DE69310721T2

DE69310721T2 - Zuckerderivate von makroliden

Info

Publication number: DE69310721T2
Application number: DE69310721T
Authority: DE
Inventors: Kevin Koch
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1992-03-02
Filing date: 1993-01-28
Publication date: 1997-09-04
Anticipated expiration: 2013-01-29
Also published as: ES2102642T3; FI944017A; AU3586293A; CA2131372C; GR3024048T3; FI107535B; CA2131372A1; MX9301060A; DK0629209T3; EP0629209B1; ATE153027T1; JPH07500352A; JP2563080B2; US5747465A; WO1993018050A1; EP0629209A1; IL104817A0; DE69310721D1; FI944017A0

Description

Die Erfindung betrifft neue chemische Verbindungen, die auf dem Gebiet der Medizinwissenschaft wertvoll sind. Genauer betrifft sie neue chemische Verbindungen, die zur Verabreichung an ein Säugetier, insbesondere einen Menschen, als immunsuppressive Mittel wertvoll sind. Diese neuen immunsuppressiven Mittel können mit den als FK-506 und FK-520 bekannten Makroliden verglichen werden, die genauer in US-Patent Nr. 4,894,366 beschrieben werden. Die neuen Verbindungen der Erfindung sind besonders nützlich, um eine Transplantat- Abstoßung nach einer Haut- oder Orantransplantation zu verhindern oder zu behandeln und um Autoimmunkrankheiten, wie Polyarthritis und Psoriasis, zu verhindern oder zu behandeln. Zusätzlich finden diese Makrolidderivate Anwendung zur Verhütung oder Behandlung von infektiösen Krankheiten, die durch Pilze verursacht werden.
Die Transplantat- oder Organtransplantat-Abstoßung nach einer chirurgischen Transplantation kommt häufig vor, wenn fremde Antigene von dem Immunsystem des Wirts erkannt werden. Das Immunsystem des Wirts setzt dann, in dem Bemühen, sich selbst vor dem fremden Gewebe zu "schützen", ein zelluläres und humorales Arsenal frei. Die Antikörper greifen das fremde Gewebe an, was zu Komplikationen führt, die oft in der Abstoßung des Gewebes enden.
In ähnlicher Weise ist das Auftreten von immunregulatorischen Unregelmäßigkeiten bei Autoimmun- und chronischen entzündlichen Erkrankungen wohlbekannt. Unabhängig von der zugrundeliegenden Ätiologie dieses Zustandes tritt eine Vielzahl von Auto-Antikörpern und selbstreaktiven Lymphozyten auf, was den Zustand verschlechtert.
Behandlungen, die das Immunsystem als Ziel haben, führen oft zu einem vollständigen Abschalten des Systems, was dazu führt, daß die Fähigkeit des Körpers, Infektionen zu bekämpfen, gesenkt wird. Dies kann genauso gefährlich sein, wie der ursprüngliche Zustand, der zu dem Abschalten geführt hat.
Derzeit ist das führende medizinische Mittel zur Verhütung oder Behandlung der Gewebeabstoßung Cyclosporin A, das von der United States Food and Drug Administration 1983 zugelassen wurde. Das Arzneimittel wirkt, indem es das Immunsystem des Körpers daran hemmt, sein Arsenal an natürlich schützenden Mitteln zu mobilisieren, um das fremde Protein des Transplantats zurückzuweisen. Obwohl Cyclosporin wirksam ist bei der Bekämpfung der Transplantat-Abstoßung, leidet es unter dem Nachteil, daß es Nierenversagen, Leberschädigungen und Geschwüre verursachen kann, die in vielen Fällen sehr schwer sein können. Sichere Arzneimittel, die selektiver sind in Bezug auf ihre Fähigkeit, das Immunsystem zu beeinflussen, und die weniger Nebenwirkungen haben, werden derzeit ständig gesucht.
US-Patent Nr. 4,894,366 offenbart unter anderem die Makrolide FK-506 und FK-520 als Immunsuppressiva, was die Behandlung einer "Abwehr gegen eine Transpiantation", von Autoimmunkrankheiten und infektiösen Erkrankungen einschließt. Die Internationale Patentschrift Nr. WO 91/02736 offenbart Derivate von FK-506, FK-520 und verwandte Makrolide. Die Europäische Patentanmeldung 0 428 365 offenbart verschiedene andere Derivate von FK-506, FK-520 und verwandte Makrolide.
Außerdem offenbart EP-A-0 466 365 neue immunsuppressive Makrolide, die mit FK-520 verwandt sind, wohingegen EP-A-0323042 Verfahren offenbart, um neue immunsuppressive Derivate bestimmter in US-PS 4,894,366 (siehe oben) beschriebenen Makrolide zu erhalten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin n 1 oder 2 ist, die gepunktete Linie eine fakultative Bindung darstellt, in dem Fall, wenn R² H ist, A und B getrennt sind und A H ist und B H oder OH ist oder A und B zusammengenommen sind und =O bilden;
R² H, ein (C&sub2;-C&sub5;)-Alkanoyloxyrest oder -OR&sup0; ist;
R³ ein (C&sub1;-C&sub3;)-Alkyl- oder Allylrest ist;
R&sup0; H oder
ist;
R¹ oder
ist, R&sup4; bei jedem Vorkommen unabhängig -CO&sub2;R&sup8;, -CO&sub2;H, -CH&sub2;OH, H, -CH&sub3;, -CONH&sub2;, -CONHR&sup8;, -CONR&sub2;&sup8;, -CH&sub2;OCOR&sup8;, -CH&sub2;OCO&sub2;R&sup8;, -CH&sub2;OCONHR&sup8;, -CH&sub2;OCONR&sub2;&sup8; oder -CH&sub2;OR&sup8; ist,
R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig b ei jedem Vorkommen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxy-, Benzyloxyreste, -OH, -OCOR&sup8;, -OCO&sub2;R&sup8; oder -OSi(R&sup9;)&sub3; sind;
R&sup8; ein (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl-, (C&sub3;-C&sub6;)-Cycloalkyl-, Allyl-, Pyridyl-, Thienyl-, Benzylrest, ein in verschiedener Weise mit 1 bis 5 Halogenatomen, OH-Gruppen oder (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxygruppen substituierter Benzylrest, ein Phenylrest oder ein variabel mit 1 bis 5 Halogenatomen, OH-Gruppen oder (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxygruppen substituierter Phenylrest ist und
R&sup9; unabhängig bei jedem Vorkommen ein (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-, Phenyl- oder Benzylrest ist.
Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Erfindung ist die Gruppe von Verbindungen der Formel (I), worin die gepunktete Linie keine Bindung bedeutet und R² -OH ist.
Eine bevorzugtere Gruppe von Verbindungen der Erfindung innerhalb der bevorzugten Gruppe von Verbindungen sind solche Verbindungen, bei denen n 2 ist, die gepunktete Linie keine Bindung bedeutet, A und B zusammen =O bilden, R² -OH ist, R³ ein Ethylrest ist, R¹
ist, R&sup4; -CH&sub2;OH, -CH&sub3;, -CH&sub2;OCOCH&sub3;, -CH&sub2;OCOCH&sub2;C&sub6;H&sub5; oder -CO&sub2;CH&sub3; ist und R&sup5;, R&sup6; und R&sub7; jeweils unabhängig -OH, -OCOCH&sub3; oder -OCOCH&sub2;C&sub6;H&sub5; sind.
Besonders bevorzugt innerhalb dieser Gruppe sind die Verbindungen, worin R¹ und
ist.
Eine zweite bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Erfindung ist die Gruppe von Verbindungen der Formel (I), worin n 2 ist, A und B getrennt sind und jeweils H bedeuten, die gepunktete Linie keine Bindung bedeutet, R² -OH ist und R³ ein Ethylrest ist.
Die Verbindungen der Formel (I) sind als Immunsuppressiva aktiv. Diese Aktivität macht diese Verbindungen geeignet zur Behandlung und Verhütung der Transplantat-Abstoßung. Weiterhin macht diese Aktivität die Verbindungen geeignet zur Verhütung und Behandlung von Autoimmunkrankheiten, wie Polyarthritis und Psoriasis bei einem Säugetier, insbesondere beim Menschen.
Daher umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung einer Abwehr gegen eine Transplantation bei einem Säugetier, das eine solche Behandlung benötigt, das umfaßt, daß man dem Säugetier eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon verabreicht.
Der Ausdruck "Transplantation", wenn er oben oder im folgenden verwendet wird, bezieht sich darauf, daß in einen Teil eines Individuums ein Gewebe oder Organ, das von einem anderen Teil dieses Individuums oder von einem anderen Individuum entnommen wurde, implantiert wird. Typische Transplantationen schließen Knochenmarks-, Herz-, Nieren-, Sehnen- und Pankreas-Duodenal-Transplantationen ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Der Ausdruck "Transplantat", wenn er oben und im folgenden verwendet wird, bezieht sich auf jedes nicht festgewachsene Gewebe oder Organ, das für Transplantationen verwendet wird. Typische Transplantate schließen Haut, Knochenmark, Fett und Nerven ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Außerdem umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit (z.B. Polyarthritis oder Psioriasis) bei einem Säugetier, das eine solche Behandlung benötigt, das umfaßt, daß man dem Säugetier eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon verabreicht.
Weiterhin umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine eine Transplantationsabwehr behandelnde wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Weiterhin umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit (z.B. Polyarthritis oder Psoriasis) wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Weiterhin haben die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) eine Aktivität gegen Pilze. Daher können diese Verbindungen verwendet werden, um Infektionen bei Säugetieren, die durch Pilze verursacht werden, zu behandeln oder zu verhüten.
Somit umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die durch Pilze verursacht werden, bei einem Säugetier, das eine solche Behandlung benötigt, das umfaßt, daß man dem Säugetier eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon verabreicht.
Zusätzlich umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine zur Behandlung einer Pilzinfektionskrankheit wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

