RU2478644C2

RU2478644C2 - Способ производства фармакологически приемлемой смеси веществ, содержащей низкомолекулярные компоненты пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий и обладающей иммуностимулирующей активностью

Info

Publication number: RU2478644C2
Application number: RU2008144644/10A
Authority: RU
Inventors: Вячеслав Леонидович Львов; Борис Владимирович Пинегин; Рахим Мусаевич Хаитов
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Корус Фарм"
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2008-11-11
Publication date: 2013-04-10
Also published as: RU2008144644A

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Готовят биомассу грамотрицательных бактерий Salmonella typhi семейства Enterobacteriacea. Выделяют пептидогликан клеточной стенки (ПКС) бактерий с помощью экстракции биомассы 45% водным фенолом при температуре 70-90°С или водными растворами ионных или неионных детергентов при температуре 37-100°С. Проводят препаративный ферментативный гидролиз для расщепления нерастворимого ПКС с применением лизоцима при рН 4,5-8,9 и температуре 10-37°С. Одновременно удаляют фармакологически приемлемую смесь веществ из реакционной смеси диализом с применением полупроницаемых мембран для ультрафильтрации с размером отсечки до 5 кДа. Проводят выделение смеси веществ также с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии, в частности препаративной гель-хроматографии на колонках с Сефадексом или TSK-гелем. Способ позволяет получить фармакологически-приемлемую смесь веществ, включающую следующие компоненты: β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота) (ГМтри);

β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин) (ГМтетра); и

димер ГМтетра (диГМтетра), в котором связь между мономерными остатками ГМтетра осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка ГМтетра, причем связанные между собой тетрапептидные остатки расположены в разных полисахаридных цепях. Выход целевого продукта составляет 320 мг. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

Description

Область изобретения

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в иммунофармакологии, в частности создания средств поддерживающей терапии, предназначенных для повышения иммунной резистентности организма.

Уровень техники

В настоящее время наблюдается снижение естественной устойчивости людей к инфекционным агентам, следствием чего является рост инфекционной заболеваемости, происходящий практически во всех странах мира. Одной из важнейших продолжает оставаться проблема гриппа и острых респираторных заболеваний, являющихся главной причиной снижения трудоспособности населения и приносящих государству многомиллионные убытки. Поэтому актуальной задачей медицинской науки является создание высокоэффективных и безопасных иммуностимулирующих препаратов, повышающих устойчивость организма к воздействию различных патогенов.

Одним из природных источников для создания иммуностимуляторов являются бактерии, которые в организме человека и животных являются главными активаторами иммунной системы. Полноценное функционирование иммунной системы полностью зависит от нормальной микрофлоры кишечника, дыхательных путей, кожи и др. Достаточно отметить, что у стерильных животных (гнотобионтов) иммунная система атрофирована, и, вследствие этого, они являются беззащитными даже перед условно-патогенными микроорганизмами.

Мощным иммуностимулятором бактериальной природы является пептидогликан клеточной стенки (ПКС) бактерий. На основании многочисленных данных структурного анализа фрагментов, полученных при действии на ПКС лизоцима - фермента, избирательно расщепляющего гликозидные связи остатков мурамовой кислоты, установлено, что ПКС представляет собой «сшитый» гетерополимер, который содержит линейные полисахаридные цепи, построенные из чередующихся остатков N-ацетил-D-глюкозамина и N-ацетил-D-мурамовой кислоты, присоединенных β-(1→4)-гликозидными связями, причем лактильные группы остатков мурамовой кислоты несут короткие пептиды («антенны»). В большинстве изученных грамотрицательных микроорганизмов «антенные» фрагменты представляют собой три- и тетрапептидные остатки - L-аланил-D-изоглутаминил-мезо-диаминопимелиновую кислоту и L-аланил-D-изоглутаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин, соответственно. Часть «антенных» тетрапептидных фрагментов, расположенных в разных полисахаридных цепях, образуют «мостиковые» структуры за счет связей между аминогруппой остатка диаминокислоты и карбоксильной группы терминального остатка D-аланина, обеспечивая создание пространственной структуры ПКС. Неоднократно отмечалось, что степень «сшитости», т.е. количество «мостиковых» фрагментов в ПКС зависит не только от вида микроорганизма, но от условий его культивирования.

