PT629203E

PT629203E - Derivados desoamino de macrolidos como agentes imunosupressores e antifungicos

Info

Publication number: PT629203E
Application number: PT93903553T
Authority: PT
Inventors: Gary Richard Schulte; James Robert Hauske
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1992-03-02
Filing date: 1993-01-27
Publication date: 2002-01-30
Also published as: CA2131371A1; EP0629203B1; ES2160593T3; WO1993018042A1; US5563135A; FI944014A0; GR3037059T3; US5506233A; EP0629203A1; DK0629203T3; DE69330747D1; JPH07500613A; DE69330747T2; ATE205496T1; FI944014A

Description

DESCRIÇÃO "DERIVADOS DESOAMINO DE MACRÓLIDOS COMO AGENTES IMUNOSUPRESSORES E ANTIFUNGÍCOS"

Antecedentes do Invento

Este invento refere-se a novos compostos químicos que têm valor no domínio da ciência médica. Mais em particular, refere-se a novos compostos que são de valor para administração a um mamífero, em particular o homem, como agentes imunosupressores. Estes novos agentes imunosupressores podem ser comparados com os macrólidos conhecidos por FK-506 e FK-520, que são descritos com mais detalhe na Patente dos Estados Unidos da América N° 4 894 366. Os novos compostos deste invento irão encontrar especial utilidade na prevenção ou tratamento de rejeição de enxerto depois de cirurgia de transplante de órgãos e de pele e na prevenção ou tratamento de doenças autoimunes tais como artrite reumatóide e psoríase. Em adição, estes derivados de macrólido irão encontrar uso na prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por fungos. A rejeição de enxerto ou de transplante de órgãos seguindo a cirurgia de transplante é uma ocorrência vulgar que acontece quando os antigénios estranhos são reconhecidos pelo sistema de resposta imune do hospedeiro. O sistema de resposta imune do hospedeiro, num esforço para "proteger" o tecido estranho, liberta depois um arsenal celular e humoral. Ambos os linfócitos activos e o ataque de anticorpos ao tecido estranho, resultam em complicações que muitas vezes terminam em rejeição do referido tecido. -2- Âi Ϋ ·»*«. i:" ϊ

«Ά

Analogamente, é bem conhecido a ocorrência de irregularidades imuno reguladoras em doenças inflamatórias crónicas e autoimunes. Independente da etiologia de alterar de acordo com a condição, uma variedade de auto-anticorpos e linfócitos reactivos surge muitas vezes para complicar a condição.

Os tratamentos que desafiam o sistema de resposta imune resultam muitas vezes numa descida do sistema, conduzindo a uma diminuição da capacidade do corpo para combater a infecção. Isto pode ser tão prejudicial quanto a condição original que conduz à descida.

Geralmente o agente medicinal que conduz à prevenção ou tratamento de rejeição de enxerto é a ciclosporina A, aprovada por "United States Food and Drug Administration" em 1983. O composto actua por inibição do sistema de resposta imune do corpo a partir da mobilização do seu arsenal de agentes de protecção naturais para rejeitar a proteína estranha do transplante. Apesar da ciclosporina ser eficaz na luta contra a rejeição de enxerto, sofre de desvantagens porque pode causar falha de rins, dano no fígado e úlceras; que em muitos casos pode ser muito grave. Os compostos seguros que são mais selectivos na sua capacidade para afectar o sistema de resposta imune e que têm menos efeitos laterais estão constantemente a ser adoptados. A Patente dos Estados Unidos da América N°. 4 894 366 revela os macrólidos FK-506 e FK-520, inter alia, como imunosupressores, incluindo o tratamento de "resistência ao transplante", doenças autoimunes e doenças infecciosas. A Publicação da Patente Internacional N°. WO 91/02736 revela os derivados de FK-506, FK-520 e macrólidos relacionados. A Publicação da -3-

Patente Europeia N°. 428 365 AI revela vários outros derivados de FK-506, FK-520 e macrólidos relacionados. A Publicação da Aplicação da Patente Europeia EP 0466 365 A2 revela um macrólido imunosupressor contendo um resíduo de açúcar.

Sumário do Invento O presente invento é dirigido a compostos da fórmula

w * H: O) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis; em que n é 2; A e B são considerados juntamente e formam =0; R' é

-4- \R R5 Ά Λ J , ι. 4 *"Ν

R4 é Η ou alquilo(Ci a C6); R5 é Η ou alquilo(Ci a Cô); R6 é -OH, -OCO, R13, -OR14; R7 é H; R8 é alquilo(Ci a C4); R13 é alquilo(Ci a C22), alquenilo(C2 a C22), cicloalquilo(C3 a C8), benzilo, benzilo substituído variadamente com um a cinco átomos de halogénio, grupos -OH ou grupos alcoxi(Ci a C4), tienilo, furanilo, fenilo ou fenilo substituído variadamente com um a cinco átomos de halogénio, grupos -OH ou grupos alcoxi(C! a C4); e R14 é alquilo(C] a C3), alquenilo(C3 a Ce) ou benzilo. R1 é de preferência

-5- Αβ ϊ*( 5

wA (

OU

Um outro aspecto do invento é dirigido a compostos da fórmula

0) e aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis; em que n é 2; -6- /1 * |,

A η Ρ *<Α A é Η; Β é Η; R1 é rVr5 *yy’ r8 R4 é H ou alquilo(Ci a Có); R5 é H ou alquilo(Ci a C6) R6 é -OH; R7 é H; R8 é alquilo(Cj a C4); R13 é alquilo(Ci a C22), alquenilo(C2 a C22), cicloalquilo(C3 a C8), benzilo, benzilo substituído variadamente com um a cinco átomos de halogénio, grupos -OH ou grupos alcoxi(Ci a C4), tienilo, furanilo, fenilo ou fenilo substituído variadamente com um a cinco átomos de halogénio, grupos -OH ou grupos alcoxi(Ci a C4); e R14 é alquilo(Ci a C3), alquenilo(C3 a C$) ou benzilo. -7- R1 é de preferência

OU

Exemplos particulares do invento que podem ser referidos são: 17-EtÍM,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3,",4"',6",-tridesoxi-2",-0-acetil-3"'- (dimetilamino)-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,2 8-díoxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-1, 14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3m,4",,6,"-tridesoxi-2",-0-benzoíl-3'M-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-l'-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; -8- Â#

L /*» . i !>ά 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2,-(4"-(3",,4"’,6’"-tridesoxi-2m-0-docosanoil-3’”-(dimetilamino)-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9] octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3",,4,",6'"-tridesoxi-2'"-0-(2,2-dimetiIpropanoíl)-3'"-(dimetilamino)-P-D-xilO'hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-1 '-metilvinil] -23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,2 8-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04’9] octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12- [2'-(4"-(3"',4"',6"'-tridesoxi-2,"-0-octadecanoí l)-3 (dimetilamino)-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-l'-metilviiiil]- 23.25- dimetoxi-l 3,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04’9] octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3"',4'",6"'-tridesoxi-2"'-0-(t-butildimetilsilil)-3"'-(dimetilamino)-a-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04’9] octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-l,14-di-hidroxi-12-[2,-(4"-(3m,4m,6,"-tridesoxi-2",-0-metil-3m- (dimetilammo)-D-xilo-liexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hcxil)-r-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,18-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04’9] octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12- [2'-(4"-(3"',4"',6"'-tridesoxi-2m-0-trietilsilil)-3 (dimetilamino)-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; -9-

·% % r

«V \ 17-Alil-1,14-di-hidroxi-12- [2’-(4"-(3 tridesoxi-r^O-aeetil)^'”- (dimetilamino)-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexi])-l'-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-1 -hidroxi- 14-(3"',4"',6"'-tridesoxi-2"'-0-acetil-3"'-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosiloxi)-12-[2'-(4"-(t-butildimetilsililoxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-1 '-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,28-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12- [2'-(4"-(3 "',4,",6,"-tridesoxi-3"'-(dimetilamino)-octadecanoíl)-3"'-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9Joctacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-l,14-di-hidroxi-12-[2,-(4"-(3'",4'",6'"-tridesoxi-3'"-(dimetilamino)-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-l'-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-l,14-di-hidroxi-[2'-(4"-(3"',4"',6"'-tridesoxi-2",-(trietilsilil)-3"'-(dimetilamino)-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3 "-metoxiciclo-hexil)-1 -metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,2 8-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04’9] octacos-18-eno-3,10,16-tetraona; 17-Etil-1,14-di-hidroxi-[2'-(4"-(3'",4"',6",-tridesoxi-3'"-(dimetilamino)-a -D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-3,10,16-tetraona; -10-

Mix-rfr 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2,-(4"-(3m,4'",6'"-tridesoxi-2M,-3 m-(dimetilamino)-a-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; e 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12- [2'-(4"-(4'"-desoxi-4'"-(dimetilamino)-P-D-cladinosiloxi-3"-metoxiciclo-hexil)-1 '-metilvinil] -23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil- 11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona.

Outros aspectos do invento incluem: o uso de um composto ou sal como aqui definido na preparação de um medicamento para o tratamento de resistência a transplante num mamífero, para o tratamento de doença autoimune num mamífero; o uso de um composto ou sal como aqui definido na preparação de um medicamento para o tratamento de doença fúngica num mamífero; uma composição farmacêutica compreendendo um composto ou sal como aqui definido e um veículo farmaceuticamente aceitável; e um composto ou sal como aqui definido para uso em medicina.

Os compostos de fórmula (I) são activos como imunosupressores. -11 -

«Ά

Esta actividade torna estes compostos úteis no tratamento c prevenção de rejeição de enxerto e transplante. Também, esta actividade toma estes compostos úteis na prevenção e tratamento de doenças autoimunes tais como artrite reumatóide e psoríase num mamífero, em especial no homem. O termo "transplante", quando atrás e posteriormente aqui usado, refere-se ao implante numa parte de um tecido ou órgão individual tirados de outra parte do indivíduo ou de outro indivíduo. Transplantes típicos incluem, mas não são limitados a, transplantes de medula óssea, coração, renal, tendão e pancreáticoduodenal. O termo "enxerto" quando atrás e posteriormente aqui usado, refere-se a qualquer tecido ou órgão não ligado que é usado para transplantes. Os enxertos típicos incluem, mas não são limitados a enxertos de pele, osso, gordura e nervos.

Este invento inclui também uma composição farmacêutica compreendendo uma resistência a tratamento de transplante com uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (I) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Este invento também ainda inclui uma composição farmacêutica compreendendo o tratamento de uma doença autoimune (tal como artrite reumatóide ou psoríase) com uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (I) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Também ainda os compostos deste invento de fórmula (I) têm actividade antifúngica. Assim estes compostos podem ser usados para tratar ou prevenir infecções em mamíferos causadas por fungos. ο - 12- i *Λ

Em adição, este invento inclui uma composição farmacêutica compreendendo o tratamento de uma doença infecciosa fúngica com uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (I) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Descrição Detalhada

Os compostos de fórmula (I) do presente invento são facilmente preparados. Mais geralmente, um macrólido de fórmula (X) abaixo referido

0) é ligado com um derivado sintético de açúcar da fórmula

I -13- em que X é 2-tiopirimidino. O macrólido ligado (ou glicosilado) é depois modificado como aqui descrito posteriormente. A produção de macrólidos de fórmula (X) é bem conhecida na literatura. A via geralmente preferida para estes macrólidos é a via biológica de fermentação de microorganismos pertencendo ao género Streptomyces. Os compostos de fórmula (X) em que R3 é alilo são obtidos por fermentação de Streptomyces tsukubaensis N°. 9993 (Ferm BP-927). O composto de fórmula (X) em que R3 é etilo e o composto de fórmula (X) em que R3 é metilo são obtidos por fermentação de Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891.

Uma amostra liofilizada de Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891 foi depositada com a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maiyland, 20852, Estados Unidos da América, sob os termos do Tratado de Budapeste de 13 de Janeiro, 1992. Esta cultura recentemente depositada originou o novo depósito número ATCC 55276.

Streptomyces tsukubaensis N°. 9993 (Ferm BP-927) está geralmente em depósito com o Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (n°. 1-3, Higashi-l-chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaraki Prefecture, Japão), sob as provisões do Tratado de Budapeste. Uma amostra nova do microorganismo será depositada com American Type Culture Collection de acordo com os termos do Tratado de Budapeste.

Os microorganismos atrás referidos, quando colocados separadamente em meio nutriente aquoso, irão produzir os compostos de fórmula (X) já mencionados. A fermentação destes microorganismos para produzir estes macrólidos é realizada substancialmente como revelado na Patente dos Estados Unidos da América N° 4 894 366, que é aqui incorporada como referência. Quaisquer alterações feitas ao processo revelado são feitas com o fim de adaptar equipamento existente como facilidade e são descritas nas Preparações 1 e 2 aqui posteriormente referidas. A reacção de ligação (ou glicosilação) de um açúcar sintético de fórmula (XII) e de um macrólido de fórmula (X) é realizada utilizando o processo do invento descrito com detalhe aqui posteriormente.

Um macrólido de fórmula (X) é dissolvido num solvente de reacção inerte. A expressão "solvente de reacção inerte" quando aqui usado atrás e posteriormente refere-se a qualquer solvente que não interactua com os materiais iniciais, reagentes, intermediários ou produtos que de uma forma afectam adversariamente o rendimento do produto desejado. Os solventes adequados para esta reacção incluem os solventes clorados tais como clorofórmio, diclorometano e 1,2-dicloroetano; os solventes etéreos tais como éter dietílico, tetra-hidrofurano ou dioxano, solventes aromáticos tais como benzeno, tolueno ou xileno; e solventes apróticos dipolares tais como N,N-dimetilformamida, acetonitrilo c N-mctilpirrolidona. Os solventes podem ser utilizados simplesmente, mas em geral é vantajoso utilizar uma combinação de solventes. Uma combinação preferida inclui misturas de um solvente aromático e um solvente clorado. A combinação mais preferida é uma mistura 1:1 de diclorometano e tolueno. Em geral é desejável utilizar solvente suficiente para que os reagentes sejam dissolvidos ou suspensos pelo solvente. Tipicamente a quantidade de solvente usada é variada para dar uma solução de 10'1 a 10~3 Molar de macrólido, sendo preferida uma solução com 10'2 Molar de macrólido. A temperatura da mistura reaccional pode variar de cerca de -20°C até cerca de - 15- (

50UC. Hm geral, a temperatura preferida é uma temperatura de cerca de 0°C até cerca de 30°C. Durante a fase inicial, a mistura reaccional é geralmente arrefecida num banho de água gelada para originar uma temperatura de cerca de 5°C. As condições secas são mantidas ao longo da reacção pela utilização de solventes anidros, mantendo uma atmosfera de reacção inerte e pela introdução de um agente de secagem na mistura reaccional. O termo "atmosfera de reacção inerte", quando aqui atrás usado e posteriormente, pretende definir uma atmosfera que não interactua com os materiais iniciais, reagentes, intermediários ou produtos de uma forma que afecta adversariamente o rendimento do produto desejado. As atmosferas de reacção inerte adequadas incluem atmosferas de árgon e atmosferas de azoto. Em geral é preferido o árgon. Os agentes de secagem úteis para esta reacção incluem filtros moleculares, sulfato de cálcio e sulfato de magnésio. Um agente de secagem preferido são filtros moleculares de 4 A. Em geral os filtros moleculares são triturados para se obter uma superfície de secagem maior. Em geral é utilizado uma quantidade de filtros 1/1 W/W para macrólido, apesar de poder ser adicionado mais ou menos quando necessário. A mistura reaccional é depois tratada com cerca de 1,0 a cerca de 20,0 equivalentes de trifluorometanosulfonato de prata. Em geral são preferidas as condições em que são utilizados 3 equivalentes. Um derivado de açúcar sintético de fórmula (XII) em que X é 2-tiopirimidino é dissolvido em suficiente solvente de reacção inerte, tipicamente diclorometano, tal que seja gerada uma solução de 0,5 M até cerca de 1,0 Μ. A solução do referido derivado de açúcar é depois adicionada lentamente à mistura reaccional arrefecida. O tempo necessário para completar a adição irá variar dependendo da escala da reacção e pode ser de cerca de 10 minutos até cerca de 24 horas ou mais. Para uma reacção em que a quantidade de derivado de açúcar a ser adicionada é de cerca de 70 mmoles, o tempo necessário para adição será de cerca de uma hora.

