PT1326896E

PT1326896E - Anticorpos humanos anti-cd40

Info

Publication number: PT1326896E
Application number: PT01979395T
Authority: PT
Inventors: Keting Chu; Changyu Wang; Corrine Yoshihara; John J Donnelly
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-10-02
Publication date: 2011-03-03
Also published as: AU2001296547A1; WO2002028481A3; JP2008074870A; EP1326896A2; US20110033456A1; WO2002028480A2; EP1717251A2; EP1326896B1; EP1322383B9; DE60143535D1; EP1322383B1; JP4271440B2; WO2002028480A3; CA2424296A1; DE60119945T2; WO2002028481A2; JP2009019046A; US7288252B2; WO2002028905A3; EP1717251A3

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "ANTICORPOS HUMANOS ANTI-CD40" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo Técnico A invenção relaciona-se com anticorpos humanos com a capacidade de se ligar ao CD40, com métodos para uso dos anticorpos e com o tratamento de doenças mediadas pelos anticorpos em seres humanos.

Descrição do Campo Técnico Relacionado 0 antigénio CD40 é uma glicoproteina expressa à superfície das células B e de outras células, incluindo as células dendríticas. Durante a diferenciação das células B, a molécula é inicialmente expressa pelas células pré-B e desaparece então da superfície celular quando a célula B se diferencia em plasmócito. 0 crosslinking das moléculas de CD40 com anticorpos anti-CD40 medeia diversos efeitos a nível das células B. Sabe-se que o antigénio CD40 está relacionado com o receptor do factor de crescimento dos nervos humano (NGF) e com o receptor do factor de necrose tumoral α (TNF-α), o que sugere que o CD40 constitui um receptor para um ligando com funções importantes na activação das células B. 0 antigénio CD40 é um elemento-chave das respostas imunes. A interacção entre o CD40 apresentado pelas células apresentadoras do antigénio e o seu ligando, designado por CD40L ou CD154, causa a produção de citocinas e a regulação positiva de moléculas co-estimuladoras, conduzindo à activação 1 eficiente dos linfócitos T. A interacção com o CD40 nos linfócitos B fornece um sinal co-estimulador à célula B no sentido de dirigir a produção de anticorpos. Deste modo, o bloqueio da interacção e da activação de CD40 possui um potencial de supressão das respostas imunes mediadas por anticorpos e mediadas por células. Os anticorpos antagonistas anti-CD40 poderão ser usados para tratar doenças autoimunes tais como o lúpus sistémico, psoriase, esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino (doença de Crohn) e artrite reumatóide. Tais anticorpos poderão ainda ser usados para evitar a rejeição de enxertos de órgãos ou tecidos através da supressão das respostas autoimunes, para tratar linfomas ao privar os linfócitos B malignos do sinal activador fornecido pelo CD40, e para libertar de modo especifico toxinas para células portadoras de CD40.

Antecedentemente, foram já apresentados anticorpos monoclonais de ratinho, tal como 5D2, que se ligam a CD4 0 sem proporcionar um sinal activador. Estes anticorpos possuem a capacidade de inibir as respostas imunes in vivo e in vitro. No entanto, os anticorpos de ratinho não podem ser usados para tratar doenças humanas, uma vez que estimulam a produção de anticorpos humanos anti-ratinho que prejudicam a eficácia do tratamento. Deste modo, existe neste campo técnico a necessidade de desenvolver anticorpos que tenham uma especificidade comparável mas que sejam compostos por uma sequência de aminoácidos humana. A Patente EP0945465 descreve anticorpos com a capacidade de se ligar a CD40, métodos para a produção desses anticorpos e métodos para o seu uso. 2

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção fornece um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento que tem a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula B humana normal, mostrando-se o dito anticorpo monoclonal ou fragmento isento de actividade agonista significativa quando o dito anticorpo monoclonal ou fragmento se liga ao antigénio CD40 expresso à superfície da dita célula B normal, e sendo que, quando o dito anticorpo monoclonal ou fragmento se liga ao antigénio CD40 expresso à superfície da dita célula B normal, o crescimento ou diferenciação da dita célula B normal é inibido, e sendo que o dito anticorpo monoclonal ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada contendo os resíduos 31-35, 50-66 e 99-111 da SEQ ID NO:13, e compreende uma região variável de cadeia leve contendo os resíduos 24-39, 55-61 e 94-102 da SEQ ID NO:17. A invenção fornece igualmente