PT1696935E - Novos derivados da morfina-6-gluctjronida, composições farmacêuticas que os contem, processo para a sua preparação e suas utilizações. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"NOVOS DERIVADOS DA MORFINA-6-GLUCURONIDA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUAS UTILIZAÇÕES" A presente invenção tem por objecto novos derivados da morfina β-glucuronida, o processo para a sua preparação, assim como as suas utilizações em terapia, nomeadamente como analgésicos. A morfina é actualmente o analgésico mais utilizado no tratamento de dores de média e grande intensidade. Ao nivel do sistema nervoso central, distinguem-se três classes principais de receptores opióides: μ (miu), k (kapa) e δ (delta). A morfina, tal como os outros opióides, produzem os seus principais efeitos sobre o sistema nervoso central e sobre o sistema digestivo, por intermédio dos receptores μ-opióides. Existem dois subtipos de receptores μ: o tipo μ-l, de afinidade muito alta e fraca capacidade, e o tipo μ-2, de baixa afinidade e forte capacidade (Pasternak & Wood, 1986. Life Sei 38: 1889-1898). A ligação aos receptores μΐ provoca uma reacção analgésica de tipo supraespinal e a diminuição da renovação da acetilcolina, enquanto a ligação aos receptores μ2 provoca uma reacção analgésica de tipo espinal e é responsável pela depressão respiratória e pela inibição do trânsito intestinal.

Os mecanismos pelos quais a morfina exerce a sua acção analgésica não estão ainda completamente esclarecidos. Sabe-se que sofre um importante metabolismo, que conduz a metabolitos, alguns dos quais contribuem para a sua acção analgésica. 0 figado aparece como o sítio principal da sua biotransformação. A morfina sofre principalmente uma 2 glucuronidação enântio-selectiva catalisada pela UDP-glucuroniltransferase (UGT), que conduz à formação de dois metabolitos: a morfina-3-glucuronida (a seguir designada por "M3G") e a morfina-6-glucuronida (a seguir igualmente designada por "M6G").

Foi demonstrado que a modificação da posição 3-hidroxi da morfina diminuía a actividade analgésica, ao passo que as modificações da posição 6-hidroxi podem, pelo contrário, aumentar a actividade analgésica (Aderjan & Skopp, 1998, Therapeutic Drug Monitoring 20: 561-569).

Assim, a M3G não tem afinidade para os receptores opióides e não participa na actividade analgésica da morfina.

Pelo contrário, a morfina-6-glucuronida tem uma grande afinidade para os receptores opióides e foi demonstrado que tem um efeito analgésico, tanto nos roedores como no homem. A M6G foi descrita como sendo um analgésico mais potente que a própria morfina após uma administração central (Paul et al., 1989, J. Pharmacol. Exp. Ther. 49; 6280-6284; Francês et al., 1992, J. Pharmacol. Exp. Ther. 262; 25-31) e tendo a mesma actividade por via sistémica. Estudos de ligação ligante-receptor aos opiáceos realizados in vitro mostraram que a M6G se ligava aos receptores opióides e que tinha de 1 a 5 vezes menos afinidade para os receptores μ que a morfina (Christensen & Jorgensen 1987. Pharmacol. toxicol. 60: 75-76; Francês et al., 1992 J. Pharmacol. Exp. Ther. 262; 25-31).

Outros metabolitos da morfina, em particular a normorfina, mostraram uma certa actividade analgésica. No entanto, estes outros metabolitos estão presentes em fracas 3 concentrações e não são susceptíveis de contribuir de maneira significativa para o efeito global da morfina.

Todavia, apesar da sua grande eficácia, o tratamento da dor pela morfina é acompanhada por efeitos secundários indesejáveis, tais como: depressão respiratória, inibição do trânsito intestinal, náuseas, vómitos, e sobretudo síndroma de dependência e indução de tolerância.

Procurou-se, portanto, preparar outras substâncias activas, apresentando uma eficácia analgésica comparável à morfina, mas não tendo todos ou parte dos seus efeitos secundários indesejáveis.

Bem entendido, por causa da sua actividade analgésica exposta mais acima, propôs-se utilizar a M6G como substituto da morfina.

Pode-se, para este efeito, fazer referência ao pedido internacional WO 95/05831, visando a utilização de uma composição farmacêutica para administração oral, contendo a M6G, para o tratamento da dor. O pedido internacional WO 99/64430 descreve um processo para a síntese da M6G e dos seus intermediários. A patente US 5 621 087 descreve um novo processo para a preparação da M6G ou de alguns dos seus derivados. A M6G, que, como se viu, apresenta propriedades analgésicas comparáveis à morfina, tem como vantagem diminuir as náuseas e os vómitos. Todavia, a M6G não contribui para a supressão de outros efeitos indesejáveis da morfina, nomeadamente, a depressão respiratória e o síndroma de dependência (Osborne et al., 1992. Br. J. Clin. 4

Pharmac 34: 130-138). As patentes FR 2821272, e EP 0816375 descrevem igualmente derivados da M6G como analgésicos. A patente US 6 150 524 descreve processos para a síntese de outros derivados da morfina, que são tidos como apresentando propriedades analgésicas fortes e que podem ser administrados por via oral. É igualmente sabido que a associação de um composto que se liga aos receptores μ e de um composto que se liga aos receptores k, apresenta um efeito analgésico poderoso, sem os efeitos secundários de dependência física e de depressão respiratória (Rothman et al., 2000; J. Subst Abuse Treat 19: 277-281; Shook et al., 1990 Am Rev Respir Dis 142: 895-909.

No entanto, tanto quanto é do conhecimento dos inventores, não existe qualquer analgésico com uma eficácia comparável à da morfina ou da M6G, mas que não apresente, ou apresente menos, efeitos secundários, nomeadamente no que se refere à dependência física e à depressão respiratória. A presente invenção tem, assim, por principal objecto novos compostos, derivados da M6G, que permitem resolver este problema. Mais particularmente, os compostos da invenção apresentam a vantagem de possuir uma afinidade para os receptores k maior que a M6G, sem no entanto apresentar uma afinidade reduzida para os receptores μ, a fim de se obter um composto tendo uma actividade analgésica poderosa mas menos efeitos secundários.

