JP2004509647A - ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 - Google Patents
ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004509647A JP2004509647A JP2002532471A JP2002532471A JP2004509647A JP 2004509647 A JP2004509647 A JP 2004509647A JP 2002532471 A JP2002532471 A JP 2002532471A JP 2002532471 A JP2002532471 A JP 2002532471A JP 2004509647 A JP2004509647 A JP 2004509647A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- polynucleotide
- nos
- haemophilus influenzae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 title claims abstract description 114
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 title claims abstract description 110
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 66
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 273
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 264
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 262
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 68
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 68
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 36
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 31
- 206010061190 Haemophilus infection Diseases 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 claims description 10
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 10
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 claims description 7
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 2
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 2
- -1 nitroaryl halides Chemical class 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229910017081 AlNH4(SO4)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100406392 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) omp26 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241001246312 Otis Species 0.000 description 1
- 101150103068 P2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000022760 infectious otitis media Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002796 poly[α-(4-aminobutyl)-L-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000037384 skin absorption Effects 0.000 description 1
- 231100000274 skin absorption Toxicity 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- ZZIZZTHXZRDOFM-XFULWGLBSA-N tamsulosin hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].CCOC1=CC=CC=C1OCCN[C@H](C)CC1=CC=C(OC)C(S(N)(=O)=O)=C1 ZZIZZTHXZRDOFM-XFULWGLBSA-N 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本発明は、予防、診断及び／又は治療のために用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼのポリぺプチドに関する。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトのような個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）感染症を予防、診断及び／又は治療するのに用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼのポリぺプチド及び対応ＤＮＡ断片に関する。
【０００２】
発明の背景
ヘモフィルス・インフルエンゼは、ヒト病原体としてのみ天然に見出されているグラム陰性桿菌である。ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の分離物は、封入形態と非封入形態に更に分けることができる。封入菌株は、“ａ”〜“ｆ”型を示している６種の構造上と抗原性で異なる莢膜多糖の１種である。非封入菌株は、認識されたヘモフィルス・インフルエンゼ莢膜多糖に対する抗血清と凝集することができないことによって定義され、非型別不能を意味する。
【０００３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株は、一般に、鼻咽腔や後口腔咽頭を含む上気道にコロニー形成する。多くの健康な個体の調査から小児と成人両方でコロニー形成率４０％〜８０％が示されている（Ｓｐｉｎｏｌａ Ｓ．Ｍ．， Ｐｅａｃｏｃｋ Ｊ．， Ｄｅｎｎｙ Ｆ．Ｗ．， Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｌ． ＆ Ｃａｎｎｏｎ Ｊ．Ｇ． （１９８６） Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ： ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １５４：１００−１０９； Ｔｒｏｔｔｉｅｒ Ｓ．， Ｓｔｅｎｂｅｒｇ Ｋ． ＆ Ｓｖａｎｂｏｒｇ−Ｅｄｅｎ Ｃ． （１９８９） Ｔｕｒｎ ｏｖｅｒ ｏｆ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７：２１７５−２１７９）。具体的な菌株とのコロニー形成によって、たいていの個体において数週間か数ヶ月間この期間全体に無症候のままであることにより持続してしまう。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼに基づく疾患の発生機序は、気道内での近接拡散を必要とする。隣接領域への拡散は、通常は非特異的又は特異的ホスト防御における異常の結果である。そのようにして、ヘモフィルス・インフルエンゼは耳炎、副鼻腔炎、気管支炎又は肺炎を含む小児や成人における種々の呼吸器系感染症を引き起こす。これらの感染症は、気管支炎又は耳炎をもつ患者において慢性又は再発することがある。実際に、乳児や小児では型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは、急性中耳炎がしばしば起こり、一般的には再発中耳炎に関係があるとされている（Ｈａｒａｂｕｃｈ Ｙ．， Ｆａｄｄｅｎ Ｈ．， Ｙａｍａｎａｋａ Ｎ．， ｄｕｆｆｙ Ｌ．， Ｗｏｌｆ Ｊ．， Ｋｒｙｓｔｏｆｉｋ Ｄ． ＆ Ｔｎａｗａｎｄａ／Ｗｉｌｌｉａｍｓｖｉｌｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ． （１９９４） Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｎｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７０：８６２−８６６）。
【０００４】
乳児では、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは１歳までは中耳炎の最初のエピソードの２７〜３７％に関与している（Ｓｍｉｔｈ−Ｖａｕｇｈａｎ Ｈ．Ｃ．， Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ Ｋ．Ｓ．， Ｍａｔｈｅｗｓ Ｊ．Ｄ． ＆ Ｋｅｍｐ Ｄ．Ｊ． （１９９７） Ｎｏｎｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ａｂｏｒｉｇｉｎａｌ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ： ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃａｒｒｉａｇｅ ｏｆ Ｐ２ ｐｏｒｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５：１４６８−１４７４； Ｔｅｅｌｅ Ｄ．Ｗ．， Ｋｌｅｉｎ Ｊ．Ｏ．， Ｒｏｓｎｅｒ Ｂ． ＆ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ Ｏｔｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａ ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ． （１９８９） Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｅｖｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｌｉｆｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ： ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ， ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６０：８３−９４）。髄膜炎は、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼによってしばしば引き起こされ、すべての症例の１〜３％ とみなされている。しかし、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）や嚢胞性線維症のような生来の粘膜免疫系に働く基礎にある疾患をもつホストにおいて特に優勢である（Ｍｕｒｐｈｙ Ｔ．Ｆ． ＆ Ｓｅｔｈｉ Ｓ． （１９９２） Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １４６：１０６７−１０８３； Ｓｔ． Ｇｅｍｅ Ｊ．Ｗ． ＩＩＩ． （１９９３） Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｄｉｓｅａｓｅ： ｅｐｉｄｅｍｉｌｏｇｙ， ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ａｇｅｎｔｓ Ｄｉｓ． ２：１−１６）。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株は、痰が粘液膿性になるときの悪化の間に主に見られる。慢性気管支炎の急性感染性の悪化は、慢性肺疾患をもつ患者の疾病率と死亡率に重要な役割を果たしている。
【０００５】
院外感染性肺炎の病因は、この十年間で変化してきたと思われる。ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は依然として主な病原体であるが、他の微生物を含む症例の割合が増加してきた。ヘモフィルス・インフルエンゼは、肺炎の第２の最も一般的な原因であると現在しばしば報告されている。ヘモフィルス・インフルエンゼ肺炎症例の１０％ は、菌血症になる。発展途上国では、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼによる肺炎が小児における疾病率と死亡率の重要な原因であることは明らかである。
【０００６】
数種のヘモフィルス・インフルエンゼｂ型多糖結合ワクチンが開発されたが、これらのワクチンは他のヘモフィルス・インフルエンゼ株による疾患に対しては無効である（Ｓｃｈｅｉｆｅｌｅ Ｄ．Ｗ．， Ｊａｄａｖｊｉ Ｔ．Ｐ．， Ｌａｗ Ｂ．Ｊ．， Ｇｏｌｄ Ｒ．， Ｍａｃｄｏｎａｌｄ Ｎ．Ｅ．， Ｌｅｂｅｌ Ｍ．Ｈ．， Ｍｉｌｌｓ Ｅ．Ｌ．， Ｄｅｒｙ Ｐ．， Ｈａｌｐｅｒｉｎ Ｓ．Ａ．， Ｍｏｒｒｉｓ Ｒ．Ｆ．， Ｍａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ Ｖ． ＆ Ｄｕｃｌｏｓ Ｐ．Ｊ． （１９９６） Ｒｅｃｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎａｄａ． Ｃａｎ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． Ｊ． １５４：１０４１−１０４７； Ｓｃｈｕｌｔｅ Ｅ．Ｅ．， Ｂｉｒｋｈｅａｄ Ｇ．Ｓ．， Ｋｏｎｄｒａｃｋｉ Ｓ．Ｆ． ＆ Ｍｏｒｓｅ Ｄ．Ｌ． （１９９４） Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔａｔｅ， １９８７−９９１： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｄａｙ−ｃａｒｅ ａｔｔｅｎｄａｎｃｅ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ９４：１０１４−１０１６）。保存交差防御抗原の同定は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染や疾患に対する広域ワクチンの開発に重要である。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、ＰＣＰ、ＯＭＰ２６又はＤ−１５のような外膜タンパク質が同定され、現在は潜在的ワクチン抗原としても追究されている（Ｆｏｘｗｅｌｌ Ａ．Ｒ．， Ｋｙｄ Ｊ．Ｍ． ＆ Ｃｒｉｐｐｓ Ａ．Ｗ． （１９９８） Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ： Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：２９４−３０８）。プロテインＤ−１５は、科学文献に多重血清型や型別不能菌株に対して防御を与えることができると記載されている唯一の保存免疫原である。
それ故、ヒトのような個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を予防、診断及び／又は治療するのに用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドが依然として強く求められている。
【０００７】
発明の要約
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドに関する。
他の態様においては、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリぺプチド、医薬組成物、発現制御領域に作用可能に結合した本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターでトランスフェクトしたホスト細胞及び前記ホスト細胞を発現に適した条件下で培養する段階を含むポリぺプチドの生産方法が提供される。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を予防、治療、及び／又は診断するために用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドをコードする精製分離したポリヌクレオチドを提供する。本発明は、１２の別個の好ましいポリヌクレオチドを提供し、各々が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３の１つによって別個に定義されている。更に、本発明は、１２の別個のポリぺプチドを提供し、各々が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、又は２４の１つによって別個に定義されている。本発明には本出願において本明細書に記載されているようにそのようなポリぺプチドの突然変異体、変異体、相同体又は誘導体のような類似体をコードするポリヌクレオチドが含まれることを当業者は理解している。本発明は、本発明のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子も包含している。ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子のほかに、本発明は対応ポリぺプチドとそのようなポリぺプチドに特異的に結合する単一特異抗体を包含している。
【０００９】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープに関する。
【００１１】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含むポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１３】
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
相同％ は、アミノ酸型の同一％ と類似％ 又は保存％ の合計として定義される。
アミノ酸配列を比較するためにＣＬＵＳＴＡＬプログラムのようなプログラムを使用し得る。このプログラムによって、アミノ酸配列が比較され、適するように両配列のスペースを挿入することにより最適アラインメントが見出される。最適アラインメントのアミノ酸同一又は類似（アミノ酸型の同一と保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似の配列の最長の伸長物を配列させ、価値を一致まで対応させる。このようにいくつかの類似領域が見られる比較を得ることが可能であり、各々が異なるスコアをもっている。両方のタイプの同定分析が本発明に企図されている。
【００１４】
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは抗原性である。
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは免疫原性である。
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは個体において免疫応答を誘発し得る。
他の実施態様においては、本発明は、上で定義した本発明のポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチド又はその断片又は類似体に結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
“結合特異性を有する”抗体は、選択されたポリぺプチドを認識結合するが試料、例えば、生体試料中の他の分子をほとんど認識結合しない抗体である。特異結合は、選択されたポリぺプチドが抗原として使われるＥＬＩＳＡ分析を用いて測定し得る。
【００１５】
本発明によれば、生物学的実験における“防御”は生存曲線、生存率又は生存期間の著しい増加によって定義される。生存曲線を比較するログランク試験、また、生存率や死亡するまでの日数を比較するフィッシャー確定試験を用いる統計分析がＰ値を計算するとともに２つのグループ間の差が統計的に有意であるかを求めるために用いることができる。０．０５のＰ値は有意とみなされない。
本発明の他の態様においては、本発明のポリぺプチドの抗原性／免疫原性断片、又はその類似体が提供される。
本発明の断片は、１種以上のそのエピトープ領域を含まなければならず、抗原性／免疫原性の性質を保持するその領域にも十分似ていなければならない。従って、本発明の断片の場合、記載されたポリぺプチド又はその類似体の具体的な部分に１００％ 同一であってもよいので、同定度はおそらく無関係である。本発明は、更に、本発明のポリぺプチド配列から少なくとも１０の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。実施態様においては、少なくとも１５の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。実施態様においては、少なくとも２０の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。
【００１６】
前と同様に、重要な課題は断片が抗原性／免疫原性の性質を保持することである。
本発明のポリぺプチドの断片、類似体又は誘導体が本発明に関連して、即ち、抗原性／免疫原性材料として使われることは当業者によって理解される。従って、例えば、１つ以上の付加、欠失、置換等を含むポリぺプチドは本発明によって包含される。
本明細書に用いられる本発明のポリぺプチドの“断片”、“類似体”又は“誘導体”には、アミノ酸残基の１つ以上が保存アミノ酸残基で置換され（好ましくは保存され）かつ天然であっても天然でなくてもよいポリぺプチドが含まれる。実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体や類似体は、図面に示された配列又はその断片と約７０％ が同一である。即ち、残基の７０％ が同じである。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が８０％より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９５％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９９％ より多い。他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドの類似体は置換、修飾又は欠失が約２０のアミノ酸残基より少なく、好ましくは１０未満である。
