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PT2845866T - Anticorpos e imunoconjugados e utilizações dos mesmos - Google Patents

Anticorpos e imunoconjugados e utilizações dos mesmos Download PDF

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PT2845866T
PT2845866T PT141710137T PT14171013T PT2845866T PT 2845866 T PT2845866 T PT 2845866T PT 141710137 T PT141710137 T PT 141710137T PT 14171013 T PT14171013 T PT 14171013T PT 2845866 T PT2845866 T PT 2845866T
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PT
Portugal
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antibody
amino acid
seq
acid sequence
steap
Prior art date
Application number
PT141710137T
Other languages
English (en)
Inventor
S Dennis Mark
Rubinfeld Bonnee
Polakis Paul
Jakobovits Aya
Original Assignee
Genentech Inc
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Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
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Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPOS E IMUNOCONJUGADOS UTILIZAÇÕES DOS MESMOS CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos anti-STEAP-l e imunoconjugados dos mesmos. A invenção refere-se adicionalmente a métodos de utilização de anticorpos anti-STEAP-l e de imunoconjugados dos mesmos.
ANTECEDENTES
Em seres humanos, o cancro da próstata é uma das malignidades mais comuns diagnosticadas no sexo masculino e é a segunda principal causa de mortes relacionadas com cancro nos membros do sexo masculino. A American Cancer Society estima que no ano 2000, serão diagnosticados 180.400 novos casos de cancro da próstata com 31.900 mortes provocadas pela doença. Em estádios avançados, o cancro da próstata metastiza para os ossos. Embora tenham sido alcançados avanços no diagnóstico precoce e no tratamento de tumores localmente confinados, o cancro da próstata é incurável após ter metastizado. Os pacientes com cancro da próstata metastático sob terapia hormonal desenvolverão eventualmente um estado refratário a androgénios (independente de androgénios) que conduzirá à progressão da doença e à morte. Atualmente, o antigénio específico da próstata (PSA) é o marcador tumoral mais amplamente utilizado para o rastreio, diagnóstico e monitorização do cancro da próstata. Contudo, a utilização disseminada do PSA como ferramenta para o rastreio é controversa dado que o PSA não é capaz de discriminar com precisão entre doença da próstata benigna e maligna.
Dependendo do estádio do cancro, o tratamento do cancro da próstata e da bexiga envolve uma ou uma combinação das seguintes terapêuticas: cirurgia para remover o tecido canceroso, terapêutica com radiação, quimioterapia, privação de androgénios (por exemplo, terapêutica hormonal) no caso de cancro da próstata. Embora a terapêutica cirúrgica ou com radiação melhore significativamente a sobrevivência em pacientes com estádios precoces da doença, as opções terapêuticas são muito limitadas para casos avançados, particularmente para recorrências do tumor após ablação hormonal. A maioria dos pacientes que são submetidos a terapêutica hormonal progridem para o desenvolvimento de doença independente de androgénios. Atualmente, nâo existe nenhum tratamento eficaz para os 20-40Ê dos pacientes de cancro da próstata que desenvolvem doença recorrente após cirurgia ou terapêutica com radiação, ou para aqueles em quem o cancro tenha metastizado no momento do diagnóstico. A quimioterapia tem os seus efeitos secundários tóxicos, especialmente em pacientes mais idosos. 0 desenvolvimento de novas formas de terapêutica especialmente para doença refratária à privação de androgénios constitui uma necessidade urgente na gestão do carcinoma prostático.
Foi descrita a identificação de um novo antigénio de superfície celular, STEAP-1, (veja-se a Patente US N.° 6.329.503) . STEAP-1 é membro dos antigénios transmembranares da serpentina da superfície celular. É expresso predominantemente no cancro da próstata, e consequentemente os membros desta família foram denominados "STEAP" (Antigénios Epiteliais da Próstata de Seis Domínios Transmembranares). As proteínas STEAP humanas exibem um elevado grau de conservação estrutural dentro da família mas não mostram homologia estrutural significativa com nenhumas proteínas humanas conhecidas. A STEAP-1 parece ser uma proteína de membrana do tipo IIIa expressa predominantemente em células da próstata em tecidos humanos normais. Estruturalmente, a STEAP-1 é uma proteína de 339 aminoácidos caracterizada por uma topologia molecular de seis domínios transmembranares e terminais N e C intracelulares, sugerindo que se dobra numa "serpentina" em três ansas extracelulares e duas intracelulares. A expressão da proteína STEAP-l é mantida em níveis elevados ao longo de vários estados do cancro da próstata. A STEAP-l é altamente sobreexpressa noutros cancros humanos tais como do pulmão e do cólon. Foram criados anticorpos de ratinho contra fragmentos de STEAP-l humana e os anticorpos foram mostrados como ligando a STEAP-l na superfície da célula (veja-se a Publicação de Patente U.S. N.° 200402532.32A1) . 0 documento WO 2005/113601 A divulga anticorpos monoclonais anti-STEAP-1. 0 documento WO 2006/034488A divulga anticorpos manipulados com cisteína. A terapêutica à base de anticorpos provou ser muito eficaz no tratamento de vários cancros. Por exemplo, foram utilizados HERCEPTIN® e RITUXAN® (ambos da Genentech, S. San Francisco) exitosamente para tratar o cancro da mama e linfoma não Hodgkin, respetivamente. HERCEPTIN® é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que liga seletivamente ao domínio extracelular do proto-oncogene do recetor 2 de fator de crescimento epidérmico humano (HER2). A sobreexpressão da proteína HER2 é observada em 25-30Ê dos cancros da mama primários. RITUXAN® é um anticorpo monoclonal quimérico de ratinho/humano geneticamente manipulado dirigido contra o antigénio CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos. Ambos estes anticorpos são produzidos em células CHO. A utilização de conjugados anticorpo-fãrmaco para a entrega local de agentes citotõxicos ou citostáticos, isto é fármacos para matar ou inibir células tumorais no tratamento do cancro (Syrigos e Epenetos (1999) Anti cancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; patente U.S. 4975278) permite a entrega orientada da fração de fármaco a tumores, e acumulação intracelular nos mesmos, enquanto a administração sistémica destes agentes fármacos não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para as células normais bem como as células tumorais destinadas a serem eliminadas (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05,- Thorpe, (1985) "Antiboby Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506) . É deste modo procurada a eficácia máxima com toxicidade mínima. Tanto anticorpos policlonais como anticorpos monoclonais foram relatados como úteis nestas estratégias (Rowland et al. , (1986) Cancel' Immunol.
Immunother., 21:183-87). Os fármacos utilizados nestes métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al. , Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87 (1986)). As toxinas utilizadas em conjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tais como a toxina difterica, toxinas de plantas tais como ricina, toxinas de molécula pequena tais como geldanamicina (Kerr et al. (1997) Bioconjugate Chem. 8(6):781-784,- Mandler et al. (2000) Journal of the Nat. Cancer Ins t. 92(19) :1573- 1581,- Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al. , (1996)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). As toxinas podem efetuar os seus efeitos citotóxicos e citostáticos através de mecanismos incluindo ligação a tubulina, ligação a ADN ou inibição de topoisomerase (Meyer, D.L. e Senter, P.D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy" em Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol 38 (2003) Capítulo 23, 229-237). Alguns fármacos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos quando conjugados com grandes anticorpos ou ligandos de recetores de proteínas. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetano, Biogen/Idec) é urn conjugado anticorpo-radioisõtopo composto por um anticorpo monoclonal IgGl capa de ratinho dirigido contra o antigénio CD20 encontrado 11a superfície de linfócitos B normais e malignos e radioisótopo m-In ou ligado por um ligante-quelante de tioureia (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7) :766-77,- Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12) : 4336-42; Witzig et al. (2002) J. Cl in. Oncol. 20(10):2453-63,- Witzig et al. (2002) J. Cl in. Oncol. 20(15) :3262-69) . Embora ZEVALIN tenha atividade contra o linfoma não Hodgkin (NHL) de células B, a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado de anticorpo e fármaco composto por um anticorpo hu CD33 ligado a caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mieloide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686,-Patentes US 4.970.198; 5.079.233; 5.585.089; 5.606.040; 5.693.762; 5.739.116; 5.767.285; 5.773.001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), um conjugado de anticorpo e fármaco composto pelo anticorpo huC242 ligado através do ligante de dissulfureto SPP à fração de fármaco maitansinoide, DM1, está a ser desenvolvido para o tratamento de cancros que expressam o antigénio CanAg, tais como cancro do cólon, pancreático, gástrico e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), um conjugado de anticorpo e fármaco composto pelo anticorpo monoclonal anti antigénio membranar específico da próstata (PSMA) ligado à fração de fármaco maitansinoide, DM1, está em desenvolvimento para o potencial tratamento de tumores da próstata. A mesma fração de fármaco maitansinoide, DM1, foi ligada através de um ligante não de dissulfureto, SMCC, a um anticorpo monoclonal de ratinho, TA.l (Chari et al. (1992) Cancer Research 52:127-131). Este conjugado foi relatado como sendo 200 vezes menos potente do que o correspondente conjugado com ligante de dissulfureto. 0 ligante SMCC foi considerado no mesmo como sendo "não clivável."
Foram isolados vários compostos peptídicos curtos a partir do molusco marinho, Dolabella auricularia, e constatados como tendo atividade biológica (Pettit et al. (1993) Tetrahedron 49:9151; Nakamura et al. (1995) Tetrahedron Letters 36:5059-5062; Sone et al. (1995) Journal Grg Chem. 60:4474). Foram também preparados análogos destes compostos, e alguns foram constatados como tendo atividade biológica (para uma revisão, veja-se Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277) . Por exemplo, a auristatina E (US 5635483) é um análogo sintético do produto natural marinho Dolastatina 10, um agente que inibe a polimerização de tubulina por ligação ao mesmo local na tubulina que o fármaco anti cancro vincristina (G.R. Pettit, (1997) Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70:1-79) . A dolastatina 10, a auristatina PE e a auristatina E são péptidos lineares tendo quatro aminoácidos, três dos quais são únicos para a classe de compostos da dolastatina, e uma amida C-terminal.
Os péptidos de auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados com: (i) anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y nos carcinomas) ; (ii) cAClO que é específico para CD30 em malignidades hematológicas (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773,- Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784,-"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465,-US 2004/0018194; (iii) anticorpos anti-CD20 tais como Rituxan® (rituximab) (documento WO 04/032828) para o tratamento de cancros que expressam CD20 e distúrbios imunitários,· (iv) anticorpos 2H9 anti-EphB2, e anti-IL-8 para tratamento de cancro colorretal (Mao, et al. (2004) Cancer Research 64(3):781-788),- (v) anticorpo para E-selectina (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6394); e (vi) outros anticorpos anti-CD30 (documento WO 03/043583). A monometilauristatina (MMAE) foi também conjugada com 2H9, um anticorpo contra EphB2R que é um recetor de tirosina quinase TM de tipo I com homologia estreita entre ratinho e humano, e é sobreexpresso em células de cancro colorretal (Mao et al. (2004) Cancer Res. 64 : 781-788) . A monometilauristatina MMAF, uma variante de auristatina E (MMAE) com uma fenilalanina no terminal C (documentos US 5767237; US 6124431), foi relatada como sendo menos potente do que a MMAE, mas mais potente quando conjugada com anticorpos monoclonais (Senter et al. , Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, mostrado em 28 de março de 2004) . A auristatina F fenilenodiamina (AFP); uma variante de fenilalanina da MMAE foi ligada a um mAb anti-CD70, 1F6, através do terminal C de 1F6 por meio de um espaçador de fenilenodiamina (Law et al. , Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 625, mostrado em 28 de março de 2004).
Existe uma necessidade na técnica de fármacos adicionais para tratar vários cancros tais como cancros e metástases de cancros na próstata, no pulmão e no cólon. Fármacos particularmente úteis para este propósito incluem conjugados de anticorpo anti-STEAP-1 e fãrmaco direcionados para células da próstata, do pulmão ou do cólon tendo uma toxicidade significativamente menor, porém eficiência terapêutica útil. Estas e outras limitações e problemas do passado são abordados pela presente invenção. A recitação de qualquer referência neste pedido não é uma admissão de que a referência é da técnica anterior relativamente ao presente pedido.
SUMÁRIO A invenção proporciona anticorpos monoclonals humanizados que ligam a STEAP-1, e imunoconjugados e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos, conforme definido nas reivindicações.
Na presente divulgação, é proporcionado um anticorpo que liga a STEAP-1, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos mostrada na Figura 2A (SEQ ID NO: 6) ou um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 2B (SEQ ID NO: 9) . Na divulgação, é proporcionado um anticorpo que liga a STEAP-1, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 2A (SEQ ID NO: 6) e um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na Figura 2B (SEQ ID NO: 9).
Na divulgação, é proporcionado um anticorpo que liga a STEAP-1, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada tendo pelo menos 90Ê, pelo menos 91Ê, pelo menos 92Ê, pelo menos 93Ê, pelo menos 94Ê, pelo menos 95Ê, pelo menos 96Ê, pelo menos 97Ê, pelo menos 98Ê, ou pelo menos 9 9Ê de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 9 ou 10. 0 anticorpo pode compreender um domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 10. 0 anticorpo da invenção compreende uma região de esqueleto 1 de um domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 25. 0 anticorpo divulgado no presente documento pode compreender um domínio variável da cadeia leve tendo pelo menos 90Ê, pelo menos 91Ê, pelo menos 92Ê, pelo menos 93Ξ, pelo menos 94Ê, pelo menos 95Ê, pelo menos 96Ê, pelo menos 97Ê, pelo menos 98Ê, ou pelo menos 99Ê de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. 0 anticorpo pode compreender um domínio variável da cadeia leve de SEQ ID MO: 6. É proporcionado um anticorpo que liga a STEAP-l, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia pesada tendo pelo menos 90Ê, pelo menos 91Ê, pelo menos 92Ê, pelo menos 93Ê, pelo menos 94Ê, pelo menos 95Ê, pelo menos 96Ê, pelo menos 97Ê, pelo menos 98Ê, ou pelo menos 99Ê de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NQs: 9 ou 10. 0 anticorpo pode compreender um domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 10. 0 anticorpo da invenção compreende uma região estrutural 1 de um domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 25. 0 anticorpo pode compreender ainda um domínio variável da cadeia leve tendo pelo menos 90Ê, pelo menos 91Ê, pelo menos 92Ê, pelo menos 93Ê, pelo menos 94Ê, pelo menos 95Ê, pelo menos 96Ê, pelo menos 97Ê, pelo menos 98Ê, ou pelo menos 9 9Ê de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. 0 anticorpo divulgado no presente documento pode compreender um domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 6.
Nesta divulgação, é proporcionado um polinucleótido codificando quaisquer dos anticorpos acima. É também proporcionado um vetor compreendendo o polinucleótido. É proporcionada uma célula hospedeira compreendendo o vetor. A célula hospedeira é eucariota. A célula hospedeira é uma célula de ovário de hámster chinês (CHO). É proporcionado um método de preparação de um anticorpo anti-STEAP-l, em que o método compreende a cultura da célula hospedeira sob condições adequadas para a expressão do polinucleótido que codifica o anticorpo, e o isolamento do anticorpo.
Num aspeto, é proporcionado um anticorpo de acordo com as reivindicações que liga a STEAP-l expressa na superfície de uma célula. Numa forma de realização, o anticorpo liga a um epítopo no interior de uma região de STEAP-l humana ou de ratinho. Numa forma de realização, a célula é uma célula de mamífero. Numa forma de realização, a célula é uma célula humana. Numa forma de realização, a célula é uma célula de cancro. Numa forma de realização a célula é uma célula da próstata, do pulmão ou do cólon. Numa forma de realização a célula de cancro é uma célula de cancro da próstata. Noutra forma de realização, a célula é de uma metástase de um cancro primário da próstata, do pulmão ou do cólon. 0 anticorpo é um anticorpo monoclonal. Numa forma de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir de um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab!)2. 0 anticorpo é humanizado.
Na presente divulgação, é proporcionado um método de deteção da presença de STEAP-l numa amostra biológica, o método compreendendo o contacto da amostra biológica com qualquer dos anticorpos anteriores sob condições permissivas para ligação do anticorpo a STEAP-l, e deteção de se é ou não formado um complexo entre o anticorpo e STEAP-l. A amostra biológica pode compreender células da próstata. A amostra biológica pode ser de um mamífero que sofre ou suspeito de sofrer de um distúrbio celular na próstata e/ou um distúrbio proliferativo celular ou tecidos incluindo, mas não limitados a, cancro da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga e ovariano e sarcoma de Ewing bem como metástases de cancros primários da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga e ovariano e sarcoma de Ewmng. Veja-se, por exemplo, (veja-se a Patente US 6.329.503; e Rodeberg, D.A. et al. , Clin. Cancer Res. 11(12):4545-4552 (2005)).
Na presente divulgação é proporcionado um método de diagnóstico de um distúrbio proliferativo celular associado a expressão aumentada de STEAP-l, o método compreendendo o contacto de uma célula de teste com qualquer dos anticorpos anteriores; a determinação do nível de expressão de STEAP-l por deteção da ligação do anticorpo a STEAP-l; e a comparação do nível de expressão de STEAP-l pela célula de teste com o nível de expressão de STEAP-1 por uma célula de controlo, em que um nível superior de expressão de STEAP-1 pela célula de teste em comparação com a célula de controlo indica a presença de um distúrbio proliferative celular associado a expressão aumentada de STEAP-1. A célula de teste pode ser uma célula de um paciente suspeito de ter urn distúrbio proliferativo celular, tal como uma distúrbio proliferativa da próstata. 0 distúrbio proliferativo celular pode ser selecionado a partir de distúrbios celulares da próstata incluindo, mas não limitadas a cancro da próstata. 0 método pode compreender a determinação do nível de expressão de STEAP-1 na superfície da célula de teste (tal como, por exemplo, uma célula de cancro da próstata) e a comparação do nível de expressão de STEAP-1 na superfície da célula de teste com o nível de expressão de STEAP-1 na superfície da célula de controlo (tal como, por exemplo, uma célula normal da próstata para além de uma célula da próstata em proliferação anormal). É proporcionado um método de diagnóstico de um distúrbio proliferativo celular associado a um aumento de células, tais como células da próstata, que expressam STEAP-1, o método compreendendo o contacto de células de teste numa amostra biológica com qualquer dos anticorpos anteriores; a determinação do nível de anticorpo ligado às células de teste na amostra por deteção da ligação do anticorpo a STEAP-1; e a comparação do nível de anticorpo ligado a células numa amostra de controlo, em que o nível de anticorpo ligado é normalizado ao número de células que expressam STEAP-1 nas amostras de teste e de controlo, e em que um nível superior de anticorpo ligado na amostra de teste em comparação com a amostra de controlo indica a presença de um distúrbio proliferativo celular associado a células que expressam STEAP-1. É também proporcionado um método de deteção de STEAP-1 solúvel em sangue ou soro, o método compreendendo o contacto de uma amostra de teste de sangue ou soro de um mamífero suspeito de sofrer de um distúrbio proliferativo celular na próstata com um anticorpo anti-STEAP-1 da invenção e a deteção de um aumento de STEAP-1 solúvel na amostra de teste relativamente a uma amostra de controlo de sangue ou soro de um mamífero normal. 0 método de deteção pode ser útil como um método de diagnóstico de um distúrbio proliferativo celular na próstata associado com um aumento de STEAP-1 solúvel em sangue ou soro de um mamífero.
Os anticorpos da invenção incluem anticorpos manipulados com cisteína como definido na reivindicação 9, onde um ou mais aminoácidos de um anticorpo parental são substituídos por um aminoácido de cisteína livre conforme divulgado no documento W02006/034488. Um anticorpo manipulado com cisteína compreende um ou mais aminoácidos de cisteína livre tendo um valor de reatividade de tiol no intervalo de 0,6 a 1,0. Um aminoácido de cisteína livre é um resíduo de cisteína que foi manipulado no anticorpo parental e não faz parte de uma ponte de dissulfeto. Os anticorpos manipulados com cisteína são úteis para a fixação de compostos citotóxicos e/ou imagiológicos no local da cisteína manipulada através de, por exemplo, uma maleimida ou um haloacetilo. A reatividade nucleofílica da funcionalidade tiol de um resíduo Cys com um grupo maleimida é cerca de 1000 vezes superior em comparação com qualquer outra funcionalidade de aminoácido numa proteína, tal como o grupo amino dos resíduos de lisina ou o grupo amino N-terminal. A funcionalidade específica de tiol em reagentes de iodoacetilo e maleimida pode reagir com grupos amino, mas são necessários um pH superior (>9,0) e tempos de reação mais longos (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London) .
Os anticorpos manipulados com cisteína podem ser úteis no tratamento do cancro e incluem anticorpos específicos para recetores da superfície celular e transmembranares, e antigénios associados a tumores (TAA). Tais anticorpos podem ser utilizados na forma de anticorpos nus (não conjugados com um fármaco ou a uma fração marcadora) ou na forma de conjugados anticorpo-fármaco (ADC). Os anticorpos manipulados com cisteína da invenção podem ser acoplados de modo específico de local e eficazmente com um reagente reativo com tiol. 0 reagente reativo com tiol pode ser um reagente ligante multifuncional, um reagente marcador de captura, um reagente fluoróforo ou um intermediário fármaco-ligante. 0 anticorpo manipulado com cisteína pode ser marcado com um marcador detetável, imobilizado sobre um suporte de fase sólida e/ou conjugado com uma fração de fármaco. A reatividade de tiol pode ser generalizada a qualquer anticorpo onde a substituição de aminoácidos por aminoácidos de cisteína reativos possa ser efetuada dentro das gamas na cadeia leve selecionadas a partir das gamas de aminoácidos: L-10 a L-20; L-38 a L-48; L-105 a L-115; L-139 a L-149; L-163 a L-173; e dentro das gamas na cadeia pesada selecionadas a partir das gamas de aminoácidos: H-35 a H-45; H- 83 a H-93; H-114 a H-127; e H-170 a H-184, e na região Fc dentro das gamas selecionadas de H-268 a H-291; H-319 a H-344; H-370 a H-380; e H-395 a H-405, onde a numeração das posições de aminoácidos começa na posição 1 do sistema de numeração de Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) e continua posteriormente sequencialmente conforme divulgado no documento WO 2006/034488. A reatividade de tiol pode também ser generalizada a determinados domínios de um anticorpo, tais como o domínio constante da cadeia leve (CL) e domínios constantes da cadeia pesada, CHI, CH2 e CH3. Podem ser feitas substituições por cisteína que resultam em valores de reatividade de tiol de 0,6 e superiores nos domínios constantes da cadeia pesada α, δ, ε, γ e μ de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respetivamente, incluindo as subclasses de IgG: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Estes anticorpos e as suas utilizações são divulgados no documento WO 2006/034488.
Os anticorpos manipulados com cisteína da invenção retêm preferentemente a capacidade de ligação a antigénio dos seus homólogos de anticorpo parental de tipo selvagem. Consequentemente, os anticorpos manipulados com cisteína são capazes de ligar, preferentemente especificamente, a antigénios. Tais antigénios incluem, por exemplo, antigénios associados a tumores (TAA), proteínas recetoras da superfície celular e outras moléculas da superfície celular, proteínas transmembranares, proteínas de sinalização, fatores reguladores da sobrevivência celular, fatores reguladores da proliferação celular, moléculas associadas a (por exemplo, conhecidos como ou suspeitos como contribuindo funcionalmente para) desenvolvimento de tecido ou diferenciação, linfocinas, citocinas, moléculas envolvidas na regulação do ciclo celular, moléculas envolvidas na vasculogénese e moléculas associadas a (por exemplo, conhecidas como ou suspeitas com contribuindo funcionalmente para) angiogénese.
Um anticorpo da invenção pode ser conjugado com outros agentes reativos com tiol em que o grupo reativo é, por exemplo, uma maleimida, uma iodoacetamida, um dissulfeto de piridilo, ou outro parceiro de conjugação reativo com tiol (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; German, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. em Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). 0 parceiro pode ser um agente citotõxico (por exemplo uma toxina tal como doxorrubicina ou toxina de pertussis) , um fluoróforo tal como um corante fluorescente como fluoresceína ou rodamina, um agente que1ante para um metal de imagiologia ou radioterapêutico, um marcador ou etiqueta de deteção de peptidilo ou não peptidilo, ou um agente modificador de eliminação tal como vários isómeros de polietilenoglicol, um péptido que liga a um terceiro componente, ou outro hidrato de carbono ou agente lipofílico.
Num aspeto, os anticorpos da invenção podem ser conjugados com qualquer fração marcadora que possa ser unida covalentemente ao anticorpo através de uma fração reativa, uma fração ativada ou um grupo tiol reativo de cisterna (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304:147-15;
Harlow E. e Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2a ed. CRC Press, Boca Raton, FL). 0 marcador unido pode funcionar para: (i) proporcionar um sinal detetável; (ii) interatuar com um segundo marcador para modificar o sinal detetável proporcionado pelo primeiro ou segundo marcadores, por exemplo para obter FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência); (iii) estabilizar interações ou aumentar a afinidade de ligação, com o antigénio ou o ligando; (iv) afetar a mobilidade, por exemplo mobilidade eletroforética ou permeabilidade celular através da carga, hidrofobicidade, formato ou outros parâmetros físicos, ou (v) proporcionar uma fração de captura, para modular a afinidade para com o ligando, a ligação anticorpo/'antigénio ou a complexação iónica.
Os anticorpos manipulados com cisterna marcados podem ser úteis em ensaios de diagnóstico, por exemplo, para deteção da expressão de um antigénio de interesse em células, tecidos ou soro específicos. Para aplicações em diagnóstico, o anticorpo será tipicamente marcado com uma fração detetável. Estão disponíveis numerosos marcadores que podem ser genericamente agrupados nas seguintes categorias:
Radioisótopos (radionuclídeos) , tais como 8H, ^c, 14C, 18F, 32p; 35g, 64cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, niIn, 123i; 124]y 125I; 131I; 133Xe, 177Lu, 211At ou 213ΒΪ. Os anticorpos marcados com radioisótopos são úteis em experiências de imagiologia orientadas a recetores. 0 anticorpo pode ser marcado com reagentes ligandos que ligam, quelam ou de outro modo se complexam com um radioisótopo de metal em que o reagente é reativo com o tiol da cisteína manipulada do anticorpo, utilizando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nova Iorque, NY, Pubs. (1991) . Os ligandos quelantes que podem complexar ura ião metálico incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Os radionuclídeos podem ser orientados por via de complexação com os conjugados anticorpo-fãrmaco da invenção (Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9) :1137-1146).
Os reagentes ligantes tais como DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobenzil-DOTA) podem ser preparados pela reação de aminobenzil-DOTA com ácido 4-maleimidobutírico (Fluka) ativado com isopropilcloroformiato (Aldrich), seguindo o procedimento de Axoworthy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807). Os reagentes DOTA-maleimida reagem com os aminoácidos de cisteína livres dos anticorpos manipulados com cisteína e proporcionam um ligando complexante de metais no anticorpo (Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Os reagentes marcadores ligantes quelantes tais como DOTA-NHS (mono(éster de N-hidroxissuccinimida) do ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético) estão comercialmente disponíveis {Macrocyclics, Dallas, TX) . A imagiologia orientada a recetores com anticorpos marcados com radionuclídeos pode proporcionar um marcador de ativação de vias por deteção e quantificação da acumulação progressiva de anticorpos em tecido tumoral (Albert et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210) . Os radio-metais conjugados podem permanecer intracelulares após degradação lisossómica. São divulgados complexos metal-quelato adequados como marcadores de anticorpos para experiências de imagiologia: documentos US 5.342.606; US 5.428.155; US 5.316.757; US 5.480.990; US 5.462.725; US 5.428.139; US 5.385.893; US 5.739.294; US 5.750.660; US 5.834.456; Hnatowich et al. (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al. (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al. (1990) J. Cancer 1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al. (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al. (19 98) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verei et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al. (1994) Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al. (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verei et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al. (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al. (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al. (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al. (2003) Cancer Bíotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al. (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al. (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20. (b) Os marcadores fluorescentes tais como quelatos de terras raras (quelato de európio), tipos de fluoresceína incluindo FITC, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína; tipos de rodamina incluindo TAMRA; dansilo; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; Vermelho de
Texas; e análogos dos mesmos. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados com anticorpos utilizando as técnicas divulgadas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. Os corantes fluorescentes e reagentes marcadores fluorescentes incluem aqueles que estão comercialmente disponíveis da Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL). (c) Estão disponíveis ou são divulgados vários marcadores enzima-substrato (documento US 4275149). A enzima geralmente catalisa uma alteração química de um substrato cromogénico que pode ser medida utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor num substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimiluminescência do substrato. São descritas acima técnicas para a quantificação de uma alteração na fluorescência. 0 substrato quimiluminescente torna-se eletronicamente excitado através de uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (utilizando um quimioluminómetro, por exemplo) ou doa energia a um aceitador fluorescente. Os exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; documento US 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, maleato-desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacãrido-oxidases (por exemplo, glucose-oxidase, galactose-oxidase e glucose-6-fosfato-desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina-oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase. São descritas técnicas para a conjugação de enzimas a anticorpos em O'Sullivan et al. (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", em Methods in
Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nova Iorque, 73:147-166.
Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de rábano (HRP) com peroxidase de hidrogénio como substrato, em que a peroxidase de hidrogénio oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenilenodiamina (OPD) ou cloridrato de 3,35,5'-tetrametilbenzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenilo como substrato cromogénico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou um substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil^-D-galactosidase.
Estão disponíveis numerosas outras combinações enzima-substrato para o perito na especialidade. Para uma revisão geral, veja-se os documentos US 4275149 e US 4318980.
Um marcador pode ser conjugado indiretamente com uma cadeia lateral de aminoãcido, uma cadeia lateral de aminoãcido ativada ou um anticorpo manipulado com cisteína. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer das três amplas categorias de marcadores acima mencionadas pode ser conjugada com avidina ou estreptavidina, ou vice-versa. A biotina liga seletivamente a estreptavidina e consequentemente, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo desta maneira indireta.
Alternativamente, para conseguir a conjugação indireta do marcador com a variante polipeptídica, a variante polipeptídica é conjugada com um hapteno pequeno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores acima mencionados é conjugado com uma variante polipeptídica anti hapteno (por exemplo, anticorpo anti digoxina). Gonsequentemente, pode ser conseguida a conjugação indireta do marcador com a variante polipeptídica (Hermanson, G. (1996) em Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego) .
Os anticorpos da presente invenção podem ser empregues em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ELISA, ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.).
Um marcador de deteção pode ser útil para a localização, visualização e quantificação de um evento de ligação ou reconhecimento. Os anticorpos marcados da invenção podem detetar recetores da superfície celular. Outra utilização para anticorpos marcados de forma detetável consiste num método de imunocaptura à base de microesferas compreendendo a conjugação de uma microesfera com um anticorpo marcado fluorescente e a deteção de um sinal de fluorescência após a ligação de um ligando. Metodologias de deteção de ligação semelhantes utilizam o efeito de ressonância de plasmão de superfície (SPR) para medir e detetar interações anticorpo-antigénio.
Os marcadores de deteção tais como corantes fluorescentes e corantes quimiluminescentes (Briggs et ai. (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino acids", J. Chem. Soc. , Perkin-Trans. 1:1051-1058) proporcionam um sinal detetável e são geralmente aplicáveis para marcação de anticorpos, preferentemente com as seguintes propriedades: (i) o anticorpo marcado deverá produzir um sinal muito elevado com baixo ruído de fundo de modo a que pequenas quantidades de anticorpos possam ser detetadas com sensibilidade em ensaios tanto isentos de células como à base de células; e (ii) o anticorpo marcado deverá ser fotoestável de modo a que o sinal fluorescente possa ser observado, monitorado e registado sem fotobranqueamento significativo. Para aplicações que envolvem ligação na superfície celular de anticorpo marcado a membranas ou superfícies celulares, especialmente células vivas, os marcadores preferentemente (iii) têm boa solubilidade em água para conseguir uma concentração de conjugado eficaz e sensibilidade de deteção e (iv) não são tóxicos para células vivas de modo a não interromper os processos metabólicos normais das células ou causar morte celular prematura. A quantificação direta da intensidade de fluorescência celular e a enumeração de eventos marcados por fluorescência, por exemplo ligação na superfície celular de conjugados péptido-corante, podem ser levadas a cabo num sistema (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) que automatiza a mistura-e-leitura, ensaios não radioativos com células vivas ou microesferas (Miraglia, "Homogeneous cell-and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204) . As utilizações de anticorpos marcados também incluem ensaios de ligação a recetor da superfície celular, ensaios de imunocaptura, ensaios imunossorventes com ligação a fluorescência (FLISA), clivagem por caspase (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6.372.907), apoptose (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) e ensaios de citotoxicidade. Pode ser utilizada tecnologia de ensaios fluorométricos em microvolumes para identificar a regulação negativa ou positiva de uma molécula que é orientada a superfície celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).
Os anticorpos marcados da invenção são úteis como biomarcadores de imagiologia e sondas pelos vários métodos e técnicas de imagiologia biomédica e molecular tais como: (i) RM (imagiologia por ressonância magnética); (ii) MicroCT (tomografia computadorizada); (iii) SPECT (tomografia computadorizada com emissão de fotão único); (iv) PET (tomografia com emissão de positrões) Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) bioluminescência; (vi) fluorescência; e (vii) ecografia. A imunocintigrafia é um procedimento de imagiologia em que anticorpos marcados com substâncias radioativas são administrados a um paciente animal ou humano e é obtida uma imagem de locais no corpo onde o anticorpo está localizado (documento US 6528624) . Os biomarcadores de imagiologia podem ser objetivamente medidos e avaliados como indicadores de processos biológicos normais, processos patogénicos, ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Os biomarcadores podem ser de vários tipos: o Tipo 0 são marcadores da história natural de uma doença e estão correlacionados longitudinalmente com índices clínicos conhecidos, por exemplo avaliação por RM de inflamação sinovial na artrite reumatoide; os marcadores do Tipo I capturam o efeito de uma intervenção de acordo com um mecanismo de ação, muito embora o mecanismo possa não estar associado a um resultado clínico; os marcadores do Tipo II funcionam como pontos finais substitutos onde a alteração, ou o sinal, do biomarcador prevê um benefício clínico para "validar" a resposta orientada, tal como a erosão óssea medida na artrite reumatoide por TAC. Os biomarcadores de imagiologia podem consequentemente proporcionar informação terapêutica farmacodinâmica (PD) cerca de: (i) expressão de uma proteína alvo, (ii) ligação de um produto terapêutico à proteína alvo, isto é, seletividade, e (iii) dados de eliminação e semivida farmacocinética. As vantagens dos biomarcadores de imagiologia in vivo relativamente aos biomarcadores laboratoriais incluem: tratamento não invasivo, avaliação quantificãvel da totalidade do corpo, dosagem e avaliações repetitivas, isto é, múltiplos pontos de tempo, e efeitos potencialmente transferíveis a partir de resultados pré-clínicos (animais pequenos) a clínicos (humanos). Para algumas aplicações, a bioimagiologia suplanta ou minimiza o número de experiências em animais em estudos pré-clínicos.
Os métodos de marcação de péptidos são bem conhecidos. Veja-se Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Carman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al. (1975) Chemical Modification of Proteins. Labora tory Techniques in Biochemistryr and Molecular Biology (T.S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., Nova Iorque; Lundblad, R.L. e Noyes, C.M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I e II, CRC Press, Nova Iorque; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin e Nova Iorque; e Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al. (2004) Chem. Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al. (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237. Péptidos e proteínas marcados com duas frações, um repórter fluorescente e um extintor em proximidade suficiente são submetidos a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Os grupos repórter são tipicamente corantes fluorescentes que são excitados pela luz a um determinado comprimento de onda e transferem energia para um grupo aceitador, ou extintor, com o desvio de Stokes adequado para emissão ao brilho máximo. Os corantes fluorescentes incluem moléculas com aromaticidade estendida, tais como fluoresceína e rodamina, e os seus derivados. 0 repórter fluorescente pode ser parcialmente ou significativamente extinto pela fração extintora num péptido intacto. Após a clivagem do péptido por uma peptidase ou protease, pode ser medido um aumento detetável da fluorescência (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolitic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34).
Os anticorpos marcados da invenção podem também ser utilizados como um agente de purificação por afinidade. Neste processo, o anticorpo marcado é imobilizado numa fase sólida tal como uma resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. 0 anticorpo imobilizado é colocado em contacto com uma amostra contendo o antigénio a purificar, e posteriormente o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra exceto o antigénio a purificar, que está ligado a variante polipeptídica imobilizada. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que irá libertar o antigénio da variante polipeptídica.
Os reagentes de marcação têm tipicamente uma funcionalidade reativa que pode reagir (i) diretamente com um tiol de cisteína de um anticorpo manipulado com cisternas para formar o anticorpo marcado, (ii) com um reagente ligante para formar um intermediário ligante-marcador, ou (iii) com um anticorpo ligante para formar o anticorpo marcado. A funcionalidade reativa dos reagentes de marcação inclui: maleimida, haloacetilo, éster succinimidílico de iodoacetamida (por exemplo NHS, N-hidroxissuccinimida), isotiocianato, cloreto de sulfonilo, 2,6 -diclorotriazinilo, ester de p0r1t0flu.o1rof0r1i.lo 0 fosforamidite, embora possam também ser utilizados outros grupos funcionais.
Um grupo funcional reativo exemplar é o éster de N-hidroxissuccinimidilo (NHS) de um grupo carboxilo substituinte de um marcador detetável, por exemplo biotina ou um corante fluorescente. 0 éster NHS do marcador pode ser preparado, isolado, purificado e/ou caracterizado, ou pode ser formado in situ e feito reagir com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Tipicamente, a forma carboxilo do marcador é ativada por reação com alguma combinação de um reagente de carbodiimida, por exemplo diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida, ou um reagente de urónio, por exemplo TSTU (tetrafluoroborato de
0- (N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametilurónio, HBTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-l-il)-Ν,Ν,Ν',N'- tetrametilurónio), ou HATU (hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-Ν,Ν,Ν',N!-tetrametilurónio), um ativador, tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), e N-hidroxissuccinimida para originar o éster NHS do marcador. Nalguns casos, o marcador e o anticorpo podem ser acoplados por ativação in situ do marcador e reação com o anticorpo para formar o conjugado marcador-anticorpo numa única etapa. Outros reagentes de ativação e de acoplamento incluem TBTU (hexafluorofosfato de 2-(IH-benzotriazo-l-il)- 1- 1,3,3-tetrametilurónio), TFFH (2-fluoro-hexafluorofosfato
de N,Ν',N",N"'-tetrametilurónio), PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidinofosfónio, EEDQ (2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-di-hidroquinolina) , DCC
(diciclohexilcarbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida), MSNT (1-(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol, e halogenetos de arilsulfonilo, por exemplo cloreto de triisopropilbenzenossulfonilo. Compostos péptido-Fab de ligação a albumina da invenção: 0 anticorpo da invenção pode ser fundido com uma proteína de ligação a albumina. A ligação plasma-proteína pode ser um meio eficaz para melhorar as propriedades farmacocinéticas de moléculas de vida curta. A albumina é a proteína mais abundante no plasma. Os péptidos de ligação a albumina sérica (ABP) podem alterar a farmacodinâmica de proteínas de domínios ativos fundidas, incluindo alteração da assimilação, penetração e difusão nos tecidos. Estes parâmetros farmacodinâmicos podem ser modulados por seleção específica da sequência adequada do péptido que liga a albumina sérica (documento US 20040001827). Foram identificados uma série de péptidos de ligação a albumina por rastreio de exibição em fagos (Dennis et al. (2002)
"Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; documento WO 01/45746). Os compostos da invenção incluem sequências de ABP ensinadas por: (i) Dennis et al. (2002) J
Biol Chem. 277:35035-35043 nos Quadros III e IV, página 35038; (ii) documento US 20040001827 em [0076] SEQ ID NOS: 9-22; e (iii) documento WO 01/45746 nas páginas 12-13. Os Péptidos de Ligação a Albumina (ABP)-Fab são manipulados por fusão de um péptido de ligação a albumina com, por exemplo, o terminal C da cadeia pesada de Fab numa razão estequiométrica de 1:1 (1 ABP/1 Fab). Foi mostrado que a associação destes ABP-Fab com albumina aumentou a semivida do anticorpo em mais de 25 vezes em coelhos e ratinhos. Os resíduos Cys reativos acima descritos podem como tal ser introduzidos nestes ABP-Fab e utilizados para conjugação específica do local com fãrmacos citotóxicos seguindo-se estudos in vivo em animais.
As sequências de péptidos de ligação a albumina exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, as sequências de aminoãcidos listadas nas SEQ ID NOS: 80-84. CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 80 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 81 QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 82 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 83 DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 84 Conjugados Anticorpo-Fármaco
Noutro aspeto, a invenção proporciona imunoconjugados, ou conjugados anticorpo-fármaco (ADC), compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, um fármaco, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos dos mesmos), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). São também descritos no presente documento métodos de utilização dos imunoconjugados. Num aspeto, os anti-STEAP-1 podem ser anticorpos covalentemente ligados a um agente citotóxico ou a um agente detetável conforme definido nas reivindicações. A utilização de conjugados anticorpo-fármaco para a administração local de agentes citotõxicos ou citostãticos, isto é, fãrmacos para matar ou inibir células tumorais no tratamento de cancro (Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; Patente U.S. 4,975,278) permite a administração orientada da fração de fármaco a tumores, e a acumulação intracelular nos mesmos, quando a administração sistémica destes agentes de fármaco não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais bem como as células tumorais destinadas a serem eliminadas (Baldwin et ai., (1986) Lancet pp. (15 de março de 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em
Monoclonal Antibodies ! 84: Biological And Clinical
Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). É desta forma consequentemente procurada a máxima eficácia com o mínimo de toxicidade. Foram relatados tanto anticorpos policlonais como anticorpos monoclonais como sendo úteis nestas estratégias (Rowland et ai., (1986)
Cancer Immunol. Immunother. , 21:183-87). Os fãrmacos utilizados nestes métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . As toxinas utilizadas em conjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tais como toxina diftérica, toxinas de plantas tais como ricina, toxinas de molécula pequena tais como geldanamicina (Mandler et al. (2000) Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581,- Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). As toxinas podem efetuar os seus efeitos citotóxicos e citostãticos através de mecanismos incluindo ligação a tubulina, ligação a ADN ou inibição de topoisomerase. Alguns fãrmacos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos quando conjugados com anticorpos grandes ou ligandos de recetores de proteínas. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetano, Biogen/Idec) é um conjugado anticorpo-radioisõtopo composto por um anticorpo monoclonal IgGl capa de ratinho dirigido contra o antigénio CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos e radioisótopo ^In ou ligado por um quelante ligante de tioureia (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7) : 766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63,-Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15) :3262-69) . Embora ZEVALIN tenha atividade contra linfoma não Hodgkin (NHL) de células B, a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado de anticorpo e fármaco composto por um anticorpo huCD33 ligado a caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mieloide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686,- Patentes US 4.970.198; 5.079.233; 5.585.089; 5.606.040; 5.693.762; 5.739.116; 5.767.285; 5.773.001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), um conjugado de anticorpo e fãrmaco composto pelo anticorpo huC242 ligado através do ligante de dissulfureto SPP à fração de fãrmaco maitansinoide, DM1, está a avançar para ensaios de Fase II para o tratamento de cancros que expressam CanAg, tais como do cólon, pancreãtico, gástrico e outros. 0 MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZL Biologies, Immunogen Inc.), um conjugado de anticorpo e fãrmaco composto pelo anticorpo monoclonal anti antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) ligado à fração de fãrmaco maitansinoide, DM1, está em desenvolvimento para o potencial tratamento de tumores da próstata. Os péptidos de auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (ΜΜΆΕ), análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados com anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y em carcinomas) e cAClO (específicos para CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7) :778-784) e estão em desenvolvimento terapêutico. São descritos no presente documento agentes quimioterapêuticos úteis na geração de imunoconjugados. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser utilizados incluem cadeia A da difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxina diftérica, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Veja-se, por exemplo, o documento WO 93/21232 publicado a 28 de outubro de 1S93. Estão disponíveis uma variedade de radionuclídeos para a produção de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem 131131in, 90y e 186^e_ 0 s conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como 3 -(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo HC1), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoí1)-hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazónio-benzoíl)etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos bis-activos de flúor (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, pode ser preparada uma imunotoxina de ricina conforme descrito em Vitetta et al. (1987) Science, 238:1098, 0 ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleõtidos com o anticorpo (documento WO94/11026). São também contemplados no presente documento conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, um tricoteceno e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade de toxina.
Maitansina e maitansinoides
Um anticorpo (comprimento completo ou fragmentos) pode ser conjugado com uma ou mais moléculas de maitansinoide.
Os maitansinoides são inibidores mitóticos que atuam por inibição da polimerização da tubulina. A maitansina foi pela primeira vez isolada a partir do arbusto da África oriental Maytenus serra ta (Patente U.S. N.° 3896111).
Subsequentemente, foi descoberto que determinados micróbios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (Patente U.S. N.° 4.151.042). O maitansinol sintético e derivados e análogos do mesmo são divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. N.°s 4.137.230; 4.248.S70; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533.
As frações de fãrmaco maitansinoide são frações de fãrmaco atrativas em conjugados de anticorpo e fãrmaco dado que são: (i) de preparação relativamente acessível por fermentação ou modificação química, derivatização de produtos de fermentação, suscetíveis de derivatização com grupos funcionais adequados para conjugação através dos ligantes não dissulfureto com anticorpos, (iii) estáveis no plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhas de células tumorais.
Os compostos de maitansina adequados para utilização como frações de fármaco maitansinoide são bem conhecidos na técnica, e podem ser isolados a partir de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos, produzidos utilizando técnicas de engenharia genética (veja-se Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973), ou maitansinol e análogos de maitansinol preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
As frações de fármaco maitansinoide exemplificativas incluem aquelas tendo um anel aromático modificado, tais como: C-19-descloro (documento US 4256746) (preparado por redução com hidreto de alumínio e lítio de ansamitocina P2) ; C-20-hidroxi (ou C-20-desmetilo) Ã/-C-19-descloro (Pat. US N.°s 4361650 e 4307016) (preparados por desmetilação utilizando Streptomyces ou Actinomyces ou descloração utilizando LAH); e C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-0C0R), Â/-descloro (Pat. U.S. N.° 4.294.757) (preparados por acilação utilizando cloretos de acilo), e os que têm modificações em outras posições
As frações de fármaco maitansinoide exemplares também incluem aquelas tendo modificações tais como: C-9-SH (documento US 4424219) (preparadas pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5) ; C-14- alcoximetil(desmetoxi/CH2OR) (documento US 4331598); C-14- hidroximetilo ou aciloximetilo (CH2OH ou CH2OAc) (documento US 4450254) (preparadas a partir de Nocardia); C-15- hidroxi/aciloxi (documento US 4.364.866) (preparadas pela conversão de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (Pat. US N.°s 4.313.946 e 4.315.929) (isoladas de Trewía nudiflora); C-18-N-desmetilo (Pat. US N.°s 4.362.663 e 4.322.348) (preparadas pela desmetilação de maitansinol por Streptomyces); e 4,5-desoxi (documento US 4371533) (preparadas pela redução com tricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
Frações de fármaco maitansinoide exemplares incluem: DM1; DM3; e DM4, tendo as estruturas:
em que a linha ondulada indica a união covalente do átomo de enxofre do fãrmaco a um ligante (L) de um conjugado de anticorpo e fármaco. Foi relatado HERCEPTIN® (trastuzumab) ligado por SMCC a DM1 (documento WO 2005/037992). Pode ser preparado um conjugado de anticorpo e fãrmaco da presente invenção de acordo com os procedimentos divulgados no presente documento.
Outros conjugados de anticorpo e fármaco maitansinoide exemplares têm as seguintes estruturas e abreviaturas, (em que Ab é anticorpo e p é de 1 a cerca de 8):
DM1
Os conjugados de anticorpo e fãrmaco exemplares onde DM1 está ligado através de um ligante BMPEO a um grupo tiol do anticorpo têm a estrutura e a abreviatura:
onde Ab é anticorpo; néO, lou2; e p é 1, 2, 3 ou 4.
Os imunoconjugados contendo maitansinoides, métodos para preparar os mesmos, e a sua utilização terapêutica, são divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. N.°s 5.208.020; 5.416.064; 6.441.163 e Patente Europeia EP 0 425 235 Bl.
Liu et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imunoconjugados compreendendo um maitansinoide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra cancro colorretal humano. 0 conjugado foi verificado como sendo altamente citotóxico para células de cancro do cólon em cultura, e mostrou atividade anti tumoral num ensaio de crescimento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que urn maitansinoide foi conjugado através de um ligante de dissulfureto ao anticorpo de ratinho A7 que liga a um antigénio em linhas celulares de cancro do cólon humano, ou a outro anticorpo monoclonal de ratinho TA.l que liga ao oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.l-maitansonoide foi testada in vitro na linha celular de cancro da mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 antigénios de superfície HER-2 por célula. 0 conjugado de fármaco alcançou um grau de citotoxicidade semelhante ao do fãrmaco maitansinoide livre, que poderia ser aumentado aumentando o número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticorpo. 0 conjugado A7-maitansinoide apresentou baixa citotoxicidade sistémica em ratinhos.
Os conjugados anticorpo anti-STEAP-l-maitansinoide são preparados por ligação química de um anticorpo a uma molécula de maitansinoide sem diminuição significativa da atividade biológica do anticorpo ou da molécula de maitansinoide. Veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N.° 5.208.020. Uma média de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticorpo mostrou eficácia no aumento da citotoxicidade de células alvo sem afetar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, embora seja esperado que inclusive uma única molécula de toxina/anticorpo aumente a citotoxicidade relativamente à utilização de anticorpo nu. Os maitansinoides são bem conhecidos na especialidade e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. São divulgados maitansinoides adequados, por exemplo, na Patente U.S. M.° 5.208.020 e nas outras patentes e publicações de não patente referidas acima no presente documento. Os maitansinoides preferidos são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou noutras posições da molécula de maitansinol, tais como vários ésteres de maitansinol.