Detaillierte Beschreibung

Die Verbindungen der Formel (I) der vorliegenden Erfindung können leicht hergestellt werden. Am einfachsten wird ein Makrolid der Formel (IV) oder (V) unten
mit einem geeigneten Zucker-Halogenidderivat der Formel
gekuppelt, worin X Halogen, z.B. Brom oder Chlor ist. Das gekuppelte (oder glycosylierte) Makrolid wird dann weiter modifiziert, wie unten beschrieben.
Die Herstellung von Makroliden der Formeln (IV) und (V) ist in der Literatur wohlbekannt. Der allgemein bevorzugte Weg zu diesen Makroliden erfolgt über eine biologische Fermentation von Mikroorganismen, die zur Gattung Streptomyces gehören. Die Verbindungen der Formeln (IV) und (V), worin R³ ein Allylrest ist, werden durch Fermentation von Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 (Ferm BP-927) erhalten. Die Verbindung der Formel (IV), worin R³ ein Ethylrest ist und die Verbindung der Formel (IV), worin R³ ein Methylrest ist, werden durch Fermentation von Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891 erhalten.
Eine lyophilisierte Probe von Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA nach den Vorschriften des Budapester Vertrages am 13. Januar 1992 hinterlegt. Diese neu hinterlegte Kultur erhielt die neue Hinterlegungsnummer ATCC 55276.
Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 (Ferm BP-927) ist derzeit beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Nr. 1-3, Higashi-1-chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaraki Prefecture, Japan) nach den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt. Eine frische Probe der Mikroorganismen wird bei der American Type Culture Collection nach den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt.
Die oben erwähnten Mikroorganismen erzeugen, wenn sie getrennt in wäßrige Nährmedien gegeben werden, die oben erwähnten Verbindungen der Formeln IV und V. Die Fermentation dieser Mikroorganismen zur Erzeugung dieser Makrolide wird im wesentlichen erreicht, wie in US-Patent Nr. 4,894,366 beschrieben. Alle Veränderungen, die an dem offenbarten Verfahren gemacht werden, erfolgen zur Anpassung an eine vorhandene Ausstattung und sind in den Herstellungsbeispielen 1 und 2 unten beschrieben.
Um die Verbindung der Formel (I) herzustellen, worin R&sup0; H ist und R¹ ein Zuckersubstituent der Formel (II) oder (III), wird ein Makrolid der Formel (IV) oder (V) mit einem Zuckerhalogenid der Formel (VI) oder (VII) gekuppelt.
Die Kupplungs- (oder Glycosylierungs-)-Reaktion eines Zuckerhalogenids der Formel (VI) oder (VII) mit einem Makrolid der Formel (IV) oder (V) wird direkt erreicht unter Verwendung der Chemie, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt ist. Die Kupplungsreaktion wird allgemein durchgeführt unter Verwendung der peracetylierten Form des Zuckers. Etwa 2 bis 4 Moläquivalente des geeigneten Zuckerhalogenids der Formel (VI) oder (VII) werden mit dem Makrolid der Formel (IV) oder (V) in einem reaktionsinerten Lösungsmittel vermischt. Reaktionsinerte Lösungsmittel, die für diese Art von Reaktion nützlich sind, schließen chlorierte Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid und Ethylendichlorid; Ether- Lösungsmittel, wie Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethoxyethan; aromatische Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol und Xylol und dipolare aprotische Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, Acetonitril und N-Methylpyrrolidon ein. Bevorzugte Lösungsmittel sind chlorierte Lösungsmittel und ein besonders bevorzugtes Lösungsmittel ist Methylenchlorid. Im allgemeinen ist es wünschenswert, genug Lösungsmittel anzuwenden, daß die Reaktanden in dem Lösungsmittel gelöst sind oder im Lösungsmittel suspendiert sind. Typischerweise wird die Menge an verwendetem Lösungsmittel variiert, um eine 10&supmin;¹ bis 10&supmin;³ molare Lösung des Makrolids zu ergeben, wobei eine 10&supmin;¹ molare Lösung bevorzugt ist. Trockene Bedingungen werden im Verlauf der Reaktion aufrechterhalten durch Verwendung von wasserfreien Lösungsmitteln und durch Zugabe eines Trocknungsmittels zu der Reaktionsmischung. Trocknungsmittel, die typischerweise für diesen Zweck verwendet werden, sind Molekularsiebe, Calciumsulfat und Magnesiumsulfat. Ein bevorzugtes Trocknungsmittel sind 4 Å Molekularsiebe. Das anfängliche Mischen der Reagenzien wird bei einer Temperatur von etwa -78ºC bis etwa 70ºC durchgeführt. Bevorzugt sind Temperaturen im Bereich von etwa -78ºC bis etwa 0ºC. Besonders bevorzugt wegen der leichten Herstellung ist ein Kühlbad, das die Reaktionstemperatur bei -78ºC hält.
Nachdem die oben erwähnten Reaktanten vermischt worden sind und die Temperatur auf -78ºC äquilibriert worden ist, wird die Reaktionsmischung mit einer geeigneten Base, z.B. Quecksilbercarbonat, Silbercarbonat, Quecksilbernitrat oder Silbernitrat versetzt. Die bevorzugte Base für diese Reaktion ist Silbercarbonat. Nach Zugabe dieser Base wird die Reaktionsmischung mit einem Katalysator versetzt. Typische Katalysatoren für diese Reaktion schließen Triflat-, Perchloratund Tetrafluorboratsalze des mit der jeweils verwendeten Base verwandten Kations ein. Der bevorzugte Katalysator ist Silbertriflat.
Nachdem alle Reaktanten und Reagenzien zugegeben worden sind, wird die Reaktionsmischung auf 0ºC erwärmt, 0,5 bis 24 Stunden lang bei 0ºC gerührt und dann langsam auf Raumtemperatur erwärmt. Die Reaktionsmischung wird weitere 0,5 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Im allgemeinen wird die Reaktionsmischung 5 Stunden lang bei 0 ºC gerührt und 3 Stunden lang auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und anschließend bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gerührt. Das Produkt wird dann aus der Reaktionsmischung isoliert unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet vertraut sind. So liefert eine einfache Filtration durch eine Filterhilfe, wie Celite und eine anschließende Verdampfung einen Rückstand, der mit Säulen-Chromatographie gereinigt wird. Der Fachmann erkennt, daß Säulenchromatographie die Verwendung einer Festphasen-Komponente, wie Silicagel, und einer Flüssigphasen-Komponente, die aus einer vorteilhaften Mischung von Lösungsmitteln zur Auftrennung und Reinigung von Verbindungen aus einer Mischung gebildet wird, umfaßt. Die Entfernung der Lösungsmittel nach der Chromatographie liefert das Glycosylmacrolid.
Im allgemeinen findet die Kupplungsreaktion nur an einer der drei Alkoholstellen des Macrolids statt, wobei diese Stelle die alkoholische Funktion an C-4" ist (siehe Formel IV). Diese Selektivität beruht möglicherweise auf der besseren Verfügbarkeit der Hydroxylgruppe an dieser Position in der bevorzugten Konformation des Macrolids. Bei manchen Gelegenheiten werden jedoch mit besonders reaktiven Zuckerhalogeniden geringe Mengen des diglycosylierten Materials (worin R² OR&sup0; ist) gebildet. Dieses Material wird bei der Überwachung des Fortschreitens der Reaktion nachgewiesen, was allgemein mit Dünnschicht-Chromatographie gemäß der Standardpraxis erreicht wird. Das diglycosylierte Material wird isoliert und gereinigt, wie für das monoglycosylierte Material angegeben, mit der bemerkenswerten Ausnahme, daß das diglycosylierte Material das erste Material ist, das bei der Chromatographie isoliert wird, wobei das monoglycosylierte Material in späteren Fraktionen isoliert wird. Die Verwendung von zugegebenen Äquivalenten an Zuckerchlorid oder die Veränderung anderer Parameter, wie Lösungsmittel, Base oder Katalysator kann die Ausbeute an diglycosyliertem Material beeinflussen.
