PT2298066E - Marcadores para uso na produção de linhagens restauradoras duplo zero de brassica napus com bom valor agronómico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MARCADORES PARA USO NA PRODUÇÃO DE LINHAGENS RESTAURADORAS DUPLO ZERO DE BRASSICA NAPUS COM BOM VALOR AGRONÓMICO A invenção refere-se a um método de produção de linhagens restauradoras duplo-zero de Brassica napus para a esterilidade masculina citoplasmática (cms) Ogura apresentando uma introgressão do rabanete contendo o gene restaurador Rfo em que o alelo Pgi-2 do rabanete é suprimido e recombinado com o gene Pgi-2 de Brassica oleracea, e possuindo um bom valor agronómico caracterizado por fertilidade feminina, uma boa taxa de transmissão de Rfo e um elevado vigor vegetativo. A invenção refere-se igualmente a um método de produção de semente híbrida de Brassica napus e respetiva descendência. A presente invenção refere-se ao uso dos marcadores para a selecção e à composição destes marcadores. A reprodução de linhagens restauradoras para o sistema de esterilidade masculina citoplasmática (cms) Ogu-INRA na colza (Brassica napus L.) tem sido um objetivo prioritário nos últimos anos. Foram necessários retrocruzamentos e seleções extensivos para melhorar a sua fertilidade feminina e obter linhas restauradoras duplo-zero. As chamadas variedades «duplo-zero» são de baixo teor em ácido erúcico no óleo e de baixo teor de glucosinolatos na componente sólida que resta após extração do óleo. Contudo, algumas dificuldades podem ainda ser encontradas na reprodução destas linhagens (reorganizações de introgressão, possível ligação com características negativas) devido às grandes dimensões da introgressão do rabanete.

Os inventores estabeleceram então como objetivo produzir uma linhagem restauradora duplo-zero nova e melhorada, com bom valor agronómico.

Este objetivo é concretizado por um novo método de produção de uma linhagem restauradora duplo-zero recombinada para a cms Ogu-INRA na colza.

Uma primeira divulgação refere-se a um método de produção de linhagens restauradoras duplo-zero de Brassica napus para a esterilidade masculina citoplasmática (cms) Ogura apresentando introgressão do rabanete contendo o gene restaurador Rfo em gue o alelo Pgi-2 do rabanete foi suprimido e recombinado com o gene Pgi-2 de Brassica oleracea, e possuindo um bom valor agronómico, caracterizado por fertilidade feminina, uma boa taxa de transmissão de Rfo e um elevado vigor vegetativo, incluindo o referido método as seguintes etapas: a) cruzar linhagens cms duplo-zero de Brassica napus de primavera contendo uma inserção de rabanete suprimida com a linhagem duplo-zero de Drakkar de primavera para formar plantas restauradas heterozigóticas de Brassica napus, b) irradiar antes da meiose as plantas restauradas heterozigóticas obtidas na etapa a) com radiação gama, c) cruzar pólen de flores obtidas na etapa b) com a linhagem cms duplo-zero de Wesroona de primavera, d) testar, para a descendência, o vigor, a fertilidade feminina e a taxa de transmissão do gene cms, e) selecionar linhagens de descendência.

Na presente invenção, o termo "linhagem(ens)" refere-se a uma planta que é essencialmente homozigótica e que é reproduzível por autopolinização. A divulgação é também dirigida ao método acima, em que a dose de irradiação da etapa b) é de 65 Gray durante 6 minutos.

Em particular, a linhagem cms duplo-zero de Brassica napus de primavera da etapa a) é R211. A R211 é uma linhagem restauradora de primavera do INRA.

Drakkar é uma variedade francesa de primavera registada.

Wesroona é uma variedade australiana de primavera registada.

De modo vantajoso, o teste do método aqui descrito é realizado com a combinação de cinco marcadores selecionados entre PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon e CP418.

Outro objecto da presente divulgação refere-se linhagens restauradoras duplo-zero de Brassica napus para a cms de Ogura que apresenta uma inserção de Rfo em que o alelo Pgi-2 do rabanete é suprimido e recombinado com o gene Pgi-2 da Brassica oleracea, possuindo um bom valor agronómico caracterizado por fertilidade feminina, uma boa taxa de transmissão de Rfo e um elevado vigor vegetativo.

De forma vantajosa, as linhagens restauradoras duplo-zero apresentam uma combinação única de cinco marcadores selecionados entre PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon e CP418.

Outro objecto da presente divulgação refere-se a um método de formação de plantas híbridas de Brassica napus e respetiva descendência obtidas através das seguintes etapas: a) fornecer uma linhagem restauradora produzida de acordo com a reivindicação 1 e reproduzida para ser homozigótica, b) utilizar a dita linhagem restauradora como polinizadora num campo de produção de híbridos, c) utilizar plantas cms estéreis num campo de produção de híbridos como as plantas de produção das sementes híbridas, e d) colher a semente híbrida da planta estéril masculina.

Outro objecto da presente divulgação refere-se a sementes da planta Brassica obtidas a partir dos métodos de acordo com a presente invenção. É ainda outro objeto da da divulgação relacionada com as sementes de Brassica napus depositadas em NCIMB Limited, 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB24 3RY, UK, a 4 de julho de 2003, com o número de referência NCIMB41183. A presente invenção refere-se ao uso de uma composição de quatro marcadores, PGIol, PGIint, BolJon e CP418, para caracterizar linhagens restauradoras recombinadas de Brassica napus para cms Ogura que apresentam uma inserção de Rfo em que o alelo Pgi-2 do rabanete foi suprimido e recombinado com o gene Pgi-2 da Brassica oleracea, e possuindo um bom valor agronómico caracterizado por fertilidade feminina, uma boa taxa de transmissão de Rfo e um elevado vigor vegetativo.

Na presente invenção, a expressão "qualquer parte deles compreendendo pelo menos um sítio polimórfico" entende-se qualquer parte da sequência que mostra, pelo menos, uma diferença entre a sequência do tipo B. oleracea e tipo de sequência B.rapa.

