BR112014014549A2

BR112014014549A2 - anti-inflamatório de popipeptídeos não sializado

Info

Publication number: BR112014014549A2
Application number: BR112014014549-0A
Authority: BR
Inventors: Jeffrey V. Ravetch; Andrew Pincetic
Original assignee: The Rockefeller University
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2020-09-24
Also published as: JP2015504883A; JP2018093874A; IN2014CN04765A; IL268787B; US11608379B2; EA201892339A3; HK1203374A1; IL233082A0; ZA201405185B; US9587025B2; NZ627002A; US20140377280A1; JP2022091768A; EP2793943B1; MX2014007292A; CN117964709A; CN104010659A; US20160319024A9; PT2793943T; SG11201403311SA

Abstract

POLIPEPTÍDEOS ISOLADOS NÃO SIALILADOS COM ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA, MÉTODOS PARA OBTÊ-LOS, ÁCIDOS NUCLEICOS QUE OS CODIFIQUE, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA E FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA QUE OS CONTENHA, MÉTODO E USO DOS MESMOS EM TRATAMENTOS DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS Esta invenção diz respeito a agentes antiinflamatórios, composições e métodos para tratamento de desordens inflamatórias.

Description

POLIPEPTÍDEOS ISOLADOS NÃO SIALILADOS COM ATIVIDADE ANTI- INFLAMATÓRIA, MÉTODOS PARA OBTÊ-LOS, ÁCIDOS NUCLEICOS QUE OS CODIFIQUE, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA E FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA QUE OS CONTENHA, MÉTODO E USO DOS MESMOS EM TRATAMENTOS DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS REFERÊNCIA CRUZADA PARA APLICAÇÃO RELATIVA

[0001] Esta aplicação reivindica prioridade do Pedido Provisório norte-americano U.S. No. 61/577,361, depositado em 19 de dezembro de 2011. O conteúdo do pedido é incorporado neste documento inteiramente por referência.

INTERESSES DO GOVERNO

[0002] A invenção divulgada neste documento foi feita, pelo menos em parte, com o apoio do Governo, suportada sob a Outorga No. NIH AI035875 do National Institutes of Health. Consequentemente, o Governo dos EUA tem certos direitos nesta invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] Esta invenção se refere a agentes inflamatórios, composições e métodos para tratamento de desordens inflamatórias.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Desordens inflamatórias, incluindo doenças autoimunes, são doenças envolvendo ativação anormal e subsequente migração de glóbulos brancos para afetar áreas do corpo. Estas condições englobam uma grande gama de doenças que afetam a vida de milhões de pessoas em todo o mundo. Embora vários tratamentos estejam atualmente disponíveis, muitos possuem significantes efeitos colaterais ou não são muito efetivos em aliviar todos os sintomas. Deste modo, existe a necessidade de agentes anti-inflamatórios para tratamento de desordens inflamatórias e necessidade de métodos de identificação e avaliação de tais agentes.

[0005] A imunoglobulina G (IgG) tem sido muito apreciada para mediar ambas as atividades pró e anti-inflamatórias através de interações mediadas por este fragmento de Fc. Enquanto interações Fc-FcR são responsáveis pelas propriedades pró-inflamatórias de complexos imunes e anticorpos citotóxicos, a gamaglobulina intravenosa (intravenous gamma globulin - IVIG) e seus fragmentos Fc são anti-inflamatórios e são largamente usados para suprimir doenças inflamatórias. Tem sido proposto que a glicosilação de IgG é crucial para a regulação de citotoxicidade e potencial inflamatório de IgG. Por exemplo, tem sido sugerido que a atividade anti- inflamatória de IVIG é uma propriedade do fragmento de Fc e seus glicanos ligados, requerendo ligação de terminal ácido siálico .2,6, indicando um requisito combinado para o suporte principal do polipeptídeo específico e estrutura de glicano para imunossupressão. (Anthony, et al., 2008, Science 320: 373-376 e patente internacional WO 2007/117505).

[0006] No entanto, apenas uma pequena população de IgG em IVIG tem terminações glicanas em ácido siálico .2,6 (sFc) e a atividade anti-inflamatória. Como um resultado, para a supressão de auto anticorpo desencadeou variedade de situações clínicas, em uma delas foi preciso administrar IVIG a doses altas (l-2g/kg), para enriquecer a sialilação de IgGs, ou de outra maneira aumentar a sialilação de IgGs (Aplicações norte- americanas U.S. Nos. 20080206246, e 20090004179, e Nimmerjahn et al. Annu Rev Immunol 26, 513-533 (2008)).

[0007] A presente invenção direciona e atende as necessidades acima mencionadas pela identificação de anti- inflamatórios polipeptídeos livres de sialilação.

SUMÁRIO

[0008] Esta invenção se refere a agentes, tais como polipeptídeos e anticorpos, e métodos para tratamento de desordens inflamatórias, exemplo, doenças autoimunes.

[0009] Consequentemente, um aspecto desta invenção caracteriza um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência modificada que é pelo menos 75% (exemplo, qualquer número entre 75% e 100%, inclusive, exemplo, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, e 100%) idêntica para uma região IgG Fc. A sequência modificada é livre de sialilação e o polipeptídeo tem uma atividade anti-inflamatória que é mais elevada que a de um polipeptídeo originador. O polipeptídeo originador pode compreender a região IgG Fc, tal como a sequência de SEQ ID NO: 1 listada abaixo. Em algumas concretizações, o polipeptídeo tem habilidade de se ligar ao DC-SIGN, e para se ligar ao hFcRIIA ou RIIB. Em uma concretização, o polipeptídeo isolado tem uma habilidade de se ligar ao hFcRIIA ou RIIB a um KD de 2xl0-5 M ou menor (isto é, KA de 5,0 x 104 M"1 ou maior). Preferencialmente, a sequência modificada tem uma mutação de FA241. A sequência modificada pode ser pelo menos 75% (exemplo, qualquer número entre 75% e 100%, inclusive, exemplo, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, e 100%) idêntica à SEQ ID NO: 2. Em alguns exemplos, a sequência modificada compreende ou consiste essencialmente da SEQ ID NO: 2.

[00010] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a produção de um polipeptídeo tendo uma atividade anti-

inflamatória. O método inclui, entre outros, os passos de fornecer um polipeptídeo originador tendo a sequência de uma região IgG Fc ou uma primeira sequência de ácido nucleico codificando polipeptídeo originador; e modificando o polipeptídeo originador para obter um polipeptídeo modificado tal que o polipeptídeo modificado é livre de sialilação e simula a estrutura de uma forma sialilatada da região IgG Fc. O passo de modificação pode ser conduzido pela modificação da primeira sequência de ácido nucleico para obter um segundo ácido nucleico codificando o polipeptídeo modificado. A invenção também fornece um polipeptídeo produzido pelo método recém descrito.

[00011] Em um terceiro aspecto, a invenção caracteriza um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência codificando o polipeptídeo descrito acima; um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico, e, uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico. A invenção também caracteriza um método de produção de um polipeptídeo. O método inclui o cultivo da célula hospedeira em um meio, sob condições que permitam a expressão de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico e a purificação do polipeptídeo da célula cultivada ou o meio da célula.

[00012] Em um quarto aspecto, a invenção caracteriza uma formulação farmacêutica compreendendo (i) o polipeptídeo ou ácido nucleico descrito acima, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00013] Em um quinto aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de doença inflamatória. O método inclui a administração a um indivíduo que dele necessita uma quantidade terapeuticamente efetiva do polipeptídeo ou ácido nucleico codificando o polipeptídeo acima mencionado. Também fornecido é o uso do polipeptídeo ou ácido nucleico na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença inflamatória. A invenção também caracteriza um polipeptídeo isolado, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição ou método para tratamento de uma doença inflamatória, substancialmente, como mostrado e descrito neste documento.

[00014] Os detalhes de uma ou mais concretizações da invenção são estabelecidos na descrição abaixo. Outras características, objetos, e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00015] As FIGURAS la-c são diagramas e fotografias mostrando que ácido siálico .2,6 ligante confere atividade de ligação de DC-SIGN ao recombinante humano IgGl Fc.

[00016] As FIGURAS 2a-b são diagramas e fotografias mostrando que desregulação de interações de Fc-glicano confere atividade de ligação de DC-SIGN ao recombinante humano IgG1 Fc.

