KR970005249B1

KR970005249B1 - 신규한 단백질 분해효소 및 세제에 있어서의 사용

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Publication number: KR970005249B1
Application number: KR1019890701867A
Authority: KR
Inventors: 알베르터스 게라르더스 반 에켈렌 크리스티안; 요하네스 소피 마리 물레네즈 레오나더스; 코넬리스 반 데르 라안 요하네스; 미세트 오노; 안네크 쿠퍼루스 로엘크; 헤르만 알베르트 렌싱크 요한
Original assignee: 제넨코르 인터내셔널 인코퍼레이티드; 스튜어트 엘. 멜톤
Priority date: 1988-02-11
Filing date: 1989-02-13
Publication date: 1997-04-14
Also published as: AU629814B2; PT89702B; FI105481B; EP0328229B1; EP1160327A2; IE940164L; LV10652A; EP1160327A3; CN1036602A; IE63248B1; ATE250669T1; RU2069695C1; WO1989007642A1; IE890446L; CN1056187C; US5336611A; PT89702A; DE68929484D1; LT3963B; DK175813B1

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

신규한 단백질 분해효소 및 세제에 있어서의 사용

[도면의 간단한 설명]

제1a도는 PB92 단백질 분해효소 유전자가 들어 있는 변이 벡터의 구성을 도시하였다.

제1b도는 사용된 변이순서를 도식적으로 도시하였다.

제1c도는 변이체 PB92 단백질 분해효소 유전자가 들어 있는 발현벡터의 구성을 도시한 것이다.

제2a,2b 및 제3도는 상이한 세척조건에서 다양한 PB92 단백질 분해효소 변이체의 세척능력 대 특이적 단백질 분해효소활성을 도시하였다.

제4도는 PB92 단백질 분해효소 유전자의 핵산서열 및 코드화 전구(precursor) 효소의 아미노산 서열을 도시하였다.

[발명의 상세한 설명]

[서론]

[기술분야]

본 발명은 세제에 사용하기 위하여 특성이 개선된 신규한 단백질 분해효소에 관한 것이다.

이러한 특성으로는 세탁용 세제의 세척조성물에 있어서의 개선된 얼룩제거능력, 저장에 있어서 세탁용 세제내에서의 개선된 안정성 및 세제로부터 생겨나는 거품에 있어서의 개선된 안정성이 있다.

[발명의 배경]

단백질을 기초로 하는 오염원을 제거할 수 있는 특별한 단백질 분해효소, 즉 세제조성물에 있어서 효소첨가물의 사용이 널리 알려져 왔다.

예를들어보면 공개유럽 특허출원(EP-A) 제0220921호 및 제0232269호, 미국 특허 제4,480,037호 및 재특허 제30,602호 및 논문 미생물에 의한 효소의 생산 Microbial Technology, Vol. 1(1979)281-311 Academic Press가 있다.

세제조성물은 세제활성물질로서 한가지 또는 그 이상의 음이온성, 비이온성, 양이온성, 쯔비터이온(zwitterion)성, 또는 양쪽성 이온성 화합물을 함유한다.

이러한 화합물은 Schwartz, Perry 및 Berch에 의해 표면활성제 Vo1. II Interscience Publishers(1958)에 충분히 개시되어 있다.

또한 이 화합물에는 봉쇄제(Sequestering agent), 안정화합물, 방향성 화합물 및 어떤 경우에는 보통 표백제라고 불리우는 산화제가 포함될 수 있다.

세제조정물은 단단한 표면의 세척, 화장실청소, 접시세척(자동 또는 수동) 및 세탁물 세탁에 사용된다.

세탁용 세제는 대개 크게 액체 및 분말의 2가지 유형으로 나뉘어진다. 액체 세탁용 세제에는 보통의 알칼리성 pH에 대하여 중성인 고농도의 표면활성제가 들어 있으며 표백제는 대개 함유되어 있지 않다.

분말세제는 나트륨 트리폴리인산염과 같은 봉쇄제를 사용하기 때문에 대개 높은 알칼리성(거품 pH9-11)이고 세제가 시판되는 나라의 세탁 습관에 따라 표백제를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다.

현재 세제조성물에 사용되는 효소는 액체현탁액, 졸(Sol), 또는 과립상의 형태로 첨가된다.

예를들어 분말세제내에서 단백질 분해효소는 대개 프릴(prill)(예를들어 Maxatase^R및 Maxacal^R) 또는 과립(예를들어 Savinase^R또는 Alcalase^R)과 같은 캡슐화된 형태로 존재한다.

Maxatase 및 Mawxacal은 International Bio-Systhetics B.V.(Rijswijk, 네덜란드)에서 시판하고 Savinase 및 Alcalse는 NOVO Industri A/S(Bagsvaerd, 덴마아크)에서 시판한다.

액체 섹탁세제에 있어서 효소는 대개 용액형태로 존재한다.

단백질 분해효소는 일반적으로 세제조성물과 결합되기 어렵다.

이 효소는 사용되는 동안, 예를들어 온도범위 약 10℃ 내지 60℃ 이상에서 세탁하는 동안에 직물로부터 단백질성 얼룩을 제거하는데 있어서 안정하고 활성이 있어야 한다.

또한 이 효소는 세제 생산물내에 저장되는 긴 시간동안에 안정해야만 한다.

따라서 효소는 봉쇄제, 표면활성제, 고알칼리성의 존재하에서, 어떤 경우에는 표백제 존재하에서 및 고온에서 안정하고 기능적이어야 한다. 전세계에 걸쳐 사용되는 보편적인 세탁용 세제가 있지도 않고 보편적 세탁조건(pH, 온도, 거품-농도, 물의 경도)이 있는 것도 아니기 때문에 세제의 용도와 세탁조건에 따라 효소에 대한 요구사항은 다양하다.

분말세제에 있어서 효소의 안정성을 지배하는 조건은 대개 최적의 조건이 아니다. 예를들어 분말세제내에 효소 제조물이 저장되어 있는 동안에, 효소가 캡슐화됨으로써 효소가 세제 매트릭스로부터 물리적으로는 명백하게 분리되어 있음에도 불구하고 세제의 산화제가 단백질 분해효소에 영향을 미치고 효소의 활성을 감소시키다.

보관되는 동안에 분말세제내에 있는 효소가 불안정한 다른 경우는 특히 습도가 높을때의 자가분해이다.

또한, 종종 분말세제내에 들어 있는 산화제는 세탁물을 세척하는 동안에 단백질성 얼룩을 직물에 고착시킴으로써 얼룩제거 효과에 대해 중대한 결점을 가지게 된다.

또한 이러한 산화제 및 봉쇄제와 같은 세제조성물은 세탁이 진행되는 동안에 얼룩을 제거하는데 있어서 단백질 분해효소의 효능을 감소시킨다.

액체세제에 있어서 중대한 문제점은 특히 고온에서 효소의 급격한 불활성화이다. 세제내에서 효소는 용액내에 존재하기 때문에 보통의 저장 조건에서는 저장하는 동안 세제내에서 이미 불활성화가 일어나서 실제로 세제를 사용하기 전에 효소의 활성이 감소된다. 예를들어 알킬황산염과 같은 특별한 음이온성 표면활성제는 물 및 증강제와 조합되면 효소를 비가역적으로 변성시키고 효소를 불활성화시키거나 단백질 분해성의 감소에 민감하게 한다.

액체세제내의 효소의 관계된 안정성 문제에 대해 예를들어 효소의 불활성화를 감소시키는 안정화제를 사용하는 것과 같이 액체세제 제조를 변화시킴으로써 부분적인 해결이 이루어졌다.

EP-A0-126505호 및 EP-A-01994905, 미국 특허 제4,318,818호 및 영국 특허출원 제2178055A호를 참조하기로 한다.

액체세제내에서 효소의 안정성을 확고히 하기 위한 또다른 접근방법이 제EP-A-0238216호에 개시되어 있는데, 여기에서는 제조기술에 의해 효소분자 및 이것과 상대되는 액체세제매트릭스 사이의 물리적 격리가 이루어졌다. EP-A-0170360에서는 분말세제에 있어서 캡슐화 형태로 교체할 것이 제안되었다.

세제조성물로 사용하기에 실제로 유용한 효소의 한계점과 단백질 분해효소가 최적의 기능을 발휘하기 위해 필요로 하는 조건을 앞에서 요약하였다.

세제조성물내에서 효소의 안정성을 확고히 하려는 노력에도 불구하고 보통의 보관 및 사용조건에서는 실질적으로 여전히 활성손실이 일어나고 있다.

예를들어 세제에 사용되는 것과 같이 용도가 정해진 새로운 효소에 대한 확인 및 분리가 몇가지 방법으로 수행되었다.

한가지 방법은 원하는 효소적 활성을 나타내는 유기체나 미생물을 선발하고, (미)생물로부터 또는 상기(미)생물의 배양 상층액으로부터 효소를 분리 및 정제하고, 효소의 생화학적 특성을 결정하여 이 생화학적 특성이 사용의 요구조건에 합당한 것인가를 점검하는 것이다.

만일 확인된 효소가 자연적으로 유기체로부터 형성되어지는 것이 아니라면 DNA 재조합 기술을 사용하여 효소를 코드화하는 유전자를 분리하고 다른 유기체내에서 유전자를 발현시켜서 발현된 효소를 분리 및 정제한 다음 그 효소가 의도하는 용도에 적합한지의 여부를 시험하도록 한다.

용도가 정해진 신규한 효소를 얻는 또다른 방법은 기존의 효소를 변형하는 것이다. 이 방법은 특히 화학적 변형법(I. Svendsen, Carlsberg Res. Connun.44(1976),237-291)에 의해 달성될 수 있다.