Estes marcadores são representados na listagem de sequências e nas figuras que se seguem para a linhagem R2000.

De forma vantajosa, os referidos marcadores são os seguintes:

- 0 marcador PGIol, que é amplificado utilizando os iniciadores (primers): PGIol U e PGIol L (PGIol U: 5TCATTTGATTGTTGCGCCTG3'; PGIol L: 5'TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3') - 0 marcador PGIint, amplificado utilizando os

iniciadores: PGIint U e PGIint L (PGIint U: 5'CAGCACTAATCTTGCGGTATG3'; PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3') - 0 marcador PGIUNT, amplificado utilizando os iniciadores: PGIol U e PGIint L: (PGIol U: 5TCATTTGATTGTTGCGCCTG3' ; PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3') - 0 marcador BolJon, amplificado utilizando os iniciadores: BolJon U e BolJon L: (BolJon U: 5'GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3';

BolJon L: 5'GCCTACTCCTCAAATCACTCT3') - 0 marcador CP418, amplificado utilizando os iniciadores: SG129 U e pCP418 L: (SG129 U: cf. Giancola et al, 2003 Theor Appl. Genet. (no prelo); pCP418 L: 5'AATTTCTCCATCACAAGGACC3')

Outro objecto da presente invenção refere-se a marcadores PGlol, PGIUNT, PGIint, BolJon e CP418 cujas sequências seguir :

Marcador PGlol R2000: TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA 60 ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT 120 AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC 180 GTTTTCGTAC AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTTACAAA CTGAATTTTC TACCGGGTCT 240 GATGTACA 248

Marcador PGIUNT R2000: TCATTTGATT GTTGCGCCTG TCGCCTTGTT GTGTTATGAT GAATGAACAG CAGTCATTTA 60 ACATGTGGTT AACTTAACAG GGCTCCGGCT GTTGCAAAAC ACATGGTTGC TGTCAGCACT 120 AATCTTGCGG TATGAATTTG TGATTAAATT TGTTTGTTTG TGACTCTTTC TTCATTGTTC 180 GTTTTCGTAC'AATAAACCGA ATGTATAATC TTTTACAAAC TGAATTTTCT ACCGGGTCTG 24 0 ATGTACAATG CTAGTCTCCA TGTTCTTGGG GATCATGATT TATTTTCTAC ATGTATTCAG 300 ACAGTACAGA AGAAAGTGTT CAAAACTCTG GATGTTTTAA TTTACAGTTA GTGGAGAAGT 360 TCGGCATTGA TCCGAACAAT GCATTTGCAT TTTGGGACTG GGTTGGTGGA AGGTACAGTG 420 GTAAGTGCTT GTTTATTTGG TTGTATAAAT TTCTCGTCCA TTTCCGCTTG CTTAGTGTAT 480 AACTGAAATT CTTTTGCAGT TTGCAGTGCT GTTGGAGTCT TACCATTGTC TCTACAGTAT 540 GGCTTCTCTG TGGTTGAGAA GTACGGTACC TTCTACTTTA TCAGCCATCT CATAAAATGT 600 CTTAGGCATA TTCTTTCTAT TTTATTTCCC TCTTAATGAT TTCTTCTTTT TTTTATTGCA 660 TTCCCGTTTT ATTTTCAAAA GTTGTTACTG TCTCTAAATC AAGAAGAAAC CTTCTTAGTA 720 GATCCAGCTG ATATTCAGCC TTTTTTAAAT TGGACTGCAG GTTTTTAAAG GGGAGCTTCA 780 AGCATTGATA AGCATTTCCA GTCCACACCG TTTGAGAAGA ATATACCCGT GAGTTGCATT 840 AGTTGTGTGA TTATACAGTT TTCTTGTCTT TTTGCTATGT CCATCAACAC TAGAGATTCG 900 TGAAGTTATT AGTGTAGTCA ACGCATAGGG AGAGGTGATT GGTGACTTTT GGACGATTTC 960 AGGTGCTTTA GGGTTATTG 979

Marcador PGIint R2000: CAGCACTAAT CTTGCGGTAT GAATTTGTGA TTAAATTTGT TTGTTTGTGA CTCTTTCTTC 60 ATTGTTCGTT TTCGTACAAT AAACCGAATG TATAATCTTT TACAAACTGA ATTTTCTACC 120 GGGTCTGATG TACAATGCTA GTCTCCATGT TCTTGGGGAT CATGATTTAT TTTCTACATG 180 TATTCAGACA GTACAGAAGA AAGTGTTCAA AACTCTGGAT GTTTTAATTT ACAGTTAGTG 240 GAGAAGTTCG GCATTGATCC GAACAATGCA TTTGCATTTT GGGACTGGGT TGGTGGAAGG 300 TACAGTGGTA AGTGCTTGTT TATTTGGTTG TATAAATTTC TCGTCCATTT CCGCTTGCTT 360 AGTGTATAAC TGAAATTCTT TTGCAGTTTG CAGTGCTGTT GGAGTCTTAC CATTGTCTCT 420 ACAGTATGGC TTCTCTGTGG TTGAGAAGTA CGGTACCTTC TACTTTATCA GCCATCTCAT 480 AAAATGTCTT AGGCATATTC TTTCTATTTT ATTTCCCTCT TAATGATTTC TTCTTTTTTT 540 TATTGCATTC CCGTTTTATT TTCAAAAGTT GTTACTGTCT CTAAATCAAG AAGAAACCTT 600 CTTAGTAGAT CCAGCTGATA TTCAGCCTTT TTTAAATTGG ACTGCAGGTT TTTAAAGGGG 660 AGCTTCAAGC ATTGATAAGC ATTTCCAGTC CACACCGTTT GAGAAGAATA TACCCGTGAG 720 TTGCATTAGT TGTGTGATTA TACAGTTTTC TTGTCTTTTT GCTATGTCCA TCAACACTAG 780 AGATTCGTGA AGTTATTAGT GTAGTCAACG CATAGGGAGA GGTGATTGGT GACTTTTGGA 840 CGATTTCAGG TGCTTTAGGG TTATTG 866