[00017] A FIGURA 3 é um conjunto de diagramas mostrando que a mutação FA241 em hlgGl Fc recapitula atividade anti- inflamatória de .2,6 sFc.

[00018] As FIGURAS 4a-d são diagramas mostrando requisitos caracterizantes da atividade anti-inflamatória FA241.

[00019] A FIGURA 5 é um conjunto de diagramas mostrando que mutação de FA241 aumenta a ligação do receptor Fc.

[00020] As FIGURAS 6a-b são fotografias mostrando indução de IL-33 mRNA em macrófagos derivados de medula óssea por FA241.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00021] Esta invenção é baseada, pelo menos em parte, e uma revelação inesperada que variantes de IgG Fc não sialilatadas conferem atividade anti-inflamatórias e simulam o efeito de Fc sialilatado .2,6 como mediadores anti-inflamatórios.

Sialilação de IgG e Fc

[00022] IgG é a principal imunoglobulina do soro. É uma glicoproteína composta de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves, que por sua vez são compostas de domínios variáveis e constantes. IgG contem um único, N-ligação de glicano em Asn297 no domínio CH2 em cada uma das duas cadeias pesada. A ligação covalente, carboidrato complexo é composta de um núcleo, penta-polissacarídeo biantenários contendo N- acetilglucosamina (GIcNAc) e mannose (man). Adicional modificação da estrutura do núcleo do carboidrato é observada em anticorpos de soro na presença de fucose, ramificação GIcNAc, galactose (gal) e radicais variáveis de ácido siálico terminal (sa) encontrados. Mais de 40 diferentes glicoformas foram assim detectáveis para serem covalentemente ligadas a esta situação simples de glicosilação (Fujii et al., J. Biol. Chem. 265, 6009, 1990). Glicosilação de IgG foi mostrada para ser essencial pra ligação de todos FcRs por manutenção de uma conformação aberta das duas cadeias pesada. Jefferis e Lund, Imune. 1 Lett. 82, 57 (2002), Sondermann et al, J. Mol. Biol. 309, 737 (2001). Acredita-se que esta glicosilação de IgG para ligação de FcR explica a inabilidade de desglicosilatado anticorpos de IgG para mediar desencadeamento in vivo de resposta inflamatória, tal como ADCC, fagocitose e a liberação de mediadores inflamatórios. Nimmerjahn e Ravetch, Immunity 24, 19 (2006). Observações adicionais que glicoformas de IgG individuais podem contribuir para a modulação de respostas inflamatórias foi sugerida pela afinidade alterada para individuais FcRs reportados por anticorpos IgG contendo ou faltando fucose e seus consequências efeitos em citotoxidade. Shields et al, J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002), Nimmerjahn e Ravetch, Science 310, 1510 (2005). Uma ligação entre estados autoimunes e modelos específicos de glicosilação de anticorpos IgG foi observado em modelos com artrite reumatóide e várias vasculites autoimunes em que a redução de galactosilação e sialilação de anticorpos IgG foi reportada. Parekh et al., Nature 316, 452 (1985), Rademacher et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6123 (1994), Matsumoto et al, 128, 621 (2000), Holland et al., Biochim. Biophys. Acta December 27. Variações em glicoformas IgG foram também reportadas como sendo associadas ao envelhecimento e após imunização, embora o significado in vivo dessas alterações não foram determinadas. Shikata et al., Glycoconj. J. 15, 683 (1998), Lastra, et al., Autoimmunity 28, 25 (1998).

[00023] Como revelado neste documento, certas variantes IgG Fc não sialilada surpreendentemente também confere atividade anti-inflamatória. Tais variantes incluem a variante FA241, que representam espécies dentro de maiores gêneros de moléculas que, em virtude de simular a estrutura e propriedades biológicas de sialilatada Fc, mas não requerendo sialilação, pode ser desenvolvido como terapêuticos anti- inflamatórios.

Polipeptídeos e Ácidos Nucleicos Polipeptídeos

[00024] Como divulgado neste documento, esta invenção fornece polipeptídeos isolados tendo sequências de variantes de IgG Fc humano que falta uma cadeia de polissacarídeo tendo um terminal ácido siálico conectado a um radical de galactose através da ligação de .2,6 no acima mencionado Asn297. Tais não sialilatadas variantes de IgG Fc podem ser derivadas de um anticorpo que ocorre naturalmente ou expressado em uma linha de célula.

[00025] Em uma concretização, a região Fc inclui uma ou mais substituições da sequência de aminoácido hlgGl. Embora não limitado a estes, exemplares regiões IgGl Fc são fornecidas como segue: Fc de hlgGl (partindo do aminoácido 210 no sistema Kabat):

KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:1; F241 e F243 são sublinhadas) Fc de hlgGl FA241:

KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVALFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 2) Fc de hlgGl FA243:

KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLAPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP

APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 3)

[00026] Os termos "peptídeo," "polipeptídeo," e "proteína" são usados neste documento intercambiavelmente para descrever a combinação de resíduos de aminoácido em um polímero. Um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína pode ser composto do padrão 20 aminoácido que ocorre naturalmente, em adição de aminoácidos raros e aminoácidos sintéticos análogos. Eles podem ser qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou modificação pós- translacional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação). O peptídeo, polipeptídeo, ou proteína "desta invenção" inclui versões produzidas recombinantemente ou sinteticamente tendo os domínios particulares ou porções que ligam ao DC-SIGN, FcRIIA e FcRIIB. O termo também engloba polipeptídeos que têm um terminal amino metionina adicional (útil para expressão em células procarióticas).

[00027] Um polipeptídeo ou proteína "isolado" refere-se a um polipeptídeo ou proteína que foi separado de outras proteínas, lipídios, e ácido nucleicos com os quais está naturalmente associado. O polipeptídeo/proteína pode constituir pelo menos 10% (isto é, qualquer porcentagem entre 10% e 100%, exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 85%, 90%, 95%, e 99%) por peso seco da preparação purificada. A pureza pode ser medida através de um método padrão apropriado, por exemplo, por cromatografia de coluna, eletroforese de poliacrilamida gel, ou análise HPLC. Um polipeptídeo/proteína isolado descrito na invenção pode ser purificado de uma fonte natural, produzido por técnica de DNA recombinante, ou por métodos químicos. Um equivalente funcional de IgG Fc refere-se a um polipeptídeo derivado de IgG Fc, exemplo, uma proteína tendo um ou mais pontos de mutações, inserções, deleções, truncações, uma proteína de fusão, ou uma combinação destes. Retendo substancialmente a atividade do IgG Fc, isto é, a habilidade de se ligar ao respectivo receptor e dar partida à respectiva resposta celular. O polipeptídeo isolado pode conter a SEQ ID NO: 2. Em geral, o equivalente funcional é pelo menos 75% (por exemplo, qualquer número entre 75% e 100%, inclusive, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, e 99%) idêntica à SEQ ID NO: 2.

[00028] A "percentagem de identidade" de duas sequências de aminoácido ou de dois ácidos nucleicos é determinada usando-se o algoritmo de Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como em Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Assim um algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. A pesquisa de BLAST nucleotídeo pode ser realizada como programa NBLAST, pontuação=100, comprimento da palavra=12 para obter sequências nucleotídeo homólogas para as moléculas de ácido nucleico da invenção. A pesquisa de proteína BLAST pode ser realizada com o programa XBLAST, pontuação=50, comprimento da palavra=3 para obter sequências aminoácido homólogas para as moléculas de proteína da invenção. Onde intervalos existam entre duas sequências, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al, Ácidos Nucleico Res. 25(17):3389-3402, 1997. Quando utilizando programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.

[00029] A composição de aminoácido do polipeptídeo descrito neste documento pode variar sem romper a habilidade do polipeptídeo de se ligar ao respectivo receptor e provocar a respectiva resposta celular. Por exemplo, pode conter uma ou mais substituições conservativas de aminoácido. Uma substituição "conservativa de aminoácido" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tenso numa cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na matéria. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas beta (exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um predito resíduo de aminoácido não essencial, por exemplo, na SEQ ID NO: 2, é preferencialmente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte das sequências, tal como por mutagênese de saturação, e as mutantes resultantes podem ser selecionadas pela habilidade de se ligar ao respectivo receptor e desencadear a respectiva resposta celular para identificar mutantes que retêm a atividade como descrito nos exemplos abaixo.