Depois de todos os reagentes terem sido adicionados , a mistura - 16-

reaccional é aquecida até à temperatura ambiente e é agitada durante mais 0,5 a 24 horas. A mistura reaccional é agitada durante a noite, convenientemente. O produto é isolado do meio reaccional e purificado usando as técnicas de química orgânica bem conhecidas por qualquer pessoa experiente no domínio. Estas técnicas podem variar de exemplo para exemplo devido à natureza dos compostos particulares envolvidos. Em geral, no entanto, a mistura reaccional é filtrada directamente através da ajuda de um filtro tal como Celite*. A camada de Celite* é lavada com um solvente de reacção inerte e o filtrado é evaporado a vácuo. A purificação pode ser realizada de várias formas mas é obtida convenientemente através de cromatografia rápida do resíduo obtido depois da evaporação. Esta cromatografia é efectuada num componente de fase sólida apropriada tal como sílica gel. A eluição com um componente de fase líquida compreendendo uma mistura vantajosa de solventes deu origem a macrólido glicosilado puro de fórmula (I) depois da evaporação de solventes.

Altemativamente, a reacção de ligação pode ser realizada utilizando um açúcar sintético de fórmula (XII) em que X é halo tal como cloro ou bromo. Cerca de 2-4 equivalentes molares do halogeneto de açúcar apropriado de fórmula (XII) é misturado com o macrólido de fórmula (X) num solvente de reacção inerte. Os solventes de reacção inerte úteis para este tipo de reacção incluem solventes clorinados tais como clorofórmio, cloreto de metileno c dicloreto de etileno; os solventes de éter tais como éter dietílico, tetra-hidrofurano, dioxano e dimetoxietano; solventes aromáticos tais como benzeno, tolueno e xileno; e solventes apróticos dipolares tais como N,N-dimetilformamida, acetonitrilo e N-metilpirrolidona. Os solventes preferidos são os solventes clorados e um solvente particularmente preferido é o cloreto de metileno. Em geral é desejável utilizar solvente suficiente tal que os reagentes são dissolvidos ou suspensos pelo solvente. Tipicamente a quantidade de solvente usada é variada para dar uma solução de macrólido 10'1 a IO'3 Molar - 17-

sendo preferida a solução com 10*1 Molar. As condições secas são mantidas durante o decorrer da reacção pela utilização de solventes anidros e pela adição de um agente de secagem à mistura reaccional. Os agentes de secagem tipicamente usados para este fim são os filtros moleculares, sulfato de cálcio e sulfato de magnésio. Um agente de secagem preferido são os filtros moleculares de 4A°. A mistura inicial dos reagentes é realizada a uma temperatura de cerca de -78°C até cerca de 125°C. As temperaturas preferidas variam da gama de cerca de -78°C até cerca de 0°C. Especialmente preferido por facilidade de preparação é um banho de arrefecimento que mantém a temperatura da reacção a -78UC.

Depois dos reagentes atrás referidos terem sido misturados e a temperatura se ter equilibrado para -78°C, a mistura reaccional é tratada com uma base adequada tal como carbonato mercúrico, carbonato de prata, nitrato mercúrico ou nitrato de prata. A base preferida para esta reacção é o carbonato de prata. Depois da adição desta base, a mistura reaccional é tratada com um catalisador. Os catalisadores típicos para esta reacção incluem os sais de triflato, perclorato e tetrafluoroborato do catião associado com a base particular usada..O catalisador preferido é o triflato de prata.

Depois de todos os reagentes terem sido adicionados, a mistura reaccional é aquecida até 0°C, agitada durante 0,5-24 horas a 0°C e depois aquecida lentamente até à temperatura ambiente. A mistura reaccional é agitada durante mais 0,5-24 horas à temperatura ambiente. Em geral, a mistura reaccional é agitada a 0°C durante 5 horas e deixada aquecer à temperatura ambiente durante 3 horas seguido por agitação à temperatura ambiente durante 16 horas. O produto é depois isolado da mistura reaccional usando técnicas -18-

familiares de qualquer pessoa experiente no domínio. Assim, uma filtração simples através da ajuda de um filtro tal como Celite* seguido por evaporação origina um resíduo que é purificado por cromatografia em coluna. Qualquer pessoa experiente no domínio reconhecerá que a cromatografia em coluna assegura o uso de um componente de fase sólida tal como sílica gel e um componente de fase líquida compreendido de uma mistura de solventes com vantagem para a separação e purificação de compostos de uma mistura. A remoção de solventes depois da cromatografia origina o glicosilmacrólido.

Em geral, a reacção de ligação tem lugar apenas num dos três pontos de álcool do macrólido, sendo este ponto a função alcoólica C-4" (ver Fórmula X). Esta selectividade é possivelmente devido à maior capacidade do grupo hidroxilo desta posição na conformação preferida do macrólido. No momento, no entanto, com os halogenetos de açúcar particularmente reactivos, são formadas pequenas quantidades de material diglicosilado (em que R2 = OR°). Este material é detectado durante o controlo do desenvolvimento da reacção, que é realizado geralmente através de cromatografia de camada fina, de acordo com a prática padrão. O material diglicosilado é isolado e purificado como para o material monoglicosilado com a notável excepção de que o material diglicosilado é geralmente o primeiro material isolado a partir de cromatografia, sendo o material monoglicosilado isolado nas últimas fracçõcs. O uso dc equivalentes adicionados de cloreto de açúcar ou a alteração de outros parâmetros tais como solvente, base ou catalisador podem afectar o rendimento do material diglicosilado.

Para preparar os compostos do invento de fórmula (I) em que A e B são tomados separadamente e são cada um H (aqui posteriormente referidos como o macrólido C-2 desoxo), um composto de fórmula (I) em que A e B são considerados juntamente e formam =0 é reduzido usando condições padrão para -19-

Aè h~.. v r' X /<3Λ- t ' C.__( *Ά a redução de α-cetoamidas. Este processo de redução reduz selectivamente o carbonilo adjacente à amida sem afectar outros carbonilos na molécula. Em geral o macrólido é dissolvido num solvente de reacção inrte ou mistura de solventes e faz-se borbulhar sulfureto de hidrogénio através da mistura reaccional durante a noite. Os solventes de reacção inerte adequados para esta reacção incluem, mas não são limitados, a bases orgânicas tais como dietilamina, trietilamina, dimetilamina, trimetilamina, piperidina, morfolina e anilina, a solventes apróticos dipolares tais como Ν,Ν-dimetilformamida, dimetilsulfóxido e N-metilpirroli-dona; e solventes alcoólicos tais como metanol, etanol e propanol. Uma combinação de dois ou mais destes solventes é algumas vezes usado para se obter um rendimento óptimo ou para afectar o decorrer da redução. Por exemplo, o macrólido em que A é H e B é OH é preparado usando como solvente o metanol. Um sistema de solvente particularmente preferido para se obter o macrólido C-2 desoxo é a piridina e Ν,Ν-dimetilformamida em quantidades iguais. Quando a reacção está completa, o produto é isolado usando as técnicas padrão de química orgânica como será compreendido por qualquer pessoa experiente no domínio.

Altemativamente, os compostos de fórmula (X) ou (XI) podem ser reduzidos antes da glicosilação, usando o processo anterior. Depois da redução, o macrólido pode ser glicosilado como aqui atrás referido.

Os derivados de açúcar sintético que são aqui usados são preparados de uma forma ordenada como aqui posteriormente descrito.

Para preparar os compostos de fórmula (XII) em que X é 2-tiopirimidino, faz-se reagir um composto de fórmula (XII) em que X é -OH utilizando técnicas padrão conhecidas de qualquer pessoa experiente no domínio. Em geral, é dissolvido num solvente de reacção inerte cerca de 1,1 até cerca de 1,5 equivalentes de uma tri-n-alquilfosfína. Os solventes de reacção inerte incluem os solventes aromáticos tais como tolueno, xileno e benzeno e os solventes etéreos tais como éteres de dietilo, 1,2-dimetoxietano e tetra-hidrofurano. A mistura reaccional é arrefecida de 0°C para -40°C e em geral até cerca de -20°C, e são adicionados gota a gota cerca de 1,1 até cerca de 1,5 equivalentes de dietilazodicarboxilato. Depois da adição estar completa, a mistura reaccional é agitada durante cerca de vinte minutos e é adicionado rapidamente um equivalente de um composto de fórmula (XII) em que X é -OH. A mistura reaccional é agitada durante mais 30 minutos a uma hora e depois é adicionado 1,1 a 1,5 equivalentes de 2-mercapto-pirimidina. A mistura reaccional é aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante cerca de 16 a 24 horas. O produto é isolado utilizando técnicas bem conhecidas de qualquer pessoa experiente no domínio.

Para preparar os compostos de fórmula (XII) em que X é 2-tiopirimidino e R6 é -OCOR13 e -OSO2R13 , um composto de fórmula (XII) em que X é 2-tiopirimidino, R6 é -OH e o grupo 3-amino ter sido dialquilado são esterificados ou sulfonilados utilizando condições padrão de química orgânica. Os agentes de esterificação típicos incluem mas não são limitados a anidridos ácidos e cloretos de ácido das fórmulas R13C02C0R13 e R13COCl respectivamente. Os agentes de sulfonilação típicos incluem mas não são limitados a cloretos de sulfonilo dc fórmula R13S02C1. Em geral um composto dc fórmula (XII) em que R6 é -OH e X é tiopirimidino é dissolvido num solvente de reacção inerte a uma temperatura de cerca de -20°C até cerca de 30UC. O diclorometano é o solvente de escolha, no entanto para esterificação particular ou sulfonilações qualquer pessoa experiente no domínio pode decidir escolher um diferente solvente de reacção inerte. Por conveniência, a reacção é efectuada geralmente à temperatura ambiente. A mistura reaccional é tratada com o desejado cloreto de sulfonilo, cloreto de ácido ou anidrido ácido e uma amina orgânica tal como trietilamina, di-isopropilamina ou di-isopropiletilamina. A -21 - /VA*- h

mistura reaccional é agitada durante cerca de uma hora até cerca de 24 horas, convenientemente, a mistura reaccional é agitada durante a noite, e o produto é isolado usando técnicas padrão. De igual modo, os compostos de fórmulas (XIV) e (XV) em que X é tiopirimidino e R7 é -OCOR13 e -0S02R13 podem ser preparados de uma mesma forma.

Para preparar os compostos de fórmula (XII) em que R6 é -OR14, um composto de fórmula (XII) em que R6 é -OH, X é tiopirimidino e o grupo 3-amino é totalmente substituído é alquilado usando métodos padrão de química orgânica. Os agentes de alquilação típicos incluem os compostos da fórmula R-Z, em que Z é cloro, bromo ou iodo, mas também podem ser escolhidos outros agentes de alquilação, tais como sulfato de dimetilo. Utilizando esta mesma química, mas começando com um composto de fórmula (XIV) ou (V) em que R2 é OH e X é tiopirimidino, são preparados os compostos de fórmulas (XIV) ou (XV) em que X é tiopirimidino e R7 é -OR14.

Para preparar os compostos de fórmula (XII) em que R6 ou R7 é -OC(=S)SR14 , faz-se reagir um composto de fórmula (XII) em que R6 ou R7 é -OH sob as condições conhecidas habituais de qualquer pessoa experiente no domínio. Em geral, o composto de fórmula (XII) em que R6 ou R7 é -OH é dissolvido num solvente de rcacção inerte tal como tetra-hidrofurano, tolueno, benzeno ou xileno e é tratado com uma base tal como hidreto de sódio. A mistura reaccional é tratada com disulfureto de carbono seguido por um agente de alquilação tal como sulfato de dimetilo. A mistura reaccional é agitada durante 0,5 horas até 24 horas e os produtos são isolados utilizando as técnicas usuais de química orgânica.

Para preparar os compostos de fórmula (XII) em que R6 é -OSiR15R162, faz-se reagir um composto de fórmula (XII) em que X é -22- -22-

η tiopirimidino, R6 é -OH e o grupo 3-amino é totalmente substituído sob as condições de sililação padrão aqui atrás descritas.

Para preparar os compostos de fórmula (XII) em que R5 é -CO(CH2)pR13, -C02R13 ou -CONHR13, um composto de fórmula (XII) em que R5 é H é alquilado, carboxilado ou carbamilado de acordo com os métodos padrão de química orgânica. Em geral o composto de fórmula (XII) em que R5 é H é dissolvido num solvente de reacção inerte e tratado com o desejado agente de acilação, carboxilação ou carbamilação na presença de uma amina orgânica tal como trietilamina ou di-isopropiletilamina. A reacção é efectuada geralmente a uma temperatura da gama de 0°C até cerca de 100°C. Muitas vezes a temperatura ambiente é suficiente para se atingir a reacção completa. Os agentes de alquilação típicos incluem mas não são limitados a anidridos ácidos da fórmula 0(C0(CH2)PR13)2 e cloretos de ácido da fórmula RnCOCl. Os agentes de carboxilação típicos incluem mas não são limitados a compostos da fórmula R13NHCOCl. Os produtos são isolados usando as técnicas padrão de química orgânica.

Para preparar os compostos de fórmulas (XII) a (XV) em que X é halo tal como cloro ou bromo, faz-se reagir um composto de fórmula (XII) a (XV) em que X é -OH utilizando técnicas padrão de halogenação bem conhecidas de qualquer pessoa experiente no domínio.

Os precursores para os compostos de açúcar aqui atrás descritos podem ser preparados utilizando os processos revelados por Newman e colaboradores, Journal of Organic Chemistry, 30, 1287-88 (1965) e Newman e colaboradores, Journal of Organic Chemistry, 29, 1461 (1964). Os açúcares obtidos por utilização dos métodos aí descritos podem ser transformados, usando os métodos padrão de química orgânica bem conhecidos de qualquer pessoa -23- / k* * S ¥ « experiente no domínio, para se chegar aos precursores dos compostos de fórmulas (XII) a (XV).

Quando os compostos de fórmula (I) deste invento são básicos, como quando R4 ou R5 são como atrás definidos mas excluindo -CO2R13, -CO(CH2)pR13, -CONHR13 ou -SO2R13, o invento inclui também os sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis dos referidos compostos de fórmula (I).

Os sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis típicos incluem hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, hidrogenossulfato, fosfato, hidrogenofosfato, di-hidrogenofosfato, acetato, succinato, citrato, mesilato (metanosulfonato) e tosilato (p-toluenosulfonato). Estes sais são facilmente preparados por reacção das formas de base com o ácido apropriado. Quando o sal é de um ácido monobásico (por exemplo, o hidrocloreto, hidrobrometo, p-toluenosulfonato ou acetato), a forma hidrogenada de um ácido dibásico (por exemplo, 0 hidrogeno sulfato ou succinato) ou a forma di-hidrogenada de um ácido tribásico (por exemplo, 0 di-hidrogenofosfato ou 0 citrato), é utilizado pelo menos um equivalente molar e em geral um excesso molar do ácido. No entanto, quando são desejados estes sais como o sulfato, o hemissuccinato, o hidrogenofosfato ou o fosfato, serão geralmente utilizados os equivalentes químicos exactos e apropriados. Λ base livre e o ácido são em geral combinados num co-solvente a partir do qual o sal desejado precipita ou pode ser isolado de outro modo por concentração e/ou adição de um não solvente.

Em relação aos macrólidos de fórmula (I) deste invento, é de compreender que são formas conformadoras ou estereoisoméricas tais como isómeros ópticos e geométricos devido a átomos de carbono assimétricos e ligações duplas, e tais isómeros também são incluídos dentro do âmbito deste invento. *4 -24- /">

Os compostos de fórmula (I) assim preparados são úteis no tratamento de resistência a transplante e doenças autoimunes tais como artrite reumatóide ou psoríase. No tratamento de resistência a transplante, pode ser usado um composto de fórmula (I) quer profílacticamente quer em resposta a uma reacção contrária pelo ser humano a um órgão ou tecido tranplantado. Quando usado profílacticamente, um composto de fórmula (I) é administrado ao doente ou ao tecido ou órgão a ser transplantado antes da operação de transplante. O tratamento profiláctico também pode incluir a administração da medicação depois da operação de transplante mas antes de serem observados quaisquer sinais de reacção contrária ao transplante. Quando administrado em resposta a uma reacção contrária, um composto de fórmula (I) é administrado directamente ao doente com o fim de tratar tal resistência ao transplante depois de terem sido manifestados sinais exteriores da resistência.