Более тридцати лет назад группа французских исследователей под руководством Ледерера установила, что минимальный фрагмент ПКС - N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-глутаминовая кислота) (мурамилдипептид, МДП) обладает адъювантным эффектом, способностью стимулировать антиинфекционную резистентность, противоопухолевый иммунитет, активировать иммунокомпетентные клетки и индуцировать синтез ряда цитокинов [Ellouz AF, Ciorubaru R, Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan subunits. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1974. 59. 1317-1325]. Однако из-за высокой пирогенности он оказался непригодным для клинического применения. Впоследствии было показано, что полусинтетический β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглутамин) (глюкозаминилмурамилдипептид, ГМДП), содержащий по сравнению с МДП дополнительный остаток N-ацетил-D-глюкозамина, обладает значительно меньшей пирогенностью и может быть использован в качестве иммуномодулятора широкого спектра действия. Однако, необходимо учитывать, что ГМДП представляет собой синтетический продукт, лишь имитирующий в пептидной части структуру природных пептидогликановых фрагментов. Он, в отличие от нативных компонентов, выделенных из ПКС грамотрицательных бактерий, пептидные антенны которых построены из трех или четырех аминокислотных остатков, включает только два. Более того, природные пептидогликановые фрагменты несут отрицательные и положительные заряды (содержат свободные карбоксильные и амино-группы), тогда как в ГМДП карбоксильная группа остатка изоглутаминовой кислоты находится в форме амида, т.е. ГМДП - молекула нейтральная.

Анализ исследований последних лет позволяет сделать заключение, что интерес для медицинской практики могут представлять три группы природных биологически активных препаратов, выделенных из клеточной стенки грамотрицательных микроорганизмов.

К первой относится высокоочищенный, главным образом, от следовых количеств высокоэндотоксичного бактериального липополисахарида (ЛПС), нерастворимый в воде (включая буферные растворы и растворы детергентов и хаотропных соединений) ПКС, потенциальная область применения которого обусловлена его выраженными адъювантными и иммуностимулирующими свойствами, причем в случае подкожного введения возможно пролонгированное действие ПКС (эффект «депо»).

Ко второй группе относятся растворимые высокомолекулярные фракции ПКС, которые могут быть получены из него с помощью воздействия мощного ультразвука или в результате обработки лизоцимом, как описано в уровне техники. При получении этой группы препаратов зачастую наблюдается невоспроизводимость параметров молекулярно-массового распределения, а также содержания «антенных» и «сшитых» фрагментов в высокомолекулярных продуктах расщепления ПКС, что обусловлено, главным образом, трудностью стандартизации процессов культивирования микроорганизмов, а также тем, что в процессе довольно длительной дезактивации микробных клеток после завершения культивирования возможно действие гидролитических бактериальных ферментов - мурамидаз и амидаз. Это приводит к неконтролируемым вариациям иммунобиологических свойств этих препаратов в довольно широких пределах. Кроме того, при получении высокомолекулярных фракций ПКС ферментативным методом возникает трудноразрешимая проблема удаления больших количеств лизоцима, так как молекулярные массы фермента и образующихся пептидогликановых фракций довольно близки.

Третья группа биологически активных препаратов пептидогликановой природы, наиболее изученная в химическом и иммунобиологическом отношении, представлена низкомолекулярными компонентами (800-2000 дальтон), являющимися конечными продуктами гидролиза ПКС действием лизоцима. В подавляющем большинстве ПКС грамотрицательных микроорганизмов в качестве мажорных обнаруживаются два «антенных» фрагмента - β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглутаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота) (ГМтри) и β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглутаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин).(ГМтетра), а также «сшитый» фрагмент, представляющий собой димер ГМтетра (диГМтетра), в котором связь между мономерными остатками ГМтетра осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка ГМтетра, причем оба тетрапептидных остатка локализованы в разных полисахаридных цепях.

До последнего времени практическое использование этой группы природных низкомолекулярных пептидогликановых производных было осложнено, помимо их недостаточной изученности характера индуцируемых ими эффектов тем, что, с одной стороны, выход этих соединений не позволял рассчитывать на их практическое использование, а с другой, - трудностями в их очистке от пирогенных, токсичных и, возможно, аллергенных примесей (бактериальных ЛПС, белков, нуклеиновых кислот и пр.).

Из известных способов получения биологически активных веществ иммуностимулирующего действия наиболее близким к описываемому изобретению является способ получения биологически активной субстанции из вещества бактериальной природы (US №5185321, A61K 37/18, 1993 г.), включающий приготовление биомассы, выделение ПКС бактерии, расщепление его ферментативным гидролизом с применением лизоцима и выделение фрагментов ПКС в качестве целевого продукта.