[00030] Um polipeptídeo como descrito nesta invenção pode ser obtido como um polipeptídeo recombinante. Para preparar um polipeptídeo recombinante, um ácido nucleico codificado que o codifica (exemplo, FA241, SEQ ID NO: 2) pode ser ligado a um outro ácido nucleico codifica uma associação de fusão, exemplo, glutationa-s-transferase (GST), etiqueta 6x-His epitope, ou M13 Gene 3 proteína. O ácido nucleico resultante de fusão expressa em uma célula hospedeira adequada uma proteína de fusão que pode ser isola por métodos conhecidos na matéria. A proteína de fusão isolada pode ser adicionalmente tratada, exemplo, por digestão enzimática, para remover a fusão associada e obter o polipeptídeo recombinante desta invenção.

Ácidos Nucleicos

[00031] Outro aspecto da invenção caracteriza um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica o polipeptídeo ou proteína descritos acima. Um ácido nucleico refere-se a uma molécula de DNA (exemplo, um cDNA ou DNA genômico), uma molécula de RNA (exemplo, um mRNA), ou um DNA ou RNA análogo. Um DNA ou RNA análogo pode ser sintetizado de nucleotídeos análogos. A molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas preferencialmente é um DNA de cadeia dupla. Um "ácido nucleico isolado" refere-se a um ácido nucleico a estrutura do qual não é idêntica de qualquer ácido nucleico que ocorre naturalmente ou de qualquer fragmento de um ácido nucleico genômico que ocorre naturalmente. O termo abrange, portanto, por exemplo, (a) um DNA que tem a sequência de parte de uma molécula de DNA genômico que ocorre naturalmente, mas não é ladeado por ambas as sequências de codificação que ladeiam a parte da molécula no genoma do organismo em que naturalmente ocorre; (b) um ácido nucleico incorporado em um vetor ou no DNA genômico de uma procariota ou eucariota de uma maneira tal que a molécula resultante não é idêntica a qualquer vetor que ocorra naturalmente ou no DNA genômico; (c) uma molécula separada tal como uma cDNA, um fragmento genômico, um fragmento produzido por reação de cadeia de polimerase (Polymerase Chain Reação - PCR), ou um fragmento de restrição; e (d) uma sequência de nucleotídeo recombinante que é parte de um gene híbrido, isto é, um gene codificador de uma proteína de fusão. O ácido nucleico descrito acima pode ser usado para expressar a proteína de fusão desta invenção. Para este propósito, pode ser operativamente ligado ao ácido nucleico com as sequências reguladoras adequadas para gerar um vetor de expressão.

[00032] Um vetor refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual tenha sido ligado. O vetor pode ser capaz de replicações autônomas ou integradas em um DNA hospedeiro. Exemplos de vetor incluem um vetor plasmídeo, cosmídeo, ou viral. O vetor inclui um ácido nucleico em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Preferencialmente o vetor inclui uma ou mais sequências reguladoras operativamente ligadas à sequência de ácido nucleico a ser expressa.

[00033] Uma "sequência reguladora" inclui promotores, potenciadores, e outros elementos de controle de expressão (exemplo, sinais de poliadenilação). As sequências reguladoras incluem as que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo, tanto quanto sequências reguladoras e/ou indutíveis de tecido específico. O desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como: a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína ou RNA desejado, e semelhantes. O vetor de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira para produzir um polipeptídeo desta invenção. Um promotor é definido como uma sequência de DNA que dirige a RNA polimerase para se ligar ao DNA e inicia a síntese de RNA. Um promotor forte é aquele que faz com que os mRNAs sejam iniciados em alta frequência.

[00034] Qualquer polinucleotídeo como mencionado acima ou um polinucleotídeo biologicamente equivalente disponível ao experiente na matéria para o mesmo propósito pode ser inserido em um apropriado vetor de expressão e ligado com outras moléculas de DNA para formar "moléculas recombinantes de DNA" expressando este receptor. Estes vetores podem ser constituídos de DNA ou RNA; para a maioria dos propósitos de clonagem vetores de DNA são preferidos. Vetores típicos incluem plasmídeos, viroses modificadas, bacteriófagos e cosmídeos, cromossomas de levedura artificial e outras formas de DNA epissomal ou integrado. Está bem dentro do alcance do técnico determinar um vetor apropriado para um uso particular.

[00035] Uma variedade de vetores de expressão de mamífero podem ser utilizados para expressar o acima mencionado IgG Fcs em células de mamíferos. Como observado acima, vetores de expressão podem ser sequências de DNA que são requeridas para a transcrição do DNA clonado e a translação de seus mRNAs em um hospedeiro apropriado. Tais vetores podem ser usados para expressar DNA eucariótico em uma variedade de hospedeiros tais como bactérias, cianobactérias, células vegetais, células de insetos e células animais. Vetores especificamente projetados permitem a reciprocidade de DNA entre hospedeiros tais como células de bactéria-levedura ou de bactéria-animal. Um vetor de expressão apropriadamente construído deve conter: uma origem de replicação para replicação autônoma em células hospedeiras, marcadores selecionáveis, um número limitado de situações de restrição de enzima úteis, um potencial para um número alto de cópias, e promotores ativos. Os vetores de expressão podem incluir, mas não são limitados a vetores de clonagem, vetores de clonagem modificados, plasmídeos ou viroses especificamente designados. Vetores de expressão comercialmente disponíveis de mamíferos que podem ser adequados incluem, mas não são limitados a, pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCTneo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 e pLITMUS39 (New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV- 1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), e IZD35 (ATCC 37565).

[00036] Também dentro do escopo desta invenção está uma célula hospedeira que contem o ácido nucleico acima descrito. Exemplos incluem células E. coli, células de insetos (exemplo, usando vetores de expressão de baculovirus), células de levedura, ou células de mamíferos. Ver exemplo, Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Para produzir um polipeptídeo desta invenção, pode-se fazer uma cultura de uma célula hospedeira em um meio sob condições, que permitam a expressão do polipeptídeo codificado por um ácido nucleico desta invenção e purifiquem o polipeptídeo a partir da célula de cultura ou do meio da célula. Alternativamente, o ácido nucleico desta invenção pode ser transcrito e transladado in vitro, por exemplo, usando as sequências reguladoras promotor T7 e polimerase T7.

[00037] Todos os IgG Fcs que ocorrem naturalmente, IgG Fcs projetados geneticamente, e IgG Fcs sintetizados quimicamente podem ser usados para prática da invenção divulgada neste documento. IgG Fc obtido por tecnologia de DNA recombinante pode ter a mesma sequência de aminoácido como [FA241] SEQ ID

NO: 2) ou um funcionalmente equivalente desta. O termo "IgG Fc" também engloba versões quimicamente modificadas. Exemplos de IgG Fc quimicamente modificados incluem IgG Fcs sujeitos a mudança conformacional, adição ou supressão de uma cadeia de açúcar, e IgG Fc para o qual um composto tal como polietileno glicol foi ligado.

[00038] Pode-se verificar a eficácia de um polipeptídeo/ proteína assim feito usando um modelo animal, tal como um rato transgênico, como descrito abaixo. Qualquer aumento estatisticamente significante na expressão in vivo de basófilos ou expressão IL-33 do receptor FcRIIB no efeito macrófagos indica que o polipeptídeo/proteína é um candidato para o tratamento das doenças mencionadas abaixo. Em uma concretização, o ensaio acima descrito pode ser baseado na medida de uma ligação para a proteína DC-SIGN ou células DC- SIGN(+). A matéria está repleta de várias técnicas disponíveis para um experiente na matéria que será adequada para medir a habilidade de um composto para um DC-SIGN ou para células DC- SIGN(+)e trocas relacionadas na expressão de um gene regulado pelo caminho de DC-SING, tal como IL-33. O experiente na matéria será capaz de misturar e combinar estas várias ferramentas de pesquisa sem excessiva experimentação. Uma vez purificada e testada por métodos padrões ou de acordo com o ensaios e métodos descritos nos exemplos abaixo, variantes não sialilatadas de IgG Fc podem ser incluídas na composição farmacêutica para tratamento de desordens inflamatórias.

[00039] Como usado neste documento, "anticorpo" é usado no amplo senso e especificamente envolve anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (exemplo,

anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo desde que estes exibam a desejada atividade biológica.