No âmbito dos seus trabalhos de pesquisa, os inventores puderam assim determinar que a modificação da 5 M6G por substituição com o auxilio de um grupo portador de uma função tiol ou de um átomo de enxofre, permite aumentar de modo significativo a afinidade para os receptores k, sem no entanto diminuir a dos receptores μ. A invenção refere-se, assim, a um composto de fórmula (A) : CHL I 3

na gual: o conjunto da entidade acima, à excepção do substituinte X, é denominado M6G-N(R2) Ri-S-;

Ri representa um grupo alquilo linear ou ramificado em Ci-Cio, não substituído ou substituído pelo menos por um substituinte, estando a cadeia de alquilo eventualmente interrompida por um ou vários heteroátomos escolhidos entre 0, S e N; R2 representa o hidrogénio, um grupo alquilo linear ou ramificado em Ci-C5 ou um grupo arilo, heteroarilo ou (Ci— C5)-alquilarilo, não substituído ou substituído por um alquilo em C1-C4; X representa o hidrogénio, um resíduo M6G-N (R2) Ri-S- ou um polímero ligado ao resto da entidade por um braço separador; 6 - os carbonos assimétricos presentes na fórmula (A) podem ter configuração R ou S.

Quando Ri representa um grupo alquilo substituído por um ou vários substituintes, o (ou os) substituintes são escolhidos, por exemplo, entre: um grupo alquilo em C1-C5; um grupo amino; um grupo COOR3; um grupo CONR3R4, representando R3 e R4 nos grupos COOR3 ou CONR3R4, independentemente, o hidrogénio, um grupo alquilo em Cl_C20 eventualmente substituído, arilo, heteroarilo ou alquilarilo; uma cetona em Ci-C2tu de preferência em C1-C10; um aldeído em C1-C20; de preferência em C1-C10.

Quando R2 representa um grupo arilo ou heteroarilo monocíclico, este pode ser escolhido, por exemplo, entre os grupos fenilo, tiofenilo, piridilo, pirrolilo, pirazolilo, furanilo, ou indolilo. Quando R2 representa um grupo alquilarilo, este pode ser, por exemplo, o benzilo. São compostos preferidos para os fins da invenção os compostos de fórmula (A) , na qual Ri representa um grupo alquilo linear ou ramificado em C1-C10, em particular metilo, etilo, propilo ou butilo, não substituído ou substituído pelo menos por um substituinte, estando a cadeia alquilo eventualmente interrompida por um ou vários heteroátomos escolhidos entre 0, S e N, R2 representa 0 hidrogénio e X representa o hidrogénio.

Entre estes, é preferido o composto de fórmula (A) na qual Ri representa -(CH2)2, R2 é o hidrogénio e X é o hidrogénio. Um composto deste tipo, representado na estrutura (I) abaixo, é designado M6G-cisteamida. 7 ÇH3

São compostos preferidos aqueles nos quais X representa um resíduo M6G-N(R2) Ri-S-. Neste caso, a estrutura (A) corresponde à forma oxidada da estrutura (A) inicial, e encontra-se neste caso sob a forma de dímero.

Os dois resíduos M6G-N (R2) Ri-S-, constituindo os compostos de fórmula (A) sob a forma de dímero, podem ser idênticos ou diferentes. São composições deste tipo particularmente vantajosas aquelas nas quais os dois resíduos M6G-N (R2) Ri-S- são idênticos, e os compostos dímeros têm uma estrutura simétrica.

Foi demonstrado na literatura que as ligações dissulfureto, relativamente estáveis no plasma, podem ser clivadas no interior das células para retomarem uma função tiol, e por isso poderia permitir melhorar as propriedades das moléculas activas in vivo (G. Saito et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55, 199-215) . São composições preferidas de acordo com a invenção os compostos de fórmula (A) na qual Ri é tal como foi definido 8 mais acima, R2 é o hidrogénio e X é um resíduo M6G-N(R2)Ri_ S- tal como foi definido mais acima.

Um composto preferido de fórmula (A) na qual Ri representa -(CH2)2r R2 é o hidrogénio e X é um resíduo M6G-N(R2)Ri-S- no qual Ri = (CH2)2 e R2 é o hidrogénio, representado na estrutura (II) abaixo, é designado M6G-Cia-Cia-M6G. 0 composto (II) é a forma oxidada, portanto, dimerizada, do composto (I).

Outros compostos vantajosos de fórmula (A) são, por exemplo, aqueles nos quais:

Ri representa um grupo -CH(C00R3) -CH2- no qual R3 representa o hidrogénio ou um alquilo, em particular metilo, etilo, propilo ou butilo, R2 representa o hidrogénio e X representa o hidrogénio ou um resíduo M6G-N(R2) Ri-S- no qual Ri = -CH (COOR3) -CH2-, no qual R3 é tal como foi definido acima e R2 é o hidrogénio;

Ri representa um grupo -CH (CONR3R4)-CH2- na qual R3 e R4 representam o hidrogénio ou um alquilo, em particular metilo, etilo, propilo ou butilo, R2 representa o hidrogénio e X representa o hidrogénio ou um resíduo M6G-N(R2)Ri-S- no qual Ri = -CH (CONR3R4) -CH2- no qual R3 e R4 são tal como foram definidos acima e R2 é 0 hidrogénio;

Ri representa um grupo -CH (C00R3) -C (CH3) 2- no qual R3 representa o hidrogénio ou um alquilo, em particular 9 metilo, etilo, propilo ou butilo, R2 representa o hidrogénio e X representa o hidrogénio ou um resíduo M6G-N(R2)Ri-S- no qual Ri = -CH (COOR3) -C (CH3) 2- no qual R3 é tal como foi definido acima e R2 é o hidrogénio; - Ri representa um grupo -CH (COOR3) - (CH2) 2_C (0) NHCH (R5) -CH2-, no qual R3 representa o hidrogénio ou um alquilo, em particular metilo, etilo, propilo ou butilo, R5 representa -C (0)-NH-CH2-COOR3 no qual R3 é tal como foi definido acima, R2 representa o hidrogénio e X representa o hidrogénio ou um resíduo M6G-N (R2) Ri-S- no qual Ri = -CH (COOR3) - (CH2) 2_ C (0) NHCH (R5) -CH2- no qual R3 e R5 são tal como foram definidos acima e R2 representa o hidrogénio.

