическими молекулами в участках локализации опухолей, называемых опухолевыми антигенами. Такие вещества (целевая нагрузка) могут быть токсинами, лекарствами, радионуклидами, предшественниками лекарственных средств. Многие из этих типов связей включают химическое конъюгирование реакционно-способного компонента (целевой нагрузки) с заданным препаратом антитела, этот процесс может быть трудоемким и подверженным вариациям (US 4,671,958).

Среди этих новых молекул иммуноцитокины представляют особоый интерес. Указанные иммуноцитокины соответствуют гибридным белкам, содержащим антитело и цитокин. Данные белки сохраняют как антигенсвязывающую способность, так и активность цитокинов.

Цитокины относятся к категории сигнальных белков и гликопротеинов, которые как гормоны и нейротрансмиттеры, активно используются в клеточной коммуникации. Если гормоны секретируются в кровь определенными органами, а нейротрансмиттеры имеют отношение к нейрональной активности, то цитокины представляют собой более разнообразный класс соединений в отношении происхождения и назначения. Их продуцирует широкий круг гемопоэтических и негемопоэтических клеток, и они могут оказывать влияние как на близлежащие клетки, так и на весь организм, иногда проявляя сильную зависимость от присутствия других химических соединений. Семейство цитокинов состоит в основном из небольших водорастворимых белков и гликопротеинов массой от 8 до 30 кДа. Цитокины играют ключевую роль в реализации врожденного и приобретенного иммунных ответов. Их часто секретируют клетки иммунной системы, которые встретили патоген, для активации и мобилизации большего количества клеток иммунной системы и усиления ответа иммунной системы на патоген. Однако, кроме своей роли в развитии и функционировании иммунной системы, цитокины также задействованы в нескольких процессах развития в ходе эмбриогенеза.

Среди цитокинов интерлейкин 15 (IL-15) является цитокином, обладающим структурным сходством с IL-2, секретирующимся мононуклеарными фагоцитами (и некоторыми другими клетками) в ответ на инфицирование вирусом(ами) или непрямую стимуляцию клетками, которые распознаются как "не свои" или ослабленные. Этот цитокин индуцирует пролиферацию естественных киллерных клеток; клеток, обеспечивающих врожденный иммунитет, основная роль которых заключается в уничтожении клеток, инфицированных вирусом. Белок, кодируемый этим геном, представляет собой цитокин, регулирующий активацию и пролиферацию Т клеток и естественных киллерных клеток.

Таким образом, создание иммуноцитокинов на основе IL-15 будет представлять особый интерес для сочетания полезных свойств опухоле-специфических антител, мишенями которых являются опухоли, с иммуномодулирующим действием интерлейкина 15. Уже было получено несколько иммуноцитокинов, в частности с использованием интерлейкина-2 (IL-2), которые продемонстрировали очень интересные и обнадеживающие результаты в клинических исследованиях 2 фазы в области онкологии. Некоторые примеры этих гибридных белков описаны в нескольких заявках на патенты (US 5,645,835, ЕР 0,305,967, WO 86/01533, EP 0,439,095 и WO 85/00974).

Так, иммуноцитокин на основе интерлейкина 15 был произведен в клетках НЕК-293 и описан в заявке на международный патент РСТ WO 2007/128563, а также KASPAR et at. (Cancer Research, vol.67(10), p:494O-4948, 2007).

Однако, авторы изобретения установили, что такие иммуноцитокины на основе интерлейкина 15 обладают очень ограниченной активностью интерлейкина 15, и что их продукция очень затруднена, в частности, в клетках яичников китайского хомячка (от англ. Chinese hamster ovary cells), и сопровождается низким выходом и контаминацией другими видами белков.

Таким образом, по-прежнему существует потребность в иммуноцитокинах на основе интерлейкина 15, которые можно было бы применять в иммунотерапии.

Сущность изобретения

Изобретение относится к иммуноцитокину, содержащему:

A) конъюгат и

B) антитело или его фрагмент, напрямую или опосредованно ковалентно связанный с указанным конъюгатом,

где указанный конъюгат содержит:

(i) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность интерлейкина 15 или его производных и

(ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность домена sushi IL-15Rα или его производных.

Во втором аспекте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей иммуноцитокин, описанный выше.

В третьем аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, описанную выше.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, генетически модифицированной с применением полинуклеотида или вектора, описанных ранее. Настоящее изобретение также относится к способу получения генетически модифицированной клетки-хозяина, экспрессирующей иммуноцитокин по изобретению, причем указанный способ включает этапы: (i) внедрения in vitro или ex vivo нуклеиновой кислоты или вектора, описанных выше, в клетку-хозяина, (ii) культивирования in vitro или ex vivo полученной рекомбинантной генетически модифицированной клетки-хозяина и (iii) возможно отбор клеток, экспрессирующих и/или секретирующих указанный иммуноцитокин.

В предпочтительном воплощении указанная генетически модифицированная клетка-хозяин является клеткой животного происхождения, предпочтительно клеткой яичников китайского хомячка (СНО).

В пятом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая иммуноцитокин, описанный выше, кодирующую его нуклеиновую кислоту или нуклеиновокислотный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, возможно связанные с фармацевтически приемлемым носителем.

В предпочтительном воплощении указанная композиция содержит дополнительный терапевтический агент, который предпочтительно является противоопухолевым агентом.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, описанной ранее, для лечения рака у субъекта.

В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к продуктам, содержащим:

(i) иммуноцитокин, описанный выше, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую его, или вектор, содержащий такую последовательность нуклеиновой кислоты, и

(ii) терапевтический агент, предпочтительно противоопухолевый агент, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения рака у субъекта.

В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему этап введения указанному субъекту фармацевтической композиции, описанной ранее.

В последнем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему этап одновременного, раздельного или последовательного введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества:

(i) иммуноцитокина, описанного выше, нуклеиновой кислоты, кодирующей его, или вектора, содержащего такую последовательность нуклеиновой кислоты, и

(ii) терапевтического агента, предпочтительно противоопухолевого агента.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1 показана активность иммуноцитокинов на основе IL15, направленных против CD20, в сравнении с IL15.

На Фиг.2 показана активность иммуноцитокина на основе IL15, направленного против O-ацетилированного GD2, в сравнении с IL15.

На Фиг.3 показана способность связывать CD20, O-ацетилированный GD2 и HER-2 у иммуноцитокинов на основе IL15, направленных против CD20, O-ацетилированного GD2 и HER2, соответственно.

На Фиг.4 показана способность связывать IL-15Rα у иммуноцитокина на основе IL15, направленного против CD20, в сравнении с антителом к CD20 (Rituximab).

На Фиг.5 показана способность связывать CD20, O-ацетилированный GD2 и HER-2 у иммуноцитокинов на основе IL15, направленных против CD20 и O-ацетилированного GD2, а также иммуноцитокина на основе RLI, направленного против HER2, соответственно.

На Фиг.6 показана способность связывать IL15Ra у иммуноцитокина на основе RLI, направленного против CD20, и иммуноцитокина на основе IL15, направленного против O-ацетилированного GD2.

На Фиг.7 показана активность иммуноцитокинов на основе RLI, направленных против CD20, в сравнении с IL15.

На Фиг.8 показана активность иммуноцитокинов на основе RLI, направленных против O-ацетилированного GD2, в сравнении с IL15.

На Фиг.9 показана антиметастатическая активность иммуноцитокина, направленного против O-ацетилированного GD2, в сравнении с антителом к O-ацетилированному GD2.

На Фиг.10 показана противоопухолевая активность иммуноцитокина, направленного против CD20, на модели с использованием клеток Raji.

На Фиг.11 показана активность иммуноцитокинов на основе IL-15, направленных против HER2, в сравнении с IL15.

На Фиг.12 показана активность иммуноцитокинов на основе RLI, направленных против HER2, в сравнении с IL15.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении авторами изобретения, что продукция иммуноцитокина, содержащего интерлейкин 15, приводит к потере более чем 90% активности интерлейкина 15, продукция иммуноцитокинов на основе RLI приводит к получению 11-15-содержащих иммуноцитокинов нового типа, демонстрирующих выраженную биологическую активность в отношени и клеток иммунной системы, экспрессирующих IL-15Rαβγ и IL-15Rβγ, значительно превосходящую активность иммуноцитокинов на основе IL-15.

Неожиданно обнаружили, что иммуноцитокины на основе RLI, содержащие полноразмерное моноклональное IgG антитело, демонстрируют улучшенную биологическую эффективность в отношении клеток иммунной системы, экспрессирующих IL-15Rβγ, по сравнению с RLI в отдельности или с иммуноцитокинами, содержащими антитело, представляющее собой фрагмент scFv. Это неожиданное усиление активности в отношении клеток иммунной системы, экспрессирующих IL-15Rβγ, могло оказаться критическим в отношении активации/реактивации NK клеток и Т-лимфоцитов в иммуносуппресивном окружении.

Неожиданным оказался и факт, что тогда как иммуноцитокин на основе интерлейкина 15 для проявления активности нуждается в присутствии линкера между компонентами иммуноглобулина и интерлейкина 15, иммуноцитокин по изобретению, демонстрирует аналогичную активность интерлейкина 15, при наличии и при отсутствии какого-либо линкера между его соответствующими иммуноглобулиновыми и цитокиновыми частями. Такое необязательное наличие линкерного участка может оказаться значительным преимуществом в том, что касается иммуногенности гибридного белка, позволяя ограничить использование шарнирных участков, создающих новые антигенные эпитопы, являющихся источником иммуногенности, и в том, что касается получения продукта с ограниченным количеством расщепленных форм.

Также было неожиданным, что иммуноцитокины по изобретению являются суперагонистами IL-15, демонстрирующими повышенную активность (т.е. в 10-100 раз) по сравнению с RLI в отдельности.

Кроме того, авторы изобретения добились продукции с хорошим выходом иммуноцитокина по изобретению в клетках СНО, при этом выход составлял более 90%. Это было неожиданным, поскольку продукция в тех же самых клетках иммуноцитокина на основе интерлейкина 15 в клетках СНО была очень затруднена. Поскольку иммуноцитокины, как правило, имеют ограниченное время полужизни в сыворотке и поскольку опосредуемая иммуноцитокинами скорость определения местонахождения опухоли является критическим показателем в получении стойкого противоопухолевого эффекта, специфическая биологическая активность иммуноцитокинов на основе RLI, позволяющая активировать клетки иммунной системы при очень низких концентрациях, представляет собой важный изобретательский шаг в данной области и может улучшить эффективность таких биологических соединений у больных раком.

Наконец, выраженная активность иммуноцитокина по изобретению позволяет предусмотреть практически реализуемое терапевтическое применение этого иммуноцитокина, который можно будет вводить путем инъекции в дозе 2,5-1 мг/кг веса субъекта или менее, и даже в дозе 0,1 мг/кг или менее. Известно, что низкая активность иммуноцитокинов на основе интерлейкина 15, таких как описанные в заявке на международный патент WO 2007/128563, не обеспечивает практически реализуемого терапевтического применения (т.е. для достижения терапевтического эффекта требуется доза, превышающая 20 мкг иммуноцитокина при четырех инъекциях в день в модели на мышах, предполагающая необходимость введения дозы, превышающей 5 мг/кг иммуноцитокина для получения некоторого терапевтического эффекта).

Следовательно, один аспект настоящего изобретения относится к иммуноцитокину, содержащему:

A) конъюгат и

B) антитело или его фрагмент, напрямую или опосредованно связанный при помощи ковалентной связи с указанным конъюгатом, где указанный конъюгат содержит:

(i) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность интерлейкина 15 или его производных, и

(ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность домена sushi IL-15Rα или его производных.

Термин "иммуноцитокин" обозначает молекулу, содержащую антитело или его фрагменты, напрямую или опосредованно связанные при помощи ковалентной связи с цитокином или его производными. Указанное антитело и указанный цитокин могут быть связаны при помощи линкерного пептида.