[00040] Como usado neste documento, "fragmentos de anticorpo", pode compreender uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo a ligação ao antígeno ou região variável do intacto anticorpo ou a região Fc de um anticorpo que retém a capacidade de ligação de FcR. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecífico formado de fragmentos de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo preferencialmente conservam pelo menos parte do ponto principal e opcionalmente a região CHI de uma cadeia pesada IgG. Mais preferencialmente, os fragmentos de anticorpo conservam a região constante inteira de uma cadeia pesada IgG, e incluem uma cadeia leve IgG.

[00041] Como usado neste documento, o termo "fragmento Fc" ou "região Fc" é usada para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "região Fc" pode ser uma sequência da região Fc nativa ou uma região Fc variante. Embora os contornos da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a cadeia pesada de região IgG humana Fc é usualmente definida para estender de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, aos terminais carboxila destes.

[00042] A "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada in nature. Uma "região Fc variante" como apreciada por um experiente na matéria compreende uma sequência de aminoácido que difere de uma sequência de região Fc nativa em virtude de pelo menos uma "modificação de aminoácido." Preferencialmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada com uma sequência de região Fc nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo originador, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácido, e preferencialmente de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma sequência de região Fc nativa ou na região Fc de um polipeptídeo originador. A região variante de Fc neste documento preferencialmente possuirá pelo menos cerca de 75 ou 80% de homologia com uma sequência região Fc nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo originador, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95% homologia com esta, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 99% homologia com esta.

[00043] Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em uma concretização da invenção, FcR é uma sequência nativa humana FcR. Em outra concretização, o FcR, inclui FcR humano, ligado a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcRI, FcRII, e FcRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas "emendadas" destes receptores. Os receptores FcRII incluem FcRIIA (um "receptor de ativação") e FcRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação de FcRIIA contém um imunorreceptor com motivo de ativação baseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplásmico. O receptor de inibição FcRIIB contém um imunorreceptor com motivo de inibição baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplásmico (ver revisão em Daron, Annu Rev Immunol, 15, 203-234 (1997); FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, Annu Rev Immunol, 9, 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4, 25-34 (1994); e de Haas et al, J Lab Clin Med, 126, 330-41 (1995), Nimmerjahn e Ravetch 2006, Ravetch Fc Receptors in Fundemental Immunology, ed William Paul 5th Ed. Cada um dos quais é incorporado neste documento por referência).

[00044] O termo "nativo" ou "originador" refere-se a um polipeptídeo não modificado compreendendo uma sequência aminoácido Fc. O polipeptídeo originador pode compreender uma sequência nativa de região Fc ou uma região Fc com modificações na sequência de aminoácidos pré existentes (tal como adições, deleções e/ou substituições).

Composições

[00045] Dentro do escopo desta invenção está uma composição que contém um veículo adequado e um ou mais dos agentes descritos acima, tais como os variantes de IgG Fc não sialilatados. A composição pode ser uma composição farmacêutica que contém um veículo farmaceuticamente aceitável ou uma composição cosmética que contenha um veículo cosmeticamente aceitável.

[00046] O termo "composição farmacêutica" refere-se à combinação de um agente ativo com um veículo, inerte ou ativo, fazendo a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vivo ou ex vivo. Um "veículo farmaceuticamente aceitável" depois de administrado a um indivíduo, não causa indesejáveis efeitos fisiológicos. O veículo na composição farmacêutica pode ser "aceitável" também no sentido de que é compatível com o ingrediente ativo e pode ser capaz de estabilização. Um ou mais agentes de solubilização podem ser utilizados como veículos farmacêuticos para entrega de composto ativo. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados para, veículos biocompatível, adjuvantes, aditivos, e diluentes para alcançar uma composição utilizável como uma forma de dosagem. Exemplos de outros veículos incluem óxido de silício coloidal, estearato de magnésio, celulose, e lauril sulfato de sódio.

[00047] A composição acima descrita, em qualquer das formas descritas acima, pode ser usada para tratamento de doenças caracterizadas por inflamação. Uma quantidade efetiva refere- se à quantidade de um composto/agente ativo que é requerido para conferir a efeito terapêutico a um indivíduo em tratamento. As doses eficazes irão variar, como reconhecido por experientes na matéria, dependendo dos tipos de doenças tratadas, rota de administração, excipiente usado, e a possibilidade de utilização conjunta com outro tratamento terapêutico.

[00048] Uma composição farmacêutica desta invenção pode ser administrada parenteralmente, por via oral, por via nasal, por via retal, topicamente ou bucalmente. O termo "parenteral" como usado neste documento refere-se a subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intra-sinovial, intra-esternal, intratecal, intralesional ou injeção intracraniana, bem como qualquer adequada técnica de infusão.

[00049] Uma composição estéril injetável pode ser uma solução ou suspensão e um diluente ou um solvente não tóxico parenteralmente aceitável. Tais soluções incluem, mas não são limitados a, 1,3-butanediol, manitol, água, solução Ringer e solução de cloreto de sódio isotônico. Em adição, óleos de fixação são convencionalmente empregados com um solvente ou meio de suspensão (exemplo, mono- ou diglicerídeos sintéticos). Ácido graxo, tal como, mas não limitado a, ácido oleico e seus derivados de glicerídeo, são úteis na preparação de injetáveis, como são os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como, mas não limitados a, óleo de oliva ou óleo de rícino, versões polioxietilatadas destes. Estas soluções de óleo ou suspensões também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa tal como, mas não limitado a, carboximetil celulose, ou agentes dispersantes similares. Outros surfactantes comumente usados, tais como, mas não limitados a, TWEENS ou SPANS ou similares agentes emulsificantes ou potenciadores de biodisponibilidade, normalmente usados na fabricação de medicações farmaceuticamente aceitáveis quer sejam sólidas, líquidas, ou em outras formas de dosagem, também podem ser usadas para o propósito de formulação.

[00050] Uma composição para administração oral pode ser apresentada em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável, incluindo cápsulas, tabletes, emulsões e suspensões aquosas, dispersões, e soluções.

[00051] No caso de tabletes, veículos normalmente usados incluem, mas não são limitados a, lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como, mas não limitados a, estereato de magnésio, também são tipicamente acrescentados. Para administração oral em forma de cápsula, diluentes úteis incluem, mas não são limitados a, lactose e amido de milho seco. Quando suspensões ou emulsões aquosas são administradas oralmente, o ingrediente ativo pode ser suspenso ou dissolvido numa fase oleosa combinada com agentes emulsionantes ou de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, aromatizantes, ou colorantes podem ser acrescentados.

[00052] As composições farmacêuticas para administração tópica de acordo com a invenção descrita podem ser formuladas como soluções, pomadas, cremes, suspensões, loções, pós, pastas, géis, aerossóis ou óleos. Alternativamente, formulações tópicas podem ser na forma de cobertura ou curativos impregnados com ingrediente(s) ativo(s), que podem opcionalmente compreender um ou mais excipientes ou diluentes. Em algumas concretizações preferenciais, as formulações tópicas incluem um material que pode melhorar a absorção ou penetração do agente(s) ativo(s) através da pele ou outras áreas afetadas. A composição tópica é útil para o tratamento de desordens inflamatórias na pele, incluindo, mas não limitadas a, eczema, acne, rosácea, psoríase, dermatite de contato, e reações à hera venenosa.

[00053] Uma composição tópica contém uma quantidade segura e efetiva de um veículo dermatologicamente aceitável para adequada aplicação na pele. Uma composição ou componente "aceitável cosmeticamente" ou "aceitável dermatologicamente" refere-se à composição ou componente que é adequado para uso em contato com a pele humana sem indevida toxicidade, incompatibilidade, instabilidade, resposta alérgica, ou similares reações. O veículo possibilita que um agente ativo e componente opcional seja entregue à pele a uma concentração apropriada. O veículo desta maneira pode atuar como um diluente, dispersante, solvente, ou semelhantes para garantir que os materiais ativos sejam aplicados e distribuídos uniformemente sobre o alvo selecionado a uma concentração apropriada. O veículo pode ser sólido, semissólido, ou líquido. O veículo pode ser na forma de uma loção, um creme, ou um gel, em particular um que possua uma espessura ou ponto de escoamento suficiente para impedir que os materiais ativos sedimentem. O veículo pode ser inerte ou possuir benefícios dermatológicos. Também deve ser físico e quimicamente compatível com os componentes ativos descritos neste documento, e não deve impedir indevidamente a estabilidade, eficácia ou outros benefícios dos usos associados com a composição. A composição tópica pode ser um produto cosmético ou dermatológico na forma conhecida na matéria para aplicações tópicas ou transdérmicas, incluindo soluções, aerossóis, cremes, gel, coberturas, pomada, loção, ou espuma.

