PT1896071E - Métodos e composições com melhorias na atividade terapêutica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

" MÉTODOS E COMPOSIÇÕES COM MELHORIAS NA ATIVIDADE TERAPÊUTICA" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo A divulgação refere-se a métodos para a modificação terapêutica de proteínas que interajam com os recetores com fragmentos Fc e produção de proteínas terapêuticas modificadas, e.g., anticorpos, de tal modo que a composição das cadeias de oligossacáridos possa aumentar a de ligação do anticorpo para com o seu alvo e altere a afinidade do ligando recetor, e como consequência a atividade da função efetora dos ditos anticorpos quando comparada com anticorpos não modificados.

Descrição do estado da técnica

Os anticorpos são glicoproteínas séricas solúveis que desempenham um papel significativo na imunidade inata. As estruturas de hidrocarbonetos de todos os anticorpos produzidos naturalmente em posições conservadas nas regiões constantes de cadeias pesadas variam com o isotipo. Cada isotipo possui uma matriz distinta de estruturas de oligossacáridos N-ligados, o que afeta variavelmente a construção, secreção ou atividade funcional das proteínas (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). Referente às Figs. 1 & 2, a estrutura dos oligossacáridos N-ligados varia consideravelmente, dependendo do grau de processamento, e pode incluir alto conteúdo em manose, assim como oligossacáridos biantenários complexos com ou sem a GlcNAc bifurcada e resíduos centrais de fucose (Wright, A., and Morrison, S. L., supra). Tipicamente, existe um processo heterogéneo das estruturas centrais de oligossacáridos ligadas a um local de glicosilação em particular de tal modo que mesmo os anticorpos monoclonais existem como múltiplas glicoformas. Do mesmo modo, foi demonstrado que as maiores diferenças na glicosilação de anticorpos ocorre entre linhas celulares produtoras de anticorpos, e mesmo diferenças menores são vistas para uma dada linha celular cultivada em diferentes condições de cultura. 0 ácido siálico nos glicanos (grupos estáticos) são tidos como importantes no prolongamento do tempo de meia vida do soro de glicoproteinas exceto anticorpos (Stockert, R. J. (1995) Physiol. Rev. 75, 591-609). Até agora, o papel do ácido siálico em anticorpos monoclonais (Mabs) não está bem elucidada. O tempo de meia vida dos Mabs é particularmente elevado e a construção de proteínas de fusão com fragmentos Fc tem-se revelado como uma estratégia útil no desenvolvimento de proteínas terapêuticas, e.g., a proteína etanercepte.

Os anticorpos e as moléculas recetoras de células T contêm regiões que são responsáveis por um recetor transmembranar ligante específico, cuja ligação modula a resposta celular. No sistema imunitário, estas funções são classificadas como humoral e celular. Os anticorpos são muitas vezes referidos como moléculas adaptadoras que ligam mecanismos imunitários humorais e celulares: as repostas humorais são atribuídas maioritariamente a anticorpos maturados, secretados e circulantes capazes de uma ligação de elevada afinidade a um antígeno alvo. As respostas celulares são atribuídas às consequências de ativação celular por ligação de complexos ab-ag e às consequências a jusante causadas pela libertação de mediadores celulares como resultado de uma ligação do complexo ab-ag às células efetoras. Estas respostas celulares incluem a neutralização do alvo, opsonização e sensibilização (se o antígeno estiver disposto na superfície de uma célula), sensibilização de mastócitos, e ativação do complemento. Para alvos celulares, isto é, antígenos transmembranares, estas funções de efetor levam ao que é comumente conhecido como citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

Por entre os isotipos de anticorpos (e.g., IgE, IgD, IgA, IgM, and IgG) , os IgGs são os mais abundantes, e as subclasses IgGl exibem o grau e gama de funções de efetor mais significativas. Os anticorpos tipo IgGl são os anticorpos mais comumente usados na imunoterapia do cancro, onde as atividades ADCC e CDC são consideradas importantes. Estruturalmente, a região da dobra IgG e os domínios CH2 desempenham um papel importante nas funções efetoras do anticorpo. Os oligossacáridos N-ligados presentes na região do fragmento Fc (formada pela dimerização da dobra, e os domínios CH2 e CH3) afetam as funções do efetor. Os oligossacáridos ligados covalentemente são estruturas do tipo biantenário e são bastante heterogéneos (Ver Figs. 1 e 2) . Existe em cada domínio CH2 um local conservado de glicosilação N-ligado em Asn297. No anticorpo maturado, os dois complexos biantenários de oligossacáridos ligados a Asn297 estão encobertos entre os domínios CH2, formando contactos extensos com o suporte principal polipeptídico. Foi descoberto que a sua presença é essencial para que o anticorpo medie funções de efetor, tais como ADCC (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., supra).

Estes oligossacáridos heterogéneos contêm predominantemente resíduos de ácido siálico, fucose, galactose e GlcNAc como açúcares terminais (Raju, T.S., et al. Glycobiology 2000. 10(5) : 477-86) . Foi demonstrado que alguns destes açúcares terminais, tais como os resíduos expostos de galactose, fucose central e a GlcNAc bifurcado afetam a atividade ADCC, CDC e também a ligação dos anticorpos a vários ligandos incluindo o complemento proteico Clq (Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol. 13 (4) : SI9-25) . Apesar de a maioria dos oligossacáridos N-ligados que estão presentes no fragmento Fc serem complexos biantenários na sua natureza, não são sialilados numa extensão significativa (Idusogie EE, et al. 2000. J Immunol. 15:164(8):4178-84).

As maiores estruturas encontradas na IgG humana e outras IgGs de produção recombinantes são as estruturas biantenárias complexas com ou sem resíduos expostos de Gal (Fig. 1). O significado biológico das estruturas que contêm Gal terminal nas funções do anticorpo têm sido estudadas em detalhe. A extensão da galactosilação dos anticorpos é afetada pela idade, género e doença (Raju, T.S., et al. Glycobiology 2000. 10(5): 477-86). De um modo geral, as estruturas de oligossacáridos são pouco específicas entre espécies e variam amplamente. Ainda mais, o significado biológico de estruturas de oligossacáridos com e sem resíduos de GlcNAc bifurcadas e fucose central foi também estudada. A IgG humana e muitas das IgGs de produção recombinante contêm menores quantidades de oligossacáridos sialilados, no entanto, a larga maioria das IgGs contêm estruturas de oligossacáridos não sialilados. A informação sobre os efeitos do ácido siálico no glicano Fc dos Abs na função FC é limitada, devido parcialmente à indisponibilidade de pares da mesma base de Mabs que diferem significativamente no conteúdo em ácido siálico. A remoção de ácido siálico do anticancerigeno IgGl Campath-lH foi relatada como não tendo efeito na atividade ADCC, porém os glicanos Fc na preparação original de Mab que foram usados como referência aparentavam estar cerca de menos 10% sialilados, tornando mais difícil a deteção de qualquer efeito (Boyd et al., 1995). De um modo similar, Wright and Morrison (1998) relataram que não houve diferença discernível na ligação FcyRI entre um Ab IgGl expresso numa linha celular mutante CHO que estava defeituosa em sialilação e o mesmo Ab expresso numa linha celular de estirpe selvagem CHO. No entanto, a quantidade de ácido siálico presente no Ab das células de estirpe selvagem era bastante baixo (Wright et al., 2000), e como tal quaisquer diferenças na ligação entre Abs sialilados e não sialilados seria também difícil de detetar. Mimura et al. (2000) compararam a atividade Fc da IgGl-Fc nativa (heterogénea) e IgGl AB vs o mesmo material após tratamento com sialidase e beta-galactosidase, mas não apenas com sialidase, o que permitiria uma análise sobre os efeitos do ácido siálico. Um Ab IgG3 humano mutado e fortemente sialilado (via ligação a2,3) (Lund et al., 1996 supra) foi 2 a 3 vezes menos ativo que a sua estirpe selvagem homóloga menos sialilada nos ensaios complementares de lise, e em ensaios funcionais FcyRI-dependentes e FcyRII-dependentes, mas uma variante altamente sialilada do mesmo Ab que continha uma mistura de duas ligações ácido siálico (oí2,3 e oí2,6) demonstrou atividades comparáveis com a estirpe selvagem (Jassal et al., 2001 Biochem Biophys Res Comm 286:243-249). Apesar de ter sido demonstrado que o tipo de ligação ácido siálico pode ter no mínimo algum efeito na função Fc de um Ab IgG3 mutante, os estudos não fizeram a comparação da função Fc de uma IgG com elevado conteúdo em ácido siálico com uma IgG com baixo conteúdo de ácido siálico.

Portanto, é necessária uma análise sistemática do papel das composições de ácido siálico em estruturas de oligossacáridos ligados a regiões constantes da imunoglobulina. Dadas as técnicas disponíveis de pré-expressão genética aplicada ou modificação pós-expressão de anticorpos terapêuticos, esta informação pode ser usada para aumentar e ainda mais corresponder as respostas celulares suscitadas por esta classe de biofarmacêuticos no alvo primário e indícios em questão. A WO 99/54342 divulga uma aplicação de glicosilação de proteínas. Jassal R et al., (2001) Biochemical and Biophysical Research Communications 286(2):243-9 divulgam a sialilação de um carbohidrato IgG-Fc. Suen KF et al., (2010) Protein Expression and Purification 71(1):96-102 divulgam uma expressão transiente de uma proteína de fusão com domínio Fc extracelular IL-23R em células CHO vs. HEK. Kumpel BM et al., (1994) Human Antibodies and Hybridomas 5(3-4):143-151 divulgam a galactosilação da IgG monoclonal humana anti-D produzido por linhas celulares linfoblastóides-B transformadas por EBV.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção providencia um método in vitro para controlo das propriedades de uma molécula contendo FC, compreendendo a alteração na sialilação de oligossacáridos na região Fc da glicoforma sialilada G2S2, em que a sialilação é ampliada na região Fc, em que a sialilação é alterada da região Fc da estirpe selvagem por tratamento ou modificação enzimática da molécula por uma a-(2,3)- sialiltransferase, e em que as propriedades controladas são selecionadas do grupo constituído por afinidade para um ou mais recetores

FcyRI, FcyRIIA, e FcyRIIIA, atividade ADCC, ativação de macrófagos ou monócitos, tempo de meia vida do soro, e predisposição. A presente invenção também providencia um método in vitro para o controlo das propriedades de uma proteina terapêutica contendo FC caracterizada por ter um oligossacárido biantenário covalentemente ligado a um residuo de asparagina no dominio da imunoglobulina CH2 da dita proteina, compreendendo a conversão de uma proteina contendo Fc não da glicoforma G2S2 num oligossacárido da glicoforma sialilada G2S2, em que o passo de conversão compreende o uso de uma a-(2,3)-sialiltransferase para adicionar resíduos de ácido siálico, e em que a dita proteína contendo Fc tem uma ou mais propriedades selecionadas do grupo constituído pela afinidade reduzida para FcyRIIA e FcyRIIIA, atividade reduzida em ensaios ADCC mediados por células NK, aumento da afinidade para FcyRI, aumento da habilidade para a ativação de macrófagos, e menor tempo de meia vida do soro quando comparado com a mesma proteína terapêutica contendo Fc não da glicoforma G2S2 . A presente invenção também providencia uma proteína terapêutica caracterizada por ter um oligossacárido covalentemente ligado a um resíduo de asparagina no domínio da imunoglobulina CH2 da dita proteína sendo da glicoforma a-(2,3)-sialilada G2S2, em que a dita proteína contendo Fc tem afinidade reduzida para FcyRIIA e FcyRIIIA, atividade reduzida em ensaios ADCC mediados por células NK, aumento da afinidade para FcyRI, aumento da habilidade para a ativação de macrófagos, e menor tempo de meia vida do soro quando comparado com uma preparação da mesma proteína terapêutica contendo Fc nas glicoformas não sialiladas GO, G1 ou G2. A presente invenção também providencia um método in vitro para a preparação de um lote de proteínas terapêuticas recombinantes contendo Fc da glicoforma G2S2 caracterizada por compreender um domínio isotípico da imunoglobulina IgG de pelo menos uma região com dobra, um domínio CH2 e CH3, em que o método compreende o tratamento de um lote com a enzima a-(2,3)-sialiltransferase de modo a adicionar resíduos de ácido siálico nas cadeias de polissacáridos ligadas à dita proteína. A presente invenção também providencia um método in vitro para o controlo da afinidade da ligação para um alvo de uma molécula contendo Fc com um domínio de ligação específico para o alvo, compreendendo a alteração da sialilação dos oligossacáridos na região Fc da glicoforma sialilada G2S2, em que a sialilação é ampliada na região Fc e a predisposição descresce, e em que a sialilação é alterada da região Fc da estirpe selvagem por tratamento ou modificação enzimática da molécula com uma a-(2,3)-sialiltransferase. A presente invenção divulga métodos para a otimização das funções celulares humorais e imunes de moléculas contendo Fc, particularmente anticorpos terapêuticos. A presente divulgação compreende um método para o controlo das propriedades de uma molécula que contenha Fc, compreendendo a alteração (aumento ou redução a partir da estirpe selvagem) da sialilação de oligossacáridos na região FC de modo a controlar a avidez (avidity) da molécula para múltiplas proteínas alvo localizadas; a afinidade para um ou mais dos recetores gama FC,e.g., recetores FcyRI, FcyRIIA, e FcyRIIIA; atividade ADDC; ativação de monócitos ou macrófagos; e tempo de meia vida do soro. A sialilação de glicanos pode ser alterada por tratamento enzimático ou modificação enzimática da molécula, manipulação genética da molécula, cromatografia da lectina, cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão molecular, seleção especifica ou modificação genética da linha celular usada para a expressão da proteína, cultivo de células hospedeiras usadas para produzir a proteína contendo Fc num soro ou num meio contendo enzimas capazes de promover modificações em oligossacáridos ou inibição de tais enzimas, e exposição da proteína a diferentes ambientes de pH. A divulgação também se refere à preparação de lotes de anticorpos altamente homogéneos contendo oligossacáridos N-ligados totalmente sialilados no domínio da Fc. Refere-se ainda à purificação de lotes de anticorpos enriquecidos para anticorpos que contenham ácido siálico no oligossacárido Fc assim como anticorpos que não contenham ácido siálico no oligossacárido Fc.

Em particular, a divulgação refere-se a um método de manipulação da glicosiltransferase (sialiltransferase) in vitro, de modo a afetar o nível de sialilação do anticorpo monoclonal resultante, expressado de um modo recombinante, ou outra proteína de fusão que contenha Fc e em que o método origina que a proteína expresse de modo recombinante tenha uma otimização apropriada (i) funções efetoras mediadas por Fc, (i i) ligação ao recetor Fcy, (i i i) alterações de ADCC, (iv) tempo de meia vida do soro comparável ao polipéptido expresso de modo recombinante contendo Fc não otimizado para conteúdo em ácido siálico ou (v) avidez (avidity) para moléculas alvo exibidas numa ordem natural ou sintética.

DESCRIÇÃO BREVE DAS VÁRIAS VISTAS SOBRE AS FIGURAS

Fig. 1 é um esquema da maior estrutura de oligossacárido encontrada na IgG humana.

Fig. 2 é um esquema das maiores estruturas de oligossacáridos produzidos nas células do ovário de hamster Chinês (CHO).

Fig. 3 mostra os resultados de uma análise de HPLC de oligossacáridos FC. Os oligossacáridos N-ligados foram libertados do anticorpo através do tratamento com a enzima PNGase F. Os oligossacáridos libertados foram marcados com ácido antranilico e os oligossacáridos marcados foram purificados por cromatografia de filtração por gel. Os oligossacáridos marcados e purificados foram analisados por HPLC, resultando no cromatograma exibido.

Figs. 4A e 4B são gráficos que mostram a ligação de diferentes complexos imunes Abl:TNF a FcyRII humana em células K562 por dois formatos diferentes. (A) Ligação por competição medida pela adição de várias quantidades de complexos não marcados de Abl e TNF nas células, na presença de uma quantidade predeterminada da IgGl Ab5 humana marcada em 125I com Ab6, um Ab específico de ratinho para Ab5. (B) Ligação direta medida através da adição as células K562 variando quantidades de Abl complexado com TNK marcado em 125I.

Figs. 5A-D apresenta gráficos de estudos de ligação da FcYRIIIa com várias preparações teste de Ab usadas para competição com mAb anti-FcYRIIIa 3G8 com uma concentração invariável pela ligação com as variantes de glicosilação natural da célula NK FcYRIIIa: Abl (A); Variantes naturais de glicosilação Ab5 (B) ; frações Abl da coluna de lectina (C); e frações Ab2 da coluna de LECTINA (D).

Figs. 6A-D apresenta gráficos que demonstram resultados dos ensaios in vitro ADCC efetuados usando Abl que difere no conteúdo em ácido siálico, células alvo K2 que sobreexpressam TNF na sua superfície celular, e células efetoras humanas PMBC que expressam o FcyRs. (A) variantes naturais de glicosilação Abl, (B) variantes de glicosilação natural Ab5, (C) comparação dos 3 sub-gráficos de Abl que diferem no conteúdo em ácido siálico, após fracionamento por afinidade por lectina WGA, e Abl (Gno) desglicolisado enzimaticamente, (D) comparação de uma amostra não tratada de Abl e uma amostra G2S2 Abl completamente sialilada, ou um controlo negativo Ab isotipicamente correspondente Ab7. As amostras foram analisadas em triplicado (as barras de erro representam o d.p.) e os resultados apresentados são representativos de três experiencias independentes para cada par de variantes. A diferença na atividade entre estas amostras teste foi significativa (P <0,0001 para os gráficos A, C, e D; P=0,0016 para o gráfico B) como determinado pela soma dos quadrados do teste F.