Однако известный способ не обеспечивает освобождения реакционной смеси от белков, нуклеиновых кислот и других компонентов бактериальной клетки, которые остаются в целевом продукте. Полученные известным способом фрагменты ПКС наряду с другими бактериальными биополимерами непосредственно добавляют к ряду кисломолочных продуктов, что вызывает при его применении нежелательные эффекты (аллергизация организма, эндотоксические эффекты, в частности пирогенный).

Кроме того, известный способ предполагает использование грамположительных бактерий Lactobacillus bulgaricus, в которых основные полисахаридные антигены грамположительных микроорганизмов - тейхоевые кислоты, присоединены к остатку мурамовой кислоты ПКС прочной ковалентной связью. Поэтому для очистки целевого продукта от тейхоевых кислот (или их фрагментов) требуется их предварительная химическая деградация, что представляет собой значительные технологические трудности на стадии очистки.

В опубликованной недавно работе описан способ получения биологически активного димера β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил D-аланил-D-аланина), выделенного в аналитических количествах из клеточной стенки Salmonella typhi. Однако, нами при анализе ПКС вирулентных и вакцинных штаммов различных родов грамотрицательных микроорганизмов, и в частности, из S. typhi и из бактерий рода Shigella, описанного в данной публикации фрагмента обнаружено не было. Во всех случаях основными (и, зачастую, единственными) компонентами гидролиза КПС лизоцимом были описанные выше ГМтри, ГМтетра и диГМтетра, тогда как пептидогликанового компонента с пятью остатками аминокислот или его димера идентифицировать не удалось.

Наличие нежелательных побочных эффектов, например, индивидуальная чувствительность пациентов к синтезированным препаратам, возможность снижения терапевтического эффекта при длительном применении известных иммуностимуляторов приводит к необходимости направленного поиска новых путей получения новых более эффективных и безопасных комплексов биологически активных веществ для восстановления естественной резистентности и повышения устойчивости к инфекционным агентам.

Сущность изобретения

При сравнительном анализе продуктов обработки ПКС различных грамотрицательных бактерий лизоцимом было установлено, что в большинстве случаев наряду с не подвергшимся солюбилизации ПКС и высомолекулярными продуктами ферментативного расщепления гидролизат обычно содержит растворимые в воде низкомокомолекулярные фрагменты ПКС, обнаружение которых в гидролизате обусловлено очевидно наличием в составе ПКС более или менее обширных участков с высоким содержанием «антенных» (но не «мостиковых») структур. Наличие в составе ПКС обширных областей, не солюбилизируемых лизоцимом, с максимальным содержанием пептидных «мостиков» между полисахаридными цепями, наряду с участками, которые при действии лизоцима расщепляются на растворимые в воде поли- и олигомерные фрагменты, подтверждает обнаруживаемую во многочисленных экспериментах сложность и неоднородность пространственного строения ПКС.

Сущность изобретения состоит в разработке метода выделения из ПКС грамотрицательных бактерий фармакологически приемлемой смеси веществ с иммуностимулирующим эффектом и включающая в качестве действующих веществ три основные компонента - ГМтри, ГМтетра и диГМтетра.

Технический результат изобретения заключается в создании схемы выделения и очистки фрагментов ПКС, включающей минимальное количество стадий (что предполагает существенное снижение количества технологических примесей), каждая из которых обеспечивает одновременное удаление примесных соединений различной природы и выделение целевого препарата высокой степени чистоты, а также в предоставлении указанной выше фармакологически приемлемой смеси веществ.

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения фармакологически приемлемой смеси веществ иммуностимулирующего действия из вещества бактериальной природы включает приготовление бактериальной массы, выделение ПКС бактерии, расщепление нерастворимого ПКС действием лизоцима - фермента специфически расщепляющего гликозидные связи остатков мурамовой кислоты, и хроматографическая очистка фармакологически приемлемой смеси веществ.

Отличие предлагаемого способа, как будет описано ниже, заключается в использовании комбинации и последовательности операций, каждая из которых характеризуется уникальным набором условий их проведения, что приводит к получению продукта с высоким уровнем чистоты и выходом.