Marcador BolJon R2000: GATCCGATTC TTCTCCTGTT GAGATCAGCT CCAAACATCA AACAACTTGT ACACAAATAT 60 CTTTACTTGC TAAATGGAAC ATGACAAGAG ATAGAAAATC TTGCTCATAG TATTGTACAA 120 GGGATAACAG TGTAGAAAAC AAACCGTCTG TAAGATTTTC TCCCTGATCC TCTCACTTAA 180 CCAGTAGGCG TTTTTCACAT TGAAGCGCAT ATCTACTTTG GTATTCACTG AATAAAAAAA 240 GAAAGCTGGT AACATGTGAA GGATATACAA GCATTGATAC ACCAAGTAGT CACAAACTAC 300 ATTATAAAGG TCAGACCTTT GTTCACATTC TGGCCTCCAG GACCACCGCT TCTAGCAAAG 360 TTAAGCGTAA CATGGTCTGC ACGTATACAA ATGAAAATGT TTCTATCAAA ATCCTATAAA 420 ATAGAGCTCT ATAACATTGT CGATACATAG TTTCACTAAC TCTGCAAGTA CTAAACACAT 480 ATACAAACAA AACTATGCGA ACAGATCAAA ACTACTACAG AACACAGTTC TATGACACTG 540 TCGATAGTAA CATCCTCTGC AAGTACCAAA GAGATAGCAA ATGAAACTAT GTAAACAAAT 600 CAAAATTCTA AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT 660 GTAAATATTT CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT 720 TCCAACAAAA CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA 780 ACCACTACAG AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA 840 CTTTCCCCGT AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTACGA 900 CATCGTTTTG AGATTAGAAC AAACTGAAAC TTACGTAGAG TGATTTGAGG AGTAGGC 957

Marcador CP418L R2000: AATTTCTCCA TCACAAGGAC CTACAGAATA GAGTTATCAT AACATTTTCT GTAAATATTT 60 CCATCAAAAT GACTAGAGAA CAGAGTTCTT ATAACATTAT CTGTAAATGT TCCAACAAAA 120 CCACTACATA GCAGAGTTCT TATAACATTG TCTGTAAATG TCCAATCAAA ACCACTACAG 180 AACAAAGCTC CTATAACATT GTTTATACAA AGTTTCACTA AATCTACAAA CTTTCCCCGT 240 AAATGAGCTT AATATCACCC AAAGATGTTT CAATCAGATA AAGAGTAACG ACATCGTTTT 300 GAGATTAGAA CAAACTGAAA CTTACGTAGA GTGATTTGAG GAGTAGGCTC GTTGCCAGCA 360 GAGCTAGCTC TCTCCTCCGC CTCATGAAGC ATCTGTTGCA CCTGAGACAA CCGTGACGAA 420 ACTTTCCGAT CACCGCCACC AGAATTCGAC GCCGCGCATC GGAAGGATCC GAATCGGGAA 480 CTGAGTGAAC CCGAGCGATC CCGGGAGTGC GACGGAGCGA TGGGAAAAGA GAGTGGCACG 540 ATTTCGACGA AGAGTGGAAG AGGAGAGGGT GGTGGATAAA CTCGCGTATG ATCAAGTTCG 600 TCATCGTCCT GATTGCCGCC ATTTTTTTTG TCAGGGCGCT CTGTGGCTTA GAAGTTTCCG 660 ATGTCAATGA AC 672

Nas imagens em anexo que se seguem, são utilizadas as seguintes abreviaturas:

Dra Drakkar

Rel-15-1, E38, R15 R2000

Hete, Hei, R211.Drakkar R211 heterozigótico*Drakkar

Darm Darmor

Boi: Brassica oleracea

Bra, B.rap: Brassica rapa GCPA18-A19, Wes, Aust: Wesroona

Sam, SamlPGIolSunt5 Samourai RRH1, ba2c RRH1 rav, N.WR Híbrido Brassica /iapus*rabanete silvestre - A Figura 1 ilustra a irradiação com raios gama e a produção de F2. - A Figura 2 ilustra a formação de sementes em 'R211' e 'R2000 ' . - A Figura 3 ilustra o número de sementes por vagem de linhagens diferentes. - A Figura 4 ilustra a localização do iniciador PGIol no segmento da sequência PGI da Base de Dados. Nessa figura: PGIol: - iniciador PGIol U (referido em SGAP: BnPGIch 1 U) - iniciador PGIol L (referido em SGAP: Bn PGIch 1 L) PGIint:

- iniciador PGIint U - iniciador PGIint L (está fora da sequência). - A Figura 5 ilustra o gel da eletroforese do gene PGI-2 (PGIol), marcador PCR e SG34, um marcador PCR próximo do Rf o. - A Figura 6 ilustra um segmento Pgi-2 de ADN amplificado por PCR com iniciadores PGIol. - A Figura 7 ilustra a digestão do produto de PCR PGIol por Msel.

Nessa figura:

Sam e Darm têm uma banda de 75 bp.

Drak, R211.Dk e R2000 exibiam uma banda de 70 pb (Acrilamida 15%). 8 era semelhante a Samourai (75bp); misturado com Drakkar (70pb) permitiu a visualização das duas bandas. - A Figura 8 ilustra o gel de agarose da eletroforese do marcador PGIUNT.

Nessa figura: A banda PGIUNT (cerca de 980 bp) está presente em B. oleracea, B. rapa cv Asko, linhagens restauradoras e de manutenção, exceto em 'R211'. Não há amplificação no rabanete e na Arabidopsis.

Nos diversos genótipos de Brassica apenas uma banda foi amplificada. O tamanho das bandas é semelhante, mas as sequências são diferentes. - A Figura 9 ilustra o gel da eletroforese do marcador PCR PGIint.