Para uso no tratamento de resistência ao transplante e doenças autoimunes tais como artrite reumatóide ou psoríase num mamífero, incluindo o homem, um composto de fórmula (I) é formulado numa composição farmacêutica adequada contendo uma quantidade eficaz de tratamento da doença. Dependendo da potência do composto particular de fórmula (I) a ser administrado, c administrado ao mamífero a scr tratado ccrca dc 0,05 mg/kg de peso do corpo por dia até cerca de 30 mg/kg de peso do corpo por dia, em doses simples ou múltiplas diariamente. Uma gama mais preferida é de 0,05 mg/kg de peso do corpo por dia até cerca de 20 mg/kg de peso do corpo por dia, apesar de em casos particulares, pelo discernimento do médico assistente, poderem ser usadas doses fora da gama mais larga. A via de administração preferida é em geral a via oral, mas a administração parentérica (por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intramedular) será preferida em casos especiais tais como quando a administração oral é inadequada ao desafio do momento ou -25-

quando o doente é incapaz por várias razões de ingerir o medicamento. A administração tópica também pode ser indicada, como quando o doente sofre de uma doença de pele tal como psoríase ou quando a medicação é melhor aplicada à superfície de um tecido ou órgão como administrado pelo médico assistente.

Os compostos de fórmula (I) assim preparados também são úteis no tratamento de infecções causadas por fungos. Para uso no tratamento destas infecções fúngicas num mamífero, incluindo o homem, um composto de fórmula (I) é formulado numa composição farmacêutica contendo uma quantidade eficaz no tratamento da doença. Dependendo da potência do composto particular de fórmula (I) a ser administrado, é administrado ao mamífero a ser tratado cerca de 0,05 mg/kg de peso do corpo por dia até cerca de 30 mg/kg de peso do corpo por dia, em doses simples ou múltiplas diariamente. Uma gama mais preferida é de 0,05 mg/kg de peso do corpo por dia até cerca de 20 mg/kg de peso do corpo por dia, apesar de em casos particulares, pelo discernimento do médico assistente, poderem ser usadas doses fora da gama mais larga. A via de administração preferida é em geral a via oral, mas a administração parentérica (por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intramedular) será preferida em casos especiais tais como quando a administração oral é inadequada ao desafio do momento ou quando o doente é incapaz por várias razões de ingerir o medicamento. A administração tópica também pode ser indicada, como quando o doente sofre de uma doença de pele tal como psoríase ou quando a medicação é melhor aplicada à superfície de um tecido ou órgão como administrado pelo médico assistente.

Os compostos do presente invento são em geral administrados na forma de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um dos compostos de fórmula (I) juntamente com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Estas composições são em geral formuladas de uma forma convencional utilizando veículos ou diluentes sólidos ou líquidos como apropriado ao modo de administração: para administração oral, na forma de comprimidos, cápsulas de gelatina dura ou macia, suspensões, grânulos, pós e semelhantes; para administração parentérica, na forma de soluções ou suspensões injectáveis e semelhantes; e para administração tópica, na forma de soluções, loções, pomadas, emplastros e semelhantes. A utilidade dos compostos do presente invento como agentes médicos no tratamento de resistência ao transplante, doenças infecciosas fúngicas e doenças autoimunes tal como artrite reumatóide ou psoríase é demonstrada pela actividade destes compostos nos ensaios biológicos aqui descritos posterior-mente. Tais ensaios biológicos providenciam também um meio em que as actividades dos compostos de fórmula (I) podem ser comparados com as actividades de outros compostos conhecidos. Os resultados destas comparações são úteis para determinar os níveis de dosagem em mamíferos, incluindo o homem, para o tratamento de resistência a transplante e doenças autoimunes tais como artrite reumatóide e psoríase.

No homem, a reacção linfocitária mista (MLR) é usada para induzir uma resposta imune não específica que é medida através do consumo de 3H-timidina. Este exemplo usa células mononuclcarcs de sangue periférico num MLR de duas-vias modificado. Para assegurar a disparidade de antigénios HLA tipo D e portanto maximizar a estimulação, é usado uma reserva de células dadoras congeladas como estimulador de população; as células recentemente isoladas são utilizadas como população receptora.

As células mononucleares recentemente extraídas são suspendidas em RPM1-1640 enriquecido com: solução(100 x) de aminoácidos não essenciais MEM a 0,5%, 1% de L-glutamina (200mM), 1% vitaminas MEM (100 x), 1% de -27- Αα U 5 ί solução (10000 unidades / niL) de penicilina e estreptomicina, e 15% de soro humano AB inactivado por aquecimento (NABI). As células são contadas e a concentração é ajustada para 5 x 105 células / mL. A solução é então transferida para um balão redondo 96 pratos well em quantidades de 100pL/well. Estes pratos contêm agora as células receptoras.

As células estimuladoras são preparadas pela reunião das células mononucleares colhidas de vários indivíduos diferentes. As células são suspensas em soro AB humano a 90% e DMSO a 0% tal que a contagem de células seja de 2 x 107 células/mL. As células são então armazenadas em azoto líquido. Para um MLR, as células viáveis são diluídas para 5 x 105 células/mL, e é adicionado 100pL/well aos pratos contendo as células receptoras. Para cada well, contendo uma mistura de células receptoras e células estimuladoras, é adicionado 50pL de solução do composto. Os wells em triplicado são realizados para cada dose Os pratos são incubados a 37°C numa atmosfera de 5%C02 e são humidificados durante 5 dias. Para cada well é adicionado lpCi de 3H-timidina e a incubação é continuada durante 18 horas. As células são avaliadas usando o sistema LKB Beta Plate. A percentagem de inibição de controlo estimulado é obtida usando a equação seguinte: %de!nibição = 100- média de cpm de fármaco média de cpm de controlo estimulado, x 100 A abreviatura cpm é definida como contagem por minuto. RPMI-1640 é um meio de cultura de tecidos que está disponível a partir de Sigma. A actividade em MLR atrás referida é indicativo de utilidade do -28- »Qa. Υ h -'''"“'«"C f *Ί composto activo no tratamento de resistência a transplante e doenças autoimunes tais como artrite reumatóide e psoríase.

As actividades antimicrobianas dos macrólidos do presente invento em relação a vários fungos são determinadas por um método de diluição série agar num agar Sabouraud. Os valores de concentração de inibição mínima (MIC) são obtidos depois de incubação durante 24 horas a 30°C. O presente invento é ilustrado pelos exemplos seguintes. No entanto, deve ser compreendido que o invento não é limitado aos detalhes específicos destes exemplos. Todas as reacções são conduzidas sob uma atmosfera inerte, tal como árgon, excepto quando especificado de outro modo. As abreviaturas THF, DMSO, DAST, DMAP e Ac, quando usados, referem-se a tetra-hidrofurano, dimetil sulfóxido, dimetilamino trifluoreto de enxofre, 4-dimetilaminopiridina e acetilo, respectivamente. Foram usados solventes anidros, sendo definido anidros como substancialmente livre de água.

Os termos ou acrónimos que aparecem nas Preparações 1 e 2 são descritos com mais detalhe aqui posteriormente. O agar PYEA é preparado por dissolução de 10 g de maltose Difco, 4 g de extracto de cevada, 4 g de dextrose, 15 g de agar Difco e 50 mL de leite de côco recente em suficiente água desionizada para dar uma solução de um litro; e a solução é ajustada para pH igual a 7,3 com NaOH IN. O meio ATCC 172 é preparado por dissolução de 10 g de glucose, 20 g de amido solúvel, 5 g de extracto de cevada, 5 g de NZ-amina A (Difco) e 1 g de carbonato de cálcio em suficiente água desionizada para dar uma solução de um litro; e a solução é ajustada para pH igual a 7,0 com KOH IN. -29- -29-

«'Λ Λ, Ο meio JDYTT é preparado por dissolução de 10 g com cerelose, 5 g de amido de milho, 5 g de fungo de milho líquido, 5 g de NZ-amina YTT, 0,002 g de cloreto de cobalto e 3 g de carbonato de cálcio em suficiente água desionizada para dar uma solução de um litro; e a solução é ajustada para pH igual a 7,2 com NaOH IN. A NZ-amina A e a NA-amina YTT encontram-se disponíveis a partir de Difco, como são a maioria dos ingredientes do meio anterior.

No protocolo MLR aqui atrás obtido, RPMI-1640 é um meio padrão para estudos MLR; MEM é definido como "meio essencial mínimo"; e um fornecedor é NABI. EXEMPLO 1 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-Γ2,-(4,,-f3,".4,,,.6,"-tridesoxi-2",-0-acetil-3",-fdimetilaminoVB-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinill-23,25-dimetoxi-13.19.21.27-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04,9loctacos-18-eno-2.3.10.16-tetraona

Foi dissolvido 17,8 g (22,51 mmol) do composto indicado em título da Preparação 1 em lOOOmL de mistura 1:1 de tolueno e diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob árgon. A solução foi arrefecida até 5°C (num banho de gelo) e triturada em 17,0 g de filtros moleculares de 4D e foram adicionados em sequência 17,4 g (67,52 mmol) de trifluorometanosulfonato de prata. A solução arrefecida foi adicionado lentamente durante 1 hora uma solução de 21,06 g (67,52 mmol) do composto da Preparação 8 em 100 mL de diclorometano. Quando a adição esteve completa a mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente e foi agitada durante dezoito horas. A reacção foi filtrada através de Celite* e a camada de Celite’ foi lavada abundantemente com mais 200 mL de diclorometano. O filtrado foi evaporado a vácuo e o resíduo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel ( eluído com acetato de etilo e depois com com uma mistura 95:5 de acetato de etilo:trietilamina) para se obterl2,0 g (54%) do composto indicado em título sob a forma de uma espuma incolor.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1123 (M+ Cs+, 5%), 1013 (M + Na+, 14%), 334 (100%) e 200 (CioH18N03+, 80%) picos seleccionados de NMR do protão *H (CD2C12): δ 4,70 (1H, dd, J = 8,4 Hz, 10,3 Hz), 4,41 (1H, d, J = 8,4 Hz), 3,39 (3H, s), 3,37 (3H, s), 3,29 (3H, s), 3,09 (1H, m), 2,24 (6H, s), 2,03 (3H, s)e 1,25 (3H, d, J = 7,1 Hz). EXEMPLOS 2-8

Usando substancialmente o mesmo processo que o referido no Exemplo 1, mas substituindo o composto indicado em título na Preparação 8, pelo derivado apropriado de tiopirimidina de fórmulas (XII) - (XV), foram preparados os seguintes compostos: 2. 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-r2,-f4,,-G,".4,,,.6,,,-tridesoxi-2,"-0-benzoíl-3m- (dimetilaminoV B-D-xilo-hexopiranosiloxiV3"-metoxiciclo-hexilV 1 '-metilvinill -23.25-dimetoxi-13.19.21.27-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04|9loctacos-18-eno-2.3.10,16-tetraona

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1053 (M+ H+, 5%), espectro de NMR do protão *H seleccionado (CD2C12): δ 8,20 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,58 (1H, t, J = 7,2 Hz), 7,45 (2H, dd, J=7,2, 7,2 Hz), 4,60 (1H, d, J=7,6 Hz), 3,37 (3H, s), 3,36 (3Η, s), 3,28 (3H, s), 2,28 (6H, s), 1,57 (3H, s larga), 1,54 (3H, s larga), e 1,29 (3H, d, J=6,l Hz); espectro de NMR do 13C ( CD2C12): δ 213,7, 197,3, 169,5, 165,7, 165,4, 139,2, 133,2, 132,5, 131,0, 130,0, 129,9, 128,7, 123,6, 100,2, 97,2, 81,7, 80,1, 77,5, 75,5, 74,0, 73,3, 72,1, 70,5, 69,7, 63,9, 57,7, 57,1, 56.6, 55,1, 49,0, 43,2, 40,8, 40,0, 39,6, 36,9, 35,0, 34,8, 33,1, 33,0, 31,2, 30,7, 29.7, 27,9, 26,8,24,9, 24,6,22,7, 21,3, 20,6, 16,4, 15,9,14,1, 11,8 e 9,4. 3. 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-r2,-r4,,-t3,,,.4l,,.6",-tridesoxi-2,,,-Q-docosanoil- 3 m-f dimetilamino)- B-D-xilo-hexopiranosiloxiV 3 "-metoxiciclo-hexiD-1 *-metilvinill -23,25-dimetoxi-13.19.21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclof22,3.1.04,9loctacos-18-eno-2.3.10,16-tetraona.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1272 (M+ H+, 6%), espectro de NMR do protão 'Η seleccionado (CD2C12): δ 4,72 (1H, dd, J = 9,3, 7,4 Hz), 4,44 (1H, d, J = 7,4 Hz), 3,39 (3H, s), 3,36 (3H, s), 3,29 (3H, s), 2,24 (6H, s), 1,63 (3H, s larga), 1,57 (3H, s larga) e 1,27 (38H, s larga); espectro de NMR do 13C (CD2C12): δ 213,6, 197,2, 172,7, 169,4, 165,2, 139,1, 132,4, 129,8, 123,3, 99,6, 97,0, 81,6, 79,5, 77,2, 75,3, 73,8, 73,2, 70,9, 70,3, 69,5, 63,6, 57,6, 57,0, 56,4, 54.9, 48,8, 42,6, 40,6, 39,7, 39,4, 36,8, 34,8, 34,8, 34,7, 33,0, 32,8, 32,1, 30,6, 29.9, 29,8, 29,6, 29,5, 29,3, 27,8, 26,6, 25,3, 24,7, 24,5, 22,9, 21,5, 21,1, 20,4, 16,2, 15,8, 14,1, 14,0, 11,7 e 9,2. 4. 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-r2,-t4"-t3,,,.4,,,.6,,,-tridesoxi-2"’-0-f 2.2- dimetilpropanoílV3’"-(dimetilaminoVB-D-xilo-hexopiranosiloxiV3"-metoxiciclo-hexilV 1 '-metilvinill-23,25-dimetoxi-l 3,19.21.27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04,91octacos-18-eno-2,3.10.16-tetraona.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1034 (M + H+, 5%), espectro de NMR do protão ‘H seleccionado (CD2C12): δ 4,67 (1H, dd, J = 10,1, 7,6 Hz), 4,48 (1H, d, J = 7,6 Hz), 3,39 (3H, s), 3,37 (3H, s), 3,29 (3H, s), 2,22 (6H, s), 1,62 (3H, s larga), 1,59 (3H, s larga), 1,26 (3H, d, J = 6,1 Hz) e 1,18 (9H, s). 5. 17-Etil-1 14-di-hidroxi-12-r2'-í4"-f3",.4,".6"'-tridesoxi-2’"-Q- octadecanoílV3dimetilamino)- β-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3 "-metoxiciclo-hexilV 1 l-metilvinin-23.25-dimetoxi-13.19.21.27-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04,9loctacos-18-eno-2.3.10.16-tetraona

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1215 (M + H+, 5%) e 424 (C26H50NO3, 100%); espectro de NMR do protão ‘H seleccionado (CD2C12): δ 4,71 (1H, dd, J = 10,5, 7,7 Hz), 4,42 (1H, d, J = 7,7 Hz), 3,39 (3H, s), 3,36 (3H, s), 3,29 (3H, s), 2,22 (6H, s), 1,62 (3H, s larga), 1,58 (3H, s larga) e 1,26 (30H, s). Espectro de NMR do 13C ( CD2C12): δ 213,6, 197,2, 172,7, 169,4, 165,2, 139,1, 132,4, 129,8, 123,3, 99,6, 97,0, 81,6, 79,5, 77,2, 75,3, 73,8, 73,2, 71,0, 70.3, 69,5, 63,6, 57,6, 57,0, 56,4, 54,9, 48,8, 42,9, 40,6, 40,4, 40,3, 39,7, 39,4, 36,8, 34,9, 34,8, 34,7, 33,0, 32,8, 32,1, 30,7, 30,6, 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,5, 29.4, 29,3, 29,2, 27,8, 26,6, 25,3, 24,7, 24,5, 22,9, 21,5, 21,1, 20,4, 16,2, 15,8, 14,1,14,0,11,7 e 9,2. 6. 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-r2,-f4"-(3m.4",.6,,,-tridesoxi-2m-0-ft- butildimetilsililV3"'-rdimetilaminoVa-D-xilo-hexopiranosiloxi')-3,'-metoxiciclo-hexiO-1 '-me til vinil! -23.25-dimetoxi-13.19.21.27-tetrametil-11.2 8-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04,9loctacos-18-eno-2.3.10.16-tetraona