Figs. 7A e B apresentam gráficos que mostram a ligação competitiva de várias amostras de anticorpos IgG ao recetor FcyRI (CD64) humano em células U-937 (A) Abl G2 (totalmente galactosiladas e não sialiladas) e Abl GS2S2(hi) (totalmente galactosiladas e totalmente sialiladas) diferem apenas na ausência ou presença de ácido siálico, (B) dois lotes diferentes de Ab3 diferem na quantidade de espécies oligossacárido carregadas (espécies contendo ácido siálico) , sendo ou 2% ou 42% do total do oligossacárido.

Fig. 8 apresenta um gráfico que demonstra a relação entre o tempo após a administração e a concentração sérica da porção FC de uma proteína de fusão (FcPl) que tenha sido completamente sialilada (G2S2) ou não modificada.

Fig. 9 apresenta um gráfico que demonstra a relação entre o tempo após administração e a concentração sérica da portão Fc de um Ab2 G2S2 completamente sialilado, ou um Ab2 G2 completamente não sialilado, por métodos enzimáticos, como foi descrito.

Fig. 10A-D apresenta gráficos que demonstram o efeito do ácido siálico em preparações de Ab em termos de afinidade para o ligando alvo na superfície celular por ligação competitiva com AB radiomarcados: (A) Variantes naturais Abl, (b) variantes naturais Ab5, (C) frações de coluna de lectina de variantes Abl, e (D) frações de coluna de lectina de variantes Ab2. As amostras foram testadas em duplicados ou quadruplicados, e os resultados demonstrados são representativos de 3 ou 4 estudos independentes. A diferença na ligação entre estas amostras teste foi significativa (P <0,0001 para os gráficos A, C, e D) sendo determinado pela soma dos quadrados do teste F.

Fig. 11A-B apresentam gráficos que demonstram o efeito do ácido siálico em preparações de Ab na afinidade para o ligado alvo revestido em placas EIA; (A) variantes naturais Abl ligadas a TNF, (B) ligação de Ab2 a um anticorpo anti-Id.

Fig. 12A-C apresentam gráficos que demonstram o efeito do ácido siálico em preparações de Ab na afinidade para o ligando alvo apresentado como um antigeno solúvel radiomarcado ao Ab ligado à superfície: (A) Variantes naturais Abl), (B) frações da coluna de lectina de variantes Abl, e (C) frações da coluna lectina de variantes Ab2. Incubações paralelas com Ag radiomarcado e Ag em excesso de 100 vezes foram feito para determinar a capacidade de ligação não específica. As amostras foram testadas em triplicado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Abreviaturas al,3GT, oí-1,3-galactosiltransferase; a2,3ST, oí-2,3- sialiltransferase; β1,4ΘΤ, β-l,4-galactosiltransferase; ADCC, citotoxicidade celular dependente de anticorpos; ATCC, Coleção de Culturas Tipo Americana; BATDA, bis(acetoximetil) 2,2':6',2"-terpiridina-y,y"- dicarboxilato; BSA, albumina do soro bovino; meio CD, meio de cultura definido quimicamente; CDC, citotoxicidade dependente do complemento; CMP-Sia, ácido N-acetilneuramínico citidina monofosfato; DMEM, meio sintético Dulbecco's Modified Eagle media; E:T, rácio célula efetora para célula alvo; FBS, soro fetal bovino; ESI-MS, espectrometria de massa por ionização com electrospray. Células NK, células exterminadoras naturais; IgG, imunoglobulina G; IMDM, meio sintético Iscove's Modified Dulbecco's medium; MALDI-TOF-MS, espectroscopia de massa com analisador de tempo de voo e ionização/desorção a laser assistida por matriz; MHX, ácido micofenólico, hipoxantina, xantina; NANA, isómero do ácido siálico ácido N-acetilneuramínico; NGNA, isómero do ácido siálico - ácido N-glicolilneuramínico; PMBC, células mononucleares do sangue periférico; PBS, tampão fosfato salino; PNGase F, N-glicosidade F peptídica; RP-HPLC, Cromatografia liquida de alta performance de fase reversa; RT, temperatura ambiente; Sia, ácido siálico; UDP-Gal, uridina difosfato galactose; UDP-GlcNAc, uridina difosfato N-acetilglucosamina.

Definições 0 termo afinidade como aqui usado é entendido como uma medida da constante de ligação de um ligando simples monovalente ao seu correspondente par cognato ligante, por exemplo, a ligação de um fragmento Fab' para um antigeno ou epitopo. A afinidade pode ser medida de diversos modos, incluindo a medição de rácios on- e off- (kon e koff respetivamente) por e.g. ressonância de plasma (Biacore) e expressa como uma associação total (Kass) ou constante de dissociação (KD) onde o Kass é kon / koff e KD é koff / kon. KD pode também ser medido empiricamente por, e.g. medição da concentração na qual a ligação do ligando ao seu par está saturada a metade. Outro método de medir o KD é por um ensaio de competição, no qual um aglutinante ou ligando é ligado ou marcado e mantido a uma concentração constante enquanto o aglomerante ou ligando teste é adicionado em várias concentrações de modo a competir, movendo a substancia marcada do seu par ligando cognato e determinando a concentração na qual a marcação diminuiu para metade. 0 termo avidez (avidity) como aqui usado é entendido como uma medida da tendência de um ligando permanecer ligado ao seu par ligante enquanto ambos o ligando e o par ligante possam ser multivalentes e ter a tendência para múltiplos eventos de associação e dissociação que possam ocorrer simultaneamente para um ligando especifico. Assim, a avidez (avidity) pode ser aferida por um aumento na afinidade aparente ou conformações multivalentes de um par ligante com uma afinidade conhecida. 0 termo "proteína contendo Fc" ou "molécula contendo Fc" como aqui usado refere-se a uma proteína monomérica, dimérica ou heterodimérica com um domínio ligante e pelo menos um domínio de imunoglobulina CH2 e CH3. Os domínios CH2 e CH3 podem constituir pelo menos parte da região dimérica da proteína/molécula (e.g., anticorpo). 0 termo "anticorpo" destina-se a envolver anticorpos, fragmentos de digestão, porções específicas e variantes do mesmo, incluindo, sem limitação, miméticos de anticorpos ou porções constituintes de anticorpos que mimetizem a estrutura e/ou função de um anticorpo ou fragmento específico ou porção do mesmo, e retenham funções mediadas por Fc, incluindo sem limitações: ligação a recetores Fc (e.g. FcyRI (CD64) FcyRIIA (CD32A), FcyRIIIA (CD16A) e FcRn), ligação complementar (e.g. Clq), ADCC e CDC. 0 termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado é uma forma específica de uma proteína de fusão contendo Fc na qual o domínio de ligação do ligando retêm uma homologia substancial em pelo menos um domínio variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo de pelo menos uma espécie do anticorpo animal. 0 termo "ácido siálico" refere-se a qualquer membro da família dos açúcares carboxilados com nove carbonos. 0 membro mais comum da família do ácido siálico é o ácido N-acetilneuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D- galactononulopiranos-l-ónico (frequentemente abreviado para Neu5Ac, NeuAc, ou NANA). Um segundo membro da família é o ácido N-glicolilneuramínico (NGNA, Neu5Gc ou NeuGc), no qual o grupo N-acetil do NeuAc está hidroxilado. Esta forma é prevalente em glicoproteínas de roedores e fontes microbianas. Um terceiro membro da família ácido siálico é o ácido 2-ceto-3-desoxinonulosónico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). Também estão incluídos substitutos (na posição 9) do ácido siálico como 9-O-C -C6 acil Neu5Ac como 9-0-lactil-Neu5Ac ou 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac e 9 azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para um review da família do ácido siálico, ver, e.g., Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer Verlag, New York (1992)).

Descrição

Foi descoberto de um modo inesperado que o nível de sialilação dos oligossacáridos Fc altera a afinidade dos anticorpos terapêuticos produzidos de forma recombinante por recetores Fcy, resultando na modulação de vários aspetos das ações biológicas dos ditos anticorpos. Mais especificamente, foi descoberto que Abs muito sialilados têm uma afinidade significativamente reduzida para os recetores de baixa afinidade, FcyRIIA (CD32A) e FcyRIIIA (CD16A) e possuem uma atividade in vitro significativamente reduzida em ensaios ADCC nos quais o FcyRIIIA é tido como sendo o recetor relevante. Foi também descoberto que Abs muito sialilados possuem uma maior afinidade para o recetor de alta afinidade Fcy, FcyRI (CD64), e que as proteínas contendo Fc totalmente sialiladas reduziram o seu tempo sérico de meia vida, quando comparados com proteínas contendo Fc não sialiladas ou parcialmente sialiladas.

Foi ainda descoberto que a remoção (ou ausência, ou níveis reduzidos) de ácido siálico dos oligossacáridos Fc aumenta a avidez (avidity) de anticorpos terapêuticos produzidos de forma recombinante para a sua molécula alvo. Enquanto não se pretendendo ficar ligado a uma teoria, a remoção do grupo estático carregado do oligossacárido pode ser interpretando como permissão de maior flexibilidade na estrutura total do anticorpo, em que a flexibilidade desempenha uma esfera alargada de interação potencial para os dois domínios de ligação no que respeita um ao outro. A capacidade de um Ab se ligar de um modo bivalente a dois epítopos de antígenos também irá depender da acessibilidade, orientação, densidade e mobilidade do epítopo. Deve ser notado que o efeito da sialilação na ligação do antígeno pode também ser relevante para Abs que reconheçam antígenos de superfície virais ou bacterianos, e mesmo antígenos solúveis que são homopolímeros, dado que a flexibilidade do Ab pode determinar a extensão na qual as moléculas de Ab individuais se ligam de um modo bivalente quando num complexo imune solúvel, onde não só poderão alguns dos Abs ligar a mais do que um antígeno, mas alguns antígenos poderão estar ligado por mais do que um Ab. A presente divulgação compreende um método para o controlo das propriedades de uma molécula contendo Fc por alteração da sialilação dos Fcs dos oligossacáridos e as moléculas contendo Fc alteradas. 0 ácido siálico possui uma carga negativa a pH fisiológico e, assim, com a presença de ácido siálico no carbohidrato ligado a Fc, pode-se esperar que haja uma alteração na estrutura tridimensional, e assim a conformação do domínio CH2, afetando a ligação de Fc aos vários ligandos ou recetores. A molécula contendo Fc altera a afinidade por um ou mais recetores FcyRI, FcyRIIA, and FcyRIIIA, atividade ADCC, ativação de macrófagos ou monócitos, e tempo de meia vida do soro.

Enriquecimento de Formas Sialiladas de Proteínas contendo

Fc

Uma aproximação para preparar sub-lotes de uma proteína contendo Fc em particular que possam diferir no conteúdo em ácido siálico será o de pegar numa preparação da proteína contendo Fc com oligossacáridos Fc heterogéneos, incluindo ambas as moléculas sialiladas e não sialiladas, e passar por uma coluna de lectina imobilizada que tenha uma diferente afinidade para oligossacáridos sialilados e não sialilados. A parte não ligante que passa pela coluna (T, através) ou a fração da coluna não ligada pode ser separada da fração ligada (B, ligada), sendo que a última é recolhida enquanto é passado o tampão de eluição pela coluna. Pode também ser possível a recolha em separado de uma fração fracamente ligada ou a fração retardada pela coluna (R, retardada), por exemplo, procedendo à recolha da proteína contendo Fc que elui durante a lavagem contínua da coluna com o tampão da amostra original. Dependendo da lectina usada, a fração não ligante pode ter um conteúdo mais alto ou mais baixo em ácido siálico do que a fração ligante.

Exemplos de lectinas que podem ser enriquecidas para proteínas contendo Fc sialiladas ou não sialiladas são a lectina da Maackia amurensis (MAA), que liga especificamente a oligossacáridos com ácido siálico terminal, e a lectina aglutinina de germe de trigo (WGA), que liga especif icamente a oligossacáridos com um ácido siálico terminal ou N-acetilglucosamina terminal (GlcNAc). Outro exemplo é a lectina Ricina I (RCA) , que liga a oligossacáridos com galactose terminal.

No último exemplo, a fração de passagem não ligante pode ser enriquecida para moléculas contendo Fc sialiladas.

Modificação enzimática de proteínas contendo Fc

Uma aproximação alternativa para a preparação de sub-lotes de uma proteína que contenha Fc, e que difira no conteúdo de ácido siálico, é o tratamento de uma porção de uma preparação de proteínas contendo Fc com a enzima sialidase, que assim remove os ácidos siálicos. 0 material não sialilado resultante pode então ser comparado com o material oriqinal e parcialmente sialilado tendo em conta diferenças na atividade biolóqica. Quando mais elevado o conteúdo em ácido siálico no lote oriqinal da proteína que contém Fc, maior a probabilidade de detetar qualquer diferença na atividade biolóqica. Por exemplo, se apenas 10% dos oligossacáridos Fc na preparação original da proteína contiverem ácido siálico, deverá ser difícil a deteção de diferenças na atividade biológica após tratamento com sialidase, quando 0-1% dos oligossacáridos contêm ácido siálico. A comparação da atividade biológica de uma proteína que contém Fc antes e depois do tratamento com sialidase será mais difícil se o tratamento com sialidase resultar numa diferente distribuição de oligossacáridos fucosilados e não fucosilados, dado que os níveis de fucose possuem um efeito profundo em certas atividades biológicas, tais como a afinidade para o FcyRIIIA humano e atividade ADCC. Por exemplo se uma redução no conteúdo de ácido siálico de 30% dos oligossacáridos para 0% resultar num aumento na proporção de oligossacáridos não fucosilados de 5% para 15%, então não será possível a atribuição de diferenças entre a atividade ADCC apenas ao decréscimo no conteúdo de ácido siálico. Tal efeito do tratamento da sialidase na proporção relativa de oligossacáridos fucosilados e não fucosilados é possível (e já foi observado) dada a diferença na sialilação de oligossacáridos fucosilados e não fucosilados previamente ao tratamento com a sialidase para remoção dos resíduos de ácido siálico. A sialilação de oligossacáridos presente na região Fc pode também ser conseguida através de métodos de glicosilação in vitro. Ao usar tais métodos, é possível conseguir obter glicoformas totalmente sialiladas de amostras de anticorpos. Com base na descoberta dos aplicantes, as glicoformas com máximo de sialilação de anticorpos ou outras criações que contem Fc terão um tempo de meia vida sérico reduzido, quando comparado com anticorpos não sialilados ou fracamente sialilados. Assim, o método da invenção providencia um meio ótimo para o controlo de tanto a homogeneidade das glicoformas que constituem o anticorpo ou outras proteínas criadas contendo uma região Fc da immunoglobulina e os aspetos funcionais in vivo dos ditos anticorpos ou criações. A função natural das glicosiltransferases é a síntese de oligossacáridos. Produzem produtos específicos com excelente geometria estereoquímica e regioquímica. A transferência de resíduos de glicosil resulta numa elonganção ou síntese de um oligo- ou polissacárido. Um número de tipos de glicotransferases foi descrito, incluindo sialiltransferases, fucosiltransferases, galactoiltransferases, N-acetilgalactosaminiltransferases, N-acetilglucosaminiltransferases.

As Glicosiltransferases que são úteis na presente divulgação incluem, por exemplo, α-sialiltransferases, α-glucosiltransferases, α-galactosiltransferases, α-fucosil-transferases, α-manosiltransferases, α-xilosiltransferases, α-Ν-acetilhexosaminiltransferases, β-sialiltransferases, β-glucosiltransferases, β-galactosiltransferases, β-fucosiltransferases, β-manosiltransferases, β- xilosiltransferases, e β-Ν-acetilhexosaminiltransferases, tais como as provenientes da Neisseria meningitidis, ou outras fontes bacterianas, e provenientes de rato, ratinho, coelho, porco, humano e inseto e fontes virais. Preferencialmente, a glicosiltransferase é uma variante truncada da enzima glicosiltransferase no qual o domínio ligante da membrana foi deletado.

Exemplos de galactosiltransferases incluem a(l,3) galactosiltransferase (E.C. No. 2.4.1.151, ver, e.g., Dabkowski et ai., Transplant Proc. 25:2921 (1993) e Yamamoto et al. Nature 345:229-233 (1990)) e a(l,4) galactosiltransferase (E.C. No. 2.4.1.38). Outras galactosiltransferases podem ser usadas, como a sialiltransferase.