um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com a invenção para uso com fins terapêuticos. A invenção fornece ainda um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com a invenção para uso em (i) profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por anticorpos num paciente, (ii) profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por IgE num paciente, ou (ii i) profilaxia ou tratamento de uma doença autoimune num paciente. A invenção proporciona também o uso de um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com a invenção no fabrico de um medicamento para (i) profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por anticorpos num paciente, (ii) profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por IgE num paciente, ou (iii) profilaxia ou tratamento de uma doença autoimune num paciente. 3

Claims

A invenção fornece ainda um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com a invenção para uso na inibição da produção de anticorpos pelas células B num paciente humano. A invenção proporciona ainda o uso de um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com a invenção no fabrico de um medicamento para inibir a produção de anticorpos pelas células B num paciente humano. A invenção proporciona igualmente um método para a inibição do crescimento ou diferenciação de uma célula B humana normal, ou para a inibição da proliferação de uma célula B humana normal, sendo que a dita proliferação é aumentada pela interacção de um ligando de CD40 com um antigénio CD40 expresso à superfície de uma célula B, e sendo o dito método caracterizado por compreender o contacto da dita célula B in vitro com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano ou de um seu fragmento de acordo com a invenção. A invenção fornece igualmente um hibridoma com a capacidade de produzir o anticorpo monoclonal humano da invenção. A invenção fornece ainda um ácido nucleico caracterizado por compreender um polinucleótido que codifica para o anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com a invenção, sendo o polinucleótido caracterizado por compreender as sequências apresentadas em SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8. A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica caracterizada por compreender o anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento de acordo com a invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Outros aspectos da invenção são apresentados nas Reivindicações anexas. 4 Os aspectos da descrição que se segue que não se relacionam especificamente com a invenção reivindicada são apresentados para fins de comparação e ilustração. BREVE SUMÁRIO DA EXPOSIÇÃO É aqui exposto um anticorpo monoclonal humano com a capacidade de se ligar a um antigénio CD40 humano localizado à superfície de uma célula B humana, sendo que a ligação do anticorpo ao antigénio CD40 evita o crescimento ou diferenciação da célula B. É igualmente aqui apresentado um método para prevenir ou tratar uma doença mediada por anticorpos num paciente, sendo o método caracterizado por compreender a administração, a um paciente que necessite de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal humano que tem a capacidade de se ligar a um antigénio CD40 humano localizado à superfície de uma célula portadora de CD40, tal como uma célula B humana ou uma célula dendrítica, sendo que a ligação do anticorpo ao antigénio CD40 evita o crescimento ou diferenciação da célula B, num excipiente farmaceuticamente aceitável. É igualmente aqui exposto um método para a profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por IgE, tal como uma alergia, num paciente, sendo o método caracterizado por compreender a administração, a um paciente que necessite de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal humano, tendo este a capacidade de se ligar a um antigénio CD40 humano localizado à superfície de uma célula B humana e sendo que a ligação do anticorpo ao antigénio CD40 evita o crescimento ou diferenciação da célula B, num excipiente farmaceuticamente aceitável. 