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1085 (M + Na+, 21%),1063 (M + H+J 12%) e 272 {C14H30NO2Si, 100%); espectro de NMR do protão ’H -33-

seleccionado (CD2C12): 5=5,06 {1 H, d, J=3,6 Hz); 3,55 (1H, dd, J=10,4, 3,6 Hz)), 3,37 (3H, s), 3,36 {3H, s), 3,29 (3H, s), 2,25 (6H, s), 1,63 (3H, s larga), 1,58 (3H, s larga), 1,11 (3H, d, J = 6,3 Hz), 0,92 (9H, s), 0,09 (3H, s) e 0,08 (3H, s). 7. 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-r2,-(4l,-(3",.4l".6m-tridesoxi-2,t,-0-metil-31"-(dimetilaminoVD-xilo-hexot>iranosiloxiV3ll-metoxiciclo-hexilV 1 '-metilvinill-23-25-dimetoxi-13,19.21.27-tetrametil-11.18-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04,9loctacos-l 8-eno-2.3.10.16-tetraona

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 985 (M + Na+, 6%), 963 (M + H+, 12%) e 172 (C9Hi8N02, 100%); espectro de NMR do protão 'H seleccionado (CD2C12): δ = 3,38 (3H, s), 3,36 (3H, s), 3,35 {3H, s), 3,27 (3H, s), 2,31 (6H, s), 1.64 (3H, s larga) e 1,58 (3H, s larga). 8. 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-r2,-(4,,-(3,,,.4,,,.6m-tridesoxi-2,,,-0-tríetilsililV 3IM-( dimetilamino')-D-xilo-hexopiranosiloxiV3,'-metoxiciclo-hexilV 1 '-metilvinil]-23.25-dimetoxi-13,19.21.27-tetrametil-l 1.28-dioxa-4- azatriciclor22.3.1.04,9loctacos-18-erto-2.3.10.16-tetraona

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1085 (M + Na', 16%) e 272 (Ci4H30NO2Si, 76%); espectro de NMR do protão lU (CD2C12) α anómero 5=5,04 (1 H, d, J=3,6 Hz), 3,56 (1 H, dd, J=10,4, 3,6 Hz}, 3,39 (3H, s), 3,36 (3HJ, s), 3,28 (3H, s), 2,25 (6H, s), 1,63 (3H, s larga), 1,57 (3H,s larga), 1,10 (3H, d, J=6,l Hz), 0,97 (9H, t, J=7,5 Hz) e 0,63 (6H, q, J=7,5 Hz); β anómero 5=4,27 (1 H, d, J=7,3 Hz), 3,39 (3H, s), 3,37 {3H, s), 3,28 (3H, s), 2,25 (6H, s), 1.64 (3H, s larga), 1,57 (3H, s larga), 1,22 {3H, d, J-6,3 Hz), 0,95 {9H, t, J=7,4 Hz) e 0,60 (6H, q, J=7,4 Hz). EXEMPLO 9 17-Alil-1.14-di-hidroxi-1242^^^3^4^.6^^^650^-2^^0^61111-311^ (dimetilaminol- β -D-xilo-hexopiranosiloxiV 3 "-metoxiciclo-hexil V1 '-metilvinill -23,25-dimetoxi-13,19.21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo Γ22.3.1.04,9] octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona

Usando substancialmente o mesmo processo que o referido no Exemplo 1, mas utilizando o composto indicado em título da Preparação 2 em vez do composto indicado em título da Preparação 1, foi preparado o composto do Exemplo 9.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1003 (M + H+, 8%) e 200 (C10H18NO3, 100%); espectro de NMR do protão ]H (CD2CI2) δ=4,68 (1H, dd, J=10,3, 7,4 Hz), 4,40 (1H, d, J=7,4 Hz), 3,39 (3H, S), 3,37 (3H, S), 3,30 (3H, s), 2,24 (6H, s), 2,03 (3H, s), 1,64 (3H, s larga), 1,59 (3H, s larga) e 1,23 (3H, d, J=6,2 Hz). EXEMPLO 10 17-Etil-1 -hidroxi-14-( 3 lll.4lll.6"l-tridesoxi-2'"-0-acetil-3 '"-(dimetilaminoVB-D-xilo-hexopiraiiosiloxiV12-r2t-(4"-ri-bulildimelilsililoxiV3"-meluxieielo-hexilVr-metilvinill-23.25-dimetoxi-13.19.21.28-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04,9loctacos-18-eno-2.3.10.16-tetraona O composto indicado em título deste Exemplo foi preparado usando 0 mesmo processo que 0 referido no Exemplo 1, mas substituindo o composto da Preparação 1 pelo composto da Preparação 31.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1003 (M + H+ , 8%) e 200 -35- / ! f 1 * 1 *4 (CioHi8N03, 100%); espectro de NMR do protão 'H (CD2C12) isómero β δ= 4,70 (1H, dd, J=9,8, 7,3 Hz). 4,30 (1 H, d, J=7,3 Hz), 3,37 (6H, S), 3,32 (3H, s), 2,25 (6H, S), 2,22 (3H, s), 1,65 {3H, s larga), 1,45 (3H, s larga), 1,18 (3H, d, J=6,l Hz), 0,89 (9H, S), 0,09 (3H. s) e 0,08 (3H, s). EXEMPLO 11

Foi dissolvido 12,0 g (12,12 mmol) do composto indicado em título do Exemplo 1 em 200 mL de metanol e agitado à temperatura ambiente. Depois de dezasseis horas a mistura reaccional foi evaporada a vácuo e o resíduo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 20:80:1 de 2-propanol:diclorometano:amónia aquosa) para se obter 6,8 g do composto indicado em título, sob a forma de uma espuma branca.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 950 (M + H+ , 16%); picos seleccionados de NMR do protão *H (CD2C12) 8= 4,36 (1H, d, J=7,4 Hz), 3,39 (3H, s), 3,36 (3H, s), 3,29 (3H, s), 2,29 (6H, s), 1,63 (3H, s larga), 1,58 (3H, s larga) e 1,23 (3H, d, J=6,l Hz).

Espectro de NMR do 13C ( CD2C12): δ = 213,7, 197,3, 169,5, 165,3, 139,2, 132,6, 130,0, 123,5, 101,3, 97,2, 81,7, 78,7, 77,3, 75,4, 73,9, 73,3, 70,4, 70,0, 69,7, 65,8, 57,2, 57,1, 56,5, 55,0, 48,9, 43,1, 40,6, 39,9, 39,5, 36,6, 35,0, 34,9, 33,1, 32,9, 30,9, 30,0, 29,5, 27,9, 26,7, 26,4, 24,8, 24,6, 21,6, 21,4, 20,5, 16,3, 15,9, 14,2, 11,8 e 9,4. EXEMPLO 12

Foi dissolvido 1,25 g (1,32 mmol) do composto indicado em título do Exemplo 11 em 15 mL de piridina e 15 mL de DMF com agitação à temperatura ambiente. Fez-se borbulhar sulfureto de hidrogénio gasoso na -36- /<l

mistura reaccional à temperatura ambiente. A mistura reaccional tomou-se verde escuro dentro de trinta minutos depois da adição de sulfureto de hidrogénio. Após vinte horas, o borbulhar de sulfureto de hidrogénio foi interrompido e o meio reaccional foi diluído com 300 mL de tolueno. A solução de tolueno foi lavada exaustivamente com 5 x 200 mL de salmoura, seca sobre Na2S04, filtrada e evaporada a vácuo para dar um sólido amarelo. O sólido foi cromatografado em sílica gel (utilizando uma mistura 95:5 de acetato de etilo:trietilamina) para se obter 850 mg (69% de rendimento ) do composto indicado em título.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 935 (M + H+, 18%);

Espectro seleccionado de NMR do protão !H (CD2CI2) δ= 7,02, (1H, permutável), 4,33 (1 H, d, J=7,3 Hz), 3,39 (3H, s), 3,32 (3H, s), 3,28 (3H, s), 2,27 (6H, s), 1,64 (3H, s larga), 1,62 (3H, s larga), 1,22 (3H, d, J=6,l Hz), 0,93 (3H, d, J=6,2 Hz), 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 0,85 (3H, d, J=7,2 Hz), e 0,75 (3H, d, J=5,8 Hz). EXEMPLOS 13 E 14

Usando substancialmente o mesmo processo que o referido no Exemplo 12, mas substituindo o composto do Exemplo 11 pelo composto apropriado dos Exemplos 8 ou 15. 13. íy-Etil-l.M-di-hidroxi-re^^^^^^-tridesoxi^^rtrietilsiliD^’'’-(dimetilaminoVD-xilo-hexopiranosiloxi)-3l,-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinill-23.25-dimetoxi-13,19.21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatricick>r22.3.1.04,91octacos-l 8-eno-3.10.16-tetraona

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1071 (M + H+ , 40%) e 272, {C14H30NO2S1,100%);

Espectro seleccionado de NMR do protão 'H (CD2Cl2), a isómero 5= 6,98 (1H, s larga, permutável), 5,04 (1H, d, J=3,7 Hz), 3,39 (3H, s), 3,32 (3H, s), 3,27 (3H, s), 2,63 (1H, d, J=17 Hz), 2,49 (1H, d, J= 17 Hz), 2,23 (6H, s), 1,65 (3H, s larga), 1,61 (3H, s larga), 1,08 (3H, d, J=6,3 Hz)! 0,96 (9H, t, J=7,2 Hz) e 0,62 (6H, q, J=7,2 Hz). 14. 17-Etil-1.14-di-bidroxi-r2,-r4"-t3,,,.4,,,.6,,,-tridesoxi-3,"-tdimetilaminoVa -D-xilo-hexopiranosiloxiV3',-metoxiciclo-hexilVr-meti1vinill-23.25-dimetoxi-13,19.21,27-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatriciclof22.3.1.04,91octacos-18-eno-3.10.16-tetraona

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 957 (M + H+, 100%);

Espectro seleccionado de NMR do protão 'H (CD2C12), a isómero δ= 6,99 (1H, s larga, permutável), 5,03 (1 H, d, J=3,6 Hz), 3,37 (3H, s), 3,31 (3H, s), 3,26 (3H, s), 2,64 (1 H, d, J=17 Hz), 2,49 (1H, d, J=17 Hz), 2,28 (6H, s), 1,65 (3H, s larga) e, 1,62 (3H, s larga). EXEMPLO 15 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-r2,-('4"-(,3,,,.4,,,.6,,l-tridesoxi-2ll,-3,,,-('dimetilaminoVa-D-xilo-hexopiranosiIoxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23.25-dimetoxi-13.19.21.27-tetrametil-11,2 8-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04|9loctacos-18-eno-2.3.10.16-tetraona:

Foi dissolvido 757 mg (0,71 mmoles) do composto indicado em título do Exemplo 8 em 30 mL de acetonitrilo à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi tratada com porções de 6 x 0,5 mL de ácido fluorídrico aquoso a -38-

48% durante ο período de tempo de trinta minutos. Duas horas depois da última adição de ácido fluorídrico, a mistura reaccional foi vertida em hidróxido de sódio aquoso IN, tal que o pH Final seja igual a 11,0. A solução aquosa foi extraída com 2 x 35 mL de acetato de etilo. As porções orgânicas foram combinadas, secas sobre MgSC>4 e filtradas para dar origem a uma espuma branca após evaporação a vácuo. A espuma foi submetida a cromatografia rápida em sílica gel ( eluída com uma mistura 95:5 de acetato de etilo:trietilamina) para se obter 201 mg (30% de rendimento )do composto indicado em título puro.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 949 (M + H+ , 48%) e 158 (C8H16N02,100%);

Espectro seleccionado de NMR do protão ’h (CD2CI2) a-isómero 6= 5,05 (1H, d, J=3,7 Hz), 3,38 (3H, s), 3,36 (3H, s), 3,29 (3H, s), 2,28 (6H, s), 1,63 (3H, s larga), 1,58 (3H, s larga) e 1,12 (3H, d, J=6,3 Hz). EXEMPLO 16 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-r2'-(4"-í4"'-desoxi-4"'-(dimetilaminol-B-D-cladinosiloxi-3ll-metoxiciclo-hexilV r-metilvinin-23.25-dimetoxi-13.19.21.27-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatriciclor22.3.1.04,9loctacos-18-eno-2.3,10.16-tctraona.

Usando substancialmente o mesmo processo que 0 referido no Exemplo 1, mas substituindo 15 equivalentes do composto indicado em título da Preparação 32 em vez do composto indicado em título na Preparação 8, e utilizando 20 equivalentes de trifluorometanosulfonato de prata e 5,0 g de filtros moleculares, foi preparado 0 composto indicado em título neste Exemplo, com 0 rendimento de 4,3 % de rendimento. Foram obtidos o isómero α e β do carbono C-4'". -39- *—· «-Α

Espectro de massa (FAB de alta resolução): Isómero-a:

Valores calculados para C54H90N2O12 : 958,6470, Valores encontrados para C54 H90N2O12: 958,6501;

Isómero-β:

Valores calculados para C54H90N2Oi2 : 958,6470, Valores encontrados para C54 H90N2O12 : 958,6595. PREPARAÇÃO 1 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-r2,-í4"-hidroxi-3"-metoxi-ciclo-hexil')-1 '-metilvinill-23,25-dimetoxi-13.19.21.27-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatriciclol22.3.1,04,91-octacos-18-eno-2.3.10.16-tetraona.

Foi feita cultura ATCC 14891 de streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus em meio de agar PYEA (lOg/L de maltose Difco, 4g/L de extracto de cevada Difco, 4g/L de dextrose, 15 g/L de agar Difco e 50 mL de leite de côco fresco que foi diluído para um litro de água desionizada eopH foi depois ajustado para 7,3 com NaOH). A preparação foi incubada durante 10 a 12 dias a 28°C, e os esporos foram depois transferidos para tubos misturadores esterilizados 1x6 contendo 10 mL de meio ATCC 172 (10 g/L de glucose, 20g/L de amido solúvel, 5g/L de extracto de cevada, 5g/L de NZ-amina A e lg/L de carbonato de cálcio. O pH foi ajustado para 7,0 com KOH IN). Os tubos foram incubados a 28°C e agitados num agitador rotativo entre cerca de 150 e 200 ciclos/minuto. Depois de 4 a 5 dias o meio foi diluído para 40% com glicerol e com meio ATCC 172 e depois transferidos assepticamente para criotubos. Cada -40- C-^ tubo foi carregado com 1/2 mL de meio de cultura. Os tubos foram congelados a -80°C durante a armazenagem.

Foram usados os tubos de armazenagem ultra fria como inoculação da semente para a preparação de frascos de inoculação, um tubo por 50 mL de meio JDYTT estéril em frascos misturadores de 300mL. A composição do meio JDYTT era de lOg/L de cerelose, 5g/L de NZ-amina YTT, 0,02gL de cloreto de cobalto e 3g/L de carbonato de cálcio. O pH do meio JDYTT foi ajustado para pH igual a 7,2 com NaOH IN. Os frascos misturadores foram agitados e incubados num misturador rotativo entre cerca de 150 e 200 ciclos/minuto e 28°C.

Foi usado 2 mL de um frasco misturador de inoculação com cerca de 3 a 5 dias de idade para inocular o frasco de inoculação de segunda fase contendo 80 mL de meio JDYTT num recipiente de fermentação de 3L. O meio de fermentação foi 45 g/L de amido de milho, 10 g/L de licor de milho, 10 g/L de cevada seca âmbar ou Baker, 3 g/L de carbonato de cálcio e 0,005 g/L de cloreto de cobalto. O pH foi ajustado para um valor entre cerca de 6,4 e 6,8 com NaOH. Foi adicionado ao recipiente de fermentação 1 mL de antiespuma P-2000 juntamente com 100 mL de óleo de feijão de soja. O pH foi ajustado para um valor entre cerca de 6,4 e 6,8 com NaOH IN e o material foi agitado a 1700 rpm. A temperatura foi mantida a 28°C e fez-se passar através do meio ar esterilizado à velocidade de 1 volume por volume por minuto.