Конъюгаты иммуноцитокинов по изобретению

Термин "интерлейкин 15" имеет общеупотребительное в области техники значение и обозначает цитокин, обладающий структурным сходством с IL-2 (GRABSTEIN et al., Science, vol.264 (5161), p:965-968, 1994). Этот цитокин также известен как IL-15, IL15 или MGC9721. Обнаружили, что данный цитокин и IL-2 имеют во многом схожую биологическую активность и связываются с общими субъединицами рецептора гемопоэтина. Таким образом, они могут конкурировать за один рецептор, отрицательно регулируя активность друг друга. Было установлено, что IL-15 регулирует активацию и пролиферацию Т-клеток и естественных киллерных клеток, и было показано, что количество CD8+клеток памяти контролируется балансом между этим цитокином и IL2. Активность IL-15 можно измерить путем определения его индуцирующего пролиферацию действия на клеточной линии kit225 (HORI et al., Blood, vol.70(4), p:1069-72, 1987), как описано в Примерах.

Активность указанного IL-15 или его производных составляет по меньшей мере 10% от активности человеческого интерлейкина-15 в отношении индукции пролиферации клеточной линии kit225, предпочтительно по меньшей мере 25% и более предпочтительно по меньшей мере 50%.

Указанный интерлейкин 15 представляет собой интерлейкин 15 млекопитающего, предпочтительно интерлейкин 15 примата, и более предпочтительно интерлейкин 15 человека.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать интерлейкин 15 млекопитающего. В качестве примера можно привести интерлейкин 15 Sus scrofa (Номер доступа ABF82250), Rattus norvegicus (Номер доступа NP_037261), Mus musculus (Номер доступа NP_032383), Bos Taurus (Номер доступа NP_776515), Oryctolagus cuniculus (Номер доступа NP_001075685), Ovies aries (Номер доступа NP_001009734), Fe//s catus (Номер доступа NP_001009207), Macaca fascicularis (Номер доступа ВАА19149), Homo sapiens (Номер доступа NP_000576), Macaca Mulatta (Номер доступа NP_001038196), Cavia porcellus (Номер доступа NP_001166300) или Chlorocebus sabaeus (Номер доступа ACI289). В данном документе термин "интерлейкин 15 млекопитающего" обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:1.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать интерлейкин 15 примата. В качестве примера можно привести интерлейкин 15 Sus scrofa (Номер доступа ABF82250), Oryctolagus cuniculus (Номер доступа NP_001075685), Масаса fascicularis (Accession number BAA19149), Homo sapiens (Номер доступа NP_000576), Масаса Mulatta (Номер доступа NP_001038196) или Chlorocebus sabaeus (Номер доступа ACI289).

В данном документе термин "интерлейкин 15 примата" обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:2.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать интерлейкин 15 человека, который обозначает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

В данном документе термин "производные интерлейкина 15" обозначает аминокислотную последовательность, у которой показатель идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO::1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, составляет по меньшей мере 92,5% (т.е. соответствует приблизительно 10 аминокислотным заменам), предпочтительно по меньшей мере 96% (т.е. соответствует приблизительно 5 аминокислотным заменам), и более предпочтительно по меньшей мере 98,5% (т.е. соответствует приблизительно 2 аминокислотным заменам) или по меньшей мере 99% т.е. соответствует приблизительно 1 аминокислотной замене). Специалист в данной области техники может легко идентифицировать такие производные, основываясь на личных знаниях и на описании данной патентной заявки. В качестве примеров таких производных можно привести описанные в заявке на международный патент РСТ WO 2009/135031. Следует понимать, что природные аминокислоты можно заменить химически модифицированными аминокислотами. Как правило, такие химически модифицированные аминокислоты увеличивают время полужизни полипептида.

В данном документе "показатель идентичности" между двумя аминокислотными последовательностями означает процентное содержание идентичных аминокислот между двумя сравниваемыми последовательностями, полученный при наилучшем выравнивании указанных последовательностей, это процентное содержание является исключительно статистическим показателем, а различия между этими двумя последовательностями случайным образом распределены по аминокислотной последовательности. В данном документе "наилучшее выравнивание" или "оптимальное выравнивание" означает выравнивание, при котором рассчитываемый показатель идентичности (см. ниже) является наибольшим. Сравнение последовательностей двух аминокислот обычно проводится путем сравнения этих последовательностей, предварительно выровненных в соответствии с наилучшим выравниванием; такое сравнение выполняется в пределах сегмента сравнения для выявления и сравнения локальных участков, обладающих сходством. Наилучшее выравнивание последовательностей для проведения сравнения можно выполнить вручную, а также с помощью алгоритма поиска общей гомологии, разработанного SMITH and WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), с использованием алгоритма поиска локальной гомологии, разработанного NEDDLEMAN and WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), с использованием метода поиска сходства, разработанного PEARSON and LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), с применением компьютерных программ, использующих такие алгоритмы (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), с использованием алгоритмов множественного выравнивания MUSCLE (Edgar, Robert С., Nucleic Acids Research, vol.32, p:1792, 2004). Для достижения наилучшего локального выравнивания предпочтительно использовать программу BLAST с матрицей BLOSUM 62. Показатель идентичности между двумя последовательностями аминокислот определяется путем сравнения этих двух оптимально выровненных последовательностей, аминокислотные последовательности могут включать вставки или делеции относительно референсной последовательности для достижения оптимального выравнивания между этими двумя последовательностями. Показатель идентичности рассчитывается путем определения числа идентичных позиций между этими двумя последовательностями, деления этого числа на общее число сравниваемых позиций и умножения полученного результата на 100 для получения показателя идентичности между этими двумя последовательностями, выраженного в процентах. Предпочтительно, производные интерлейкина 15 представляют собой агонисты или суперагонисты IL-15. Специалист в данной области техники может легко идентифицировать агонист или суперагонист IL-15. В качестве примера агониста или суперагониста IL-15 можно привести описанные в заявке на международный патент WO 2005/085282 или описанные ZHU et al. (J. Immunol., vol.183 (6), p:3598-607, 2009). Предпочтительно, указанный агонист или суперагонист IL-15 выбран из группы, содержащей/состоящей из L45D, L45E, S51 D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y и N72P (применительно к последовательности IL-15 человека, SEQ ID NO:3).

В данном документе термин "домен sushi IL-15Rα" имеет общеупотребительное в области техники значение и обозначает домен, начинающийся первым остатком цистеина (С1) после сигнального пептида IL-15Rα, и заканчивающийся четвертым остатком цистеина (С4) после указанного сигнального пептида. Указанный домен sushi соответствует части внеклеточного участка IL-15Rα, необходимого для его связывания с IL-15 (WEI et al., J. Immunol., vol. 167(1), p:277-282, 2001). Указанный домен "sushi" IL-15Rα или его производные обладают по меньшей мере 10% связывающей активности домена sushi IL-15Rα человека в отношении интерлейкина-15 человека, предпочтительно по меньшей мере 25% и более предпочтительно по меньшей мере 50%. Указанную связывающую активность можно легко определить согласно способу, описанному WEI et al. (abovementioned, 2001). Указанный домен sushi IL-15Rα представляет собой домен sushi IL-15Rα млекопитающего, предпочтительно домен sushi IL-15Rα примата и более предпочтительно, домен sushi IL-15Rα человека. Специалист в данной области техники может легко идентифицировать домен sushi IL-15Rα млекопитающего. В качестве примера можно привести домен sushi IL-15Rα Rattus norvegicus (Номер доступа ХР_002728555), Mus musculus (Номер доступа EDL08026), Bos Taurus (Номер доступа ХР_002692113), Oryctolagus cuniculus (Номер доступа ХР_002723298), Масаса fascicularis (Accession number ACI42785), Масаса nemestrina (Accession number ACI42783), Homo sapiens (Номер доступа СА141081), Масаса Mulatta (Номер доступа NP_001166315), Pongo abelii (Номер доступа XP_002820541), Cercocebus torquatus (Номер доступа ACI42784), Callithrix jacchus (Номер доступа ХР_002750073) или Cavia porcellus (Номер доступа NP_001166314). В данном документе термин "домен sushi" IL-15Rα млекопитающего" обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:4.

Предпочтительно, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность домена sushi IL-15Rα млекопитающего обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:5.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать домен "sushi" IL-15Rα примата. В качестве примера можно привести домен "sushi" IL-15Rα Oryctolagus cuniculus, Macaca fascicularis, Macaca nemestrina, Homo sapiens, Macaca Mulatta, Pongo abelii, Cercocebus torquatus или Callithrix jacchus.

В данном документе термин "домен sushi IL-15Rα примата" обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:6.

Предпочтительно полипептид, содержащий аминокислотную последовательность домена sushi IL-15Rα примата обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:7.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать домен "sushi" IL-15Rα человека, который обозначает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

Предпочтительно, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность домена sushi IL-15Rα человека, обозначает SEQ ID NO:9.

В данном документе термин "производные домена sushi IL-15Ra" обозначают аминокислотную последовательность, имеющую показатель идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO::4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9, по меньшей мере 92% (т.е. соответствующий приблизительно 5 аминокислотным заменам), предпочтительно по меньшей мере 96% (т.е. соответствующий приблизительно 2 аминокислотным заменам), и более предпочтительно по меньшей мере 98% (т.е. соответствующий приблизительно 1 аминокислотной замене). Такие производные содержат четыре остатка цистеина домена sushi IL-15Rα и могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области техники на основании общедоступных сведений и описания данной патентной заявки. Следует понимать, что природные аминокислоты можно заменить химически модифицированными аминокислотами. Как правило, такие химически модифицированные аминокислоты позволяют увеличить время полужизни полипептида.

Согласно предпочтительному воплощению конъюгат содержит (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность домена sushi и шарнирного домена IL-15Rα или его производных.

Шарнирный домен IL-15Rα определяется аминокислотной последовательностью, которая начинается первым аминокислотным остатком после домена sushi и заканчивается последним аминокислотным остатком перед первым потенциальным сайтом гликозилирования. Аминокислотная последовательность шарнирного участка IL-15Rα человека состоит из четырнадцати аминокислот, которые расположены после домена sushi этого IL-15Rальфа, в С-концевом положении относительно указанного домена sushi, т.е. указанный шарнирный участок IL-15Rальфа начинается первой аминокислотой после указанного остатка цистеина (С4) и заканчивается четырнадцатой аминокислотой (считая в стандартном направлении "от N-конца к С-концу").

Указанные домен sushi и шарнирный домен IL-15Rα представляют собой домен sushi и шарнирный домен IL-15Rα млекопитающего, предпочтительно домен sushi и шарнирный домен IL-15Rα примата и более предпочтительно домен sushi и шарнирный домен IL-15Rα человека.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать аминокислотную последовательность домена sushi и шарнирного домена IL-15Rα млекопитающего. В данном документе термин "домен sushi и шарнирный домен IL-15Rα млекопитающего" обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:10.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать аминокислотную последовательность домена sushi и шарнирного домена IL-15Rα примата. В данном документе термин "домен sushi" и шарнирный домен IL-15Rα примата" обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:11.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать аминокислотную последовательность домена sushi и шарнирного домена IL-15Rα человека. В данном документе термин "домен sushi" и шарнирный домен IL-15Rα человека" обозначает консенсусную последовательность SEQ ID NO:12.

В данном документе термин "производные домена sushi" и шарнирного домена IL-15Rα" обозначает аминокислотную последовательность, имеющую показатель идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO::10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 по меньшей мере 93% (т.е. соответствующей приблизительно 5 аминокислотным заменам), предпочтительно по меньшей мере 97% (т.е. соответствующей приблизительно 2 аминокислотным заменам), и более предпочтительно по меньшей мере 98% (т.е. соответствующей приблизительно 1 аминокислотной замене). Такие производные содержат четыре остатка цистеина домена sushi IL-15Rα и могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области техники на основании общедоступных сведений и описания данной патентной заявки. Следует понимать, что природные аминокислоты можно заменить химически модифицированными аминокислотами. Как правило, такие химически модифицированные аминокислоты позволяют увеличить время полужизни полипептида.

Оба полипептида i) и ii) конъюгата могут быть связаны нековалентно, как в комплексе, описанном в патенте США US 8,124,084 В2. Указанный конъюгат или комплекс могут быть легко получены при наличии надлежащего количества полипептида i), при наличии надлежащего количества полипептида ii), смешивании обоих полипептидов при надлежащих значениях рН и ионной силы на протяжении времени, достаточного для образования комплекса (т.е. конъюгата) и, возможно, концентрировании или очистки указанного комплекса. Полипептиды комплекса (т.е. конъюгата) можно создать, например, с применением синтезатора пептидов в соответствии со стандартными способами; при экспрессии каждого полипептида в отдельности в клетке или клеточном экстракте, с последующим выделением и очисткой полипептида. Возможно, используемый в терапевтических целях комплекс полипептида по изобретению можно создать при экспрессии обоих полипептидов i) и ii) в той же клетке или клеточном экстракте, с последующим выделением и очисткой комплексов, например, с применением хроматографических методов, таких как аффинная хроматография с антителами к лимфокиновой части, части лимфокинового рецептора или к комплексу.

