ES2228082T3 - Conjugados dextrano-leptina, composiciones farmaceuticas y metodos relacionados. - Google Patents
Conjugados dextrano-leptina, composiciones farmaceuticas y metodos relacionados.Info
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Abstract
Un conjugado de dextrano-leptina que comprende al menos un resto dextrano de bajo peso molecular unido al menos a un resto leptina, en el que dicho resto dextrano tiene un peso molecular de 1 kD a 20 kD.
Description
Conjugados dextrano-leptina,
composiciones farmacéuticas y métodos relacionados.
La presente invención se refiere en general al
campo de la modificación de proteínas y, más específicamente, a la
unión de restos dextrano a proteínas leptina incluyendo análogos de
las mismas (el término "proteína" como se utiliza en la
presente memoria es sinónimo de "polipéptido" o "péptido"
a menos que se indique otra cosa). En otro aspecto, la presente
invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen
conjugados de dextrano-leptina. La presente
invención proporciona también composiciones relacionadas y métodos
de preparación y uso de dichas composiciones.
Aunque la base molecular de la obesidad es
desconocida en gran medida, la identificación del "gen OB" y su
proteína codificada ("proteína OB" o "leptina") ha
arrojado alguna luz sobre los mecanismos que utiliza el cuerpo para
regular la deposición de grasa corporal. Véanse el documento PCT WO
96/05309, titulado "Modulators of Body Weight, Corresponding
Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses
Thereof", incorporado a la presente memoria como referencia en su
totalidad; Zhang et al., Nature 372:
425-432 (1994); véase también la corrección en
Nature 374: 479 (1995), ambos incorporados también a la
presente memoria como referencia. La proteína OB es activa in
vivo tanto en ratones mutantes ob/ob (ratones obesos debido a un
defecto en la producción del producto del gen OB) como en ratones
normales de tipo silvestre. La actividad biológica se manifiesta,
entre otras cosas, por pérdida de peso. Véase en general Barinaga,
"Obese Protein Slims Mice", Science 269:
475-476 (1995). Se han dado a conocer con más
detalle la proteína OB, análogos, derivados y el uso de los mismos
como moduladores para el control del peso y la adiposidad de
animales, incluyendo mamíferos y seres humanos, en el documento WO
96/05309, supra. Véanse también las publicaciones
internacionales PCT números WO 96/40912, WO 97/06816, WO 97/18833,
WO 97/38014, WO 98/08512 y WO 98/28427. La proteína OB, o leptina
como se denomina en la presente memoria, causa pérdida de peso en
seres humanos. Greenberg et al., "Preliminary safety and
efficacy of recombinant methionyl human leptin (rL) administered by
SC injection in lean and obese subjects", póster presentado en la
58ª Reunión Anual y Sesiones Científicas de la American Diabetes
Association, 14 de junio de 1998, Chicago, IL.
Es sabido que la administración continua de una
proteína leptina a la circulación sistémica mediante, por ejemplo,
bomba osmótica o modificando químicamente la leptina para que tenga
un tiempo de circulación aumentado, reduce la dosificación necesaria
para la pérdida de peso. Por ejemplo, documento PCT WO 96/40912,
titulado "OB Protein Compositions and Methods", incorporado a
la presente memoria como referencia. Generalmente, las ventajas
buscadas por la formulación de proteína y la modificación química
pueden incluir, en ciertas circunstancias, aumentar la estabilidad y
el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y reducir la
inmunogenicidad. Es un artículo de revisión que describe la
modificación de proteína y proteínas de fusión: Francis, Focus on
Growth Factors 3: 4-10 (mayo de 1992)
(publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane,
Londres N20, OLD, RU). Están actualmente disponibles diversos
métodos para unir restos químicos, véase por ejemplo la publicación
internacional del Tratado de Cooperación de Patentes (PCT) nº WO
96/11953, titulada "N-Terminally Chemically
Modified Protein Compositions and Methods", incorporada a la
presente memoria como referencia en su totalidad. Esta publicación
PCT da a conocer, entre otras cosas, la unión selectiva de polímeros
solubles en agua a la terminación N de proteínas.
Los polietilenglicoles son un tipo de polímero
soluble en agua que puede utilizarse para la modificación de
proteínas. Véase el documento WO 96/11953, supra, que da a
conocer también el factor estimulante de colonias de granulocitos
monopegilado N-terminal
("G-CSF") y el interferón de consenso
monopegilado N-terminal (designando "monopegilado
N-terminal" que el resto proteína se ha unido a
un solo resto polietilenglicol en la terminación N). Los restos
polietilenglicol pueden utilizarse con mucho éxito para ciertas
proteínas terapéuticas tales como el G-CSF y el
factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos ("MGDF")
(Sheridan & Menchaca, "Overview of the Safety and Biologic
Effects of PEG-rHuMGDF in Clinical Trials", en
Stem Cells 16 (supl. 2): 193-198 (1998)).
Los polímeros polisacáridos son otro tipo de
polímero soluble en agua que puede utilizarse para la modificación
de proteínas. Los dextranos son polímeros polisacáridos que
comprenden subunidades individuales de glucosa unidas
predominantemente mediante enlaces \alpha1-6. El
dextrano mismo está disponible en muchos intervalos de peso
molecular, y está fácilmente disponible en pesos moleculares de
aproximadamente 1 kilodalton ("kD") a aproximadamente 70 kD
(utilizándose el término "aproximadamente" para indicar el peso
molecular medio en una preparación comercial típica de dextrano de
pureza farmacéutica, ya que algunas moléculas de dextrano pueden
pesar ligeramente más que el peso indicado, y algunas menos.) El
dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para la
modificación de proteínas. Véanse los documentos WO 96/11953,
supra, y WO 96/05309, supra. Se ha reseñado también el
uso de dextrano conjugado con inmunoglobulinas terapéuticas o de
diagnóstico. La publicación de patente europea ("EP") nº
0315456, titulada "Polysaccharide-Modified
Immunoglobulins Having Reduced Immunogenic Potential or Improved
Pharmacokinetics", incorporada a la presente memoria como
referencia, reseña inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas
unidas a polisacáridos de bajo peso molecular modificados,
incluyendo dextranos.
Existe una considerable experiencia clínica en el
uso de grandes cantidades de dextrano en solución como expansores de
plasma (expansores del volumen plasmático). Véase, por ejemplo,
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 18ª ed., en
804-805 (Mack Publishing Co.: Easton, PA (1990)),
incorporada a la presente memoria como referencia. Están disponibles
soluciones que contienen dextranos de peso molecular relativamente
grande tales como dextranos con pesos moleculares de aproximadamente
40, 70 y 75 kD, y se administran en cantidades de gramos. Se
utilizan también soluciones de dextrano-hierro en el
tratamiento de la anemia.
Se ha reseñado que los dextranos de gran peso
molecular, cuando se administran en cantidades de gramos, dan como
resultado vacuolas renales. Por ejemplo, Diomi et al.,
Annals of Surgery 172: 813-824 (1970) (que
reseña vacuolización renal en perros); Maunsbach et al.,
Laboratory Investigation 11: 421-432 (1962)
(que reseña vacuolización renal en ratas); véase también Engberg,
Acta Chir. Scand. 142: 172-180 (1976). Los
conjugados de polietilenglicol-proteína, en casos
particulares, se han asociado también a la inducción de vacuolas
renales. Bendele et al., Toxicological Sciences 42:
152-157 (1998). Aunque las vacuolas renales no se
consideran actualmente como clínicamente relevantes, en general una
composición farmacéutica debe ser eficaz sin causar cambios
anatómicos injustificados. Por tanto, los dextranos de gran peso
molecular y polímeros de polietilenglicol pueden no ser generalmente
aplicables para la modificación química de todas las proteínas
terapéuticas.
Otra desventaja de utilizar dextrano de gran peso
molecular en un entorno clínico es la posibilidad de una reacción
anafiláctica en el paciente. Véase, por ejemplo, Richter et
al., Immunology Today 3: 132-138 (1982),
incorporado a la presente memoria como referencia, así como las
referencias citadas en el mismo, para una revisión. Se cree que
ciertos individuos pueden tener en su circulación sistémica
anticuerpos preformados que se unen a estos dextranos de gran peso
molecular. La administración de dextrano clínico de gran peso
molecular a una subpoblación pequeña (pero impredecible) de
individuos con altas titulaciones de estos anticuerpos reactivos con
dextranos ("ARD") preformados de la clase IgG da como resultado
un shock anafiláctico, y posiblemente la muerte. Se cree que los
dextranos clínicos generan complejos inmunes dañinos que activan el
complemento y ocurre la agregación de leucocitos y plaquetas. El
material agregado puede secuestrarse en el pulmón y la liberación de
mediadores vasoactivos puede conducir a reacciones anafilácticas.
Richter et al., supra, en 136.
Para superar este riesgo potencial, se han
estudiado soluciones de dextrano que contienen dextrano con un peso
molecular de aproximadamente 1000 D como inhibidores de hapteno del
ARD preformado. Se encontró adecuado un fragmento de dextrano de
seis unidades de glucosa (peso molecular 990) como preparación de
hapteno monovalente para experimentos in vivo. Richter et
al., supra, en 136 y siguientes. El uso de la inhibición
de hapteno para reducir las reacciones anafilácticas ha sido
bastante exitoso para expansores de sangre. Por ejemplo, Ljungstrom,
Infusionsther Transfusionsmed 20: 206-210
(1993), incorporado a la presente memoria como referencia. En los
años 1983 a 1992, se reseña que el uso de una preparación comercial
denominada Promit® ha reducido drásticamente la incidencia de las
reacciones anafilácticas graves inducidas por dextrano
("RAID"). Se reseñaron reacciones letales a una incidencia de
una por 2,5 millones de dosis.
El documento EP 0315456, como se observa
anteriormente, reseña el uso de dextranos que tienen un peso
molecular de aproximadamente 6 kD para conjugación con
inmunoglobulinas. Se ha reseñado que los anticuerpos monoclonales
que se cree que son útiles con fines terapéuticos conjugados con
dextranos tienen una inmunogenicidad reducida mientras que retienen
la inmunoreactividad deseada, y pueden poseer propiedades
farmacocinéticas deseadas. Véanse también Mikolajczyk et al.,
Bioconjugate Chem. 7: 150-158 (1996)
(componente Fab' de un conjugado Fab'-
\beta-lactamasa); Fagnani et al.,
-Nuclear Medicine Comm. 16: 362-369 (1995)
(fragmentos Fab' de un anticuerpo monoclonal
anti-antígeno carcinoembriónico de múrido); Fagnani
et al., Cancer Res. 50: 3638-3645
(1990) (inmunoglobulinas de múrido y conejo).
Sería por lo tanto deseable tener composiciones
farmacéuticas que contuvieran conjugados de
dextrano-leptina que fueran no anafilácticos para
individuos con ARD preformado en circulación. Además, sería
particularmente deseable tener conjugados de
dextrano-leptina que exhibieran las características
deseadas de, en comparación con la leptina no modificada, un tiempo
de circulación aumentado y una eficacia y solubilidad mejoradas. La
presente invención proporciona conjugados de
dextrano-leptina que tienen las ventajas de las
proteínas leptina modificadas químicamente sin los riesgos
potenciales asociados al polietilenglicol o a los dextranos
inductores de la anafilaxia.