【００１７】
実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体又は類似体は、図面に示された配列又はその断片と約７０％ が相同である。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が８０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９５％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９９％ より多い。他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体又は類似体はアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失が約２０より少なく、更に好ましくは１０未満である。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
【００１８】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を特徴とするポリぺプチドを提供する。
【００１９】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
【００２０】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列を含むポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列を特徴とするポリぺプチドを提供する。
これらの置換は、ポリぺプチドの二次構造と親水性に対して影響が最少のものである。好ましい置換は、保存された当該技術において既知のものである。即ち、置換残基が疎水性、サイズ、電荷又は官能基のような物理的又は化学的性質を共有するものである。Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５， １９７８； Ａｒｇｏｓ， Ｐ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８， ７７９−７８５， １９８９に記載された置換が含まれる。例えば、下記群の１つに属する天然の或いは天然でないアミノ酸は保存的変化である。
ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｖａｌ；
ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
ｌｙｓ、ａｒｇ、ｏｒｎ、ｈｉｓ；及び
ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
好ましい置換には、対応するＬ−アミノ酸をＤ−エナンチオマーに置換することが含まれている。
【００２１】
好ましくは、本発明のポリぺプチドの断片、類似体又は誘導体は少なくとも１つの抗原領域、即ち、少なくとも１つのエピトープを含む。
代替的方法においては、類似体は精製を容易にする部分を取り込んでいる、例えば、所望のポリぺプチドを効果的にタグ標識することによる融合ポリぺプチドであり得る。“タグ”を除去することは必要なことであり、融合ポリぺプチド自体が用いるのに十分な抗原性を保持している例であってもよい。
従って、類似体、誘導体又は断片について重要なことは、少なくともタンパク質又はポリぺプチドが由来している程度の抗原性／免疫原性をもっていることである。
ポリぺプチドの生物学的性質又は薬理学的性質を変える他の化合物、即ち、半減期を増大させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、精製を容易にするリーダー配列又は分泌アミノ酸配列、プレプロ配列又はプロ配列又は（多）糖を融合したポリぺプチドも包含される。
更に、アミノ酸領域が多型であることがわかった状態においては、異なるヘモフィルス・インフルエンゼ株の異なるエピトープを効果的にミミックするように１つ以上の具体的なアミノ酸を変えることが望ましい。
【００２２】
更に、本発明のポリぺプチドは、安定性、支持体又は他の分子に結合する高疎水性を得るために末端−ＮＨ２アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミノ化、例えば、アンモニア又はメチルアミンを用いた末端カルボキシアミノ化）により修飾し得る。
ポリぺプチド断片又は類似体のヘテロ又はホモポリぺプチド多量体も企図される。これらの重合体は、例えば、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒド又はジメチルスーパーイミデートのような架橋剤で架橋したポリぺプチド１種以上を含む。そのような重合体としては、組換えＤＮＡ技術によって生成したマルチシストロンｍＲＮＡから生産された縦列又は逆方向隣接配列を２つ以上有するポリぺプチドが含まれる。
他の実施態様においては、本発明は、本出願の図面に定義されたポリぺプチド又はその断片又は類似体又は誘導体を１種以上含むキメラポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドを２つ以上含むキメラポリぺプチドに関し、該ポリぺプチドはキメラポリぺプチドを形成するように結合されている。
【００２３】
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドを２つ以上含むキメラポリぺプチドに関し、該ポリぺプチドはキメラポリぺプチドを形成するように結合されている。
抗原重合体（即ち、合成多量体）の形成を達成するために、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハライド等を有するポリぺプチドを用いることができ、その試薬はチオ基に特異的である。それ故、異なるぺプチドの２つのメルカプト基間の結合は単結合であってもよく、炭素原子が少なくとも２個、典型的には少なくとも４個で１６個以下、通常は約１４個以下の結合基から構成されていてもよい。
具体的な実施態様においては、本発明のポリぺプチド断片又は類似体は、出発メチオニン（Ｍｅｔ）残基を含んでいない。好ましくは、ポリぺプチドはリーダー配列又は分泌配列（シグナル配列）を取り込まない。本発明のポリぺプチドのシグナル部分は、確立された分子生物学的手法に従って求めることができる。一般に、問題のポリぺプチドは、ヘモフィルス培養物から分離し、次に配列決定して成熟タンパク質の開始残基、それ故成熟ポリぺプチドの配列を求めることができる。
次の表Ａは、図面に記載された本発明のポリぺプチドのシグナル配列を記載したものである。
【００２４】
【表１】
【００２５】
本発明の他の態様によれば、（ｉ）本発明のポリぺプチドを担体、希釈剤又は補助剤と共に含む物質の組成物；（ｉｉ）本発明のポリぺプチドと担体、希釈剤又は補助剤とを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）本発明のポリぺプチドと担体、希釈剤又は補助剤とを含むワクチン；（ｉｖ）個体において免疫応答、例えば、ヘモフィルスに対する防御免疫応答を誘発する本発明のポリぺプチドの免疫原性的に有効な量を該個体に投与することによりヘモフィルスに対して免疫応答を誘発する方法； 特に（ｖ）本発明のポリぺプチドの予防又は治療量を必要としている個体に投与することによりヘモフィルス感染症（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）を予防及び／又は治療する方法が提供される。
免疫化する前に、本発明のポリぺプチドは、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、灰白髄炎ウイルスＶＰ１抗原又は他のウイルス毒素又は細菌毒素又は抗原のような担体タンパク質又は強い免疫応答の発生を刺激する適切なタンパク質にカップリング又はコンジュゲートし得る。このカップリング又はコンジュゲーションは化学的に又は遺伝的に行うことができる。ぺプチド−担体結合の詳しい説明は、Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ， Ｍ．Ｈ．Ｖ．， Ｂｒｉａｎｄ Ｊ．Ｐ．， Ｍｕｌｌｅｒ Ｓ．， Ｐｌａｕｅ Ｓ．，《Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ》Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１９ （ｅｄ．） Ｂｕｒｄｏｕ， Ｒ．Ｈ． ＆ Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ Ｐ．Ｈ． （１９８８）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで得られる。
【００２６】
他の態様によれば、１種以上の本発明のヘモフィルスポリぺプチドを薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は補助剤との混合物で含む医薬組成物が提供される。適切な補助剤としては、（１）水中油型エマルジョン製剤、例えば、ＭＦ５９（登録商標）、ＳＡＦ（登録商標）、Ｒｉｂｉ（登録商標）；（２）フロインド完全アジュバント又は不完全アジュバント；（３）塩、即ち、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４、シリカ、カオリン；（４）サポニン誘導体、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）又はそれから生成された粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；（５）サイトカイン、例えば、インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；（６）他の物質、例えば、炭素ポリヌクレオチド、即ち、ポリＩＣやポリＡＵ、無毒化コレラ毒素（ＣＴＢ）又は粘膜免疫を誘発する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定毒素が含まれる。補助剤の詳しい説明は、Ｍ．Ｚ．Ｉ Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． １１， Ｎｏ．１ （１９９４） ｐｐ２−１１からの総説、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． １３， Ｎｏ． １４， ｐｐ１２６３−１２７６ （１９９５）からの他の総説、国際出願第９９／２４５７８号で得られる。好ましい補助剤としては、ＱｕｉｌＡ（登録商標）、ＱＳ２１（登録商標）、Ａ１ｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕｐｈｏｓ（登録商標）が含まれる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収による非経口投与、又はバッカル又は経口投与することができる。
本発明の医薬組成物は、Ｐ．Ｒ． Ｍｕｒｒａｙ （Ｅｄ， ｉｎ ｃｈｉｅｆ）， Ｅ．Ｊ． Ｂａｒｏｎ， Ｍ．Ａ． Ｐｆａｌｌｅｒ， Ｆ．Ｃ． Ｔｅｎｏｖｅｒ ＆ Ｒ．Ｈ． Ｙｏｌｋｅｎ． Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． ７ｔｈ ｅｄ．， １９９９， ｐ１４８１−１４８２に記載されているヘモフィルス感染症及び／又はヘモフィルス感染症によって仲介される疾患又は症状の治療又は予防に用いられ、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。実施態様においては、本発明の医薬組成物は、中耳炎（急性又は再発）、副鼻腔炎、気管支炎、肺塩、髄膜炎又は菌血症の治療又は予防に用いられる。実施態様においては、本発明の医薬組成物は、ヘモフィルス感染症及び／又はヘモフィルス感染症によって仲介される疾患又は症状の治療又は予防に用いられる。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症はヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症は型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症は型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）である。
【００２８】
本出願において用いられる“個体”という用語は哺乳動物が含まれる。他の実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
具体的な実施態様においては、医薬組成物は、乳児、高齢者又はイムノコンプロマイズド個体のようなヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の恐れがある個体に投与される。
医薬組成物は、免疫処置の間に約１〜６週間の間隔で１〜３回好ましくは約０．００１〜１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）、更に好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜１μｇ／ｋｇの単位剤形にある。
医薬組成物は、免疫処置の間に約１〜６週間の間隔で１〜３回好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ〜１ ｍｇ、最も好ましくは１０〜１００μｇの単位剤形にある。
実施態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリぺプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができる配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３に示されたものである。
他の実施態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリぺプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３に示されたものである。
【００２９】
縮重コドンで修飾することができる図面に示されたポリヌクレオチド配列が本発明のポリぺプチドをなおコードすることは理解される。従って、本発明は、配列間で５０％ が同一である上記ポリヌクレオチド（又はその補体配列）を提供する。実施態様においては、配列間で少なくとも７０％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも７５％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも８０％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも８５％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも９０％ が同一である。他の実施態様においては、ポリヌクレオチドはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。即ち、少なくとも９５％ が同一である。他の実施態様においては、同一が９７％ より多い。
ハイブリダイゼーションに適したストリンジェントな条件は当業者によって容易に求めることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．）。
【００３０】
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又はその断片又は類似体を含むポリヌクレオチドを提供する。
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又はその断片又は類似体を含むポリヌクレオチドを提供する。
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含むポリぺプチドから少なくとも１０の隣接アミノ酸残基を含むポリヌクレオチドを提供する。
当業者によって容易に理解されるように、ポリヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡ双方を含む。
本発明は、また、本出願に記載されたポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む。
他の態様においては、本発明のポリぺプチド、その断片又は類似体をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ免疫法で用いることができる。即ち、注入時に複製可能であり発現可能であるベクターに取り込むことができ、よってインビボで抗原ポリぺプチドが産生される。例えば、真核細胞において機能するＣＭＶプロモーターの制御下でプラスミドベクターに取り込むことができる。好ましくは、ベクターは筋肉内注射される。
【００３２】
他の態様によれば、ホスト細胞においてポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、その発現したポリぺプチド産物を回収することによる組換え技術によって本発明のポリぺプチドを生産する製造工程又は方法が提供される。また、ポリぺプチドは、確立された合成化学法、即ち、全ポリぺプチドを生産するためにライゲートするオリゴぺプチドの液相又は固相合成に従って生産し得る（ブロックライゲーション）。
ポリヌクレオチドとポリぺプチドの獲得と評価の一般法は、次の文献： Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．； ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， （１９９７） Ｅｄ． Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ４９０ ｐ．； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ， （１９９３） Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．Ｋ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．， ３ｒｄ Ｅｄ．， ３８０ ｐ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．に記載され、これらの文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【００３３】
組換え生産については、ホスト細胞を本発明のポリぺプチドをコードするベクターでトランスフェクトし、次にプロモーターの活性化、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅に適切なように修飾した栄養培地で培養する。適切なベクターは、選ばれたホストにおいて生存可能で複製可能なものであり、染色体配列、非染色体配列又は合成ＤＮＡ配列、例えば、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合わせに由来するベクターが含まれる。ポリぺプチド配列は、プロモーターと、リボソーム結合部位（コンセンサス領域又はシャイン・ダルガーノ配列）と、任意によりオペレーター（制御要素）とを含む発現制御領域に作用可能に結合するように制限酵素を用いてベクターの適切な部位に取り込むことができる。確立された分子生物学原理に従って或るホストとベクターに適している発現制御領域の個々の成分が選択され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｋｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ． これらの文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。
【００３４】
適切なプロモーターとしては、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔａｃ又はｔｒｐプロモーター又はファージλＰＬプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、複製起点と選択マーカー、即ち、アンピシリン耐性遺伝子を組込むことが好ましい。適切な細菌ベクターとしては、ｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＤ１０ ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５又は真核ベクター、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ又はｐＳＶＬが含まれる。ホスト細胞は、細菌細胞、即ち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）； 真菌細胞、即ち、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニダリンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌｉｎｓ）； 酵母、即ち、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又は真核細胞、即ち、ＣＨＯ、ＣＯＳが含まれる。
【００３５】
ポリぺプチドの培養内発現時に、細胞を、典型的には、遠心分離により収集し、次に物理的手段又は化学的手段（発現したポリぺプチドが培地に分泌していない場合）により破壊し、得られた粗抽出物を保持して問題のポリぺプチドを分離する。ポリぺプチドの培養液又は溶解物からの精製は、ポリぺプチドの性質によっては確立された手法により、即ち、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はレシチンクロマトグラフィーを用いて達成することができる。最終精製は、ＨＰＬＣを用いて達成することができる。
ポリぺプチドは、リーダー配列又は分泌配列を含めて又は含めずに発現することができる。前者の例においては、リーダーは転写後処理を用いて除去することができ（米国特許第４ ４３１ ７３９号、同第４ ４２５ ４３７号、同第４ ３３８ ３９７号参照、これらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする）、発現したポリぺプチドの精製に続いて化学的に除去することもできる。