Раскрытие изобретения

Способ предполагает использование комбинации стадий выделения фармакологически приемлемой смеси веществ из ПКС, включающей приготовление биомассы, содержащей вещества бактериальной природы, выделение ПКС бактерий, расщепление нерастворимого ПКС препаративным ферментативным гидролизом с применением лизоцима и буферного водного раствора и выделение фармакологически приемлемой смеси веществ, за счет того, что в качестве вещества бактериальной природы применены грамотрицательные бактерии, при этом выделение и очистку ПКС осуществляют экстракцией, расщепление нерастворимого ПКС проводят с одновременным удалением целевых продуктов ферментативного гидролиза диализом с последующей лиофилизацией диализата, при этом в качестве буферного раствора используют буферный водный раствор лиофилизующихся или нелиофилизующихся компонентов при рН 4,5-8,9, для выделения фармакологически приемлемой смеси веществ применяют препаративную колоночную гель-проникающую хроматографию. При этом в одном из вариантов осуществления изобретения экстракцию микробных клеток осуществляют 45%-ным водным фенолом при температуре от 70 до 90ºС.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения экстракцию микробных клеток осуществляют водными растворами ионных и неионных детергентов.

Диализ проводят с применением диализных трубок, в частности с применением полупроницаемых мембран для ультрафильтрации с размером отсечки 1-5 kDa.

Для выделения фармакологически приемлемой смеси веществ применяют колоночную гель-проникающую хроматографию с использованием гелей типа Сефадекс и TSK при элюции буферами, содержащими лиофилизующиеся или нелиофилизующиеся компоненты, причем на этой стадии происходит освобождение фармакологически приемлемой смеси веществ от примесей (1-3%) три- и тетрамерных «сшитых» и/или линейных пептидогликановых фрагментов (данные масс-спектрометрии).

Для осуществления процесса согласно данному изобретению приготавливают биомассу, содержащую вещества бактериальной природы, в качестве которых применены грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriacea (например, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Shigella sonnei) посредством их культивирования в питательной среде, последующего выделения бактериальных клеток центрифугированием или микрофильтрацией и тщательной отмывкой бактериальных клеток от компонентов питательной среды.

При использовании различных бактериальных источников имеется возможность получать фармакологически приемлемую смесь веществ с различным содержанием в них пептидогликановых компонентов - ГМтри, ГМтетра и диГМтетра (обычно заметно отличается соотношение ГМтри и ГМтетра).

Полученная таким образом биомасса, содержащая грамотрицательные бактерии, является источником для дальнейшего получения ПКС. Содержание ПКС в грамотрицательных бактериях хотя и ниже, чем в грамположительных, однако их применение исключает значительные трудности на стадии отделения целевого продукта от тейхоевых кислот (или их фрагментов) - основных полисахаридных антигенов грамположительных микроорганизмов, ковалентно присоединенных к остатку мурамовой кислоты ПКС. При использовании грамотрицательных бактерий стадии предварительной химической обработки не требуется, так как основной полисахарид-содержащий антиген грамотрицательных бактерий - эндотоксичный ЛПС легко элиминируется из внешней мембраны клеточной стенки в результате экстракции, причем на этой же стадии происходит освобождение от белков, нуклеиновых кислот и других нековалентно связанных с ПКС компонентов бактериальной клетки. В качестве экстрагента чаще всего используют 45%-ный водный фенол при температуре от 65-68°С (экстракция по Вестфалю), так как при этой температуре происходит полная гомогенизация смеси фенола и воды. Кроме того, для экстракции бактериальных клеток могут быть использованы водные растворы хаотропных соединений, а также детергентов, обладающих способностью разрушать агрегаты, образующиеся амфифильными полимерными молекулами.

В рамках данного изобретения наиболее эффективно использование 45%-ного водного фенола при температуре, более высокой, чем используется обычно при экстракции ЛПС по Вестфалю, а именно при температуре 70-90ºС, так как в указанном интервале температур помимо полной гомогенизации смеси фенола и воды происходит растворение в этой смеси клеточных стенок и, как следствие, максимальное извлечение из них «посторонних» биополимеров. Так, сравнительный анализ ПКС, полученных по традиционной методике (температура экстракции 65-68^оС) и при более высокой температуре (70-90^оС) показывает, что уровень содержания в них белковых примесей различается в 2-3 раза. При более низком содержании белков в ПКС заметно (10-50%) повышается выход БАФ при действии лизоцима, что очевидно связано с дезэкранированием ПКС в результате удаления объемных белковых биополимеров.