Métodos de Tratamento

[00054] A invenção descrita fornece métodos para o tratamento de um indivíduo com uma desordem inflamatória. O termo "desordem inflamatória" refere-se a uma desordem que é caracterizada por inflamação anormal ou indesejada, tal como uma doença autoimune. Doenças autoimunes são doenças caracterizadas pela ativação crônica de células imunes sob condições de não ativação. Exemplos incluem psoríase, doenças inflamatórias do intestino (exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), artrite reumatóide, artrite psoriática, esclerose múltipla, lupus, diabetes tipo I, cirrose biliar primária, e transplante.

[00055] Outros exemplos de desordens inflamatórias que podem ser tratadas pelos métodos desta invenção incluem asma, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, dermatoses inflamatórias (por exemplo, dermatite, eczema, dermatite atópica, dermatite de contato alérgica, urticária, vasculite necrosante, vasculite cutânea, vasculite de hipersensibilidade, miosite eosinofílica, polimiosite, deraiatomiosite e eosinofílica fasceíte), síndrome da angústia respiratória aguda, hepatite fulminante, doenças pulmonares de hipersensibilidade (por exemplo, pneumonia de hipersensibilidade, pneumonia eosinofílica, de hipersensibilidade retardada, doença pulmonar intersticial (interstitial lung disease - ILD), fibrose pulmonar idiopática, e ILD associada à artrite reumatoide) e rinite alérgica. Exemplos adicionais também incluem miastenia grave, diabetes juvenil, glomerulonefrite, tireoidite autoimune, espondilite anquilosante, esclerose sistêmica, doenças inflamatórias agudas e crônicas (por exemplo, anafilaxia ou hipersensibilidade respostas sistêmicas, alergias a medicamentos, alergias picada de insetos, rejeição do enxerto e doenças de enxerto versus hospedeiro) e síndrome de Sjogren.

[00056] Um "indivíduo" refere-se a um animal humano e não humano. Exemplos de um animal não humano incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos, tais como mamíferos não humanos, primatas não humanos (particularmente primatas superiores), cão, roedor (exemplo, rato ou camundongo), porquinho da índia, gato, coelho, e não mamíferos, tal como pássaros, anfíbios, répteis, etc. Em uma concretização, o indivíduo é um humano. Em outra concretização, o indivíduo é um modelo experimental, animal não humano ou animal adequado como um modelo de doença.

[00057] Um indivíduo para ser tratado de uma desordem inflamatória pode ser identificado por técnicas padrões de diagnóstico da desordem. Opcionalmente, o indivíduo pode ser examinado pelo nível ou porcentagem de uma ou mais de citocinas ou células de uma amostra de teste obtida a partir do indivíduo por métodos conhecidos na matéria. Se o nível ou percentagem é igual ou abaixo de um valor (que pode ser obtido de um indivíduo normal), o indivíduo é um candidato para o tratamento descrito neste documento. Para confirmar a inibição ou o tratamento, pode-se avaliar e/ou verificar o nível ou percentagem de um ou mais das citocinas acima mencionadas, ou das células no indivíduo após tratamento.

[00058] "Tratar" ou "tratamento" refere-se à administração de um composto ou agente para um indivíduo que tem uma desordem com o propósito de cura, aliviar, socorrer, reparar, retarda o aparecimento, prevenir, ou melhorar a desordem, o sintoma da desordem, o estado da doença secundária para o distúrbio, ou a predisposição para a desordem.

[00059] Uma "quantidade efetiva" ou "quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se a uma quantidade do composto ou agente que é capaz de produzir um resultado médico desejado em um indivíduo tratado. O método de tratamento pode ser realizado in vivo ou ex vivo, sozinho ou em conjunção com outras drogas ou terapia. Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não é entendido para ser limitado para uma rota de formulação ou administração.

[00060] O agente pode ser coadministrado in vivo ou ex vivo, sozinho ou administrado em conjunção com outras drogas ou terapia, isto é, um coquetel terapêutico. Como usado neste documento, o termo "coadministração" ou "coadministrado" refere-se à administração de pelo menos dois agentes ou terapias para um indivíduo. Em algumas concretizações, a coadministração de dois ou mais agentes/terapias é concorrente. Em outras concretizações, um primeiro agente/terapia é administrado antes de um segundo agente/terapia. Os experientes na matéria entenderão que as formulações e/ou rotas de administração dos vários agentes/terapias usados podem variar.

[00061] Em uma abordagem in vivo, um composto ou agente é administrado para um indivíduo. Geralmente, o composto ou agente é suspenso em um veículo farmaceuticamente aceitável (tal como, por exemplo, mas não limitado a, salina fisiológica) e administrado oralmente ou por infusão intravenosa, ou injetado ou implantado subcutaneamente, intramuscularmente, intratecalmente, intraperitonealmente, intraretalmente, intravaginalmente, intranasalmente, intragastricalmente, intratraqueal, ou intrapulmonarmente.

[00062] A dosagem requerida depende da escolha da rota de administração; a natureza da formulação; a natureza da doença do paciente; o tamanho do indivíduo, peso, área de superfície, idade e sexo; de outras drogas sendo administradas; e do julgamento do médico assistente. Dosagens adequadas estão no intervalo de 0,01-100 mg/kg. Espera-se que variações na necessidade de dosagem tendo em vista a utilização de uma variedade de compostos/agentes disponíveis e às diferentes eficiência das diversas rotas de administração.

[00063] Por exemplo, espera-se que a administração oral requeira dosagens mais elevadas do que a administração por via de injeção intravenosa. Variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas usando rotas empíricas padrão para otimização como é bem entendido na matéria. O encapsulamento do composto em um veículo de entrega adequado (por exemplo, micropartículas poliméricas ou dispositivos implantáveis) pode aumentar a eficiência de entrega, particularmente por entrega oral.

Exemplo 1: Métodos e Materiais

[00064] Este exemplo descreve métodos e materiais gerais usados nos Exemplos 2-7.

Ratos

[00065] Os ratos tipo selvagem C57BL/6 foram adquiridos do Jackson Laboratories. Os ratos SIGNR1-/- foram providos por A. McKenzie. Os ratos transgênicos CDl lc-DC-SIGN+ foram providos por T. Sparwasser. Os ratos transgênicos hDC-SIGN BAC em uma prática SIGNRl-/- foram gerados no laboratório dos inventores, tal como descrito anteriormente. Os ratos KRN TCR C57BL/6 (oferta de D. Mathis e C. Benoist) foram criados com ratos NOD para gerar ratos K/BxN. O sangue dos ratos K/BxN (6-12 semanas de idade) foram coletados e soro contendo anticorpos artritogênicos agrupados juntos. A transferência passiva de 200 µl K/BxN de soro através de injeção intra venosa a ratos primitivos (8-12 semanas de idade) induziu artrite. A inflamação foi marcada de 0-3 pontos para cada pata que somados geraram uma pontuação clínica total individual por rato. Preparação de Fc Recombinante

[00066] IDEC-114, uma fonte recombinante de anticorpo humano de comprimento completo monoclonal IgGl, foi digerida com papaína durante a noite a 37°C para clivar os fragmentos Fab e Fc. Após digerir, a reação foi parada pela adição de 2,5 mg/ml de iodoacetamida. Para separar fragmentos clivados de anticorpo não digerido, amostras foram passadas através de uma coluna de exclusão de tamanho HiPrep 26/60 S-200HR (GE HEALTHCARE). O fragmento Fc foi subsequentemente purificado com cápsulas de proteína G agarose. A pureza da amostra foi verificada pela mancha de coomassie azul brilhante de gel de SDS-poliacrilamida. Alternativamente, recombinante Fcs foram produzidos por uma transfecção de transiente de expressões de plasmídeos IgG1 Fc humano em células 293T, seguido por precipitação com sulfato de amônio de frações de supernadantes e de purificação de proteína G. A sequência genética que codifica a região Fc de IgGl humano foi amplificada de 4-4-20 IgGl por protocolos PCR padrão e ligada em pSecTag2 (INVITROGEN). As mutações pontuais foram introduzidas, na sequência de codificação de Fc, por meio de técnicas convencionais de mutagênese e verificadas por sequenciação de DNA. Primers PCR para a substituição de Phe para Ala na posição 241 (FA241) foram: 5'-ggggaccgtcagtcgccctcttccccccaa-3' (SEQ ID NO: 4) e 5'- ttggggggaagagggcgactgacggtcccc-3' (SEQ ID NO: 5).