Uma α (2,3)sialiltransferase, frequentemente referida como sialiltransferase, pode ser usada na produção de sialil lactose ou outras estruturas de ordem superior. Esta enzima transfere ácido siálico (NeuAc) a partir de ácido CMP-siálico para um resíduo Gal com a formação de uma ligação α entre os dois sacáridos. A ligação entre os sacáridos acontece entre a posição 2- do NeuAc e a posição 3 da Gal. Um exemplo de α(2,3)sialiltransferase referida como α (2,3)sialiltransferase (EC 2.4.99.6) transfere o ácido siálico para o Gal terminal não redutor de um Gaipi^3Glc dissacárido ou glicósido. Ver, Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem., 256:3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem., 257:13845 (1982) e Wen et al., J. Biol. Chem., 267:21011 (1992). Outro exemplo a-2,3- sialiltransferase (EC 2.4.99.4) transfere ácido siálico para o terminal não redutor Gal do dissacárido ou glicósido. Ver, Rearick et al., J. Biol. Chem., 254:4444 (1979) e Gillespie et al., J. Biol. Chem., 267:21004 (1992). Exemplos adicionais de enzimas incluem Gal-β-Ι,ί- GlcNAc a-2,6 sialiltransferase (Ver, Kurosawa et al. Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)).

Outras glucosiltransferases particularmente úteis na preparação dos oligossacáridos da divulgação são as manosiltransferases, que incluem a(l,2) manosiltransferase, a(l,3) manosiltransferase, β (1,4) manosiltransferase, Dol-PMan sintase, OChl, e Pmtl.

Ainda outras glucosiltransferases incluem N-acetilgalactosaminiltransferases incluindo a(l,3) N-acetilgalactosaminiltransferase, β(1,4) N-acetilgalactosaminiltransferase (Nagata et al. J. Biol. Chem. 267:12082-12089 (1992) e Smith et al. J. Biol Chem. 269:15162 (1994)) e N-acetilgalactosaminiltransferase polipeptidica (Homa et al. J. Biol Chem. 268:12609 (1993)). N-acetilglucosaminiltransferases adequadas incluem GnTI (2.4.1.101, Hull et al., BBRC 176:608 (1991)), GnTII, e GnTIII (Ihara et al. J. Biolchem. 113:692 (1993)), GnTV (Shoreiban et al. J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)).

Para as formas de realização nas quais o método seja praticado a uma escala comercial, pode ser vantajosa a imobilização da glicosil transferase num suporte. Esta imobilização facilita a remoção da enzima do lote do produto, e consequente novo uso da enzima. A imobilização de glicosil transferases pode ser conseguida, por exemplo, através da remoção do domínio ligante da membrana da transferase, e anexando no seu lugar um domínio ligante de celulose. Um técnico especialista na técnica irá compreender que podem ser usados outros métodos de imobilização, e estão descritos na literatura.

Devido aos substratos aceitadores poderem ser essencialmente qualquer monossacárido ou oliqossacárido com um resíduo sacárido terminal para o qual a glicosil transferase exiba especificidade, o substrato pode ser substituído na posição na sua terminação não redutora. Assim, o glicósido aceitador pode ser um monossacárido, oligossacárido, sacárido marcado com fluorescência, ou um derivado de sacárido, como um antibiótico aminoglicósido, um galngliósido, ou uma glicoproteína incluindo anticorpo e outras proteínas que contêm Fc. Num grupo de formas de realização preferenciais, o aceitador glicósido é um oligossacárido, preferencialmente Ga^ (1-3) GlcNAc, Ga^(l-4)GlcNAc, Gaip(l- 3)GalNAc, Gaip(1-4)GalNAc, Man a(l,3)Man, Man α(1,6)Man, ou GalNAcp(1-4)-manose. Numa forma de realização preferencial, o oligossacárido aceitador está ligado ao domínio CH2 de uma proteína que contém Fc. 0 uso de um substrato ativado de açúcar, i.e., um fosfato nucleósido de açúcar, pode ser contornado pelo uso de uma reação de regeneração que concorre com a reação da glicotransferase (também conhecido como sistema de reciclagem). Por exemplo, tal como explicado na, e.g., U.S. Pat. 6, 030,815, um sistema de reciclagem de uma CMP-ácido siálico usa uma sintase de CMP-ácido siálico para reabastecer CMP-ácido siálico (CMP-NeuAc) à medida que esta reage com o aceitador da sialiltransferase na presença de uma α(2,3)sialyltransferase para formar o sialilsacárido. O sistema de regeneração CMP-ácido siálico que é útil para a invenção compreende a citidina monofosfato (CMP), um nucleósido trisfosfato (por exemplo adenosina trifosfato (ATP), um dador de fosfato (por exemplo o fosfoenolpiruvirato ou o acetil fosfato), uma quinase (por exemplo quinase ou quinase acetato) capaz de transferir fosfatos do fosfato dador para os nucleósidos di-fosfatos e uma quinase nucleósida monofosfato (por exemplo, mioquinase) capaz de transferir o fosfato terminal de um nucleósido trifosfato para o CMP. A α(2,3)sialiltransferase e a CMP-ácido siálico sintase podem também ser vistas como parte o sistema de regeneração CMP-ácido siálico dado que a remoção dos ácidos siálicos ativados origina a manutenção de uma razão positiva no avanço da síntese. A síntese e uso de compostos ácido siálico num procedimento de sialilação com o uso de fagomídios compreendendo um gene para uma enzima sintase de CMP-ácido siálico está divulgada numa aplicação internacional WO 92/16640, publicada a 1 de Outubro de 1992.

Um método alternativo para a preparação de oligossacáridos é através do uso de uma glicosiltransferase e derivados de glicosil ativados como dadores de açúcares, eliminando a necessidade de nucleótidos de açúcar como dadores de açúcar, conforme explicado na U.S. Pat. 5,952,203. Os derivados de glicosil ativados agem como alternativas aos substratos naturalmente ocorrentes, que são nucleóditos de açúcares caros, usualmente nucleótidos difosfoaçúcares ou nucleótidos monofosfoaçúcares nos quais o nucleótido fosfato está α-ligado na posição 1- do açúcar

Os derivados de glicósidos ativados que são úteis incluem um grupo de saída ativado, como por exemplo, fluoro, cloro, bromo, éster tosilato, éster mesilato, éster triflato. Formas de realização preferenciais de derivados de glicósidos ativados incluem glicosil fluorados e glicosil mesilatos, com os glicosil fluorados a serem particularmente preferidos. Entre os glicosil fluorados, a-galactosil fluorado, a-manosil fluorado, a-glucosil fluorado, a- fucosil fluorado, a-xilosil fluorado, a-sialil fluorado, alfa-N-acetilglucosaminil fluorado, a-N-acetilgalactosaminil fluorado, β-galactosil fluorado, β-manosil fluorado, β-glucosil fluorado, β-fucosil fluorado, β-xilosil fluorado, beta-sialil fluorado, β-Ν-acetilglucosaminil fluorado e P-N- acetilgalactosaminil fluorado são os mais preferenciais.

Os glicosil fluorados podem também ser preparados a partir de açúcar livre acetilando o açúcar em primeiro lugar, e tratando com HF/piridina. Os glicosil fluorados acetilados podem ser desprotegidos por reação com uma base (catalítica) fraca em metanol (e.g. NaoMe/MeOH). Além disto, muitos glicosil fluorados estão disponíveis comercialmente.

Outros derivados ativados de glicosil podem ser preparados através do uso de métodos convencionais conhecidos pelos técnicos especialistas na técnica. Por exemplo, glicosil mesilatos podem ser preparados através do tratamento da forma hemiacetal completamente benzilada de um açúcar com cloreto de mesilo, seguido de hidrogenação catalítica para remoção dos grupos benzilo.

Um componente adicional da reação é uma quantidade catalítica de um fosfato de nucleósido ou um análogo do mesmo. Os monofosfatos de nucleósidos que são adequados para uso na presente invenção, incluem, por exemplo, adenosina monofosfato (AMP), citidina monofosfato (CMP), uridina monofosfato (UMP, guanosina monofosfato (GMP), inosina monofosfato (IMP) e timidina monofosfato (TMP). Os trifosfatos de nucleósidos adequados para uso em concordância com a presente invenção incluem a adenosina trifosfato (ATP), citidina trifisfato (CTP), uridina trifosfato (UTP), guanosina trifosfato (GTP), inosina trifosfato (ITP) e a timidina trifosfato. Um trifosfato de nucleósido preferencial é a UTP. Preferencialmente o fosfato de nucleósido é um difosfato de nucleósido, por exemplo, adenosina difosfato (ADP), citidina difosfato (CDP) , uridina difosfato (UDP), guanosida difosfato (GDP), inosina difosfato (IDP) e timidina difosfato (TDP). Um difosfato de nucleósido preferencial é o UDP. Tal como observado acima, a presente invenção pode também ser praticada com um análogo de fosfatos de nucleósido. Análogos adequados incluem, por exemplo, sulfatos de nucleósido e sulfonatos. Ainda outros análogos incluem fosfatos simples, por exemplo, pirofosfato.

Um procedimento para a modificação de proteínas recombinantes produzidas, em e.g., células de murino onde a forma hidroxilada do ácido siálico predomina (NGNA), será efetuar o tratamento da proteína com sialidase, para remover o tipo-NGNA do ácido siálico, seguido de galactosilação enzimática usando o reagente UDP-Gal e beta 1,4 Galtransferase para produzir glicoformas G2 altamente homogéneas. A preparação pode depois ser, opcionalmente, tratada com o reagente CMP-ΝΑΝΑ e alfa-2,3 sialiltransferase para originar glicoformas G2S2 altamente homogéneas.

Caracterização Estrutural das Variantes de Ácido Siálico

Para a caracterização estrutural de variantes de ácido siálico contendo oligossacáridos, as preparações de glicoproteinas incluindo preparações de anticorpos foram tratadas com a péptido-N-glicosidase F para libertar oligossacárido N-ligados. A enzima péptido-N-glicosidase F (PNGase F) cliva os oligossacáridos ligados à asparagina. Os oligossacáridos foram marcados para fluorescência com ácido antranilico (ácido 2-aminobenzóico) , purificados e analisados por HPLC tal como descrito (Ver Anumula, K. R. and Dhume ST Glycobiology. 1998 Jul; 8(7) :685-94) . Tal como demonstrado na figura 3, os oligossacáridos separados como GO, Gl, G2, G2S1 e G2S2 no cromatograma podem ser detetados e quantificados. As espécies não glicosiladas, naturalmente desprovidas de glicanos ou tendo sido quimicamente ou enzimaticamente desprovidas de glicanos são designadas por Gno.

Caracterização Biológica das Variantes do Ácido Siálico

As proteínas que contêm Fc podem ser comparadas quanto à funcionalidade por vários ensaios in vitro bem conhecidos. Em particular, a afinidade para membros da família FcyRI, FcyRII, e FcyRIII ou recetores Fcy é de interesse. Estas medições puderam ser feitas usando as formas recombinantes solúveis dos recetores ou formas associadas a células dos recetores. Em adição, a afinidade para o FcRn, recetor responsável pelo tempo de meia vida de circulação da IgGs pode ser medida, por exemplo por BIAcore usando FcRn recombinante solúvel. Os ensaios funcionais baseados em células, tais como os ensaios ADCC ou CDC, providenciam conhecimento sobre as prováveis consequências funcionais de estruturas variantes em particular. Numa forma de realização, o ensaio ADCC é configurado para que as células NK possam agir como as células efetoras primárias, refletindo assim os efeitos funcionais do recetor FcyRIIIA. Ensaios de fagocitose podem também ser efetuados para comparar as funções imunitárias do efetor de diferentes variantes, assim como ensaios que possam medir respostas celulares, tais como superóxidos ou libertação de mediadores de inflamação.

Ensaios de Afinidade e Avidez (avidity)

Os anticorpos, que são naturalmente multivalentes, podem ser testados para determinar vários parâmetros de ligação a proteínas alvo. Um formato conveniente para determinar um

Kd aparente é o ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ou RIA (radioimmunoassay). "ELISA" descreve um ensaio de ligação feito num suporte sólido usando métodos de deteção indiretos. Geralmente, num ELISA, os analitos solúveis são removidos da solução após se ligarem especificamente com reagentes da fase sólida. No método, os reagentes são preparados por adsorção de um antígeno ou um anticorpo em placas de titulação de plástico; noutros métodos, os reagentes da fase sólida são moléculas associadas a células. Em todos os protocolos, os reagentes de fase sólida são incubados com reagentes secundários ou terciários covalentemente ligados com a uma enzima. Os conjugados não ligados são removidos por lavagem, e um substrato cromogénico ou fluorogénico é adicionado. À medida que o substrato é hidrolisado pelo conjugado ligado da enzima, é gerado um produto colorido ou fluorescente. Finalmente, o produto é detetado visualmente com um leitor de placas de titulação. A intensidade do sinal gerado é proporcional à quantidade do analito inicial na mistura teste.

Numa variação do ensaio em fase sólida, um antígeno pode ser indiretamente imobilizado ou capturado, e.g., usando um anticorpo imobilizado de captura que reconheça um domínio irrelevante no antígeno ou usando um anticorpo ou outro ligando que se ligue a uma "marca" construída na proteína alvo, e.g., uma sequência de poli-histidina.

Um método alternativo para a medição da ligação de anticorpos contra antígenos de superfície é o de usar células completas que expressem (naturalmente ou através de modificação genética) um antígeno na superfície celular. As células são incubadas com uma solução teste que contém o anticorpo primário. 0 anticorpo não ligado é removido por lavagem e as células são incubadas com uma enzima conjugada para anticorpos específicos para o anticorpo primário. 0 conjugado da enzima não ligado é removido por lavagem, e é adicionada solução do substrato. 0 nível do anticorpo primário ligado é proporcional à quantidade de substrato hidrolisado. Esta relação será quantitativa se o número de células por unidade de volume for mantido constante. Alternativamente, a deteção pode ser feita usando um ligando radiomarcado através de ligação direta ou competição como descrito acima. Os protocolos para os ensaios ELISA podem ser encontrados em e.g. Ausebel, FM et al. Protocolos atuais em Molecular Biology. 2003 John Wiley & Sons, Inc.

As proporções de ligação, proporções de associação e proporções de dissociação, podem também ser medidas usando a tecnologia BIAcore que usa um ligador ou ligando de fase sólida ou um ligador de fase móvel/solução ou um ligando detetado por ressonância plasmónica de superfície. Métodos para Avaliação da Função Efetora O papel da glicosilação dos anticorpos na clearance, e consequentemente na farmacocinética da terapêutica das proteínas que contêm Fc parece mínima; a ligação ao recetor neonatal Fc (FcRn), considerado responsável pela remoção da IgG em circulação, parece impassível pela falta de um oligossacárido N-ligado na posição Fc de um anticorpo.

Os recetores IgG Fc (FcR) que ligam as respostas imunitárias mediadas por anticorpos da IgG com funções celulares efetoras incluem os recetores gama-Fc: FcRI (CD64), FcRII (CD32) (ambos FcRIIA e FCRIIB), e FcRIII (CD16).Todos os três são encontrados em monócitos. No entanto, a elaboração destes recetores em várias células alvo parece ocorrer diferencialmente e em resposta a outros fatores. Assim, a medição da afinidade de bioterapêuticos contendo Fc modificado por glicosilação para os recetores gama-Fc é uma medição apropriada para a previsão de funções efetoras reforçadas.

Os Abs humanos IgGl com níveis baixos de glucose nos seus glicanos Fc têm sido reportados como tendo maior afinidade para o CD16 FcR humano, e dramaticamente reforçadas in vitro em ensaios ADCC usando células efetoras humanas PBMC (Shinkawa et al. J Biol Chem 278(5):3466-3473, 2003; Shields et al. J Biol Chem 277(30):26733-26740, 2002; Umana et al., Nat Biotech 17:176-180,1999).

Um método para avaliar as funções efetoras usando o ensaio ADCC in vitro pode ser feito de um modo quantitativo. Assim, um ensaio in vitro pode ser desenhado para medir a habilidade do anticorpo ligado causar destruição da célula que exibe o seu ligando cognato através de uma seleção correta do alvo e linhas celulares efetoras e avaliando a "morte" da célula quer por inabilidade das células se continuarem a dividir, ou através da libertação de conteúdos internos, e.g. libertação de 5ICr. A célula alvo pode ser uma linha celular que normalmente expressa um ligando alvo para o anticorpo, fragmento do anticorpo ou proteína de fusão na sua superfície. Um exemplo de tal linha celular construída é a célula K2, uma linha celular de mieloma de ratinho Sp2/0 que expressa de um modo estável na sua superfície TNF recombinante humano que permanece com a formação de uma transmembrana devido à introdução de uma deleção dos aminoácidos 1-12 da citoquina maturada (Perez et al., Cell 63:251-258, 1990) . Esta linha celular é útil para a avaliação de alterações na atividade ADCC dos anticorpos anti-TNF, fragmentos de anticorpos, ou proteínas de fusão anti-TNFalfa direcionadas construídas com domínios Fc ou atividade de domínios Fc.

As células efetoras para o ensaio de atividade ADCC in vitro podem ser PBMC (células monocíticas de sangue periférico) de fonte humana ou de outros mamíferos. As células efetoras PMBC pode ser isoladas logo após a recolha do sangue dos dadores por métodos aprovados. Outras células monocíticas ou macrofágicas que podem ser usadas são as derivadas de fluidos de efusão como as de exsudatos peritoneais.