Outros compostos interessantes são aqueles nos quais X representa um polímero ligado ao resto da entidade por um braço separador.

Com efeito, mostrou-se na literatura que a conjugação de uma molécula orgânica de interesse biológico com um poli(etileno-glicol) permitia aumentar a semi-vida plasmática desta molécula (R. B. Greenwald et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55, 217-250).

Será, de preferência, utilizado um braço separador tendo a fórmula S- (CH2) n-NH-C (O) - na qual n = 0 a 4, de preferência 2.

Podem-se utilizar, igualmente, outros tipos de braços separadores, tais como, por exemplo, um radical orgânico bivalente, escolhido entre os grupos alquileno lineares ou ramificados em Ci-C2o, contendo eventualmente uma ou várias duplas ligações ou triplas ligações e/ou contendo eventualmente um ou vários heteroátomos, tais como 0, N, S, P, ou um ou vários grupos carbamoilo ou carboxamido; os grupos cicloalquileno em C5-Cs e os grupos arileno em C6- 10 C14, estando os referidos grupos alquileno, cicloalquileno ou arileno eventualmente substituídos por grupos alquilo, arilo ou sulfonato.

Entre os compostos nos quais X representa um polímero ligado ao resto da entidade por um braço separador, são compostos preferidos de acordo com a invenção os compostos de fórmula (A) nos quais Ri representa um grupo -(CH2)2-, R2 representa o hidrogénio e X representa um polímero ligado ao resto da entidade por um braço separador de fórmula -S-(CH2) n-NH-C (O) - no qual n = 0 a 4, de preferência 2, e o referido polímero é um poli(etileno-glicol) (igualmente denominado PEG) de peso molecular (Mw) superior ou igual a 10000.

De acordo com um aspecto posterior, a invenção refere-se, igualmente, a um processo para a preparação dos compostos de fórmula (A). O referido processo compreende os passos que consistem em se fazer reagir a morfina-6-glucuronida com um composto de fórmula (III) NRH2-Ri-S-S-Ri-NHR2, na qual Ri e R2 são tal como foram definidos acima, na presença de um agente de acoplamento, e em se reduzir in situ a ponte de dissulfureto com o auxílio de um agente redutor, se necessário (quer dizer, quando X = H na fórmula (A)). A reacção da morfina-6-glucuromida com o composto de fórmula (III) tem lugar, de preferência, em meio básico.

Para a preparação dos compostos de fórmulas (I) ou (II) será utilizado, por exemplo, um composto de fórmula (III) na qual R2 é o hidrogénio e Ri representa um grupo -(CH2)2-, denominado cistamina. 11 A titulo de agente de acoplamento, podem citar-se os agentes de acoplamento habitualmente utilizados em síntese peptídica, tais como o hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio (PyBOP), a diciclohexil-carbo-diimida (DCC), a DCC associada ao hidrobenzotriazol (DCC/HOBT) ou a diisopropilcarbodiimida associada ao HOBT (DIPCDI/HOBT). O agente de acoplamento será utilizado de preferência em excesso molar de cerca de 1,1 a 4 equivalentes molares para 1 equivalente molar do composto de fórmula (III). 0 acoplamento é realizado, de preferência, à temperatura ambiente, num solvente polar, tal como, por exemplo, a dimetilformamida (DMF), a N-metilpirrolidona (NMP), o dicloro-metano ou o acetonitrilo. A titulo de agente redutor, podem citar-se, por exemplo, a tris(2-carboxietil)-fosfina, a trifenilfosfina, a tris-(hidroximetil)-fosfina ou o ditiotreitol. 0 agente redutor será utilizado de preferência em excesso molar de cerca de 1,1 a 5 equivalentes. A redução tem lugar, de preferência, à temperatura ambiente e a um pH inferior a 7.

De acordo com um outro aspecto da invenção, o composto de fórmula (A) na qual X = H pode ser obtido por um processo compreendendo os passos que consistem em se fazer reagir a morfina-6-glucuronida com um composto de fórmula (IV) NHR2-Ri-SH, na qual Ri e R2 são tal como foram definidos acima, na presença de um agente de acoplamento, e 12 em se reduzirem in situ os sub-produtos de oxidação com o auxilio de um agente redutor. A reacção da morfina -6-glucuronida com o composto de fórmula (IV) tem lugar, de preferência, em meio básico.