Оба полипептида i) и ii) конъюгата могут также быть ковалентно связаны с помощью бифункциональных сшивающих агентов, обеспечивающих присоединение белков, или в составе гибридного белка.

Бифункциональные сшивающие агенты, обеспечивающие присоединение белков, хорошо известны специалистам в данной области, наряду со способами их применения, и включают, например, N-сукцинимидил (2-пиридилдитио) пропионат (SPDP), сукцинимидил (N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметил адипимидат HCL), активные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис-(р-азидобензоил) гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(р-диазониумбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат и соединения с 2 атомами активного фтора (такие как 1,5-дифлуоро-2,4-динитробензол).

Термин "гибридный белок" обозначает белок, созданный путем объединения двух или более генов, которые исходно кодировали отдельные белки. Он также известен под названием химерного белка. Трансляция такого объединенного гена дает в результате единый полипептид с функциональными свойствами, унаследованными от каждого исходного белка. Рекомбинантные гибридные белки создают искусственным образом при помощи технологии рекомбинантной ДНК для применения в биологических исследованиях или в терапии. Рекомбинантный гибридный белок представляет собой белок, полученный в результате создания объединенного гена методами генной инженерии. Как правило, они включают удаление стоп-кодона последовательности ДНК, кодирующей первый белок, и присоединение последовательности кДНК второго белка в рамке считывания при помощи лигирования или при помощи ПЦР с перекрывающимися праймерами. Эту последовательность ДНК затем экспрессируют в клетке в виде единого белка. Белок может быть создан таким образом, чтобы включать полную последовательность обоих исходных белков или только части каждого из них.

В предпочтительном воплощении конъюгат представляет собой гибридный белок. Аминокислотная последовательность интерлейкина 15 или его производных может находиться в С-концевом или N-концевом положении относительно аминокислотной последовательности домена sushi IL-15Rα или его производных. Предпочтительно, аминокислотная последовательность интерлейкина 15 или его производных находится в С-концевом положении относительно аминокислотной последовательности домена sushi IL-15Rα или его производных.

Аминокислотная последовательность интерлейкина 15 или его производных и аминокислотная последовательность домена sushi IL-15Rα или его производных может быть отделена первой линкерной аминокислотной последовательностью. Указанная первая линкерная аминокислотная последовательность может иметь длину, достаточную для того, чтобы гибридный белок приобретал надлежащую вторичную и третичную структуру.

Длина первой линкерной аминокислотной последовательности может варьировать без существенного влияния на биологическую активность гибридного белка. Как правило, первая линкерная аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере один, но менее чем 30 аминокислот, например, линкер из 2-30 аминокислот, предпочтительно из 10-30 аминокислот, более предпочтительно из 15-30 аминокислот, еще более предпочтительно из 15-25 аминокислот, наиболее предпочтительно из 18-22 аминокислот.

Предпочтительными являются такие линкерные аминокислотные последовательности, которые позволяют конъюгату принимать надлежащую конформацию (т.е. конформацию, обеспечивающую надлежащую передачу сигнала во всем сигнальном пути IL-15Rбета/гамма).

Наиболее подходящие линкерные аминокислотные последовательности (1) будут иметь гибкую растянутую конформацию, (2) не будут демонстрировать склонность к образованию упорядоченных вторичных структур, которые могут взаимодействовать с функциональными доменами гибридных белков, и (3) будут обладать минимальной гидрофобностью или зарядом, которые могут способствовать взаимодействию с функциональными доменами белка.

Предпочтительно, первая линкерная аминокислотная последовательность содержит почти нейтральные аминокислоты, выбранные из группы, включающей Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) и Gin (Q), наиболее предпочтительно из группы, включающей Gly (G), Asn (N) и Ser (S).

Примеры линкерных последовательностей описаны в патентах США US 5,073,627 и 5,108,910.

Приведенные в качестве примера гибкие линкеры, которые являются особенно подходящими для настоящего изобретения, включают такие, которые кодируются последовательностями SEQ ID NO:13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), SEQ ID NO:14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG) или SEQ ID NO:15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ).

Антитело иммуноцитокина по изобретению

Термин "антитело" обозначает молекулу иммуноглобулина, соответствующую тетрамеру, содержащему четыре полипептидных цепи, две идентичных тяжелых цепи (Н) (приблизительно 5O-70 кДа в случае полноразмерной цепи) и две идентичных легких цепи (L) (приблизительно 25 кДа в случае полноразмерной цепи), соединенные между собой дисульфидными связями. Легкие цепи подразделяются на каппа- и лямбда-цепи. Тяжелые цепи подразделяются на гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Каждая тяжелая цепь содержит N-концевой вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенно обозначенный здесь HCVR) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов (СН1, СН2 и СНЗ) в случае IgG, IgD и IgA; и 4 доменов (СН1, СН2, СН3 и СН4) в случае IgM и IgE. Каждая легкая цепь содержит N-концевой вариабельный участок легкой цепи (сокращенно обозначенный здесь LCVR) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, CL. Участки HCVR и LCVR можно подразделить на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся с участками, которые являются более консервативными и обозначаются каркасными участками (FR). Каждый HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Принадлежность аминокислот каждому домену определяется в соответствии с общеизвестными правилами. Функциональная способность антитела связывать конкретный антиген определяется вариабельными участками каждой пары легкой/тяжелой цепей, и в большой степени определяется CDR.

Термин "антитело" в данном документе обозначает моноклональное антитело per se. Моноклональное антитело может быть человеческим антителом, химерным антителом и/или гуманизированным антителом. Преимущественно, термин антитело обозначает IgG, такие как IgG1, IgG2 (IgG2a или IgG2b), IgG3 и IgG4. Предпочтительно, термин антитело обозначает IgG1 или IgG2, и более предпочтительно IgG2a.

"Химерное антитело" означает антитело, которое состоит из вариабельных участков мышиного иммуноглобулина и константных участков человеческого иммуноглобулина. Эта модификация заключается в простой замене константного участка человеческого антитела константным участком мышиного антитела, полученный химерный белок человека/мыши может обладать достаточно низкой иммуногенностью, чтобы оказаться приемлемым для фармацевтического применения. Был описан ряд способов получения таких химерных антител, что представляет собой известный уровень техники для квалифицированного специалиста (см., например, патент США US 5,225,539).

"Гуманизированное антитело" означает антитело, которое состоит частично или полностью из аминокислотных последовательностей, полученных на основе первичного антитела человека, путем модификации последовательности антитела, имеющего участки, определяющие комплементарность (CDR), отличные от человеческих. Такая гуманизация вариабельного участка антитела и, возможно, CDR осуществляется с применением методик, которые хорошо известны в области техники. Например, в заявке на патент Великобритании GB 2188638A и в патенте США US 5,585,089 описан процесс получения рекомбинантных антител, у которых замещается только часть антитела, представляющая собой участок, определяющий комплементарность, или CDR. Методику пересадки CDR используют для создания антител, состоящих из мышиных CDR и человеческих каркасных участков вариабельных областей и константных участков (см., например, RIECHMANN et al., Nature, vol.332, p: 323-327, 1988). Эти антитела сохраняют константные участки человеческого происхождения, необходимые для осуществления Fc-зависимых эффекторных функций, но с гораздо меньшей вероятностью вызывают иммунный ответ против антитела. Например, каркасные участки вариабельных областей замещаются соответствующими каркасными участками человеческого происхождения, при сохранении CDR, не имеющих человеческого происхождения, по существу интактными, или даже при замене CDR последовательностями, полученными на основе генома человека (см., например заявку на патент США US 2006/25885). Полностью человеческие антитела продуцируют в генетически модифицированных мышах, иммунная система которых подверглась изменению с тем, чтобы соответствовать иммунной системе человека. Как упоминалось выше, для применения в способах по изобретению достаточно использовать иммунологически специфический фрагмент антитела, включающий фрагменты, представляющие одноцепочечные формы.

Гуманизированное антитело также обозначает антитело, содержащее каркасные участки человеческого происхождения, по меньшей мере один CDR антитела, не имеющего человеческого происхождения, в котором любой присутствующий константный участок является по существу идентичным константному участку иммуноглобулина человека, т.е., идентичным по меньшей мере приблизительно на 85 или 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%. Таким образом, все части гуманизированного антитела, возможно за исключением CDR, являются по существу идентичными соответствующим частям одной или более нативных последовательностей иммуноглобулина человека. Например, гуманизированный иммуноглобулин как правило не будет включать химерное антитело с вариабельными участками мышиного происхождения/константными участками человеческого происхождения. Например, конструирование гуманизированных иммуноглобулинов может осуществляться следующим образом: если аминокислота подходит под следующую категорию, аминокислота каркасного участка используемого иммуноглобулина человека (иммуноглобулина-акцептора) замещается аминокислотой каркасного участка иммуноглобулина, не имеющего человеческого происхождения, предоставляющего CDR (иммуноглобулина-донора): (а) аминокислота в каркасном участке человеческого происхождения иммуноглобулина-акцептора является нетипичной для иммуноглобулина человека в данном положении, тогда как соответствующая аминокислота иммуноглобулина-донора является типичной для иммуноглобулина человека в данном положении; (б) аминокислота находится в положении, непосредственно граничащем с одним из CDR; или (в) любой атом боковой цепи аминокислоты каркасного участка находится в пределах приблизительно 5-6 ангстрем (от центра до центра) от любого атома аминокислоты CDR в трехмерной модели иммуноглобулина (QUEEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p:2869, 1991). Когда каждая аминокислота каркасного участка человеческого происхождения иммуноглобулина-акцептора и соответствующая аминокислота иммуноглобулина-донора является нетипичной для иммуноглобулина человека в этом положении, такая аминокислота замещается аминокислотой, типичной для иммуноглобулина человека в этом положении.

Термин "фрагмент антитела" в данном документе обозначает фрагмент антитела, способный вступать в реакцию с тем же антигеном, что и его антитело-аналог. Такие фрагменты могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области техники и включают, например, F_ab фрагмент (например, полученный при расщеплении папаином), F_ab' фрагмент (например, полученный при расщеплении пепсином и частичном восстановлении), F(_ab')₂ фрагмент (например, полученный при расщеплении пепсином), F_acb (например, полученный при расщеплении плазмином), F_d (например, полученный при расщеплении пепсином, частичном восстановлении и реагрегации), а также scF_v фрагмент (одноцепочечный Fv; например, полученный с помощью методов молекулярной биологии) и находятся в рамках изобретения.

Такие фрагменты можно получать при помощи ферментативного расщепления, методов синтеза или рекомбинантных методов, известных в области техники и/или описанных здесь. Антитело можно также получать в виде разнообразных укороченных форм, используя гены антитела, в которых были внедрены один или более стоп-кодонов, расположенных против хода транскрипции относительно природного стоп-кодона. Например, комбинированный ген, кодирующий часть тяжелой цепи F(_ab')₂, может быть сконструирован таким образом, чтобы включать последовательности ДНК, кодирующие домен CH₁ и/или шарнирный участок тяжелой цепи. Различные части антитела могут быть соединены друг с другом химическим способом при помощи стандартных методов или могут быть собраны в виде сплошного белка с применением методов генной инженерии.

Предпочтительно, указанный фрагмент антитела представляет собой scFv фрагмент.

В предпочтительном воплощении указанное антитело или его фрагмент направлены против антигена, имеющего отношение к неоваскуляризации опухоли или к внеклеточному матриксу опухоли, или против опухолевого антигена.

В данном документе "антиген, имеющий отношение к неоваскуляризации опухоли" обозначает антиген, экспрессируемый новообразованными кровеносными сосудами, присутствующими в опухоли.

В качестве примера такого антигена можно привести домены EDA и EDB фибронектина, эндосалин/ТЕМЧ, эндоглин/105, простатспецифический мембранный антиген или В7-Н4.

В данном документе "антиген, имеющий отношение к внеклеточному матриксу опухоли" обозначает антиген, который экспрессируется во внеклеточном матриксе, присутствующем в опухоли.

В качестве примера такого антигена можно привести G45 фрагмент ламинина-332 (ROUSSELLE et al., Cancer Research, vol.68(8), p:2885-94, 2008).