【００３６】
他の態様においては、本発明のヘモフィルスポリぺプチドは、ヘモフィルス・インフルエンゼ、特にヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の診断試験に用いることができる。いくつかの診断法、例えば、生体試料においてヘモフィルス菌を検出する段階が可能であり、下記手順：
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のヘモフィルスポリぺプチドと反応性の抗体又はその断片を該生体試料とインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルスの存在を示す該混合物において特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出する段階と
を行うことができる。
また、前記抗体を含有する又は含有する疑いのある生体試料においてヘモフィルス・インフルエンゼ抗原に特異的な抗体を検出する方法は、次のように
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチド又はその断片と該生物試料とをインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼに特異的な抗体の存在を示す該混合物において特異的に結合した抗原又は結合した断片を検出する段階と
を行うことができる。
【００３７】
当業者は、この診断試験が実質的にはポリぺプチドに特異的な抗体が細菌内に存在しているかを求めるために、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫分析又はラテックス凝集分析を含むいくつかの形態を取ることができることを認識する。
他の態様によれば、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を予防又は治療する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
他の態様によれば、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を診断する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。
【００３８】
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を予防又は治療する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
他の態様においては、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を診断する方法であって、本組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を診断する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
【００３９】
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス感染症を予防又は治療するための医薬組成物の使用であって、該組成物の予防又は治療量を個体に投与する段階を含む、前記使用に関する。
他の態様によれば、本発明のヘモフィルスポリぺプチドは、ヘモフィルス感染症の診断を検出するための本発明のポリぺプチドを含むキットに用いることができる。
本発明のポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列は、ヘモフィルス・インフルエンゼを含んでいる疑いのある生体試料においてその細菌の存在を検出するのに用いられるＤＮＡプローブを設計するために用いることができる。本発明の検出法は、
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のポリぺプチド又はその断片をコードするＤＮＡ配列を有する１種以上のＤＮＡプローブを生体試料とインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼ菌の存在を示す該混合物において特異的に結合するＤＮＡプローブを検出する段階と
を含む。
【００４０】
本発明のＤＮＡプローブは、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を診断する方法として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、試料において循環ヘモフィルス・インフルエンゼ（即ち、ヘモフィルス・インフルエンゼ核酸）を検出するために用いることができる。プローブは、慣用的な手法を用いて合成することができ、固相に固定化することができ、検出可能標識で標識することもできる。本出願に好ましいＤＮＡプローブは、本発明のヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドの少なくとも約６隣接ヌクレオチドに相補的な配列をもつオリゴマーである。
個体においてヘモフィルス・インフルエンゼを検出する他の診断法は、
ａ． 本発明のポリぺプチド又はその断片と反応性の抗体を検出可能標識で標識する段階と；
ｂ． 標識抗体又は標識断片を該個体に投与する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼの存在を示す該個体において特異的に結合した標識抗体又は標識断片を検出する段階と
を含む。
【００４１】
本発明の他の態様は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の診断、特に治療に特異的な抗体を生産する免疫原としての本発明のヘモフィルスポリぺプチドの使用である。適切な抗体は、適切なスクリーニング法を用いて、例えば、試験モデルにおいてヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に対して受動的に防御する具体的な抗体の能力を測定することにより求めることができる。動物モデルの一例は実施例に記載されたマウスモデルである。抗体は、全抗体でもその抗原結合断片であってもよく、免疫グロブリン類に属していてもよい。抗体又は断片は、動物由来、特に哺乳動物由来、特にマウス、ラット又はヒト由来であってもよい。自然抗体又はその断片、又は所望される場合には、組換え抗体又は抗体断片であってもよい。組換え抗体又は抗体断片という用語は、分子生物学手法を用いて生産された抗体又は抗体断片を意味する。抗体又は抗体断片は、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであってもよい。ヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドと関連がある多くのエピトープに特異的であってもよいが１つに特異的であることが好ましい。
本発明の他の態様は、ヘモフィルス感染症を予防又は治療するための本発明の医薬組成物の使用であって、該組成物の予防又は治療量を個体に投与する段階を含む、前記使用である。
特に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術科学用語は、本発明が属している当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に挙げたすべての出版物、特許出願、特許、他の参考文献の記載は全体で本願明細書に含まれるものとする。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。更に、材料、方法、実施例は単に例示であり、限定するものではない。
【００４２】
【実施例】
型別不能ヘモフィルス ・ インフルエンゼ（ ＮＴＨＩ ）ポリぺプチドの分離とこれらのポリぺプチドをコードする遺伝子の同定
表面曝露 ＮＴＨＩ ポリぺプチドの分離
細菌株
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ臨床分離物１２０８５と１００９５はＤ．Ｍ． Ｇｒａｎｏｆｆ（セントルイス、ミズリー州）から、Ｂ−２０、Ａ１８、Ａ１０８、Ｃ−９８、Ｃ−２６、Ｂ−３１をＣｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｌｏｇｉｅ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ ｄｅ ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌａｖａｌから供与された。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５は、パキスタンの下気道感染症をもつ子供の血液から分離した。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、バーリントン、オンタリオ）を組換えＤＮＡ用のホスト株として用いた。大腸菌 ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）をλＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージベクターによる感染用のホスト株として用いた。大腸菌 ＸＬＯＬＲ（ストラタジーン）をインビボ励起繊維状λＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓによる感染用のホスト株として用いた。
【００４３】
抗血清
完全又は不完全フロインドアジュバント（シーダーレーンラボラトリーズ社、ホーンバイ、カナダ）の存在下外膜タンパク質で３週おきに皮下免疫した後にマウス抗血清を産生した。３回目の免疫処置の２１日後に血清を集めた。
熱死滅型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５についてＥＬＩＳＡとウェスタンブロッティングによる反応性に基づいて４種のヒト抗血清を選択した。
【００４４】
ヘモフィルス ・ インフルエンゼライブラリーの構築とスクリーニング
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５ＤＮＡをゲノム抽出キット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて抽出した。ＤＮＡをＴｓｐ５０９Ｉで消化し、ＥｃｏＲＩ消化λ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージアーム（ストラタジーン）にライゲートした。そのライゲーションを製造業者の推奨（ストラタジーン）に従ってギガパック抽出物に試験管内パッケージングした。組換えファージを大腸菌 ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に２．５×１０４ ＰＦＵ／１５０ ｍｍ（直径）プレートの密度で塗布した。８時間インキュベートした後、プレートをニトロセルロースディスクで重層し、得られたリフトをヒトとマウスの血清でイムノブロッティング処理した。正のクローンを集め、プラーク精製した。問題のヘモフィルス遺伝子をコードする組換えｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドをＥｘＡｓｓｉｓｔ繊維状ヘルパーファージとλ耐性株大腸菌 ＸＬＯＬＲを用いて精製バクテリオファージからインビボ切除により回収した。
【００４５】
抗原の同定
これらの組換え大腸菌の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＡとイムノブロット分析から各クローンがヒト又はマウス抗血清と反応する１種以上のポリぺプチドを発現したことがわかった。
【００４６】
ＤＮＡ シークエンシングと配列分析
ゲノムクローンをタクダイデオキシターメネーターサイクルシークエンシングキット（Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ）（アプライドバイオシステム、フォスターシティ、カリフォルニア州）で配列決定した。いくつかの内部プライマーをクローン化挿入断片の中へ配列決定するために設計した。配列アセンブリをシークエンサーソフトウェア（ジーンコードコーポレーション、アンアーバ、ミシガン州）を用いて行い、配列分析をマックベクターソフトウェア（オックスフォードモレキュラー社、キャンベル、カリフォルニア州）で行った。
【００４７】
実施例 １
本実施例は、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子の発現ベクターへのクローニングを示すものである。
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１〜ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３）のコード領域を、制限部位ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）、ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）又はＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を付加するために塩基拡張部分を有する下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５のゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡサーマルサイクラージーンアンプＰＣＲシステム２４００パーキンエルマー、サンホゼ、カリフォルニア州）によって増幅した。ＰＣＲ産物をキアゲン製キアクイックゲル抽出キットを用いることにより製造業者の説明書に従って（チャッツワース、カリフォルニア州）アガロスゲルから精製し、適切なエンドヌクレアーゼ（ファルマシアカナダ社、Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ、カナダ）で消化した。ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、マディソン、ウィスコンシン州）を同様に消化し、キアゲン製キアクイックゲル抽出キット（チャッツワース、カリフォルニア州）を用いてアガロースゲルから精製した。消化したＰＣＲ産物を酵素制限ｐＥＴ発現ベクターにライゲートした。ライゲートした産物を大腸菌株ＤＨ５α［φ８０ｄｌａｃΔＭ１５△（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）ｄｅｏＲ ｔｈｉ−１ ｓｕｐＥ４４ λ−ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］（ギブコＢＲＳ、ゲイザースバーグ、メリーランド）にシマニスの方法（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ． （１９８５） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ， ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ． ｖｏｌ． １ ｐｐ． １０９−１３５）に従って形質転換した。組換え遺伝子含有プラスミド（ｒｐＥＴ）をキアゲンキット（チャッツワース、カリフォルニア州）を用いて精製し、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した（タクダイデオキシターメネーターサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。
【００４８】
表１． ＤＮＡクローニング用オリゴヌクレオチドプライマー表
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
＊ ヌクレオチドの位置はクローニングの結果、即ち、ＰＣＲ産物の長さと図１での位置を示す。
【００５１】
実施例 ２
本実施例は、他の型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子のＰＣＲ増幅とシークエンシング及びその遺伝子の分子保存レベルの評価を記載するものである。
それらの株由来型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１のそれぞれのコード領域を、次のオリゴ：
ＨＡＭＪ３４２（５’ −ＣＡＡＧＧＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＧＧＣＡＧＧ−３’）；
ＨＡＭＪ３４３（５’ −ＣＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＴＡＡＴＡＴＴＧ−３’）
を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡサーマルサイクラージーンアンプＰＣＲシステム２４００パーキンエルマー、サンホセ、カリフォルニア州）によって増幅した。ＰＣＲ産物を、キアゲン製のキアクイックゲル抽出キットを用いて製造業者の説明書（チャッツワース、カリフォルニア州）に従ってアガロースゲルから精製し、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した（タクダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。これらの８菌株すべてについて作成したＰＣＲ断片の長さは同一であった。これらの菌株（１２０８５、１００９５、Ａ１８、Ａ１０８）由来のヌクレオチドと予想アミノ酸配列のペアワイズ比較から、図２５に示されるように９９％ 同一であることがわかった。
【００５２】
実施例 ３
本実施例は、組換え型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１ポリぺプチドの作製と精製を示す図である。
配列番号１に対応するＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子を有する組換えｐＥＴ２１−ｂ＋プラスミドを用いて大腸菌株Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）［Ｆ−ｏｍｐＴ， ｈｓｄＳ（ｒｂ，ｍｂ）， ｇａｌ， ｄｃｎ， ｌａｃＹＩ（ＤＥ３）］（ノバジェン、マディソン、ウィスコンシン）をエレクトロトランスフォームした（ジーンパルサーＩＩ装置、バイオラドラボス、ミシソーガ、カナダ）。この大腸菌株の中で、遺伝子がイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘発性のｌａｃプロモーターの制御下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３プロファージに存在する）によって組換えポリぺプチドのＴ７プロモーター制御発現が特異的に認識される。形質転換体Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（シグマ・アルドリッヒカナダ社、オークビル、カナダ）を含有するＬＢブイヨン（ペプトン１０ ｇ／ｌ、酵母エキス５ ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ／ｌ）中２５０ ｒｐｍで撹拌しながら３７℃でＡ６００値が０．５になるまで増殖した。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドの生産を誘発させるために、細胞をＩＰＴＧの存在下に１ ｍＭの最終濃度で３０℃において３時間インキュベートした。５００ ｍｌの培養物からの誘発細胞を遠心分離により沈降させ、−７０℃で凍結した。
【００５３】
ＩＰＴＧ誘導Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１の可溶性細胞質画分からの組換えポリぺプチドの精製をＨｉｓ・タグ配列（６個の隣接的ヒスチジン残基）の性質に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって行い、Ｈｉｓ・結合金属キレート化樹脂に固定化した２価のカチオン（Ｎｉ２＋）に結合した。概要としては、５００ ｍｌのＩＰＴＧ誘導培養物から得られた沈降細胞を１ ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ；シグマ）を含有する溶解バッファー（２０ ｍＭトリス、５００ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭイミダゾール、ｐＨ ７．９）に再懸濁し、音波処理し、１６，０００Ｘｇで３０分間遠心分離してデブリを除去した。上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン、ミシソーガ、オンタリオ、カナダ）上に析出させた。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドを２５０ ｍＭイミダゾール−５００ ｍＭ ＮａＣｌ−２０ ｍＭトリスｐＨ ７．９で溶離した。試料からの塩とイミダゾールの除去は、４℃でＰＢＳに対して透析することにより行った。大腸菌の可溶性画分から得られた組換えポリぺプチド量をＭｉｃｒｏＢＣＡ（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）によって測った。
【００５４】
実施例 ４
本実施例は、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１で免疫化後、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に対する免疫原性と防御能の分析を示すものである。
５匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールスリバー、オンタリオ、カナダ）を大腸菌熱不安定毒素アジュバント（ＬＴ； １μｇ； セダーレーンラボラトリーズ社、ホーンバイ、カナダ）の存在下に２５μｇのアフィニティ精製ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドで、対照としてＰＢＳ中アジュバントのみで２週間おきに３回鼻内に免疫した。血液試料をそれぞれの免疫の前日と３回目（４２日目）の注射の１４日後に眼窩副鼻腔から集めた。抗体力価を型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５の熱死滅外膜小胞についてＥＬＩＳＡにより求めた。二次抗体は、アルカリンホスファターゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｆｃ特異的）（ジャクソンイムノリサーチラボス、ミシソーガ、オンタリオ）を用いた。抗血清の反応性力価を相互の希釈度として定義し、吸光度が免疫前血清試料で得たものより２倍増加した。ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１によって誘発した免疫応答が機能的に重要であるかを調べるために、約２×１０５ ＣＦＵの型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５で肺臓内に攻撃したマウスにおいて１４日後にインビボ防御能を評価した。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ攻撃接種物の試料をチョコレート寒天プレート上に塗布して攻撃量を確かめた。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼのインビボ増殖を制限する点で予防接種の有効性を測定するために、注射の５時間後にペントバルビタールナトリウム（ＥｕＴｈａｎｙｌ（登録商標））の腹腔内注射によってマウスを犠牲にした。気管支肺胞洗浄について細菌数定量用連続希釈のプレーティングにより細菌クリアランスを評価した。アジュバントのみを注射したマウスを負の対照として用いた。
免疫原性実験の結果（表２）から、免疫動物の血清の特異抗体のレベルが対照血清に相対して約１０００倍まで上昇したことがわかった。平均力価をＯＭＰで測定し、熱死滅試料は１つの希釈だけ異なり、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１ポリぺプチドが実際に表面曝露抗原であることが確認された。
【００５５】
表２． 血清ａにおけるＮＴＨＩ特異的抗体に対する全身免疫の影響
ａ） 免疫処置の４２日目に免疫マウスと対照マウスから血清試料を集めた。
【００５６】
防御実験の結果（表３）から、菌株１２０８５が対照動物の肺に容易に増殖して攻撃後５時間までに生存できる型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ細胞数が２００％だけ増加したことがわかった。対照的に、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１免疫マウスによる菌株１２０８５の実質的な肺クリアランスが明らかであったが、免疫動物の肺における細菌沈着物の最初の数の３５％ だけが攻撃後５時間までに回収された。
【００５７】
表３． 型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５ａの肺クリアランスに対する全身免疫の影響
ａ） 各数値は各時間での５匹の動物の平均である。
ｂ） ＊＊Ｐ ＜ ０．００９８は非対合性ｔ検定とウエルシュ補正に従って算出し、対照と比較した。
【００５８】
実施例 ５
本実施例は、ヒト血清と防御マウスからの抗血清による型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の組換えポリぺプチドの認識を示すものである。
標準ウェスタンブロット法を用いて精製組換えポリぺプチドがヒト血清によって認識されるかを調べた。更に、外膜タンパク質標品で免疫したマウスからの抗血清を精製組換えポリぺプチドに対して試験した。これらの標品で免疫したマウスは、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５で攻撃した後に高肺クリアランスを示した。抗原の調製については、精製組換えポリぺプチドをＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含有する試料バッファーで１００℃で５分間処理した。ポリぺプチドをＬａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． （１９７０） Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ， ２２７：６８０−６８５の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ポリぺプチドをゲルからニトロセルロース紙へ方法（Ｔｏｗｂｉｎ， Ｈ．， Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ， Ｔ． ＆ Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ． （１９７９） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｈｅｅｔｓ： ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ４３５０−４３５４）で電気泳動で移し、ヒト又はマウス抗血清でプローブした。抗体と反応性の抗原の検出を結合抗マウス又は抗ヒト免疫グロブリンと色基質を用いた間接酵素イムノアッセイで行った。表４の結果から、ほとんどのポリぺプチドがヒト免疫系によってすでに見られたことがわかる。ワクチン候補としてこれらのポリぺプチドは、ヒトにおいて強力な免疫応答を誘発させる可能性がある。更に、ほとんどのポリぺプチドが防御マウスからの血清によって認識された。血清反応性は、感染症のマウスモデルにおいて高肺クリアランスに相関している。
【００５９】
表４． 正常ヒト血清と防御マウス由来の抗血清と型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５組換えポリぺプチドとの反応性
ａ） ＋の数は反応の強さを示し、《−》記号は反応しないことを示している。
ｂ） マウスをそれぞれの組換えポリぺプチドで免疫し、肺クリアランスを実施例４のように測定した。
ｃ） ｎｄは実施せず。
【図面の簡単な説明】
【図１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１を示す図である。
【図２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５株由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１の推定アミノ酸配列： 配列番号２を示す図である。
【図３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ２遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号３を示す図である。
【図４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ２の推定アミノ酸配列： 配列番号４を示す図である。
【図５】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ３遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号５を示す図である。
【図６】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ３の推定アミノ酸配列： 配列番号６を示す図である。
【図７】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ４遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号７を示す図である。
【図８】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ４の推定アミノ酸配列： 配列番号８を示す図である。
【図９】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ５遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号９を示す図である。
【図１０】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ５の推定アミノ酸配列： 配列番号１０を示す図である。
【図１１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ６遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１１を示す図である。
【図１２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ６の推定アミノ酸配列： 配列番号１２を示す図である。
【図１３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ７遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１３を示す図である。
【図１４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ７の推定アミノ酸配列： 配列番号１４を示す図である。
【図１５】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ８遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１５を示す図である。
【図１６】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ８の推定アミノ酸配列： 配列番号１６を示す図である。
【図１７】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ９遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１７を示す図である。
【図１８】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ９の推定アミノ酸配列： 配列番号１８を示す図である。
【図１９】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１０遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１９を示す図である。
【図２０】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１０の推定アミノ酸配列： 配列番号６を示す図である。
【図２１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１１遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号２１を示す図である。
【図２２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１１の推定アミノ酸配列： 配列番号２２を示す図である。
【図２３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号２３を示す図である。
【図２４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２の推定アミノ酸配列： 配列番号２４を示す図である。
【図２５】
マックベクター配列分析ソフトウエア（バージョン６．５）からのプログラムクラスタルＷを用いることにより１２０８５、１００９５、Ａ１８、Ａ１０８ヘモフィルス・インフルエンゼ由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１オープンリーディングフレームの予想アミノ酸配列の比較を示す図である。アラインメントの下にコンセンサスラインがあり、（＊）の記号は同一アミノ酸残基であり、（．）は保存アミノ酸残基である。
発明の分野
本発明は、ヒトのような個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）感染症を予防、診断及び／又は治療するのに用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼのポリぺプチド及び対応ＤＮＡ断片に関する。
【０００２】
発明の背景
ヘモフィルス・インフルエンゼは、ヒト病原体としてのみ天然に見出されているグラム陰性桿菌である。ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の分離物は、封入形態と非封入形態に更に分けることができる。封入菌株は、“ａ”〜“ｆ”型を示している６種の構造上と抗原性で異なる莢膜多糖の１種である。非封入菌株は、認識されたヘモフィルス・インフルエンゼ莢膜多糖に対する抗血清と凝集することができないことによって定義され、非型別不能を意味する。
【０００３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株は、一般に、鼻咽腔や後口腔咽頭を含む上気道にコロニー形成する。多くの健康な個体の調査から小児と成人両方でコロニー形成率４０％〜８０％が示されている（Ｓｐｉｎｏｌａ Ｓ．Ｍ．， Ｐｅａｃｏｃｋ Ｊ．， Ｄｅｎｎｙ Ｆ．Ｗ．， Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｌ． ＆ Ｃａｎｎｏｎ Ｊ．Ｇ． （１９８６） Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ： ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １５４：１００−１０９； Ｔｒｏｔｔｉｅｒ Ｓ．， Ｓｔｅｎｂｅｒｇ Ｋ． ＆ Ｓｖａｎｂｏｒｇ−Ｅｄｅｎ Ｃ． （１９８９） Ｔｕｒｎ ｏｖｅｒ ｏｆ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７：２１７５−２１７９）。具体的な菌株とのコロニー形成によって、たいていの個体において数週間か数ヶ月間この期間全体に無症候のままであることにより持続してしまう。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼに基づく疾患の発生機序は、気道内での近接拡散を必要とする。隣接領域への拡散は、通常は非特異的又は特異的ホスト防御における異常の結果である。そのようにして、ヘモフィルス・インフルエンゼは耳炎、副鼻腔炎、気管支炎又は肺炎を含む小児や成人における種々の呼吸器系感染症を引き起こす。これらの感染症は、気管支炎又は耳炎をもつ患者において慢性又は再発することがある。実際に、乳児や小児では型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは、急性中耳炎がしばしば起こり、一般的には再発中耳炎に関係があるとされている（Ｈａｒａｂｕｃｈ Ｙ．， Ｆａｄｄｅｎ Ｈ．， Ｙａｍａｎａｋａ Ｎ．， ｄｕｆｆｙ Ｌ．， Ｗｏｌｆ Ｊ．， Ｋｒｙｓｔｏｆｉｋ Ｄ． ＆ Ｔｎａｗａｎｄａ／Ｗｉｌｌｉａｍｓｖｉｌｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ． （１９９４） Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ａｎｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７０：８６２−８６６）。
【０００４】
乳児では、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは１歳までは中耳炎の最初のエピソードの２７〜３７％に関与している（Ｓｍｉｔｈ−Ｖａｕｇｈａｎ Ｈ．Ｃ．， Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ Ｋ．Ｓ．， Ｍａｔｈｅｗｓ Ｊ．Ｄ． ＆ Ｋｅｍｐ Ｄ．Ｊ． （１９９７） Ｎｏｎｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ａｂｏｒｉｇｉｎａｌ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ： ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃａｒｒｉａｇｅ ｏｆ Ｐ２ ｐｏｒｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５：１４６８−１４７４； Ｔｅｅｌｅ Ｄ．Ｗ．， Ｋｌｅｉｎ Ｊ．Ｏ．， Ｒｏｓｎｅｒ Ｂ． ＆ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ Ｏｔｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａ ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ． （１９８９） Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｅｖｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｌｉｆｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ： ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ， ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６０：８３−９４）。髄膜炎は、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼによってしばしば引き起こされ、すべての症例の１〜３％ とみなされている。しかし、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）や嚢胞性線維症のような生来の粘膜免疫系に働く基礎にある疾患をもつホストにおいて特に優勢である（Ｍｕｒｐｈｙ Ｔ．Ｆ． ＆ Ｓｅｔｈｉ Ｓ． （１９９２） Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １４６：１０６７−１０８３； Ｓｔ． Ｇｅｍｅ Ｊ．Ｗ． ＩＩＩ． （１９９３） Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｄｉｓｅａｓｅ： ｅｐｉｄｅｍｉｌｏｇｙ， ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ａｇｅｎｔｓ Ｄｉｓ． ２：１−１６）。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株は、痰が粘液膿性になるときの悪化の間に主に見られる。慢性気管支炎の急性感染性の悪化は、慢性肺疾患をもつ患者の疾病率と死亡率に重要な役割を果たしている。
【０００５】
院外感染性肺炎の病因は、この十年間で変化してきたと思われる。ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は依然として主な病原体であるが、他の微生物を含む症例の割合が増加してきた。ヘモフィルス・インフルエンゼは、肺炎の第２の最も一般的な原因であると現在しばしば報告されている。ヘモフィルス・インフルエンゼ肺炎症例の１０％ は、菌血症になる。発展途上国では、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼによる肺炎が小児における疾病率と死亡率の重要な原因であることは明らかである。
【０００６】
数種のヘモフィルス・インフルエンゼｂ型多糖結合ワクチンが開発されたが、これらのワクチンは他のヘモフィルス・インフルエンゼ株による疾患に対しては無効である（Ｓｃｈｅｉｆｅｌｅ Ｄ．Ｗ．， Ｊａｄａｖｊｉ Ｔ．Ｐ．， Ｌａｗ Ｂ．Ｊ．， Ｇｏｌｄ Ｒ．， Ｍａｃｄｏｎａｌｄ Ｎ．Ｅ．， Ｌｅｂｅｌ Ｍ．Ｈ．， Ｍｉｌｌｓ Ｅ．Ｌ．， Ｄｅｒｙ Ｐ．， Ｈａｌｐｅｒｉｎ Ｓ．Ａ．， Ｍｏｒｒｉｓ Ｒ．Ｆ．， Ｍａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ Ｖ． ＆ Ｄｕｃｌｏｓ Ｐ．Ｊ． （１９９６） Ｒｅｃｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎａｄａ． Ｃａｎ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． Ｊ． １５４：１０４１−１０４７； Ｓｃｈｕｌｔｅ Ｅ．Ｅ．， Ｂｉｒｋｈｅａｄ Ｇ．Ｓ．， Ｋｏｎｄｒａｃｋｉ Ｓ．Ｆ． ＆ Ｍｏｒｓｅ Ｄ．Ｌ． （１９９４） Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔａｔｅ， １９８７−９９１： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｄａｙ−ｃａｒｅ ａｔｔｅｎｄａｎｃｅ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ９４：１０１４−１０１６）。保存交差防御抗原の同定は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染や疾患に対する広域ワクチンの開発に重要である。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、ＰＣＰ、ＯＭＰ２６又はＤ−１５のような外膜タンパク質が同定され、現在は潜在的ワクチン抗原としても追究されている（Ｆｏｘｗｅｌｌ Ａ．Ｒ．， Ｋｙｄ Ｊ．Ｍ． ＆ Ｃｒｉｐｐｓ Ａ．Ｗ． （１９９８） Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ： Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：２９４−３０８）。プロテインＤ−１５は、科学文献に多重血清型や型別不能菌株に対して防御を与えることができると記載されている唯一の保存免疫原である。
それ故、ヒトのような個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を予防、診断及び／又は治療するのに用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドが依然として強く求められている。
【０００７】
発明の要約
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドに関する。
