PT2270171E - Antigénios de haemophilus influenzae e fragmentos de adn correspondentes - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANTIGÉNIOS DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE E FRAGMENTOS DE ADN CORRESPONDENTES"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polipéptidos de Haemophilus influenzae e fragmentos de ADN correspondentes que podem ser úteis para prevenir, diagnosticar e/ou tratar infecções de Haemophilus influenzae em individuos, tais como humanos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Haemophilus influenzae é um bastonete Gram-negativo que é encontrado na natureza apenas como um patogéneo humano. Isolados de H. influenzae podem ser subdivididos em formas encapsuladas e não encapsuladas. As estirpes encapsuladas expressam um de seis polissacáridos capsulares estrutural e antigenicamente distintos que são designados, tipos "a" a "f". As estirpes não encapsuladas são definidas pela sua incapacidade de aglutinar com antissoros contra os polissacáridos capsulares de H. influenzaee reconhecidos e são referidos como não tipáveis.

As estirpes não tipáveis de H. influenzae colonizam geralmente o tracto respiratório superior, incluindo a nasofaringe e orofaringe posterior. Vários estudos de individuos saudáveis indicam taxas de colonização entre 40% a 80% entre crianças e adultos (Spinola S.M., Peacock J., Denny F.W., Smith 1 D.L. e Cannon J.G. (1986) Epidemiology of colonisation by nontypeable Haemophilus influenzae in children: a longitudinal study. J. Infect. Dis. 154:100-109; Trottier S., Stenberg K. e Svanborg-Eden C. (1989) Turn over of nontypeable Haemophilus influenzae in the nasopharynges of healthy children. J. Clin. Microbiol. 27:2175-2179). A colonização com uma estirpe particular pode persistir durante semanas ou meses, com a maioria dos indivíduos a permanecer assintomáticos ao longo deste período. A patogénese da doença devido a H. influenzae não tipáveis envolve a propagação contígua no tracto respiratório. A propagação para áreas adjacentes é geralmente uma consequência de anomalias nas defesas não específicas ou específicas do hospedeiro. Assim, os H. influenzae não tipáveis_provocam uma variedade de infecções do tracto respiratório em crianças e adultos, incluindo otite, sinusite, bronquite e pneumonia. Estas infecções podem tornar-se crónicas ou recorrentes em doentes com bronquite ou otite. De facto, em bebés e crianças, H. influenzae não tipável é uma causa frequente de otite média aguda e está implicado geralmente em otite média recorrente (Harabuchi Y., Fadden H., Yamanaka N., Duffy L., Wolf J., Krystofik D. e Tonawanda/Williamsville Pediatrics. (1994) Nasopharyngeal colonisation with nontypeable Haemophilus influenzae and recorrent otitis media. J. Infect. Dis. 170 :862-866). Em bebés, H. influenzae não tipável é responsável por entre 27% e 37% do primeiro episódio de otite média pela idade de 1 ano (Smith-Vaughan H.C., Sriprakash K.S., Mathews J.D. e Kemp D.J. (1997) Nonencapsulated Haemophilus influenzae in aboriginal infants with otitis media: prolonged carriage of P2 porin variants and evidence for horizontal P2 gene transfer. Infect. Immun. 65 :1468-1474; Teele D.W., Klein J.O., Rosner B. e Greater Boston Otitis Media Study Group. (1989) Epidemiology of otitis media during the first seven years of life in children in Greater Boston: a prospective, cohort study. J. Infect. Dis. 2 160 :83-94). A meningite é por vezes provocada por H. influenzae não tipável e é responsável por 1-3% de todos os casos. Mas, o H. influenzae não tipável é particularmente prevalente em hospedeiros com uma doença subjacente que afecta o sistema imune inato da mucosa, tais como a doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD) e fibrose cística (Murphy T.F. and Sethi S. (1992) Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease. Am. Rev. Respir. Dis. 146 :1067-1083; St. Geme J.W. III. (1993) Nontypeable Haemophilus influenzae disease: epidemiology, pathogenesis and prospects for prevention. Infect. Agents Dis. 2 :1-16). As estirpes de H. influenzae não tipáveis são encontradas predominantemente durante exacerbações guando a expectoração se torna mucopurulenta. As exacerbações infecciosas agudas da bronquite crónica desempenham um papel importante na morbidade e mortalidade de doentes com doenças pulmonares crónicas.

As etiologias de pneumonia adquirida na comunidade parecem ter mudado na última década. Enquanto o Streptococcus pneumoniae permanece o patogéneo predominante, a proporção de casos que envolvem outros organismos aumentou. H. influenzae é agora frequentemente descrito como sendo a segunda causa mais comum de pneumonia. Dez porcento dos casos de pneumonia de H. influenzae desenvolvem-se em bacteremia. Em países em desenvolvimento, a pneumonia provocada por H. influenzae não tipável é aparentemente uma causa importante de morbidade e mortalidade em crianças. O documento WO 96/33276 divulga o genoma completo de Haemophilus influenzae Rd e as suas possíveis utilizações clínicas e os polipéptidos aí codificados. 3

Embora tenham sido desenvolvidas diversas vacinas conjugadas com polissacárido do tipo b de H. influenzae, estas vacinas são ineficazes contra doença provocada por outras estirpes de H. influenzae (Scheifele D.W., Jadavji T.P., Law B.J., Gold R., Macdonald N.E., Lebel M.H., Mills E.L., Dery P., Halperin S.A., Morris R.F., Marchessault V. e Duelos P.J. (1996) Recent trends in pediatric Haemophilus influenzae type b infections in Canada. Can. Med. Assoe. J. 154 :1041-1047; Schulte E.E., Birkhead G.S., Kondracki S.F. e Morse D.L. (1994) Patterns of Haemophilus influenzae type b invasive disease in New York State, 1987-991: the role of vaccination requirements for day-care attendance. Pediatrics 94:1014-1016) . A identificação de antigénios de protecção cruzada conservados é critica para o desenvolvimento de uma vacina universal contra infecção e doença por H. influenzae. Proteínas da membrana externa, tais como Pl, P2, P4, P6, PCP, OMP26 e D-15, foram identificadas ou são actualmente exploradas como potenciais antigénios de vacina (Foxwell A.R., Kyd J.M. e Cripps A.W. (1998) Nontypeable Haemophilus Influenzae: Pathogenesis and Prevention. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:294-308). A proteína D-15 é o único imunogénio conservado que foi descrito na literatura científica, como sendo capaz de conferir protecção contra múltiplos serotipos e estirpes não tipáveis.

Deste modo, permanece uma necessidade não satisfeita para polipéptidos de H. influenzae que possam ser úteis para prevenir, diagnosticar e/ou tratar infecções de Haemophilus influenzae em indivíduos, tal como humanos. 4

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 70% de identidade com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a polipéptidos que compreendem uma sequência de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

Noutros aspectos, são proporcionados polipéptidos codificados por polinucleótidos da invenção, composições farmacêuticas, vectores compreendendo polinucleótidos da invenção ligados operativamente a uma região de controlo de expressão, assim como células hospedeiras transfectadas com os referidos vectores e processos de produção de polipéptidos compreendendo o cultivo das referidas células hospedeiras sob condições adequadas para a expressão.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI1 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 1. A Figura 2 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI1 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 2. 5 A Figura 3 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI2 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 3. A Figura 4 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI2 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 4. A Figura 5 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI3 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 5. A Figura 6 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI3 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 6. A Figura 7 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI4 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 7. A Figura 8 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI4 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 8. A Figura 9 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI5 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 9. A Figura 10 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI5 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 10. A Figura 11 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI6 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 11. 6 A Figura 12 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI6 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 12. A Figura 13 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI7 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 13. A Figura 14 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI7 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 14. A Figura 15 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI8 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 15. A Figura 16 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI8 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 16. A Figura 17 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI9 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 17. A Figura 18 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI9 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 18. A Figura 19 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI10 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 19. A Figura 20 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI10 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 20. 7 A Figura 21 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI11 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 21 A Figura 22 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHIll de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 22. A Figura 23 representa a sequência de ADN do gene BVH-NTHI12 da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 23 A Figura 24 representa a sequência de aminoácidos deduzida do BVH-NTHI12 de tamanho total da estirpe 12085 não tipável de H. influenzae; SEQ ID N°: 24. A Figura 25 representa a comparação das sequências de aminoácidos previstas das grelhas de leitura aberta de BVH-NTHI1 12085, 10095, A18 e A108 de H. influenzae por utilização do programa Clustal W do software de análise de sequência MacVector (versão 6.5). Debaixo do alinhamento, existe uma linha de consenso onde os caracteres (*) representam resíduos de aminoácidos idênticos e (. ) representam resíduos de aminoácidos conservados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona polinucleótidos purificados e isolados, que codificam polipéptidos de H. influenzae que podem ser utilizados para prevenir, tratar e/ou diagnosticar infecção por H. influenzae. A presente invenção proporciona doze polinucleótidos separados preferidos, cada um individualmente e separadamente definido por uma SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23. São também proporcionados na presente invenção doze polipéptidos separados, cada um individualmente e separadamente definido por uma SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24. Os especialistas na técnica entenderão que a invenção inclui polinucleótidos que codificam análogos, tais como mutantes, variantes, homólogos e derivados de tais polipéptidos, como aqui descritos no presente pedido de patente. A invenção também inclui moléculas de ARN que correspondem às moléculas de ADN da invenção. Além das moléculas de ADN e ARN, a invenção inclui os polipéptidos e os anticorpos monoespecificos correspondentes que se ligam especificamente a tais polipéptidos.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 70% de identidade com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem a identidade de, pelo menos, 80% com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem a identidade de, pelo menos, 85% com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem a 9 identidade de, pelo menos, 90% com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem a identidade de, pelo menos, 95% com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos;

De acordo com um aspecto, a presente refere-se a polinucleótidos que codificam uma porção contendo epitopo de um polipéptido que tem uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto, a presente refere-se a polinucleótidos que codificam uma porção contendo epitopo de um polipéptido que tem uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a porções contendo epitopo de um polipéptido que tem uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a porções contendo epitopo de um polipéptido que tem uma sequência 10 escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 .

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem, pelo menos, 70% de identidade com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem a identidade de, pelo menos, 80% com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem a identidade de, pelo menos, 85% com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem a identidade de, pelo menos, 90% com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem a identidade de, pelo menos, 95% com um segundo polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24. 11

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24;

De acordo com um aspecto, a presente refere-se a polinucleótidos que codificam uma porção contendo epitopo de um polipéptido que tem uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se também a polinucleótidos que codificam um polipéptido capaz de produzir anticorpos que têm especificidade de ligação para um polipéptido que tem uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se também a polinucleótidos que codificam um polipéptido capaz de produzir anticorpos que têm especificidade de ligação para um polipéptido que tem uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24. A percentagem de homologia é definida como a soma da percentagem de identidade mais a percentagem de semelhança ou conservação do tipo de aminoácido.

Pode-se utilizar um programa, tal como o programa CLUSTAL, para comparar sequências de aminoácidos. Este programa compara sequências de aminoácidos e encontra o alinhamento óptimo através da introdução de espaços em qualquer uma das sequências, como apropriado. É possível calcular a identidade ou semelhança (identidade mais conservação do tipo de aminoácido) de 12 aminoácidos para um alinhamento óptimo. Um programa como BLASTx irá alinhar a porção mais longa de sequências semelhantes e atribuir um valor ao ajuste. É assim possível obter uma comparação onde sejam encontradas diversas regiões de semelhança, cada uma tendo uma contagem diferente. Ambos os tipos de análise de identidade estão contemplados na presente invenção.

Numa forma de realização adicional, os polipéptidos de acordo com a presente invenção são antigénicos.

Numa forma de realização adicional, os polipéptidos de acordo com a presente invenção são imunogénicos.

Numa forma de realização adicional, os polipéptidos de acordo com a presente invenção induzem uma resposta imune num indivíduo.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se também a polipéptidos que são capazes de produzir anticorpos que têm especificidade de ligação para os polipéptidos da presente invenção, como definidos acima.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se também a polipéptidos capazes de produzir anticorpos que têm especificidade de ligação para um polipéptido que tem uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se também a polipéptidos capazes de produzir anticorpos que têm especificidade de ligação para um polipéptido que tem 13 uma sequência escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

Um anticorpo que "tem especificidade de ligação" é um anticorpo que reconhece e se liga ao polipéptido seleccionado, mas que substancialmente não reconhece nem se liga a outras moléculas numa amostra, e. g., uma amostra biológica. A ligação específica pode ser medida utilizando um ensaio de ELISA em que o polipéptido seleccionado é utilizado como um antigénio.

De acordo com a presente invenção, "protecção" nos estudos biológicos é definida como um aumento significativo na curva, taxa ou período de sobrevivência. A análise estatística utilizando o teste de Log rank para comparar curvas de sobrevivência e o teste exacto de Fisher para comparar taxas de sobrevivência e números de dias até à morte, respectivamente, podem ser úteis para calcular os valores de P e para determinar se a diferença entre os dois grupos é estatisticamente significativa. Valores de P de 0,05 são considerados como não significativos.

Num aspecto adicional da invenção são proporcionados fragmentos antigénicos/imunogénicos dos polipéptidos da invenção, ou dos seus análogos.

Os fragmentos da presente invenção devem incluir uma ou mais de tais regiões epitópicas ou serem suficientemente semelhantes a tais regiões para reter as suas propriedades antigénicas. Assim, para fragmentos de acordo com a presente invenção o grau de identidade é talvez irrelevante, uma vez que podem ser 100% idênticos a uma parte particular de um polipéptido ou de um seu análogo como aqui descrito. A presente invenção proporciona ainda fragmentos que têm, pelo menos, 10 resíduos de aminoácidos 14 contíguos das sequências polipeptídicas da presente invenção. Numa forma de realização, pelo menos, 15 resíduos de aminoácidos contíguos. Numa forma de realização, pelo menos, 20 resíduos de aminoácidos contíguos. A questão chave, uma vez mais, é que o fragmento retenha as propriedades antigénicas. O especialista entenderá que fragmentos, análogos ou derivados dos polipéptidos da invenção também terão utilização no contexto da presente invenção, i. e., como material antigénico/imunogénico. Assim, por exemplo, polipéptidos que incluem uma ou mais adições, deleções, substituições ou semelhantes estão abrangidos pela presente invenção.

Como aqui utilizados, "fragmentos", "análogos" ou "derivados" dos polipéptidos da invenção incluem aqueles polipéptidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado (de um modo preferido, conservado) e que pode ser natural ou artificial. Numa forma de realização, os derivados e análogos dos polipéptidos da invenção terão cerca de 70% de identidade com aquelas sequências ilustradas nas figuras ou nos seus fragmentos. Isto é, 70% dos resíduos são os mesmos. Numa forma de realização adicional, os polipéptidos terão mais de 80% de identidade. Numa forma de realização adicional, os polipéptidos terão mais de 90% de identidade. Numa forma de realização adicional, os polipéptidos terão mais de 95% de identidade. Numa forma de realização adicional, os polipéptidos terão mais de 99% de identidade. Numa forma de realização adicional, os análogos dos polipéptidos da invenção terão menos do que cerca de 20 substituições, modificações ou deleções de resíduos de aminoácidos e, de um modo mais preferido, menos de 10. 15

Numa forma de realização, os derivados e análogos dos polipéptidos da invenção terão cerca de 70% de homologia com aquelas sequências ilustradas nas figuras ou nos seus fragmentos. Numa forma de realização adicional, os derivados e análogos dos polipéptidos terão mais de 80% de homologia. Numa forma de realização adicional, os derivados e análogos dos polipéptidos terão mais de 90% de homologia. Numa forma de realização adicional, os derivados e análogos dos polipéptidos terão mais de 95% de homologia. Numa forma de realização adicional, os derivados e análogos dos polipéptidos terão mais de 99% de homologia. Numa forma de realização adicional, os derivados e análogos dos derivados e análogos dos polipéptidos da invenção terão menos do que cerca de 20 substituições, modificações ou deleções de resíduos de aminoácidos e, de um modo mais preferido, menos de 10.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 70% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 80% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 85% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos 16 escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 90% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 95% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos caracterizados por uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 70% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 80% de identidade com um 17 segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 85% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 90% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos que têm, pelo menos, 95% de identidade com um segundo polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos compreendendo uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona polipéptidos caracterizados por uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

Estas substituições são aquelas que têm uma influência mínima na estrutura secundária e na natureza hidropática do polipéptido. As substituições preferidas são aquelas conhecidas 18 na técnica como conservadas, i. e., os resíduos substituídos partilham propriedades físicas ou químicas, tais como hidrofobicidade, tamanho, carga ou grupos funcionais. Estas incluem substituições, tais como aquelas descritas por Dayhoff, M. em Atlas of Protein Sequence and Structure 5_, 1978 e por

Argos, P. em EMBO J. 8, 779-785, 1989. Por exemplo, os aminoácidos, naturais ou artificiais, que pertencem a um dos seguintes grupos representam alterações conservadoras: ala, pro, giy, gin, asn, ser, cys, ser, tyr, thr; vai, ile, leu, met, ala, phe; CO >1 1-1 arg, orn, his; e phe , tyr ·, trp >, his.

As substituições preferidas incluem também substituições de D-enantiómeros para os L-aminoácidos correspondentes.

De um modo preferido, um fragmento, análogo ou derivado de um polipéptido da invenção irá compreender, pelo menos, uma região antigénica, i. e., pelo menos, um epitopo.

Numa abordagem alternativa, os análogos podem ser polipéptidos de fusão, incorporando porções que tornam a purificação mais fácil, por exemplo, através de marcação eficaz do polipéptido desejado. Pode ser necessário remover o "marcador" ou pode ser o caso em que o próprio polipéptido de fusão retém antigenicidade suficiente para ser útil.

Assim, o que é importante para os análogos, derivados e fragmentos é que estes possuem, pelo menos, um grau da antigenicidade/imunogenicidade da proteína ou polipéptido a partir da qual são derivados. 19

Estão também incluídos polipéptidos que têm neles fundidos outros compostos que alteram as propriedades biológicas ou farmacológicas do polipéptido, i. e., polietilenoglicol (PEG) para aumentar a semi-vida, sequências de aminoácidos secretoras ou líder para facilitar a purificação, sequências prepro- e pro-e (poli)sacáridos.

Além disso, nessas situações em que se verifica que as regiões aminoacídicas são polimórficas, pode ser desejável variar um ou mais aminoácidos particulares para mimetizar mais eficazmente os diferentes epitopos das diferentes estirpes de H. influenzae.