La presente invención parte de la observación de
que ciertos conjugados de dextrano-leptina de peso
molecular relativamente bajo poseen sorprendentemente las
características deseables de eficacia y tiempo de circulación
mejorados y poseen otras características deseadas tales como una
solubilidad aumentada y una reducción de las reacciones en el sitio
de inyección en comparación con la leptina humana nativa. Además, la
desventaja potencial de la vacuolización renal, observada con
ciertos conjugados de polietilenglicol-leptina, no
se observó con los conjugados de dextrano-leptina
objeto.
Los ejemplos de trabajo indicados a continuación
muestran conjugados de dextrano-leptina que tienen
las siguientes características: (a) una eficacia mejorada frente a
la metionil-leptina humana recombinante no
modificada ("rmetHu-leptina"; (b) un tiempo de
circulación en plasma aumentado frente a la
rmetHu-leptina; (c) una solubilidad acuosa mejorada
a pH fisiológico frente a la rmetHu-leptina; (d)
reacciones en el sitio de inyección leves o inexistentes; (e) no
inmunogenicidad del conjugado de dextrano-leptina; y
(f) no inducción de vacuolización renal.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente
invención proporciona conjugados de dextrano-leptina
que comprenden al menos un resto dextrano de bajo peso molecular
unido al menos a un resto leptina, en los que el resto dextrano
tiene un peso molecular de 1 kD a 20 kD. Preferiblemente, para
facilitar la fabricación comercial de un producto farmacéutico, el
resto dextrano tiene un peso molecular de 1 kD a 10 kD, y más
preferiblemente aún de 1 kD a 7 kD. Es un resto dextrano
particularmente preferido de aproximadamente 6 kD, como se
ejemplifica en los ejemplos
siguientes.
siguientes.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporcionan conjugados de dextrano-leptina en los
que se une un resto dextrano de bajo peso molecular a uno o más
restos leptina. En aún otro aspecto de la invención, se proporcionan
conjugados de dextrano-leptina en los que se unen al
menos dos restos dextrano de bajo peso molecular a uno o más restos
leptina. Por tanto, la presente invención incluye en su alcance una
mezcla de conjugado de dextrano-leptina que contiene
cualquier combinación de al menos tres especies predominantes de
conjugados de dextrano-leptina: 1) conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a un resto leptina; 2) conjugado de dextrano-leptina
en el que se une un resto dextrano a dos restos leptina; y 3)
conjugado de dextrano-leptina en el que se unen dos
restos dextrano a dos restos leptina, estando unido el par de
conjugados de dextrano-leptina entre sí.
Preferiblemente, los conjugados de dextrano-leptina
de la presente invención contienen predominantemente 1) conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a dos restos leptina; y 2) conjugado de
dextrano-leptina en el que se unen dos restos
dextrano a dos restos leptina, estando unido el par de conjugados de
dextrano-leptina entre sí.
Se considera que las características de
actuación de los conjugados de dextrano-leptina de
la presente invención descritos anteriormente pueden mejorar
aumentando el grado de derivatización (concretamente, uniendo restos
dextrano adicionales a un resto leptina) sin ningún efecto negativo
sobre el potencial inductor de anafilaxia. Por tanto, los conjugados
de dextrano-leptina en los que se unen múltiples
restos dextrano al resto leptina están dentro del alcance de la
invención. Dicho conjugado multidextrano-leptina
exhibiría las mismas características deseables descritas
anteriormente.
En aún otro aspecto, la presente invención se
refiere a composiciones farmacéuticas que contienen los presentes
conjugados de dextrano-leptina en un vehículo
farmacéuticamente adecuado. Preferiblemente, las presentes
composiciones farmacéuticas contienen 1) un conjugado de
dextrano-leptina en el que un resto dextrano está
unido a dos restos leptina; y 2) un conjugado de
dextrano-leptina en el que dos restos dextrano están
unidos a dos restos leptina, estando unido el par de conjugados de
dextrano-leptina entre sí. Es un resto dextrana
particularmente preferido de aproximadamente 6 kD, como se
ejemplifica en los conjugados de dextrano-leptina
siguientes.
La presente invención se refiere también a
procesos para preparar conjugados de
dextrano-leptina como se describe anteriormente.
La presente invención se refiere también a
medicamentos para el tratamiento de individuos que utilizan
conjugados de dextrano-leptina y mezclas de
conjugados como se describen anteriormente.
La Figura 1A es una línea de registro
cartográfico peptídico de la digestión con Endolys-C
de la rmetHu-leptina no modificada ("leptina")
y del conjugado de
dextrano-rmetHu-leptina
("dextrano-leptina"); la Figura 1B es una línea
de registro cartográfico peptídico de la digestión con
Endoasp-N. La flecha en cada línea de registro
indica el péptido N-terminal de la
rmetHu-leptina no modificada.
La Figura 2 presenta un gel en gradiente de
SDS-PAGE reductor de 4-20% de
Tris-glicina que muestra que se dimeriza una
proporción significativa del conjugado de dextrano de 6
kD-leptina. El carril 1 son patrones de peso
molecular (Mark 12, Novex, San Diego, CA); el carril 2 es
rmetHu-leptina no modificada como control; el carril
3 es una mezcla del conjugado de
dextrano-rmetHu-leptina y el carril
4 es conjugado de
dextrano-rmetHu-leptina después de
cromatografía de intercambio iónico.
La Figura 3 es una gráfica que muestra los datos
en ratones de la cantidad de pérdida de peso respecto a un control
tampón frente a la dosis al final de un estudio de siete días de
dosificación diaria de (a) rmetHu-leptina no
modificada ("leptina"); y (b) conjugado de
dextrano-rmetHu-leptina
N-terminal ("dex-leptina").
La Figura 4 es una gráfica que muestra los datos
en ratones del efecto de pérdida de peso sostenido del conjugado de
dextrano-leptina de 6 kD en comparación con la
rmetHu-leptina no modificada en un estudio de dosis
única. La pérdida de peso se mide como % de pérdida de peso respecto
a un control tampón frente al tiempo (días).
La Figura 5 muestra los tiempos de circulación en
la sangre para un conjugado de dextrano de 6
kD-leptina comparados con
rmetHu-leptina no modificada en un estudio en rata
de dosis única. La Figura 5A muestra los datos de inyección
intravenosa; la Figura 5B muestra los datos de inyección
subcutánea.
La Figura 6 es una gráfica que muestra los datos
en ratones del porcentaje de pérdida de peso respecto a un control
tampón frente al tiempo al final de un estudio de siete días de
dosificación diaria de (a) rmetHu-leptina no
modificada y (b) conjugado de dextrano de 17,5
kD-leptina.
La Figura 7 es una gráfica que muestra los datos
en ratones del porcentaje de pérdida de peso respecto a un control
tampón frente al tiempo en un estudio de dosis única para (a)
rmetHu-leptina no modificada y (b) conjugado de
dextrano de 17,5 kD-leptina.
La presente invención proporciona conjugados de
dextrano-leptina que tienen las ventajas de una
eficacia mejorada, un tiempo de circulación plasmática más largo y
ninguna formación de vacuolas renales, entre otras. Las ventajas
adicionales de los conjugados de dextrano-leptina de
la presente invención incluyen una solubilidad mejorada y reacciones
mínimas en los sitios de inyección.
Los dextranos de bajo peso molecular utilizados
en la práctica de esta invención incluyen dextranos que tienen un
peso molecular de 1 kD a 20 kD, teniendo los dextranos más
preferidos un peso molecular en el intervalo de 1 kD a 10 kD. Se
prefieren más aún dextranos que tienen un peso molecular de 1 kD a 7
kD. Es un dextrano particularmente preferido por su facilidad de
fabricación comercial de un producto farmacéutico para uso humano
aquel que tiene un peso molecular de aproximadamente 6 kD
(utilizándose el término "aproximadamente" como se indica
anteriormente en la sección de "antecedentes"). De media, un
mol de dextrano de 6 kD está compuesto por 33,3 subunidades de
glucosa.
Se prefiere adicionalmente, por razones
similares, el dextrano no ramificado. El dextrano "nativo" se
produce por la bacteria Leuconostoc spp. El dextrano
"clínico" se prepara mediante la despolimerización del dextrano
nativo. De vez en cuando, pueden producirse restos dextrano tales
que se formen ciertos grupos laterales de moléculas de glucosa
unidos por enlaces \alpha1-3. La formación de
dichos grupos laterales se designa habitualmente como
"ramificación" en la técnica. Aunque no se comprende totalmente
en la actualidad, los restos dextrano de gran peso molecular con
dichos grupos laterales pueden tener más tendencia a causar
anafilaxia en seres humanos. Aunque no se desea limitarse a teoría
alguna, se cree que existe menos potencial de ramificación en los
dextranos de bajo peso molecular y, particularmente, de ramificación
múltiple, concretamente de más de un grupo lateral
\alpha1-3 por molécula de dextrano. Esto es
crítico porque se cree que las ramificaciones múltiples son
responsables de la agregación de los anticuerpos reactivos con
dextrano preformados con el dextrano, causando así la formación de
grandes complejos inmunes. Por lo tanto, preferiblemente para un
producto terapéutico humano, los restos dextrano para las
composiciones contempladas en la presente memoria son
predominantemente aquellos con enlaces \alpha1-6
entre subunidades de glucosa, y que minimizan los grupos laterales
\alpha1-3. Se ha mostrado también que el dextrano
clínico producido por Leuconostoc mesenteroides cepa NRRL B
512 minimiza las reacciones anafilácticas. Richter et al.,
supra.
Por tanto, es una característica importante de
los dextranos de bajo peso molecular utilizados en los conjugados de
dextrano-leptina de la presente invención que no son
anafilácticos para individuos con altas titulaciones de ARD
preformado en circulación.
Los restos dextrano se "activan" de modo que
puedan unirse al resto proteína leptina. Dichos métodos de
activación son bien conocidos por los expertos en la técnica e
incluyen, entre otros, introducir un resto químico en el dextrano
que pueda formar un enlace con un resto químico presente en la
proteína leptina. Véase en general, Larsen, Advanced Drug
Delivery Reviews 3: 103-154 (1989), incorporado
a la presente memoria como referencia. El término dextrano
"activado" designa dextrano que contiene múltiples grupos
reactivos. El tipo de resto químico "activado" en el dextrano
dependerá del modo en que se desee unir el resto dextrano al resto
proteína. Por ejemplo, puede añadirse un grupo aldehído al dextrano
de modo que el resto dextrano pueda unirse al resto leptina en
condiciones reductoras formando un enlace amina.
Es un método particularmente preferido de
activación la oxidación con peryodato de sodio. Se oxida el dextrano
para contener múltiples grupos aldehído según un procedimiento bien
conocido. Battersby et al., J. Contr. Rel. 42:
143-156 (1996); Fagnani et al., (1990),
supra, incorporados a la presente memoria como referencia. Se
da a conocer un método de oxidación preferido en los ejemplos a
continuación. La relación molar de peryodato a subunidad de glucosa
puede variar dependiendo del grado de oxidación deseado.