В данном документе "опухолевый антиген" обозначает антигенную субстанцию, продуцируемую опухолевыми клетками. Специалистам в данной области техники известно множество опухолевых антигенов, в качестве примеров, не являющихся исчерпывающими, можно привести CD-20, РЭА, рецептор эпидермального фактора роста EGFR, GD2, адгезивную молекулу эпителиальных клеток ЕРСАМ, муцин-1, ПСМА, CD-19, GD3, GM1, карбоангидразу IX, O-ацетилированный GD2 или HER2.

CD-20 представляет собой негликозилировнный фосфопротеин, экспрессируемый во время развития ранних пре-В клеток и сохраняется до стадии дифференцировки в плазматические клетки. В частности, молекула CD20 может регулировать этап процесса активации, необходимый для инициации клеточного цикла и дифференцировки, и обычно экспрессируется на очень высоком уровне неопластическими ("опухолевыми") В клетками. CD20, по определению, присутствует как на "нормальных" В клетках, так и на "злокачественных" В клетках. Таким образом, поверхностный антиген CD20 может быть потенциальным кандидатом для обеспечения "прицельного воздействия" на В-клеточные лимфомы. В отношении антитела, направленного против CD-20, можно упомянуть ритуксимаб ("Ритуксан®") (патент США US 5,736,137); мышиное антитело 2 В8, меченное иттрием-[90], обозначенное "Y2B8" или "Ибритумомаб тиуксетан" Зевалин® (патент США US 5,736,137); мышиное IgG2a "BI," также имеющее название "Тозитумомаб," возможно меченное ¹³¹I с получением антитела "¹³¹I-BI" (тозитумомаб/иод-131, Бексксар®) (патент США US 5,595,721); и гуманизированное 2Н7; офатумумаб, полностью гуманизированный IgG1 против нового эпитопа CD20 huMax-CD20 (заявка на международный патент РСТ WO 2004/035607). Среди них ритуксимаб, ибритумомаб тиуксетан и тозитумомаб получили разрешение на продажу для лечения определенных типов лимфомы, а офатумумаб получил разрешение на продажу для лечения определенных типов лейкоза.

Гликопротеин РЭА (раково-эмбриональный антиген) представляет собой опухолевый маркер, задействованный в адгезии клеток.

В отношении антитела, направленного против РЭА, можно упомянуть арцитумомаб (IMMUNOMEDICS).

Рецепторы ErbB экспрессируются различными тканями эпителиального, мезенхимального и нейрального происхождения. При нормальных условиях активация рецепторов ErbB находится под контролем пространственно-временной экспрессии их лигандов, которые являются представителями ростовых факторов семейства эпидермального фактора роста (EGF). Связывание лигандов с рецепторами ErbB индуцирует образование гомо- и гетеродимеров рецептора и активацию собственного киназного домена, что в результате приводит к фосфорилированию определенных остатков тирозиновой киназы в составе цитоплазматического "хвоста". Эти фосфорилированные остатки служат в качестве участков стыковки различных белков, мобилизация которых приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей. Среди рецепторов ErbB EGFR и HER2 известны тем, что играют ключевую роль в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. Они характеризуются выраженной тенденцией к ассоциации с другими человеческими эпидермальными рецепторами (HER) с образованием гомо-и/или гетеродимеров при связывании внеклеточных факторов роста, что приводит в результате к различным формам активации сигнальных путей, приводящим к апоптозу, выживаемости или пролиферации клеток.

В отношении антител, направленных против EGFR, можно отметить гуманизированное моноклональное антитело 425, также обозначаемое матузумаб (hMAb 425, патенты US 5,558,864; ЕР 0531 472), химерное моноклональное антитело 225 (cMAb 225), также обозначаемое цетуксимаб (эрбитукс®; патент США US 7,060,808) и полностью человеческое анти-EGFR антитело панитумумаб (вектибикс®; патент США US 6,235,883). Среди них цетуксимаб и панитумумаб оказывают ингибирующее действие на опухоли колоректальной зоны у человека in vivo и оба получили разрешение на продажу.

В отношении антител, направленных против Her2, можно отметить рекомбинантную гуманизированную версию мышиного антитела 4D5 ((патент США US 5,677,171), обозначаемого huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, трастузумаб, или герцептин® (патент США US 5,821,337). Это антитело получило разрешение на продажу в 1998 для лечения пациентов с метастатическим раком молочной железы, у которых опухоли характеризуются повышенной экспрессией белка ErbB2.

GD2 представляет собой дисиалоганглиозид, экспрессируемый опухолями нейроэктодермального происхождения, включая нейробластому и меланому.

В отношении антител, направленных против GD2, можно упомянуть мышиное моноклональное IgG3 антитело 3F8, которое применяют в лечении нейробластомы, или мышиное моноклональное IgG3 антитело 8 В6, специфическое в отношении O-ацетилированной формы GD2 (заявка на международный патент РСТ WO 2008/043777).

Предпочтительно, антитело направлено против CD20 (например, ритуксимаб, описанный в патенте США US 5,736,137), O-ацетилированного GD2 (например описанное в заявке на международный патент РСТ WO 2008/043777) или HER2 (например трастузумаб или герцептин®, описанное в патенте США US 5,821,337). Как конъюгат, так и антитело или его фрагмент могут быть ковалентно связаны при помощи бифункциональных сшивающих агентов, обеспечивающих присоединение белков, или в составе гибридного белка.

Способы с применением бифункциональных сшивающих агентов, обеспечивающих присоединение белков, хорошо известны специалистам в данной области и были описаны ранее. Например, специалисты в данной области могут применять способ, описанный TILL et al. (Proc. Natl. Acad. U.S.A., vol.86(6), p:1987-91, 1989)

В предпочтительном воплощении иммуноцитокин представляет собой гибридный белок.

В другом предпочтительном воплощении иммуноцитокин представляет собой комплекс, предпочтительно комплекс, содержащий конъюгат между полипептидами i) и ii), где полипептид i) или ii) гибридизован с антителом или его фрагментом. Полипептид i), полипептид ii) или конъюгат могут располагаться в С-концевом или N-концевом положении относительно аминокислотной последовательности антитела или его фрагмента.

Предпочтительно, конъюгат представляет собой гибридный белок, а аминокислотная последовательность конъюгата находится в С-концевом положении относительно аминокислотной последовательности антитела или его фрагмента, наиболее предпочтительно С-концевом положении относительно аминокислотной последовательности по меньшей мере одного константного участка тяжелой цепи антитела или его фрагмента.

Аминокислотная последовательность конъюгата и аминокислотная последовательность антитела или его фрагмента могут быть разделены или не разделены второй "линкерной" аминокислотной последовательностью.

В конкретном воплощении иммуноцитокин по изобретению представляет собой гибридный белок, где конъюгат и антитело или его фрагмент не разделены каким-либо линкером.

Действительно, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что иммуноцитокин по изобретению не требует присутствия какого-либо линкера между иммуноглобулиновой и цитокиновой частями для проявления своей активности. Как и в случае первой линкерной аминокислотной последовательности, указанная вторая линкерная аминокислотная последовательность может иметь длину, достаточную для того, чтобы гибридный белок имел надлежащую вторичную и третичную структуры.

Длина первой линкерной аминокислотной последовательности может варьировать без существенного влияния на биологическую активность гибридного белка. Как правило, первая линкерная аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну, но менее 30 аминокислот, например, линкер из 2-30 аминокислот, предпочтительно из 10-30 аминокислот, более предпочтительно из 15-30 аминокислот, наиболее предпочтительно из 15-25 аминокислот.

Как и в случае первой линкерной аминокислотной последовательности, наиболее подходящие вторые линкерные аминокислотные последовательности (1) будут иметь гибкую растянутую конформацию, (2) не будут демонстрировать склонность к образованию упорядоченных вторичных структур, которые могут взаимодействовать с функциональными доменами гибридных белков, и (3) будут обладать минимальной гидрофобностью или зарядом, которые могут способствовать взаимодействию с функциональными доменами белка.

Предпочтительно, вторая линкерная аминокислотная последовательность содержит почти нейтральные аминокислоты, выбранные из группы, содержащей Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L) и Gln (Q), наиболее предпочтительно из группы, содержащей Gly (G), Asn (N) и Ser (S).

В качестве примера второй линкерной аминокислотной последовательности, подходящей для настоящего изобретения, можно привести последовательность SEQ ID NO:16 (SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG) или SEQ ID NO:17 (AAGGGSGGGSGGGGSGGGGSAA).

Нуклеиновые кислоты, векторы и рекомбинантные клетки-хозяева

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей иммуноцитокин, описанный выше, предпочтительно иммуноцитокин, соответствующий гибридному белку.

Указанная нуклеиновая кислота соответствует РНК или ДНК, предпочтительно ДНК. Согласно предпочтительному воплощению, нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноцитокин по изобретению, функционально связана с последовательностью, участвующей в экспрессии гена, которая направляет экспрессию нуклеиновой кислоты в прокариотической или эукариотической клетке, предпочтительно в эукариотической клетке. "Последовательность, участвующая в экспрессии гена" представляет собой любую регуляторную нуклеотидную последовательность, такую как последовательность промотора или комбинация промотор-энхансер, которая способствует эффективной транскрипции и трансляции нуклеиновой кислоты иммуноцитокина, с которой она функционально связана. Последовательность, участвующая в экспрессии гена, может, например, представлять собой промотор млекопитающего или вируса, такой как конститутивный или индуцибельный промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают промоторы следующих генов:

гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (HPTR), аденозиндезаминазы, пируваткиназы, промотор бета-актина, промотор мышечной креатинкиназы, промотор человеческого фактора элонгации и другие конститутивные промоторы, но не ограничиваются ими. Примеры вирусных промоторов, функционирующих конститутивно в эукариотических клетках, включают, например, промоторы вируса обезьян (например, SV40), вируса папилломы, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), цитомегаловируса (CMV), вируса саркомы Рауса (RSV), вирус гепатита В (HBV), длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Молони и других ретровирусов, а также промотор тимидин-киназы вируса простого герпеса. Специалистам в данной области техники известны другие конститутивные промоторы.

Промоторы, которые могут найти применение в качестве последовательностей, контролирующих экпрессию генов по изобретению, также включают индуцибельные промоторы. Индуцибельные промоторы экспрессируются в присутствии индуцирующего агента. Например, индукция металлотиона в промоторе, способствует транскрипции и трансляции в присутствии определенных ионов металлов. Специалистам в данной области техники известны другие индуцибельные промоторы.

Как правило, последовательность, участвующая в экспрессии гена, должна включать в соответствии с необходимостью 5' нетранскрибируемую и 5' нетранслируемую последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции, соответственно, такие как ТАТА-бокс, последовательность кэппинга, последовательность СААТ и т.п. В частности, такие 5' нетранслируемые последовательности будут включать область промотора, которая включает последовательность промотора, контролирующая транскрипцию функционально связанной нуклеиновой кислоты. Последовательности, участвующие в экспрессии генов, при необходимости могут включать последовательности энхансеров или расположенные против хода транскрипции последовательности активаторов. В данном документе нуклеиновая последовательность, кодирующая иммуноцитокин по изобретению, и последовательность, контролирующая экспрессию генов, считаются "функционально связанными", если они ковалентно связаны таким образом, чтобы последовательность, кодирующая экспрессию или транскрипцию и/или трансляцию иммуноцитокина по изобретению, находилась под влиянием или под контролем последовательности, участвующей в экспрессии гена. Две последовательности ДНК считаются функционально связанными, если индукция промотора в последовательности, участвующей в экспрессии гена, расположенной в 5' положении, приводит к транскрипции иммуноцитокина по изобретению и если природа связи между двумя последовательностями ДНК не (1) приводит к сдвигу рамки считывания, (2) влияет на способность области промотора направлять транскрипцию иммуноцитокина по изобретению или (3) влияет на способность соответствующего транскрипта РНК транслироваться в белок. Таким образом, последовательность, участвующая в экспрессии гена, будет считаться функционально связанной с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноцитокин по изобретению, если последовательность, участвующая в экспрессии гена, способна обеспечивать транскрипцию этой последовательности нуклеиновой кислоты таким образом, что получаемый транскрипт транслируется в нужный полипептид.