Existem muitos grupos ligantes conhecidos na especialidade para a preparação de conjugados anticorpo- maitansinoide, incluindo, por exemplo, aqueles divulgados nas Patentes U.S. N.°s 5.208.020, 6.441.163, ou na Patente EP 0 425 235 Bl, Chari et al. , Cancer Research 52:127-131 (1992), e documento US 2005/0169933A1. Os conjugados anticorpo-maitansinoide compreendendo a componente ligante SMCC podem ser preparados conforme divulgado no Pedido de Patente U.S. N.° 11/141344, depositado a 31 de maio de 2005, "Antibody Drug Conjugates and Methods" Publicação N.° US 2005/0276812. Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos lãbeis a ácidos, grupos fotolábeis, grupos lábeis a peptidases ou grupos lábeis a esterases, conforme divulgado nas patentes identificadas acima. São descritos no presente documento e exemplificados grupos de ligação adicionais.
Podem ser preparados conjugados do anticorpo e maitansinoide utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo-HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tais como bis-(p-diazóniobenzoil)etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferidos incluem 3 -(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Carlsson et al, , Biochem. J. 173:723-737 (1978)) e 4 - (2 -piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) para proporcionar uma ligação dissulfureto. 0 ligante pode estar ligado à molécula de maitansinoide em várias posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, pode ser formada uma ligação éster por reação com um grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 tendo um grupo hidroxilo, na posição C-14 modificada com hidroximetilo, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxilo, e na posição C-20 tendo um grupo hidroxilo. Preferentemente, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou de um análogo de maitansinol.
Os anticorpos (comprimento completo ou fragmentos) podem ser conjugados com uma ou mais moléculas de maitansinoide. 0 agente citotóxico D pode ser um maitansinoide DM1. 0 ligante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em SPDP, SMCC, IT, SPDP e SPP.
Auristatinas e dolostatinas
Um anticorpo pode ser conjugado com dolastatinas ou análogos peptídicos de dolostatina e derivados, as auristatinas (Patentes US N.°s 5.635.483; 5.780.588). Foi mostrado que as dolastatinas e as auristatinas interferem com a dinâmica dos microtúbulos, a hidrólise de GTP e a divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e têm atividade anti cancro (documento US 5.663.149) e antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A fração de fármaco de dolastatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo através do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxilo) da fração de fármaco peptídico (documento WO 02/088172).
Formas de realização de auristatina exemplares incluem as frações de fármaco de monometilauristatina DE e DF ligadas ao terminal N, divulgadas em "Senter et al. , Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, mostrado a 28 de março de 2004.
Uma forma de realização de auristatina exemplar é MMAE (em que a linha ondulada indica a união covalente a urn ligante (L) de um conjugado de anticorpo e fãrmaco).
MMAE
Outra forma de realização exemplar de auristatina é MMAF, em que a linha ondulada indica a união covalente a um ligante (L) de um conjugado de anticorpo e fãrmaco (documento US 2005/0238649):
!
MMAF
Formas de realização exemplares adicionais compreendendo ΜΜΆΕ ou MMAF e vários componentes ligantes (descritos adicionalmente no presente documento) têm as seguintes estruturas e abreviaturas (em que Ab significa o anticorpo e p é de 1 a cerca de 8):
Tipicamente, as frações de fármaco à base de péptidos podem ser preparadas por formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoãcidos e/ou fragmentos peptídicos. Estas ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (veja-se E. Schroder e K. Lúbke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química dos péptidos. As frações de fármaco de auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos dos documentos: US 5.635.483; US 5.780.588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465;
Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; e Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784.
Caliqueamicina
Um anticorpo pode ser conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos da caliqueamicina é capaz de produzir quebras de ADN de cadeia dupla em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família da caliqueamicina, veja-se as patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas da
American Cyanamid Company). Os análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, γΐ-*-, α2-*-, α3-*-, N-acetil-γΐ-*-, PSAG e 0½ (Hinman et al. , Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al. , Cancer Research 58:2925-2928 (1998) e as patentes U.S. da American Cyanamid) mencionadas acima. Outro fármaco anti tumoral com o qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antifolato. Tanto a caliqueamicina como o QFA têm locais de ação intracelulares e não atravessam prontamente a membrana plasmãtica. Como tal, a assimilação celular destes agentes através de internalização mediada por anticorpos aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos.
Outros agentes citotóxicos
Outros agentes anti tumorais que podem ser conjugados com os anticorpos incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5 -fluorouracilo, a família de agentes conhecidos coletivamente como complexo LL-E33288 descritos nas patentes U.S. N.° 5.053.394, 5.770.710, bem como esperamicinas (patente U.S. N.° 5.877.296).
As toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser utilizados incluem cadeia A da difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxina diftérica, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaría officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja-se, por exemplo, o documento WO 93/21232 publicado a 28 de outubro de 1993. A presente invenção também contempla um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma ADN-endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; ADNase).
Para a destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Estão disponíveis uma variedade de isótopos radioativos para a produção de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem ^j-211 j 131 j 12 5 γ90 ggl86 ggl88 2^153 g-^212 p32
Pb^l2 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é utilizado para a deteção, pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigrãficos, por exemplo tc^m ou ll23# ou um marcador de spin para imagiologia por ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como imagiologia por ressonância magnética, rm) , tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, gadolínio, manganésio ou ferro.
Os radiomarcadores ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado de maneiras conhecidas. Por exemplo, o péptido pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoãcidos utilizando precursores de aminoãcidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez de hidrogénio. Podem ser ligados marcadores tais como tc^9m ou 1^23; Re186; j^e188 e jnlll através de um resíduo de cisteína no péptido. Pode ser ligado ítrio-90 através de um resíduo de lisina. Pode ser utilizado o método I0D0GEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.
Podem ser preparados conjugados do anticorpo e do agente citotõxico utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo HC1), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoíl)-hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazóniobenzoil)etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Por exemplo, pode ser uma imunotoxina de ricina preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietileno-triaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de um radionucleótido ao anticorpo. Veja-se o documento WO94/11026. 0 ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a libertação do fãrmaco citotóxico na célula. Por exemplo, pode ser utilizado um ligante lãbil a ácidos, um ligante sensível à peptidase, um ligante fotolábil, um ligante de dimetilo ou um ligante contendo dissulfureto (Chari et al. , Cancer Research 52:127-131 (1992); Patente U.S. N.0 5.208.020).
Os compostos contemplam ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB ((4-vinilsulfono)benzoato de succinimidilo) que estão disponíveis (por exemplo, da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., E.U.A). Veja-se as páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
Preparação de conjugados de anticorpo e fármaco:
Em conjugados de anticorpo e fãrmaco (ADC), um anticorpo (Ab) é conjugado com uma ou mais frações de fármaco (D) , por exemplo cerca de 1 a cerca de 20 frações de fármaco por anticorpo, através de um ligante (L). Numa forma de realização, o número de frações de fármaco (D) por anticorpo é desde cerca de 1 até cerca de 5, alternativamente, desde cerca de 2 até cerca de 6, alternativamente desde cerca de 3 até cerca de 4 frações de fármaco por anticorpo. Dado que o número de frações de fármaco por anticorpo é tipicamente um número médio de todos os conjugados numa população de um conjugado de fãrmaco e anticorpo, o número de frações de fãrmaco por anticorpo pode não ser um número inteiro. 0 ADC de fórmula I pode ser preparado por várias vias, empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos para os peritos na especialidade, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligante bivalente, para formar Ab-L, através de uma ligação covalente, seguida por reação com uma fração de fãrmaco D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma fração de fármaco com um reagente ligante bivalente, para formar D-L, através de uma ligação covalente, seguida por reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. São descritos no presente documento métodos adicionais para a preparação de ADC.
Ab - (L - D) p _> Fórmula I 0 ligante pode ser composto por um ou mais componentes ligantes. Componentes ligantes exemplares incluem 6-maleimidocaproílo ("MC"), maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonilo ("PAB"), N-Succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil-4 -(N-maleimido-metil)ciclohexano-l-carboxilato ("SMCC) e N-Succinimidil-(4-iodoacetil)aminobenzoato ("SIAB"). Numa forma de realização, o ligante é valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonilo ("vc-PAB"). São conhecidos componentes ligantes adicionais na técnica e alguns são descritos no presente documento.
Nalgumas formas de realização, o ligante pode compreender resíduos de aminoácido. Componentes ligantes de aminoácidos exemplares incluem um dipéptido, um tripéptido, a tetrapéptido ou um pentapéptido. Dipéptidos exemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Tripéptidos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly)· Os resíduos de aminoácido que constituem uma componente ligante de aminoácidos incluem os de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos não de ocorrência natural, tais como citrulina. Os componentes ligantes de aminoácidos podem ser desenhados e otimizados na sua seletividade para clivagem enzimãtica por enzimas particulares, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B, C e D, ou uma plasmina-protease. São mostradas estruturas de componentes ligantes exemplares abaixo (em que a linha ondulada indica locais de união covalente a outros componentes do ADC):
Componentes ligantes exemplares adicionais e abreviaturas incluem (em que o anticorpo (Ab) e o ligante estão reoresentados, ed é 1 a cerca de 8):
Val-cit
Os grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, mas não estão limitados a: (i) grupos amino N-terminais, (ii) grupos amino de cadeias laterais, por exemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadeias laterais, por exemplo cisterna, e (iv) grupos hidroxilo ou amino de açúcares onde o anticorpo está glicosilado. Os grupos amino, tiol e hidroxilo são nucleofílicos e são capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em frações ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e de benzilo tais como halogenoacetamidas; (iii) grupos aldeído, cetona, carboxilo e maleimido. Determinados anticorpos têm dissulfuretos inter-cadeia suscetíveis de redução, isto é, pontes de cisternas. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes por tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol) . Cada ponte de cisternas irá consequentemente formar, teoricamente, dois nucleofílicos de tiol reativos. Podem ser introduzidos grupos nucleofílicos adicionais nos anticorpos através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) que resulta na conversão de uma amina num tiol. Podem ser introduzidos grupos tiol reativos no anticorpo (ou fragmento do mesmo) por introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreendendo um ou mais resíduos de aminoãcido de cisteína não nativos).
Podem também ser produzidos conjugados de anticorpo e fármaco da invenção por modificação do anticorpo para introduzir frações eletrofílicas, que podem reagir com substituintes nucleofílicos no reagente ligante ou no fármaco. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo com reagentes oxidantes de periodato, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amino de reagentes ligantes ou frações de fármaco. Os resultantes grupos imina de bases de Schiff podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, por exemplo por reagentes de borohidreto para formar ligações amina estáveis. Numa forma de realização, a reação da fração hidrato de carbono de um anticorpo glicosilado com galactose-oxidase ou meta-periodato de sódio pode originar grupos carbonilo (aldeído e cetona) na proteína que podem reagir com grupos adequados no fármaco (Hermanson, Bioconj ugate Techniques) . Noutra forma de realização, proteínas contendo resíduos de serina ou de treonina N-terminais podem reagir com meta-periodato de sódio, resultando na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Este aldeído pode reagir com uma fração de fármaco ou um nucleofílico ligante.
Igualmente, grupos nucleofílicos numa fração de fármaco incluem, mas não estão limitados a: grupos amino, tiol, hidroxilo, hidrazida, oximo, hidrazina, tio-semicarbazona, hidrazinocarboxilato e aril-hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em frações ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e de benzilo tais como halogenoacetamidas; (iii) grupos aldeído, cetona, carboxilo e maleimido. São encontrados métodos para a conjugação de frações de ligante e fármaco a proteínas orientadas a células tais como anticorpos, imunoglobulinas ou fragmentos dos mesmos, por exemplo, nos documentos US 5.208.020; US 6.441.163; WO 2005037992; documento WO 2005081711; e WO 2006/034488.
Alternativamente, pode ser preparada uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo e o agente citotóxico, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese peptídica. O comprimento do ADN pode compreender regiões respetivas que codificam as duas porções do conjugado ou adjacentes entre si ou separadas por uma região que codifica um péptido ligante que não destrói as propriedades desejadas do conjugado. 0 anticorpo pode ser conjugado com um "recetor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-visamento de tumores em que o conjugado anticorpo-recetor é administrado ao paciente, seguido por remoção de conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de eliminação e posteriormente administração de um "ligando" (por exemplo, avidina) que está conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleótido). 0 agente citotóxico, D, pode ser uma auristatina de fórmula De ou Df
e em que R2 e R6 são cada um metilo, R3 e R4 são cada um isopropilo, R3 é sec-butilo, cada R3 é independentemente selecionado a partir de CH3, 0-CH3, OH e H; R^ é H; R13 é arilo; Z é -0-ou -NH-; R11 é H, alquilo C:L-C8 ou -(CH2)2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-0-CH3; e R33 é -C(R3)2-C(R3)2-arilo; e (d) varia de cerca de 1 a 8. São adicionalmente proporcionadas as seguintes características para qualquer dos imunoconjugados anteriores. Numa forma de realização, um imunoconjugado tem atividade de morte celular in vitro ou in vivo. Numa forma de realização, o ligante é ligado ao anticorpo através de um grupo tiol no anticorpo. Numa forma de realização, o ligante é clivável por uma protease. Numa forma de realização, o ligante compreende um dipéptido val-cit. Numa forma de realização, o ligante compreende uma unidade de p-aminobenzilo. Numa forma de realização, a unidade de p-aminobenzilo está disposta entre o fãrmaco e um local de clivagem por protease no ligante. Numa forma de realização, a unidade de p-aminobenzilo é p-aminobenziloxicarbonilo (PAB) . Numa forma de realização, o ligante compreende 6-maleimidocaproílo. Numa forma de realização, o 6-maleimidocaproílo está disposto entre o anticorpo e um local de clivagem por protease no ligante. As formas de realização acima podem ocorrer singularmente ou em qualquer combinação entre si.
Numa forma de realização, o fãrmaco é selecionado a partir de MMAE e MMAF. Numa forma de realização, o imunoconjuqado tem a fórmula
em que Ab é o anticorpo anti-STEAP-1 conforme definido nas reivindicações, S é um átomo de enxofre, e p varia de 1 a 4 .
Numa forma de realização, o imunoconjugado tem a fórmula
em que Ab é o anticorpo anti-STEAP-1 conforme definido nas reivindicações, S é um átomo de enxofre, e p varia de 1 a 4 . Métodos de imagiologia com anticorpos marcados:
Noutra forma de realização da invenção, anticorpos manipulados com cisteína podem ser marcados através do tiol da cisteína com radionuclídeos, corantes fluorescentes, frações de substrato que desencadeiam bioluminescência, frações de substrato que desencadeiam quimiluminescência, enzimas e outros marcadores de deteção para experiências de imagiologia com aplicações em diagnóstico, farmacodinâmicas e terapêuticas. Geralmente, o anticorpo marcado manipulado com cisteína, isto é, "biomarcador!! ou "sonda”, é administrado por injeção, perfusão ou ingestão oral a um organismo vivo, por exemplo, um ser humano, um roedor ou outro animal pequeno, um órgão perfundido ou uma amostra de tecido. A distribuição da sonda é detetada ao longo do tempo e é representada por uma imagem.
Artigos de Fabrico: É proporcionado um artigo de fabrico, ou "kit", contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. 0 artigo de fabrico compreende um recipiente e uma etiqueta ou bula de embalagem sobre, ou associado, ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, embalagem de blister, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. 0 recipiente contém uma composição de conjugado anticorpo-fãrmaco (ADC) que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um ADC. A etiqueta ou bula da embalagem indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de eleição, tal como cancro. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabrico pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode adicionalmente incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Composições farmacêuticas:
Num aspeto, ê proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo o conjugado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11-13 e um portador farmaceuticamente aceitável. Num aspeto, são proporcionadas as composições farmacêuticas para utilização num método de tratamento de um cancro da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga, ou do ovário, ou sarcoma de Ewing. 0 cancro da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga, e o cancro do ovário e o distúrbio proliferativo das células de Ewing podem ser uma metástase de um cancro primário da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga, ou do ovário, ou sarcoma de Ewing. Numa forma de realização, o cancro pode estar associado a uma expressão aumentada de STEAP-1 na superfície de uma célula. Ê proporcionado um método de inibição da proliferação celular, em que o método compreende a exposição de uma célula a qualquer dos imunoconjugados acima sob condições permissivas para a ligação do imunoconjugado a STEAP-1. A célula da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga ou do ovário ou de sarcoma de Ewing pode ser uma célula tumoral. A célula tumoral pode ser uma célula de tumor da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga ou do ovário ou uma célula de sarcoma de Ewing de um mamífero experimentando ou suspeito como sofrendo de um distúrbio proliferativo de células da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga ou de células de sarcoma de Ewing incluindo, mas não limitado a, uma metãstase de um tumor de cancro primário da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga ou de um tumor de sarcoma de Ewing. A célula da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga ou de sarcoma de Ewing pode ser um xenoenxerto. A exposição pode ocorrer in vitro ou in vivo. É também proporcionado um método de utilização do anticorpo anti-STEAP-1 da invenção para o ensaio de STEAP-1 solúvel em soro num mamífero experimentando um distúrbio proliferativo celular da próstata, do pulmão ou do cólon (ou metástase de uma incidência primária deste distúrbio), medição da progressão ou regressão clínica das doenças, ou avaliação da carga ou recaída tumorais.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A patente ou pedido de patente contêm pelo menos um desenho executado a cores. Serão proporcionadas cópias da publicação da patente ou do pedido de patente com desenho(s) a cores pelo Instituto após requerimento e pagamento das taxas necessárias. A Figura 1 ilustra a sequência de aminoácidos de STEAP-1 humana (SEQ ID NO: 1) alinhada com STEAP-1 de ratinho e de macaco cinamolgo (cyno) (SEQ ID NOs: 2 e 3, respetivamente). Os domínios extracelulares 1, 2 e 3 estão etiquetados e marcados por caixas sombreadas. Figuras 2A-2B: A Figura 2A ilustra a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpo anti-STEAP-1 de ratinho 120.545 alinhada com o anticorpo quimera (quimera 120) e anticorpo humanizado (enxerto 120) e alinhada com a sequência humana do subgrupo III. As CDR estão em caixas (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3) . As sequências flanqueando as CDR são as sequências estruturais (FR-L1 a FR-L4). As sequências estão numeradas de acordo com a numeração de Rabat. As CDR de Kabat, Chothia e de contacto estão indicadas perto das CDR em caixas. A Figura 2B ilustra a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de anticorpo anti-STEAP-1 de ratinho (120.545) alinhada com 0 anticorpo quimera (quimera 120) e o anticorpo humanizado (enxerto 120) e alinhada com a sequência capa 1 humana. As variantes humanizadas 24, 37, 48, 67 e 37/48, 67, 71 e 78 foram preparadas realizando as seguintes alterações de aminoácidos: A24V, V37I, V48M, F67I e L78F na cadeia pesada do anticorpo enxerto 120. As CDR estão em caixas. As sequências FR-H1, FR-H2, FR-H3 e FR-H4 flanqueiam as CDR (CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) . As sequências estão numeradas de acordo com a numeração de Kabat. As CDR de Kabat, Chothia e de contacto estão indicadas perto das CDR em caixas.
As Figuras 3A e 3B mostram sequências estruturais de consenso variáveis pesadas (VH) humanas aceitadoras exemplares para utilização na prática da presente invenção com identificadores de sequência conforme segue, onde as SEQ ID NO das FR estão enumeradas pela ordem FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4: ® estrutura de consenso de VH humana do subgrupo I "A” menos CDR de Kabat (SEQ ID NOs: 26, 27, 28, 29). •estruturas de consenso de VH humana do subgrupo 1 "B", "C" e "D" menos as regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOS: 30, 31, 28, 29; SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 29; e SEQ ID NOs: 30, 31, 33, 29). •estrutura de consenso de VH humana do subgrupo II "A" menos CDR de Kabat (SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 29). •estruturas de consenso de VH humana do subgrupo II "B!!, "C" e "D" menos as regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOs: 37, 38, 36, 29; SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 29; e SEQ ID NOs: 37, 38, 40, 29). • estrutura de consenso de VH humana do subgrupo III "A!! menos CDR de Kabat (SEQ ID NOs: 41, 42, 43, 29). •estruturas de consenso de VH humana do subgrupo III "B!!, "C" e "D" menos as regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOs : 44, 45, 43, 29; SEQ ID NOs : 44, 45, 46, 29; e SEQ ID NOs : 44, 45, 46, 29). • estrutura de VH humana aceitador 1 "A" menos CDR de Rabat (SEQ ID NOS: 48, 42, 49, 29). •estruturas de VH humana aceitadores "B" e "C" menos as regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOs: 44, 45, 49, 29; e SEQ ID NOs: 44, 45, 50, 29). • estrutura de VH humana aceitadora 2 "A" menos CDR de Rabat (SEQ ID NOs: 48, 42, 51, 29). • estrutura de VH humana aceitador 2 "B, " "C, " e "D"
menos as regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID NOs: 44, 45, 51, 29; SEQ ID NOs: 44, 45, 52, 29; e SEQ ID NOs: 44, 45, 53, 29) .
As Figuras 4A e 4B mostram sequências estruturais de consenso variáveis leves (VL) humanas aceitadoras exemplares para utilização na prática da presente invenção com identificadores de sequência conforme segue: •estrutura de consenso de VL humana capa do subgrupo I-1 (kv1-1): SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 57 • estrutura de consenso de VL humana capa do subgrupo I (κνί): SEQ ID NOs: 54, 58, 56, 57 •estrutura de consenso de VL humana capa do subgrupo II (κν2): SEQ ID NOs: 58, 59, 60, 57 • estrutura de consenso de VL humana capa do subgrupo III (kv3): SEQ ID NOs: 61, 62, 63, 57 • estrutura de consenso de VL humana capa do subgrupo IV (kv4): SEQ ID NOs: 64, 65, 66, 57. A Figura 5 ilustra alinhamentos de sequências da região Fc de IgG humana de sequência nativa, humlgGl (alotipo não A, SEQ ID NO: 85; e alotipo A, onde a sequência de aminoácidos SREEM no interior de SEQ ID NO: 85 é alterada para SRDEL), humIgG2 (SEQ ID NO: 86), humIgG3 (SEQ ID NO: 87) e humIgG4 (SEQ ID NO: 88) com as diferenças entre as sequências marcadas com asteriscos. Os números por cima das sequências representam o sistema de numeração EU. É também mostrada uma região constante capa exemplar.
As Figuras 6A-6D ilustram uma análise FACS normalizada para o nível de exibição de cada anticorpo ou variante em fagos. A Figura 6A mostra os desvios de FACS em células que expressam STEAP-1 (LB50) para quatro anticorpos exemplares. A Figura 6B mostra os desvios de FACS em células que não expressam STEAP-1 (S408) para vários anticorpos conforme indicado na figura e no Exemplo 1. As Figuras 6C e 6D são alinhamentos de desvios de FACS após normalização para níveis de exibição em fagos.
As Figuras 7A-7F ilustram graficamente análises FACS que mostram a ligação de anticorpos anti-STEAP-1 de ratinho, quimera e versão 24 humanizada a STEAP-1 humana expressa na superfície celular. As Figuras 7A-7C indicam que anti-STEAP-1 de ratinho 120, quimera 120 e humanizado 120v.24 ligam a STEAP-1 humana e de macaco cinamolgo, mas não a STEAP-1 de ratinho. As Figuras 7D-7F são gráficos de FACS que mostram a ligação de 120 de ratinho, quimera 120 e humanizado 120v.24 (clone 67) a STEAP-1 humana expressa na superfície celular. STEAP-1 exógena foi estavelmente expressa em células 293 (designadas células LB50) e em células PC3 (designadas células PS5.4) (Figuras 7D e 7E), e endogenamente expressa em células LNCaP BR (Figura 7F). Figuras 8A e 8B. A Figura 8A é um gráfico que mostra que a administração de anti-STEAP-1 de ratinho 120-MC-vc-PAB-MMAE a 3 mg/kg foi eficaz num modelo de xenoenxerto de tumor da próstata (células LNCaP-Ner). Veja-se o Exemplo 4. A Figura 8B é um gráfico que mostra que a administração de uma única dose de anticorpo anti-STEAP-1 humanizado 120v.24-MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg), 120v.24-MC-MMAF (6 mg/kg), 12Ov.24-MC-MMAF (12 mg/kg) e anti-STEAP-1 quimera 120-MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg) foi mostrada como sendo eficaz num modelo de tumor de xenoenxerto de células da próstata LNCaP. Veja-se o Exemplo 4. A Figura 9 é um gráfico que mostra que a administração de anticorpo anti-STEAP-1 quimera 120-MC-vc-PAB-MMAE (abreviado para anti-STEAP vcMMAE) a 3 mg/kg, ou quimera anti-STEAP-1 120-MC-MMAF (abreviado para anti-STEAP mcMMAF) a 6 mg/kg, foi mostrado como sendo eficaz num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID-bege castrados transplantados com células LNCaP. Veja-se o Exemplo 4. A Figura 10 é um gráfico que mostra que a administração de anticorpo quimera anti-STEAP-1 120-MC-vc-PAB-MMAE (abreviado como anti-STEAP vcMMAE (a 3 mg/kg) foi mostrado como sendo eficaz num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID bege machos (dependente de androgénios) transplantados com células LuCap77. Veja-se o Exemplo 4. A Figura 11 é um gráfico que mostra que a administração de anticorpo anti-STEAP-1 humanizado 120v,24-MC-vc-PAB-MMAE a 3 mg/kg, anticorpo anti-STEAP-1 humanizado 12Ov.24-MC-MMAF a 6 mg/kg e 12 mg/kg a ratinhos SCID-bege castrados transplantados com tumor da próstata LuCap35V foi mostrado como sendo eficaz relativamente aos controlos. Veja-se o Exemplo 4. A Figura 12 é um diagrama que ilustra STEAP-1 inserida numa membrana celular. A ligação de anticorpo 120 anti-STEAP-1 é dependente da conformação e não reconhece um epítopo linear de STEAP-1.
As Figuras 13A-13D mostram STEAP-1 expressa na superfície de células conforme detetado por imunohistoquímica. A Figura 13A mostra uma coloração imunohistoquímica de células 293 que expressam STEAP-1 exógena na superfície celular. A Figura 13B mostra uma coloração imunohistoquímica de células PC3 que expressam STEAP-1 exógena na superfície celular. A Figura 13C mostra uma coloração imunohistoquímica de células LNCaP que expressam STEAP-1 endógena na superfície celular. A Figura 13D mostra uma coloração imunohistoquímica de células LuCAP77 que expressam STEAP-1 endógena na superfície celular.
As Figuras 14Ά-14Ξ são gráficos que mostram a eficácia relativa de anticorpo anti-STEAP-1 12Qv.24-MCMMAF e anticorpo anti-STEAP-1 120v,24-MC-vc-PAB-MMAE para matar células que expressam STEAP-1 in vitro. As células PS5.4 (Figura 14A) são células PC3 transformadas com um vetor que codifica STEAP-1 tal que STEAP-1 é expressa na superfície celular. As células LB50 (Figura 14B) são células 293 transformadas com um vetor que codifica STEAP-1 tal que STEAP-1 é expressa na superfície celular. As células LNCaP (Figura 14C) expressam STEAP-1 endogenamente. "PC3 vec" (Figura 14D) e "293 vec" (Figura 14E) referem-se a células 293 e células PC3, respetivamente, transformadas com um vetor de controlo. A Figura 15 mostra ilustrações de conjugados de anticorpo e fãrmaco (ADC) anti-STEAP-1 manipulados com cisteína onde uma fração de fãrmaco está ligada a um grupo de cisteína manipulado em: cadeia leve (LC-ADC); cadeia pesada (HC-ADC); e região Fc (Fc-ADC). A Figura 16 mostra as etapas de: (i) redução de adutos de dissulfureto de cisteína e dissulfetos inter-cadeia e intra-cadeia num anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína (MabTio) com o agente redutor TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina) ; (ii) oxidação parcial, isto é, reoxidação para reformar dissulfuretos inter-cadeia e intra-cadeia, com dhAA (ácido desidroascórbico); e (iii) conjugação do anticorpo reoxidado com um intermediário fármaco-ligante para formar um conjugado de fãrmaco e anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína (ADC).
As Figuras 17A-C mostram os locais de substituições de aminoácidos realizadas para gerar anticorpos anti-STEAP-1 manipulados com cisteína (tio-mAb). A Figura 17A mostra a variante V205C de tio-LC com as correspondentes numeração sequencial e numeração normalizada de acordo com o sistema de Kabat. A Figura 17B mostra a variante A118C de tio-HC com as correspondentes numeração sequencial e numeração normalizada de acordo com o sistema EU. A Figura 17C mostra a variante S400C de tio-Fc com as correspondentes numeração sequencial e numeração normalizada de acordo com o sistema EU.
As Figuras 18A-F ilustram análises FACS que mostram que os conjugados de tio-anticorpo e fãrmaco (TDC) anti-STEAP-1 retêm a capacidade de ligar a STEAP-1 expressa na superfície celular. As Figuras 18A-18C são gráficos de FACS que mostram a ligação dos TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (LCV205C) (abreviado para huSteapl TDC (L205C) vcE e tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA 11SC) (abreviado como huSteapl TDC (HCA 118C) vcE) a STEAP-1 humana expressa na superfície celular. A STEAP-1 exógena foi expressa estavelmente em células 293 (designadas células LB50) e células PC3 (designadas células PS5.4) (Figuras ISA e 18B), e expressa endogenamente em células LNCaP BR (Figura 18C) . As Figuras 18D, 18E e 18F são alinhamentos dos desvios de FACS mostrados nas Figuras 7A, 7B e 7C, respetivamente.
As Figuras 19A-C mostram a eficácia relativa dos conjugados de tio-anticorpo e fármaco (TDC) anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (LCV205C) (abreviado como huSteapl TDC (L205C) vcE) e tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA 118C) (abreviado como huSteapl TDC (HCA118C) vcE) para matar células que expressam STEAP-1 in vitro. As células LB50 (Figura 19A) são células 293 transformadas com um vetor que codifica STEAP-1 tal que a STEAP-1 é expressa na superfície celular. As células PS5.4 (Figura 19B) são células PC3 transformadas com um vetor que codifica STEAP-1 tal que a STEAP-1 é expressa na superfície celular. As células LNCaP (Figura 19C) expressam STEAP-1 endogenamente. A Figura 20 ê um gráfico que mostra que a administração de TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA 118C) (abreviado como hu Steapl HC TDC vcE) a 3 mg/kg foi mostrada como sendo eficaz relativamente a controlos num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID-bege machos (dependente de androgénios) transplantados com células LNCaP. Veja-se o Exemplo 8. A Figura 21 é um gráfico que mostra que a administração de TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA118C) (abreviado para hu Steapl HC TDC vcE) a 3 mg/kg, ou tio-humano 120-MC-MMAF (HCA118C) (abreviado para hu Steapl HC TDC mcF) a 1, 3 ou 6 mg/kg, foi mostrada como sendo eficaz relativamente a controlos num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID-bege machos (dependente de androgénios) transplantados com células LNCaP. Veja-se o Exemplo 8. A Figura 22 é um gráfico que mostra que a administração de TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA118C) (abreviado para hu Steapl HC TDC vcE) a 3 mg/kg, ou tio-humano 120-MC-MMAF (HCA125C) (abreviado para hu Steapl HC TDC mcF) a 3 ou 6 mg/kg, foi mostrada como sendo eficaz relativamente a controlos num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID-bege castrados transplantados com tumor da próstata LuCaP 35V. Veja-se o Exemplo 8. A Figura 23 mostra os locais de substituições de aminoácidos realizadas para gerar o anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína (tio-mAb) designado "Simmons IV" ou simplesmente "SGIV," A sequência de aminoácidos da cadeia leve de SGIV (SEQ ID NO: 90) é mostrada em alinhamento com a cadeia leve de anticorpo mu 120 (SEQ ID NO: 5) e anticorpo 120.v24 (SEQ ID NO: 91) . A variante tio-LC de SGIV com as correspondentes numeração sequencial e numeração normalizada de acordo com o sistema de Kabat é mostrada alinhada com o anticorpo parental mu 120 bem como a variante tio-LC de 120.v24 com as correspondentes numeração sequencial e numeração normalizada de acordo com o sistema de Kabat. As CDR estão em caixas (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3). As sequências que flanqueiam as CDR são as sequências estrutural (FR-L1 a FR-L4). As sequências estão numeradas de acordo com a numeração de Kabat. As CDR de Kabat, Chothia e de contacto estão indicadas perto das CDR em caixas. Veja-se o Exemplo 9. A Figura 24 mostra os locais de substituições de aminoãcidos estruturais realizadas para gerar várias variantes de anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína (tio-mAb) dos anticorpos SGIV e 120v.24, A sequência de aminoãcidos da cadeia leve de SGIV é mostrada com a numeração normalizada de acordo com o sistema de Kabat, em alinhamento com as variantes LS.VLVH1 (SEQ ID NO: 92); LS.VLVH2 (SEQ ID NO: 93); LS. Q (SEQ ID NO: 94); e LS. CHI (SEQ ID NO: 95). A sequência de aminoãcidos da cadeia leve de 120.v24 com numeração normalizada de acordo com o sistema de Kabat é mostrada em alinhamento com as variantes ED. FW1 (SEQ ID NO: 96); ED.FW2 (SEQ ID NO: 97); ED. FW3 (SEQ ID NO: 98); ED.all (SEQ ID NO: 99); ED. Pro (SEQ ID NO: 100); e ED.pl (SEQ ID NO: 101) . As CDR estão em caixas. As sequências estão numeradas de acordo com a numeração de Kabat. Veja-se o Exemplo 9. A Figura 25 mostra gráficos de Scatchard de ligação do anticorpo a STEAP-1 expressa na superfície de células LNCaP.BR. As amostras foram medidas por duplicado utilizando o anticorpo 120.v24 (Figuras 25(A)-(D)) e a variante SGIV (Figuras 25(E)-(H)). Veja-se o Exemplo 9. A Figura 26 mostra gráficos de Scatchard de ligação do anticorpo a STEAP-1 expressa na superfície de células 293.LB50. As amostras foram medidas por duplicado utilizando o anticorpo 120.v24 (Figuras 26(A)-(D)) e a variante de SGIV (Figuras 26(E)-(H)). Veja-se o Exemplo 9 . A Figura 27 é um quadro que compara as afinidades médias de ligação, conforme medido por análise de Scatchard, para os anticorpos mu 1789, mu 120, quimera Fc, 120.v24 humanizado, tio-120.v24 e tio-SGIV em células PC-3-PS5.4, 293-LB50 e LNCaP-BR, bem como em células 293 que expressam transitoriamente STEAP-1. Veja-se o Exemplo 9. A Figura 28 representa uma análise FACS que mostra os desvios de FACS em células estavelmente transfetadas com STEAP-1 (293 STEAP-1 LB48, 293 STEAP-1 LB50 e 293 STEAP-LB53) com amostras de anticorpo SGIV e 120.v24. Veja-se o Exemplo 9. A Figura 29 mostra o título de anticorpo observado em diferentes colheitas de células que produzem anticorpo SGIV ou 120.V24.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO São proporcionados anticorpos conforme definido nas reivindicações que ligam a STEAP-1. São adicionalmente proporcionados imunoconjugados compreendendo anticorpos anti-STEAP-1. Os anticorpos e imunoconjugados da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de distúrbios associados à expressão alterada, por exemplo, expressão aumentada, de STEAP-1. Os anticorpos ou os imunoconjugados da invenção podem ser úteis para o diagnóstico ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular, tal como um tumor ou um cancro. Em determinadas formas de realização, a STEAP-1 é expressa em tecido tumoral ou de cancro da próstata, pulmão ou cólon. Em determinadas formas de realização, os anticorpos ou os imunoconjugados da invenção são úteis para a deteção de STEAP-1, por exemplo, STEAP-1 expressa na superfície celular. Em determinadas formas de realização, os anticorpos ou os imunoconjugados da invenção são úteis para a deteção de expressão de STEAP-l na superfície de células normais e/ou tumorais ou cancerosas de tecido da próstata, pulmão ou cólon. São proporcionados polinucleótidos que codificam anticorpos anti-STEAP-l. São proporcionados vetores compreendendo polinucleótidos que codificam anticorpos anti-STEAP-l, e células hospedeiras compreendendo tais vetores. São também proporcionadas composições, incluindo formulações farmacêuticas, compreendendo qualquer um ou mais dos polinucleótidos, anticorpos anti-STEAP-l ou imunoconjugados da invenção. São proporcionados métodos de tratamento de um distúrbio proliferativa celular, incluindo, mas não limitados a, tumor ou cancro, com um anticorpo, um conjugado de fãrmaco e anticorpo ou um imunoconjugado anti-STEAP-l, pela presente divulgação. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, tratamento de um tumor ou cancro na próstata, pulmão ou cólon de um mamífero. São proporcionados métodos de deteção de expressão de STEAP-l numa célula de tecido utilizando um anticorpo, um conjugado de fãrmaco e anticorpo ou um imunoconjugado anti-STEAP-l, pela presente divulgação. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, deteção de expressão de STEAP-l sobre, como um exemplo não limitante, uma célula normal, uma célula tumoral ou uma célula de cancro da próstata, do pulmão ou do cólon. Técnicas Gerais
As técnicas e procedimentos descritos ou referidos no presente documento são genericamente bem entendidos e comumente empregues utilizando metodologia convencional por peritos na especialidade, tais como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M.
Ausubel, et al. eds., (2003)); a série Methods in
Enzymology (Academic Press, Inc.) : Per 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A
Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Olygonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Proceedings (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M, Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammal Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polimerase Chain
Reaction, (Mullis et al. , eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies; A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000) ; Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993). DEFINIÇÕES Ξ ABREVIATURAS Def iniçoes
Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com as utilizações em investigação, diagnósticas ou terapêuticas para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteáceos ou não proteáceos. Nalgumas formas de realização, um anticorpo é purificado (1) até mais de 95Ê em peso do anticorpo conforme determinado por, por exemplo, o método de Lowry, e nalgumas formas de realização, até mais de 9 9Ê em peso; (2) num grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por utilização de, por exemplo, um sequenciador de taça rotativa, ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando, por exemplo, coloração com azul de Coomassie ou com prata. 0 anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no interior de células recombinantes dado que pelo menos uma componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Vulgarmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é separada de pelo menos uma outra molécula de ácido nucleico com a qual está vulgarmente associada, por exemplo, no seu ambiente natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada inclui adicionalmente uma molécula de ácido nucleico contida em células que expressam vulgarmente a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomicamente ou numa localização cromossómica que é diferente da sua localização cromossómica natural. "Purificado" significa que uma molécula está presente numa amostra numa concentração de pelo menos 95Ê em peso, ou pelo menos 98Ê em peso da amostra na qual está contida. A expressão "substancialmente semelhante" ou "substancialmente igual", conforme utilizado no presente documento, denota um grau suficientemente elevado de semelhança entre dois valores numéricos (por exemplo, um associado a um anticorpo da invenção e o outro associado a um anticorpo de referência/comparador), tal que um perito na especialidade considere a diferença entre os dois valores como tendo pouco ou nenhum significado biológico e/ou estatístico no contexto da característica biológica medida pelos referidos valores (por exemplo, valores de Kd). A diferença entre os ditos dois valores é, por exemplo, inferior a cerca de 50Ê, inferior a cerca de 40Ê, inferior a cerca de 3 0Ê, inferior a cerca de 2 0Ê e/ou inferior a cerca de 10Ê em função do valor de referência/comparador. A frase "substancialmente reduzido" ou "substancialmente diferente", conforme utilizado no presente documento, denota um grau suficientemente elevado de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado a uma molécula e o outro associado a uma molécula de referência/comparadora) de modo que um perito na especialidade considere a diferença entre os dois valores como sendo estatisticamente significativa no contexto da característica biológica medida pelos ditos valores (por exemplo, valores de Kd) . A diferença entre os ditos dois valores é, por exemplo, superior a cerca de 10Ê, superior a cerca de 20Ê, superior a cerca de 30Ê, superior a cerca de 40Ê e/ou superior a cerca de 50Ê em função do valor para a molécula de referência/comparadora. 0 termo "vetor", conforme utilizado no presente documento, destina-se a referir uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um ADN circular de cadeia dupla no qual podem ser ligados segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vetor é um vetor de fago. Outro tipo de vetor é um vetor virai, em que podem ser ligados segmentos de ADN adicionais ao genoma virai. Determinados vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissómicos de mamífero). Podem ser integrados outros vetores (por exemplo, vetores não epissómicos de mamífero) no genoma de uma célula hospedeira por introdução na célula hospedeira, e são como tal replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Adicionalmente, determinados vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos no presente documento como "vetores de expressão recombinantes" ou simplesmente, "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão com utilidade em técnicas de ADN recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente memória descritiva, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados indistintamente dado que o plasmídeo é a forma mais vulgarmente utilizada de vetor. "Polinucleõtido" ou "ácido nucleico", conforme utilizado indistintamente no presente documento, refere-se a polímeros de nucleótidos de qualquer comprimento, e inclui ADN e ARN. Os nucleótidos podem ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos ou bases modificados e/ou análogos dos mesmos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado num polímero por ADN ou ARN polimerase ou por uma reação sintética. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e análogos dos mesmos. Se presente, a modificação na estrutura do nucleõtido pode ser conferida antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleótido pode compreender modificação(ões) realizada (s) após a síntese, tal como conjugação com um marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "capas", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleótido tais como, por exemplo, aqueles com ligações sem carga (por exemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações com carga (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), contendo frações pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos de sinal, pli-L-lisina, etc.), com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes, etc.), contendo alquilantes, com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleótidos(s). Adicionalmente, qualquer dos grupos hidroxilo vulgarmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protetores padrão, ou ativado para preparar ligações adicionais a nucleõtidos adicionais, ou pode ser conjugado a suportes sólidos ou semissólidos. 0 terminal OH a 5' e a 3' pode ser fosforilado ou substituído por aminas ou frações de grupos de capa orgânicos de 1 a 20 átomos de carbono. Podem também ser derivatizados outros hidroxilos com grupos protetores padrão. Os polinucleótidos podem também conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na especialidade, incluindo, por exemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil-, 2'-fluoro-ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcares carbocíclicos, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos, e análogos de nucleõsidos básicos tais como metilribósido. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos ligantes alternativos. Estes grupos ligantes alternativos incluem, mas não estão limitados a, formas de realização em que fosfato é substituído por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO ou CH2 (!! f ormacetal") , etn que cada R ou R! é independentemente Η ou alquilo (1-20 C) substituído ou não substituído, opcionalmente contendo uma ligação éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo ou aralquilo. Nem todas as ligações num polinucleótido necessitam ser idênticas. A descrição anterior aplica-se a todos os polinucleótidos referidos no presente documento, incluindo ARN e ADN. "Oligonucleotide", conforme utilizado no presente documento, refere-se genericamente a polinucleótidos curtos, geralmente de cadeia simples, geralmente sintéticos, que são geralmente, mas não necessariamente, inferiores a cerca de 200 nucleótidos de comprimento. Os termos "oligonucleótido" e "polinucleótido" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para os polinucleótidos é igualmente e inteiramente aplicável a oligonucleótidos. "Percentagem (Ê) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação a uma sequência polipeptídica de referência é definida como a percentagem de resíduos de aminoãcido numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoãcido na sequência polipeptídica de referência, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para obter a percentagem máxima de identidade de sequências, e não considerando quaisquer substituições conservatives como parte da identidade de sequências. Pode ser obtido alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequências de aminoácidos de várias maneiras se encontram dentro da perícia na especialidade, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao público tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar os parâmetros adequados para o alinhamento das sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter o alinhamento máximo ao longo do comprimento completo das sequências em comparação. Para os propósitos no presente documento, contudo, os valores da Ê de identidade de sequências de aminoãcidos são gerados utilizando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. 0 programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 é da autoria da Genentech, Inc., e o código-fonte foi mostrado com documentação para o utilizador na Oficina de Direitos de Autor dos E.U.A., Washington D.C., 20559, onde está registado com o Número de Registo U.S. N.° TXU51Q0S7. O programa ALIGN-2 está disponível ao público a partir da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações onde o ALIGN-2 é empregue para comparações de sequência de aminoãcidos, a Ê de identidade de sequências de aminoãcidos de uma determinada sequência de aminoãcidos A relativamente a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoãcidos B (que pode alternativamente ser expresso como uma determinada sequência de aminoãcidos A que tem ou compreende uma determinada Ê de identidade de sequências de aminoãcidos relativamente a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoãcidos B) é calculada conforme segue:
100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos de aminoãcido pontuados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoãcido em B. Será apreciado que quando o comprimento da sequência de aminoãcidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoãcidos B, a Ê de identidade de sequências de aminoácidos de A relativamente a B não será igual à Ê de identidade de sequências de aminoácidos de B relativamente a A. A menos que especificamente indicado em contrário, todos os valores e Ê de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente documento são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior utilizando o programa de computador ALIGN-2. 0 termo "STEAP-1", conforme utilizado no presente documento, refere-se a qualquer STEAP-1 nativa a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo seres humanos, macaco cinamolgo (cyno)) e roedores (por exemplo, ratinhos e ratos), a menos que indicado em contrário. 0 termo abrange STEAP-1 de "comprimento completo", não processada, bem como qualquer forma de STEAP-1 que resulte a partir de processamento na célula. 0 termo também abrange variantes de ocorrência natural de STEAP-1, por exemplo, variantes de excisão-reparação, variantes alélicas e isoformas. A sequência de aminoácidos de STEAP-1 humana está representada na Figura 1 (SEQ ID NO: 1) . Numa forma de realização, a STEAP-1 é expressa na superfície celular, tal como na superfície de uma célula normal da próstata, pulmão ou cólon, e tem expressão aumentada em células cancerígenas da próstata, pulmão ou cólon ou metástases destas células cancerígenas. A Figura 1 também representa a sequência de aminoácidos de STEAP-1 de ratinho e de macaco cinamolgo (SEQ ID NOs: 2 e 3, respetivamente). "Anticorpos" (Ab) e "imunoglobulinas" (Ig) são glicoproteínas tendo características estruturais semelhantes. Enquanto os anticorpos exibem especificidade de ligação para um antigénio específico, as imunoglobulinas incluem tanto anticorpos como outras moléculas semelhantes a anticorpos que geralmente não têm especificidade para um antigénio. Os polipéptidos deste último tipo são, por exemplo, produzidos em níveis baixos pelo sistema linfático e em níveis aumentados por mielomas.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são utilizados indistintamente no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonals (por exemplo, anticorpos monoclonais de comprimento completo ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos contanto que exibam a atividade biológica desejada) e podem também incluir determinados fragmentos de anticorpo (conforme descrito no presente documento em maior detalhe), Um anticorpo pode ser quimérico, humano, humanizado e/ou maturado por afinidade.
As expressões "anticorpo anti-STEAP-1" ou "um anticorpo que liga a STEAP-1" referem-se a um anticorpo que é capaz de ligar a STEAP-1 com suficiente afinidade tal que o anticorpo seja útil como agente de diagnóstico e/ou terapêutico no visamento de STEAP-1. Preferentemente, a extensão de ligação de um anticorpo anti-STEAP-1 a uma proteína não STEAP-1 não relacionada é inferior a cerca de 10Ê da ligação do anticorpo a STEAP-1 conforme medida, por exemplo, por um ensaio radioimunológico (RIA). Em determinadas formas de realização, um anticorpo que liga a STEAP-1 tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM ou ^ 0,1 nM. Em determinadas formas de realização, um anticorpo anti-STEAP-1 liga a um epítopo de STEAP-1 que é conservado entre as STEAP-1 de diferentes espécies. A "região variável" ou o "domínio variável" de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. 0 domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como "VH". 0 domínio variável da cadeia leve pode ser referido como "VL". Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os locais de ligação ao antigénio. 0 termo "variável" refere-se ao facto de que determinadas frações dos domínios variáveis diferem extensamente na sequência entre anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular pelo seu antigénio particular. Contudo, a variabilidade não está uniformemente distribuída por todos os domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou regiões hipervariáveis (HVR) nos domínios variáveis tanto da cadeia leve como de cadeia pesada. As frações mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas as regiões estruturais (FR) . Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada um quatro regiões FR, adotando largamente uma configuração em lâmina beta, ligada por três CDR, que formam ansas que ligam, e nalguns casos fazem parte da estrutura da lâmina beta. As CDR em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas regiões FR e, com as CDR da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio dos anticorpos (veja-se Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpos.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa (k) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoãcidos dos seus domínios constantes.
Dependendo das sequências de aminoãcidos dos domínios constantes das suas cadeias pesadas, os anticorpos (imunoglobulinas) podem ser atribuídos a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados α, δ, ε, yep, respetivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e estão descritas genericamente em, por exemplo, Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4a ed. (2000). Um anticorpo pode fazer parte de uma molécula de fusão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou péptidos.
As expressões "anticorpo de comprimento completo", "anticorpo intacto" e "anticorpo completo" são utilizadas no presente documento indistintamente para referir um anticorpo na sua forma substancialmente Intacta, não fragmentos de anticorpo conforme definido abaixo. As expressões referem-se particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm a região Fc. "Fragmentos de anticorpo" compreendem somente uma fração de um anticorpo intacto, em que a fração retém pelo menos uma, e tantas como a maioria ou a totalidade, das funções normalmente associadas a essa fração quando presente num anticorpo intacto. Numa forma de realização, um fragmento de anticorpo compreende um local de ligação ao antigénio do anticorpo intacto e consequentemente retém a capacidade de ligar a antigénio. Noutra forma de realização, um fragmento de anticorpo, por exemplo um que compreenda a região Fc, retém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas à região Fc quando presente num anticorpo intacto, tais como ligação a FcRn, modulação da semivida do anticorpo, a função de ADCC e ligação do complemento. Numa forma de realização, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma semivida in vivo substancialmente semelhante a um anticorpo intacto. Por exemplo, um tal fragmento de anticorpo pode compreender um braço de ligação ao antigénio ligado a uma sequência de Fc capaz de conferir estabilidade in vivo ao fragmento. A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao antigénio, e um fragmento residual "Fc'!, cujo nome reflete a sua capacidade para cristalizar facilmente. 0 tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que tem dois locais de combinação com antigénio e é ainda capaz de reticular antigénios. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de ligação ao antigénio completo. Numa forma de realização, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste num dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação não covalente forte. Numa espécie de Fv de cadeia única (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem estar covalentemente ligados por um ligante peptídico flexível tal que as cadeias, leve e pesada, possam associar-se numa estrutura "dimérica" análoga à das espécies de Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDR de cada domínio variável interatuam para definir um local de ligação ao antigénio na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDR conferem ao anticorpo especificidade de ligação para com o antigénio. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar ao antigénio, embora com uma menor afinidade do que o local de ligação completo. 0 fragmento Fab contém os domínios variáveis das cadeias pesada e leve e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab1 diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxi do domínio da cadeia pesada CHI incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente documento para Fab! em que o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes possui(em) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 eram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre si. São também conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo.
Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipéptido scFv compreende adicionalmente um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antigénio. Para uma revisão sobre scFv veja-se Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994). 0 termo "diacorpos" refere-se a fragmentos pequenos de anticorpos com dois locais de ligação a antigénio, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Utilizando um ligante que seja demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigénio. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, nos documentos EP 404,097; W093/1161; Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993) . São também descritos "triacorpos" e "tetracorpos" em Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134. A expressão "anticorpo monoclonal" conforme utilizado no presente documento refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações, por exemplo, mutações de ocorrência natural, que possam estar presentes em quantidades mínimas. Consequentemente, o adjetivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos. Em determinadas formas de realização, este anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo compreendendo uma sequência polipeptídica que liga a um alvo, em que a sequência polipeptídica de ligação ao alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência polipeptídica de ligação ao alvo a partir de uma pluralidade de sequências polipeptídicas. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único a partir de uma pluralidade de clones, tal como um conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos ou clones de ADN recombinante. Deve ser entendido que uma sequência de ligação ao alvo selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade para com o alvo, para humanizar a sequência de ligação ao alvo, para melhorar a sua produção na cultura celular, para reduzir a sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo compreendendo a sequência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal da presente invenção. Em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpos monoclonais é dirigido contra um único determinante num antigénio. Para além da sua especificidade, as preparações de anticorpos monoclonais são vantajosas na medida em que tipicamente não estão contaminadas por outras imunoglobulinas. 0 adjetivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados através de uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método do hibridoma (por exemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975);
Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al, , em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N.° 4.816.567), tecnologias de exibição em fagos (veja-se, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et. al. , J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou semelhantes a humanos em animais que têm partes ou a totalidade dos loci da imunoglobulina humana ou genes que codificam sequências de imunoglobulina humana (veja-se, por exemplo, os documentos W098/24893; WO96/34096; W096/33735; WO91/10741; JakobovitS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); JakobovitS et al. , Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al. , Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes U.S. N. 0 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al. , Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) e Lonberg e Huszar, Intern. Rev.
Immunol. 13: 65-93 (1995).
Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos” em que uma fração da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse e anticorpos, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N.° 4.816.567; e Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)) .
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de ratinho) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada a partir de imunoglobulina não humana. Numa concretização, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo recetor) em que resíduos de uma região hipervariãvel do recetor estão substituídos por resíduos de uma região hipervariãvel de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como de ratinho, rato, coelho ou primata não humano, tendo a especificidade, afinidade e/ou capacidades desejadas. Nalguns casos, resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana estão substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram no anticorpo recetor nem no anticorpo dador. Estas modificações podem ser realizadas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as ansas hipervariãveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma fração de uma região constante de imunoglobulina (Fc) , tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, veja-se Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Veja-se também os seguintes artigos de revisão e referências citadas nos mesmos: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma &amp; Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoãcidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou foi preparado utilizando qualquer das técnicas para a produção de anticorpos humanos conforme divulgado no presente documento. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antigénio não humanos.
As expressões "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando utilizadas no presente documento referem-se a regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam voltas estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três na VH (Hl, H2, H3) , e três na VL (LI, L2, L3) . Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis regiões hipervariáveis, e H3 em particular é acreditada como desempenhando um papel único ao conferir especificidade fina aos anticorpos. Xu et al. (2000) Immunity 13:37-45; Johnson e Wu (2003) in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ). De facto, anticorpos camelídeos de ocorrência natural consistindo somente numa cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve. Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448; Sheriff et al. (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736.
Encontram-se em utilização e são abrangidas no presente documento várias delineações de regiões hipervariáveis. As Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) de Kabat são baseadas na variabilidade de sequências e são as mais comumente utilizadas (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se em vez disso à localização das ansas estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). As regiões hipervariáveis de AbM representam um compromisso entre as CDR de Kabat e as ansas estruturais de Chothia, e são utilizadas pelo software de modelação de AbM da Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de "contacto" são baseadas numa análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são mostrados abaixo.
Ansa Kabat AbM Chothia Contacto LI L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeração de
Kabat)
Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeração de
Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H1Q2 H96-H101 H93-H101
As regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis prolongadas" conforme segue: 24-36 ou 24-34 (Ll) , 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 ou 26-35A (Hl), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável estão numerados de acordo com Kabat et ai., supra, para cada uma destas definições. As regiões hipervariáveis HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 dos anticorpos anti-STEAP-1 humanizados 120v.24 da invenção são H26-H35A, H49-H6 e H95-H102 utilizando a numeração de Kabat. As regiões hipervariáveis HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 dos anticorpos anti-STEP-1 humanizados 12Qv.24 da invenção são L24-34, L50-56 e L89-97 utilizando a numeração de Kabat. Conforme utilizado no presente documento, os termos "HVR" e "CDR" são utilizados indistintamente.
Os resíduos "estruturais" ou "FR" são os resíduos do domínio variável para além dos resíduos da região hipervariável conforme definido no presente documento.
As expressões "numeração de resíduos do domínio variável como em Kabat" ou "numeração das posições de aminoácidos como em Kabat", e variações das mesmas, referem-se ao sistema de numeração utilizado para domínios variáveis de cadeias pesadas ou domínios variáveis de cadeias leves da compilação de anticorpos em Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Utilizando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento, ou uma inserção, numa FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma inserção de um único aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR da cadeia pesada. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência "padrão" numerada de Kabat.
Um anticorpo "maturado por afinidade" é um que tem uma ou mais alterações numa ou mais das HVR do mesmo que resulta numa melhoria da afinidade do anticorpo pelo antigénio, em comparação com um anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Numa forma de realização, um anticorpo maturado por afinidade tem afinidades no intervalo nanomolar ou inclusive picomolar pelo antigénio alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na especialidade. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem a maturação por afinidade por intercalamento de domínios VH e VL. É descrita mutagénese aleatória de resíduos de HVR e/ou estrutural por: Barbas et al. Proc Na t. Acad. Sei. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
Um anticorpo "bloqueante" ou um anticorpo "antagonista" é um que inibe ou reduz a atividade biológica do antigénio ao qual liga. Determinados anticorpos bloqueantes ou anticorpos antagonistas inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antigénio.
Um "anticorpo agonista", conforme utilizado no presente documento, é um anticorpo que imita pelo menos uma das atividades funcionais de um polipéptido de interesse. "Funções efetoras" do anticorpo referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de sequência de aminoácidos variante) de um anticorpo, e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a Clq e citotoxicidade dependente do complemento; ligação a recetores de Fc; citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de recetores da superfície celular (por exemplo recetor de células B) ; e ativação de células B. "Recetor de Fc" ou "FcR" descrevem um recetor que liga à região Fc de um anticorpo. Nalgumas formas de realização, um FcR é um FcR humano nativo. Nalgumas formas de realização, um FcR é um que liga a um anticorpo IgG (um recetor gama) e inclui recetores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas originárias de excisão-reparação alternativo destes recetores. Os recetores FcyRII incluem FcyRIIA (um "recetor ativador") e FcyRIIB (um "recetor inibidor"), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmãticos. 0 recetor ativador FcyRIIA contém um motivo de ativação à base de tirosinas imunorrecetoras (ITAM) no seu domínio citoplasmãtico. 0 recetor inibidor FcyRIIB contém um motivo de inibição à base de tirosinas imunorrecetoras (ITIM) no seu domínio citoplasmãtico. (veja-se Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)) . Os FcR estão revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Pled. 126:330-41 (1995). Outros FcR, incluindo aqueles a ser identificados no futuro, estão abrangidos pelo termo "FcR" no presente documento. A expressão "recetor de Fc" ou "FcR" também inclui o recetor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) e pela regulação da homeostasia de imunoglobulinas. São conhecidos métodos de medição da ligação a FcRn (veja-se, por exemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). A ligação a FcRn humano in vivo e a semivida no soro de polipéptidos de ligação de elevada afinidade a FcRn humano podem ser ensaiadas, por exemplo, em ratinhos transgénicos ou em linhas celulares humanas transfetadas que expressam FcRn humano, ou em primatas administrados com os polipéptidos variantes de Fc. 0 documento WO00/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída a FcR. Veja-se também, Shields et al. J, Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). "Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e desempenham funções efetoras. Em determinadas formas de realização, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham função(ões) efetoras de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrofílicos. Podem ser isoladas células efetoras a partir de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue. "Citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que Ig segregada ligada em recetores de Fc (FcR) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo células natural killer (NK), neutrofílicos e macrófagos) permite que estas células efetoras citotóxicas liguem especificamente a uma célula alvo portadora do antigénio e subsequentemente matem a célula alvo com citotoxinas. As principais células para mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida no Quadro 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio da ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente US 5.500.362 ou 5.821.337 ou Presta Patente U.S. N.° 6.737.056. As células efetoras úteis para estes ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células natural killer (NK) . Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, por exemplo, num modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação da via clássica do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a anticorpos (da subclasse adequada) que estão ligados ao seu antigénio cognato. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, por exemplo conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). São descritas variantes polipeptídicas com as sequências de aminoãcidos da região Fc alteradas e capacidade de ligação a Clq aumentada ou diminuída na Patente US 6.194.551B1 e documento W099/51642. 0 conteúdo destas publicações de patentes é especificamente incorporado no presente documento por referência. Veja-se, também, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). A expressão "polipéptido compreendendo região Fc" refere-se a um polipéptido, tal como um anticorpo ou uma imunoadesina, que compreende uma região Fc. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do polipéptido ou por engenharia recombinante do ácido nucleico que codifica o polipéptido. Como tal, uma composição compreendendo um polipéptido tendo uma região Fc de acordo com a presente invenção pode compreender polipéptidos com K447, com todos os K447 removidos, ou uma mistura de polipéptidos com e sem o resíduo K447.
Uma "estrutura humana aceitadora" para os propósitos no presente documento é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoãcidos de uma estrutura de VL ou VH derivada a partir de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana. Uma estrutura humana aceitadora "derivada a partir de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoãcidos da mesma, ou pode conter alterações preexistentes da sequência de aminoãcidos. Nalgumas formas de realização, o número de alterações preexistentes de aminoãcidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Quando estão presentes alterações preexistentes de aminoãcidos numa VH, preferentemente essas alterações ocorrem em somente três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H; por exemplo, os resíduos de aminoãcido nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Numa forma de realização, a estrutura humana de VL aceitadora é idêntica em sequência à sequência estrutural de VL de imunoglobulina humana ou à sequência estrutural de consenso humano.
Uma "estrutura de consenso humano" é uma estrutura que representa os resíduos de aminoãcidos de ocorrência mais comum numa seleção de sequências estruturais de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é a partir de um subgrupo de sequências do domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Numa forma de realização, para a VL, o subgrupo é o subgrupo capa I como em Kabat et al. , supra. Numa forma de realização, para a VH, o subgrupo é o subgrupo III como em Kabat et al., supra.
Uma "estrutura de consenso de VH do subgrupo III" compreende a sequência de consenso obtida a partir das sequências de aminoãcidos no subgrupo III variável pesado de Kabat et al., supra. Numa forma de realização, a sequência de aminoãcidos estrutural de consenso de VH do subgrupo III compreende pelo menos uma fração ou a totalidade de cada uma das seguintes sequências: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS {FR-H1, SEQ ID NO:2l)-HVR-Hl- WVRQAPGK.GLEWV (FR-H2, SEQ ID NO:22>HVR-H2- RFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (FR-H3, SEQ ID NO:23)-HVR-H3- WGQGTLYTVSS (FR-H4, SEQlDNO:24).
Uma "estrutura de consenso de VL do subgrupo I" compreende a sequência de consenso obtida a partir das sequências de aminoãcidos no subgrupo I capa leve variável de Kabat et al., supra. Numa forma de realização, a sequência de aminoãcidos estrutural de consenso de VH do subgrupo 1 compreende pelo menos uma fração ou a totalidade de cada uma das seguintes sequências: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (FR-Ll, SEQ ID NO: 17)-HVR-Ll-WYQQKPGKAPKLLIY (FR-L2, SEQ ID NO: 18)-HVR-L2- GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (FR-L3, SEQ ID NO: 19)-HVR-L3-FGQGTKVEIKR (FR-L4, SEQ ID NO: 20) . "Sequência de sinal de secreção" ou "sequência de sinal" referem-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido de sinal curto que pode ser utilizado para dirigir uma proteína de interesse recém-sintetizada através da membrana celular, habitualmente a membrana interna ou as membranas tanto interna como externa de procariotas. Como tal, a proteína de interesse tal como o polipéptido da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina é segregada para o periplasma das células hospedeiras procariotas ou para o meio de cultura. O péptido de sinal codificado pela sequência de sinal de secreção pode ser endógeno à célula hospedeira, ou pode ser exógeno, incluindo péptidos de sinal nativos ao polipéptido a expressar. As sequências de sinal de secreção estão tipicamente presentes no terminal amino de um polipéptido a expressar, e são tipicamente removidas enzimaticamente entre a biossíntese e a secreção do polipéptido a partir do citoplasma. Consequentemente, o péptido de sinal não está habitualmente presente num produto de proteína madura.
Um "aminoácido de cisteína livre" refere-se a um resíduo de aminoácido de cisteína que foi manipulado num anticorpo parental, tem um grupo tiol funcional (-SH), e não está emparelhado como, nem de outro modo faz parte de uma ponte dissulfureto intramolecular ou intermolecular. A expressão "valor de reatividade de tiol" é uma caracterização quantitativa da reatividade de aminoácidos de cisteína livres. 0 valor de reatividade de tiol é a percentagem de um aminoácido de cisteína livre num anticorpo manipulado com cisteína que reage com um reagente reativo com tiol, e convertida num valor máximo de 1. Por exemplo, um aminoácido de cisteína livre num anticorpo manipulado com cisteína que reage com 100Ê de rendimento com um reagente reativo com tiol, tal como um reagente de biotina-maleimida, para formar um anticorpo marcado com biotina tem um valor de reatividade de tiol de 1,0. Outro aminoácido de cisteína manipulado no mesmo anticorpo parental ou num diferente, que reage com 80Ê de rendimento com um reagente reativo com tiol tem um valor de reatividade de tiol de 0,8. Outro aminoácido de cisteína manipulado no mesmo anticorpo parental, ou num diferente, que não reage de todo com um reagente reativo com tiol tem um valor de reatividade de tiol de 0. A determinação do valor de reatividade de tiol de uma cisteína particular pode ser levada a cabo por ensaio ELISA, espectroscopia de massa, cromatografia líquida, autorradiografia, ou outros testes analíticos quantitativos. Reagentes reativos com tiol que permitem a captura do anticorpo manipulado com cisteína e a comparação e a quantificação da reatividade da cisteína incluem biotina-PEO-maleimida ((Â)-biotinil-3-maleimidopropionamidil-3,6-dioxaoctainodiamina, Oda et al. (2001) Nature Biotechnology 19:379-382, Pierce
Biotechnology, Inc.) Biotina-BMCC, PEO-Iodoacetil-Biotina, Iodoacetil-LC-Biotina, e Biotina-HPDP (Pierce Biotechnology, Inc.), e No;- (3-maleimidilpropionil) biocitina (MPB, Molecular Probes, Eugene, OR) . Outras fontes comerciais para biotinilação, reagentes ligantes bifuncionais e multifuncionais incluem Molecular Probes, Eugene, OR, e Sigma, St. Louis, MO.
Um "anticorpo parental" é um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoãcidos da qual um ou mais resíduos de aminoãcido são substituídos por um ou mais resíduos de cisteína. 0 anticorpo parental pode compreender uma sequência nativa ou de tipo selvagem. 0 anticorpo parental pode ter modificações preexistentes na sequência de aminoãcidos (tais como adições, eliminações e/ou substituições) relativamente a outras formas nativas, de tipo selvagem ou modificadas de um anticorpo. Um anticorpo parental pode ser dirigido contra um antigénio alvo de interesse, por exemplo um polipéptido biologicamente importante. São também contemplados anticorpos dirigidos contra antigénios não polipeptídicos (tais como antigénios glicolipídicos associados a tumores; veja-se o documento US 5091178). "Afinidade de ligação" refere-se geralmente à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (por exemplo, um antigénio). A menos que indicado de outro modo, conforme utilizado no presente documento, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antigénio). A afinidade de uma molécula X para com o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd) . A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento.
Os anticorpos de baixa afinidade ligam geralmente ao antigénio lentamente e tendem a dissociar-se facilmente, enquanto os anticorpos de elevada afinidade ligam geralmente ao antigénio mais rapidamente e tendem a permanecer ligados mais tempo. São conhecidos uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação na especialidade, e qualquer dos mesmos pode ser utilizado para os fins da presente invenção. São descritas formas de realização ilustrativas específicas seguidamente.
Numa forma de realização, a "Kd" ou o "valor de Kd" de acordo com a presente invenção é medido através de um ensaio de ligação ao antigénio radioetiquetado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e o seu antigénio conforme descrito pelo ensaio seguinte. A afinidade de ligação em solução dos Fab relativamente ao antigénio é medida equilibrando o Fab com uma concentração mínima de antigénio marcado com (125I) na presença de uma série de titulação de antigénio não marcado, posteriormente capturando o antigénio ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen, et al. , (1999) J. Mol. Bíol. 293:865-881). Para estabelecer condições para o ensaio, as placas de microtítulo (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 pg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9,6), e subsequentemente são bloqueadas com albumina sérica bovina a 2Ê (p/v) em PBS durante duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Numa placa não adsorvente (Nunc n.° 269620), são misturados 100 pM ou 26 pM de antigénio [-^5j] com diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a determinação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599) . 0 Fab de interesse é então incubado durante a noite; contudo, a incubação pode continuar durante um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que é atingido o equilíbrio.
Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, durante uma hora). A solução é então removida e a placa é lavada oito vezes com Tween-20 a 0,1Ê em PBS. Após as placas secarem, são adicionados 150 μΐ/poço de cintilante (MicroScint-20; Packard), e as placas são contadas num contador gama Topcount (Packard) durante dez minutos. As concentrações de cada Fab que originam 2 0Ê ou menos da ligação máxima são eleitas para utilização em ensaios de ligação competitiva.
De acordo com outra forma de realização, a Kd ou o valor de Kd é medido utilizando ensaios de ressonância de plasmão de superfície utilizando um BIAcoreTM-2000 ou um BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com placas CM5 de antigénio imobilizado a ~10 unidades de resposta (RU) . Resumidamente, são ativadas placas biossensoras de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore® Inc.) com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. 0 antigénio é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (-0,2 μΜ) antes da injeção a um caudal de 5 μΐ/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antigénio, é injetada etanolamina 1 M para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, são injetadas diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) em PBS com Tween 20 a 0,05Ê (PBST) a 25°C a um caudal de aproximadamente 25 μΐ/min. As velocidades de associação (kon) e as velocidades de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação de Langmuir simples de um-para-um (BIAcore® Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensogramas de associação e de dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Veja-se, por exemplo, Chen, Y,, et ai. , (1999) J. Mol. Biol. 293:865- 881. Se a velocidade de associação exceder 106 M-l s-1 no ensaio de ressonância de plasmão de superfície acima, então a velocidade de associação pode ser determinada utilizando uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de passagem de banda) a 25 °C de um anticorpo anti antigénio 2 0 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antigénio conforme medido num espectrómetro, tal como um espectrofotõmetro equipado com interruptor de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotómetro SLM-Aminco 8000-series (ThermoSpectronic) com uma cuvete agitada.
Uma "velocidade de associação" ou "kon" de acordo com a presente invenção pode também ser determinada conforme descrito acima utilizando um sistema BIAcore™-2000 ou BIAcore™-3000 (BIAcore®, Inc., Piscataway, NJ) .
Um "distúrbio" é qualquer condição ou doença que beneficiaria de tratamento com uma substância/molécula ou método da invenção. Estes incluem distúrbios crónicos e agudos incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitantes de distúrbios a tratar no presente documento incluem condições cancerígenas tais como cancros ou metãstases da próstata, pulmão e cólon.
As expressões "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbio proliferativo" referem-se a distúrbios que estão associados a algum grau de proliferação celular anormal. Numa forma de realização, o distúrbio proliferativo celular é cancro. "Tumor", conforme utilizado no presente documento, refere-se a todo o crescimento e proliferação celulares neoplãsicos, quer malignos ou benignos, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "cancro", "canceroso", "distúrbio proliferativo celular", "distúrbio proliferativo" e "tumor" não são mutuamente exclusivos conforme referido no presente documento.
Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se a, ou descrevem, a condição fisiológica nos mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais particulares destes cancros incluem cancro de células escamosas (por exemplo cancro de células escamosas epiteliais), cancro do pulmão incluindo cancro do pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou do estômago incluindo cancro gastrointestinal, cancro pancreãtico, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro ovãrico, cancro do fígado, cancro da bexiga, cancro do trato urinário, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro rectal, cancro colorretal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim ou renal, cancro da próstata, cancro vulvar, cancro da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, mieloma múltiplo e linfoma de células B, cancro do cérebro, bem como da cabeça e pescoço, e metástases associadas.
Uma "célula que expressa STEAP-1" é uma célula que expressa STEAP-1 endógena ou transfretada na superfície celular. Um "cancro que expressa STEAP-1" é um cancro compreendendo células tendo proteína STEAP-1 presente na superfície celular. Um "cancro que expressa STEAP-1" produz suficientes níveis de STEAP-1 na superfície das células do mesmo, de modo que um anticorpo anti-STEAP-1 ligar às mesmas e ter um efeito terapêutico em relação ao cancro. Um cancro que "sobreexpressa" STEAP-1 é um que tem níveis significativamente mais elevados de STEAP-1 na superfície das células do mesmo, em comparação com uma célula não cancerígena do mesmo tipo de tecido. Tal sobreexpressão pode ser causada por amplificação génica ou por transcrição ou tradução aumentadas. A sobreexpressão de STEAP-1 pode ser determinada num ensaio de diagnóstico ou prognóstico avaliando os níveis aumentados da proteína STEAP-1 presente na superfície de uma célula (por exemplo através de um ensaio imunohistoquímico; análise FACS). Alternativamente, ou adicionalmente, os níveis de ou ARNm, ácido nucleico que codifica STEAP-1, na célula, podem ser medidos por exemplo através de técnicas de hibridação in situ fluorescente; (FISH; veja-se o documento W098/45479 publicado em outubro de 1998), Southern blotting, Northern blotting ou reação em cadeia da polimerase (PCR), tal como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR) . Pode também ser estudada a sobreexpressão de STEAP-1 medindo antigénio extravasado num fluido biológico tal como soro, por exemplo, utilizando ensaios à base de anticorpos (veja-se também, por exemplo, a Patente U.S. N.° 4.933.294 publicada a 12 de junho de 1990; documento WO91/05264 publicado a 18 de abril de 1991; Patente U.S. N.° 5.401.638 publicada a 28 de março de 19 95; e Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)) . Para além dos ensaios anteriores, estão disponíveis vários ensaios in vivo para o perito na especialidade. Por exemplo, as células no interior do corpo do paciente podem ser expostas a um anticorpo que está opcionalmente marcado com um marcador detetável, por exemplo um isótopo radioativo, e a ligação do anticorpo a células no paciente pode ser avaliada, por exemplo por varrimento externo para radioatividade ou por análise de uma biópsia obtida a partir de um paciente previamente exposto ao anticorpo. Um cancro que expressa STEAP-1 inclui cancro da próstata, pulmão e cólon.
Conforme utilizado no presente documento, "tratamento” (e variações tais como "tratar” ou "tratando") refere-se à intervenção clínica numa tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou da célula a ser tratados, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o decorrer da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástases, diminuição da velocidade de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Nalgumas formas de realização, os anticorpos da invenção são utilizados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio ou para atrasar a progressão de uma doença ou distúrbio.
Os parâmetros anteriores para determinação do sucesso de um tratamento e da melhoria na doença são prontamente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares a um médico. Para a terapêutica do cancro, a eficácia pode ser medida, por exemplo, por determinação do tempo até à progressão da doença (TTP) e/ou por determinação da taxa de resposta (RR) . Para o cancro da próstata, a progressão da terapêutica pode ser determinada por métodos de rotina, habitualmente por medição dos níveis de PSA no soro (antigénio específico da próstata); quanto mais elevado o nível de PSA no sangue, mais extenso é o cancro. Estão disponíveis ensaios comerciais para deteção de PSA, por exemplo, os kits de ensaio de PSA Tandem-E e Tandem-R da Hybitech, ensaio policlonal ProsCheck da Yang (Yang Labs, Bellevue, WA) , Imx da Abbott (Abbott Labs, Abbott Park, IL) , etc. A metãstase pode ser determinada realizando testes e por varrimento ósseo e testes de nível de cálcio e outras enzimas para determinar a disseminação para os ossos. Podem também ser realizados exames TAC para observar a disseminação para a pélvis e nódulos linfáticos na área. São utilizados raios-X ao tórax e medição dos níveis das enzimas hepáticas por métodos conhecidos para procurar metástases nos pulmões e no fígado, respetivamente. Outros métodos de rotina para a monitorização da doença incluem ecografia (TRUS) e biopsia transretal com agulha (TRNB).
Um "indivíduo" é um vertebrado. Em determinadas formas de realização, o vertebrado é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais de criação (tais como vacas), animais de desporto, animais de estimação (tais como gatos, cães e cavalos), primatas, ratinhos e ratos. Em determinadas formas de realização, um mamífero é um ser humano.
Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substância/molécula da invenção pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade da substância/molécula, para eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz abrange uma quantidade em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância/molécula são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, dado que é utilizada uma dose profilática nos indivíduos antes, ou num estádio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz. No caso do cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir a dimensão do tumor,· inibir (isto é, atrasar nalguma extensão e preferentemente parar) a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos; inibir (isto é, atrasar nalguma extensão e preferentemente parar) a metástase tumoral; inibir, nalguma extensão, o crescimento tumoral; e/ou aliviar nalguma extensão um ou mais dos sintomas associados ao cancro. Veja-se a definição precedente de "tratamento". Na medida em que o fármaco possa prevenir o crescimento e/ou matar células cancerígenas existentes, pode ser citostãtico e/ou citotóxico.
Administração "crónica” refere-se à administração do(s) agente(s) num modo contínuo em oposição a um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico (atividade) inicial durante um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é o tratamento que não é consecutivamente realizado sem interrupção, mas em vez disso é de natureza cíclica.
Administração "em combinação com" um ou mais outros agentes terapêuticos inclui a administração simultânea (concorrente) e consecutiva por qualquer ordem. "Portadores" conforme utilizado no presente documento incluem portadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicos para a célula ou para o mamífero sendo exposto nas dosagens e concentrações empregues. Frequentemente, o portador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Exemplos de portadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptido de baixa massa molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; aldóis tais como manitol ou sorbitol; contraiões formadores de sais tais como sódio; e/ou tensioativos não iónicos tais como TWEEN™, polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS™. "Marcador", conforme utilizado no presente documento, refere-se a um composto ou uma composição detetáveis que são conjugados diretamente ou indiretamente com o anticorpo de modo a gerar um anticorpo "marcado". 0 marcador pode ser detetável por si só (por exemplo marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou uma composição de substrato que é detetável. A expressão "marcado com epítopo" utilizada no presente documento refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo um polipéptido do anticorpo anti-PSCA fundido com um "polipéptido marcador". 0 polipéptido marcador tem suficientes resíduos para proporcionar um epítopo contra o qual um anticorpo possa ser criado, e é no entanto suficientemente curto tal que não interfira com a atividade do polipéptido de Ig ao qual está fundido. 0 polipéptido marcador é também preferentemente bastante único para que o anticorpo não tenha reatividade cruzada de modo substancial com outros epítopos. Os polipéptidos marcadores adequados geralmente têm pelo menos seis resíduos de aminoácido e habitualmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácido (preferentemente, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácido).
Uma "molécula pequena" é definida no presente documento como tendo uma massa molecular inferior a cerca de 500 Dalton. A expressão "bula de embalagem" é utilizada para referir as instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação acerca das indicações, utilização, dosagem, administração, contraindicações e/ou advertências relativamente à utilização destes produtos terapêuticos.
Um "ácido nucleico isolado" é um ácido nucleico, por exemplo, um ARM, um ADN ou um polímero misto, que está substancialmente separado de outras sequências de ADN do genoma bem como de proteínas ou complexos tais como ribossomas e polimerases, que acompanham naturalmente uma sequência nativa. A expressão abrange uma sequência de ácido nucleico que foi removida a partir do seu ambiente de ocorrência natural, e inclui isolados de ADN recombinantes ou clonados e análogos sintetizados quimicamente ou análogos sintetizados biologicamente por sistemas heterólogos. Uma molécula substancialmente pura inclui formas isoladas da molécula. "Vetor" inclui vetores vaivém e de expressão. Tipicamente, a construção de plasmídeo também incluirá uma origem de replicação (por exemplo, a origem de replicação ColEl) e um marcador selecionável (por exemplo, resistência a ampicilina ou a tetraciclina), para replicação e seleção, respetivamente, dos plasmídeos em bactérias. Um "vetor de expressão" refere-se a um vetor que contém as sequências de controlo ou elementos reguladores necessários para a expressão dos anticorpos incluindo fragmentos de anticorpo da invenção, em células bacterianas ou eucariotas. Vetores adequados são divulgados abaixo. A célula que produz um anticorpo anti-STEAP da invenção incluirá a célula de hibridoma parental, por exemplo, os hibridomas que estão depositados com a ATCC, bem como células hospedeiras bacterianas e eucariotas nas quais foi introduzido ácido nucleico que codifica os anticorpos. São divulgadas células hospedeiras adequadas abaixo.
Um "agente inibidor do crescimento" quando utilizado no presente documento, refere-se a um composto ou uma composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula cancerígena que expressa PSCA, quer in vitro ou in vivo. Consequentemente, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduza significativamente a percentagem de células que expressam PSCA em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão no ciclo celular (num local para além da fase S) , tais como agentes que induzem paragem em G1 e paragem em fase M. Os bloqueadores clássicos de fase M incluem as vincas (vincristina e vimblastina) , taxamos e inibidores de topoisomerase II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido e bleomicina. Os agentes que param a fase G1 também extravasam para paragem em fase S, por exemplo, agentes alquilantes de ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Pode ser encontrada informação adicional em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Chapter 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente na p. 13. Os taxamos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anti cancro, ambos derivados do teixo. 0 docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semissintético do paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). 0 paclitaxel e o docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos prevenindo a despolimerizaçâo, o que resulta na inibição da mitose nas células. A expressão "agente citotóxico", conforme utilizado no presente documento, refere-se a uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ou causa a morte ou destruição celulares. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (por exemplo, At2-^, 1^-31, ι125^ γ90^ Re38^, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu) , agentes quimioterapêuticos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina, vimblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e fragmentos dos mesmos tais como enzimas nu.cieoiiLt.icaS/ antibióticos e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, toxinas, agentes inibidores do crescimento, frações de fãrmaco, e os vários agentes anti tumorais ou anti cancro divulgados abaixo. São descritos outros agentes citotóxicos abaixo. Um agente tumoricida provoca a destruição de células tumorais.
Uma "toxina” é qualquer substância suscetível de ter um efeito prejudicial sobre o crescimento ou a proliferação de uma célula.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento do cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo tais como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetra-hidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostrada de uracilo; nitrosoureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina ómega 11 (veja-se, por exemplo, Agnew, Chem Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina) , epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenõlico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-supra-renais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2!,2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C!!); tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.),
TM ABRAXANE Cremophor-free, formulação de nanoparticulas manipuladas com albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e docetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vimblastina (VELBAN®); platina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores; bem como combinações de dois ou mais dos anteriores tais como CHOP, uma abreviatura para uma terapêutica combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviatura para
TM um regime de tratamento com oxaliplatma (ELOXATIN ) combinada com 5-FU e leucovovina.
Estão também incluídos nesta definição os agentes anti hormonais que atuam para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormonas que podem promover o crescimento do cancro, e estão frequentemente na forma de tratamento sistémico, ou de corpo completo. Podem eles mesmos ser hormonas. Os exemplos incluem anti estrogénios e moduladores seletivos de recetores de estrogénios (SERM), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY 117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; anti progesteronas; reguladores negativos de recetores de estrogénios (ERD); agentes que funcionam para suprimir ou inativar os ovários, por exemplo, agonistas da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH) tais como acetato de leuprólido LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina,* outros anti androgénios tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas suprarrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestania, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®. Adicionalmente, esta definição de agentes quimioterapêuticos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoldrónico/zoldronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; bem como troxacitabina (um análogo do nucleósido de citosina de 1,3-dioxolano); oligonucleotides de sentido reverso, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas em proliferação celular aberrante, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras e recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como a vacina THERATOPE® e vacinas de terapêutica génica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (um inibidor de molécula pequena de tirosina-quinase dupla ErbB-2 e EGFR também conhecido como GW572016); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores.
Um "agente inibidor do crescimento", quando utilizado no presente documento, refere-se a um composto ou uma composição que inibe o crescimento de uma célula (tal como uma célula que expressa STEAP-1) quer in vitro quer in vivo. Consequentemente, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduz significativamente a percentagem de células (tais como células que expressam STEAP-1) em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (num lugar para além da fase S) , tais como agentes que induzem paragem em G1 e paragem em fase M. Os bloqueadores clássicos de fase M incluem as vincas (vincristina e vimblastina), taxamos, e inibidores de topoismerase II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido e bleomicina. Os agentes que param em G1 também extravasam para paragem em fase S, por exemplo, agentes alquilantes de ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Pode ser encontrada informação adicional em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds. , Chapter 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente na p. 13. Os taxamos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anti cancro, ambos derivados do teixo. 0 docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semissintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). 0 paclitaxel e o docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos prevenindo a despolimerização, o que resulta na inibição da mitose nas células. A expressão "metabolito intracelular" refere-se a um composto resultante de um processo ou reação metabólicos no interior de uma célula num conjugado anticorpo-fármaco (ADC) . 0 processo ou reação metabólicos podem ser um processo enzimático, tal como uma clivagem proteolítica de um ligante peptídico do ADC, ou uma hidrólise de um grupo funcional tal como uma hidrazona, um éster ou uma amida. Os metabolitos intracelulares incluem, mas não estão limitados a, anticorpos e fármaco livre que sofreram clivagem intracelular após entrada, difusão, assimilação ou transporte para uma célula.
As expressões "clivado intracelularmente" e "clivagem intracelular" referem-se a um processo ou reação metabólicos no interior de uma célula num conjugado anticorpo-fármaco (ADC) através do qual a união covalente, isto é, o ligante, entre a fração de fármaco (D) e o anticorpo (Ab) é quebrado, resultando no fármaco livre dissociado a partir do anticorpo no interior da célula. As frações clivadas do ADC são consequentemente metabolitos intracelulares. 0 termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistémica (isto é, níveis no sangue/plasma) de uma determinada quantidade de fármaco administrada a um paciente. A biodisponibilidade é um termo absoluto que indica a medição da quantidade no tempo (taxa) e total (extensão) de fármaco que atinge a circulação geral a partir de uma forma farmacêutica administrada. A expressão "atividade citotóxica" refere-se a um efeito de morte celular, citostãtico ou inibidor do crescimento de um conjugado anticorpo-fármaco ou de um metabolito intracelular de um conjugado anticorpo-fãrmaco. A atividade citotõxica pode ser expressa como o valor de IC50, que é a concentração (molar ou em massa) por unidade de volume à qual metade das células sobrevivem. "Alquilo" é um hidrocarboneto Cl-Cl8 contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos. Exemplos são metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1- propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propilo (i-Bu, i-butilo, CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3) , 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (- C (CH3) 2CH2CH3) , 3-met. il - 2-but. ilo (-CH (CH3 ) CH (CH3 ) 2 ) , 3- metil-l-butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butilo (- CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentilo (- CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2- butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (- CH (CH3) C (CH3) 3 . 0 termo "alquilo C1-C8", conforme utilizado no presente documento, refere-se a um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado tendo de 1 a 8 átomos de carbono. Grupos "alquilo C^Cg" representativos incluem, mas não estão limitados a, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n-heptilo, -n-octilo, -n-nonilo e -n-decilo; enquanto os alquilos C:L-C8 ramificados incluem, mas não limitados a, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, os alquilos C^Cg insaturados incluem, mas não limitados a, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, - 1- pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-l-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1-butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo, -3-metil-l-butinilo, Metilo, etilo, propilo, isopropilo, ri~bu.ti.lo, isobutilo, sec— butilo, fcere-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, iso-hexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 2,3,4-trimetilpentilo, 3-metil-hexilo, 2,2~dimetil~hexilo, 2,4-dimetil-hexilo, 2,5-dimetil-hexilo, 3,5-dimet.il-hexilo, 2,4-dimetilpentilo, 2- metil-heptilo, 3-metil-heptilo, n-heptilo, iso-heptilo, n-octilo e iso-octilo. Um grupo alquilo C^-Cg pode ser não substituído ou substituído com um ou mais grupos incluindo, mas não limitados a, -alquilo C1-C8, -0-(alquilo C^-Cg) , -arilo, -C (0) R' , -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R!)2, -NHC(0)R', -S03R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halogéneo, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, -alquilo C^-Cg e arilo. "Alquenilo" é um hidrocarboneto C2-C18 contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos com pelo menos um local de insaturação, isto é uma ligação dupla sp2, carbono-carbono. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a: etileno ou vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2) , ciclopentenilo (-C5H7) e 5-hexenilo (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2) "Alquinilo" é um hidrocarboneto C2-C18 contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos com pelo menos um local de insaturação, isto é uma ligação tripla sp, carbono-carbono. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a: acetilénico (~C=CH) e propargilo (-CH2C=CH), "Alquileno" refere-se a um radical hidrocarboneto saturado, de cadeia linear ou ramificada ou cíclica de 1-18 átomos de carbono, e tendo dois centros radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio dos mesmos ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcano parental. Os radicais alquileno típicos incluem, mas não estão limitados a: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-) e 1,4- butilo (-CH2CH2CH2CH2-) .
Um "alquileno C1-C10" é um grupo hidrocarboneto de cadeia linear, saturado, com a fórmula - (CH2) . Exemplos de um alquileno CVcio incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno e decaleno. "Alquenileno" refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado, de cadeia linear ou ramificada ou cíclica de 2-18 átomos de carbono, e tendo dois centros radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alceno parental. Radicais alquenileno trpicos incluem, mas não estão limitados a: 1,2-etileno (-CH=CH-). "Alquinileno" refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado, de cadeia linear ou ramificada ou cíclica de 2-18 átomos de carbono, e tendo dois centros radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcino parental. Radicais alquinileno típicos incluem, mas não estão limitados a: acetileno (-C^C-), propargilo (-CH2C^C-) e 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C=C-) . "Arilo" refere-se a um grupo carbocíclico aromático. Exemplos de grupos arilo incluem, mas não estão limitados a, fenilo, naftilo e antracenilo. Um grupo carbocíclico aromático ou um grupo heterocíclico aromático podem ser não substituídos ou substituídos com um ou mais grupos incluindo, mas não limitados a, -alquilo C1-C8, -0-(alquilo C:L-C8) , -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R’, -C(0)NH2, - C (0) NHR1 , -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, - halogéneo, -N,_, -NH2, -MH(R'), -N(R')2 e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado a partir de H, -alquilo 0Χ-C8 e arilo.
Um " ar i leno" é um grupo arilo que tem duas ligações covalentes e pode estar nas configurações orto, meta ou para conforme mostrado nas seguintes estruturas: fj·
' I I em que o grupo fenilo pode ser não substituído ou substituído com até quatro grupos incluindo, mas não limit ado s a, — a 1 qu ilo C, — C8, —O— (al qu ilo C ^ — C8) , — arilo, — C (0) R ! , -0C (0) R ' , -C (0) OR ' , -C(0)NH2, -C(0)NHR', C(0)N(R!)2 ”NHC(0)R!, -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halogéneo, -N3, -NH2, -NH(R!), -N (R' ) 2 e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado a partir de H, -alquilo Cj^-Cg e arilo. "Arilalquilo" refere-se a um radical alquilo acíclico em que um dos átomos de hidrogénio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp^, está substituído por um radical arilo. Grupos arilalquilo típicos incluem, mas não estão limitados a, benzilo, 2-feniletan-l-ilo, 2-fenileten-l-ilo, naftilmetilo, 2- naftiletan-l-ilo, 2-naftileten-l-ilo, naftobenzilo e 2- naftofeniletan-l-ilo. 0 grupo arilalquilo compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo a fração alquilo, incluindo grupos alcanilo, alquenilo ou alquinilo, do grupo arilalquilo tem 1 a 6 átomos de carbono e a fração arilo tem 5 a 14 átomos de carbono. "Heteroarilalquilo" refere-se a um radical alquilo acíclico em que um dos átomos de hidrogénio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, está substituído por um radical heteroarilo. Grupos heteroarilalquilo típicos incluem, mas não estão limitados a, 2-benzimidazolilmetilo e 2-furiletilo. 0 grupo heteroarilalquilo compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo a fração alquilo, incluindo grupos alcanilo, alquenilo ou alquinilo, do grupo heteroarilalquilo tem 1 a 6 átomos de carbono e a fração heteroarilo tem 5 a 14 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P e S. A fração heteroarilo do grupo heteroarilalquilo pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P e S) , por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. "Alquilo substituído", "arilo substituído" e "arilalquilo substituído" significam alquilo, arilo e arilalquilo, respetivamente, em que um ou mais átomos de hidrogénio estão, cada um independentemente, substituídos por um substituinte. Substituintes típicos incluem, mas não limitados a, -X, -R, -0", -0R, -SR, -S~, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=0, -NC5, -NO, -N02, =N2, -N3, NC (=0) R, -C(=0)R, -C(=0)NR2, -S03", -S03H, -S(=0)2R, 0S(=0)20R, -S(=0)2NR, -S(=0)R, -0P(=0) (0R)2, -P(=0)(0R)2, - P0"3, -P03H2, -C(=0)R, -C(=0)X, -C(=S)R, -co2r, -C02-, - C( = S)0R, -C(=0)SR, -C ( = S) SR, -C(=0)NR2, -C( = S)NR2, C(=NR)NR2, onde cada X é independentemente um halogéneo: F, Cl, Br ou I; e cada R é independentemente -H, alquilo C2-C18, arilo Cs-C20, heterociclo C3-C14, um grupo protetor ou uma fração de profármaco. Podem também ser semelhantemente substituídos grupos alquileno, alquenileno e alquinileno conforme descrito acima. "Heteroarilo" e "heterociclo" referem-se a um sistema de anel em que um ou mais átomos do anel são heteroátomos, por exemplo azoto, oxigénio e enxofre. 0 radical heterociclo compreende 1 a 20 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P e S. Um heterociclo pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, Ο, Ρ e S) ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P e S) , por exemplo: um sistema biciclo [4,5] , [5,5] , [5,6] ou [6,6] . São descritos heterociclos em Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nova Iorque, 1968), particularmente nos Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, e 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley &amp; Sons, Nova Iorque, 1950 até ao presente), em particular nos Volumes 13, 14, 16, 19, e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Exemplos de heterociclos incluem, a título de exemplo e não como limitação, piridilo, di-hidropiridilo, tetra-hidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetra-hidrotiofenilo, tetra-hidrotiofenilo oxidado por enxofre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetra-hidrofuranilo, bis-tetra-hidrofuranilo, tetra-hidropiranilo, bis-tetra-hidropiranilo, tetra-hidro-quinolinilo, tetra-hidroisoquinolinilo, deca-hidroquinolinilo, octa-hidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-l,2,5-ti adi az inilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, β-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pira.zolini.lo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoilo. A título de exemplo e não como limitação, os heterociclos ligados por carbono estão ligados na posição 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina, na posição 3, 4, 5 ou 6 de uma piridazina, na posição 2, 4, 5 ou 6 de uma pirimidina, na posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina, na posição 2, 3, 4 ou 5 de um furano, tetra-hidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetra-hidropirrol, na posição 2, 4 ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, na posição 3, 4 ou 5 de uma isoxazol, pirazol ou isotiazol, na posição 2 ou 3 de uma aziridina, na posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, na posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolina ou na posição 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma isoquinolina. Ainda mais tipicamente, os heterociclos ligados por carbono incluem 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimi-dinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo ou 5-tiazolilo. A título de exemplo e não como limitação, os heterociclos ligados por azoto estão ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, IH-indazol, na posição 2 de um isoindol ou isoindolina, na posição 4 de uma morfolina, e na posição 9 de um carbazol ou β-carbolina. Ainda mais tipicamente, os heterociclos ligados por azoto incluem 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo e 1-piperidinilo.
Um "heterociclo C3-C8" refere-se a um carbociclo C3-C8 aromático ou não aromático em que um a quatro dos átomos de carbono do anel estão independentemente substituídos por um heteroátomo do grupo que consiste em 0, S e N. Os exemplos representativos de um heterociclo C3-C8 incluem, mas não limitados a, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo e tetrazolilo. Um heterociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído com até sete grupos incluindo, mas não limitados a, -alquilo C^-Cg, -0-(alquilo C:L-C8) , -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R’, -C(0)NH2, -C (0) NHR1 , -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, - halogéneo, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; em que cada R> é independentemente selecionado a partir de H, -alquilo Ci-C8 e arilo. "Heterociclo C3-C8" refere-se a um grupo heterociclo C3-C8 definido acima em que um dos átomos de hidrogénio do grupo heterociclo está substituído por uma ligação. Um heterociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído com até seis grupos incluindo, mas não limitados a, alquilo Cj-Cg, -0-(alquilo C:L-C8) , -arilo, -C(0)R', 0C (0) R' , -C (0) 0R' , -C(0)NH2, -C(0)MHR!, -C(0)N(R')2 NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -0H, -halogéneo, -N3, -NH2, - NH (R1 ) , -N (R1) 2 e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado a partir de H, -alquilo C8-C8 e arilo. "Carbociclo" significa um anel saturado ou insaturado tendo 3 a 7 átomos de carbono na forma de um monociclo ou tendo 7 a 12 átomos de carbono na forma de um biciclo. Os carbociclos monocíclicos têm 3 a 6 átomos no anel, ainda mais tipicamente 5 ou 6 átomos no anel. Os carbociclos bicíclicos têm 7 a 12 átomos no anel, por exemplo dispostos como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou têm 9 ou 10 átomos no anel dispostos como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6] . Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopentenilo, l-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, l-ciclohex-3-enilo, ciclo-heptilo e ciclooctilo.
Um "carbociclo C3-C8" é um anel carbocíclico não aromático saturado ou insaturado de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 membros. Carbociclos C3-CS representativos incluem, mas não estão limitados a, -ciclopropilo, -ciclobutilo, ciclopentilo, -ciclopentadienilo, -ciclohexilo, ciclohexenilo, -1,3-ciclo-hexadienilo, -1,4- ciclohexadienilo, -ciclo-heptilo, -1,3-ciclo-heptadienilo, -1,3,5-ciclo-hepta-trienilo, -ciclooctilo e ciclooctadienilo. Um grupo carbociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído com um ou mais grupos incluindo, mas nao limitados a, -alguilo C^-C8, -0- (alquilo C-ι -C8) , - arilo, -C (0) R' , -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', - C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(0)2R!, -S(0)R', -OH, -halogéneo, -N3, -NH2, -MH (R! ) , -N (R1 ) 2 e -CN; onde cada R! é independentemente selecionado a partir de H, -alquilo C^-Cg e arilo.
Um "carbociclo C3-C8" refere-se a um grupo carbociclo C3-C8 definido acima em que um dos átomos de hidrogénio do grupo carbociclo está substituído por uma ligação. "Ligante" refere-se a uma fração química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente um anticorpo a uma fração de fãrmaco. Em várias formas de realização, os ligantes incluem um radical bivalente tal como um alquildiilo, um arildiilo, um heteroarildiilo, frações tais como: -(CR2) n0 (CR2)n-, unidades repetidas de alquiloxi (por exemplo polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) e alquilamino (por exemplo polietilenoamino, Jeffamine™); e éster e amidas de diácido incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida. 0 termo "quiral" refere-se a moléculas tendo a propriedade de não superponibilidade do parceiro de imagem especular, enquanto o termo "aquiral" se refere a moléculas que são sobreponíveis com o seu parceiro de imagem especular. 0 termo "estereoisómerosi! refere-se a compostos que têm uma constituição química idêntica, mas diferem em relação à disposição dos átomos ou grupos no espaço. "Diastereómero" refere-se a um estereoisómero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens especulares uma da outra. Os diastereõmeros têm diferentes propriedades físicas, por exemplo pontos de fusão, ponto de ebulição, propriedades espetrais, e reatividades. As misturas de diastereómeros podem ser separadas por procedimentos analíticos de alta resolução tais como eletroforese e cromatografia. "Enantiómeros" referem-se a dois estereoisómeros de um composto que não são imagens especulares sobreponíveis.
As definições e convenções estereoquímicas utilizadas no presente documento seguem geralmente S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nova Iorque; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley &amp; Sons, Inc., Nova Iorque. Muitos compostos orgânicos existem em formas opticamente ativas, isto é, têm a capacidade de rodar o plano da luz polarizada. Na descrição de um composto opticamente ativo, são utilizados os prefixos D e L, ou R e S, para denotar a configuração absoluta da molécula à volta do(s) seu(s) centro(s) quiral(ais). Os prefixos del ou (À) e (-) são empregues para designar o sinal de rotação do plano da luz polarizada pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levorrotatório. Um composto com o prefixo (Ã) ou d é dextrorrotatório. Para uma determinada estrutura química, estes estereoisómeros são idênticos exceto por serem imagens especulares um do outro. Um estereoisómero específico pode também ser referido como um enantiómero, e uma mistura destes isómeros é frequentemente denominada uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiómeros é referida como uma mistura racémica ou um racemato, que pode ocorrer quando não existiu estereosselecção ou estereoespecificidade numa reação ou processo químicos. Os termos "mistura racémica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovida de atividade ótica. "Grupo abandonante" refere-se a um grupo funcional que pode ser substituído por outro grupo funcional.