Nessa figura, o PGIint da linhagem 7 do rabanete tem cerca de 950 bp. Esta banda é igual à das RRH1 e R113 restauradas. Não se encontra em R211. Também não se encontra em R2000. Contudo, a banda PGIint tem um tamanho idêntico, de cerca de 870 bp, nas diversas espécies de Brassica, embora as sequências sejam diferentes. - A Figura 10 ilustra o gel de agarose da eletroforese do marcador PCR BolJon. - A Figura 11 ilustra o gel de agarose da eletroforese do marcador CP418.

Nessa figura, a banda CP418 (de cerca de 670 bp) é especifica do genoma de B. oleracea. Está presente em B. ol, B. napus (Samourai, Drakkar, Pactol e na R2111*Dk heterozigótica) . Está ausente na colza restaurada (RRH, R113 e R211). Está presente na R2000 homozigótica. - A Figura 12 ilustra o quadro-sintese dos marcadores. - As Figuras 13(a) e 13(b) ilustram o alinhamento de sequências do marcador PGIol entre Arabidopsis, Rabanete, B. rapa, B. oleracea e R2000. - As Figuras 14(a), 14(b), 14(c) e 14(d) ilustram ο alinhamento de sequências do marcador PGIint-UNT entre Arabidopsis, Rabanete, B. rapa, B. oleracea e R2000. - As Figuras 15(a), 15(b) e 15(c) ilustram o alinhamento de sequências do marcador CP418L entre Arabidopsis, Rabanete, B. rapa, B. oleracea e R2000. - As Figuras 16 e 16bis ilustram os marcadores BolJon em Arabidopsis, Rabanete e B. rapa. Estão alinhados com as sequências DB de Arabidopsis (fim de AC007190-início de AC01 1000), com o fim da B. oleracea EMBH959102 e o inicio de EMBH448336 e com as sequências de consenso representativas das bandas 1 e 2 dos marcadores SG129 na B. napus (em Drakkar e Samourai respetivamente). A partir do ponto 836 bp, as sequências AC07190-AC11000 e GCPATpBOJ deixam de ser estreitamente homólogas das sequências de Brassica.

As sequências do rabanete e da B. rapa (GCPconsen RsRf BOJ e BR) são ainda estreitamente homólogas à da B. napus, a partir do ponto 858 bp até aos pontos 900 bp e 981 respetivamente.

No rabanete, só foi encontrada uma homologia parcial na sequência da Brassica mais abaixo.

Na espécie B. rapa cv Asko, a parte esquerda da sequência BolJon pode ser novamente alinhada, após uma supressão de 78 bp, com as de B. oleracea e B. rapa em B. napus desde o ponto 1057 bp até ao iniciador BolJon L. - As Figuras 17 e 17bis ilustram a localização de iniciadores Pgi-2 na sequência MJB21.12 da Arabidopsis th. - A Figura 18 ilustra a localização dos iniciadores BolJon no gene mipsAtl62850 e a zona de sobreposição dos clones AC007190 e AC011000 de Arabidopsis th. É apresentado o alinhamento com o produto PCR BolJon da Arabidopsis (740 bp) .

Deve ter-se em conta, porém, que os exemplos são apenas dados a título de ilustração do objeto da invenção, e para a qual não constituem, de forma alguma, uma limitação.

Exemplo I: Método para produção de linhagem restauradora duplo-zero de Brassica napus para cms Ogura apresentando uma introgressão do rabanete, contendo o gene restaurador Rfo em que o alelo Pgi-2 do rabanete é suprimido e recombinado com o gene Pgi-2 de Brassica oleracea, possuindo um bom valor agronómico caracterizado por fertilidade feminina, uma boa taxa de transmissão de Rfo e um elevado vigor vegetativo.

Materiais e métodos:

Genótipos: A linhagem 'R211' com uma inserção de rabanete suprimida foi cruzada com colza de primavera 'Drakkar' de baixo teor de glucosinolatos (GLS) para produzir uma descendência F1 (,R211*Dk') . A linhagem cms de baixo teor de glucosinolatos 'Wesroona' de primavera (origem australiana) foi utilizada para cruzamentos posteriores. Foram utilizadas como controlo em análises moleculares: linhagens restauradas de inverno derivadas de 'Samourai' contendo a introgressão completa ('RRH1') ou incompleta ('R113'), bem como a linhagem 7 de rabanete europeu, rabanete asiático restaurado D81, híbrido Brassica napus*rabanete silvestre, Brassica oleracea, e B. rapa cv Asko, Arabidopsis thaliana.

Irradiação com raios gama: plantas floríferas completas foram tratadas com raios gama de uma fonte Co-60 numa área controlada. Foi aplicada uma dose subletal de 65 Gray antes da meiose.

Testes de cruzamento e produção de F2: as plantas irradiadas foram transferidas para uma estufa à prova de insetos depois de remover os botões com mais de 2 mm. 0 descendente F1 irradiado foi utilizado para polinizar manualmente a linhagem 'Wesroona' cms. Permitiu-se que as plantas restauradas derivadas de F1 produzissem famílias F2 colhidas individualmente e semeadas com precisão num ensaio de campo juntamente com controlos não irradiados (Fig. 1).

Seleção fenotípica: Três critérios visuais foram pontuados (numa escala de 1 a 5) ao longo de 2 anos nos ensaios de campo, em 1200 descendentes F2 mais 44 controlos (82 330 plantas citadas): 1- Vigor vegetativo, 2- Normalidade da relação plantas férteis/estéreis na segregação de F2, e 3- Fertilidade feminina (desenvolvimento da vagem e formação de sementes).

Foram obtidas gerações avançadas de autopolinização das famílias selecionadas tanto no campo como em estufa, tendo produzido linhagens homozigóticas (F4) para futura análise.

Foi realizada a análise de isoenzimas como em Delourme R. e Eber F. 1992. Theor Appl Genet 85: 222-228, marker development from Fourmann M. et al. 2002. Theor Appl.