5 É ainda aqui exposto um método para a profilaxia ou tratamento de uma doença autoimune num paciente, incluindo uma doença mediada por anticorpos, sendo o método caracterizado por compreender a administração, a um paciente que necessite de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal humano que tem a capacidade de se ligar a um antigénio CD40 humano localizado à superfície de uma célula B humana, sendo que a ligação do anticorpo ao antigénio CD40 evita o crescimento ou diferenciação da célula B, num excipiente farmaceuticamente aceitável. As doenças autoimunes particulares contempladas para tratamento por este método incluem o lúpus eritematoso sistémico (LES), a cirrose biliar primária (CBP) e a púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) . É igualmente aqui exposto um método para a inibição do crescimento de células tumorais, incluindo as células de Linfoma Não-Hodgkin (LNH). Nas formas de realização particularmente preferidas para esta exposição, o anticorpo monoclonal corresponde a 15B8, 20C4, 13E4, 12D9 ou 9F7. BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS ESQUEMAS A Figura 1 corresponde a um gráfico de barras ilustrando o efeito dos anticorpos anti-CD40 sobre a proliferação de células B estimuladas por células que expressam CD40L. A Figura 2 apresenta um gráfico de barras que ilustra o efeito dos anticorpos anti-CD40 sobre a proliferação das células B. A Figura 3 apresenta um gráfico de barras que ilustra o efeito dos anticorpos anti-CD40 sobre a proliferação das células B induzida por anti-IgM. 6 A Figura 4 corresponde a um gráfico de barras que ilustra o efeito do crosslinking com o anticorpo anti-CD40 sobre a proliferação das células B humanas do sangue periférico. A Figura 5 consiste numa comparação das sequências de aminoácidos das cadeias leves de cinco anticorpos humanos anti-CD40 e de 5H7. A Figura 6 constitui uma comparação das sequências de aminoácidos das cadeias pesadas de cinco anticorpos humanos anti-CD40 e de 5H7. A Figura 7 apresenta os resultados da análise por FACS da ligação do anticorpo monoclonal 15B8 a células que expressam CD40, mostrando que o anticorpo marcou as células do sangue periférico de três espécies: humanos; macacos Rhesus; e macacos cinomolgos. A Figura 8 fornece as sequências de DNA e de aminoácidos da região vK do anticorpo monoclonal humano 12D9. A Figura 9 fornece as sequências de DNA e de aminoácidos da região constante de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 12D9, SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente. A Figura 10 fornece as sequências de DNA das regiões vK.l e vhl do anticorpo monoclonal humano 20C4, SEQ ID NOS:3 e 4, respectivamente. A Figura 11 fornece as sequências de DNA das regiões vK.l e vhl do anticorpo monoclonal humano 9F7, SEQ ID NOS:5 e 6, respectivamente. A Figura 12 fornece as sequências de DNA das regiões vK.3 e vhl do anticorpo monoclonal humano 15B8, SEQ ID NOS:7 e 8, respectivamente. A Figura 13 fornece a sequência de DNA das regiões vhl dos anticorpos monoclonais humanos 13E4 e 12D9 (SEQ ID NO:10). A Figura 14 fornece as sequências de aminoácidos das seguintes regiões dos anticorpos monoclonais humanos indicados: 7 9F7VH1: SEQ ID NO:11 12D9VH1: SEQ ID NO:12 15B8VH1 SEQ ID NO:13 20C4VH1: SEQ ID NO:14 9F7VK1: SEQ ID NO:15 12D9VK1: SEQ ID NO:16 15B8VK1: SEQ ID NO:17 20C4VK1: SEQ ID NO:18 A Figura 15 mostra que o anticorpo anti-CD40 MS81 estimulou a proliferação de células de LNH na presença e na ausência de IL-4, usando-se células de um paciente. A Figura 16 mostra que o anticorpo anti-CD40 MS81 estimulou a proliferação de células de LNH na presença e na ausência de IL-4, usando-se células de um segundo paciente. A Figura 17 mostra que o anticorpo anti-CD40 15B8 inibiu a proliferação das células de LNH num paciente. A Figura 18 mostra a curva de dose-resposta relativa ao efeito de 15B8 sobre a proliferação de células de LNH de um paciente sensível ao rituxan. As células foram estimuladas com CD40L e IL-4. A Figura 19 mostra curvas representativas de dose- resposta relativas ao efeito de 15B8 sobre a proliferação de células B humanas estimuladas por CD40L, tendo sido usadas células de três indivíduos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Os anticorpos são constituídos por diversas regiões, existindo uma região crucial que é designada por região determinante da complementaridade, ou CDR. 0 termo "região determinante da complementaridade" refere-se a sequências de aminoácidos que em conjunto definem a afinidade de ligação e a 8 especificidade da região Fv natural de um local de ligação numa imunoglobulina nativa. Ver, p.ex., Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication No. 91-3242(1991). O termo "região constante" refere-se à porção da molécula de anticorpo que confere funções efectoras. Nos trabalhos anteriores direccionados para a produção de anticorpos não imunogénicos para uso no tratamento de doenças humanas, as regiões constantes de ratinho foram substituídas por regiões constantes