Generalmente, la relación molar de peryodato a subunidad de glucosa
puede variar de aproximadamente 0,02:1 a aproximadamente 3:1,
preferiblemente de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 1,5:1. Se
considera que se oxidan de aproximadamente un 5% a aproximadamente
un 50% de las subunidades de glucosa del dextrano. Este porcentaje
representa una media para la mezcla de reacción total, los restos
dextrano individuales pueden tener un porcentaje menor o mayor. Se
prefiere particularmente que aproximadamente un 10% de las
subunidades de glucosa contengan grupos aldehído. El término
dextrano "oxidado" designa dextrano que contiene múltiples
grupos aldehído.
Los restos dextrano deben unirse al resto leptina
considerando los efectos sobre los dominios funcionales o
antigénicos de la proteína. El método de unión de los restos
dextrano puede variar, y existe una serie de métodos disponibles
para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el dextrano puede
unirse covalentemente al resto proteína. La unión covalente puede
tener lugar mediante residuos aminoacídicos a través de un grupo
reactivo tal como una amina libre o un grupo carboxilo. Los residuos
aminoacídicos que tienen un grupo amina adecuado pueden incluir
residuos de lisina y el residuo aminoacídico
N-terminal del resto proteína leptina. Aquellos
aminoácidos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir
residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el
residuo aminoacídico C-terminal del resto proteína.
Los grupos sulfhidrilo pueden utilizarse también como grupo reactivo
para la unión del resto dextrano. Como alternativa, los grupos
reactivos pueden introducirse en el resto proteína mediante, por
ejemplo, inserción o mutagénesis dirigida a sitio. Se prefiere por
su facilidad de fabricación comercial la unión a un grupo amino tal
como la unión a la terminación N del resto proteína.
Generalmente, el dextrano activado con aldehído
puede unirse al resto leptina en condiciones reductoras formando un
enlace amina. Véanse Larsen, supra; Fagnani et al.
(1990), supra; véase también el documento PCT WO 96/11953. La
relación molar de restos dextrano a restos leptina puede estar en el
intervalo de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1,
preferiblemente de aproximadamente 20:1. Preferiblemente, el pH de
la mezcla de reacción se mantiene en o aproximadamente en pH 4,8
para que la conjugación del resto dextrano oxidado con el resto
leptina sea específica del sitio N-terminal. El pH
debe ser suficientemente ácido para que la amina
N-terminal del resto leptina no esté todavía
protonada, y por lo tanto sea reactiva, mientras que los grupos
amina en las demás posiciones del resto leptina están protonadas,
haciéndolas no reactivas.
Se considera que un experto en la técnica sería
capaz de preparar restos leptina reactivos múltiples alterando los
parámetros de reacción tales como elevando el pH de la mezcla de
reacción, utilizando otros grupos reactivos existentes o
introduciendo grupos reactivos adicionales en el resto leptina, como
se da a conocer anteriormente. Un experto en la técnica sabría cómo
combinar cualquier de los diversos métodos de conjugación química
conocidos para preparar restos leptina reactivos múltiples.
El resto dextrano puede unirse también al resto
leptina mediante restos "engarce" o engarces químicos, también
conocidos como reactivos de "reticulación", o aminoácidos de
longitudes variables. Dichos engarces químicos son bien conocidos en
la técnica e incluyen engarces químicos homobifuncionales
(concretamente el mismo grupo reactivo en cada extremo del engarce)
y engarces químicos heterobifuncionales (concretamente diferentes
grupos reactivos en cada extremo del engarce). Las consideraciones
tales como el tipo de grupos reactivos, la longitud entre los
extremos reactivos y otros rasgos beneficiosos del engarce, por
ejemplo un enlace metabolizable interno que permitiría la escisión
del resto dextrano del resto leptina, pueden influir en la elección
del engarce químico como es bien entendido por un experto en la
técnica. Véase, por ejemplo, el "Pierce Product Catalog", 1997
(Pierce Chemical Co., Rockford, IL) para una lista de reactivos de
reticulación y las referencias citadas en el mismo. Los engarces
químicos pueden unirse al resto leptina mediante cualquiera de los
grupos reactivos dados a conocer anteriormente en esta sección.
Consideraciones tales como la conformación, concretamente la
flexibilidad, y el tamaño del péptido pueden influir en la elección
del engarce peptídico, como es bien entendido por un experto en la
técnica. Por ejemplo, Neve et al.,
Cytokine 8: 365-370 (1996); Hallewell et al., J. Biol. Chem. 264: 5260-5268 (1989); véase en general, Chou & Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276 (1978). Las secuencias de engarce aminoacídico pueden incluir, pero sin limitación:
Cytokine 8: 365-370 (1996); Hallewell et al., J. Biol. Chem. 264: 5260-5268 (1989); véase en general, Chou & Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276 (1978). Las secuencias de engarce aminoacídico pueden incluir, pero sin limitación:
(a)
\;ala, ala, ala;
(b)
\;ala, ala, ala, ala;
(c)
\;ala, ala, ala, ala, ala;
(d)
\;gly, gly;
(e)
\;gly, gly, gly;
(f)
\;gly, gly, gly, gly, gly;
(g)
\;gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly;
(h)
\;gly, pro, gly;
(i)
\;gly, gly, pro, gly, gly; y
(j)
\;cualquier combinación de las subpartes (a) a (i).
Las secuencias de engarce aminoacídico pueden
unirse a la terminación N o a la terminación C del resto leptina
mediante la expresión del resto leptina en forma de una proteína de
fusión.
Composición de los conjugados de
dextrano-leptina. Los conjugados de
dextrano-leptina de la presente invención pueden
caracterizarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica tales
como análisis SDS-PAGE, espectrometría de masas,
cartografía peptídica por HPLC-FI y análisis de
secuencia N-terminal. Se ha encontrado que, en
general, existen al menos tres especies de conjugados de
dextrano-leptina N-terminales en la
mezcla de reacción después de unir el dextrano al resto leptina como
se describe anteriormente. Las tres especies son: 1) un resto
dextrano unido a un resto leptina; 2) un resto dextrano unido a dos
restos leptina; y 3) dos restos dextrano unidos a dos restos
leptina. Se cree que la especie de dos dextranos-dos
leptinas está formada por un par de conjugados de
dextrano-leptina unidos entre sí. Las dos últimas
especies constituyen típicamente aproximadamente un
65-85% de la mezcla de reacción, dando cuenta la
primera especie típicamente de un 5-10% de la mezcla
de reacción. Las especies minoritarias restantes aparecen como
leptina no reaccionada y entidades de mayor peso molecular en
análisis SDS-PAGE. Éstas pueden retirarse de la
mezcla utilizando métodos conocidos. Después de la purificación, las
dos especies diméricas constituyen típicamente aproximadamente un
70-90% del conjugado de
dextrano-leptina.
Se considera que, si se desea reducir la
tendencia del conjugado de dextrano-leptina a formar
un dímero, un experto en la técnica puede preparar un análogo de
leptina, como se discute a continuación, que tenga una tendencia
reducida hacia la formación de dímero.
Proteínas leptina. El tipo de leptina
utilizada para los presentes conjugados de
dextrano-leptina puede seleccionarse de los
descritos en la publicación internacional PCT número WO 96/05309,
como se cita anteriormente y se incorpora a la presente memoria como
referencia en su totalidad. La Figura 3 de esa publicación (como se
cita en la misma como SEC ID Nº 4) describe la secuencia
aminoacídica deducida completa derivada de leptina humana (designada
como la proteína "OB" humana). Los aminoácidos se numeran de 1
a 167. Se localiza un sitio de escisión secuencia señal después del
aminoácido 21 (Ala), de modo que la proteína madura se extiende
desde el aminoácido 22 (Val) al aminoácido 167 (Cys). Para la
presente descripción, se utiliza una numeración diferente en la
presente memoria, en la que la posición aminoacídica 1 es el residuo
de valina que está al inicio de la proteína madura. La secuencia
aminoacídica para la metionil-leptina humana
recombinante madura se presenta en la presente memoria como la SEC
Nº ID 1, en la que el primer aminoácido de la proteína madura es
valina (en la posición 1) y se localiza un residuo de metionilo en
la posición -1 (no incluido en la secuencia siguiente).
Sin embargo, como con cualquiera de los presentes
restos leptina, el residuo de metionilo en la posición -1 puede
estar ausente.
Como alternativa, puede utilizarse una variante
natural de la leptina humana que tiene 145 aminoácidos y, en
comparación con la rmetHu-leptina de SEC ID Nº 1,
tiene una glutamina ausente en la posición 28.
Generalmente, el resto leptina para uso
farmacéutico humano podrá tener uso terapéutico en seres humanos
(véanse también las leptinas animales a continuación). Por tanto,
puede ensayarse empíricamente la actividad para determinar cuáles
restos leptina pueden utilizarse. Como se indica en el documento WO
96/05309, la proteína leptina en su forma nativa, o fragmentos
(tales como productos de escisión enzimática) u otras formas
truncadas o análogos pueden retener todos actividad biológica.
Cualquiera de dichas formas puede utilizarse como resto leptina para
los presentes conjugados de dextrano-leptina, aunque
dichas formas alteradas deben ensayarse para determinar las
características deseadas. Véanse también las publicaciones
internacionales PCT números WO 96/40912, WO 97/06816, WO 97/18833,
WO 97/38014, WO 98/08512 y WO 98/28427, incorporadas a la presente
memoria como referencia en sus totalidades.
Puede prepararse un análogo de leptina humana
recombinante alterando los residuos aminoacídicos en la secuencia
humana recombinante, tal como sustituyendo los aminoácidos que
divergen de la secuencia de múrido. La leptina de múrido es
sustancialmente homóloga de la leptina humana, particularmente en
forma de proteína madura y, además, particularmente en la
terminación N. Debido a que la proteína humana recombinante tiene
actividad biológica en ratones, dicho análogo será probablemente
activo en seres humanos. Por ejemplo, en la secuencia aminoacídica
de la leptina humana nativa como se presenta en la SEC ID Nº 1,
puede sustituirse por otro aminoácido uno o más de los aminoácidos
en las posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 101,
105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Puede
seleccionarse el aminoácido en la posición correspondiente de la
proteína de múrido (véase Zhang et al., 1994, supra) u
otro aminoácido.
Pueden prepararse adicionalmente moléculas "de
consenso" basadas en la secuencia de la proteína OB de rata.
Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209:
944-952 (1995) incorporada a la presente memoria
como referencia. La proteína OB de rata difiere de la proteína OB
humana en las siguientes posiciones (utilizando la numeración de la
SEC ID Nº 1): 4, 32, 33, 35, 50, 68,
71, 74, 77, 78, 89, 97,
100, 101, 102, 105, 106, 107,
108, 111, 118, 136, 138 y
145. Puede sustituirse por otro aminoácido uno o más de los
aminoácidos en estas posiciones divergentes. Las posiciones
subrayadas son aquellas en que la proteína OB de múrido así como la
proteína OB de rata son divergentes de la proteína OB humana y, por
tanto, son particularmente adecuadas para alteración. En una o más
de las posiciones, puede sustituirse un aminoácido de la
correspondiente proteína OB de rata u otro aminoácido.