Os modelos in vivo para a medição de funções celulares imunitárias estão também disponíveis. Por exemplo, anticorpos anti-CD3 podem ser usados para medir a ativação de células T em ratos, dado que a ativação de células T está dependente da maneira pela qual o domínio Fc do anticorpo interage com recetores específicos Fey. In vitro, foi comparada a atividade anti-tumoral de uma versão com alta fucose ou baixa fucose de um Ab IgGl quimérico humano contra um recetor 4 de quimiocina CC, e não houve diferença observável na sua atividade ADCC (usando células efetoras de rato) , o Ab de baixa fucose não demonstrou uma maior eficácia in vivo. Não foram providenciadas células efetoras humanas e os ratos retiveram as células NK endógenas (Niwa et al. Cancer Res 64:2127-2133, 2004) . Dado que o recetor CD16 em células humanas NK demonstrou um acréscimo de sensibilidade para os níveis de fucose dos Abs IgGl, os dado sugerem que o mecanismo que foi estudado nas células efetoras humanas é diferente do que opera nos ratinhos. Uma possibilidade é o recentemente descoberto recetor CD16-2 de ratinho (Mechetina et al. Immunogen 54:463-468, 2002). O domínio extracellular CD16-2 do ratinho tem uma identidade significativamente maior com o CD16A humano (65%) do que com o recetor CD16 de ratinho mais conhecido, sugerindo que pode ser mais sensível para os níveis de fucose da IgGs ligante do que o CD16 de ratinho. A expressão em células do tipo macrófago J774 de ratinho reportada é consistente com a possibilidade de que os macrófagos de ratinho que expressam a CD16-2 poderem ser responsáveis pela maior atividade anti-tumoral dos Ab de baixa fucose, descrito por Niwa et al. (2004). Assim o estudo da ligação do recetor FC por proteínas humanas contendo Fc do tipo IgGl a células efetoras de murino não é preditivo.

Processos de Produção de Proteínas

Existem diferentes processos envolvidos na produção de proteínas que contêm Fc que podem causar impacto na estrutura do oligossacárido Fc, incluindo o ácido siálico. Numa forma de realização, as células hospedeiras que secretam a proteína contendo Fc são cultivadas na presença de soro, e.g., soro fetal bovino (FBS), que não foi previamente sujeito a um tratamento de elevada temperatura (por exemplo, 56°C por 30 minutos) . Tal pode resultar em que a proteína contendo Fc tenha pouca ou nenhuma quantidade de ácido siálico, devido à presença natural no soro de enzimas sialidase ativas que podem remover o ácido siálico das proteínas contendo Fc secretadas por essas células. Noutra forma de realização, as células que secretam a proteína contendo Fc são cultivadas quer na presença de soro que foi sujeito a um tratamento de temperatura elevada, inativando assim as enzimas sialidase, ou na ausência do soro ou outros componentes de meio que possam conter enzimas sialidase, tal que a proteína contendo Fc tenha níveis mais elevados de ácido siálico, para aplicações (e.g., indicações terapêuticas) quando tal for desejável.

Noutra forma de realização, as condições usadas para purificar e processar as proteínas contendo Fc estão estabelecidas de modo a que favoreçam um conteúdo ótimo em ácido siálico. Por exemplo, dado que o ácido siálico é lábil com outros ácidos, a exposição a um baixo ambiente de pH, por exemplo após a eluição de uma proteína A numa coluna de cromatografia, ou durante processos de inativação virai, pode simultaneamente levar a uma redução no conteúdo em ácido siálico.

Modificação Genética da Célula Hospedeira

Tal como aqui descrito, a célula hospedeira escolhida para a expressão da proteína recombinante contendo Fc ou anticorpo monoclonal é uma importante contribuidora para a composição final, incluindo, sem limitação, a variação na composição dos grupos funcionais oligossacárido presentes na proteína no domínio CH2 da imunoglobulina. Assim, um aspeto da divulgação envolve a seleção de células hospedeiras apropriadas para o uso e/ou desenvolvimento de uma célula produzida que expresse a proteína terapêutica desej ada.

Numa forma de realização, a célula hospedeira é uma célula que está naturalmente deficiente ou desprovida de sialiltransferases. Noutra forma de realização, a célula hospedeira é geneticamente modificada ou tratada de modo a estar desprovida de sialiltransferases, Numa forma de realização adicional, a célula hospedeira é uma linha celular hospedeira derivada selecionada para expressar níveis reduzidos ou indetetáveis de sialiltransferases. Ainda em outra forma de realização, a célula hospedeira está naturalmente desprovida de, ou geneticamente modificada ou tratada de modo a estar desprovida de, CMP- ácido siálico sintase, a enzima que catalisa a formação do CMP-ácido siálico, que é a fonte de ácido siálico usado pela sialiltransferase para transferir ácido siálico para o anticorpo. Numa forma de realização relacionada, a célula hospedeira pode estar naturalmente desprovida, ou qeneticamente modificada ou tratada de modo a estar desprovida de ácido pirúvico sintase, a enzima que forma o ácido siálico a partir do ácido pirúvico.

Numa forma de realização adicional, a célula hospedeira pode estar naturalmente desprovida de, ou qeneticamente modificada ou tratada de modo a estar desprovida de qalactosiltransferases, de modo a que os anticorpos expressos nas ditas células não possuam qalactose. Sem qalactose, o ácido siálico não estará liqado. Numa forma de realização separada, a célula hospedeira pode sobreexpressar naturalmente, ou ser qeneticamente modificada para sobreexpressar uma enzima sialidase que remova o ácido siálico dos anticorpos durante a produção. Tal enzima sialidase pode atuar de um modo intracelular nos anticorpos antes que os anticorpos sejam secretados ou possam ser secretados no meio de cultura, e atuem nos anticorpos que já tiverem sido secretados no meio. Estão descritos métodos de seleção de linhas celulares com glicosilases modificadas e que expressam glicoproteínas com composições de carbohidratos modificadas (Ripka and Stanley, 1986. Somatic Cell Mol Gen 12:51-62; US2004/0132140). Métodos para a modificação de células hospedeiras para produzirem anticorpos com padrões de glicosilação alterados, resultado num maior ADCC já foram demonstrados em e.g. U.S. Pat. 6,602,864, e, que as células hospedeiras albergam um ácido nucleico que codifica pelo menos uma glicosil transferase modificadora de glicoproteínas, especificamente β (1,4)-N-acetilglucosamniltranferase III (GnTIII).

Outras aproximações para modificações genéticas das propriedades de glicosilação de uma célula hospedeira através da manipulação da glicosiltransferase da célula hospedeira envolve a eliminação ou supressão da atividade, tal como demonstrado na EP1,176,195, especificamente, alfal,6 fucosiltransferase (FUT8 produto de gene). Será óbvio para um especialista na técnica, a prática de métodos de modificação da célula hospedeira de outros modos que não os exemplos específicos citados acima. Ainda mais, a célula hospedeira modificada pode ser de origem mamífera ou pode ser selecionada de mieloma, linfoma, levedura, células de insetos ou plantas, ou qualquer célula derivada, imortalizada ou transformada dos mesmos.

Noutra forma de realização, o método de supressão ou eliminação da atividade da enzima necessária para a ligação do ácido siálico pode ser selecionado do grupo constituído por silenciamento do gene, tal como o uso do siRNA, um knock-out genético, ou adição de um inibidor enzimático, tal como por co-expressão de um Ab intracelular ou um péptido específico para a enzima que se liga e bloqueia a sua atividade enzimática, e quaisquer outras técnicas conhecidas de modificação genética. Noutra forma de realização, um método para aumentar a expressão ou atividade de uma enzima que bloqueie a ligação do ácido siálico, ou a enzima sialidase que remove ácidos siálicos que já estão ligados, pode ser selecionada do grupo constituído por transfeções com genes enzimáticos recombinantes, transfeções ou fatores de transcrição que potenciem a síntese de enzimas de RNA, ou modificações genéticas que potenciem a estabilidade das enzimas de RNA, todos levando a uma potenciação da atividade de enzimas como as sialidases, o que resulta em níveis mais baixos de ácido siálico no produto purificado. Noutra forma de realização, podem ser adicionados inibidores específicos de enzimas ao meio de cultura celular.

Anticorpos

Um anticorpo descrito nesta aplicação pode incluir ou derivar de qualquer mamífero, tal como mas não limita a, humano, ratinho, coelho, rato, roedor, primata, ou qualquer combinação dos mesmos e inclui anticorpos anti-integrina, imunoglobulinas, produtos de clivagem e outras porções especificadas e variantes do mesmo isolados de humano, primata, roedor, mamífero, quimérico, humanizado e/ou CDR-enxertados. A divulgação também se refere à codificação de anticorpos ou ácidos nucleicos complementares, vetores, células hospedeiras, composições, formulações, aparelhos, animais transgénicos, plantas transgénicas e método para o fabrico e uso dos mesmos, como aqui descrito e juntamente com o combinado do que é conhecimento da técnica. A presente divulgação providencia células, linhas celulares e culturas celulares que expressem uma imunoglobulina ou fragmento da mesma capaz de glicosilação num domínio CH2 que ligue um antígeno, uma citoquina, uma integrina, um anticorpo, um fator de crescimento, um antígeno de superfície que seja um marcador da linhagem celular e diferenciação, uma hormona, um recetor ou proteína de fusão do mesmo, e qualquer outro análogo estrutural ou funcional de qualquer um dos acima mencionados. Numa forma de realização preferencial, a imunoglogulina, fragmento ou derivado da mesma liga um antígeno na superfície da célula alvo. Numa forma de realização particularmente preferencial a célula alvo é uma célula tumoral, uma célula da vascularização do tumor, ou uma célula imune. Numa forma de realização específica, a imunoglobulina, fragmento ou derivado do mesmo liga-se a um TNG, uma integrina, um antigeno de célula B, ou um fator tecidular.

Ainda em outra forma de realização, as células, linhas celulares e culturas celulares da presente divulgação podem expressar de um modo detetável uma proteína de fusão compreendendo um fator de crescimento ou hormona. Exemplos de fatores de crescimento contemplados pela presente divulgação incluem, não estando limitados a, fator de crescimento humano, fator de crescimento plaquetário, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento fibroblástico, fator de crescimento neural, gonadotropina coriónica humana, eritropoietina, trombopoietina, proteína morfogénica óssea, fator de crescimento transformante, fator de crescimento do tipo insulina, péptido do tipo glucano, e qualquer análoga estrutural ou funcional do mesmo.

Os anticorpos isolados da invenção incluem os que possuem isótipos de anticorpos com atividade ADCC, especialmente a IgGl humana, (e.g., IqGlkappa e IgGllameda), e, menos preferencialmente são a IgG2 e IgG3, ou isótipos híbridos que contenham resíduos alterados nos resíduos específicos dos domínios Fc e são as suas homólogas de outra espécie.Os anticorpos podem ser anticorpos completos (e.g., IgGl) ou podem incluir apenas uma porção que se ligue ao antigeno e uma porção Fc ou domínio capaz de induzir funções efetoras incluindo ADCC, ativação de complemento, e ligação Clq.

Para além disso, o fragmento de imunoglobulina produzido pelas células, linhas celulares e culturas celulares da presente divulgação pode incluir, não estando limitada a Fc ou outras estruturas que contenham um domínio CH2 e quaisquer análogos estruturais ou funcionais dos mesmos.

Numa forma de realização, o fragmento de imunoglobulina é um polipéptido de fusão com um domínio de recetor dimérico. Numa forma de realização específica, o polipéptido de fusão com um domínio de recetor dimérico é o etanercept. 0 Etanercept é uma molécula solúvel do recetor TNFa que é administrada subcutaneamente e que se liga ao TNFa no soro do paciente, tornando-o biologicamente inativo. 0 Etanercept é uma proteína de fusão dimérica constituída por uma porção ligante-ligação extracelular do recetor humano 75 kilodaton (p75) fator de necrose tumoral (TNFR) ligado à porção Fc da IgGl humana. 0 componente Fc do etanercpt contém o domínio CH2, o domínio CH3 e uma região dobra, mas não o domínio CHI da IgGl.

Outros produtos passíveis de produção usando as linhas celulares da divulgação incluem proteínas terapêuticas ou profiláticas fabricadas atualmente por outros tipos de linhas celulares animais e com um domínio CH2 com capacidade de ser glicosilado. Particularmente, são as proteínas que contêm um domínio CH2, terapêuticas, glicosiladas, que se ligam a antígenos alvo na superfície celular, ao tipo de célula que é desejável de se incapacitar ou eliminar do corpo. Um número de tais anticorpos terapêuticos são modificados para obter a IgGl humana, especialmente a IgGl, cadeia pesada que compreende os domínios humanos CHI, CH2, e CH3.Tais proteínas terapêuticas incluem, mas não estão limitadas às descritas em baixo.

Infliximab agora vendido como REMICADE®. Infliximab é um anticorpo monoclonal quimérico IgGlk com um peso molecular aproximado de 149,100 daltons. Compreende uma constante humana e regiões variáveis de murino. O Infliximab liga-se especificamente ao fator alfa da necrose tumoral humana (TNF(alfa)) com uma constante de associação de IO10 M_1. O

Infliximab neutraliza a atividade biológica do TNF (alfa) através da ligação de alta afinidade com as formas transmembranares e solúveis de TNF(alfa) e inibe a ligação do TNF(alfa) com os seu recetores. As células que expressem o TNF(alfa) transmembranar ligado pelo Infliximab pode ser lisadas in vitro ou in vivo. 0 Infliximab está indicado para o tratamento de artrite reumatoide, doença de Crohn, e espondilite anquilosante. 0 Infliximab é administrado como doses de 3 a 5 mg/kg, como uma infusão intravenosa, seguida de doses similares adicionais a 2, 6, e/ou 8 semanas após e em intervalos de cada 8 semanas dependendo da doença a ser tratada. 0 Daclizumab (vendido como ZENAPAX®) é um anticorpo monoclonal humanizado IgGl imunossupressor, produzido por tecnologia de DNA recombinante que liga especificamente à unidade alfa (p55 alfa, CD25, ou subunidade Tac) do recetor humano de alta afinidade da interleucina-2 (IL-2) que está expresso na superfície de linfócitos ativados. 0 Daclizumab é um anticorpo de região determinante de complementariedade (CDR) quimérico humano-ratinho enxertado. As sequências humanas foram derivadas dos domínios constantes da IgGl humana e das sequências de estrutura variável do anticorpo Eu mieloma. As sequências de murinos foram derivadas de CDRs de um anticorpo anti-Tac de murino. 0 Dacluzumabm está indicado para a profilaxia de rejeição aguda de órgãos em pacientes que receberam transplantes renais, e é geralmente usado como parte de um regime imunossupressor que inclui ciclosporina e corticoesteróides.