Суспензию ПКС в буферном водном растворе подвергают препаративному ферментативному гидролизу при температуре 10-37^оС с применением эндо-N-ацетилмурамидаз, например лизоцима. Применение лизоцима обусловлено избирательностью расщепления гликозидных связей между остатками мурамовой кислоты и глюкозамина в полисахаридной части ПКС в сочетании с относительно низкой стоимостью, высокой эффективностью и стабильностью в широком диапазоне значений рН и температур.

Одной из главных проблем при проведении препаративного ферментативного гидролиза является замедление реакции по мере увеличения концентрации продуктов гидролиза. Поэтому для повышения выхода и увеличения скорости ферментативного гидролиза ПКС в соответствии с настоящим изобретением расщепление ПКС проводят с одновременным удалением продуктов ферментативного гидролиза диализом. Диализ проводят в течение 1-5 суток при удалении буферного раствора, содержащего продукты гидролиза, и последующем прибавлении свежего диализационного буферного раствора, причем смену буферного раствора проводят 1-3 раза в течение суток.

При проведении диализа в качестве буферного раствора используют лиофилизующийся буферный водный раствор с рН 4,5-8,9, содержащий летучие амины (например, триэтиламин, аммиак, пиридин), а также летучие органические кислоты (например, муравьиную или уксусную), также могут быть использованы буферные растворы на основе нелиофилизующихся компонентов (например, хлорид и фосфаты натрия или ТРИС-НСl); также могут быть применены коммерчески доступные диализные трубки с различным диаметром пор или полупроницаемые мембраны для ультрафильтрации с размером отсечки до 5 kDa. При этом в буферный раствор, против которого проводится диализ, переходят низкомолекулярные продукты ферментативного гидролиза, содержащие в основном фармакологически приемлемую смесь веществ, что приводит к значительному повышению скорости процесса за счет непрерывного удаления продуктов гидролиза из реакционной смеси. Использование полупроницаемых мембран, в частности приспособлений и мембран для ультрафильтрации (как в «тупиковом», так и тангенциальном режиме), позволяет непрерывно разбавлять гидролизат «свежим» буферным раствором и с той же скоростью удалять буферный раствор, содержащий фармакологически приемлемую смесь веществ.

Далее по предлагаемой комбинации стадий объединенные растворы низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза лиофилизуют и остаток либо подвергают повторной лиофилизации (для удаления следовых количеств компонентов буфера), в случае лиофилизующихся диализационных буферов, либо обессоливают с помощью препаративной гель-хроматографии на колонке с сефадексом G10 или TSK-гелем в деионизованной воде.

Предлагаемый комбинированный подход, включающий ферментативный гидролиз с одновременным удалением из реакционной смеси целевого продукта существенно уменьшает время расщепления ПКС и повышает выход фармакологически приемлемой смеси веществ по сравнению с традиционным подходом, в котором стадия гидролиза и выделения его продуктов разделены. Анализ продуктов, оставшихся внутри диализной трубки или в надмембранном пространстве после диализа, показывает, что среди них практически не остается биополимеров пептидогликановой природы. Таким образом, предлагаемая комбинация стадий обеспечивает достаточно полное извлечение целевой фармакологически приемлемой смеси веществ из ПКС.

Выделение фармакологически приемлемой смеси веществ проводят также без использования стадии диализа с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии, в частности, гель-хроматографии с использованием гелей типа Сефадекс (Фармация) при элюции водой или водными буферными растворами, содержащими лиофилизующиеся или нелиофилизующиеся компоненты с последующей повторной лиофилизацией и обессоливанием с помощью гель-хроматографии, как описано выше. На этой стадии происходит также отделение обнаруживаемых в большинстве случаев крахмалоподобных запасных полисахаридов бактерий.

Фармакологически приемлемые смеси веществ, полученные по предлагаемому способу, содержат не более 1% белков и не более 1% нуклеиновых кислот, имеют приемлемый уровень пирогенности в тесте на кроликах и эндотоксичности в лимулус-лизат тесте и не содержат сигналов посторонних соединений в спектрах ЯМР и масс-спектрах.