일반적으로 , 효소분자가 밝혀지지 않는 한 이러한 방법은 너무 불특정적이므로 보통의 곁사슬에 있는 접근 가능한 모든 잔기들을 변형시켜 버리거나 변형시킨 적당한 아미노산의 존재에 의존하게 되고 접근하기 어려운 아미노산을 변형시킬 수 없는 경우도 있다. 그러므로 코드화 유전자의 변이를 거치는 효소 변형법은 탁월하다고 생각된다.

변이는 임의의 변이유발에 의해서 또는 부위가 정해진 변이유발에 의해 이루어질 수 있다. 물론 임의의 변이유발은 미생물 전체를 화학적 변이원으로 처리하거나 변이를 유발하는 방사선으로 처리함으로써 효소변이를 초래할 수 있다.

이런 경우에 원하는 특성을 가진 매우 희귀한 변이체를 찾아내기 위해서는 효과적인 선별 프로토콜(protocol)을 사용해야 한다.

코드화 유전자를 클론한 후, 유전자를 실험실에서나 생체내에서 변이시키고, 변이된 유전자를 적당한 숙주 세포내에서 다시 클론하여 효소를 코드화하면 임의적 변이유발에 의해 효소를 단리해낼 수 있는 가능성이 높아질 수 있다.

또한 이런 경우에, 원하는 효소변이체를 선별해내기 위해서는 적당한 생물학적 선별프로토콜을 사용해야 하는데, 국제 특허출원 WO87/05050호를 참조하기로 한다.

이러한 생물학적 선별 프로토콜로는 세제에 사용하기에 적합한 효소를 특이적으로 선별해낼 수 없다.

변형된 효소를 얻는 가장 바람직한 방법은 위치가 정해진 변이유발이며, 이 방법에 의해서 한 개 또는 그 이상의 아미노산을 다른 목적 아미노산으로 치환할 수 있다.

EP-A-0130756호에서는 변형된 단백질 분해효소를 산출하도록 발현되는 단백질 분해효소 유전자의 변이체를 생성시키기 위한 상기 기술의 사용을 예시하고 있다.

최근 표적 서열내의 몇개 위치에 염기혼합물을 함유하도록 합성된 올리고뉴클레오티드 변이원을 사용함으로써 위치-지정 변이를 중개하는 올리고뉴클레오티드의 포텐셜이 증명되었다.

이 사실에 의해, Hui 등, EMBP J.3(1984) 623-629, Matteucci 등, Nucl. Acids Res.11 3113-3121, Murphy 등. Nucl. Acids Res 11(1983) 7695-7700, Wells 등, Gen 34(1985) 315-323, Hutchinson등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(1986) 및 F.M Ausubel, Current Protocolsin Molecular Biology 1987-1988, Greene Publishers Association 및 Wiley, Interscience, 1987에 예시된 바와같은 단일합성 올리고뉴클레오티드 제조물을 사용하여 DNA 서열의 특이적 부분에 다수의 상이한 변이를 일으킬 수 있게 된다.

Strauffer 등, J.Biol. Chem. 244(1969)5333-5338은 Carlsberg Subti-lisin 내의 221위치의 메티오닌의 H₂O₂로 산화되어 메티오닌 황화물이 되고 활성이 현격하게 감소된다는 것을 이미 발견하였다.

변형된 효소를 산출하기 위한 임의적 및 위치-지정 변이유발 방법 두가지 모두의 결과로서, 섭틸리신(subtilisin BPN')이라고 불리우는 바실루스아밀로리퀴팩신스(Bacillus amyloliquefacins)의 세린 단백질 분해효소에서 유래된 변이체를 단리 및 성격을 규정하였다.

W087/05050호에는 열적 안정성이 증강된 변이체 섭틸리신 BPN'이 개시되어 있다.

EP-A-0130756호에는 소위 카세트 변이유발법을 사용하여 섭틸리신 BPN'내의 222위치에 메티오닌을 가능한 19가지 아미노산 모두로 위치-지정 돌연변이시키면 H₂O₂에 의한 산화반응에 대하여 내성이 있는 효소로 될 수 있다는 것이 개시되어 있다.

그러나 후자의 경우에 있어서, 대부분의 변이체는 단백질 분해활성이 낮다. 가장 우수한 변이체는 M222A 및 M222S였는데 이것들의 특이적 활성은 자연상태의 섭틸리신 BPN'에 비해 각각 53% 및 35%였다(Estell 등, J. Biol. Chem. 260(1985) 6518-6521참조).

변형된 단백질 분해효소 생산에 관한 종래 기술에서는 안정성이 변화되고 활성이 변화된 섭틸리신 BPN' 변이체를 얻을 수 있는데, 상기 사항 또는 다른 참고사항을 다룬 것으로는 다음과 같은 것들이 있다; 예를들어 R₉₀등, Nature 328(1987) 551-554, Bryan 등, Proteins 1(1986, 326-334, Cunningham 및 Wells, Protein Engineering 1(1987) 319-325, Russel 등, J. Mol. Biol. 193(1987) 803-819, Katz, 및 Kossiakoff, J. Biol. Chem.261(1986) 15480-15485, 및 Gait, 등, Protein Engineering 1(1987) 267-274.

그러나 이러한 참고사항중에서 세탁세제내에서 개선된 세척능력이 있거나, 세척능력 및 안정성이 있는 단백질 분해효소의 공업적 생산을 제공하는 바는 전혀 없다. 상업적으로 매우 가치가 있으며, 적절한 사용조건에서 현재 사용되는 세제효소보다 탁월한 변형된 단백질 효소는 아직 제시되지 않았다.

본 발명에 대한 요약

본 발명의 목적은 상응하는 원형(wild-type) 효소와는 최소한 한 개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 가지는 상기 효소를 코드화하는 유전자를 발현시켜 얻어진 신규한 변이체 단백질 분해효소를 제공하는 것이다. 이러한 변이효소는 세제, 특히 세탁용 세제에 적용시키기 위한 개선된 특성을 보인다. 본 발명의 바람직한 실시는 PB92 세린 단백질 분해효소에 의해 이루어진다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 효소세제를 제공하는 것이며, 이 세제는 최소한 한 개의 신규한 변이체 단백질 분해효소를 함유하고 있다. 본 발명의 더욱 확장된 목적은 수십가지 효소들중에서 세탁용 세제내에서 적용하기 적합한 개선된 성질이 있는 변이체 단백질 분해효소를 효과적으로 선별할 수 있게 해주는 시험체계를 제공하는 것이다. 이러한 효소는 변이가 유발된 단백질 분해효소 유전자의 발현에 의해 제조된다. 본 발명의 여러 가지 목적은 이하의 상세한 설명에서 더욱 분명해질 것이다.

[본 발명에 대한 상세한 설명]

변이체 단백질 분해효소와 관련되어 본 명세서에 사용된 개선된 성질이 있는이라는 어구를 사용함으로써, 본 발명자는 단백질 분해효소가 개선된 세척능력을 유지하면서도 상당하는 원-형단백질 분해효소에 비해 개선된 안정성이 있다는 것을 나타내고자 한다.

본 명세서에서 변이체 단백질 분해효소의 세척능력이라는 어구는 관련된 세척조건에서 효소가 없는 세제조성물의 효과뿐만 아니라 세탁물 세척에 대한 변이체 단백질 분해효소의 기여도로서 정의된다.

관련된 세척조건이라는 어구는 구체적으로 세척온도, 시간, 세탁기, 거품농도, 실제로 세제시장에서와 가사에 사용되는 세제의 유형 및 물의 경도를 의미하는 것으로 사용되었다.

개선된 세척능력이라는 어구는 관련된 세척조건에서 더욱 향상된 결과를 얻게 되거나, 중량을 기초로 했을때 상당하는 원-형 효소에 비해 적은 양의 변이체 단백질 분해효소로 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것을 가리키도록 사용되었다.

유지된 세척능력이라는 어구는, 중량을 기초로 했을때 변이체 단백질 분해효소의 세척능력은 관련된 세척조건에서 상당하는 원-형 단백질 분해효소에 비해 적어도 80%라는 것을 가리키도록 사용되었다.

개선된 안정성이라는 어구는 저장하는 동안에 세탁용 세제내에 있는 변이체 단백질 분해효소의 향상된 안정성 및 또는 거품액 속에서의 안정성을 가리키는 것으로 사용되었으며 여기에는 산화제, 봉쇄제, 자가분해, 표면활성제 및 상당하는 원-형 효소에 비해 높은 알칼리성에 대한 안정성이 포함된다.

바람직하게 규정된 실험조건에서 결정된 생화학적 성질은 바라는대로의 조건 및 특별한 사용조건에서 구체적인 세제 단백질 분해효소의 효능을 예상하기 위한 확실한 한정요소는 아니다.

이러한 한정효소로는 카세인, 디메틸케세인 및 헤모글로빈 또는 SAAPFpNA(succinyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenyl-alanyl-paranitroanilide)와 같은 치환된 올리고펩티드 기질이 있다.

단백질 분해효소의 외견상의 다른 특징은 세탁물을 세척하는데 있어서 효소의 효과를 결정짓는다.

본 발명은 단백질내에 아미노산을 변화시켜서 단백질의 생화학적 특성에 중대한 변화를 일으킬 수 있는 방법을 사용하더라도 실제 사용조건에서 특이적 돌연변이의 효과를 예상하기가 매우 어렵거나 심지어는 불가능하다는 점을 기초로 한다.

본 발명에 따라 광범위한 연구와 실험을 거친 후에 프로테아제의 효능에 관하여 효과적인 선별과정을 거쳐 변이체 프로테아제를 제조하는 방법이 발견되었다.