Pode utilizar-se, nomeadamente, um composto de fórmula (IV) na qual R2 é o hidrogénio e Ri representa um grupo -(CH2)2-, denominado cisteamina. A titulo de exemplo de compostos de fórmula (IV), pode igualmente citar-se o éster metilico da cisteina, a penicilamina ou a glutationa. A titulo de agente de acoplamento, podem-se utilizar os agentes de acoplamento habitualmente utilizados em sínteses peptídicas, tais como os citados acima. 0 agente de acoplamento será utilizado de preferência em excesso molar de cerca de 1,1 a 2 equivalentes molares por 1 equivalente molar de morfina-6-glucuronida. 0 acoplamento é de preferência realizado à temperatura ambiente, num solvente polar, tal como, por exemplo, a dimetilformamida (DMF), a N-metilpirrolidona (NMP), o dicloro-metano ou o acetonitrilo. 0 agente redutor pode ser escolhido entre os agentes redutores habitualmente utilizados na química peptídica, tais como os citados acima. 0 agente redutor será utilizado, de preferência, numa quantidade de cerca de 0,5 a 5 equivalentes molares. A redução tem lugar, de preferência, à temperatura ambiente e a um pH inferior a 7. 13 A invenção refere-se igualmente a uma composição farmacêutica contendo, a titulo de principio activo, um composto de fórmula (A), tal como foi descrito acima, ou um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Por "sal farmaceuticamente aceitável", entende-se, por exemplo, e de maneira não limitativa, um acetato, um sulfato ou um cloridrato. A composição farmacêutica de acordo com a invenção poderá apresentar-se, vantajosamente, sob uma forma apropriada para uma administração: por via parentérica, como, por exemplo, sob a forma de preparações injectáveis por via subcutânea, intravenosa ou intramuscular, por via oral, como, por exemplo, sob a forma de comprimidos revestidos ou não, cápsulas, pós, granulados, suspensões ou soluções orais. Uma forma deste tipo para administração por via oral pode ser quer de libertação imediata, quer de libertação prolongada ou retardada. As referidas formas de libertação prolongada ou retardada são descritas, por exemplo, nos pedidos EP 253 104 ou EP 576 643; por via rectal, como, por exemplo, sob a forma de supositórios; por via tópica, nomeadamente transcutânea, como, por exemplo, sob a forma de "patch" [emplastro], de pomada ou de gel, por via intranasal, como, por exemplo, aerossóis ou "sprays", por via perlingual, por via intraocular. 14 0 veiculo farmaceuticamente aceitável pode ser escolhido entre os veiculos utilizados de maneira clássica, de acordo com cada um dos modos de utilização. A invenção refere-se igualmente à utilização de um composto de fórmula (A), ou de um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para a fabricação de um medicamento útil para o tratamento da dor, em particular para o tratamento de dores agudas ou de dores crónicas, de dores neuropáticas, musculares ósseas, pós-operatórias, enxaqueca, dores do cancro, lombalgias, dores artrósicas, dores associadas à diabetes ou dores associada à SIDA. A invenção é ilustrada de maneira não limitativa pelos exemplos abaixo.

Exemplos: A. Sínteses

As reacções foram seguidas por cromatografia liquida alta de pressão (HPLC) analítica em fase inversa e por espectrometria de massa (MS). As purezas e a identidade dos compostos obtidos são confirmadas por HPLC analítica em fase inversa e por espectrometria de massa. As diferentes vias de síntese são realizadas de acordo com o esquema representado na figura 1. As estruturas dos compostos sintetizados estão representadas nas figuras 1 a 3.

Exemplo 1: síntese da M6G-cisteamida

As diferentes vias de síntese são realizadas de acordo com o esquema representado na figura 1. Síntese por acoplamento com a cisteamina 15

Num reactor (tubo falcon) introduziram-se 4 equivalentes molares de cisteamina, sob a sua forma de cloridrato, em dimetilformamida (DMF) a 200 g/1 e 4 equivalentes molares de diisopropiletilamina (DIEA). Adicionou-se 1 equivalente molar de M6G em pó, 1,2 equivalentes molares de hexafluorfosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio (PyBOP), previamente solubilizado em DMF a 680 g/1, e em seguida verificou-se se o pH estava sempre básico. Deixou-se reagir durante 3 horas sob agitação à temperatura ambiente.

Reduziu-se então a ponte de dissulfureto dos subprodutos de oxidação gerados aquando do acoplamento em meio básico, pela tris-(2-carboxietil)-fosfina sob a sua forma de cloridrato (TCEP) (0,72 equivalentes molares) a 150 g/1 numa mistura de (acetonitrilo/H20 (50/50), ácido trifluor-acético a 0,1%). Após 12 horas de reacção sob agitação, o produto bruto é então purificado por HPLC preparativa.

Obtém-se, após a liofilização o produto M6G-cisteamida: [M+H]+ = 521,4 - MsaiTFA = 634 - Rdt = 66% -pureza 95%. Síntese por acoplamento com a cistamina

Num reactor (tubo Falcon) introduziram-se 2 equivalentes molares de cistamina sob a sua forma de cloridrato em DMF a 30 g/1, em seguida adicionou-se 1 equivalente molar de M6G dihidrato e 4 equivalentes molares de DIEA. Verificou-se se o pH era básico (á 9) . Adicionaram-se gota a gota, arrefecendo num banho de gelo, 1,2 equivalentes molares de PyBOP previamente solubilizado em DMF a 230 g/1. Deixou-se reagir durante 3 horas sob agitação. Reduziu-se então a ponte de dissulfureto por meio 16 da tris-(2-carboxietil)-fosfina (2,5 equivalentes molares) a 215 g/1 em (H2O ácido trifluoracético a 0,1%). Após 30 minutos de reacção sob agitação, o produto bruto foi então purificado por HPLC preparativa. Obtém-se, após a liofilização, o produto M6G-cisteamida [M+H]+ = 521,2 -

MsaiTFA = 634 - Rdt = 93% - pureza 98%.

Exemplo 2: Síntese da M6G-Cia-Cia-M6G

As diferentes vias de síntese são realizadas de acordo com o esquema representado na figura 1. Síntese por acoplamento com a cistamina

Num reactor (tubo falcon) solubilizou-se 1 equivalente molar de cistamina sob a sua forma de cloridrato em DMF a 15 g/1, em seguida adicionaram-se 5 equivalentes molares de DIEA e 2 equivalentes molares de M6G dihidrato. Adicionaram-se gota a gota, arrefecendo num banho de gelo, 2,4 equivalentes molares de PyBOP previamente solubilizado em DMF a 230 g/1. Deixou-se reagir durante 12 horas sob agitação. O produto bruto é purificado por HPLC. Obtém-se, após a liofilização, o produto M6G-Cia-Cia-M6G: [M+H]+ = 1035, 7 - MgaiTFA = 1266 - Rdt = 80% - pureza 98%. Síntese por oxidação da M6G-cisteamida

Num reactor (tubo falcon) solubilizou-se a M6G-cisteamida numa solução de (sulfóxido de dimetilo 20% -tampão aquoso tris 200 mM, pH = 8) a 90 g/1, em seguida deixou-se reagir durante 48 horas sob agitação. O produto bruto é purificado por HPLC.