Além disso, os polipéptidos da presente invenção podem ser modificados por acilação do terminal NH2 (e. g., por acetilação ou amidação com ácido tioglicólico, amidação do terminal carboxilo, e. g., com amónia ou metilamina) para proporcionar estabilidade, hidrofobicidade aumentada para ligação a um suporte ou outra molécula.

Estão também contemplados hetero e homo-multímeros polipeptídicos dos fragmentos e análogos dos polipéptidos. Estas formas poliméricas incluem, por exemplo, um ou mais polipéptidos que foram reticulados com agentes de reticulação, tais como avidina/biotina, glutaraldeído ou dimetilsuperimidato. Tais formas poliméricas incluem também polipéptidos contendo duas ou mais sequências contíguas em tandem ou invertidas, produzidas a partir de ARNm multicistrónicos gerados por tecnologia de ADN recombinante.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se também a polipéptidos quiméricos que compreendem um ou 20 mais polipéptidos ou fragmentos ou análogos ou seus derivados, como definidos nas figuras do presente pedido.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se também a polipéptidos quiméricos compreendendo dois ou mais polipéptidos que têm uma sequência escolhida de SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 ou seus fragmentos ou análogos; desde que os polipéptidos estejam ligados de modo a formar um polipéptido quimérico.

Numa forma de realização refere-se também a polipéptidos mais polipéptidos que têm SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, que os polipéptidos estejam polipéptido quimérico. adicional, a presente invenção quiméricos compreendendo dois ou uma sequência escolhida de 14, 16, 18, 20, 22 e 24; desde ligados de modo a formar um

De modo a conseguir a formação de polímeros antigénicos (i. e., multímeros sintéticos), podem ser utilizados polipéptidos que têm grupos bis-haloacetilo, nitroaril-halogenetos ou semelhantes, em que os reagentes são específicos para grupos tio. Deste modo, a ligação entre dois grupos mercapto dos diferentes péptidos pode ser uma ligação simples ou pode ser composta de um grupo ligante de, pelo menos, dois, tipicamente, pelo menos, quatro e não mais de 16, mas geralmente, não mais do que cerca de 14 átomos de carbono.

Numa forma de realização particular, os fragmentos ou análogos dos polipéptidos da invenção não contêm um resíduo inicial metionina (Met). De um modo preferido, os polipéptidos não irão incorporar uma sequência secretora ou líder (sequência de sinal). A porção de sinal de um polipéptido da invenção pode ser determinada de acordo com técnicas estabelecidas de biologia 21 molecular. Em geral, o polipéptido de interesse pode ser isolado a partir de uma cultura de Haemophilus e subsequentemente sequenciado para determinar o resíduo inicial da proteína madura e assim a sequência do polipéptido maduro. A seguinte Tabela A descreve as sequências de sinal dos polipéptidos da invenção como descritos nas Figuras.

Polipéptido SEQ ID N° Sinal de secreção BVH-NTHI1 2 MPVIRQVVFYDSLTGEQTKMKKFAGLITASFVA BVH-NTHI2 4 MKKLLKISAVSAALLSAPMMA BVH-NTHI3 6 MLMKLKATLTLAAATLVLAA BVH-NTHI4 8 MMNRRHFIQIGAT SILAL SANRFAMA BVH-NTHI5 10 MKKIILTLSLGLLTAWSAQI BVH-NTHI6 12 sem sinal de secreção BVH-NTHI7 14 MKKFLIAILLLILILAGAA BVH-NTHI8 16 MKMKKFILKSFLLATLGCVAFASMAQA BVH-NTHI9 18 MTMFKKISVLFFTLILAGCSSWS BVH-NTHI10 20 MSILLQGERFKKRLMPILLSMALAGCSNLLG BVH-NTHI11 22 MIRKLMKTPPFFTALFASAIFTLSVSQGVLG BVH-NTHI12 24 MKLKQLFAITAIA

De acordo com outro aspecto da invenção, é também proporcionada (i) uma composição de matéria contendo um polipéptido da invenção, conjuntamente com um veículo, diluente ou adjuvante; (ii) uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido da invenção e um veículo, diluente ou adjuvante; (iii) uma vacina compreendendo um polipéptido da invenção e um veículo, diluente ou adjuvante; (iv) um método para induzir uma resposta imune contra Haemophilus num indivíduo, por administração ao indivíduo de uma quantidade imunogenicamente 22 eficaz de um polipéptido da invenção para induzir uma resposta imune, e. g., uma resposta imune protectora contra Haemophilus; e particularmente, (v) um método para prevenir e/ou tratar uma infecção de Haemophilus, por administração de uma quantidade profiláctica ou terapêutica de um polipéptido da invenção a um indivíduo com a sua necessidade.

Antes da imunização, os polipéptidos da invenção podem também ser acoplados ou conjugados a proteínas veiculo, tais como toxina do tétano, toxina da difteria, antigénio de superfície do vírus da hepatite B, antigénio VPl do vírus da poliomielite ou qualquer outra toxina ou antigénio virai ou bacteriano ou quaisquer proteínas adequadas para estimular o desenvolvimento de uma resposta imune mais forte. Este acoplamento ou conjugação pode ser feito quimicamente ou geneticamente. Uma descrição mais detalhada da conjugação péptido-veículo está disponível em Van Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller S., Plaué S., "Synthetic polypeptides as antigens" em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 19 (ed.) Burdou, R.H. & Van Knippenberg P.H. (1988), Elsevier Nova Iorque.

De acordo com um outro aspecto, são também proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo um ou mais polipéptidos de Haemophilus da invenção numa mistura com um veículo, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Os adjuvantes adequados incluem (1) formulações de emulsão óleo-em-água, tais como MF59 , SAF , Ribi ; (2) adjuvante completo ou incompleto de

Freund; (3) sais, i. e., A1K(S04)2, AlNa(S04)2, A1NH4(S04)2, AI (OH)3, A1P04, sílica, caulino; (4) derivados de saponina, tais como Stimulon™ ou partículas daí geradas, tal como ISCOM (complexos imunoestimuladores); (5) citocinas, tais como interleucinas, interferões, factor estimulador de colónia de 23 macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF); (6) outras substâncias, tais como polinucleótidos de carbono, i. e., poli IC e poli AU, toxina da cólera desintoxicada (CTB) e toxina termolábil de E. coli para indução de imunidade da mucosa. Uma descrição mais detalhada de adjuvantes está disponível numa revisão por Μ. Z. I Khan et al. em Pharmaceutical Research, vol. 11, N° 1 (1994) PP2- 11, e também noutra revisão por Gupta et ai., em Vaccine, Vol. 13, N° 14, ppl263-12 76 (1995) e no documento WO 99/24578. Os adjuvantes preferidos incluem QuilA™, QS21™, Alhydrogel™ e Adjuphos™.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas parentericamente por injecção, infusão rápida, absorção nasofaringea, dermoabsorção ou bucal ou oral.

As composições farmacêuticas da invenção são utilizadas para o tratamento ou profilaxia de infecção por Haemophilus e/ou doenças e sintomas mediados por infecção com Haemophilus, como descrito em P.R. Murray (Ed, em Chief), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover e R.H. Yolken. Manual of Clinicai Microbiology, ASM Press, Washington, D.C., sétima edição, 1999, pl481-1482, que são aqui incorporados por referência. Numa forma de realização, as composições farmacêuticas da presente invenção são utilizadas para o tratamento ou profilaxia de otite média (aguda ou recorrente) , sinusite, bronquite, pneumonia, meningite e bacteremia. Numa forma de realização, as composições farmacêuticas da invenção são utilizadas para o tratamento ou profilaxia de infecção por Haemophilus e/ou doenças e sintomas mediados por infecção com Haemophilus. Numa forma de realização adicional, a infecção por Haemophilus é Haemophilus influenzae. Numa forma de realização adicional, a infecção por Haemophilus é Haemophilus influenzae não tipável. Numa forma de realização 24 adicional, a infecçao por Haemophilus é Haemophilus influenzae tipável.

Como utilizado no presente pedido, o termo "indivíduo" inclui mamífero. Numa forma de realização adicional, o mamífero é humano.

Numa forma de realização particular, as composições farmacêuticas são administradas àqueles indivíduos em risco de infecção por H. influenzae, tais como bebés, pessoas idosas e indivíduos imunocomprometidos.

As composições farmacêuticas são, de um modo preferido, em forma de dosagem unitária de cerca de 0,001 a 100 pg/kg (antigénio/peso corporal) e, de um modo mais preferido, 0,01 a 10 pg/kg e, de um modo muito preferido, 0,1 a 1 pg/kg, 1 a 3 vezes com um intervalo de cerca de 1 a 6 semanas entre imunizações.

As composições farmacêuticas são, de um modo preferido, na forma de dosagem unitária de cerca de 0,1 pg a 10 mg e, de um modo mais preferido, 1 pg a 1 mg e, de um modo muito preferido, 10 a 100 pg, 1 a 3 vezes com um intervalo de cerca de 1 a 6 semanas entre imunizações.

Numa forma de realização, os polinucleótidos são aqueles ilustrados nas SEQ ID N° : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23 que podem incluir as grelhas de leitura aberta (ORF), que codificam os polipéptidos da invenção.

Numa forma de realização adicional, polinucleótidos são aqueles ilustrados nas SEQ ID N°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 que codificam os polipéptidos da invenção. 25

Deve ser entendido que as sequências de polinucleótidos ilustradas nas figuras podem ser alteradas com codões degenerados, contudo ainda codificam o polipéptido da invenção. Consequentemente, a presente invenção proporciona ainda o polinucleótido aqui descrito acima (ou a sua sequência complementar) que tem 50% de identidade entre sequências. Numa forma de realização, pelo menos, 70% de identidade entre sequências. Numa forma de realização, pelo menos, 75% de identidade entre sequências. Numa forma de realização, pelo menos, 80% de identidade entre sequências. Numa forma de realização, pelo menos, 85% de identidade entre sequências. Numa forma de realização, pelo menos, 90% de identidade entre sequências. Numa forma de realização adicional, os polinucleótidos são hibridáveis sob condições restringentes, i. e., têm, pelo menos, 95% de identidade. Numa forma de realização adicional, mais de 97% de identidade.

As condições restringentes adequadas para hibridação podem ser prontamente determinadas por um especialista na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et ai., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2a ed, Cold Spring Harbor, N.I.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) Editado por Ausubel F.M. et al., John Wiley & Sons, Inc., N.I.).

Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona polinucleótidos que hibridam sob condições restringentes com: (a) uma sequência de ADN que codifica um polipéptido ou (b) o complemento de uma sequência de ADN que codifica um polipéptido; em que o referido polipéptido compreende a SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou seus fragmentos ou análogos. 26

Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona polinucleótidos que hibridam sob condições restringentes com: (a) uma sequência de ADN que codifica um polipéptido ou (b) o complemento de uma sequência de ADN que codifica um polipéptido; em que o referido polipéptido compreende, pelo menos, 10 resíduos de aminoácidos contíguos de um polipéptido compreendendo SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou seus fragmentos ou análogos.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona polinucleótidos que hibridam sob condições restringentes com: (a) uma sequência de ADN que codifica um polipéptido ou (b) o complemento de uma sequência de ADN que codifica um polipéptido; em que o referido polipéptido compreende a SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona polinucleótidos que hibridam sob condições restringentes com: (a) uma sequência de ADN que codifica um polipéptido ou (b) o complemento de uma sequência de ADN que codifica um polipéptido; em que o referido polipéptido compreende, pelo menos, 10 resíduos de aminoácidos contíguos de um polipéptido compreendendo SEQ ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24. 27

Como será prontamente entendido pelo especialista na técnica, os polinucleótidos incluem ADN e ARN. A presente invenção inclui também polinucleótidos complementares aos polinucleótidos descritos no presente pedido.

Num aspecto adicional, os polinucleótidos que codificam polipéptidos da invenção, ou os seus fragmentos ou análogos, podem ser utilizados num método de imunização de ADN. Isto é, podem ser incorporados num vector que é replicável e expressável após injecção produzindo assim o polipéptido antigénico in vivo. Por exemplo, os polinucleótidos podem ser incorporados num vector plasmidico sob controlo do promotor CMV que é funcional em células eucarióticas. De um modo preferido, o vector é injectado intramuscularmente.

De acordo com outro aspecto, é proporcionado um processo ou método de fabrico para produzir polipéptidos da invenção por técnicas recombinantes, através da expressão de um polinucleótido que codifica o referido polipéptido numa célula hospedeira e recuperação do produto polipeptidico expresso.

Alternativamente, os polipéptidos podem ser produzidos de acordo com técnicas estabelecidas de síntese química, i. e., síntese em fase de solução ou em fase sólida de oligopéptidos que são ligados para produzir o polipéptido completo (ligação de bloco). Métodos gerais para a obtenção e avaliação de

polinucleótidos e polipéptidos são descritos nas seguintes referências: Sambrook et ai., (1989) Molecular cloning: A

Laboratory Manual, 2a ed, Cold Spring Harbor, N.I.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) Editado por Ausubel F.M. et al., John Wiley & Sons, Inc., N.I.; PCR Cloning Protocols, 28 from Molecular Cloning to Genetic Engineering, (1997) Editado por white B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 490 páginas; Protein Purification, Principies and Practices, (1993) Scopes R.K., Springer-Verlag, N.I., 3a Edição, 380 páginas; Current Protocols in Immunology, (1999) Editado por Coligan J.E. et al., John Wiley & Sons Inc., N.I., que são aqui incorporados por referência.

Para a produção recombinante, as células hospedeiras são transfectadas com vectores que codificam os polipéptidos da invenção e depois cultivadas num meio nutriente modificado de forma apropriada para activar promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes. Os vectores adequados são aqueles que são viáveis e replicáveis no hospedeiro escolhido e incluem sequências de ADN cromossomal, não cromossomal e sintético, e. g., plasmídeos bacterianos, ADN fágico, baculovirus, plasmídeos de levedura, vectores derivados de combinações de plasmídeos e ADN fágico. A sequência do polipéptido pode ser incorporada no vector no local apropriado utilizando enzimas de restrição de modo que esteja operativamente ligada a uma região de controlo de expressão compreendendo um promotor, um local de ligação a ribossoma (região de consenso ou sequência de Shine-Dalgarno) e opcionalmente um operador (elemento de controlo). Podem-se seleccionar componentes individuais da região de controlo de expressão que são apropriados para um hospedeiro e vector dados de acordo com princípios estabelecidos de biologia molecular (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, N.I.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) Editado por Ausubel F.M. et al., John Wikey & Sons, Inc., N.I., aqui incorporados por referência). Os promotores adequados incluem, mas não estão limitados, ao promotor LTR ou SV40, promotores lac, tac ou trp de E. coli e o 29 promotor PL de fago lambda. Os vectores irão, de um modo preferido, incorporar uma origem de replicação, assim como marcadores de selecção, i. e., gene de resistência à ampicilina. Os vectores bacterianos adequados incluem pET, pQE70, pQE60, pQE-9, phagescript pDIO, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, ρΝΗΙβΑ, pNHl8A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 e os vectores eucarióticos pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL. As células hospedeiras podem ser bacterianas, i. e., E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; fúngicas, i. e., Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; levedura, i. e., Saccharomyces ou eucarióticas, i. e., CHO, COS.

Após expressão do polipéptido em cultura, as células são tipicamente recolhidas por centrifugação, depois, partidas por meios físicos ou químicos (se o polipéptido expresso for excretado no meio) e o extracto bruto resultante retido para isolar o polipéptido de interesse. A purificação do polipéptido a partir do meio de cultura ou lisado pode ser realizada através de técnicas estabelecidas dependendo das propriedades do polipéptido, i. e., utilizando precipitação com sulfato de amónio ou etanol, extracção ácida, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia com fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de hidroxilapatite e cromatografia de lectina. A purificação final pode ser realizada utilizando HPLC. 0 polipéptido pode ser expresso com ou sem uma sequência líder ou secretora. No primeiro caso, a sequência líder pode ser removida utilizando processamento pós-tradução (ver documentos U.S. 4431739, U.S. 4425437 e U.S. 4338397, aqui incorporados por referência) ou ser removida quimicamente após purificação do polipéptido expresso. 30

De acordo com um aspecto adicional, os polipéptidos de Haemophilus da invenção podem ser utilizados num teste de diagnóstico para infecção por H. influenzae, em particular para infecção por H. influenzae. São possíveis vários métodos de diagnóstico, por exemplo, detectando o organismo Haemophilus numa amostra biológica, o seguinte processo pode ser seguido: a. obter uma amostra biológica a partir de um indivíduo; b. incubar um anticorpo ou um seu fragmento reactivo com um polipéptido de Haemophilus da invenção com a amostra biológica para formar uma mistura e c. detectar o anticorpo especificamente ligado ou o fragmento ligado na mistura que indica a presença de Haemophilus.

Alternativamente, um método para a detecção de anticorpo específico para um antigénio de H. influenzae numa amostra biológica, contendo ou suspeita de conter o referido anticorpo, pode ser realizado como se segue: a. obter uma amostra biológica a partir de um indivíduo; b. incubar um ou mais polipéptidos de H. influenzae da invenção ou os seus fragmentos com a amostra biológica para formar uma mistura; e c. detectar o antigénio especificamente ligado ou o fragmento ligado na mistura que indica a presença do anticorpo específico para H. influenzae.

Um especialista na técnica entenderá que este teste de diagnóstico pode tomar várias formas, incluindo um teste imunológico, tais como um imunoensaio de adsorção ligado à enzima (ELISA), um radioimunoensaio ou um ensaio de aglutinação de latex, essencialmente para determinar se os anticorpos específicos para os polipéptidos estão presente num organismo. 31

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para o tratamento profiláctico ou terapêutico de otite média, sinusite, bronquite, pneumonia e meningite e bacteremia, compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade terapêutica ou profiláctica de uma composição da invenção.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para o tratamento profiláctico ou terapêutico da infecção bacteriana de Haemophilus influenzae num indivíduo susceptível à infecção de Haemophilus influenzae, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapêutica ou profiláctica de uma composição da invenção. Numa forma de realização adicional, Haemophilus influenzae é Haemophilus influenzae não tipável. Numa forma de realização adicional, Haemophilus influenzae é Haemophilus influenzae tipável.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para o diagnóstico de otite média, sinusite, bronquite, pneumonia e meningite e bacteremia, compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade terapêutica ou profiláctica de uma composição da invenção.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para o diagnóstico de infecção bacteriana de Haemophilus influenzae num indivíduo susceptível à infecção de Haemophilus influenzae, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapêutica ou profiláctica de uma composição da invenção. Numa forma de realização adicional, Haemophilus influenzae é Haemophilus influenzae não tipável. Numa forma de realização adicional, Haemophilus influenzae é Haemophilus influenzae tipável. 32

De acordo com um aspecto adicional, a invenção refere-se à utilização de uma composição farmacêutica da invenção para o tratamento profiláctico ou terapêutico da infecção de Haemophilus, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade profiláctica ou terapêutica da composição.