Преимущественно, указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит интрон, поскольку было неоднократно продемонстрировано, что молекулы пре-мРНК улучшают выход рекомбинантных молекул. Могут рассматриваться любые последовательности интронов, в качестве примера можно привести описанные ZAGO et al. (Biotechnol. Appl. Biochem., vol.52(Pt 3), p:191-8, 2009) и CAMPOS-DA-PAZ et al. (Mol. Biotechnol., vol.39(2), p:155-8, 2008).

Доставка in vivo нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноцитокин по изобретению, может осуществляться в отдельном или в ассоциированном с вектором виде.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, описанную выше.

В широком смысле "вектор" представляет собой любой носитель, способный облегчать перенос в клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноцитокин по изобретению. Предпочтительно, при переносе нуклеиновой кислоты в клетки с помощью вектора происходит меньшая деградация по сравнению со степенью деградации, которая бы имела место в отсутствие вектора. Как правило, векторы, которые могут найти применение в изобретении, включают плазмиды, космиды, фагмиды, эписомы, искусственные хромосомы, вирусы, другие носители, полученные из вирусных или бактериальных источников, которые были модифицированы путем инсерции или встраивания последовательностей нуклеиновых кислот иммуноцитокина, но не ограничиваются ими.

Плазмидные векторы являются предпочтительным типом векторов и подробно описаны в области техники и хорошо известны специалистам в данной области. См., например, SANBROOK et at., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. He являющиеся исчерпывающими примеры плазмид включают pBR322, pUC18, pUCI9, pRC/CMV, SV40 и pBlueScript, и другие плазмиды, хорошо известные специалистам в данной области техники. Кроме того, плазмиды могут быть специально сконструированы с применением рестрикционных ферментов и реакций лигирования для удаления и добавления определенных фрагментов ДНК.

Предпочтительно, нуклеиновокислотный вектор может включать селективные маркеры, которые активны как в бактериях, так и в клетках млекопитающих.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, генетически модифицированной нуклеиновой кислотой или вектором, описанными ранее.

В данном документе термин "генетически модифицированная клетка-хозяин" относится к клеткам-хозяевам, которые были трансдуцированы, трансформированы или трансфецированы нуклеиновой кислотой или вектором, описанными ранее.

В качестве репрезентативных примеров подходящих клеток-хозяев можно привести клетки бактерий, таких как Е. coli, клетки грибов, таких как дрожжи, клетки насекомых, такие как Sf9, клетки животных, такие как СНО или COS, клетки растений и т.д. Выбор соответствующего хозяина на основании данного описания находится в компетенции специалиста в данной области техники.

Предпочтительно, генетически модифицированная клетка-хозяин представляет собой клетку животного происхождения, и наиболее предпочтительно клетку CHO-S (INVITROGEN, кат. NO:11619-012).

Клетки яичников китайского хомячка (СНО) часто применяются в биофармацевтической индустрии для производства биологических продуктов, таких как рекомбинантные белки, антитела, гибридные белки пептид-Fc домен (peptibodies) и лиганды рецепторов. Одной из причин, по которой клетки СНО часто применяют, является большой опыт их безопасного применения для производства биологических продуктов. Они считаются хорошо охарактеризованной клеточной линией, вследствие чего необходимые испытания для проверки безопасности работы в некоторых отношениях могут проводиться менее тщательно (например, безопасность ретровирусов) по сравнению с другими типами клеток. Тем не менее, получение интерлейкина 15 очень затруднено, особенно в этих клетках.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что эти клетки хорошо продуцируют иммуноцитокины по изобретению, причем получаемые иммуноцитокины имеют высокую степень чистоты и активность.

Внедрение нуклеиновой кислоты или вектора, описанных ранее, в клетку-хозяина можно осуществлять способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, такими как трансфекция с использованием фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана или электропорация.

Настоящее изобретение также относится к способу получения генетически модифицированной клетки-хозяина, экспрессирующей иммуноцитокин по изобретению, указанный способ включает этапы: (i) внедрения in vitro или ex vivo нуклеиновой кислоты или вектора, описанных выше, в клетку-хозяина, (ii) культивирования in vitro или ex vivo полученной рекомбинантной генетически модифицированной клетки-хозяина и (iii) возможно отбора клеток, которые экспрессируют и/или секретируют указанный иммуноцитокин. Такие рекомбинантные клетки-хозяева можно применять для продукции иммуноцитокина по изобретению.

Фармацевтические композиции, содержащие иммуноцитокин по изобретению

Следующий объект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей иммуноцитокин, описанный выше, кодирующую его нуклеиновую кислоту или вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, возможно связанные с фармацевтически приемлемым носителем.

Выражение "фармацевтически приемлемый" обозначает молекулярные соединения и композиции, которые являются физиологически переносимыми и при введении человеку как правило не вызывают аллергических или схожих с ними нежелательных реакций, таких как расстройство желудка, головокружение и т.п. Предпочтительно в данном документе выражение "фармацевтически приемлемый" означает одобряемый регулирующим органом федеральной или государственной власти или включенный в фармакопею США или другие общепризнанные фармакопеи для применения у животных, и, более конкретно, у человека.

Термин "носитель" обозначает растворитель, адъювант, эксципиент или наполнитель, с которым вводят соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода или масла, включая такие, которые получены из углеводородного сырья, имеют животное, растительное и синтетическое происхождение, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п.

Фармацевтическая композиция содержит "эффективное количество" иммуноцитокина по изобретению, которое является достаточным для ингибирования роста опухолевых клеток, предпочтительно достаточным для индукции регрессии опухоли. Дозировки, используемые при введении, можно адаптировать в зависимости от различных параметров, в частности, в зависимости от используемого способа введения, соответствующей патологии или, в альтернативном случае, от требуемой продолжительности лечения. Разумеется, форма фармацевтической композиции, путь введения, дозировка и режим введения обязательно зависят от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, возраста, веса и пола субъекта и т.д. Диапазоны эффективных дозировок, приведенные ниже, не ограничивают объем изобретения и представляют предпочтительные диапазоны дозировок. Однако, предпочтительная дозировка подбирается субъектуальным образом, очевидным для специалиста в данной области и определяемым им без излишнего экспериментирования.

Ввиду высокой эффективности иммуноцитокина по изобретению, специалист в данной области может планировать применение очень низких дозировок для лечения субъекта. В качестве примера, не являющегося исчерпывающим, иммуноцитокин по изобретению можно вводить субъекту при помощи инъекции в дозировке 2,5 мг/кг или 1 мг/кг или менее, предпочтительно в дозировке 0,5 мг/кг или менее или 0,25 мг/кг или менее и наиболее предпочтительно в дозировке 0,1 мг/кг или менее.

Например, фармацевтические композиции по изобретению могут быть приготовлены в виде препарата для местного, орального, интраназального, внутриглазного, внутривенного, внутримышечного или подкожного введений и т.п. Предпочтительно, фармацевтическая композиция содержит наполнители, которые являются фармацевтически приемлемыми для композиции, предназначенной для инъекции. В частности, это могут быть изотонические стерильные растворы солей (однозамещенный и двузамещенный фосфат натрия, хлорид натрия, калия, кальция или магния и т.п. а также смеси этих солей), или сухие, в частности, лиофильно высушенные композиции, которые при добавлении, в зависимости от ситуации, стерильной воды или физиологического раствора, обеспечивают получение растворов для инъекций в жидкой форме. Подходящие фармацевтические носители описаны E.W. Martin в "Remington's Pharmaceutical Sciences".

Иммуноцитокин по изобретению, кодирующие его нуклеиновые кислоты и нуклеиновокислотные векторы можно растворять в буфере или воде или включать в состав эмульсий, микроэмульсий, гидрогелей (например, гидрогели на основе триблоксополимеров PLGA-PEG-PLGA), в микросферы, в наносферы, в микрочастицы, в наночастицы (например, сополимера молочной и гликолевой кислот), микрочастицы (например, полимера молочной кислоты (PLA); сополимера молочной и гликолевой кислот) (PLGA); микросферы, наносферы, микрочастицы или наночастицы полиглутаминовой кислоты), в липосомы или другие галеновы препараты. Во всех случаях композиция должна быть стерильной и жидкой до степени, обеспечивающей введение через шприц. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена от контаминации микроорганизмами, такими как бактерии и грибы.

Растворы активных компонентов в виде чистого основания или фармакологически приемлемых солей можно приготавливать в воде, смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза.

Суспензии можно также приготавливать в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и применения такие препараты содержат консервант, предотвращающий рост микроорганизмов. Иммуноцитокины по изобретению могут входить в состав композиции в виде нейтрального основания или в виде соли. Фармацевтические приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные с участием свободных аминогрупп белка), образованные с участием неорганических кислот, например, таких как хлористоводородная или фосфорная кислоты, или таких органических кислот, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные с участием свободных карбоксильных групп, могут быть получены на основе неорганических оснований, например, таких как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п.

Носитель также может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерол, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Иммуноцитокины по изобретению также можно модифицировать, например, путем пегилирования, для повышения их биодоступности. Если иммуноцитокин по изобретению находится в форме нуклеиновой кислоты, носитель также может представлять собой вектор, такой как вирус (например MVA, rAAV, лентивирус и т.д.).

Необходимую текучесть можно поддерживать, например, с помощью нанесения оболочки, такой как лецитиновая, за счет поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсий и с применением сурфактантов. Предотвратить воздействие микроорганизмов можно с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлоробутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях будет желательно включить изотонические агенты, например, углеводы или хлорид натрия.

Пролонгированной абсорбции инъекционных составов можно добиться с применением в составе композиций агентов, замедляющих всасывание, например, моностеарата алюминия, желатина, полиолов, ковалентных и нековалентных соединений, увеличивающих время полувыведения.

Существуют различные причины нестабильности или деградации пептидов, включая гидролиз и денатурацию. Гидрофобное взаимодействие может вызывать образование кластеров молекул (т.е. агрегацию). Для ограничения или предотвращения этих проблем можно добавлять стабилизаторы.

Стабилизаторы включают циклодекстрин и его производные (см. патент США US 5,730,969). Для стабилизации конечного лекарственного состава можно добавлять такие подходящие консерванты, как сахароза, маннитол, сорбитол, трегалоза, декстран и глицерин. В состав можно добавлять стабилизатор, выбранный из ионных и неионных сурфактантов, D-глюкозы, D-галактозы, D-ксилозы, D-галактуроновой кислоты, трегалозы, декстранов, гидроксиэтилкрахмала и их смесей. Пептид может стабилизировать добавление соли щелочного металла или хлорида магния. Пептид также можно стабилизировать путем приведения его в контакт с сахаридом, выбранным из группы, состоящей из декстрана, хондроитинсерной кислоты, крахмала, гликогена, декстрина и соли альгиновой кислоты. Другие углеводы, которые можно добавлять, включают моносахариды, дисахариды, сахароспирты и их смеси (например, глюкозу, маннозу, галактозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннитол, ксилитол). Полиолы могут стабилизировать пептид и являются смешивающимися с водой или водорастворимыми. Подходящие полиолы могут представлять собой многоатомные спирты, моносахариды и дисахариды, включая маннитол, глицерол, этилен гликоль, пропиленгликоль, триметилгликоль, винилпирролидон, глюкозу, фруктозу, арабинозу, маннозу, мальтозу, сахарозу и их полимеры. Различные эксципиенты, включая сывороточный альбумин, аминокислоты, гепарин, жирные кислоты и фосфолипиды, сурфактанты, металлы, полиолы, восстанавливающие агенты, хелаты металлов, поливинилпирролидон, гидролизованный желатин и сульфат аммония также могут стабилизировать пептиды.

Перспективность терапии цитокинами основывается на открытии таких новых цитокинов, но еще более принципиальное значение для данной сферы имеет появление все большего числа результатов доклинических исследований, убедительно демонстрирующих синергичные и/или новые биологические эффекты, которых можно достичь благодаря применению нескольких комбинаций цитокинов с комплементарными иммуностимулирующими свойствами. Возможные терапевтически активные комбинации агентов с иммуноцитокинами на основе RLI включают, например, химиотерапевтические агенты, антиангиогенные агенты или иммуномодулирующие агенты.

В предпочтительном воплощении композиция по изобретению может содержать дополнительные терапевтически активные агенты, такие как химиотерапевтические агенты, антиангиогенные агенты или иммуномодулирующие агенты.