Um die Verbindung der Formel (I), worin R¹ H ist und R&sup0; ein Zuckersubstituent der Formel (II) oder (III) ist, herzustellen, wird ein Macrolid der Formel (IV) oder (V) zuerst mit einer Hydroxyl-Schutzgruppe an Position C-4" geschützt. Hydroxyl-Schutzgruppen, die für diese Zwecke geeignet sind, schließen solche Gruppen, wie Silylether, Carbonsäureester und Kohlensäureester des Alkohols ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Die Schutzgruppen werden an den Alkohol angehängt unter Verwendung wohlbekannter Methoden der organischen Chemie. Sperrige Silylether sind wegen ihrer Selektivität, Leichtigkeit der Bindung und Leichtigkeit der Entfernung bevorzugt. Üblicherweise wird ein Macrolid der Formel (IV) oder (V) in einem reaktionsinerten Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 30ºC gelöst. Reaktionsinerte Lösungsmittel für diese Art von Reaktion schließen dipolare aprotische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Acetonitril und N-Methylpyrrolidon; chlorierte Lösungsmittel, wie Chloroform, Dichlormethan und 1,2-Dichlorethan und Etherlösungsmittel, wie Diethylether, Dioxan und Tetrahydrofuran ein. Das Lösungsmittel der Wahl ist häufig Dimethylformamid. Ein Silylierungsmittel, gewöhnlich ein Silyltrifluormethansulfonat, wie t-Butyldimethylsilyltrifluormethansulfonat oder ein Silylchlorid, wie Dimethyl-t-butylsilylchlorid, Trimethylchlorsilan oder Triphenylchlorsilan, wird zusammen mit einem organischen Amin, wie Triethylamin, Trimethylamin oder Imidazol zugegeben. Üblicherweise ist Imidazol die bevorzugte Base. Die Reaktionsmischung wird etwa eine Stunde lang bis etwa 24 Stunden lang gerührt, typischerweise bei Raumtemperatur, wonach das Produkt aus der Reaktionsbrühe in einer dem Fachmann wohlbekannten Weise isoliert wird.
Das Macrolid, das nun an Position C-4" geschützt ist, kann mit einem Zuckerhalogenid der Formel (VI) oder (VII) wie oben beschrieben, gekuppelt werden. Das Produkt einer solchen Kupplungsreaktion ist ein Derivat einer Verbindung der Formel (I), wobei ein Zuckerderivat über den Sauerstoff an Position C-14 gebunden ist, mit einer geschützten Position C-4". Die Schutzgruppe an Position C-4" kann abgespalten werden, was die freie Hydroxyverbindung liefert, unter Anwendung von Standardmethoden der organischen Chemie, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind. Typischerweise wird, um die bevorzugte Silylether-Schutzgruppe zu entfernen, die an C-4" silylgeschützte Verbindung der Formel (I) in einem reaktionsinerten Lösungsmittel, wie Acetonitril, oder einem Etherlösungsmittel, wie Tetrahydrofuran oder Diethylether, bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis 30ºC gelöst und mit einer Fluoridquelle, wie Fluorwasserstoff oder Tetra-N-butylammoniumfluorid versetzt. Die Reaktion wird etwa eine Stunde lang bis etwa 24 Stunden lang gerührt und das Produkt wird dann isoliert unter Anwendung von Standardmethoden der organischen Chemie, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind.
Um die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) herzustellen, worin A und B getrennt sind und jeweils H sind (im folgenden als C-2-Desoxomacrolid bezeichnet), wird eine Verbindung der Formel (I), worin A und B zusammen =O sind, unter Verwendung von Standardbedingungen zur Reduktion von α-Ketoamiden reduziert. Dieses Reduktionsverfahren reduziert selektiv die Carbonylgruppe benachbart zu dem Amid, ohne andere Carbonylgruppen in dem Molekül zu beeinflussen. Im allgemeinen wird das C-2-Oxomacrolid der Formel (I) in einem reaktionsinerten Lösungsmittel oder einer Mischung von Lösungsmitteln gelöst und Schwefelwasserstoffgas wird 6 bis 24 Stunden lang bei Raumtemperatur durch die Mischung durchgeblasen. Der Einfachheit halber wird das Gas im allgemeinen über Nacht durch die Reaktionsmischung geblasen. Geeignete reaktionsinerte Lösungsmittel für diese Reaktion schließen organische Basen, wie Diethylamin, Triethylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Piperidin, Morpholin und Anilin; dipolare aprotische Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und N-Methylpyrrolidon und alkoholische Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol und Propanol ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Eine Kombination von zwei oder mehr dieser Lösungsmittel wird manchmal verwendet, um eine optimale Ausbeute zu erhalten oder um den Verlauf der Reduktion zu beeinflussen. Das Macrolid, worin A H ist und B OH ist wird z.B. unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel hergestellt. Ein besonders bevorzugtes Lösungsmittelsystem, um das C-2-Desoxymacrolid bereitzustellen, ist Pyridin und N,N-Dimethylformamid in gleichen Mengen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Produkt isoliert unter Verwendung von Standardtechniken der organischen Chemie, wie sie der Fachmann auf diesem Gebiet kennt.
Alternativ kann das Macrolid der Formel (IV) oder (V) vor der Glykosylierung unter Verwendung des vorhergehenden Verfahrens reduziert werden. Nach der Reduktion kann das Macrolid, wie oben angegeben, glycosyliert werden.
Um erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (I) herzustellen, worin die gepunktete Linie eine Bindung bedeutet und R² Wasserstoff ist, wird die Verbindung der Formel (I), worin R² OH ist und die gepunktete Linie keine Bindung bedeutet (im folgenden als β-Hydroxyketon bezeichnet) dehydratisiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 323 042 beschrieben Gewöhnlich wird das β-Hydroxyketon in einem reaktionsinerten Lösungsmittel, das eine katalytische Menge einer organischen Säure enthält, gelöst. Geeignete reaktionsinerte Lösungsmittel sind aromatische Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Xylol und dergleichen, wobei Toluol bevorzugt ist. Die organische Säure wird allgemein ausgewählt aus solchen Säuren wie Toluolsulfonsäure, Kampfersulfonsäure und dergleichen, wobei Toluolsulfonsäure bevorzugt ist. Die Reaktionsmischung wird etwa 5 Minuten bis etwa eine Stunde lang auf etwa 50ºC bis etwa 120ºC erwärmt. Im allgemeinen sind Dampfbad-Temperaturen (etwa 100ºC) bevorzugt und 5 Minuten reichen im allgemeinen für die vollständige Reaktion aus. Das Reaktionsprodukt wird mit Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, isoliert. Die Reaktion wird im allgemeinen mit Verbindungen durchgeführt, die bereits glycosyliert sind.
Um erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (I) herzustellen, worin R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; Hydroxyreste sind und R&sup4; ein Hydroxymethylrest ist, wird eine Verbindung der Formel (I), worin R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; Acetoxyreste sind und R&sup4; ein Acetoxymethylrest ist, deacetyliert, unter Verwendung von Standardbedingungen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, wie unten angegeben. Diese selektive Deacetylierung beeinflußt keine Amide, die vorhanden sind, und kann leicht durchgeführt werden, durch Zugabe einer Alkoxidbase zu einer Lösung des zu deacetylierenden Materials in einem alkoholischen Lösungsmittel bei 0ºC. Allgemein wird eine katalytische Menge, z.B. 0,01 Äquivalente, an Base verwendet. Gewöhnlich ist die Alkoxidbase des jeweiligen alkoholischen Lösungsmittels, das verwendet wird, bevorzugt. Am meisten bevorzugt ist, wegen der leichten Verwendung und der Reaktivität, das System, bei dem Methanol das Lösungsmittel ist und Natriummethoxid die Base ist. Die Isolierung des Produktes wird mit Standardmethoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, erreicht.
Die Zuckerhalogenidderivate der Formeln (VI) und (VII) werden üblicherweise, wenn sie nicht leicht verfügbar sind, aus den leicht verfügbaren Zuckern der Formeln (VIII) und (IX) hergestellt, worin R¹&sup0; H, ein (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl- oder (C&sub2;-C&sub4;)-Alkanoylrest ist, unter Verwendung von Standardmethoden der Halogenierung, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind.