Las posiciones tanto de proteína OB de rata como
de múrido que divergen de la proteína OB humana madura son: 4, 32,
33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106,
107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Puede ser también eficaz
una proteína OB según la SEC ID Nº 1 que tiene uno o más de los
aminoácidos anteriores reemplazados por otro aminoácido, tal como el
aminoácido encontrado en la correspondiente secuencia de rata o
múrido.
Además, los aminoácidos encontrados en la
proteína OB de mono Rhesus que divergen de la proteína OB humana
madura son (con las identidades indicadas entre paréntesis con la
abreviatura de aminoácidos de una letra): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53
(Q), 60 (I), 66 (I), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112
(D) y 118 (L). Puesto que la proteína OB humana recombinante es
activa en monos Cynomolgus, puede ser eficaz una proteína OB humana
según la SEC ID Nº 1 que tiene uno o más de los aminoácidos
divergentes de mono Rhesus reemplazados por otro aminoácido, tal
como los aminoácidos entre paréntesis. Debe observarse que ciertos
aminoácidos divergentes de Rhesus son también los encontrados en las
especies de múrido y rata anteriores (posiciones 35, 68, 89, 100,
108 y 118). Por tanto, puede prepararse una molécula consenso de
múrido/rata/Rhesus/humana (utilizando la numeración de la SEC ID Nº
1) que tiene uno o más de los aminoácidos reemplazados por otro
aminoácido en las posiciones 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53,
60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97,
100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118,
136, 138, 142 y 145. Las posiciones subrayadas son aquellas en que
las tres especies son divergentes de la proteína OB humana. Es un
análogo de leptina humana particularmente preferido aquel en el que
los aminoácidos en la posición 100 (Trp) o 138 (Trp), y más
preferiblemente en ambas posiciones, están sustituidos por otro
aminoácido, preferiblemente Gln.
Pueden prepararse otros análogos eliminando una
parte de la secuencia aminoacídica de la proteína. Por ejemplo, la
proteína madura carece de una secuencia líder (-22 a -1). Pueden
prepararse las siguientes formas truncadas de moléculas de proteína
OB humana (utilizando la numeración de la SEC ID Nº 1):
(i)
\hskip3mmaminoácidos 98-146;
(ii)
\hskip2mmaminoácidos 1-99 y (conectados con) 112-146;
(iii)
\hskip1mmaminoácidos 1-99 y (conectados con) 112-146 que tienen uno o más de los aminoácidos 100-111 dispuestos secuencialmente entre los aminoácidos 99 y 112.
Además, las formas truncadas pueden tener también
alterados uno o más de los aminoácidos que son divergentes (en la
proteína OB de múrido, rata o Rhesus) de la proteína OB humana.
Además, cualquier alteración puede estar en forma de aminoácidos
alterados, tales como peptidomiméticos o
D-aminoácidos.
Se incluyen también aquellas proteínas como se
indican anteriormente con sustituciones aminoacídicas que son
"conservativas" según la acidez, carga, hidrofobicidad,
polaridad, tamaño o cualquier otra característica conocida por los
expertos en la técnica. Éstas se indican en la Tabla 1 a
continuación. Véase en general, Creighton, Proteins, passim
(W.H. Freeman and Company, NY, 1984); Ford et al., Protein
Expression and Purification 2: 95-107 (1991),
que se incorporan a la presente memoria como referencia.
| Básicos: | Arginina |
| Lisina | |
| Histidina | |
| Ácidos | Ácido glutámico |
| Ácido aspártico | |
| Polares: | Glutamina |
| Asparagina | |
| Hidrófobos: | Leucina |
| Isoleucina | |
| Valina |
| Aromáticos: | Fenilalanina |
| Triptófano | |
| Tirosina | |
| Pequeños: | Glicina |
| Alanina | |
| Serina | |
| Treonina | |
| Metionina |
Por lo tanto, los presentes conjugados de
dextrano-leptina pueden seleccionarse de entre
(según la secuencia aminoacídica presentada en la SEC ID Nº 1 en la
presente memoria):
(a) la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 1, que
carece opcionalmente de un residuo de glutaminilo en la posición 28,
y que tiene opcionalmente un residuo de metionilo en la terminación
N;
(b) una secuencia aminoacídica de la subparte (a)
que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de las
siguientes posiciones: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67,
68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112,
118, 136, 138, 142 y 145;
(c) una secuencia aminoacídica de la subparte (b)
en la que los aminoácidos en las posiciones 100 y 138 están
sustituidos por Gln;
(d) un análogo de proteína leptina truncada
seleccionado de entre
- (i)
- los aminoácidos 98-146;
- (ii)
- los aminoácidos 1-99 y 112-146;
- (iii)
- los aminoácidos 1-99 y 112-146 que tienen uno o más de los aminoácidos 100-111 dispuestos secuencialmente entre los aminoácidos 99 y 112; y
- (iv)
- el análogo de leptina truncada de la subparte (i) que tiene uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos por otro aminoácido;
- (v)
- el análogo de leptina truncada de la subparte (iii) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 reemplazados por otro aminoácido;
- (vi)
- el análogo de leptina truncada de la subparte (iv) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 142 y 145 reemplazados por otro aminoácido; y
- (vii)
- el análogo de leptina truncada de cualquiera de las subpartes (i)-(vi) que tiene un residuo de metionilo N-terminal;
(e) una proteína leptina de cualquiera de las
subpartes (a)-(d) que tiene una o más sustituciones aminoacídicas
conservadas.
Se reseñan también proteínas leptina, análogos y
moléculas relacionadas en las siguientes publicaciones; sin embargo
no se hace mención con respecto a la actividad de ninguna de las
composiciones reseñadas:
- patentes de EE.UU. nº 5.521.283, 5.525.705, 5.532.336, 5.552.522, 5.552.523, 5.552.524, 5.554.727, 5.559.208, 5.563.243, 5.563.244, 5.563.245, 5.567.678, 5.567.803, 5.569.743, 5.569.744, 5.574.133, 5.580.954, 5.594.101, 5.594.104, 5.605.886, 5.614.379, 5.691.309, 5.719.266 (Eli Lilly and Company); PCT WO 96/23513, WO 96/23514, WO 96/23515, WO 96/23516, WO 96/23517, WO 96/23518, WO 96/23519, WO 96/23520, WO 96/23815, WO 96/27385, WO 96/34111, WO 96/37517, WO 97/00886, EP 725078, EP 725079, EP 744408, EP 745610, EP 835879 (Eli Lilly and Company); PCT WO 96/22308 (Zymogenetics), PCT WO 96/31526 (Amylin Pharmaceuticals, Inc.); PCT WO 96/34885, WO 97/46585 (SmithKline Beecham, PLC), PCT WO 96/35787 (Chiron Corporation), PCT WO 97/16550 (Bristol-Myers Squibb), PCT WO 97/20933 (Schering Corporation), EP 736599 (Takeda), EP 741187 (F. Hoffman LaRoche).
En la medida que estas referencias proporcionen
proteínas leptina o análogos útiles, o composiciones asociadas o
métodos, dichas composiciones y/o métodos pueden utilizarse junto
con los presentes conjugados de dextrano-leptina,
tal como para coadministración (conjunta o separadamente, en un
esquema de dosificación seleccionado).
Se contemplan específicamente los siguientes
conjugados de dextrano-leptina: leptina humana
recombinante ("rHu-leptina"), la secuencia
aminoacídica de SEC ID Nº 1, que carece opcionalmente de un residuo
de glutamina en la posición 28, y que tiene además opcionalmente un
residuo de metionilo N-terminal, unida a (a) un
resto dextrano sólo en la terminación N; o (b) un resto dextrano en
la terminación N en combinación con restos dextrano adicionales en
la terminación N en posiciones distintas de la terminación N de la
proteína leptina. Particularmente, los restos dextrano de los
presentes conjugados de dextrano-leptina pueden
tener un peso molecular en el intervalo de 1 kD a 20 kD, más
particularmente de 1 kD a 10 kD, aún más particularmente de 1 kD a 7
kD y, lo más particularmente, tener un peso molecular de
aproximadamente 6 kD. Se contempla también específicamente un
conjugado de dextrano-leptina constituido por un
resto dextrano de 6 kD unido a la terminación N de
rmetHu-leptina. Los restos dextrano de los presentes
conjugados de dextrano-leptina se preparan
preferiblemente a partir de una cepa de bacteria que minimiza la
ramificación \alpha1-3.
Se contemplan también específicamente mezclas de
conjugado de dextrano-leptina que comprenden los
siguientes en cualquier combinación:
(a) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a un resto leptina;
(b) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a dos restos leptina; y
(c) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se unen dos restos
dextrano a dos restos leptina, estando unido dicho par de conjugados
de dextrano-leptina entre sí; estando unido el resto
dextrano a la terminación N del resto leptina que tiene la secuencia
aminoacídica de SEC ID Nº 1, que carece opcionalmente de un residuo
de glutaminilo en la posición 28 y que tiene opcionalmente además un
residuo de metionilo en la terminación N.
Además de la leptina terapéutica humana anterior,
están también disponibles ciertas leptinas animales para uso
terapéutico animal. Se da a conocer la leptina canina en el
documento WO 97/32022. Se dan a conocer otras especies animales en
las siguientes publicaciones: WO 96/36644, EP 743321 (porcina y
bovina); WO 98/04288 (bovina); WO 98/04690 (porcina).
En aún otro aspecto de la presente invención, se
proporcionan composiciones farmacéuticas de los presentes conjugados
de dextrano-leptina y medicamentos que utilizan
dichas composiciones farmacéuticas para usos terapéuticos. Dichas
composiciones farmacéuticas pueden ser para administración mediante
inyección en bolo o mediante infusión (por ejemplo intravenosa o
subcutánea), u oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de
administración. En general, la invención abarca composiciones
farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de conjugados de
dextrano-leptina de la invención junto con
diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes,
coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dichas
composiciones farmacéuticas incluyen diluyentes de diversos
contenido de tampón (por ejemplo Tris-HCl, acetato,
fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como detergentes y
agentes solubilizantes (por ejemplo Tween 80, Polisorbato 80),
antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metabisulfito de sodio),
conservantes (por ejemplo timersol, alcohol bencílico) y sustancias
de carga (por ejemplo lactosa, manitol); y la incorporación del
material a preparaciones particuladas de compuestos poliméricos
tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) etc., o a
liposomas. Véase, por ejemplo, el documento PCT WO 96/29989. Puede
utilizarse también ácido hialurónico, y esto puede tener el efecto
de aumentar la duración sostenida en circulación. Dichas
composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad,
velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación
in vivo de los presentes conjugados de
dextrano-leptina. Véase, por ejemplo, "Remington's
Pharmaceutical Sciences", 18ª ed. (1990, Mack Publishing Co.,
Easton, PA 18042) páginas 1435-1712. Las
composiciones pueden prepararse en forma líquida o pueden estar en
forma seca, tal como en forma liofilizada. Las formulaciones de
liberación sostenida implantables se contemplan también, así como
las formulaciones
transdérmicas.
transdérmicas.