Для химиотерапевтических агентов показали, что их терапевтические эффекты могут быть отчасти опосредованы непрямым влиянием на иммунные ответы, либо за счет индукции клеточной гибели, вызывающей иммунный ответ (иммуногенной клеточной гибели), балансирования иммуносуппрессивного окружения, уменьшения объема крупных первичных опухолей и затем усиления иммунной атаки, либо за счет индукции транзиторной лимфопении с последующей гомеостатической лимфопролиферацией. Многие из них хорошо известны специалистам в данной области и, в качестве примера химиотерапевтического агента, который можно скомбинировать с иммуноцитокином по изобретению, можно привести флударабин, гемцитабин, капецитабин, метотрексат, таксол, таксотер, меркаптопурин, тиогуанин, гидроксимочевину, цитарабин, циклофосфамид, ифосфамид, нитрозомочевины, комплексы платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин, митомицин, дакарбазин, прокарбизин, этопозид, тенипозид, кампатецины, блеомицин, доксорубицин, идарубицин, даунорубицин, дактиномицин, пликамицин, митоксантрон, L-аспарагиназу, доксорубицин, эпимбицин (epimbicin), 5-флуороурацил, таксаны, такие как доцетаксел и паклитаксел, лейковорин, левамизол, иринотекан, эстрамустин, этопозид, азотистый иприт, БХНМ, нитрозомочевины, такие как кармустин и ломустин, алкалоиды барвинка, такие как винбластин, винкристин и винорельбин, иматиниб мезилат, гексаметилмеламин, топотекан, ингибиторы киназ, ингибиторы фосфатаз, ингибиторы АТФаз, тирфостины, ингибиторы протеаз, ингибиторы гербимицин А, генистеин, эрбстатин и лавендустин А.

Для антиангиогенных агентов показали, что они обладают нецелевым действием на иммунную систему и могут впоследствии усиливать иммунный ответ на опухоль. В качестве примера антиангиогенного агента, который можно скомбинировать с иммуноцитокином по изобретению, можно привести лекарства, мишенью которых является рецептор фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR) через воздействие на его тирозиновую киназу, такие как сорафениб, сунитиниб и пазопаниб, или белок-мишень рапамицина млекопитающих (mTOR), такие как темсиролимус и эверолимус.

В качестве иммуномодулирующих агентов, которые можно скомбинировать с иммуноцитокином по изобретению, можно привести цитокины (IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL18, IL-21, GM-CSF, G-CSF, IFNα, …), хемокины/антиангиогенные цитокины (IP10, Mig, SDF-1, RANTES, …), агонисты TLR и антитела, обладающие иммунорегулирующим действием (анти-СТ1-А4, анти-PDI, анти-TGFb, агонист анти-CD40, …).

Терапевтические способы и применение

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, согласно описанию выше, для лечения рака у субъекта, предпочтительно фармацевтической композиции, содержащей иммуноцитокин, описанный выше.

В данном документе термин "субъект" обозначает млекопитающего, такого как грызун, животное семейства кошачьих, псовых, примат и, наиболее предпочтительно, человек. В другом аспекте настоящее изобретение относится к продуктам, содержащим:

(i) иммуноцитокин, описанный выше, последовательность кодирующей его нуклеиновой кислоты или вектор, содержащий такую последовательность нуклеиновой кислоты, и

(ii) терапевтический агент, предпочтительно противоопухолевый агент, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения рака у субъекта. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему этап введения указанному субъекту фармацевтической композиции, описанной ранее.

В последнем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему этап одновременного, раздельного или последовательного введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества:

(i) иммуноцитокина, описанного выше, последовательности кодирующей его нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего последовательность такой нуклеиновой кислоты, и

(ii) терапевтического агента, предпочтительно противоопухолевого агента.

В контексте изобретения термин "лечить" или "лечение" в данном документе обозначают регрессию, облегчение, подавление прогрессирования или предупреждение возникновения нарушения или состояния, к которому относится этот термин, или одного или более симптомов такого нарушения или состояния. Термин "лечить рак" в данном документе означает подавление роста опухолевых клеток. Предпочтительно, такое лечение также ведет к регрессии опухоли, т.е. уменьшению размера опухоли, поддающейся измерению. Наиболее предпочтительно, такое лечение ведет к полной регрессии опухоли.

Ниже приводится более подробное описание изобретения, со ссылками на аминокислотные последовательности, последовательности нуклеиновых кислот и Примеры. Однако, приводимые Примеры не ограничивают объема изобретения. Напротив, изобретение относится к любому воплощению, которое включает подробности, которые не указаны напрямую в приведенных здесь Примерах, но которые будут найдены специалистом в данной области техники без чрезмерных усилий.

Описание примеров осуществления изобретения

1) Конструирование иммуноцитокинов на основе интерлейкина 15

Конструирование иммуноцитокинов, направленных против CD20 (Ритуксимаб) и O-ацетилированного GD2

Экспрессирующие плазмиды, кодирующие легкие цепи химерного IgG к CD20 и легкие цепи химерного IgG к O-ацетилированному GD2, были любезно предоставлены Dr WATIER (Universite Francois-Rabelais de Tours, France) и Dr BIRKLE (INSERM, Universite de Nantes, U892, France), соответственно. Последовательности тяжелых цепей химерных IgG каждого антитела были сконструированы таким образом, чтобы их 3'-концы можно было соединить с IL15 (SEQ ID NO:3, где аминокислотой в положении 93 является К) с помощью линкера из 22 аминокислот или без линкера (SEQ ID NO:16). Эти нуклеотидные последовательности были синтезированы и клонированы в плазмиды pcDNA3.1 в компании GENEART. Полная последовательность легкой и тяжелой цепей антитела к O-ацетилированному GD2 (8 В6) описаны в заявке на патент ЕР 2,076,542 А1, а также CERATO et al. (Hybridoma, vol. 16(4), p:307-16, 1997). Полная последовательность легкой и тяжелой цепей антитела к CD20 (2 В8) описаны в патенте США US 5,736,137 (ANDERSON et al. в виде антитела под названием "С2В8"), а также REFF et al. (Blood. vol.83 (2), p:435-45, 1994).

Приготовление плазмидной ДНК и реагента для трансфекции

Линейный полиэтиленимин (ПЭИ) с молекулярной массой 40 кДа был приобретен в компании POLYSCIENCE. Матричный раствор с концентрацией 1 мг/мл приготавливали растворением ПЭИ в воде при нагревании, с нейтрализацией NaOH и стерилизацией фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Матричный раствор разливали на аликвоты и хранили при -20°С.

Плазмидную ДНК для трансфекции очищали с применением наборов для очистки плазмид в соответствии с интрукциями производителя (MACHEREY-NAGEL) и стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Получение и очистка иммуноиитокинов

1-Транзиторная трансфекция в суспензии:

Поддерживаемые в стандартных условиях клетки CHO-S (INVITROGEN) высаживали с плотностью 1×10⁶ клеток/мл в среде PowerCHO2 (LONZA) и культивировали в течение ночи при 37°С в шейкер-инкубаторе (100 об/мин) при 5% CO2. Для трансфекции клетки разводили до концентрации 2×10⁶ клеток/мл в среде CD-CHO (INVITROGEN). Комплексы для трансфекции готовили в объеме, составляющем 10% от объема культуры клеток с применением 150 мМ NaCl. Экспрессирующие конструкции ДНК (2,5 мг/л объема культуры клеток, при соотношении плазмид, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь 1:2) смешивали с ПЭИ, разведенным в NaCl (10 мг/л конечного объема культуральной среды) и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре перед добавлением к культуре. Клетки культивировали в шейкер-инкубаторе (130 об/мин) при 37°С в течение 5 ч перед добавлением равного объема среды PowerCHO2. Надосадочную жидкость собирали через 5 дней после трансфекции.

2-Стабильная трансфекция адгезивных клеток

Клетки СНО-К1 (АТСС NO:CCL-61) выращивали в среде DMEM с добавлением I-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллина (100 ед/мл)/стрептомицина (100 мкг/мл) и трансфецировали каждым вектором с использованием реагента липофектамин 2000 (INVITROGEN), согласно инструкциям производителя. Для отбора клонов выполняли предельное разведение с использованием среды, содержащей генетицин и гигромицин (0,5 мг/мл) или бластицин и гигромицин (5 мкг/мл и 100 мкг/мл) для иммуноцитокина, направленного против O-ацетилированного GD2, и иммуноцитокина, направленного против CD20, соответственно. Надосадочную культуральную жидкость от каждого клона исследовали на предмет продукции бифункциональных белков методом твердофазного ИФА. Для получения иммуноцитокинов отобранные клоны амплифицировали в среде, состоящей из 25% DMEM и 75% AIM (INVITROGEN). Затем клетки поддерживали в 100% среде AIM, a надосадочную жидкость собирали и заменяли каждые 2 дня на протяжении 10 дней.

3-Очистка надосадочной жидкости

Собранную надосадочную жидкость центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин при 4°С, доводили до рН 7,8 с помощью NaOH и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Кондиционированные среды очищали методом аффинной хроматографии с использованием колонок с белком A (GE) согласно инструкциям производителя. Очищенные белки концентрировали с использованием концентраторов AMICON с уровнем отсечки 50 кДа (MILLIPORE). На этом этапе элюирующий буфер заменяли на ФСБ. В заключение очищенные белки исследовали при помощи твердофазного ИФА и измеряли поглощение при 280 нм. Степень чистоты оценивали с помощью электрофореза.

4-Детекция иммуноглобулинового компонента при помощи твердофазного ИФА.

Плоскодонные планшеты для микротитрования Maxisorp (NUNC) покрывали 100 мкл антитела козы к иммуноглобулинам человека (UP 892370, INTERCHIM), разведенным в ФСБ до концентрации 1,5 мкг/мл в течение ч при 4°С. Затем поверхность планшетов блокировали 200 мкл блокирующего буфера (1% БСА+0,1% TWEEN 20 в ФСБ) в течение 1 ч при 37°С. Затем планшеты отмывали 3 раза отмывочным буфером (0,1% TWEEN 20 в ФСБ), и добавляли образцы, разведенные в блокирующем буфере, и инкубировали в течение 30 мин при 37°С (100 мкл). После 3 отмывок добавляли конъюгированное с пероксидозой антитело к IgG1 человека (109-036-003, JACKSON), разведенное 1:10000 и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Для определения концентрации белка использовали субстрат ТМВ (INTERCHIM), оптическую плотность определяли при 450 нм. Для получения стандартной кривой использовали очищенный ритуксимаб (ROCHE).

5-Детекция цитокинового компонента при помощи твердофазного ИФА.

Плоскодонные планшеты для микротитрования Maxisorp (NUNC) покрывали 100 мкл антитела В-Е29 к IL15 (DIACLONE), разведенным в карбонатном буфере до концентрации 2 мкг/мл в течение 16 ч при 4°С. Затем поверхность планшетов блокировали 200 мкл блокирующего буфера (1% БСА в ФСБ) в течение 1 ч при 37°С. Затем планшеты отмывали 3 раза отмывочным буфером (0,05% Tween 20 в ФСБ). добавляли образцы, разведенные в TBS+0,05% БСА и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С (100 мкл). После 3 отмывок добавляли биотинилированное антитело ВАМ 247 к IL15 (R&D SYSTEM), разведенное до концентрации 200 нг/мл и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты отмывали 3 раза и добавляли стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой в разведении 1:1000. Для определения концентрации белка использовали субстрат ТМВ (INTERCHIM), оптическую плотность определяли при 450 нм. Для получения стандартной кривой использовали IL-15 (PEPROTECH).

Результаты показали, что полученный препарат иммуноцитокинов содержит много белковых примесей (т.е. в количестве, равном или превышающем 25%). Для уменьшения количества этих белковых примесей два иммуноцитокина на основе интерлейкина 15, направленные против O-ацетилированного GD2, подвергали второму циклу очистки с использованием сефарозы с белком А. После этого второго цикла очистки с помощью сефарозы с белком А степень чистоты иммуноцитокинов C8B6-I22-IL15 и C8B6-IL15 составляла 70 и 90% соответственно.