Basilixmab (vendido como SIMULECT®) é um anticorpo monoclonal quimérico (murino/humano) produzido por tecnologia de DNA recombinante, que funciona como um agente imunossupressor, ligando e bloqueando o recetor da interleucina-2 na cadeia-(alfa) (IL-2R(alpha) , também conhecido como antígeno CD25) na superfície de linfócitos-T ativados. Baseado na sequencia de aminoácidos, o peso molecular calculado para a proteína é de 144 kilodaltons. É uma glicoproteína obtida a partir de fermentação de uma linha celular estabelecida de mieloma de ratinho modificada geneticamente para expressar plasmídeos que contêm genes de região constante de cadeia pesada e leve de humanos (IgGl) e genes de região variável de cadeia pesada e leve de ratinhos que codificam o anticorpo RFT5 que se liga seletivamente ao IL-2R(alfa). 0 Basilixma está indicado para a profilaxia de rejeição aguda de órgãos em pacientes que receberam transplantes renais, quando usados como parte de um regime imunossupressor que inclui ciclosporina e corticosteróides. 0 Adalimumab (vendido como HUMIRA®) é um anticorpo monoclonal recombinante humano IgGl específico para o fator de necrose tumoral humano (TNF). 0 Adalimumab foi criado usando tecnologia de phage display resultando num anticorpo humano com regiões variáveis de cadeias pesadas e leves e regiões constantes kappa IgGl humana. 0 HUMIRA ® é indicado para a redução de sinais e sintomas e inibição da progressão de danos estruturais em pacientes adultos com artrite reumatóide ativa moderada a severa que tenham tido uma resposta inadequada a um ou mais DMARDs. 0 HUMIRA® pode ser usado como monoterapia ou em combinação com MTX ou outros DMARDs. 0 Rituximab (vendido como RTTUXAN®) é um anticorpo monoclonal quimérico murino/humano modificado geneticamente e direcionado contra o antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos. 0 anticorpo é uma imunoglobulina kappa que contém sequências de regiões variáveis de cadeias leves e pesadas de murino, e sequências de regiões constantes humanas. 0 Rituximab tem uma afinidade de ligação para com o antigeno CD20 de aproximadamente 8,0 nM. O Rituximab está indicado para pacientes com linfoma de non-Hodgkin's das células B, com recaídas ou refratário, de baixo-grau ou folicular, com CD20-positivo. O Rituxan® é administrado por infusão UV de 375 mg/m2 uma vez por semana e por 4 a 8 doses. O Trastuzumab (vendido como HERCEPTIN®) é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de DNA que se liga seletivamente e com grande afinidade num ensaio baseado em células (Kd=5nM) ao domínio extracelular do recetor 2 da proteína de fator de crescimento epidérmico humano, HER2. O anticorpo é um kappa IgGl que contém regiões estruturais humanas com regiões determinadas por complementaridade de um anticorpo de murino (4D5) que se liga a HER2. O Herceptin está indicado como um agente de monoterapia para o tratamento de pacientes com cancro do peito metastizado cujos tumores sobreexpressam a proteína HER2 e que tenham recebido um ou mais regimes de quimioterapia para a sua doença metastática. O HERCEPTIN® em combinação com o paclitaxel está indicado para o tratamento de pacientes com cancro do peito metastizado cujos tumores sobreexpressam a proteína HER2 e que tenham recebido um ou mais regimes de quimioterapia para a sua doença metastática. A dose recomendada é uma dose inicial de carga 4mg/kg de trastuzumab administrado como uma infusão ao longo de 90 minutos e uma dose de manutenção semanal de 2 mg/kg de trastuzumab que pode ser administrada como uma infusão de duração de 30 min se a dose de carga inicial for bem tolerada. O Alemtuzumab (vendido como CAMPATH®) é um anticorpo monoclonal humano (Campath-lH) derivado de ADN que está direcionado contra a glicoproteína de superfície celular de 21-28kD, CD52. O Alemtuzumab liga-se com o CD52, um antígeno não modulador que está presente na superfície de essencialmente todos os linfócitos B e T, a maioria dos monócitos, macrófagos e células NK, uma subpopulação de granulócitos e tecidos do sistema reprodutor masculino. 0 anticorpo Campath-lH é um IgGl kappa com regiões constantes e estrutura variável humana, e anticorpo monoclonal (Campath-1G) com regiões determinadas por complementaridade de murino (rato). 0 Campath está indicado para o tratamento de leucemia linfocítica crónica das células B (B-CLL) em pacientes que tenham sido tratados com agentes alquilantes e que tenham falhado a terapia com fludarabina. A determinação da eficácia do Campath é baseada na taxa de resposta global. 0 Campath é administrado inicialmente a 3 mg por infusão IV diária, por 2 horas; uma vez tolerada, a dose diária deverá aumentar até aos 10 mg e ser continuada enquanto tolerada. Uma vez que esta dosagem seja tolerada, a dose de manutenção de Campath 30 mg pode ser iniciada e administrada três vezes por semana por até 12 semanas. Na maior parte dos pacientes, o aumento até 30 mg pode ser conseguido em 3-7 dias. O Omalizumab (vendido como XOLAIR®) é um anticorpo monoclonal recombinante humanizado IgGl {kappa) que se liga seletivamente à imunoglobulina humana E (IgE). O Omalizumab inibe a ligação da IgE ao recetor de alta afinidade de IgE (Fc(epsilon) RI) na superfície dos mastócitos e basófilos. A redução da IgE ligado à superfície em células que contenham Fc(epsilon)RI limita a libertação de mediadores de resposta alérgica. O tratamento com omalizumab também reduz o número de recetores Fc(epsilon)RI em basófilos em pacientes atópicos. O Omalizumab está indicado para adultos e adolescentes (12 anos de idade e acima) com asma moderada a severa e persistente que tenham um teste de pele positivo ou de reatividade in vitro a um aeroalergéneo perenial e cujos sintomas sejam inadequadamente controlados com corticosteróides inaláveis. 0 Omalizumab é administrado SC a cada 2 a 4 semanas com uma dose de 150 a 375 mg. O Efalizumab (RAPTIVA®) é um anticorpo monoclonal IgGl kappa isotípico humanizado recombinante e imunossupressor que se liga ao CDlla humano. O Efalizumab liga-se ao CDlla, a subunidade (alfa) da função leucocitária do antígeno-1 (LFA-1), que é expressa em todos os leucócitos e decresce a expressão na superfície celular de CDlla. O Efalizumab inibe a ligação do LFA-1 com a molécula-1 de adesão intracelular (ICAM-1), inibindo assim a adesão de leucócitos a outros tipos celulares. A interação entre LFA-1 e ICAM-1 contribui para a iniciação e manutenção de múltiplos processos, incluindo a ativação de linfócitos T, adesão de linfócitos T a células endoteliais, e migração de linfócitos T para locais de inflamação incluindo pele com psoriase. A ativação de linfócitos Tea sua migração para a pele desempenham um papel na fisiopatologia da psoriase crónica em placas. Na pele com psoriase, a expressão da superfície celular de ICAM-1 está sobreregulada no endotélio e queratinócitos. O CDlla é também expressão na superfície de linfócitos B, monócitos, neutrófilos, células NK, e outros leucócitos. Assim, existe potencial para o efalizumab afetar a ativação, adesão, migração, e número de células que não os linfócitos T. A dose recomendada de RAPTIVA® é uma única dose de condicionamento SC de 0,7mg/kg seguida por doses SC semanais de 1 mg/kg (dose máxima individual não deve exceder o total de 200 mg).

Noutra forma de realização, a linha celular da divulgação é transfetada de um modo estável ou de outro modo modificada para expressar um derivado de polipéptido não-imunoglobulina mas que cai na definição de uma proteína que contém Fc.

Os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos e proteínas desta invenção podem ser derivados de várias maneiras conhecidas no estado da técnica. Num aspeto, os anticorpos são convenientemente obtidos de hibridomas preparados através da imunização de um ratinho com os péptidos da invenção. Os anticorpos podem assim ser obtidos usado qualquer das técnicas de hibridoma bem conhecidas no estado da técnica, ver, e.g., Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds. , Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Noutro método conveniente para derivar a porção ligante alvo do anticorpo, tipicamente os domínios variáveis pesados e/ou variáveis leves de um anticorpo, estas porções são selecionadas de uma biblioteca de tais domínios ligantes criados em, e.g., uma biblioteca de phage. A biblioteca de phage pode ser criada inserindo uma biblioteca de oligonucleótidos aleatórios ou uma biblioteca de polinucleótidos contendo sequências de interesse, tais como as provenientes das células B de um animal ou humano imunizado (Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317). As bibliotecas phage de anticorpos contêm pares de regiões variáveis pesadas (H) e leves (L) em uma phage, permitindo a expressão de fragmentos de uma cadeia Fv ou fragmentos Fab (Hoogenboom, et al. 2000, Immunol.Today 21(8) 371-8). A diversidade de uma biblioteca fagemídio pode ser manipulada para aumentar e/ou alterar as imunoespecificidades de anticorpos monoclonais da biblioteca para produzir e subsequentemente identificar anticorpos monoclonais humanos adicionais e desejáveis. Por exemplo, a cadeia pesada (H) e a cadeia leve (L) da molécula de imunoglobulina codifica gentes que podem ser misturados (baralhados) aleatoriamente para criar novos pares HL numa molécula construída de imunoglobulina. Adicionalmente, qualquer ou ambas cadeias H e L que codifiquem genes podem ser mutados numa região determinada por complementaridade (CDR) da região variável do polipéptido imunoglobulina, e subsequentemente ser conduzido um screening por capacidades de afinidade e neutralização desejadas. As bibliotecas de anticorpos podem ser criadas sinteticamente selecionando uma ou mais sequências de estruturas humanas e introduzindo coleções de cassetes CDR derivadas de reportórios de anticorpos humanos e através de variações projetadas (Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602). As posições de diversidade não estão limitadas a CDRs mas podem também incluir os segmentos estruturais de regiões variáveis e podem incluir outros que não anticorpos de regiões variáveis, tais como péptidos.

Outras bibliotecas de componentes ligantes alvo que podem incluir outros que não anticorpos de regiões variáveis são os displays de ribossomas, displays de leveduras, e displays de bactérias. O display de ribossomas é um método de translação de mRNAs nas suas proteínas cognatas enquanto mantendo a proteína ligada ao RNA. A sequência de codificação de ácidos nucleicos é recuperada por RT-PCR (Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 9022) . O display de fermento é baseado na construção de proteínas de fusão do recetor de adesão de levedura alfa-aglutinina associada a membrana, agal e aga2, parte do sistema de ligação (Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7). O display de bactérias é baseado na fusão do alvo para proteínas bacterianas exportadas que se associam com a membrana celular ou parede celular (Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503).

Em comparação com a tecnologia de hibridoma, o phage e outros métodos de display de anticorpos permitem a oportunidade de manipular a seleção contra o alvo do antígeno in vitro e sem a limitação da possibilidade de efeitos do hospedeiro no antígeno ou vice-versa. Células hospedeiras

As células hospedeiras aqui descritas compreendem células hospedeiras capazes de produzir anticorpos específicos com conteúdo em ácido siálico definido no conteúdo de oligossacáridos dos ditos anticorpos.

Ao contrário da maior parte dos genes que são transcritos a partir de sequências contínuas de ADN genómico, os genes de anticorpos são construídos a partir de segmentos de genes que podem estar amplamente separados na linhagem germinativa. Em particular, os genes de cadeia pesada são formados por recombinação de três segmentos genómicos que codificam a variável (V) , diversidade (D) e as regiões de constante (C)/junção (J) do anticorpo. Os genes de cadeias leves funcionais são formados pela junção de dois segmentos de genes: um codifica a região V e o outro codifica a região J/C. Os loci da cadeia pesada e da cadeia kappa leve contêm muitos genes de segmento V (as estimativas variam entre 100s e 1000s) estimadas por se estenderem muito acima de 1000 kb. O locus lambda é, por contraste, bastante mais pequeno e foi mostrado que se estende por aproximadamente 300 kb no cromossoma 16 nos ratinhos. Consiste em dois segmentos variáveis de genes e quatro segmentos de junção/constante (J/C) de segmentos de genes. A formação de um gene funcional requer a recombinação entre um elemento V e um J/C.

Na célula B na qual o anticorpo é naturalmente produzido, o controlo da transcrição de ambos os genes rearranjados de cadeia pesada e cadeia kappa leve dependem ambos da atividade de um promotor tecidular especifico a montante da região V e um potenciador tecidular especifico localizado no intrão J-C. Estes elementos agem sinergicamente. Ainda, um segundo potenciador especifico de células B foi identificado no locus da cadeia leve kappa. Este potenciador está localizado 9kb a jusante da Ckappa. Assim, o método de hibridoma de imortalizar genes de expressão de anticorpos depende das sequências promotoras e potenciadoras endógenas da linhagem da célula B parental. Alternativamente, os ácidos nucleicos da presente divulgação podem ser expressos numa célula hospedeira através da ativação (por manipulação) numa célula hospedeira que contenha DNA endógeno que codifica um anticorpo da presente invenção. Tais métodos são bem conhecidos no estado da técnica, e.g., como descritos nas Patentes US N° 5,580,734, 5,641,670, 5,733,746, e 5,733,761. A clonagem do ADN genómico do anticorpo num vetor artificial é outro método de criação de células hospedeiras capazes de expressar anticorpos. No entanto, a expressão de anticorpos monoclonais com base num promotor forte aumenta as hipóteses de identificação de linhas celulares de alta produção e a obtenção de rendimentos mais elevados de anticorpos monoclonais. Os anticorpos da invenção podem ser produzidos numa célula hospedeira de transfetora usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfeção de genes como é bem conhecido no estado da técnica (e. g., Morrison, S. (1985) Science 229:1202). São bem conhecidos sistemas para clonagem e expressão de um polipéptido numa variedade de diferentes células hospedeiras. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, células de plantas, leveduras e sistemas de baculovírus e plantas e animais transgénicos

Linhagens celulares de mamíferos disponíveis do estado da técnica para expressão de polipéptidos heterólogos de proteínas glicosiladas intactas incluem células do ovário de hamster chinês (CHO) , células HeLa, células do rim de hamster bebé (BHK), células de melanoma de murinos NSO e linhagens celulares derivadas, e.g. células de mieloma de ratinho SP2/0, YB2/0 (ATC CRL-1662), células de rim embriónico humano (HEK), células de retina embriónica humanas, células PerC.6, células hep G2, BSC-1 (e.g., ATCC CRL-26) e muitas outras formas disponíveis, por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org). Uma bactéria hospedeira comum e preferencial é a E. coli. Células de mamíferos tais como as células CHO, células de mieloma, células HEK293, células BHK (BHK21, ATCC CRL-10), células de ratinho Ltk-, e células NIH3T3 são frequentemente usadas para uma expressão estável de genes heterólogos. As linhagens celulares como Cos (COS-1 ATCC CRL 1650; COS-7, ATCC CRL-1651) e HEK293 são usadas rotineiramente para expressão transiente de proteínas recombinantes. Células hospedeiras de mamíferos preferenciais para expressar os anticorpos recombinantes da divulgação incluem células do mieloma como Sp2/0, YB2/0 (ATC CRL-1662), NSO, e P3X63.Ag8.653 (e.g. SP2/0-Agl4) devido ao seu elevado grau de expressão. Em particular, para o uso com células do mieloma NSO, outro sistema preferencial de expressão é o sistema de expressão de genes GS divulgado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338,841. Quando os vetores de expressão recombinante que codificam os genes do anticorpo são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos através da cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras, ou, mais preferencialmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando meios padrão de purificação de proteínas.

As células CHO-K1 e DHFR- CHO, DG44 e DUK-Bll (G. Urlaub, L.A. Chasin, 1980. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77, 4216-4220) são usadas para produção de proteínas de alto nível dado que a amplificação de genes de interesse é promovida pela incorporação de um marcador de amplificação selecionável, DHFR usando e.g. o fármaco metotrexato (MTX) (R.J. Kaufman, 1990. Methods Enzymol. 185: 537-566). As células DHFR-CHO podem produzir anticorpos ant-MCP-1 a uma velocidade de 80-110 mg 106 células-1 dia-1 ou mais do que 200 mg 106 células-1 dia-1. Uma variedade de promotores foi usada para obter a expressão de cadeias H- e L- nestas células CHO, por exemplo, o promotor de b-actina, o promotor humano CMV MIE, o promotor major late de Ad vírus (MLP), o promotor RSV, e o vírus da leucemia murina LTR. Um número de vetores para expressão de mAb estão descritos na literatura no qual duas cadeias de Ig são transportadas por dois plasmídeos diferentes com um marcador selecionável/amplificador independente. Os vetores que contêm uma cadeia de anticorpos, e.g., a cadeia H-, ligada a um arcador DHFR, e uma cassete de expressão de cadeia L-com o marcador Neor ou vice-versa pode ser usado para obter até 180 mg de mAb L_1 7 dia-1 em frascos spinner. Os métodos usados para a seleção inicial e subsequente amplificação podem ser variados e são bem conhecidos pelos especialistas no estado da técnica. De um modo geral, a expressão de alto nivel de mAb pode ser obtida seguinte os seguintes passos: seleção inicial e subsequente amplificação dos clones candidatos, co-seleção (e.g., em casos em que tanto a os vetores da cadeia H- como da cadeia L- transportam a unidade de expressão DHFR), e amplificação, coamplificação usando diferentes marcadores amplificáveis, e seleção e amplificação para cultura em massa, seguido de clonagem por diluição limitante para identificar os clones individuais de alta expressão. Dado que os locais de integração podem influenciar a eficácia da expressão da cadeia H- e cadeia L- e a expressão integral de mAb, foram criados vetores singulares nos quais as unidades de expressão das duas cadeias Ig foram colocadas em tandem. Estes vetores também transportam um marcador selecionável dominante como o Neor e a cassete de expressão DHFR. Para um review, ver Ganguly, S. and A. Shatzman. Expression Systems, mammalian cells IN: Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation. 1999 by John Wiley & Sons, Inc . .

Cockett et al. (1990. Bio/Technology 8, 662-667) desenvolveram o Sistema GS para expressão de alto nivel de genes heterólogos em células CHO. A transfeção de um vetor de expressão contendo um cDNA (sob o controlo de transcrição do promotor hCMV) e urn mini gene GS (sob o controlo do promotor late SV40) em células CHO-Kl (seguido de uma seleção com 20mM para 500 mM MSX) podem ser usados para originar clones que expressam os anticorpos da divulgação com rendimentos comparáveis com os sistemas DHFR- CHO. O sistema GS é discutido na totalidade ou em parte em ligação com as Patentes Europeias N° 0 216 846, 0 256 055, e 0 323 997 e com a Aplicação de Patente Europeia N°89303964.4.

Enquanto tendo descrito a invenção em termos gerais, as formas de realização da invenção serão adicionalmente divulgadas nos exemplos seguintes.

EXEMPLO 1: SEPARAÇÃO BASEADA EM LECTINA DE ESPÉCIES DE ANTICORPOS COM DIFERENTES NÍVEIS DE ÁCIDO SIÁLICO

Esferas de agarose conjugadas com MAA (Aglutinina Maackia amurensis) ou WGA (Aglutinina de Germe de Trigo) foram compradas dos Vector Labs ou EY Labs. O anticorpo teste, Abl é um anticorpo monoclonal humano que liga o TNF humano. O Abl (—1 — 10 mg) em 20 mM de tampão Tris-HCl (pH 7.0) contendo 20 mM CaCÍ2 e 20 mM MgCÍ2 foi fracionado numa coluna de MMA-agarose ou WGA-agarose. O Abl que se ligou com a MAA-agarose foi eluido com 0,5% de ácido acético, neutralizado co tampão 1M Tris-HCL (pH 7,0) e trocado o tampão para PBS. O material foi denominado de Abl MAAB.