놀랍게도 이 방법으로는 비교적 다수의 효소를 효과적으로 선별해낼 수 있었다.

본 발명에 따르는 시험체계는 적절한 세척조건을 갖추고 라운더오미터(launder-ometer) 또는 터고트오미터(tergot-ometer) 내에서 시험직물로부터 프로테아제에 민감한 얼룩을 제거하는 것을 기초로 한다. 적당한 시험직물은 예를들어 시판중인 EMPA(Eidgenossosche Material Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, 스위스) 직물을 인위적으로 단백질성 물질로 오염시킨 것을 사용하였다.

프로테아제를 시험하기 위한 직물상의 적당한 오염물질은 피, 풀, 쵸코렛 얼룩, 및 다른 단백질성 얼룩들이었다.

또한 이러한 체계에 있어서 예를들어 세제조성물, 거품액의 농도, 물의 경도, 세척방법, pH 및 온도와 같은 다른 관련인자들은 판로에 있어서 가정용으로서 사용하기 위한 전형적인 조건을 모방하는 방법으로 조절될 수 있다.

프로테아제의 세척능력은 종래에는 적절한 시험조건에서 어떤 전형적인 얼룩을 제거하는 능력으로 측정되었다.

이러한 능력은 라운더오미터 또는 터고트오미터내에서 효소의 존재 및 부재상태에서 세척한 후에 시험직물에 대하여 반사율을 측정함으로써 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 실험실 사용 시험체계는 DNA 변이유발에 의해 변형된 단백질 분해효소에 대하여 사용되었을때 가정용에 관하여 전형적인 것이다.

따라서, 본 발명은 다량의 상이한 효소들을 시험할 수 있도록 하고 특이한 유형의 세제사용에 특히 적합한 효소의 선발을 가능하게 하였다.

이 방법으로는 특수한 사용조건에 대한 기성 효소를 쉽게 선별해낼 수 있다.

몇가지 세균의 세린 프로테아제를 섭틸리신으로서 인용하였다.

섭틸리신은 바실루스 섭틸리신(Bacillus subtilis), 바실루스 아밀로리퀴팩신(섭틸리신 BPN') 및 바실루스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)(섭틸리신 칼스버그(Carlsberg))로 이루어져 있다.

The Enzymes(Boyer, ed.) Vol. 3, 561-608 Academic Press, New York에 있는 Markland와 Smith의 평론(1971)을 참조하였다.

친알칼리성 바실루스 주(strain)와 같은 바실루스 주는 다른 프로테아제를 생성한다.

후자의 범주에 속하는 실례로서는 이후에 PB92 프로테아제(바실루스 nov. spec. PPB92로부터의)로 불리는 막사칼(Maxacal)내의 세린 프로테아제, 및 이전에 언급했던 사비나제(Savinase)가 있다.

PB92 프로테아제의 아미노산 서열은 제4도에 도시되어 있다.

완성된 프로테아제는 분자량이 약 27000D인 269개의 아미노산으로 구성되어 있고 높은 알칼리성 범위에 등전위점이 있다.

PB92 프로테아제의 단백질 기질에 대한 활성은 알칼리성 델프트단위(Alkaline Delft Unit, ADU)로 나타내어진다.

ADU로 표현된 활성은 pH가 8.5 내지 10.000으로 변화된 것을 제외하고는 영국 특허 명세서 제1,353,317호에 개시된 방법에 따라 결정된다. 정제된 PB92 프로테아제는 mg당 활성이 21,000ADU이다.

카세인에 대하여 측정된 전환수(Kcat)는 90sec^-1이다.

정제된 섭틸리신 칼스버그(Delange 및 Smith, J. Biol. Chem. 243(1968)2184) 제조물의 특이적 활성은 10,000ADU/mg이고 섭틸리신 BPN'(Matsubara 등, J. Biol, Chem. 240(1965) 1125)의 특이적 활성은 7,000ADU/mg에 이른다.

특이적 활성 및 전환수(Kcat)와 같은 상기 매개변수 이외에도 PB92 프로테아제는 높은 양성전하를 가진다는 점에서 칼스버그 섭틸리신, 섭틸리신 BPN' 및 세제내에 조제되어 있는 다른 프로테아제(예를들어 막사타제(Maxatase) 및 알칼라제(Alcalase)와 구별되며 이후의 실시예 4에 개시된 바와같이 천연단백질의 겔-전기영동에 의해 명시화될 수 있다.

PB92 프로테아제는 알칼리성 pH 값에서 얼룩을 제거하는데 있어서 활성이기 때문에 일반적으로표면활성제, 증진제 및 산화제와 같은 세제성분과 함께 세제첨가물로서 사용된다.

이러한 세제성분중의 작용제들은 대개 분말형태로 사용된다.

PB92 프로테아제는 상기 섭틸리신과 같은 다른 프로테아제에 비해 얼룩제거효율이 높다. 이러한 사실은 더 적은 양의 PB92 프로테아제로 동일한 세탁능을 얻을 수 있다는 것을 의미한다.

산화작용에 대한 감도는 PB92 프로테아제 및 세제내에 적용시키기 위해 사용되도록 공지된 다른 모든 세린 프로테아제(Stauffer 등, J. Biol. Chem. 244(1969)5333-5338 ; Estell 등, J. Biol. Chem. 263(1985) 6518-6521 참조)의 결점이다.

과붕산염-4 수산화물 및 TEAD를 함유하고 활성화제 체계에 의해 생성되는 과산류(peracids) 또는 H₂O₂에 의한 PB92 프로테아제가 산화되면 효소는 비-산화 PB92 프로테아제에 비해 특이적 활성이 AUD/mg으로 각각 50% 및 10%가 된다(실험섹션 7 및 실시예 1 참조).

본 발명에 따른 방법은 원래 생성되어 있는 박테리아의 세린 프로테아제에서 유래된 변이체 단백질 분해 효소를 제조, 선발 및 선택하기에 매우 적합하다.

이러한 변이체로서는 예를들어 친알칼리성 바실루스 주 및 PB92의 원형 유전자로부터 유래된 유전자에 의해 코드화된 것이 바람직하다. 또한 친알칼리성 바실루스 세린 프로테아제 사비나제에서 유래된 변이체도 적합하다. 또한 이러한 방법은 친알칼리성 바실루스 주 PB92로부터의 세린 프로테아제와는 다른 프로테아제로부터 유래된 변형 프로테아제를 선택하기 위해 사용하기에 유리하다.

예를들어 변이유발의 표적으로서는 바실루스 섭틸리신, 바실루스 아밀루리퀴팩신스 및 바실루스 리케니포미스(Bacilus licheni formis)의 세린 프로테아제를 코드와하는 유전자를 사용할 수 있다.

올리고뉴클레오티드가 가해진 위치가 지정된 변이유발 또는 영역이 지정된 임의 변이유발을 사용하거나 프로테아제에 유전자에 있어서 효과적으로 변이를 일으키는 다른 적합한 방법을 사용할 수 있다는 것은 명백하다.

본 발명에 따라 변이체 단백질 분해효소를 선택하는 방법(제조 및 선발과정을 포함한다)은 다음의 단계로 이루어진다; 목적으로 하는 단백질 분해효소 또는 이것의 단편을 코드화하는 클론된 유전자에 변이를 일으키는 단계; 얻어진 변이체 프로테아제 유전자 또는 유전자들을 단리하는 단계; 상기 변이체 프로테아제 유전자 또는 유전자들을 바람직하게 적당한 벡터에 삽입하여 발현 및 제조하기 위한 적합한 숙주안으로 도입하는 단계; 생성된 변이체 프로테아제를 회수하는 단계; 및 세제내에 적용하기 위한 개선된 특성이 있는 변이체 프로테아제를 확인하는 단계.

변이체 프로테아제를 제조하기 위한 적합한 숙주는 프로테아제의 발현을 시킬 수 있는 형질전환이 가능한 미생물이다.

구체적으로는 프로테아제가 제조되는 숙주로는 동일 종 또는 동일 속이 적합하고 예를들어 바실루스 주, 바람직하게는 친알칼리성 바실루스 주, 가장 바람직하게는 바실루스 nov.spec. PB92 또는 이것과 실질적으로 특성이 같은 변이체를 들 수 있다. 또한 바실루스 섭틸리신, 바실루스 리케니포미스 및 바실루스 아밀로리퀴팩신주도 바람직한 균주이다. 또다른 적합한 숙주로서는 실질적으로 변이체 유전자에 의한 형질전환보다 우선적으로 세포외 단백질 분해효소를 제조할 수 없는 균주들이 바람직하다. 예를들어 nov.spec. PB92의 프로테아제 결핍 유도체와 같은 프로테아제 결핍 바실루스 숙주가 특별히 바람직하다.

프로테아제는 선택된 숙주 유기체내에서 작용하는 발현표지를 사용하여 발현된다. 발현표지는 프로테아제 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 N DNA 서열이다.

알맞은 벡터는 선택된 숙주내에서 충분히 높은 복사수로 복제될 수 있고 염색체 통합에 의해 숙주내에서 프로테아제 유전자를 안정하게 유지할 수 있다.

본 발명에 따른 변이체 단백질 분해효소는 목적 변이체 단백질 분해유전자 또는 유전자들로 이루어지는 형질전환된 숙주를 적절한 발효조건에서 배양하고 생성된 효소를 회수함으로써 제조될 수 있다.

발현된 프로테아제는 바람직하게 프로테아제의 회수를 촉진하는 배양 배지안으로 분비되거나 그람음성 박테리아 숙주의 경우에 있어서는 외질(periplasma) 공간으로 분비된다.