De acordo com um aspecto adicional, os polipéptidos de Haemophilus da invenção podem ser utilizados num kit compreendendo os polipéptidos da invenção para a detecção de diagnóstico da infecção de Haemophilus.

As sequências de ADN que codificam polipéptidos da invenção podem também ser utilizadas para conceber sondas de ADN para utilização na detecção da presença de H. influenzae numa amostra biológica suspeita de conter tais bactérias. 0 método de detecção desta invenção compreende: a. obter a amostra biológica a partir de um indivíduo; b. incubar uma ou mais sondas de ADN que têm uma sequência de ADN que codifica um polipéptido da invenção ou os seus fragmentos, com a amostra biológica para formar uma mistura; e c. detectar a sonda de ADN especificamente ligada na mistura que indica a presença da bactéria H. influenzae.

As sondas de ADN desta invenção podem também ser utilizadas para detectar H. influenzae circulante (i. e., ácidos nucleicos de H. influenzae) numa amostra, por exemplo, utilizando uma reacção em cadeia da polimerase, como um método de diagnóstico de infecções de H. influenzae. A sonda pode ser sintetizada utilizando técnicas convencionais e pode ser imobilizada numa fase sólida ou pode ser marcada com um marcador detectável. Uma sonda de ADN preferida para este pedido é um oligómero que tem 33 uma sequência complementar a, pelo menos, cerca de 6 nucleótidos contíguos dos polipéptidos de H. influenzae da invenção.

Um outro método de diagnóstico para a detecção de H. influenzae num indivíduo compreende: a. marcar um anticorpo reactivo a um polipéptido da invenção ou seu fragmento com um marcador detectável; b. administrar o anticorpo marcado ou o fragmento marcado ao indivíduo; e c. detectar o anticorpo marcado ou o fragmento marcado especificamente ligado no indivíduo, o que indica a presença de H. influenzae.

Um aspecto adicional da invenção é a utilização dos polipéptidos de Haemophilus da invenção como imunogénios para a produção de anticorpos específicos para o diagnóstico e, em particular, para o tratamento da infecção por H. influenzae. Os anticorpos adequados podem ser determinados utilizando métodos de rastreio apropriados, por exemplo, através de medição da capacidade de um anticorpo particular para proteger passivamente contra infecção por H. influenzae num modelo de teste. Um exemplo de um modelo animal é o modelo de murganho descrito no exemplo aqui apresentado. 0 anticorpo pode ser um anticorpo completo ou um seu fragmento de ligação a antigénio e pode pertencer a qualquer classe de imunoglobulinas. 0 anticorpo ou o fragmento pode ser de origem animal, especificamente de origem mamífera e, mais especif icamente, de origem murina, de rato ou humana. Pode ser um anticorpo natural ou um seu fragmento, ou se desejado, um anticorpo recombinante ou um fragmento de anticorpo. A expressão anticorpo recombinante ou fragmento de anticorpo significa anticorpo ou fragmento de anticorpo que foi produzido utilizando técnicas de biologia molecular. 0 anticorpo 34 ou fragmentos de anticorpo podem ser policlonais ou, de um modo preferido, monoclonais. Pode ser especifico para vários epitopos associados com os polipéptidos de H. influenzae, mas é, de um modo preferido, especifico para um.

Um aspecto adicional da invenção é a utilização de uma composição farmacêutica da invenção para o tratamento profiláctico ou terapêutico da infecção por Haemophilus, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade profiláctica ou terapêutica da composição.

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por um técnico com conhecimento geral na matéria a que esta invenção pertence.

ISOLAMENTO DE POLIPÉPTIDOS DE H. INFLUENZAE NÃO TIPÁVEL (NTHI) E IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE CODIFICAM ESTES POLIPÉPTIDOS

ISOLAMENTO DE POLIPÉPTIDOS DE NTHI EXPOSTOS À SUPERFÍCIE

Estirpes bacterianas

Os isolados clínicos 12085 e 10095 de H. influenzae não tipável foram fornecidos por D.M. Granoff (St-Louis, Missouri) e B-20, AI8, A108, C-98, C-26 e B-31 pelo Centre de Recherche en

Infectiologie do Centre Hospitalier da Université Lavai. O H. influenzae não tipável 12085 foi isolado a partir de sangue de uma criança com infecção do tracto respiratório inferior no Paquistão. 35

Foi utilizada Escherichia coli DH5a (GIBCO BRL, Burlington, Ontário) como a estirpe hospedeira para ADN recombinante. Foi utilizada E. coli XLl-Blue MRF' (Stratagene, LaJolla, Califórnia) como a estirpe hospedeira para infecção com o vector fágico lambda ZAP Express. Foi utilizada E. coli XLOLR (Stratagene) como a estirpe hospedeira para infecção com lambda ZAP Express filamentoso excisado in vivo.

Antissoros

Os antissoros de murganhos foram produzidos após imunização subcutânea com intervalos de três semanas, com proteínas da membrana externa na presença de adjuvantes completos ou incompletos de Freund (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) . Os soros foram recolhidos 21 dias após a imunização terciária.

Quatro antissoros humanos foram seleccionados com base na sua reactividade por ELISA e transferência de Western em H. influenzae 12085 não tipável, mortos com calor.

Construção e rastreio da biblioteca de H. influenzae O ADN de H. influenzae 12085 não tipável foi extraído utilizando um Kit de extracção genómica (QIAgen) . 0 ADN foi digerido parcialmente com Tsp509l e ligado a braços fágicos λ-ΖΑΡ Expresso digeridos com FcoRI (Stratagene). A ligação foi empacotada in vitro com extractos de Gigapack de acordo com as recomendações do fabricante (Stratagene). O fago recombinante foi plaqueado em E. coli XLl-Blue MRF' a uma densidade de 36 2,5 x IO4 PFU/placa de 150 mm (diâmetro). Após oito horas de incubação, as placas foram sobrepostas com discos de nitrocelulose e os discos resultantes foram processados para imunotransferência com soros de humano e de murganho. Os clones positivos foram recolhidos e purificados em placa. Os plasmídeos recombinantes pBK-CMV que codificam para genes de interesse de Haemophilus foram recuperados a partir do bacteriófago purificado utilizando o fago filamentoso auxiliar ExAssist e a estirpe XLOLR de E. coli resistente a lambda por excisão in vivo.

Identificação de antigénios SDS-PAGE e análise de imunotransferência dos lisados destas E. coli recombinantes mostrou que cada clone expressou um ou mais polipéptidos que reagiram com antissoros de humano ou de murganho.

Sequenciação de ADN e análise de sequência

Os clones genómicos foram sequenciados com o kit de sequenciação Taq DyeDeoxy Terminator Cycle (Applied Biosystem, Foster City, Califórnia). Vários iniciadores internos foram concebidos para sequenciar mais nas inserções clonadas. A montagem das sequências foi realizada utilizando o software Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan) e a análise de sequência foi realizada com o software McVector (Oxford Molecular Ltd., Campbell, Califórnia). 37 EXEMPLO 1

Este exemplo ilustra a clonagem de genes de H. influenzae não tipável num vector de expressão

As regiões codificantes dos genes BVH-NTHI1 a BVH-NTHI12 de H. influenzae não tipável (SEQ ID N°: 1, 3, 5, 1, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 e 23) foram amplificadas por PCR (sistema de PCR DNA Thermal Cycler GeneAmp 2400 da Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico da estirpe 12085 de H. influenzae não tipável, através de utilização dos seguintes iniciadores oligonucleotidicos que continham extensões de base para a adição de locais de restrição IVcol (CCATGG) , NdeI (CATATG) , Sall (GTCGAC) ou Xhol (CTCGAG) (Tabela 1). Os produtos de PCR foram purificados a partir de géis de agarose por utilização de um kit de extracção de gel QIAquick da QIAgen, seguindo as instruções do fabricante (Chatsworth, CA) e digeridos com as endonucleases de restrição apropriadas (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfé, Canadá). Os vectores pET (Novagen, Madison, Wisconsin) foram digeridos do mesmo modo e purificados a partir de géis de agarose utilizando um kit de extracção de gel QIAquick da QIAgen (Chatsworth, Califórnia). Os produtos de PCR digeridos foram ligados ao vector de expressão pET digerido com enzimas de restrição. Os produtos ligados foram transformados na estirpe DH5oí de E. coli [D80dIacZAM15 Δ (lacZYA-argF) U169 endAl recAl hsdRl7 (rK-mK+) deoR thi-1 supE44 X~gyrA96 relAl] (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) de acordo com o método de Simanis (Hanahan D. (1985) Em: DNA Cloning. D.M. Glover, ed., IRL Press, Washington D.C. vol. 1 pp. 109-135). Os plasmideos contendo genes recombinantes (rpET) foram purificados utilizando um kit QIAgen (Chatsworth, Califórnia) e as inserções de ADN foram sequenciadas (kit de sequênciação Taq Dye Deoxy Terminator Cycle, ABI, Foster City, Califórnia). 38

Tabela 1. Lista de iniciadores oligonucleotídicos para clonagem de ADN.

Conjunto de Iniciadores de PCR Seq. ID. Sequência 5 '-3 ' Posição do nucleótido * Locais de restrição Estirpe do vector de Clonagem HAMJ 3 4 2- 25 CAAGGCGTTTTCAT ATGCCTGTCATTCG GCAGG 1-1137 Nde I pET21-b+ Tuner (DE3) HAMJ 3 43 26 CTAATTGACCTCGA GTTTTGCTGCTTTT AATTCTTGATAATA TTG Xho I HAMJ 3 4 5- 27 GTAAGGAAACATAC ATATGAAAAAACT T TTAAAAATTAGTG 1-1005 Nde I pET21-b+ BL21 (DE3) HAMJ 3 4 4 28 T T AGAGACTCGAGT TTAGCTAAACATTC TATGTAGCTATC Xho I HAMJ 3 4 8- 29 CCTAACATTGACAT ATGCTTATGAAACT AAAAGCAACA 1-1647 Nde I pET21-b+ AD494 (DE3) HAMJ 3 4 9 30 TCAATATCTCGAGT TTACCATCAACACT CACACC Xho I 39 (continuação)

Conjunto de Iniciadores de PCR Seq. ID. Sequência 5 '-3 ' Posição do nucleótido * Locais de restrição Estirpe do vector de Clonagem HAMJ 3 4 6- 31 CTAATAAGGAAAAC CATATGAT GAACAG ACGTCATTTTATTC 1-1971 Nde I pET21-b+ Tuner (DE3) HAMJ3 9 9 32 GACCTAGCTCGAGT TTAGATAAATCAAT TTGATACACTG Xho I HAMJ 3 7 6- 33 CATAAGGAGTAACA TATGAAAAAAATTA TTTTAACATTATC 1-480 Nde I pET21-b+ Tuner (DE3) HAMJ3 7 7 34 GTGCAGATTCTCGA GTTTTTTATCAACT GAA Xho I HAMJ460- 35 CTGGACAGACCATA TGCCTTCTGATTTA GTCGC 2-936 Nde I pET21-b+ Tuner (DE3) HAMJ461 36 CTAAATTGAGCTCG AGATTAGTTTTTAA TTTACTCC XHo I 40 (continuação)

Conjunto de Iniciadores de PCR Seq. ID. Sequência 5 '-3 ' Posição do nucleótido * Locais de restrição Estirpe do vector de Clonagem HAMJ 45 8-HAMJ459 37 38 CTTTCTTATAGCAT ATGAAGAAATTTTT AATTGCGATT CTTCCGCACTCGAG TTTGGCATTTTTC 1-1041 Nde I Xho I pET21-b+ Tuner (DE3) pLysS HAMJ 4 7 7- 39 GGAAGGAGCTAGCA T GAAAAT GAAAAAA TTTATTC 1-939 Nhe I pET21-b+ Tuner (DE3) HAMJ 4 7 8 40 TTGATACTCTCGAG TTTATTAAAATACT G Xho I HAMJ 4 81- 41 CTTTAATCACATAT GACTATGTTTAAAA AAATCTCTG 1-534 Nde I pET21-b+ HAMJ 4 8 2 42 CACCAATCTCGAGT TTAGATGTACAGGC TT Xho I 41 (continuação)

Conjunto de Iniciadores de PCR Seq. ID. Sequência 5 '-3 ' Posição do nucleótido * Locais de restrição Estirpe do vector de Clonagem HAMJ78- 43 ACCCGCATGGCTGT TCAAATCTACTTGG TAG 75-1728 Nco I pET32-c+ AD494 (DE3) HAMJ79 44 ACTCGTCGACTTAG TTTGCAACTGGTAC AAT Sal 1 HAMJ414- 45 GAT TAGGGAAAACA TATGATTAGGAAAC TTATGAA 1-3336 Nde 1 pET21-b+ HAMJ415 46 CCATAATTTGCTCG AGTTTTTTTACATC AAC Xho 1 HAMJ450- 47 GGAAGGAGCTAGCA TGAAATTAAAACAA CTTTTTG 1-816 Nhe 1 pET21-b+ Tuner (DE3) HAMJ411 48 GTGCGGTAGCTCGA GCCAACCTTTTAC Xho I * A posição do nucleótido indica o resultado da clonagem, i. e., o comprimento e a posição na Figura 1 dos produtos de PCR. 42 EXEMPLO 2

Este exemplo descreve a amplificação por PCR e a sequenciação do gene BVH-NTHI1 a partir de outras estirpes de H. influenzae não tipáveis e a avaliação do nível de conservação molecular deste gene.

As respectivas regiões codificantes do gene BVH-NTHI1 de H. influenzae não tipável a partir destas estirpes foram amplificadas por PCR (sistema de PCR DNA Thermal Cycler GeneAmp 2400 da Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico utilizando os seguintes oligos: HAMJ342 (5'-CAAGGCGTTTTCA TATGCCTGTCATTCGGCAGG-3'); HAMJ343 (5'-CTAATTGACCTCGAGTTTTGCT GCTTTTAATTCTTGATAATATTG-3'). Os produtos de PCR foram purificados a partir de géis de agarose utilizando um kit de extracção de gel QIAquick da QIAgen, seguindo as instruções do fabricante (Chatsworth, CA) e as inserções de ADN foram sequenciadas (kit de sequênciação Taq Dye Deoxy Terminator Cycle, ABI, Foster City, CA) . O comprimento dos fragmentos de PCR gerados para todas estas oito estirpes foi idêntico. Comparações par-a-par dos nucleótidos e das sequências de aminoácidos previstas de quatro destas estirpes (12085, 10095, A18 e A108) revelaram uma identidade de 99% como mostrado na Figura 25. EXEMPLO 3

Este exemplo ilustra a produção e purificação do polipéptido BVH-NTHIl recombinante de H. influenzae não tipável. 43 0 plasmídeo pET21-b+ recombinante com o gene BVH-NTHI1 que corresponde à SEQ ID N°: 1 foi utilizado para electrotransformar (dispositivo Gene Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) a estirpe Tuner(DE3) de E. coli [F“ ompT, hsdS (rb, mb) , gal, dcn, lacYI(DE3)] (Novagen, Madison, Wisconsin). Dentro desta estirpe de E. coli, a expressão controlada pelo promotor T7 do polipéptido recombinante é reconhecida especificamente pela T7 RN A polimerase (presente no profago ÀDE3) cujo gene está sob controlo do promotor lac que é induzivel por isopropil-p-d-tio-galactopiranósido (IPTG). 0 transformante Tuner(DE3)/rpET21 foi cultivado a 37 °C com agitação a 250 rpm em caldo LB (peptona 10 g/L, extracto de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L) contendo 100 pg/mL da carbenicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canadá), até a A60o alcançar um valor de 0,5. De modo a induzir a produção de polipéptido recombinante BVH-NTHIl-His«Marcador de H. influenzae não tipável, as células foram incubadas durante mais 3 horas a 30 °C, na presença de IPTG a uma concentração final de 1 mM. As células induzidas de uma cultura de 500 mL foram sedimentadas por centrifugação e congeladas a -70 °C.

A purificação dos polipéptidos recombinantes a partir da fracção citoplasmática solúvel de Tuner(DE3)/rpET21 induzida por IPTG, foi realizada por cromatografia de afinidade com base nas propriedades da sequência His«Marcador (6 resíduos consecutivos de histidina) para se ligar a catiões divalentes (Ni2+) imobilizados na resina quelante de metal His«Ligante. Resumidamente, as células sedimentadas obtidas a partir de uma cultura induzida por IPTG de 500 mL foram ressuspensas em tampão de lise (20 mM de Tris, 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazole, pH 7,9) contendo 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF; Sigma), sonicadas e centrifugadas a 16000 X g durante 30 minutos para remover restos. 0 sobrenadante foi depositado numa coluna de agarose Ni-NTA (QIAgen, Mississauga, Ontário, Canadá). O 44 polipéptido recombinante BVH-NTHIl-His«Marcador de H. influenzae não tipável foi eluído com 250 mM de imidazole-500 mM de NaCl-20 mM de Tris pH 7,9. A remoção do sal e do imidazole a partir da amostra foi realizada por diálise contra PBS a 4 °C. A quantidade de polipéptido recombinante obtida a partir da fracção solúvel de E. coli foi estimada por MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois). EXEMPLO 4

Este exemplo ilustra a análise da imunogenicidade e da capacidade protectora de murganhos contra infecção de H. influenzae não tipável, após imunização com BVH-NTHI1.