Die Bromierung ist das Verfahren der Wahl; eine Chlorierung kann auch in bestimmten Fällen angewendet werden. Die Bromierung wird bewirkt, indem ein 1-Hydroxy-, Alkoxy- oder Alkanoyloxy-Zuckerderivat der Formeln (VIII) oder (IX) in einem organischen sauren Lösungsmittel, z.B. Essigsäure, gelöst wird. Wenn der Zucker ein 1-Hydroxy- oder 1-Alkoxyzucker ist, werden im allgemeinen 1 bis 10 Äquivalente Essigsäureanhydrid zugegeben. Die bevorzugten Substrate sind 1-Acetoxy-Zuckerderivate. Die Reaktionsmischung wird so gekühlt, daß die Temperatur in einen Bereich von etwa -20ºC bis etwa 0ºC fällt. Die allgemein bevorzugte Temperatur ist etwa 0ºC. Die gekühlte Reaktionsmischung wird mit einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in dem sauren Lösungsmittel versetzt. Im allgemeinen wird ein großer Überschuß, z.B. 10 bis 40 Moläquivalente Bromwasserstoffsäure angewendet. Die Reaktionsmischung wird auf Raumtemperatur erwärmt und gerührt, bis die Reaktion abgeschlossen ist. Im allgemeinen wird der Einfachheit halber die Reaktionsmischung über Nacht rühren gelassen. Die Isolierung des bromierten Produktes wird direkt in an sich dem Fachmann wohlbekannter Weise erreicht. Oft betrifft dies einfach die Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum. Gegebenenfalls wird, um eine vollständigere Entfernung des Lösungsmittels zu erreichen, ein Co-Lösungsmittel, z.B. Toluol, das mit dem Reaktions-Lösungsmittel ein Azeotrop bildet, verwendet. Eine weitere Reinigung wird manchmal durch Verwendung von Säulen-Chromatographie erreicht.
Um Verbindungen der Formeln (VIII) und (IX) herzustellen, worin R&sup4; -CH&sub2;OCOR&sup8; ist, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; -OCOR&sup8; sind und R¹&sup0; -COR&sup8; ist, wird eine Verbindung der Formeln (VIII) oder (IX), worin R&sup4; -CH&sub2;OH ist, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; -OH sind und R¹&sup0; H ist, als Substrat in einer Standard-Acylierungsreaktion verwendet. Typischerweise wird dieses Substrat mit einem geeigneten Acylierungsmittel umgesetzt, wie z.B. mit Essigsäureanhydrid, ohne darauf beschränkt zu sein, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Essigsäure, bei etwa 0 bis etwa 25ºC. Das Produkt wird isoliert unter Verwendung von Standardtechniken der organischen Chemie, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind.
Die Zuckerderivate der Formeln (VIII) und (IX) sind im allgemeinen leicht verfügbar, wobei sie meistens natürlich vorkommende Zucker sind.
Die Zuckerderivate der Formeln (VIII) und (IX), worin R&sup4; -COOH ist, sind leicht erhältlich, da sie natürlich vorkommende Uronsäurederivate der entsprechenden Zucker sind. Die Zuckerderivate der Formeln (VIII) und (IX), worin R&sup4;-CONH&sub2;, -CONHR&sup8;, -CONR&sub2;&sup8; oder -CO&sub2;R&sup8; ist, können, wenn sie nicht leicht verfügbar sind, leicht hergestellt werden unter Anwendung wohlbekannter Methoden der Veresterung oder Amidierung, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
Um die Verbindung der Formel (I) herzustellen, worin R&sup4; -COOH ist, wird ein Zuckerhalogenid der Formel (VI) oder (VII) mit einem Macrolid der Formel (IV) oder (V), wie oben beschrieben, gekuppelt. Nach dem Kuppeln wird die Gruppe -R&sup8; entfernt unter Verwendung von Standard-Verseifungsmethoden der organischen Chemie, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, was eine Verbindung der Formel (I) liefert, worin R&sup4; -COOH ist.
Wenn die Verbindungen der Formel (I) der vorliegenden Erfindung sauer sind, z.B. wenn R&sup4; -CO&sub2;H ist, umfaßt die Erfindung auch pharmazeutisch annehmbare Salze dieser Verbindungen der Formel (I).
Typische pharmazeutisch annehmbare kationische Salze für eine solche Verwendung schließen Alkalimetallsalze (z.B. Natrium und Kalium), Erdalkalimetallsalze (z.B. Magnesium und Calcium), Aluminiumsalze, Ammoniumsalze und Salze mit organischen Aminen, wie Benzathin (N,N'-Dibenzylethylendiamin), Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, Meglumin (N-methylglucamin), Benethamin (N-benzylphenethylamin), Diethylamin, Piperazin, Tromethamin (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol) und Procain ein. Ein besonders bevorzugtes Salz ist das Natriumsalz.
Die pharmazeutisch annehmbaren kationischen Salze der vorliegenden Erfindung können leicht hergestellt werden, indem die sauren Formen mit einer geeigneten Base umgesetzt werden, gewöhnlich mit einem Äquivalent in einem Co-Lösungsmittel. Typische Basen sind Natriumhydroxid, Natriummethoxid, Magnesiumhydroxid, Calciumhydroxid, Benzathin, Cholin, Diethanolamin, Piperazin und Tromethamin. Das Salz wird isoliert, indem es zur Trockene eingeengt wird oder durch Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels. In vielen Fällen werden die Salze bevorzugt hergestellt, indem eine Lösung der Säure mit einer Lösung eines anderen Salzes des Kations (Natrium- oder Kaliumethylhexanoat, Magnesiumoleat) unter Anwendung eines Lösungsmittels (z.B. Ethylacetat) vermischt wird, aus dem das gewünschte kationische Salz ausfällt oder in anderer Weise isoliert werden kann durch Einengen und/oder Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels.
Im Hinblick auf die Makrolide der Formel (I) der Erfindung versteht es sich, daß es konformere oder stereoisomere Formen gibt, z.B. optische und geometrische Isomere aufgrund asymmetrischer Kohlenstoffatome und aufgrund von Doppelbindungen und solche Isomeren liegen auch im Schutzbereich der Erfindung.
Die so hergestellten Verbindungen der Formel (I) sind geeignet zur Behandlung einer Transplantations-Abwehr und von Autoimmun-Erkrankungen, wie Polyarthritis oder Psoriasis. Bei der Behandlung einer Transplantationsabwehr kann eine Verbindung der Formel (I) entweder prophylaktisch oder auf eine nachteilige Reaktion des Menschen auf ein transplantiertes Organ oder Gewebe hin verwendet werden. Wenn die Verbindung der Formel (I) prophylaktisch verwendet wird, wird sie dem Patienten oder dem Gewebe oder Organ, das transplantiert werden soll, vor der Transplantations-Operation verabreicht. Eine prophylaktische Behandlung kann auch die Verabreichung des Arzneimittels nach der Transplantations-Operation, aber bevor irgendwelche Zeichen auf eine Abstoßungsreaktion des Transplantats beobachtet werden, einschließen. Wenn eine Verbindung der Formel (I) als Reaktion auf eine abstoßende Reaktion verabreicht wird, wird sie dem Patienten direkt verabreicht, um die Transplantationsabwehr zu behandeln, nachdem äußere Zeichen der Abwehr festgestellt wurden.
Bei der Verwendung zur Behandlung einer Transplantationsabwehr und von Autoimmunerkrankungen, wie Polyarthritis oder Psoriasis bei einem Säugetier, einschließlich einem Menschen, wird eine Verbindung der Formel (I) zu einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert, die eine die Krankheit behandelnde wirksame Menge enthält. Abhängig von der Wirksamkeit der jeweils verabreichten Verbindung der Formel (I) werden etwa 0,05 mg/kg Körpergewicht pro Tag bis etwa 30mg/kg Körpergewicht pro Tag in einer einzelnen Dosis oder in mehrfachen täglichen Dosen dem zu behandelnden Säugetier verabreicht. Ein bevorzugterer Bereich ist 0,1 mg/kg Körpergewicht pro Tag bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag, obwohl in einzelnen Fällen nach Entscheidung des herbeigezogenen Arztes Dosen außerhalb des breiteren Bereichs erforderlich sein können. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist im allgemeinen oral, aber eine parenterale Verabreichung (z.B. intravenös, intramuskulär, subcutan oder intramedullär) ist in speziellen Fällen bevorzugt, wenn eine orale Verabreichung nicht geeignet ist oder wenn der Patient aus verschiedenen Gründen das Arzneimittel nicht schlucken kann. Eine topische Verabreichung kann auch indiziert sein, wenn der Patient unter einer Hautkrankheit leidet, z.B. Psoriasis, oder wenn das Arzneimittel am besten auf die Oberfläche eines Gewebes oder Organs aufgetragen wird, was von dem herbeigezogenen Arzt bestimmt wird.