Genet. 105:1196-1206. Os produtos PCR são validados por sequenciamento. Os alinhamentos foram feitos utilizando Blast Ncbi e Uk Crop Net Brassica DB e o software Multialin da INRA Toulouse. Método:

Escolhemos uma linhagem restauradora homozigótica de primavera com baixo teor de glucosinolatos, 'R211', que exibia já supressões na introgressão (Delourme R. and Eber F. 1992. Theor Appl Genet 85: 222-228. Delourme R. et al. 1998. Theor Appl Genet 97:129-134. Delourme R. et al. 1999. 10th Int. Rapeseed Congress, Canberra). Vários marcadores moleculares desapareceram de ambos os lados do Rfo, como o spATCHIA (Fourmann M. et al. 2002. Theor Appl. Genet. 105:1196-1206), o spSG91 (Giancola S. et al. 2003 Thear

Appl. Genet. (no prelo)) . A 'R211' perdeu a expressão de isoenzimas do alelo Pgi-2 do gene do rabanete, mas também a do alelo Pgi-2 do genoma de B. oleracea (1,2) . Para além disso, a 'R211' homozigótica mostra características negativas ligadas, como baixo vigor e uma formação de sementes muito pobre. Colocámos a hipótese de estas plantas carecerem de um segmento cromossómico de colza. O rácio de fertilidade em descendentes F2 derivados deste material é menor do que o esperado (64% em vez de 75%) . Iniciámos o programa a partir desta linhagem 'R211' e tentámos forçar a recombinação entre o Rfo que continha a introgressão a partir desta linhagem suprimida e o cromossoma homólogo da colza de uma linhagem duplo-zero de B. napus. É sabido que a irradiação ionizante induz reorganizações cromossómicas por quebras do duplo filamento seguidas de reunião anómala das extremidades. Foi utilizada irradiação de raios gama numa F1 heterozigótica derivada da linhagem 'R211' para induzir quebras de cromossomas, mesmo antes da meiose, visando uma recombinação da introgressão suprimida do rabanete no genoma da colza.

Resultados:

Em 1200 famílias F2 testadas, muito poucas obtiveram a melhor pontuação nos três critérios.

Apenas uma, a 'R2000', demonstrou produzir um rácio normal de plantas férteis por descendente autopolinizado com uma recuperação estável de boas caracteristicas agronómicas, como uma boa fertilidade feminina, com uma formação de sementes normal, por comparação com a 'R211' (Figs. 2 e 3). Esta família foi obtida com um tratamento por irradiação de 6 min, com um fluxo de dose de 65 Gray por hora. A análise de glucosinolatos confirmou o seu baixo teor.

Na Figura 2 (Formação de sementes em 'R211' e 'R2000'), R2000 apresentava inflorescências normais, com uma arquitetura de aspeto normal.

Na Figura 3 (número de sementes por vagem), observamos: - nas melhores famílias ,R2000'' F4 em autopolinização (Selfings) e em cruzamentos-teste, - na linhagem cms de 'Pactol' em controlos da colza e 'R211' .

Exemplo II: Seleção de mercadores no gene Pgi-2

Análise da isoenzima PGI: o descendente 'R2000' exprimia o alelo Pgi-2 da colza do genoma da B. oleracea, originariamente perdido em 'R211'.

Foram definidos três marcadores PCR para caracterizar a família R2000 por comparação com o conhecido restaurador RRH1 e R113 da colza. 1) 0 marcador PGIol foi desenvolvido a partir das sequências de BrassicaDB, a fim de ser específico do genoma da Brassica. Não existe amplificação no rabanete nem na Arabidopsis th., mas apenas na Brassica, com uma banda de 248 bp. 2) 0 marcador PGIint amplificou uma parte mais longa do gene Pgi-2, permitindo uma distinção clara entre as diversas espécies testadas Brassica, Raphanus e Arabidopsis. As espécies B. rapa e B. oleracea não foram distinguidas pelo tamanho da banda em gel de agarose, mas pela sua sequência de banda PGINT. 3) 0 marcador PGIUnt, uma combinação dos iniciadores PGIol U e PGIint L. Este marcador possuía a especificidade do marcador PGIol mas amplificava uma parte mais longa, tal como o PGIint. II.1 Marcador PGIol

Com os iniciadores PGIol, a linhagem parental 'R211' não mostrava amplificação, ao passo que as linhagens de primavera testadas mostravam uma banda de 248 bp. A sua sequência de ADN é homóloga das sequências PGI-2 da espécie Brassica da Crop Net UK DB e de trabalhos anteriores do nosso grupo (chamadas sequências SGAP) (Localização dos iniciadores SG PGI chou, Fig. 4).

Era ortólogo do clone MJB21-12, no cromossoma V, (34543bp) na Arabidopsis (NCBI DB). PGIol mais SG34 para estabelecer um teste de homozigosidade: A utilização combinada de dois conjuntos de iniciadores numa PCR mista, com o PGIol a marcar o gene Pgi-2 ausente na planta homozigótica restaurada e o SG34 (de S. Giancola et al. , Giancola S. et al. , 2003 Theor Appl. Genet. (no prelo)) um marcador muito aproximado do gene Rfo, foi estabelecida para discriminar plantas homozigóticas de heterozigóticas entre as plantas férteis que segregavam nos descendentes de F2 derivados de 'R211'. Em vez de utilizar SG34, é possível utilizar qualquer outro marcador aproximado do qene Rfo ou pertencente ao mesmo.

Apenas uma família R2000 não mostrou diferença entre descendência homozigótica e heterozigótica: 0 gene Pgi-2 está presente no homozigoto R2000, o que não acontece com o R211 homozigótico parental.