humanas. As regiões constantes dos anticorpos humanizados utilizados derivavam de imunoglobulinas humanas. No entanto, estes anticorpos humanizados ainda estimulavam uma resposta imune indesejada e potencialmente perigosa em seres humanos, registando-se ainda uma perda de afinidade. Os anticorpos monoclonais anti-CD40 humanos de acordo com a presente exposição pretendem resolver as limitações dos anticorpos monoclonais resultantes dos desenvolvimentos técnicos anteriores. Deste modo, os anticorpos monoclonais humanos aqui apresentados são preferencialmente produzidos usando animais transgénicos que são alterados por engenharia genética de modo a conter loci de imunoglobulinas humanas. Por exemplo, W098/24893 apresenta animais transgénicos possuindo um locus de Ig humana, sendo que os animais não produzem imunoglobulinas endógenas funcionais devido à inactivação dos loci endógenos de cadeias pesadas e de cadeias leves. Ainda, WO 91/10741 apresenta hospedeiros transgénicos mamíferos não primatas capazes de desenvolver uma resposta imune face a um imunogénio, possuindo os anticorpos regiões constantes e/ou variáveis de primatas e tendo os loci que codificam para as imunoglobulinas endógenas sido substituídos ou inactivados. A WO94/02602 apresenta hospedeiros mamíferos não humanos possuindo loci inactivados de Ig endógenas e loci funcionais de Ig humanas. A Patente US N° 5.939.598 apresenta métodos 9 para a produção de ratinhos transgénicos que não produzem cadeias pesadas endógenas e que expressam um locus de imunoglobulina exógena compreendendo uma ou mais regiões constantes xenogénicas. Através do uso de um animal transgénico tal como acima descrito, é possivel produzir uma resposta imune dirigida a uma molécula antigénica seleccionada, neste caso CD40, e as células produtoras de anticorpo podem ser removidas do animal e usadas para produzir hibridomas que segregam anticorpos monoclonais humanos. Os protocolos de imunização, os adjuvantes e outros elementos são já conhecidos neste campo técnico, sendo usados na imunização de, por exemplo, um ratinho transgénico tal como o descrito em WO 96/33735. Os anticorpos monoclonais podem ser testados quanto à sua capacidade para inibir ou neutralizar a actividade biológica ou o efeito fisiológico da proteína correspondente. Tal como aqui é usado, o termo "anticorpo" refere-se a anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeia única e fragmentos, tais como Fab, F(ab')2, Fv e outros fragmentos que retêm a função de ligação ao antigénio exibida pelo anticorpo progenitor. Tal como aqui é usado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a uma composição de anticorpo que possui uma população homogénea de anticorpos. 0 termo não é limitado no que diz respeito à espécie ou fonte do anticorpo, e também não pretende ser limitado pelo seu processo de fabrico. 0 termo abrange as imunoglobulinas completas e os fragmentos, tais como Fab, F(ab')2f Fv e outros, que retêm a função de ligação ao antigénio do anticorpo. Nesta exposição poderão usar-se anticorpos monoclonais provenientes de qualquer espécie de mamífero. Na prática, no entanto, os anticorpos serão tipicamente de rato ou murinos devido à disponibilidade das linhas celulares de rato ou murinas que podem ser usadas para 10 produzir as linhas celulares híbridas, ou hibridomas, que produzirão anticorpos monoclonais. Tal como aqui é usado, o termo "anticorpos de cadeia única" refere-se a anticorpos preparados através da determinação dos domínios de ligação (tanto das cadeias leves como das pesadas) de um anticorpo, e do fornecimento de uma porção molecular de ligação que permite preservar a função de ligação. Tal forma, na sua essência, um anticorpo radicalmente abreviado, possuindo apenas a parte do domínio variável que é necessária para a ligação ao antigénio. Os processos de determinação e construção de anticorpos de cadeia única são descritos na Patente US N° 4.946.778, de Ladner et al. 0 termo "epitopo do antigénio CD40", tal como aqui é usado, refere-se a uma molécula que tem a capacidade de exibir imunoreactividade com os anticorpos monoclonais anti-CD40 desta invenção, excluindo o próprio antigénio CD40. Os epitopos do antigénio CD40 poderão compreender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos e outras moléculas, mas para os fins da presente exposição serão mais vulgarmente proteínas, oligopéptidos curtos, emuladores de oligopéptidos (i.e., compostos orgânicos que emulam as propriedades de ligação ao anticorpo do antigénio CD40), ou combinações