Se contemplan formulaciones orales, como se
describen en el documento PCT WO 95/21629. Esta publicación PCT
describe el suministro oral de proteínas químicamente modificadas,
incluyendo proteínas modificadas por restos dextrano. Las
composiciones y métodos dados a conocer en la misma son aplicables
aquí para preparar formulaciones de suministro oral de los presentes
conjugados de dextrano-leptina.
El suministro pulmonar de los presentes
conjugados de dextrano-leptina está también
contemplado, y las composiciones y métodos dados a conocer en el
documento PCT WO 94/20069 son útiles para la preparación y el uso de
los presentes conjugados de dextrano-leptina. El
documento WO 94/20069 da a conocer el suministro pulmonar de
G-CSF modificado químicamente.
Los conjugados de
dextrano-leptina de la presente invención deben
prepararse ventajosamente en forma particulada con un tamaño de
partícula medio de menos de 10 micrómetros, lo más preferiblemente
de 0,5 a 5 micrómetros, para un suministro más eficaz al pulmón
distal.
El suministro nasal de los presentes conjugados
de dextrano-leptina está también contemplado. El
suministro nasal permite el paso de la proteína a la corriente
sanguínea directamente después de administrar el producto
terapéutico a la nariz, sin necesidad de deposición del producto en
el pulmón. Las formulaciones para suministro nasal incluyen aquellas
con dextrano o dextrina, tales como ciclodextrina. El suministro
mediante transporte a través de otras membranas mucosas está también
contemplado.
Un experto en la técnica podrá evaluar las
dosificaciones eficaces mediante la administración y la observación
del efecto terapéutico deseado. Preferiblemente, la formulación del
conjugado será tal que entre aproximadamente 0,01 \mug de resto
leptina/kg de peso corporal/día y 10 mg de resto leptina/kg de peso
corporal/día se proporcionará el efecto terapéutico deseado. Las
dosificaciones eficaces pueden determinarse utilizando herramientas
de diagnóstico frente al tiempo. Por ejemplo, puede utilizarse en
primer lugar un diagnóstico para medir la cantidad de leptina en la
sangre (o plasma o suero) para determinar los niveles endógenos de
proteína leptina. Dicha herramienta de diagnóstico puede estar en
forma de un ensayo de anticuerpos, tal como un ensayo de anticuerpos
de tipo sándwich. Se cuantifica inicialmente la cantidad de proteína
leptina endógena, y se determina la línea base. Las dosificaciones
terapéuticas se determinan a medida que continúa la cuantificación
de resto proteína leptina endógena y exógena (es decir, proteína,
análogo o derivado encontrado en el cuerpo, autoproducido o
administrado) durante el transcurso de la terapia. Las
dosificaciones pueden variar por lo tanto durante el transcurso de
la terapia, utilizándose inicialmente por ejemplo una dosificación
relativamente alta, hasta que se observa el beneficio terapéutico, y
utilizándose dosificaciones menores para mantener los beneficios
terapéuticos.
Terapéutico: Los usos terapéuticos
incluyen la modulación del peso, el tratamiento o la prevención de
la diabetes, la reducción del nivel de lípidos sanguíneos (y el
tratamiento de afecciones relacionadas), el aumento de la masa
corporal magra y el aumento de la sensibilidad a la insulina.
Además, las presentes composiciones pueden utilizarse para la
fabricación de uno o más medicamentos para el tratamiento o la
mejora de las afecciones anteriores.
Modulación del peso: Las presentes
composiciones pueden utilizarse para la reducción del peso. Visto de
otro modo, las presentes composiciones pueden utilizarse para el
mantenimiento de un peso o nivel de adiposidad deseado. Como se ha
demostrado en modelos de múrido (véase a continuación), la
administración de los presentes conjugados de
dextrano-leptina da como resultado la pérdida de
peso. La masa corporal perdida es principalmente de tejido adiposo o
grasa. Dicha pérdida de peso puede asociarse al tratamiento de
afecciones concomitantes tales como las siguientes, y constituye por
tanto una aplicación terapéutica. Además, se proporcionan usos
cosméticos en la presente memoria si la modulación del peso es
únicamente para mejora de la apariencia.
Tratamiento de la diabetes. Las presentes
composiciones pueden utilizarse en la prevención o el tratamiento de
diabetes de tipo II. Ya que la diabetes de tipo II puede
correlacionarse con la obesidad, el uso de la presente invención
para reducir peso (o mantener un peso deseado, o reducir o mantener
un nivel de adiposidad) puede aliviar o prevenir también el
desarrollo de la diabetes. Además, incluso en ausencia de
dosificaciones suficientes para dar como resultado la pérdida de
peso, las presentes composiciones pueden utilizarse para prevenir o
mejorar la diabetes.
Modulación de lípidos sanguíneos. Las
presentes composiciones pueden utilizarse en la modulación de los
niveles de lípidos sanguíneos. La hiperlipidemia (también denominada
lipemia o dislipidemia) es la presencia de una cantidad anormalmente
grande de lípidos en la sangre en circulación. Idealmente, en
situaciones en que se desea únicamente la reducción de los niveles
de lípidos sanguíneos, o en que se desea el mantenimiento de los
niveles de lípidos sanguíneos, la dosificación será insuficiente
para dar como resultado la pérdida de peso. Por tanto, durante el
transcurso inicial de la terapia de un paciente obeso, pueden
administrarse dosificaciones mediante las que se consiga una pérdida
de peso y una reducción concomitante de los niveles de lípidos
sanguíneos. Una vez se ha conseguido una pérdida de peso suficiente,
puede administrarse por ejemplo una dosificación suficiente para
evitar volver a ganar peso, pero suficiente para mantener los
niveles de lípidos sanguíneos deseados, u otras condiciones como se
indican en la presente memoria. Estas dosificaciones pueden
determinarse empíricamente, ya que los efectos de la proteína
leptina son reversibles. Por ejemplo Campfield et al.,
Science 269: 546-549 (1995) en 547.
Por tanto, si se observa una dosificación que da como resultado
pérdida de peso cuando no se desea pérdida de peso, se administraría
una dosis menor para conseguir los niveles de lípidos sanguíneos
deseados, pero manteniendo el peso deseado. Véase, por ejemplo, la
publicación PCT WO 97/06816 incorporada a la presente memoria como
referencia.
Aumentar la masa magra o la sensibilidad a la
insulina. Idealmente, en situaciones en que se desea únicamente
un aumento de la masa corporal magra, la dosificación será
insuficiente para dar como resultado pérdida de peso. Por tanto,
durante el transcurso inicial de la terapia de un paciente obeso,
pueden administrarse dosificaciones mediante las que se consiga una
pérdida de peso y una reducción del tejido graso/aumento de la masa
magra concomitante. Una vez se consigue suficiente pérdida de peso,
puede administrarse una dosificación suficiente para evitar volver a
ganar peso, pero suficiente para mantener el aumento de masa magra
deseado (o la prevención del agotamiento de masa magra). Para
aumentar la sensibilidad de un individuo a la insulina, pueden
tenerse en cuenta consideraciones de dosificación similares. El
aumento de masa magra sin pérdida de peso puede considerarse
suficiente para reducir la cantidad de insulina (o potencialmente
amilina, antagonistas o agonistas de amilina o tiazolidindionas, u
otros fármacos que tratan potencialmente la diabetes) que se
administraría a un individuo para el tratamiento de la diabetes.
Para aumentar el vigor total, puede haber consideraciones de
dosificación similares. El aumento de masa magra con aumento
concomitante del vigor total puede conseguirse con dosis
insuficientes para dar como resultado pérdida de peso. Pueden
conseguirse también otros beneficios tales como un aumento de los
glóbulos rojos (y de la oxigenación de la sangre) y una reducción de
la resorción ósea o la osteoporosis en ausencia de pérdida de peso.
Véase, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 97/18833.
Terapias de combinación. Las presentes
combinaciones pueden utilizarse junto con otras terapias tales como
dietas alteradas y ejercicio y otros medicamentos tales como
aquellos útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo
insulina y posiblemente amilina, antagonistas o agonistas de la
misma, tiazolidindionas (véase, por ejemplo, la publicación PCT Nº
WO 98/08512, u otros fármacos que tratan potencialmente la
diabetes), medicamentos reductores del nivel de colesterol y de la
presión sanguínea (tales como aquellos que reducen los niveles de
lípidos sanguíneos u otros medicamentos cardiovasculares),
medicamentos que aumentan la actividad (por ejemplo anfetaminas),
diuréticos (para la eliminación de líquidos) y supresores del
apetito (tales como agentes que actúan sobre receptores del
neuropéptido Y o inhibidores de la recaptación de serotonina). Dicha
administración puede ser simultánea o puede ser en serie. Además,
los presentes métodos pueden utilizarse junto con procedimientos
quirúrgicos, tales como cirugía cosmética, ideados para alterar la
apariencia global de un cuerpo (por ejemplo liposucción o cirugía
láser ideadas para reducir la masa corporal, o cirugías de implante
ideadas para aumentar la apariencia de masa corporal). Los
beneficios sanitarios de la cirugía cardiaca, tales como cirugía de
bypass u otras cirugías ideadas para aliviar una afección dañina
causada por el bloqueo de vasos sanguíneos por depósitos grasos, tal
como placa arterial, pueden aumentarse con el uso concomitante de
las presentes composiciones y métodos. Pueden utilizarse también
métodos para eliminar cálculos biliares, tales como métodos
ultrasónicos o láser, antes, durante o después del transcurso de los
presentes métodos terapéuticos. Además, los presentes métodos pueden
utilizarse como auxiliares para cirugías o terapias para huesos
rotos, músculo dañado u otras terapias que mejorarían por un aumento
de la masa de tejido magro.
Los restos leptina utilizados en la presente
memoria pueden prepararse en células procarióticas o eucarióticas,
aunque para los restos leptina utilizados en los ejemplos de trabajo
siguientes se prefieren las bacterias por su facilidad de
fabricación comercial. Puede utilizarse adicionalmente leptina
formada en células humanas, tal como la formada controlando un
elemento regulador nativo o introducido que afecta a la regulación
de un gen endógeno que codifica la proteína deseada. La expresión
recombinante de restos leptina útiles en los conjugados de
dextrano-leptina de la presente invención se ha
descrito, por ejemplo, en el documento WO 96/40912, incluyendo todos
los depósitos de vectores y cepas de hospedadores citados en el
mismo.
Los conjugados de
dextrano-leptina seleccionados de la presente
invención pueden aislarse de mezclas de conjugado de
dextrano-leptina utilizando métodos bien conocidos
en la técnica para la purificación de proteínas. Puede realizarse
fácilmente un procedimiento de purificación de una etapa realizando
una cromatografía de intercambio catiónico. Véase, por ejemplo,
Ralph et al., Biochemistry, 34:
4889-4897 (1995). Otro método de purificación
conocido útil en la purificación de conjugados de
dextrano-leptina de la presente invención implica
cromatografía de interacción hidrófoba. Véanse, por ejemplo, las
instrucciones del kit HiTrap HIC Test de Pharmacia Biotech,
71-7147-00, ed. AF, en
1-19 (1993; Uppsala, Suecia).