Grupos de 5 murganhos BALB/c fêmeas (Charles River, Ontário, Canadá) foram imunizados intranasalmente três vezes, em intervalos de duas semanas, com 25 pg de polipéptido recombinante BVH-NTHIl-His«Marcador purificado por afinidade na presença de adjuvante de toxina termolábil de E. coli (LT; 1 pg; Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) ou como um controlo, apenas com adjuvante em PBS. As amostras de sangue foram recolhidas a partir do seio orbital, no dia antes de cada imunização e 14 dias após a terceira injecção (dia 42). Os títulos de anticorpo foram determinados por ELISA em células mortas com calor e em vesículas da membrana externa da estirpe 12085 de H. influenzae não tipável. O anticorpo secundário utilizado foi um IgG + IgM (H+L) (específico de Fc) anti-murganho de cabra conjugado com fosfatase alcalina (Jackson Immunoresearch Labs, Mississauga, Ontário). O título reactivo de um anti-soro foi definido como o inverso da diluição que mostra 45 um aumento de duas vezes na absorvência, relativamente àquela obtida com a amostra de soro pré-imune. Para investigar se as respostas imunes induzidas por BVH-NTHI1 foram funcionalmente significativas, foi avaliada a eficácia protectora in vivo 14 dias mais tarde, em murganhos desafiados intrapulmonarmente com aproximadamente 2 x 105 CFU da estirpe 12085 de H. influenzae não tipável. Amostras do inoculo do desafio de H. influenzae não tipável foram plaqueadas em placas de ágar de chocolate para verificar a dose do desafio. Para medir a eficácia da vacinação na limitação do crescimento in vivo de H. influenzae não tipável, os murganhos foram sacrificados através de uma injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (Euthanyl™) , 5 h após a infecção. As lavagens bronco-alveolares foram avaliadas para eliminação bacteriana através de plaqueamento de diluições em série para determinação da contagem bacteriana. Os murganhos injectados apenas com adjuvante foram utilizados como controlos negativos.

Os resultados do estudo de imunogenicidade (Tabela 2) mostraram que o nivel de anticorpos específicos no soro de animais imunizados aumentou em cerca de 1000 vezes, relativamente ao soro de controlo. O titulo médio medido em OMP e em amostras mortas com calor divergiu por apenas uma diluição, confirmando que o polipéptido BVH-NTHI1 representa realmente um antigénio de superfície exposta. 46

Tabela 2. Efeito de imunização sistémica nos niveis de anticorpo dirigido a NTHI no soroa NTHI 12085 Titulo de ELISA Controlo Imune Polipéptidos da 200 184 320 membrana externa Mortas com calor 360 368 640 a) As amostras de soro foram recolhidas a partir de murganhos imunes e de controlo no dia 42 do regime de imunização.

Os resultados do estudo de protecção (Tabela 3) mostraram que a estirpe 12085 prontamente se multiplicou nos pulmões dos animais de controlo, de modo que 5 horas pós-desafio, o número de células viáveis de H. influenzae não tipável tinha aumentado em 200%. Pelo contrário, foi claramente evidente eliminação pulmonar substancial da estirpe 12085 pelos murganhos imunizados com BVH-NTHI1, enquanto apenas 35% do número original de organismos depositados nos pulmões dos animais imunes foi recuperado em 5 horas pós-desfio.

Tabela 3. Efeito da imunização sistémica na eliminação pulmonar de H. influenzae não tipável 12085a.

Murganhos BALB/c H. influenzae nao tipável 12085 (x 104) CFU 0 h 5 h Controlo 4, 6 9,2 Imunizados nd a) Cada valor representa uma média de cinco animais em cada tempo. b) **P < 0, 0098, calculado de acordo com o teste t desemparelhado com a correcção de Welch e comparado ao controlo. EXEMPLO 5

Este exemplo ilustra o reconhecimento de polipéptidos recombinantes da estirpe 12085 de H. influenzae não tipável por soros humanos e por antissoros de murganhos protegidos.

Foi utilizada uma técnica convencional de transferência de Western para investigar se os polipéptidos recombinantes purificados foram reconhecidos por soros humanos. Além disso, os antissoros de murganhos imunizados com preparações de proteinas da membrana externa foram testados contra os polipéptidos recombinantes purificados. Os murganhos imunizados com estas preparações demonstraram eliminação pulmonar aumentada após um desafio com a estirpe 12085 de H. influenzae não tipável. Para a preparação dos antigénios, os polipéptidos recombinantes purificados foram tratados com tampão de amostra contendo SDS e 2-mercaptoetanol durante 5 minutos a 100 °C. Os polipéptidos foram separados por SDS-PAGE de acordo com o método de Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature, 227 :680-685. Após SDS-PAGE, os polipéptidos foram transferidos electroforeticamente do gel para papel de nitrocelulose pelo método (Towbin, H., Staehelin, T. e Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76 :4350-4354) e sondados com antissoros humanos ou de murganho. A detecção de antigénios reactivos com os anticorpos foi realizada por imunoensaio de enzima indirecto utilizando imunoglobulinas anti-murganho ou anti-humano conjugadas e um substrato corado. Os resultados na Tabela 4 mostram que a maioria dos polipéptidos tinha já sido visto pelo sistema imune humano. Como candidatos a vacina, estes polipéptidos têm assim um potencial para induzir uma resposta 48 imune forte em humanos. Além disso, a maioria dos polipéptidos foram reconhecidos por soros de murganhos protegidos. As reactividades do soro correlacionam-se com a eliminação pulmonar aumentada no modelo de murganho de infecção.

Tabela 4. As reactividades de soros humanos normais e antissoros de murganhos protegidos com polipéptidos recombinantes de H. influenzae 12085 não tipável. SEQ ID Polipéptido Reactividade sérica3 Humano Murganho Eliminação pulmonar (%)b 2 BVH-NTHI1 ++ +++ 65 4 BVH-NTHI2 + +++ 36 6 BVH-NTHI3 + ++ 56 8 BVH-NTHI4 ++ +++ 98 10 BVH-NTHI5 - ++ ndc 16 BVH-NTHI8 - + nd 18 BVH-NTHI9 + + + + nd 20 BVH-NTHI10 + + + + + + 44 24 BVH-NTHI12 + + + + - 20 a) 0 número de + indica a intensidade da reacçao 0 sinal indica sem reacção b) Os murganhos foram imunizados com os polipéptidos recombinantes respectivos e a eliminação pulmonar foi medida como no Exemplo 4 c) nd, não realizado LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS 49 <110> SHIRE BIOCHEM INC. HAMEL, Josee COUTURE, France BRODEUR, Bernard R. MARTIN, Denis

<12 0> ANTIGÉNIOS DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE E FRAGMENTOS DE ADN CORRESPONDENTES <130> 484112.440EP1 <150> PCT/CAO1/01402 <151> 2001-10-02 <150> 60/236712 <151> 2000-10-02 <160> 51 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 1140 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae 50 <40 0> 1 atgcctgtca ttcggcaggt ggttttttac gactctttaa caggagaaca aacaaaaatg 60 aaaaaatttg caggtttaat tactgccagc ttcgtagctg caactttaac cgcttgcaac 120 gataaagatg ctaagcaaga aactgcaaaa gctacggctg ctgctaatga cactgtgtat 180 ctctacactt ggacagaata tgtaccagat ggtcttttag atgagtttac taaagaaact 240 ggcatcaaag ttatcgtttc aagcctagaa tcaaacgaaa caatgtacgc aaaactcaaa 300 actcaaggcg agtctggtgg ctatgatgtt atcgcacctt ctaactactt cgtttctaaa 360 atggcacgcg aaggaatgtt aaaagaactt gatcacagca aattacctgt tcttaaagaa 420 ttagatcctg attggctcaa taaaccttat gataaaggta acaaatactc tcttccgcaa 480 cttttaggtg cgccgggtat cgcattcaat accaacactt acaaaggcga acaattcact 540 tcttgggcag acttatggaa acctgaattt gcaaacaaag ttcagttatt agacgatgcg 600 cgcgaagtat tcaacatcgc tttattgaaa attggtcaag atccaaatac tcaagatcca 660 gccattatca aacaagccta tgaagaatta ttgaaattac gtccaaatgt actttctttc 720 aattccgata acccagctaa ctcgttcatc tcaggcgaag tggaagtggg tcaattatgg 780 aatggttcgg tacgtattgc taaaaaagaa aaagcacctt taaatatggt attcccaaaa 840 gagggtcctg tactttgggt tgatacactt gcaattcctg taacagctaa aaatcctgaa 900 ggcgcacaca agctgattaa ctacatgtta gggaaaaaaa cagctgaaaa attaacctta 960 gctatcggtt acccaacctc aaatattgaa gcgaaaaaag cattaccaaa agaaatcact 1020 gaagatccag cgatttatcc gtcagctgat atattaaaaa atagtcactg gcaagatgac 1080 gttggcgatg caattcaatt ctatgaacaa tattatcaag aattaaaagc agcaaaataa 1140

<210> 2 <211> 379 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> SINAL <222> (1)..(33) <400> 2

Met Pro vai ile Arg Gin vai vai Phe Tyr Asp Ser Leu Thr Gly Glu 15 10 15

Gin Thr Lys Met Lys Lys Phe Ala Gly Leu Ile Thr Ala Ser Phe vai 20 25 30

Ala Ala Thr Leu Thr Ala Cys Asn Asp Lys Asp Ala Lys Gin Glu Thr 35 40 45

Ala Lys Ala Thr Ala Ala Ala Asn Asp Thr vai Tyr Leu Tyr Thr Trp 50 55 60

Thr Glu Tyr vai Pro Asp Gly Leu Leu Asp Glu Phe Thr Lys Glu Thr 65 70 75 80

Gly Ile Lys vai Ile vai Ser Ser Leu Glu ser Asn Glu Thr Met Tyr 85 90 95

Ala Lys Leu Lys Thr Gin Gly Glu Ser Gly Gly Tyr Asp Vai ile Ala 100 105 K no

Pro Ser Asn Tyr Phe Vai Ser Lys Met Ala Arg Glu Gly Met Leu Lys 115 120 125

Glu Leu Asp His Ser Lys Leu Pro Vai Leu Lys Glu Leu Asp Pro Asp 130 135 140

Trp Leu Asn Lys Pro Tyr Asp Lys Gly Asn Lys Tyr ser Leu Pro Gin 145 150 155 160 51

Leu Leu Glv Ala Pro Glv lie Ala Phe Asn Thr Asn Thr Tyr Lys^jlyl 165 170 π . !75

Glu Gin Phe Thr Ser Trp Ala Asp Leu Trp Lys Pro Glu Phe Ala Asn 180 185 1?0

Lys Val Gin Leu Leu Asp Asp Ala Arg Glu Vai Phe Asn Ile Ala Leu 195 200 205

Leu Lys Ile Gly Gin Asp Pro Asn Thr Gin Asp Pro Ala Ile Ile Lys 210 215 220

Gin Ala Tyr Glu Glu Leu Leu Lys Leu Arg Pro Asn val Leu Ser Phe 225 230 235 240

Asn Ser Asp Asn Pro Ala Asn Ser Phe ile Ser Gly Glu val Glu Val 245 250 255

Gly Gin Leu Trp Asn Gly Ser Val Arg Ile Ala Lys Lys Glu Lys Ala 260 265 270

Pro Leu Asn Met val Phe Pro Lys Glu Gly Pro val Leu Trp val Asp 275 280 285

Thr Leu Ala Ile Pro Val Thr Ala Lys Asn Pro Glu Gly Ala His Lys 290 295 300

Leu Ile Asn Tyr Met Leu Gly Lys Lys Thr Ala Glu Lys Leu Thr Leu 305 310 315 n 320

Ala ile Gly Tyr Pro Thr Ser Asn ile Glu Ala Lys Lys Ala Leu Pro 325 330 335

Lys Glu Ile Thr Glu Asp Pro Ala Ile Tyr Pro Ser Ala Asp ile Leu 340 345 350

Lys Asn ser His Trp Gin Asp Asp val Gly Asp Ala Ile Gin Phe Tyr 355 360 365

Glu Gin Tyr Tyr Gin Glu Leu Lys Ala Ala Lys 370 375 <210> 3 <211> 1008

<212> ADN <213> Haemophilus influenzae <400> 3 atgaaaaaac ttttaaaaat tagtgccgtt tctgccgcac ttttaagtgc gccaatgatg 60 gcgaatgccg atgtattagc atcagtaaaa cctttaggct ttattgtttc atctattgca 120 gatggcgtaa ctggtacaca agtccttgtt cctgctggcg cctctccgca tgattacaat 180 ttgaaattat ctgatattca aaaagtaaaa tctgcagatt tagttgtatg gattggtgaa 240 gacattgatt cattcttaga caaaccaatt agccaaattg aacgtaaaaa agtgattacc 300 attgccgatc ttgcggatgt aaaaccttta ttaagtaaag ctcaccacga gcatttccat 360 gaagatggcg atcatgatca tgaccataag cacgaacaca aacatgatca taaacatgac 420 catgaccatg atcataaaca cgagcataaa cacgatcacg aacatcatga tcacgatcat 480 cacgagggtt taacaacaaa ctggcacgtt tggtattctc cagctatcag caaaattgtt 540 gcacaaaaag tagcggataa attaactgca caattcccag ataaaaaagc gttaattgca 600 caaaatcttt cagattttaa ccgcactttg gcagaacaaa gtgaaaaaat tacggcacaa 660 cttgcaaatg ttaaagataa aggtttctac gttttccacg atgcttatgg ttatttcaac 720 gatgcttatg ggttaaaaca aacaggttac tttaccatca atccattagt agcaccgggt 780 gcaaaaactt tagcgcacat taaagaagaa attgatgaac ataaagtaaa ttgcttattc 840 gcagagcctc aatttacgcc aaaagtgatt gagtctttag cgaaaaatac taaagtcaat 900 gtaggacagc tcgacccaat tggcgataaa gttactttag gtaaaaattc ttatgcaaca 960 ttcttgcaat ctactgcaga tagctacata gaatgtttag ctaaataa 1008 52 <210> 4 <211> 335 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> SINAL <222> (D . . (21) <40 0> 4

Met Lys Lys Leu Leu Lys ile Ser Ala Val Ser Ala Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ala Pro Met Met Ala Asn Ala Asp Val Leu Ala Ser Val Lys Pro Leu 20 25 30 Gly Phe Ile Val Ser Ser ile Ala Asp Gly Val Thr Gly Thr Gin Val 35 40 45 Leu vai Pro Ala Gly Ala Ser Pro His Asp Tyr Asn Leu Lys Leu Ser 50 55 60 Asp lie Gin Lys val Lys Ser Ala ASP Leu Val Val Trp Ile Gly Glu 65 70 75 80 Asp ile Asp Ser phe Leu Asp Lys Pro ile ser Gin ile Glu Arg Lys 85 90 95 Lys Vai ile Thr Ile Ala Asp Leu Ala Asp Val Lys pro Leu Leu Ser 100 105 110 Lys Ala Hi s Hi S Glu Hi s Phe HÍS Glu ASP Gly Asp His Asp His Asp 115 120 125 His Lys Hi S Glu His Lys His Asp His Lys His Asp Hi S Asp His Asp 130 135 140 HiS Lys HÍS Glu His Lys HiS ASP His Glu His His ASP Hl S ASP His 145 150 155 160 His Glu Gly Leu Thr Thr Asn Trp HÍS Val Trp Tyr Ser Pro Ala ile 165 170 175 Ser Lys ile val Ala Gin Lys val Ala Asp Lys Leu Thr Ala Gin Phe 180 185 190 pro Asp Lys Lys Ala Leu ile Ala Gin Asn Leu Ser Asp Phe Asn Arg 195 200 205 Thr Leu Ala Glu Gin Ser Glu Lys Ile Thr Ala Gin Leu Ala Asn Val 210 215 220 Lys ASP Lys Gly Phe Tyr Val Phe His Asp Ala Tyr Gly Tyr Phe Asn 225 230 235 240 Asp Ala Tyr Gly Leu Lys Gin Thr Gly Tyr Phe Thr ile Asn pro Leu 245 250 255 Vai Ala Pro Gly Ala Lys Thr Leu Ala HÍS Ile Lys Glu Glu ile Asp 260 265 270 Glu His Lys val Asn Cys Leu Phe Ala Glu Pro Gin phe Thr pro Lys 275 280 285 Gly vai Ile Glu Ser Leu Ala Lys Asn Thr Lys val Asn Val Gin Leu 290 295 300 Ala Thr Asp Pro ile Gly Asp Lys Val Thr Leu Gly Lys Asn ser Tyr 305 310 315 Ala 320 Phe Leu Gin Ser Thr Ala Asp Ser Tyr ile Glu cys Leu Lys 325 330 335 53

<210> 5 <211> 1650 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae <400> 5 atgcttatga aactaaaagc aacattaact ctcgccgctg caactcttgt tttggcagct 60 tgtgatcaat ctagctcggc aaataaatct accgctcaaa ctgaagcaaa atcctcgtca 120 aataatactt tcgtttattg cacagcgaaa gctccattgg gatttagccc tgcgttaata 180 attgaaggta cttcttataa tgcaagctca caacaagtgt ataaccgctt agttgaattt 240 aaaaaaggct caacggatat tgaaccagct ttagctgaaa gctgggaaat tagcgatgat 300 ggcttaagtt atacttttca tttgagaaaa ggggttaaat tccacacaac aaaagaattt 360 accccgacac gtgattttaa tgcagatgat gttgtatttt cattccaacg tcagttagat 420 ccaaatcatc catatcacaa tgtatctaag gggacttatc catattttaa agcaatgaaa 480 ttccctgaat tgttgaaatc agtggagaaa gtagacgata acacaattcg tattacctta 540 aacaagacag atgcgacttt cttggctagt cttggtatgg attttatttc tatttattct 600 gcagaatatg ctgattcaat gctgaaagcg ggtaaaccag aaacgcttga tagtcgccca 660 gtggggacag gcccttttgt ttttgtggat tataaaacag atcaagccat acaatatgtt 720 gcgcatgaaa attattggaa aggtagaaca cctttagatc gtttagtcat tagcattgtg 780 cctgatgcaa caacacgtta tgcaaaatta caggcgggta cttgcgattt aattttattc 840 ccaaatgtag cggatttagc caaaatgaaa accgatccaa aagtacaact tttggaacaa 900 aaaggtttga acgtagcgta tatcgcattc aataccgaaa aagcaccgtt tgataatgtc 960 aaagtgcgcc aagcgttgaa ttacgcagtg gataaaaaag cgattattga agcggtttat 1020 caaggcgcag gaacatcagc taaaaaccca cttcctccaa caatttggag ttataatgat 1080 gaaatccaag attatccgta cgatccagaa aaagcaaaac aacttttagc agaagcgggt 1140 tatccaaatg gttttgaaac tgatttctgg attcaaccta ttattcgtgc ttctaatcca 1200 aatccaaaac gtatggctga attaattatg gcggattggg cgaaaattgg tgtaaaaact 1260 aacccagtga cttatgaatg ggctgattat agaaaacgag caaaagaggg agaattaact 1320 gcgggtatct ttggttggtc tggcgacaat ggcgatcctg ataatttctt atccccatta 1380 ttaggtagct caaatatagg taattctaat atggcacgtt tcaataattc agaatttgat 1440 gctttactca atgaggctat tggattaacc aataaggaag aacgtgcgaa actttataaa 1500 caagctcaag ttattgtcca taatcaagca ccttggattc cagttgccca ctctgttggt 1560 tttgcgccac ttagtcctcg tgtaaaaggt tatgtacaaa gcccatttgg ctatgacgct 1620 ttttatggtg tgagtgttga tggtaaataa 1650