아미노-말단 표지서열이 사용되므로, 만일 이 서열이 선택 숙주내에서 작용하면 표지서열은 원래의 유전자에 의해서 바람직하게 코드화된다.

본 발명의 견해에 따르면 가정에서의 세탁조건에 해당되는 적합한 세탁능 시험을 개발할 수 있다.

예를들어 강력 유럽 분말세제에 대하여 적합한 시험을 개발하였는데, 여기에서는 표백제가 함유되거나 함유되지 않은 분말조립 세제를 10-20°GH(German Hardness)에서 거품액 농도 세제 1-10g/l로 25-80℃ 사이의 온도에서 사용하였다.

더욱 상세하게는 온도가 40℃이고 거품액 농도가 15°GH에서 세제 4.7 또는 10g/l인, TEAD 및 과붕산염을 함유하는 분말조립세제를 사용하였다. 또한 액체세탁세제에 대한 시험이 제공되었다. 15~40℃의 온도에서 5-15°GH일때 거품액의 농도가 세제 1.5-5g/l 범위인 상기 세제는 상업적으로 사용되었다.

더욱 상세하게는, 미국 액체세제조건을 나타내는 25℃ 및 40℃에서 5°GH일때의 거품액 농도가 세제 1.5g/l일때, 및 유럽 액체 세제조건을 나타내는 40℃에서 15°GH일때의 거품액 농도가 세제 5g/l일때의 비표백액체세제 조성물을 사용하였다.

세제가 사용될 다른 조건에 대해서도 적당한 효능 분석을 실행할 수 있다. 프로테아제에 대하여 민감한 얼룩으로 오염된 시험 직물, 구체적으로는 피, 풀, 쵸코렛 얼룩 및 다른 단백질성 얼룩으로 오염된 직물, 더욱 상세하게는 EMPA 시험직물 116 및 117을 세척능 비교시험에 사용하였다.

효소내 다양한 변이를 일으킴으로써 자연발생 또는 자연 변이된 세제 프로테아제의 특성이 증강될 수 있었다.

대부분의 경우에 보호적이거나 비보호적이거나간에 변이는 치환이었다. 또한 결실 및 삽입도 사용되었음을 발견할 수 있었다.

보호적 치환에 대하여 다음의 표가 사용되었다.

지방족

즉, 극성 아미노산 N,Q는 대전성 아미노산을 치환하거나 이것에 의해 치환될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는, 프로테아제의 양이온성이 증가되었고 구체적으로 활성부위에 치환위치가 포함되어 있지 않은 치환물이 특별히 바람직히다.

변이를 위해 특히 바람직한 영역은 만일 에글린(Eglin) C가 활성부위에 결합되었을 경우에 억제제 분자인 에글린 C로부터 4Å 거리 이내의 아미노산 영역이다.

다음의 번호매김은 PB92 프로테아제를 기초로 한 것이지만 실질적으로 여기에 있는 아무 아미노산이라도 같은 종류의, 구체적으로는 같은 선상에 있는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.

바람직하게는 약 70% 이상이 상동구조이고 더욱 바람직하게는 약 90% 이상이 상동구조인 다른 세린 프로테아제에 관해서도 고려할 수 있다.

이러한 위치는 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198, 203-216이며 이 위치들 대부분은 단백질성 기질과 직접 상호작용할 수 있다.

이러한 부위에서 변이가 일어나면 세탁능이 떨어지는 경향이 있기 때문에 대개 32, 62, 153 및 215위치는 치환되지 않는다.

구체적으로 바람직한 치환위치는 60, 62, 94, 97-102, 105, 116, 123-128, 150, 152, 153, 160, 183, 203, 211, 212 및 213-216이다.

어떤 위치에 있어서는 일반적 구조와 그 위치에 있어서의 아미노산 부피를 유지하면서도 불안정한 아미노산을 교환하려는 경향이 있는데 예를들어 메티오닌은 산화적으로 더욱 안정한 아미노산, 예컨대 트레오닌으로 교환된다. 다른 경우에 있어서는 중성 아미노산을 거의 모든 다른 아미노산으로 교체함으로써, 구체적으로는 히드록실화 아미노산, S, T를 극성 또는 비극성 아미노산으로, 심지어는 방향성 아미노산으로 교체함으로써 개선된 결과를 얻을 수 있다.

바람직한 치환은 다음과 같다;

G116 I,V,L

S216 모든 아미노산

P127

S128

S160 음이온성 또는 중성지방족 또는 R

S166 대전성, 구체적으로는 음이온성

M169 중성지방족, 구체적으로는 비-극성

N212 음이온성

M216 극성지방족, 구체적으로는 S,T,N,Q

변이가 일어나면 많은 경우에 보통의 기질에 대한 프로테아제의 특이적 활성이 저하되는 반면, 중성효소의 경우에 있어서 세탁능은 비슷하거나 증강되고 많은 경우에 저장안정성이 개선되었다.

원래의 프로테아제를 X100%로 하여 이것과 동일한 효과를 얻기 위해 필요한 효소의 상대량의 역수만큼 PB92 변이체 프로테아제의 세척능이 발현된 경우 이 세척능은 120% 이상, 심지어 어떤 경우에는 180% 이상으로 증가되었다.

본 발명의 다른 견해에 따르면, 표백제를 함유하는 분말세제 조성물내에서 원래의 PB92 프로테아제보다 저장안정성이 개선되고 세탁능을 유지하는 BP92 프로테아제 변이체를 제공할 수 있다.

이러한 변이체의 실례로서는 M216S와 M216Q 및 다른 부위의 변이 이외에도 이 변이가 최소한 한 개 있는 변이체들이 있다.

본 발명의 또다른 견해에 따르면, 놀랍게도 액체세탁세제 조성물(산화제가 포함되지 않은) 내에서 변이체 PB92 프로테아제 M216S, MS16Q, S160D 및 N212D는 PB92 프로테아제 보다 양호하게 활성을 유지한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 변이체중에서 M216S 및 M216Q는 세탁능을 보유하였고 S160D 및 N212D는 세탁능이 개선되었다.

시험액체세제의 저장안정성 개선은 S160D 및 M216Q 변이체에 있어서 가장 현저하다.

또한 세제조성물 내에 있는 프로테아제의 안정성을 증가시키는 몇가지 변이를 결합시키는 것도 가능하다. 동일한 프로테아제의 세척능에 양성의 영향을 미치는 몇가지 변이를 이것보다 훨씬 더 개선된 프로테아제, 예를들어[S126M,P127A,S128G,S160D] 및 [G116V,S126N,P127S,S128A,S160D]를 제조할 수 있는 단일 변이체 프로테아제 유전자에 적용시킬 수 있다.

예를들어 N212D 및 S160D의 양호한 세척능 특성을, 예를들어 M216S 또는 M216Q의 안정성 특성과 결합시켜서 새로운 프로테아제 변이체를 제조할 수 있다. 예를들어 [S160D,M216S] 변이체는 개선된 세척능 및 더욱 우수한 저장안정성을 나타낸다.

또한 어떤 변이와, 본 명세서에 기술된 변이 조(組)를 결합하여 유용한 변이체를 제조할 수 있다.

그외에도 여기에 기술된 유용한 변이를 효소의 성질을 실질적으로 변화시킬 수도 있는 다른 부위의 변이와 결합시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시는 다음의 PB92 프로테아체 변이체와 같다:[M216Q]; [N212D]; [S160D]; [S160G,N212D]; [S160D,M216Q]; [S160D,M216S]; [A166D,MI691]; [G116V,S126V,P127E,S128K]; [G116V,S126G,P127Q,S128I]; [G116V,S126L,P127N,S128V]; [G116V,S126L,P127Q,S128A]; [G116V,S126V,P127M]; [G116V,S126H,P127Y]; [G116V,P127S,S128P]; [G116V,S126F,P127Q]; [G16V,S126F,P127L,S128T]; [S126M,P127A,S128G]; [S126M,P127A,S128G,S160D]; 및 [G116V,S126N,P127S,S128A,S160D].

대표적인 세탁용 시험을 일차적 선택의 표준으로 이용하여, 세탁물 세제에 적용하기에 알맞은 신규한 프로테아제를 얻기 위해 본 발명에 사용되는 접근방법의 중요성을 설명하기 위하여, 변이체 PB92 프로테아제의 세척능 시험의 결과를 보통 단백질의 생화학적 및 효소학적 연구에서 결정되는 생화학적 한정요소와 비교하였다. 이러한 결과로서 정의된 기질에 대한 친화도를 결정하는 한정요소 및 단백질 분해작용의 역학 및 세척능 사이에 관계가 있다는 결론이 내려진다(실시예 1의 표 1 참조).

그러므로, 또한 2가지 또는 그 이상의 변이체를 동일효소 제조물이나 동일 세척과정에 있어서의 상이한 특성과 결합시키는 것이 가능하다.

이러한 결합에는 협력작용이 있을 수도 있다.

또한 본 발명은 이전에 정의한 바와 같이 세제조성물이나 세척과정에 있어서 한가지 또는 그 이상의 변이체 단백질 분해효소를 사용하는 것으로 이루어진다.

결국, 프로테아제 폴리펩티드사슬에, 변이에 의해 인공적으로 만들어지거나 PB92 프로테아제와 상동구조인 프로테아제 내에서 자연적으로 생겨나는 아미노산을 결실 또는 삽입시킴으로써 아미노산의 수자가 변화 할 수 있다.

그러나 PB92 프로테아제의 아미노산 위치와 상동구조인 위치가 본 청구범위에 대항된다는 점을 이해하여야 한다.

다음의 실시예들을 제공함에 있어서는 이는 설명을 위한 것이며 본 발명에 제한을 가하려함이 아니다.