El primer conjunto de los ejemplos siguientes
muestra con el conjugado de dextrano de 6
kD-rmetHu-leptina: (1) actividad,
(2) tiempo de circulación aumentado in vivo en comparación
con la rmetHu-leptina nativa, (3) solubilidad
aumentada en condiciones fisiológicas (en comparación con la
rmetHu-leptina nativa), (4) falta de reacciones en
el sitio de inyección, (5) respuesta inmunogénica mínima en
primates; y (6) falta de vacuolización renal. El segundo conjunto de
los ejemplos siguientes muestra algunas de las mismas
características de actuación que anteriormente con el conjugado de
dextrano de 17,5
kD-rmetHu-leptina.
Animales. Los animales de ensayo
utilizados en los siguientes experimentos se albergaron cinco en una
jaula para ratones y dos en una jaula para ratas; se alimentaron
todos los animales a voluntad. Se mantuvo un ciclo de luz/oscuridad
de 12 horas a lo largo de los experimentos. Los animales se
manejaron y cuidaron según las prácticas aceptadas para el cuidado
de animales de laboratorio.
Administración de
dextrano-leptina. La administración de
composición de ensayo o placebo fue mediante inyección subcutánea
("sc") en la piel dorsal de la nuca del cuello de los animales
o por vía intravenosa a través de un catéter residente en la vena
yugular ("iv"). Todas las dosificaciones de conjugado de
dextrano-leptina se calcularon determinando la
concentración de proteína leptina del conjugado.
Proteína leptina. Se utilizó
metionil-leptina humana recombinante
(rmetHu-leptina) para los presentes
experimentos.
Este ejemplo muestra la preparación de un
conjugado de dextrano de 6 kD-leptina de la presente
invención.
Activación de dextrano. Se adquirió
dextrano de 6 kD (peso molar máximo 6 kD con una polidispersidad de
aproximadamente 1,77 kD) en Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY).
Se activó el dextrano para añadir grupos aldehído. Brevemente, se
añadió lentamente peryodato de sodio 0,35 M a tetraborato de sodio
10 mM en hielo, y se ajustó el pH a pH 3,0. Se añadieron 120 g de
dextrano de 6 kD a 400 ml de la solución anterior y se agitó la
mezcla durante 24 horas a temperatura ambiente. La relación molar de
peryodato a subunidad de glucosa fue de 0,26:1. Siguiendo la
agitación, se añadieron 73,6 ml de etilenglicol y se agitó la mezcla
durante 2 horas adicionales. Se dializó el dextrano oxidado
extensivamente frente a H_{2}O destilada desionizada.
Tanto antes como después de la activación, se
ensayó el dextrano utilizando cromatografía de permeación en gel
(GPC) para confirmar la estabilidad del resto dextrano. Después de
la activación, se cuantificó el número de aldehídos en los restos
dextrano activados utilizando métodos bien conocidos por un experto
en la técnica. Zhao & Heindel, Pharm. Res. 8:
400-402 (1991). Se ensayaron otros dextranos y se
activaron de forma similar.
Unión de dextrano a proteína leptina.
Brevemente, se preparó rmetHu-leptina en una
solución a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en tampón
acetato de sodio 40 mM, pH 4,8, que se mezcló con un dextrano
oxidado 10 mg/ml en una solución de acetato de sodio 40 mM, pH 4,8.
La relación molar final de restos dextrano a restos leptina fue de
20:1. Se agitó la mezcla en una plataforma giratoria durante 1 hora
a temperatura ambiente. Se añadió una solución de NaBH_{3}CN 1
mg/ml en acetato de sodio 40 mM, pH 4,8, a una relación molar de
NaBH_{3}CN a dextrano de 10:1. Se agitó la mezcla a temperatura
ambiente durante dos horas y después se transfirió a una sala fría
(4ºC) para continuar la agitación. Se trató el conjugado de
dextrano-leptina con NaBH_{4} 10 mg/ml en acetato
de sodio 40 mM, pH 4,8, a una relación molar de NaBH_{4} a
unidades de glucosa oxidadas de 2,5:1 (al 10% o 3,3 ml de unidades
de glucosa oxidadas/mol de dextrano de 6 kD). Se añadió gota a gota
la solución de NaBH_{4} a la mezcla en hielo con agitación.
Caracterización. Se realizó la
determinación de la sustitución de dextrano de los conjugados. Se
determinaron la pureza y el peso molecular aproximado de los
conjugados de dextrano-leptina mediante análisis
SDS-PAGE.
Se determinó que el enlace de los grupos aldehído
activados de los restos dextrano oxidados estaba unido a la
terminación N de los restos leptina. Brevemente, se cortaron el
conjugado de dextrano-rmetHu-leptina
y rmetHu-leptina no modificada mediante
endoproteasas en los residuos de lisina (EndoLys-C)
o en los residuos de ácido aspártico (EndoAsp-N),
respectivamente, en dos experimentos separados. Se digirieron las
muestras a una relación de enzima a sustrato de 1:50 y 1:75,
respectivamente, a 25ºC, durante 8 y 7 horas, respectivamente. Los
fragmentos peptídicos resultantes se cartografiaron mediante
HPLC-FI utilizando una columna YMC
C-8 (2,1 mm de di) y se eluyeron utilizando un
gradiente de dos disolventes, disolvente A) 0,1% de TFA en agua de
pureza HPLC y disolvente B) 01,% de TFA en acetonitrilo al 90% de
pureza HPLC a las siguientes concentraciones: 5 min, 100% de A; 80
min, 90% de A, 10% de B; 5 min, 50% de A, 50% de B; 10 min, 10% de
A, 90% de B. Se mantuvo la columna a 26ºC y se eluyó a 0,2 ml/min.
Ralph et al., supra. En comparación con la
rmetHu-leptina no modificada, la cartografía
peptídica del conjugado de
dextrano-rmetHu-leptina con
digestión con EndoLys-C (Fig. 1A) mostró que
desaparecía un solo pico aproximadamente a 14 minutos. De forma
similar, la cartografía peptídica con digestión con
Endoasp-N (Fig. 1B) mostró que desaparecía un solo
pico aproximadamente a 16 minutos. Se secuenciaron
N-terminalmente estos péptidos de
rmetHu-leptina no modificada para identificación, y
se confirmó que eran péptidos N-terminales generados
por las digestiones con proteasa. Por tanto, la unión del resto
dextrano al resto leptina fue selectiva de los péptidos
N-terminales. Además, la secuenciación
N-terminal mostró aproximadamente un 98,6% de
N-terminaciones bloqueadas, indicando que el
dextrano estaba conjugado con la terminación N de
rmetHu-leptina.
Además, se determinó mediante análisis
SDS-PAGE que la tendencia de la reacción se desplazó
hacia la formación de dímero, concretamente la unión de un resto
dextrano a dos restos leptina o de dos restos dextrano a dos restos
leptina. Como se observa en la Figura 2, una proporción
significativa del conjugado de dextrano-leptina
presenta formación de dímero (el carril 3 es una mezcla de conjugado
de dextrano-rmetHu-leptina). Se ha
determinado mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF de extracción retardada, utilizando ácido
sinapínico como matriz, que la banda principal del carril 3 consiste
en ambas especies diméricas (concretamente un resto
dextrano-dos restos leptina, dos restos
dextrano-dos restos leptina). Se separaron la
rmetHu-leptina no reaccionada y algunas de las
especies de mayor peso molecular formadas en cantidades minoritarias
de la mayoría de conjugados diméricos y la minoría de conjugados
monoméricos mediante cromatografía de intercambio iónico (el carril
4 muestra el conjugado de
dextrano-rmetHu-leptina después de
cromatografía de intercambio iónico).
Este ejemplo demuestra la eficacia mejorada de
los conjugados de dextrano de 6 kD-leptina de la
presente invención frente a la rmetHu-leptina no
modificada. Se ensayó la eficacia del conjugado de
dextrano-leptina del ejemplo 1 en la inducción de
pérdida de peso en ratones normales.
Se inyectaron diariamente ratones C57BL/6 hembra
normales (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) de
8-10 semanas de edad y aproximadamente 20 gramos de
peso durante siete días con el conjugado de
dextrano-leptina objeto (como se describe en el
ejemplo 1 anterior), leptina no modificada o placebo (solución
salina tamponada con fosfato, "PBS"). Se ensayaron dosis de 1
mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg y 100 mg/kg tanto para el
conjugado de dextrano-leptina como para la leptina
no modificada. Se monitorizaron los pesos durante el estudio.
Se comparó el cambio de peso al final del estudio
(día 7) para el grupo tratado con conjugado de
dextrano-leptina frente al grupo tratado con leptina
no modificada. Se calculó la pérdida de peso como la cantidad de
pérdida de peso respecto a un control tampón ((peso del grupo de
tampón-peso del grupo de muestra)/peso del grupo de
tampón x 100). La eficacia del conjugado de
dextrano-leptina era significativamente mayor que
para la leptina no modificada a dosis de 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50
mg/kg y 100 mg/kg. Además, se observó una respuesta a la dosis para
el conjugado de dextrano-leptina. El porcentaje de
pérdida de peso al final del estudio respecto al control con tampón
PBS se representó frente a la dosis en mg/kg tanto para el conjugado
de dextrano-leptina como para la leptina modificada.
Como se muestra en la Figura 3, ajustando los datos a curvas
logarítmicas sencillas y suponiendo que la DE_{50} (dosis
requerida para conseguir un 50% de pérdida de peso máxima) da un 7%
de pérdida de peso, puede aproximarse que los valores de DE_{50}
para el conjugado de dextrano-leptina y la leptina
no modificada son de 4 mg/kg y 20 mg/kg, respectivamente. Por tanto,
los datos demuestran que el conjugado de
dextrano-leptina de la presente invención es
aproximadamente 5 veces más eficaz que la leptina no modificada.
Este ejemplo demuestra el efecto de pérdida de
peso sostenida de los conjugados de dextrano de 6
kD-leptina de la presente invención. Se inyectaron
sc ratones C57BL/6 hembra normales de 8-10 semanas
de edad y de aproximadamente 20 g de peso sólo el día 0 a una dosis
de 100 mg/kg con conjugado de dextrano-leptina o
leptina no modificada. Como se observa en la Figura 4, el efecto de
pérdida de peso del conjugado de dextrano-leptina
duró 4-5 días, con un aumento de dos veces la
pérdida de peso máxima, mientras que el efecto de pérdida de peso de
la leptina no modificada duró sólo 1-2 días.