他の態様においては、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリぺプチド、医薬組成物、発現制御領域に作用可能に結合した本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターでトランスフェクトしたホスト細胞及び前記ホスト細胞を発現に適した条件下で培養する段階を含むポリぺプチドの生産方法が提供される。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を予防、治療、及び／又は診断するために用いることができるヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドをコードする精製分離したポリヌクレオチドを提供する。本発明は、１２の別個の好ましいポリヌクレオチドを提供し、各々が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３の１つによって別個に定義されている。更に、本発明は、１２の別個のポリぺプチドを提供し、各々が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、又は２４の１つによって別個に定義されている。本発明には本出願において本明細書に記載されているようにそのようなポリぺプチドの突然変異体、変異体、相同体又は誘導体のような類似体をコードするポリヌクレオチドが含まれることを当業者は理解している。本発明は、本発明のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子も包含している。ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子のほかに、本発明は対応ポリぺプチドとそのようなポリぺプチドに特異的に結合する単一特異抗体を包含している。
【０００９】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープに関する。
【００１１】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープに関する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％ が同一であるポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含むポリぺプチドをコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１３】
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
相同％ は、アミノ酸型の同一％ と類似％ 又は保存％ の合計として定義される。
アミノ酸配列を比較するためにＣＬＵＳＴＡＬプログラムのようなプログラムを使用し得る。このプログラムによって、アミノ酸配列が比較され、適するように両配列のスペースを挿入することにより最適アラインメントが見出される。最適アラインメントのアミノ酸同一又は類似（アミノ酸型の同一と保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似の配列の最長の伸長物を配列させ、価値を一致まで対応させる。このようにいくつかの類似領域が見られる比較を得ることが可能であり、各々が異なるスコアをもっている。両方のタイプの同定分析が本発明に企図されている。
【００１４】
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは抗原性である。
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは免疫原性である。
他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドは個体において免疫応答を誘発し得る。
他の実施態様においては、本発明は、上で定義した本発明のポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチド又はその断片又は類似体に結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドに関する。
“結合特異性を有する”抗体は、選択されたポリぺプチドを認識結合するが試料、例えば、生体試料中の他の分子をほとんど認識結合しない抗体である。特異結合は、選択されたポリぺプチドが抗原として使われるＥＬＩＳＡ分析を用いて測定し得る。
【００１５】
本発明によれば、生物学的実験における“防御”は生存曲線、生存率又は生存期間の著しい増加によって定義される。生存曲線を比較するログランク試験、また、生存率や死亡するまでの日数を比較するフィッシャー確定試験を用いる統計分析がＰ値を計算するとともに２つのグループ間の差が統計的に有意であるかを求めるために用いることができる。０．０５のＰ値は有意とみなされない。
本発明の他の態様においては、本発明のポリぺプチドの抗原性／免疫原性断片、又はその類似体が提供される。
本発明の断片は、１種以上のそのエピトープ領域を含まなければならず、抗原性／免疫原性の性質を保持するその領域にも十分似ていなければならない。従って、本発明の断片の場合、記載されたポリぺプチド又はその類似体の具体的な部分に１００％ 同一であってもよいので、同定度はおそらく無関係である。本発明は、更に、本発明のポリぺプチド配列から少なくとも１０の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。実施態様においては、少なくとも１５の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。実施態様においては、少なくとも２０の隣接アミノ酸残基をもつ断片を提供する。
【００１６】
前と同様に、重要な課題は断片が抗原性／免疫原性の性質を保持することである。
本発明のポリぺプチドの断片、類似体又は誘導体が本発明に関連して、即ち、抗原性／免疫原性材料として使われることは当業者によって理解される。従って、例えば、１つ以上の付加、欠失、置換等を含むポリぺプチドは本発明によって包含される。
本明細書に用いられる本発明のポリぺプチドの“断片”、“類似体”又は“誘導体”には、アミノ酸残基の１つ以上が保存アミノ酸残基で置換され（好ましくは保存され）かつ天然であっても天然でなくてもよいポリぺプチドが含まれる。実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体や類似体は、図面に示された配列又はその断片と約７０％ が同一である。即ち、残基の７０％ が同じである。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が８０％より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９５％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドは同一が９９％ より多い。他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドの類似体は置換、修飾又は欠失が約２０のアミノ酸残基より少なく、好ましくは１０未満である。
【００１７】
実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体又は類似体は、図面に示された配列又はその断片と約７０％ が相同である。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が８０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９０％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９５％ より多い。他の実施態様においては、ポリぺプチドの誘導体又は類似体は相同が９９％ より多い。他の実施態様においては、本発明のポリぺプチドの誘導体又は類似体はアミノ酸残基の置換、修飾又は欠失が約２０より少なく、更に好ましくは１０未満である。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
【００１８】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を特徴とするポリぺプチドを提供する。
【００１９】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも８５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９０％が同一であるポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドを提供する。
【００２０】
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列を含むポリぺプチドを提供する。
他の態様によれば、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列を特徴とするポリぺプチドを提供する。
これらの置換は、ポリぺプチドの二次構造と親水性に対して影響が最少のものである。好ましい置換は、保存された当該技術において既知のものである。即ち、置換残基が疎水性、サイズ、電荷又は官能基のような物理的又は化学的性質を共有するものである。Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５， １９７８； Ａｒｇｏｓ， Ｐ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８， ７７９−７８５， １９８９に記載された置換が含まれる。例えば、下記群の１つに属する天然の或いは天然でないアミノ酸は保存的変化である。
ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｖａｌ；
ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
ｌｙｓ、ａｒｇ、ｏｒｎ、ｈｉｓ；及び
ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
好ましい置換には、対応するＬ−アミノ酸をＤ−エナンチオマーに置換することが含まれている。
【００２１】
好ましくは、本発明のポリぺプチドの断片、類似体又は誘導体は少なくとも１つの抗原領域、即ち、少なくとも１つのエピトープを含む。
代替的方法においては、類似体は精製を容易にする部分を取り込んでいる、例えば、所望のポリぺプチドを効果的にタグ標識することによる融合ポリぺプチドであり得る。“タグ”を除去することは必要なことであり、融合ポリぺプチド自体が用いるのに十分な抗原性を保持している例であってもよい。
従って、類似体、誘導体又は断片について重要なことは、少なくともタンパク質又はポリぺプチドが由来している程度の抗原性／免疫原性をもっていることである。
ポリぺプチドの生物学的性質又は薬理学的性質を変える他の化合物、即ち、半減期を増大させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、精製を容易にするリーダー配列又は分泌アミノ酸配列、プレプロ配列又はプロ配列又は（多）糖を融合したポリぺプチドも包含される。
更に、アミノ酸領域が多型であることがわかった状態においては、異なるヘモフィルス・インフルエンゼ株の異なるエピトープを効果的にミミックするように１つ以上の具体的なアミノ酸を変えることが望ましい。
【００２２】
更に、本発明のポリぺプチドは、安定性、支持体又は他の分子に結合する高疎水性を得るために末端−ＮＨ２アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミノ化、例えば、アンモニア又はメチルアミンを用いた末端カルボキシアミノ化）により修飾し得る。
ポリぺプチド断片又は類似体のヘテロ又はホモポリぺプチド多量体も企図される。これらの重合体は、例えば、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒド又はジメチルスーパーイミデートのような架橋剤で架橋したポリぺプチド１種以上を含む。そのような重合体としては、組換えＤＮＡ技術によって生成したマルチシストロンｍＲＮＡから生産された縦列又は逆方向隣接配列を２つ以上有するポリぺプチドが含まれる。
他の実施態様においては、本発明は、本出願の図面に定義されたポリぺプチド又はその断片又は類似体又は誘導体を１種以上含むキメラポリぺプチドに関する。
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドを２つ以上含むキメラポリぺプチドに関し、該ポリぺプチドはキメラポリぺプチドを形成するように結合されている。
【００２３】
他の実施態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドを２つ以上含むキメラポリぺプチドに関し、該ポリぺプチドはキメラポリぺプチドを形成するように結合されている。
抗原重合体（即ち、合成多量体）の形成を達成するために、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハライド等を有するポリぺプチドを用いることができ、その試薬はチオ基に特異的である。それ故、異なるぺプチドの２つのメルカプト基間の結合は単結合であってもよく、炭素原子が少なくとも２個、典型的には少なくとも４個で１６個以下、通常は約１４個以下の結合基から構成されていてもよい。
具体的な実施態様においては、本発明のポリぺプチド断片又は類似体は、出発メチオニン（Ｍｅｔ）残基を含んでいない。好ましくは、ポリぺプチドはリーダー配列又は分泌配列（シグナル配列）を取り込まない。本発明のポリぺプチドのシグナル部分は、確立された分子生物学的手法に従って求めることができる。一般に、問題のポリぺプチドは、ヘモフィルス培養物から分離し、次に配列決定して成熟タンパク質の開始残基、それ故成熟ポリぺプチドの配列を求めることができる。
次の表Ａは、図面に記載された本発明のポリぺプチドのシグナル配列を記載したものである。
【００２４】
【表１】
本発明の他の態様によれば、（ｉ）本発明のポリぺプチドを担体、希釈剤又は補助剤と共に含む物質の組成物；（ｉｉ）本発明のポリぺプチドと担体、希釈剤又は補助剤とを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）本発明のポリぺプチドと担体、希釈剤又は補助剤とを含むワクチン；（ｉｖ）個体において免疫応答、例えば、ヘモフィルスに対する防御免疫応答を誘発する本発明のポリぺプチドの免疫原性的に有効な量を該個体に投与することによりヘモフィルスに対して免疫応答を誘発する方法； 特に（ｖ）本発明のポリぺプチドの予防又は治療量を必要としている個体に投与することによりヘモフィルス感染症（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）を予防及び／又は治療する方法が提供される。
免疫化する前に、本発明のポリぺプチドは、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、灰白髄炎ウイルスＶＰ１抗原又は他のウイルス毒素又は細菌毒素又は抗原のような担体タンパク質又は強い免疫応答の発生を刺激する適切なタンパク質にカップリング又はコンジュゲートし得る。このカップリング又はコンジュゲーションは化学的に又は遺伝的に行うことができる。ぺプチド−担体結合の詳しい説明は、Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ， Ｍ．Ｈ．Ｖ．， Ｂｒｉａｎｄ Ｊ．Ｐ．， Ｍｕｌｌｅｒ Ｓ．， Ｐｌａｕｅ Ｓ．，《Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ》Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１９ （ｅｄ．） Ｂｕｒｄｏｕ， Ｒ．Ｈ． ＆ Ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ Ｐ．Ｈ． （１９８８）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで得られる。
【００２６】
他の態様によれば、１種以上の本発明のヘモフィルスポリぺプチドを薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は補助剤との混合物で含む医薬組成物が提供される。適切な補助剤としては、（１）水中油型エマルジョン製剤、例えば、ＭＦ５９（登録商標）、ＳＡＦ（登録商標）、Ｒｉｂｉ（登録商標）；（２）フロインド完全アジュバント又は不完全アジュバント；（３）塩、即ち、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４、シリカ、カオリン；（４）サポニン誘導体、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）又はそれから生成された粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；（５）サイトカイン、例えば、インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；（６）他の物質、例えば、炭素ポリヌクレオチド、即ち、ポリＩＣやポリＡＵ、無毒化コレラ毒素（ＣＴＢ）又は粘膜免疫を誘発する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定毒素が含まれる。補助剤の詳しい説明は、Ｍ．Ｚ．Ｉ Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． １１， Ｎｏ．１ （１９９４） ｐｐ２−１１からの総説、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． １３， Ｎｏ． １４， ｐｐ１２６３−１２７６ （１９９５）からの他の総説、国際出願第９９／２４５７８号で得られる。好ましい補助剤としては、ＱｕｉｌＡ（登録商標）、ＱＳ２１（登録商標）、Ａ１ｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕｐｈｏｓ（登録商標）が含まれる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収による非経口投与、又はバッカル又は経口投与することができる。
本発明の医薬組成物は、Ｐ．Ｒ． Ｍｕｒｒａｙ （Ｅｄ， ｉｎ ｃｈｉｅｆ）， Ｅ．Ｊ． Ｂａｒｏｎ， Ｍ．Ａ． Ｐｆａｌｌｅｒ， Ｆ．Ｃ． Ｔｅｎｏｖｅｒ ＆ Ｒ．Ｈ． Ｙｏｌｋｅｎ． Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． ７ｔｈ ｅｄ．， １９９９， ｐ１４８１−１４８２に記載されているヘモフィルス感染症及び／又はヘモフィルス感染症によって仲介される疾患又は症状の治療又は予防に用いられ、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。実施態様においては、本発明の医薬組成物は、中耳炎（急性又は再発）、副鼻腔炎、気管支炎、肺塩、髄膜炎又は菌血症の治療又は予防に用いられる。実施態様においては、本発明の医薬組成物は、ヘモフィルス感染症及び／又はヘモフィルス感染症によって仲介される疾患又は症状の治療又は予防に用いられる。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症はヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症は型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス感染症は型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）である。
【００２８】
本出願において用いられる“個体”という用語は哺乳動物が含まれる。他の実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
具体的な実施態様においては、医薬組成物は、乳児、高齢者又はイムノコンプロマイズド個体のようなヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の恐れがある個体に投与される。
医薬組成物は、免疫処置の間に約１〜６週間の間隔で１〜３回好ましくは約０．００１〜１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）、更に好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜１μｇ／ｋｇの単位剤形にある。
医薬組成物は、免疫処置の間に約１〜６週間の間隔で１〜３回好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ〜１ ｍｇ、最も好ましくは１０〜１００μｇの単位剤形にある。
実施態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリぺプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができる配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び２３に示されたものである。
他の実施態様においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリぺプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３に示されたものである。
【００２９】
縮重コドンで修飾することができる図面に示されたポリヌクレオチド配列が本発明のポリぺプチドをなおコードすることは理解される。従って、本発明は、配列間で５０％ が同一である上記ポリヌクレオチド（又はその補体配列）を提供する。実施態様においては、配列間で少なくとも７０％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも７５％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも８０％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも８５％ が同一である。実施態様においては、配列間で少なくとも９０％ が同一である。他の実施態様においては、ポリヌクレオチドはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。即ち、少なくとも９５％ が同一である。他の実施態様においては、同一が９７％ より多い。
ハイブリダイゼーションに適したストリンジェントな条件は当業者によって容易に求めることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．）。
【００３０】
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又はその断片又は類似体を含むポリヌクレオチドを提供する。
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又はその断片又は類似体を含むポリヌクレオチドを提供する。