Determinados grupos abandonantes são bem conhecidos na especialidade, e os exemplos incluem, mas não estão limitados a, um halogeneto (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), metanossulfonilo (mesilo), p-toluenossulfonilo (tosilo), trifluorometi1sulfonilo (triflato) e trifluorometilsulfonato. ÂhTPVI £3 f" 11 T*£3 €5
fail/ A. V A Ct w U4 tji Çt Q COMPONENTES LIGANTES: MC = 6-maleimidocaproílo
Val-Cit ou "vc" = valina-citrulina (um dipéptido exemplar num ligante clivãvel por protease)
Citrulina = ácido 2-amino-5-ureidopentanóico PAB = p-aminobenziloxicarbonilo (um exemplo de um componente ligante "auto-imolativo")
Me-Val-Cit N-metil-valina-citrulina (em que a ligação peptídica ligante foi modificada para impedir a sua clivagem por catepsina B) MC(PEG)6-QH = maleimidocaproil-polietilenoglicol (pode ser ligado a cisteínas do anticorpo). SPP = N-succinimidil-4 -(2-piridiltio)pentanoato SPDP = N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato SMCC = succinimidil-4 -(N-maleimidometil)ciclohexano-1- carboxilato IT = iminotiolano FÁRMACOS CITOTÓXICOS: MMAE = mono-metilauristatina E (MW 718) MMAF = variante de auristatina E (MMAE) com uma fenilalanina no terminal C do fármaco (MW 731,5) MMAF-DMAEA = MMAF com DMAEA (dimetilaminoetilamina) numa ligação amida à fenilalanina C-terminal (MW 801,5) MMAF-TEG = MMAF com tetraetilenoglicol esterificado na fenilalanina
MMAF-NtBu = N-t-butilo, ligado na forma de amida ao terminal C de MMAF DM1 = N(2')-desacetil-N(2!) -(3-mercapto-l-oxopropil)maitansina DM3 = N(21)-desacetil-N2-(4-mercapto-1-oxopentil)maitansina DM4 = N(2')-desacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-l- oxopentil)-maitansina
Outras abreviaturas são conforme segue: AE é auristatina E, Boc é N-(t-butoxicarbonilo), cit é citrulina, dap é dolaproina, DCC é 1,3-diciclohexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD é dietilazodi-carboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD é diisopropilazodicarboxilato, Dl EA é N,N- diisopropiletilamina, dil é dolaisoleucina, DMA é dimetilacetamida, DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DME é éter dimetílico de etilenoglicol (ou 1,2-dimetoxietano), DMF é N,N-dimetilformamida, DMSO é dimetilsulfóxido, doe é dolafenina, dov é N,N-dimetilvalina, DTNB é 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) , DTPA é ácido dietilenotriaminopentaacético, DTT é ditiotreitol, EDCI é cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ é 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-di-hidroquinolina, ES-MS é espectrometria de massa com electropulverização, EtOAc é acetato de etilo, Fmoc é N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo), gly é glicina, HATU é hexafluorofosfato de 0- (7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónio, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia líquida de alta pressão, ile é isoleucina, lys é lisina, MeCN (CH3CN) é acetonitrile, MeOH é metanol, Mtr é 4-anisildifenilmetilo (ou 4-metoxitritilo), nor é (IS,2R)-(Â)-norefedrina, PBS é solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4), PEG é polietilenoglicol, Ph é fenilo, Pnp é p-nitrofenilo, MC é 6-maleimidocaproílo, phe é L-fenilalanina, PyBrop é hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfónio, SEC é cromatografia de exclusão por tamanho, Su é succinimida, TFA é ácido trifluoroacético, TLC é cromatografia de camada fina, UV é ultravioleta e vai é valina.
COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA PREPARAR AS MESMAS São proporcionados anticorpos que ligam a STEAP-1. São proporcionados imunoconjugados compreendendo anticorpos anti-STEAP-1. Os anticorpos e os imunoconjugados da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou o tratamento de distúrbios associados a expressão alterada, por exemplo, expressão aumentada, de STEAP-1. Em determinadas formas de realização, os anticorpos ou imunoconjugados da invenção são úteis para o diagnóstico ou o tratamento de um distúrbio proliferativo celular, tal como o cancro.
Anticorpos Anti-STEAP-1
Num aspeto, a invenção proporciona anticorpos que ligam a STEAP-1. Nalgumas formas de realização, são proporcionados anticorpos que ligam a uma forma madura de STEAP-1 humana e de macaco cinamolgo (cyno). Numa destas formas de realização, uma forma madura de STEAP-1 humana tem uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 1 (Figura 1) . A STEAP-1 de cyno tem uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 3 (Figura 1). Nalgumas formas de realização, um anticorpo contra STEAP-1 liga a uma forma madura de STEAP-1 expressa na superfície celular. Nalgumas formas de realização, um anticorpo que liga a uma forma madura de STEAP-1 expressa na superfície celular inibe o crescimento da célula. Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-STEAP-1 liga a uma forma madura de STEAP-1 expressa na superfície celular e inibe a proliferação celular. Em determinadas formas de realização, um anticorpo anti-STEAP-1 liga a uma forma madura de STEAP-1 expressa na superfície celular e induz morte celular. Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-STEAP-1 liga a uma forma madura de STEAP-1 expressa na superfície de células cancerígenas. Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-STEAP-1 liga a uma forma madura de STEAP-1 que é sobreexpressa na superfície de células cancerígenas em relação a células normais do mesmo tecido de origem. Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-STEAP-1 está conjugado com uma citotoxina ou um marcador detetável e liga a STEAP-1 na superfície de uma célula. Nalgumas formas de realização, o conjugado anticorpo-toxina inibe o crescimento da célula. Nalgumas formas de realização, o conjugado anticorpo-marcador detetável causa que uma célula que expresse STEAP-1 na sua superfície seja detetável in vitro ou in vivo. 0 anticorpo anti-STEAP-1 é um anticorpo monoclonal humanizado. 0 anticorpo anti-STEAP-1 pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fab, Fab!-SH, Fv, scFv ou (Fab')2. Num aspeto, qualquer dos anticorpos anti-STEAP-1 descritos no presente documento são purificados. São proporcionados no presente documento anticorpos monoclonais exemplares derivados a partir de uma biblioteca de fagos. 0 antigénio utilizado para rastreio da biblioteca foi um polipéptido tendo a sequência de sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 8 ou SEQ ID NO: 30, correspondentes aos domínios extracelulares (ECD) de STEAP-1 beta e alfa. Os anticorpos resultantes do rastreio da biblioteca são maturados por afinidade. São proporcionados anticorpos monoclonais que competem com 120.545 de ratinho, enxerto 120 e !20v.24 humanizado pela ligação a STEAP-1. São também proporcionados anticorpos monoclonais que ligam ao mesmo epítopo que 120.545 de ratinho, enxerto 120 e 120v.24 humanizado.
Num aspeto da invenção, são proporcionados polinucleótidos que codificam anticorpos anti-STEAP-1. Em determinadas formas de realização, são proporcionados vetores compreendendo polinucleótidos que codificam anticorpos anti-STEAP-1. Em determinadas formas de realização, são proporcionadas células hospedeiras compreendendo estes vetores. São proporcionadas composições compreendendo anticorpos anti-STEAP-1 ou polinucleótidos que codificam anticorpos anti-STEAP-1, Em determinadas formas de realização, uma composição da invenção é uma formulação farmacêutica para utilização no tratamento de um cancro conforme definido na reivindicação 16.
Uma descrição detalhada de anticorpos anti-STEAP-1 exemplares é conforme segue: 2. Formas de realização específicas de anticorpos anti-STEAP-1 A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 9 ou 10 da Figura 2B. É também descrito um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo um domínio variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 6 da Figura 2A. A divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 9, tendo uma ou mais das seguintes alterações de aminoãcidos na posição de Kabat indicada: A24V, V37I, V48M, F67I, e L78F. A cadeia pesada compreende uma região estrutural da cadeia pesada FR-H1 de SEQ ID NO: 25. Conforme utilizado no presente documento, as regiões estruturais da cadeia pesada são designadas "FR-H1-H4" ou "HC-FR1-FR4", e as regiões estruturais da cadeia leve são designadas "FR-L1-L4" ou "LC-FR1-FR4!! . A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-l compreendendo uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 6. A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-l compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências HVR do anticorpo 120.v24 mostradas nas Figuras 2A e 2B.
Geralmente, um anticorpo ant.i-STEAP-1 pode compreender qualquer sequência estrutural de domínio variável adequada, contanto que o anticorpo retenha a capacidade de ligar a STEAP-1. Por exemplo, nalgumas formas de realização, os anticorpos anti-STEAP-l da invenção compreendem uma sequência estrutural de consenso da cadeia pesada do subgrupo III humano. A sequência estrutural de consenso da cadeia pesada pode compreender substituição(ões) na posição 24, 37, 48, 67 e/ou 78. A posição 24 pode ser A ou V, a posição 37 pode ser I ou V, a posição 48 pode ser M ou V, a posição 67 pode ser I ou F e/ou a posição 78 pode ser F ou L. Estes anticorpos podem compreender uma sequência estrutural de domínio variável da cadeia pesada de huMAb4D5-8, por exemplo, SEQ ID NO: 21, 22, 23 e 24 (FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4, respetivamente). huMAb4D5-8 é comercialmente conhecido como anticorpo anti-HER2 <s> HERCEPTIN , Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EUA; também referido nas Pat. U.S. N.0 6.407.213 e 5.821.337, e Lee et al. , J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93. Estes anticorpos podem compreender adicionalmente uma sequência estrutural de consenso da cadeia leve κΐ humana. Estes anticorpos podem compreender uma sequência estrutural de domínio variável da cadeia leve de huMAb4D5-8, por exemplo SEQ ID NO: 17, 18, 19 e 20 (FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-L4, respetivamente).
Um anticorpo anti-STEAP-l pode compreender um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência estrutural e regiões hipervariáveis, em que a sequência estrutural compreende a sequência FR-H1-FR-H4 de SEQ ID NO: 21 ou 25 (FR-H1) , 22 (FR-H2) , 23 (FR-H3) , e 24 (FR-H4) , respetivamente; a HVR Hl compreende a sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 14; a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Um anticorpo anti-STEAP-1 pode compreender um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência estrutural e regiões hipervariáveis, em que a sequência estrutural compreende as sequências FR-L1-FR-L4 de SEQ ID NOs: 17, 18, 19 e 20, respetivamente; a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11, 12 e 13. 0 domínio variável da cadeia pesada pode compreender SEQ ID NO: 10 e o domínio variável da cadeia leve compreende SEQ ID NO: 6. A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90Ê, 91Ê, 92Ê, 93Ê, 94Ê, 95Ê, 96Ê, 97Ê, 98Ê ou 99Ê de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou 10. Uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90Ê, 91Ê, 92Ê, 93Ê, 94Ê, 95Ê, 96Ê, 97Ê, 98Ê ou 99Ê de identidade de sequência pode conter substituições, inserções ou eliminações relativamente à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência de aminoácidos retém a capacidade de ligar a STEAP-1. Podem ser substituídos, inseridos ou eliminados um total de 1 a 10 aminoácidos numa sequência de SEQ ID NOs: 9, 10, 14, 15, 16, 21, 22, 23, 24, 25, 75, 76, 77, 78 e/ou 79. As substituições, inserções ou eliminações podem ocorrer em regiões fora das HVR (isto é, nas FR) . Um anticorpo anti-STEAP-1 pode compreender um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou 10. A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada conforme representado na Figura 2B (SEQ ID NO: 10).
As sequências HVR e FR da cadeia pesada descritas no presente documento podem compreender as seguintes: HVR-H1 (GYSITSDYAWN, SEQ ID NO: 14) HVR-H2 (GYISNSGSTSYNPSLKS, SEQ ID NO: 15) HVR-H3 (ERNYDYDDYYYAMDY, SEQ ID NO: 16) FR-H1 (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS, SEQ ID NO: 21) FR-H1 (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVS, SEQ ID NO: 25) FR-H2 (WVRQAPGKGLEWV, SEQ ID NO: 22) FR-H2 (WIRQAPGKGLEWV, SEQ ID NO: 75) FR-H2 (WVRQAPGKGLEWM, SEQ ID NO: 76) FR-H2 (WIRQAPGKGLEWM, SEQ ID NO: 77) FR-H3 (RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR, SEQ ID NO: 23) FR-H3 (RITISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR, SEQ ID NO: 78) FR-H3 (RFTISRDNSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCAR, SEQ ID NO: 79) FR-H4 (WGQGTLVTVSS, SEQ ID NO: 24) A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo um domínio variável da cadeia leve conforme representado na Figura 2A (SEQ ID NO: 6).
As sequências HVR da cadeia leve compreendem as seguintes: HVR-LI (KSSQSLLYRSNQKNYLA, SEQ ID NO: 11) HVR-L2 (WASTRES, SEQ ID NO: 12) HVR-L3 (QQYYNYPRT, SEQ ID NO: 13).
As sequências FR da cadeia leve podem compreender as seguintes: FR-L1 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC, SEQ ID NO: 17); FR-L2 (WYQQKPGKAPKLLIY, SEQ ID NO: 18); FR-L3 (GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC, SEQ ID NO: 19) FR-L4 (FGQGTKVEIKR, SEQ ID NO: 20). A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 9GE, 91 E, 9 2 E, 93E, 94E, 95E, 96E, 9 7 E, 98Ξ ou 9 9 E de identidade de sequência com uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 6. Uma sequência de aminoãcidos tendo pelo menos 90Ê, 91Ê, 92Ξ, 93Ê, 94Ê, 95Ê, 96Ê, 97Ê, 98Ê ou 99Ê de identidade de sequência pode conter substituições, adições ou eliminações relativamente à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência de aminoãcidos retém a capacidade de ligar a STEAP-1. podem ser substituídos, inseridos ou eliminados um total de 1 a 10 aminoãcidos numa sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 6, 17, 18, 19, e 20. As substituições, inserções ou eliminações ocorrem em regiões fora das HVR (isto é, nas FR) . Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-STEAP-1 compreende um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 6. A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo (a) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoãcidos tendo pelo menos 90Ê, 91Ê, 92Ê, 93Ê, 94Ê, 95Ê, 96Ê, 97Ê, 98Ê ou 99Ê de identidade de sequência com uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 9 e 10; e (b) um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoãcidos tendo pelo menos 90Ê, 91Ê, 92Ê, 93Ê, 94Ê, 95Ê, 96Ê, 97Ê, 98Ê ou 99Ê de identidade de sequência com uma sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 6. Uma sequência de aminoãcidos tendo pelo menos 90Ê, 91Ê, 92Ê, 93Ê, 94Ê, 95Ê, 96Ê, 97Ê, 98Ê ou 99Ê de identidade de sequência pode conter substituições, adições ou eliminações relativamente à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência de aminoãcidos retém a capacidade de ligar a STEAP-1. Podem ser substituídos, inseridos ou eliminados um total de 1 a 10 aminoãcidos na sequência de referência, incluindo, mas não limitados a, uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 9, 10, 21, 22, 23, 24, 75, 76, 77, 78, 79. As substituições, inserções ou eliminações ocorrem em regiões fora das HVR (isto é, nas FR) . Um anticorpo anti-STEAP-i pode compreender um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 6. A presente divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo (a) uma, duas ou três HVR de VH selecionadas a partir das mostradas na Figura 2B e/ou (b) uma, duas ou três HVR de VL selecionadas a partir das mostradas na Figura 2A. A divulgação proporciona um anticorpo anti-STEAP-1 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada selecionado a partir dos mostrados na Figura 2B e um domínio variável da cadeia leve selecionado a partir dos mostrados na Figura 2A, 2. Fragmentos de Anticorpo A presente invenção abrange fragmentos de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo podem ser gerados por meios tradicionais, tais como digestão enzimática, ou por técnicas recombinantes. Em determinadas circunstâncias existem vantagens em utilizar fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos completos. 0 menor tamanho dos fragmentos permite uma rápida eliminação, e pode levar a um acesso melhorado aos tumores sólidos. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpo, veja-se Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.
Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja-se, por exemplo, Morimoto et al. , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem atualmente ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos e segregados por E. coli, consequentemente permitindo a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas de anticorpos sobre fagos discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab!-SH podem ser diretamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al. , Bio/Technology 10:163-167 (1992)) . De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. São descritos fragmentos Fab e F(ab')2 com semivida in vivo aumentada compreendendo resíduos de epítopo de ligação a recetores de salvamento na Pat. U.S. N.° 5.869.046. Serão evidentes outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo para o perito na especialidade. Em determinadas formas de realização, um anticorpo é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Veja-se documento WO 93/16185; Pat. U.S. N.°s 5.571.894; e 5.587.458. Fv e os scFv são as únicas espécies com locais de combinação intactos que estão desprovidas de regiões constantes; consequentemente, podem ser adequados para ligação não específica reduzida durante utilização in vivo. Podem ser construídas proteínas de fusão de scFv para obter a fusão de uma proteína efetora no terminal amino ou no terminal carboxi de um scFv. Veja-se Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. 0 fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Pat. U.S. N.° 5.641.870, por exemplo. Estes anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. 3. Anticorpos Humanizados A invenção abrange anticorpos humanizados. São conhecidos vários métodos para humanização de anticorpos não humanos na especialidade. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoãcido não humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente tomados a partir de um domínio variável " importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), substituindo as sequências da região hipervariãvel pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Desse modo, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N.° 4.816.567) em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A eleição de domínios variáveis humanos, tanto da cadeia leve como pesada, a ser utilizados na preparação dos anticorpos humanizados pode ser importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o denominado método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a totalidade da biblioteca de sequências conhecidas de domínios variáveis humanos. A sequência humana que é mais próxima à do roedor é então aceite como a estrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Outro método utiliza uma estrutura particular derivada a partir da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. Pode ser utilizada a mesma estrutura para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623. É ainda geralmente desejável que os anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade elevada para com o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objetivo, de acordo com um método, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Estão normalmente disponíveis modelos tridimensionais de imunoglobulinas e são familiares para os peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para ligar ao seu antigénio. Desta maneira, podem ser selecionados e combinados resíduos de FR a partir das sequências do recetor e importadas de modo a conseguir as características desejadas para o anticorpo, tais como afinidade aumentada para o(s) antigénio(s) alvo. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão diretamente e muito substancialmente envolvidos na influência sobre a ligação ao antigénio. 4. Anticorpos Humanos
Podem ser construídos anticorpos anti-STEAP-1 humanos combinando sequência(s) de domínio variável de clones de Fv selecionadas de bibliotecas de exibição em fagos derivadas a partir de humano com sequências(s) de domínio constante humanas conhecidas conforme descrito acima.
Alternativamente, podem ser preparados anticorpos monoclonals anti-STEAP-1 humanos através do método do hibridoma. Foram descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma de ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991). Ê atualmente possível produzir animais transgénicos (por exemplo ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a eliminação homozigótica do gene da região de união (JH) da cadeia pesada do anticorpo em ratinhos quiméricos e mutante da linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do arranjo de genes de imunoglobulina da linha germinal humana em tais ratinhos mutantes da linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após desafio com o antigénio. Veja-se, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 1: 33 (1993).
Pode também ser utilizado "intercalamento" de genes para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos não humanos, por exemplo de roedor, quando o anticorpo humano tem afinidades e especificidades semelhantes às do anticorpo não humano de partida. De acordo com este método, que é também denominado "imprimação de epítopos", a região variável da cadeia pesada ou leve de um fragmento de anticorpo não humano obtida por técnicas de exibição em fagos conforme descrito no presente documento é substituída por um repertório de genes do domínio V humano, criando uma população de quimeras de scFv ou Fab de cadeia não humana/cadeia humana. A seleção com antigénio resulta no isolamento de um scFv ou Fab quiméricos de cadeia não humana/cadeia humana em que a cadeia humana restaura o local de ligação ao antigénio destruído pela remoção da correspondente cadeia não humana no clone de exibição em fagos primário, isto é, o epítopo governa (imprima) a eleição do parceiro de cadeia humana. Quando o processo é repetido de modo a substituir a restante cadeia não humana, é obtido um anticorpo humano (veja-se a PCT WO 93/06213 publicada a 1 de abril, 1993) . Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos não humanos por enxerto das CDR, esta técnica proporciona anticorpos completamente humanos, que não têm resíduos de FR ou CDR de origem não humana. 5. Anticorpos Biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser anticorpos humanos ou humanizados. Em determinadas formas de realização, uma das especificidades de ligação é para STEAP-1 e a outra é para qualquer outro antigénio. Em determinadas formas de realização, os anticorpos biespecíficos podem ligar a dois epítopos diferentes de STEAP-1. Os anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para orientar agentes citotóxicos para células que expressam STEAP-1. Estes anticorpos têm um braço de ligação a STEAP-1 e um braço que liga a um agente citotóxico, tal como, por exemplo, saporina, anti interferão-a, alcaloide de vinca, cadeia A da ricina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo. Podem ser preparados anticorpos biespecíficos na forma de anticorpos de comprimento completo ou de fragmentos de anticorpo (por exemplo anticorpos biespecíficos F(ab')2). São conhecidos métodos para a preparação de anticorpos biespecíficos na especialidade. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Devido à distribuição aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais somente uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é habitualmente realizada por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada, e os rendimentos do produto são baixos. São divulgados procedimentos semelhantes no documento WO 93/08829 publicado a 13 de maio, 1993, e em Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655 (1991) .
De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis dos anticorpos com as especificidades de ligação (locais de combinação anticorpo-antigênio) desejadas são fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão, por exemplo, é com um domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. Em determinadas formas de realização, a primeira região constante da cadeia pesada (CHI), contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve, está presente em pelo menos uma das fusões. São inseridos ADN que codificam as fusões da cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, da cadeia leve de imunoglobulina, em vetores de expressão separados, que são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em formas de realização em que proporções desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam os rendimentos ótimos. É, contudo, possível inserir as sequências de codificação para duas ou para as três cadeias polipeptídicas num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não têm particular significado.
Numa forma de realização desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrido (que proporciona uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Foi constatado que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado a partir de combinações indesejadas de cadeias de imunoglobulina, dado que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona uma maneira fácil de separação. Esta abordagem é divulgada no documento WO 94/04690. Para mais detalhes da geração de anticorpos biespecíficos veja-se, por exemplo, Suresh et al. , Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acordo com outra abordagem, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinantes. A interface compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoãcidos pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo tirosina ou triptofano). São criadas "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(ais) grandes na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo as cadeias laterais de aminoãcidos grandes por cadeias mais pequenas (por exemplo alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero relativamente a outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Estes anticorpos foram, por exemplo, propostos para orientar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente US 4.676.980), e para o tratamento de infeção por HIV (documentos WO 91/00360, WO 92/00373, e EP 03089). Podem ser preparados anticorpos heteroconjugados utilizando qualquer método conveniente de reticulação. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na especialidade, e estão divulgados na Patente US 4.676.980, juntamente com várias técnicas de reticulação.
Foram também descritas técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo na literatura. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos biespecíficos utilizando ligação química. Brennan et al. , Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vizinhos e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab! gerados são então convertidos em derivados tionitrobenzoato (TNB) . Um dos derivados Fab’-TNB é então reconvertido no Fab!-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas. 0 progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab!-SH a partir de E. colí, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al. , J. Exp. Meã., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico completamente humanizado F(ab')2. Cada fragmento Fab’ foi segregado separadamente a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. 0 anticorpo biespecífico consequentemente formado foi capaz de ligar a células que sobreexpressam o recetor de HER2 e células T humanas normais, bem como desencadear a atividade lítica de linfócitos citotõxicos humanos contra alvos tumorais da mama humanos.
Foram também descritas várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpo biespecíficos diretamente a partir da cultura de células recombinantes. Por exemplo, foram produzidos anticorpos biespecíficos utilizando fechos de leucina. Kostelny et al, , J. Immunol., 148(5) :1547-1553 (1992) . Os péptidos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às frações Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão génica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formar monómeros e posteriormente reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpo biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, consequentemente formando dois locais de ligação ao antigénio. Foi também relatada outra estratégia para preparar fragmentos biespecíficos de anticorpos utilizando dímeros de Fv de cadeia única (sFv). Veja-se Gruber et ai., J. Immunol., 152:5368 (1994) . São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). 6. Anticorpos Multivalentes
Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rapidamente do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antigénio ao qual os anticorpos ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que são outros para além da classe IgM) com três ou mais locais de ligação ao antigénio (por exemplo anticorpos tetravalentes), que podem ser prontamente produzidos por expressão recombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. 0 anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais locais de ligação ao antigénio. Em determinadas formas de realização, o domínio de dimerização compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais locais de ligação ao antigénio amino-terminais relativamente à região Fc. Em determinadas formas de realização, um anticorpo multivalente compreende (ou consiste em) três a cerca de oito locais de ligação ao antigénio. Numa destas formas de realização, um anticorpo multivalente compreende (ou consiste em) quatro locais de ligação ao antigénio. 0 anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (por exemplo, duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreendem dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) podem compreender VD1-(XI)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, XI e X2 representam um aminoácido ou polipéptido, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia (s) polipeptídica (s) podem compreender: VH-CHl-ligant.e flexível-VH-CHl-cadeia da região Fc; ou VH-CH1-VH-CH1-cadeia da região Fc. 0 anticorpo multivalente no presente documento pode adicionalmente compreender pelo menos dois (por exemplo, quatro) polipéptidos de domínio variável da cadeia leve. 0 anticorpo multivalente no presente documento pode, por exemplo, compreender de cerca de dois a cerca de oito polipéptidos de domínio variável da cadeia leve. Os polipéptidos de domínio variável da cadeia leve contemplados no presente documento compreendem um domínio variável da cadeia leve e, opcionalmente, compreendem adicionalmente um domínio CL. 7. Anticorpos de Domínio Único
Um anticorpo da invenção pode ser um anticorpo de domínio único. Um anticorpo de domínio único ê uma cadeia polipeptídica única compreendendo a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Um anticorpo de domínio único pode ser um anticorpo humano de domínio único (Domantis, Inc., Waltham, ΜΆ; veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N.° 6.248.516 Bl). Um anticorpo de domínio único consiste na totalidade ou numa porção do domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo. 8. Variantes de Anticorpos
Nalgumas formas de realização, estão contempladas modificação(ões) na sequência de aminoácidos dos anticorpos descritos no presente documento. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Podem ser preparadas variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo por introdução de alterações adequadas na sequência de nucleótidos que codifica o anticorpo, ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, eliminações e/ou inserções e/ou substituições de resíduos no interior das sequências de aminoácidos do anticorpo.
Pode ser realizada qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição para chegar à construção final, contanto que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos do anticorpo do indivíduo no momento em que a sequência é preparada.
Um método útil para a identificação de determinados resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações preferidas para mutagénese é denominado "mutagénese por varrimento de alaninas" conforme descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aqui, são identificados um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituídos por um aminoãcido neutro ou com carga negativa (por exemplo, alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antigénio. As localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinadas por introdução de variantes adicionais, ou outras variantes em, ou em vez de, os locais de substituição. Consequentemente, embora o local para introdução de uma variação na sequência de aminoácidos esteja predeterminado, a natureza da mutação em si não precisa de ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num determinado local, é levada a cabo mutagénese por varrimento de ala ou aleatória no codão ou região alvo e as imunoglobulinas expressas são rastreadas para a atividade desejada.
As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões amino-e/ou carboxilo-terminais variando de comprimento de um resíduo a polipéptidos contendo uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intra-sequência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionilo N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão do terminal N ou do terminal C do anticorpo a uma enzima (por exemplo para ADEPT) ou um polipéptido que aumenta a semivida no soro do anticorpo.
Em determinadas formas de realização, um anticorpo da invenção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A glicosilação de polipéptidos é tipicamente ligada a N ou ligada a 0. Ligada a N refere-se à união de uma fração de hidrato de carbono na cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoãcido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para união enzimãtica da fração hidrato de carbono à cadeia lateral da asparagina. Consequentemente, a presença de uma destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um local potencial de glicosilação. Glicosilação ligada a 0 refere-se à união de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose num hidroxiaminoácido, mais vulgarmente serina ou treonina, embora também possam ser utilizadas 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição ou a eliminação de locais de glicosilação no anticorpo é convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoãcidos de modo a ser criada ou removida uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para locais de glicosilação ligada a N). A alteração pode também ser realizada através de adição, eliminação ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação ligada a 0).
Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o hidrato de carbono a ligado à mesma pode ser alterado. Por exemplo, são descritos anticorpos com uma estrutura de hidratos de carbono matura que carece de fucose ligada a uma região Fc do anticorpo no pedido de Pat. US N.° 2003/0157108 (Presta, L.). veja-se também o documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . São referidos anticorpos com uma N- acetilglucosamina (GlcNAc) de bifurcação no hidrato de carbono ligado a uma região Fc do anticorpo em documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. e na Patente US 6.602.684, Umana et al. São relatados anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacárido ligado a uma região Fc do anticorpo em documento WO 1997/30087, Patel et al. Veja-se, também, os documentos WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO 1999/22764 (Raju, S.) relativamente a anticorpos com hidratos de carbono alterados ligados à região Fc dos mesmos. Veja-se também o documento US 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas de ligação ao antigénio com glicosilação modificada.
Em determinadas formas de realização, uma variante de glicosilação compreende uma região Fc, em que uma estrutura de hidratos de carbono ligada à região Fc carece de fucose. Estas variantes têm uma função de ADCC melhorada. Opcionalmente, a região Fc compreende adicionalmente uma ou mais substituições de aminoãcidos na mesma que melhoram adicionalmente a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração Eu de resíduos). Exemplos de publicações relacionadas com anticorpos "desfucosilados" ou "deficientes em fucose" incluem: documentos US 2003/0157108; WO 2000/ 61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/ 0110282; US 2004/0109865; documento WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; documento WO 2005/035778; W02005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) . Exemplos de linhas celulares produtoras de anticorpos desfucosilados incluem células CHO Lecl3 deficientes em fucosilação de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); pedido de Pat. 2003/0157108 Al, Presta, L; e documento WO 2004/056312 Al, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhas celulares knockout, tais como células CHO knockout no gene da alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, (Yamane-Ohnuki et ai. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).
Numa forma de realização, o anticorpo é alterado para melhorar a sua semivida sérica. Para aumentar a semivida sérica do anticorpo, pode ser incorporado um epítopo de ligação ao recetor de salvamento no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) conforme descrito no documento US 5739277, por exemplo. Conforme utilizado no presente documento, a expressão "epítopo de ligação ao recetor de salvamento" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semivida sérica in vivo da molécula de IgG (documento US 2003/0190311, US 6821505; US 6165745; US 5624821; US 5648260; US 6165745; US 5834 597) .
Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoãcidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoãcido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os locais de interesse para mutagénese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas estão também contempladas alterações em FR. São mostradas na Quadro 1 substituições conservativas sob o título de "substituições preferidas." Se estas substituições resultarem numa alteração desejável na atividade biológica, então podem ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" no Quadro 1, ou conforme descrito adicionalmente abaixo em referência às classes dos aminoãcidos, e os produtos rastreados. QUADRO 1
São obtidas modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo selecionando substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da cadeia estrutural polipeptídica na área da substituição, por exemplo, na forma de uma conformação em lâmina ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no seu local alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com semelhanças nas propriedades das suas cadeias laterais (em A.L. Lehninger, em Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nova Iorque(1975)): (1) não polares: Ala (A), Vai (V), Leu (L), lie (I), Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (Ξ) (4) básicos: Lys (K), Arg (R) , His(H)
Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly,
Pro ; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
As substituições não conservativas implicarão a permuta de um membro de uma destas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos locais de substituição conservativa ou, nos locais restantes (não conservados).
Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionadas para desenvolvimento adicional terão propriedades biológicas modificadas (por exemplo, melhoradas) relativamente ao anticorpo parental a partir do qual são geradas. Uma maneira conveniente para gerar estas variantes de substituição envolve maturação por afinidade utilizando exibição em fagos. Brevemente, são mutados vários locais da região hipervariável (por exemplo 6-7 locais) para gerar todas as possíveis substituições de aminoácidos em cada local. Os anticorpos consequentemente gerados são exibidos a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões com pelo menos parte de uma proteína de revestimento de fago (por exemplo, o produto do gene III de M13) empacotada no interior de cada partícula. As variantes exibidas em fagos são então rastreadas para a sua atividade biológica (por exemplo afinidade de ligação). De modo a identificar locais da região hipervariãvel candidatos para modificação, pode ser realizada mutagénese de varrimento (por exemplo, varrimento de alaninas) para identificar resíduos da região hipervariãvel que contribuem significativamente para a ligação ao antigénio. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o antigénio. Estes resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com técnicas conhecidas na especialidade, incluindo as elaboradas no presente documento. Após serem geradas estas variantes, o painel de variantes é submetido a rastreio utilizando técnicas conhecidas na especialidade, incluindo as descritas no presente documento, e podem ser selecionados anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes para desenvolvimento adicional.
As moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequências de aminoãcidos do anticorpo são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoãcidos de ocorrência natural) ou a preparação por mutagénese mediada por oligonucleõtidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR e mutagénese por cassetes de uma variante anteriormente preparada ou de uma versão não variante do anticorpo.
Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoãcidos numa região Fc dos anticorpos da invenção, como tal gerando uma região Fc variante. A região Fc variante pode compreender uma sequência de uma região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo uma substituição) em uma ou mais posições de aminoãcidos incluindo a de uma cisteína de dobradiça.
De acordo com esta descrição e com os ensinamentos da técnica, é contemplado que nalgumas formas de realização, um anticorpo da invenção possa compreender uma ou mais alterações em comparação com o anticorpo homólogo de tipo selvagem, por exemplo na região Fc. Estes anticorpos não obstante reteriam substancialmente as mesmas características requeridas para utilidade terapêutica em comparação com o seu homólogo de tipo selvagem. Por exemplo, é acreditado que podem ser efetuadas determinadas alterações na região Fc que irão resultar em alteração (isto é, ou melhoria ou diminuição) da ligação a Clq e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito no documento W099/51642. Veja-se também Duncan e Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente U.S. N.° 5.648.260; Patente U.S. N.° 5.624.821; e documento WO 94/29351 relativamente a outros exemplos de regiões Fc variantes. Os documentos WO 00/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída a FcR. Veja-se, também, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2) : 6591-6604 (2001) . Os anticorpos com semividas aumentadas e ligação melhorada ao recetor de Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgG maternas ao feto (Guyer et ai., J.
Immunol. 117:587 (1976) e Kim et ai., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos no documento US 2005/0014934A1 (Hinton et al.) . Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que melhoram a ligação da região Fc a FcRn. São descritas variantes polipeptídicas com sequências de aminoãcidos da região Fc alteradas e capacidade de ligação a Clq aumentada ou diminuída na Patente US 6.194.551B1, documento W099/51642. Veja-se, também, Idusogie et ai. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) .
Num aspeto, a invenção proporciona anticorpos compreendendo modificações na interface de polipéptidos de
Fc compreendendo a região Fc, em que as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Estas modificações compreendem a introdução de uma protuberância num primeiro polipéptido de Fc e uma cavidade num segundo polipéptido de Fc, em que a protuberância é posicionável na cavidade de modo a promover a complexação dos primeiro e segundo polipéptidos de Fc. São conhecidos métodos para gerar anticorpos com estas modificações na técnica, por exemplo, conforme descrito em Pat. U.S. N.° 5.731.168.
Sn ^2 ν'* T rra λ e? rí λ 2 n 7 λλ λ * JJSjl2.vB.Q,OS uc JiH:UXC03r]p0
Os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente modificados para conter frações não proteãceas adicionais que são conhecidas na técnica e estão prontamente disponíveis. Preferentemente, as frações adequadas para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoãcidos (quer homopolímeros quer copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinilpirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. 0 propionaldeído de polietilenoglicol pode ter vantagens no fabrico devido à sua estabilidade em água. 0 polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. 0 número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se estiver mais do que um polímero ligado, estes podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou o tipo de polímeros utilizados para derivatização podem ser determinados com base em considerações incluindo, mas não limitadas a, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a ser melhorado, se o derivado de anticorpo será utilizado numa terapêutica sob condições definidas, etc.
Noutra forma de realização, são proporcionados conjugados de um anticorpo e uma fração não proteácea que podem ser seletivamente aquecidos por exposição a radiação. Numa forma de realização, a fração não proteácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não está limitada a, comprimentos de onda que não prejudicam células vulgares, mas que aquecem a fração não proteácea a uma temperatura à qual as células proximais da fração não proteácea do anticorpo são mortas.
Determinados Métodos de Preparação de Anticorpos 1. Determinados Métodos â Base de Hibridomas
Os anticorpos monoclonais anti-STEAP-1 da invenção podem ser preparados utilizando o método do hibridoma descrito inicialmente por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (Patente U.S. N.° 4.816,567).
No método do hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro adequado, tal como um hámster, é imunizado para eliciar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se irão ligar especifícamente à proteína utilizada para a imunização. Os anticorpos contra STEAP-1 são geralmente criados em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) de STEAP-1 e um adjuvante. STEAP-1 pode ser preparada utilizando métodos bem conhecidos na especialidade, alguns dos quais são adicionalmente descritos no presente documento. Por exemplo, STEAP-1 pode ser produzida recombinantemente. Numa forma de realização, são imunizados animais com um derivado de STEAP-1 que contém uma fração extracelular de STEAP-1 fundida à fração Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Numa forma de realização, os animais são imunizados com uma proteína de fusão STEAP-l-IgGl. Numa forma de realização, os animais são imunizados com derivados imunogénicos de STEAP-1 numa solução com lípido de monofosforilo A (MPL)/ dicrinomicolato de trealose (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT), e a solução é injetada intradermicamente em múltiplos locais. Duas semanas mais tarde os animais recebem reforços. Sete a catorze dias mais tarde os animais são sangrados, e o soro é testado para ao título de anti-STEAP-1. Os animais recebem reforços até atingirem patamares de título.
Alternativamente, podem ser imunizados linfõcitos in vitro. Os linfõcitos são posteriormente fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp,59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma consequentemente preparadas são semeadas e cultivadas num meio de cultura adequado, por exemplo, um meio que contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais, não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não carecem da enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
Em determinadas formas de realização, as células de mieloma são aquelas que se fundem eficazmente, suportam a produção estável e de nível elevado de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Células de mieloma exemplares incluem, mas não estão limitadas a, linhas de mieloma de ratinho, tais como as derivadas a partir dos tumores de ratinho M0PC-2Í e MPC-11 disponíveis no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA, e as células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et ai. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). O meio de cultura em que as células de hibridoma são crescidas é testado para a produção de anticorpos monoclonais que ligam a STEAP-1. Preferentemente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio imunoadsorvente com ligação a enzimas (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada através de análise Scatchard de Munson et al. , Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Após serem identificadas células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e cultivados por métodos padrão (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp,59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores ascíticos num animal. Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido ascítico, ou soro por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatite, proteína A-Sepharose, eletroforese em gel, diãlise ou cromatografia de afinidade. 2. Determinados Métodos de Rastreío de Bibliotecas
Podem ser preparados anticorpos anti-STEAP-1 da invenção utilizando bibliotecas combinatórias para o rastreío de anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, são conhecidos na especialidade uma variedade de métodos para a geração de bibliotecas de exibição em fagos e rastreío de tais bibliotecas para anticorpos tendo as características de ligação desejadas. Tais métodos são descritos genericamente em Hoogenboom et al. (2001) em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ) , e em determinadas formas de realização, em Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093 .
Em princípio, são selecionados clones de anticorpos sintéticos por rastreío de bibliotecas de fagos contendo fagos que exibem vários fragmentos de regiões variáveis de anticorpos (Fv) fundidos com a proteína de revestimento de fago. Tais bibliotecas de fagos são selecionadas por cromatografia de afinidade contra o antigénio desejado. Os clones que expressam fragmentos de Fv capazes de ligar ao antigénio desejado são adsorvidos no antigénio e consequentemente são separados dos clones não ligantes na biblioteca. Os clones ligantes são então eluídos a partir do antigénio, e podem ser adicionalmente enriquecidos por ciclos adicionais de adsorção/eluição de antigénio. Qualquer dos anticorpos anti-STEAP-1 da invenção pode ser obtido desenhando um procedimento de rastreío adequado para 0 antigénio para selecionar o clone de fago de interesse seguido por construção de um clone de anticorpo anti-STEAP-
1 de comprimento completo utilizando as sequências de Fv do clone de fago de interesse e as sequências adequadas da região constante (Fc) descritas em Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH
Publicação 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
Em determinadas formas de realização, o domínio de ligação a antigénio de um anticorpo é formado a partir de duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, uma de cada a partir das cadeias leve (VL) e pesada (VH) , que mostram ambas três ansas hipervariáveis (HVR) ou regiões determinantes de complementaridade (CDR). Os domínios variáveis podem ser exibidos funcionalmente sobre fagos, quer na forma de fragmentos Fv de cadeia única (scFv), em que VH e VL estão covalentemente ligadas através de um péptido curto, flexível, quer na forma de fragmentos Fab, em que estão fundidos com um domínio constante e interatuam não covalentemente, conforme descrito em Winter et al. , Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Conforme utilizado no presente documento, clones de fagos que codificam scFv e clones de fagos que codificam Fab são coletivamente referidos como "clones de fagos de Fv" ou "clones de Fv".
Podem ser clonados repertórios de genes de VH e VL separadamente por reação em cadeia por polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem posteriormente ser pesquisadas para clones de ligação ao antigénio conforme descrito em Winter et al. , Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). As bibliotecas a partir de fontes imunizadas proporcionam anticorpos de elevada afinidade contra o agente imunogénico sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, o repertório naive pode ser clonado para proporcionar uma fonte única de anticorpos humanos contra um amplo intervalo de antigénios não próprios e também próprios sem qualquer imunização conforme descrito por Griffiths et al. , EMBO J. , 12: 725-734 (1993) . Finalmente, podem também ser preparadas bibliotecas naive sinteticamente por clonagem dos segmentos de genes V não redispostos a partir de células estaminais, e utilizando iniciadores de PCR contendo sequências aleatórias para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para realizar a redisposição in vitro conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Em determinadas formas de realização, é utilizado fago filamentoso para exibir fragmentos de anticorpo por fusão com a proteína de revestimento menor pill. Os fragmentos de anticorpo podem ser exibidos na forma de fragmentos Fv de cadeia única, em que os domínios VH e VL estão ligados na mesma cadeia polipeptídica através de um espaçador polipeptídico flexível, por exemplo conforme descrito por Marks et al. , J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou como fragmentos Fab, em que uma cadeia está fundida com pill e a outra é segregada para o periplasma da célula hospedeira bacteriana onde ocorre montagem de uma estrutura Fab-proteína de revestimento que é exibida sobre a superfície do fago por deslocamento de algumas das proteínas de revestimento do tipo selvagem, por exemplo conforme descrito em Hoogenboom et al. , Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991) .
Em geral, são obtidos ácidos nucleicos que codificam os fragmentos de genes do anticorpo a partir de células imunitárias recolhidas a partir de seres humanos ou animais. Se for desejada uma biblioteca desviada a favor de clones anti-STEAP-1, o indivíduo é imunizado com STEAP-1 para gerar uma resposta de anticorpos, e são recuperadas células do baço e/ou células B circulantes para além de linfócitos do sangue periférico (PBL) para a construção da biblioteca. Numa forma de realização preferida, é obtida uma biblioteca de fragmentos de genes do anticorpo humano desviada a favor de clones anti-STEAP-1 gerando uma resposta de anticorpos anti-STEAP-1 em ratinhos transgénicos portadores de um arranjo de genes de imunoglobulina humana funcional (e carecendo de um sistema de produção de anticorpos endógenos funcional) de modo que a imunização com STEAP-1 dá origem a células B produtoras de anticorpos contra STEAP-1 humanas. A geração de ratinhos transgénicos produtores de anticorpos humanos é descrita abaixo.
Pode ser obtido enriquecimento adicional em populações de células reativas anti-STEAP-1 utilizando um procedimento de rastreio adequado para isolar células B que expressam anticorpo específico para STEAP-1 ligado à membrana, por exemplo, por separação celular utilizando cromatografia de afinidade com STEAP-1 ou adsorção de células a STEAP-1 marcada com fluorocromos seguida por separação de células ativada por fluxo (FACS).
Alternativamente, a utilização de células do baço e/ou de células B ou outros PBL a partir de um dador não imunizado proporciona uma melhor representação do possível repertório de anticorpos, e também permite a construção de uma biblioteca de anticorpos utilizando qualquer espécie animal (humana ou não humana) em que a STEAP-1 não é antigénica. Para bibliotecas que incorporam a construção génica do anticorpo in vitro, são recolhidas células estaminais a partir do indivíduo para proporcionar ácidos nucleicos que codificam segmentos de genes de anticorpos não redispostos. As células imunitárias de interesse podem ser obtidas a partir de uma variedade de espécies animais, tais como seres humanos, de ratinho, de rato, lagomorfos, lupinos, caninos, felinos, suínos, bovinos, equinos e aviários, etc. São recuperados ácidos nucleicos que codificam segmentos génicos variáveis de anticorpo (incluindo segmentos VH e VL) a partir das células de interesse e amplificados. No caso de bibliotecas de genes de VH e VL redispostos, o ADN desejado pode ser obtido por isolamento de ADN genómico ou ARNm de linfõcitos seguido por reação em cadeia por polimerase (PCR) com iniciadores correspondentes às extremidades 5' e 3! dos genes de VH e VL redispostos conforme descrito em Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 3833-3837 (1S89), preparando como tal repertórios de genes V diversos para expressão. Os genes V podem ser amplificados a partir de ADNc e ADN genõmico, com iniciadores reversos na extremidade 5' do exão que codifica o domínio V maduro e iniciadores diretos baseados no interior do segmento J conforme descrito em Orlandi et al. (1989) e em Ward et al. , Nature, 341: 544-546 (1989). Contudo, para a amplificação a partir de ADNc, os iniciadores reversos podem também ser baseados no exão de comando conforme descrito em Jones et al. , Biotechnol., 9: 88-89 (1991), e iniciadores diretos no interior da região constante conforme descrito em Sastry et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar a complementaridade, pode ser incorporada degenerescência nos iniciadores conforme descrito em Orlandi et al. (1989) ou Sastry et al. (1989). Em determinadas formas de realização, a diversidade da biblioteca é maximizada utilizando iniciadores de PCR orientados para cada família de genes V de modo a amplificar todas as disposições de VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucleico de células imunitárias, por exemplo conforme descrito no método de Marks et al. , J. Mol. Biol. , 222: 581-597 (1991) ou conforme descrito no método de Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993) . Para a clonagem do ADN amplificado nos vetores de expressão, podem ser introduzidos locais de restrição raros no interior do iniciador de PCR como marcador numa extremidade conforme descrito em Orlandi et al. (1989), ou por amplificação adicional por PCR com um iniciador marcado conforme descrito em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).
Os repertórios de genes V sinteticamente rearranjados podem ser derivados in vitro a partir de segmentos de genes V. A maioria dos segmentos de genes VH humanos foram clonados e sequenciados (relatado em Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), e mapeados (relatado em
Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas as conformações principais da ansa Hl e H2) podem ser utilizados para gerar repertórios de diversos genes VH com iniciadores de PCR que codificam voltas H3 de diversas sequências e comprimentos conforme descrito em Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Podem também ser preparados repertórios de VH com toda a diversidade de sequências focada numa ansa H3 longa de um único comprimento conforme descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4457-4461 (1992). Foram clonados segmentos de Vk e VX humanos e sequenciados (relatado em Williams e Winter, Euz\ J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser utilizados para preparar repertórios de cadeias leves sintéticos. Os repertórios sintéticos de genes V, baseados numa gama de ansas VH e VL, e comprimentos de L3 e H3, irão codificar anticorpos de diversidade estrutural considerável. Após amplificação dos ADN que codificam os genes V, os segmentos de genes V da linha germinal podem ser redispostos in vitro de acordo com os métodos de Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol.i 227: 381-388 (1992).
Podem ser construídos repertórios de fragmentos de anticorpo combinando repertórios de genes VH e VL juntos de várias maneiras. Cada repertório pode ser criado em vetores diferentes, e os vetores podem ser recombinados in vitro, por exemplo, conforme descrito em Hogrefe et al. , Gene, 128: 119-126 (1993), ou in vivo por infeção combinatória, por exemplo, o sistema loxP descrito em Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). A abordagem de recombinação in vivo explora a natureza de duas cadeias dos fragmentos Fab para ultrapassar o limite sobre a dimensão da biblioteca imposto pela eficiência da transformação de E. colí. São clonados repertórios de VH e VL naive separadamente, um num fagemídeo e o outro num vetor de fago. As duas bibliotecas são então combinadas por infeção de fago de bactérias contendo fagemídeo de modo que cada célula contém uma combinação diferente e a dimensão da biblioteca está limitada somente pelo número de células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos os vetores contêm sinais de recombinação in vivo de modo que os genes VH e VL são recombinados num único replicão e são co-empacotados em viriões de fagos. Estas enormes bibliotecas proporcionam grandes números de anticorpos diversos de boa afinidade (Kd”1 de cerca de 10“8 M).
Alternativamente, os repertórios podem ser clonados sequencialmente no mesmo vetor, por exemplo conforme descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou montados em conjunto por PCR e posteriormente clonados, por exemplo conforme descrito em Clackson et al. , Nature, 352: 624-628 (1991) . Pode também ser utilizada montagem por PCR para unir os ADN de VH e VL com ADN que codifica um espaçador peptídico flexível para formar repertórios de Fv de cadeia única (scFv). Ainda noutra técnica é utilizada "montagem por PCR na célula" para combinar genes de VH e VL no interior de linfõcitos por PCR e posteriormente repertórios de clone de genes ligados como descrito em Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20 : 3831-3837 (1992) .
Os anticorpos produzidos por bibliotecas naive (quer naturais quer sintéticas) podem ser de afinidade moderada (Kd”1 de cerca de 106 a 107 M”1), mas a maturação por afinidade pode também ser imitada in vitro construindo e re-seleccionando a partir de bibliotecas secundárias conforme descrito em Winter et al. (1994), supra. Por exemplo, pode ser introduzida uma mutação aleatoriamente in vitro utilizando polimerase propensa a erros (relatada em Leung et al. , Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de
Hawkins et al. , J. Mol. Bíol. , 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 89: 3576-3580 (1992), Adicionalmente, pode ser realizada maturação por afinidade por mutação aleatória de uma ou mais CDR, por exemplo utilizando PCR com iniciadores portando sequências aleatórias dispersos pelas CDR de interesse, em clones de Fv individuais selecionados e rastreio para clones de afinidade mais elevada. 0 documento WO 9607754 (publicado a 14 de março de 19 96) descreve um método para indução de mutagénese numa região determinante de complementaridade de uma cadeia leve de imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes de cadeia leve. Outra abordagem eficaz consiste em recombinar os domínios VH ou VL selecionados por exibição em fagos com repertórios de variantes de domínio V de ocorrência natural obtidas de dadores não imunizados e rastrear quanto a maior afinidade em vários ciclos de novo intercalamento de cadeias conforme descrito em Marks et ai., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades de cerca de 10m ou menos.
