RU1804479C - Способ получени культуральной жидкости SеRRатIа маRсеSсеNS, обладающей хитиназной активностью - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи , касаетс  способа получени  культуральной жидкости Serratia mercescens с хитиназной активностью. Хитиназа (К.Ф. 3. 2.1.4) может быть использована дл  биоконверсии хи- тинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с насекомыми и патогенными грибами, вредител ми сельскохоз йственных растений, как биохимический реагент в лабораторной практике. Сущность изобретени : осуществл ют культивирование мутантного штамма Serratia marcescens ВКПМ В-4870 на среде, содержащей , г/л: цитрат аммони  5,0; глицерин 5,0; К2НРО« 10,0; MgS04«7H20 0.5; NaCI 0,5; FeO/jO,025; кукурузный экстракт 2,5; рН среды 7,6 в течение 24 ч при 30°С с аэрацией. 1 табл. fe

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  получени  ферментов хити- наз, в частности хитиназы Serratia marcescens (К.Ф.3.2.1.4), котора  может быть использована дл  биоконверсии хи- тинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с насекомыми, патогенными грибами и нематодами, вредител ми сельскохоз йственных растений, в качестве биохимического реактива при количественном и качественном определении хитина в составе клеточной стенки грибов и других биологических объектов, дл  разрушени  клеточной стенки грибов.

Целью изобретени   вл етс  повышение активности и упрощение способа.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что мутантный штамм S. marcescens 28-13 (коллекционный номер ВКПМ В-4870) выращиваетс  на водной питательной среде, содержащей в качестве источника углерода - глицерин, источник азота - цитрат аммони . источника фосфора - калий фосфорнокислый двузамещенный, источника витаминов - кукурузный экстракт, а также натрий хлористый, магний сернокислый и железо сернокислое. Культивирование проводили на качалке в течение 24 ч при 30°С.

Пример 1. При постановке опытов используют среду следующего состава, г/л: глицерин 5,0; цитрат аммони  5.0; К2НР04 10,0; MgS04 7H20 0,5; NaCI 0.5: FeS04 0,025;

кукурузный экстракт 15 (по сухой массе). рН среды 7,6.

Подготовка посевного материала. Культуру S. marcescens 28-13 выращивают в течение суток в пробирках со скошенным м сопептонным агаром при 30°С. Выросшие клетки смывают 0,5% физиологическим раствором. Полученный таким образом посевной материал засевают в колбы с питательной средой из расчета 0,05 оптических единиц (Дбзо) на мл среды.

Постановка опыта. Посевной материал засевают в конические колбы с 200 мл питательной среды. Отношение объема питательной среды к объему колбы 1:5. Посевы выращивают на качалке (200 об/мин) при 30 С в течение 72 ч. Пробы отбирают через каждые 24 ч. Бактериальные клетки отдел ют центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определ ют хитиназную активность и содержание белка по методу Лоури.

Определение хитиназной активности. Хитиназную активность определ ют по количеству образующегос  при гидролизе коллоидного хитина Ы-ацетил-О-глюкоза- мина с динитросалициловой кислотой согласно методике (1).

Инкубационна  смесь объемом 1 мл содержит 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,75; 0,4 мл 1,25% коллоидного хитина, 0,1 мл культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют при 50°С в течение 30 мин. Затем пробы разбавл ют в 2 раза дистиллированной водой, негидролизованный хитин отдел ют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 мин, а в надосадочной жидкости определ ют количество N- ацетил-О-глюкозамина. Дл  этого к пробе 1 мл добавл ют равный объем реактива, содержащего динитросалициловую кислоту и нагревают в кип щей вод ной бане в течение 15 мин. Пробы охлаждают и измер ют поглощение при 570 нм. Количество М-аце- тил-О-глюкозамина рассчитывают по калибровочной кривой. За единицу принимают количество фермента, которое при гидролизе коллоидного хитина освобождает 1 мкМ М-ацетил-О-глюкозамина за 1 ч инкубации .

Коллоидный хитин получают согласно известной методике. К 1 г тонко размолотого хитина добавл ют последовательно 5 мл ацетона и 30 мл концентрированной сол ной кислоты при посто нном перемешивании . Полученную однородную смесь фильтруют через стеклоткань так, чтобы фильтрат поступал в колбу, содержащую 1,5 л 30%-ного этанола при посто нном перемешивании . Через 2 ч хлопь  коллоидного хитина отдел ют центрифугированием при 3000 g 30 мин и отмывают от кислоты дистиллированной водой до нейтрального рН.

Коллоидный хитин дополнительно гомогенизируют , диализуют в течение суток против воды и используют в опытах.

Уровень хитиназной активности через 24 ч выращивани  равн лс  117 ед. через 48

ц 122 ед. через 72 ч 123 ед. Таким образом. высокий уровень хитиназной активности в культуральной жидкости достигаетс  на 24 ч культивировани  и практически не увеличиваетс  в процессе дальнейшего выращивани  бактерий в течение 72 ч.

Уровень хитиназной активности, равный 117-127 ед на мл культуральной жидкости , в 2,2 раза превышает хитиназную активность, полученную ранее (прототип).

Сравнительные данные хитиназной активности S. marcescens, полученные различными авторами при использовании разных способов, суммированы в таблице.

Таким образом, предлагаемый нами

способ получени  культуральной жидкости S. marcescens с хитиназной активностью позвол ет на более простой среде, не содержащей хитина, за более короткое врем  ферментации получить вдвое большее количество хитиназы. Штамм 28-13 внедр етс  в производство как высокопродуктивный продуцент эндонуклеазы. Предлагаемый способ получени  культуральной жидкости с хитиназной активностью с использованием штамма 28-13 не требует изменений в технологическом процессе при его внедрении в производство.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  культуральной жидкости Serratia marcescens, обладающей хитиназной активностью, предусматривающий культивирование в услови х аэрации и

   перемешивани  штамма продуцента на водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, витаминов, фосфора и сернокислый магний, отличающий- с   тем, что, с целью повышени  активности

   и упрощени  способа, в качестве продуцента используют штамм Serratia marcescens ВКПМ В-4870, культивирование ведут в течение 24 ч на среде, дополнительно содержащей хлористый натр ий, сернокислое

   железо, в качестве источника углерода - глицерин, источника азота - цитрат аммони , источника фосфора - фосфорнокислый двузамещенный калий и источника витаминов - кукурузный экстракт

   Примечание. М-АГА-М-ацетил-О-глюкозамин.