Пролиферативное действие иммуноцитокинов

Исследовали Пролиферативное действие интерлейкина-15 у полученных иммуноцитокинов. Пролиферативный ответ клеток Kit 225 и 32DR на иммуноцитокины определяли по включению [³Н] тимидина. Клетки держали в среде для культивирования в течение 3 дней, дважды отмывали и оставляли голодать в среде, не содержащей цитокинов в течение 24 ч или 4 ч в случае клеток Kit 225 и 32DB, соответственно. Затем их высаживали в многолуночные планшеты в концентрации 10⁴ клеток/лунку в 100 мкл и культивировали в течение 48 ч в среде с добавлением увеличивающихся концентраций образца. В качестве калибратора использовали rIL-15 человека и RLI. Клетки активировали в течение 16 ч [³Н] тимидином в дозе 0,5 мкКи/лунку, собирали на стекловолоконные фильтры и измеряли радиоактивность клеток, связавших метку.

На Фиг.1 показано включение [³H] тимидина в клетки Kit 225 и 32Dβ, которые культивировали при повышении концентраций rIL-15 (■), c8B6-IL15 (Δ) и C8B6-I22-IL15 (O).

На Фиг.1 показано включение [³Н] тимидина в клетки Kit 225 и 32Dβ, которые культивировали при повышении концентраций rlL-15 и c2B8-I22-IL15 (O).

Результаты показывают, что биологическая активность IL-15 при его нахождении в составе иммуноцитокина резко понижается, означая, что конъюгирование IL-15 с моноклональным антителом приводит к потере активности. Кроме того, эта потеря оказывается более значительной при отсутствии линкера между двумя компонентами. Следует отметить, что эта потеря активности более выражена в случае IL-15Rβγ.

Связывающая активность иммуноцитокинов

Специфическое связывание иммуноцитокинов, направленных против CD20 и O-ацетилированного GD2, с опухолевыми клетками Raji и IMR32 соответственно, оценивали при помощи проточной цитометрии. Способность иммуноцитокинов связываться с рецептором IL-15 эффекторных клеток исследовали с использованием Kit225. Иммуноцитокины, связавшиеся с целевыми клетками, определяли с помощью РЕ-конъюгированного моноклонального антитела козы к IgG человека (PN IM0550, BECKMAN COULTER) или с помощью биотинилированного мышиного антитела к IL15 (ВАМ247, R&D SYSTEM), связанного с РЕ-стрептавидином (SIGMA-ALDRICH). Целевые клетки (1×10⁵) инкубировали с каждым иммуноцитокином в течение 1 ч при 4°С, отмывали и затем инкубировали с РЕ-конъюгатом в течение 1 ч при 4°С. В заключение отмытые клетки исследовали на приборе FACSCALIBUR (BECTON DICKINSON).

На Фиг.3 показано определение иммуноцитокинов, направленных против CD20 (c2B8-I22-IL15) и O-ацетилированного GD2 (c8B6-IL15 и c8B6-I22-IL15), на поверхности клеток Raji, экспрессирующих CD20, и клеток IMR32, экспрессирующих O-ацетилированный GD2, с помощью проточной цитометрии. Вначале клетки инкубировали с иммуноцитокином, затем с РЕ-конъюгированным моноклональным антителом козы к IgG человека в случае анти-CD20 или с биотинилированным антителом к IL15+РЕ-конъюгированным стрептавидином в случае анти-CD20 и анти-GD2 соответственно. В заключение образцы исследовали на приборе FACSCALIBUR. При использовании клеток Raji иммуноцитокины сравнивали с моноклональным антителом к CD20 ритуксимаб (MABTHERA, ROCHE).

На Фиг.4 показано определение иммуноцитокинов, направленных против CD20 (C2B8-I22-IL15) и O-ацетилированного GD2 (c8B6-IL15 и C8B6-I22-IL15), на поверхности клеток Kit 225, экспрессирующих IL15R, с помощью проточной цитометрии. Вначале клетки инкубировали с иммуноцитокином, затем с РЕ-конъюгированным моноклональным антителом козы к IgG человека. В заключение образцы анализировали на приборе FACSCALIBUR. Иммуноцитокины сравнивали с моноклональным антителом к CD20 ритуксимаб (MABTHERA, ROCHE).

Результаты показывают, что различные иммуноцитокины связываются с рецептором IL-15, а также с их соответствующим опухолевым антигеном-мишенью.

Таким образом, потеря активности интерлейкина 15 у этих иммуноцитокинов не является следствием потери связывания интерлейкина 15 с его специфическим рецептором. Однако, по-видимому, это существующее связывание не позволяет индуцировать нормальной клеточной пролиферации.

Конструирование иммуноцитокинов на основе RLI

Конструирование иммуноцитокинов на основе RLI. направленных против CD20 и O-ацетилированного GD2

Иммуноцитокины, направленные против CD20 и O-ацетилированного GD2, конструировали как описано ранее, за исключением того, что последовательность IL15 Homo sapiens заменена последовательностью RLI2 (SEQ ID NO:17).

Получение и очистка иммуноцитокинов

Получение и очистку иммуноцитокинов осуществляли как описано ранее, за исключением того, что эти иммуноцитокины были получены с хорошим выходом и хорошей степенью чистоты (т.е. выше 90%) только после одного цикла очистки с использованием сефарозы, конъюгированной с белком А.

Связывающая активность иммуноцитокинов

Специфическое связывание иммуноцитокинов на основе RLI, направленных против CD20 и O-ацетилированного GD2, с опухолевыми клетками Raji, WM266.4 и IMR32 оценивали при помощи проточной цитометрии. Способность иммуноцитокинов на основе RLI связываться с рецептором IL-15 на поверхности эффекторных клеток исследовали на клетках Kit225. Иммуноцитокины на основе RLI на поверхности целевых клеток определяли с помощью РЕ-конъюгированного моноклонального антитела козы к IgG человека (PN IM0550 BECKMAN COULTER) или с помощью биотинилированного мышиного антитела к IL15 (ВАМ247, R&D SYSTEM), связанного с РЕ-стрептавидином (SIGMA-ALDRICH). Целевые клетки (1×10⁵) инкубировали с каждым иммуноцитокином в течение 1 ч при 4°С, отмывали и затем инкубировали с РЕ-конъюгатом в течение 1 ч при 4°С. В заключение отмытые клетки исследовали на приборе FACSCALIBUR (BECTON DICKINSON).

На Фиг.5 показано определение иммуноцитокинов c2B8-RLI, c8B6-RLI и c8B6-I22-RLI на поверхности клеток Raji, экспрессирующих CD20, и клетках WM266.4 и IMR32, экспрессирующих O-ацетилированный GD2, с помощью проточной цитометрии. Вначале клетки инкубировали с иммуноцитокином на основе RLI, затем с РЕ-конъюгированным моноклональным антителом козы к IgG человека в случае анти-CD20 или с биотинилированным анти-IL15+РЕ-конъюгированным стрептавидином в случае анти-CD20 и анти-O-ацетилированного GD2, соответственно. В заключение, образцы анализировали на приборе FACSCALIBUR. Иммуноцитокины на основе RLI на клетках Raji сравнивали с моноклональным антителом к CD20 ритуксимаб (MABTHERA, ROCHE).

На Фиг.6 показано определение иммуноцитокинов на основе RLI, направленных против CD20 (C2B8-RLI) и O-ацетилированного GD2 (c8B6-RLI и C8B6-122-RLI) на клетках Kit 225, экспрессирующих IL15Rα, с помощью проточной цитометрии. Вначале клетки инкубировали с иммуноцитокином на основе RLI, затем с РЕ-конъюгированным моноклональным антителом козы к IgG человека. В заключение образцы анализировали на приборе FACSCALIBUR.

Результаты показывают, что иммуноцитокины по изобретению связываются с рецептором IL-15, а также со своим соответствующим опухолевым антигеном-мишенью.

Пролиферативное действие иммуноцитокинов

Исследовали Пролиферативное действие интерлейкина-15 у полученных новых иммуноцитокинов.

На Фиг.7 показано включение [³Н] тимидина в клетки Kit 225 и 32DB, культивируемые с увеличением концентраций RLI (■), rIL-15 (♦) c8B6-RLI (Δ) и C8B6-122-RLI (О).

На Фиг.8 показано включение [³Н] тимидина в клетки 32DB, культивируемые при увеличении концентраций RLI (■), rlL-15 (♦) и C2B8-RLI (Δ).

Результаты показывают, что биологическая активность IL-15 сохраняется у иммуноцитокинов на основе RLI, в отличие от иммуноцитокинов на основе IL15, означая, что конъюгирование RLI с моноклональным антителом неожиданно обеспечивает сохранение этой активности IL-15. Более того, этот неожиданный эффект не требует наличия второго линкера между RLI и моноклональным антителом. Следует отметить, что иммуноцитокины на основе RLI демонстрируют существенное усиление биологической активности по сравнению со свободным IL15 в случае IL-15Rβγ (усиление приблизительно в 10-100 раз).

Противоопухолевая активность иммуноцитокина, направленного против O-ацетилированного GD2

Клеточную линию нейробластомы мыши NXS2 выращивали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM) (10% эмбриональной телячьей сыворотки) в стандартных условиях культивирования клеток (37°С, 5% CO2). Клеточная линия NXS2 NB, экспрессирующая O-ацетилированный GD2, была получена и охарактеризована LODE et al. (J. Natl. Cancer Inst., vol.89 (21), p:1586-94, 1997).

Мыши A/JOIaHsd в возрасте 8 недель были приобретены в лабораториях HARLAN. Мышей содержали в виварии Inserm U892, аккредитованом французской ассоциацией по аккредитации лабораторий, содержащих животных, и соответствующем нормам и стандартам института Inserm и Французского Департамента Сельского Хозяйства.

Метастазы печени в эксперименте индуцировали при помощи инъекции в хвостовую вену опухолевых клеток 1×10⁵ NXS2 NB в 200 мкл DMEM (рН 7,4). Лечение, которое начинали через день после инокуляции опухолевых клеток, состояло из 4 внутрибрюшинных инъекций 80 пмоль C8B6-RLI2 или с8 В6 вдень 1, 4, 7 и 11. Мышей умерщвляли через 25 дней после трансплантации и оценивали массу опухолевой ткани печени по сырому весу печени.

На Фиг.9 показана эффективность влияния C8B6-RL12 на метастазы печени, индуцированные NXS2. с8 В6 (12 мкг) или C8B6-RLI (16 мкг) вводили внутрибрюшинно в день 1, 4, 7 и 11. Слева: график представляет среднее в каждой группе (n=5); столбцы, ош. средн. Справа: репрезентативные снимки печени, стрелками указаны некоторые метастазы.

Результаты показали, что мыши, получавшие иммуноцитокин, не имели метастазов. Таким образом, в отличие от с8 В6, иммуноцитокин способен препятствовать развитию метастазов печени, индуцированных NXS2, означая, что конъюгация RLI с моноклональным антителом значительно повышает его противоопухолевую активность.

Противоопухолевая активность иммуноцитокина на основе RLI2. направленного против CD20. в модели на клетках Rail:

Человеческие В-клетки Raji культивировали в среде RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ 1-глутамина.

Мыши SCID СВ-17 в возрасте 8 недель были приобретены в лабораториях по разведению животных CHARLES RIVER. Мышей содержали в условиях отсутствия специфических патогенов в отдельном виварии, в микроизоляторах с автоклавированными клетками, давали стерилизованный облучением твердый корм и стерильную воду.

Для инокуляции клетки Raji собирали в log-фазе, отмывали и ресуспендировали в концентрации 2,5×10⁶ клеток/0,1 мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) перед внутривенной инъекцией мыши с последующим внутрибрюшинным введением иммуноцитокинов 3 раза в неделю (начиная с 5 дня) в течение 3 недель после имплантации. Мыши получали лечение в эквимолярных дозах за исключением групп "иммуноцитокин" и "ритуксимаб+RLI", получавших половинную дозу. У мышей ежедневно проверяли наличие паралича задней конечности и в этом случае умерщвляли и учитывали как погибших.

На Фиг.10 показан анализ выживаемости мышей СВ17 SCID, получавших внутривенные инъекции клеток Raji (n=5) и получавших в качестве терапии в день J5-J7-J9; J12-J14-J16; J19-J21-J23 ФСБ (■); RLI (▲; 2 мкг); ритуксимаб (♦; 12 мкг); ритуксимаб+RLI (●; 6 мкг+1 мкг), антиCD20-RLI (V; 8 мкг), по методу Каплана-Мейера.

Результаты показывают, что доля выживших мышей, получавших клетки Raji и леченных RLI или ритуксимабом, была одинаковой, а медиана выживаемости (50%) мышей, имеющих опухоли, сдвигалась от 20 до 27 дней и до 28 дней, соответственно, относительно контрольных животных (ФСБ).