Pode ser realizado rastreio das bibliotecas através de várias técnicas conhecidas na especialidade. Por exemplo, pode ser utilizada STEAP-1 para revestir os poços de placas de adsorção, expressa em células hospedeiras afixadas a placas de adsorção ou utilizadas em seleção de células, ou conjugadas com biotina para captura com microesferas revestidas de estreptavidina, ou utilizadas em qualquer outro método para seleção de bibliotecas de exibição em fagos.
As amostras de bibliotecas de fagos são colocadas em contacto com STEAP-1 imobilizada sob condições adequadas para ligação de pelo menos uma fração das partículas de fago ao adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo pH, força iónica e temperatura, são selecionadas para imitar as condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e posteriormente eluídos por ácido, por exemplo conforme descrito em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 88: 7978-7982 (1991), ou por alcalino, por exemplo conforme descrito em Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 ¢1991), ou por competição com antigénio STEAP-1, por exemplo num procedimento semelhante ao método de competição com antigénio de Clackson et al. , Nature, 352: 624-628 (1991). Os fagos podem ser enriquecidos 20-1000 vezes num único ciclo de seleção. Adicionalmente, os fagos enriquecidos podem ser cultivados em cultura bacteriana e submetidos a ciclos adicionais de seleção. A eficácia da seleção depende de muitos fatores, incluindo a cinética de dissociação durante a lavagem, e se múltiplos fragmentos de anticorpo num único fago podem simultaneamente estar envolvidos com o antigénio. Os anticorpos com cinética de dissociação rápida (e fracas afinidades de ligação) podem ser retidos utilizando lavagens curtas, exibição multivalente em fagos e densidade elevada de revestimento de antigénio em fase sólida. A densidade elevada não só estabiliza o fago através de interações multivalentes, mas também favorece a nova ligação do fago que se dissociou. A seleção de anticorpos com cinética de dissociação lenta (e boas afinidades de ligação) pode ser promovida por utilização de lavagens longas e exibição monovalente em fagos conforme descrito em Bass et al. , Proteins, 8: 309-314 (1990) e no documento WO 92/09690, e uma baixa densidade de revestimento de antigénio conforme descrito em Marks et al. , Biotechnol. , 10 : 779-783 (1992) . Ê possível selecionar entre anticorpos de fagos de diferentes afinidades, inclusive com afinidades que diferem ligeiramente, para STEAP-1. Contudo, a mutação aleatória de um anticorpo selecionado (por exemplo conforme realizado nalgumas técnicas de maturação por afinidade) é propensa a dar origem a muitos mutantes, a maioria ligando ao antigénio, e poucos com maior afinidade. Com STEAP-1 limitante, pode haver competição com fagos de elevada afinidade raros. Para reter todos os mutantes de maior afinidade, os fagos podem ser incubados com excesso de STEAP-1 biotinilada, mas com STEAP-1 biotinilada numa concentração de menor molaridade do que a constante de afinidade molar alvo para STEAP-1. Os fagos com ligação de elevada afinidade podem então ser capturados por microesferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. Esta "captura de equilíbrio" permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com as suas afinidades de ligação, com sensibilidade que permite o isolamento de clones mutantes com afinidade tão baixa quanto duas vezes superior a partir de um grande excesso de fagos com menor afinidade. As condições utilizadas na lavagem dos fagos ligados a uma fase sólida podem também ser manipuladas para discriminar com base na cinética da dissociação.
Podem ser selecionados clones ant.i-STEAP-1 com base na atividade. Em determinadas formas de realização, a invenção proporciona anticorpos anti-STEAP-1 que ligam a células vivas que expressam naturalmente STEAP-1. Numa forma de realização, a invenção proporciona anticorpos anti-STEAP-1 que bloqueiam a ligação entre um ligando de STEAP-1 e STEAP-1, mas não bloqueiam a ligação entre um ligando STEAP-1 e uma segunda proteína. Os clones de Fv correspondentes a estes anticorpos anti-STEAP-1 podem ser selecionados por (1) isolamento de clones anti-STEAP-1 a partir de uma biblioteca de fagos conforme descrito acima, e opcionalmente amplificação da população isolada de clones de fagos por crescimento da população num hospedeiro bacteriano adequado; (2) seleção de STEAP-1 e uma segunda proteína contra a qual é desejada atividade bloqueante e não bloqueante, respetivamente; (3) adsorção dos clones de fagos anti-STEAP-1 a STEAP-1 imobilizada; (4) utilização de um excesso da segunda proteína para eluir quaisquer clones indesejados que reconhecem determinantes de ligação a STEAP-1 que se sobrepõem a, ou são partilhados por, os determinantes de ligação da segunda proteína; e (5) eluição dos clones que permanecem adsorvidos após a etapa (4) . Opcionalmente, podem ser adicionalmente enriquecidos clones com propriedades bloqueantes/não bloqueantes desejadas por repetição dos procedimentos de seleção descritos no presente documento, uma ou mais vezes. 0 ADN que codifica anticorpos monoclonais derivados de hibridomas ou clones de Fv por exibição em fagos da invenção é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo utilizando iniciadores oligonucleotídicos desenhados para amplificar especificamente as regiões de codificação da cadeia pesada e leve de interesse a partir de um hibridoma ou um molde de ADN de fago). Após ser isolado, o ADN pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfetados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hámster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais desejados nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de ADN de codificação de anticorpos incluem Skerra et ai. , Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992). 0 ADN que codifica os clones de Fv da invenção pode ser combinado com sequências de ADN conhecidas que codificam regiões constantes da cadeia pesada e/ou da cadeia leve (por exemplo as sequências de ADN adequadas podem ser obtidas a partir de Kabat et al., supra) para formar clones que codificam cadeias pesadas e/ou leves de comprimento completo ou parcial. Será notado que podem ser utilizadas regiões constantes de qualquer isotipo para este fim, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, igD, e IgE, e que estas regiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal. Um clone de Fv derivado do ADM do domínio variável de uma espécie animal (tal como o ser humano) e posteriormente fundido com o ADN da região constante de outra espécie animal para formar sequência(s) de codificação para cadeias pesadas e/ou cadeias leves "híbridas" de comprimento completo está incluído na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido" conforme utilizado no presente documento. Em determinadas formas de realização, um clone de Fv derivado de ADN variável humano é fundido com ADN da região constante humana para formar sequência (s) de codificação para cadeias pesadas e/ou leves de comprimento completo ou parcial humanas. 0 ADN que codifica anticorpo anti-STEAP-1 derivado de um hibridoma da invenção pode também ser modificado, por exemplo, por substituição da sequência de codificação para domínios constantes da cadeia pesada e leve humanos em vez de sequências homólogas murinas derivadas do clone do hibridoma (por exemplo conforme no método de Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)) . 0 ADN que codifica um anticorpo ou fragmento derivado de hibridomas ou de clones de Fv pode ser adicionalmente modificado por união covalente da sequência de codificação da imunoglobulina com a totalidade ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não de imunoglobulina. Desta maneira, são preparados anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" que têm a especificidade de ligação dos anticorpos derivados de clones de Fv ou de hibridomas da invenção. 3. Vetores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes
Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido num vetor replicável para posterior clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. 0 ADN que codifica o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos). Estão disponíveis vários vetores. A eleição do vetor depende em parte da célula hospedeira a utilizar. Geralmente, as células hospedeiras são de origem procariota ou eucariota (geralmente de mamífero). Será apreciado que podem ser utilizadas regiões constantes de qualquer isotipo para este fim, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, e que estas regiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal. Geração de anticorpos utilizando células hospedeiras procariotas:
Construção de Vetores
Podem ser obtidas sequências de polinucleótidos que codificam componentes polipeptídicos do anticorpo da invenção utilizando técnicas recombinantes padrão. As sequências de polinucleótidos desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células produtoras de anticorpo tais como células de hibridoma. Alternativamente, podem ser sintetizados polinucleótidos utilizando sintetizadores de nucleótidos ou técnicas de PCR. Após serem obtidas, as sequências que codificam os polipéptidos são inseridas num vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleótidos heterõlogos em hospedeiros procariotas. Podem ser utilizados vários vetores que estão disponíveis e são conhecidos na técnica para a finalidade da presente invenção. A seleção de um vetor adequado irá depender principalmente da dimensão dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão de polinucleõtido heterólogo, ou ambas) e da sua compatibilidade com a célula hospedeira particular na qual reside. Componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a: uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um local de ligação ao ribossoma (RBS), uma sequência de sinal, a inserção de ácido nucleico heterõlogo e uma sequência de terminação da transcrição.
Em geral, são utilizados vetores plasmídicos contendo replicões e sequências de controlo que são derivadas a partir de espécies compatíveis com a célula hospedeira, em ligação a estes hospedeiros. 0 vetor porta vulgarmente um local de replicação, bem como sequências marcadoras que são capazes de proporcionar a seleção fenotípica nas células transformadas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transformada utilizando pBR322, um plasmídeo derivado a partir de uma espécie de E. colí. pBR322 contém genes que codificam resistência a ampicilina (Amp) e a tetraciclina (Tet) e consequentemente proporciona um meio fácil para a identificação das células transformadas. pBR322, os seus derivados, ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos, podem também conter, ou ser modificados para conter, promotores que podem ser utilizados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. São descritos exemplos de derivados de pBR322 utilizados para a expressão de anticorpos particulares em detalhe em Carter et al., Patente U.S. N.° 5.648.237.
Adicionalmente, podem ser utilizados vetores de fagos contendo replicões e sequências de controlo que são compatíveis com o microrganismo hospedeiro, como vetores de transformação em ligação a estes hospedeiros. Por exemplo, pode ser utilizado bacteriófago tal como AGEM.TM.-11 na preparação de um vetor recombinante que pode ser utilizado para transformar células hospedeiras suscetíveis tais como E. coli LE392. 0 vetor de expressão da invenção pode compreender dois ou mais pares promotor-cistrão, que codificam cada um dos componentes polipeptídicos. Um promotor é uma sequência reguladora não traduzida localizada a montante (51) de um cistrão que modula a sua expressão. Os promotores procariotas tipicamente caem em duas classes, indutíveis e constitutivos. 0 promotor indutível é um promotor que inicia níveis aumentados de transcrição do cistrão sob o seu controlo em resposta a alterações das condições de cultura, por exemplo a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração da temperatura. São bem conhecidos um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais. 0 promotor selecionado pode estar operativamente ligado a ADN de cistrões que codificam a cadeia leve ou pesada por remoção do promotor a partir do ADN fonte através de digestão por enzimas de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vetor da invenção. Podem ser utilizados tanto a sequência promotora nativa como vários promotores heterólogos para dirigir a amplificação e/ou a expressão dos genes alvo. Nalgumas formas de realização são utilizados promotores heterólogos, dado que geralmente permitem maior transcrição e rendimentos mais elevados de gene alvo expresso em comparação com o promotor do polipéptido alvo nativo.
Promotores adequados para utilização com hospedeiros procariotas incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores de β-galactamase e lactose, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos tais como o promotor tac ou trc. Contudo, são também adequados outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores bacterianos ou de fagos conhecidos). As suas sequências de nucleótidos foram publicadas, permitindo como tal a um trabalhador especializado ligá-los operativamente a cistrões que codificam as cadeias leves e pesadas alvo (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) utilizando ligantes ou adaptadores para proporcionar quaisquer locais de restrição necessários.
Num aspeto da invenção, cada cistrão no interior do vetor recombinante compreende uma componente sequência de sinal de secreção que dirige a translocação dos polipéptidos expressos através da membrana. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do ADN do polipéptido alvo que é inserido no vetor. A sequência de sinal selecionada para os fins da presente invenção deverá ser uma sequência que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem e processam as sequências de sinal nativas aos polipéptidos heterólogos, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariota selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste nos líderes de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II estável ao calor (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Numa forma de realização da invenção, as sequências de sinal utilizadas em ambos cistrões do sistema de expressão são sequências de sinal STII ou variantes das mesmas.
Noutro aspeto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira, e como tal não requer a presença de sequências de sinal de secreção no interior de cada cistrão. A esse respeito, as cadeias leves e pesadas de imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais no interior do citoplasma. Determinadas estirpes hospedeiras (por exemplo, as estirpes de E. coli trxB-) proporcionam condições no citoplasma que são favoráveis à formação de ligações dissulfeto, permitindo como tal a dobragem e montagem corretas de subunidades de proteína expressas. Proba e Pluckthun, Gene, 159:203 (1995).
Os anticorpos da invenção podem também ser produzidos utilizando um sistema de expressão em que a razão quantitativa de componentes polipeptídicos expressos pode ser modulada de modo a maximizar o rendimento de anticorpos da invenção segregados e corretamente montados. Esta modulação é realizada, pelo menos em parte, por modulação simultânea das forças de tradução para as componentes polipeptídicas. É divulgada uma técnica para a modulação das forças de tradução em Simmons et al., Pat. U.S. N.° 5.840.523. Esta utiliza variantes da região de iniciação da tradução (TIR) no interior de um cistrão. Para uma determinada TIR, pode ser criada uma série de variantes de sequência de aminoãcidos ou de ácidos nucleicos com um intervalo de forças de tradução, proporcionando como tal um meio conveniente através do qual ajustar este fator ao nível de expressão desejado da cadeia específica. Podem ser geradas variantes de TIR por técnicas convencionais de mutagénese que resultam em alterações de codões que podem alterar a sequência de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, as alterações da sequência de nucleótidos são silenciosas. As alterações da TIR podem incluir, por exemplo, alterações do número ou do espaçamento de sequências de Shine-Dalgarno, juntamente com alterações da sequência de sinal. Um método para gerar sequências de sinal mutantes é a geração de um "banco de codões" no início de uma sequência de codificação que não altera a sequência de aminoãcidos da sequência de sinal (isto é, as alterações são silenciosas). Isto pode ser realizado alterando a terceira posição de nucleótido de cada codão; adicionalmente, alguns aminoãcidos, tais como leucina, serina e arginina, têm múltiplas primeira e segunda posições que podem adicionar complexidade à preparação do banco. Este método de mutagénese é descrito em detalhe em Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.
Numa forma de realização, é gerado um conjunto de vetores com um intervalo de forças de TIR para cada cistrão no mesmo. Este conjunto limitado proporciona uma comparação de níveis de expressão de cada cadeia bem como do rendimento dos produtos de anticorpo desejados sob várias combinações de força de TIR. As forças de TIR podem ser determinadas por quantificação do nível de expressão de um gene repórter conforme descrito em detalhe em Simmons et al. Pat. U.S. N.° 5.S40.523. Com base na comparação de forças de tradução, são selecionadas as TIR individuais desejadas para ser combinadas nas construções do vetor de expressão da invenção. Células hospedeiras procariotas adequadas para expressão de anticorpos da invenção incluem Archaebacteria e Eubacteria, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli) , Bacilli (por exemplo, B. subtilís), Enterobacteria, espécies de Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Numa forma de realização, são utilizadas células Gram-·negativas. Numa forma de realização, são utilizadas células de E. coli como hospedeiros para a invenção. Exemplos de estirpes de E. coli incluem a estirpe W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; N.° de Depósito ATCC 27.325) e derivados dos mesmos, incluindo a estirpe 33D3 tendo o genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (Pat. U.S. N.° 5.639.635). São também adequadas outras estirpes e derivados das mesmas, tais como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli À1776 (ATCC 31,537) e E. coli RV308 (ATCC 31,608). Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes. Os métodos para construção de derivados de quaisquer das bactérias mencionadas acima tendo genótipos definidos são conhecidos na especialidade e estão descritos, por exemplo, em Bass et al. , Proteins, 8:309-314 (1990). É geralmente necessário selecionar a bactéria adequada tendo em consideração a replicabilidade do replicão nas células de uma bactéria. Por exemplo, podem ser adequadamente utilizadas E. coli, espécies de Serratia ou Salmonella como hospedeiro quando são utilizados plasmídeos bem conhecidos como pBR322, pBR325, pACYC 177 ou pKN410 para proporcionar o replicão. Tipicamente, a célula hospedeira deverá segregar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e podem ser desejavelmente incorporados inibidores de protease adicionais na cultura celular.
Produção de Anticorpos
As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meios de nutrientes convencionais modificados conforme adequado para induzir promotores, selecionar transformant.es ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.
Transformação significa introdução de ADN no hospedeiro procariota de modo a que o ADN seja replicável, quer na forma de um elemento extracromossómico quer como integrante cromossómico. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas padrão adequadas para tais células. É geralmente utilizado tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio para células bacterianas que contêm barreiras de parede celular substanciais. Outro método para a transformação emprega polietilenoglicol/DMSO. Ainda outra técnica utilizada é a electroporação.
As células procariotas utilizadas para produzir os polipéptidos da invenção são cultivadas em meios conhecidos na especialidade e adequados para a cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequados incluem caldo lúria (LB) mais os suplementos de nutrientes necessários. Nalgumas formas de realização, os meios também contêm um agente de seleção, eleito com base na construção do vetor de expressão, para permitir o crescimento seletivo de células procariotas contendo o vetor de expressão. Por exemplo, é adicionada ampicilina aos meios para o crescimento de células que expressam genes de resistência a ampicilina.
Podem também ser incluídos quaisquer suplementos necessários para além de fontes de carbono, azoto e fosfato inorgânico nas concentrações adequadas introduzidos singularmente ou como uma mistura com outro suplemento ou meio tal como uma fonte de azoto complexa. Opcionalmente o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo que consiste em glutationa, cisterna, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
As células hospedeiras procariotas são cultivadas a temperaturas adequadas. Em determinadas formas de realização, para o crescimento de E. coli, as temperaturas de crescimento variam de cerca de 20°C a cerca de 39°C; de cerca de 25°C a cerca de 37°C; ou cerca de 30°C. 0 pH do meio pode ser qualquer pH variando de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Em determinadas formas de realização, para E. coli, o pH é de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, ou de cerca de 7,0.
Se for utilizado um promotor indutível no vetor de expressão da invenção, a expressão da proteína é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Num aspeto da invenção, são utilizados promotores PhoA para controlar a transcrição dos polipéptidos. Consequentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas num meio com limitação por fosfato para a indução. Em determinadas formas de realização, o meio com limitação por fosfato é o meio C.R.A.P. (veja-se, por exemplo, Simmons et al. , J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Podem ser utilizados uma variedade de outros indutores, de acordo com a construção de vetor empregue, conforme é conhecido na técnica.
Numa forma de realização, os polipéptidos expressos são segregados para e recuperados a partir do periplasma das células hospedeiras. A recuperação de proteínas envolve tipicamente a rutura do microrganismo, geralmente por meios como choque osmótico, sonicação ou lise. Após a rutura das células, os detritos celulares ou células completas podem ser removidos por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia em resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para os meios de cultura e isoladas nos mesmos. As células podem ser removidas a partir da cultura e o sobrenadante da cultura sendo filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipéptidos expressos podem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodos comumente conhecidos tais como eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio Western blot,
Mum aspeto da invenção, a produção de anticorpos é leva a cabo em grande quantidade através de um processo de fermentação. Estão disponíveis vários procedimentos de fermentação descontínua a grande escala para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações a grande escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, e em determinadas formas de realização, cerca de 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizam propulsores de agitação para distribuir oxigénio e nutrientes, especialmente glucose (a fonte preferida de carbono/energia) . Fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação num fermentador que não tem mais de aproximadamente 100 litros de capacidade volumétrica, e pode variar de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.
Num processo de fermentação, a indução da expressão de proteínas é tipicamente iniciada após as células terem sido cultivadas sob condições adequadas até uma densidade desejada, por exemplo, uma DO550 de cerca de 180-220, em cujo estádio as células estão na fase estacionária precoce. Podem ser utilizados uma variedade de indutores, de acordo com a construção de vetor empregue, conforme é conhecido na especialidade e descrito acima. As células podem ser cultivadas durante períodos mais curtos antes da indução. As células são habitualmente induzidas durante cerca de 12-50 horas, embora possa ser utilizado um tempo de indução mais longo ou mais curto.
Para melhorar o rendimento de produção e a qualidade dos polipéptidos da invenção, podem ser modificadas várias condições da fermentação. Por exemplo, para melhorar a montagem e dobragem corretas dos polipéptidos de anticorpo segregados, podem ser utilizados vetores adicionais que sobreexpressam proteínas chaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil-cis, trans-isomerase com atividade chaperona) para co-transformar células hospedeiras procariotas. As proteínas chaperonas foram demonstradas como facilitando a dobragem correta e a solubilidade de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al. , Patente U.S. N.° 6,083,715; Georgiou et al. , Patente U.S. N.° 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210 .
Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), podem ser utilizadas determinadas estirpes hospedeiras deficientes em enzimas proteolíticas na presente invenção. Por exemplo, podem ser modificadas estirpes de células hospedeiras para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e combinações das mesmas. Algumas estirpes de E. coli deficientes em proteases estão disponíveis e são descritas em, por exemplo, Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al, , Patente U.S. N.° 5.264.365; Georgiou et ai., Patente U.S. N.° 5.508.192; Hara et al. , Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996) .
Numa forma de realização, são utilizadas estirpes de E. coli deficientes em enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos que sobreexpressam uma ou mais proteínas chaperonas como células hospedeiras no sistema de expressão da invenção.
Purificação de Anticorpos
Numa forma de realização, a proteína do anticorpo produzida no presente documento é adicionalmente purificada para obter preparações que são substancialmente homogéneas para ensaios e utilizações adicionais. Podem ser empregues métodos padrão de purificação de proteínas conhecidos na técnica. Os seguintes procedimentos são exemplares de procedimentos de purificação adequados: fracionamento em colunas de imunoafinidade ou permuta iõnica, precipitação em etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia sobre sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE, cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amónio e filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G- 75 .
Num aspeto, é utilizada Proteína A imobilizada numa fase sólida para purificação por imunoafinidade dos produtos de anticorpo da invenção. A proteína A é uma proteína da parede celular de 41 kD de Staphylococcus aureas que liga com elevada afinidade à região Fc de anticorpos. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Me th. 62:1-13. A fase sólida a que a Proteína A é imobilizada pode ser uma coluna compreendendo uma superfície de vidro ou de sílica, ou uma coluna de vidro de poros controlados ou uma coluna de ácido silícico. Nalgumas aplicações, a coluna é revestida com um reagente, tal como glicerol, para possivelmente prevenir a aderência não específica de contaminantes.
Como a primeira etapa de purificação, pode ser aplicada uma preparação derivada a partir da cultura celular conforme descrito acima a uma Proteína A imobilizada em fase sólida para permitir a ligação específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida será então lavada para remover contaminantes ligados não especificamente à fase sólida. Finalmente, o anticorpo de interesse é recuperado a partir da fase sólida por eluiçâo.
Geração de anticorpos utilizando células hospedeiras eucariotas:
Um vetor para utilização numa célula hospedeira eucariota inclui geralmente uma ou mais das seguintes componentes não limitantes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição.
Componente de sequência de sinal
Um vetor para utilização numa célula hospedeira eucariota pode também conter uma sequência de sinal ou outro polipéptido tendo um local de clivagem específico no terminal N da proteína madura ou do polipéptido de interesse. A sequência de sinal heteróloga selecionada pode ser uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Na expressão em células de mamífero, estão disponíveis sequências de sinal de mamífero bem como líderes de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex. 0 ADN para esta região precursora é ligado em grelha de leitura a ADN que codifica o anticorpo.
Origem de replicação
Geralmente, não é necessário um componente de origem de replicação para vetores de expressão em mamífero. Por exemplo, pode tipicamente ser utilizada somente a origem SV40 dado que contém o promotor precoce.
Componente gene de seleção
Os vetores de expressão e de clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado um marcador selecionãvel. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, quando relevante, ou (c) proporcionam nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos.
Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas exitosamente com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e consequentemente sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos desta seleção dominante utilizam os fãrmacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para captar o ácido nucleico do anticorpo, tais como DHFR, timidina-quinase, metalotioneína-I e -II, preferentemente genes de metalotioneína de primata, adenosina-desaminase, ornitina-descarboxilase, etc.
Por exemplo, nalgumas formas de realização, as células transformadas com o gene de seleção de DHFR são primeiro identificadas por cultura de todos os transformantes num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Nalgumas formas de realizaçao, uma célula hospedeira adequada quando é empregue DHFR de tipo selvagem é a linha células de ovário de hámster chinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).
Alternativamente, podem ser selecionadas células hospedeiras (particularmente hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de ADN que codificam um anticorpo, proteína DHFR de tipo selvagem, e outro marcador selecionável tal como aminoglicósido-3!-fosfotransferase (ΑΡΗ), por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Veja-se a Patente U.S. N.° 4.965.199.
Componente promotor
Os vetores de expressão e de clonagem contêm habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado a ácido nucleico que codifica um polipéptido de interesse (por exemplo, um anticorpo). São conhecidas sequências promotoras para os eucariotas. Por exemplo, praticamente todos os genes eucariotas têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde é iniciada a transcrição. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleótido. No terminal 3! da maioria dos genes eucariotas existe uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda de poli A ao terminal 3' da sequência de codificação. Em determinadas formas de realização, qualquer uma ou todas estas sequências podem ser adequadamente inseridas em vetores de expressão eucariotas. A transcrição a partir de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus do polioma, o vírus da bouba aviária, adenovirus (tais como Adenovirus 2), papilomavírus bovino, sarcomavírus aviário, citomegalovírus, um retrovirus, vírus da hepatite-B e Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, contanto que estes promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos na forma de um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação viral de SV40. 0 promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido na forma de um fragmento de restrição Hindi II E. É divulgado um sistema para a expressão de ADN em hospedeiros de mamífero utilizando o papilomavírus bovino como vetor na Patente U.S. N.° 4.419.446. É descrita uma modificação deste sistema na Patente U.S. N.° 4.601.978. Veja-se também Reyes et al. , Nature 297:598-601 (1982), que descrevem a expressão de ADNc de interferão β humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor de timidina-quinase a partir do vírus herpes simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa do Vírus do Sarcoma de Rous pode ser utilizada como o promotor.
Componente de elemento potenciador A transcrição de ADN que codifica um anticorpo da presente invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada por inserção de uma sequência potenciadora no vetor. São atualmente conhecidas várias sequências potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, contudo, será utilizado um potenciador a partir de um vírus de células eucariotas. Os exemplos incluem o potenciador de SV4 0 do lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador do polioma do lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovirus. Veja-se também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) que descrevem elementos potenciadores para a ativação de promotores eucariotas. O potenciador pode ser unido por excisão- reparação no vetor numa posição a 5! ou a 31 da sequência que codifica do polipéptido de anticorpo, mas está geralmente localizada num local a 5' do promotor.
Componente de terminação da transcrição
Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucariotas podem também conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Estas sequências estão normalmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas a 5! e, ocasionalmente a 3', de ADN ou ADNc eucariotas ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na fração não traduzida do ARNm que codifica um anticorpo. Um componente de terminação da transcrição útil ê a região de poliadenilação da hormona de crescimento bovina. Veja-se o documento WO94/11026 e os vetores de expressão divulgados no mesmo.
Seleção e transformação de células hospedeiras Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos presentes vetores incluem células eucariotas superiores descritas no presente documento, incluindo células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis são a linha CVI de rim de macaco transformada com SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al. , J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovário de hámster chinês/'-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70) ; células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W 138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para a produção de anticorpo e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme adequado para a indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.
Cultura das células hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para produzir um anticorpo da presente invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como meio FIO de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura das células hospedeiras. Adicionalmente, pode ser utilizado qualquer dos meios descritos em Ham et al. , Me th. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Pat. U.S. N.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4,560,655; ou 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; ou Patente U.S. N.° 30.985, como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES) , nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN™), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar), e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Podem também ser incluídos quaisquer outros suplementos em concentrações adequadas que serão conhecidos para os peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, e pH, são aquelas utilizadas previamente com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão evidentes para o perito na especialidade.
Purificação de anticorpo
Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, ou ser segregado diretamente no meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como primeira etapa, os detritos particulados, quer células hospedeiras quer fragmentos lisados, podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão podem ser primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Pode ser incluído um inibidor de protease tal como PMSF em qualquer das etapas anteriores para inibir a proteólise, e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição de anticorpos preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatite, eletroforese em gel, diãlise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo uma técnica conveniente. A adequabilidade da proteína A como ligando de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al. , J. Immunol. Methods 62:1-13 (1983)) . A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para γ3 humana (Guss et ai., EMBO J. 5:15671575 (1986)) . A matriz à qual o ligando de afinidade está ligado pode ser agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e menores tempos de processamento do que os podem ser obtidos com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação de proteínas tais como fracionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™ cromatografia numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amónio, estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
Após qualquer etapa ou etapas preliminar(es) de purificação, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a purificação adicional, por exemplo, por cromatografia de interação hidrofóbica a baixo pH utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferentemente realizada a baixas concentrações de sal (por exemplo, de cerca de 0-0,25M de sal).
Em geral, várias metodologias para a preparação de anticorpos para utilização em investigação, testes e utilização clínica, estão bem estabelecidas na especialidade, consistentes com as metodologias descritas acima e/ou conforme considerado adequado por um perito na especialidade para um anticorpo de interesse particular. Imunoconj ugados A invenção também proporciona imunoconjugados (indistintamente referidos como "conjugados anticorpo-fãrmaco" ou "ADC") compreendendo quaisquer dos anticorpos anti-STEAP-1 da invenção conjugados com um ou mais agentes citotóxicos, tais como um agente quimioterapêutico, um fãrmaco, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).
Em determinadas formas de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo anti-STEAP-1 e um agente quimioterapêutico ou outra toxina. São descritos no presente documento agentes quimioterapêuticos úteis na geração de imunoconjugados (por exemplo, acima). Podem também ser utilizadas e são descritas no presente documento toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas.
Em determinadas formas de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo anti-STEAP-1 e uma ou mais toxinas de molécula pequena, incluindo, mas não limitadas a, fãrmacos de molécula pequena tais como uma caliqueamicina, maitansinoide, dolastatina, auristatina, tricoteceno e CC1065, e os derivados destes fãrmacos que têm atividade citotóxica. São discutidos exemplos destes imunoconjugados em mais detalhe abaixo. 1. Imunoconjugados Exemplares
Um imunoconjugado (ou "conjugado anticorpo-fãrmaco" ("ADC")) da invenção pode ter a fórmula I, abaixo, em que um anticorpo anti-STEAP-1 está conjugado (isto é, covalentemente ligado) a uma ou mais frações de fãrmaco (D) através de um ligante opcional (L).
Ab-(L-D)p Fórmula I
Consequentemente, o anticorpo anti-STEAP-1 pode ser conjugado com o fãrmaco ou diretamente ou através de um ligante. Ma Fórmula I, p é o número médio de frações de fãrmaco por anticorpo, que pode variar, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 20 frações de fãrmaco por anticorpo, e em determinadas formas de realização, de 1 a cerca de 8 frações de fãrmaco por anticorpo.
Ligantes Exemplares São divulgados no presente documento ligantes e frações de fãrmaco exemplares. Um ligante pode compreender um ou mais componentes ligantes. Componentes ligantes exemplares incluem 6-maleimidocaproílo ("MC"), maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" ou "vc"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonilo (um "PAB"), N-Succinimidil-4 -(2-piridiltio)pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil-4 -(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato ("SMCC"), N-Succinimidil-(4- iodoacetil)aminobenzoato ("SIAB"), e etilenoxi-CH2CH20- como uma ou mais unidades repetidas ("EO" ou "PEO") . São conhecidos na técnica vários componentes ligantes, alguns dos quais são descritos abaixo.
Um ligante pode ser um "ligante clivável", que facilita a libertação de um fãrmaco na célula. Por exemplo, pode ser utilizado um ligante lãbil a ácidos (por exemplo, hidrazona), ligante sensível a proteases (por exemplo, sensível a peptidase), ligante fotolábil, ligante de dimetilo ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al. , Cancer Research 52:127-131 (1992); Patente U.S. N.° 5.208.020).
Numa forma de realização, o ligante L de um ADC tem a fórmula: -Aa-Ww-Yy- em que: -A- é uma unidade Extensora covalentemente ligada a um tiol de cisteína do anticorpo (Ab); a é 0 ou 1; cada -W-é independentemente uma unidade de Aminoácido; w é independentemente um número inteiro que varia de 0 a 12; -Y- é uma unidade Espaçadora covalentemente ligada à fração de fármaco; e y é 0, 1 ou 2.
Unidade Extensors A unidade Extensora (-A-), quando presente, é capaz de ligar uma unidade anticorpo a uma unidade aminoãcido (-W-). A este respeito um anticorpo (Ab) tem um grupo tiol de cisterna livre que pode formar uma ligação com um grupo funcional eletrofílico de uma Unidade Extensora. Unidades Extensoras exemplares em conjugados de Fórmula I são representadas pelas Fórmulas II e III, em que Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definido acima, e R-^ é um radical bivalente selecionado a partir de (CH2)r, C3-C8 carbociclilo, 0-(CH2)r, arileno, (CH2) r-arileno, -arileno-(CH2) r~ a (CH2) r-(C3-C8 carbociclilo), (C3-C8 carbociclilo)-(CH2) r, C3-C8 heterociclilo, (CH2) r- (C3-C8 heterociclilo) , - (C3-C8 heterociclilo) - (CH2) r-, - (CH2) rC (0) NRb (CH2) r- , (CH2CH20) r- , - (CH2CH20) r-CH2, - (CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-, (CH2) rC (0) NRb (CH2CH20) r-CH2- , - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2CH20) r- , (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2CH20) r~CH2 , e - (CH2CH20) rC (0) NRb (CH2) r- ; onde R^ é H, alquilo C1-C6, fenilo, ou benzilo; e r é independentemente um número inteiro que varia de 1-10.
Arileno inclui radicais hidrocarboneto aromáticos bivalentes de 6-20 átomos de carbono derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio do sistema de anel aromático. Grupos arileno típicos incluem, mas não estão limitados a, radicais derivados a partir de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno e bifenilo.
Os grupos heterociclilo incluem um sistema de anel em que um ou mais átomos no anel são heteroátomos, por exemplo azoto, oxigénio e enxofre. 0 radical heterociclo compreende 1 a 20 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P e S. Um heterociclo pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P e S) ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P e S) , por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. São descritos heterociclos em Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nova Iorque, 1968) , particularmente nos Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; -"The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley &amp; Sons, Nova Iorque, 1950 até ao presente), em particular Volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Exemplos de heterociclos incluem, a título de exemplo e não limitação, piridilo, di-hidropiridilo, tetra-hidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetra-hidrotiofenilo, tetra-hidrotiofenilo oxidado com enxofre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetra-hidrofuranilo, bis-tetra-hidrofuranilo, tetra-hidropiranilo, bis-tetra-hidropiranilo, tetra-hidro-quinolinilo, tetra-hidroisoquinolinilo, deca-hidro-quinolinilo, octa-hidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-l,2,5-ti adi az inilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4Ah-carbazolilo, carbazolilo, β-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pira.zolini.lo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoilo.
Os grupos carbociclilo incluem um anel saturado ou insaturado tendo 3 a 7 átomos de carbono na forma de urn monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono na forma de urn biciclo. Os carbociclos monociclicos têm 3 a 6 átomos no anel, ainda mais tipicamente 5 ou 6 átomos no anel. Os carbociclos bicíclieos têm 7 a 12 átomos no anel, por exemplo dispostos como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou 9 ou 10 átomos no anel dispostos como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6], Exemplos de carbociclos monociclicos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, l-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, l-ciclohex-3-enilo, ciclo-heptilo e ciclooctilo.
Deve ser entendido a partir de todas as formas de realização exemplares de ADC de fórmula I tais como II-VI, que inclusive quando não explicitamente denotado, estão ligadas de 1 a 4 frações de fãrmaco a um anticorpo (p = 1-4) , dependendo do número de resíduos de cisteína manipulados.
Uma unidade Extensora de Fórmula II ilustrativa é derivada a partir de maleimidocaproílo (MC) em que R17 é -(CH2)5-:
Uma unidade Extensora de fórmula II ilustrativa ê derivada a partir de maleimidopropanoílo (MP) em que R^7 é - (CH2)2-:
Outra unidade Extensora de fórmula II ilustrativa em que R17 é - (CH2CH,0) r-CH,-e r é 2:
Outra unidade Extensora de fórmula II ilustrativa em que R^-7 é - (CH,) t-C (0) NRk (ΟΗ,ΟΗ,Ο) r-CH,-onde R*3 é H e cada r é 2:
Uma unidade Extensora de fórmula III ilustrativa em que R17 é - (CH2) 5- :
Noutra forma de realização, a unidade Extensora está ligada ao anti anticorpo manipulado com cisterna através de uma ligação dissulfeto entre o átomo de enxofre da cisterna manipulada do anticorpo e um átomo de enxofre da unidade Extensora. Uma unidade Extensora representativa desta forma de realização é ilustrada pela Fórmula IV, em que R17, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definido acima.
ÍV
Ainda noutra forma de realização, o grupo reativo do Extensor contém um grupo funcional reativo com tiol que pode formar uma ligação com um tiol livre de cisteína de um anticorpo. Exemplos de grupos funcionais reativos com tiol incluem, mas não estão limitados a, maleimida, a-haloacetilo, ésteres ativados tais como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anidridos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. As unidades Extensoras representativas desta forma de realização são ilustradas pelas Fórmulas Va e Vb, em que -R17-, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definido acima;
Va
Vh
Noutra forma de realização, o ligante pode ser um ligante de tipo dendrítico para união covalente de mais de uma fração de fãrmaco através de uma fração ligante multifuncional de ramificação a um anticorpo (Sun et al. (2002) Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et ai. (2003) Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Os ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar de fãrmaco para anticorpo, isto é, a carga, que está relacionada com a potência do ADC. Consequentemente, quando um anticorpo manipulado com cisteína é portador somente de um grupo tiol de cisteína reativo, podem ser ligados uma pluralidade de frações de fármacos através de um ligante dendrítico.
Unidade de aminoácido 0 ligante pode compreender resíduos de aminoácido. A unidade de Aminoácido (-Ww~), quando presente, liga o anticorpo (Ab) à fração de fármaco (D) do conjugado anticorpo manipulado com cisteína-fármaco (ADC) da invenção. -Ww-é uma unidade dipeptídica, tripeptídica, tetrapeptídica, pentapeptídica, hexapeptídica, heptapeptídica, octapeptídica, nonapeptídica, decapeptídica, undecapeptídica ou dodecapeptídica. Os resíduos de aminoácido que constituem a unidade de Aminoácido incluem os de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácido não de ocorrência natural, tais como citrulina. Cada unidade -W-tem independentemente a fórmula representada abaixo entre parêntesis retos, e w é um número inteiro que varia de 0 a 12 :
em que é hidrogénio, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, benzilo, p-hidroxibenzilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, “CH2COOH, - CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, - (CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2) 3NHCOCH3, - (CH2) 3NHCHO, - (CH2) 4NHC (=NH) Nib, -(CH2)4NH2, - (CH2) 4NHCOCH3, - (CH2) 4NHCHO, - (CH2) 3nhconh2, - (CH2) 4NHCONH2j -CH2CH2CH (OH) CH2NH2 , piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo,
Quando R19 é outro para além de hidrogénio, o átomo de carbono ao qual R^-9 está ligado é quiral. Cada átomo de carbono ao qual R-^-9 está ligado está independentemente na configuração (S) ou (R) , ou numa mistura racémica. As unidades de Aminoácido podem consequentemente ser enantiomericamente puras, racémicas ou diastereoméricas.
Unidades de Aminoácido -Ww- exemplares incluem um dipéptido, um tripéptido, um tetrapéptido ou um pentapéptido. Dipéptidos exemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe) . Tripépfidos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Os resíduos de aminoácido que constituem uma componente ligante de aminoácido incluem os de ocorrência natural, bem como aminoãcidos menores e análogos de aminoácido não de ocorrência natural, tais como citrulina. A unidade de Aminoácido pode ser clivada enzimaticamente por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a tumores, para libertar a fração de Fármaco (-D), que numa forma de realização é protonada in vivo após libertação para proporcionar um Fármaco (D) . Os componentes ligantes de aminoácido podem ser desenhados e otimizados na sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada a tumores, catepsina B, C e D, ou uma plasmina protease.
Unidade Espaçadora A unidade Espaçadora (-Yy-), quando presente (y = 1 ou 2), liga uma unidade de Aminoácido (-Ww-) a fração de fãrmaco (D) quando está presente uma unidade de Aminoácido (w = 1-12). Alternativamente, a unidade Espaçadora liga a unidade Extensora à fração de Fármaco quando a unidade de Aminoácido está ausente. A unidade Espaçadora também liga a fração de fármaco à unidade de anticorpo quando tanto a unidade de Aminoácido como a unidade Extensora estão ausentes (w, y = 0) . As unidades Espaçadoras são de dois tipos genéricos: auto-imolativas e não auto-imolativas. Uma unidade Espaçadora não auto-imolativa é uma em que parte ou a totalidade da unidade Espaçadora permanece ligada à fração de Fãrmaco após clivagem, particularmente enzimática, de uma unidade de Aminoácido do conjugado anticorpo-fármaco ou da fração de Fármaco-Ligante. Quando um ADC contendo uma unidade Espaçadora glicina-glicina ou uma unidade Espaçadora glicina sofre clivagem enzimática através de uma protease associada a células tumorais, uma protease associada a células cancerígenas ou uma protease associada a linfócitos, é clivada uma glicina-glicina-fração de Fãrmaco ou uma glicina-fração de Fãrmaco de Ab-Aa-Ww-. Numa forma de realização, ocorre uma reação de hidrólise independente no interior da célula alvo, clivando a ligação glicina-fração de Fármaco e libertando o Fármaco.
Noutra forma de realização, -Yy- é uma unidade p-aminobenzilcarbamoílo (PAB) cuja fração fenileno está substituída com em que Q é -alquilo C-L-C8, -0- (alquilo C-L-Cg) , -halogéneo, -nitro ou -ciano; e m é um número inteiro que varia de 0-4.
Formas de realização exemplares de uma unidade Espaçadora não auto-imolativa (-Y-) são: -Gly-Gly-; -Gly-; -Ala-Phe-; -Val-Cit-.
Numa forma de realização, é proporcionada uma fração de Fãrmaco-ligante ou um ADC no qual a unidade Espaçadora está ausente (y=0), ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Alternativamente, um ADC contendo uma unidade Espaçadora auto-imolativa pode libertar -D. Numa forma de realização, -Y-é um grupo PAB que está ligado a -Ww- através do átomo de azoto do amino do grupo PAB, e ligado diretamente a -D através de um grupo carbonato, carbamato ou éter, em que o ADC tem a estrutura exemplar:
em que Q é -alquilo Ci-Cg, -0- (alquilo Cx-Cg) , halogéneo, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; e p varia de 1 a 4.
Outros exemplos de espaçadores auto-imolativos incluem, mas não estão limitados a, compostos aromáticos que são eletronicamente semelhantes ao grupo PAB tal como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et ai. (1999) Bioorg.
Med. Chem. Lett. 9:2237), análogos de PAB heterocíclicos (documento US 2005/0256030) , beta-glucuronida (documento WO 2007/011968), e orto- ou para-aminobenzilacetais. Podem ser utilizados espaçadores que sofrem ciclização após hidrólise da ligação amida, tais como amidas de ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al. (1995)
Chemistry Biology 2:223), sistemas de anel biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] adequadamente substituídos (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas de ácido 2- aminofenilpropiónico (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867) . A eliminação de fármacos contendo amino que estão substituídos na glicina (Kingsbury et al. (1984) J. Meã.
Chem. 27:1447) são também exemplos de espaçadores auto-imolativos úteis nos ADC.
X
Unidades Espaçadoras exemplares Í-Yy-) são representadas pelas Fórmulas X-XII:
XI ΧΠ
Ligantes dendríticos
Noutra forma de realização, o ligante L pode ser um ligante do tipo dendrítico para união covalente de mais do que uma fração de fãrmaco através de uma fração ligante multifuncional de ramificação a um anticorpo (Sun et al. (2002) Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters 12:2213- 2215; Sun et al. (2003) Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Os ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar de fãrmaco para anticorpo, isto é, a carga, que está relacionada com a potência do ADC. Consequentemente, quando um anticorpo manipulado com cisteína é portador somente de um grupo tiol de cisteína reativo, podem ser ligadas uma pluralidade de frações de fãrmaco através de um ligante dendrítico. Formas de realização exemplares de ligantes dendríticos ramificados incluem unidades de dendrímero 2,6-bis(hidroximetil)-p-cresol e 2,4,6-tris(hidroximetil)fenol (documento WO 2004/01993; Szalai et al. (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al. (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499).
Numa forma de realização, a unidade Espaçadora é um bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificado, que pode ser utilizado para incorporar e libertar múltiplos fármacos, tendo a estrutura:
compreendendo uma unidade de dendrímero 2-(4-aminobenzilideno)propano-1,3-diol (documento WO 2004/043493; de Groot et al, (2003) Angew. Chem. Int, Ed. 42:4490-4494), em que Q é -alquilo C1-C8, -O-(alquilo Cx-C8) , -halogéneo, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a 4.
Formas de realização exemplares dos compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula I incluem XlIIa (MC), XlIIb (val-cit), XIIIc (MC-val-cit), e XlIId (MC-val-cit-PAB):
Outras formas de realização exemplares dos compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula Ia incluem XIVa-e:
e R é independentemente H ou alquilo Cj^-Cg,· e n é 1 a 12.
Noutra forma de realização, um Ligante tem um grupo funcional reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo com um grupo eletrofílico presente num anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis num anticorpo incluem, mas não estão limitados a, grupos carbonilo de aldeídos e cetonas. 0 heteroãtomo de um grupo nucleofílico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofílico num anticorpo e formar uma ligação covalente com uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis num Ligante incluem, mas não estão limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tio-semicarbazona, hidrazinocarboxilato e aril-hidrazida. 0 grupo eletrofílico num anticorpo proporciona um local conveniente para união a um Ligante.
Tipicamente, podem ser preparados Ligantes de tipo peptídico por formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoãcidos e/ou fragmentos peptídicos. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (E. Schrôder e K. Lubke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de péptidos. Os intermediários dos Ligantes podem ser montados com qualquer combinação ou sequência de reações incluindo unidades Espaçadoras, Extensoras e de Aminoãcidos. As unidades Espaçadoras, Extensoras e de Aminoãcidos podem empregar grupos reativos funcionais que são de natureza eletrofílica, nucleofílica ou de radical livre. Grupos funcionais reativos incluem, mas não estão limitados a, carboxilos, hidroxilos, para-nitrofenilcarbonato, isotiocianato e grupos abandonantes, tais como O-mesilo, 0-tosilo, -Cl, -Br, -I; ou maleimida.
Noutra forma de realização, o Ligante pode estar substituído com grupos que modulam a solubilidade ou a reatividade. Por exemplo, um substituinte carregado tal como sulfonato (-S03~) ou amónio, pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reação de acoplamento do reagente ligante com o anticorpo ou a fração de fãrmaco, ou facilitar a reação de acoplamento de Ab-L (intermediário anticorpo-ligante) com D, ou D-L (intermediário fármaco-ligante) com Ab, dependendo da via sintética empregue para preparar o ADC.
Frações de fármaco exemplares Maitansina e maitansinoid.es
Nalgumas formas de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção conjugado com uma ou mais moléculas de maitansinoide. Os maitansinoides são inibidores mitóticos que atuam por inibição da polimerizaçao da tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez a partir do arbusto da África oriental Maytenus serrata (Patente U.S. N.° 3896111).
Subsequentemente, foi constatado que determinados micróbios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e ésteres de maitansinol C-3 (Patente U.S. N.° 4.151.042).
Maitansinol sintético e seus derivados e análogos estão divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. N.° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533.
As frações de fármaco maitansinoide são frações de fármaco atrativas em conjugados anticorpo-fármaco dado que são: (i) de preparação relativamente acessível por fermentação ou modificação química ou derivatização de produtos de fermentação, (ii) passíveis de derivatização com grupos funcionais adequados para conjugação através de ligantes não dissulfeto a anticorpos, (iii) estáveis no plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhas celulares tumorais.
Os compostos de maitansina adequados para utilização como frações de fármaco maitansinoide são bem conhecidos na técnica e podem ser isolados a partir de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou produzidos utilizando técnicas de engenharia genética (veja-se Yu et ai. (2002) PNAS 99:7968-7973). Podem também ser preparados maitansinol e análogos de maitansinol sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
Formas de realização exemplares de frações de fármaco maitansinoide incluem: DM1; DM3; e DM4, conforme divulgado no presente documento.
Auristatinas e dolastatinas
Nalgumas formas de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção conjugado com dolastatina ou um análogo peptídico ou um derivado de dolastatina, por exemplo, uma auristatina (Pat. US N.° 5635483; 5780588). As dolastatinas e as auristatinas foram mostradas como interferindo com a dinâmica dos microtúbulos, a hidrólise de GTP e a divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antímicrob. Agents and
Chemother. 45(12):3580-3584) e têm atividade anticancerígena (Pat. US N.° 5663149) e antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A fração de fármaco de dolastatina ou de auristatina pode ser ligada ao anticorpo através do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxilo) da fração de fármaco peptídico (documento WO 02/088172).
Formas de realização exemplares de auristatina incluem as frações de fármaco de monometilauristatina ligadas no terminal N DE e DF, divulgadas em Senter et al.,
Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, mostrado a 28 de março de 2004.