<210> 6 <211> 549 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> SINAL <222> (1).. (20) 54 <400> 6

Met Leu Met Lys Leu Lys Ala Thr Leu Thr Leu Ala Ala Ala Thr Leu 1 5 10 15 Vai Leu Ala Ala cys Asp Gin Ser Ser Ser Ala Asn Lys Ser Thr Ala 20 25 30 Gin Thr Glu 35 Ala Ala Lys Ser Ser ser 40 Ser Asn Asn Thr Phe val 45 ile Tyr cys Thr Ala Lys Pro Leu Gly Phe Pro Ala Leu ile Glu Gly Thr 50 55 Gin val 60 Ser Tyr Asn Ala ser Ser Gin Tyr Asn Arg Leu Val Glu Phe 65 70 Ile Glu 75 80 Lys Lys Gly Ser Thr Asp pro Ala Leu Ala Glu Ser Trp Glu 85 90 95 ile Ser Asp Asp Gly Leu Ser Tyr Thr Phe His Leu Arg Lys Gly Val 100 105 110 Lys phe Hi s Thr Thr Lys Glu Phe Thr Pro Thr Arg Asp Phe Asn Ala 115 120 125 Asp Asp vai Val Phe Ser Phe Gin Arg Gin Leu Asp Pro Asn His Pro 130 135 Thr 140 Tyr His Asn Val Ser Lys Gly Tyr Pro Tyr Phe Lys Ala Met Lys 145 150 155 160 Phe Pro Glu Leu Leu Lys Ser val Glu Lys Val Asp Asp Asn Thr Ile 165 170 175 Arg ile Thr Leu Asn Lys Thr Asp Ala Thr Phe Leu Ala Ser Leu Gly 180 185 190 Met Asp Phe ile ser ile Tyr Ser Ala Glu Tyr Ala Asp Ser Met Leu 195 200 205 Thr Gly Lys Ala Gly Lys Pro Glu Thr Leu Asp Ser Arg Pro Val Gly 210 215 220 Tyr Val Pro Phe Val Phe val Asp Tyr Lys Thr Asp Gin Ala ile Gin 225 230 235 240 Ala Hi s Glu Asn Tyr Trp Lys Gly Arg Thr Pro Leu Asp Arg Leu val 245 250 255 Ile Ser Ile val Pro Asp Ala Thr Thr Arg Tyr Ala Lys Leu Gin Ala 260 265 270 Ala Lys Gly Thr Cys Asp Leu ile Leu Phe pro Asn Val Ala ASP Leu 275 280 285 Gly Met Lys Thr Asp pro Lys val Gin Leu Leu Glu Gin Lys Leu Asn 290 295 300 Asn val vai Ala Tyr Ile Ala Phe Asn Thr Glu Lys Ala pro phe Asp 305 310 315 Ala 320 Lys vai Arg Gin Ala Leu Asn Tyr Ala Val ASp Lys Lys ile ile 325 330 335 Glu Ala Val Tyr Gin Gly Ala Gly Thr Ser Ala Lys Asn pro Leu Pro 340 345 350 Tyr Asp Pro Thr ile Trp ser Tyr Asn Asp Glu ile Gin Asp Tyr Pro 355 360 365 Asn Gly Pro Glu Lys Ala Lys Gin Leu Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Pro 370 375 380 Ala Phe Glu Thr Asp Phe Trp ile Gin Pro Ile ile Arg ser Asn Pro 385 390 395 Ala 400 Asn Pro Lys Arg Met Ala Glu Leu ile Met Ala Asp Trp Lys ile 405 410 415 Gly Vai Lys Thr Asn Pro Val Thr Tyr Glu Trp Ala Asp Tyr Arg Lys 420 425 430 Ser Gly Arg Ala Lys Glu Gly Glu Leu Thr Ala Gly ile Phe Gly Trp 435 440 445 Gly Ser Ser Asp Asn Gly Asp Pro Asp Asn Phe Leu ser Pro Leu Leu 450 455 460 Glu Phe Asp Asn Ile Gly Asn Ser Asn Met Ala Arg Phe Asn Asn Ser 465 470 475 480 55

Ala Leu Leu Asn Glu Ala lie Gly Leu Thr Asn Lys Glu Glu Arg Ala 485 490 495

Lys Leu Tyr Lys Gin Ala Gin vai ile vai His Asn Gin Ala Pro Trp 500 505 510 ile Pro vai Ala His Ser vai Gly Phe Ala Pro Leu ser Pro Arg Vai 515 520 525

Lys Gly Tyr vai Gin ser Pro Phe Gly Tyr Asp Ala Phe Tyr Gly Vai 530 535 540

Ser Vai Asp Gly Lys 545 <210> 7 <211> 1974 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae <400> 7 atgatgaaca gacgtcattt tattcaaatt ggtgcgacca gtattcttgc attaagtgca 60 aaccgttttg cgatggcaaa aggaaagagc gatgttgatt tacgcattgt ggcaacaaca 120 gatgttcata gtttcttgac cgattttgac tattataaag atgcaccaac cgataaattc 180 ggttttactc gtgcggcaag ccttattcgt caagcacgtg ctaaagtaaa aaatagcgta 240 ttggtagata atggggattt aattcaaggt aatccaattg cagactatca agccgcacaa 300 ggctataaag agggtaaatc taaccctgcg gtcgattgtt taaatgcgat gaattatgaa 360 gtgggtacat taggtaacca cgaatttaac tatggtctca attatcttgc agatgccatc 420 aaacaagcta aattcccaat tgtgaatgct aacgtagtaa aagcggggac agaagaacct 480 tatttcacac cttatgtcat tcaagaaaaa tctgtggtgg ataataatgg caaaacacat 540 aaattaaaaa ttggttacat cggttttgtg ccaccgcaaa ttatggtttg ggataaagca 600 aaccttcaag gcaaagttga aacccgtgat attgtaaaaa cagcgcaaaa atatgtacct 660 gaaatgaaga aaaaaggggc tgatattgtc gttgcattag ctcacactgg tccatctgat 720 gaaccttatc aagaaggtgc tgaaaactca gcattctatc tagcggatgt tccacacatt 780 gatgcggtta tttttggtca ctcacaccgt ttattcccaa ataaagaatt cgcaaaatca 840 ccaaatgcag acatcgtaaa tggtaccgta aaaggcgtac cagaaagtat ggctggttac 900 tgggcaaata atatcagcgt ggtggattta ggcttaacag aacacaaggg taaatggatc 960 gtgacttctg gcaaagctgt gcttcgtcca atttatgatg tagaaaccaa aaaagcactt 1020 gcaaaaaatg acccagaaat taccgcactt ttaaaaccag ttcacgaagc aacacgtaaa 1080 tatgtttctc aacctatcgg caaagccaca gacaatatgt atagttacct tgcattaata 1140 caagatgatc caaccattca aattgtaaac caagcacaaa aagcgtatgt agagaaagtt 1200 gcaccaagtg ttgcagcaat ggctggctta cctattttaa gtgcaggtgc tccatttaaa 1260 gcgggtggtc gtaaaaatga cccaacgggc tataccgaag taaataaagg tgaattaact 1320 ttccgtaatg cagcagactt atacctttat ccaaatacgc tagtggttgt taaagcgaca 1380 ggcgaacaat taaaagaatg gttagaatgt agtgctggta tgtttaaaca aattgaccct 1440 acaagtgata aaccacaatc attaatcgac tgggaaggtt tccgcactta taactttgat 1500 gtgattgatg gtgtcaatta tgaatacgat ctaaccaaac cagctcgtta cgatggcgaa 1560 tgtaagttaa tcaacccaga atcgcatcgt gtagtgaatc tcacttatca aggtaaacca 1620 gttgatccaa aagcagaatt tttgattgca acgaataact atcgtgctta cggcaataaa 1680 ttcccaggta ctggcgatca acatattgtt tacgcatcac cagatgaaag ccgtcaaatt 1740 ttggctgatt atattaaagc aaccagtgag aaagagggtt cagtcaatcc aaatgcggat 1800 aaaaactggc gttttgtgcc tatcacaggt aacgataaat tagatgtccg ttttgaaaca 1860 tcgccaagcg aacaagcggc gaaatttatc gcagaaaaag cacaataccc aatgaaacaa 1920 gtgggtactg acgaaatcgg ttttgcagtg tatcaaattg atttatctaa ataa 1974 56

Gin ile Gly Ala Thr Ser Ile Leu 10 15 Val Met Al a Lys Gly Lys Ser ASP 25 30 Asp val Hi S Ser phe Leu Thr Asp 45 Thr Asp Lys Phe Gly Phe Thr Arg 60 Val Arg Al a Lys val Lys Asn Ser 75 80 Gin Gly Asn Pro ile Ala Asp Tyr 90 95 Gly Lys Ser Asn Pro Ala val Asp 105 110 Glu Val Gly Thr Leu Gly Asn Hi s 125 Ala Asp Ala ile 1 Af\ Lys Gin Ala Lys Val Lys Ala JLHU Gly Thr Glu Glu Pro 155 160 Glu Lys Ser val val Asp Asn Asn 170 175 Gly Tyr Ile Gly Phe Val Pro Pro 185 190 Asn Leu Gin Gly Lys Val Glu Thr 205 Lys Tyr val Pro Glu Met Lys Lys 220 Leu Al a Hi s Thr Gly Pro Ser Asp 235 240 Asn Ser Ala Phe Tyr Leu Ala Asp 250 255 Phe Phe Gly His Ser HiS Arg Leu 265 270 Pro Asn Ala Asp Ile Val Asn Gly 285 Met Ala Gly Tyr Trp Ala Asn Asn 300 Ile Thr Glu Hi s Lys Gly Lys Trp 315 320 Arg Pro Ile Tyr Asp Val Glu Thr 330 335 Pro Glu ile Thr Ala Leu Leu Lys 345 350

<210> 8 <211> 657 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> SINAL <222> (1) .. (26) <400> 8

Met Met Asn Arg Arg His Phe Ile 1 5

Ala Leu Ser Ala Asn Arg Phe Ala 20

Asp Leu Arg lie vai Ala Thr Thr 35 40

Phe Asp Tyr Tyr Lys Asp Ala Pro 50 55

Ala Ala Ser Leu ile Arg Gin Ala 65 70

Leu vai Asp Asn Gly Asp Leu ile 85

Gin Ala Ala Gin Gly Tyr Lys Glu 100

Cys Leu Asn Ala Met Asn Tyr Glu 115 120

Phe Asn Tyr Gly Leu Asn Tyr Leu 130 135

Phe Pro lie vai Asn Ala Asn vai 145 150

Tyr Phe Thr Pro Tyr vai Ile Gin 165

Gly Lys Thr His Lys Leu Lys Ile 180

Gin Ile Met vai Trp Asp Lys Ala 195 200

Arg Asp Ile Vai Lys Thr Ala Gin 210 215

Lys Gly Ala Asp Ile vai vai Ala 225 230

Glu Pro Tyr Gin Glu Gly Ala Glu 245 val Pro His Ile Asp Ala Vai Ile 260

Pro Asn Lys Glu Phe Ala Lys Ser 275 280

Thr Val Lys Gly val Pro Glu Ser 290 295 ile Ser Val val Asp Leu Gly Leu 305 310 val Thr Ser Gly Lys Ala val Leu 325

Lys Lys Ala Leu Ala Lys Asn Asp 340 57 ΡΓΟ Vai His GlU Ala Thr Arg Lys Tyr val Ser Gin Pro Ile Gly Lys 355 360 Ala 365 Ala Thr Asp Asn Met Tyr Ser Tyr Leu Leu Ile Gin Asp Asp Pro 370 375 Ala 380 val Thr lie Gin ile Vai Asn Gin Ala Gin Lys Tyr Val Glu Lys 385 390 395 400 Ala Pro Ser vai Ala Ala Met Ala Gly Leu Pro He Leu ser Ala Gly 405 410 415 Ala Pro Phe Lys Ala Gly Gly Arg Lys Asn Asp Pro Thr Gly Tyr Thr 420 425 430 Glu Vai Asn Lys Gly Glu Leu Thr Phe Arg Asn Ala Ala Asp Leu Tyr 435 440 445 Leu Tyr Pro Asn Thr Leu Val val Val Lys Ala Thr Gly Glu Gin Leu 450 455 phe 460 Lys Glu Trp Leu Glu Cys ser Ala Gly Met Lys Gin ile Asp Pro 465 470 475 480 Thr Ser Asp Lys Pro Gin ser Leu ile Asp Trp Glu Gly Phe Arg Thr 485 490 495 Tyr Asn Phe Asp Vai ile Asp Gly val Asn Tyr Glu Tyr ASP Leu Thr 500 505 510 Lys Pro Ala Arg Tyr Asp Gly Glu cys Lys Leu ile Asn Pro Glu Ser 515 520 Gly 525 HlS Arg Vai Vai Asn Leu Thr Tyr Gin Lys Pro Val Asp Pro Lys 530 535 540 Ala Glu Phe Leu ile Ala Thr Asn Asn Tyr Arg Ala Tyr Gly Asn Lys 545 550 555 560 Phe Pro Gly Thr Gly ASp Gin His Ile Val Tyr Ala ser pro Asp Glu 565 570 575 Ser Arg Gin Ile Leu Ala Asp Tyr ile Lys Ala Thr Ser Glu Lys Glu 580 585 590 Gly Ser Vai Asn Pro Asn Ala Asp Lys Asn Trp Arg Phe Val Pro ile 595 600 605 Thr Gly Asn Asp Lys Leu Asp Val Arg Phe Glu Thr Ser Pro Ser Glu 610 615 620 Gin Ala Ala Lys Phe ile Ala Glu Lys Ala Gin Tyr Pro Met Lys Gin 625 630 635 640 Vai Gly Thr Asp Glu ile Gly Phe Ala val Tyr Gin Ile Asp Leu Ser 645 650 655

<210> 9 <211> 483 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae <400> 9 60 120 180 240 300 360 420 480 483 atgaaaaaaa ttattttaac attatcactt gggttactta ccgcttggtc tgctcaaatc caaaaggctg aacaaaatga tgtgaagctg gcaccgccga ctgatgtacg aagcggatat atacgtttgg taaagaatgt gaattattac atcgatagtg aatcgatctg ggtggataac caagagccac aaattgtaca ttttgataca gtggtgaatt tagataaggg attgtatgtt tatcctgagc ctaaacgtta tgcacgttct gttcgtcagt ataagatttt gaattgtgca aattatcatt taactcaagt acgaactgat ttctatgatg aattttgggg acagggtttg cgggcagcac ctaaaaagca aaagaaacat acgttaagtt taacacctga tacaacgctt tataatgctg ctcagattat ttgtgcaaat tatggtaaag cattttcagt tgataaaaaa taa 58 <210> 10 <211> 160 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> SINAL <222> (D · · (20) <400> 10

Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Trp 1 5 10 15 ser Ala Gin Ile Gin Lys Ala Glu Gin Asn Asp val Lys Leu Ala Pro 20 25 30 pro Thr Asp Val Arg ser Gly Tyr Ile Arg Leu val Lys Asn val Asn 35 40 45 Glu Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gin Pro Gin 50 55 60 lie val His Phe Asp Thr val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr val 65 70 75 Gin 80 Tyr Pro Glu pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Tyr Lys Ile 85 90 95 Leu Asn cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gin val Arg Thr Asp Phe Tyr 100 105 110 Asp Glu Phe Trp Gly Gin Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gin Lys 115 120 125 Lys Hi s Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala 130 135 140 Gin He Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Al a Phe Ser val Asp Lys Lys 145 150 155 160 <210> 11 <211> 939 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae 59 < 4 Ο Ο > 11 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 939 gtgccttctg acctttgaaa ggctatgatt cttcaaccga aataaagaat attgaagtta aaacctgaat gcattattac tatgagcgtt gtcccttacg gcgcagaaag atggataact gacttcttac ccaaataatg ccaccagcgg atttatgaaa atttagtcgc gcaacgaaga tggtgtttcc ttgatcaaag tcgacccaga atgcggatga ttaaaggcaa tggatggtaa tagaaaaact tacaaggcga aaaatcaatc atgcgattcc ttcgccctga gggcgaaaac aagaagtgga aatattggag acagttctct aatgtatgcg atcaagttac taaattgacc aaataaatat gattgatcct agttctcatg atcgccaaat gttaccaaat agttgcaatt tcttcaattt gactacagca aaatgcaaaa attgctaagc aaaaggaatt taaattaaaa aaagaaactg aaacttaaac tacgtaaata aatattcatc tcattacctt aaaaccatta accagtgatg accaccaatg gtagcgactt ggtatgattt gtgtatccaa aaaaatgttg attgttatcg gcggaagttg atgcaaggcg actaattag gcatcgaggt ttactcagaa aaatgattaa aaatccctaa acgtttacgg ccagctgggc cgcgtgaagt aagaagacat ttaactctga ggaatggttc aagaaggtgc aaggtgcaca aacgcatggg ctaatgatcc atgtaggaga aatttattct tacgggttct ggaaaagatg acatttatta cttaactggt agatttatgg gttccacgta caaaacagct ttctcctgaa agcttattta aattttctgg taagttcatt cttttctatg aaaattattt agcggtcgat

<210> 12 <211> 312 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 12

Met Pro ser Asp Leu Vai Ala Gin Phe Ser Lys Glu Thr Gly ile Glu 1 5 10 Ala 15 vai lie Tyr Ser Thr Phe Glu Ser Asn Glu Glu Met Tyr Lys Leu 20 25 30 Lys Leu Thr Gin Asn Thr Gly Ser Gly Tyr Asp Leu Val Phe Pro Ser 35 40 45 Gin ile Ser Tyr Tyr vai Asn Lys Met Ile Lys Glu Lys Met Leu Pro 50 55 60 Asp Gin Ser Lys Leu Thr Asn Ile Hi S Gin ile Pro Lys His Leu Leu 65 70 75 Val 80 Asn Lys Glu Phe Asp Pro Glu Asn Lys Tyr ser Leu Pro Tyr Tyr 85 90 95 Thr Gly Leu Thr Gly Ile Glu Vai Asn Ala Asp Glu Ile Asp Pro Lys 100 105 110 Val lie Thr Ser Trp Ala Asp Leu Trp Lys Pro Glu Phe Lys Gly Lys 115 120 Vai 125 Leu Met Thr Ser Asp Ala Arg Glu Vai Phe His Ala Leu Leu Leu 130 135 140 Ile Thr Ala Asp Gly Lys Ser Pro Asn Thr Thr Asn Glu Glu Asp Lys 145 150 155 Thr Phe 160 Tyr Glu Arg Leu Glu Lys Leu Leu Pro Asn Vai Ala Asn Ser 165 170 Ala ile 175 Asp ser Pro Glu Vai Pro Tyr Vai Gin Gly Glu vai Gly Met 180 185 Glu 190 lie Trp Asn Gly Ser Ala Tyr Leu Ala Gin Lys Asn Gin Ser Leu 195 200 205 Gin Phe Vai Tyr Pro Lys Glu Gly Ala Ile Phe Trp Met Asp Asn Tyr 210 215 220 Phe Ile Ala Ile Pro Thr Thr Ala Lys Asn vai Glu Gly Ala His Lys 225 230 235 240 60