실험섹션

물질 및 방법

PB92 프로테아제 변이체의 구성

돌연변이 작용이 사작되는 기본구조는 EP-A-0283075호에 상세하게 개시된 pM58을 참조하기로 한다.

방법은 다음 세가지 단계로 구성되었다:

a. 돌연변이 유발 벡터 M131M1

b. 변이순서

c. pM 58δEco의 구조 및 이 벡터내에 있는 변이 DNA단편의 하위 클로닝.

1. a. M13M1벡터 변이유발의 구성

pM58기본구조물을 제한효소 Hpa I 및 Ba II으로 소화시켰다. PB92 프로테아제 유전자가 들어있는 1400bp 단편을 저온(low melting) 아가로스 상에서 정제하였다(Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). M13MP11벡터(Messing등, Nucl. Acid. Res. 9, (1981) 303-321)를 Sma I으로 소화시켰다.

Cohen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, (1972) 2110-2114에 의해 개시된 방법에 따라서 문제의 1400bp DNA 단편을 이 벡터에 연결하여 대장균 JM101에 감염시켰다.

파지를 대장균 JM101 내에서 증식시킨 후에 ssDNA를 단리(Heidecker 등, Gene 10, (1980) 69-73)하고, Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(1977) 6463에 의해 개시된 방법을 사용하는 DNA서열화에 의해 그 삽입물 및 삽입물의 적응상태를 점검하였다.

변이유발에 적합한 벡터를 얻고 M13M1이라고 명명하였다. 상기 순서를 제1a도에 도식적으로 도시하였다.

1. b. 변이순서

M13M1벡터의 ssDNA 및 M13mp19의 dsDNA를 사용하여 변이유발을 수행(Messing 등, Nucleic Acids Res.9,(1988) 303-321)하고, M13mp19를 제한효소 EcoR I 및 HindⅢ로 소화시킨 후 저온 아가로스상에서 큰 단편들을 정제하였다.

Kramer 등, Nucleic Acids Res. 12에 의해 개시된 바와 같이 변이체를 선별하기 위해 대장균 WK30-3 대신에 대장균 JM105를 사용하여 변형시켜서 변이유발을 수행하였다.

특이적 변이를 일으키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드의 길이는 22뉴클레오티드였다. 특이적 DNA서열 내에서 한꺼번에 몇가지 변이를 일으키기 위해 사용된 영역 특이적 변이를 변이가 아미노산(들)에 상응하는 부위에 뉴클레오티드 4개 모두가 임의로 결합되어 있고 길이가 40뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하였다.

변이 유발후에는 Sanger, 상기 참조의 디데옥시(dideoxy)법을 사용하는 서열분석을 함으로써, 잠재적인 변이체에 해당변이가 일어났는가를 점검하였다. 모든 단일 스트랜드(strand)간격(제1b도 참조)을 서열화하여 2차 변이가 없는가를 점검하였다. 순서를 도식적으로 제1b도에 도시되어 있다.

개시된 순서는 프로테아제 유전자의 3' 부분에 변이가 일어난 DNA 단편(아미노산 154-269)을 산출하기에 유용하다.

당 기술에 숙련된 자에게는 바실루스 벡터의 포로테아제 유전자의 5' 부분에 변이가 일어난 DNA 단편을 산출하기 위해서는 제1a도의 방법과 유사하게 선택적 제한효소를 사용하여 변형 PB92 프로테아제에 유전자를 구성할 수 있다는 것이 명백하다.

1. c. pM58δEco의 구성 및 이 벡터내에서 변이가 일어난 DNA 단편의 하위 클로닝(제1c도)

pM58δEco를 구성하기 위해서 pM58을 제한효소 EcoR I으로 소화시키고, 희석된 상태에서 T4 리가아제로 연결하였다.

Spizizen 등, J. Bacteriol. 81, (1961) 741-746의 방법에 따라 B 섭틸리스 1-A40(Bacillus Genetic Stock Centre, Ohio)을 형질전환시키기 위해 이 연결혼합물을 사용하였다.

형질전환 혼합물에서 취한 세포를 EP-A-0283075호의 실시예 1에 개시된 바대로 네오마이신 20㎍/ml가 함유된 최소 플레이트에 플레이트하였다.

형질전환체의 플라스미드 DNA를 Birnboim 및 Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523에 의해 개시된 방법에 따라 단리하고 제한효소 분석하여 성격을 규정지었다. 이 방법으로 pM58δEco를 단리하였다(제1c도 참조).

변이체 효소를 생산하기 위하여 섹션 1.b.에 개시된 바와같이 산출된 목적 변이가 일어난 M13M1의 DNA단편을 pM58δEco안으로 하위클론하였다.

M13M1의 dsDNA(상기 참조)를 EcoR I으로 소화시키고 pM58δEco의 EcoR I 부위로 연결하였다.

Spizizen 등, 상기 참조의 방법을 사용하여 연결혼합물을 B 섭틸리스 DB104를 형질환하기 위해 사용하였다(Doi, J. Bacteriol. (1984) 160, 442-444)

형질전환 혼합물에서 취한 세포를 네오마이신 20㎍/ml 및 카세인 0.4%가 함유된 최소 플레이트에 플레이트하였다(EP-A-0283075호).

형질전환체를 제조하는 프로테아제의 DNA를 Birnboin 및 Doly에 의해 개시된 방법(상기 참조)에 따라 단리하고 제한효소 분석에 의해 성격을 규정하였다.

2. 변이체 프로테아제의 제조

변이 프로테아제 유전자가 있는 벡터를 함유한다고 판단되는 DB104의 형질전환체를 네오마이신 20㎍/ml를 함유하는 Tryptopan Soya Broth(TSB) 10ml에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이트 하였다.

배양물의 샘플(0.1ml)을 프로테아제 제조물 배지 100ml:효모추출물(Yeast Extract)(Difco), CaCl₂·6H₂O 0.97g/l, MgCl₂·6H₂O 2.25g/l, MnSO₄·4H₂O 20mg/l, CoCl₂·6H20 1mg/l, 시트르산염 0.5g/l, 항포말5693 0.5ml/l, 말토오스 6% w/v, pH 6.8 인산염완충액 0.2M 및 네오마이신 20㎍/ml를 함유하는 500ml 진동플라스크내에서 인큐베이트 하였다.

일정하게 공기를 쏘이면서 65시간 동안 인큐베이트한 후, Lin 등, J. Biol. Chem. 244 (1969) 780-793에 의해 개시된 방법을 사용하고 기질로서는 디메틸 카세인을 사용하여 배양물의 프로테아제 활성을 분석하였다.

원형 PB92 및 변이체 92 프로테아제를 더 많은 양으로 제조해내기 위해서, 이 주를 진동플라스크에 사용됐던 것과 동일한 제조배지를 사용하여 부피 10l 또는 그 이상인 발효기에서 공기를 쏘이면서 37℃에서 배양하였다.

얻어진 육즙은 프로테아제의 정제를 위해서 사용하였다.

3. 원형 BP92 플로테아제 및 변이체의 정제 및 농축

진동플라스크 또는 10l 발효기 내에서 바실루스 섭틸리스 DB104에 의해 제조된 원형 PB92 프로테아제의 변이체를 Zeta-Prep^R디스크 또는 카트리지(PS-형, LKB)를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

발효육즙을 원심분리(300xg, 10분)하고 상층액을 pH5.5의 10mM 나트륨인산염완충액으로 10배 희석시킨후 양이온 교환기에 넣었다. 카트리지 부피의 몇배에 달하는 인산염 완충액으로 세척한 후 인산염 완충액에 0.4M Nacl을 넣어 프로테아제를 용리하였다.

프로테아제 활성이 있는 단편들을 모으고 나서 PM-10 필터가 장치된 Amicon 교반세포를 사용하여 한외여과에 의해 농축하였다.

프로테아제 용액을 인산염 완충액으로 희석 및 농축하여 Nacl 농도를 대략 50mM로 감소시킨 후 단백질 농도 1-10mg/ml 사이에서 -80℃에 저장하였다.

또한 대량 발효육즙으로부터 PB92-프로테아제 변이체를 회수하기 위해 CaCl₂(1% w/w) 및 아세톤(30% w/w)를 첨가했다.

세포를 제거하기 위해 여과시킨 후, CaSO₄·2H₂O를 0.2-2%(w/w) 가하고 또한 아세톤을 최종 농도가 60% w/w로 될 때까지 가함으로써 상기 얻어진 여과물로부터 프로테아제를 침전시켰다.

여과에 의해 침전물을 분리해내고 아세톤으로 스퍼지(Sparge)한 후 건조시킴으로써 원 효소분말(crude enzyme powder, (EP))을 산출하였다.

4. 정제된 프로테아제의 순도를 점검하는 분석기술

프로테아제는 전기영동 및 고성능겔 전기영동(HPLC)을 각각 사용하여 한 개의 밴드 또는 피이크가 나타날 때 순수한 것이라고 판단된다.

Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685에 따라 나트륨 도데실 황산염(SDS)의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔-전기영동(PAGE)를 수행하였다. 그러나 프로테아제의 자기감성(auto degradation)을 막기 위해 프로테아제 활성을 불활성화 시키기 전에 100℃에서 SDS에 의한 단백질 샘플의 변성이 선행되어야만 한다.

이 작업은 페닐메틸술포닐 플로오르화물(PMSF)로 인큐베이트(1mM, 30분, 실온)하거나 트리클로로아세트산으로 침전(TCA, 85, 30분, 얼음위에서)시킴으로써 가능하다.

pH7.45에서 원 PAGE를 수행하였다(겔 완충액은 5% 폴리아크릴아미드 겔(아크릴아미드 : 비스아클릴아미드=20:1)내에 히스티딘(His) 20mM 및 3-[N-모르폴리노] 프로판술폰산(MOPS) 50mM를 함유한다).