Pode ser selecionada uma fração de fármaco peptídico a partir das Fórmulas De e Df abaixo:
em que a linha ondulada de De e Df indica o local de união covalente a um anticorpo ou componente anticorpo-ligante, e independentemente em cada localização: R2 é selecionado a partir de H e alquilo C1-C8; R3 é selecionado a partir de H, alquilo C^-Cg, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo C1-C8- (heterociclo C3-C8) ; R4 é selecionado a partir de H, alquilo C^-Cg, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C^Cg-arilo, alquilo C^-Cg- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo CL-C8- (heterociclo C3-C8) ; R3 é selecionado a partir de H e metilo; ou R4 e R3 formam conjuntamente um anel carbocíclico e têm a fórmula - (CRaR^) n-em que Ra e R45 são independentemente selecionados a partir de H, alquilo C8 e carbociclo C3-C8 e n é selecionado a partir de 2, 3, 4 , 5 e 6 ; R3 é selecionado a partir de H e alquilo C^-Cg; R7 é selecionado a partir de H, alquilo C^Cg, carbociclo C3“C8, arilo, alquilo C-|-C8-arilo, alquilo C]-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo C-L-Cg- (heterociclo C3-C8) ;
Cada R8 é independentemente selecionado a partir de H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 e 0- (alquilo C1-C8) ; R9 é selecionado a partir de H e alquilo C1-C8; R10 é selecionado a partir de arilo ou heterociclo C3-C8; Z é 0, S, NH ou NR42, em que R42 é alquilo Cj-C8; R44 é selecionado a partir de H, alquilo ^-Ο20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14 ou - (R130) !n-CH (R15) 2 ; m é um número inteiro que varia de 1-1000; R43 é alquilo C2-C8; R44 é H ou alquilo C-L-Cg,· cada ocorrência de R45 é independentemente H, COOH, (CH2) n-N (R43) 2, -(CH2)n-S03H ou - (CH2) n-S03-alquilo C^Cg,· cada ocorrência de R4^ é independentemente H, alquilo C3-C8 OU - (CH2)n-COOH; r18 g selecionado a partir de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8) e -C(R8)2-C(R8)2- (carbociclo C3-C8) ; e n é um número inteiro que varia de 0 a 6.
Numa forma de realização, R2, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R8 é -H ou metilo. Numa forma de realização exemplar, R2 e R4 são cada um isopropilo, R5 é -H, e R7 é sec-butilo.
Ainda noutra forma de realização, R2 e R^ são cada um metilo e R9 é -H.
Ainda noutra forma de realização, cada ocorrência de R8 é -0CH3.
Numa forma de realização exemplar, R2 e R4 são cada um isopropilo, R2 e R6 são cada um metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -0CH3, e R9 é -H.
Numa forma de realização, Z é -0-ou -NH-.
Numa forma de realização, R48 é arilo.
Numa forma de realização exemplar, R48 é -fenilo.
Numa forma de realização exemplar, quando Z é -0-, R44 é -H, metilo ou t-butilo.
Numa forma de realização, quando Z é -NH, R44 é CH(R45)2, em que R45 é - (CH2) n-N (R16) 2 e R46 é -alquilo Cx-C8 ou - (CH2)n-C00H.
Noutra forma de realização, quando Z é -NH, R44 é -CH(R45)2, em que R45 é - (CH2) n-S03H.
Uma forma de realização exemplar da auristatina de fórmula De é ΜΜΆΕ, em que a linha ondulada indica a união covalente a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fármaco:
MMAE
Uma forma de realização exemplar de auristatina de fórmula Dp é MMA.F, em que a linha ondulada indica a união covalente a um ligante (L) de um conjugado anticorpo-fãrmaco (veja-se o documento US 2005/0238649 e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124):
VÍMAF
Outras frações de fãrmaco incluem os seguintes derivados de MMAF, em que a linha ondulada indica a união covalente a um liqante (L) de um conjugado
anticorpo-fármaco: e
Num aspeto, grupos hidrofílicos incluindo mas não limitados a, ésteres de trietilenoglicol (TEG), conforme mostrado acima, podem ser ligados à fração de fãrmaco em rH. Sem estar ligado a qualquer teoria em particular, os grupos hidrofílicos ajudam na internalização e não aglomeração da fração de fármaco. São descritas formas de realização exemplares de ADC de fórmula I compreendendo uma auristatina/dolastatina ou um derivado das mesmas, no documento US 2005-0238649 AI e Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Formas de realização exemplares de ADC de fórmula I compreendendo MMAE ou MMAF e várias componentes ligantes têm as seguintes estruturas e abreviaturas (em que "Ab" é um anticorpo; péla cerca de 8, "Val-Cit" é um dipéptido valina-citrulina; e "S" é um átomo de enxofre:
Ab-MC-MMAF
Formas de realização exemplares de ADC de fórmula I compreendendo MMAF e vários componentes ligantes incluem adicionalmente Ab-MC-PAB-MMAF e Ab-PAB-MMAF. De forma interessante, imunoconjugados compreendendo MMAF ligado a um anticorpo através de um ligante que não é proteoliticamente clivável foram mostrados como tendo atividade comparável com imunoconjugados compreendendo MMAF ligado a um anticorpo através de um ligante proteoliticamente clivável. Veja-se, Doronina et al. (2006) Bíoconjugate Chem. 17:114-124. Nestes casos, a libertação do fãrmaco é acreditada como sendo efetuada por degradação do anticorpo na célula. Id.
Tipicamente, podem ser preparadas frações de fármaco à base de péptidos formando uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Estas ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (veja-se E.
Schroder e K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química dos péptidos. Podem ser preparadas frações de fármaco de auristatina/dolastatina de acordo com os métodos dos documentos: US 2005-0238649 AI; Pat. US M.° 5635483;
Pat. US N.° 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et ai. Synthesis, 1996, 719-725;
Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; e Doronina (2003) Nat. Bíotechnol. 21 (7):778-784.
Em particular, as frações de fármaco de auristatina/ dolastatina de fórmula Df, tais como MMAF e derivados do mesmo, podem ser preparadas utilizando métodos descritos no documento US 2005-0238649 Al e Doronina et ai. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Podem ser preparadas frações de fármaco de auristatina/dolastatina de fórmula De, tais como MMAE e derivados do mesmo, utilizando métodos descritos em Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778- 784. Podem ser convenientemente sintetizadas frações Fármaco-ligante MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF e MC-vc-PAB-MMAE por métodos de rotina, por exemplo, conforme descrito em Doronina et al, (2003) Nat. Biotech. 21:778- 784, e Publicação de Pedido de Patente US 2005/0238649 Al, e posteriormente conjugadas a um anticorpo de interesse. Carga de fármaco A carga de fármaco é representada por p e é o número médio de frações de fármaco por anticorpo numa molécula de fórmula I. A carga de fármaco pode variar de 1 a 20 frações de fármaco (D) por anticorpo. Os ADC de fórmula I incluem coleções de anticorpos conjugados com um intervalo de frações de fármaco, de 1 a 20. 0 número médio de frações de fármaco por anticorpo em preparações de ADC a partir de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espectroscopia de massa, ensaio ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Nalguns casos, pode ser conseguida separação, purificação e caracterização de ADC homogéneo em que p tem um determinado valor de ADC com outras cargas de fármaco por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese.
Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode estar limitado pelo número de locais de união no anticorpo. Por exemplo, quando a união é num tiol de cisteína, como nas formas de realização exemplares anteriores, um anticorpo pode ter somente um ou vários grupos tiol de cisteína, ou pode ter somente um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser ligado. Em determinadas formas de realização, uma carga de fármaco superior, por exemplo p >5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda de permeabilidade celular de determinados conjugados anticorpo-fármaco. Em determinadas formas de realização, a carga de fármaco para um ADC da invenção varia de 1 a cerca de 8; de cerca de 2 a cerca de 6; de cerca de 3 a cerca de 5; de cerca de 3 a cerca de 4; de cerca de 3,1 a cerca de 3,9; de cerca de 3,2 a cerca de 3,8; de cerca de 3,2 a cerca de 3,7; de cerca de 3,2 a cerca de 3,6; de cerca de 3,3 a cerca de 3,8; ou de cerca de 3,3 a cerca de 3,7. De facto, foi demonstrado que para certos ADC, a razão ótima de frações de fármaco por anticorpo pode ser inferior a 8, e pode ser de cerca de 2 a cerca de 5. Veja-se o documento US 2005-0238649 AI (incorporado no presente documento por referência na sua totalidade).
Em determinadas formas de realização, são conjugadas menos do que o máximo teórico de frações de fármaco a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o intermediário fármaco-ligante ou reagente ligante, conforme discutido abaixo. Geralmente, os anticorpos não contêm vários grupos tiol de cisteína livres e reativos que possam ser ligados a uma fração de fármaco; de facto, a maioria dos resíduos tiol da cisteína em anticorpos existem como pontes de dissulfeto. Em determinadas formas de realização, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor tal como ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições de redução parcial ou total, para gerar grupos tiol de cisteína reativos. Em determinadas formas de realização, um anticorpo é submetido a condições desnaturantes para revelar grupos nucleofílicos reativos tais como lisina ou cisteína, A carga (razão fãrmaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes maneiras, por exemplo: (i) limitando o excesso molar de intermediário fármaco-ligante ou reagente ligante relativamente ao anticorpo, (ii) limitando o tempo ou a temperatura da reação de conjugação, (iii) limitando as condições de redução ou redução parcial para a modificação do tiol de cisteína, (iv) manipulação através de técnicas recombinantes a sequência de aminoãcidos do anticorpo de modo a que o número e a posição de resíduos de cisteína sejam modificados para controlar o número e/ou a posição de ligações ligante-fármaco (tais como MabTio ou FabTio preparados conforme divulgado no presente documento e no documento W02006/034488).
Deve ser entendido que quando mais do que um grupo nucleofílico reage com um intermediário fármaco-ligante ou reagente ligante seguido por um reagente de fração de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos ADC com uma distribuição de uma ou mais frações de fármaco ligadas a um anticorpo. 0 número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura através de um ensaio ELISA duplo ao anticorpo, que seja específico para o anticorpo e específico para o fármaco. Podem ser identificadas moléculas de ADC individuais na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo cromatografia de interação hidrófoba (veja-se, por exemplo, Hamblett, K.J., et ai. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de março de 2 004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2 004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugate", Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004). Em determinadas formas de realização, pode ser isolado um ADC homogéneo com um valor único de carga a partir da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia.
Determinados Métodos de Preparação de Imunoconjugados
Pode ser preparado um ADC de fórmula I por várias vias empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos para os peritos na especialidade, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligante bivalente para formar Ab-L através de uma ligação covalente, seguida por reação com uma fração de fãrmaco D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma fração de fãrmaco com um reagente ligante bivalente para formar D-L, através de uma ligação covalente, seguida por reação com um grupo nucleofílico de um anticorpo. São descritos métodos exemplares para a preparação de um ADC de fórmula I através desta última via no documento US 20050238649 Al.
Os grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas não estão limitados a: (i) grupos amino N-terminais, (ii) grupos amino de cadeias laterais, por exemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadeias laterais, por exemplo cisteína, e (iv) grupos hidroxilo ou amino de açúcares quando o anticorpo é glicosilado. Os grupos amino, tiol e hidroxilo são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em frações ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e de benzilo tais como halogenoacetamidas; (iii) grupos aldeído, cetona, carboxilo e maleimido. Determinados anticorpos têm dissulfetos inter-cadeia redutíveis, isto é, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes por tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), de modo a que o anticorpo seja completamente ou parcialmente reduzido. Cada ponte de cisteína irá como tal formar, teoricamente, dois nucleofílicos de tiol reativo. Podem ser introduzidos grupos nucleofílicos adicionais em anticorpos através de modificação de resíduos de lisina, por exemplo, por reação de resíduos de lisina com 2-iminotiolano (reagente de Traut), resultando na conversão de uma amina num tiol. Podem ser introduzidos grupos tiol reativos num anticorpo introduzindo um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparando anticorpos variantes compreendendo um ou mais resíduos de aminoácido de cisteína não nativos).
Podem também ser produzidos conjugados anticorpo-fármaco da invenção por reação entre um grupo eletrofílico num anticorpo, tal como um grupo carbonilo de aldeído ou cetona, com um grupo nucleofílico num reagente ligante ou fármaco. Grupos nucleofílicos úteis num reagente ligante incluem, mas não estão limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tio-semicarbazona, hidrazinocarboxilato e aril-hidrazida. Numa forma de realização, um anticorpo é modificado para introduzir frações eletrofílicas que são capazes de reagir com substituintes nucleofílicos no reagente ligante ou no fármaco. Noutra forma de realização, os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo com reagentes oxidantes de periodato, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amino de reagentes ligantes ou frações de fãrmaco. Os resultantes grupos imina de base de Schiff podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, por exemplo por reagentes de boro-hidreto para formar ligações amino estáveis. Numa forma de realização, a reação da fração hidrato de carbono de um anticorpo glicosilado com galactose-oxidase ou meta-periodato de sódio, pode originar grupos carbonilo (aldeído e cetona) no anticorpo que podem reagir com grupos adequados no fãrmaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . Noutra forma de realização, anticorpos contendo resíduos de serina ou treonina N-terminais podem reagir com meta-periodato de sódio, resultando na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoãcido (Geoghegan &amp; Stroh, (1992) Bíoconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Um tal aldeído pode ser reagido com uma fração de fãrmaco ou um ligante nucleofílico.
Os grupos nucleofílicos numa fração de fãrmaco incluem, mas não estão limitados a: grupos amino, tiol, hidroxilo, hidrazida, oximo, hidrazina, tio-semicarbazona, hidrazinocarboxilato e aril-hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em frações ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e de benzilo tais como halogenoacetamidas; (iii) grupos aldeído, cetona, carboxilo e maleimido.
Os compostos da invenção contemplam explicitamente, mas não estão limitados a, ADC preparados com os seguintes reagentes reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfO-EMCS, sulfO-GMBS, sulfO-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB e SVSB ( (4-vinilsulfono)benzoato de succinimidilo) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, em Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A; veja-se as páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
Os imunoconjugados compreendendo um anticorpo e urn agente citotóxico podem também ser preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4 -(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT) , derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo HC1), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tais como bis-(p-diazoniobenzoi1)eti1enodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Por exemplo, pode ser preparada uma imunotoxina de ricina conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). 0 ácido l-isotioeianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleótidos ao anticorpo. Veja-se o documento WO94/11026.
Alternativamente, pode ser preparada uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo e um agente citotóxico, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese peptídica. Uma molécula de ADN recombinante pode compreender regiões que codificam o anticorpo e frações citotóxicas do conjugado quer adjacentes entre si quer separadas por uma região que codifica um péptido ligante que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.
Ainda noutra forma de realização, um anticorpo pode ser conjugado com um "recetor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento de tumores em que o conjugado anticorpo-recetor é administrado ao paciente, seguido por remoção do conjugado não ligado a partir da circulação utilizando um agente de eliminação e posteriormente administração de um '’ligando" (por exemplo, avidina) que está conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleótido).
Preparação de anticorpos anti-STEAP-1 manipulados com cisteína
Os métodos de desenho, seleção e preparação da invenção potenciam adicionalmente anticorpos anti-STEAP-1 manipulados com cisteína que são reativos com a funcionalidade eletrofílica. Estes métodos potenciam adicionalmente compostos conjugados de anticorpo tais como compostos conjugado anticorpo-fármaco (ADC) com moléculas de fãrmacos em locais seletivos designados, desenhados. Os resíduos de cisteína reativos na superfície de um anticorpo permitem a conjugação específica de uma fração de fármaco através de um grupo tiol reativo tal como maleimida ou haloacetilo. A reatividade nucleofílica da funcionalidade tiol de um resíduo de Cys com um grupo maleimido é cerca de 1000 vezes superior em comparação com qualquer outra funcionalidade de aminoácido numa proteína, tais como grupos amino de resíduos de lisina ou o grupo amino N-terminal. A funcionalidade tiol específica em reagentes iodoacetilo e maleimida pode reagir com grupos amino, mas são necessários pH superiores (>9,0) e tempos de reação mais longos (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London). A quantidade de tiol livre numa proteína pode ser estimada através do ensaio de Ellman padrão. A imunoglobulina M é um exemplo de um pentâmero ligado por dissulfeto, enquanto a imunoglobulina G é um exemplo de uma proteína com pontes de dissulfeto internas que ligam as subunidades. Em proteínas como estas, é requerida redução das ligações dissulfeto com um reagente tal como ditiotreitol (DTT) ou selenol (Singh et aI. (2002) Anal. Biochem. 304:147-156) para gerar o tiol livre reativo. Esta abordagem pode resultar na perda da estrutura terciária do anticorpo e da especificidade de ligação a antigénio. 0 Ensaio Pheselector (Phage ELISA para Seleção de Tióis Reactivos) permite a deteção de grupos cisteína reativos em anticorpos num formato de ELISA em fagos ajudando como tal no desenho de anticorpos manipulados com cisteína (documento WO 2006/034488). 0 anticorpo manipulado com cisteína é aplicado como revestimento nas superfícies de poços, seguido por incubação com partículas de fago, adição de anticorpo secundário marcado com HRP, e deteção de absorvância. As proteínas mutantes exibidas sobre fagos podem ser rastreadas de uma maneira rápida, robusta e de alto rendimento. Podem ser produzidas bibliotecas de anticorpos manipulados com cisteína e submetidas a seleção por ligação utilizando a mesma abordagem para identificar locais adequadamente reativos de incorporação de Cys livre a partir de bibliotecas de proteínas aleatórias em fagos de anticorpos ou outras proteínas. Esta técnica inclui a reação de proteínas mutantes de cisteína exibidas em fagos com um reagente de afinidade ou um grupo repórter que é também reativo com tiol. 0 ensaio PHESELECTOR permite o rastreio de grupos tiol reativos em anticorpos. A identificação da variante A121C por este método é exemplar. A totalidade da molécula de Fab pode ser eficazmente rastreada para identificar mais variantes FabTio com grupos tiol reativos. Foi empregue um parâmetro, acessibilidade da superfície fracionada, para identificar e quantificar a acessibilidade do solvente aos resíduos de aminoácido num polipéptido. A acessibilidade à superfície pode ser expressa como a área da superfície (Á^) que pode ser contactada por uma molécula de solvente, por exemplo água. 0 espaço ocupado de água é aproximadamente uma esfera de 1,4 Ã de raio. Está disponível gratuitamente ou sob licença software (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, Reino Unido, Fax: (Â44) 1925 603825, ou através da internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) como os programas de cristalografia CCP4 Suite que empregam algoritmos para calcular a acessibilidade à superfície de cada aminoácido de uma proteína com coordenadas derivadas de cristalografia de raios X conhecidas ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. 050:760-763). Dois módulos exemplares de software que realizam cálculos de acessibilidade à superfície são "AREAIMOL" e "SURFACE", baseados nos algoritmos de B. Lee e F.M. Richards (1971) J.Mol.Biol. 55:379-400. AREAIMOL define a superfície acessível ao solvente de uma proteína como o locus do centro de uma esfera de sonda (representando uma molécula de solvente) à medida que roda sobre a superfície de Van der Waals da proteína. AREAIMOL calcula a área da superfície acessível ao solvente gerando pontos de superfície numa esfera estendida à volta de cada átomo (a uma distância do centro do átomo igual à soma dos raios do átomo e da sonda) , e eliminando aqueles que se situam em esferas equivalentes associadas a átomos vizinhos. AREAIMOL encontra a área acessível ao solvente de átomos num ficheiro de coordenadas PDB, e resume a área acessível por resíduo, por cadeia e para a molécula completa. Podem ser escritas áreas (ou diferenças de áreas) acessíveis para átomos individuais num ficheiro de saída de pseudo-PDB. AREAIMOL assume um único raio para cada elemento, e somente reconhece um número limitado de elementos diferentes. AREAIMOL e SURFACE relatam acessibilidades absolutas, isto é, o número de Angstroms (Ã) quadrados. A acessibilidade à superfície fracionada é calculada por referência a um estado padrão relevante para um aminoácido num polipéptido. 0 estado de referência é o tripéptido Gly-X-Gly, onde X é o aminoácido de interesse, e o estado de referência deverá ser uma conformação 'estendida', isto é, como as das cadeias beta. A conformação estendida maximiza a acessibilidade de X. Uma área acessível calculada é dividida pela área acessível num estado de referência do tripéptido Gly-X-Gly e relata o quociente, que é a acessibilidade fracionada. A percentagem de acessibilidade é a acessibilidade fracionada multiplicada por 100. Outro algoritmo exemplar para calcular a acessibilidade à superfície é baseado no módulo SOLV do programa xsae (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basel) que calcula a acessibilidade fracionada de um resíduo de aminoácido a uma esfera de água com base nas coordenadas de raios X do polipéptido. A acessibilidade à superfície fracionada para cada aminoácido num anticorpo pode ser calculada utilizando informação disponível sobre a estrutura cristalina (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995). 0 ADN que codifica os anticorpos manipulados com cisterna e prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de ratinho). As células de hibridoma servem como fonte de tal ADN. Após isolado, o ADN pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfetados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hámster Chinês (CHO), ou outras células hospedeiras de mamífero, tais como células de mieloma (documentos US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310) que de outro modo não produzem a proteína do anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.
Após o desenho e a seleção, os anticorpos manipulados com cisteína, por exemplo FabTio, com os resíduos de Cys desemparelhados, manipulados, altamente reativos, podem ser produzidos por: (i) expressão num sistema bacteriano, por exemplo E. coli, (Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262; Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188) ou num sistema de cultura de células de mamífero (documento WO 01/00245), por exemplo células de Ovário de Hãmster Chinês (CHO); e (ii) purificação utilizando técnicas de purificação de proteínas comuns (Lowman et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988).
Os grupos tiol de Cys manipulados reagem com reagentes ligantes eletrofílicos e intermediários fãrmaco-ligante para formar conjugados de anticorpo manipulado com cisteína e fãrmaco e outros anticorpos manipulados com cisteína marcados. Os resíduos de Cys de anticorpos manipulados com cisteína, e presentes nos anticorpos parentais, que estão emparelhados e formam ligações dissulfureto inter-cadeia e intra-cadeia, não têm quaisquer grupos tiol reativos (a menos que tratados com um agente redutor) e não reagem com reagentes ligantes eletrofílicos ou intermediários fãrmaco-ligante. 0 resíduo de Cys recém-manipulado, pode permanecer desemparelhado, e capaz de reagir com, isto é, ser conjugado com, um reagente ligante eletrofílico ou um intermediário fármaco-ligante, tal como um fãrmaco-maleimida. Intermediários fármaco-ligante exemplares incluem: MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE e MC-vc-PAB-MMAF. As posições na estrutura dos resíduos de Cys manipulados das cadeias pesadas e leves são numeradas de acordo com o sistema de numeração sequencial. Este sistema de numeração sequencial está correlacionado com o sistema de numeração de Kabat. (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) começando no terminal N, e difere do esquema de numeração de Kabat (linha inferior) por inserções indicadas como a, b, c. Utilizando o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoãcidos linear real pode conter menos aminoãcidos ou aminoãcidos adicionais correspondentes a um encurtamento, ou uma inserção, em FR ou CDR do domínio variável. Os locais da variante de cadeia pesada manipulada com cisteína são identificados através dos esquemas de numeração sequencial e de numeração de Kabat. 0 anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína pode ser preparado através de um processo compreendendo: (a) substituição de um ou mais resíduos de aminoácido de um anticorpo anti-STEAP-1 parental por cisteína; e (b) determinação da reatividade de tiol do anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína por reação do anticorpo manipulado com cisteína com um reagente reativo com tiol. 0 anticorpo manipulado com cisteína pode ser mais reativo do que o anticorpo parental com o reagente reativo com tiol.
Os resíduos de aminoácido de cisteína livres podem estar localizados nas cadeias pesadas ou leves, ou nos domínios constantes ou variáveis. Podem também ser manipulados fragmentos de anticorpo, por exemplo Fab, com um ou mais aminoácidos de cisteína em substituição de aminoácidos do fragmento de anticorpo, para formar fragmentos de anticorpo manipulados com cisteína. A presente divulgação também proporciona um método de preparação (produção) de um anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína, compreendendo: (a) introdução de um ou mais aminoácidos de cisteína num anticorpo anti-STEAP-1 parental de modo a gerar o anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína; e (b) determinação da reatividade de tiol do anticorpo manipulado com cisteína com um reagente reativo com tiol; em que o anticorpo manipulado com cisteína é mais reativo do que o anticorpo parental com o reagente reativo com tiol. A etapa (a) do método de preparação de um anticorpo manipulado com cisteína pode compreender: (i) mutagénese de uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo manipulado com cisteína; (ii) expressão do anticorpo manipulado com cisteína; e (iii) isolamento e purificação do anticorpo manipulado com cisteína. A etapa (b) do método de preparação de um anticorpo manipulado com cisteína pode compreender a expressão do anticorpo manipulado com cisteína numa partícula virai selecionada a partir de uma partícula de fago ou de fagemídeo. A etapa (b) do método de preparação de um anticorpo manipulado com cisteína pode também compreender: (i) reação do anticorpo manipulado com cisteína com um reagente de afinidade reativo com tiol para gerar um anticorpo manipulado com cisteína marcado por afinidade; e (ii) medição da ligação do anticorpo manipulado com cisteína marcado por afinidade a um meio de captura.
Também é proporcionado um método de rastreio de anticorpos manipulados com cisteína com aminoãcidos de cisteína desemparelhados, altamente reativos para a reatividade de tiol compreendendo: (a) introdução de um ou mais aminoãcidos de cisteína num anticorpo parental de modo a gerar um anticorpo manipulado com cisteína; (b) reação do anticorpo manipulado com cisteína com um reagente de afinidade reativo com tiol para gerar um anticorpo manipulado com cisteína marcado por afinidade; e (c) medição da ligação do anticorpo manipulado com cisteína marcado por afinidade com um meio de captura; e (d) determinação da reatividade de tiol do anticorpo manipulado com cisteína com o reagente reativo com tiol. A etapa (a) do método de rastreio de anticorpos manipulados com cisteína pode compreender: (i) mutagénese de uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo manipulado com cisteína; (ii) expressão do anticorpo manipulado com cisteína; e (iii) isolamento e a purificação do anticorpo manipulado com cisteína. A etapa (b) do método de rastreio de anticorpos manipulados com cisteína pode compreender a expressão do anticorpo manipulado com cisteína numa partícula virai selecionada a partir de uma partícula de fago ou de fagemídeo. A etapa (b) do método de rastreio de anticorpos manipulados com cisteína pode também compreender: (i) reação do anticorpo manipulado com cisteína com um reagente de afinidade reativo com tiol para gerar um anticorpo manipulado com cisteína marcado por afinidade; e (ii) medição da ligação do anticorpo manipulado com cisteína marcado por afinidade a um meio de captura.
Anticorpos anti-STEAP-1 manipulados com cisteína marcados
Os anticorpos anti-STEAP-1 manipulados com cisteína podem ser acoplados de modo específico de local e eficazmente a um reagente reativo com tiol. 0 reagente reativo com tiol pode ser um reagente ligante multifuncional, um reagente marcador de captura, isto é, de afinidade, (por exemplo um reagente ligante a biotina), um marcador de deteção (por exemplo um reagente fluoróforo), um reagente de imobilização em fase sólida (por exemplo SEPHAROSE™, poliestireno ou vidro), ou um intermediário fármaco-ligante. Um exemplo de um reagente reativo com tiol é N-etilmaleimida (NEM). Numa forma de realização exemplar, a reação de um FabTio com um reagente ligante a biotina proporciona um FabTio biotinilado através do qual a presença e a reatividade do resíduo de cisteína manipulado podem ser detetadas e medidas. A reação de um FabTio com um reagente ligante multifuncional proporciona um FabTio com um ligante funcionalizado que pode adicionalmente reagir com um reagente de fração de fãrmaco ou outro marcador. A reação de um FabTio com um intermediário fãrmaco-ligante proporciona um conjugado de FabTio e fármaco.
Os métodos exemplares descritos no presente documento podem ser aplicados genericamente à identificação e produção de anticorpos, e mais genericamente, a outras proteínas através da aplicação das etapas de desenho e rastreio descritas no presente documento.
Uma tal abordagem pode ser aplicada à conjugação de outros reagentes reativos com tiol nos quais o grupo reativo é, por exemplo, uma maleimida, uma iodoacetamida, um dissulfeto de piridilo, ou outro parceiro de conjugação reativo com tiol (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Carman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. em Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671) . 0 reagente reativo com tiol pode ser uma fração de fãrmaco, um fluoróforo tal como um corante fluorescente como fluoresceína ou rodamina, um agente quelante para um metal de imagiologia ou radioterapêutico, um marcador ou etiqueta de deteção de peptidilo ou não peptidilo, ou um agente de modificação da eliminação tal como vários isómeros de polietilenoglicol, um péptido que liga a um terceiro componente, ou outro hidrato de carbono ou agente lipofilico.
Utilizações de anticorpos anti-STEAP-1 manipulados com cisterna
Podem ser utilizados anticorpos anti-STEAP-1 manipulados com cisterna, e conjugados dos mesmos como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico. A presente divulgação proporciona adicionalmente métodos de prevenção, gestão, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados a um distúrbio relacionado com STEAP-1. Em particular, a presente divulgação proporciona métodos de prevenção, gestão, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados a um distúrbio proliferativo celular, tal como cancro, por exemplo, cancro da próstata, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro da bexiga, cancro do ovário e sarcoma de Ewing. A presente divulgação proporciona ainda, adicionalmente, métodos para o diagnóstico de um distúrbio relacionado com STEAP-1 ou predisposição ao desenvolvimento de um tal distúrbio, bem como métodos para a identificação de anticorpos, e fragmentos de ligação a antigénio de anticorpos, que ligam preferentemente a polipéptidos de STEAP-1 associados a células.
Também é proporcionada a utilização de um anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisterna para a preparação de um medicamento útil no tratamento de uma condição que é responsiva a um distúrbio relacionado com STEAP-1. Preparação de conjugados anticorpo-fármaco ant.i-STEAP-1 manipulados com cisterna 0 ADC de fórmula I pode ser preparado por várias vias, empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos para os peritos na especialidade, incluindo: (1) reação de um grupo de cisterna de um anticorpo manipulado com cisterna com um reagente ligante, para formar o intermediário anticorpo-ligante Ab-L, através de uma ligação covalente, seguida por reação com uma fração de fármaco ativada D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma fração de fármaco com um reagente ligante, para formar um intermediário ligante-fármaco D-L, através de uma ligação covalente, seguida por reação com um grupo cisteína de um anticorpo manipulado com cisteína. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregues com uma variedade de anticorpos manipulados com cisteína, frações de fármaco e ligantes para preparar os conjugados anticorpo-fármaco de fórmula I.
Os grupos tiol de cisteínas do anticorpo são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em reagentes ligantes e em intermediários fármaco-ligante incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e de benzilo, tais como halogenoacetamidas; (iii) grupos aldeído, cetona, carboxilo e maleimido; e (iv) dissulfetos, incluindo dissulfetos de piridilo, através de permuta de sulfeto. Os grupos nucleofílicos numa fração de fármaco incluem, mas não estão limitados a: grupos amino, tiol, hidroxilo, hidrazida, oximo, hidrazina, tio-semicarbazona, hidrazinocarboxilato e aril-hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em frações ligantes e reagentes ligantes.
Os anticorpos manipulados com cisteína podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes por tratamento com um agente redutor tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA), seguido por reoxidação para formar novamente ligações dissulfeto inter-cadeia e intra-cadeia. Por exemplo, anticorpos monoclonais manipulados com cisteína (MabTios) de comprimento completo expressos em células CHO são reduzidos com um excesso de cerca de 50 vezes de TCEP durante 3 h a 37°C para reduzir ligações dissulfeto em adutos de cisteína que podem ser formados entre os resíduos de cisteína recém-introduzidos e a cisteína presente no meio de cultura. 0 MabTio reduzido é diluído e carregado numa coluna HiTrap S em acetato de sódio a 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio a 0,3 M. Foram restabelecidas ligações dissulfureto entre resíduos de cisteína presentes no Mab parental com sulfato de cobre (CuS04) aquoso diluído (200 nM) à temperatura ambiente, durante a noite. Alternativamente, o ácido desidroascórbico (DHAA) é um oxidante eficaz para restabelecer os grupos dissulfureto intra-cadeia do anticorpo manipulado com cisteína após clivagem redutiva dos adutos de cisteína. Podem ser utilizados outros oxidantes, isto é, agentes oxidantes, e condições oxidantes, que são conhecidos na técnica. A oxidação ao ar ambiente também é eficaz. Esta etapa de reoxidação parcial, moderada, forma eficazmente dissulfetos intra-cadeia com elevada fidelidade e preserva os grupos tiol dos resíduos de cisteína recém-introduzidos. Foi adicionado um excesso de aproximadamente 10 vezes de intermediário fármaco-ligante, por exemplo MC-vc-PAB-MMAE, misturado e deixado em repouso durante cerca de uma hora à temperatura ambiente para efetuar a conjugação e formar o conjugado anticorpo-fãrmaco. A mistura de conjugação foi filtrada em gel e carregada e eluída através de uma coluna HiTrap S para remover o excesso de intermediário fãrmaco-ligante e outras impurezas. A Figura 16 mostra o processo geral para preparar um anticorpo manipulado com cisteína expresso a partir de uma cultura celular para conjugação. Quando o meio da cultura celular contém cisteína, podem ser formados adutos de dissulfeto entre o aminoácido de cisteína recém-introduzido e a cisteína a partir do meio. Estes adutos de cisteína, ilustrados com um círculo no MabTio exemplar (esquerda) na Figura 12, devem ser reduzidos para gerar anticorpos manipulados com cisteína reativos para conjugação. Os adutos de cisteína, presumivelmente em conjunto com várias ligações dissulfeto inter-cadeia, são clivados redutivamente para originar uma forma reduzida do anticorpo com agentes redutores tais como TCEP. As ligações dissulfureto inter-cadeia entre resíduos de cisteína emparelhados são novamente formadas sob condições de oxidação parcial com sulfato de cobre, DHAA, ou exposição ao oxigénio ambiente. Os resíduos de cisteína manipulados, recém-introduzidos, e não emparelhados, permanecem disponíveis para reação com reagentes ligantes ou intermediários fármaco-ligante para formar os conjugados de anticorpo da invenção. Os MabTios expressos em linhas celulares de mamífero resultam num aduto de Cys conjugado externamente a uma Cys manipulada através da formação de ligações -S-S-. Como tal, os MabTio purificados são tratados com procedimentos de redução e reoxidação conforme descrito no Exemplo 5 para produzir MabTio reativos. Estes MabTio são utilizados para conjugação com fãrmacos citotóxicos contendo maleimida, fluoróforos, e outros marcadores. A Figura 15 mostra formas de realização de conjugados de anticorpo anti-STEAP-1 manipulados com cisteína e fármaco (ADC) onde uma fração de fármaco de auristatina é ligada a um grupo de cisteína manipulada em: a cadeia leve (LC-ADC); a cadeia pesada (HC-ADC) ,* e a região Fc (Fc-ADC) . Formulações Farmacêuticas
Administração de Conjugados Anticorpo-Fármaco
Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da invenção podem ser administrados por qualquer via adequada para a condição a tratar. 0 ADC será tipicamente administrado por via parentérica, isto é, infusão, via subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural.
Para o tratamento de cancros, por exemplo, da próstata, pulmão e/ou cólon, numa forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é administrado através de infusão intravenosa. A dosagem administrada por infusão está no intervalo de cerca de 1 pg/m2 a cerca de 10.000 pg/m2 por dose, geralmente uma dose por semana num total de uma, duas, três ou quatro doses. Alternativamente, o intervalo de dosagem é de cerca de 1 pg/m2 a cerca de 1000 pg/'m2, de cerca de 1 pg/m2 a cerca de 800 pg/m2, cerca de 1 pg/m2 a cerca de 600 pg/m2, cerca de 1 pg/m2 a cerca de 400 pg/m2, cerca de 10 pg/m2 a cerca de 500 pg/m2, cerca de 10 pg/m2 a cerca de 3 00 pg/m2, cerca de 10 pg/m2 a cerca de 2 00 pg/m2, e cerca de 1 pg/m2 a cerca de 200 pg/m2. A dose pode ser administrada uma vez por dia, uma vez por semana, múltiplas vezes por semana, mas menos de uma vez por dia, múltiplas vezes por mês mas menos de uma vez por dia, múltiplas vezes por mês mas menos de uma vez por semana, uma vez por mês ou intermitentemente para reduzir ou aliviar os sintomas da doença. A administração pode continuar em qualquer dos intervalos divulgados até à remissão do tumor ou dos sintomas do linfoma, leucemia a ser tratados. A administração pode continuar após a remissão ou alívio dos sintomas quando tal remissão ou alívio são prolongados durante tal administração continuada. A divulgação também proporciona um método de tratamento de um cancro da próstata, pulmão e/ou cólon e/ou de uma metástase de tal cancro, compreendendo administração a um paciente que sofre de um cancro da próstata, do pulmão ou do cólon, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo 120v.24 humanizado de qualquer uma das formas de realização precedentes, cujo anticorpo não está conjugado com uma molécula citotóxica ou uma molécula detetável. 0 anticorpo será tipicamente administrado num intervalo de dosagem de cerca de 1 pg/m2 a cerca de 1000 mg/m2. A divulgação também proporciona um método de tratamento de um cancro da próstata, pulmão e/ou cólon e/ou uma metástase de tal cancro, compreendendo administração a um paciente que sofre de um cancro da próstata, pulmão ou cólon, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo 120v.24 humanizado de qualquer uma das formas de realização precedentes, cujo anticorpo está conjugado com uma molécula citotóxica ou uma molécula detetável. 0 anticorpo será tipicamente administrado num intervalo de dosagem de cerca de 1 pg/m2 a cerca de 1000 mg/m2.
Num aspeto, a invenção proporciona adicionalmente formulações farmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo anti-STEAP-1 da invenção e/ou pelo menos um seu imunoconjugado e/ou pelo menos um conjugado anticorpo-fármaco anti-STEAP-1 da invenção. Nalgumas formas de realização, uma formulação farmacêutica compreende 1) um anticorpo anti-STEAP-1 e/ou um conjugado anticorpo-fármaco anti-STEAP-le/ou um imunoconjugado do mesmo, e 2) um portador farmaceuticamente aceitável. Nalgumas formas de realização, uma formulação farmacêutica compreende 1) um anticorpo anti-STEAP-1 e/ou um imunoconjugado do mesmo, e opcionalmente, 2) pelo menos um agente terapêutico adicional.
As formulações farmacêuticas compreendendo um anticorpo ou um imunoconjugado da invenção ou o conjugado anticorpo-fármaco da invenção são preparadas para armazenagem por mistura do anticorpo ou do conjugado anticorpo-fármaco tendo o grau desejado de pureza com portadores, excipientes ou estabi1izantes fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)) na forma de soluções aquosas ou liofilizadas ou outras formulações secas. Os portadores, excipientes ou estabilizant.es aceitáveis não são tóxicos para os beneficiários nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio); fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixa massa molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacãridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraiões formadores de sais tais como sódio; complexos de metais (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensioativos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). As formulações farmacêuticas a ser utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. Isto é prontamente obtido por filtração através de membranas de esterilização por filtração.
Podem também ser aprisionados ingredientes ativos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respetivamente, em sistemas de administração de fãrmaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocãpsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeãveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo ou imunoconjugado da invenção, cujas matrizes estão na forma de artigos formados, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliesteres, bidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactidas ( Pat. U.S. N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólicG degradáveis tais como o LUPRQN DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprõlido), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, determinados hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos ou os imunoconjugados encapsulados permanecem no corpo durante um tempo longo, podem desnaturar ou agregar-se como resultado da exposição a humidade a 37°C, resultando numa perda de atividade biológica e possíveis alterações de imunogenicidade. Podem ser deduzidas estratégias racionais para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação for constatado como sendo formação de ligações S-S intermoleculares através de permuta de tio-dissulfureto, pode ser obtida estabilização por modificação de resíduos de sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilizando aditivos adequados, e desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas.
Tratamentos com Conjugado Anticorpo-Fármaco É contemplado que os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da presente invenção possam ser utilizados para tratar várias doenças ou distúrbios, por exemplo caracterizados pela sobreexpressão de um antigénio tumoral. Condições ou distúrbios hiperproliferativos exemplares incluem tumores benignos ou malignos; leucemia e malignidades linfoides. Outros incluem distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais, blastocélicos; inflamatórios, angiogénicos e imunolõgicos, incluindo autoimunes. Ainda outros incluem cancros da próstata, pulmão e cólon.
Os compostos de ADC que são identificados nos modelos animais e em ensaios à base de células podem ser adicionalmente testados em ensaios clínicos em primatas superiores e seres humanos portadores de tumores. Podem ser desenhados ensaios clínicos em humanos para testar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-STEAP-1 ou do imunoconjugado da invenção em pacientes que sofrem de um distúrbio proliferativo celular da próstata, pulmão ou cólon incluindo, sem limitação, cancros da próstata, pulmão e cólon e metãstases de tais cancros. 0 ensaio clínico pode ser desenhado para avaliar a eficácia de um ADC em combinações com regimes terapêuticos conhecidos, tais como radiação e/ou quimioterapia envolvendo agentes quimioterapêuticos e/ou citotóxicos conhecidos. 0 cancro pode compreender células que expressam STEAP-1, tal que um ADC da presente invenção seja capaz de ligar às células cancerígenas. Para determinar a expressão de STEAP-1 no cancro, estão disponíveis vários ensaios de diagnóstico/prognóstico. Numa forma de realização, a sobreexpressão de STEAP-1 pode ser analisada por IHC. Podem ser submetidas secções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia tumoral ao ensaio IHC e é-lhes atribuído um critério de intensidade de coloração da proteína STEAP-1 em relação ao grau de coloração e na proporção das células tumorais examinadas.
Para a prevenção ou o tratamento de doenças, a dosagem adequada de um ADC irá depender do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, da gravidade e decurso da doença, se a molécula é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, terapêutica anterior, historial clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e da discrição do médico assistente. A molécula é adequadamente administrada ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo 0,1-20 mg/kg) de molécula é uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, quer, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, quer por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 m9/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dosagem exemplar de ADC a ser administrada a um paciente está no intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 10 m9/kg de peso do paciente.
Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Um regime de dosagem exemplar compreende a administração de uma carga de dosagem inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida de uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg de um anticorpo anti-STEAP-1. Podem ser úteis outros regimes de dosagem. A progressão desta terapêutica é facilmente monitorizada por técnicas e ensaios convencionais. Terapêutica de Combinação
Um conjugado anticorpo-fãrmaco (ADC) da invenção pode ser combinado numa formulação farmacêutica de combinação, ou num regime de dosagem na forma de terapêutica de combinação, com pelo menos um composto adicional tendo propriedades anticancerígenas. 0 pelo menos um composto adicional da formulação farmacêutica de combinação ou regime de dosagem tem preferentemente atividades complementares às do ADC da combinação de modo que não se afetam adversamente um ao outro. 0 pelo menos um composto adicional pode ser um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citocina, agente inibidor do crescimento, agente anti hormonal e/ou cardioprotetor. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida. Uma composição farmacêutica contendo um ADC da invenção pode também ter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterapêutico tal como um inibidor da formação de tubulina, um inibidor de topoismerase ou uma aglutinante de ADN.
Mum aspeto, o primeiro composto é um ADC ant.i-STEAP-1 da invenção e o pelo menos um composto adicional é um anticorpo terapêutico para além de um anti-STEAP-1 (anticorpo nu ou um ADC) . Numa forma de realização, o pelo menos um composto adicional é um anticorpo anti-PSCA. Numa forma de realização o pelo menos um composto adicional é um anticorpo anti-HER2, trastuzumab (por exemplo, Herceptin®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA) . Numa forma de realização o pelo menos um composto adicional é um anticorpo anti-HER2, pertuzumab (Omnitarg™, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, veja-se o documento US6949245). Numa forma de realização, o pelo menos um composto adicional é um anticorpo anti-VEGF (por exemplo, Avastin®, Genentech, Inc.) . Em cada caso, o pelo menos um composto é ou um anticorpo nu ou um ADC) . Numa forma de realização, o pelo menos um composto adicional é um anticorpo (um anticorpo nu ou um ADC), e o anticorpo adicional é um segundo, um terceiro, um quarto, um quinto, um sexto anticorpo ou mais, tal que uma combinação destes segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, ou mais anticorpos (nus ou como um ADC) é eficaz no tratamento de uma doença celular proliferativa num tecido que expressa STEAP-1.
Podem ser combinados outros regimes terapêuticos com a administração de um agente anti cancro identificado de acordo com a presente invenção incluindo, sem limitação, terapêutica com radiação e/ou transplantes de medula óssea e sangue periférico e/ou um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico ou um agente inibidor do crescimento. Numa destas formas de realização, um agente quimioterapêutico é um agente ou uma combinação de agentes tais como, por exemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, adriamicina, doxorrubicina, vincristina (Oncovin™), prednisolona, CHOP, CVP ou COP, ou imunoterapêuticos tais como anti-PSCA, anti-HER2 (por exemplo, Herceptin®, Omnitarg™) ou anti-VEGF (por exemplo, Avastin®). A terapêutica de combinação pode ser administrada como um regime simultâneo ou sequencial. Quando administrada sequencialmente, a combinação pode ser administrada em duas ou mais administrações. A administração combinada inclui coadministração, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva por qualquer ordem, em que existe preferentemente um período de tempo durante o qual ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente as suas atividades biológicas.
Numa forma de realização, o tratamento com um ADC envolve a administração combinada de um agente anti cancro identificado no presente documento, e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do crescimento, incluindo coadministração de cocktails de diferentes agentes quimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos incluem taxamos (tais como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. A preparação e os esquemas de dosagem para estes agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo técnico especialista. São também descritos preparação e esquemas de dosagem para esta quimioterapia em "Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams &amp; Wilkins, Baltimore, Md.
As dosagens adequadas para qualquer dos anteriores agentes coadministrados são aquelas atualmente utilizadas e podem ser diminuídas devido à ação combinada (sinergia) do agente recentemente identificado e outros agentes quimioterapêuticos ou tratamentos. A terapêutica de combinação pode proporcionar "sinergia" e provar ser "sinérgica", isto é, o efeito conseguido quando os ingredientes ativos são utilizados em conjunto é superior à soma dos efeitos que resultam a partir da utilização dos compostos separadamente. Pode ser conseguido um efeito sinérgico quando os ingredientes ativos são: (1) co-formulados e administrados ou dispensados simultaneamente numa formulação farmacêutica combinada unitária; (2) administrados em alternância ou em paralelo na forma de formulações separadas; ou (3) por algum outro regime. Quando administrados em terapêutica alternada, pode ser obtido um efeito sinérgico quando os compostos são administrados ou dispensados sequencialmente, por exemplo através de diferentes injeções em seringas separadas. Em geral, durante a terapêutica alternada, é administrada sequencialmente uma dosagem eficaz de cada um dos ingredientes ativos, isto é, em série, enquanto na terapêutica de combinação, são administradas em conjunto dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos. Metabolitos dos Conjugados Anticorpo-Fármaco
Também são considerados os produtos metabólicos in vivo dos compostos ADC descritos no presente documento, na medida em que estes produtos são novos e não são óbvios em relação ao estado da técnica. Tais produtos podem resultar por exemplo de oxidação, redução, hidrólise, amidação, esterificação ou clivagem enzimática do composto administrado. Consequentemente, esta divulgação inclui compostos novos e não óbvios produzidos por um processo compreendendo o contacto de um composto da presente invenção com um mamífero durante um período de tempo suficiente para obter um produto metabólico do mesmo.
Os produtos metabolitos são tipicamente identificados pela preparação de um ADC radioetiquetado (por exemplo 14C ou 3H), administração parentérica do mesmo numa dose detetável (por exemplo, superior a cerca de 0,5 mg/kg) a um animal tal como rato, ratinho, porquinho-da-índia, macaco ou ser humano, deixando tempo suficiente para que ocorra o metabolismo (tipicamente cerca de 30 segundos a 30 horas) e isolamento dos seus produtos de conversão a partir da urina, sangue ou de outras amostras biológicas. Estes produtos são facilmente isolados dado que estão marcados (outros são isolados utilizando anticorpos capazes de ligar a epítopos que sobrevivem no metabolito). As estruturas dos metabolitos são determinadas da maneira convencional, por exemplo por análise MS, LC/MS ou RMN. Em geral, a análise de metabolitos é realizada da mesma maneira que estudos convencionais de metabolismo de fármacos bem conhecidos para os peritos na especialidade. Os produtos de conversão, contanto que não se encontrem de outro modo in vivo, são úteis em ensaios de diagnóstico para doseamento terapêutico dos compostos ADC da invenção. Métodos Adicionais de Utilização de Anticorpos e
Imunoconjugados Anti-STEAP-1 Métodos de diagnóstico e métodos de deteção
Os anticorpos e imunoconjugados anti-STEAP-1 da invenção são úteis para a deteção da presença de STEAP-1 numa amostra biológica. 0 termo "deteção", conforme utilizado no presente documento, abrange deteção quantitativa ou qualitativa. Uma amostra biológica compreende uma célula ou um tecido. Estes tecidos podem incluir tecidos normais e/ou cancerosos que expressam STEAP-1 em níveis mais elevados em comparação com outros tecidos, por exemplo, da próstata, pulmão e cólon. A presente divulgação proporciona um método de deteção da presença de STEAP-1 numa amostra biológica. 0 método compreende o contacto da amostra biológica com um anticorpo anti-STEAP-1 sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-STEAP-1 a STEAP-1, e deteção de se é formado um complexo entre o anticorpo anti-STEAP-1 e STEAP-1. A presente divulgação proporciona um método de diagnóstico de um distúrbio associado com expressão aumentada de STEAP-1. 0 método pode compreender o contacto de uma célula de teste com um anticorpo anti-STEAP-1; determinação do nível de expressão (quantitativa ou qualitativa) de STEAP-1 pela célula de teste por deteção da ligação do anticorpo anti-STEAP-1 a STEAP-1; e comparação do nível de expressão de STEAP-1 pela célula de teste com o nível de expressão de STEAP-1 por uma célula de controlo (por exemplo, uma célula normal do mesmo tecido de origem que a célula de teste ou uma célula que expressa STEAP-1 em níveis comparáveis a uma tal célula normal), em que um nível de expressão de STEAP-1 superior pela célula de teste em comparação com a célula de controlo indica a presença de um distúrbio associado a expressão aumentada de STEAP-1. A célula de teste pode ser obtida a partir de um indivíduo suspeito como tendo um distúrbio associado a expressão aumentada de STEAP-1. Em determinadas formas de realização, o distúrbio é um distúrbio proliferativo celular, tal como um cancro ou um tumor.
Distúrbios celulares proliferativos exemplares que podem ser diagnosticados utilizando um anticorpo da invenção incluem os cancros da próstata, pulmão e cólon ou metástases de tais cancros.
Um método de diagnóstico ou deteção, tal como os descritos acima, pode compreender a deteção da ligação de um anticorpo anti-STEAP-1 a STEAP-1 expressa na superfície de uma célula ou numa preparação de membrana obtida a partir de uma célula que expressa STEAP-1 na sua superfície. 0 método pode compreender o contacto de uma célula com um anticorpo anti-STEAP-1 sob condições permissivas para ligação do anticorpo anti-STEAP-1 a STEAP-1, e deteção de se é formado um complexo entre o anticorpo anti-STEAP-1 e STEAP-1 na superfície celular. Um ensaio exemplar para deteção da ligação de um anticorpo anti-STEAP-1 a STEAP-1 expressa na superfície de uma célula é um ensaio !!FACS".