[00067] A expressão de proteína e a purificação foram confirmadas por "immunoblotting" com anticorpos anti-humanos Fc e/ou mancha de coomassie de azul brilhante de gel de SDS- poliacrilamida.

Passo dois Reação de Sialilação in vitro

[00068] Após a purificação, fragmentos Fc de 10-50 mg/ml foram trocados do receptáculo para o receptáculo de uma reação de galactosilação (50mM MOPS, pH 7,2; 20mM MnCl2) e incubada durante a noite a 37°C com 50 mg UDP-galactose e 0,75 U pi,4- galatosiltransferase. A galactosilação foi confirmada por mancha de lectina usando ECL para reconhecer resíduos de galactose terminal. Os Fcs galactosilatado foram então trocados do receptáculo para o receptáculo de uma reação de sialilação (100 mM MOPS, 0,2 mg/ml BSA, 0,5% Triton X-100, pH 7,4) e incubada durante a noite a 37°C com 50 mg CMP-ácido siálico e 0,75 U 2,6-sialiltransferase. A sialilação foi confirmada por mancha de lectina usando SNA para reconhecer resíduos de ácido siálico terminal com uma ligação .2-6.

Transferência Adotiva de Macrófagos Derivados de Medula Óssea

[00069] As células da Medula Óssea foram liberadas da tíbias e fêmures de ratos DC-SIGNtg ou SIGNRl-/-, e semeadas em cultura de tecido não tratado placas de 10 cm no meio de crescimento RPMI 1640 suplementado com 10% FBS, 1% Pen/Strep, IL-3 (5 ng/ml, PEPROTECH), e M-CSF (5 ng/ml, PEPROTECH). Após incubação durante a noite a 37°C, células não aderentes recuperadas e transferidas para cultura de placas de tecido não tratado de 10 cm com meio de crescimento RPMI suplementado com IL-3/M-CSF-, e cultivadas por 5-7 dias a 37°C. Macrófagos maduros foram tripsinizados e colocados em 6 placas de cultura a uma densidade de 2xl06 células/cultura, e com permissão de se ligarem durante a noite. No dia seguinte macrófagos foram pulsados com a indicada preparação recombinante Fc por 30 minutos a 37°C. As células foram recuperadas, lavadas com PBS frio, e lxlO6 células foram administradas intravenosamente aos ratos tipo selvagem C57BL/6. Uma hora após a injeção, os ratos foram infectados com soro K/BxN. Expressão e Purificação de DC-SIGN Humano Solúvel

[00070] Um plasmídeo contendo a sequência cDNA do domínio extracelular (extracellular domain - ECD) de DC-SIGN humano foi fornecido por K. Drickamer. A sequência de codificação para DC-SIGN ECD foi modificada para introduzir um terminal-N indicativo de estreptococo por técnicas padrão PCR e ligada a pET28b(+). pET28b-strepDCSIGN foi transformado em cepa de E. colli BL21/DE3 e cresceu em 3 litros do meio de crescimento TB a 37°C até a cultura da bactéria alcançar OD600 0,7-0,8. A expressão de proteína foi induzida por adição de 100 mg/l de IPTG e a cultura incubada a 37°C por 3,5 h. As bactérias foram sedimentadas por centrifugação a 4000xg por 10 minutos a 4°C. As bactérias sedimentadas foram suspensas novamente em 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, e lisadas por sonicação. Os corpos de inclusão foram sedimentados por centrifugação a 10.000xg por 15 minutos a 4°C e solubilizados em 100 ml de 6 M guanidina- HCl; 100 mM Tris-HCl, pH 7,8; 0,2% TRITON X- 100. Material particulado foi removido por centrifugação a 20.000xg por 30 minutos a 4°C, e a fração supernadante foi dialisada contra 250 mM NaCl; 25 mM Tris-HCl, pH 7,8; 25 mM CaCl2. Depois da diálise, precipitados insolúveis foram removidos por centrifugação a 20.000xg por 30 minutos a 4°C, e a fração supernadante aplicada a uma resina de strep-tactin (NOVAGEN) para derrubar strep DC-SIGN ECD marcados. Proteínas ligadas foram eludidas da resina com o receptáculo de elução fornecido pelo fabricante (NOVAGEN). As frações foram analisadas por SDS-PAGE e as frações positivas combinadas e carregadas em uma coluna mannose-agarose para selecionar por receptores ativos. DC-SIGN ECD foi eluído com 250 mM NaCl; 25 mM Tris-HCl, pH 7,8; 5 mM EDTA. As frações foram analisadas por SDS-PAGE.

Ressonância de Plasma de Superfície

[00071] Para determinar a interação entre vários preparações recombinantes Fc para solúvel hDC-SIGN ou hFcRs, medições de afinidade em estado estacionário foram gravadas em um sensor Biacore T100. Receptores, diluídos para 20-50 μg/ml em NaOAc pH 5,0, foram imobilizados em chip CM5 a densidade alta (2000 RU) por acoplamento padrão de amina. Por interações hDC-SIGN, injeções foram realizadas a uma razão de fluxo de 20 μl/minuto com o receptáculo HBS-P+ comercialmente disponível ajustado para pH 9,0 e suplementado com 2 mM CaCl2 e 500 mM NaCl. Para interações de hFcRs, injeções foram realizadas a uma razão de fluxo de 20 μl/minuto com o receptáculo HBS-EP+ comercialmente disponível. As superfícies foram regeneradas com um pulso curto de 50 mM NaOH. Valores de Kd foram calculados depois da subtração do nível de ligação para um fluxo de controle de célula usando o software Biacore Evaluation.

RT-PCR

[00072] O RNA total foi extraído de macrófagos derivados de medula óssea usando o kit RNeasy Mini (QIAGEN). Uma micrograma de RNA total foi usada para análise da expressão de mRNA IL-33 por RT-PCR usando o kit OneStep RT-PCR (QIAGEN). Expressão de GAPDH serviu de controle de carga. Primers PCR para mIL-33 foram 5'-gaagatcccaacagaagacc-3'(SEQ ID NO: 6) e 5'- ttccggaggcgagacgtcac-3'(SEQ ID NO: 7); e mGAPDH foram 5'- gccgcctggagaaacctgc-3' (SEQ ID NO: 8) e 5'- tgaggtccaccaccctgttg-3' (SEQ ID NO: 9). As condições do PCR foram 94°C por 30 s; 55°C por 30 s; 72°C por 60 s x 35 ciclos (IL-33) ou 25 ciclos (GAPDH).

Exemplo 2: Ácido siálico ligando .2,6 conferiu a atividade de Ligação DC-SIGN para Recombinante IgG1 Fc humano

[00073] A menor população de anticorpos em preparações IVIG suprimiu a inflamação induzida por auto anticorpo. Estes anticorpos, contendo ácido siálico ligando terminal 2,6 no Fc glicano, mediou uma resposta anti-inflamatória por ligação para SIGNR1 em macrófagos de zona marginal ou seus ortólogo humano, DC-SIGN, em células mieloides.

[00074] Para o estudo da interação de sFc com DC-SIGN, uma forma solúvel do domínio extracelular de DC-SIGN (DC-SIGN ECD) foi purificada de bactéria e imobilizada em chips CM5. O sFc foi preparado de anticorpos IDEC-114 de comprimento completo e sialilatada in vitro (Figura lb), e foi especificamente ligado à superfície conjugada de DC-SIGN (Figura la). Medições de afinidade no estado de equilíbrio foram realizados e o valor de KD para esta interação foi calculada como aproximadamente 1,3xl0-6 M (Figura la). Em contraste, uma glicoforma asialilatada de IDEC-114 Fc não mostrou atividade de ligação para DC-SIGN sugerindo que a sialilação induz uma troca conformacional no suporte principal Fc para revelar uma situação de ligação de DC-SIGN.