Die so hergestellten Verbindungen der Formel (I) sind auch geeignet zur Behandlung von Infektionen, die durch Pilze verursacht werden. Zur Verwendung zur Behandlung von Pilzinfektionen bei einem Säugetier, einschließlich Menschen, wird eine Verbindung der Formel (I) zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert, die eine zur Behandlung der Krankheit wirksame Menge enthält. Abhängig von der Wirksamkeit der jeweiligen verabreichten Verbindung der Formel (I) werden etwa 0,05 mg/kg Körpergewichr pro Tag bis etwa 30 mg/kg Körpergewicht pro Tag in einer einzelnen Dosis oder in mehrfachen täglichen Dosen dem zu behandelnden Säugetier verabreicht. Ein bevorzugterer Bereich ist 0,1 mg/kg Körpergewicht pro Tag bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag, obwohl in speziellen Fällen nach Entscheidung des herbeigezogenen Arztes Dosen außerhalb des breiteren Bereiches erforderlich sein können. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist im allgemeinen oral, aber eine parenterale Verabreichung (z.B. intravenös, intramuskulär, subcutan oder intramedullär) ist in speziellen Fällen bevorzugt, z.B. wenn die orale Verabreichung für das entsprechende Ziel nicht geeignet ist, oder wenn der Patient aus verschiedenen Gründen das Arzneimittel nicht schlucken kann. Eine topische Verabreichung kann auch indiziert sein, wenn das Arzneimittel am besten auf die Oberfläche eines Gewebes oder Organs aufgetragen wird, was von dem herbeigezogenen Arzt bestimmt wird.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden allgemein in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, die mindestens eine der Verbindungen der Formel (I) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthält. Solche Zusammensetzungen werden im allgemeinen in üblicher Weise formuliert unter Verwendung von festen oder flüssigen Trägern oder Verdünnungsmitteln, je nach Art der Verabreichung: für eine orale Verabreichung in Form von Tabletten, Hart- oder Weichgelatinekapseln, Suspensionen, Körnchen, Pulvern und dergleichen; für die parenterale Verabreichung in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen und dergleichen und für die topische Verabreichung in Form von Lösungen, Lotionen, Cremes, Salben und dergleichen.
Der Nutzen der erfindungsgemäßen Verbindungen als medizinische Mittel zur Behandlung einer Transplantationsabwehr und von Autoimmunerkrankungen, wie Polyarthritis oder Psioriasis wird durch die Aktivität dieser Verbindungen in einem unten beschriebenen biologischen Screening gezeigt. Ein derartiges biologisches Screening liefert auch ein Mittel, mit dem die Aktivität der Verbindungen der Formel (I) mit der Aktivität anderer bekannter Verbindungen verglichen werden kann. Die Ergebnisse dieser Vergleiche sind nützlich, um die Dosishöhe bei Säugetieren, einschließlich Menschen, zur Behandlung von Transplantationsabwehr und von Autoimmunkrankheiten, wie Polyarthritis und Psioriasis, zu bestimmen.
Die gemischte Human-Lymphozyten-Reaktion (MLR) wird verwendet, um eine Immunantwort in vitro zu erzeugen, die über eine ³H-Thymidinaufnahme gemessen wird. Für dieses Screening werden einkernige periphere Blutzellen in einer modifizierten Zweiwege-MLR verwendet. Um die Verschiedenartigkeit der HLA- artigen D-Antigene sicherzustellen und dadurch die Stimulierung zu maximieren, wird ein Pool aus gefrorenen Spenderzellen als Stimulator-Population verwendet; frisch isolierte Zellen werden als Empfänger-Population verwendet.
Frisch gezogene einkernige Zellen werden in RPMI-1640-Medium, das mit 0,5 % MEM einer Lösung nicht essentieller Aminosäuren (100x), 1 % L-Glutamin (200 mM), 1 % MEM-Vitaminen (100x), 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten/ml) und 15 % hitzeinaktiviertem Human-AB-Serum (NABI) angereichert ist, suspendiert. Die Zellen werden gezählt und die Konzentration wird auf 5x10&sup5; Zeilen pro ml eingestellt. Die Lösung wird dann in Platten mit 96 Näpfen in einer Menge von 100 µl/Napf überführt. Diese Platten enthalten nun die Empfängerzellen.
Die Stimulatorzellen werden vorbereitet, indem einkernige Zellen, die von verschiedenen Individuen gesammelt wurden, gepoolt werden. Die Zellen werden in 90 % Human-AB-Serum und 10 % DMSO suspendiert, so daß sich eine Zellzahl von 2 x 10&sup7; Zellen pro ml ergibt. Die Zellen werden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Für eine MLR werden die lebensfähigen Zellen auf 5 x 10&sup5; Zellen pro ml verdünnt und 100 µl pro Napf werden auf die Platten, die die Empfängerzellen enthalten, gegeben. Zu jedem Napf, der eine Mischung aus Empfängerzellen und Simulatorzellen enthält, werden 50 µl einer Lösung der Verbindung gegeben. Für jede Dosis werden dreifache Versuche durchgeführt. Die Platten werden bei 37ºC bei einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO&sub2; 5 Tage lang inkubiert. Jedem Napf wird 1 µCi ³H-Thymidin zugegeben und die Inkubation weitere 18 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen werden geerntet unter Verwendung des LKB-Beta-Plate-Systems.
Die Hemmung der stimulierten Kontrolle in % wird erhalten unter Verwendung der folgenden Gleichung:
% Hemmung = [100 -(durchschnittliche cpm Arzneimittel/durchschnittliche cpm stimulierte Kontrolle) x 100]
Die Abkürzung cpm ist definiert als Zählrate pro Minute. RPMI-1640 ist ein Gewebekulturmedium, das von Sigma erhältlich ist.
Die Aktivität in dem MLR-Screening, die oben angegeben ist, deutet auf den Nutzen der aktiven Verbindung zur Behandlung einer Transplantationsabwehr und von Autoimmunkrankheiten, wie Polyarthritis und Psioriasis hin.
Die antimikrobielle Aktivität der Makrolide der vorliegenden Erfindung gegenüber verschiedenen Pilzen wird bestimmt mit einer Reihen-Agar-Verdünnungsmethode in einem Sabouraud-Agar. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) werden nach einer 24stündigen Inkubation bei 30ºC erhalten.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert. Es versteht sich jedoch, daß die Erfindung nicht auf die spezifischen Details dieser Beispiele beschränkt ist. Alle Reaktionen werden unter Inertatmosphäre, z.B. Stickstoff, durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. Die Abkürzungen THF, DMSO, DAST, DMAP und Ac, beziehen sich, wenn sie verwendet werden, auf Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid, Dimethylaminoschwefeltrifluorid, 4-Dimethylaminopyridin bzw. Acetyl. Die Zucker-Halogenide wurden von einem zuverlässigen Lieferanten, wie Sigma oder Aldrich erworben, ebenso wie die Zucker, wenn nicht anders angegeben. Wasserfreie Lösungsmittel wurden verwendet, wobei wasserfrei definiert ist als im wesentlichen frei von Wasser.
Der Ausdruck "reaktionsinertes Lösungsmittel", wie er oben verwendet wird, bezieht sich auf ein Lösungsmittel, das mit den Ausgangsmaterialien, den Reagenzien, Zwischenprodukten oder Produkten nicht in einer solchen Weise eine Wechselwirkung eingeht, die die Ausbeute des gewünschten Produktes negativ beeinflußt.
Ausdrücke oder Acronyme, die in den Herstellungsbeispielen 1 und 2 erscheinen, werden genauer unten beschrieben.
PYEA-Agar wird hergestellt, indem Difco-Maltose (10 g), Difco-Hefeextrakt (4 g), Dextrose (4 g), Difco-Agar (15 g) und frische Kokosmilch (50 ml) in ausreichend deionisiertem Wasser gelöst werden, um 1 l einer Lösung zu liefern und der pH der Lösung wird mit 1 n NaOH auf 7,3 eingestellt.
ATCC 172-Medium wird hergestellt, indem Glucose (10 g), lösliche Stärke (20 g), Hefeextrakt (5 g), NZ-Amin A (Difco, 5 g) und Calciumcarbonat (1 g) in ausreichend deionisiertem Wasser gelöst werden, um 1 l Lösung zu liefern und der pH der Lösung wird mit 1 n KOH auf 7,0 eingestellt.
JDYTT-Medium wird hergestellt, indem Cerelose (10 g), Maisstärke (5 g), Maisquellwasser (5 g), NZ-Amin YTT (5 g), Kobaltchlorid (0,002 g) und Calciumcarbonat (3 g) in ausreichend deionisiertem Wasser gelöst werden, um 1 l Lösung zu liefern und der pH der Lösung wird mit 1 n NaOH auf 7,2 eingestellt.
NZ-Amin A und NA-Amin YTT sind von Difco erhältlich, wie die meisten Inhaltsstoffe der obigen Medien.
Bei dem oben angegebenen MLR-Protokoll ist RPMI-1640 ein Standardmedium für MLR-Untersuchungen; MEM wird definiert als "minimal essentielles Medium" und NABI ist ein Lieferant.