Na figura 5 (marcadores PCR PGIol e SG34): A família 'R2000' homozigótica recuperou a banda PGIol. A sequência de ADN da banda confirmou a homologia com a conhecida sequência Pgi-2 de Arabidopsis e Brassica. Os genótipos de controlo (Drakkar, Pactol, e Samourai, Darmor) tinham o mesmo padrão no gel. A sequência desta banda comum permitiu confirmar a sua elevada homologia pois eram quase semelhantes exceto uma substituição de base. A família 'R2000' homozigótica recuperou a banda PGIol do tipo Brassica oleracea. Era distinta do conhecido restaurador do grupo Samourai.

Esta parte amplificada do Pgi-2 está muito conservada e quase que não se verificaram diferenças entre os vários genótipos. Investigou-se uma parte mais longa do gene Pgi-2 . II.2 Marcadores PGIUNT e PGIint Padrões de eletroforese de produtos PCR:

Marcador PGIUNT: Um segundo iniciador reverso, PGIint L, foi desenhado mais abaixo na sequência Pgi-2, para amplificar regiões do gene como bem conservadas e como variáveis. Quando utilizado com o iniciador PGIol U, ele amplifica uma banda de 980 bp apenas nos genomas de

Brassica. R211 não mostrou qualquer banda. A yR2000' homoziqótica mostrou a banda PGIUNT tal como no proqenitor de Drakkar.

Na figura 8 (marcador PGIUNT): 0 marcador PGIint amplificou um segmento de PGIUNT. 0 iniciador superior PGIint permite a amplificação em todas as espécies analisadas, permitindo uma distinção clara entre Arabidopsis, Rabanete e Brassica. A B. rapa e a B. oleracea não se distinguiam pelas dimensões da banda em gel de agarose, mas pela sua sequência PGIint. Todos os genótipos restaurados analisados, exceto a linhagem 'R211', exibiam a banda do rabanete europeu e uma banda de Brassica, homóloga à de I. rapa. A 'R2000' homozigótica não mostrou a banda PGIint do rabanete, como na linhagem parental "R211" suprimida, mas mostrou uma banda de Brassica, homóloga à de I. oleracea. A eletroforese do marcador PGIint está representada na figura 9 .

Análise de sequências:

Comparação das sequências PGI das bases de dados.

Conhece-se um segmento PGI de cerca de 490 bp.

Estudaram-se no nosso grupo laboratorial sequências de um segmento de cerca de 490 bp proveniente de diferentes genótipos (B. oleracea, B. rapa, B. napus), e algumas sequências foram dadas à Brassica Crop Net DB: EMAF25875 a 25788 por M. Fouramnn (4) . Estas sequências estão muito conservadas.

Comparação das sequências PGI das espécies B. rapa e B. oleracea (figuras 13 e 14): A comparação entre as sequências PGI que obtivemos a partir dos qenótipos analisados das espécies B. oleracea e B. rapa mostrou que elas se diferenciavam por 21 substituições de base. Estas substituições permitiam distinguir sequências PGIint dos outros genótipos analisados de colza, homólogos quer da B. rapa cv Asko (RRH1 e RI 13) quer da B. oleracea (Drakkar, R211*DK mas também R2000).

Exemplo III: Seleção do marcador numa região próxima de Rfo

Determinaram-se os marcadores que envolvem o gene Rfo na inserção do rabanete para facilitar a clonagem do gene Rfo (Desloires S. et ai., 2003 EMBO reports 4, 6:588-594) . Um destes, o marcador PCR SG129 estava localizado muito próximo do Rfo (Giancola S. et ai., 2003 Theor Appl. Genet. (in press)): ele co-amplifiçava bandas distintas nos genomas da B. oleracea e B. rapa da B. napus, mas a banda do rabanete era muito difícil de ver num gel de agarose. A sequência alvo SG129 era ortóloga de um clone (ACOllOOO, no locus F16P17) na Arabidopsis thaliana. Este clone sobrepunha-se a um clone contlg adjacente de Arabidopsis (AC07190).

Na Brassica Crop Net DB, encontrámos um clone de B. oleracea (EMBH448336, 764 bp) utilizando o BLAST com o início de A011000, e um segundo clone de B. oleracea (EMBH53971) , distante dos cerca de 300 bp no mapa da Arabidopsis, utilizando o BLAST com o fim de AC07190.

Desenhámos um novo marcador PCR, BolJon, entre os dois clones de B. oleracea. Verificámos que ele permitia a amplificação de uma banda PCR específica nos diferentes genótipos aqui comparados.

Nas figuras 16 (gel de eletroforese de produtos PCR BolJon): - Na Arabidopsis, amplificou-se uma banda BolJon de 815 bp, homóloga do segmento sobreposto dos contigs. - Nas espécies Brassiceae diplóide, o marcador BolJon apresentava bandas distintas: uma de 950 bp em B. oleracea e uma de 870 bp em B. rapa. Ele mostrava gue os dois clones de B. oleracea (EMBH53971 e EMBH448336) estão em continuidade sequencial no genoma de Brassica tal como acontece com as sequências ortólogas na Arabidopsis. - Na B. napus, estas duas bandas estão co-amplifiçadas nas linhagens de manutenção, Samourai ou

Drakkar. - Na linhagem 7 do rabanete, uma banda do BolJon foi amplificada de cerca de 630 bp. A banda do cmsRd81 do rabanete restaurado era ligeiramente menor. - Em todas as linhagens de colza restauradas, uma das bandas do BolJon era do mesmo tamanho da linhagem 7 do rabanete. BolJon é um marcador da introgressão do rabanete. - As linhagens de colza restauradas homozigóticas, 'RRH1', 'R113' e também 'R211', mostravam apenas a banda de B. rapa e a banda de rabanete de 630 bp, sugerindo que o ortólogo de B. oleracea do gene alvo está ausente ou foi modificado quando o segmento de cromossoma do rabanete foi inserido no genoma constitutivo da B. oleracea da colza.

As plantas homozigóticas 'R2000' mostravam BolJon PCR do rabanete, mais as duas bandas do BolJon da Brassica, tendo mais uma vez recuperado a da B. oleracea, perdida na 'R211' e outras linhagens restauradoras.