Podem ser utilizados determinados outros métodos para detetar a ligação de anticorpos anti-STEAP-1 a STEAP-1. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação a antigénio que são bem conhecidos na técnica, tais como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente com ligação a enzima), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios com proteína A e imunohistoquímica (IHC).
Em determinadas formas de realização, os anticorpos anti-STEAP-1 são marcados. Os marcadores incluem, mas não estão limitados a, marcadores ou frações que são detetados diretamente (tais como marcadores fluorescentes, cromofóricos, densos em eletrões, quimiluminescentes e radioativos), bem como frações, tais como enzimas ou ligandos, que são detetados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou uma interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não estão limitados a, os radioisótopos 32p; 125jj 3¾ e fluoróforos tais como quelatos de terras raras ou fluoresceína e os seus derivados, rodamina e os seus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana (Pat. U.S. N.° 4.737.456), luciferina, 2,3-di- hidroftalazinodionas, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacãrido-oxidases, por exemplo, glucose-oxidase, galactose-oxidase e glucose-6-fosfato-desidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e xantina-oxidase, acopladas a uma enzima que emprega perõxido de hidrogénio para oxidar um precursor de um corante tal como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores bacteriófagos ou radicais livres estáveis.
Em determinadas formas de realização, os anticorpos anti-STEAP-1 estão imobilizados numa matriz insolúvel. A imobilização implica a separação do anticorpo anti-STEAP-1 a partir de qualquer STEAP-1 que permaneça livre em solução. Isto é obtido convencionalmente insolubilizando o anticorpo anti-STEAP-1 antes do procedimento de ensaio, como por adsorção a uma matriz ou superfície insolúveis em água (Bennich et ai. , U.S. N.° 3.720.760), ou por acoplamento covalente (por exemplo, utilizando reticulação com glutaraldeído), ou insolubilizando o anticorpo anti-STEAP-1 após a formação de um complexo entre o anticorpo anti-STEAP-1 e a STEAP-1, por exemplo, por imunoprecipitação.
Podem ser realizados diagnóstico ou a deteção conforme descritos acima utilizando um imunoconjugado da invenção em vez de, ou para além de, um anticorpo anti-STEAP-1. Métodos terapêuticos
Podem ser utilizados um anticorpo ou imunoconjugado da invenção, por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo. A divulgação proporciona métodos para a inibição do crescimento ou da proliferação celulares, quer in vivo quer in vitro, o método compreendendo a exposição de uma célula a um anticorpo anti-STEAP-1 ou um imunoconjugado do mesmo sob condições permissivas para ligação do imunoconjugado a STEAP-1. "Inibição do crescimento ou proliferação celulares" significa a diminuição do crescimento ou da proliferação de uma célula em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%, e inclui indução de morte celular. A célula pode ser uma célula tumoral. A célula pode ser uma célula da próstata, do pulmão, do cólon, da bexiga ou do ovário, ou uma célula de sarcoma de Ewing. A célula pode ser um xenoenxerto, por exemplo, conforme exemplificado no presente documento.
Podem ser utilizados um anticorpo ou um imunoconjugado da invenção para tratar ou prevenir um distúrbio proliferative celular da próstata, pulmão, cólon, bexiga ou ovário ou de sarcoma de Ewing. Em determinadas formas de realização, o distúrbio proliferativo celular está associado a expressão e/ou atividade aumentadas de STEAP-1.
Por exemplo, o distúrbio proliferativo celular da próstata, pulmão, cólon, bexiga ou ovário ou de sarcoma de Ewing está associado a expressão aumentada de STEAP-1 na superfície de uma célula da próstata, pulmão, cólon, bexiga ou ovário ou de sarcoma de Ewing, 0 distúrbio proliferativo celular da próstata, pulmão, cólon, bexiga ou ovário ou de sarcoma de Ewing pode ser um tumor ou um cancro ou metástase de tal cancro.
Num aspeto, a invenção proporciona métodos para tratamento de um distúrbio proliferativo celular da próstata, pulmão ou cólon compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-STEAP-1 ou de um imunoconjugado do mesmo. 0 método para o tratamento de um distúrbio proliferativa celular da próstata, pulmão ou cólon compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-STEAP-1 ou um imunoconjugado anti-STEAP-1 e, opcionalmente, pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como aqueles proporcionados no presente documento.
Num aspeto, pelo menos alguns dos anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ligar a STEAP-1 de uma espécie não humana. Consequentemente, os anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser utilizados para ligar STEAP-1, por exemplo, numa cultura celular contendo STEAP-1, em seres humanos, ou noutros mamíferos tendo uma STEAP-1 com a qual anticorpo ou imunoconjugado da invenção reage de modo cruzado (por exemplo chimpanzé, babuíno, sagui, macacos cinamolgo e rhesus, cão, porco, rato ou ratinho). Numa forma de realização, podem ser utilizados um anticorpo ou um imunoconjugado anti-STEAP-1 para visar STEAP-1 em células da próstata, pulmão ou cólon por contacto do anticorpo ou imunoconjugado com STEAP-1 para formar um anticorpo ou complexo imunoconjugado-antigénio de modo que uma citotoxina conjugada do imunoconjugado aceda ao interior da célula. Numa forma de realização, a STEAP-1 à qual o anticorpo anti-STEAP-1 liga é STEAP-1 humana. Numa forma de realização, a STEAP-1 à qual o anticorpo anti-STEAP-1 liga é STEAP-1 de macaco cinamolgo. Numa forma de realização, o anticorpo humanizado anti-STEAP-1 liga a STEAP-1 humana e/ou de macaco cinamolgo.
Podem ser utilizados um anticorpo ou um imunoconjugado anti-STEAP-1 num método para ligação de STEAP-1 num indivíduo sofrendo de um distúrbio associado a expressão e/ou atividade aumentadas de STEAP-1, o método compreendendo a administração ao indivíduo do anticorpo ou imunoconjugado tal que a STEAP-1 no indivíduo seja ligada. Numa forma de realização, o anticorpo ou imunoconjugado ligados são internalizados na célula da próstata, pulmão, cólon, bexiga ou ovário ou de sarcoma de Ewing que expressam STEAP-1. Numa forma de realização, a STEAP-1 é STEAP-1 humana, e o indivíduo é um indivíduo humano. Alternativamente, o indivíduo pode ser um mamífero que expressa STEAP-1 à qual um anticorpo anti-STEAP-1 liga. Ainda adicionalmente o indivíduo pode ser um mamífero no qual foi introduzida STEAP-1 (por exemplo, por administração de STEAP-1 ou por expressão de um transgene que codifica STEAP-1).
Podem ser administrados um anticorpo ou um imunoconjugado anti-STEAP-1 a um ser humano para fins terapêuticos. Adicionalmente, podem ser administrados um anticorpo ou um imunoconjugado anti-STEAP-1 a um mamífero não humano que expressa STEAP-1 com a qual o anticorpo tem reatividade cruzada (por exemplo, um primata, cão, porco, rato ou ratinho) para fins veterinários ou como modelo animal de doença humana. Em relação a este último, estes modelos animais podem ser úteis para avaliação da eficácia terapêutica de anticorpos ou imunoconjugados da invenção (por exemplo, teste de dosagens e decursos de tempo de administração).
Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser utilizados por si sós ou em combinação com outras composições numa terapêutica. Por exemplo, um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional e/ou um adjuvante. Em determinadas formas de realização, um agente terapêutico adicional é um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico ou um agente inibidor do crescimento. Numa de tais formas de realização, um agente quimioterapêutico é um agente ou uma combinação de agentes tais como, por exemplo, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, adriamicina, doxorrubicina, vincristina (Oncovin™), prednisolona, CHOP, CVP ou OOP, ou imunoterapêuticos tais como anti-PSCA (veja-se, por exemplo, o documento US6824780) , anti-VEGF (por exemplo, Avastin®, Genentech, Inc.), anti-HER2 (por exemplo, Herceptin®, Omnitarg™ Genentech, Inc.), ou anti-HER2 em combinação com Taxol® (veja-se, por exemplo, Bioworld Today, 17 de novembro de 1999, página 1), em que a terapêutica de combinação é útil no tratamento de distúrbios celulares proliferativos, cancros e/ou metãstases de cancros da próstata, pulmão e/ou cólon.
Tais terapêuticas de combinação notadas acima abrangem administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas), e administração separada, em cujo caso a administração do anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ocorrer antes de, simultaneamente com, e/ou após, a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante. Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem também ser utilizados em combinação com terapêutica com radiação.
Um anticorpo ou um imunoconjugado da invenção (e qualquer agente terapêutico ou adjuvante adicional) podem ser administrados através de qualquer meio adequado, incluindo administração parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, intralesional. As infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra~arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Adicionalmente, o anticorpo ou imunoconjugado são adequadamente administrados por infusão por pulso, particularmente com doses decrescentes do anticorpo ou imunoconjugado. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crónica.
Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção serão formulados, doseados e administrados de uma maneira consistente com a boa prática médica. Os fatores a ter em consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de administração do agente, o método de administração, o esquema de administração, e outros fatores conhecidos para os profissionais médicos. 0 anticorpo ou imunoconjugado não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade de anticorpo ou de imunoconjugado presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e vias de administração conforme descrito no presente documento, ou a cerca de 1 a 99Ê das dosagens descritas no presente documento, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada como sendo adequada.
Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem adequada de um anticorpo ou de um imunoconjugado da invenção (quando utilizados por si sós ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais, tais como agentes quimioterapêuticos) irá depender do tipo de doença a ser tratado, tipo de anticorpo ou imunoconjugado, gravidade e decurso da doença, se o anticorpo ou o imunoconjugado são administrados para fins preventivos ou terapêuticos, terapêutica anterior, historial clínico do paciente e resposta ao anticorpo ou ao imunoconjugado, e da discrição do médico assistente. 0 anticorpo ou imunoconjugado são adequadamente administrados ao paciente numa só vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg (por exemplo 0,1 mg/kg-20mg,/kg) de anticorpo ou imunoconjugado pode ser uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, quer, por exemplo, numa ou mais administrações separadas, quer por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento será geralmente sustentado até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo ou imunoconjugado estará no intervalo de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Consequentemente, podem ser administradas ao paciente uma ou mais doses de cerca de 0,5 m9/kçu 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) de anticorpo ou imunoconjugado. Estas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo semanalmente ou de três em três semanas (por exemplo, tal que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo cerca de seis doses do anticorpo ou imunoconjugado). Podem ser administradas uma dose de carga inicial superior, seguida por uma ou mais doses menores. Um regime de dosagem exemplar compreende a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Contudo, podem ser úteis outros regimes de dosagem. A progressão desta terapêutica é facilmente monitorizada por técnicas e ensaios convencionais.
Ensaios
Os anticorpos e imunoconjugados anti-STEAP-1 da invenção podem ser caracterizados pelas suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas através de vários ensaios conhecidos na técnica.
Ensaios de atividade São proporcionados ensaios para a identificação de anticorpos anti-STEAP-1 ou imunoconjugados dos mesmos tendo atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, a capacidade para inibir o crescimento ou proliferação celular (por exemplo, atividade de "morte celular"), ou a capacidade para induzir morte celular, incluindo morte celular programada (apoptose). São também proporcionados anticorpos ou imunoconjugados tendo esta atividade biológica in vivo e/ou in vitro.
Um anticorpo anti-STEAP-1 ou um imunoconjugado do mesmo podem ser testados para a sua capacidade de inibir o crescimento ou proliferação celular in vitro. Os ensaios para inibição do crescimento ou da proliferação celulares são bem conhecidos na técnica. Determinados ensaios para a proliferação celular, exemplificados pelos ensaios de "morte celular" descritos no presente documento, medem a viabilidade celular. Um tal ensaio é o Ensaio Luminescente , . „ , TM ^ de Viabilidade Celular CellTiter-Glo , que esta comercialmente disponível da Promega (Madison, WI) . Esse ensaio determina o número de células viáveis em cultura com base na quantificação de ATP presente, que é uma indicação de células metabolicamente ativas. Veja-se Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, Pat. US N.° 6602677. 0 ensaio pode ser levado a cabo no formato de 96 ou 384 poços, tornando-o suscetível a rastreio automático de alto rendimento (HTS). Veja-se Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. 0 procedimento do ensaio envolve a adição de um unico reagente (Reagente CellTiter-Glo ) diretamente às células em cultura. Isto resulta na lise das células e na geração de um sinal luminescente produzido por uma reação da luciferase. 0 sinal luminescente é proporcional à quantidade de ATP presente, que é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes em cultura. Os resultados podem ser registados por um luminõmetro ou um dispositivo de imagiologia com câmara CCD. A produção de luminescência é expressa como unidades relativas de luz (RLU).
Outro ensaio para a proliferação celular é o ensaio "MTT", um ensaio colorimétrico que mede a oxidação de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio a formazano pela redutase mitocondrial. Tal como o ensaio CellTiter-Glo'M, este ensaio indica o número de células metabolicamente ativas presentes numa cultura celular. Veja-se, por exemplo, Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63, e Zhang et al. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882.
Um anticorpo anti-STEAP-1 pode ser testado para a sua capacidade de induzir morte celular in vitro. São bem conhecidos ensaios de indução de morte celular na técnica. Tais ensaios podem medir, por exemplo, a perda de integridade da membrana conforme indicado pela captação de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (veja-se Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11), ou 7AAD. Num ensaio exemplar de captação de PI, as células são cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM): F-12 de Ham (50:50) suplementado com FBS 10% inactivado por calor (Hyclone) e 2 mM de L-glutamina. Consequentemente, o ensaio é realizado na ausência de complemento e células imunitárias efetoras. As células são semeadas a uma densidade de 3 x 10^ por placa em placas de 100 x 20 mm e deixadas fixar durante a noite. 0 meio e removido e substituído por meio fresco sozinho ou meio contendo várias concentrações do anticorpo ou imunoconjugado. As células são incubadas durante um período de tempo de 3 dias. Após o tratamento, as monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por tripsinização. As células são então centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C, o sedimento é ressuspenso o _ „ em 3 ml de tampão de ligação de Ca2A £ri° (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) e dividido em alíquotas em 12 x tubos e 75 mm com tampas filtrantes de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção de agregados celulares. Os tubos recebem então PI (10 pg/rnl). As amostras são analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Os anticorpos ou imunoconjugados que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular conforme determinado pela captação de PI são consequentemente identificados.
Um anticorpo ou imunoconjugado anti-STEAP-1 pode ser testado para a sua capacidade de induzir apoptose (morte celular programada) in vitro. Um ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzem apoptose é um ensaio de ligação a anexina. Num ensaio de ligação a anexina exemplar, as células são cultivadas e semeadas em placas conforme discutido no parágrafo anterior. 0 meio é removido e substituído por meio fresco por si só ou meio contendo 0,001 a 10 pg/ml do anticorpo ou imunoconjugado. Após um período de incubação de três dias, as monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por tripsinização. As células são posteriormente centrifugadas, ressuspensas em tampão de ligação de Ca2·^, e divididas em alíquotas em tubos conforme discutido no parágrafo anterior. Os tubos recebem então anexina marcada (por exemplo anexina V-FITC) (1 pg/ml). As amostras são analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e software FACSCONVERT™
CellQuest (BD Biosciences). Os anticorpos ou imunoconjugados que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação a anexina relativamente ao controlo são consequentemente identificados. Outro ensaio exemplar para anticorpos ou imunoconjugados que induzem apoptose é um ensaio colorimétrico de ELISA de ADN e histona para a deteção de degradação internucleossõmica de ADN genómico. Este ensaio pode ser realizado utilizando, por exemplo, o kit de ELISA de Deteção de Morte Celular (Roche, Paio Alto, CA).
As células para utilização em qualquer dos ensaios in vitro anteriores incluem células ou linhas celulares que expressam naturalmente STEAP-1 ou que foram manipuladas para expressar STEAP-1. Estas células incluem células tumorais que sobreexpressam STEAP-1 relativamente a células normais do mesmo tecido de origem. Estas células também incluem linhas celulares (incluindo linhas celulares tumorais) que expressam STEAP-1, e linhas celulares que normalmente não expressam STEAP-1 mas foram transfetadas com ácido nucleico que codifica STEAP-1.
Um anticorpo anti-STEAP-1 ou imunoconjugado do mesmo podem ser testados para a sua capacidade de inibir o crescimento ou proliferação celular in vivo. Em determinadas formas de realização, um anticorpo anti-STEAP-1 ou imunoconjugado do mesmo podem ser testados para a sua capacidade de inibir o crescimento tumoral in vivo. Podem ser utilizados para este teste sistemas modelo in vivo, tais como modelos de xenoenxerto. Num sistema de xenoenxerto exemplar, são introduzidas células tumorais humanas num animal não humano adequadamente imunocomprometido, por exemplo, um ratinho SCID. Podem ser administrados ao animal um anticorpo ou imunoconjugado da invenção. É medida a capacidade do anticorpo ou do imunoconjugado de inibir ou diminuir o crescimento tumoral. No sistema de xenoenxerto anterior, as células tumorais humanas podem ser células tumorais de um paciente humano. Estas células úteis para a preparação de modelos de xenoenxerto incluem linhas celulares tumorais humanas da próstata, pulmão ou cólon, que incluem sem limitação células PC3 que expressam STEAP-1 exógena, e células que expressam naturalmente STEAP-1 que incluem, sem limitação, células LnCAP (Southern Research Institute, Birmingham, AL) , células LuCAP77 e células LuCAP35V (University of Washington, Seattle, WA). As células tumorais humanas podem ser introduzidas num animal não humano adequadamente imunocomprometido por injeção subcutânea ou por transplante num local adequado, tal como uma almofada de gordura mamária.
Ensaios de ligação e outros ensaios
Um anticorpo anti-STEAP-1 pode ser testado para a sua atividade de ligação a antigénio. Por exemplo, um anticorpo anti-STEAP-1 pode ser testado para a sua capacidade de ligar a STEAP-1 exógena ou endógena expressa na superfície de uma célula. Pode ser utilizado para tal teste um ensaio FACS.
Podem ser utilizados ensaios de competição para identificar um anticorpo monoclonal que compete com enxerto 120 ou variantes humanizadas do mesmo, incluindo sem limitação, anticorpo 120v.24, pela ligação a STEAP-1. Este anticorpo competidor pode ligar ao mesmo epítopo (por exemplo, um péptido de epítopo linear ou um epítopo conformacional formado por expressão de STEAP1 na superfície de uma célula) que é ligado pelo anticorpo enxerto 120, ou anticorpo enxerto 120 humanizado, incluindo a variante de anticorpo anti-STEAP-1 humanizado 120v.24. Ensaios de competição exemplares incluem, mas não estão limitados a, ensaios de rotina tais como os proporcionados em Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual c.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . São proporcionados métodos exemplares detalhados para mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo liga em Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Dois anticorpos são afirmados como ligando ao mesmo epítopo se cada um bloquear a ligação do outro em 50Ê ou mais.
Num ensaio de competição exemplar, é incubada STEAP-1 imobilizada numa solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que liga a STEAP-1 (por exemplo, anticorpo de ratinho 120.545, anticorpo enxerto 120, ou anticorpo humanizado 120v.24) e um segundo anticorpo não marcado que está a ser testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo pela ligação a STEAP-1. 0 segundo anticorpo pode estar presente num sobrenadante de hibridomas. Como controlo, é incubada STEAP-1 imobilizada numa solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação sob condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo a STEAP-1, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e é medida a quantidade de marcador associado a STEAP-1 imobilizada. Se a quantidade de marcador associado a STEAP-1 imobilizada for substancialmente reduzida na amostra de teste relativamente à amostra de controlo, então isso indica que o segundo anticorpo está a competir com o primeiro anticorpo pela ligação a STEAP-1. Uma STEAP-1 imobilizada está presente na superfície de uma célula ou numa preparação de membrana obtida de uma célula que expressa STEAP-1 na sua superfície.
Os anticorpos anti-STEAP-1 purificados podem ser adicionalmente caracterizados por uma série de ensaios incluindo, mas não limitados a, sequenciaçâo N-terminal, análise de aminoácidos, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), exclusão por tamanho não desnaturante, espectrometria de massa, cromatografia de permuta iõnica e digestão com papaína.
Numa forma de realização, a invenção contempla um anticorpo alterado que tem algumas, mas não todas, as funções efetoras, o que o torna um candidato desejável para muitas aplicações nas quais semivida do anticorpo in vivo ê importante mas determinadas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Em determinadas formas de realização, as atividades de Fc do anticorpo são medidas para garantir que somente são mantidas as propriedades desejadas. Podem ser conduzidos ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo para confirmar a redução/esgotamento das atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, podem ser levados a cabo ensaios de ligação a recetores de Fc (FcR) para garantir que o anticorpo carece de ligação a FcyR (como tal provavelmente carecendo de atividade de ADCC), mas retém capacidade de ligação a FcRn. As células principais para mediação de ADCC, as células NK, somente expressam Fc(RIII, enquanto os monócitos expressam Fc(RI, Fc(RII e Fc(RIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida na Quadro 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991) . É descrito um exemplo de um ensaio in vitro para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse nas Patentes U.S. N.° 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células natural killer (NK) . Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, num modelo animal tal como aquele divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Podem também ser realizados ensaios de ligação a Clq para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar a Clq e como tal carece de atividade de CDC. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, por exemplo conforme descrito em Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Podem também ser realizadas determinações da ligação a FcRn e de eliminação/semivida in vivo utilizando métodos conhecidos na técnica.
EXEMPLOS
Os seguintes são exemplos de métodos e composições da invenção. É entendido que podem ser postas em prática várias outras formas de realização, dada a descrição geral proporcionada acima.
Exemplo 1: Preparação de anticorpos anti-STEAP-1 humanizados São preparadas moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequência de aminoãcidos do anticorpo, de
fragmento de anticorpo, de domínio VL ou de domínio VH através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleõtidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR e mutagénese por cassetes de uma variante anteriormente preparada ou uma versão não variante do anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio VL ou domínio VH. Por exemplo, podem ser criadas bibliotecas visando posições de aminoãcidos acessíveis de VL em VH, e opcionalmente numa ou mais CDR, para substituição de aminoácidos com aminoácidos variantes utilizando o método de Kunkel. Veja-se, por exemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol. (1987), 154:367-382 e os presentes exemplos. É também descrita geração de sequências aleatórias abaixo nos Exemplos. A sequência de oligonucleõtidos inclui um ou mais dos conjuntos de codões desenhados para uma posição particular numa CDR (HVR) ou região FR de um polipéptido da invenção. Um conjunto de codões é um conjunto de diferentes sequências de tripletos de nucleõtidos utilizadas para codificar aminoãcidos variantes desejados. Os conjuntos de codões podem ser representados utilizando símbolos para designar nucleótidos particulares ou misturas equimolares de nucleótidos conforme mostrado abaixo de acordo com o código IUB. CÓDIGOS IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A ou G) Y (C ou T) M (A ou C) K (G ou T) S (C ou G) W (A ou T) H (A ou C ou T) B (C ou G ou T) V (A ou C OU G) D (A ou G ou T) N (A ou C ou G ou T)
Por exemplo, no conjunto de codões DVK, D pode ser os nucleótidos A ou G ou T; V pode ser A ou G ou C; e K pode ser G ou T. Este conjunto de codões pode mostrar 18 codões diferentes e pode codificar os aminoãcidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly e Cys.
Podem ser sintetizados conjuntos de oligonucleótidos ou iniciadores utilizando métodos padrão. Um conjunto de oligonucleótidos pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese em fase sólida, contendo sequências que representam todas as combinações possíveis de tripletos de nucleótidos proporcionadas pelo conjunto de codões e que codificarão o grupo desejado de aminoãcidos. A síntese de oligonucleótidos com "degenerescência” de nucleótidos selecionados em determinadas posições é bem conhecida na técnica. Tais conjuntos de nucleótidos tendo determinados conjuntos de codões podem ser sintetizados utilizando sintetizadores comerciais de ácido nucleico (disponíveis, por exemplo, da Applied Biosystems, Foster City, CA), ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, da Life Technologies, Rockville, MD). Como tal, um conjunto de oligonucleótidos sintetizado tendo um conjunto particular de codões irá tipicamente incluir uma pluralidade de oligonucleótidos com sequências diferentes, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de codões dentro da sequência global. Os oligonucleótidos, conforme utilizado de acordo com a invenção, têm sequências que permitem hibridação com um molde de ácido nucleico do domínio variável e também podem incluir sítios de enzimas de restrição, para fins de clonagem.
Num método, podem ser criadas sequências de ácido nucleico que codificam aminoácidos variantes por mutagénese mediada por oligonucleótidos. Esta técnica é bem conhecida na especialidade conforme descrito por Zoller et ai., 1987, Nucleic Acids Res. 10:6487-6504. Resumidamente, são criadas sequências de ácido nucleico que codificam aminoácidos variantes por hibridação de um conjunto de oligonucleótidos que codificam os conjuntos desejados de codões com um molde de ADN, onde o molde é a forma de cadeia simples do plasmídeo contendo uma sequência molde de ácido nucleico da região variável. Após hibridação, é utilizada ADN-polimerase para sintetizar uma segunda cadeia complementar completa do molde que irá consequentemente incorporar o oligonucleótido iniciador, e irá conter os conjuntos de codões conforme proporcionado pelo conjunto de oligonucleótidos.
Geralmente, são utilizados oligonucleótidos de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento. Um oligonucleótido ótimo terá 12 a 15 nucleótidos que são completamente complementares ao molde de cada lado do(s) nucleõtido(s) que codificam para a(s) mutação (ões) . Isto garante que o oligonucleótido irá hibridar adequadamente com a molécula de molde de ADN de cadeia simples. Os oligonucleótidos são prontamente sintetizados utilizando técnicas conhecidas na especialidade tais como a descrita por Crea et al. , Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA, 75:5765 (1978). 0 molde de ADN é gerado por aqueles vetores que são derivados a partir de vetores de bacteriófago M13 (os vetores M13mpl8 e M13mpl9 comercialmente disponíveis são adequados), ou aqueles vetores que contêm uma origem de replicação de fago de cadeia simples conforme descrito por Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Consequentemente, o ADN que se destina a ser mutado pode ser inserido num destes vetores de modo a gerar o molde de cadeia simples. A produção do molde de cadeia simples é descrita nas secções 4.21-4.41 de Sambrook et al. , acima.
Para alterar a sequência de ADN nativa, o oligonucleótido é hibridado com o molde de cadeia simples sob condições de hibridação adequadas. É então adicionada uma enzima de polimerização de ADN, habitualmente ADN-polimerase T7 ou o fragmento de Klenow da ADN-polimerase I, para sintetizar a cadeia complementar do molde utilizando o oligonucleótido como iniciador para a síntese. É consequentemente formada uma molécula de heterodúplex tal que uma cadeia de ADN codifica a forma mutada do gene 1, e a outra cadeia (o molde original) codifica a sequência nativa, não alterada, do gene 1. Esta molécula de heterodúplex é então transformada numa célula hospedeira adequada, habitualmente um procariota tal como E. coli JM101. Após crescimento das células, estas são colocadas em placas de agarose e rastreadas utilizando o oligonucleótido iniciador radioetiquetado com um 32-Fosfato para identificar as colónias bacterianas que contêm o ADN mutado. 0 método descrito imediatamente acima pode ser modificado de modo a criar uma molécula de homodúplex em que ambas as cadeias do plasmídeo contêm a(s) mutação(ões).
As modificações são conforme segue: 0 oligonucleõtido de cadeia simples é hibridado com o molde de cadeia simples conforme descrito acima. Uma mistura de três desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) e desoxirribotimidina (dTT), é combinada com uma tiodesoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que pode ser obtida da Amersham). Esta mistura é adicionada ao complexo molde- oligonucleótido. Após a adição de ADN-polimerase a esta mistura, é gerada uma cadeia de ADN idêntica ao molde exceto para as bases mutadas. Adicionalmente, esta nova cadeia de ADN irã conter dCTP- (aS) em vez de dCTP, que serve para a proteger da digestão por endonucleases de restrição. Após a cadeia molde do heterodúplex de cadeia dupla ser cortada com uma enzima de restrição adequada, a cadeia molde pode ser digerida com nuclease ExoIII ou outra nuclease adequada mais além da região que contém o(s) local(ais) que vão sofrer mutagénese. A reação é então parada para deixar uma molécula que é apenas parcialmente de cadeia simples. É então formado um homodúplex de ADN completo de cadeia dupla utilizando ADN polimerase na presença dos quatro desoxirribonucleõtido trifosfatos, ATP e ADN-ligase. Esta molécula de homodúplex pode então ser transformada numa célula hospedeira adequada.
Conforme indicado previamente, a sequência do conjunto de oligonucleótidos tem comprimento suficiente para hibridar com o molde de ácido nucleico e pode também, embora não necessariamente, conter locais de restrição. 0 molde de ADN pode ser gerado pelos vetores que são derivados a partir de vetores de bacteriófago Ml3 ou vetores que contêm uma origem de replicação de fago de cadeia simples conforme descrito por Viera et al. ((1987)
Meth. Enzymol., 153:3). Consequentemente, o ADN destinado a ser mutado deve ser inserido num destes vetores de modo a gerar o molde de cadeia simples. A produção do molde de cadeia simples está descrita nas secções 4.21-4.41 de Sambrook et ai., supra.
De acordo com outro método, pode ser gerada uma biblioteca proporcionando conjuntos de oligonucleótidos a montante e a jusante, em que cada conjunto tem uma pluralidade de oligonucleótidos com sequências diferentes, sendo as diferentes sequências estabelecidas pelos conjuntos de codões proporcionados no interior da sequência dos oligonucleótidos. Os conjuntos de oligonucleótidos a montante e a jusante, juntamente com uma sequência molde de ácido nucleico de domínio variável, podem ser utilizados numa reação em cadeia por polimerase para gerar uma "biblioteca” de produtos de PCR. Os produtos de PCR podem ser referidos como "cassetes de ácido nucleico", dado que podem ser fundidos com outras sequências de ácido nucleico relacionadas ou não relacionadas, por exemplo, proteínas de revestimento virai e domínios de dimerização, utilizando técnicas de biologia molecular estabelecidas.
Podem ser utilizados conjuntos de oligonucleótidos numa reação em cadeia por polimerase utilizando uma sequência de molde de ácido nucleico de domínio variável como molde para criar cassetes de ácido nucleico. A sequência do molde de ácido nucleico de domínio variável pode ser qualquer fração das cadeias pesadas de imunoglobulina contendo as sequências de ácido nucleico alvo (isto é, sequências de ácido nucleico que codificam aminoácidos alvo para substituição). A sequência do molde de ácido nucleico de região variável é uma fração de uma molécula de ADN de cadeia dupla tendo uma primeira cadeia de ácido nucleico e uma segunda cadeia de ácido nucleico complementar. A sequência do molde de ácido nucleico de domínio variável contém pelo menos uma fração de um domínio variável e tem pelo menos uma CDR. Nalguns casos, a sequência do molde de ácido nucleico de domínio variável contém mais do que uma CDR. Podem ser visadas uma fração a montante e uma fração a jusante da sequência do molde de ácido nucleico de domínio variável para hibridação com membros de um conjunto de oligonucleótidos a montante e um conjunto de oligonucleótidos a jusante.
Um primeiro oligonucleótido do conjunto de iniciadores a montante pode hibridar com a primeira cadeia de ácido nucleico e um segundo oligonucleótido do conjunto de iniciadores a jusante pode hibridar com a segunda cadeia de ácido nucleico. Os iniciadores oligonucleotídicos podem incluir um ou mais conjuntos de codões e ser desenhados para hibridar com uma fração da sequência do molde de ácido nucleico de região variável. A utilização destes oligonucleótidos pode introduzir dois ou mais conjuntos de codões no produto da PCR (isto é, a cassete de ácido nucleico) após a PCR. 0 iniciador oligonucleótido que hibrida com regiões da sequência de ácido nucleico que codificam o domínio variável do anticorpo inclui frações que codificam resíduos de CDR que são alvos para substituição de aminoácidos.
Os conjuntos de oligonucleótidos a montante e a jusante podem também ser sintetizados para incluírem locais de restrição no interior da sequência oligonucleotídica. Estes locais de restrição podem facilitar a inserção das cassetes de ácido nucleico (isto é, produtos da reação PCR) num vetor de expressão tendo uma sequência de anticorpo adicional. Numa forma de realização, os locais de restrição são desenhados para facilitar a clonagem das cassetes de ácido nucleico sem introduzir sequências de ácido nucleico estranhas ou remover sequências de ácido nucleico de CDR ou estrutural originais.
As cassetes de ácido nucleico podem ser clonadas em qualquer vetor adequado para expressão de uma fração ou da totalidade da sequência da cadeia leve ou pesada contendo as substituições de aminoácidos alvo geradas por via da reação de PCR. De acordo com métodos detalhados na invenção, a cassete de ácido nucleico é clonada num vetor que permite a produção de uma fração ou da totalidade da sequência da cadeia leve ou pesada fundida com a totalidade ou uma fração de uma proteína de revestimento virai (isto é, criando uma proteína de fusão) e exibida na superfície de uma partícula ou de uma célula. Embora estejam disponíveis e possam ser utilizados na prática da presente invenção vários tipos de vetores, os vetores de fagemídeo são os vetores preferidos para utilização no presente documento, dado que podem ser construídos com relativa facilidade, e podem ser prontamente amplificados. Os vetores de fagemídeo contêm geralmente uma variedade de componentes incluindo promotores, sequências de sinal, genes de seleção fenotípica, locais de origem de replicação, e outros componentes necessários conforme são conhecidos para os peritos na especialidade.
Quando uma combinação de aminoácidos variante particular se destina a ser expressa, a cassete de ácido nucleico contém uma sequência que é capaz de codificar a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou leve, e é capaz de codificar as combinações de aminoácidos variantes. Para a produção de anticorpos contendo estes aminoácidos variantes ou combinações de aminoácidos variantes, como numa biblioteca, as cassetes de ácido nucleico podem ser inseridas num vetor de expressão contendo uma sequência de anticorpo adicional, por exemplo a totalidade ou porções dos domínios variáveis ou constantes das regiões variáveis da cadeia leve e pesada. Estas sequências de anticorpo adicionais podem também ser fundidas a outras sequências de ácidos nucleicos, tais como sequências que codificam proteínas de revestimento virai e como tal permitem a produção de uma proteína de fusão. É descrita no presente documento humanização de anticorpo de ratinho anti-STEAP-1 humana.
Materiais e Métodos
Os números dos resíduos estão de acordo com Kabat (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) . São utilizadas abreviaturas dos aminoácidos de letra única. As degenerescências do ADN estão representadas utilizando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
Clonagem de domínios variáveis 120 de ratinho e geração de um anticorpo 120 quimérico - Foi extraído ARN total a partir de células de hibridoma produtoras de M2-120.545 (designado como "120 de ratinho" ou "mul20" no presente documento) utilizando métodos padrão. Os domínios variável leve (VL) e variável pesado (VH) foram amplificados utilizando RT-PCR com iniciadores degenerados nas cadeias pesadas e leves. Os iniciadores diretos foram específicos para a sequência de aminoácidos N-terminal das regiões VL e VH. Respetivamente, os iniciadores reversos LC e HC foram desenhados para hibridizar com uma região no domínio constante leve (CL) e no domínio constante pesado 1 (CHI), que são altamente conservados entre as espécies. Os VL e VH amplificados foram clonados em vetores de expressão de mamífero. A sequência polinucleotídica das inserções foi determinada utilizando métodos de sequenciação de rotina. As sequências de aminoácidos de VL e VH de M2-120.545 ("mu 120") estão mostradas nas Figuras 2A e 2B, respetivamente.
Geração de quimera 120 de ratinho - Foi preparado um anticorpo anti-STEAP-1 quimérico por fusão das regiões variável pesada (VH) e variável leve (VL) de 120 de ratinho com os domínios constantes de uma IgG humana. 0 anticorpo resultante é designado aqui "quimera 120," "120 quimera", "IgG 120 quimérica", ou "Fc quimera".
Enxertos diretos da região hipervariável na estrutura de consenso humano aceitadora - Foram avaliadas variantes construídas durante a humanização de 120 de ratinho tanto como proteína na forma de uma IgG ou como um Fab exibido sobre fagos. O fagemídeo utilizado para este trabalho é um vetor de exibição de Fab-g3 monovalente e consiste em dois quadros de leitura abertos sob o controlo do promotor phoA. 0 primeiro quadro de leitura aberto consiste na sequência de sinal stII fundida com os domínios VL e CHI da cadeia leve aceitadora e o segundo consiste na sequência de sinal stll fundida com os domínios VH e CHI da cadeia pesada aceitadora seguidos pela proteína de revestimento de fago menor P3.
Os domínios VL e VH de 12 0 de ratinho foram alinhados com as sequências de consenso capa I de VL humana (huKI) e do subgrupo III de VH humana (huIII) . Para preparar os enxertos de CDR, foram enxertadas regiões hipervariáveis do anticorpo 120 de ratinho nas estruturas aceitadores de huKI e hu111.
Foram manipuladas regiões hipervariáveis do anticorpo 120 de ratinho (mul20) na estrutura de consenso humano aceitadora para gerar o enxerto de CDR direto (designado como "enxerto 120" ou "120 enxerto" no presente documento). No domínio VL foram enxertadas as seguintes regiões no aceitador de consenso humano: posições 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) . No domínio VH, foram enxertadas as posições 26-35a (Hl), 49-65 (H2) e 95-102 (H3). As sequências das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do enxerto 120 são mostradas nas Figuras 2A-2B. As CDR (também designadas aqui como HVR) são mostradas em caixas (Figuras 2A-2B). Estas definições de CDR incluem as posições definidas pela hipervariabilidade da sua sequência (ref de Kabat), pela sua localização estrutural (ref de Chothia) e pelo seu envolvimento em contactos antigénio-anticorpo (MacCallum et al. J. Mol, Bíol. 262: 732-745 (1996)).
As variantes de enxerto direto expressas como Fab exibido sobre fagos ou como uma IgG foram geradas por mutagénese de Kunkel utilizando um oligonucleótido separado para cada região hipervariável. Os clones corretos foram determinados por sequenciação do ADN.
Geração de variantes de fago 120 humanizado - Foram geradas variantes 120 humanizadas na forma de Fab exibido sobre fagos por mutagénese de Kunkle. Foi adicionado um oligonucleótido fosforilado a 300 ng de molde de Kunkel em Tris 50 mM, pH 7,5, MgCl2 10 mM num volume final de 10 μ!. mistura foi hibridizada a 90°C durante 2 min, a 50°C durante 5 min e posteriormente arrefecida em gelo. 0 molde hibridizado foi então preenchido por adição de 0,5 μΐ de ATP lOmM, 0,5 μΐ de dNTPs lOmM (lOmM cada de dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , 1 μΐ de DTT lOOmM, 1 μΐ de tampão 10X TM (Tris 0,5 M, pH 7,5, MgCl2 0,1 M), 80 U de ligase T4, e 4 U de polimerase T7 num volume total de 2 0 μΐ durante 2 h à temperatura ambiente. 0 produto preenchido e ligado foi posteriormente transformado em células XLl-blue (Stratagene). Os clones corretos foram identificados por sequenciação de ADN.
Os clones de fagos corretos foram cultivados em 25 ml de 2YT contendo carbenacilina 50 pg/rnl e fago auxiliar M13/K07 (MOI 10) durante a noite a 37°C.
Avaliação de variantes de 120 humanizado - Foram avaliadas variantes humanizadas expressas como IgG por análise FACS utilizando linhas celulares positivas (293 Steapl NT LB50) e negativas (293 vetor S408) para Steapl.
Foram também avaliadas variantes humanizadas expressas como um Fab exibido sobre fagos por análise FACS. Os fagos que expressam variantes de Fab foram primeiro avaliados para o seu nível de exibição de Fab utilizando um ELISA de fagos utilizado para detetar um marcador FLAG fundido com a cadeia leve do Fab. Foram revestidas placas de microtitulo MaxiSorp com anti-gD 1766 a 10 pg/ml em PBS durante a noite e posteriormente bloqueadas com bloqueador de Caseína. Os fagos dos sobrenadantes da cultura foram diluídos em série em PBST contendo BSA 0,5Ê numa placa de microti tulo de cultura de tecidos e foram transferidos para os poços revestidos durante 1 h para capturar o fago de exibição de Fab. A placa foi lavada com PBST e foi adicionado anti-M13 conjugado com HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 em PBST contendo BS A0,5Ê) durante 40 min. A placa foi lavada com PBST e desenvolvida por adição de substrato de Tetrametilbenzidina (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) . Foi utilizada a absorvãncia a 405 nm como uma estimativa do nível de exibição de Fab na superfície dos fagos. As preparações de fagos foram normalizadas para exibição por diluição. Foram utilizados fagos de baixa exibição (por exemplo a quimera) sem purificação para a análise FACS.
Para a análise FACS de ligação de fagos, as células foram removidas a partir da placa utilizando EDTA 2 mM, recolhidas num tubo de fundo cónico de 15 ml e sedimentadas por centrifugação. As células (5 X 10^ células por amostra) foram ressuspensas em 100 μΐ de fagos (normalizados por nível de exibição) em tampão de FACS (FBS 1Ê, PBS com EDTA 2 mM) e incubadas durante 1-2 horas em gelo. As amostras foram lavadas duas vezes com tampão FACS por centrifugação. Foi adicionado anticorpo anti-M13 5G7 de controlo (Genentech, Inc. South San Francisco, CA) a 2 pg/ml e incubado em gelo durante pelo menos 45 minutos. As amostras foram lavadas duas vezes com tampão FACS por centrifugação. Foi adicionada uma diluição de 1:200 de PE anti ratinho (Fragmento Fcy de cabra anti-IgG de ratinho com R-ficoeritrina, Jackson Immunoresearch) e incubado em gelo durante 30 minutos. As amostras foram novamente lavadas duas vezes com tampão FACS por centrifugação e analisadas por FACS.
Para análise de IgG por FACS, foram preparadas células conforme em FACS de fagos. Cada IgG foi adicionada a 5 pg/ml em gelo durante 1 hora. As amostras foram lavadas duas vezes com tampão de FACS por centrifugação e adicionou-se uma diluição de 1:200 de conjugado de PE anti-humano (Fragmento Fcy anti-IgG humana de cabra com R-ficoeritrina, Jackson Immunoresearch) durante 30 minutos. As amostras foram novamente lavadas duas vezes com tampão de FACS por centrifugação e as amostras foram analisadas por FACS.
Produção de IgG e Determinação da Afinidade - Foi purificada IgG por cromatografia de afinidade com Proteína G. realizadas determinações da afinidade foram por análise Scatchard em células 293 STEAP-1 NT LB50.
Resultados e Discussão
Desenho de enxerto de atribuição de CDR e sequências do domínio variável de 120 de ratinho - A estrutura aceitadora humana utilizada para a humanização de M2-120.545 é baseada no domínio de consenso de VL capa I humano e no domínio de consenso de VH do subgrupo III humano. Os domínios VL e VH de M2-120.545 de ratinho foram cada um alinhados com os domínios humanos capa I e subgrupo III; cada região de complementaridade (CDR) foi identificada e enxertada na estrutura aceitadora humana para gerar um enxerto de CDR que podia ser exibido na forma de um Fab em fagos e expresso na forma de uma IgG. As sequências de regiões variáveis de anticorpo humanizado anti-STEAP-1 versão 24 são mostradas nas Figuras 2A e 2B. 0 Fab de enxerto 120 exibido em fagos e a IgG de enxerto 120 foram testados para a ligação a células que expressam STEAP-1 exógena (293 STEAP-1 NT LB50) por análise FACS. Embora a IgG de enxerto 120 ligasse especificamente às células que expressam STEAP-1, o sinal de FACS observado para a IgG de enxerto 120 foi inferior ao observado para a IgG 120 quimérica indicando uma perda de afinidade de ligação. A exibição em fagos do Fab de enxerto 120 também gerou um sinal de FACS que somente foi observado em células que expressam STEAP-1.
Este desvio foi inferior ao observado para a IgG 120 quimérica. A análise Scatchard da IgG de enxerto 120 também indicou uma perda significativa (aproximadamente 50 vezes) da afinidade de ligação (KD = 3 6 nM para o 12 0v,78; KD = 260 nM para o enxerto 120).
Humanização de M2-120.545 - Foram identificadas aproximadamente 30 posições de vernier que influenciam a conformação das CDR e o empacotamento do domínio VL:VH e deverão ser consideradas as alterações nestas posições entre as estruturas dadora e humana aquando da humanização de anticorpos (Foote, J. e Winter, G., J. Mol. Biol, 224(2) :487-499 (1992)) . Uma avaliação do alinhamento de M2-120.545 de ratinho com o domínio VL capa I humano de consenso e o domínio VH do subgrupo III humano de consenso revelou diferenças de sequência em 6 posições de vernier chave no domínio VH: 24, 37, 48, 67, 73, 78 (veja-se a Figura 2B) . Para avaliar a influência destas posições, foram individualmente introduzidos resíduos de ratinho no domínio VH do subgrupo III humano de consenso do Fab sobre o fago. Isto envolveu efetuar as seguintes mutações no Fab de enxerto 120 exibido no fago individualmente: A24V (120.v24), V37I (120.v37), V48M (120.v48), F67I (120.v67), e L7 8F (120.v78) . N73T não foi testada. Cada variante de fago foi normalizada por diluição até um nível de exibição de Fab equivalente determinado pela titulação de um marcador epitópico fundido à cadeia leve exibida no fago e posteriormente avaliada para a ligação a STEAP-1 por análise FACS em células que expressam STEAP-1 (293 STEAP-1 NT LB50) e células que não a expressam (293 vetor S408). 0 termo "2o" refere-se ao anticorpo secundário na análise FACS. 0 termo "a-120" refere-se ao anticorpo anti-STEAP-1 120 de ratinho. 0 termo "a-10Hl" refere-se a um anticorpo de controlo. Os termos "Fago 24" e "fago 37" referem-se a variantes anti-STEAP-1 humanizadas conforme divulgado no presente documento exibidas em fagos. "fago Ch 120" refere- se à quimera 120 exibida num fago, e "fago enxerto 120" refere-se ao enxerto 120 exibido num fago (Figura 6) . A importância da normalização de clones de fagos pelo seu nível de exibição de Fab é ilustrada por uma análise FACS do enxerto 120 e diferentes títulos de fago: 7x10^2 fagos/ml na Figura 6 e 2 x 1011 fagos/ml na Figura 6. Após diluição para a menor concentração de fagos, o fago de enxerto 120 já não produziu um desvio de FACS observável. Consequentemente, a normalização dos diferentes clones de fagos para o seu nível de exibição foi uma etapa importante para a avaliação das suas diferenças de afinidade para Steapl.
Após a normalização para os níveis de exibição de Fab, a variante do enxerto 120 contendo a mutação adicional A24V (120.v24) produziu um desvio em FACS superior às outras variantes (Figura 6) . Quando expresso como uma IgG, o 120.v24 produziu um desvio em FACS semelhante ao do anticorpo 120 quimérico em todas as concentrações testadas. A subsequente análise Scatchard de 120.v24 indicou uma Kd de 2,2 nM para a ligação a células 293 STEAP-1 NT LB50, uma melhoria de duas vezes em relação à quimera 120 e ao M2-120.545 de ratinho original (Quadro 2).
Quadro 2: Afinidade de ligação de anticorpo anti-STEAP-1 para STEAP-1 da superfície celular (Kd (nM))
A atividade de ligação de anticorpos anti-STEAP-1 nus, de 120 de ratinho e quimera 120 foi também testada utilizando análise FACS. A ligação foi comparada para STEAP-l exógena em células 293 STEAP-1 NT LB50 estáveis, PC3 estáveis STEAP-l PS5.4, e STEAP-1 endógena em células LNCaP. Os resultados são também mostrados nas Figs. 7D-7F. Foram preparadas células NT LB50 que expressam STEAP-1 humana exógena na superfície celular por transformação estável de células 293 (ATCC CRL-1573) com ADN de STEAP-1 humana. Foram preparadas células PS5.4 que expressam STEAP-1 humana exógena na superfície celular por transformação estável de PC3 (ATCC CLL-1435) com ADN de STEAP-1 humana. Células LNCaP (ATCC CRL-1740) expressam STEAP-1 endogenamente.
Exemplo 2: Caracterização de anticorpos anti-STEAP-1
Os anticorpos anti-STEAP-1 (anticorpos nus e conjugados de anticorpo e fãrmaco divulgados no presente documento) foram caracterizados ou podem ser caracterizados de acordo com métodos padrão.
Ensaios à base de ELISA: 0 rastreio de anticorpo anti-STEAP-1 por ELISA é realizado conforme segue, com todas as incubações efetuadas à temperatura ambiente. Foram revestidas placas de teste (Nunc Immunoplate) durante 2 horas com STEAP-1 purificada em tampão de carbonato de sódio 50 mM, pH 9,6, posteriormente foram bloqueadas com albumina sérica bovina a 0,5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 30 minutos, posteriormente lavadas quatro vezes com PBS contendo Tween 20 (PBST) Q,05Ê. Foram adicionados sobrenadantes do anticorpo de teste e incubados duas horas com agitação, posteriormente lavados quatro vezes com PBST. As placas foram desenvolvidas por adição de 100 μΐ/poço de uma solução contendo 10 mg de dicloridrato de o-fenilenodiamina (Sigma, n.° P8287) e 10 μΐ de uma solução de peróxido de hidrogénio a 30Ê em 25 ml de tampão de fosfato e citrato, pH 5,0, e incubadas durante 15 minutos. A reação é parada por adição de 100 μΐ/poço de ácido sulfúrico 2,5 M. Os resultados são obtidos por leitura das placas num leitor de placas de ELISA automático a uma absorvância de 490 nm.
Caracterização da ligação anti-STEAP-1 por análise Scatchard: A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchard descrita em Munson et al. , Anal. Biochem., 107:220 (1980) utilizando técnicas padrão bem conhecidas na técnica relevante. Veja-se também Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660 (1947).