Asp Phe Leu Leu Arg Pro Glu Asn Ala Lys Ile Vai Ile Glu Arg Met 245 250 255

Glv Phe Ser Met Pro Asn Asn Gly Ala Lys Thr Leu Leu Ser Ala Glu 260 265 270

Vai Ala Asn Asp Pro Lys Leu Phe Pro Pro Ala Glu Glu Vai Glu Lys 275 280 285

Gly Ile Met Gin Gly Asp vai Gly Glu Ala Vai Asp ile Tyr Glu Lys 290 295 300

Tyr Trp Ser Lys Leu Lys Thr Asn 305 310 <210> 13 <211> 1041 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae <400> 13 60 120 180 240 300 360 420 480 JW 600 660 720 780 840 900 960 1020 1041 atgaagaaat ttttaattgc gattttactt tttgcttatt acaaaatgac tgaatttgta cttttaacta ttgaacgtgg cacaacaggt aagttaattg ctgatgggaa attattacct aaaataaaag cagggactta ttctcttgag ttgcttaatt caggtaagga agtgcagttt aaggattggc gaaaagatct tgaaaatgca cgtaacgaag acattttcac attacttgac aaaaatgtgg aaggttggct ttatcctgat ttagagctac ttaagcgatc ggctgagcaa gagcgtgacg atgatttacc tttagcgaat gtagaaaaag aaacgggtat tgctaatgag cgtttaaaag caaaaatgaa attacagacg aattacaatg ggaatattcg caaaaaagat gtgattgatg gattaccgcc aacacctatt gttgcaaaac ctgaaaaaac agatttttat aaatttaccc gaaatttgaa tgaacataat cgcagtcaga aaaatgccaa a ttaattttga ttttagcggg cgcggcgagt aaaacaccag taaatgtgca ggcagatcaa tcaaaattag ccgcactttt tgagcaagaa tatttgctga agttgaaatc tgagctaaat aatgttaaaa ctgtgcaaga tttactggat aatgtaaaat ggattgaagg aaaaactttc ccgcacttgg tgcaaacctt gaaagataag ttgccagatg tcggtcaaaa tcttgaacta acttataatt atacgcctaa atccacagac atgaaaaagg cgttaaataa ggcttggaac ccttatgaaa tgttgatttt ggcttctatc agagcaaaag tggcctctgt atttatcaac gatccaacgg taatttatgg tatgggcgaa ttagaaaccc taacgcctta taatacgtat gcgatgccaa gcgaaagttc gttacaagct tattttgtgg cagatggttc tggtgggcat aaagcggtgc aagaatattt acgttggtat <210> 14 <211> 347 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> SINAL <222> (D · · (19) 61 <400> 14

Met Lys Lys Phe Leu Ile Ala ile Leu Leu Leu ile Leu Ile Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ser Phe Ala Tyr Tyr Lys Met Thr Glu Phe vai Lys Thr 20 25 30 ΡΓΟ Vai Asn Vai Gin Ala Asp Gin Leu Leu Thr ile Glu Arg Gly Thr 35 40 45 Thr Gly ser Lys Leu Ala Ala Leu Phe Glu Gin Glu Lys Leu ile Ala 50 55 60 Asp Gly Lys Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Lys Leu Lys ser Glu Leu Asn 65 70 75 80 Lys Ile Lys Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Glu Asn Vai Lys Thr Vai Gin 85 90 95 Asp Leu Leu Asp Leu Leu Asn ser Gly Lys Glu vai Gin Phe Asn vai 100 105 110 Lys Trp Ile Glu Gly Lys Thr Phe Lys Asp Trp Arg Lys Asp Leu Glu 115 120 125 Glu Asn Ala Pro Hi s Leu Vai Gin Thr Leu Lys Asp Lys Arg Asn Asp 130 135 140 Glu He phe Thr Leu Leu Asp Leu Pro Asp vai Gly Gin Asn Leu Leu 145 150 155 Thr 160 Lys Asn Vai Glu Gly Trp Leu Tyr Pro Asp Thr Tyr Asn Tyr Pro 165 170 175 Lys Ser Thr Asp Leu Glu Leu Leu Lys Arg Ser Ala Glu Gin Met Lys 180 185 190 Lys Ala Leu Asn Lys Ala Trp Asn Glu Arg Asp Asp Asp Leu Pro Leu 195 200 205 Glu Glu Ala Asn Pro Tyr Glu Met Leu Ile Leu Ala Ser Ile Vai Lys 210 215 220 ile Thr Gly Ile Al a Asn Glu Arg Ala Lys Vai Al a Ser Vai Phe Asn 225 230 235 Vai ile 240 Arg Leu Lys Ala Lys Met Lys Leu Gin Thr Asp Pro Thr Tyr 245 250 255 Gly Met Gly Glu Asn Tyr Asn Gly Asn Ile Arg Lys Lys Asp Leu Glu 260 265 270 Thr Thr Leu Thr Pro Tyr Asn Thr Tyr vai ile Asp Gly Leu Pro Pro 275 280 285 Ala Pro Ile Ala Met pro Ser Glu Ser Ser Leu Gin Ala vai Lys Pro 290 295 300 Gly Gly Glu Lys Thr Asp Phe Tyr Tyr Phe Vai Ala Asp Gly ser Hi s 305 310 315 vai Gin Glu 320 Lys Phe Thr Arg Asn Leu Asn Glu His Asn Lys Ala Tyr 325 330 335 Leu Arg Trp Tyr Arg Ser Gin Lys Asn Ala Lys 340 345 <210> 15 <211> 942

<212> ADN <213> Haemophilus influenzae 62 <400> 15 atgaaaatga ttcgcttcta ttagaaagcc aaaattattg cctcgtgaaa caatttttgg gccaatcaaa acgcgtgaag acggcgcaga ccattgttaa gcaggtaaaa gcgaatggcg accgtcgtga catattttgg aaagcatatg gcattgcgta aaaaatttat tggcacaagc aagtgcgtgc atgatatttt ttgatcatat atgcgttaga tggtgatggg aagttgtcgc aagttatggg atgatgctca caacttttgc gtagtttagg aaagtaaaca aagtaactgg aacgtttagt aaagagcgaa tctaaaatct ggaggaacgt caatatgggt ggtgcaaaaa tgtggaagac ttaccaaggc ggctgtacgc actcggtcaa gaaagagtat agcaaaaaaa tgatgccgca ttatgcgttc aggtgtgatt cgtacgtgat aaatactcaa tattcagtat tttttattgg gtcgtagcga aaaaaaggtg gcagttcaag actgcggcaa atttcattaa aacaaagcta aaaatgttag gaagttcgcc caattagcta ttaaaatatt ccagaaactt tctgcaccat ggcgatctta ttacaagatg tttaataaat ctactttggg cagtggatgg atcgccaaag aatcgggagt gaaatggctt atgcatttcg ttcaagaaag aagaagcgaa atattttgtt aaattcgttc ctaaagatta atgcaccaca ttaaaactga cagcagaagc cgacgaacga aa atgtgtcgct 60 tattcctgtt 120 tgcgattgat 180 caaaattgat 240 aacttatggt 300 tcagcaaatt 360 cattgatgta 420 agaaaagggt 480 aaaacttaat 540 tgatattatt 600 tttatcgggt 660 gtttgcgcaa 720 gtttggttgg 780 ctacacacaa 840 ttgggttaaa 900 942

<210> 16 <211> 313 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <22 0> <221> SINAL <222> (1)..(27) <40 0> 16

Met 1 Lys Met Lys Gly Cys vai Ala 20 Ala Thr vai 35 Asp Met Gly 50 ile Lys Lys Asp 65 Leu vai Pro Arg Glu Ile Leu Thr Tyr Gly 100 Leu Asn Ala 115 Phe Vai Arg 130 Asn Lys Vai 145 Vai Ala Leu Thr Ala Gin Lys

Lys 5 Phe ile Leu Phe Ala ser Met Gly ile Pro vai 40 Gin Gly Asp Arg 55 Ala Gin Lys 70 Vai Asp 85 Hi S Ile Vai Gin Phe Leu Asp Arg Gin Gin Ile 120 Ala ile Gin 135 Glu Gly Gin 150 Lys Met Vai 165 Met Gly Lys

Lys Ser Phe Leu 10 Ala Gin Ala Glu 25 Leu Glu Ser Gin Ser Ala Ile Asp 60 Gin Glu ser Gly 75 Glu Asp Thr Ala 90 Ala Leu Asp Tyr 105 Ala Asn Gin Met Ser ile Asp Vai 140 Leu Glu Glu Ala 155 Glu Tyr Glu Vai 170

Leu Al a Thr Leu 15 Glu Arg Val val 30 vai Arg Al a Asn 45 Lys Ile Ile Asp Vai Lys Ile Asp 80 Ala Arg Asn Gly 95 Gin Gly Ile Ser 110 val Met Gly Ala 125 Thr Arg Glu Glu Lys Glu Lys Gly 160 Arg His Ile Leu 175 63

Teu Lys Leu Asn Pro Leu Leu Asn Asp Ala Gin Ala Tys j-ys 180 185 190

Ala Lys Ile Arg Ser Asp Ile Ile Ala Gly Lys Thr Thr Phe 195 200 205

Ala Ala Leu Lys Tyr ser Lys Asp Tyr Leu Ser Gly Ala Asn 210 215 220 .

Ser Leu Gly Tyr Ala Phe Pro Glu Thr Tyr Ala Pro Gin Phe 225 230 235

Thr Vai Vai Lys Ser Lys Gin Gly Vai Ile Ser Ala Pro Phe 245 250

Glu Phe Gly Trp His Ile Leu Glu vai Thr Gly Vai Arg Asp 260 265 270

Leu Thr Ala Glu Ala Tyr Thr Gin Lys Ala Tyr Glu Arg Leu 275 280 285

Thr Gin Leu Gin Asp Ala Thr Asn Asp Trp vai Lys Ala Leu 290 295 300

Arg Ala Asn ile Gin Tyr Phe Asn Lys 305 310 <210> 17 <211> 487 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae <400> 17

Gin Leu Ala Asp Gly Gly Ala Gin 240 Lys Thr 255 Gly Asp Vai Asn Arg Lys atgactatgt ttaaaaaaat tcttggtcat cggttactaa ttagataaag ataaaatcga acatataaag gtcgcgtgaa gactggtatt taggtcgtat ggcggtcatg attctgatat caagctaacc ttaaacgttt gctcaaggta tttatgatgc taaataa aggttgttct 60 agtgattgat 120 gactgtggcg 180 tggtgcgaat 240 actttataca 300 ggaagcattg 360 gcaaagtatg 420 cctgtacatc 480 487 ctctgtttta ctatattcca tcaaaaatcc tgaaaatttc tttagttcct atatgcttat aagtgtaagc gatgcgtgat ttttttacgt tttatgggga tatgcagcgg tttgtagata gtgaaacaaa tatagcggcg tgttgggaaa tagtgaagcg taatattggc acgataaaaa cttatgaagc attttgcaag ttcaggataa tgttacatgc aagtagattc ctgctgaaag <210> 18 <211> 178 <212> PRT <213> Haemophilus <220> <221> SINAL <222> (D · · (23) 6 4 <4 Ο 0> 18

Phe Lys 5 Lys lie Ser vai Leu 10 Phe Phe Thr Leu Ile 15 Leu Ser Ser Trp Ser Ser Val Thr Asn Tyr ile Pro Phe Met 20 25 30 Gin Lys Lys Vai Ile Asp 40 Leu Asp Lys Asp Lys 45 Ile Asp Ala Ala Ala Tyr Glu Ala Thr Val Ala Thr Tyr Lys Gly 55 60 Ala Glu Asn phe Phe vai Asp Asn Phe Ala ser Gly Asn 70 75 Gin 80 Leu Gly Arg ile Leu val Pro Val Lys Gin Ile Asp 85 90 95 Thr Gly Gly His Asp Ser Asp Ile Tyr Ala Tyr Tyr Ser 100 105 110 His Ala Glu Ala Leu Gin Ala Asn Leu Lys Arg Leu Ser 120 125 ile Trp Glu Lys vai Asp Ser Gin Ser Met Ala Gin Gly 135 140 Glu Met Arg Asp Leu Gin Lys Gly Glu Ala Arg Gly Asn 150 155 Ala 160 ile Vai Gin Gly ser Glu Ala Leu Leu Lys Cys Thr 165 170 175 <210> 19 <211> 1728 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae

Met Thr Met 1

Ala Gly Cys

Gly Asn Asp 35

Lys Ser Tyr 50

Arg vai Asn 65

Asp Trp Tyr

Lys Leu Tyr

Gly Vai Leu 115 vai ser Cys 130

Tyr Asp Ala 145

Asp Glu Tyr Ser Lys <400> 19 atgtctattc tattacaagg atggctttag ctggctgttc gatgcaaatg caagttctga gatcaacaaa cctataaatt caatcggcag cgttattgag gcattaattg aagcgagaat ttacgtgcat tggatttaaa ttagctattg ttgccgaaaa atggataaga atttaacaga ttattgcgtt cagcgaatac ttaggcggtt ggctaacatt ttaagccaag ccttacaaag ttcccaaaag aattgcttac ttactcttgc cattaagtgg aacgacgcga aaggtaactc gtccaagata tcattgcgca ctaaaacaaa atcttgatgt cttgcattaa atgccacacc tctccagaag atgaagctga ccacttgtcg caatgccgca cgttggcagc aattagcagg cgaacgtttt aaaaaacgtt aaatctactt ggtagcaatt attttatata aacaaattag gctcgcggct cgagtgttaa ggaattaggc gaattaaatg ttctgccgca aaaaatgcca taaactaagc ccgtcacaaa ccgtaaagac atgattgaag tgtacaacgt cgtcaagata tggcgttatt aataatgcct aatcaaagcc tacaacgatt ttggaaaaat gcttatccaa attgcttaat ttccaacaaa agatggacaa attcttggta aaccattcca gtgcaagtgt agcaaaacaa gcggggatta gattttagcg gatcctgctc acattctcgt gcgattcctc atctgccgcc aataaaatgt aaatgattta ggacaacgcg tactgatgcg aatatccgtt taatgccaat tttattgtca tcacgcaaac cttacaaaaa ggcaaacgca agaacttgaa tccgtgaaaa taaggttgaa atgcgcaaaa attagatcgt atgaagtcgc acaaaatcaa aatctcgtta ttacgaaacc cggtaaaagc gcggatagaa atattgataa aacttgggct ctgatgaagg taatgcagct atattcgtca gcctgtacaa atcatgcagc cgcaacgttg cgaatgtgtc acaaattggt caaccattca atcgggtttt ttgatacctc aatgaattct aaaccttagt cggcccatta aaattcaagg tatggatgtg aactttgtta ttacggactt ggaacgatgg cgtgcgtaat taggcaatgc ctttaatgta actacaattt gcctgcggat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 7 20 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 65 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1728 gtgacctatt tcgttcaaga aaataactca aatacaaccg cactttatgc cgtagcaagt ccaactgaac tggcagaaat gaaaggttat ttaacaaata tcgtacctaa tttagcgatt tatgccagtt ctcgagcaag cgcaagtgcg acaaacacta ataccgactt catcgcacag atgaacggtg tacagtttag tgatattcca ttttttaaag ataccaattc tccacaatat cagaagttag caaaatccac ggggggtgaa tatcaattga tgcgtttata tgcaatgggt gcagatgcgt ggttgctcat taatcaattt aatgaattac gccaagtgcc aggctatcgc ttgagtggct taacagggat tttaagtgct gataccaact gtaatgttga acgcgatatg acttggtatc aatatcaaga tggtgcaatt gtaccagttg caaactaa

<210> 20 <211> 575 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <22 0> <221> SINAL <222> (1)..(31) <400> 20

Met Ser He Leu Leu Gin Gly Glu Arg Phe Lys Lys Arg Leu Met Pro 1 5 10 15 lie Leu Leu Ser Met Ala Leu Ala Gly Cys Ser Asn Leu Leu Gly Ser 20 25 30 Asn Phe Thr Gin Thr Leu Gin Lys Asp Ala Asn Ala Ser Ser Glu Phe 35 40 45 Tyr ile Asn Lys Leu Gly Gin Thr Gin Glu Leu Glu ASP Gin Gl n Thr 50 55 60 Tyr Lys Leu Leu Ala Ala Arg Vai Leu ile Arg Glu Asn Lys Val Glu 65 70 75 80 Gin Ser Ala Ala Leu Leu Arg Glu Leu Gly Glu Leu Asn Asp Ala Gin 85 90 95 Lys Leu Asp Arg Ala Leu lie Glu Ala Arg Ile ser Al a Al a Lys Asn 100 105 110 Ala Asn Glu Vai Ala Gin Asn Gin Leu Arg Ala Leu Asp Leu Asn Lys 115 120 125 Leu Ser Pro Ser Gin Lys Ser Arg Tyr Tyr Glu Thr Leu Ala Ile Val 130 135 140 Ala Glu Asn Arg Lys ASp Met Ile Glu Ala Vai Lys Ala Arg ile Glu 145 150 155 160 Met Asp Lys Asn Leu Thr Asp Vai Gin Arg Arg Gl n Asp Asn ile Asp 165 170 175 Lys Thr Trp Ala Leu Leu Arg Ser Ala Asn Thr Gly val Ile Asn Asn 180 185 190 Ala ser Asp Glu Gly Asn Ala Ala Leu Gly Gly Trp Leu Thr Leu ile 195 200 205 Lys Ala Tyr Asn Asp Tyr Ile Arg Gin Pro Vai Gin Leu ser Gin Ala 210 215 220 Leu Gin Ser Trp Lys Asn Al a Tyr Pro Asn His Ala Ala Ala Thr Leu 225 230 235 240 66