Depois da inoculação, foi usado óleo de feijão de soja para controlar a formação de espuma. Em fermentações maiores, e, dependendo do meio usado, o conteúdo de açúcar pode ser controlado e as sementes de açúcar usadas a 40, 60 e 90 horas para manter o nível de redução de açúcar para 0,05% ou superior. A fermentação decorreu durante um período de tempo de 46 horas. -41 - Μ *V' jífl r

I

Usando métodos padrão de cromatografia em camada fina e HPLC, o meio de fermentação foi controlado e foi calculado a potência relativa.

Foi encontrado o produto essencialmente no micélio, mas é preferido trabalhar todo o meio. Assim, depois de se ter realizado a fermentação, todo o meio foi extraído duas vezes com um terço a um meio do seu volume de mctilisobutilcetona (MIBK). As camadas foram separados por meio de um separador de DeLaval ou um extractor de Podbielnack. A camada de solvente foi clarificada e concentrada primeiro a vácuo e depois num evaporador rotativo. O concentrado foi submetido a um contador de quatro tubos de distribuição de corrente e 20 litros usando uma camada superior de 10 litros e uma camada inferior de 1 litro de um sistema 10/1 de heptano/acetonitrilo. As camadas activas inferiores foram recolhidas, combinadas e concentradas. O material foi depois purificado através de filtração por Florisil (lavagem com hexano, hexano / cloreto de metileno e cloreto de metileno, sucessivamente, com um aumento gradual em cloreto de metileno). A maior parte da actividade foi encontrada nas fracções de cloreto de metileno. Estas foram combinadas e concentradas. Foi realizado um segundo passo de filtração, desta vez através de sílica gel (lavagem com heptano, cloreto de metileno, cloreto de metileno / acetato de etilo e acetato de etilo). A actividade foi encontrada principalmente nas fracções contendo uma mistura de cloreto de metileno / acetato de etilo e nas fracções contendo apenas acetato de etilo. Estas foram combinadas e concentradas, dissolvidas outra vez em cloreto de metileno e tratadas com DARCO G60. A amostra foi depois dividida em porções del2al5ge cada amostra foi depois cromatografada num cromatógrafo líquido Prep 500 usando colunas de sílica gel e eluindo usando um gradiente linear começando com 100% de cloreto de metileno e terminando com 100 % de acetato de etilo. Foram combinados os cortes activos, concentrados e

-42-

C.....-.U cromatografados num Prep 500, usando sílica gel de fase reversa (18C) e eluindo com um gradiente linear começando com acetona e terminando com 100 % de água. Foi obtido produto limpo como último componente isolado para fora da coluna.

As fracções activas no processo de fermentação anterior foram determinadas usando o bioensaio que se segue.

Foi aplicado directamente um disco de 12,5 mm à superfície de agar. Foram usados Candida albicans ATCC 14053, Saccharomyces pastorianus FD3737 e uma espécie sensível de Byssochlamys fulva FM 10 300(S) e FM 10 464 (R). Foram incubadas preparações de Candida e Saccharomyces a 37°C durante 18 horas, e depois foram oservadas em relação à actividade. As preparações de Byssochlamys foram incubadas a 28 °C e lidas depois de 18 horas. As preparações contendo apenas FK506 e FK520 (CP-105051) eram activas em relação à espécie Byssochlamys. As fracções impuras (contendo nigericina) eram também activas em relação a outras espécies.

Também foi usado um método de HPLC para determinar a pureza das fracções. O método constava de uma coluna Dupont Zorhax CN (4,6 mm x 25 cm) e um sistema isocrático composto de 55/45 de água/acetonitrilo e uma taxa de fluxo de 1 mL / minuto. A detecção foi realizada a 214 nm. A amostra (20 mL) do meio de cultura foi misturada com 20 mL de MIBK e agitado durante cerca de 4 a 5 minutos. As camadas foram separadas e o solvente foi concentrado quase até à secura. O resíduo foi extraído em 1 mL de acetonitrilo puro e foi injectado uma amostra de 5 pL em HPLC. O tempo de retenção para FK520 é aproximadamente de 12,7 minutos sob estas condições. -43- ( PREPARAÇÃO 2 17-Alil-1.14-di-hidroxi- 12-[2'-( 4"-hidroxi-3 "-metoxi-ciclo-hexil V1 '-metilvinill -23,25-dimetoxi-13.19.21,27-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatricic1or22.3.1.04'91-octacos-18-eno-2.3.10.16-tetraona.

Streptomyces tsukubaensis N°. 9993 FERM BP-927 foi colocada em pratos de agar PYEA (10 g / L de maltose Difco, 4 g / L de extracto de cevada Difco, 4 g / L de dextrose, 15 g / L de agar Difco e 50 mL de leite de côco fresco que foi diluído até ! litro com água desionizada e depois o pH foi ajustado para 7,3 com NaOH IN). A preparação foi incubada durante 10 a 12 dias a 28°C, e os esporos foram então transferidos para tubos misturadores 1x6 esterilizados contendo 10 mL de meio ATCC 172 ( 10 g/L de glucose, 20 g/L de amido solúvel, 5 g/L de extracto de cevada, 5 g/L de NZ-amina A e 1 g/L de carbonato de cálcio. O pH foi ajustado para 7,0 com KOH IN). Os tubos foram incubados a 28°C e agitados num agitador rotativo entre cerca de 150 a 200 ciclos / minuto. Após 4 a 5 dias a mistura foi diluída para 40% com glicerol e com o meio ATCC 172 e depois foram transferidos assepticamente para criotubos. Cada tubo foi carregado com 172 mL de mistura. Os tubos foram congelados a -80°C durante a armazenagem.

Os tubos de armazenamento ultra frio foram usados como semente de inoculação para a preparação de frascos de inoculação, um tubo por 50 mL de meio JDYTT esterilizado em 300 mL de frascos misturadores. A composição do meio JDYTT era de lOg/L de cerelose, 5 g/L de NZ-amina YTT, 0,002 g/L de cloreto de cobalto e 3 g/L de carbonato de cálcio. O pH do meio JDYTT foi ajustado para pH igual a 7,2 com NaOH IN. Os frascos misturadores foram agitados e incubados num agitador rotativo entre cerca de 150 e 200 ciclos / minuto e 28°C. -44- λ. I *·Ά

Depois da inoculação, foi usado óleo de feijão de soja para controlar a formação de espuma. Em fermentações maiores, e, dependendo dos meios usados, o conteúdo de açúcar pode ser controlado e as sementes de açúcar usadas a 40, 60 e 90 horas para manter o nível de redução de açúcar para 0,05% ou superior. A fermentação decorreu durante um período de tempo de 46 horas.

Os fermentadores foram interrompidos e extraídos duas vezes com metade do seu volume de metilisobutilcetona (MIBK). A camada de solvente foi separada por aspiração e concentração a vácuo até se obter um óleo viscoso. O óleo foi triturado com hexano, éter dietílico e cloreto de metileno e os cortes activos (os cortes de éter dietílico) foram cromatografados em florisil. O florisil foi eluído sucessivamente, com éter dietílico, cloreto de metileno, acetato de etilo e acetona. O eluato foi concentrado e tratado com carvão activado. O concen- trado foi filtrado e dissolvido em acetato de etilo. Foi adicionado hexono para cristalizar o produto. A bioactividade da mistura e subsequente correntes de recuperação foi seguida usando uma espécie de Byssochlamys fulva. Os componentes na mistura e correntes de recuperação foram visualizados por cromatografia em pratos de sílica gel Analtech GF (Marca registada) usando acetato de etilo puro como eluente. Os pratos de cultura desenvolvidos foram pulverizados com reagente vanilina (3 g de vanilina em 75 mL de etanol e 25 mL de ácido fosfórico a 85%) e foram aquecidos até 80°C. O produto apareceu sob a forma de uma mancha de côr violeta. PREPARAÇÃO 3

Os compostos que se seguem foram preparados pelo método revelado por Newman, Journal of Organic Chemistry, 30, 1287-88 (1965). 3(a) 3 A6-Tridesoxi-3-(dimetilaminoVD-xilo-hexot>iranósido de Etilo 3(b) 3.4.6-Tridesoxi-3-('metilaminoVD-xilo-hexopiranósido de Etilo PREPARAÇÃO 4 3.4.6-tridesoxi-3-(metil(metanosulfonil)amino )-D-xilo-hexopiranósido de Etilo

Foi dissolvido 0,50 g (2,65 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 3(b) em 10 mL de diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. Foi adicionado 0,46 g (2,65 mmoles) de anidrido metanosulfónico seguido por 0,34 g (2,65 mmoles) de di-

isopropiletilamina. A mistura reaccional foi agitada durante 23 horas à temperatura ambiente e depois submetida a cromatografia rápida em sílica gel (eluída com uma mistura 1:1 de acetato de etilo : diclorometano) para se obter 0,50 g (71%) do composto indicado em título puro.

Espectro de massa (impacto electrónico) m/z = 267 (M+, 28%) 193 (M+ - C3H602, 30%) e 151 (M+ - C6HI202, 100%).

Espectro de NMR do protão *H (CD2C12), a isómero δ= 4,84 (1 H, d, J=4,9 Hz), 4,1,3,4 (5H, complexo), 2,88 (3H, s), 2,79 (3H, s), 1,71 {1H, m), 1,52 (1H, ddd, J=10,3 Hz, 10,3 Hz, 10,3 Hz), 1,25 (3H, t, J=7,l Hz) e 1,15 (3H, d, J=6,7 Hz); β-isómero δ = 4,21 (1H, d, J=9,2 Hz), 4,1-3,4 (4H, complexo), 3,33 (1H, dd, J=10,2, 9,2 Hz), 2,88 (3H, s), 2,80 (3H, s), 1,71 (1H, m), 1,55 (1H, ddd, J=10,3 Hz, 10,3 Hz, 10,3 Hz) e 1,20 (6H, m). PREPARAÇÃO 5 1 -(2-Tiopirimidina) 3.4.6-tridesoxi-3-('metil- ('metanosulfoniDaminoVD-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 1,38 g (6,8 mmoles) de tri-n-butilfosflna em 200 mL e arrefecido até -15°C sob uma atmosfera de árgon. A solução agitada foi tratada com um volume de 2,81 mL de uma solução de tolueno a 38 % de dietilazodicarboxilato (6,8 mmoles). Após vinte minutos, foi dissolvido 1,25 g (5,23 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 4 numa solução 1:1 de tolueno:diclorometano (50 mL) e foi adicionado à solução de fosfina. Depois de mais 45 minutos, foi adicionado 0,76 g (6,8 mmoles) de 2-mercaptopirimidina e a mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi agitada durante 24 horas e depois dluida com 300 mL de acetato de etilo. A solução orgânica foi lavada com 2 x 75 mL de hidróxido de sódio aquoso a 0,5 N, seca sobre Na2S04, filtrada e o solvente foi removido a vácuo para se obter um óleo amarelo. A cromatogradia rápida em sílica gel (eluída com 100% de acetato de etilo) deu origem ao composto indicado em título puro.

Espectro de NMR do protão *H (CDC13), a isómero 5= (picos), δ= 8,54 (2H, d, J=4,8 Hz), 7,06 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,55 (1H, d, J=11,3 Hz), 4,05 (1H, m), 3,73 (1H, m)l 3,67 (1H, dd, J=ll,3 Hz, 11,3 Hz), 2,96 (3H, s), 2,86 (3H, s), 1,86 (1H, m), 1,67 (1H, ddd, J=ll,3 Hz, 11,3 Hz, 11,3 Hz) e 1,23 (3H, d, J=7,0 Hz). PREPARAÇÃO 6 3.4.6- Tridesoxi-3-(metil(metanosulfoml)ammo VD-xílo-hexopiranose

Foi dissolvido 11,50 g (43,0 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 4 em 100 mL de uma mistura de etanol e 500 mL de ácido clorídrico aquoso 2,5 N. A mistura reaccional foi aquecida sob refluxo durante 8 horas e depois arrefecida até à temperatura ambiente. A solução foi evaporada parcialmente para se obter um volume de 500 mL. A solução aquosa foi ajustada lentamente para pH igual a 8 com hidróxido de sódio aquoso 6N. Toda a solução aquosa foi passada através de uma coluna de cromatografia contendo um polímero adsorvente neutro (HP 2Γ) e este foi lavado com mais 200 mL de água. A coluna foi depois lavada com 500 mL de etanol. O etanol foi evaporado para dar origem ao composto indicado em título, sob a forma de um óleo castanho claro.

Espectro de NMR do protão 'H (CDC13), a isómero δ= 5,32 (lH,d, J—4,1 Hz), 4,35 - 3,63 (2H, complexo), 3,58 (1H, dd, J=10,l Hz, 4,1 Hz), 2,96 -48-

η c (311, s), 2,83 (311, s), 1,79 (III, m), 1,59 (III, ddd, J=10,7 IIz, 10,7 IIz, 10,7 IIz) e 1,25 (3H, d, J=6,3 Hz}; β-isómero δ = 4,59 (1H, d, J=9,8 Hz), 4,35-3,63 {2H, complexo), 3,36 (1H, dd, J=10,7 Hz, 9,8 Hz), 2,95 (3H, s), 2,84 (3H, s), 1,79 (1H, m), 1,59 (1H, ddd, J=10,7 Hz, 10,7 Hz, 10,7 Hz) e 1,19 (3H, d, J=6,9 Hz) PREPARAÇÃO 7 l-(2-Tiopirimidina)-3.4.6-tridesoxi-3-(dimetilamino )-D-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 21,2 mL (85,24 mmoles) de tri-n-butilfosfine em 375 mL de tolueno à temperatura ambiente sob árgon. A solução foi arrefecida até -24°C e tratada gota a gota com 35,3 mL (85,24 mmoles) de diazodicarboxilato de dietilo. Após vinte minutos, a mistura reaccional foi tratada rapidamente com uma solução de 11,49 g (65,57 mmoles) de D-desosamina em em 50 mL de tolueno. Depois de mais 45 minutos, foi adicionado de uma sóvez 9,56 g (85,24 mmoles) de 2-mercaptopirimidina sólida. O banho de arrefecimento foi removido imediatamente e a solução foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante 17 horas. A mistura reaccional foi filtrada e o filtrado foi concentrado a vácuo para dar um óleo amarelo. O óleo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 7:2:1 de acetato de etilo:hexano:trietilamina) para se obter 16,67 g de um óleo impuro amarelo. O óleo foi dissolvido em 500 mL de acetato de etilo e extraído com 65 mL de HCÍ IN. O extracto acídico foi lavado com 100 mL de acetato de etilo e o pH foi ajustado para 12 com hidróxido de sódio aquoso 6N. A solução aquosa foi saturada com cloreto de sódio sólido e extraído repetidamente com 3 x 150 mL de acetato de etilo. A evaporação a vácuo deu origem a 9,31 g (53% de rendimento) do composto indicado em título puro, sob a forma de uma espuma amarela. -49-

η

Espectro de NMR do protão 'H (CDC13), β-isómero (superior) δ = 8,47 (2H, d, J=4,8 Hz), 6,94 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,57 (1H, d, J=9,8 Hz), 3,74 (1H, m), 3,46 (1H, dd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz), 2,64 (1H, m) 2,27 (6H, s), 1,76 (1H, m), 1,33 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 9,8 Hz) e 1,22 (3H, d, J=6,2 Hz); β-isómero (menor), delta 8,48 (2H, d, J=4,8 Hz), 6,94 (1H, t, J=4,8 Hz), 6,69 (1H, d, J=3,8 Hz), 4,16 (1H, m), 3,88 (1H, dd, J=9,8 Hz, 3,8 Hz), 2,47 (1H, m), 2,27 (6H, s), 1,65 (1H, m), 1,34 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 9,8 Hz) e 1,17 (3H, d, J=6,2 Hz).