Obteve-se, após a liofilização, o produto M6G-Cia-Cia-M6G: [M+H]+ = 1040,1 - MsaiTFA = 1266 - Rdt = 95% - pureza 99%. 17

Exemplo 3: Síntese da M6G-Cia-Cia-PEG20000 Acoplamento com a cistamina A síntese da M6G-Cia-Cia é realizada de acordo com o esquema 1. Num reactor (tubo falcon) introduziram-se 12 equivalentes molares de cistamina sob a sua forma de cloridrato em DMF a 65 g/1, em seguida adicionaram-se 10 equivalentes molares de DIEA e 1 equivalente molar de M6G dihidrato. Adicionaram-se 1,05 equivalentes molares de PyBOP e agitou-se vigorosamente durante 5 minutos. Deixou-se reagir durante 1 hora sob agitação. O produto bruto é purificado por HPLC. Obteve-se, após a liofilização, o produto M6G-Cia-Cia: [M+H]+ = 596, 3 - M3aiTFA = 823 - Rdt = 69% - pureza 98%.

Acoplamento com o PEG 20000

Num balão introduziu-se 1 equivalente molar de polietileno-glicol 20000 em tolueno a 20 g/1, em seguida adicionaram-se 23 equivalentes molares de cloroformato de 4-nitrofenilo e DIEA. Aqueceu-se durante 12 horas a 55°C. O produto bruto é purificado por cristalização em diclorometano/éter dietilico. Obteve-se o carbonato de 4-nitrofenil-PEG com um rendimento da ordem de 95%. Num balão, introduziu-se 1 equivalente molar de carbonato de 4-nitrofenil-PEG em diclorometano a 250 g/1, em seguida adicionaram-se 2 equivalentes molares de M6G-Cia-Cia em DMF a 40 g/1 e 5 equivalentes molares de DIEA. Agitou-se durante 12 horas, precipitou-se o produto bruto com éter dietilico e em seguida purificou-se por cristalização em diclorometano/éter dietilico.

Obteve-se o M6G-Cia-Cia-PEG20000 com um rendimento da ordem de 85%.

Exemplo 4: síntese da M6G-cys-OEt 18

Num reactor (tubo falcon) introduziram-se 4 equivalentes molares de éster etílico de cisteína sob a sua forma de cloridrato em DMF a 100 g/1 e 4 equivalentes molares de DIEA. Adicionou-se 1 equivalente molar de M6G em pó, 1,05 equivalentes molares de PyBOP previamente solubilizado em DMF a 109 g/1. Deixou-se reagir durante 2 horas sob agitação.

Reduziu-se então a ponte de dissulfureto dos subprodutos de oxidação, gerados aquando do acoplamento em meio básico, por meio de 2 equivalentes molares de TCEP a 30 g/1 numa mistura de (acetonitrilo/H20 - ácido trifluoracético a 0,1% 1/1). Após 1 noite de reacção sob agitação, o produto bruto é então purificado por HPLC preparativa.

Obtém-se, após a liofilização, o produto M6G-cys-OEt: [M+H]+ = 593, 5 - MsaiTFA = 706 - Rdt = 87% - pureza 98%.

Exemplo 5: Síntese da M6G-cys-DEA

Num reactor (tubo falcon) introduziu-se 1 equivalente molar de dietilamida de cisteína sob a sua forma trifluoracetato em DMF a 77 g/1 e 4 equivalentes molares de DIEA. Adicionou-se 1 equivalente molar de M6G dihidrato em pó, em seguida 1,05 equivalentes molares de PyBOP. Deixou-se reagir durante 1 hora sob agitação.

Reduziu-se então a ponte de dissulfureto dos subprodutos de oxidação por meio de 2 equivalentes molares de TCEP a 30 g/1 numa mistura (H20-ácido trifluoracético a 0,1%). Após 1 hora de reacção sob agitação, o produto bruto é purificado por HPLC preparativa. Obtém-se, após a liofilização, o produto M6G-cys-DEA: [M+H]+ = 620,2 - MsaiTFA = 733 - Rdt = 93% - pureza 98%. 19

Exemplo 6: síntese de M6G-glu-S-S-glu-M6G

Esterificação das funções ácidas da glutationa:

Num reactor (reactor Wheaton) introduziu-se 1 equivalente molar de glutationa oxidada em metanol a 100 g/1 e 0,1 equivalente molar de ácido sulfúrico. Aqueceu-se o meio reactivo a 80°C, sob agitação, durante 4 horas, em seguida a agitação é mantida 15 horas à temperatura ambiente e o meio é de novo aquecido a 80°C durante 6 horas. O produto bruto é então purificado por HPLC preparativa.

Obtém-se, após a liofilização, a glutationa oxidada esterificada: [M+H]+ = 669 - MsaiTFA = 896 - Rdt = 17% - pureza 76%.

Acoplamento da M6G:

Num reactor (reactor Wheaton) 2 equivalentes molares de M6G dihidrato em pó são postos em suspensão em DMF a 93 g/1. Adiciona-se 1 equivalente molar de glutationa oxidada esterificada, 2 equivalentes molares de PyBOP e 4 equivalentes molares de DIEA. Deixa-se reagir 5 horas sob agitação à temperatura ambiente. O meio reactivo é então purificado por HPLC preparativa.

Após a liofilização obtém-se o dimero M6G-glu-S-S-glu- M6G: [M+H]+ = 1555 - MgaiTFA = 1782 - pureza 91%.