Phe Pro Lys Glu Leu Leu Thr Leu Leu Asn Phe Gin Gin Thr Asn val 245 250 Gly Gly 255 Ser Gin ile Gly Leu Leu Leu Pro Leu Ser Asp Gl n ile Leu 260 265 270 Gly Thr Thr Ile Gin Ser Gly Phe Asn Asp Ala Lys Gly Asn Ser Thr 275 280 285 He Pro val Gin Val Phe Asp Thr Ser Met Asn Ser Val Gl n Asp Ile 290 295 300 ile Ala Gin Ala Lys Gl n Ala Gly Ile Lys Thr Leu Val Gly Pro Leu 305 310 Ile 315 Ala 320 Leu Lys Gin Asn Leu Asp Val Leu Ala Asp Pro Gin Ile Gin 325 330 335 Gly Met Asp Val Leu Ala Leu Asn Ala Thr Pro His Ser Arg Ala Ile 340 345 Glu 350 Pro Gin Leu Cys Tyr Tyr Gly Leu Ser Pro Glu Asp Al a Glu Ser 355 360 365 Ala Ala Asn Lys Met Trp Asn Asp Gly Val Arg Asn Pro Leu Val Ala 370 375 380 Met Pro Gin Asn ASp Leu Gly Gin Arg Val Gly Asn Ala Phe Asn val 385 390 Ala 395 Ile 400 Arg Trp Gin Gin Leu Ala Gly Thr Asp Asn Arg Tyr Tyr Asn 405 410 415 Leu Pro Ala Asp val Thr Tyr Phe val Gin Glu Asn Asn Ser Asn Thr 420 425 430 Thr Ala Leu Tyr Ala val Ala Ser Pro Thr Glu Leu Ala Glu Met Lys 435 440 445 Gly Tyr Leu Thr Asn ile val Pro Asn Leu Al a ile Tyr Ala Ser Ser 450 455 460 Arg Ala Ser Ala Ser Ala Thr Asn Thr Asn Thr Asp Phe Ile Ala Gin 465 470 475 480 Met Asn Gly val Gin Phe Ser Asp ile Pro Phe Phe Lys Asp Thr Asn 485 490 495 Ser Pro Gin Tyr Gin Lys Leu Ala Lys Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Gin 500 505 510 Leu Met Arg Leu Tyr Ala Met Gly Ala Asp Ala Trp Leu Leu Ile Asn 515 520 525 Gin Phe eon Asn Glu Leu Arg Gin roc val Pro Gly Tyr Arg Leu Ser Gly Leu Thr jjU Gly Ile Leu ser Ala d j j ASP Thr Asn cys Asn val Glu Arg Asp Met 545 550 555 560 Thr Trp Tyr Gin Tyr Gin ASP Gly Ala ile val Pro val Ala Asn 565 570 575

<210> 21 <211> 3336 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae 67 <4Ο0> 21 atgattagga aacttatgaa aacacctcca ttttttaccg cactttttgc ctcggcaata 60 ttcaccctta gtgtttcaca aggggtatta ggggcaaatt caacaaatgt attaccaacg 120 gagcaatcgc ttaaagccga tttggctaac gctcaaaaaa tgagtgaggg ggaagcaaaa 180 aagaggttgt tagcagaatt acaaacatca attgatttat tgcagcaaat tcaagctcaa 240 caaaaaatca atgatgcatt gcaaacaaca ttaagccatt cagagagtga aattagaaag 300 aataatgcag aaattcaagc attaaaaaaa caacaagaaa cagcaacaag tactgattat 360 aatgcacagt cacaggacga tttacaaaat agtctcgcta agttaaatga tcaattacaa 420 gatacgcaaa acgcattagg cgcggcaaat gcacaattgg cagggcaaaa ttctatttct 480 gaacgagctc aagcggcatt aacggaaaat gttgtacgca ctcagcaaat taatcaacaa 540 ttggccaata atgatattgg tagcgcatta cgaaaacaat atcagattga attacaactg 600 attgatttaa agaatagtta taatcaaaat ttattaaaaa ataatgatca gctttcttta 660 ctttatcaaa gtcgttacga cctattgaat ttacgtttgc aggtgcaaca acaaaatatt 720 attgcgattc aagaagtcat taatcaaaaa agtcttcagc aatcacaaaa tcaactagaa 780 caagctcagc agcaacagca aaaaactgtg caaaatgatt acattcaaaa agaacttgat 840 cgcaatgcac agcttggtca gtatctatta caacaaacag aaaaagcgaa ttcattaact 900 caagatgagt taagaatgcg gaatatttta gatagcctca ctcaaactca acatactatt 960 gatgaacaaa ttagtgcatt acaaggcacg ttagttcttt cacgtattat ccagcaacaa 1020 aaacaaaaat taccgactaa cttaaatatt caaggtttat caaaacaaat tgccgatttg 1080 cgtgtgcata tttttgacat tactcaaaaa cgcaatgaac tttatgatct agataactat 1140 attaataaag ttgaaagtga agatggaaaa caatttactg aggcagaaag aacgcaagtt 1200 aaaacgctat taactgagcg tcggaaaatg acatctgatc tgattaaatc cttaaataat 1260 caattaaatc tcgcgatttc tttggaatta acacagcagc aaattacaca aatcagtgat 1320 caaattcaat ctaaattaga gcagcaaagt ttttgggtga aaagtaataa tcccattaat 1380 ttagattgga taaaaatgct tccaagagct ttaattgaac agtttaatgg tatgttgaaa 1440 aaattaggtt ttccaactaa ttatgacaat ttaccttatt tacttatgta tttcttaggg 1500 ttatttattg taggcggtgc aatttttaaa tttaaaaatc gtattaaaca acaattaaac 1560 aaaattaatc gtgaaataca tcgcttagat acagatagtc agtggagtac gccacttgcc 1620 ctgttattaa ctgcgttttt aacgctttct agtacacttt ggtttttagc agtttgccaa 1680 atgatcggct tctttttctt caaaaatcca gaagaatttt ggcattggtc atttagtatg 1740 gcgagttatt ggtggttctt tacattttgg atttcattgt tccgtccaaa tggtattttt 1800 gttaatcatt ttgaatcttc aaaagagaat gcacaacgtt ttcgtggtgt tatccagcgt 1860 attattattg cgatagtatt actcttgaat acatctgttt ttagtaatgt aacagacagt 1920 ggcttagcca atgatgtcct aggggaaatt aatactatta cggcgttaat tttctgcacg 1980 gcgattattg ctcctcgttt taatcgagta cttcgctctt atgaacctga aacaaataaa 2040 catcattggt taataaaaat tgtacaaatt ggtttgagat taattcctgt gggattaatc 2100 gtacttattg ttttaggcta ttactacacc gctttaaatt taattgagca ttttattcat 2160 tcttatattg cttggtgtgt atggtggtta gtacgtaata cgatttaccg tggtattacg 2220 gtttcttctc gtcgtttagc acatcgccgt ttagcagaaa aacgtcgtca aaaagcactt 2280 gaaaataatt atgaaaatat ttcctctgat gatgtggttg cagtgggaga gccagaggaa 2340 ggtttagcgt taaatgatgt gcgtagccaa ttattacgtt ttgtagatct ctttatttgg 2400 acagcattat tggggatttt ctactatgta tggtcagatt tagtcacagt agtgagctat 2460 ttacgtgaaa ttacactttg gcaacaaacc acgacaaccg atgctggcac tgtaatggaa 2520 agcattactt tatttaatct tcttgttgct ttggttatcc taggaattac ttatgtgttg 2580 gttcgtaata tttcaggtat tttggaagta ttaattttct ctcgcgtgaa tctttcacaa 2640 ggtacgcctt atacgattac gacattgctc acttatattt ttatcgccat tggtggtgcg 2700 tgggcatttg caaccttagg aatgtcttgg tcaaaattgc aatggttatt tgccgcactt 2760 tccgttggtc ttggttttgg tatgcaagaa atttttgcaa actttgtgtc gggcattatt 2820 ttgctatttg aacgcccaat ccgagttggc gatgtcgtaa ccattaatgg agtgagcggt 2880 actgtagcga aaattcgtat tcgtgcaatt acattaattg attttgatcg caaagaaatt 2940 attgtgccaa ataaatcttt tgtgacaggt caagtaacca attgggcatt atctagcacg 3000 atgacacgtt tagtgattag cgttggtgtt gcttatggtt ctgatttaac actcgttcgt 3060 caattattac ttcaagcagc tgatgaacag ccgactgttt tacgcgatcc taaaccatct 3120 gcttattttt taacttttgg tgcaagtact ttggatcacg aattacgtgt ttatgtagaa 3180 caagttggag atcgtaccag tactacagat gctattaatc gccgtattaa tgaattattt 3240 gcagaacata atattgatat tgcctttaat caattagatg tatttatcaa aaataatgac 3300 actggcgaag aaattccttt tgttgatgta aaaaaa 3336 68

<210> 22 <211> 1112 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> SINAL <222> (1)..(31) <400> 22

Met ile Arg Lys Leu Met Lys Thr Pro Pro Phe Phe Thr Ala Leu Phe 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ala Ile Phe Thr Leu ser val Ser Gin Gly val Leu Gly 20 25 30 Asn Ser Thr Asn Vai Leu Pro Thr Glu Gin Ser Leu Lys Ala Asp Leu 35 40 45 Ala Asn Ala Gin Lys Met Ser Glu Gly Glu Ala Lys Lys Arg Leu Leu 50 55 60 Ile Gin Ala Gin Ala Glu Leu Gin Thr ser Ile Asp Leu Leu Gin Gin 65 70 75 Glu 80 Gin Lys Ile Asn Asp Ala Leu Gin Thr Thr Leu Ser His ser Ser 85 90 95 Gin Glu ile Arg Lys Asn Asn Ala Glu Ile Gin Ala Leu Lys Lys Gin 100 105 Gin 110 Glu Thr Ala Thr ser Thr Asp Tyr Asn Ala Gin ser Asp Asp Leu 115 120 125 Thr Gin Gin Asn Ser Leu Ala Lys Leu Asn Asp Gin Leu Gin Asp Asn 130 135 140 Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asn Ala Gin Leu Ala Gly Gin Asn Ser Ser 145 150 155 Thr Gin 160 Glu Arg Ala Gin Ala Ala Leu Thr Glu Asn val val Arg Gin 165 170 Ala 175 Ile Asn Gin Gin Leu Ala Asn Asn Asp ile Gly Ser Leu Arg Lys 180 185 190 Gin Tyr Gin Ile Glu Leu Gin Leu Ile Asp Leu Lys Asn Ser Tyr Asn 195 200 205 Gin Gin Asn Leu Leu Lys Asn Asn Asp Gin Leu ser Leu Leu Tyr ser 210 215 220 Gin Gin Arg Tyr Asp Leu Leu Asn Leu Arg Leu Gin val Gin Asn ile 225 230 235 Gin Gin 240 Ile Al a Ile Gin Glu Vai Ile Asn Gin Lys Ser Leu Ser Gin 245 250 Val 255 Asn Gl n Leu Glu Gin Ala Gin Gin Gin Gin Gin Lys Thr Gin Asn 260 265 Gin 270 Gin Asp Tyr ile Gl n Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ala Leu Gly Tyr 275 280 285 Glu Leu Leu Gin Gin Thr Glu Lys Ala Asn ser Leu Thr Gin Asp Leu 290 295 300 Gin Arg Met Arg Asn ile Leu Asp Ser Leu Thr Gin Thr His Thr ile 305 310 315 320 Asp Glu Gin Ile Ser Ala Leu Gin Gly Thr Leu Val Leu Ser Arg Ile 325 330 335 69 ile Gin Gin Gin 340 Lys Gl n Lys Leu Leu Ser Lys 355 Gl n Ile Ala ASP Leu 360 Gin Lys 370 Arg Asn Glu Leu Tyr 375 Asp Glu 385 Ser Glu Asp Gly Lys 390 Gin Phe Lys Thr Leu Leu Thr 405 Glu Arg Arg Ser Leu Asn Asn 420 Gin Leu Asn Leu Gin Gin Ile 435 Thr Gin Ile ser Asp 440 Gin Ser 450 Phe Trp vai Lys Ser 455 Asn Lys 465 Met Leu Pro Arg Ala 470 Leu Ile Lys Leu Gly Phe Pro 485 Thr Asn Tyr Tyr Phe Leu Gly 500 Leu Phe Ile Val Asn Arg Ile 515 Lys Gin Gin Leu Asn 520 Leu Asp 530 Thr ASP Ser Gin Trp 535 ser Ala 545 Phe Leu Thr Leu Ser 550 ser Thr Met ile Gly Phe Phe 565 Phe Phe Lys Ser Phe ser Met 580 Ala Ser Tyr Trp Leu phe Arg 595 Pro Asn Gly ile phe 600 Glu Asn 610 Ala Gin Arg Phe Arg 615 Gly ile 625 vai Leu Leu Leu Asn 630 Thr Ser Gly Leu Ala Asn Asp 645 vai Leu Gly Ile Phe Cys Thr 660 Ala Ile lie Ala Ser Tyr Glu 675 Pro Glu Thr Asn Lys 680 Gin Ile 690 Gly Leu Arg Leu ile 695 Pro Leu 705 Gly Tyr Tyr Tyr Thr 710 Ala Leu Ser Tyr Ile Al a Trp 725 cys Val Trp Arg Gly Ile Thr 740 Vai Ser Ser Arg Glu Lys Arg 755 Arg Gin Lys Ala Leu 760 ser Asp 770 ASp vai vai Ala val 775 Gly Asn 785 Asp Vai Arg Ser Gin 790 Leu Leu

Gin Ile Gin Ser Lys Leu Glu Gin 445 Asn Pro Ile Asn Leu Asp Trp Ile 460 Glu Gin Phe Asn Gly Met Leu Lys 475 480 Asp Asn Leu Pro Tyr Leu Leu Met 490 495 Gly Gly Ala ile Phe Lys Phe Lys 505 510 Lys Ile Asn Arg Glu lie His Arg 525 Thr Pro Leu Ala Leu Leu Leu Thr 540 Leu Trp Phe Leu Ala Val Cys Gin 555 560 Asn Pro Glu Glu Phe Trp His Trp 570 575 Trp Phe Phe Thr Phe Trp Ile Ser 585 590 val Asn Hi s Phe Glu Ser Ser Lys 605 val ile Gin Arg Ile Ile ile Ala 620 val Phe ser Asn val Thr Asp ser 635 640 Glu Ile Asn Thr ll 8 Thr Al a Leu 650 655 Pro Arg Phe Asn Arg Val Leu Arg 665 670 Hi s His Trp Leu Ile Lys Ile Val 685 val Gly Leu ile Val Leu ile Val 700 Asn Leu ile Glu Hi s Phe ile His 715 720 Trp Leu val Arg Asn Thr ile Tyr 730 735 Ala Arg Leu Ala His Arg Arg Leu 745 750 Glu Asn Asn Tyr Glu 7CC Asn Ile Ser Glu Pro Glu Glu f O j Gly Leu Al a Leu 780 Arg Phe Val ASP Leu Phe ile Trp 795 800

Pro Thr Asn Leu Asn ile Gin Gly 345 350

Arg vai His lie Phe Asp ile Thr 365

Leu Asp Asn Tyr lie Asn Lys vai 380

Thr Glu Ala Glu Arg Thr Gin vai 395 400

Lys Met Thr ser Asp Leu lie Lys 410 415

Ala Ile Ser Leu Glu Leu Thr Gin 425 430 70

Thr Ala Leu Leu Gly He Phe Tyr Tyr vai Trp ser Asp Leu vai Thr 805 810 815

Vai Vai Ser Tyr Leu Arg Glu Ile Thr Leu Trp Gin Gin Thr Thr Thr 820 825 830

Thr asp Ala Gly Thr Vai Met Glu Ser ile Thr Leu Phe Asn Leu Leu 835 840 845 vai Ala Leu vai ile Leu Gly ile Thr Tyr vai Leu vai Arg Asn ile 850 855 860

Ser Gly Ile Leu Glu vai Leu ile Phe Ser Arg vai Asn Leu Ser Gin 865 870 875 880

Gly Thr Pro Tyr Thr Ile Thr Thr Leu Leu Thr Tyr Ile Phe Ile Ala 885 890 895

Ile Gly Gly Ala Trp Ala Phe Ala Thr Leu Gly Met ser Trp ser Lys 900 905 910

Leu Gin Trp Leu Phe Ala Ala Leu Ser Vai Gly Leu Gly Phe Gly Met 915 920 925

Gin Glu Ile Phe Ala Asn Phe vai Ser Gly ile ile Leu Leu Phe Glu 930 935 940

Arg Pro ile Arg vai Gly Asp vai vai Thr ile Asn Gly vai ser Gly 945 950 955 L 960

Thr Vai Ala Lys ile Arg ile Arg Ala ile Thr Leu ile Asp Phe Asp 965 970 L 9n5

Arg Lys Glu ile Ile vai Pro Asn Lys ser Phe vai Thr Gly Gin Vai 980 985 990

Thr Asn Trp Ala Leu Ser Ser Thr Met Thr Arg Leu Vai Ile Ser Vai 995 1000 1005

Gly val Ala Tyr Gly Ser Asp Leu Thr Leu Vai Arg Gin Leu Leu 1010 1015 1020

Leu Gin Ala Ala Asp Glu Gin Pro Thr val Leu Arg Asp Pro Lys 1025 1030 1035

Pro ser Ala Tyr Phe Leu Thr Phe Gly Ala Ser Thr Leu Asp His 1040 1045 1050

Glu Leu Arg val Tyr val Glu Gin Val Gly Asp Arg Thr ser Thr 1055 1060 1065

Thr Asp Ala ile Asn Arg Arg ile Asn Glu Leu Phe Ala Glu His 1070 1075 , 1080

Asn Ile Asp ile Ala Phe Asn Gin Leu Asp val Phe He Lys Asn 1085 1090 1095

Asn Asp Thr Gly Glu Glu Ile Pro Phe Val Asp Val Lys Lys íioo 1105 mo

<210> 23 <211> 816 <212> ADN <213> Haemophilus influenzae 71 <4Ο0> 23 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 816 atgaaattaa tgtaaagaag tctggccctg ttagacgttc ggtgatttag aaaaatttaa tctaaaaaaa gatccaacaa aaagatgcaa aacatcactg gtagtaaaca gtagaagata agcaaagctg caaaaacact aacaactttt acaaaaaacc agcatcaagt aattcgttga atgcaaacgc ataacttagt tcaaaaatgt accgtggtcg ataaccttct aagtagatac atacttatgc aagattctcc ttcaagattt ttaaagatgg tgcaatcact tgaagcagca tgcagaaatt attcaatgac aatgcaacat tatcgtgggt gaatgaatta tgcattaatt ttcaactgta ttctgttgcg gggtcaagta atatgtgaac cgtaaaatct cgttgtaaaa gcaatcgcat gcaccgctta gcagcaaaag tacgcattac aaaccttatt aatactttcg caagacggtg cttcttgaaa ttagatattg gcacgcgcat ggcttaaatg attatcgttt taccaaacag ggttgg cagctctcgt aaatcaaagt tcgctaaaga caaatgaagc tagatgaaga tctatccatt ctaaagttgt aacaaggttt ttgaaaatcc tagacgacgt ctcaagatga ctcgtaccga aagaagttta tttaacaggc aggcgtgatg aaaatatggt tgtagctaaa tgcaaaagcg agcgggttat tgttcctaac aatcaaatta gaaaaaatta tgatttagct cggtgtattt taacaaagac ccaagaagct