destes. Os emuladores de oligopéptidos adequados são descritos, inter alia, na Publicação Internacional N° W091/19735. Os anticorpos da presente exposição são produzidos por ratinhos transgénicos portadores de loci de imunoglobulinas humanas, e ligam-se a um antigénio CD40 humano à superfície de uma célula humana, particularmente uma célula B. Estes anticorpos podem ser anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeia única e fragmentos destes. Os anticorpos monoclonais 15B8, 20C4, 13E4, 12D9 e 9F7 são preparados tal como descritos nos Exemplos. Outros anticorpos 11 poderão ser preparados de modo similar usando ratinhos transgénicos para loci de imunoglobulinas humanas ou através de outros métodos conhecidos da técnica e/ou aqui descritos. Os soros policlonais podem ser preparados através de métodos convencionais. Genericamente, uma solução contendo o antigénio CD40 é inicialmente usada para imunizar um animal adequado, correspondendo na presente exposição a um animal transgénico, preferencialmente um ratinho portador de loci de imunoglobulinas humanas. Numa forma de realização preferida, são usadas como imunogénio células Sf9 expressando CD40. A imunização pode também ser realizada misturando ou emulsificando a solução que contém o antigénio em soro fisiológico, preferencialmente num adjuvante como o adjuvante completo de Freud, e injectando a mistura ou emulsão parentericamente (geralmente por via subcutânea ou intramuscular). Uma dose de 50-200 yg/injecção é tipicamente suficiente. A imunização é geralmente reforçada 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injecções da proteína em soro fisiológico, preferencialmente usando o adjuvante incompleto de Freund. Poderão alternativamente gerar-se anticorpos por imunização in vitro usando métodos conhecidos neste campo, procedimento que, para os fins da presente invenção, é considerado como equivalente à imunização in vivo. Os soros policlonais são obtidos sangrando o animal imunizado para um contentor de vidro ou plástico, incubando o sangue a 25°C durante uma hora e incubando-o seguidamente a 4°C durante 2-18 horas. O soro é recuperado por centrifugação (p.ex., a 1000 x g durante 10 minutos). Poderão obter-se cerca de 20-50 ml por sangradura em coelhos. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o método de Kohler e Milstein, Nature 256:495-96 (1975), ou uma modificação deste. Tipicamente, um ratinho é imunizado tal como acima descrito. No entanto, em lugar de sangrar o animal 12 para extrair o soro, o baço (e opcionalmente diversos nódulos linfáticos grandes) é removido e dissociado em células isoladas. Se desejado, os esplenócitos poderão ser rastreados (após a remoção das células de adesão não especifica) através da aplicação de uma suspensão celular a uma placa ou poço revestido com o antigénio. As células B expressando uma imunoglobulina ligada à membrana que é especifica para o antigénio ligam-se à placa e não são arrastadas por lavagem com o resto da suspensão. As células B resultantes, ou todos os esplenócitos dissociados, são então induzidos a fundir-se com células de mieloma para formar hibridomas, procedendo-se à cultura destes num meio selectivo (p.ex., meio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Os hibridomas resultantes são plaqueados por diluição limitante e são ensaiados quanto à produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio imunizante da superfície celular desejado (e que não se ligam a antigénios não relacionados) . Os hibridomas secretores de MAbs seleccionados são então cultivados in vitro (p.ex., em frascos de cultura de tecidos ou em reactores de fibras ocas) ou in vivo (como ascites em ratinhos) . Como alternativa ao uso de hibridomas, o anticorpo pode ser produzido numa linha celular como uma linha celular CHO, tal como exposto nas Patentes US Nos. 5.545.403, 5.545.405 e 5.998.144. Abreviadamente, a linha celular é transfectada com vectores diferentes que têm a capacidade de expressar uma cadeia leve e uma cadeia pesada, respectivamente. Através da transfecção das duas proteínas em vectores separados, é possível produzir anticorpos quiméricos. Outra vantagem consiste na correcta glicosilação do anticorpo. Preferencialmente, os anticorpos inteiramente humanos contra CD40 são obtidos através da imunização de ratinhos transgénicos. Um destes tipos de ratinho é referido como Xenomouse e é apresentado nas Patentes US Nos. 6.075.181, 13 6.091.001 e 114.598. Para produzir os anticorpos aqui expostos foram imunizados ratinhos, transgénicos para o locus