Após carregar a amostra do anticorpo Abl na coluna WGA-agarose, a fração não ligante (T, não retida) foi recolhida e o tampão trocado para PBS. O material foi denominado de Abl WGAT. A coluna que continha o ABI ligado foi lavada com o mesmo tampão descrito acima e qualquer anticorpo eluido, representando material fracamente ligado (R, atrasado), foi recolhido em frações de 1 ml sendo monitorizado pela medição de OD a 280 nm. O material eluido foi trocado de tampão para PBS e denominado de WGA-R. Finalmente, o material ainda ligado à coluna após lavagem foi eluido com uma solução de GlcNac 200mM e a amostra foi trocada para o tampão PBS. 0 material foi denominado Abl WGAB. Análises de HPLC e espectrometria de massa revelaram que os sub-lotes de Abl variam no conteúdo em ácido siálico (ver Tabela 1), com variações de um máximo de 43% de Abl MAAB até um mínimo de 29% para Abl WGAT. Outro lote de Abl-29 não modificado foi passado diretamente sobre lectina de aglutinina de germe de trigo (WGA). Foi determinado o conteúdo fração que passou diretamente e uma fração fracamente retida, contendo 29% e 41% de glicanos sialilados respetivamente, e foram denominados de Abl-WGA-29 e Abl-WGA-41.

Outro Ab anti-TNF, Ab2, que continha cerca de 5% de sialilação Fc, foi primeiro tratado com galactosiltransferase para preparar material completamente galactosilado previamente ao fracionamento na coluna WGA, resultando numa grande quantidade de Ab2-GT-WGA-5 e uma pequena quantidade de Ab2-GT-WGA-67. 0 antígeno reconhecido pelo Ab2 é o mesmo que para Abl, e um anticorpo anti-idiotipo (anti-Id) reconheceu Ab2 e foi denominado anti-Id2

EXEMPLO 2: MODIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DA GALACTOSILAÇÃO E SIALILAÇÃO DE ANTICORPOS β-l,4-galactosiltransferase (pi,4GT) bovina e UDP-Gal, obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) foram adicionados às amostras de anticorpos galactosilados purificados, oí-2,3-sialyltransferase (a2,3ST) recombinante de fígado de rato, a-1,3-galactosyltransferase (al,3GT) recombinante e CMP-Sai fora obtidos dos New England Biolabs (Beverly, MA) ou da Prozyme (San Leandro, CA). A PNGase F foi obtida dos New England Biolabs (Beverly, MA) ou da

Prozyme (San Leandro, CA) ou da Selectin BioSciences (Pleasant Hill, CA). A β-Galactosidase e β-glucosaminidase de Diplococcus pneumoniae foram obtidas da ProZyme ou da Selectin BioSciences. A β-Galactosidase de rim de bovino e todas as outras enzimas foram obtidas da ProZyme ou da Selectin BioSciences. As colunas NAP-5 e HiTrap proteina A foram obtidas da Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) . Todos os outros reagentes são de grau analítico.

Uma forma enzimaticamente desglicosilada (denominada Gno) do Abl foi preparada para servir como anticorpo controlo que carece de função efetora imune Fc. Esta variante foi preparada com o Abl (—10 mg em 1,0 ml de tampão) em lOOmM de tampão MES (pH 7,0) e tratando-o com 1000 U de PNGase F a 37°C por 24 horas. Outra alíquota da enzima foi adicionada e a incubação prosseguiu por 24 horas adicionais. O Abl desglicosilado foi purificado com uma coluna HiTrap protein A e colocada em PBS, pH 7,0. A glicoforma Gno foi caracterizada por MALDI-TOF-MS para confirmar a desglicosilação

Adicionalmente às preparações de Ab manipuladas em laboratório, os sub-lotes Ab naturalmente diferentes no conteúdo em ácido siálico, aqui referidos como "variantes naturais", foram também comparados. O anticorpo não modificado foi denominado Abl PBS após o material do lote original ser colocado por troca de tampão em PBS. Os Abs monoclonais IgGl humanos, Abl e Ab3, nos quais os membros dos pares diferiam na extensão da sialilação Fc, aparentemente devido a diferentes processos de preparação usados (produzindo ainda assim o mesmo tipo de célula hospedeira) . Os variantes Abl, Abl-20 e Abl-29, continham 20% e 29% de glicanos silalilados, respetivamente, e as variantes Ab5, Ab5-20 e Ab5-26, continham 0% e 26% de glicanos sialilados, respetivamente. Caso contrário, os membros de cada par tinham as mesmas sequências de aminoácidos, os mesmo níveis de fucosilação Fc e conteúdo em GlcNac bifurcada (análises de MALDI-TOF espectrometria de massa) , e o mesmo nível baixo de agregados Ab (< 1 % por análise SECHPLC).

Um resumo de preparações proteicas contendo Fc de Ab usados nos vários bioensaios e o modo em que estão derivados é apresentado na tabela 1.

Table 1. Resumo da lista das preparações teste de proteínas contend Fc aqui usadas

Todas as amostras de teste continham a dobra da IgGl humana, domínios CH2 e CH3. Abl, Ab2, Ab3 e Ab5 são Abs monoclonais IgG com regiões constantes IgGl humanas e kappa. Abl é um Ab totalmente humano específico para a TNF humana e Ab2 é um Ab quimérico ratinho/humano específico para a TNF humana. Ab3 é um Ab totalmente humano específicos para uma das subunidades de uma citoquina heterodimérica proinflamatória. Todos os quatro Abs foram expressos e transfectados em células de mieloma de ratinho Sp2/0. Ab5 é um anticorpo totalmente humano direcionado para uma subunidade de um recetor de superfície de uma célula heterodimérica. FcPl é uma proteína de fusão dimérica que compreende a dobra da IgGl humana e os domínios CH2 e CH3.

As glicoformas G2 foram preparadas sujeitando amostras da IgG a 100 mM de tampão MES (pH7,0) (—10 mg em 1,0 ml de tampão) a 50 miliunidades de pi,4GT, 5 mmol de UDP-Gal, e 5 mmol de MnCl2 a 37°C por 24 horas. Foi depois adicionada outra alíquota da enzima e UDP-Gal e a mistura foi incubada por 24 horas adicionais a 37°C. As amostras IgG re-galactosiladas foram purificadas usando uma coluna HiTrap protein A. Os oligossacáridos foram libertados por PNGase F e caracterizados por MALDI-TOD-MS e HPLC tal como descrito abaixo. A glicoforma G2S2 foi formada colocando amostras da IgG em 100 mM de tampão MES (pH7,0) (—10 mg em 1,0 ml de tampão) usando colunas NAP-5 de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. A esta solução foram adicionadas βΐ e 4GT, a2,3ST e 5 mmol de UDP-Gal e CMP-Sia (isómero NANA), e MnCl2. A mistura foi incubada a 37°C. Após 24 horas, foi adicionada outra alíquota das enzimas juntamente com os açúcares do nucleótido e a mistura foi incubada por 24 horas adicionais a 37°C. A glicoforma G2S2 das amostras da IgG foi purificada como descrito acima. Por cada lote em particular Abl G2S2, Abl G2S2(lo), o ácido siálico que estava originalmente ligado foi perdido durante o armazenamento, possivelmente devido a uma contaminação com sialidase. As análises mostraram que apenas 30% dos oligossacáridos Fc em Abl G2S2(lo) continham ácido siálico, enquanto ~95% dos oligossacáridos Fc em Abl G2S2 (hi) continham ácido siálico

As estruturas de glicanos das preparações de Ab foram analisadas por vários métodos. Para uma análise MALDI-TOF-MS de amostras intactas de Abs IgG, amostras da IgG foram colocadas em tampão Tris-HCL 10 mM, pH 7,0 e a concentração ajustada a ~1 mg/ml de tampão. Cerca de 2 ml da solução da IgG foram misturados com 2 ml de uma solução matriz (a solução matriz foi preparada através da dissolução de ácido sinapínico em 1,0 ml de 50% acetonitrilo em água com 0,1% de ácido trifluoroacético) e 2 ml desta solução foi carregada no alvo e deixada a secar ao ar. O MALDI-TOF-MS foi adquirido com um instrumento da Applied BioSystems (Foster City, CA).

De modo a efetuar a análise MALDI-TOF-MS dos glicanos Fc libertados, amostras da IgG (~50 mg) foram digeridas com PNGase F em tampão Tris-HCl 10 mM (50 ml) pH 7,0 por 4 horas a 37°C. A digestão foi finalizada através de uma acidificação da mistura reacional com 50% de ácido acético (~5 ml) e passada por uma coluna com resina de permuta iónica, como previamente descrito (Papac et al., 1996; Papac et al., 1998; Raju et al., 2000). Estas amostras contendo uma mistura de oligossacáridos ácidos e neutros foi analisada por MALDI-TOF-MS nos modos iónicos positivo e negativo, como descrito em outro lugar (Papac et al., 1996; Papac et al., 1998; Raju et al., 2000) usando uma Voyager DE instrument da Applied BioSystems (Foster City, CA). A análise HPLC dos glicanos Fc foi efetuada digerindo amostras da IgG com PNGase F em tampão Tris-HCl 10 mM (50 ml) pH 7,0 a 37°C por 4-8 horas. Foi efetuada uma derivatização dos oligossacáridos libertados com ácido antranílico (ácido 2-aminobenzóico) tal como descrito (ver Anumula KR, Anal Biochem. 2000 Jul 15;283(1):17-26). Seguido de um curto período de tempo, foi preparada uma solução de acetato de sódio a 4% 3H20 (w/v) e 2% de ácido bórico (w/v) em metanol. 0 reagente de derivatização foi então preparado na hora através da dissolução de ~30 mg de ácido antranílico (Aldrich) e ~20 mg de cianoborohidreto (Aldrich) em 1,0 ml de uma solução de metanol-acetato de sódio-borato. Os oligossacáridos derivados da IgG (<3 nmol em 20-50 ml de água) foram misturados com 0,1 ml da solução do reagente ácido antranílico (AA) em vials de rosca para congelamento de polipropileno com O rings, e hermeticamente fechados. Os vials foram aquecidos a 80 °C num forno ou bloco de aquecimento (Reacti-Therm, Pierce) por 1-2 horas. Após arrefecimento dos vials a temperatura ambiente, as amostras foram diluídas com água para perfazer um volume de -0,5 ml. Os oligossacáridos derivatizados foram purificados recorrendo ao uso de colunas NAP-5.

EXEMPLO 3: LIGAÇÃO A RECETORES FC DE BAIXA AFINIDADE

Dos vários tipos de recetores Fc em células efetoras, os tipos II e III de FC gamma são considerados como recetores de afinidade baixa ou média. No geral, a ligação monomérica pode ter uma afinidade muito baixa para ser detetada ou com níveis muitos baixos. Por exemplo, a ligação monomérica da IgG ao tipo IIA Fc gama é mais difícil de medir. Estes recetores funcionam para acoplar complexos imunes, que devido à sua natureza multivalente se ligam com mais avidez (avidity), presumivelmente devido a uma off rate lenta do complexo.

As células humanas K563, que expressam o FcyRIIA como o único recetor Fcy, foram usadas nos dois tipos de ensaios de ligação para testar se as variações no conteúdo em ácido siálico no glicano Fc afetavam a ligação a este recetor humano Fcy de baixa afinidade. Para se obter avidez (avidity) suficiente de ligação ao FcyRIIA, que tem uma baixa afinidade para a IgG monomérica, foram preparados complexos imunes misturando Abs anti-TNF teste como TNF homotrimérico num rácio molar de 2:1, um rácio que tem mostrado que resulta apenas em quantidades vestigiais de Ab livre ou TNF livre. A dependência dos complexos imunes foi ilustrada quando o Ab2 isolado ligado a células K562 não foi detetado em concentrações de até 1 ug/ml, mas complexos Ab2:TNF mostraram ligação significativa a 0,02 ug/ml (dados não apresentados).

Ligação competitiva. Dois sets de complexos imunes da IgG foram preparados, um complexo marcado contendo o anticorpo humano IgG com especificidade irrelevante foi complexado com uma região anti-V especifica de um Ab não-humano e Ab5. De modo a criar este complexo marcado, um Ab monoclonal quimérico com regiões V de hamster com IgGl humana e regiões constantes kappa de cadeia leve foi iodado usando o reagente IODO-GEN tal como previamente descrito (Knight et al., 1993). Um Ab IgG2a de rato especifico para o região V do idiotipo da quimera hamster/humano foi então misturado num rácio molar de 1:1 em PBS por 30 min para permitir a formação de complexos imunes radiomarcados. O anti-Id do rato não mostrou contribuições para o FcyRIIA acoplar diretamente quando os complexos foram gerados com a quimera desglisosilada hamster-humano, ocorreu um baixa ligação; enquanto complexos com Ab quimérico não modificados mostraram elevados níveis de ligação (dados não apresentados). Em adição, não houve reatividade cruzada detetável entre os agentes utilizados para gerar os complexos imunes em separado, o que pode indicar que o complexo imune se pode ligar com o outro complexo imune (dados não apresentados).

Para os complexos teste, variantes de ácido siálico de Abl foram misturados com o homotrímero humano TNF com um rácio molar de 2:1 (mostrado por análise de dispersão de luz para o resultado de muito pouco Ab não ligado e TNF não ligado) em PBS a temperatura ambiente por 30 min. Num conjunto de experiencias, os complexos de variantes naturais Ab com 20 e 29 por cento de ácido siálico foram comparados entre si. Num segundo conjunto de experiencias, Abl - 29:complexo TNF foram comparados com a coluna de lectina da preparação potenciada Abl - 43: complexo TNF. Em ambos os casos, o complexo de controlo foi o Abl-Gno:TNF em que o anticorpo estava sem glicanos retirados enzimaticamente.

As células humanas K562 foram semeadas a 3 X 105 células/poço em placas de 96 poços em IMDM, 5% FBS. Uma quantidade de complexo de anticorpo radiomarcado foi adicionado às várias quantidades de complexo anticorpo teste e a mistura combinada adicionada a células K562 de modo a que cada poço tivesse uma concentração final de 0,1 mg/ml de complexo de anticorpo iodado. As placas foram incubadas a 16-18 horas a 4°C, após as quais o Ab não ligado foi removido por 3 lavagens com IMDM, 5% FBS, e a contagem de ligação às células foi determinada usando um contador gama.

Resultados. Quantidades crescentes de complexos imunes competidores não marcados aumentaram de um modo crescente a ligação ao complexo imune radiomarcado. As variantes de ácido siálico do Abl não modificado (29% sialilado) e Abl MAAB (43% sialilado) mostraram que o complexo com o Ab mais sialilado necessitava de concentrações mais elevadas 5 a 10 vezes do que o complexo com o Abl menos sialilado, de modo a produzir a mesma extensão de ligação ao FcyRII (Fig. 4A). Para as variantes naturais de Abl diferindo por 9% no conteúdo em ácido siálico (20 vs 29), a diferença foi cerca de 4 vezes maior avidez (avidity) pela preparação menos sialilada (não apresentado) . Assim, a presença do isómero do ácido siálico NGNA, como resultados de expressão combinatória numa célula hospedeira de mieloma de murino nesta IgGl humana reduziu a avidez (avidity) dos complexos imunes para com o FcyRII humano.

Ligação de complexos imunes a células K562. Amostras teste 7 p c de Abl foram misturadas com TNF humano I-marcado num rácio molar definido 2:1, e quantidades variáveis do complexo imune resultante foram adicionados a 3 X 105 células K562 em placas de cultura de 96 poços. Uma comparação de complexos Abl G2:TNF (Ab não sialilado) vs complexos Abl G2S2(hi):TNF (Ab totalmente sialilado) mostraram que o Ab totalmente sialilado se ligou com muito menos avidez (avidity), com a variante mais sialilada a necessitar de concentrações 10 vezes maiores do que a variante não sialilada para atingir o mesmo grau de ligação (Fig. 4B). Os resultados indicam que a presença do isómero NANA do ácido siálico, introduzido in vitro por modificações enzimáticas, reduziu a avidez (avidity) do anticorpo pelo FcyRII humano, o que pode ser atribuído a uma redução na afinidade de ligação para o alvo (TNF) , tornando os complexos Ab:TNF menos estáveis, por redução da afinidade da região constante para o recetor FC, ou ambos.

Ligação do Ab ao FcYRIIIa celular.

De modo a analisar a ligação Ab ao FcYRIIIa em células natural killer (NK), PMBCs humanos foram isolados como descrito acima, e as células NK foram isoladas de PBMCs por separação celular activada magneticamente (sorting) usando um NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) . As células NK foram cultivadas durante a noite em placas de 96 poços com 1 X IO5 células por poço em meio DMEM com 10% FBS a 37°C com 5% CO2. Os mAb Anti- FcyR-IIIa 3G822 (BD Biosciences Pharmingen) foram marcados com 125I usando tubos de Iodogen (Pierce) para uma atividade específica de 11 mCi/mg. O mAb 3G8 iodado foi pré-misturado com quantidades variáveis de competidor Ab não marcado em DMEM, 10% FDS e a mistura Ab adicionada às células NK para uma concentração final de 0,3 mg/ml de 3G8 iodado. As células foram incubadas a 4°C por 16 horas e o IgG não ligado foi removido por 4 lavagens com PBS. O número de CPMs ligado às células foi determinado usando um contador gama.

As células U-397 (não foram pré tratadas para potenciar a expressão do FcyR) que foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 2mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, e 10% FBS (meio U-937) foram semeadas em placas de 96 poços de modo a terem 3 X 105 células por poço em 50 ml de meio U-937. O Ab2 (IgGl humano) foi marcado com 125I para se obter uma atividade específica de 17 mCi/mg. O Ab Ab2 iodado foi pré-misturado com quantidades variáveis de amostras Ab2 competidoras não marcadas em meio U-937. 50 ml da mistura Ab foi então adicionada aos 50 ml de células U-937 para uma concentração final de 0,2 mg/ml de Ab3 iodado em todos os poços. As células foram incubadas a 4°C por 16 horas e o Ab não ligado foi removido por 3 lavagens com meio U-937. O número de CPMs ligado às células foi determinado usando um contador gama.