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
他の実施態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含むポリぺプチドから少なくとも１０の隣接アミノ酸残基を含むポリヌクレオチドを提供する。
当業者によって容易に理解されるように、ポリヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡ双方を含む。
本発明は、また、本出願に記載されたポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む。
他の態様においては、本発明のポリぺプチド、その断片又は類似体をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ免疫法で用いることができる。即ち、注入時に複製可能であり発現可能であるベクターに取り込むことができ、よってインビボで抗原ポリぺプチドが産生される。例えば、真核細胞において機能するＣＭＶプロモーターの制御下でプラスミドベクターに取り込むことができる。好ましくは、ベクターは筋肉内注射される。
【００３２】
他の態様によれば、ホスト細胞においてポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、その発現したポリぺプチド産物を回収することによる組換え技術によって本発明のポリぺプチドを生産する製造工程又は方法が提供される。また、ポリぺプチドは、確立された合成化学法、即ち、全ポリぺプチドを生産するためにライゲートするオリゴぺプチドの液相又は固相合成に従って生産し得る（ブロックライゲーション）。
ポリヌクレオチドとポリぺプチドの獲得と評価の一般法は、次の文献： Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．； ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， （１９９７） Ｅｄ． Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ４９０ ｐ．； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ， （１９９３） Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．Ｋ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．， ３ｒｄ Ｅｄ．， ３８０ ｐ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．に記載され、これらの文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【００３３】
組換え生産については、ホスト細胞を本発明のポリぺプチドをコードするベクターでトランスフェクトし、次にプロモーターの活性化、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅に適切なように修飾した栄養培地で培養する。適切なベクターは、選ばれたホストにおいて生存可能で複製可能なものであり、染色体配列、非染色体配列又は合成ＤＮＡ配列、例えば、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合わせに由来するベクターが含まれる。ポリぺプチド配列は、プロモーターと、リボソーム結合部位（コンセンサス領域又はシャイン・ダルガーノ配列）と、任意によりオペレーター（制御要素）とを含む発現制御領域に作用可能に結合するように制限酵素を用いてベクターの適切な部位に取り込むことができる。確立された分子生物学原理に従って或るホストとベクターに適している発現制御領域の個々の成分が選択され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９９） Ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｋｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ． これらの文献の記載は本願明細書に含まれるものとする）。
【００３４】
適切なプロモーターとしては、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔａｃ又はｔｒｐプロモーター又はファージλＰＬプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、複製起点と選択マーカー、即ち、アンピシリン耐性遺伝子を組込むことが好ましい。適切な細菌ベクターとしては、ｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＤ１０ ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５又は真核ベクター、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ又はｐＳＶＬが含まれる。ホスト細胞は、細菌細胞、即ち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）； 真菌細胞、即ち、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニダリンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌｉｎｓ）； 酵母、即ち、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又は真核細胞、即ち、ＣＨＯ、ＣＯＳが含まれる。
【００３５】
ポリぺプチドの培養内発現時に、細胞を、典型的には、遠心分離により収集し、次に物理的手段又は化学的手段（発現したポリぺプチドが培地に分泌していない場合）により破壊し、得られた粗抽出物を保持して問題のポリぺプチドを分離する。ポリぺプチドの培養液又は溶解物からの精製は、ポリぺプチドの性質によっては確立された手法により、即ち、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はレシチンクロマトグラフィーを用いて達成することができる。最終精製は、ＨＰＬＣを用いて達成することができる。
ポリぺプチドは、リーダー配列又は分泌配列を含めて又は含めずに発現することができる。前者の例においては、リーダーは転写後処理を用いて除去することができ（米国特許第４ ４３１ ７３９号、同第４ ４２５ ４３７号、同第４ ３３８ ３９７号参照、これらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする）、発現したポリぺプチドの精製に続いて化学的に除去することもできる。
【００３６】
他の態様においては、本発明のヘモフィルスポリぺプチドは、ヘモフィルス・インフルエンゼ、特にヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の診断試験に用いることができる。いくつかの診断法、例えば、生体試料においてヘモフィルス菌を検出する段階が可能であり、下記手順：
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のヘモフィルスポリぺプチドと反応性の抗体又はその断片を該生体試料とインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルスの存在を示す該混合物において特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出する段階と
を行うことができる。
また、前記抗体を含有する又は含有する疑いのある生体試料においてヘモフィルス・インフルエンゼ抗原に特異的な抗体を検出する方法は、次のように
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチド又はその断片と該生物試料とをインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼに特異的な抗体の存在を示す該混合物において特異的に結合した抗原又は結合した断片を検出する段階と
を行うことができる。
【００３７】
当業者は、この診断試験が実質的にはポリぺプチドに特異的な抗体が細菌内に存在しているかを求めるために、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫分析又はラテックス凝集分析を含むいくつかの形態を取ることができることを認識する。
他の態様によれば、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を予防又は治療する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
他の態様によれば、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を診断する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。
【００３８】
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を予防又は治療する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
他の態様においては、本発明は、中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症を診断する方法であって、本組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を診断する方法であって、本発明の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法に関する。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである。他の実施態様においては、ヘモフィルス・インフルエンゼは型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである。
【００３９】
他の態様によれば、本発明は、ヘモフィルス感染症を予防又は治療するための医薬組成物の使用であって、該組成物の予防又は治療量を個体に投与する段階を含む、前記使用に関する。
他の態様によれば、本発明のヘモフィルスポリぺプチドは、ヘモフィルス感染症の診断を検出するための本発明のポリぺプチドを含むキットに用いることができる。
本発明のポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列は、ヘモフィルス・インフルエンゼを含んでいる疑いのある生体試料においてその細菌の存在を検出するのに用いられるＤＮＡプローブを設計するために用いることができる。本発明の検出法は、
ａ． 個体から生体試料を得る段階と；
ｂ． 本発明のポリぺプチド又はその断片をコードするＤＮＡ配列を有する１種以上のＤＮＡプローブを生体試料とインキュベートして混合物を形成する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼ菌の存在を示す該混合物において特異的に結合するＤＮＡプローブを検出する段階と
を含む。
【００４０】
本発明のＤＮＡプローブは、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症を診断する方法として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、試料において循環ヘモフィルス・インフルエンゼ（即ち、ヘモフィルス・インフルエンゼ核酸）を検出するために用いることができる。プローブは、慣用的な手法を用いて合成することができ、固相に固定化することができ、検出可能標識で標識することもできる。本出願に好ましいＤＮＡプローブは、本発明のヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドの少なくとも約６隣接ヌクレオチドに相補的な配列をもつオリゴマーである。
個体においてヘモフィルス・インフルエンゼを検出する他の診断法は、
ａ． 本発明のポリぺプチド又はその断片と反応性の抗体を検出可能標識で標識する段階と；
ｂ． 標識抗体又は標識断片を該個体に投与する段階と；
ｃ． ヘモフィルス・インフルエンゼの存在を示す該個体において特異的に結合した標識抗体又は標識断片を検出する段階と
を含む。
【００４１】
本発明の他の態様は、ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症の診断、特に治療に特異的な抗体を生産する免疫原としての本発明のヘモフィルスポリぺプチドの使用である。適切な抗体は、適切なスクリーニング法を用いて、例えば、試験モデルにおいてヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に対して受動的に防御する具体的な抗体の能力を測定することにより求めることができる。動物モデルの一例は実施例に記載されたマウスモデルである。抗体は、全抗体でもその抗原結合断片であってもよく、免疫グロブリン類に属していてもよい。抗体又は断片は、動物由来、特に哺乳動物由来、特にマウス、ラット又はヒト由来であってもよい。自然抗体又はその断片、又は所望される場合には、組換え抗体又は抗体断片であってもよい。組換え抗体又は抗体断片という用語は、分子生物学手法を用いて生産された抗体又は抗体断片を意味する。抗体又は抗体断片は、ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルであってもよい。ヘモフィルス・インフルエンゼポリぺプチドと関連がある多くのエピトープに特異的であってもよいが１つに特異的であることが好ましい。
本発明の他の態様は、ヘモフィルス感染症を予防又は治療するための本発明の医薬組成物の使用であって、該組成物の予防又は治療量を個体に投与する段階を含む、前記使用である。
特に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術科学用語は、本発明が属している当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に挙げたすべての出版物、特許出願、特許、他の参考文献の記載は全体で本願明細書に含まれるものとする。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。更に、材料、方法、実施例は単に例示であり、限定するものではない。
【００４２】
【実施例】
型別不能ヘモフィルス ・ インフルエンゼ（ ＮＴＨＩ ）ポリぺプチドの分離とこれらのポリぺプチドをコードする遺伝子の同定
表面曝露 ＮＴＨＩ ポリぺプチドの分離
細菌株
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ臨床分離物１２０８５と１００９５はＤ．Ｍ． Ｇｒａｎｏｆｆ（セントルイス、ミズリー州）から、Ｂ−２０、Ａ１８、Ａ１０８、Ｃ−９８、Ｃ−２６、Ｂ−３１をＣｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｌｏｇｉｅ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ ｄｅ ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌａｖａｌから供与された。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５は、パキスタンの下気道感染症をもつ子供の血液から分離した。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、バーリントン、オンタリオ）を組換えＤＮＡ用のホスト株として用いた。大腸菌 ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）をλＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージベクターによる感染用のホスト株として用いた。大腸菌 ＸＬＯＬＲ（ストラタジーン）をインビボ励起繊維状λＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓによる感染用のホスト株として用いた。
【００４３】
抗血清
完全又は不完全フロインドアジュバント（シーダーレーンラボラトリーズ社、ホーンバイ、カナダ）の存在下外膜タンパク質で３週おきに皮下免疫した後にマウス抗血清を産生した。３回目の免疫処置の２１日後に血清を集めた。
熱死滅型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５についてＥＬＩＳＡとウェスタンブロッティングによる反応性に基づいて４種のヒト抗血清を選択した。
【００４４】
ヘモフィルス ・ インフルエンゼライブラリーの構築とスクリーニング
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５ＤＮＡをゲノム抽出キット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて抽出した。ＤＮＡをＴｓｐ５０９Ｉで消化し、ＥｃｏＲＩ消化λ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージアーム（ストラタジーン）にライゲートした。そのライゲーションを製造業者の推奨（ストラタジーン）に従ってギガパック抽出物に試験管内パッケージングした。組換えファージを大腸菌 ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に２．５×１０４ ＰＦＵ／１５０ ｍｍ（直径）プレートの密度で塗布した。８時間インキュベートした後、プレートをニトロセルロースディスクで重層し、得られたリフトをヒトとマウスの血清でイムノブロッティング処理した。正のクローンを集め、プラーク精製した。問題のヘモフィルス遺伝子をコードする組換えｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドをＥｘＡｓｓｉｓｔ繊維状ヘルパーファージとλ耐性株大腸菌 ＸＬＯＬＲを用いて精製バクテリオファージからインビボ切除により回収した。
【００４５】
抗原の同定
これらの組換え大腸菌の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＡとイムノブロット分析から各クローンがヒト又はマウス抗血清と反応する１種以上のポリぺプチドを発現したことがわかった。
【００４６】
ＤＮＡ シークエンシングと配列分析
ゲノムクローンをタクダイデオキシターメネーターサイクルシークエンシングキット（Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ）（アプライドバイオシステム、フォスターシティ、カリフォルニア州）で配列決定した。いくつかの内部プライマーをクローン化挿入断片の中へ配列決定するために設計した。配列アセンブリをシークエンサーソフトウェア（ジーンコードコーポレーション、アンアーバ、ミシガン州）を用いて行い、配列分析をマックベクターソフトウェア（オックスフォードモレキュラー社、キャンベル、カリフォルニア州）で行った。
【００４７】
実施例 １
本実施例は、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子の発現ベクターへのクローニングを示すものである。
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１〜ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３）のコード領域を、制限部位ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）、ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）又はＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）を付加するために塩基拡張部分を有する下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５のゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡサーマルサイクラージーンアンプＰＣＲシステム２４００パーキンエルマー、サンホゼ、カリフォルニア州）によって増幅した。ＰＣＲ産物をキアゲン製キアクイックゲル抽出キットを用いることにより製造業者の説明書に従って（チャッツワース、カリフォルニア州）アガロスゲルから精製し、適切なエンドヌクレアーゼ（ファルマシアカナダ社、Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ、カナダ）で消化した。ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、マディソン、ウィスコンシン州）を同様に消化し、キアゲン製キアクイックゲル抽出キット（チャッツワース、カリフォルニア州）を用いてアガロースゲルから精製した。消化したＰＣＲ産物を酵素制限ｐＥＴ発現ベクターにライゲートした。ライゲートした産物を大腸菌株ＤＨ５α［φ８０ｄｌａｃΔＭ１５△（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋）ｄｅｏＲ ｔｈｉ−１ ｓｕｐＥ４４ λ−ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］（ギブコＢＲＳ、ゲイザースバーグ、メリーランド）にシマニスの方法（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ． （１９８５） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ， ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ． ｖｏｌ． １ ｐｐ． １０９−１３５）に従って形質転換した。組換え遺伝子含有プラスミド（ｒｐＥＴ）をキアゲンキット（チャッツワース、カリフォルニア州）を用いて精製し、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した（タクダイデオキシターメネーターサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。
【００４８】
表１． ＤＮＡクローニング用オリゴヌクレオチドプライマー表
【表２】
【表３】
＊ ヌクレオチドの位置はクローニングの結果、即ち、ＰＣＲ産物の長さと図１での位置を示す。
【００５１】