de cadeia pesada de IgG2 humana e para o locus de cadeia leve K humana, com células Sf9 expressando CD40 humano. Os ratinhos podem igualmente ser transgénicos para outros isotipos. A produção de células Sf9 (de Spodoptera frugiperda) é exposta em de Boer, Patente US N° 6.004.552. Abreviadamente, sequências codificando para o CD40 humano foram recombinadas num baculovirus usando vectores de transferência tais como os descritos por de Boer. Os plasmideos foram co-transfectados com DNA de baculovirus de tipo selvagem em células Sf9. As células Sf9 infectadas com baculovirus recombinante foram identificadas e purificadas por clonagem. Os ratinhos foram injectados intraperitonealmente (IP) ao dia 0 e ao dia 14 com 5 x 106 células Sf9 expressando CD40. Foi realizada uma injecção final pelo menos cinco semanas mais tarde, e as células do baço e do timo foram removidas e usadas para a fusão celular. A fusão celular foi efectuada tal como descrito por de Boer. Os anticorpos de hibridoma foram rastreados tal como se descreve nos Exemplos. Foram seleccionados cinco hibridomas para estudo posterior, com base na sua capacidade para inibir a proliferação de células B humanas do sangue periférico induzidas pelo ligando de CD40 (CD40L) e por anti-IgM, e na sua capacidade para inibir a produção de IgM por células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T humanas do sangue periférico activadas por anti-CD3. Os cinco hibridomas que evidenciaram uma actividade inibitória óptima foram designados por 15B8.8.6 (15B8), 20C4.1.6 (20C4), 13E4.12.il (13E4), 12D9.9.10 (12D9), 9F7.9.11.1 (9F7) e 15B8.7.2. Nenhum destes hibridomas evidenciou uma capacidade significativa para induzir a 14 proliferação de células B humanas do sangue periférico em repouso. As propriedades de ligação relativas destes anticorpos de hibridoma foram examinadas por citometria de fluxo, tal como se descreve em detalhe nos Exemplos. Abreviadamente, os anticorpos comparados exibiram diferenças de afinidade, apesar da sua capacidade para reconhecer os mesmos epitopos ou epitopos estreitamente relacionados. Por exemplo, o MAb 15B8 bloqueou a ligação do MAb 20C4 aos linfócitos CD20+ humanos do sangue periférico, mas o MAb 20C4 não bloqueou a ligação do MAb 15B8 aos linfócitos CD20+. A ligação diferencial a CD40 pelos hibridomas é apresentada na Tabela 4 (Exemplo 4). Quatro dos hibridomas testados (15B8, 20C4, 12D9 e 9F7) produziram anticorpos monoclonais que marcaram as células do sangue periférico de três espécies: humanos; macacos Rhesus; e macacos cinomolgos (Figura 7). Para determinar sequências de polinucleótidos que codificam para os anticorpos monoclonais, foi preparado mRNA a partir dos hibridomas e foi efectuado um ensaio de RT-PCR dos mRNAs usando procedimentos padronizados. Os produtos de PCR foram analisados em geles, sequenciados e traduzidos. As sequências de polinucleótidos e de aminoácidos são apresentadas nas SEQ ID NOS :1-18, tal como mostra a Tabela 7, Exemplo 11. As sequências de aminoácidos de cinco anticorpos monoclonais (9F7, 15B8, 12D9, 20C4 e 13E4) foram comparadas com a sequência de aminoácidos do anticorpo monoclonal anti-CD40 de ratinho 5H7, tal como mostram as Figuras 5 (cadeias leves) e 6 (cadeias pesadas). Os resultados obtidos usando os cinco anticorpos monoclonais expostos indicam que estes anticorpos, assim como seus fragmentos e formas quiméricas, possuem caracteristicas antagonistas que os tornam adequados para diversas aplicações 15 clínicas, incluindo o tratamento de doenças autoimunes, o tratamento de reacções e rejeições a transplantes, o uso como terapêuticas adjuvantes em terapias genéticas e terapias com proteínas, e o uso na inibição do crescimento de células tumorais, incluindo células de Linfoma Não-Hodgkin. Os usos adicionais incluem o tratamento de qualquer doença mediada por uma célula maligna que expresse CD40, e o seu uso no tratamento de doenças relacionadas com a proliferação, activação ou regulação de células que expressam CD40. A actividade dos cinco MAbs está resumida na Tabela 1. Tabela 1 Clones Inibição da secreção de IgM pelas células B Inibição da proliferação de células B estimuladas por células Jurkat Inibição da proliferação de células B estimuladas por células CHO-CD40L Estimulação da proliferação de células B estimuladas por anti-hlgM Estimulação da proliferação de células B Cross-linking de Ab para estimular a proliferação de células B MS81 12D9.9.10 -29% -64% -24% 190% 178% 120% MS81 15B8.8.6.12 -47% -81% -89% 352% 513% 76% MS81 20C4.1.6 -35% -74% -97% 