Beispiel 1

17-Ethyl-1,14-dihydroxy-12-[2'-(4"-(2"',3"',4"'-tri-O-acetyl-α-D-fucopyranosyloxy)-3"-methoxycyclohexyl)-1'-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo[22.3.2.O4,9]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon

Zu einer gerührten Aufschlämmung der Titelverbindung von Herstellungsbeispiel 1 (6,41 g, 0,0081 mmol) α-L-Acetochlorfucose (Sigma, 5,0 g, 0,016 mmol) und 4 Å Molekularsieben (zerkleinert, 5,0 g) in Methylenchlorid (wasserfrei, 150 ml) bei -78ºC wurde Silbercarbonat (13,36 g, 0,0324 mmol) und anschließend Silbertriflat (0,83 g, 0,0032 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 8 Stunden lang auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und dann weitere 5 Stunden lang gerührt. Die entstehende lohfarbene Aufschlämmung wurde durch Celite filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde auf Silicagel gereinigt, mit Hexan/Ethylacetat (2/1) eluiert, was das Produkt als Mischung von Anomeren (9,0 g, 52 %) lieferte.

Beispiele 2 bis 11

Mit dem Verfahren von Beispiel 1, wobei 1 Moläquivalent des geeigneten Zuckerchlorids jedes Moläquivalent von α-L-Acetochlorfucose ersetzte, wurden die folgenden Verbindungen hergestellt.

Beispiel 12

Zu einer gerührten Lösung der Titelverbindung von Beispiel 1 (1,0 g, mmol) in Methanol (100 ml) wurde Natriummethoxid (20 mg, mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 0ºC 8 Stunden lang gerührt und dann mit einem Tropfen Essigsaure versetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand auf Silicagel gereinigt, mit THF eluiert, was 610 mg eines Schaums (72 %) lieferte. Massenspektrum (FAB): m/z = 960,6 (Molekülion + Na&spplus;).

Beispiele 13 bis 21

Mit dem Verfahren von Beispiel 12, wobei 1 Moläquivalent der Titelverbindung der Beispiele 2 bis 11, jedes Moläquivalent der Titelverbindung von Beispiel 1 ersetzte, wurden die folgenden Verbindungen hergestellt.

Beispiel 21

17-Ethyl-1,14-dihydroxy-12-[2'-(4"(2"',3"',4"'-tri-O-acetyl-α-D-rhamnopyranosyloxy)-3"-methoxycyclohexyl)-1'-methylvinyl]-23,15-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- azatricyclo[22.3.1.O4,9]-octacos-18-en-3,10,16-trion

Die Titelverbindung von Beispiel 3 (1,0 g) wurde in DMF (15 ml) und Pyridin (15 ml) gelöst und Schwefelwasserstoffgag wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur durch die Reaktionsmischung durchgeblasen Es wurde verhindert, daß überschüssiger Schwefelwasserstoff in die Atmosphäre entwich mit Hilfe einer Chlorox -Falle. Nach 16 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit Toluol (50 ml) verdünnt und mit Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch ein Kissen aus Silicagel geleitet und mit Ethylacetat/Hexan (2/1) eluiert, was die Titelverbindung lieferte. Massenspektrum (FAB) m/z = 1072,7 (Molekülion + Na&spplus;). ¹³C-NMR: δ 215,3, 174,0, 170,3, 170,1, 169,4, 141,1 und 132,6.

Herstellungsbeispiel 1

17-Ethyl-1,14-dihydroxy-12-[2'-(4"-hydroxy-3"-methoxy-cyclohexyl)-1'-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]-octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon

Eine Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus-Kultur ATCC 14891 wurde auf PYEA-Schrägagar (10 g/l Difco-Maltose, 4 g/l Difco-Hefeextrakt, 4 g/l Dextrose, 15 g/l Difco-Agar und 50 ml frische Kokosmilch, die auf 1 l mit deionisiertem Wasser verdünnt wurde und deren pH dann mit 1 n NaOH auf 7,3 eingestellt wurde). Das Präparat wurde 10 bis 12 Tage bei 28ºC inkubiert und die Sporen wurden dann in sterile 1x6 Schüttelröhrchen überführt, die 10 ml ATCC 172-Medium (10 g/l Glucose, 20 g/l lösliche Stärke, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NZ- Amin A und 1 g/l Calciumcarbonat; der pH wurde mit 1 n KOH auf 7,0 eingestellt) enthielten. Die Röhrchen wurden bei 28ºC inkubiert und auf einem Rundschüttler mit etwa 150 bis 200 Cyclen pro Minute geschüttelt. Nach 4 bis 5 Tagen wurde die Brühe auf 40 % mit Glycerin und ATCC 172-Medium verdünnt und dann aseptisch in Kryoröhrchen überführt. Jedes Röhrchen wurde mit ½ ml Brühe beladen. Die Röhrchen wurden bei -80ºC während der Lagerung eingefroren.
Die Röhrchen aus dem ultrakalten Vorrat wurden als Impfinoculum für die Herstellung von Inoculumkolben verwendet, ein Röhrchen pro 50 ml sterilem JDYTT-Medium in 300 ml Schüttelflaschen. Die Zusammensetzung des JDYTT-Mediums war 10 g/l Cerelose, 5 g/l NZ-Amin YTT, 0,002 g/l Kobaltchlorid und 3 g/l Calciumcarbonat. Der pH des JDYTT-Mediums wurde mit 1 n NaOH auf 7,2 eingestellt. Die Schüttelflaschen wurden auf einem Rundschüttler mit etwa 150 bis 200 Cyclen pro Minute und bei 28ºC geschüttelt und inkubiert.
2 ml eines etwa 3 bis 5 Tage alten Schüttelflaschen-Inoculums wurde verwendet, um die Kolben mit dem Inoculum der zweiten Stufe zu beimpfen, die 80 ml JDYTT-Medium in einem 3 l Fermentations-Behälter enthielten. Das Fermentermedium war 45 g/l Maisstärke, 10 g/l Maisquellwasser, 10 g/l frische oder getrocknete Bäckerhefe, 3 g/l Calciumcarbonat und 01005 g/l Kobaltchlorid. Der pH wurde mit 1 n NaOH auf etwa 6,4 bis 6,8 eingestellt. 1 ml Entschäumer P-2000 wurde den Fermentern zusammen mit 100 ml Sojaöl zugegeben. Der pH wurde mit 1 n NaOH auf etwa 6,4 bis 6,8 eingestellt und das Material wurde mit 1700 Upm gerührt. Die Temperatur wurde auf 28ºC gehalten und sterile Luft wurde durch das Medium in einer Rate von 1 Volumen pro Volumen pro Minute eingeblasen.
Nach der Beimpfung wurde steriles Sojaöl verwendet, um das Schäumen zu kontrollieren. Bei längeren Fermentationen und abhängig von den verwendeten Medien kann der Zuckergehalt überwacht werden und Zuckerzugaben nach 40, 60 und 90 Stunden verwendet werden, um den Gehalt an reduzierendem Zucker auf oder über 0,05 % zu halten. Die Fermentation wurde 46 Stunden lang durchgeführt.
Unter Verwendung von Standardmethoden der Dünnschicht-Chromatographie und HPLC wurde die Fermentationsbrühe überwacht und die relative Wirksamkeit berechnet.
Es wurde gefunden, daß das Produkt hauptsächlich im Mycel war, aber eine Aufarbeitung der gesamten Brühe ist bevorzugt. Daher wurde, nachdem die Fermentation ihren Verlauf genommen hatte, die gesamte Brühe zweimal mit ¼ bis ½ ihres Volumens an Methylisobutylketon (MIBK) extrahiert. Die Phasen wurde mit Hilfe eines Delaval-Separators oder Podbielnack-Extraktors getrennt. Die Lösungsmittelphase wurde geklärt und zuerst in einem Vakuumbehälter eingeengt und dann in einem Rotationsverdampfer. Das Konzentrat wurde vier Verteilungen im Gegenstrom in 20 l Ballonen unterzogen unter Verwendung von 10 l Deckschicht und 1 l Bodenschicht eines Heptan/Acetonitril 10/1-Systems pro Ballon. Die aktiven Bodenschichten wurden gesammelt, vereinigt und eingeengt. Das Material wurde weiter gereinigt über eine Filtration durch Florisil (wobei aufeinanderfolgend mit Hexan, Hexan/Methylenchlorid und Methylenchlorid gewaschen wurde, mit einer graduellen Zunahme an Methylenchlorid). Die meiste Aktivität wurde in den Methylenchlorid-Fraktionen gefunden. Diese wurden vereinigt und eingeengt. Eine zweite Filtrationsstufe wurde durchgeführt, dieses Mal durch Silicagel (wobei mit Heptan, Methylenchlorid, Methylenchlorid/Ethylacetat und Ethylacetat gewaschen wurde). Die meiste Aktivität fand sich in den Fraktionen, die eine Methylenchlorid/Ethylacetat-Mischung enthielten und den Fraktionen, die nur Ethylacetat enthielten. Diese wurden vereinigt und eingeengt, wieder in Methylenchlorid aufgelöst und mit DARCO G60 versetzt. Die Probe wurde dann in Teile mit 12 bis 15 g aufgeteilt und jede Probe wurde weiter auf einem Prep 500 Flüssigchromatographen unter Verwendung von Silicagelsäulen chromatographiert, wobei unter Verwendung eines linearen Gradienten, beginnend mit 100 % Methylenchlorid und endend mit 100 % Ethylacetat, eluiert wurde. Die aktiven Abschnitte wurden vereinigt, eingeengt und auf einer Prep 500 chromatographiert, wobei Reverse Phase-(¹&sup8;C)-Silicagel verwendet wurde und mit einem linearen Gradienten, beginnend mit Aceton und endend mit 100 % Wasser eluiert wurde. Ein reines Produkt wurde erhalten, wenn die letzte Komponente aus der Säule isoliert wurde.
Die aktiven Fraktionen in dem vorhergehenden Fermentationsverfahren wurden bestimmt unter Verwendung des folgenden biologischen Tests.
Eine Scheibe mit 12,5 mm wurde direkt auf die Agar-Oberfläche gelegt. Candida albicans ATCC 14053, Saccharomyces pastorianus FD3737 und ein empfindlicher Stamm von Byssochlamys fulva FM 10,300(S) und EM 10,464(R) wurde verwendet. Die Candida- und Saccharomyces-Platten wurden 18 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, dann wurden die Platten auf Aktivität untersucht. Die Byssochlamys-Platten wurden bei 28ºC inkubiert und nach 18 Stunden abgelesen. Platten, die nur FK506 und FK520 (CP-105051) enthielten, waren gegen den Byssochlamys-Stamm aktiv. Unreine Fraktionen (die Nigericin enthielten) waren ebenso gegen die anderen Stämme aktiv.
Ein HPLC-Verfahren zur Bestimmung der Reinheit der Fraktionen wurde auch verwendet. Die Methode umfaßte die Verwendung einer Dupont Zorbax CN-Säule (4,6 mm x 25 cm) und ein isokratisches System, das aus 55/45 Wasser/Acetonitril zusammengesetzt war, bei einer Durchflußrate von 1 ml/Minute. Der Nachweis erfolgte bei 214 nm. Die Probe der Brühe (20 ml) wurde mit MIBK (20 ml) vermischt und etwa 4 bis 5 Minuten lang geschüttelt. Die Phasen wurden getrennt und das Lösungsmittel fast bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 1 ml reinem Acetonitril aufgenommen und eine 5 µl Probe wurde in den HPLC injiziert. Die Retentionszeit für FK520 ist unter diesen Bedingungen ungefähr 12,7 Minuten.