Таким образом, по предлагаемому способу впервые получены препаративные (граммовые) количества смеси природных нативных фрагментов пептидогликановой природы с иммуностимулирующей активностью, которые образуются главным образом в кишечнике теплокровных и человека из ПКС грамотрицательных бактерий и играют важнейшую роль в поддержании их иммунного статуса. Иммунологический анализ фармакологически приемлемой смеси веществ, выделенных из различных микроорганизмов и резко отличающихся по соотношению входящих в их состав компонентов, показали, что их активности близки. Из этих данных следовало, что в рамках проведенного исследования все компоненты фармакологически приемлемой смеси веществ обладают сходным уровнем иммунологической активности. Результаты химического и физико-химического исследования показали, что фармакологически приемлемая смесь веществ содержит минимальные количества примесей и что, следовательно, предлагаемая технологическая схема позволяет удалить из целевого продукта практически все компоненты, наличие которых могло бы придать фармакологически приемлемой смеси веществ нежелательные свойства.

Предложенный способ может быть реализован в крупномасштабном производстве, т.к. каждая стадия, описанная ниже в приведенных примерах, является адекватной промышленной моделью.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры, приведенные в целях детализации и иллюстрации изобретения, не имеют цели ограничения притязаний настоящего изобретения.

Пример 1

Выделение ПКС

20 г высушенных ацетоном и эфиром (или 120-180 г влажных) бактериальных клеток S.typhi суспендировали при интенсивном перемешивании в 350 мл дистиллированной воде. Полученную суспензию нагревали до температуры 68-70°C и прибавляли 350 мл нагретого до той же температуры 90%-ного водного фенола. Смесь перемешивали в течение 20-30 минут при температуре 65-68°C после чего охлаждали до температуры 10-12°C и центрифугировали в течение 40 мин при 5000 об/мин. Осадок после декантации водного и фенольного слоев подвергали повторной экстракции по той же схеме (возможно 2-3 кратное уменьшение объема экстрагентов). Полученный в результате экстракции осадок промывали 0,2М аммоний-бикарбонатным буфером до отсутствия поглощения при 260-280 нм в УФ-спектре супернатанта (область специфического поглощения нуклеиновых кислот и белков), а затем 2-3 раза водой.

Выход отмытого и лиофильно высушенного осадка, представляющего собой неочищенный ПКС, составлял 20-40% от веса сухих клеток. Аминокислотный анализ показал, что наряду с мономерными компонентами ПКС (мурамовая кислота, глюкозамин, аланин, диаминопимелиновая и глутаминовая кислоты) полученный продукт, как правило, содержит значительное количество связанного белка.

Количество экстракций горячим водным фенолом возможно сократить до одной или увеличить до 3-4, объем экстрагента может уменьшен или увеличен в 1,5-2 раза, при проведении экстракции при температуре более высокой, чем 65-68^оС, время экстракций сокращается до 10-15 минут.

Ферментативный гидролиз ПКС лизоцимом

5 г ПКС суспензировали в 100 мл 0,2М триэтиламмоний-ацетатного буфера рН 7,2. К перемешиваемой при температуре (здесь и далее) 10^оС суспензии прибавляли 300 мг лизоцима и через час перемешивания реакционную смесь переносили в диализную трубку, которую помещали в сосуд с 300 мл описанного выше буфера. Диализ проводили течение 3-х суток, периодически (1-3 раза в сутки) удаляя диализат и добавляя во внешний сосуд свежий буферный раствор. По окончании процесса объединенные диализаты упаривали до объема 200 мл при температуре менее 40^оС, остаток лиофилизовали и далее растворяли в 200 мл деионизованной воды и раствор повторно лиофилизовали. Выход фармакологически приемлемой смеси веществ составил 320 мг.

Выделение и очистка фармакологически приемлемой смеси веществ

Препаративное выделение фармакологически приемлемой смеси веществ проводили с помощью гель-хроматографии на колонке с Сефадексом G-50 в 0,05М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,3. Фармакологически приемлемая смесь веществ элюируется в виде двух, близких по площади пиков, с Kd 0,42 и 0,53, причем с меньшим временем элюируется диГМтетра, а с большим - смесь ГМтри и ГМтетра. Объединенные фракции лиофилизуют и далее повторно лиофилизуют из деионизованной воды. В качестве альтернативы объединенные фракции могут быть подвергнуты обессоливанию на колонке с Сефадексом G-10 (элюент - деионизированная вода).

Анализ гидролизата фармакологически приемлемой смеси веществ (4М НCl, 100°C, 16 час) с помощью аминокислотного анализатора показал, что в его состав входят близкие к эквимолярным количества глюкозамина, мурамовой, глутаминовой и диаминопимелиновой кислот, а также удвоенное количество аланина, что соответствует набору и соотношению компонентов в ПКС S.tyhhi.