237% 279% 143% MS81 13E4.12.il -44% -50% n/a 346% 660% n/a MS81 9F7.9.11.1 -30% -71% -57% 120% 275% 84% * foram apresentados dados representativos dos anticorpos à conc. de 1 pg/ml A exposição abrange não apenas os cinco anticorpos monoclonais aqui descritos, mas também anticorpos que diferem destes mas retêm a CDR; e anticorpos com uma (ou mais) adição(ões), delecção(ões) ou substituição(ões), sendo a actividade medida em termos de inibição da proliferação de células B e/ou da secreção de anticorpos. A exposição abrange 16 igualmente anticorpos desimunizados, os quais podem ser produzidos tal como descrito em, por exemplo, WO 98/52976, "Método para a Produção de Proteínas Não Imunogénicas". São igualmente aqui apresentadas proteínas de fusão compreendendo um anticorpo monoclonal de acordo com a exposição, ou um seu fragmento, podendo estas proteínas de fusão ser sintetizadas ou expressas a partir de vectores polinucleotídicos correspondentes, tal como reconhecido neste campo técnico. Os anticorpos de acordo com a presente exposição poderão conter variações de sequência produzidas por recurso a métodos descritos em, por exemplo, as Publicações de Patente Nos. EP 0 983 303 Al, WO 00/34317 e WO 98/52976. Por exemplo, foi já evidenciado que as sequências contidas na CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue a moléculas de Classe II do MHC e desencadeie uma resposta indesejada por parte das células T helper. Uma substituição conservativa permitirá que o anticorpo retenha a actividade de ligação, perdendo no entanto a capacidade para desencadear uma resposta de células T indesejada. As substituições conservativas ou não conservativas poderão ser realizadas usando métodos conhecidos da técnica, e os anticorpos resultantes serão abrangidos pelo âmbito da exposição. São igualmente aqui expostas sequências de aminoácidos para as cadeias leves e para as cadeias pesadas dos anticorpos monoclonais preferidos (SEQ ID NOS:l-18). As sequências estão alinhadas tal como mostram as Figuras 5 e 6. Estes alinhamentos indicam posições de aminoácidos específicas que serão mais susceptíveis de sofrer substituição sem perda das propriedades biológicas desejadas para o anticorpo. Usando apenas métodos de rotina, um perito na técnica poderá construir plasmídeos que codificarão para variantes destas sequências. Os anticorpos variantes poderão ser rotineiramente testados quanto à sua actividade antagonista, afinidade, 17 especificidade e actividade agonista usando os métodos aqui descritos. Um anticorpo produzido por qualquer dos métodos acima descritos, ou por qualquer outro método aqui não apresentado, estará abrangido pelo âmbito desta exposição se possuir pelo menos uma das seguintes actividades biológicas: inibição da secreção de imunoglobulinas pelas células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T; inibição da proliferação das células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T Jurkat; e inibição da proliferação das células B humanas do sangue periférico estimuladas por células que expressam CD40L. Estes ensaios podem ser realizados tal como descrito nos Exemplos. Os anticorpos exibirão ainda uma afinidade de ligação a local único (KD) de pelo menos 10"5 M, preferencialmente de pelo menos 10~6-10~7 M, mais preferencialmente de pelo menos 10“ 8 M, e ainda mais preferencialmente de pelo menos 10’9 M, tal como IO’10 M, segundo medido através de um ensaio padronizado e conhecido neste campo técnico como o Biacore, sendo efectuada a comparação com controlos apropriados. Poderá também ser atingida uma afinidade de ligação de ΙΟ-11 Μ, ΙΟ’13 Μ, IO’15 M, 10“17 M e 10“19 M. Estes ensaios são automatizados e possibilitam a medição da especificidade e da reactividade cruzada do MAb, parâmetros que poderão também ser ensaiados usando técnicas padronizadas conhecidas neste campo. São fornecidos detalhes sobre os ensaios Biacore no "BIApplications Handbook" da Biacore. Os métodos descritos em WO 01/27160 podem ser usados para modular a afinidade de ligação. Se desejado, os anticorpos (policlonais ou monoclonais) poderão ser marcados usando técnicas convencionais. Os marcadores adequados incluem fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos (particularmente 32P e 125I), reagentes densos a 18 electrões, enzimas e ligandos com parceiros de ligação especifica. Os enzimas são tipicamente detectados por intermédio da sua actividade. Por exemplo, a peroxidase de rábano (HRP) é geralmente detectada através da sua capacidade para converter a 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) num pigmento azul, quantificável por um espectrofotómetro. 