Herstellungsbeispiel 2

17-Allyl-1,14-dihydroxy-12-[2'-(4"-hydroxy-3"-methoxy-cyclohexyl)-1'-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9]-octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon

Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 FERM BP-927 wurde auf PYEA-Schrägagar (10 g/l Difco-Maltose, 4 g/l Difco-Hefeextrakt, 4 g/l Dextrose, 15 g/l Difco-Agar und 50 ml frische Kokosmilch, mit 1 1 deionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt, wobei der pH mit 1 n NaOH auf 7,3 eingestellt war) gehalten. Das Präparat wurde 10 bis 12 Tage lang bei 28ºC inkubiert und die Sporen wurden dann in sterile 1x6 Schüttelröhrchen überführt, die 10 ml ATCC 172-Medium enthielten (10 g/l Glucose, 20 g/l lösliche Stärke, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NZ-Amin A und 1 g/l Calciumcarbonat. Der pH wurde mit 1 n KOH auf 7,0 eingestellt). Die Röhrchen wurden bei 28ºC inkubiert und auf einem Rundschüttler mit etwa 150 bis 200 Cyclen pro Minute geschüttelt. Nach 4 bis 5 Tagen wurde die Brühe mit Glycerin und ATCC 172-Medium auf 40 % verdünnt und dann aseptisch in Kryoröhrchen überführt. Jedes Röhrchen wurde mit ½ ml Brühe beschickt. Die Röhrchen wurden bei -80ºC während der Lagerung eingefroren.
Die Röhrchen aus dem ultrakalten Vorrat wurden als Impfinoculum zur Herstellung von Inoculumkolben verwendet, ein Röhrchen pro 50 ml sterilem JDYTT-Medium in 300 ml Schüttelflaschen. Die Zusammensetzung des JDYTT-Mediums war 10 g/l Cerelose, 5 g/l NZ-Amin YTT, 0,002 g/l Kobaltchlorid und 3 g/l Calciumcarbonat. Der pH des JDYTT-Mediums wurde mit 1 n NaOH auf 7,2 eingestellt. Die Schüttelkolben wurden auf einem Rundschüttler mit etwa 150 bis 200 Cyclen pro Minute und bei 28ºC geschüttelt und inkubiert.
2 ml eines etwa 3 bis 5 Tage alten Schüttelkolben-Inoculums wurden verwendet, um den Kolben mit dem Inoculum der zweiten Stufe zu beimpfen, der 80 ml JDYTT-Medium in einem 3 l Fermenter enthielt. Das Fermentermedium war 45 g/l Maisstärke, 10 g/l Maisquellwasser, 10 g/l feuchte oder trockene Bäckerhefe, 3 g/l Calciumcarbonat und 0,005 g/l Kobaltchlorid. Der pH wurde mit 1 n NaOH auf etwa 6,4 bis 6,8 eingestellt. 1 ml Entschäumer P-2000 wurde dem Fermenter zusammen mit 100 ml Sojaöl zugegeben. Der pH wurde mit 1 n NaOH auf etwa 6,4 bis 6,8 eingestellt und das Material wurde mit 1700 Upm bewegt. Die Temperatur wurde auf 28ºC gehalten und sterile Luft wurde durch das Medium in einer Rate von 1 Volumen pro Volumen pro Minute geblasen.
Nach der Beimpfung wurde steriles Sojaöl zur Schaumkontrolle verwendet. Bei längeren Fermentationen und abhängig von den verwendeten Medien kann der Zuckergehalt überwacht werden und Zuckerzugaben nach 40, 60 und 90 Stunden verwendet werden, um den Gehalt an reduzierendem Zucker bei oder über 0,05 % zu halten. Die Fermentation wurde 46 Stunden lang durchgeführt.
Unter Verwendung von Standardmethoden der Dünnschicht-Chromatographie und HPLC wurde die Fermentationsbrühe überwacht und die relative Wirksamkeit berechnet.
Die Fermenter wurden gestoppt und zweimal mit ½ ihres Volumens an Methylisobutylketon (MIBK) extrahiert. Die Lösungsmittelphase wurde durch Absaugen abgetrennt und im Vakuum zu einem viskosen Öl eingeengt. Das Öl wurde mit Hexan, Diethylether und Methylenchlorid verrieben und die aktiven Anteile (Diethyletheranteile) wurden auf Florisil chromatographiert. Das Florisil wurde aufeinanderfolgend mit Diethylether, Methylenchlorid, Ethylacetat und Aceton eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und mit Aktivkohle versetzt. Das Konzentrat wurde filtriert und in Ethylacetat gelöst. Hexan wurde zugegeben, um das Produkt zu kristallisieren.
Die biologische Aktivität der Brühe und der nachfolgenden Aufarbeitungsströme wurde unter Verwendung eines Stamms von Byssochlamys fulva überwacht. Die Komponenten in der Brühe und den Aufbereitungsströmen wurden visuell durch Chromatographie auf Analtech Silicagel GF-(Markenzeichen)-Platten unter Verwendung von reinem Ethylacetat als Elutionsmittel sichtbar gemacht. Die entwickelten Platten wurden mit Vanillin-Reagenz (3 g Vanillin in 75 ml Ethanol und 25 ml 85 % Phosphorsäure) besprüht und auf 80ºC erwärmt. Das Produkt erschien als violetter Fleck.

Herstellungsbeispiel 3

2,3,5-Tri-O-benzyl-β-arabinofuranosylbromid

2,3,5-Tri-O-benzyl-1-O-p-nitrobenzoyl-β-arabinofuranosid (Sigma, 5,69 g, 10 mmol) wurde in Methylenchlorid (25 ml) bei 0ºC gelöst und mit 33 % HBr in Essigsäure (Fluka, 25 ml) versetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand als Azeotrop mit Toluol getrennt, was ein bräunliches Öl lieferte. Ausbeute 98%, der Rückstand wurde verwendet wie er war.

Herstellungsbeispiele 4 bis 6

Unter Anwendung der von Kartha, K.P.R. und H.J. Jennings, Journal of Carbohydrate Chemistry, 9, 777-781 (1990) beschriebenen Verahren wurden die folgenden Verbindungen hergestellt:
4. 2,3,4-Tri-O-acetyl-β-arabinosylbromid
5. 2,3,4-Tri-O-acetyl-α-arabinosylbromid
6. 2,3,4-Tri-O-acetyl-β-rhamnosylbromid.