Exemplo 7: síntese da M6G-glu-SH

Redução do dimero M6G-glu-S-S-glu-M6G:

Num reactor (tubo falcon) introduziram-se 1 equivalente molar do dimero M6G-glu-S-S-glu-M6G e 3 equivalentes molares de TCEP a 88 g/1 de uma mistura 20 acetonitrilo/H20 (50/50), ácido trifluoracético a 0,1%. Deixa-se reagir 5 horas sob agitação à temperatura ambiente. O bruto reactivo é então purificado por HPLC preparativa. Após a liofilização, obtém-se o produto M6G-glu-SH: [M+H]+ = 779 - MsaiTFA = 892 - Rdt = 100% - pureza 95%.

Exemplo 8: síntese de M6G- (cys-NBu2) -S-S- (cys-NBu2) -M6G

Acoplamento da (Boc-cys-OH)2 com a di-n-butilamina:

Num reactor (tubo falcon) introduz-se 1 equivalente molar de (Boc-cys-OH) 2 em DMF a 105 g/1, 2,2 equivalentes molares de di-n-butilamina, 2,2 equivalentes molares de hexafluorfosfato de 2-(l-H-9-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (HATU) e 2,2 equivalentes molares de DIEA. Deixa-se reagir 60 minutos sob agitação à temperatura ambiente. O grupo protector t-butoxicarbonilo é clivado com uma mistura de ácido trifluoracético/triisopropilsilano (94/6) a 26 g/1. Deixa-se sob agitação durante 3 horas à temperatura ambiente. O meio é então diluido numa mistura de acetonitrilo/H20 (50/50) e é liofilizado e em seguida purificado por HPLC preparativa.

Após a liofilização, obtém-se o produto (H-Cys-Nbu2) 2: [M+H]+ = 4 63 - MgaiTFA = 690 - Rdt = 83% - pureza 98%.

Acoplamento da M6G:

Num reactor introduzem-se 2 equivalentes molares de M6G dihidrato em DMF a 99 g/1. Adicionam-se 1 equivalente molar do produto (H-Cys-NBu2) 2, 4 equivalentes molares de DIEA e 2 equivalentes molares de PyBOP. Deixa-se sob agitação à temperatura ambiente durante 1 hora. O produto bruto é então purificado por HPLC preparativa. Após a liofilização obtém-se o dimero M6G-(cys-NBu2)-S-S-(cys- 21 NBu2)-M6G: [M+H]+ = 1349 - M3aiTFA = 1576 - Rdt = 36% -pureza 90%.

Exemplo 9: síntese da M6G-(cys-NBu2) -SH

Redução do dímero M6G- (cys-NBu2) -S-S- (cys-NBu2) -M6G:

Num reactor (tubo falcon) introduziram-se 1 equivalente molar de M6G-(cys-NBu2) -S-S-(cys-NBu2) -M6G e 3 equivalentes molares de TCEP a 85 g/1 de uma mistura de acetonitrilo/H20 (50/50), ácido trifluoracético a 0,1%.

Após 4 horas de reacção sob agitação à temperatura ambiente, o produto bruto reactivo é purificado por HPLC preparativa.

Após a liofilização, obtém-se o produto M6G-(cys-NBu2)-SH: [M+H]+ = 676 - MsaiTFA = 789 - Rdt = 85,8% - pureza 93%.

Exemplo 10: síntese da M6G-cys-OMe

Num reactor (tubo falcon) introduzem-se 2 equivalentes molares de éster dimetilico de cistina sob a forma de cloridrato em DMF a 68 g/1 e 4 equivalentes molares de DIEA. Deixa-se sob agitação durante 2 horas à temperatura ambiente. Adiciona-se 1 equivalente molar de M6G dihidrato em pó e 1,2 equivalentes molares de PyBOP. Deixa-se reagir durante 3 horas sob agitação à temperatura ambiente. Reduz-se então a ponte de dissulfureto por meio de 2 equivalentes molares de TCEP a 11,5 g/1 numa mistura H20/ácido trifluoracético a 0,1%. Deixa-se agitar uma noite à temperatura ambiente. O produto bruto é purificado por HPLC preparativa. 22

Obtém-se, após a liofilização, o produto M6G-cys-0Me: [M+H]+ = 579 - MsaiTFA = 692 - Rdt = 83% - pureza 98%.

Exemplo 11: síntese da M6G-cys-OH

Num reactor introduzem-se 1 equivalente molar de M6G-cys-OMe em água a 69 g/1 e 3 equivalentes molares de hidróxido de litio. Deixa-se reagir sob agitação à temperatura ambiente durante 1 noite.

Reduz-se a ponte de dissulfureto do subproduto de oxidação por meio de 3 equivalentes molares de TCEP a 30 g/1 numa mistura de H20/ácido trifluoracético a 0,1%. Deixa-se sob agitação durante 30 minutos à temperatura ambiente. O produto bruto é então purificado por HPLC preparativa.

Após a liofilização obtém-se o produto M6G-cys-OH: [M+H]+ = 565 - MgaiTFA = 678 - Rdt = 42% - Pureza 98%. B: Estudo do efeito analgésico

Para este estudo, utilizou-se o teste designado por "tail flick".

Este teste consiste em colocar a cauda de um rato diante de uma fonte de infra-vermelhos num dado momento após a administração do produto testado, tomado como tempo 0. A luz é focalizada para a superfície ventral da cauda, de maneira a produzir uma temperatura de superfície de 55°C. Mede-se então o tempo de latência (tempo de reacção) entre a administração do produto testado e o momento em que o rato mexe a cauda.

Os compostos estudados, nomeadamente a M6G, a morfina e os derivados de acordo com a invenção foram administrados por via intravenosa em doses de 0,25 a 5 mg/kg equivalentes 23 (5 a 10 ratos por grupo). Foram feitas três medições antes da administração do produto testado, para se ter um tempo de base. O tempo de latência para um mesmo rato foi medido em diferentes instantes, variando de 15 minutos a 360 minutos após a injecção do produto. Foi escolhido um tempo máximo de 10 s como tempo máximo de reacção.