Para testar que variants Ab mostram afinidade diferencial para FcYRIIIa, células Nk recém-isoladas de dadores humanos saudáveis e usados em experiencias de ligação competitivo usando mAb 3G8, um Ab anti- FcYRIIIa que compete pela ligação com Fc, e Abs não marcados como competidores. Abs livres, não complexados foram usado em vez de complexos imunes (que geralmente mostram maior ligação a FcYRIIIa) de modo a que os resultados não fossem confundidos por diferenças na estabilidade dos próprios complexos imunes solúveis, o que poderia ser influenciado pelo conteúdo em ácido siálico Fc (dados próprios não publicados). Os resultados mostraram que a variante natural de Abl mais sialilada, Ab29, tem uma afinidade reduzida para FcYRIIIa nas células NK, sendo necessárias concentrações 5 vezes maiores do que Abl-20 para atingir o mesmo grau de ligação (Fig. 5A) .Uma diferença similar foi demonstrada com as variantes naturais de Ab5, onde o Ab5-26 necessitou de concentrações 5 vezes mais altas do que o Ab5-0 para competir contra mAB 3G8 na mesma extensão (Fig. 5B). Resultados similares foram obtidos em cada experiencia quando usadas células NK de pelo menos dois outros dadores de sangue (dados não apresentados; alotipo FcYRIIIa não determinado). Estes resultados mostram que níveis mais elevados de sialilação podem reduzir a afinidade da IgG por FcYRIIIa, e, assim, quase certamente contribuir para a redução observada na atividade ADCC.

Quando a mesma experiencia foi feita com os pares de variantes derivados por fracionamento de lectina, contudo, foi detetado que as variantes mais sialiladas se ligavam ao FcYRIIIa com a mesma facilidade, talvez um pouco melhor, que as variantes menos sialiladas (Figuras 5C e 5D) . As razões para os diferentes resultados com os dois pares de variantes naturais e os dois pares de variantes derivados de lectina não são conhecidas, mas uma boa possibilidade será que existem diferenças nas localizações dos resíduos de ácido siálico que estão presentes. EXEMPLO 4: Ensaios ADCC in vitro

As células alvo para o Ab anti-TNF compreendiam uma linha celular de mieloma de ratinho Sp2/0 que expressam de um modo estável na sua superfície TNF recombinante humano que permanece na forma transmembranar devido à introdução de uma deleção dos aminoácidos 1-12 do TNF maturado (Perez et al., 1990). As células K2 foram cultivadas em meio Iscove's contendo FBS inativado por calor, 2mM de L-glutamina, lmM de piruvato de sódio, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, e MHX. Os meios de cultura e suplementos foram adquiridos da Gibco (Invitrogen). A células foram passadas 1:5 a cada 2-3 dias. No dia do ensaio, as células K2 foram centrifugadas e lavadas uma vez com PBS. As células foram ajustadas a cerca de 1 X 106 células/ml com o meio de cultura e foram adicionados 15 microlitros de reagente de marcação por fluorescência BATDA (da Delfia EuTDA Cytotoxicity Reagent Kit, Perkin-Elmer Life Sciences) a 5 ml das células (Blomberg et al., 1996) . As células foram incubadas por 5 minutos a 37°C e depois lavadas duas vezes com PBS a 1000 rpm, 5 min. Imediatamente antes da mistura com células efetoras PBMC, as células alvo foram centrifugadas e ressuspendidas a 2 X 105 células/ml em meio Iscove's contendo 1% BSA.

As células efetoras PMBC foram isoladas de dadores saudáveis após recolher o sangue em contentores de vácuo com heparina, e diluição por duas vezes com PBS. Trinta mis de sangue diluído foram colocados no topo de 15 ml de Ficoll-Paque (Amersham, Uppsala, Sweden) num tubo cónico de 50 ml e centrifugados a 1500 rpm, 30 min a temperatura ambiente (RT) . A interface (camada leucocitária) contendo PMBCs foi recolhida e lavada duas vezes com PBS e centrifugada a 1200 rpm, 10 min, RT. As células foram ressuspendidas em meio Iscove's contendo 5%de FBS inativado por calor, 2mM de L-glutamina, lmM de piruvirato de sódio e 0,1 de aminoácidos não essenciais. Os PBMCs foram ativados por aproximadamente 4 horas a 37°C, 5% CO2 por incubação em lOOmm de pratos de cultura de tecidos (Corning) revestidos com OKT3 (10 ug/ml em PBS, Ortho Pharmaceutical) overnight a 4°C e passados por PBS. Os PMBCs foram recolhidos, lavados uma vez com meio Iscove's contendo 1% BSA; contados e ressuspendidos aproximadamente 1 x 107 células/ml.

As amostras de teste Abl, incluindo a variante de controlo negativo Abl Gno, foram diluidas em série em meio Iscove's 1% BSA. Foram adicionados cinquenta microlitros das células alvo (-10000) e 100 microlitros de anticorpo a uma placa de 96 poços de fundo redondo (Corning). Foram adicionados à mistura cinquenta (50) microlitros de células efetoras (-500000 células), e a placa foi centrifugada a 1000 rpm por 5 min, RT. O rácio de E:T foi normalmente 50:1, no entanto, foi usado algumas vezes 35:1. Para fluorescência de background, os poços foram incubados com células efetoras, células alvo e meio. Para um máximo de fluorescência, 10 microlitros de solução de lise (da Delfia EuTDA Cytotoxicity kit) foi adicionado aos poços de background. Para o ensaio ADCC, as células foram incubadas a 37°C, 5% CO2, por aproximadamente 2 horas. 20 Microlitros do sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96 poços de fundo liso (Corning). 200 Microlitros da solução de Európio (Delfia EuTDA Cytotoxicity Kit) foram adicionados e a placa foi colocada num agitador de placas por 10 minutos a RT. A fluorescência foi medida num fluorómetro de tempo resolvido Envision Instrumento (Perkin-Elmer Life Sciences). A percentagem de lise especifica em cada amostra foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: % Libertação especifica = ([libertação experimental libertação espontânea] 4[libertação máxima - libertação espontânea]) X 100.

As avaliações iniciais dos efeitos do ácido siálico focaram-se na atividade ADCC in vitro dos dois pares de variantes naturais. 0 Abl-29 e o Abl-20 foram incubados com várias concentrações com células alvo que expressam Agl, marcadas com Európioa. Como demonstrado na Figura 6A, existe uma clara diferença na atividade citotóxica, em que Abl-29, com níveis mais elevados de sialilação Fc, e foram necessárias concentrações 7 vezes maiores do que Abl-20 de modo a despoletar a lise celular com a mesma extensão. Os resultados mostram que o sub-lote Abl, enriquecido com glicoformas sialiladas, Abl MAAB, é menos potente que o Abl PBS não modificado. Aproximadamente 3 vezes tanto como o material Abl MAAB-43% foi necessário para tingir a mesma quantidade de lise que a amostra Abl PBS-29%. Experiências com células que expressam Ag5 mostraram o mesmo padrão para o par de variantes naturais Ab2. De modo a atingir o mesmo grau de lise célular que a variante Ab2-0 sem ácido siálico detetável, foi necessária uma concentração 6 vezes maior de Ab2-26 (conforme demonstrado na Figura 6B). Assim, o efeito da variação da glisocilação natural nesta medida de ADCC não é específico para Ab ou para um alvo. EXEMPLO 4: Ensaios ADCC in vitro

Numa experiencia representativa para comparar a atividade ADCC dos sub-lotes Abl que diferem no conteúdo em ácido siálico depois de um fracionamento com lectina, o Abl MAAB (43% sialilado) foi comparado com o lote do Abl não modificado do qual foi derivado (Abl PBS) . Numa segunda experiencia para comparar os sub-lotes Abl que diferiam no conteúdo em ácido siálico, foram comparados entre si o Abl WGAT (29% sialilado) , o Abl WGAR (40% sialilado) , e o Abl WGAB (32% sialilado)

Os resultados do ensaio também demonstram uma relação inversa entre o conteúdo em ácido siálico e a potência no ensaio ADCC independentemente do modo com o qual o Ab foi preparado (Fig 6C) . Ou seja, o Abl WGAT, que contém cerca de a mesma quantidade de ácido siálico que o Abl não modificado, mostrou a mesma atividade que o Abl não modificado. No entanto, as frações WGA preparadas perderam potência com o aumento no conteúdo em ácido siálico.

Numa experiência, duas amostras com diferenças mais profundas no conteúdo em ácido siálico foram comparadas, Abl G2 enzimaticamente modificado (0% sialilado) e Abl G2S2 (hi) (~95% sialilado) . PMBCs recentes foram isolados por centrifugação por densidade em Ficoll-Paque. 5 X 105 PBMCs num volume de 100 ml foram pré-incubados por aproximadamente 10 minutos com quantidade variáveis de Abl não tratado, Abl G2S2(hi) (totalmente galactosilado e sialilado), ou Ab7, do mesmo isotipo, Ab de controlo negativo. As células K2 que expressam o TNF recombinante humano ligado à superfície foram usados como alvos, através de marcação com 200 mCi de 5ICr. As células marcadas foram adicionadas a uma mistura PMBC/Ab, centrifugadas e 1000 rpm por 1 minuto, e incubadas a 37°C por 4 horas. O tempo de incubação (4 horas) é conhecido por revelar primariamente lise celular induzida por células NK (dentro da população de células PBMC), que expressam o FcyRIIIA, em vez de macrófagos, que geralmente expressam o FcyRI (CD64), o FcyRIIIA (CD32A), e o FcyRIIIA (CD16A). O número de radioatividade nos sobrenadantes celulares foi depois determinado usando o Topcount. Os resultados apresentados (Fig. 6D) são representativos das duas experiências independentes feitas usando PBMCs de diferentes dadores e mostram uma alteração de 10 vezes na potência da lise celular entre o Ab totalmente sialilado e um que está praticamente não sialilado.

Outros pares de preparação de Ab foram também comparados no ensaio ADCC. Frações de lectina WGA preparadas a partir de Ab2 galactosilado foram avaliadas em ensaios ADCC usando células alvo que expressam Ag2. De novo, o material mais sialilado foi menos ativo, apesar de haver apenas uma diferença de 4 vezes nos seus valores de EC50 apesar de uma diferença significativa no conteúdo em ácido siálico (5% vs 67%). Por comparação, as frações de lectina WGA feitas a partir de Abl mostraram que 41% da variante sialilada necessitava de estar em concentrações mais elevadas até 6 vezes do que a variante sialilada 29% para atingir o mesmo nível de lise celular.

Estes resultados para os três Abs testados mostraram consistentemente que níveis mais elevados de ácido siálico Fc estavam associados com uma atividade ADCC reduzida. Apesar de não serem quantitativas, as diferenças entre a magnitude na mudança da atividade ADCC e no conteúdo em ácido siálico das preparações Ab, houve uma relação consistente entre o painel de quatro variantes Ab, em que os valores de EC40 foram tipicamente 0,3 ng/ml, 2 ng/ml, 2 ng/ml e 10 ng/ml para Abl-20, Abl-29, Abl-WGA-29, e Abl-WGA-41, respetivamente. Os resultados das frações de lectina também confirmam que as preparações de Ab sialiladas continham espécies moleculares com níveis variados de atividade ADCC. É de digno de nota que, com a exceção de Ab3-0 e Ab3-26, as variantes aqui analisadas tenderam a não mostrar diferenças no nível máximo de lise atingida.

Dado que este método de medir a atividade ADCC é primariamente mediado pelas células NK FcyRIIIA-positivas, os dados implica que, enquanto a presença de ácido siálico no oliqossacárido Fc aumenta a liqação ao FcyRI, a sua presença diminui siqnificativamente a liqação ao FcyRIIIA.

EXEMPLO 5: LIGAÇÃO AO RECETOR FC DE ALTA AFINIDADE A liqação dos Abs teste que diferem no conteúdo em ácido siálico para o recetor humano Fc de alta afinidade, FcyRI (CD64), foi medido usando um formato de liqação competitivo em células U-937, uma linha celular humana monocitica. As células U-937 foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 2mM de L-qlutamina, lmM de piruvirato de sódio, e 10% de FBS em frascos T e mantida em incubadora com 5% de CO2 a 37°C. Ab2, um Ab quimérico IgGl ratinho/humano foi iodado usando IODO-Gen tubos de iodação pré-revestido para uma atividade especifica de 17,2 mCi/mg. As células U-937 foram ressuspendidas em 6 X 106 células/ml com meio de cultura recente, e semeadas em placas de cultura celular de tecidos de 96 poços Milipore como filtros a uma densidade de 3 X 105 células por poço. As células não foram pré-tratadas para induzir maior expressão FcyR. O Ab2 iodado foi pré-misturado com quantidades variadas de competidor Mab (as amostras teste) usando meio de cultura como diluição, num volume de 50 ml. As misturas foram então adicionadas a 50 ml de cultura de células U-937 para uma concentração final de Ab2 iodado de 0,2 ng/ml. As células foram então incubadas a 4°C por 16 horas. A IgG não ligada foi removida por lavagem com meio e aspiração por 3 vezes usando um sistema de aspiração por vácuo de placas. A contagem de ligação às células foi determinada usando um contador gama. A Fig. 7A mostra que, comparativamente com Abl G2 (sem ácido siálico), Abl G2S2(hi) (~95% sialilado) ligou-se ao FcR (CD64) de alta afinidade em células U-937 com uma afinidade superior em 5 a 10 vezes, i.e., Abl G2S2 (hi) necessitou de apenas um quinto ou um décimo da concentração para originar o mesmo grau de inibição da ligação do Ab2 iodado. O Abl G2 não mostrou diferenças detetáveis do Abl não tratado (dados não apresentados) , sendo que o último é uma mistura heterogénea de diferentes glicoformas, a maior parte das quais contêm menos galactose (i.e. glicoformas GO e Gl) do que a amostra Abl G2 A Fig. 7B mostra que dois lotes diferentes de Ab3 que diferem na quantidade de espécies oligossacárido carregadas (espécies contendo ácido siálico), sendo ou 2% do oligossacárido total ou 42%, de um modo semelhante mostram que o lote caracterizado por ter um maior conteúdo em ácido siálico tem uma maior afinidade para o FcyRI.

Após observar a ligação reduzida à célula NK FcyRIIIa por preparações de anticorpos com maior conteúdo em ácido siálico para dois pares de variantes natural de glicosilação de Abl e Ab5 (Exemplo 3, Fig. 5A e B) , foi considerada a possibilidade de que o efeito seja apenas devido a simples repulsão electroestática entre o ácido siálico carregado negativamente e a superfície celular carregada negativamente. No entanto, o efeito inverso do conteúdo de ácido siálico na afinidade de ligação para com o recetor FcyRI nas células humanas U-937 não seguiu o mesmo padrão para Ab5 ou outros Abs (dados não apresentados).

Deve ser notado que, enquanto as duas amostras Abl diferem na ausência/presença da forma NANA do ácido siálico, as duas amostras Ab3 acredita-se que difiram na quantidade da forma NGNA do ácido siálico (produzido nas células hospedeiras de ratinhos).

EXEMPLO 6: MEDIÇÃO DO TEMPO DE MEIA VIDA DO SORO

No presente exemplo, uma proteína de fusão contendo Fc compreendendo um péptido fundido com uma sequencia de região variável de um anticorpo e uma dobra da IgGl humana, e domínios CH2 e CH3 expressos em células de mieloma de ratinho foi tratado para originar a forma totalmente sialilada (G2S2). Ratos fêmea normais CDl (4 por grupo de tratamento) foram injetados intravenosamente com a forma não modificada de FcPl, que contém oligossacáridos Fc que estão 5% sialilados, ou a versão totalmente sialilada (~98% sialilada), foram injetados separadamente em grupos de ratos fêmea CDl intravenosamente. 0 sangue foi recolhido por sangramentos retroorbitais em 1 hora, 5 horas, 24 horas, 72 horas, 7 dias, 14 dias e 21 dias, e seguidamente uma coleção de sangue terminal foi retirada por punção cardíaca dos animais anestesiados com CO2 ao 28° dia. 0 soro foi preparado a partir das amostras de sangue e a concentração de Fc humano no soro foi medida usando um ELISA colorimétrico. Logo depois, placas de 96 poços EIA foram revestidas com anticorpos anti-humano Fc goat policlonais. Várias diluições diferentes das amostras de soro foram incubadas nos poços por 1 hora a temperatura ambiente. A proteína não acoplada foi removida por lavagem, e o Fc humano ligado foi detetado usando anticorpos IgG anti-humano goat conjugados por enzimas, seguido dos substratos com a cor apropriada.

Os resultados do estudo são apresentados na Fig. 8. A área debaixo da curva calculada (AUC) foi de 9561,6 dia-ng/ml X 10”3 para o anticorpo não modificado e 4861,9 dia-ng/ml X 10“3. Tal demonstra que um grau mais elevado de sialilação no oligossacárido Fc está associado com uma clearance mais rápida em ratos normais.