Claims

1. Verbindung der Formel

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin n 1 oder 2 ist,

die gepunktete Linie eine fakultative Bindung in dem Fall, wenn R² H ist, bedeutet, A und B getrennt sind und A H bedeutet und B H oder OH bedeutet oder A und B zusammen =O bilden,

R² H, ein (C&sub2;-C&sub5;)-Alkanoyloxyrest oder -OR&sup0; ist,

R³ ein (C&sub1;-C&sub3;)-Alkyl- oder Allylrest ist,

R&sup0; H, oder

ist, R¹ oder

ist, R&sup4; bei jedem Vorkommen unabhängig -CO&sub2;R&sup8;, -CO&sub2;H, -CH&sub2;OH, H, -CH&sub3;, -CONH&sub2;, -CONHR&sup8;, -CONR&sub2;&sup8;, -CH&sub2;OCOR&sup8;, -CH&sub2;OCO&sub2;R&sup8;, -CH&sub2;OCONHR&sup8;, -CH&sub2;OCONR&sub2;&sup8; oder -CH&sub2;OR&sup8; ist,

R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig bei jedem Vorkommen (C&sub1;-C&sub4;)- Alkoxyreste, Benzyloxyreste, -OH, -OCOR&sup8;, -OCO&sub2;R&sup8; oder -OSi(R&sup9;)&sub3; sind;

R&sup8; ein (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl-, (C&sub3;-C&sub6;)-Cycloalkyl-, Allyl-, Pyridyl-, Thienyl-, Benzyl-, ein in verschiedener Weise mit 1 bis 5 Halogenatomen, OH-Gruppen oder (C&sub1;-C&sub4;)- Alkoxygruppen substituierter Benzyl-, ein Phenyl- oder ein in verschiedener Weise mit 1 bis 5 Halogenatomen, OH-Grupen oder (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxygruppen substituierter Phenylrest ist und

R&sup9; unabhängig bei jedem Vorkommen ein (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-, Phenyl- oder Benzylrest ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin die gepunktete Linie keine Bindung bedeutet und R² -OH ist.

3. Verbindung nach Anspruch 2, worin n 2 ist und A und B zusammen =O bilden.

4. Verbindung nach Anspruch 3, worin R³ ein Methyl-, Ethyl- oder Allylrest ist.

5. Verbindung nach Anspruch 4, worin R³ ein Ethylrest ist.

6. Verbindung nach Anspruch 5, worin R¹ oder

ist.

7. Verbindung nach Anspruch 6, worin R&sup4; -CH&sub2;OH, -CH&sub3;, -CH&sub2;OCOCH&sub3;, -CH&sub2;OCOCH&sub2;C&sub6;H&sub5; oder -CO&sub2;CH&sub3; ist und R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; jeweils unabhängig -OH, OCOCH&sub3; oder -OCOCH&sub2;C&sub6;H&sub5; sind.

8. Verbindung nach Anspruch 7, worin R¹

ist.

9. Verbindung nach Anspruch 8, worin R&sup4; -CH&sub3; ist, R&sup5; -OCOCH&sub3; ist, R&sup6; -OCOCH&sub3; ist und R&sup7; -OCOCH&sub3; ist.

10. Verbindung nach Anspruch 8, worin R&sup4; -CH&sub3; ist, R&sup5; -OH ist, R&sup6; -OH ist und R&sup7; -OH ist.

11. Verbindung nach Anspruch 7, worin R¹

ist.

12. Verbindung nach Anspruch 11, worin R&sup4; -CH&sub2;OCOCH&sub3; ist und R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; jeweils -OCOCH&sub3; sind.

13. Verbindung nach Anspruch 11, worin R&sup4; -CH&sub2;OCOCH&sub3; ist und R&sup5;, R&sup5; und R&sup7; jeweils -OH sind.

14. Verbindung nach Anspruch 1, worin n 2 ist, A und B getrennt sind und jeweils H bedeuten, die gepunktete Linie keine Bindung bedeutet, R² -OH ist und R³ ein Ethylrest ist.

15. Verbindung nach Anspruch 14, worin R¹

ist.

16. Verbindung nach Anspruch 1, worin n 2 ist, A und B zusammen =O bilden, die gepunktete Linie keine Bindung bedeutet, R² OR&sup0; ist, R³ ein Ethylrest ist und R&sup0; und R¹ jeweils

sind.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

18. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oder eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung als Arzneimittel.

19. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Transplantationsabwehr, Autoimmunkrankheit oder Pilzerkrankung.

20. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

worin n 1 oder 2 ist,

R² -OR&sup0; ist,

R³ ein (C&sub1;-C&sub3;)-Alkyl- oder Allylrest ist,

R&sup0; H,

ist,

R¹

ist,

R&sup4; bei jedem Vorkommen unabhängig -CO&sub2;R&sup8;, -CO&sub2;H, H, -CH&sub3;, -CONH&sub2;, -CONHR&sup8;, -CONR&sub2;&sup8;, -CH&sub2;OCOR&sup8;, -CH&sub2;OCO&sub2;R&sup8;, -CH&sub2;OCONHR&sup8;, -CH&sub2;OCONR&sub2;&sup8; oder -CH&sub2;OR&sup8; ist,

R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig bei jedem Vorkommen (C&sub1;-C&sub4;)- Alkoxyreste, Benzyloxyreste, -OCOR&sup8;, -OCO&sub2;R&sup8; oder -OSi(R&sup9;)&sub3; sind;

R&sup8; ein (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl-, (C&sub3;-C&sub6;)-Cycloalkyl-, Allyl-, Pyridyl-, Thienyl-, Benzyl-, ein in verschiedener Weise mit 1 bis 5 Halogenatomen, OH-Gruppen oder (C&sub1;-C&sub4;)- Alkoxygruppen substituierter Benzyl-, ein Phenyl- oder ein in verschiedener Weise mit 1 bis 5 Halogenatomen, OH-Gruppen oder (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxygruppen substituierter Phenylrest ist und

R&sup9; unabhängig bei jedem Vorkommen ein (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-, Phenyl- oder Benzylrest ist,

umfassend, daß man eine Verbindung der Formel

worin R ein (C&sub1;-C&sub3;)-Alkyl- oder Allylrest ist und n 1 oder 2 ist mit 2 bis 4 Moläquivalenten einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oder

worin X Halogen ist,

R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig bei jedem Vorkommen (C&sub1;-C&sub4;)- Alkoxyreste, Benzyloxyreste, -OCOR&sup8;, -OCO&sub2;R&sup8; oder - OSi(R&sup9;)&sub3; sind;

R&sup9; unabhängig bei jedem Vorkommen ein (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-, Phenyl- oder Benzylrest ist, in Gegenwart eines Trocknungsmittels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Molekularsieben, Calciumsulfat und Magnesiumsulfat, einer Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Quecksilbercarbonat, Silbercarbonat, Quecksilbernitrat und Silbernitrat und einem Katalysator ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silbertriflat, Silberperchlorat, Silbertetrafluorborat, Quecksilbertriflat, Quecksilberperchlorat und Quecksilbertetrafluorborat in einem reaktionsinerten Lösungsmittel bei etwa -78ºC bis etwa -70ºC umsetzt, wobei etwa 0,5 bis etwa 24 Stunden lang auf etwa 0ºC erwärmt wird und anschließend bei Raumtemperatur etwa 0,5 bis 24 Stunden lang gerührt wird.

21. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

worin n 1 oder 2 ist,

R² ein (C&sub2;-C&sub5;)-Alkanoyloxyrest oder -OR&sup0; ist,

R³ ein (C&sub1;-C&sub3;)-Alkyl- oder Allylrest ist;

R&sup0; H oder

ist, R¹ oder

ist,

R&sup4; bei jedem Vorkommen unabhängig -CO&sub2;R&sup8;, -CO&sub2;H, -CH&sub2;OH, H, -CH&sub3;, -CONH&sub2;, -CONHR&sup8;, -CONR&sub2;&sup8;, -CH&sub2;OCOR&sup8;, -CH&sub2;OCO&sub2;R&sup8;, -CH&sub2;OCONHR&sup8;, -CH&sub2;OCONR&sub2;&sup8; oder -CH&sub2;OR&sup8; ist,

umfassend, daß man eine Verbindung der Formel

worin n 1 oder 2 ist,

R² ein (C&sub2;-C&sub5;)-Alkanoyloxyrest oder -OR&sup0; ist,

R³ ein (C&sub1;-C&sub3;)-Alkyl- oder Allylrest ist;

R&sup0; H oder

ist, R¹ oder

ist,

R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; unabhängig bei jedem Vorkommen (C&sub1;-C&sub4;)- Alkoxyreste, Benzyloxreste, -OCOR&sup8;, -OCO&sub2;R&sup8; oder -OSi(R&sup9;&sub3; sind;

mit einer katalytischen Menge einer Alkoxidbase in einem alkoholischen Lösungsmittel bei 0ºC umsetzt.