Exemplo 3: Produção de Conjugados de anticorpo anti-STEAP-1 e fármaco
Produção de ADC anti-STEAP-1 com auristatina - Foram produzidos ADC anti-STEAP-1 por conjugação de anticorpos anti-STEAP-1 120.545 de ratinho, quimera 120, enxerto 120 e variantes estruturais de 120 humanizado com as seguintes frações de fármaco-ligante: spp-DMl, smcc-DMl, MC-vc-PAB-MMAE; MC-vc-PAB-MMAF; MC-MMAE, MC-MMAF, vc-MMAE e vc-MMAF, em que as frações fármaco-ligante e de e os métodos de união são divulgados no presente documento bem como no documento WO 2004/010957, publicado a 5 de Fevereiro de 2004, documento W02006/034488, publicado a 9 de Setembro de 2005, e em Doronina, S.O. et al., Nature Biotechnol. 21:778-784 (2003). Antes da conjugação, os anticorpos foram parcialmente reduzidos com TCEP utilizando métodos padrão de acordo com a metodologia descrita no documento WO 2004/010957. Os anticorpos parcialmente reduzidos foram conjugados com as frações de fármaco-ligante acima utilizando métodos padrão de acordo com a metodologia descrita em Doronina et ai. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784 e o documento US 2005/0238649 AI. Brevemente, os anticorpos parcialmente reduzidos foram combinados com as frações de fármaco-ligante para permitir a conjugação das frações a resíduos de cisterna. As reações de conjugação foram extintas, e os ADC foram purificados. A carga de fãrmaco (número médio de frações de fármaco por anticorpo) para cada ADC foi determinada por HPLC. Conforme utilizado no presente documento, o componente ligante-fãrmaco de um ADC, "-MC-vc-PAB-MMAE" ou "-MC-vc-PAB-MMAF" é por vezes abreviada para ,!-vcMMAE'! ou "-vcMMAF", e a componente "-MC-MMAF" é por vezes abreviada para "MCMMAF" ou "mcMMAF."
Produção de ADC anti-STEAP-1 com maitansinoide - Foram produzidos ADC anti-STEAP-1 por conjugação de anticorpos anti-STEAP-1, 120 de ratinho, quimera 120, enxerto 120 e variantes estruturais de 120 humanizado, com a fração de fármaco-ligante -smcc-DMl. Esta conjugação pode ser realizada de acordo com o método divulgado no documento WO 2005/037992 para a conjugação de anticorpo anti-HER2 Herceptin®.
Exemplo 4: Ensaio de Redução do Volume Tumoral In Vivo
Para testar a eficácia de anticorpos monoclonais anti-STEAP-1 conjugados com toxina ou não conjugados para à capacidade de reduzir o volume tumoral in vivo e in vitro, foi empregue o seguinte protocolo.
Linhas de células de mamífero e xenoenxertos tumorais humanos: 293 é uma linha de células de rim embrionário humano imortalizadas (referência ATCC: CRL1573), PC-3 é uma linha celular de adenocarcinoma da próstata humano (referência ATCC: CRL1435) e LNCaP é uma linha celular de carcinoma da prostata (ATCC CRL1740). Todas as células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco com elevado teor de glucose e F12 de Ham 50/50 suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 10Ê, glutamina 2mM, penicilina-estreptomicina a 1Ê e cultivadas a 37°C em C02 a 5Ê. As linhas celulares 293 e PC-3 estáveis foram geradas por transfeção (Fugene, Roche) com um vetor dirigido por citomegalovírus que codifica ou STEAP1 de comprimento completo (LB50 e PS5.4, respetivamente) ou um vetor vazio, e foram selecionadas em G418 a 400 pg/rnl (Geneticin, Life Technologies). Foram obtidos modelos de explante da próstata humana, LuCAP77 e LuCAP35V, da University of Seattle . A expressão exógena e endógena de STEAP-1 na superfície celular foi demonstrada por imunohistoquímica (IHC) e análise FACS conforme segue. Foram gerados anticorpos anti-STEAP-1 de ovelha e de ratinho (Agensys, Inc., Santa Monica, CA) contra um péptido amino-terminal intracelular de STEAP-1 (veja-se Hubert, R.S., Vivanco, I. et al., PNAS 25:14523-14528 (1999)). Foram gerados anticorpos monoclonais contra os domínios extracelulares de STEAP-1 (Agensys, Inc.) por imunização de ratinhos com células 293T transitoriamente transfetadas com STEAP-1. Para a análise IHC, foi utilizado o anticorpo anti-STEAP-1 de ovelha primário para deteção. Para a análise FACS, as células foram cultivadas até 90Ê da confluência e removidas das placas utilizando EDTA 2 mM em PBS. As células foram lavadas e ressuspensas em tampão FACS (PBS com BSA a 1Ê) e incubadas durante 60 minutos com anticorpos anti-STEAPl à temperatura ambiente seguido por 60 minutos com o anticorpo secundário adequado conjugado com ficoeritrina. A análise foi realizada num FACSscan (BD Biosciences). Para a imunofluorescência, as células foram cultivadas em lâminas da câmara durante a noite e posteriormente incubadas com anticorpo primário a 37°C durante 60 minutos. As células foram fixadas em paraformaldeído, bloqueadas em BSA a 1Ê e incubadas com o anticorpo secundário adequado conjugado com fluoresceína.
Foram utilizados modelos de xenoenxerto de cancro da próstata in vivo para testar a eficácia dos ADC anti-STEAP-1. Estes modelos incluíram a linha celular LNCaP humana (ATCC CRL-1740 ou Southern Research Institute, Birmingham, AL). Os modelos de explante da próstata incluíram LuCaP77 e LuCaP35V (University of Washington, Seattle, WA) . Cada modelo de explante de próstata foi mantido por transplantes em série em ratinhos SCID-bege machos castrados (modelo independente de androgénios, LuCAP 35V) ou não castrados (modelo dependente de androgénios, LuCAP 77) , da Charles River Lab. Os ratinhos não castrados receberam um sedimento de testosterona antes da implantação, enquanto foi realizada castração pelo menos duas semanas antes da implantação do tumor para permitir que os níveis de testosterona atingissem o ponto mais baixo. Quando os ratinhos dadores tinham tumores entre 800-1000 mm^, o tecido tumoral foi removido assepticamente e dissecado em pequenos pedaços de tamanho implantável (aproximadamente 20 mm^) n0s animais do estudo. 0 tumor é colocado numa bolsa no local do implante e a pele é fechada utilizando grampos cirúrgicos. Para o modelo da linha celular LNCaP, foram injetadas células LNCaP cultivadas in vitro subcutaneamente a 8-10 milhões de células por ratinho em matrigel a 50Ê em ratinhos SCID-bege machos que receberam um sedimento de testosterona. Quando a dimensão média do tumor atingiu 100-200 mm^, Qs animais foram agrupados aleatoriamente em dez grupos de dez ratinhos cada e foi-lhes dada uma administração IV única de ADC de anticorpo de teste ou anticorpo de controlo (nu ou controlo). Nalgumas experiências, foram administradas múltiplas doses de anticorpo de teste ou de controlo (vejam-se as Figuras 8A, 9, e 10) . Nalgumas experiências, foram administradas uma única dose de anticorpo teste e de controlo conforme observado nas Figuras 8B e 11. Quando o modelo de explante da próstata foi LuCap 77, foi implantado um sedimento de testosterona nos ratinhos aproximadamente 3-7 dias antes do transplante de tumor exógeno. Os tumores foram medidos duas vezes por semana durante 4 semanas, posteriormente uma ou duas vezes por semana durante o resto do estudo ou uma vez por semana ao longo do estudo. Um volume tumoral significativamente inferior nos animais de teste ao longo do tempo foi considerado como sendo uma indicação de eficácia. Nalguns casos, o volume tumoral diminuiu significativamente a partir do volume inicial e permaneceu baixo ao longo do estudo. Os resultados são representados graficamente nas Figuras 8-11.
Os conjugados de anti-STEAP-1 e fármaco de auristatina reduzem o volume do tumor da próstata in vivo A administração de anti-STEAP-1 de ratinho 120-MC-vc-PAB-MMAE a 3 mg/kg foi eficaz num modelo de xenoenxerto de tumor da próstata (células LNCaP-Ner). Foram utilizados PBS e anti-gpl20-MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg) como controlos. As doses foram administradas nos dias 0, 7 e 14. Veja-se a
Figura 8A. A administração de anticorpo anti-STEAP-1 humanizado 12Ov.24 -MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg), 12Ov.24-MC-MMAF (6 mg/kg), 120v.24-MC-MMAF (12 mg/kg) e quimera anti-STEAP-1 120-MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg) a ratinhos SCID bege transplantados com tumor LNCap-Ner (tratados com um sedimento de testosterona conforme descrito no presente documento) foi mostrada como sendo eficaz. Foram utilizados veículo, anti-ambrósia-MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg) e anti-ambrósia-MC-MMAF (12 mg/kg) como controlos. As doses foram administradas nos dias indicados na Figura 8. Os resultados estão representados graficamente na Figura 8B.
A administração de anticorpo anti-STEAP-1 quimera 120-MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg) e anti-STEAP-1 quimera 120-MC-MMAF (6 mg/kg) foi mostrada como sendo eficaz num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID-bege transplantados com células LNCaP. Foram administradas aos ratinhos três doses aproximadamente nos dias 15, 25 e 30 a 3 mg/kg (anti-STEAP-vcMMAE) ou 6 mg/kg (anti-STEAP-mcMMAF). Foram utilizados anti-ambrósia-MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg) e anti-ambrósia-MC-MMAF (6 mg/kg) de controlo. Veja-se a Figura 9. A administração de anticorpo anti-STEAP-1 humanizado quimera 120-MC-vc-PAB-MMAE (3 mg/kg) foi mostrada como sendo eficaz num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID bege machos (dependente de androgénios) transplantados com células LuCap 77. Os controlos foram veículo e anti-ambrósia-MC-vc-PAB-MMAE. Foram administradas três doses a 3 mg/kg de anticorpos de teste e de controlo. Veja-se a Figura 10. A administração de anticorpo anti-STEAP-1 humanizado 120v.24-MC-vc-PAB-MMAE a 3 mg/kg, anticorpo anti-STEAP-1 12Ov.24-MC-MMAF a 6 mg/kg e 12 mg/kg a ratinhos castrados SCID-bege transplantados com tumor da próstata LuCap35V foi mostrada com sendo eficaz relativamente aos controlos. A carga de fármaco foi de 3,1 por anticorpo. Os anticorpos de controlo foram anti-ambrósia-MC-MMAF administrado a 12 mg/kg, e anti-gp 120-MC-vc-PAB-MMAE administrado a 6 mg/kg. Veja-se a Figura 11.
Os conjugados de anti-STEAP-1 e fármaco de auristatina reduzem o volume do tumor da próstata in vitro
Foram realizados ensaios de morte celular in vitro para avaliar a eficácia de conjugados anti-STEAP-1 com fármaco para inibir o crescimento e/ou matar células que expressam STEAP-l. Brevemente, células que expressam STEAP-1 foram colocadas em placas a aproximadamente 2000 células/poço numa placa de 96 poços e tratadas 24 horas mais tarde por duplicado com conjugado de fármaco e anticorpo. As placas foram incubadas durante 5-7 dias a 37°C e desenvolvidas com 0 kit de ensaio de viabilidade celular luminescence CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI, EUA) . As células de teste incluíram células PS5.4 (células PC3 que expressam STEAP-1 exógena), células LB50 (células 293 que expressam STEAP-1 exógena), células PC3 transfetadas com vetor por si só, células 293 transfetadas com vetor por si só e células LNCaP que expressam STEAP-1 endógena. Os conjugados de anticorpo e fármaco testados incluíram anticorpo-MC-MMAF de controlo, anticorpo-vc-MMAE de controlo, anticorpo anti-STEAP-1 quimera 120-vc-MMAE, anticorpo anti-STEAP-1 quimera 120-MC-MMAF (dois lotes diferentes de material), e anticorpo anti-STEAP-1 quimera-vc-MMAF. Os resultados são mostrados na Figura 14A-E.
Exemplo 5: Preparação de Anticorpos Anti-STEAP-1 Manipulados com Cisteína para Conjugação por Redução e Reoxidação
São dissolvidos Anticorpos monoclonais anti-STEAP-1 de comprimento completo, manipulados com cisteína, (MabTio) expressos em células CHO, em borato de sódio 500 mM e cloreto de sódio 500 mM a cerca de pH 8,0 e reduzidos com um excesso de cerca de 50-100 vezes de TCEP 1 mM (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (Getz et ai. (1999) Anal. Bíochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) durante cerca de 1-2 h a 37°C. 0 MabTio reduzido é diluído e carregado numa coluna HiTrap S em acetato de sódio 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio 0,3 M. 0 MabTio reduzido eluído é tratado com ácido desidroascórbico 2 mM (dhAA) a pH 7 durante 3 horas, ou sulfato de cobre aquoso 2 mM (CuS04) à temperatura ambiente durante a noite. A oxidação ao ar ambiente pode também ser eficaz. 0 tampão é permutado por eluição sobre resina Sephadex G25 e eluído com PBS com DTPA 1 mM. 0 valor de tiol/Ab é verificado por determinação da concentração de anticorpo reduzido a partir da absorvância a 280 nm da solução e a concentração de tiol por reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) e determinação da absorvancia a 412 nm.
Exemplo 6: Preparação de Conjugados de Anticorpo Anti-STEAP-1 Manipulado com Cisteína e Fármaco por Conjugação de Anticorpos Anti-STEAP-1 Manipulados com Cisteína e Intermediários Fármaco-Ligante
Após os procedimentos de redução e reoxidação do Exemplo 5, o anticorpo anti-STEAP manipulado com cisteína é dissolvido em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) e arrefecido em gelo. São dissolvidos cerca de 1,5 equivalentes molares relativamente a cisteínas manipuladas por anticorpo de um intermediário fármaco-ligante de auristatina, tal como MC-MMAE (maleimidocaproíImonometilauristatina E) , MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE ou MC-val-cit-PAB-MMAF, com um grupo funcional reativo com tiol tal como maleimido, em DMSO, diluídos com acetonitrilo e água, e adicionados a anticorpo reduzido, reoxidado, arrefecido, em PBS. Após cerca de uma hora, é adicionado um excesso de maleimida para extinguir a reação e rematar quaisquer grupos tiol do anticorpo sem reagir. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o conjugado de fármaco e anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína é purificado e dessalinizado por eluição através de uma resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 pm sob condições estéreis, e congelado para armazenagem.
Através do procedimento acima, são preparados os seguintes conjugados de anticorpo ant.i-STEAP-1 manipulado com cisteína e fármaco (onde a numeração para as variantes é numeração normalizada de Kabat para a cadeia leve e numeração EU para a cadeia pesada), conforme proporcionado no presente documento e na Figura 17): tio humano 12 0-MC-MMAF por conjugação de tio hu 12 0 de cadeia leveV205C e MC-MMAF; tio humano 12 0-MC-MMAF por conjugação de tio hu 12 0 de cadeia pesadaAUSC e MC-MMAF; tio humano 120-MC-val-cit-PAB-MMAE por conjugação de tio hu 120 de cadeia leve V205C e MC-val-cit-PAB-MMAE; e tio humano 120-MC-val-cit-PAB-MMAE por conjugação de tio hu 120 de cadeia pesadaAUSC e MC-val-cit-PAB-MMAE. Exemplo 7: Caracterização de anticorpos anti-STEAP-1 manipulados com cisterna
Os conjugados de anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína e fármaco (TDC) preparados conforme descrito acima foram ensaiados para confirmar que retinham a atividade do anticorpo parental in vitro. Os TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (LCV205C) (abreviado como huSteapl TDC (L205C) vcE e tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA 11SC) (abreviado como huSteapl TDC (HCA118C) vcE) foram avaliados para a ligação a STEAP-1 por análise FACS em células que expressam (293 STEAP-1 NT LB50) e que não expressam (293 vetor S408) STEAP-1. A expressão "somente 2o" refere-se ao anticorpo secundário na análise FACS. 0 controlo de TDC (vcE) e o controlo ADC pad. (vcE) são conjugados de anticorpo de controlo tio e não-tio vc-PAB-MMAE e fármaco, respetivamente. 0 huSteapl ADC (pad.) é um conjugado de fármaco vc-PAB-MMAE derivado do anticorpo anti-STEAP-1 humano parental. Conforme mostrado, os TDC produziram desvios de FACS semelhantes ao do ADC huSteapl parental.
Foram também realizados ensaios de morte celular in vitro, para avaliar a eficácia dos conjugados de anticorpo anti-STEAP-1 manipulado com cisteína e fármaco para inibir o crescimento e/ou a morte de células que expressam STEAP-1. Resumidamente, células que expressam STEAP-1 foram colocadas em placas a aproximadamente 2000 células/poço numa placa de 96 poços e foram tratadas 24 horas mais tarde por duplicado com conjugado de fármaco e anticorpo. As placas foram incubadas durante 5-7 dias a 37°C e desenvolvidas com o kit de ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI, EUA). As células de teste incluíram PS5.4 (células PC3 que expressam STEAP-1 exógena), LB50 (células 293 que expressam STEAP-i exógena) e células LNCaP que expressam STEAP-1 endógena. Os conjugados de anticorpo e fármaco testados incluíram anticorpo-vc-MMAE de controlo (ADC pad. controlo (vcE)), tio anticorpo-vc-MMAE de controlo (TDC controlo (vcE)), os TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (LCV205C) (abreviado como huSteapl TDC (L205C) vcE e tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA1 18C) (abreviado como huSteapl TDC (HCA118C) vcE), e huSteapl ADC (pad.), um conjugado de fármaco vc-PAB-MMAE derivado do anticorpo anti-STEAP-1 humano parental. Conforme mostrado nas Figuras 19A-C, os TCD anti-STEAP-1 retêm a atividade do ADC parental in vitro.
Exemplo 8: Ensaios de Redução do Volume Tumoral In Vivo para Conjugados de Anticorpo Anti-STEAP-1 Manipulado com Cisterna e Fármaco
Foram utilizados modelos de xenoenxerto de cancro da próstata in vivo para testar a eficácia de ADC anti-STEAP-1 manipulados com cisterna. Estes modelos e os protocolos de teste empregues correspondiam aos descritos no Exemplo 4. A administração do TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA118C) (abreviado como huSteapl HC TDC vcE) (3 mg/kg) a ratinhos SCID bege transplantados com tumor LNCap-Ner (tratados com um sedimento de testosterona conforme descrito no presente documento) foi mostrada como sendo eficaz. Foram utilizados veículo (PBS), anticorpo-vc-MMAE de controlo (ADC pad. Ctrl vcE) e tio anticorpo-vc-MMAE de controlo (TDC HC Ctrl vcE) como controlos. 0 efeito do TDC anti-STEAP-1 foi também comparado com o de anticorpo anti-STEAP-1 humano 120-MC-vc-PAB-MMAE (hu Steapl pad. ADC vcE) como controlo positivo. Foi administrada uma única dose no dia 0. Todos os anticorpos foram administrados a 3 mg/kg. Os resultados são representados graficamente na Figura 20. A Figura 21 mostra que a administração de TDC anti- STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA 118C) (abreviado como huSteapl HC TDC vcE) a 3 mg/kg e TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-MC-MMAF (HCA 118C) (abreviado como huSteapl HC TDC mcF) a 1, 3 ou 6 mg/kg foi mostrada como sendo eficaz num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID-bege transplantados com células LNCaP. Foram administradas aos ratinhos doses únicas no dia 0 a 0,3, 1 ou 3 mg/kg (huSteapl HC TDC vcE) ou 1, 3 ou 6 mg/kg (huSteapl HC TDC mcF). Foram utilizados como controlos veículo (PBS) , o anticorpo-vc-MMAE de controlo (ADC pad. Ctrl vcE) e tio anticorpo-vc-MMAE de controlo (TDC HC Ctrl vcE) . A Figura 22 mostra que a administração de TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-vc-PAB-MMAE (HCA118C) (abreviado como huSteapl HC TDC vcE) a 3 mg/kg e de TDC anti-STEAP-1 tio-humano 120-MC-MMAF (HCA1 18C) (abreviado como huSteapl HC TDC mcF) a 3 ou 6 mg/kg foi mostrada como sendo eficaz num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata de ratinhos SCID bege machos (dependente de androgénios) transplantados com células LuCap 35V. Foram administradas aos ratinhos doses únicas no dia 0 a 0, 3, 1 ou 3 mg/kg (huSteapl HC TDC vcE) ou 1, 3 ou 6 mg/kg (huSteap 1 HC TDC mcF) . Foram utilizados como controlos veículo (PBS), anticorpo-vc-MMAE de controlo (ADC pad. Ctrl vcE) e tio anticorpo-vc-MMAE de controlo (TDC HC Ctrl vcE) .
Exemplo 9: Preparação e Caracterização do Anticorpo Anti-STEAP-1 SGIV a Partir da Variante 24 do Anticorpo 120
Foi preparada outra variante de LC de anticorpo anti-STEAP-1 em que a cadeia leve e as regiões estruturais foram adicionalmente modificadas para obter níveis melhorados de expressão do anticorpo.
Materiais e Métodos
Os números dos resíduos estão de acordo com Kabat (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD (1991)) . São utilizadas abreviaturas de aminoãcidos de letra única. As degenerescências do ADN estão representadas utilizando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
Preparação de uma Variante de Cadeia Leve Revista: Foi gerada e caracterizada uma variante do anticorpo 120.v24, designada "Simmons IV" ou simplesmente "SGIV". A sequência de aminoãcidos da cadeia leve de SGIV é proporcionada em SEQ ID NO: 90. Esta sequência, alinhada com as regiões correspondentes do anticorpo mu 120 (SEQ ID MO: 89) e do anticorpo 120.v24 (SEQ ID NO: 91) é mostrada na Figura 23.
Avaliação da variante SGIV em comparação com a variante 120.v24 - Foram avaliados anticorpos SGIV e 12 0.v24, expressos na forma de IgG, por análise FACS utilizando as linhas celulares transformadas de forma estável positivas para Stepl, 293 Stepl NT LB48, 293 Stepl NT LB50 e 293 Steapl NT LB53, bem como em células LNCaP, que expressam STEAP-1 endógena (Figura 28) . As células foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1. Cada IgG foi adicionada a 5 pg/ml em gelo durante 1 hora. As amostras foram lavadas duas vezes com tampão FACS por centrifugação e foi adicionada uma diluição de 1:200 de conjugado de PE anti-humano (Fragmento Fcy anti-IgG humana de cabra com R-ficoeritrina, Jackson Immunoresearch) durante 30 minutos. As amostras foram novamente lavadas duas vezes com tampão de FACS por centrifugação e as amostras foram analisadas por FACS.
Determinação da Afinidade à Base de Scatchard da ligação de SGIV e 120. v24 a STEAP-1 - As afinidades de ligação dos anticorpos 120.v24 e Simmons IV ("SGIV") a STEAP-1 foram determinadas utilizando análise Scatchard de acordo com métodos padrão. A IgG foi purificada por cromatografia de afinidade em Proteína G. As determinações de afinidade foram realizadas por análise Scatchard em células PC-3- PS5.4, 293-LB50 e LNCaP-BR por duplicado. Os gráficos Scatchard de 120. v24 e SGIV em células LNCaP BR e em células 293.LB50 são mostrados nas Figuras 25 e 26, respetivamente. É mostrado um quadro que compara as afinidades de ligação médias para mu 1789, mu 120, quimera Fc, 120.v24 humanizado, tio-120.v24 e tio-SGIV em células PC-3-PS5.4, 293-LB50 e LNCaP-BR, bem como em células 293 que expressam transitoriamente STEAP-1, na Figura 27.
Mutagénese Dirigida ao Local de SGIV e 120.v24: Foram preparadas variantes dos anticorpos SGIV e 120.v24 utilizando protocolos padrão de mutagénese conforme descrito acima. A primeira classe de variantes resultou de mutagénese dirigida ao local em que resíduos particulares de Simmons IV ("SGIV") foram substituídos pelos resíduos correspondentes de 120.v24 para melhorar adicionalmente a afinidade de ligação. As variantes específicas produzidas, conforme mostrado na Figura 24, foram conforme segue: (1) LS.VLVHl, em que os resíduos 42 Í"Q!!) e 43 ("P") foram modificados para "K" e "A" respetivamente (SEQ ID NO: 92) (2) LS.VLVH2, em que o resíduo 3 ("V") foi modificado para "Q", os resíduos 4 2 ("Q") e 4 3 ("P") foram modificados para "K" e "A" respetivamente, e o resíduo 85 (!!V") foi modificado para "T" (SEQ ID NO: 93) (3) LS.Q, em que o resíduo 3 ("V") foi modificado para !!Q" (SEQ ID NO: 94) (4) LS.CH 1, em que o resíduo 15 ("L") foi modificado para "V" e o resíduo 83 ("V") foi modificado para "F'! (SEQ ID NO: 95)
Foi gerada uma segunda classe de variantes através de mutagénese dirigida ao local em que resíduos particulares de 120.v24 foram substituídos pelos resíduos correspondentes de Simmons IV (SGIV) numa tentativa de melhorar os níveis de expressão do anticorpo. As variantes específicas, conforme mostrado na Figura 24, foram conforme segue: (1) ED.FWl, em que o resíduo 3 (i!Q") foi modificado para "V"; o resíduo 9 ("S") foi modificado para "D"; o resíduo 12 ("S") foi modificado para "A"; o resíduo 13 ("A") foi modificado para "V'!; o resíduo 15 ("V") foi modificado para "L"; o resíduo 17 (i!D") foi modificado para "E!!; o resíduo 19 ("V") foi modificado para "A!!; e o resíduo 22 ("T'!) foi modificado para l!N" (SEQ ID NO: 96) (2) ED. FW2, em que os resíduos 42 ("K") e 43 Í"A!!) de 120.v24 foram modificados para "Q" e "P!!, respetivamente (SEQ ID NO: 97) (3) ED. FW3, em que o resíduo 60 ("S") foi modificado para "D"; o resíduo 80 ("P") foi modificado para "A"; o resíduo 83 ("F") foi modificado para "V"; e o resíduo 85 ("T") foi modificado para "V'! (SEQ ID NO: 98) (4) ED. all, em que em que o resíduo 3 ("Q") foi modificado para "V"; o resíduo 9 ("S") foi modificado para "D"; o resíduo 12 ("S") foi modificado para "A"; o resíduo 13 ("Ai!) foi modificado para "V"; o resíduo 15 ("V") foi modificado para i!L"; o resíduo 17 ("D") foi modificado para "E"; o resíduo 19 ("V") foi modificado para "A"; o resíduo 22 (i!T") foi modificado para "N!!; os resíduos 42 ("K") e 43 ("A") de 120.v24 foram modificados para "Q" e "P"; o resíduo 60 ("S") foi modificado para "D"; o resíduo 80 ("P") foi modificado para i!A"; o resíduo 83 ("F") foi modificado para "V"; e o resíduo 85 ("T") foi modificado para !,V" (SEQ ID NO: 99) (5) ED.Pro, em que o resíduo 43 ("A") foi modificado para
"P" e o resíduo 80 ("P") foi modificado para "A" (SEQ ID NO: 100) (6) ED.pl, em que o resíduo 9 (!!S") foi modificado para "D"; o resíduo 42 ("K") foi modificado para "Q!! e o resíduo 60 ("S") foi modificado para "D” (SEQ ID NO: 101)
Resultados e Discussão
Preparação de Anticorpo SGIV - As sequências da região variável de anticorpo anti-STEAP-1 versão 24 (120.v24) são mostradas nas Figuras 23 e 24 (SEQ ID NO: 91) . Utilizando mutagénese dirigida ao local, foi preparada outra variante denominada "Simmons IV" ou simplesmente "SGIV" utilizando protocolos padrão de mutagénese conforme descrito acima. As Figuras 23 e 24 mostram a sequência da cadeia leve de SGIV em alinhamento com a do anticorpo mu 120 e 120. v24. Os títulos de várias colheitas de anticorpo SGIV são mostrados na Figura 29.
Comparação da ligação de SGIV e 120.v24 a STEAP-l utilizando FACs - A capacidade de ambos os anticorpos, 120.v24 e SGIV, de ligarem a STEAP-l expressa na superfície celular foi medida utilizando FACs. A ligação de anticorpo a linhas celulares que expressam STEAP-l exógena (293 STEAP-l LB4 8, 293 STEAP-l LB50 e 293 STEAP-l LB53) OU STEAP-l endógena (LNCaP.Br) foi medida por duplicado; os resultados são resumidos na Figura Conforme mostrado na Figura 28, ambos os anticorpos foram capazes de ligar a STEAP-l nas quatro linhas celulares.
Afinidade de ligação do anticorpo SGIV a STEAP-l e comparação com 120.v24 - As afinidades de ligação de SGIV e 120.v24 a STEAP-l foram examinadas utilizando análise de Scatchard. Os gráficos de Scatchard de 120.v24 e SGIV em células LNCaP BR e células 293.LB 50 são mostrados nas
Figuras 25 e 26, respetivamente. É mostrado um quadro que compara as afinidades de ligação médias para os anticorpos mu 1789, mu 120, quimera Fc, 120.v24 humanizado, tio-120.v24 e tio-SGIV em células PC-3-PS5.4, 293-LB50 e LNCaP-BR, bem como em células 293 que expressam transitoriamente STEAP-l, na Figura 27. Os resultados indicam que a afinidade de ligação do anticorpo 120.v24 em células 293-LB50 e LNCaP.BR é cerca de 1,5 vezes a da variante SGIV. LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Genentech, Inc.
<12G> Anticorpos e Imunoconjugados e Suas Utilizações <130> SMK/FP6826895 <140> EP <141> 26-10-2007 <150> EP 07863572,9 <151> 26-10-2007 <150> PCT/US2007/082726 <151> 26-10-2007 <150> US 60/863,295 <151> 27-10-2007 <150> US 60/868,707 <151> 05-12-2006 <150> US 60/921,300 <151> 30-03-2007 <150> US 60/937,857 <151> 29-06-2007 <160> 137 <170> Patentln 3.3
<210> 1 <211> 340 <212> PRT <213> Homo sapiens <4QG> 1
Met Glu Ser Arg Lys Asp lie Thr Asn Gin Glu Glu Leu Trp Lys Met 1 5 10 15
Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr 20 25 30
Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gin 35 40 45
Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gin His Thr 50 55 60
Gin Glu Leu Phe Pro Gin Trp His Leu Pro lie Lys lie Ala Ala lie 65 70 75 80 lie Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val lie His 85 90 95
Pro Leu Ala Thr Ser His Gin Gin Tyr Phe Tyr Lys lie Pro lie Leu 100 105 110
Val lie Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser lie Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125
Vai Tyr Leu Pro Gly Vai lie Ala Ala lie Val Gin Leu His Asn Gly 130 135 140
Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160
Arg Lys Gin Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 lie Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190
Leu Asn Trp Ala Tyr Gin Gin Val Gin Gin Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 lie Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu lie Tyr Val Ser Leu Gly lie 210 215 220
Val Gly Leu Ala lie Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser lie Pro Ser 225 230 235 240
Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr lie Gin Ser Lys 245 250 255
Leu Gly lie Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr lie His Ala Leu lie Phe 260 265 270
Ala Trp Asn Lys Trp lie Asp lie Lys Gin Phe Val Trp Tyr Thr Pro 275 280 285
Pro Thr Phe Met lie Ala Val Phe Leu Pro lie Val Val Leu lie Phe 290 295 300
Lys Ser lie Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys lie Leu Lys lie 305 310 315 320
Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys lie Asn Lys Thr Glu lie Cys 325 330 335
Ser Gin Leu Asn 340
<210> 2 <211> 340 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2
Met Glu He Ser Asp Asp Val Thr Asn Pro Glu Gin leu Trp Lys Met 15 10 15 lys Pro Lya Gly Asn Leu Glu Asp Asp Sar Tyr Sar Thr Lys Asp Sar 20 25 30
Gly Glu Thr Ser Met leu lys Arg Pro Gly leu Ser His leu Gin His 35 40 45
Ala Val His Val Asp Ala Pha Asp Cys Pro Ser Glu leu Gin His Thr 50 55 60
Gin Glu Pha Phe Pro Asn Trp Arg Lau Pro Val lys Val Ala Ala lie 65 70 75 * 80 lie Ser Ser leu Thr Phe leu Tyr Thr leu leu Arg Glu He He Tyr 85 90 95
Pro leu Val Thr Ser Arg Glu Gin Tyr Phe Tyr Lys He Pro He leu ICO 105 110
Val Ha Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ala He Thr leu Leu Ala leu 115 120 125
Val Tyr Leu Pro Gly Glu Leu Ala Ala Val Val Gin Leu Arg Asn Gly 130 135 140
Thr lys Tyr Lya Lys Phe Pro Pro Trp Leu Asp Arg Trp Met Leu Ala 145 150 155 " 160
Lys Lys Gin Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175
Val Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190
Leu Aan Trp Ala Tyr Lys Gin Val Gin Gin Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205
Val Glu His Asp Val Trp Arg Mat Glu He Tyr Val Ser Leu Gly lie 210 215 220
Val Gly Leu Ala lie Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser lie Pro Ser 225 230 235 240
Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr He Gin Ser Lys 245 250 255
Leu Gly He Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Val His Ala Leu Val Phe 260 265 270
Ala Trp Asn Lys Trp Val Asp Val Sar Gin Phe Val Trp Tyr Mat Pro 275 280 285
Pro Thr Phe Met He Ala Val Phe Leu Pro Thr Leu Val Leu He Cys 2 SO 295 300
Lys lie Ala Leu Cys Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys lie Leu Lys lie 305 310 ” 315 320
Arg Cys Gly Trp Glu Asp Val Ser Lys He Asn Arg Thr Glu Met Ala 325 330 335
Ser Arg Leu Asn 34 0
< 210 > 3 <211> 340 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 3
Met Glu Ser Arg Lys Asp lie Thr Aen Glu Glu Giu Leu Trp Lys Met 15 10 15
Lys Pro Arg Arg Αεη Leu Giu Glu Asp Αερ Tyr Leu His Lys Asp rhr 20 25 30
Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Vai Leu Leu His Leu Kie Gin 35 4!) 45 rhr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu leu Gin His Thr 50 55 60
Gin Glu Leu Ph* Pro Gla Trp His Leu Pr* lie Lys lie ALa Ala lie 65 70 75 30 lie Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Vai Ile His 85 90 95
Pro Leu Ala Thr Ser His Gin Gin Tyr Phe Tyr Lya lie Pro He Leu 100 105 110
Vai lie Asn Lys Vai Leu Pro Met Vai Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125
Vai Tyr Leu Pro Gly Vai Ile Ala Ala Ile Vai Gla leu His Asa Gly 130 135 140
Thr Lys Tyr Lys Lye Phe Pro Mis Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160
Arg Lys Gin Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Vai Leu Kie Ala 165 170 175 ll.e Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu ISO 185 " 190
Leu Asn Trp Ala Tyr Gla Gin Vai Gin Gin Asn Lys Glu Asp Ala Trp 135 200 205
He Glu His Asp Vai Trp Arg Met Glu Ile Tyr Vai Ser Leu Gly Ile 210 215 220
Vai Gly Leu Ala ile Leu Ala Leu Leu Ala Vai Thr Ser lie Pro Ser 225 230 235 240
Vai Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gin Ser Lys 245 250 255
Leu Gly Ile Vai Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe 260 265 270
Ala Trp Asn Lys Trp lie Asp lie Lys Gin Phe Vai Trp Tyr Thr Pro 275 280 285
Pro Thr Phe Met lie Ala Vai Phe Leu Pro Vai Vai Vai Leu Ile Phe 290 295 300
Lys Ser He Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile 305 310 315 320
Arg His Gly Trp Glu Asp lie Thr Lys lie Asn Lys Met Glu Ile Ser 325 330 335
Ser Gin Leu Asn 340 <210> 4 < 211> 108
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Leu Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105
< 210 > 5 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5
Asp He Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cye Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30
Ser Aan Gin Lya Aan Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lya Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
S5 70 75 SO lie Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 65 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lye Val Glu lie 100 105 110 lys Arg
<210> 6 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cya lya Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30
Ser Asm Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lya Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Ser Arq Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 ’ 70 75 80
He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Aan Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110
Lye Arg <210> 7 <211> 113
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 GIv. Val G1 ϊ; Ts.-:·i: Val Glu 3eGly G1 y Gly Lew Val Glu Pro GÍ y Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly leu Glu Trp Val 35 4 Q 45
Ser Val He Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 SO lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn. Ser Lys Asn Thr leu Tyr €5 70 75 90 leu Gin Met Asn Ser leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 ” 105 110
Ser
<210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 8
Asp Vai Gin Vai Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80
Leu Gin Leu Ile Ser Vai Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ala 115 120 124
<210> 9 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 9
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ele Thr Ser Asp 20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg 51n Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 " 45
Vai Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ele Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110
Tyr Tm Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 124
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp 20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45
Val Gly Tyr lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala
<210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13
Gin Gin Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr 1 5
<210> 14 < 211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 ’ 10
<210> 15 < 211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Gly Tyr lie Ser Ser Gly $er Thr $er Tyr Aen Pro Ser Leu Lye 1 5 10 15
Ser
<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4QG> 16
Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr IS 10 15
<210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17
Asp lie Gin Met Thr Gin Sen ::ro Sen Sen Lee Sen Ala Sen Va.l Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20
<210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys leu Leu lie Tyr 15 10 15
<210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19
Gly Val Pro Sen Arg Phe Sen Gly Sen Gly Sen Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15 <210> 20
Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30
< 211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 1 5 10
<210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 IQ 15
Ser leu Arg Leu Ser Cvs Ala Ala Ser 20 25
<210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Lev Glu Trp Val 15 10 <210> 23 < 211> 32
< 212 > PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 23
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lye Aen Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 2Q 25 30
<210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 24
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 <210> 25
< 211> 2 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser 20 25 < 210 > 2 6
< 211> 3 0 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2 6
Gin Val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 3 0 <210> 27
< 211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly
15 1C <210> 28
< 211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2 8
Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15 lie Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 29
< 211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 9
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 < 210 > 3 0
< 211> 2 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lye Lye Pro Gly Ala 1 5 10 ” 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25
<210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 31
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Lev Glu Trp Met 1 ' S 10 <210> 32
< 211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 32
Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu l" 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30 <210> 33
< 211> 3 0 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 33
Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser "hr Ala Tyr Met Glu 15 10 15 <210> 34
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
< 211> 3 0 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Gin Val Gin Leu Gin. Glu Sen Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Sen Gin 15 IQ 15
Thr leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Sen Gly Gly Ser Val Ser
20 25 3D <210> 35
< 211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35
Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly 1 5 10
<210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36
Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lye Asn Gin Pbe Ser Leu Lye 15 IQ 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
2G 25 3 D
<210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37
Gin. Val Gin Leu Gin Glu Ser G"y Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15
Thr leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25
<210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38
Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly lys Gly Leu Glu Trp lie 15 10
<210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys 15 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30
<210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40
Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys 15 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
< 210 > 41 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro GLy Gly 15 10 15
Ser leu Arg Leu Ser Cye Ala. Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 3 0 < 210 > 4 2
< 211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 15 10 <210> 43
< 211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lye Aen Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser lieu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 2Q 25 3D <21G> 44
< 211> 2 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4QG> 44
Glu V,'-: Í Gin Leu Val G"! I ! Gsr*" Gly Gly Gly Leu Val G' π Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
<210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10
<210> 46 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asm Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tvr Cys Ala 2 G 25 * 30
<210> 47 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 48 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys 20 25 30 <210> 49 < 211> 32
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lye Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
2 0 25 3D <210> 50 < 211> 31
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser lieu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 20 25 30 <210> 51 < 211> 32
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Set- Lye Aen Thr Ala Tyr Leu Gin 1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
2 Q 25 3D
<210> 52 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30
<210> 53 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 54 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <4QG> 54
Asp Tie Gin Met Thr Gin Sen Pro Sen Sen Lea Ser Ala Sen Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cya
2 Q
<210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys leu Leu lie ryr 15 10 15
<210> 56 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56
Gly Val Pro Ser Arg· Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe rhr 15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 3D <210> 57 <211> 10
<212> PRT <213> Homo sapiens <40G> 57
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 1 5 10 <210> 58
< 211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lye Ala Pro Lys Leu Leu lie 15 10
<210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59
Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr 15 10 15
<210> 60 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Plie rhr 15 10 15
Leu lys lie Ser Arg Val Slu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 3 0
<210> 61 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 62
< 211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 62
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie ryr 15 10 15 <210> 63
< 211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63
Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys 20 < 210 > 6 5
< 211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie ryr 15 10 15 <210> 66
< 211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66
Gly Val Pro Asp Arg Phe Sen Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe rhr 15 10 15
Leu Thr rle Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 3D <210> 67
< 211> 2 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 67
Asp He Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys 2 0 <210> 68
< 211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 6 8
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15
<210> 69 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69
Gly Val Pro Asp Aeq Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ttar Asp Phe Thr 1 " 5 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 70
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 1 5 10
<210> 71 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71
Asp Val Gin Val Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cye Thr Val Thr 20 25 <210> 72 <211> 13
<212> PRT <213> Mus muscuius <400> 72
Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met 15 10
<210> 73 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73
Arg lie Ser He Thr Arg .Asp Thr Ser Lye Aen Gin Phe Phe Leu Gin 15 10 15
Leu lie Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tvr Tyr Cys Ala Arg 2Q 25 " 30
<210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 74
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ala Ser Ala 15 10
<210> 75 <211> 13 <212> PRT <213> Home sapiens <400> 75
Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 10
<210> 76 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 6
Trp Val Arg Gin Ala Fro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 1 5 IQ
<210> 77 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77
Trp lie Arg Gin Ala Fro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 15 10
<210> 78 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78
Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Asm Ser Lys Aen Thr Lea Tyr Lea Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 ” 30
<210> 79 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <4QG> 79
Arg Phe Thr He Ser Arg Aep Asn Ser Lye Aen Thr Phe Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
2G 25 * 3D
<210> 80 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético < 4 0 0 > 80
Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Ser Gin Arg Leu Met Glu Asp 1 5 10 " 15 lie Cys Lew Pro Arg Trp Gly Cys leu Trp Glu Asp Asp Phe 20 25 3 0 <210> 81 < 211> 2 0
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético <400> 81
Gin Arg Leu Met Glu Asp lie Cys leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 15 10 15
Glu Asp Asp Phe 20
<21G> 82 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético <400> 82
Gin Arg He Gin Asp lie Cys Leu. Pro Arg Trp Gly Cys Leu 7rp 15 10 15
Gin. Asp Asp Phe 20
<210> 83 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético <400> 83
Arg Leu lie Glu Asp Lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 15 10 15
Asp Asp
<210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético <400> 84
Asp lie Cys Leu Pro Arg irp GLy Cys Leu Trp 1 S 10
<210> 85 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 15 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30
Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 35 40 45
Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 65 70 75 80
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125
Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 180 185 190
Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
<210> 86 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 15 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr 35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 65 70 75 80
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95
Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin 100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140
Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val 180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 87 <211> 168
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 15 10 15
Lye Pro Lye Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 “ 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Lys rrp 35 40 45
Tyr Val Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro 50 55 60
Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 65 70 75 80
Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 85 90 95
Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tvr 100 105 110
Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 115 120 125
Ser Lys Leu Thr Val Aap Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn lie Phe 130 135 140
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gin Lye 145 150 155 160
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 165
<210> 88 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 15 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp 35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60
Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu 115 120 125
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn 180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215
<210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Sec Gly The Ala Sec Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Fhe Asn Arg Gly Glu Cys 1G0 105
<210> 90 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Gye Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30
Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 " 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 €0
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ann Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110
Lys Arg
<210> 91 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <4QG> 91
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Sen Sen lieu Sen Ala Sen Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cya lya Ser Sen Gin Ser Leu Leu. Tyr Arg 20 25 30
Sen Agn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Pro Lya Leu Leu lie Tyr Itp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Ser Arq Phe Ser Gly Ser Glv Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr S5 ’ 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ehe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110
Lys Arg
<210> 92 <211> 109 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético <400> 92
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Sen Leu Ala Val Sen Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30
Ser Asn Gin Lye Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 BO lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 1G0 105
<210> 93 <211> 109 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético <400> 93
Asp Tie Gin Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30
Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 " 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 €0
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95 <210> 94
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys ICO 105 < 211> 109
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético <400> 94
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Aso Sen Leu Ala Val Sen Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Aan Cya Lya Ser Ser Gin Sar Leu Leu Tyr Arg 2U 25 30
Ser Aon Gin Lys Aen Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 €0
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys ICO 105
<210> 95 <211> 109 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético <400> 95
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Sen Leu Ala Val Sen Val Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30
Ser Asn Gin Lye Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala. Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Tie Ser Ser Leu Gin Ale Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 1G0 105
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Asp Tie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30
Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 " 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 €0
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys ICO 105 <210> 97 < 211> 109
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Aso Sen Leu Ser Ala Sen Val Gly 1 5 10 15
Gill Arg Ala Thr lie &amp;sn Cys Lys See Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 2U 25 30
Ser Aon Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 €0
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys ICO 105
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Asp lie Gin Met Thr Gin Sen Pro Asp Sen Leu Sen Ala Sen Val Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lya Ser Sen Gin Sen Leu Leu Tyr Arg 20 ’ ’ 25 30
Ser Aen Gin Lye Asn Tyr Leu Ala Trp Tyn Gin Gin Lye Pro Gly Lye 35 40 45
Ala Pro Lya Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 €0
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 BO
Tie Sen Sen Leu Gin Ale Glu Asp Val Ala Val Tyn Tyn Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 100 105
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Asp Tie Val Met Thr Gin Sen Pro Asp Sen Leu Ala Val Sen Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30
Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 " 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala. Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95 <210> 100
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys ICO 105 < 211> 109
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Asp Sen Leu Ser Ala Sen Val Gly 1 5 10 15
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Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Giu Ser Gly Val 50 55 €0
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys ICO 105
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Ser Aen Gin Lye Asn Tyr Leu Ala Trp Tyn Gin Gin Lye Pro Gly Gin 35 40 45
Ala Pro Lya Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 BO
Tie Sen Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 1G0 105
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< 210 > 106 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106
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Lev Tyr Leu T rr: Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Sen Sen Ala Sen 15 10 15
Thr lye Gly Pro Sen Val Phe Pro leu Ala Pro Sen Sen Lys Sen Thr 20 25 30
Sen Gly Gly Thr Ala Ala Leu 35
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Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 20 25 30
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 35 40
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 35 40 <210> 117
< 211> 4 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 T ;'p 71r $er Gly Leu Asp Tyr Tup Sly Gin Gly Th r Leu Val Thr Val 15 10 15
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Sly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 20 25 30
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 35 40
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Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val. Thr 15 10 15
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 35 40
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Arg Ser His Val Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 1 5 10 15
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<210> 124 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124
Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 15 10 15
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 35 4 0 4 5
<210> 126 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 15 10 15
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Hie Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser lieu Ser 35 40 45
<210> 127 < 211> 4 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 15 10 15
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 20 25 30
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 35 40 45
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 1 5 10 15
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Her Leu Ser 35 40 45
<210> 129 < 211> 4 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <4QG> 129
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lye Leu Thr Val 1 5 10 15
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 35 40 45
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 15 10 15
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 35 40 45
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser lieu Ser 35 40 45
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 15 10 15
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Ser Asn Gin Lye Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 B0 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
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Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 100 105
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
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Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Um anticorpo monoclonal humanizado que liga a STEAP-1, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada (HC) compreendendo: (1) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:14; (2) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 15; (3) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 16; e (4) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:25; e uma cadeia leve (LC) compreendendo: (1) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 11; (2) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:12; e (3) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO :13, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.
2. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente pelo menos uma, duas, ou três regiões estruturais (FRs) HC selecionadas a partir de: (1) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:22; (2) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoãcidos da RFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR; e (3) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:24.
3. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo compreende (a) domínio variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:25; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da RFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO :24, e (b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20.
4. Um anticorpo monoclonal humanizado que liga a STEAP-1, em que o anticorpo compreende: (a) domínio variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID MO: 14; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15; e (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, e (b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO :20.
5. O anticorpo de acordo com a reivindicação 4, em que o domínio variável de cadeia pesada compreende adicionalmente: (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da RFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24
6. O anticorpo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve (LC) compreendendo: (1) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NQ:9Q; (2) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:92; (3) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:93; (4) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:94; (5) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:95; (6) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:96; (7) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:97; (8) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:98; (9) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO:99; (10) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 100; ou (11) uma região de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO :101.
7. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-6, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.
8. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado a partir de um fragmento Fab, Fab' -SH, Fv, scFv, ou (Fab')2.
9. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, em que um ou mais resíduos de aminoãcido são substituídos com um ou ais aminoãcidos livres de cisteína tendo uma reatividade de tiol no intervalo de 0.6 a 1.0, opcionalmente em que o anticorpo está covalentemente unido a um marcador de captura, um marcador de deteção, ou um suporte sólido.
10. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo compreende uma cisteína numa ou mais posições selecionadas a partir de 15, 43, 110, 144, 168 e 205 da cadeia leve de acordo com a convenção da numeração de Kabat e 41,88, 115, 118, 120, 171, 172, 282, 375, e 400 da cadeia pesada de acordo com a convenção da numeração EU.
11. Um imunoconjugado compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer das revindicações 1-10, em que o anticorpo está covalentemente ligado a um agente citotóxico, em que opcionalmente o agente citotóxico é selecionado a partir de uma toxina, um agente quimioterapêutico, uma fração de fãrmaco, um antibiótico, um isótopo radioativo, e uma enzima nucleolitica.
12. 0 imunoconjugado de acordo com a reivindicação 11, em que o imunoconjugado tem a fórmula formula Ab-(L-D)p, e em que: (a) Ab é anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10; (b) L é um ligante; (c) D é uma fração de fãrmaco; e (d) p varia desde cerca de 1 até 20, em que opcionalmente L compreende um ou mais de 6-maleimidocaproílo (MC), maleimidopropanoílo (MP), valina-citrulina (val-cit), alanina-fenilalanina (ala-phe), p-aminobenziloxicarbonilo (PAB), N-Succinimidilo 4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), N-succinimidil-4 -(N- maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), N- Succinimidil-(4-iodo-acetil)aminobenzoato (SIAB), e 6-maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonilo (MC-vc-PAB).
13. 0 imunoconjugado de acordo com a reivindicação 11 ou 12 tendo a estrutura:
Ab-BMPE0-DM1 em que Vai é valina; Cit é citrulina; p varia desde 1 até 4; e Ab é um anticorpo anti-STEAP-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10.
14. Uma composição farmacêutica compreendendo o imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 para utilização no tratamento do cancro da próstata, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro da bexiga, cancro do ovário, ou sarcoma de Ewing, o método compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, em que opcionalmente o paciente é administrado com um agente quimioterapêutico em combinação com o composto imunoconjugado, em que o agente quimioterapêutico é selecionado a partir de letrozol, cisplatina, carboplatina, taxol, paclitaxel, oxaliplatina, docetaxel, 5-FU, leucovorina, lapatinib, e gencitabina.
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