実施例 ２
本実施例は、他の型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子のＰＣＲ増幅とシークエンシング及びその遺伝子の分子保存レベルの評価を記載するものである。
それらの株由来型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１のそれぞれのコード領域を、次のオリゴ：
ＨＡＭＪ３４２（５’ −ＣＡＡＧＧＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＧＧＣＡＧＧ−３’）；
ＨＡＭＪ３４３（５’ −ＣＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＴＡＡＴＡＴＴＧ−３’）
を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ＤＮＡサーマルサイクラージーンアンプＰＣＲシステム２４００パーキンエルマー、サンホセ、カリフォルニア州）によって増幅した。ＰＣＲ産物を、キアゲン製のキアクイックゲル抽出キットを用いて製造業者の説明書（チャッツワース、カリフォルニア州）に従ってアガロースゲルから精製し、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した（タクダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット、ＡＢＩ、フォスターシティ、カリフォルニア州）。これらの８菌株すべてについて作成したＰＣＲ断片の長さは同一であった。これらの菌株（１２０８５、１００９５、Ａ１８、Ａ１０８）由来のヌクレオチドと予想アミノ酸配列のペアワイズ比較から、図２５に示されるように９９％ 同一であることがわかった。
【００５２】
実施例 ３
本実施例は、組換え型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１ポリぺプチドの作製と精製を示す図である。
配列番号１に対応するＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子を有する組換えｐＥＴ２１−ｂ＋プラスミドを用いて大腸菌株Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）［Ｆ−ｏｍｐＴ， ｈｓｄＳ（ｒｂ，ｍｂ）， ｇａｌ， ｄｃｎ， ｌａｃＹＩ（ＤＥ３）］（ノバジェン、マディソン、ウィスコンシン）をエレクトロトランスフォームした（ジーンパルサーＩＩ装置、バイオラドラボス、ミシソーガ、カナダ）。この大腸菌株の中で、遺伝子がイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘発性のｌａｃプロモーターの制御下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３プロファージに存在する）によって組換えポリぺプチドのＴ７プロモーター制御発現が特異的に認識される。形質転換体Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（シグマ・アルドリッヒカナダ社、オークビル、カナダ）を含有するＬＢブイヨン（ペプトン１０ ｇ／ｌ、酵母エキス５ ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ／ｌ）中２５０ ｒｐｍで撹拌しながら３７℃でＡ６００値が０．５になるまで増殖した。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドの生産を誘発させるために、細胞をＩＰＴＧの存在下に１ ｍＭの最終濃度で３０℃において３時間インキュベートした。５００ ｍｌの培養物からの誘発細胞を遠心分離により沈降させ、−７０℃で凍結した。
【００５３】
ＩＰＴＧ誘導Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１の可溶性細胞質画分からの組換えポリぺプチドの精製をＨｉｓ・タグ配列（６個の隣接的ヒスチジン残基）の性質に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって行い、Ｈｉｓ・結合金属キレート化樹脂に固定化した２価のカチオン（Ｎｉ２＋）に結合した。概要としては、５００ ｍｌのＩＰＴＧ誘導培養物から得られた沈降細胞を１ ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ；シグマ）を含有する溶解バッファー（２０ ｍＭトリス、５００ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭイミダゾール、ｐＨ ７．９）に再懸濁し、音波処理し、１６，０００Ｘｇで３０分間遠心分離してデブリを除去した。上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン、ミシソーガ、オンタリオ、カナダ）上に析出させた。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドを２５０ ｍＭイミダゾール−５００ ｍＭ ＮａＣｌ−２０ ｍＭトリスｐＨ ７．９で溶離した。試料からの塩とイミダゾールの除去は、４℃でＰＢＳに対して透析することにより行った。大腸菌の可溶性画分から得られた組換えポリぺプチド量をＭｉｃｒｏＢＣＡ（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）によって測った。
【００５４】
実施例 ４
本実施例は、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１で免疫化後、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に対する免疫原性と防御能の分析を示すものである。
５匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールスリバー、オンタリオ、カナダ）を大腸菌熱不安定毒素アジュバント（ＬＴ； １μｇ； セダーレーンラボラトリーズ社、ホーンバイ、カナダ）の存在下に２５μｇのアフィニティ精製ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１−Ｈｉｓ・タグ組換えポリぺプチドで、対照としてＰＢＳ中アジュバントのみで２週間おきに３回鼻内に免疫した。血液試料をそれぞれの免疫の前日と３回目（４２日目）の注射の１４日後に眼窩副鼻腔から集めた。抗体力価を型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５の熱死滅外膜小胞についてＥＬＩＳＡにより求めた。二次抗体は、アルカリンホスファターゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｆｃ特異的）（ジャクソンイムノリサーチラボス、ミシソーガ、オンタリオ）を用いた。抗血清の反応性力価を相互の希釈度として定義し、吸光度が免疫前血清試料で得たものより２倍増加した。ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１によって誘発した免疫応答が機能的に重要であるかを調べるために、約２×１０５ ＣＦＵの型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５で肺臓内に攻撃したマウスにおいて１４日後にインビボ防御能を評価した。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ攻撃接種物の試料をチョコレート寒天プレート上に塗布して攻撃量を確かめた。型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼのインビボ増殖を制限する点で予防接種の有効性を測定するために、注射の５時間後にペントバルビタールナトリウム（ＥｕＴｈａｎｙｌ（登録商標））の腹腔内注射によってマウスを犠牲にした。気管支肺胞洗浄について細菌数定量用連続希釈のプレーティングにより細菌クリアランスを評価した。アジュバントのみを注射したマウスを負の対照として用いた。
免疫原性実験の結果（表２）から、免疫動物の血清の特異抗体のレベルが対照血清に相対して約１０００倍まで上昇したことがわかった。平均力価をＯＭＰで測定し、熱死滅試料は１つの希釈だけ異なり、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１ポリぺプチドが実際に表面曝露抗原であることが確認された。
【００５５】
表２． 血清ａにおけるＮＴＨＩ特異的抗体に対する全身免疫の影響
【００５６】
防御実験の結果（表３）から、菌株１２０８５が対照動物の肺に容易に増殖して攻撃後５時間までに生存できる型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ細胞数が２００％だけ増加したことがわかった。対照的に、ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１免疫マウスによる菌株１２０８５の実質的な肺クリアランスが明らかであったが、免疫動物の肺における細菌沈着物の最初の数の３５％ だけが攻撃後５時間までに回収された。
【００５７】
表３． 型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５ａの肺クリアランスに対する全身免疫の影響
ｂ） ＊＊Ｐ ＜ ０．００９８は非対合性ｔ検定とウエルシュ補正に従って算出し、対照と比較した。
【００５８】
実施例 ５
本実施例は、ヒト血清と防御マウスからの抗血清による型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の組換えポリぺプチドの認識を示すものである。
標準ウェスタンブロット法を用いて精製組換えポリぺプチドがヒト血清によって認識されるかを調べた。更に、外膜タンパク質標品で免疫したマウスからの抗血清を精製組換えポリぺプチドに対して試験した。これらの標品で免疫したマウスは、型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５で攻撃した後に高肺クリアランスを示した。抗原の調製については、精製組換えポリぺプチドをＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含有する試料バッファーで１００℃で５分間処理した。ポリぺプチドをＬａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． （１９７０） Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ， ２２７：６８０−６８５の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ポリぺプチドをゲルからニトロセルロース紙へ方法（Ｔｏｗｂｉｎ， Ｈ．， Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ， Ｔ． ＆ Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ． （１９７９） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｈｅｅｔｓ： ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ４３５０−４３５４）で電気泳動で移し、ヒト又はマウス抗血清でプローブした。抗体と反応性の抗原の検出を結合抗マウス又は抗ヒト免疫グロブリンと色基質を用いた間接酵素イムノアッセイで行った。表４の結果から、ほとんどのポリぺプチドがヒト免疫系によってすでに見られたことがわかる。ワクチン候補としてこれらのポリぺプチドは、ヒトにおいて強力な免疫応答を誘発させる可能性がある。更に、ほとんどのポリぺプチドが防御マウスからの血清によって認識された。血清反応性は、感染症のマウスモデルにおいて高肺クリアランスに相関している。
【００５９】
表４． 正常ヒト血清と防御マウス由来の抗血清と型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５組換えポリぺプチドとの反応性
ｂ） マウスをそれぞれの組換えポリぺプチドで免疫し、肺クリアランスを実施例４のように測定した。
ｃ） ｎｄは実施せず。
【図面の簡単な説明】
【図１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１を示す図である。
【図２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ１２０８５株由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１の推定アミノ酸配列： 配列番号２を示す図である。
【図３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ２遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号３を示す図である。
【図４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ２の推定アミノ酸配列： 配列番号４を示す図である。
【図５】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ３遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号５を示す図である。
【図６】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ３の推定アミノ酸配列： 配列番号６を示す図である。
【図７】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ４遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号７を示す図である。
【図８】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ４の推定アミノ酸配列： 配列番号８を示す図である。
【図９】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ５遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号９を示す図である。
【図１０】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ５の推定アミノ酸配列： 配列番号１０を示す図である。
【図１１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ６遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１１を示す図である。
【図１２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ６の推定アミノ酸配列： 配列番号１２を示す図である。
【図１３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ７遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１３を示す図である。
【図１４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ７の推定アミノ酸配列： 配列番号１４を示す図である。
【図１５】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ８遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１５を示す図である。
【図１６】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ８の推定アミノ酸配列： 配列番号１６を示す図である。
【図１７】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ９遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１７を示す図である。
【図１８】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ９の推定アミノ酸配列： 配列番号１８を示す図である。
【図１９】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１０遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号１９を示す図である。
【図２０】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１０の推定アミノ酸配列： 配列番号６を示す図である。
【図２１】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１１遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号２１を示す図である。
【図２２】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１１の推定アミノ酸配列： 配列番号２２を示す図である。
【図２３】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２遺伝子のＤＮＡ配列： 配列番号２３を示す図である。
【図２４】
型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ株１２０８５由来の全長ＢＶＨ−ＮＴＨＩ１２の推定アミノ酸配列： 配列番号２４を示す図である。
【図２５】
マックベクター配列分析ソフトウエア（バージョン６．５）からのプログラムクラスタルＷを用いることにより１２０８５、１００９５、Ａ１８、Ａ１０８ヘモフィルス・インフルエンゼ由来のＢＶＨ−ＮＴＨＩ１オープンリーディングフレームの予想アミノ酸配列の比較を示す図である。アラインメントの下にコンセンサスラインがあり、（＊）の記号は同一アミノ酸残基であり、（．）は保存アミノ酸残基である。
Claims (30)
- 下記より選ばれたポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチド； 又は
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）におけるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。 - 下記より選ばれたポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含む第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含むポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープをコードするポリヌクレオチド； 又は
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）におけるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２記載のポリヌクレオチド。
- ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又はその断片又は類似体を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。 - ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。 - ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又はその断片又は類似体を含むポリぺプチドから少なくとも１０の隣接アミノ酸残基を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。 - ストリンジェントな条件下で
（ａ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリぺプチドをコードするＤＮＡ配列の補体；
のいずれかに対してハイブリダイズし、前記ポリぺプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４を含むポリぺプチドから少なくとも１０の隣接アミノ酸残基を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。 - 前記ＤＮＡが発現制御領域に作用可能に結合する、請求項１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ＤＮＡが発現制御領域に作用可能に結合する、請求項２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１１記載のベクターでトランスフェクトしたホスト細胞。
- 請求項１２記載のベクターでトランスフェクトしたホスト細胞。
- ポリぺプチドを生産する方法であって、前記ポリぺプチドの発現に適した条件下で請求項１３記載のホスト細胞を培養する段階を含む、前記方法。
- ポリぺプチドを生産する方法であって、前記ポリぺプチドの発現に適した条件下で請求項１４記載のホスト細胞を培養する段階を含む、前記方法。
- 下記より選ばれた１種を含む単離されたポリぺプチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体を含むポリぺプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープ；
（ｆ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基が欠失している（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリぺプチド； 又は
（ｇ）分泌アミノ酸配列が欠失している（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリぺプチド。 - 下記より選ばれた１種を含む単離されたポリぺプチド。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも７０％が同一であるポリぺプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれたアミノ酸配列をもつ第２ポリぺプチドに対して少なくとも９５％が同一であるポリぺプチド；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列を含むポリぺプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドに結合特異性を有する抗体を産生することができるポリぺプチド；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドの一部をもったエピトープ；