Numa segunda experiência, ratos normais foram injetados com uma única dose de 3 mg/kg de Ab2 enzimaticamente modificado para estar totalmente não sialilado (G2) ou totalmente sialilado (G2S2) . 0 Fc humano no soro foi monitorizado e medido usando o teste ELISA colorimétrico conforme descrito acima. Os resultados desta experiencia estão descritos acima. Os resultados desta experiencia estão apresentados na Fig. 9. Após um período de aproximadamente uma semana, o Ab2 G2S começou a ser eliminado mais rapidamente do soro dos ratos e aos 20 dias o Ab2 G2S2 que permaneceu no soro era aproximadamente menos 1000 vezes que a concentração de Ab2-G2.

Clearance das variantes de ácido siálico do Abl da circulação sistémica em ratos. Outra medida direta do efeito do conteúdo em ácido siálico foi feita, a quantificação da taxa de clearance das espécies individuais de glicosilação do soro após injeção de uma amostra contendo uma mistura heterogénea de espécies de glicanos ligados a um Abl. A mesma preparação heterogeneamente glicosilada de Abl foi injetada i.p em 18 ratos Balb/c normais, com 8-10 semanas de idade a uma dose de 20 mg/kg. Foi recolhido o sangue de 6 ratos no 3o dia, de outros 6 ratos no 14° dia, e dos 6 ratos finais no 28° dia. O soro foi preparado de cada amostra de sangue e o Abl repurificado do soro usando uma coluna de afinidade anti-Id específica para regiões Abl V. As estruturas dos glicanos Fc das amostras de Abl purificadas foram então analisadas por HPLC e a proporção relativa das várias glicoformas foi determinada conforme aqui descrito.

Foi descoberto que a glicoforma galactosilada que não possui ácido siálico (G2S0) mantém a sua abundancia relativa em ratos após um período de 4 semanas, enquanto as glicoformas dos Ab contendo glicanos com 1 ácido siálico (G2S1) e as glicoformas com 2 ácidos siálicos (G2S2) tiveram uma clearance mais rápida.

Assim, as proteínas que contêm Fc totalmente sialiladas possuem um tempo de meia vida sérico inferior às composições não sialiladas ou parcialmente sialiladas.

EXEMPLO 7: CONTEÚDO EM ÁCIDO SIÁLICO E AVIDEZ (AVIDITY) DOS ANTICORPOS

Os resultados aqui descritos apoiam a teoria de que a modificação no conteúdo em ácido siálico do glicano Fc do domínio Fc (dobra dimerizado-CH2-CH3) vai ter impacto em toda a proteína. No que respeita a bivalência dos anticorpos e proteínas de fusão compreendendo um Fc glicosilado, os efeitos podem ser manifestados na avidez (avidity) da proteína para com um alvo específico. As expêriencias neste exemplo foram efetuadas para testar esta teoria e, mais ainda, demonstrar o efeito específico do conteúdo em ácido siálico na afinidade de ligação com o alvo.

Ligação ao antígeno da superfície celular. As mesmas linhas celulares que expressam Ag usadas nos ensaios ADCC acima descritos foram usados em ensaios de ligação para testar diferenças entre variantes de ácido siálico na sua avidez (avidity) de ligação ao antígeno. Os ensaios foram efetuados num formato competitivo, no qual um dos Abs radiomarcados (Abl, Ab2 ou Ab5), mantido a uma concentração fixa, foi incubado com as células que expressam Ag na presença de diferentes quantidades de Abs teste não marcados. Abs iodados, preparados pelo método Iodogen, tiveram na generalidade uma atividade especifica de 10uCi/ug.

As células de superfície que expressam TNF foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços com 50000 células por poço, e as células que expressam Ag2 a 180000 células por poço, em meio IMDM com 5% FBS. O Ab apropriado marcado com 125I foi pré-misturado com quantidades titulantes de Abs teste e a mistura adicionada às células que expressam Ag apropriadas. As placas foram incubadas a RT por 2 horas para permitir a ligação Ab com as células. As células foram depois lavadas 3 vezes com IMDM, 5% FBS para remover o Ab não ligado, e a contagem de ligação às células foi determinada usando um contador gama.

Para as variantes Ab5, células que expressam Ag5 foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 96 polos com 186000 células por poço em 50 ml de DMEM, 10% de FBS. O Ab2 marcado com 125I foi pré-misturado com quantidades titulantes de Ab teste e 50 ml da mistura adicionada às células que expressam Ag. As placas foram incubadas a 4°C por 16 horas para permitir a ligação de Ab ao antigeno nas células. As células foram depois lavadas três vezes com DMEM, 10% FBS para remover o Ab não ligado, e a contagem de ligação às células foi determinada usando um contador gama. As amostras foram testadas em duplicados ou quadruplicados, e os resultados apresentados são representativos de 3 ou 4 experiencias independentes. A diferenças na ligação entre estas amostras teste foi significante (P < 0,0001 para os gráfico a, c, e d) conforme determinado pelo teste F da soma extra dos quadrados.

Os resultados são apresentados na Fig. 10A-D: a ligação de Abl com as células que expressam Agl na presença de variantes normais Abl como competidores (Fig. 10A); ligação pelo Ab5 radiomarcado com as células que expressam Ag5 na presença de variantes naturais Ab5 não marcadas como competidoras (Fig. 10B); ligação pelo Abl radiomarcado com as células que expressam Agl na presença de variantes derivadas de lectina de Abl não marcado como competidores (Fig.lOC); ligação pelo Ab3 radiomarcado com as células que expressam Ag3 na presença de variantes derivadas de lectina de Ab3 não marcado como competidores (Fig.lOD).

Ligação Ab a um ligando de fase sólida. TNF recombinante solúvel ou anti-Id2 foi colocado como revestimento em placas EIA adicionado 50 ml de Ag ou Ab anti-Id a 1 mg/ml em PBS para cada poço e incubando as placas a 4°C overnight. Os poços foram lavados e depois pré-tratados com 50 ml de 1% BSA, 0,125% gelatina em PBS por 1 hora a RT para minimizar a ligação não especifica. O Abl marcado com

7 O £T 7 O £T I ou Ab3 marcado com I foram pre-misturado com quantidades titulantes das respetivas preparações teste Ab em IMDM, 5% FBS, e 50 ml da mistura adicionada para os poços revestidos alvo. A concentração final de Ab radiomarcado foi de 100 ng/ml em todos os poços. As placas foram incubadas a RT por 2 horas para permitir a ligação Ab aos alvos revestidos. Os poços foram lavados para removes o Ab não ligado, e a quantificação da ligação determinada usando um contador gama.

Ligação de Abs revestidos em placa a antigenos solúveis. Placas de 96 poços foram revestidas com variantes de ácido siálico de Abl ou Ab3 e incubadas com quantidades variáveis de antígeno solúvel radiomarcado conforme se segue: (a) ligação de Abl solúvel radiomarcado a variantes naturais Abl revestidas em placas, (b) ligação de Abl solúvel radiomarcado a variantes fracionadas por lectina de Abl revestidas em placas, (c) ligação de Ab3 solúvel radiomarcado a variantes fracionadas por lectina de Ab3 revestidas em placas. Incubações paralelas com Ag radiomarcado e um excesso de 100 vezes de Ag não marcado foram feitas para determinar a ligação não específico. As amostras foram testadas em tripicados. As variantes Ab2 não foram analisadas devido à indisponibilidade de Ag2 solúvel.

Análise estatística. Uma diferença na potência entre as variantes de anticorpos foi analisada por comparação das curvas usando regressões logísticas simultâneas de 4 parâmetros com um mínimo comum, máximo, e declive, após um teste preliminar para o declive e a variação dado um plano em comum para uma concentração zero (i.e., assumindo sempre sem testar um mínimo comum para as curvas crescentes e um máximo comum para curvas decrescentes). O teste de signif icância foi feito com o F-teste da soma extra dos quadrados em GraphPad Prism v4. Um p value de < 0,05 foi considerado significativo. Análises em CPM foram inversamente ponderadas por CMP2 devido ao desvio padrão do CPM aumentar proporcionalmente com a média (i.e., o coeficiente de variação de CPM, CV não está relacionado com a média).

Resultados

As experiencias de ligação de antígeno efetuadas num formato competitivo com as mesmas células alvo que expressam Ag que foram usadas nos ensaios ADCC mostraram inesperadamente que Abl-29 acoplad de um modo consistente com o antígeno de superfície celular com cerca de 3 vezes menos afinidade que o Abl-20 (Fig. 10A) . O Ab5-26, por outro lado, mostrou uma afinidade indistingível de Ab5-0 (Fig.lOB). A mesma análise feita com dois pares de variantes derivadas de lectina mostrou resultados similares com as variantes naturais Abl, i.e., o Abl-WGA-41 mais sialilado era necessário em concentrações mais elevadas de 4 a 6 vezes do que o Abl-WGA-29 menos sialilado para tingir o mesmo grau de ligação competitivo (Fig. 10C), e o Ab2-GT-WGA-67 mais sialilado era necessário em concentrações 4 a 6 vezes maiores que o Ab2-GT-WGA-5 menos sialilado(Fig. 10D) .

Curiosamente, o mesmo padrão de decrescente ligação das variantes Abl e Ab2 com crescentes quantidades de sialilação também foram observados em experiencias de análise de ligação aos alvos (antígeno recombinante solúvel ou anti-Id Ab) que foram imobilizados em placas EIA de 96 poços (Fig. 11A and B) . Estes resultados mostram que as diferenças na extensão da sialilação FC podem ter impacto na ligação ao antígeno assim como a FcyRIIIA, mas que a extensão da sialilação não tem impacto na ligação do antígeno de todos os Abs.

Através dos dados da ligação alvo imobilizado, acredita-se que o aumento na sialilação Fc pode servir para reduzir a flexibilidade da região da dobra do Ab. No caso da ligação de Abl e Ab2 ao antígeno de superfície celular, a flexibilidade reduzida da dobra pode levar a um maior ligação monovalente e menor ligação bivalente (mais alta avidez (avidity)) ao antígeno dependendo do espaçamento das epitopes do antígeno no suporte sólido ou superfície celular. A região da dobra do Ab5 pode também ter flexibilidade reduzida, mas a flexibilidade por não ser necessária para este Ab atingir a ligação máxima a Ag5.

De modo a diferenciar se os efeitos de flexibilidade do Ab ou a afinidade de ligação intrínseca foram afetados pela sialilação de Fc, a ligação do Ab ao ligando solúvel foi testada como medida de afinidade de ligação puramente monovalente. Os resultados mostraram que para três pares de variantes de ácido siálico que mostraram diferenças na ligação ao antígeno de superfície celular, não foram detetadas diferenças observáveis entre os pares de variantes na sua ligação aos alvos solúveis (Fig.l2A-C). Juntando ambos, os reslutados demonstram que as diferenças na ligação de alvos imobilizados (superfície celular ou revestimento em placas) não aconteceram detido a diferenças na afinidade intrínseca entre cada braço Fab e o alvo. Assim, as diferenças entre as variantes de ácido siálico Abl e Ab2 na sua ligação com alvos imobilizados acontecem devido a diferenças na extensão da ligação bivalente com as células.

Está claro que a inveção pode ser praticada de outros modos que não os particularmente descritos na descrição acima mencionada e exemplos. São possíveis numerosas modificações e variações da presente invenção, à luz dos ensinamentos acima mencionados.

Lisboa, 02 de junho de 2015

Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método in vitro para o controlo das propriedades de uma molécula contendo Fc, compreendendo a alteração da sialilação dos oligossacáridos na região Fc para uma glicoforma G2S2 sialilada, em que a sialilação aumenta na região Fc, em qua a sialilação é modificada da região Fc da estirpe selvagem por tratamento enzimático ou modificação enzimática da molécula por uma a-(2,3)-sialiltransferase, e em que as propriedades controladas são selecionadas do grupo constituído por afinidade por um ou mais de recetores FcyRI, FcyRIIA, ed FcyRIIIA, atividade ADCC, ativação de macrófagos ou monócitos, tempo de meia vida do soro, e avidez (avidity).
2. 2. b 0 método da reivindicação 1, em que a molécula contendo Fc tem um domínio de ligação específico para um alvo, sendo o dito alvo um alvo imobilizado.
3. 3. 0 método da reivindicação 1, em que a molécula contendo Fc tem um domínio de ligação específico para um alvo, sendo que o dito alvo está expresso na superfície de uma célula.
4. 4. 0 método da reivindicação 1, em que a molécula contendo Fc é um anticorpo.
5. 5. Um método in vitro para o controlo das propriedades de uma proteína terapêutica que contém Fc caracterizada por conter um oligossacárido biantenário covalentemente ligado a um resíduo de aspargina no domínio CH2 da imunoglobulina da dita proteína, compreendendo a conversão de uma proteína terapêutica que contém Fc não na glicoforma G2S2 num oligossacárido que esteja na glicoforma sialilada G2S2, em que o passo de conversão compreenda o uso de uma a-(2,3)-sialiltransferase para adicionar resíduos de ácido siálico, e em que a dita proteína que contém Fc tem uma ou mais das propriedades selecionadas do qrupo constituído por afinidade reduzida para FcyRIIA e FcyRIIIA, atividade reduzida em ensaios ADCC mediados por células NK, aumento da afinidade para FcyRI, aumento da habilidade de ativação de macrófaqos, e menor tempo de meia vida do soro, quando comparada com a mesma proteína terapêutica contendo Fc não na qlicoforma G2S2.
6. 6. Uma proteína que contém Fc produzida ou alterada pelo método de qualquer uma das reivindicações 1-5.
7. 7. Uma proteína terapêutica que contém Fc caracterizada por ter um oligossacárido covalentemente ligado a um resíduo de asparagina no domínio CH2 da imunoglobulina da dita proteína sendo da glicoforma G2S2 a-(2,3)-sialilada, em que a dita proteína que contém FC tem uma afinidade reduzida para FcyRIIA e FcyRIIIA, atividade reduzida em ensaios ADCC mediados por células NK, aumento da afinidade para FcyRI, aumento da habilidade de ativação de macrófagos, e menor tempo de meia vida do soro, quando comparada com uma preparação da mesma proteína terapêutica que contém Fc nas glicoformas não sialiladas GO, G1 ou G2.
8. 8. A proteína da reivindicação 7, em que o alvo ligado pelo domínio da ligação alvo da proteína é um alvo imobilizado.
9. 9. A proteína da reivindicação7, em que o alvo ligado pelo domínio de ligação da proteína é expresso na superfície de uma célula.
10. 10. A proteína de qualquer uma das reivindicações 7-9, em que a proteína está indicada para o tratamento de distúrbios do foro oncológico, doenças crónicas ou infeciosas.
11. 11. A proteína da reivindicação 10 em que a doença infeciosa envolve a clearance mediada por FcR de células de anticorpos opsonizados ou partículas que compreendem um ou ambos os vírus e bactérias e doenças crónicas que necessitem de tratamento a longo prazo.
12. 12. A proteína da reivindicação 7., em que a proteína compreende um anticorpo monoclonal expresso por recombinação ou um anticorpo modificado enzimaticamente através do uso de sialiltransferases.
13. 13. A proteína da reivindicação 7, em que a proteína é selecionada do grupo constituído por Abl, Ab2, Ab3, ou Ab5
14. 14. Um método in vitro para a preparação de um lote de proteínas terapêuticas recombinantes que contêm Fc da glicoforma sialilada G2S2 caracterizado por compreender um domínio do isotipo IgG da imunoglobulina de pelo menos uma região da dobra, CH2 e um domínio CH3, em que o método compreende o tratamento do lote com uma enzima a-(2,3)-sialiltransferase para adicionar resíduos de ácido siálico às cadeias de polissacáridos ligadas à dita proteína.
15. 15. Uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína produzida através do método da reivindicação 14 em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
16. 16. A proteína produzida pelo método da reivindicação 14 para o uso no tratamento de uma doença ou condição.
17. 17. A proteína produzida pelo método da reivindicação 15 para o uso in vivo no diagonóstico de uma doença ou condição.
18. 18. A proteína da reivindicação 16, em que a dita proteína é usada para tratar uma doença neoplástica selecionada do grupo constituído por carcinoma, linfoma, sarcoma e mieloma.
19. 19. A proteína da reivindicação 16, em que a dita proteína é usada para o tratamento de um distúrbio inflamatório selecionado do grupo constituído por psoríase, artrite reumatoide, colite ulcerosa, síndrome do colon irritável, doença de Chron, e lúpus sistémica eritematosa.
20. 20. A proteína da reivindicação 16, em que a proteína é usada para o tratamento de distúrbios envolvendo neovascularização corneal ou retinal.
21. 21. Um método in vitro para o controlo da afinidade de ligação para um alvo de uma molécula que contém Fc que contenha um domínio de ligação específico para o alvo, compreendendo a alteração na sialilação dos oligossacáridos na região FC da glicoforma G2S2 sialilada, em que a sialilação aumenta na região Fc e a avidez (avidity) diminui, e em que a sialilação é alterada a partir da região Fc da estirpe selvagem por tratamento enzimático ou modificação enzimática da molécula por uma a-(2,3)-sialiltransferase.
22. 22. O método da reivindicação 21, em que o alvo é um alvo imobilizado.
23. 23. O método da reivindicação 21, em que o alvo está expresso na superfície de uma célula.
24. 24. 0 método da reivindicação 21, em que a molécula contendo Fc é um anticorpo.
25. 25. Um método in vitro compreendendo a proteína produzida pelo método da reivindicação 14 no diagonóstico de uma doença ou condição. Lisboa, 02 de junho de 2015