Desenhámos um iniciador, pCP418L, específico do genoma da B. oleracea nas espécies testadas. Com o iniciador SG129U ele amplificava apenas uma banda PCR (670 bp) na espécie B.oleracea (Figs. 17). Não houve amplificação na B.rapa no rabanete nem na Arabidopsis, mas havia uma clara banda CP418 nas linhagens de manutenção da B. napus. A sua seguência era estritamente homóloga da seguência EMBH448336. Este marcador estava numa sequência de ADN muito conservada, não permitindo polimorfismo entre genótipos exceto por presença / ausência.

Em RRH1, R113 e em R211 não havia banda de CP418, indicando como anteriormente que o ortólogo da B.oleracea do gene alvo está ausente ou foi modificado após a inserção de rabanete.

As plantas homozigóticas 'R2000' mostravam banda de CP418, tendo mais uma vez recuperado a específica de B. oleracea.

Na presente invenção, selecionou-se uma linhagem restauradora de baixo GLS recombinada com uma boa fertilidade feminina. O baixo valor da linhagem 'R211' permitiu a seleção no terreno para um evento de recombinação raro e caracterização da família 'R2000'. A 'R2000' homozigótica apresenta uma combinação única dos marcadores PGIol, PGIUNT, PGIint e BolJon em comparação com o restaurador de colza analisado até agora: o marcador PGIint mostrou que as linhagens de colza restauradas homozigóticas, RRH1 e R113 apresentavam a banda de rabanete europeu mais uma banda de Brassica, homóloga do genoma da B. rapa. A 'R2000' não apresenta banda de rabanete, perdida como na sua linhagem parental suprimida R211, mas mostrava uma banda de Brassica homóloga da B. oleracea. A sequência PGIint ortóloga no seu genoma de B. rapa não é amplificada com este marcador no background genético de R211 e Drakkar.

As sequências do marcador PGIol e do marcador PGIUNT nas linhagens restauradoras RRH1 e R113 eram homólogas da do B. rapa cv Asko. No 'R2000', a sequência de PGIUNT é homóloga da B. oleracea. A sequência de PGIUnt ortóloga no seu genoma de B. rapa não é amplificada com este marcador no background genético de R211 e Drakkar. 0 marcador BolJon mostrou que as linhagens de colza restauradas homozigóticas, incluindo 'R211', apresentavam a banda do rabanete europeu mais apenas a de B. rapa. A 'R2000' mostra as duas bandas de 'R211' mais a banda de BolJon da B. oleracea recuperada. 0 marcador CP418 mostrou que a 'R2000' recuperou este segmento de B. oleracea conservado. A nossa hipótese é que um evento de recombinação ocorreu na célula mãe de pólen que deu origem a plantas 'R2000'. A introgressão de rabanete suprimida foi depois integrada no segmento de cromossoma homólogo normal, portador do gene do tipo Pgi-2 da B. oleracea e da sequência alvo de BolJon, caracterizada por estes marcadores, provavelmente proveniente do genoma '00' de Drakkar presente na 'R211*DK' heterozigótica irradiada. 0 padrão observado para o BolJon sugere que o evento de recombinação produziu uma região duplicada particular, uma do rabanete e uma B. oleracea, na família 'R2000'.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) <120> Método de produção de linhagens restauradoras duplo zero de Brassica napus tendo um bom valor agronómico <130> D21413 <140> EP 04744142.3 <141> 2004-07-05 <150> EP 03291677.7 <151> 2003-07-04 <150> EP 03293057.0 <151> 2003-12-08 <160> 5

<170> Patentin versão 3.2 <210> 1 <211> 248 <212> ADN <213> Brassica napus <220> <223> marcador PGIol <400> 1 tcatttgatt gttgcgcctg tcgccttgtt gtgttatgat gaatgaacag cagtcattta 60 acatgtggtt aacttaacag ggctccggct gttgcaaaac acatggttgc tgtcagcact 120 aatcttgcgg tatgaatttg tgattaaatt tgtttgtttg tgactctttc ttcattgttc 180 gttttcgtac aataaaccga atgtataatc tttttacaaa ctgaattttc taccgggtct 240 gatgtaca 248 <210> 2 <211> 979

<212> ADN <213> Brassica napus <220> <223> marcador PGI-UNT <400> 2 tcatttgatt gttgcgcctg tcgccttgtt gtgttatgat gaatgaacag cagtcattta 60 acatgtggtt aacttaacag ggctccggct gttgcaaaac acatggttgc tgtcagcact 120 aatcttgcgg tatgaatttg tgattaaatt tgtttgtttg tgactctttc ttcattgttc 180 gttttcgtac aataaaccga atgtataatc ttttacaaac tgaattttct accgggtctg 240 atgtacaatg ctagtctcca tgttcttggg gatcatgatt tattttctac atgtattcag 300 acagtacaga agaaagtgtt caaaactctg gatgttttaa tttacagtta gtggagaagt 360 tcggcattga tccgaacaat gcatttgcat tttgggactg ggttggtgga aggtacagtg 420 gtaagtgctt gtttatttgg ttgtataaat ttctcgtcca tttccgcttg cttagtgtat 480 aactgaaatt cttttgcagt ttgcagtgct gttggagtct taccattgtc tctacagtat 540 ggcttctctg tggttgagaa gtacggtacc ttctacttta tcagccatct cataaaatgt 600 cttaggcata ttctttctat tttatttccc tcttaatgat ttcttctttt ttttattgca 660 ttcccgtttt attttcaaaa gttgttactg tctctaaatc aagaagaaac cttcttagta 720 gatccagctg atattcagcc ttttttaaat tggactgcag gtttttaaag gggagcttca 780 agcattgata agcatttcca gtccacaccg tttgagaaga atatacccgt gagttgcatt 840 agttgtgtga ttatacagtt ttcttgtctt tttgctatgt ccatcaacac tagagattcg 900 tgaagttatt agtgtagtca acgcataggg agaggtgatt ggtgactttt ggacgatttc 960 aggtgcttta gggttattg 979 <210> 3 <211> 866