Из данных масс-спектрометрии (MALDI-TOF) следовало, что фармакологически приемлемая смесь веществ содержит три компонента - ГМтри, ГМтетра и диГМтетра с мол. массами (рассчитанные значения в скобках) 868,4 (868,8), 939,4 (939,8) и 1860,8 (1861.7), соотвественно.

Анализ спектра 13С-ЯМР позволил подтвердить строение фармакологически приемлемой смеси веществ и отсутствие заметных количеств примесных веществ.

Полученный таким образом препарат в дозе 0,1 мкг/мл не вызывал пирогенного эффекта в тесте на кроликах. Содержание бактериальных эндотоксинов в растворе препарата с концентрацией 100 мкг/мл поданным ЛАЛ-теста не превышало 1,5 ЕЭ/мл. Однократное внутримышечное и внутрибрюшинное введение препарата мышам линии BALB/C и крысам Wistar в диапазоне испытанных доз 1-500 мг/кг не вызывает каких-либо признаков интоксикации и гибели животных. Высшая из испытанных на мышах и крысах доза 500 мг/кг более чем в 300000 раз превышала высшую терапевтическую дозу (100 мкг/человека или 1,5 мкг/кг), рекомендованную для человека.

Используя описанные выше примеры, специалисты в силах провести адекватное масштабирование с целью создания крупномасштабного производства.

Иммуностимулирующая активность мурамилпептидных соединений

Определение иммуностимулирующей активности фармакологически приемлемой смеси веществ проводили в соответствии с «Методическими указаниями по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ» Р.М.Хаитова с соавторами, утвержденных Фармакологическим Государственным Комитетом Министерства Здравоохранения Российской Федерации (В кн. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств. М. 2000. 257-262). В соответствии с этими указаниями исследуемое вещество, являющееся предположительно иммуностимулятором, должно усиливать ряд параметров иммунной системы, среди которых центральное место принадлежит исследованию гуморального иммунного ответа и синтеза фактора некроза опухолей-α (ФНО-α). Эти параметры иммунной системы играют центральную роль в защите организма от инфекции.

При исследовании гуморального иммунитета для сравнения использовали полиакриловую кислоту - ПАК (производство «Петровакс ФАРМ, Россия), стимулирующей у мышей в оптимальных дозах формирование антителообразующих клеток (АОК) в 4-6 раз; при исследовании синтеза ФНО-α для сравнения использовали липополисахарид (ЛПС) E.coli (Sigma, USA), являющийся сильным индуктором этого цитокина.

Пример 2

Оценка гуморального иммунного ответа

В данном примере гуморальный иммунный ответ оценивали по способности образовывать антителообразующие клетки (АОК) в ответ на введение тимусзависимого антигена - эритроцитов барана (ЭБ). АОК определяли методом локального гемолиза в агаре по Ерне и Нордину. Исследование проведено на мышах, самках (СВАхC57Bl/6)F₁ массой 22±0,6 грамма. В каждой группе было по 8-10 мышей.

Препарат разводили физиологическим раствором и в объеме 200 мкл вводили мышам подкожно в холку в дозах 0,01, 0,1 и 1,0 мкг за 3 часа до внутрибрюшинной иммунизации ЭБ в дозе 5х10⁶. Эта доза ЭБ является субоптимальной для развития гуморального иммунного ответа. Контрольным животным вместо препарата вводили физиологический раствор и также иммунизировали их ЭБ. ПАК вводили подкожно в дозе 100 мкг/мышь. На 4 сутки определяли количество АОК в селезенках. Результаты выражали в виде числа АОК на селезенку и в виде индекса стимуляции (ИС) иммунного ответа по сравнению с контрольной группой (Таблица 1).

Таблица 1 Влияние фармакологически приемлемой смеси веществ на гуморальный иммунный ответ АОК/селез. (M+m)
Обработка животных		Фармакологически приемлемая смесь веществ		ПАК
Препарат	Антиген	Абс.	ИМ	Абс.	ИМ
ЗФР	+ ЭБ	343,6±40,8	1,00±0,12	343,6±40,8	1,00±0,12
1 мкг Полимурамил	+ ЭБ	1080,9±167,6	3,15±0,49*	Н.Д.	Н.Д.
10 мкг Полимурамила	+ ЭБ	1141,1±182,7	3,30±0,50*	980±128	2,8±0,65*
100 мкг Полимурамила	+ ЭБ	868,1+190,4	2,51±0,55*	1290±210	3,7±0,9*
*р<0,05

Из представленной таблицы видно, что фармакологически приемлемая смесь веществ обладает выраженной способностью стимулировать гуморальный иммунный ответ. Этот эффект зависит от дозы. Максимальный стимулирующий эффект наблюдается при применении дозы 10 мкг. В дозе 100 мкг/мышь дальнейшего нарастания стимулирующего эффекта не происходит. Стимулирующий эффект фармакологически приемлемой смеси веществ сопоставим с действием классического активатора гуморального иммунитета ПАК и дозе 10 мкг/мышь даже несколько его превосходит.