Результаты показывают увеличение доли выживших мышей, имеющих опухоли, еще наполовину в группе "ритуксимаб+RLI", что достоверно отличалось от результатов, полученных в группе RLI (Р<0,01 или менее).

Наконец, неожиданным оказалось, что согласно результатам, лечение иммуноцитокином, направленным против CD20, приводит к полному прекращению развития опухоли и отсутствию погибших мышей в конце эксперимента (день 50).

Конструирование дополнительных иммуноцитокинов

Конструирование иммуноцитокинов на основе RLI и IL15, направленных против HER2Neu (с полноразмерным IgG и ScFv)

Последовательности, кодирующие легкие цепи мышиного IgG 4D5, направленного против HER2, тяжелые цепи мышиного IgG 4D5, направленного против HER2, и scFv, направленного против HER2, были любезно предоставлены Dr DONDA (Biochemistry Institute Lausanne, Switzerland). Иммуноцитокины на основе RLI и IL15, направленные против HER2Neu, были сконструированы, как описано ранее, на основе легкой (SEQ ID NO:18) и тяжелой цепи (SEQ ID NO:19) антитела к HER2Neu. Для этих конструкций последовательности, кодирующие лидерную последовательность бета2 микроглобулина в рамке считывания с последовательностью, кодирующей тяжелую цепь химерного IgG, были созданы таким образом, чтобы их 3'-концы можно было соединить с использованием линкера из 22 аминокислот (SEQ ID NO:16) или без линкера с IL15 (SEQ ID NO:20 и 21, соответственно) и с RLI (SEQ ID NO:22 и 23 соответственно).

Также были разработаны и получены конструкции, соответствующие последовательности, кодирующей лидерную последовательность бета2 микроглобулина в рамке считывания с последовательностью, кодирующей фрагмент ScFv, направленный против HER2Neu, 3'-конец которого соединен при помощи линкера из 22 аминокислот или без линкера с IL15 (SEQ ID NO:24 и 25, соответственно) и с RLI (SEQ ID NO:26 и 27 соответственно). Эти нуклеотидные последовательности были синтезированы в компании GENEART и субклонированы в плазмиды pCR3 (INVITROGEN).

Исследовали биологическую и связывающую активности этих соединений.

Конструирование иммуноцитокинов на основе интерлейкина 15

Приготовление плазмидной ДНК и реагента для трансфекции

Линейный ПЭИ с молекулярной массой 40 кДа был приобретен в компании POLYSCIENCE. Матричный раствор с концентрацией 1 мг/мл приготавливали растворением ПЭИ в воде при нагревании, с нейтрализацией NaOH и стерилизацией фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Матричный раствор разливали на аликвоты и хранили при -20°С.

Плазмидную ДНК для трансфекций очищали с применением наборов для очистки плазмид в соответствии с интрукциями производителя (MACHEREY-NAGEL) и стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Получение и очистка иммуноцитокинов

1 - Транзиторная трансфекция:

Клетки НЕК293Т, любезно предоставленные Dr. SCHNEIDER (Biochemistry Institute Lausanne, Switzerland) высаживали во флаконы Т175 см2 в среде DMEM-Glutamax с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С и 5% CO2. В день трансфекций приготавливали комплексы плазмидной ДНК и ПЭИ в стерильном растворе NaCl 150 мМ. Плазмидную ДНК, разведенную в NaCl (1,25 мг/л объема культуры клеток), смешивали с ПЭИ, разведенным в NaCl (12,5 мг/л культуры клеток) и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре до добавления к культуре клеток. В случае иммуноцитокинов на основе IgG-RLI или -IL15, направленных против HER2, использовали соотношение плазмидной ДНК 1:2 (тяжелая:легкая цепи). Затем клетки культивировали при 37°С в течение 4 ч. После этого среду удаляли и добавляли свежую DMEM без эмбриональной телячьей сыворотки. Надосадочную жидкость собирали через 5 дней после трансфекций.

2 - Очистка надосадочной жидкости:

Собранную надосадочную жидкость центрифугировали первый раз при 1000 об/мин в течение 5 мин и второй раз при 3000 об/мин в течение 15 мин при 4°С, приводили в соответствие с составом и рН 20 мМ раствора фосфата натрия рН 8-9 в соответствии с рекомендациями производителя и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Кондиционированную среду очищали при помощи аффинной хроматографии с применением колонок с белком A (GE) согласно инструкциям производителя. Очищенные белки концентрировали с помощью концентраторов AMICON с уровнем отсечки 50 кДа (MILLIPORE) в случае иммуноцитокина, содержащего IgG, или 10 кДа в случае иммуноцитокина, содержащего scFv. На этом этапе элюирующий буфер заменяли на ФСБ. В заключение белки анализировали при помощи твердофазного ИФА и измеряли поглощение при 280 нм. Степень чистоты оценивали при помощи электрофореза.

Связывающая активность иммуноцитокинов

Специфическое связывание иммуноцитокинов, направленных против HER2, содержащих IgG или scFv, с положительными по HER2 клетками SK-BR-3 оценивали при помощи проточной цитометрии с использованием антитела к IL15. Способность иммуноцитокинов связываться с рецептором IL-15 на эффекторных клетках исследовали на клетках Kit225. Иммуноцитокины на поверхности целевых клеток определяли с помощью FITC-конъюгированного моноклонального антитела козы к IgG мыши (SIGMA-ANDRICH) или с помощью FITC-конъюгированного мышиного антитела к IL15 (R&D SYSTEM). Целевые клетки (1×10⁵) инкубировали с каждым иммуноцитокином в течение 1 ч при 4°С, отмывали и затем инкубировали с FITC-конъюгатом в течение 1 ч при 4°С. В заключение отмытые клетки анализировали на приборе FACSCALIBUR (BECTON DICKINSON).

На Фиг.3 показано определение иммуноцитокинов, направленных против HER2 (трастузумаб-11-15 и трастузумаб-122-1115), на поверхности экспрессирующих HER2 клеток SKBR3 с помощью проточной цитометрии.

На Фиг.5 показано определение иммуноцитокина трастузумаб-RLI на клетках SKBR3, экспрессирующих HER2, с помощью проточной цитометрии. Иммуноцитокины, направленные против HER2, сравнивали с трастузумабом (герцептин®, Genentech) на клетках SKBR3.

Результаты показали способность иммуноцитокина трастузумаб-RLI покрывать клетки линий опухолевого происхождения, экспрессирующие соответствующий опухолеассоциированный антиген.

Пролиферативное действие иммуноцитокинов

Пролиферативное действие интерлейкина-15 у гибридных белков, содержащих IL-15 и трастузумаб или фрагменты scFv, направленные против HER2, исследовали на клетках Kit 225 и 32DB», определяя включение [³Н] тимидина согласно способу, описанному ранее.

На Фиг.11 показано включение [³Н] тимидина клетками Kit 225 и 32DB,, культивируемыми при повышающихся концентрациях трастузумаб-122-IL-15 (О), трастузумаб-IL-15 (Δ) и rIL-15 (■).

На Фиг.12 показано включение [³Н] тимидина клетками Kit 225 и 32DR», культивируемыми при повышающихся концентрациях трастузумаб-RLI (Δ), RLI (■) и rIL-15 (♦).

Результаты показывают, что биологическая активность IL-15 в отношении клеток, экспрессирующих IL-15Raβγ. значительно понижается при его нахождении в составе иммуноцитокина, означая, что конъюгирование IL-15 с моноклональным антителом приводит к потере активности. Более того, эта потеря является более значимой при отсутствии линкера между двумя компонентами. В отношении клеток, экспрессирующих IL-15Rβγ, конъюгирование приводит к полной потере биологической активности IL-15 при наличии или отсутствии линкера.

Результаты показывают, что в составе иммуноцитокинов на основе RLI, в отличие от иммуноцитокинов на основе IL15, биологическая активность IL-15 сохраняется, означая, что конъюгирование RLI с моноклональным антителом неожиданно обеспечивает сохранение этой активности IL-15. Более того, этот необычный эффект не требует присутствия второго линкера между RLI и моноклональным антителом.

Также неожиданно результаты показали, что иммуноцитокины на основе RLI, содержащие трастузумаб, демонстрируют существенное усиление биологической активности по сравнению со свободным IL-15 в случае IL-15Rβγ (повышение приблизительно в 10-100 раз).

Результаты также показали, что в составе иммуноцитокинов на основе RLI, содержащих scFv, в отличие от иммуноцитокинов на основе IL15, биологическая активность IL-15 также сохраняется, означая, что конъюгирование RLI с фрагментом scFv неожиданно позволяет сохранить эту активность IL-15 (результаты не приведены). Аналогично, этот необычный эффект не требует присутствия второго линкера между RLI и фрагментом scFv (результаты не приведены).

Claims (29)

1. Иммуноцитокин для лечения рака, содержащий:

a) конъюгат и

b) антитело, направленное против антигена, выбранного из группы, содержащей антигены, имеющие отношение к неоваскуляризации опухоли или к внеклеточному матриксу опухоли, и опухолевые антигены, или его фрагмент, способный вступать в реакцию с тем же антигеном, что и антитело,

где указанный фрагмент выбран из группы, состоящей из F_ab фрагмента, F_ab' фрагмента, F(_ab')₂ фрагмента, F_acb, F_d, и scF_v,

где конъюгат и антитело или его фрагмент ковалентно связаны при помощи бифункциональных сшивающих агентов, обеспечивающих присоединение белков, или в составе гибридного белка,

где аминокислотная последовательность конъюгата находится в С-концевом положении относительно аминокислотной последовательности антитела или его фрагмента;

где указанный конъюгат включает:

(i) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность интерлейкина 15, и

(ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность домена sushi IL-15Rα,

где конъюгат включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO 17.

2. Иммуноцитокин по п. 1, где

а) полипептиды (i) и (ii) конъюгата ковалентно связаны в составе гибридного белка; и

b) указанный конъюгат и антитело или его фрагмент ковалентно связаны в составе гибридного белка.

3. Иммуноцитокин по п. 2, где аминокислотная последовательность конъюгата и аминокислотная последовательность антитела или его фрагмента не разделены какой-либо линкерной аминокислотной последовательностью.

4. Иммуноцитокин по любому из пп. 1-3, где аминокислотная последовательность конъюгата и аминокислотная последовательность антитела или его фрагмента разделены линкерной аминокислотной последовательностью.

5. Иммуноцитокин по п. 1, где антиген неоваскуляризации выбран из группы, состоящей из доменов EDA и EDB фибронектина, эндосалин/TEM1, эндоглин/105, простатспецифического мембранного антигена (PSMA) или В7-Н4.

6. Иммуноцитокин по п. 1, где антиген внеклеточного матрикса опухоли представляет собой G45 фрагмент ламинина-332.

7. Иммуноцитокин по п. 1, где опухолевый антиген выбран из группы, состоящей из CD-20, РЭА, EGFR, GD2, ЕРСАМ, MUC1, PSMA, CD-19, GD3, GM1, CAIX, О-ацетилированного GD2 или HER2.

8. Иммуноцитокин по любому из пп. 1-7, где указанный фрагмент антитела представляет собой scF_v.

9. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноцитокин по любому из пп. 1-8.

10. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 9.

11. Клетка-хозяин для продуцирования иммуноцитокина по любому из пп. 1-8, где указанная клетка-хозяин генетически модифицирована нуклеиновой кислотой по п. 9, функционально связанной с последовательностью, участвующей в экспрессии гена, или вектором экспрессии по п. 10.

12. Клетка-хозяин по п. 11, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку животного.

13. Клетка-хозяин по п. 12, где указанная клетка животного представляет собой клетку яичников китайского хомячка (СНО).

14. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая эффективное количество иммуноцитокина по любому из пп. 1-8, возможно связанного с фармацевтически приемлемым носителем.

15. Фармацевтическая композиция по п. 14, где указанная фармацевтическая композиция предназначена для введения путем инъекции в дозе 2,5 мг/кг массы субъекта или менее.

16. Комбинированный препарат, содержащий фармацевтическую композицию по п. 14 или 15 и противоопухолевый агент, для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения рака у субъекта.

17. Способ лечения рака у субъекта, включающий этап введения указанному субъекту фармацевтической композиции по п. 14 или 15.

18. Способ лечения рака у субъекта, включающий этап одновременного, раздельного или последовательного введения указанному субъекту фармацевтической композиции по п. 14 или 15 и противоопухолевого агента.

Images