Espectro de NMR do 13C ( CDC13): β-isómero (maior), δ = 170,5, 157,3, 117,1, 85,0, 73,9, 68,0, 67,4,40,3, 28,8 e 21,6. PREPARAÇÃO 8 1 -í2-Tiopirimidina)-3.4.6-trídesoxi-2-0-acetil-3-( dimetilamino )-D-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 5,05 g (18,77 mmoles) de l-(2-tiopirimidina)-3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino )-D-xilo-hexopiranósido da Preparação 7 em 200 mL de diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob árgon. A solução foi tratada com 3,98 g (39,42 mmoles) de trietilamina e depois com 2,10 g (20,65 mmoles) de anidrido acético. A mistura reaccional foi agitada durante 15 horas c depois lavada com 3 x 120 mL de bicarbonato de sódio aquoso a 5% e depois com lx 150 mL de salmoura. A solução orgânica foi seca com sulfato de magnésio, filtrada e o solvente foi removido a vácuo para dar um óleo amarelo. O óleo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 6:3,5:0,5 de acetato de etilo:hexanos:trietilamina) para se obter 4,12 g (71 % de rendimento) de um óleo claro que cristalizou deixando em repouso; com o ponto de fusão de 76-92°C. -50-

ρ ρ

Espectro de Massa ( impacto electrónico ) m/z — 311 (M+, 20%), 252 (M+, -OAc, 8%) and 200 (M+ -tiopirimidina, 95%).

Espectro de NMR do protão 'H (CDCI3), β-isómero (superior) δ = 8,53 (2H, d, J=4,8 Hz), 7,02 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,62 (1H, d, J=9,6 Hz), 4,97 (1H, dd, J=9,6 Hz, 9,6 Hz), 3,71 (1H, m), 2,87 (1H, m), 2,27 (6H, s), 1,97 (3H, s), 1,84 (1H, m), 1,43 (1H, ddd, J=9,6 Hz, 9,6 Hz, 9,6 Hz) e 1,20 (3H, d, J=6,8 Hz). PREPARAÇÃO 9 1-^-Tiopirimidina )-3.4.6-tridesoxi-2-0-metoxi-carbonil-3-(' dimetilamino )-D-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 5,00 g (18,58 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 7 em 180 mL de diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob árgon. A solução foi tratada com 5,28 g (40,89 mmoles) de di-isopropiletilamina seguido por 1,93 g (20,45 mmoles) de cloriformato de metilo. A mistura reaccional foi agitada durante 2 horas e depois concentrada a vácuo para dar um óleo amarelo. O óleo foi submetido a cromatografía rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 95:5 de acetato de etilortrietilamina) para se obter 2,25 g (37 % de rendimento) do composto indicado em título cristalino puro; ponto de fusão de 48-50°C.

Espectro de Massa (impacto electrónico ) m/z = 216,1227 (M+ -tiopirimidina, 100%).

Espectro de infravermelho (KBr): 1751 cm'1.

Espectro de NMR do protão 'H (CD2C12), β isómero (superior) δ=

8.53 (2Η, d, J—4,5 Hz), 7,02 (1H, t, J=4,5 Hz), 5,66 (1H, d, J=9,7 Hz), 4,77 (III, dd, J=9,7 Hz, 9,7 Hz), 3,74 (3H, s), 2,89 (1H, m9,2,29 (6H, s), 1,86 (1H, m) 1,43 (1H, ddd, J=9,7 Hz, 9,7 Hz, 9,7 Hz) e 1,23 (3H, d, J=6,8 Hz).

Espectro de NMR do 13C ( CDC13): 0=170,3, 157,8, 155,4, 117,8, 83,4,74,0, 72,7, 65,1. 55,3, 40,7, 30,8 e 21,4. PREPARAÇÃO 10 l-í2-Tiopirimidina)-3.4.6-tridesoxi-2-0-benzoíl-3-(dimetilamino VD-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 4,00 g (14,85 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 7 em 150 mL de diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob árgon. A solução foi tratada com 19,19 g (149 mmoles) de di-isopropilamina seguido por 13,44 g (59,40 mmoles) de anidrido benzóico. A mistura reaccional foi agitada durante 24 horas e concentrada a vácuo para dar um óleo. O óleo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 30:65:5 de acetato de etilo : hexanos : trietilamina) para se obter 3,09 g (56 % de rendimento) do composto indicado em título puro sob a forma de um óleo amarelo.

Espectro de NMR do protão !H (CD2C12), β isómero (superior) δ= 8,49 (2H, d, J—4,8 Hz), 7,95 (2H, t larga, J=7,2 Hz), 7,53 (1H, brt, J“7,2 Hz), 7,39 (2H, t, J=7,2 Hz), 6,98 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,81 (1H, d, J=9,7 Hz), 5,26 (1H, dd, J=9,7 Hz, 9,7 Hz}, 3,80 (1H, m), 3,05 (1H, m), 2,30 (6H, s), 1,92 (1H, m), 1.54 (1H, ddd, J=9,7 Hz, 9,7 Hz, 9,5 Hz) e 1,26 (3H, d, J=6,8 Hz).

t-A -52- PREPARAÇÃO 11 l-(2-Tiopirimidinay3.4,6-tridesoxi-2-0-docosanoíl-S-fdimetilamino VD-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 6,00 g (230 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 7 em diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. Foi adicionado 6,34 g (49,06 mmoles) de di-isopropiletilamina seguido por 16,27 g (24,50 mmoles) de anidrido docosanóico. A mistura heterogénea foi aquecida sob refluxo durante sete horas e depois arrefecida até à temperatura ambiente e agitada durante mais dezasseis horas. A mistura reaccional foi concentrada a vácuo para dar um resíduo oleoso. O resíduo oleoso foi dissolvido em 200 mL de acetato de etilo e lavado co 150 mL de bicarbonato de sódio aquoso a 5 %. Formou-se uma mistura; a solução bifásica foi filtrada. A fase orgânica do filtrado foi separada, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e evaporada a vácuo para dar um óleo amarelo. O óleo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 35: 60: 5 de acetato de etilo : hexanos : trietilamina) para se obter 4,26 g (32 % de rendimento) do composto indicado em título puro; sob a forma de um sólido com um ponto de fusão baixo, de 35-36°C.

Espectro de Massa ( impacto electrónico ) m/z = 480,4463 (C3oH58N03, M+ - tiopirimidina, 100%).

Espectro de infravermelho (KBr): 1741 cm'1.

Espectro de NMR do protão ’H (CD2C12), β isómero (superior) δ = 8,52 (2H, d, J-4,7 Hz), 7,02 (1H, t, J=4,7 Hz), 5,65 (1H, d, J=9,8 Hz), 4,98.(1 H, dd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz), 3,71 (1H, m), 2,85 (1 H, m), 2,27 (6H, s), 2,23 (2H, m), -53- Âj>

Ι^Λ. Y

1,85 (1H, m), 1,53 (2H, m), 1,44 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 9,6 Hz), 1,26 (36H, larga), 1,22 (3H, d, J=6,8 Hz) e 0,87 (3H, t, J=7,l Hz).

Espectro de NMR do 13C ( CD2C12): δ = 172,9, 170,7, 157,8, 117,6, 83,7, 74,1, 68,5, 65,3, 40,8, 34,8, 32,3, 31,4, 30,1, 30,0, 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,3, 25,3, 23,1, 21,5 e 14,3. PREPARAÇÃO 12

Usando substancialmente o mesmo processo que o referido no Exemplo 11, mas substituindo o anidrido docosanóico pelo agente de acilação apropriado, foi preparado o seguinte composto. 12. l-(2-Tiopirimidina)-3.4.6-tridesoxi-2-0-octadecanoíl-3-(dimetilamino)-xilo-hexopiranósido

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 536 ( M+ H+, 35%) e 424 (M+-tiopirimidina, 100%).

Espectro de infravermelho (CHCI3): 1734 cm'1.

Espectro de NMR do protão *11 (CD2C12), β isómero (superior) δ = 8,53 (2H, d, J=4,7 Hz), 7,02 (1H, t, J=4,7 Hz), 5,65 (1H, d, J=9,6 Hz), 4,98 (1H, dd; J=9,6 Hz, 9,6 Hz), 3,71 (1H, m), 2,85 (1H, m), 2,28 (6H, s), 2,22 (2H, m), 1,84 (1H, m), 1,63 (1H, m), 1,53 (1H, m), 1,45 (1H, ddd, J=9,6 Hz, 9,6 Hz, 9,4 Hz), 1,25 (28H, s larga), 1,20 (3H, d, 6,8 Hz) e 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz).

Espectro de NMR do 13C ( CD2C12): δ = 172,9, 170,1,157,7,117,6, 83,7, 74,1, 68,5, 65,3, 40,8, 34,8, 32,3, 31,4, 30,1, 30,0, 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,3, 29,2, 25,3, 23,1, 21,5 e 14,3. -54-

PREPARAÇÃO 13 l-f2-Tiopirimidina)-3.4.6-tridesoxi-2-0-metano- sulfonil-3-fdimetilamino )-D- xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 0,27 g (1,0 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 7 em 10 mL de diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. A mistura reaccional foi tratada com 0,41 g (3,2 mmoles) de di-isopropiletilamina seguido por 0,29 g (1,7 mmoles) de anidrido metanosulfónico. A mistura reaccional foi agitada durante três horas e depois arrefecida pela adição de 10 mL de bicarbonato de sódio aquoso a 5%. A fase orgânica foi separada, seca sobre MgSCU, filtrada e evaporada a vácuo para dar um resíduo oleoso impuro. O resíduo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 1 : 1 de acetato de etilo : hexanos) para se obter 0,06 g (20 % de rendimento) do composto indicado em título puro; sob a forma de um sólido ceroso branco.

Espectro de NMR do protão 'H (CD2CI2), β isómero (superior) δ = 8,54 (2H, d, J=4,8 Hz), 7,05 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,18 (1H, d, J=9,6 Hz), 4,62 (1H, d larga), 3,73 (1H, m), 3,16 (3H, s), 2,93 (1H, larga), 2,35 (6H, s larga), 1,94 (1H, s larga), 1,47 (1H, ddd, J=9,6 Hz, 9,6 Hz, 9,6 Hz) e ,1,25 (3H, d, J=6,8 Hz). PREPARAÇÃO 14 1 -(2-Tiopirimidina)-3,4.6-tridesoxi-2-0-(2.2-dimetilpropanoíl)-3-(di-metilamino)-D-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 3,50 g (12,99 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 7 em 125 mL de diclorometano e tratada com 12,70 g (104,00 mmoles) de 4-N,N-dimetilaminopiridina à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. A mistura reaccional foi tratada com várias porções pequenas de cloreto de 2,2-dimetilpropanoílo (totalizando 6,27 g, 51,98 mmoles). A mistura reaccional foi agitada durante dezasseis horas e depois foi concentrada a vácuo para dar origem a um sólido. O sólido foi fínamente triturado, suspenso em 100 mL de acetato de etilo durante trinta minutos e filtrado. O filtrado foi evaporado a vácuo originando um sólido. A suspensão/filtração e processo de evaporação foi repetido duas vezes, dando finalmente um óleo amarelo. O óleo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 30: 65: 5 de acetato de etilo : hexanos : trietilamina) para se obter 1,62 g (35 % de rendimento) do composto indicado em título puro; sob a forma de um óleo amarelo que solidificou deixando-o em repouso.

Espectro de NMR do protão 'fl (CD2CI2), β isómero (superior) δ = 8,53 (2H, d, J=4,8 Hz), 7,02 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,67 (1H, d, J=9,8 Hz), 4,95 (1H, dd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz), 3,72 (1H, m), 2,84 (1H, m), 2,25 (6H, s), 1,85 (1H, m), 1,45 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 9,6 Hz), 1,24 (3H, d, J=6,7 Hz) e 1,08 (9H, s); α-isómero (menor), δ = 8,51 (2H, d, J=4,8 Hz), 7,00 (1H, t, J=4,8 Hz), 6,64 (1H, d, J=3,8 Hz), 5,14 (1H, dd, J=9,7 Hz, 3,8 Hz), 4,11 (1H, m), 2,93 (1H, m), 2,29 (6H, s), 1,76 (1H, m), 1,45 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 9,8 Hz), 1,17 (3H, d, J=6,8 Hz) e 1,08 (9H, s). PREPARAÇÃO 15 l-(2-TiopirimidinaV3.4.6-tridesoxi-2-0-metil-3-(dimethvlamino VD-xilo-hexo- D-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 1,61 g (5,98 mmoles) do composto indicado em -56- título na Preparação 7 cm 90 mL dc dicloromctano à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon e foi tratado com 0,28 g (7,17 mmoles) de hidreto de sódio (60% dispersão de óleo). A mistura reaccional foi agitada durante 45 minutos e depois foi tratada com 0,83 g (6,57 mmoles) de sulfato de dimetilo. Após trinta minutos a mistura reaccional foi arrefecida pela adição cuidadosa de 3 mL de água. A mistura reaccional foi concentrada a vácuo e o resíduo foi repartido entre acetato de etilo e água. A camada orgânica foi separada e seca sobre MgSCL, filtrada e evaporada a vácuo para dar um óleo amarelo. O óleo foi submetido a cromatografía rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 60 : 35: 5 de acetato de etilo : hexanos : trietilamina) para se obter 0,70 g (31 % de rendimento) do composto indicado em título puro; sob a forma de um óleo claro.

Espectro de Massa ( LSIMS ) m/z = 284 ( M + H+, 100%).

Espectro de NMR do protão ]H (CDCI3), β isómero (superior) δ = 8,51 (2H, d, J=4,8 Hz), 6,97 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,55 (1H, d, J=9,8 Hz), 3,70 (1H, m), 3,58 (3H, s), 3,23 (1H, dd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz), 2,82 (1H, m), 2,40 (6H, s), 1,80 (1H, m), 1,40 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 9,6 Hz) e 1,24 (3H, d, J=6,9 Hz).

Espectro de NMR do I3C ( CD2C12): δ = 170,8, 157,4, 117,0, 84,8, 78,2, 73,4, 66,3, 60,1,41,0, 31,7 e 21,5. PREPARAÇÃO 16 l-í2-Tiopirimidina)-3.4.6-tridesoxi- 2-0-f aliloxicarbonil)-3-fdi-metilamino )-D-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 0,27 g (1,00 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 7 em 15 mL de diclorometano e foi tratado com 0,98 g (7,99 mmoles) de 4-dimetilaminopiridina à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. Foi depois adicionado à mistura reaccional 0,48 g (3,99 mmoles) de cloroformato de alilo, que foi agitado durante 3 horas. A mistura reaccional foi agitada durante 45 minutos e depois foi tratada com 0,83 g (6,57 mmoles) de sulfato de dimetilo. A mistura reaccional foi evaporada a vácuo para dar origem a um resíduo amarelo que foitriturado com acetato de etilo. A evaporação do filtrado originou um sólido oleoso que foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 30 : 65: 5 de acetato de etilo : hexanos : trietilamina) para se obter 0,25 g (72 % de rendimento) do composto indicado em título puro; sob a forma de um óleo incolor,

Espectro de NMR do protão *H (CDC13), β isómero (superior) δ = 8,53 (2H, d, J=4,7 Hz), 6,99 (1H, t, J=4,7 Hz), 5,87 (1H, ddt, J=15,2 Hz, 10,5 Hz, 4,7 Hz), 5,70 (1H, d, J=9,8 Hz), 5,82 (1H, d larga, J=15,2 Hz), 5,21 (1H, d larga, J=10,5 Hz), 4,86 (1H, dd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz), 4,63 (2H, d larga, J=4,7 Hz). 3,77 (1H, m), 2,93 (1H, m), 2,33 (3H, s), 1,86 (1H, m), 1,49 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, ,9,5 Hz) e 1,27 (3H, d, J=7,0 Hz).

Espectro de NMR do 13C ( CDC13): δ = 170,3, 157,4, 154,2, 131,5, 118,4,117,2, 83,1, 73,8, 72,5, 68,6, 64,9, 40,7, 31,3 e 21,4. PREPARAÇÃO 17 l-í2-TiopirimidinaV3.4.6-tridesoxi-2-0-aliI-3-fdimetilamino VD-xilo-hexopiranósido

Foram combinadas 20 mg (0,03 mmoles) e 15 mg (0,03 mmoles) de quantidades catalíticas de bis(dibenzilidenoacetona)paládio e 1,4-bis(difenil-fosfino)butano em 3 mL de tetra-hidrofurano à temperatura ambiente sob árgon. -58-

Foi dissolvido 245 mg (0,69 mmoles) do composto indicado cm título na Preparação 7 em 5 mL de tetra-hidrofurano e foi adicionado à mistura reaccional. A solução foi aquecida até 50°C durante trinta minutos. A mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente e depois foi evaporada a vácuo para dar origem a um resíduo amarelo. O resíduo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 50 : 45: 5 de acetato de etilo : hexanos : trietilamina) para se obter o composto indicado em título, sob a forma de um óleo incolor.