<212> ADN <213> Brassica napus <22 0> <223> marcador PGI-int <400> 3 cagcactaat cttgcggtat gaatttgtga ttaaatttgt ttgtttgtga ctctttcttc 60 attgttcgtt ttcgtacaat aaaccgaatg tataatcttt tacaaactga attttctacc 120 gggtctgatg tacaatgcta gtctccatgt tcttggggat catgatttat tttctacatg 180 tattcagaca gtacagaaga aagtgttcaa aactctggat gttttaattt acagttagtg 240 gagaagttcg gcattgatcc gaacaatgca tttgcatttt gggactgggt tggtggaagg 300 tacagtggta agtgcttgtt tatttggttg tataaatttc tcgtccattt ccgcttgctt 360 agtgtataac tgaaattctt ttgcagtttg cagtgctgtt ggagtcttac cattgtctct 420 acagtatggc ttctctgtgg ttgagaagta cggtaccttc tactttatca gccatctcat 480 aaaatgtctt aggcatattc tttctatttt atttccctct taatgatttc ttcttttttt 540 tattgcattc ccgttttatt ttcaaaagtt gttactgtct ctaaatcaag aagaaacctt 600 cttagtagat ccagctgata ttcagccttt tttaaattgg actgcaggtt tttaaagggg 660 agcttcaagc attgataagc atttccagtc cacaccgttt gagaagaata tacccgtgag 720 ttgcattagt tgtgtgatta tacagttttc ttgtcttttt gctatgtcca tcaacactag 780 agattcgtga agttattagt gtagtcaacg catagggaga ggtgattggt gacttttgga 840 cgatttcagg tgctttaggg ttattg 866 <210> 4 <211> 957

<212> ADN <213> Brassica napus <22 0> <223> marcador BolJon <400> 4 gatccgattc ttctcctgtt gagatcagct ccaaacatca aacaacttgt acacaaatat 60 ctttacttgc taaatggaac atgacaagag atagaaaatc ttgctcatag tattgtacaa 120 gggataacag tgtagaaaac aaaccgtctg taagattttc tccctgatcc tctcacttaa 180 ccagtaggcg tttttcacat tgaagcgcat atctactttg gtattcactg aataaaaaaa 240 gaaagctggt aacatgtgaa ggatatacaa gcattgatac accaagtagt cacaaactac 300 attataaagg tcagaccttt gttcacattc tggcctccag gaccaccgct tctagcaaag 360 ttaagcgtaa catggtctgc acgtatacaa atgaaaatgt ttctatcaaa atcctataaa 420 atagagctct ataacattgt cgatacatag tttcactaac tctgcaagta ctaaacacat 480 atacaaacaa aactatgcga acagatcaaa actactacag aacacagttc tatgacactg 540 tcgatagtaa catcctctgc aagtaccaaa gagatagcaa atgaaactat gtaaacaaat 600 caaaattcta aatttctcca tcacaaggac ctacagaata gagttatcat aacattttct 660 gtaaatattt ccatcaaaat gactagagaa cagagttctt ataacattat ctgtaaatgt 720 tccaacaaaa ccactacata gcagagttct tataacattg tctgtaaatg tccaatcaaa 780 accactacag aacaaagctc ctataacatt gtttatacaa agtttcacta aatctacaaa 840 ctttccccgt aaatgagctt aatatcaccc aaagatgttt caatcagata aagagtacga 900 catcgttttg agattagaac aaactgaaac ttacgtagag tgatttgagg agtaggc 957 <210> 5 <211> 672

<212> ADN <213> Brassica napus <220> <223> marcador CP418L <400> 5 aatttctcca tcacaaggac ctacagaata gagttatcat aacattttct gtaaatattt 60 ccatcaaaat gactagagaa cagagttctt ataacattat ctgtaaatgt tccaacaaaa 120 ccactacata gcagagttct tataacattg tctgtaaatg tccaatcaaa accactacag 180 aacaaagctc ctataacatt gtttatacaa agtttcacta aatctacaaa ctttccccgt 240 aaatgagctt aatatcaccc aaagatgttt caatcagata aagagtaacg acatcgtttt 300 gagattagaa caaactgaaa cttacgtaga gtgatttgag gagtaggctc gttgccagca 360 gagctagctc tctcctccgc ctcatgaagc atctgttgca cctgagacaa ccgtgacgaa 420 actttccgat caccgccacc agaattcgac gccgcgcatc ggaaggatcc gaatcgggaa 480 ctgagtgaac ccgagcgatc ccgggagtgc gacggagcga tgggaaaaga gagtggcacg 540 atttcgacga agagtggaag aggagagggt ggtggataaa ctcgcgtatg atcaagttcg 600 tcatcgtcct gattgccgcc attttttttg tcagggcgct ctgtggctta gaagtttccg 660 atgtcaatga ac 672

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de cinco marcadores, sendo esses marcadores PGlol, PGIUNT, PGlint, BolJon, e CP418, em que o marcador PGlol tem a sequência de SEQ ID NO: 1, o marcador PGIUNT tem a sequência de SEQ ID NO: 2, o marcador PGlint tem a sequência de SEQ ID NO: 3, o marcador BolJon tem a sequência de SEQ ID NO: 4, e a CP418 marcador tem a sequência de SEQ ID NO: 5 .
2. 2. Utilização da composição de cinco marcadores de acordo com a reivindicação 1 para a detecção de linhas restauradoras duplas baixas recombinadas de Brassica napus para Ogura cms apresentando uma introgressão rabanete portador do gene restaurador Rfo fertilidade masculina excluído do rabanete isozima Pgi 2-alelo e recombinadas com o gene Pgi-2 a partir de Brassica oleracea, e tendo uma boa valor agronómico da fertilidade feminina, uma taxa de transmissão de bom Rfo e um alto vigor vegetativo.
3. 3. A utilização da reivindicação 2, que compreende amplificar os referidos cinco marcadores de acordo com a reivindicação 1.