단백질 샘플을 겔(slab gel)의 위에 놓고 음극쪽으로 전기영동하였다. 전기영동(tank) 완충액으로서는 동일한 His/MOPS 완충액을 사용하였으나 pH는 6.3으로 하였다.

전기영동(350V로 11/2-2h)한 후에, 겔 안에 있는 단백질을 고착시키기 위해서 겔을 8% 아세트산에 담그고 다음으로는 Coomassie Brilliant Blue R250으로 염색한 후 표준방법에 따라 다시 염색하였다.

HPLC에 의한 순도점검은 양이온 교환컬럼(MonoS-Pharmacia Fine Chemical) 및 겔 여과 칼럼(TSK 2000 SW-LKB)을 활용하여 수행하였다.

pH5.5인 나트륨인산염 완충액 내에서 양이온 교환컬럼을 실시하고 pH5.5 10-300mM 나트륨 인산염의 선형변화도에 의해 결합 단백질의 용리를 이루었다.

pH5.5인 0.25M 나트륨 아세트산염에서 겔 여과컬럼을 실시하였다.

5. 프로테아제 농도의 결정

정제된 프로테아제 용액 내에서 단백질 농도를 결정하기 위해서 다음을 이용하였다.

i) 계산된 소멸계수(extinction coefficient,^εM)를 이용하여 280nm에서 소멸 측정, 및

ii) 활성부위 적정.

효소분자당 트립토판(^εM=5,6000M^-1·㎝^-3) 및 티로신(^εM=1,330M^-1·㎝^-3)의 수로부터 280nm에서의 소멸 계수를 계산해냈다. PB92 프로테아제에 대하여^εM은 280nm에서 측정된

에 당량인 26,100M^-1·cm^-1(3Trp, 7Tyr 잔기)였다. Trp와 Tyr의 수가 많아진 변이체의 경우에 있어서는 그에 따라서 보정을 하였다.

활성부위를 적정하여 활성효소분자의 수를 정량하였다.

N-트랜스 신나몰리미다졸(M.L. Bender 등, J.Am. Chem. Soc. 88, (1966)은 5890-5931)을 이용하여 널리 사용되는 방법은 PB92 프로테아제에 대해서는 만족스럽게 작용하지 않는다고 판명되었으므로 본 발명에서는 그 대신에 PMSF를 사용하는 방법을 실시하였다. 지금까지 농도가 측정(280nm 흡수로부터)된 프로테아제 용액을 PMSF와 각각 0.25, 0.50, 0.75, 1.00 및 1.25당량으로 혼합하고 pH 6.5인 10mM 나트륨인산염내에서 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 효소농도는 최소한 50μM이 되도록 했다.

기질로서는 숙시닐-L-알라닐-L-알라닐-L-페닐-알라닐-vk라니트로아닐리드(sAAPFpNA)를 사용(이하참조)하여 잔기활성을 분광측정법으로 측정하였다. NMR-분광학에 의해 PMSF의 순도(여기에서는 농도)를 결정하고 이소프로판올 내에서 저장용액을 제조하였다.

활성부위적정의 결과가 HPLC를 사용한 순도점검의 결과와 일치한다는 것을 알게 되었다.

6, 원형 및 변이체 프로테아제의 활동적 한정 요인 측정

1°. 영국 특허명세서 제1,357,317호에 개시된 바와 같이 단백질 기질(카세인)에 대한 활성을 pH10.0에서 측정하였다(ADU=Alkaline Delft Unit으로 표현).

2°. pH-고정상태에서 기질로서의 카세인에 대한 전환수를 측정하였다. pH-고정 반응실(Radiometer, 코펜하겐)에는 카세인 50mg(Hannerstein, Merck)와 함께 0.1M KCl이 10ml 들어있다. pH를 10.0으로 유지하면서(40℃, 질소가스를 쏘이면서) PB92 프로테아제에 의해 가수분해된 카세인으로부터 유리된 프로톤에 NaOH 10ml를 적정하였다.

3°. sAAPFpNA를 사용하여 합성펩티드에 대한 활성을 측정하였다. 형성된(황색) 파라니트론 아닐리드를 온도조절식 6-위치 세포교환기가 장치된 UVIKON 860(KONTRON)분광측정기를 사용하여 410nm:^εM=8,480M^-1·㎝^-3에서 분광측정 광학적으로 측정하였다(E.G. Delmar 등, Anal. Biochem. 94 (1979) 316-320).

다변량분포 교차반복법(multivariate secant iterative method)으로 비-선형 복귀를 이용하여 자료를 쌍곡선 함수(huperbolic function)에 적용함으로써 여러 가지 기질 농도(PB92 프로테아제에 대하여 0.1-6.0mM)에서의 초기속도로부터 활동적 한정요인 Kcat 및 Km을 얻었다. 특이성 상수 Kcat/Km을 계산하였다.

0.1 TRIS-HCl+pH 8.6인 0.1M Nacl을 함유하는 최종부피 1ml 25℃에서 측정을 하였다.

염화나트륨이 없으면 PB92 프로테아제는 기질억제에 의해 야기되는 비-선형 Lineweaver-Burk 곡선을 나타내므로 염화나트륨이 필요하다. 우선 기질을 DMSO에 용해시켜서 농도가 200mM이 되도록 한 후 pH8.6인 0.1M TRIS-HCl로 희석하여 20mM 저장용액(분광측정법으로 315nm에서 측정하였다:^εM=14,000M^-1·㎝^-3)을 산출하였다. DMSO의 다양한 농도(0.05-3% v/v)에 대해서는 보정을 하지 않았다.

7. PB92 프로테아제의 산화

H₂O₂에 의한 산화에 대하여 Estell등, L, Biol. Chem. 260 (1985) 6518-6521에 의해 개시된 방법에 따라 PB92 프로테아제의 감수성을 시험하였으나 다음을 예외로 하였다.

i) 100mM H₂O₂대신에 20mM을 사용, 및

ii) 첨가산화제로선 100mM TEAD와 결합된 20mM 나트륨 과붕산염을 사용하였다.

8. 세척능 시험

우유, 피 및 잉크로 오염된 면직물 및 폴리에스테르/면적물(5.0×5.0cm, EMPA, St. Gallen 스위스, 제116번 및 117번)을 사용하여, 특별히 고안된 세탁시험으로 PB92 프로테아제 변이체를 시험하였다.

세척시험을 정해진 세제조성물과 시험한 프로테아제(PB92 프로테아제 변이체 및 PB92 프로테아제) 각각을 담는 스텐레스 강 시험 용기가 장치된 Atlas Lauderometer LEF-FC 내에서 수행되었다.

그외에는 정하지 않고 원하는 온도에서 30분간 시험을 수행하였다.

세척후, 직물을 공기-건조하고 시험직물의 반사율을 녹색필터가 장치된 Photovelt 광학측정기(모델 577)로 측정하였다.

PB92 프로테아제 변이체에 대해 측정된 반사율 자료를 PB92 프로테아제가 함유된 비교측정군의 반사율 자료와 비교하였다.

PB92 프로테아제의 단백질 양(mg)을 동일한 반사율 v×100을 얻기 위해 필요한 변이체 프로테아제의 단백질의 양(mg)으로 나누어 변이체 프로테아제의 세척능 값을 계산하였다.

[실시예 1]

A. 유럽분말세제 중에서 여러 가지 PB92 프로테아제 변이체의 세탁능을 하기의 방법으로 측정하였다.

각각의 스테인레스 스틸 시험용기에, 15°GH의 물 250ml에 소정량의 분말세제 IEC를 용해시켜 담은 후 2개의 면과 2개의 폴리에스테르/면직물 견본을 넣었다. 분말세제 IEC의 조성은 아래와 같았다.

각각의 용기에, 선택된 정제 PB92 프로테아제 변이체를 담금액 리터당 프로테아제(정제) 0 내지 1.73mg으로 농도를 달리하면서 가하였다. 하나의 용기는 PB92 프로테아제를 시험하는 것과 같은 방법으로 하여 대조로 사용하였다. 40℃에서 시험은 시행하였다.

결과를 표 1에 표시한다.

# 세탁능은 분말세제 IEC를 함유하는 STPP에서 측정하였다(40℃).

* PB92 프로테아제는 정의에 의해 100% 특이활성을 갖는다.

활성은 ADU 방법에 의해 측정하였다.

+ 분석조건:기질 S-A-A-P-F-PNA;

완충익 0.1M 트리스 HCI, PH 8.6;

0.1M NaCl : 25℃.

B. 몇가지 PB92 프로테아제 변이체를 함유하는 같은 세제에 대해 25℃에서 세탁능 시험을 반복하였다.

PB92 프로테아제를 기준으로 다시 사용하였다.

다른 시험조건을 상기와 같이 하였다.

결과를 표 2에 표시한다.

C. 세탁견뢰도 측정기(Laun derometer)를 사용해서 25℃ 및 40℃에서 유럽 분말세제를 함유한 비인산계표백제에서 프로테아제의 세탁능을 또한 측정하였다. 다시 PB92 프로테아제를 기준으로 사용하였다. 다른 시험조건은 상기와 같이 하였다.

결과를 표 3에 표시한다.

실시예 2

실시예 1에서 기술된 분말세제 IEC에서 PB92 변이체 M216S의 저장안정성을 시험하였다.

상대습도(RH) 80%, 온도 30℃ 기후판에서 저장안정성을 조사하였다. 이 시험을 위해 프로테아제를 다음과 같이 캡슐화하였다.