Espectro de NMR do protão *H (CDC13), β isómero (superior) δ = 8,55 (2H, d, J=4,9 Hz), 7,00 (1H, t, J=4,9 Hz), 6,81 (1H, d, J=5,l Hz), 5,91 (1H, m), 5,28 (1H, d larga, J=17,2 Hz), 5,16 (1H, d larga, J=10,2 Hz), 4,18 (2H, m), 4,02 (1H, d larga, J=ll,2 Hz, 6,6 Hz), 3,85 (1 H, dd, J=10,6 Hz, 5,1 Hz), 2,92 (1H, m), 2,43 (6H, s), 1,86 (1H, m), 1,40 (1H, ddd, J=10,2,10,2, 10,0 Hz) e 1,18 (3H, d, J=6,l Hz). PREPARAÇÃO 18 1 -(2-Tiopirimidina) 3.4.6-tridesoxi-2-0-(t-butildimeti1silil)-3-(di-metilamino )-D- xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 1,50 mg (18,56 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 7 em 50 mL de diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob árgon e tratada com 1,58 g (12,25 mmoles) de di-isopropiletilamina. A mistura reaccional foi lavada com 2 x 75 mL de bicarbonato de sódio aquoso a 5 % e a fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e evaporada a vácuo para dar origem a 2,05 g (96% de rendimento) do composto indicado em título puro sob a forma de um sólido acastanhado. -59- f"1 : '

Espectro de NMR do protão Ή (CDC13), β isómero (superior) δ = 8,50 (2H, d, J=4,7 Hz), 6,94 (1H, t, J=4,7 Hz), 5,53 (1H, d, J=9,8 Hz), 3,69 (1H, m), 3,50 (1H, dd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz), 2,61 (1H, m), 2,24 (6H, m), 1,79 (1H, m), 1,36 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 9,6 Hz), 1,23 (3H, d, J=6,3 Hz), 0,78 (9H, s), 0,08 (3H, s) e 0,04 (3H, s). PREPARAÇÕES 19 E 20

Usando substancialmente o mesmo processo que o referido na Preparação 18, mas substituindo o trifluorometanosulfonato de t-butildimetilsililo pelo agente de acilação apropriado, foram preparados os seguintes compostos: 19. l-(2-Tiopirimidina)-3.4.6-tridesoxi-2-0-trietilsilil-3-(dimetilaminoVD-xilo-hexopiranósido

Espectro de NMR do protão 'H (CDC13), β isómero (superior) 5 = 8,47 (2H, d, J=4,8 Hz), 6,93 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,51 (1H, d, J=9,6 Hz), 3,67 (1H, m), 3,50 (1H, dd, J=9,6 Hz, 9,6 Hz), 2,26 (6H, s), 1,80 (1H, m), 1,34 (1H, ddd, J=9,6 Hz, 9,6 Hz, 9,4 Hz), 1,21 (3H, d, J=6,2 Hz), 0,86 (9H, t, J=8,l Hz) e 0,57 (6H, q, J=8,l Hz); α-isómero (inferior), δ = 8,53 (2H, d, J=4,8 Hz), 6,99 (1H, t, J=4,8 Hz), 6,51 (1H, d, J=5,l Hz), 4,22 (1H, m), 4,05 (1H, dd, J=9,8 Hz, 5,1 Hz), 2,73 (1H, m), 2,36 (6H, s), 1,77 (1H, m), 1,34 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 9,8 Hz), 1,15 (3H, d, J=6,2 Hz), 0,91 (9H, t, J=8,l Hz) e 0,59 (6H, q, 8,1 Hz). 20. l-(2-Tiopirimidina)-3.4.6-tridesoxi-2-0-trimetilsiliI-3-(dimetilamino)-D-xilo- hexopiranósido

Espectro de NMR do protão 'H (CDC13), β isómero (superior) δ = 8,51 (2H, d, J=4,8 Hz), 6,94 (1H, t, J=4,8 Hz), 5,53 (1H, d, J=9,9 Hz), 3,71 (1H,

m), 3,52 (1H, dd, J=9,9 Hz, 9,9 Hz), 2,62 (1H, m), 2,28 (6H, s), 1,78 (1H, m), 1,36 (1H, ddd, J=9,9 Hz, 9,9 Hz, 9,7 Hz), 1,25 (3H, d, J=6,9 HZ) e 0,09 (9H, s). PREPARAÇÃO 21

Etil 3.4.6-tridesoxi-2-0-((tiometil)tiocarbonil)-3-(dimetilamino)-D-xilo- hexopiranósido

Foi dissolvido 500 mg (2,46 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 3 (a) em 15 mL de tetra-hidrofurano com agitação à temperatura ambiente sob árgon e foi tratada cuidadosamente com um ligeiro excesso de hidreto de sódio (60% de dispersão de óleo, 128 mg, 3,20 mmoles). Após 45 minutos, a mistura reaccional foi tratada com 375 mg (4,92 mmoles) de disulfureto de carbono. A mistura reaccional foi agitada durante trinta minutos e depois foi adicionado 341 mg (2,71 mmoles) de sulfato de dimetilo. A mistura reaccional foi agitada durante mais duas horas e foi adicionado cuidadosamente 0,5 mL de água. A mistura reaccional foi evaporada a vácuo e o resíduo foi repartido entre 100 mL de acetato de etilo e 50 mL de água. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com duas porções de acetato de etilo ( 2 x 75 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e secas sobre MgSC>4, filtradas e evaporadas a vácuo para dar origem a 716 mg (2,44 mmoles, 99% de rendimento) do composto indicado em título puro sob a forma de um óleo amarelo.

Espectro de NMR do protão 'H (CDC13), α-isómero (superior), õ = 5,69 (1H, dd, J=10,9 Hz, 3,7 Hz), 5,06 (1H, d, J=3,7 Hz), 4,00 (1H, m),3,70 (1H, dq, J=10,0 Hz, 7,0 Hz), 3,47 (1H, dq, J=10,0 Hz, J 7,0 Hz), 3,39 (1H, ddd, J=12,2 Hz, 10,0 Hz, 4,3 Hz), 2,56 (3H, s), 2,31 (6H, s), 1,82 (1H, m), 1,43 (ddd, J=12,2 Hz, 12,2 Hz, 11,9 Hz), 1,26 (3H, d, J=6,2 Hz) e 1,15 (3H, t, J=7 Hz); β isómero 4 A η «Ί -61 - (inferior), δ = 5,74 (1Η, dd, J-10,3 Hz, 7,4 Hz), 4,41 (1H, d, J=7,4 Hz), 3,85 (1H, dq, J=9,7 Hz, 7,1 Hz), 3,57 (1H, m), 3,53 (1H, dq, J=9,7 Hz, 7,1 Hz), 2,94 (1H, ddd, J=12,2 Hz, 10,3 Hz, 4,3 Hz), 2,57 (3H, s), 2,30 (6H, s), 1,78 (1H, m), 1,45 (1H, ddd, J=12,2 Hz, 12,2 Hz, 11,8 Hz), 1,19 (3H, t, J=7,0 Hz) e 1,18 (3H, d, J=6,2 Hz). PREPARAÇÃO 22

Etil 2.3.4.6-tetradesoxi-3-(dirnetilamino)-D-treo-hexopiranósido

Foi adicionado 9,95 g (34,20 mmoles) de hidreto de tri-n-butilestanho a 150 mL de tolueno à temperatura ambiente sob árgon. A solução foi levada a refluxo e foi adicionado lentamente durante uma hora 5,00 g (17,04 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 21 em 100 mL de tolueno. A solução amarela tomou-se incolor. A mistura reaccional foi agitada durante mais uma hora a refluxo e depois foi arrefecida até à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi passada através de uma camada de sílica gel e eluída com tolueno até o material activo UV se ter eluído. A camada de sílica foi depois eluída com uma mistura 90:10 de acetato de etilo: trietilamina para dar 1,42 g de produto impuro sob a forma de um óleo incolor. O óleo foi destilado utilizando um aparelho de Kugelrohr para se obter 1,08 g do composto indicado em título, sob a forma de um óleo incolor; p.eb. = 50 - 65°C (0,25 - 0,35 mm Hg). Espectro de NMR do protão *H (CDC13), α-isómero, δ = 4,92 (1H, d larga, J=2,7 Hz), 4,0-33 (3H, complexo), 2,73 (1H, dddd, J=11,9 Hz, 11,9 Hz, 4,0 Hz, 4,0 Hz), 2,22 (6H, s), 1,88 (1H, m), 1,78 (1 H, m), 1,5-1,0 (8H, complexo); β isómero, δ = 4,36 (1H, dd, J=9,5 Hz, 2,1 Hz), 4,0-3,3 (3H, complexo), 2,42 (1 H, dddd, J=11,9 Hz, 11,9 Hz, 4,0 Hz, 4,0 Hz), 2,23 (6H, s), 1,98 (1H, m), 1,72 (1H, m) e 1,5-1,0 (8H, complexo). -62-

Espectro de NMR do l3C (CDC13): α-isómero, δ = 97,5, 64,2, 62,3, 55,8, 41,3, 36,4, 32,4, 21,7 e 15,2; β isómero, δ = 101,0, 69,4, 64,3, 60,1, 41,4, 35,7, 33,9,21,5 e 15,2. PREPARACAO 23

Hidrocloreto de 2.3.4.6-tetradesoxi-3-rdimetilaminoVD-treo-hexopiranósido

Foi suspenso 1,02 g (5,45 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 22 em 30 mL de uma solução aquosa 2N de ácido clorídrico. A solução turva foi levada a refluxo durante vinte horas, tempo depois do qual a mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente. A solução foi evaporada por mistura azeotrópica com acetonitrilo para se obter um sólido oleoso. O sólido oleoso foi triturado com 10 mL de acetona e filtrado para se obter 841 mg (79% de rendimento do composto indicado em título sob a forma de um sólido branco; p. fusão = 178 - 180°C.

Espectro de massa (LSIMS): m/z = 160 (M + H+, 100%) e 142 ( M + H+ -H20, 84%).

Espectro de NMR do protão *Η (DMSO-d6), a- e β- isómeros, δ = 5,27 (1H, s larga), 4,58 (1H, d larga, J = 9,8 Hz), 3,99 (1H, m), 2,67 (6H, s), 2,65 (6H, s), 2,18-1,91 (4H, complexo), 1,63 (1H, ddd, J=9,8 Hz, 9,8 Hz, 2,5 Hz), 1,46-1,20 (3H, d, J=7 Hz) c 1,10 (3H, d, J-7 Hz).

Espectro de NMR do 13C ( CDC13): a- e β- isómeros, δ = 93,5, 89,9, 67,4, 62,4, 60,2, 57,6, 40,4, 39,8, 33,2, 33,0, 32,4, 31,2, 21,4 e 21,2. PREPARAÇÃO 24 3a(rRV4(SV6(RV7afSV1.6-dimetil-4-etoxi-1.3a,7-hexa-hidro-2H-piranor4,3- dloxazol

Foi adicionado 1,98 g (6,82 mmoles) de hidreto de tri-n-butilestanho a 15 mL de tolueno à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. A solução foi aquecida até 70°C. Foram dissolvidos 0,50 g (1,71 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 21 e 10 mg de 2,2'-azobis (2-metilpropionitrilo em 10 mL de tolueno e foram adicionados à solução de hidreto aquecida através de uma seringa de êmbolo durante duas horas. A mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente depois de estar completa a adição. Quando se atinge a temperatura ambiente, a mistura reaccional foi tratada com 3 mL de amónia aquosa. A solução foi agitada durante 15 minutos e a mistura reaccional foi repartida entre 15 mL de salmoura e 30 mL de acetato de etilo. A fase orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com mais uma quantidade adicional de acetato de etilo (2 x 30 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e secas sobre MgS04, filtradas e submetidas a cromatografia rápida em sílica gel (eluídas com acetato de etilo e depois com uma mistura 95:5 de acetato de etilo : trietilamina) para se obter 75 mg do produto indicado em título contaminado com sais de estanho.

Espectro de NMR do protão 'H (CDCI3), δ = 5,01 (1H, d, J=2,6 Hz), 3,91 (1H, m), 3,87-3,63 (5H, complexo), 3,53 (1H, dq, J=9,7 Hz, 7,0 Hz), 3,11 (1H, m), 2,34 (3H, s), 1,77 (1H, m), 1,30 (1H, obscuro) e 1,14 (6H, complexo).

Espectro de NMR do 13C ( CDC13): δ = 96,6, 74,3, 70,4, 64,0, 62,9, 58,9, 40,6, 32,2,21,1 e 15,1. (7 Λ /7 ;--. , ?/ C. ·*' 1 - 64 - /-^Λ 1>Λ· <- ' PREPARAÇÃO 25

l-f2-TiopirimidinaV3.4.6-tridesoxi-2-0-acetil-3-(metiirmetanosulfonil')aminoV D-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido 160 mg (0,45 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 5 em 10 mL de diclorometano à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. Foi adicionado 232 mg (1,80 mmoles) de di-isopropiletilamina seguido por 112 mg (1,10 mmoles) de anidrido acético e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. A solução foi diluída com 30 mL de diclorometano e lavada com 2 x 15 mL de ácido clorídrico IN e 2 x 15 mL de bicarbonato de sódio aquoso a 5%. A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e evaporada a vácuo para se obter o composto indicado em título puro sob a forma de um óleo.

Espectro de NMR do protão ]H (CDCI3): β- isómero (superior), δ = 8,54 (2H, d, J=4,9 Hz), 7,03 (1H, t, J=4,9 Hz), 5,75 (1H, d, J=10,2 Hz), 5,08 (1H, dd, J=10,2 Hz, 10,2 Hz), 4,42 (1H, ddd, J=10,2 Hz, 10,2 Hz, 4,6 Hz), 4,35-3,80 (complexo), 2,87 (3H, s), 2,74 (3H, s), 2,09 (3H, s), 1,84 (1H, m), 1,62 (1H, ddd, J=10,2 Hz, 10,2 Hz, 10,2 Hz) e 1,30-1,12 (6H, complexo). PREPARAÇÃO 26

Mistura de etil 3.4.6-tridesoxi-3-(etoxicarbonilmetileno)('metil)amino-D-xilo-hexopiranósido e 4a(RV5(SV7('RV8a(S')-l .7-dimetil-5-etoxi-2.4a.8-hexa-hidro-3-oxo-2H-pirano Γ 3 -4-bl Γ1.41 oxazina

Foi dissolvido 0,56 mg (2,96 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 3(b) em 25 mL de diclorometano e foi agitado à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. A mistura reaccional foi tratada com 0,38 -65-

¢--1 mg (2,97 mmoles) de di-isopropiletilaxnina seguido por 0,49 g (2,96 mmolcs) dc bromoacetato de etilo. A mistura reaccional foi agitada durante 17 horas e o solvente foi evaporado a vácuo e o resíduo submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com acetato de etilo) para se obter 0,64 g de uma mistura dos compostos indicados em título, sob a forma de um óleo límpido.

Espectro de Massa (impacto electrónico): m/z = 275 (M+(Ci3H25N05), 10%), 229 (M+(CnH19N04), 27%) e 202 (C,3H25N05-C02CH2CH3,100%).