（ｆ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基が欠失している（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリぺプチド； 又は
（ｇ）分泌アミノ酸配列が欠失している（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリぺプチド。 - 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列又はその断片又は類似体をもつポリぺプチドを２つ以上含み、該ポリぺプチドがキメラポリぺプチドを形成するように結合するキメラポリぺプチド。
- 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４より選ばれた配列をもつポリぺプチドを２つ以上含み、該ポリぺプチドがキメラポリぺプチドを形成するように結合するキメラポリぺプチド。
- 請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のポリぺプチドと薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は補助剤を含む医薬組成物。
- 中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症の予防又は治療方法であって、請求項２１記載の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法。
- ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を予防又は治療する方法であって、請求項２１記載の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法。
- ヘモフィルス・インフルエンゼが型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである、請求項２３記載の方法。
- ヘモフィルス・インフルエンゼが型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである、請求項２３記載の方法。
- 中耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、肺炎及び髄膜炎並びに菌血症の診断方法であって、請求項２１記載の組成物の治療又は予防量を個体に投与する段階を含む、前記方法。
- ヘモフィルス・インフルエンゼ感染症に感受性のある個体においてヘモフィルス・インフルエンゼ細菌感染症を診断する方法であって、請求項２１記載の組成物の治療又は予防量を前記個体に投与する段階を含む、前記方法。
- ヘモフィルス・インフルエンゼが型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼである、請求項２７記載の方法。
- ヘモフィルス・インフルエンゼが型別可能ヘモフィルス・インフルエンゼである、請求項２７記載の方法。
- ヘモフィルス感染症を予防又は治療するための請求項２１記載の医薬組成物の使用であって、該組成物の予防又は治療量を個体に投与する段階を含む、前記使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23671200P | 2000-10-02 | 2000-10-02 | |
| PCT/CA2001/001402 WO2002028889A2 (en) | 2000-10-02 | 2001-10-02 | Haemophilus influenzae antigens and corresponding dna fragments |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008320133A Division JP2009149642A (ja) | 2000-10-02 | 2008-12-16 | ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004509647A true JP2004509647A (ja) | 2004-04-02 |
| JP2004509647A5 JP2004509647A5 (ja) | 2005-12-22 |
Family
ID=22890628
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002532471A Withdrawn JP2004509647A (ja) | 2000-10-02 | 2001-10-02 | ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 |
| JP2008320133A Pending JP2009149642A (ja) | 2000-10-02 | 2008-12-16 | ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 |
| JP2011121415A Pending JP2011231114A (ja) | 2000-10-02 | 2011-05-31 | ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008320133A Pending JP2009149642A (ja) | 2000-10-02 | 2008-12-16 | ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 |
| JP2011121415A Pending JP2011231114A (ja) | 2000-10-02 | 2011-05-31 | ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040171802A1 (ja) |
| EP (4) | EP1322762A2 (ja) |
| JP (3) | JP2004509647A (ja) |
| AU (1) | AU2002211999A1 (ja) |
| BR (1) | BR0114403A (ja) |
| CA (1) | CA2424275A1 (ja) |
| CY (2) | CY1114614T1 (ja) |
| DK (2) | DK2270171T5 (ja) |
| ES (2) | ES2588023T3 (ja) |
| HK (1) | HK1152965A1 (ja) |
| PT (2) | PT2270171E (ja) |
| SI (2) | SI2270171T1 (ja) |
| WO (1) | WO2002028889A2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009501012A (ja) * | 2005-07-15 | 2009-01-15 | コンセホ スペリオール デ インヴェスティガシオーネス シエンティフィカス | 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｂｄｖ）に由来する中空キメラ性ウイルス様粒子、これらの製造および応用 |
| JP2009523790A (ja) * | 2006-01-17 | 2009-06-25 | フオルスレン，アルネ | 新規表面露出ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳＩＮＦＬＵＥＮＺＡＥ）タンパク質（タンパク質Ｅ；ｐＥ） |
| JP2015515486A (ja) * | 2012-04-26 | 2015-05-28 | ノバルティス アーゲー | 抗原および抗原の組み合わせ |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004018514A1 (en) * | 2002-08-22 | 2004-03-04 | Id Biomedical Corporation | Polypeptides of nontypeable haemophilus influenzae and corresponding dna fragments |
| GB0410866D0 (en) | 2004-05-14 | 2004-06-16 | Chiron Srl | Haemophilius influenzae |
| EP2548884B1 (en) | 2005-08-10 | 2017-08-02 | Arne Forsgren AB | Interaction of moraxella catarrhalis with epithelial cells, extracellular matrix proteins and the complement system |
| TW201302779A (zh) | 2011-04-13 | 2013-01-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 融合蛋白質及組合疫苗 |
| US10279026B2 (en) * | 2012-04-26 | 2019-05-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Antigens and antigen combinations |
| EP3302404B1 (en) | 2015-06-05 | 2022-09-28 | Firmenich SA | Microcapsules with high deposition on surfaces |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4425437A (en) | 1979-11-05 | 1984-01-10 | Genentech, Inc. | Microbial polypeptide expression vehicle |
| US4431739A (en) | 1979-11-05 | 1984-02-14 | Genentech, Inc. | Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein |
| US4338397A (en) | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| EP0821737A4 (en) * | 1995-04-21 | 2005-01-19 | Human Genome Sciences Inc | NUCLEOTIDE SEQUENCE OF THE GENOME HAEMOPHILUS INFLUENZAE RD, THE FRAGMENTS THEREOF, AND ITS APPLICATIONS |
| GB9513074D0 (en) * | 1995-06-27 | 1995-08-30 | Cortecs Ltd | Novel anigen |
| CA2671261A1 (en) | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Neisserial antigens |
-
2001
- 2001-10-02 DK DK10177857.9T patent/DK2270171T5/da active
- 2001-10-02 PT PT101778579T patent/PT2270171E/pt unknown
- 2001-10-02 US US10/398,186 patent/US20040171802A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-02 CA CA002424275A patent/CA2424275A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-02 EP EP01980063A patent/EP1322762A2/en not_active Withdrawn
- 2001-10-02 AU AU2002211999A patent/AU2002211999A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-02 BR BR0114403-0A patent/BR0114403A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-10-02 SI SI200131030T patent/SI2270171T1/sl unknown
- 2001-10-02 EP EP10177857.9A patent/EP2270171B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 WO PCT/CA2001/001402 patent/WO2002028889A2/en active Application Filing
- 2001-10-02 JP JP2002532471A patent/JP2004509647A/ja not_active Withdrawn
- 2001-10-02 EP EP09159896.1A patent/EP2088197B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 ES ES09159896.1T patent/ES2588023T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 EP EP10177862A patent/EP2280071A3/en not_active Withdrawn
- 2001-10-02 ES ES10177857T patent/ES2435923T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 PT PT91598961T patent/PT2088197T/pt unknown
- 2001-10-02 SI SI200131055A patent/SI2088197T1/sl unknown
- 2001-10-02 DK DK09159896.1T patent/DK2088197T3/en active
-
2008
- 2008-12-16 JP JP2008320133A patent/JP2009149642A/ja active Pending
-
2011
- 2011-05-31 JP JP2011121415A patent/JP2011231114A/ja active Pending
- 2011-07-05 HK HK11106917.4A patent/HK1152965A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-10-31 CY CY20131100967T patent/CY1114614T1/el unknown
-
2016
- 2016-07-07 CY CY20161100642T patent/CY1117746T1/el unknown
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009501012A (ja) * | 2005-07-15 | 2009-01-15 | コンセホ スペリオール デ インヴェスティガシオーネス シエンティフィカス | 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｂｄｖ）に由来する中空キメラ性ウイルス様粒子、これらの製造および応用 |
| JP2009523790A (ja) * | 2006-01-17 | 2009-06-25 | フオルスレン，アルネ | 新規表面露出ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳＩＮＦＬＵＥＮＺＡＥ）タンパク質（タンパク質Ｅ；ｐＥ） |
| JP2013126986A (ja) * | 2006-01-17 | 2013-06-27 | Arne Forsgren | 新規表面露出ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳＩＮＦＬＵＥＮＺＡＥ）タンパク質（タンパク質Ｅ；ｐＥ） |
| JP2015515486A (ja) * | 2012-04-26 | 2015-05-28 | ノバルティス アーゲー | 抗原および抗原の組み合わせ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040171802A1 (en) | 2004-09-02 |
| DK2088197T3 (en) | 2016-08-01 |
| EP2270171A3 (en) | 2011-04-27 |
| DK2270171T5 (da) | 2013-11-18 |
| EP1322762A2 (en) | 2003-07-02 |
| EP2280071A2 (en) | 2011-02-02 |
| ES2435923T3 (es) | 2013-12-26 |
| WO2002028889A2 (en) | 2002-04-11 |
| EP2270171A2 (en) | 2011-01-05 |
| SI2088197T1 (sl) | 2016-11-30 |
| EP2088197A2 (en) | 2009-08-12 |
| CA2424275A1 (en) | 2002-04-11 |
| JP2011231114A (ja) | 2011-11-17 |
| CY1114614T1 (el) | 2016-10-05 |
| EP2280071A3 (en) | 2011-04-27 |
| BR0114403A (pt) | 2004-02-17 |
| PT2270171E (pt) | 2013-11-05 |
| JP2009149642A (ja) | 2009-07-09 |
| EP2088197A3 (en) | 2011-12-21 |
| AU2002211999A1 (en) | 2002-04-15 |
| ES2588023T3 (es) | 2016-10-28 |
| DK2270171T3 (da) | 2013-10-14 |
| EP2088197B8 (en) | 2016-07-20 |
| CY1117746T1 (el) | 2017-05-17 |
| EP2088197B1 (en) | 2016-06-08 |
| EP2270171B1 (en) | 2013-09-04 |
| SI2270171T1 (sl) | 2013-12-31 |
| PT2088197T (pt) | 2016-08-01 |
| HK1152965A1 (en) | 2012-03-16 |
| WO2002028889A3 (en) | 2003-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2011231114A (ja) | ヘモフィルス・インフルエンゼ抗原及び対応ｄｎａ断片 | |
| US20090074807A1 (en) | Moraxella (branhamella) catarrhalis antigens | |
| AU2007202270B2 (en) | Haemophilus influenzae antigens and corresponding DNA fragments | |
| AU2011253696B8 (en) | Haemophilus influenzae antigens and corresponding DNA fragments | |
| US20080227706A1 (en) | Bvh-a2 and bvh-a3 antigens of group b streptococcus | |
| US7410648B2 (en) | Polypeptides of Moraxella (Branhamella) catarrhalis | |
| JP4397233B2 (ja) | モラクセラ（ブランハメラ）カタラーリスポリペプチド及び対応するｄｎａ断片 | |
| AU2002302236A1 (en) | Moraxella(Branhamella) catarrhalis antigens | |
| JP2005508146A (ja) | モラクセラ（ブランハメラ）カタラーリス抗原 | |
| WO2004048575A2 (en) | Streptococcus pneumoniae surface polypeptides | |
| AU2002325109A1 (en) | Moraxella (branhamella) catarrhalis polypeptides and corresponding DNA fragments | |
| WO2004018514A1 (en) | Polypeptides of nontypeable haemophilus influenzae and corresponding dna fragments | |
| AU2002344869A1 (en) | Moraxella (branhamella) catarrhalis antigens | |
| WO2004009621A2 (en) | Polypeptides of nontypeable haemophilus influenzae |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040820 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040820 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20080326 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080616 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080911 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080919 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081216 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091116 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20100316 |