[00075] Como mostrado na Figura la, foi encontrado que ligação recombinante de cc2,6-sFc para DC-SIGN solúvel como medido por ressonância de superfície de plasma (surface plasmon resonance - SPR). Fcs foram preparados por clivagem de papaína de anticorpo monoclonal IgGl humano de comprimento completo (IDEC-114) seguida por reações de galactosilação in vitro e de sialilação. Os sensorgramas SPR de ligação de anticorpo para DC-SIGN imobilizado são mostrados por glicoformas sialilatadas e galactosilatadas de hlgGl Fcs como descrito acima no Exemplo 1. Foi verificado que os fluxos de concentrações de Fc em DC-SIGN ECD estão no intervalo de 3-0,8 μΜ. Como mostrado na Figura lb, mancha de lectina com SNA confirmou ligação de ácido siálico com ligação de 2,6 em Fc

(painel superior); controles de carga de manchas de coomassie foram mostrados no painel inferior. O estado estacionário da mediada de KD da ligação de sFc a DC-SIGN (como mostrado em a.) foi calculado pelo software Biacore Evaluation.

Exemplo 3: Rompimento de Mutações de interações glicano Fc conferiu atividade de ligação DC-SIGN a Recombinante IgG1 Fc humano

[00076] A cadeia de oligossacárido do núcleo ligado a Asn faz extensas interações não covalentes com o suporte principal de aminoácidos de Fc. Mudanças conformacionais no Fc induzido por diferentes resíduos de açúcar ligado par ao núcleo de glicano são medidas por estas interações carboidrato-proteína. Substituições de alanina que anulam ponto de contato chave entre o suporte principal Fc e resíduos de glicano parecem conferir atividade de ligação DC-SIGN.

[00077] Como mostrado na Figura 2A, mutações FA241 e FA243 exibem atividade de ligação DC-SIGN sem tratamento enzimático in vitro. Aparentes valores de KD estão na ordem de 6x10-7 M para FA241 de 3x10-7 M para FA243. Relatórios anteriores indicam que estas mutações aumentam a sialilação de anticorpos, provavelmente para a obtenção de glicano mais acessível para a glicosol transferase, quando expressas em células de mamíferos. Para verificar isto, uma mancha de lectina foi realizada para determinar se a ligação de FA241 e FA243 a DC-SIGN é devida ao aumento de sialilação de proteínas transientemente expressas. Como mostrado na Figura 2B, manchas de SNA não detectaram resíduos de ácido siálico terminal em FA241 e FA243 purificados indicando que interação DC-SIGN foi independente de modificação do ácido siálico.

[00078] Mais especificamente, resíduos F241, F243, D265, e

R301 ao longo do suporte principal aminoácido de IgGl Fc foram substituídos por alanina para romper interações não covalentes com resíduos de oligosacarídeo. Fcs foram expressos e purificados de células 293T e analisados para atividade de ligação de DC-SIGN com ressonância de superfície de plasma como descrito acima. Foi encontrado Fcs em mutações que carregam FA241 ou FA243 exibindo aumento de afinidade para DC- SIGN relativo a medida de afinidade para sFc (Figura la). Manchas de lectinas com ECL (Figura lb, painel central) e SNA (painel superior) foram conduzidos para determinar radicais de açúcar terminal em Fcs purificado de células 293T. Como um controle positivo para sialilatada Fcs, FA241 foi sialilatada in vitro como descrito na Figura la. Controles de carga de manchas de coomassie mostrados no painel inferior da Figura lb.

Exemplo 4: Mutação FA241 em hlgGl Fc recapitulou atividade anti-inflamatória de .2,6 sFc

[00079] Se as mutações FA241 e FA243 simulam a atividade DC- SIGN de ligação de sFc, ensaios foram conduzidos para examinar se estas mutações poderiam replicar a atividade anti- inflamatória de sFc in vivo. Combinados por idade e sexo ratos SIGNR1-/- e hDC-SIGN+/SIGNR-/- foram infectados com soro artritogênico K/BxN e tratados com sFc, FA241, ou FA243 a uma dose efetiva de 0,033 g/kg. Consistente com resultados anteriores, sFc suprimiu inchação na parte inferior da pata em ratos DC-SIGN+, mas não em ratos SIGNRl-/-. Similarmente, FA241 demonstrou atividade comparável à anti-inflamatória daquelas com sFc em ratos hDC-SIGN+/SIGNRr-/-. Ratos administrados com FA243 não mostraram redução em inflamação nas juntas. Este resultado sugere que recombinante Fcs tendo uma mutação F241A

(FA241) restaura a ligação de DC-SIGN e a atividade anti- inflamatória de sFc na ausência de modificação de ácido siálico.

[00080] Como mostrado na Figura 3, ratos hDC-SIGN+/SIGNRl-/- (quadrados brancos) e SIGNR1-/- (quadrados pretos) foram administrados com 0,7 mg/rato de sFc, FA241, ou FA243 por injeção intravenosa. Os ratos foram subsequentemente infectados com soro K/BxN 1 hora depois. Inchação da parte inferior da pata foi monitorada e registrada ao longo de vários dias. Como anteriormente reportado, atividade anti- inflamatória de sFc é dependente de DC-SIGN- (painel esquerdo). FA241 também suprimiu inflamação artrítica em ratos K/BxN infectados de um modo dependente de DC-SIGN. FA243 não reduziu significantemente inchação da parte inferior da pata em 6 dias. Médias e erro padrão da média (Standard Error Mean - SEM) de pontuações clinicas de 4-5 ratos por grupo são plotados no Dia 6.

Exemplo 5: Caracterização de Requisitos para Atividade Anti-Inflamatória de FA241

[00081] Para identificar os fatores determinantes para a atividade anti-inflamatória de FA241, macrófagos derivados de medula óssea (ΒΜΜΦ) de ratos CDllc.DC-SIGN+ e SIGNR1-/- foram estimulados com FA241 ou outras preparações de Fc e transferidos para ratos WT C57BL/6 receptores infectados com soro K/BxN.

[00082] Resumidamente, macrófagos derivados de medula óssea de ratos CDl lc.DC-SIGN+ e SIGNR1-/- foram cultivados em IL-3 (5 ng/ml) e M-CSF (5 ng/ml) por 5-7 dias. como mostrado na Figura 4, DC-SIGN+ ΒΜΜΦ foram pulsado com 0,5 mg/ml asialilatada (barras pretas) ou sialilatada (barras brancas) glicoformas da indicada de preparações Fc. ΒΜΜΦ tratados com Fc foram transferidos para ratos WT C57BL/6 receptores seguido por -/- desafio de K/BxN. como mostrado na Figura 4b SIGNRl (barras + pretas) e DC-SIGN (barras brancas) ΒΜΜΦ foram pulsados com 0,5 mg/ml de indicada preparação de Fc e transferido para ratos WT C57BL/6 receptores seguido por desafio de K/BxN. Similarmente, DC-SIGN+ ΒΜΜΦ foram pulsados com 0,5 mg/ml de FA241 ou FA241 deglicosilatado (Figura 4c, barras brancas) ou PBS (Figura 4c, barra preta) e transferidos para os ratos receptores WT C57BL/6 seguidos por infecção por K/BxN. FA241 foi deglicosilatado com PNGase F e a remoção de glicano confirmada por manchas de lecitina. DC-SIGN+ ΒΜΜΦ foram pulsados com a indicada preparação de Fc asialilatada ou PBS (Figura 4d, círculo preto) e transferidos para ratos receptores WT C57BL/6 seguida por infecção de K/BxN. Em todos os casos, a inchação da parte inferior da pata foi monitorada e registrada ao longo de vários dias. Médias e erro padrão da média (Standard Error Mean - SEM) de pontuações clínicas de 4-5 ratos por grupo são plotados. *P < 0,05, como determinado por um teste de análise de variância (ANOVA), seguido por teste post hoc de Tukey.

[00083] Como mostrado na Figura 4A, não sialilatada ou sialilatada preparações de FA241 foram igualmente efetivos na supressão de inflamação nas juntas comparado para sFc. Preparações WT Fc embora, requereu ácido siálico ligado a .2,6 uma vez que DC-SIGN+ ΒΜΜΦ pulsado com asialilatada WT Fc não transferiu proteção para os ratos depositados.

[00084] Correspondendo com os resultados mostrado na Figura 3, ambos sFc e FA241 requereram expressão DC-SIGN em ΒΜΜΦ para transferir proteção (Figura 4B). Embora FA241 não requereu ácido siálico para transferir proteção, deglicosilação com

PNGase F anulando as propriedades anti-inflamatórias de FA241 (Figura 4C) sugerindo que o Fc glicano é ainda necessário. Além disso, para mostras que a observada atividade anti- + inflamatória é específica para a mutação F24iA, DC-SIGN ΒΜΜΦ foram pulsados com Fcs que produziram mutações alternativas que não conferiram aumento da ligação de DC-SIGN. Só ΒΜΜΦ estimulando FA241 protegeu rato depositado infectado com K/BxN.