Пример 3

Оценка синтеза ФНО-α

В данном примере сравнение мурамилпептидных соединений проводили на модели ФНО-α - одного из центральных медиаторов иммунной системы. Для этого мононуклеарные клетки периферической крови 7 здоровых доноров в возрасте 20-40 лет, выделенные стерильно на градиенте фиколл-верографин, плотность 1,077, инкубировали 2 суток в СО₂-инкубаторе в полной культуральной среде, состоящей из среды RPMI-1640 с гентамицином 150 мкг/мл, с 10% инактивированной эмбриональной телячьей сывороткой, 15 мМ глутамина (Sigma). В опытные лунки добавляли фармакологически приемлемую смесь веществ в дозах 100 мкг/мл, 10 мкг/мл и 1 мкг/мл, в контрольные лунки - питательную среду. В качестве сравнения использовали ЛПС энтеробактерий в тех же дозах. Содержание ФНО-α в супернатантах культивированных клеток определяли с использованием твердофазного ИФА с применением коммерческих тест-систем Cytelisa фирмы Cytimmune (USA).

Результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2 Уровень ФНО-α в супернатантах стимулированных мононуклеаров
	Концентрация препарата	ФНО-α
Нестимулируемые клетки	-	47±44
фармакологически приемлемая смесь веществ	0,1 мкг/мл	2±2
	1 мкг/мл	1552±1757
	10 мкг/мл	4269±2422
	100 мкг/мл	8326±1665
ЛПС	0,1 мкг/мл	1504±1092
	1 мкг/мл	2462±1721
	10 мкг/мл	4248±1002
	150 мкг/мл	3559±636

Из представленной таблицы видно, что ЛПС в низких концентрациях существенно превосходит фармакологически приемлемую смесь веществ по способности индуцировать ФНО, но в больших дозах фармакологически приемлемая смесь веществ приближается или несколько превосходит иммуностимулирующий эффект ЛПС.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что фармакологически приемлемая смесь веществ по двум исследованным параметрам иммунной системы обладает выраженными иммуностимулирующими свойствами.

Claims

1. Способ получения фармакологически приемлемой смеси веществ, обладающих иммуностимулирующей активностью, где смесь веществ включает следующие компоненты:
β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота) (ГМтри);
β-N-ацетил-D-глюкозаминил-(1→4)-N-ацетил-D-мурамоил-(L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-D-аланин) (ГМтетра);
и димер ГМтетра (диГМтетра), в котором связь между мономерными остатками ГМтетра осуществляется за счет карбоксильной группы терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ω-аминогруппы мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка ГМтетра, причем связанные между собой тетрапептидные остатки расположены в разных полисахаридных цепях, включающий
a) приготовление биомассы грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriacea,
b) выделение пептидогликана клеточной стенки (ПКС) бактерий в виде не растворимого в воде материала с помощью экстракции указанной биомассы 45% водным фенолом при температуре 70-90°С или экстракцию осуществляют водными растворами ионных или неионных детергентов при температуре 37-100°С,
c) расщепление нерастворимого ПКС препаративным ферментативным гидролизом с применением лизоцима при рН 4,5-8,9 и температуре 10-37°С с одновременным удалением фармакологически приемлемой смеси веществ из реакционной смеси диализом, с применением полупроницаемых мембран для ультрафильтрации, для выделения низкомолекулярных продуктов ферментативного расщепления ПКС;
d) выделение фармакологически приемлемой смеси с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что грамотрицательной бактерией является Salmonella typhi.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что диализ проводят с применением диализных трубок или полупроницаемых мембран для ультрафильтрации с размером отсечки до 5 кДа.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение фармакологически приемлемой смеси веществ проводят с помощью препаративной гель-хроматографии на колонках с Сефадексом или TSK-гелем.