Los estudios farmacocinéticos en ratas mostraron
que el conjugado de dextrano-leptina persistía en la
sangre sustancialmente más tiempo que la leptina no modificada. Se
inyectaron ratas Wistar Kyoto macho cateterizadas de
200-250 g de peso con una dosis única a 10 mg/kg del
conjugado de dextrano-leptina objeto (como se
describe en el ejemplo 1 anterior) o leptina no modificada, por vía
sc o intravenosa ("iv"). Se extrajeron muestras de sangre a
intervalos de tiempo fijos tras la inyección mediante el catéter
residente. Como se observa en la Figura 5A, el conjugado de
dextrano-leptina inyectado por vía iv persistía en
la sangre a lo largo de 72 horas después de la inyección, mientras
que la leptina no modificada se eliminaba completamente en
aproximadamente 8-12 horas después de la inyección.
Aunque ambas moléculas exhibían eliminación bifásica, tanto la
semivida de la fase inicial como, particularmente, la semivida de la
fase terminal del conjugado de dextrano-leptina
aumentaron significativamente, indicando que el dextrano conjugado
retarda la eliminación de la proteína leptina de la corriente
sanguínea. Por tanto, el tiempo en circulación plasmática in
vivo del conjugado de dextrano-leptina aumentó
en comparación con el tiempo de circulación de la
rmetHu-leptina no modificada.
Similarmente, el conjugado de
dextrano-leptina inyectado sc persistía en la sangre
durante 96 horas después de la inyección, mientras que la leptina no
modificada tenía una eliminación relativamente rápida de
aproximadamente 18-24 horas después de la inyección,
como se observa en la Figura 5B.
Este ejemplo demuestra la solubilidad aumentada
en condiciones fisiológicas de los conjugados de dextrano de 6
kD-leptina de la presente invención en comparación
con la rmetHu-leptina no modificada. Se tomaron
muestras del conjugado de dextrano-leptina y de la
leptina no modificada después de la purificación de proteína. Se
dializaron las muestras durante una noche a 4ºC en PBS de Dulbecco,
pH 7. Se concentró una solución diluida de cada uno de
rmetHu-leptina no modificada y conjugado de
dextrano-rmetHu-leptina
(aproximadamente 1-2 mg/ml de proteína leptina)
utilizando un sistema de concentración Amicon Centriprep™ 10
(Beverly, MA). Se centrifugaron las muestras en ciclos repetidos de
duración decreciente a 4ºC, 3400 rpm hasta obtener un volumen de
aproximadamente 0,5 ml. Se determinó la concentración de proteína
por triplicado mediante el ensayo de Bradford, Anal. Biochem.
72: 248-254 (1976), utilizando reactivos BioRad
(Hercules, CA). Aunque la solución de rmetHu-leptina
no modificada empezaba a mostrar precipitación de proteína
aproximadamente a 2-3 mg/ml en PBS a pH neutro, el
conjugado de dextrano-leptina era todavía soluble a
80 mg/ml. A concentraciones aún mayores, la solución de conjugado de
dextrano-leptina se volvió difícil de manejar. Como
bien entenderá un experto en la técnica, pueden ajustarse los
parámetros tales como el sistema de tampón, la temperatura, los
tensioactivos y la fuerza iónica para optimizar las condiciones de
solubilidad.
Este ejemplo demuestra las reacciones mínimas del
sitio de inyección de los conjugados de dextrano de 6
kD-leptina de la presente invención. Se inyectaron
una vez ratones C57BL/6 hembra normales (tres ratones por grupo) una
vez al día durante siete días a una dosis de 25 mg/kg o 100 mg/kg
(concentración de 5 mg/ml y 20 mg/ml, respectivamente) con el
conjugado de dextrano-leptina (en PBS, pH 7,1)
preparado como en el ejemplo 1 y rmetHu-leptina no
modificada (en tampón acetato de sodio 10 mM, 5% de sorbitol, pH
4,0). Se recogieron muestras de los sitios de inyección el octavo
día. Se analizaron en los sitios de inyección de los animales
diversos parámetros histopatológicos: necrosis, inflamación
(mononuclear frente a supurativa), leptina precipitada, fibroplasia
y células gigantes. Basándose en dicha evaluación, el conjugado de
dextrano-leptina era muy bien tolerado en el sitio
de inyección, incluso cuando se inyectaba a una concentración de 20
mg/ml. No hubo evidencia de precipitación de leptina ni de necrosis
del tejido alrededor de la señal de inyección. En comparación con la
leptina no modificada, la reacción del sitio de inyección era bien
tolerada a concentraciones mayores de la concentración clínicamente
aceptable de leptina no modificada. El límite superior de
concentración para las reacciones del sitio de inyección aceptables
del conjugado de dextrano-leptina no se ha
determinado todavía.
Este ejemplo demuestra la falta de una respuesta
inmunogénica en primates ante los conjugados de dextrano de 6
kD-leptina de la presente invención. Se trataron
chimpancés durante 4 semanas con una inyección sc tres veces por
semana de 0,1 mg/kg de conjugado de dextrano de 6
kD-leptina como se prepara en el ejemplo 1, y se
analizaron los sueros de chimpancé mediante ELISA. Se observaron
pocas o ninguna respuesta de IgG o IgM ante el conjugado de
dextrano-leptina. Se observó un alto nivel de fondo
de anticuerpos y, por tanto, se realizaron estudios de inhibición
para determinar si estos anticuerpos eran reactivos frente al
dextrano (de 6 kD o 70 kD), al conjugado de dextrano de 6
kD-leptina o a la proteína leptina misma. Los
estudios de inhibición con muestras antes del tratamiento y al final
del estudio (día 29) no mostraron diferencias significativas en la
inhibición, indicando que la reactividad de anticuerpos estaba
dirigida hacia los anticuerpos preformados. Particularmente, el
dextrano de 70 kD mostró una inhibición completa, mientras que el
dextrano de 6 kD mostró una inhibición parcial. Además, el conjugado
de dextrano-leptina mostró también una inhibición
completa, mientras que la proteína leptina no modificada no mostró
inhibición. Estos resultados indicaban que la actividad de
anticuerpo estaba dirigida hacia el dextrano. Lo más probablemente,
se dirigiera a epítopos del dextrano ramificado (70 kD). Los
resultados mostraron claramente que no se dirigía actividad de
anticuerpo hacia la proteína leptina misma.
Este ejemplo demuestra la falta de formación de
vacuolas renales ante los conjugados de dextrano de 6
kD-leptina de la presente invención tales como
conjugados de
mono-polietilenglicol-leptina.
Brevemente, se inyectaron ratones (tres por grupo) una vez al día
durante siete días a una dosis de 1 mg/kg o 10 mg/kg con el
conjugado de dextrano de 6 kD-leptina como se
prepara en el ejemplo 1 y rmetHu-leptina no
modificada. Se recogieron muestras el octavo día. Se evaluó la
formación de vacuolas tubulares. No hubo inducción de la formación
de vacuolas renales con el conjugado de
dextrano-leptina a ninguna dosis. Los hallazgos de
histopatología fueron comparables a los observados para leptina no
modificada. En contraposición, la leptina monopegilada a dosis de 1
mg/kg y 10 mg/kg indujeron una formación ligera y notable de
vacuolas, respectivamente, en las mismas condiciones.
Este ejemplo muestra la preparación y las
características de pérdida de peso de otro conjugado de
dextrano-leptina de la presente invención. Se
preparó el conjugado de dextrano-leptina según los
métodos del ejemplo 1, con la excepción de que se utilizó dextrano
de 17,5 kD en lugar de dextrano de 6 kD. Se adquirió el dextrano de
17,5 kD en Fluka Chemical Corp.
Se ensayó la eficacia en la inducción de la
pérdida de peso del conjugado de dextrano de 17,5
kD-leptina en ratones normales. Se inyectaron
diariamente ratones C57BL/6 hembra normales de 8-10
semanas de edad y de aproximadamente 20 g de peso durante siete días
con el conjugado objeto de dextrano de 17,5
kD-leptina, rmetHu-leptina no
modificada o placebo (solución salina tamponada con fosfato,
"PBS"). Se ensayó una dosis de 10 mg/kg para tanto el conjugado
de dextrano de 17,5 kD-leptina como la leptina no
modificada. Se monitorizaron los pesos a lo largo del estudio.
Se comparó el cambio de peso durante el
transcurso del estudio para el grupo tratado con conjugado de
dextrano de 17,5 kD-leptina frente al grupo tratado
con leptina no modificada. Como se observa en la Figura 6, la
eficacia del conjugado de dextrano-leptina era mayor
que para la leptina no modificada a la dosis de 10 mg/kg.
Se ensayó también el efecto de pérdida de peso
sostenida del conjugado de dextrano de 17,5
kD-rmetHu-leptina. Se inyectaron
ratones sc el día 0 sólo a una dosis de 100 mg/kg con conjugado de
dextrano de 17,5 kD-rmetHu-leptina o
rmetHu-leptina no modificada. Como se observa en la
Figura 7, el efecto de pérdida de peso del conjugado de
dextrano-leptina duró 5-6 días con
un aumento de 1,5 veces la pérdida de peso máxima, mientras que el
efecto de pérdida de peso de la leptina no modificada duró sólo
3-4 días.
Por tanto, este ejemplo demuestra la eficacia
mejorada de los conjugados de dextrano de 17,5
kD-leptina de la presente invención frente a la
rmetHu-leptina no modificada para la pérdida de
peso.
Este ejemplo demuestra la falta de formación de
vacuolas renales ante los conjugados de dextrano de 17,5
kD-leptina de la presente invención en comparación
con conjugados de polímero soluble en agua de la técnica anterior
tales como conjugados de
monopolietilenglicol-leptina. Se inyectaron ratones
a una dosis de 1 mg/kg o 10 mg/kg con el conjugado de dextrano de
17,5 kD-leptina o rmetHu-leptina no
modificada según los procedimientos del ejemplo 7. No hubo inducción
de la formación de vacuolas renales con el conjugado de dextrano de
17,5 kD-leptina a ninguna dosis. Los hallazgos de
histopatología fueron comparables a los observados para leptina no
modificada.
Este ejemplo considera la falta de respuesta de
los conjugados de dextrano-leptina de la presente
invención con anticuerpos humanos de individuos susceptibles de
reacciones anafilácticas con dextrano. Se realizan experimentos para
mostrar que los conjugados de dextrano-leptina de la
presente invención son no anafilácticos para individuos con altas
titulaciones de anticuerpos preformados en circulación reactivos con
dextrano.
Se recogen los sueros de pacientes con altas
titulaciones de ARD preformados en circulación que habían
experimentado reacciones anafilácticas (RA) de gravedad variable. Se
recogen también sueros de individuos normales como controles.
Ensayo in vitro : El ensayo in
vitro para la reactividad frente a ARD incluye métodos conocidos
tales como hemaglutinación pasiva. Véase, por ejemplo, Hedin et
al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 52:
145-149 (1976), incorporado a la presente memoria
como referencia. Se ha mostrado que la titulación de ARD está
relacionada positivamente con el grado de gravedad de las RA.
Richter et al., supra, en 134-135.
Por ejemplo, se ensayan sueros de reactores de
dextrano en un ensayo de hemaglutinación pasiva para determinar si
los sueros reactivos con ARD reaccionan con los conjugados de
dextrano-leptina de la presente invención.