정제 프로테아제 2%, 비이온성 활성제 50%(50-80 E.O. 단위의 에톡시화 C₁₄-C₁₈알코올), TiO₂5% CaSO₄·2H₂O를 3-10% 및 나머지 Na2SO4(100%까지)를 함유(w/w)하는 혼합물을 만들었다.

혼합물을 65-90℃까지 가열한 후 실온으로 냉각시켰다.

얻어진 고체 혼합물을 입자로 분쇄하였다. 직경 0.5 내지 1mm의 입자를 시브(sieve)로 걸러서 세제중 저장시험을 위해 사용하였다.

6140 ADU/g 세제의 농도로 변이체 M216S를 함유하는 분말세제 IEC 3.5g을 18ml비알(vial)에 저장하였다.

대조를 위해 PB92 프로테아제를 같은 조건하에 저장하였다.

2,4,5 및 6주후 프로테아제의 잔여활성을 측정하였다.

결과를 표 4에 표시한다.

실시예 3

분말세제 중에서 PB92 프로테아제 및 여러 가지 PB92 프로테아제 변이체의 저장 안정성을 시험하였다.

다음 성분을 80℃에서 혼합하여 프로테아제 제품을 만들었다.

* AE=C₁₄-C₁₈알코올 폴리에톡실레이트 알코올은 50-80 산화에틸렌(EO)기로 에톡시화 되었다.

** PVP=폴리비닐 피롤리돈 K17

*** BHT=2.6-비스(t-부틸)4-메톡시페놀

이 혼합물을 영국 특허 제1,603,640호에 사실상 기재된 바와 같은 분사조립(prilling)에 의해 캡슐화 하였다.

0.3 내지 0.8mm 사이의 입경을 가지는 입자분획을 사용하여 프로테아제의 저장안정성을 측정하였다. 캡슐화된 프로테아제(140mg)을 ALL^R염기(6.4g) 및 과붕산나트륨 4수화물(0.6g)과 혼합하였다[ALL은 Unilever N.V.의 등록상표이다].

사용된 ALL 염기분말은 효소나 표백제를 함유하지 않은 것이었다.

효소/세제/과붕산나트륨 4수화물의 혼합물을 30℃, 80% RH에서 배양하였다. 표 5에서 소정의 기간동안 배양을 위해 저장한 후의 잔여활성이 제공된다.

실시예 4

PB92 프로테아제 및 여러 가지 PB92 프로테아제 변이체를 실시예 3에서 기재된 방법에 따라 캡슐화하였다.

그러나 이 실시에에서는 0.3 내지 0.9mm 입경의 캡슐화된 프로테아제 70mg을 ALL 3.2d 및 과붕산나트륨 4수화물 0.3g과 혼합하였다. 샘플을 18ml 비알에 넣고 진공건조기에서 30℃로 저장하였다. 저장기간의 첫번째 3일동안 진공(25mmHg)을 가하였다.

진공을 가함으로써 수증기의 이동속도가 증가하기 때문에 진공을 가하지 않았을 때보다 시스템은 80% RH에서 평형에 빨리 도달한다. 80% RH는 브롬화칼륨의 포화용액에 의해 확립되었다.

표 6에서 소정의 저장(주:週)후의 잔여활성이 제공된다.

실시예 5

다음의 액체세제 조성물을 제조하였다.

이 조성물에 PB92 프로테아제 및 여러 가지 PB92 프로테아제 변이체를 소정량 가하여 프로테아제의 최초 농도가 0.13% w/w가 되게 하였다.

프로테아제 함유 조성물을 37℃에서 소정 기일동안 저장한 후 프로테아제 안정성(잔여활성%)을 측정하였다.

결과를 표 7에 표시한다.

실시예 6

PB92 프로테아제 및 그것의 몇가지 변이체를 다음과 같이 조성하였다. 각각의 프로테아제로써 다음의 성분으로 구성된 혼합물을 만들었다.

미합중국 특허 제4,242,219호의 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 이들 혼합물로부터 과립을 제조하였다.

다만 상기 실시예에 기재된 혼합물을 상기 혼합물을 래체하고; 오리피스의 직경을 1.0mm 대신에 0.7mm의 것으로 사용하였으며; 과립을 피복하지 아니하였다.

이들 과립(140mg)을 ALL 염기(6.4g) 및 과붕산나트륨 4수화물(0.6g)과 혼합하고 36ml 비알에 배치하였다.

30℃, 80% RH에서 소정기간(주)동안의 비알 저장후 프로테아제 안정성(잔여활성%)를 측정하였다.

결과를 표 8에 표시한다.

실시예 7

PB92 프로테아제 및 그것의 몇가지 변이체의 분사조립(噴射造粒) 생성물을 제조한 후 실시예 3에 기재된 바와 같이 세제 및 표백제와 혼합하였다.

이들 샘플의 저장안정성(잔여활성%)을 30℃ 및 60/80% RH(60% RH에서 12시간 그리고 80% RH에서 12시간 동안 교대로)에서 측정하였다.

결과를 표 9에 표시한다.

실시예 8

실시예 6에 기재된 바와 같이 PB92 프로테아제 및 그것의 몇가지 변이체를 함유하는 과립을 제조하고 세제 및 표백제와 혼합하였다.

30℃로 60% RH에서 12시간, 80% RH에서 12시간 교대로 소정의 기간 동안 배양(incubation)한 후에 이들 샘플의 저장안정성(잔여활성%)을 측정하였다.

결과를 표 10에 표시한다.

실시예 9

30℃, 80% RH에서 표백제를 함유하는 분말세제중에서 PB92 프로테아제 및 그것의 몇가지 변이체의 저장안정성을 시험하였다. 이 실험을 위해서 프로테아제 캡슐의 형태로 사용하였다.

80℃에서 다음의 조성으로 된 혼합물을 만들었다.

* 비이온성활성제=C₁₄-C₁₈알코올 폴리에톡실레이트(50-80EO기)

상기 혼합물을 실온으로 냉각시켰다.

고체혼합물을 더 작은 입자로 분쇄하엿다.

0.3 내지 0.8mm의 입자를 시브(sieve)로 걸러서 저장실험에 사용하였다. 저장실험을 위해서 각각의 캡슐화된 프로테아제 140mg을 ALL 베이스 분말세제 6.4g 및 과붕산나트륨 4 수화물 0.6g과 혼합하였다.

ALL 베이스 분말은 효소도 없고 과붕산나트륨도 없다.

ALL 베이스/프로테아제/과붕산나트륨 4수화물의 혼합물은 30℃, 80% RH에서 배양하였다.

0,1,2 또는 4주 동안 저장한 후에 각각의 프로테아제에 대해서 잔여활성%로 표현한 프로테아제 안정성을 측정하였다.

결과를 표 11에 표시한다.

실시예 10

실시예 1에 기재된 것과 사실상 같은 조건하에 PB92 프로테아제 변이체의 세척시험을 하였다. 다만, 다음 조성의 액체 세제 0.375g을 세탁견뢰도 측정기 용기에서 5°GH의 물 250ml에 첨가하였다.

이 액체세제중에서 여러 가지 프로테아제의 세척능을 세탁견뢰도 측정기에서 25℃로 30분동안 측정하였다.

세탁후에 실시예 1에 기재된 대로 시험세탁물의 리플렉턴스(reflec-tance)를 측정하였다. 변이체 프로테아제의 세척능을 실시예 1에 기재된 대로 측정하였다.

결과를 표 12에 표시한다.

0 : PB92 프로테아제와 비교해서 100%±20% 세탁능(유지된 세탁능)

+ : PB92 프로테아제와 비교해서 120% 초과의 세탁능

- : PB92 프로테아제와 비교해서 80% 미만의 세탁능

상업상 구입가능한 액체세제 Tide^R, Wisk^R및 Ariel^R중에서 여러 가지 프로테아제의 세탁능을 측정하였다. 스테인레스 스틸용기에는 각각 5°GH의 물 250ml중의 Tide 0.375g 5°GH의 물 250ml중의 Wisk 0.35g 또는 15°GH의 물 250ml중의 Ariel 1.25g을 담았다.

25℃ 또는 40℃에서 세탁능을 측정하였다.

다른 조건은 실시예 1에 기재된 것과 같이 하였다.

결과를 표 13에 표시한다.

ND=측정되지 않음

0=PB92 프로테아제와 비교해서 100%±20% 세탁능

+=PB92 프로테아제와 비교해서 120% 초과의 세탁능

-=PB92 프로테아제와 비교해서 80% 미만의 세탁능

실시예 11

네덜란드의 델프트 소재의 TNO(Cleaning Techniques Research Institute)에 의해 통계적인 실크기 세탁기 시험으로 PB92 프로테아제의 변이체의 세탁능을 측정하였다. 이들 변이체의 세탁능을 PB92 프로테아제와 비교하였다.

모든 프로테아제를 단백질 중량(0.007% w/w)을 기준으로 IEC 세제에 투여하였다. 활성에 근거하여 이들 투여량을 산출하였다.

PB92 프로테아제 1460ADU/g 세제

M216S 679ADU/g 세제

M216Q 479ADU/g 세제

S160D 1080ADU/g 세제

N212D 1455ADU/g 세제

각각의 세제 프로테아제 조성물에 대하여 동일한 AEG Turnamat twinup 세탁기로 40℃에서 8회 세탁시험을 하였다.

각 세탁기에 170g의 세제를 사용하였다.

이 시험을 하는 동안 각각의 세탁기에서 같은 세탁회수로 세탁하는 방법으로 각각의 분말을 사용하였다.

다음과 같은 평균수치의 성질을 가지는 델프트시에 공급되는 수도물을 시험에 사용하였다.