<210> 24 <211> 272 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <220> <221> SINAL <222> (1)..(13) <400> 24

Met Lys Leu Lys Gin Leu Phe Ala ile Thr Ala Ile Ala Ser Ala Leu 1 5 10 Ala 15 Vai Leu Thr Gly cys Lys Glu Asp Lys Lys Pro Glu Ala Ala Pro 20 25 30 val Ala Leu Lys lie Lys vai Gly Val Met Ser Gly Pro Glu His Gin 35 40 45 val Gin Glu ile Ala Ala Lys vai Ala Lys Glu Lys Tyr Gly Leu Asp 50 55 60 val Ala Phe Vai Glu Phe Asn Asp Tyr Ala Leu Pro Asn Glu Ala Lys 65 70 75 80 Gly Asp Leu Asp Ala Asn Ala Met Gin His Lys Pro Tyr Leu Asp Glu 85 90 95 Thr Asp Ala Lys Ala Lys Asn Leu Asn Asn Leu Val Ile Val Gly Asn 100 105 110 val Phe Vai Tyr Pro Leu Ala Gly Tyr Ser Lys Lys Ile Lys Asn Asn 115 120 125 Thr Glu Leu Gin Asp Gly Ala Lys Val val Val Pro Asn Asp pro Asn 130 135 140 Ile Arg Gly Arg Ala Leu ile Leu Leu Glu Lys Gin Gly Leu Lys Leu 145 150 155 Val Glu 160 Lys Asp Ala Asn Asn Leu Leu Ser Thr Val Leu Asp ile Asn 165 170 Ala 175 ΡΓΟ Lys Lys Leu Asn ile Thr Glu Val Asp Thr Ser Val Ala Arg 180 185 190 Ala Gly Ala Leu Asp Asp Vai Asp Leu Ala Val val Asn Asn Thr Tyr 195 200 205 72

Gin Val Gly Leu Asn Ala Gin Asp 210 215

Asp Ser Pro Tyr val Asn ile ile 225 230

Ser Lys Ala Val Gin Asp Phe Val 245 Tyr Gin Glu Ala Gin Lys His Phe 260

Asp Gly val Phe val Glu Asp 220 Val Ser Arg Thr Asp Asn Lys 235 Lys Ser Tyr Gin Thr Glu Glu

Lys 250

Asp 240 Val 255

Asp Gly Val val Lys Gly Trp 270

<210> 25 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAMJ342 <400> 25 caaggcgttt tcatatgcct gtcattcggc agg 33

<210> 26 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador HAMJ343 <400> 26 45 ctaattgacc tcgagttttg ctgcttttaa ttcttgataa tattg <210> 27 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial 73 <220> <223> Iniciador HAMJ345 <400> 27gtaaggaaac atacatatga aaaaactttt aaaaattagt g 41 <210> 28 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador HAMJ344 <400> 28 ttagagactc gagtttagct aaacattcta tgtagctatc 40 <210> 29 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAM3348 <40 0> 29 cctaacattg acatatgctt atgaaactaa aagcaaca <210> 30 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial 38 74 34 <220> <223> Iniciador HAMJ349 <400> 30 tcaatatctc gagtttacca tcaacactca cacc <210> 31 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAMJ346 <40 0> 31 42 ctaataagga aaaccatatg atgaacagac gtcattttat tc <210> 32 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador HAMJ3 9 9 <400> 32 39 gacctagctc gagtttagat aaatcaattt gatacactg

<210> 33 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial 75 41 <220> <223> Iniciador HAMJ376 <400> 33 cataaggagt aacatatgaa aaaaattatt ttaacattat c

<210> 34 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAMJ377 <400> 34 31 gtgcagattc tcgagttttt tatcaactga a

<210> 35 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador HAMJ460 <400> 35 33 ctggacagac catatgcctt ctgatttagt cgc

<210> 36 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial 76 <220> <223> Iniciador HAMJ461 <400> 36 ctaaattgag ctcgagatta gtttttaatt tactcc 36 <210> 37 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAMJ458 <40 0> 37 ctttcttata gcatatgaag aaatttttaa ttgcgatt 38 <210> 38 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAMJ459 <40 0> 38 cttccgcact cgagtttggc atttttc 27 <210> 39 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial 77 35 <220> <223> Iniciador HAMJ477 <400> 39 ggaaggagct agcatgaaaa tgaaaaaatt tattc <210> 40 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador HAMJ478 <400> 40 ttgatactct cgagtttatt aaaatactg <210> 41 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador HAMJ481 <400> 41 ctttaatcac atatgactat gtttaaaaaa <210> 42 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial 29 37 78 <220> <223> Iniciador HAMJ482 <40 0> 42 caccaatctc gagtttagat gtacaggctt <210> 43 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAMJ 7 8 <40 0> 43 acccgcatgg ctgttcaaat ctacttggta <210> 44 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador HAMJ 7 9 <40 0> 44 actcgtcgac ttagtttgca actggtacaa <210> 45 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial 79 35 <220> <223> Iniciador HAMJ414 <400> 45 gattagggaa aacatatgat taggaaactt atgaa

<210> 46 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAMJ415 <400> 46 31 ccataatttg ctcgagtttt tttacatcaa c

<210> 47 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador HAMJ450 <400> 47 35 ggaaggagct agcatgaaat taaaacaact ttttg

<210> 48 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial 80 <22 0> <223> Iniciador HAMJ411 <400> 48 gtgcggtagc tcgagccaac cttttac 27

<210> 49 <211> 379 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 49

Met Pro vai Ile Arg Gin vai val Phe Tyr Asp Ser Leu Thr Gly Glu 1 5 10 Ile Thr Ala 15 Gin Thr Lys Met Lys Lys Phe Ala Gly Leu Ser Phe val 20 25 Ala 30 Ala Ala Thr Leu Thr Ala cys Asn Asp Lys Asp Lys Gin Glu Thr 35 40 val 45 Ala Lys Ala Thr Ala Ala Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Tyr Thr Trp 50 55 Glu 60 Thr Thr Glu Tyr Vai Pro Asp Gly Leu Leu Asp Phe Lys Glu Thr 65 70 75 Glu 80 Gly ile Lys vai Ile Vai Ser Ser Leu Glu Ser Asn Thr Met Tyr 85 90 95 Ala Lys Leu Lys Thr Gin Gly Glu Ser Gly Gly Tyr Asp Val Ile Ala 100 105 Glu Gly 110 Pro Ser Asn Tyr Phe Vai Ser Lys Met Ala Arg Met Leu Lys 115 120 Glu 125 Glu Leu Asp Hi s ser Lys Leu Pro val Leu Lys Leu Asp Pro Asp 130 135 140 Trp Leu Asn Lys Pro Tyr Asp Lys Gly Asn Lys Tyr ser Leu Pro Gin 145 150 155 160 Leu Leu Gly Al a Pro Gly Ile Ala Phe Asn Thr Asn Thr Tyr Lys Gly 165 170 175 Glu Gin Phe Thr Ser Trp Ala Asp Leu Trp Lys Pro Glu Phe Ala Asn 180 185 190 Lys vai Gin Leu Leu Asp Asp Ala Arg Glu Val Phe Asn Ile Ala Leu 195 200 205 Leu Lys Ile Gly Gin Asp Pro Asn Thr Gin Asp Pro Ala Ile Ile Lys 210 215 220 Gin Ala Tyr Glu Glu Leu Leu Lys Leu Arg Pro Asn val Leu Ser Phe 225 230 235 240 Asn Ser Asp Asn Pro Ala Asn Ser Phe Ile ser Gly Glu Val Glu Val 245 250 255 Gly Gin Leu Trp Asn Gly Ser val Arg Ile Ala Lys Lys Glu Lys Ala 260 265 270 Pro Leu Asn Met Vai Phe Pro Lys Glu Gly pro val Leu Trp val Asp 275 280 285 Thr Leu Ala ile Pro Vai Thr Ala Lys Asn pro Glu Gly Ala His Lys 290 295 300 81

Leu Ile Asn Tyr Met Leu Gly Lys Lys Thr Ala Glu Lys Leu Thr Leu 305 310 315 320

Ala ile Gly Tyr Pro Thr ser Asn Ile Glu Ala Lys Lys Ala Leu Pro 325 330 335

Lys Glu ile Thr Glu Asp Pro Ala Ile Tyr pro Ser Ala Asp ile Leu 340 345 350

Lys Asn Ser His Trp Gin Asp Asp Vai Gly Asp Ala Ile Gin Phe Tyr 355 360 365

Glu Gin Tyr Tyr Gin Glu Leu Lys Ala Ala Lys 370 375

<210> 50 <211> 379 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 50

Met 1 Pro vai Ile Arg 5 Gin val Val Phe Tyr Asp 10 ser Leu Thr Gly Glu 15 Gin Thr Lys Met 20 Lys Lys Phe Ala Gly 25 Leu Ile Thr Ala Ser 30 Phe Val Ala Ala Thr 35 Leu Thr Ala Cys Asn 40 Asp Lys Asp Ala Lys 45 Gin Glu Thr Ala Lys 50 Ala Thr Ala Ala Ala 55 Asn Asp Thr val Tyr 60 Leu Tyr Thr Trp Thr 65 Glu Tyr vai Pro Asp 70 Gly Leu Leu Asp Glu 75 Phe Thr Lys Glu Thr 80 bly Ile Lys Vai Ile 85 val ser Ser Leu Glu Ser 90 Asn Glu Thr Met Tyr 95 Ala Lys Leu Lys 100 Thr Gin Gly Glu ser 105 Gly Gly Tyr Asp val 110 Ile Ala pro Ser Asn 115 Tyr Phe val Ser Lys 120 Met Ala Arg Glu Gly 125 Met Leu Lys Glu Leu 130 Asp Hi s Ser Lys Leu 135 Pro Val Leu Lys Glu 140 Leu Asp Pro Asp Trp 145 Leu Asn Lys Pro Tyr 150 Asp Lys Gly Asn Lys 155 Tyr Ser Leu Pro Gin 160 Leu Leu Gly Ala Pro 165 Gly Ile Ala Phe Asn Thr 170 Asn Thr Tyr Lys Gly 175 Glu Glu Phe Thr 180 Ser Trp Ala Asp Leu 185 Trp Lys Pro Glu Phe 190 Ala Asn Lys vai Gin 195 Leu Leu Asp Asp Ala 200 Arg Glu Val Phe Asn 205 ile Ala Leu Leu Lys 210 Ile Gly Gin Asp Pro 215 Asn Thr Gin Asp Pro 220 Ala ile ile Lys Gin 225 Al a Tyr Glu Glu Leu 230 Leu Lys Leu Arg Pro 235 Asn Val Leu Ser Phe 240 Asn Ser Asp Asn Pro 245 Ala Asn Ser Phe lie Ser 250 Gly Glu Val Glu Val 255 Gly Gin Leu Trp 260 Asn Gly Ser val Arg 265 Ile Ala Lys Lys Glu 270 Lys Ala Pro Leu Asn 275 Met Vai Phe Pro Lys 280 Glu Gly Pro val Leu 285 Trp Val Asp Thr Leu 290 Ala Ile Pro Ala Thr 295 Ala Lys Asn Ser Glu 300 Gly Ala His Lys 82

Leu Ile Asn Tyr Met Leu Gly Lys Lys Thr Ala Glu Lys Leu Thr Leu 305 310 315 320

Ala Ile Gly Tyr Pro Thr Ser Asn Ile Glu Ala Lys Lys Ala Leu Pro 325 330 335

Lys Glu ile Thr Glu Asp Pro Ala ile Tyr Pro ser Ala Asp Ile Leu 340 345 350

Lys Asn Ser His Trp Gin Asp Asp vai Gly Asp Ala Ile Gin Phe Tyr 355 360 365

Glu Gin Tyr Tyr Gin Glu Leu Lys Ala Ala Lys 370 375

<210> 51 <211> 379 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 51 Met Pro Val Ile Arg Gin Val val Phe Tyr Asp Ser Leu Thr 1 5 10 Gin Thr Lys Met Lys Lys Phe Ala Gly Leu Ile Thr Ala Ser 20 25 30 Ala Al a Thr Leu Thr Ala cys Asn Asp Lys Asp Ala Lys Gin 35 40 45 Ala Lys Ala Thr Ala Ala Ala Asn Asp Thr Val Tyr Leu Tyr 50 55 60 Thr Glu Tyr val Pro Asp Gly Leu Leu Asp Glu Phe Thr Lys 65 70 75 Glu Thr Gly ile Lys val Ile val Ser Ser Leu Glu Ser Asn 85 90 Ala Lys Leu Lys Thr Gin Gly Glu ser Gly Gly Tyr Asp val 100 105 Glu Gly 110 Pro ser Asn Tyr Phe Val Ser Lys Met Ala Arg Met 115 120 Glu 125 Glu Leu Asp His Ser Lys Leu Pro Val Leu Lys Leu Asp 130 135 140 Trp Leu Asn Lys Pro Tyr Asp Lys Gly Asn Lys Tyr Ser Leu 145 150 155 Thr Leu Leu Gly Ala Pro Gly ile Ala phe Asn Thr Asn Tyr 165 170 Glu Phe Glu Gin Phe Thr Ser Trp Ala Asp Leu Trp Lys Pro 180 185 Val Phe 190 Lys val Gin Leu Leu Asp Asp Ala Arg Glu Asn Ile 195 200 205 ile Leu Lys Ile Gly Gin Asp Pro Asn Thr Gin Asp Pro Ala 210 215 220 val Gin Ala Tyr Glu Glu Leu Leu Lys Leu Arg Pro Asn Leu 225 230 235 Gly Glu Val Asn Ser Asp Asn Pro Ala Asn Ser Phe ile Ser 245 250 Ala Glu Gly Gin Leu Trp Asn Gly Ser Val Arg Ile Lys Lys 260 265 270

Gly Glu 15

Phe Val

Glu Thr

Thr Trp

Glu Thr 80

Met Tyr 95 ile Ala

Leu Lys

Pro Asp

Pro Gin 160 Lys Gly 175

Ala Asn

Ala Leu ile Lys

Ser Phe 240 Glu Val 255

Lys Ala 83

Pro Leu Asn Met vai Phe Pro Lys Glu Gly Pro vai Leu Trp Vai Asp 275 280 285 Thr Leu Ala ile Pro vai Thr Ala Lys Asn Pro Glu Gly Ala Hi s Lys 290 295 300 Leu ile Asn Tyr Met Leu Gly Lys Lys Thr Ala Glu Lys Leu Thr Leu 305 310 315 320 Ala lie Gly Tyr Pro Thr Ser Asn Ile Glu Ala Lys Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Lys Glu ile Thr Glu Asp Pro Ala ile Tyr Pro Ser Al a Asp Ile Leu 340 345 350 Lys Asn Ser His Trp Gin Asp ASp vai Gly Asp Ala ile Gin Phe Tyr 355 360 365 Glu Gin Tyr Tyr Gin Glu Leu Lys Ala Ala Lys 370 375

Lisboa, 28 de Outubro de 2013 84

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido isolado seleccionado de: (a) um polipéptido que tem mais de 99% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°:10; (b) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 10; (c) o polipéptido de (a) ou (b) , em que o resíduo Met N-terminal é removido; e (d) o polipéptido de (a) ou (b) , em que a sequência de aminoácidos secretora é removida; em que polipéptido isolado pode induzir uma resposta imune a Haemophilus influenzae.
2. 2. Composição farmacêutica imunogénica compreendendo um polipéptido isolado seleccionado de: de identidade SEQ ID N°:10; de identidade SEQ ID N°:10; de identidade SEQ ID N°:10; de identidade SEQ ID N°:10; de identidade SEQ ID N°:10; de aminoácidos (a) um polipéptido que tem, pelo menos, 70% com a sequência de aminoácidos apresentada em (b) um polipéptido que tem, pelo menos, 80% com a sequência de aminoácidos apresentada em (c) um polipéptido que tem, pelo menos, 85% com a sequência de aminoácidos apresentada em (d) um polipéptido que tem, pelo menos, 90% com a sequência de aminoácidos apresentada em (e) um polipéptido que tem, pelo menos, 95% com a sequência de aminoácidos apresentada em (f) um polipéptido compreendendo a sequência apresentada em SEQ ID N°: 10; 1 (g) um polipéptido que compreende um fragmento imunogénico consistindo de, pelo menos, 15 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N° : 10, em que o fragmento imunogénico pode induzir uma resposta imune a Haemophilus influenzae; (h) o polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f) ou (g), em que o residuo Met N-terminal é removido; e (i) o polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e), (f) ou (g), em que a sequência de aminoácidos secretora é removida; em que o polipéptido isolado pode induzir uma resposta imune a Haemophilus influenzae; e um veiculo, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
3. 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, em que que o polipéptido é como definido na reivindicação 1.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2 ou 3 para utilização no tratamento profiláctico ou terapêutico de otite média, sinusite, bronquite, pneumonia e meningite ou bacteremia mediada por infecção bacteriana de Haemophilus influenzae.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2 ou 3 para utilização no tratamento profiláctico ou terapêutico de infecção bacteriana de Haemophilus influenzae num indivíduo susceptível à infecção de Haemophilus influenzae.
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2 ou 3 para utilização no tratamento profiláctico ou terapêutico de infecção de Haemophilus influenzae. 2
7. 7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, em que (a) Haemophilus influenzae é Haemophilus influenzae não tipável ou (b) Haemophilus influenzae é Haemophilus influenzae tipável. Lisboa, 28 de Outubro de 2013 3