Os resultados obtidos estão representados pelas curvas das figuras 4 a 12, nas quais figuram em abcissa, o tempo de medição (minutos), e em ordenada, o tempo de reacção (s) . As doses de produtos testados estão expressas em mg equivalentes de M6G. São utilizados nas figuras os seguintes símbolos para as diferentes dosagens: figura 4 (actividade do derivado M6G-cys-DEA) ♦- 2,5 mg/kg eq; --^-1 mg/kg eq; -·- 0,4 mg/kg eq; figura 5 (actividade do derivado M6G-cisteamida) ♦- 5 mg/kg eq.; 2,5 mg/kg eq; -·- 1 mg/kg eq; figura 6 (actividade do derivado M6G-Cya-Cya-PEG) ♦- 5mg/kg eq; 2,5 mg/kg eq; -·- 1 mg/kg eq; figura 7 (actividade do derivado M6G-OEt) ♦ - 5 mg/kg eq; 2,5mg/kg eq; -·- 1 mg/kg eq; figura 8 (actividade do derivado M6G-Cya-Cya-M6G) ♦- 5 mg/kg eq; 2,5 mg/kg eq; -·- 1 mg/kg eq; figura 9 (actividade do derivado M6G-Cys-OH) ♦- 5mg/kg eq; 2,5 mg/kg eq; -·- 1 mg/kg eq; figura 10 (actividade do derivado M6G-glu-SS-glu-M6G); ♦- 5mg/kg eq; 2,5 mg/kg eq; -·- 1 mg/kg eq; figura 11 (actividade da morfina) ♦- 5 mg/kg eq; -·*- 2,5 mg/kg eq; -·- 1,75 mg/kg eq 1 mg/kg; figura 12 (actividade da M6G) ♦- 1 mg/kg eq; 0,5 mg/kg eq; -·- 0,25mg/kg eq 24 --3 mg/kg.

Os resultados mostram que os derivados da M6G de acordo com a invenção têm uma actividade analgésica pelo menos semelhante à M6G e à morfina. Com efeito, a ED50, dose que induz 50% de efeito analgésico, está compreendida entre 0,3 e 2,5 mg eq./kg para os derivados de acordo com a invenção, a comparar respectivamente com 0,55 e 2,65 para a M6G e a morfina.

Além disso, observa-se que para a maior parte dos derivados de acordo com a invenção, a actividade analgésica dura muito mais tempo. Com efeito, para a M6G e a morfina, a duração da acção é de cerca de 100 minutos, enquanto, por exemplo, para M6G-cya-cya-M6G, a duração da acção é de 360 minutos. C: estudo da afinidade aos receptores opióides C.l/ Modo operatório

Comparou-se a afinidade da M6G e da morfina à dos derivados de M6G de acordo com a invenção para os receptores opióides μ (miu) e k (kapa).

Para determinar a afinidade aos receptores μ, homogeneizados da membrana do córtex cerebral do rato (200 μg de proteina) foram incubados ou com a M6G, ou com a morfina ou com o composto de acordo com a invenção e 1 nM de [3H] [D-Ala2, N-MePhe4, gly (ol)5]-encefalina (DAMGO) durante 60 minutos a 22°C num tampão contendo 50 mM Tris-HCl [pH 7,7].

Para determinar a afinidade aos receptores k, foram incubados homogeneizados de membrana de cerebelo de cobaia 25 (250 pg de proteína) ou com a M6G, ou com a morfina, ou com o composto de acordo com a invenção, e 0,7 nM [3H]U 69593 (80 minuto a 22°C) num tampão contendo 50 mM tris-HCl [pH 7,4], 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA. Utilizaram-se concentrações de M6G, de morfina e do composto de acordo com a invenção de IO'14 a 10“6 M. A ligação não específica foi determinada graças à adição aos ligantes marcados de naloxona 10 μΜ.

Após a incubação, as amostras foram filtradas sobre fibras de vidro (GF/B, Packard) previamente incubadas com 0,3% de polietilenoimina e lavadas várias vezes com 50 mM de tris-HCl frio, utilizando um "96-sample cell harvester" (Unifilter, Packard). Os filtros foram em seguida secos e foi contada a radioactividade. C.2/ Resultados

Os resultados estão referidos no quadro 1 abaixo. (Ki expresso em nM) composto receptores μ receptores κ morfina 12,43 155,15 M6G 13, 63 223,91 M6G-cisteamida 2,35 4,49 M6G-cys-OMe 1, 04 14, 02 M6G-cys-OEt 1,17 11,24 M6G-cys-DEA 0,36 1, 90 M6G-cya-cya-M6G 0,38 6,22 M6G-cya-cya-PEG20000 0, 92 0,72

Os resultados mostram que: - a M6G liga-se aos receptores μ com um Ki = 13,63 nM, indicando uma afinidade para estes receptores. Em contrapartida, o valor de Ki para os receptores k, da ordem de 224 nM indica uma fraca afinidade para estes receptores; a afinidade dos compostos de acordo com a invenção para os receptores κ (Ki = 0,72 a 14,02) é aumentada de maneira espectacular em relação à da M6G (até 310 vezes) , em virtude da modificação química, sem que a afinidade para os receptores μ diminua. Observa-se mesmo um aumento desta afinidade para os receptores μ de um factor de cerca de 10.

Lisboa, 19 de Junho de 2007

Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula (A) ÇH3

na qual: o conjunto da entidade acima, com excepçâo do substituinte X, é denominado M6G-N(R2)Ri-S-, Ri representa um grupo alquilo linear ou ramificado em C1-C10, não substituído ou substituído pelo menos por um substituinte, estando a cadeia de alquilo eventualmente interrompida por um ou vários heteroátomos escolhidos entre 0, S e N; R2 representa o hidrogénio, um grupo alquilo linear ou ramificado em Ci-C5, ou um grupo arilo, heteroarilo ou (Ci — C5)-alquilarilo, não substituído ou substituído por um alquilo em C1-C4; X representa o hidrogénio, um resíduo M6G-N(R2)Ri-S-ou um polímero ligado ao resto da entidade por um braço separador; os carbonos assimétricos presentes na fórmula (A) podem ter configuração R ou S, assim como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 2

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por - Ri e r2 serem tal como foram definidos na reivindicação 1; X representar um resíduo M6G-N(R2) Ri-S-, sendo os dois resíduos M6G-N(R2) Ri-S-, que constituem os compostos de fórmula (A) sob a forma de dímeros, idênticos ou diferentes.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por - Ri ser tal como foi definido na reivindicação 1; - R2 representar o hidrogénio, e X representar o hidrogénio.

4. Composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por - Ri ser tal como foi definido na reivindicação 1; - R2 representar o hidrogénio, e X representar um resíduo M6G-N (R2) Ri-S- no qual Ri e R2 são tal como foram definidos acima.

5. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por Ri representar um grupo alquilo substituído por um ou vários substituintes escolhidos entre: um grupo alquilo em Ci-C5; um grupo amino ou um grupo COOR3; um grupo CONR3R4, representando R3 e R4 nos grupos COOR3 ou CONR3R4,independentemente, o hidrogénio, um grupo alquilo em Ci-C2o eventualmente substituído, arilo, heteroarilo ou alquilarilo; uma cetona em Ci-C2o e um aldeído em Ci-C2o- 3

6. Composto de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracterizado por Ri representar -(CH2)2-, R2 representar o hidrogénio e X representar o hidrogénio.

7. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 4, caracterizado por Ri representar -(CH2)2-, R2 representar o hidrogénio e X representar um resíduo M6G-N(R2)Ri~S- no qual Ri = (CH2)2~ e R2 representa o hidrogénio.

8. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 4, caracterizado por Ri representar um grupo -CH (COOR3) -CH2- no qual R3 representa o hidrogénio, metilo, etilo, propilo ou butilo, - R2 representar o hidrogénio, X representar o hidrogénio ou um resíduo M6G-N(R2)Ri-S-no qual Ri = -CH (COOR3) -CH2- no qual R3 é tal como foi definido acima e R2 representa o hidrogénio.

9. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 ou 5, caracterizado por Ri representar um grupo -CH (CONR3R4) -CH2- no qual R3 e R4 representam hidrogénio, metilo, etilo, propilo ou butilo, R2 representar o hidrogénio, X representar o hidrogénio ou um resíduo M6G-N(R2)Ri-S_ no qual Ri = -CH (CONR3R4)-CH2- no qual R3 e R4 são tal como foram definidos acima e R2 representa o hidrogénio.

10. Composto de acordo com as reivindicações 1 ou 5, caracterizado por 4 Ri representar um grupo -CH (COOR3) -C (CH3) 2_ no qual R3 representa o hidrogénio, metilo, etilo propilo ou butilo, R2 representar o hidrogénio, X representar o hidrogénio ou um resíduo M6G-N (R2) Ri-S-, no qual Ri = -CH (COOR3)-c (CH3) 2- no qual R3 é tal como foi definido acima e R2 representa o hidrogénio.

11. Composto de acordo com as reivindicações 1 ou 5, caracterizado por Ri representar um grupo -CH (COOR3) - (CH2) 2_C (0) NHCH (R5) -CH2-, no qual R3 representa hidrogénio, metilo, etilo, propilo ou butilo e R5 representa -C(0)-NH-CH2-COOR3, - R2 representar o hidrogénio, X representar o hidrogénio ou um resíduo M6G-N(R2)Ri-s- no qual Ri = -CH (C00R3) - (CH2) 2-C (0) NHCH (R5) -CH2- no qual R3 e R5 são tal como foram definidos acima e R2 representa o hidrogénio.

12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Ri representar um grupo -(CH2)2-, R2 representar hidrogénio, X representar um polímero ligado ao resto da entidade por um braço separador de fórmula -S- (CH2) n-NH-C (0) - na qual n = 0 a 4 e o referido polímero é um polietileno-glicol de peso molecular (Mw) superior ou igual a 10000.

13. Processo para a preparação de um composto de fórmula (A) de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender os passos que consistem em se fazer reagir a morfina-6-glucuronida com um composto de 5 fórmula (III) NRH2-R1-S-S-R1-NHR2, na qual Ri e R2 são tal como foram definidos em qualquer das reivindicações 1 a 11, na presença de um agente de acoplamento, e em se reduzir a ponte de dissulfureto com o auxilio de um agente redutor, se necessário.

14. Processo para a preparação de um composto de fórmula (A) de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, na qual X = H, caracterizado por compreender os passos que consistem em se fazer reagir a morfina-6-glucuronida com um composto de fórmula (IV) NHR2-Ri-SH, na qual Ri e R2 são tal como foram definidos em qualquer das reivindicações 1 a 12, na presença de um agente de acoplamento, e em se reduzirem in situ os subprodutos de oxidação com o auxilio de um agente redutor.

15. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 ou 14, caracterizado por o agente de acoplamento ser escolhido entre o hexafluorfosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio (PyBOP), a diciclohexilcarbodiimida (DCC), a DCC associada ao hidroxibenzotriazol (DCC/HOBT) e a diisopropilcarbodiimida associada ao HOBT (DIPCDI/HOBT).

16. Processo de acordo com uma das reivindicações 13 ou 14, caracterizado por o agente redutor ser escolhido entre a tris (2-carboxietil)-fosfina, a trifenilfosfina, a tris-(hidroximetil)-fosfina e o ditiotreitol.

17. Composição farmacêutica, caracterizada por conter um composto de fórmula (A) , de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, e um veiculo farmaceuticamente aceitável. 6

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por se apresentar sob uma forma administrável por via parentérica.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por se apresentar sob a forma de preparação injectável por via subcutânea, intravenosa ou intramuscular.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por se apresentar sob uma forma administrável por via oral.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por apresentar uma actividade prolongada ou retardada.

22. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, ou de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 17 a 21, para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da dor. Lisboa, 19 de Junho de 2007