알칼리도(M):2.2mmol/ι

강도(H):1.6mmol/ι(9°GH)

온도:20℃

시험세탁물로부터 흙과 얼룩의 제거

각각의 6회 시험에서 면(번호 111,116 및 117)에 대한 EMPA 흙 얼룩의 3종류의 직물견본을 흙 얼룩 세탁물과 함께 세탁하였다.

인공적으로 흙 오염된 시험포의 흙 및 얼룩의 제거는 삼자극(tristimulus) 청색관을 시험포에 수직하게 보내서 측정하였다.

시험포로 45°각도로 재방사되는 빛의 양을 측정하였다.

IEC 456에 따르면 산화마그네슘의 제방사치는 100으로 정해져 있다. 재방사치가 높으면 특별 종류의 흙 오염에 대한 세탁공정이 우수한 것이다.

세탁기의 부하

세탁기에는 시험옷감과 가정에서 일상적인 사용에 의해 더럽혀진 세탁물로 구성된 세탁물 4.75kg을 넣었다.

세탁물은 주방 수건 6개

내의 4개

침대시트 4개

베갯잇 4개

이었다.

필요한 무게에 도달하기 위해서 필요에 따라 깨끗한 침대시트와 베갯잇을 더 넣었다.

각각의 세탁공정을 위해서 세탁물을 조심스럽게 선택하였다.

각각의 세탁기에 투여되는 각각의 천은 다른 세탁기에 투입되는 세탁물의 대응부의 오염정도를 같게한 것을 사용하였다.

이런 방법으로 각 공정에서 흙 오염의 부하는 같았다.

세탁공정의 파라메타

8회 세탁시험후에 재방사(V) 및 비율(R)의 평균치를 측정하였다. 2번의 독립된 실험의 결과를 표 14A 및 14B에 표시한다.

표 15에서 통계적인 실크기 세탁기 시험으로부터 얻어진 비율(R)을, 유사한 조건(10g/ι IEC, 시험표 EMPA 116 및 11, 세탁시간 30분, 온도 40℃)하에 세탁견뢰도 측정기로부터 얻어진 PB92 프로테아제와 비교한 세척능으로부터 계산된 대응비율(R)로 나누었다.

*정의에 의해서

1.0에 근접한 변이체 프로테아제에 대한 R/R' 값은 실크기 세탁기 시험 및 세탁견뢰도 측정기의 상관관계를 나타낸다.

실시예 12

제2a 및 2b도는 실시예 1에 기재된 시험에 따른 여러 가지 PB92 프로테아제 변이체의 IEC/ι4g에서의 세척능을 나타내는바, 이들은 특이활성의 기능으로서 본래 PB92 프로테아제와 비교한 것이다.

도표의 숫자는 다음의 변이체 프로테아제를 지칭한다.

제3도는 실시예 1에 기재된 시험에 따른 여러 가지 PB92 프로테아제 변이체의 7g IEC/ι의 세척능을 나타내는바, 특이활성의 기능으로서 본래 PB92 프로테아제와 비교한 것이다. 도표의 숫자는 제2a 및 2b도의 숫자와 같은 변이체 프로테아제를 지칭한다.

이 명세서에 언급된 모든 공보(특허출원 포함)는 이 발명이 관련되는 분야에서 숙련된 전문가의 수준을 지시한다.

본 명세서에 참고로 제출하는 것으로 특정적 개별적으로 표시된 범위까지 모든 공보를 여기에 참고로 제출한다.

본 발명을 기술함에 있어서 이해를 쉽게 하기 위해 몇가지 실시예를 통해 상세히 설명하였지만 이 분양의 통상의 지식을 가진 자에게는 본 발명의 특허청구의 범위의 사상과 범위를 벗어남이 없이 많은 변화와 수정을 가할 수 있음은 명백하다.

Claims

제4도에서 보여지는 성숙 PB92 세린 프로테아제의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 상동성을 갖고, 바실루스 노보 종(Bacillus novo species) PB92로부터 얻어지는 성숙 PB92 세린 프로테아제의 116,126,127,128,160,166,169,212 및 216으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 위치에 해당되는 선택부위에서 한 아미노산 잔기의 치환이 이루어진 세린 프로테아제 변이체로 이루어지는 효소제조물.
제1항에 있어서, 상기 세린 프로테아제 변이체가 세탁물 세제내에서 개선된 세척능을 나타내는 것을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 상기 세린 프로테아제 변이체가 세탁세제내에 저장되는 동안 세척능을 유지하면서도 개선된 안정성을 나타내는 것을 특징으로 하는 효소제조물.
제3항에 있어서, 상기 세린 프로테아제 변이체가 산화제에 대한 내성으로 이루어지는 개선된 안정성을 나타내는 것을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항 내지 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세린 프로테아제 변이체가 자연적으로 제조되는 박테리아의 세린 프로테아제로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 상기 세린 프로테아제의 유전자가 친알칼리성 바실루스주의 원형 세린 프로테아제 유전자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 효소제조물.
제6항에 있어서, 상기 유전자가 바실루스 섭틸리스, 바실루스 리케니포미스 및 바실루스 아밀로리퀴팩신스로 구성되는 군으로부터 선택된 주의 원형 유전자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 효소제조물.
제6항에 있어서, 상기 원-형 유전자가 기본적으로 다음의 아미노산 서열을 코드화하는 것을 특징으로 하는 효소제조물.

H₂N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
제8항에 있어서, 상기 원-형 유전자가 바실루스 nov. spec. PB92로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 상기 변이가 116번 아미노산에서, 글리신으로부터 고분자량이고 비-극성인 지방족 아미노산으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 변이가 아미노산 126에서는 세린에서 다른 비-히드록실화 아미노산으로, 아미노산 127에서는 어떤 다른 아미노산으로, 아미노산 126에서는 어떤 다른 아미노산으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 아미노산 216에서의 변이는 메티오닌으로부터 황을 함유하는 아미노산이 다른 것으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 아미노산 160에서의 변이가 글리신 또는 음이온성 아미노산으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 아미노산 166에서의 변이가 음이온성 아미노산으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 아미노산 169에서의 변이가 비-극성 지방족 아미노산으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 아미노산 212에서의 변이가 음이온성 아미노산으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 변이는 중성 아미노산에서 음이온성 아미노산으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 변이는 아미노산 116 글리신이 발린, 이소로이신 또는 로이신으로 바뀌는 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제18항에 있어서, 상기 효소제조물은 아미노산 126,127 또는 128에서 최소한 한가지 변이가 추가로 일어난 것임을 특징으로 하는 효소제조물.
제1항에 있어서, 상기 세린 프로테아제 변이체가 [M216S]; [M216Q]; [N212D]; [S160D]; [S160G,N212D]; [S160D,M216Q]; [S160D,M216S]; [A166D,M1691]; [G116V, S126V,P127E,S128K]; [G116V,S126G,P127Q,S128I]; [G116V,S126L,P127N,S128V]; [G116V,S126L,P127Q,S128A]; [G116V,S126V,P127M]; [G116V,S126H,P127Y]; [G116V,S126R,P127S,S128P]; [G116V,S126F,P127Q]; [G116V,S126F,P127L,S128T]; [S126M,P127A,S128G]; [S126M,P127A,S128G,S160D]; and [G116V,S126N,P127S,S128A,S160].

으로 구성되는 PB92 프로테아제 변이체군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효소제조물.
세제내에 적용하기 위한 개선된 특성이 있는 단백질 분해효소를 선택하는 방법에 있어서, 목적으로 하는 단백질 분해효소 또는 그 단편을 코드화하는 클론된 유전자를 돌연변이원화하는 단계; 얻어진 변이체 프로테아제 유전자 또는 유전자들을 단리하는 단계; 상기 변이체 프로테아제 유전자 또는 유전자들을 발현 및 제조하기에 적합한 숙주안으로 도입하는 단계; 제조된 변이체 프로테아제를 회수하는 단계; 세제내에 적용하기 위한 개선된 특성이 있는 상기 변이체 프로테아제를 확인하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 따른 세린 프로테아제 변이체를 코드화하는 것을 특징으로 하는 변이체 유전자.
제22항의 변이체 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제23항의 발현벡터에 의해 형질전환되는 것을 특징으로 하는 원핵숙주균주
제24항에 있어서, 형질전환된 원핵숙주균주가 바실루스인 것을 특징으로 하는 형질전환된 원핵숙주균주.
제25항에 있어서, 친알칼리성 바실루스인 것을 특징으로 하는 형질전환된 원핵숙주균주.
제26항에 있어서, 바실루스 nov. spec. PB92 또는 이것의 변이체인 것을 특징으로 하는 형질전환된 원핵숙주균주
제25항에 있어서, 바실루스 섭틸리스, 바실루스 리케니포미스 및 바실루스 아밀로리퀴팩신스로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 원핵숙주균주.
제24항에 있어서, 형질전환 되기전에는 실질적으로 세포외 단백질분해효소를 제조할 수 없는 것을 특징으로 하는 형질전환된 원핵숙주균주.
제1항에 따른 세린 프로테아제 변이체를 제조하는 방법에 있어서, 세린 프로테아제 변이체 유전자를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주균주를 적당한 발효조건에서 배양하는 단계 및 상기 제조된 효소를 회수하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 따른 효소제조물을 포함하는 것을 특징으로 하는 세제조성물.
제1항의 하나 또는 그 이상의 세린 프로테아제 변이체를 세제조성물내에 사용하는 것을 특징으로 하는 세린 프로테아제 변이체의 사용방법.
제1항의 하나 또는 그 이상의 세린 프로테아제 변이체를 세척과정에 사용하는 것을 특징으로 하는 세린 프로테아제 변이체의 사용방법.