Exemplo 6: Mutação FA241 Aumentada Ligação de Receptor Fc

[00085] Se uma substituição de alanina na posição 241 induz uma troca conformacional no Fc, então talvez a afinidade com relação aos receptores Fc humano será alterada. Foi anteriormente relatado que sialilação reduz a afinidade de IgGs para FcRs, consequentemente atenuando atividade ADCC in vivo.

[00086] Recombinante ligação de IgGl Fc's para FcRs solúvel foi medido por ressonância de superfície de plasma (Surface Plasmon Resonance - SPR). Fcs foram preparados da maneira como descrito acima. Os sensorgramas SPR para anticorpo ligando aos hFcRIIA131R e hFcRIIB imobilizados são mostrados na Figura 5 por glicoformas asialilatada e sialilatada de WT hlgGl Fc e por asialilatada FA241 Fc.

[00087] Como mostrado na Figure 5, glicoformas asialilatada de WT Fc ligando ao hFcRIIA e RIIB com um observado valor de KD de aproximadamente 2-3xl 0-5 M. O sFc, no entanto, não se torna visível para ligar hFcRIIA ou RIIB. Surpreendentemente, FA241 torna-se visível para ligar ambos hFcRIIA e RIIB com um grau de magnitude de maior afinidade (KD = ~2xl0"6 M).

Exemplo 7: Indução de IL-33 mRNA em Macrófagos Derivados de Medula Óssea por FA241

[00088] O SFc induziu uma via anti-inflamatória dependente de TH2, que requer a secreção de IL-4 a partir de uma população de leucócitos FcεRI+, possivelmente basófilos, para aumentar a regulação de FcRIIB em macrófagos de regulação. Administração de IL-33 in vivo ou in vitro estimula basófilos para liberar reserva de IL-4. A expressão de IL-33 mRNA tem a regulação aumentada em baço de ratos WT C57BL/6 tratado com sFc ou IVIG, mas não em ratos SIGNRl-/-. Isto sugere que sFc pode induzir expressão de IL-33 em células de SIGNR1-/- ou DC-SIGN+. Neste exemplo, ensaios foram conduzidos e mostrou que a estimulação de DC-SIGN+ ΒΜΜΦ com FA241 torna-se viável para aumentar a regulação da expressão da IL-33.

[00089] Mais especificamente, macrófagos derivados de medula óssea de ratos CD1 lc.DC-SIGN+ e SIGNRl-/- foram cultivados na maneira descrita cima. ΒΜΜΦ foram semeados em 12 placas de culturas em meio de soro livre de RPMI e permitiu a aderência durante a noite a 37°C. No dia seguinte, as células foram pulsadas com 0,5 mg/ml de indicado Fc meio de soro livre de RPMI por 1 hora (Figura 6a.) ou 4 horas (Figura 6b.) a 37°C. O mRNA foi coletado de células em pontos de tempo específicos e 1 μg total RNA usada para amplificação de IL-33 mRNA (painéis superiores). A amplificação de GAPDH serviu como um controle de carga (painéis inferiores). Co-expressão de plasmídeo DA265 Fc e humano sialiltransferase (ST6Gall) foram transfectadas em células 293T rendendo recombinante altamente sialilatada Fc (ST6-DA265).

[00090] Como mostrado na Figura 6, estimulação de DC-SIGN+ ΒΜΜΦ com FA241 tornou viável para aumentar a regulação da expressão IL-33. Apesar dos maiores níveis de expressão basal de IL-33 comparado com DC-SIGN+ ΒΜΜΦ, SIGNR1-/- ΒΜΜΦ regulando mais baixo a expressão IL-33 mRNA nas respostas ao tratamento FA241.

[00091] O exemplo precedente e a descrição das concretizações preferenciais devem ser tomadas como ilustrando e não como limitando a presente invenção, tal como definido pelas reivindicações. Todas as publicações citadas neste documento são deste modo incorporadas inteiramente por referência. Serão prontamente apreciadas, as numerosas variações e combinações das características acima definidas que podem ser utilizadas sem se afastarem da presente invenção conforme definido nas reivindicações. Tais variações não são consideradas como um afastamento do escopo da invenção, e todas essas variações são entendidas como inclusas no escopo das seguintes reivindicações.

Claims

- REIVINDICAÇÕES -

1. Polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência modificada que é pelo menos 75% idêntica para uma região IgG Fc, caracterizado por: a sequência modificada ser livre de sialilação e o polipeptídeo ter uma atividade anti-inflamatória que é maior que de um polipeptídeo original.

2. Polipeptídeo isolado da reivindicação 1, caracterizado por: o polipeptídeo original compreender a região IgG Fc.

3. Polipeptídeo isolado da reivindicação 1 ou 2, caracterizado por: a região IgG Fc compreender a sequência SEQ ID NO: 1.

4. Polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por: o polipeptídeo isolado ter uma habilidade para ligar- se ao DC-SIGN.

5. Polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por: o polipeptídeo isolado ter uma habilidade para ligar- se ao hFcγRIIA ou RIIB.

6. Polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado por: o polipeptídeo isolado ter uma habilidade para ligar- se ao hFcγRIIA ou RIIB em um KD de 2x10~5 M ou menor (isto é, em um KA de 5,0 x 104 M"1 ou maior).

7. Polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado por: a sequência modificada ter uma mutação FA241.

8. Polipeptídeo isolado de qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado por: a sequência modificada ser pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 2.

9. Polipeptídeo isolado da reivindicação 8, caracterizado por: a sequência modificada ser pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 2.

10. Polipeptídeo isolado da reivindicação 9, caracterizado por: a sequência modificada ser pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2.

11. Polipeptídeo isolado da reivindicação 10, caracterizado por: a sequência modificada ser pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2.

12. Polipeptídeo isolado da reivindicação 11, caracterizado por: a sequência modificada ser pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 2.

13. Polipeptídeo isolado da reivindicação 12, caracterizado por: a sequência modificada compreender a SEQ ID NO: 2.

14. Polipeptídeo isolado da reivindicação 9, caracterizado por: a sequência modificada consistir essencialmente da SEQ ID NO: 2.

15. Método para obter um polipeptídeo com uma atividade anti-inflamatória, caracterizado por: compreender as etapas de:

prover um polipeptídeo original tendo a sequência de uma região IgG Fc ou uma primeira sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo original; e modificar o polipeptídeo original para obter um polipeptídeo modificado tal que o mesmo seja livre de sialilação e simule a estrutura de uma forma sialilada da região IgG Fc.

16. Método da reivindicação 15, caracterizado por: a etapa de modificação ser conduzida através da modificação da primeira sequência de ácido nucleico para obter um segundo ácido nucleico codificando o polipeptídeo modificado.

17. Polipeptídeo caracterizado por: ser obtido pelo método das reivindicações 15 ou 16.

18. Ácido nucleico isolado caracterizado por: compreender uma sequência codificando o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1-14 e 17.

19. Vetor de expressão caracterizado por: compreender um ácido nucleico da reivindicação 18.

20. Célula hospedeira caracterizada por: compreender um ácido nucleico da reivindicação 18.

21. Método de produção de um polipeptídeo, caracterizado por: compreender as etapas de: cultura de célula hospedeira da reivindicação 20 em um meio sob condições que permita a expressão de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, e a purificação do polipeptídeo da cultura da célula ou do meio da célula.

22. Formulação farmacêutica caracterizada por: compreender:

(i) um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1-14 e 17 ou um ácido nucleico da reivindicação 18, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

23. Método de tratamento de uma doença inflamatória, caracterizado por: compreender a administração em um indivíduo com necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1-14 e 17, ou um ácido nuclcico que codifica o polipeptídeo.

24. Polipeptídeo isolado, ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, ou composição substancialmente como mostrado e descrito neste documento.

25. Método para tratar uma doença inflamatória substancialmente como mostrado e descrito neste documento.

26. Uso de um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1-14 e 17 ou um ácido nucléico da reivindicação 18 na fabricação de um medicamento para tratamento de doença inflamatória.