Espectro de NMR do protão lE (CDC13): δ = 4,79 (1H, d, J=3,5 Hz), 4,15-2,90 (complexo), 3,58 (1H, d, J=17,3 Hz), 2,95 (1H, d, J=17,3 Hz), 2,55 (1H, m), 2,12 (3H, 5),1,96 (1H, m) e 1,3-1,0 (complexo) (α-isómer de 4a(R)-5(S)-7(R)-8a(S)-l,7-dimetil-5-etoxi-2,4a,8-hexa-hidro-3-oxo-2H-pirano[3,4-b][l ,4]oxazina; δ 4,37 (1H, d, J=9,l Hz), 4,15-2,90 (complexo), 2,15 (3H, s), 1,92 (1H, m) e 1,3-1,0 (complexo) (β-isómero de 4a(R)-5(S)-7(R)-8a(S)-l,7-dimetil-5-etoxi-2,4a,8-hexa-hidro-3-oxo-2H-pirano [3,4-b][l,4]oxazina δ = 4,84 (1H, d, J=3,7 Hz), 4,15-2,90 (complexo), 2,38 (3H, s), 1,75 (1H, m) e 1,3-1,0 (complexo) (a-isómero de etil 3,4,6-tridesoxi-3-etoxicarbonilmetileno)(me-til)amino-D-xilo-hexopiranósido; δ = 4,17 (1H, d, J=9,0 Hz), 4,15-2,90 (complexo), 2,32 (3H, s), 1,69 (1H, m) e 1,30-1,0 (complexo) β-isómero de etil 3,4,6-tridesoxi-3-(etoxicarbonilmetileno)(metil)amino-D-xilo-hexopiranósido. PREPARAÇÃO 27 3a(R)-4(SV6(RV7a(SN)-l,6-dimetil-4-etoxi-1.3a.7-hexa-hidro-2H-piranol4.3- dloxazol

Foi dissolvido 240 mg da mistura obtida da Preparação 26 em 6 mL -66-

de 1,2-dicloroetano à temperatura ambiente sub uma atmosfera de árgon c foi tratado comi mL de di-isopropiletilamina. A solução reaccional foi levada a refluxo durante oito horas, arrefecida até à temperatura ambiente e diluída com 50 mL de diclorometano. A solução orgânica foi lavada com 3 x 25 mL de bicarbonato de sódio aquoso a 5 %, seca sobre MgS04, filtrada e evaporada a vácuo para se obter o composto indicado em título, sob a forma de um óleo castanho claro, puro.

Espectro de Massa (impacto electrónico): m/z = 229 (M+, 18%) e 184 (M+ -OEt, 42%).

Espectro de NMR do protão ’H (CDC13): α-isómero (superior) δ = 4,89 (1H, d, J=3,3 Hz), 4,21 (1H, dd, J=9,3 Hz, 3,3 Hz), 4,03 (1H, m), 3,85-3,45 (complexo), 3,73 (1H, d, J=17,l Hz), 3,08 (1H, d, J=17,l Hz), 2,74 (1H, m), 2,25 (3H, s), 2,05 (1H, m), 1,30 (1H, m), 1,25 (3H, d, J=6,9 Hz) e 1,22 (3H, t, J=7,2 Hz).

Espectro de NMR do l3C ( CDC13): δ = 156,2, 95,8, 79,6, 64,2, 63,9, 57,3, 54,9, 39,7, 35,6, 20,8 e 15,1. PREPARAÇÃO 28

Benzil 3.4.6-tridesoxi-2-0-metil-3-(dimetilamino)-D-xilo-hexopiranósido

Foi dissolvido em 300 mL de tetra-hidrofurano 10,01 g (38,06 mmoles) de 3,4,6-tridesoxi-3-(dimetilamino)-D-xilo-hexopiranósido de benzilo (Korte, F., A. Bilow e R. Heinz, Tetrahedron, 1962, 18, 657, 666, com agitação à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon. A solução foi tratada com pequenas porções de 1,83 g (45,68 mmoles) de hidreto de sódio (60% de -67-

Ají * /<ÍK ν' dispersão de óleo). Depois de uma hora, foi adicionado 5,28 g (41,87 mmolcs) dc sulfato de dimetilo e a mistura reaccional foi agitada durante duas horas. A mistura reaccional foi arrefecida pela adição cuidadosa de água e a solução foi evaporada a vácuo deixando um resíduo oleoso que foi suspenso novamente em acetato de etilo e água. A camada orgânica foi separada, seca sobre MgS04 e filtrada para se obter 9,74 g (93%) do composto indicado em título, sob a forma de um óleo ligeiramente amarelo que solidificou ao ficar em repouso

Espectro de NMR do protão !H (CDC13): α-isómero (superior) δ = 7,47-7,20 (5H, complexo), 5,03 (1H, d, J=3,7 Hz), 4,75 (1H, d, J=14,2 Hz), 4,59 (1H, d, J—14,2 Hz), 3,91 (1H, m), 3,30 (3H, s), 3,25 (1H, dd, J=10,3 Hz, 3,7 Hz), 3,07 (1H, m), 2,32 (6H, s), 1,73 (1H, m), 1,25 (1H, m) e 1,14 (3H, d, J==7,0 Hz). PREPARAÇÃO 29 3.4.6-Tridesoxi-2-0-metil-3-(di-metilamino )-D-xilo-hexopiranose

Foi dissolvido 0,50 g (1,87 mmol) do composto indicado em título da Preparação 28 numa solução de 30 mL de etanol e 0,5 mL de ácido clorídrico concentrado. Foi adicionado 100 mg de hidróxido de paládio sobre carbono à mistura reaccional que foi colocada num aparelho de hidrogenação de Parr e carregado com hidrogénio à pressão de 38 PSI. A mistura reaccional foi agitada durante 12 horas à temperatura ambiente e pressão de H2 de 38 PSI e depois foi vertida através de Celite* A camada de Celite* foi lavada abundantemente com etanol. O filtrado foi evaporado o óleo foi submetido a cromatografia rápida em sílica gel (eluído com uma mistura 85: 10: 5 de acetato de etilo:hexanos:trietil-amina) para se obter 310 mg do composto indicado em título sob a forma de um óleo límpido. -68-

Espectro de NMR do protão 1II (CD2CI2): α-isómero, δ — 5,26 (III, d, J=3,2 Hz), 4,01 (1H, m), 3,31 (3H, s), 3,13 (1H, dd, J=10,l Hz, 3,2 Hz), 2,94 (1H, m), 2,22 (6H, s), 1,67 (1H, m), 1,15 (1H, m) e 1,02 (3H, d, J=6,2 Hz); β-isómero, Ô = 4,42 (1 H, d, J=7,2 Hz), 3,48 (3H, s), 3,38 (1H, m), 2,85 (1H, dd, J=9,8 Hz, 7,2 Hz), 2,52 (1H, m), 2,22 (6H, s), 1,61 (1H, m), 1,13 (1H, m) e 1,85 (3H, d, J=6,l Hz).

Espectro de NMR do 13C (CDC13): a- e β-isómeros, 8 = 98,5, 89,9, 80,9, 78,9, 68,6, 63,8, 63,5, 59,5, 58,1, 56,4,40,9,40,6, 32,9,32,2 e 21,1. PREPARAÇÃO 30 3aíR.'l-4íS)-6ÍRs)-7afS')-1.6-dimetil-4-etoxi-1.3a.7-hexa-hidro-2-oxo-2H- piranoí4.3-d1oxazol

Foi dissolvido 0,63 g (3,31 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 3(b) em 40 mL de diclorometano com agitação à temperatura ambiente sob uma atmosfera de árgon e foi tratado com 0,90 g (5,49 mmoles) de l,l’-carbonildi-imidazole. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas e depois foi aquecida a refluxo durante quatro horas. A mistura reaccional foi arrefecida e evaporada a vácuo para dar origem a um óleo amarelo. O óleo foi submetido a cromatografía rápida em sílica gel (eluído com acetato de etilo) para se obter 0,51 g (72%) do composto indicado em título, sob a forma de um óleo límpido.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 216 (M+, H+ , 100%).

Espectro de NMR do protão !H (CDCI3): α-isómero (superior) 8 = 4,95 (1H, d, J=2,7 Hz), 3,79 (1H, m), 3,78-3,36 (4H, complexo), 2,59 (3H, s),

1 *Λ -69- I, 91 (1Η, ddd, J=ll,9 Hz, 2;9 Hz, 2,7 Hz), 1,31 (1H, ddd, J=11,9 Hz, 11,6 Hz, II, 6 Hz), 1,07 (3H, d, J=6,3 Hz) an.d 1,06 (3H, t, J=7,l Hz).

Espectro de NMR do l3C ( CDC13): δ = 159,3, 95,0, 78,2, 65,4, 63,7, 55,5, 37,3, 29,6, 20,6 e 15,0. PREPARAÇÃO 31 17-Etil-1.14-di-hidroxi-12-r2’-f4"-t-butildimetilsililoxiV3"-ímetoxiciclo-hexil')-1 l-metilvinin-23.25-dimetoxi-13.19.21.27-tetrametil-11.28-dioxa-4-azatrícicloí22.3.1.04’9loctacos-18-eno-2.3.10,16-tetraona

Foram dissolvidos 5,0 g (6,31 mmoles) do composto indicado em título na Preparação 1 e 1,78 g (13,86 mmoles) de di-isopropiletilamina em 50 mL de diclorometano com agitação à temperatura ambiente e sob uma atmosfera de árgon. A solução foi arrefecida até -72°C (gelo seco/acetona) e foi adicionado lentamente 1 equivalente de t-butildimetilsililtrifluorometano-sulfonato. A solução fria foi arrefecida após trinta minutos com 2 mL de bicarbonato de sódio saturado e foi aquecida até à temperatura ambiente. A camada orgânica foi lavada com 2 x 30 mL de bicarbonato de sódio saturado e depois com 2 x 30 mL de salmoura. A solução orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e evaporada a vácuo para se obter um vidro límpido. A cromatografia rápida em sílica gel (eluída com uma mistura 1:9 de acetato de etilo:diclorometano) deu origem a 3,7 g (65% de rendimento) do composto puro indicado em título.

Espectro de Massa (LSIMS): m/z = 1038 (M + Cs+ , 4%, 928 (M + Na+, 6%) e 888 (M - H20 + H+, 27%).

Espectro de NMR do protão 'Η (CD2C12): δ = 3,37 (6H, s), 3,28 -70- (3Η, s), 1,64 (3H, s larga), 1,60 (3H, s larga), 0,89 (9H, s), 0,08 (3H, s) e 0,06 (3H, s). PREPARAÇÃO 32

Usando substancialmente o mesmo processo que o referido na Preparação 5, mas substituindo 1 equivalente de desoxi-4-(dimetilamino)-D-cladinose (preparado como revelado em Sciavolino, Patente dos Estados Unidos da América N° 4 150 220 pelo composto indicado em título na Preparação 4, e utilizando 20 equivalentes de 2-mercaptopirimidina e 13 equivalentes de tri-n-butilfosfína, foi preparado o composto indicado em título nesta preparação, com o rendimento de 25%.

Lisboa, 7 de Novembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial PUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

4?Λ REIVINDICAÇÕES 1. Um compostos da fórmula

0) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; em que n é 2; A e B são considerados juntamente e formam =0; R1 é RVRS R4 é H ou alquilo(Ci a Cô)

{ •Ί -2- R5 é H ou alquilo(Ci a Cô) R6 é -OH, -OCO, R13, -OR14; R7 é H; R8 é alquilo(C] a C4); R13 é alquilo(Ci a C22), alquenilo(C2 a C22), cicloalquilo(C3 a C8), benzilo, benzilo substituído variadamente com um a cinco átomos de halogénio, grupos -OH ou grupos alcoxi(Ci a C4), tienilo, furanilo, fenilo ou fenilo substituído variadamente com um a cinco átomos de halogénio, grupos -OH ou grupos alcoxi(C! a C4); e R14 é alquilo(Ci a C3), alquenilo(C3 a Cê) ou benzilo.
2. O composto de acordo com a reivindicação 1, em que Rl é NMe2

3. O composto de acordo com a reivindicação 1, em que R1 é NMe2

-3- ν*Γ l/st, ν ·ί~{ f *Ά /<^· *i
4. O composto de acordo com a reivindicação 1, em que R1 é
5. Um compostos da fórmula

0) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; em que n é 2; A é Η; B é H R1 é:

R4 é H ou alquilo(Ci a Cg) R5 é H ou alquilo(Ci a C6) R6 é -OH; R7 é H; R8 é alquilo(Ci a C4); R13 é alquilo(Ci a C22), alquemlo(C2 a C22), cicloalquilo(C3 a Cg), benzilo, benzilo substituído variadamente com um a cinco átomos de halogénio, grupos -OH ou grupos alcoxi(C) a C4), tienilo, furanilo, fenilo ou fenilo substituído variadamente com um a cinco átomos de halogénio, grupos -OH ou grupos alcoxi(Ci a C4); e R14 é alquilo(Cj a C3), alquenilo(C3 a C6) ou benzilo.
6. O composto de acordo com a reivindicação 5 em que R1 é ΝΠθρ HO f \A CK^VIe 7. -5-

O composto de acordo com a reivindicação 5, em que R1 é ΝΠβ2 HO
8. Um composto seleccionado a partir de:
17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2,-(4"-(3'",4'",6",-tridesoxi-2'"-0-acetil-3'"-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-l 8-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3'",4,",6"'-tridesoxi-2,"-0-benzoíl-3'"-(dimetilamino)-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-l'-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-l 8-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3 m,4m,6m-tridesoxi-2m-0-docosanoiI-3 (dimetilamino)-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,2 8-dioxa-4-azatricicIo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3m,4m,6"'-tridesoxi-2m-0-(2,2-dimetilpropanoí l)-3'"-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3 "-meto xi ciclo-hexil)-1 '-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; -6- /<r’t r 1'ζ i n
17-Etil-l,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3"',4m,6m-tridesoxi-2m-0-octadecanoíl)-3"'-(dimetilamino)-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]- 23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,y]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Etil-l,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3'",4'",6",-tridesoxi-2",-0-(t-butildimetilsilil)-3"'-(dimetilamino)-a-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi-l 3,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Etil-1,14-di-hidroxi-12- [2,-(4,’-(3",,4m,6m-tridesoxi-2m-0-metil-3",-(dimetilamino)-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-l'-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,18-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Etil-l,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3"',4",,6"'-tridesoxi-2m-0-trietilsilil)-3,"- (dimetilamino)-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-l 1,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Alil-1,14-di-hidroxi-12- [2'-(4"-(3,",4’",6",-tridesoxi-2,"-0-acetil)-3m-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]- 23.25- dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1,04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Etil-l-hidroxi-14-(3"',4"',6"'-tridesoxi-2"'-0-acetil-3'"-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosiloxi)-12- [2'-(4"-(t-butildimetilsililoxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-1 metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,28-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona; -7- $ '< ·'
17-Etil-l,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3",,4"',6",-tridesoxi-3'"-(dimetilamino)-octadecanoíl)-3m-P-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-l'-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-l 1,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04’9] octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona;
17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2,-(4"-(3,",4m,6,,,-tridesoxi-3m-(dimetilamino)-p-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-meloxii;ii;lo-hexil)-l,-iiiclilviml]-23,25-dimetoxi- 13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno- 2,3,10,16-tetraona; 17-Etil-l,14-di-hidroxi-[2,-(4"-(3"',4"',6",-tridesoxi-2,"-(trietilsiIil)-3"'-(dimetilammo)-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-3,10,16-tetraona; 17-Etil-l,14-di-hidroxi-[2,-(4"-(3'",4",,6",-tridesoxi-3"'-(dimetilamino)-a -D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi- 13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno- 3,10,16-tetraona; 17-Etil-1,14-di-hidroxi-12-[2'-(4"-(3"',4"',6,"-tridesoxi-2"'-3"'-(dimetilamino)-a-D-xilo-hexopiranosiloxi)-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi- 13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno- 2,3,10,16-tetraona; e -8- 17-Elil-1,14-di-liidioxi-12-[2'-(4"-(4,"-desoxi-4"'-(dmietilamino)-P-D-cladinosiloxi-3"-metoxiciclo-hexil)-r-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.04,9]octacos-18-eno-2,3,10,16-tetraona. 9. O uso de um composto ou sal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 na manufactura de um medicamento para o tratamento de resistência a transplante num mamífero. 10. O uso de um composto ou sal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 na manufactura de um medicamento para o tratamento de doença autoimune num mamífero. 11. O uso de um composto ou sal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 na manufactura de um medicamento para o tratamento de doença antifiingica num mamífero. 12. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto ou sal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um seu veículo farmaceuticamente aceitável. 13. Um composto ou sal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso em medicina. Lisboa, 7 de Novembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficia! da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14