Brevemente, los eritrocitos sobre cuya superficie se han absorbido
los conjugados de dextrano-leptina de la presente
invención, así como los eritrocitos que han absorbido leptina no
modificada y dextrano de bajo peso molecular, separadamente, como
controles negativos y dextrano de 70 kD como control positivo, se
incuban con sueros de ARD y después se observan en los eritrocitos
signos de aglutinación. No tiene lugar ninguna aglutinación de los
eritrocitos porque los sueros de ARD tienen una afinidad reducida
por los dextranos de bajo peso molecular utilizados en la práctica
de esta invención y/o los dextranos de bajo peso molecular no causan
la agregación de anticuerpos y los efectos de cascada.
Ensayo in vivo : Como alternativa,
se realizan estudios animales para determinar la reactividad de ARD
con los conjugados de dextrano de bajo peso
molecular-leptina de la presente invención. En
primer lugar, los animales se sensibilizan utilizando antisueros
reactivos cruzados con dextrano y/o antisueros frente a dextrano de
alto peso molecular (por ejemplo dextrano de 70 kD) a una dosis
suficiente para desencadenar la anafilaxia. A continuación, se
exponen los animales a un conjugado de
dextrano-leptina de la presente invención. Se
observa en los animales cualquier signo de reacciones anafilácticas
tales como manifestaciones dérmicas, una rápida caída de la presión
sanguínea, dificultades respiratorias, parada cardiaca, etc. No se
observan signos de reacciones anafilácticas, ya que los ARD
preformados no son reactivos con los dextranos de bajo peso
molecular utilizados en la práctica de esta invención.
Claims (30)
1. Un conjugado de
dextrano-leptina que comprende al menos un resto
dextrano de bajo peso molecular unido al menos a un resto leptina,
en el que dicho resto dextrano tiene un peso molecular de 1 kD a 20
kD.
2. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 1, en el que
dicho resto dextrano tiene un peso molecular de 1 kD a 10 kD.
3. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 2, en el que
dicho resto dextrano tiene un peso molecular de 1 kD a 7 kD.
4. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 1, en el que
dicho resto dextrano tiene un peso molecular de 6 aproximadamente
kD.
5. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 1, en el que
un resto dextrano está unido a uno o más restos leptina.
6. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 1, en el que
al menos dos restos dextrano están unidos a uno o más restos
leptina.
7. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 1, en el que
múltiples restos dextrano están unidos a un resto leptina.
8. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 1, en el que
dicho resto leptina está seleccionado del grupo constituido por
(según la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 1):
(a) la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 1, que
carece opcionalmente de un residuo de glutaminilo en la posición 28,
y que tiene opcionalmente además un residuo de metionilo en la
terminación N;
(b) una secuencia aminoacídica de la subparte (a)
que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de las
siguientes posiciones: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67,
68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112,
118, 136, 138, 142 y 145;
(c) una secuencia aminoacídica de la subparte (b)
en la que los aminoácidos en las posiciones 100 y 138 están
sustituidos por Gln;
(d) un análogo de proteína leptina truncada
seleccionado de entre:
- (i)
- los aminoácidos 98-146;
- (ii)
- los aminoácidos 1-99 y 112-146;
- (iii)
- los aminoácidos 1-99 y 112-146 que tienen uno o más de los aminoácidos 100-111 dispuestos secuencialmente entre los aminoácidos 99 y 112; y
- (iv)
- el análogo de leptina truncada de la subparte (i) que tiene uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos por otro aminoácido;
- (v)
- el análogo de leptina truncada de la subparte (iii) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 reemplazados por otro aminoácido;
- (vi)
- el análogo de leptina truncada de la subparte (iv) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 142 y 145 reemplazados por otro aminoácido; y
- (vii)
- el análogo de leptina truncada de cualquiera de las subpartes (i)-(vi) que tiene un residuo de metionilo N-terminal;
(e) una proteína leptina de cualquiera de las
subpartes (a)-(d) que tiene una o más sustituciones aminoacídicas
conservadas.
9. Una mezcla de conjugado de
dextrano-leptina que comprende los siguientes en
cualquier combinación:
(a) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a un resto leptina;
(b) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a dos o más restos leptina; y
(c) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se unen al menos dos
restos dextrano a un resto leptina; y
(d) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se unen al menos dos
restos dextrano al menos a dos restos leptina.
10. La mezcla de conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 9, que
comprende los siguientes en cualquier combinación:
(a) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a un resto leptina;
(b) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a dos restos leptina; y
(c) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se unen dos restos
dextrano a dos restos leptina, estando unido dicho par de conjugados
de dextrano-leptina entre sí.
11. La mezcla de conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 10,
constituida predominantemente por:
(a) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a dos restos leptina; y
(b) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se unen dos restos
dextrano a dos restos leptina, estando unido dicho par de conjugados
de dextrano-leptina entre sí.
12. Un conjugado de
dextrano-leptina producido mediante el método que
comprende:
(a) activar un resto dextrano que tiene un peso
molecular de 1 kD a 20 kD;
(b) unir el resto dextrano activado a un resto
leptina en condiciones reductoras para formar un enlace amina, a un
pH suficientemente ácido como para que la amina
N-terminal no esté todavía protonada mientras que
los grupos amina en las demás posiciones en la proteína leptina
están protonados;
(c) obtener el conjugado de
dextrano-leptina; y
(d) opcionalmente, purificar el conjugado de
dextrano-leptina.
13. Una composición farmacéutica que comprende un
conjugado de dextrano-leptina según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8 en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
14. Una composición farmacéutica que comprende
una mezcla de conjugado de dextrano-leptina según
una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
15. Uso de una composición para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento en un individuo de una afección
seleccionada de entre: obesidad, diabetes e hiperlipidemia,
comprendiendo dicha composición:
una cantidad eficaz de un conjugado de
dextrano-leptina según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
16. Uso de una composición para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento en un individuo de una afección
seleccionada de entre: obesidad, diabetes e hiperlipidemia,
comprendiendo dicha composición:
una cantidad eficaz de un conjugado de
dextrano-leptina según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11.
17. Un conjugado de
dextrano-leptina que comprende al menos un resto
dextrano que tiene un peso molecular de 1 kD a 20 kD unido a la
terminación N de al menos un resto leptina que tiene la secuencia
aminoacídica de SEC ID Nº 1, que carece opcionalmente de un residuo
de glutaminilo en la posición 28, y que tiene opcionalmente además
un residuo de metionilo en la terminación N.
18. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 17, en el que
dicho resto dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 6
kD.
19. Una mezcla de conjugado de
dextrano-leptina que comprende los siguientes en
cualquier combinación:
(a) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a un resto leptina;
(b) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a dos restos leptina; y
(c) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se unen dos restos
dextrano a dos restos leptina, estando unido dicho par de conjugados
de dextrano-leptina entre sí;
teniendo dicho resto dextrano de dicho conjugado
de dextrano-leptina un peso molecular de 1 kD a 20
kD y estando unido a la terminación N de dicho resto leptina que
tiene la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 1, que carece
opcionalmente de un residuo de glutaminilo en la posición 28 y que
tiene opcionalmente además un residuo de metionilo en la terminación
N.
20. Una mezcla de conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 19, en la que
dicho resto dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 6
kD.
21. Una composición farmacéutica que comprende un
conjugado de dextrano-leptina según una cualquiera
de las reivindicaciones 17 a 18 en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
22. Un conjugado de
dextrano-leptina producido mediante el método que
comprende:
(a) activar un resto dextrano que tiene un peso
molecular de 1 kD a 20 kD;
(b) unir el resto dextrano activado a un resto
leptina en condiciones reductoras para formar un enlace amina, a un
pH suficientemente ácido como para que la amina
N-terminal no esté todavía protonada mientras que
los grupos amina en las demás posiciones en la proteína leptina
están protonados;
(c) obtener el conjugado de
dextrano-leptina; y
(d) opcionalmente, purificar el conjugado de
dextrano-leptina;
estando dicho resto dextrano unido a la
terminación N de dicho resto leptina que tiene la secuencia
aminoacídica de SEC ID Nº 1, que carece opcionalmente de un residuo
de glutaminilo en la posición 28, y que tiene opcionalmente además
un residuo de metionilo en la terminación N.
23. Uso de una composición para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento en un individuo de una afección
seleccionada de entre: obesidad, diabetes e hiperlipidemia,
comprendiendo dicha composición:
una cantidad eficaz de un conjugado de
dextrano-leptina según una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 18.
24. Un conjugado de
dextrano-leptina que comprende al menos un resto
dextrano que tiene un peso molecular de 1 kD a 20 kD unido a la
terminación N de al menos un resto leptina que tiene la secuencia
aminoacídica de SEC ID Nº 1, en la que los aminoácidos en las
posiciones 100 y 138 están sustituidos por glutamina, que carece
opcionalmente de un residuo de glutaminilo en posición 28 y que
tiene opcionalmente además un residuo de metionilo en la terminación
N.
25. El conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 24, en el que
dicho resto dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 6
kD.
26. Una mezcla de conjugado de
dextrano-leptina que comprende los siguientes en
cualquier combinación:
(a) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a un resto leptina;
(b) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se une un resto dextrano
a dos restos leptina; y
(c) un conjugado de
dextrano-leptina en el que se unen dos restos
dextrano a dos restos leptina, estando unido dicho par de conjugados
de dextrano-leptina entre sí;
teniendo dicho resto dextrano de dicho conjugado
de dextrano-leptina un peso molecular de 1 kD a 20
kD y estando unido a la terminación N de dicho resto leptina que
tiene la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 1, que carece
opcionalmente de un residuo de glutaminilo en la posición 28 y que
tiene opcionalmente además un residuo de metionilo en la terminación
N.
27. Una mezcla de conjugado de
dextrano-leptina de la reivindicación 26, en la que
dicho resto dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 6
kD.
28. Una composición farmacéutica que comprende un
conjugado de dextrano-leptina según una cualquiera
de las reivindicaciones 24 a 25 en un vehículo farmacéuticamente
adecuado.
29. Un conjugado de
dextrano-leptina producido mediante el método que
comprende:
(a) activar un resto dextrano que tiene un peso
molecular de 1 kD a 20 kD;
(b) unir el resto dextrano activado a un resto
leptina en condiciones reductoras para formar un enlace amina, a un
pH suficientemente ácido como para que la amina
N-terminal no esté todavía protonada mientras que
los grupos amina en las demás posiciones en la proteína leptina
están protonados;
(c) obtener el conjugado de
dextrano-leptina; y
(d) opcionalmente, purificar el conjugado de
dextrano-leptina;
estando dicho resto dextrano unido a la
terminación N de dicho resto leptina que tiene la secuencia
aminoacídica de SEC ID Nº 1, en la que los aminoácidos en las
posiciones 100 y 138 están sustituidos por glutamina, que carece
opcionalmente de un residuo de glutaminilo en la posición 28, y que
tiene opcionalmente además un residuo de metionilo en la terminación
N.
30. Uso de una composición para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento en un individuo de una afección
seleccionada de entre: obesidad, diabetes e hiperlipidemia,
comprendiendo dicha composición:
una cantidad eficaz de conjugado de
dextrano-leptina según una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 25.
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