0 termo "parceiro de ligação especifica" refere-se a uma proteína que tem a capacidade de se ligar a uma molécula de ligando com elevada especificidade, tal como acontece, por exemplo, com um antigénio e um anticorpo monoclonal específico para este. Outros parceiros de ligação específica incluem biotina e avidina ou estreptavidina, IgG e proteína A, e os numerosos pares de receptor-ligando conhecidos neste campo técnico. Deve entender-se que a descrição acima não pretende categorizar os diferentes marcadores em classes distintas, uma vez que o mesmo marcador poderá actuar de diversos modos distintos. Por exemplo, o 125I poderá actuar como um marcador radioactivo ou como um reagente denso a electrões. A HRP poderá funcionar como uma enzima ou como um antigénio para um MAb. Ainda, é possível combinar vários marcadores para obter o efeito desejado. Por exemplo, os MAbs e a avidina requerem também marcadores para a prática desta invenção: assim, poderá marcar-se um MAb com biotina e detectar a sua presença com avidina marcada com 125I, ou com um MAb anti-biotina marcado com HRP. Outras permutas e possibilidades se tornarão facilmente evidentes aos técnicos de perícia média, sendo consideradas como equivalentes dentro do âmbito da presente exposição. Os anticorpos a usar de acordo com esta exposição podem ser produzidos através de qualquer técnica adequada. Por exemplo, WO 01/27160 descreve um método para conferir a afinidade de ligação de uma CDR dadora a uma framework aceitadora na região variável de um anticorpo. O método pode 19 ainda ser usado para optimizar a afinidade de ligação de uma região variável ou de um anticorpo, tal como aumentar a afinidade de ligação. Os métodos para a produção de anticorpos humanizados possuindo uma ou mais CDRs são apresentados na Patente US N° 6.180.370. Os métodos para a produção de anticorpos que foram optimizados para administração a seres humanos estão expostos em WO 00/34317, a qual descreve a produção de proteínas que foram modificadas para se tornarem menos imunogénicas ou não imunogénicas. A Patente US N° 5.514.548 apresenta métodos para a selecção de proteínas de ligação a ligandos, tais como anticorpos, que se ligam com elevada afinidade a um ligando-alvo. A Patente US N° 5.877.397 apresenta animais transgénicos não humanos que têm a capacidade de produzir anticorpos heterólogos. FORMULAÇÕES E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO Os anticorpos desta exposição são administrados a uma concentração que é terapeuticamente eficaz para prevenir ou para tratar doenças mediadas por anticorpos, tais como alergias, LES, CBP, PTI, esclerose múltipla, psoríase, doença de Crohn, rejeição de enxertos e linfoma a células B. Para atingir este objectivo, os anticorpos poderão ser formulados usando uma variedade de excipientes aceitáveis conhecidos neste campo. Tipicamente, os anticorpos são administrados por injecção intravenosa ou intraperitoneal. Os métodos para efectuar esta administração são conhecidos dos técnicos de perícia média. Será ainda possível obter composições que poderão ser administradas por via tópica ou oral, ou que poderão ser transmitidas através de membranas mucosas. Antes da sua administração aos pacientes, poderão adicionar-se agentes de formulação aos anticorpos. É preferida uma formulação líquida. Por exemplo, estes agentes de 20 formulação poderão incluir óleos, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sais, tampões, albumina, surfactantes ou agentes formadores de volume. De preferência, os hidratos de carbono incluem açúcares ou açúcares alcoólicos, tais como mono-, di- ou polisacáridos, ou glucanos solúveis em água. Os sacáridos ou glucanos poderão incluir frutose, dextrose, lactose, glucose, manose, sorbose, xilose, maltose, sacarose, dextrano, pululano, dextrina, alfa e beta-ciclodextrina, amido solúvel, amido hidroxietílico e carboximetilcelulose, ou misturas destes. A sacarose é particularmente preferida. Um "açúcar alcoólico" é definido como um hidrocarboneto de C4 a C8 possuindo um grupo -OH e inclui galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol e arabitol. 0 manitol é particularmente preferido. Estes açúcares ou açúcares alcoólicos acima mencionados poderão ser usados individualmente ou em combinação. Não existe um limite fixo à quantidade a usar, desde que o açúcar ou açúcar alcoólico seja solúvel na preparação aquosa. Preferencialmente, a concentração de açúcar ou de açúcar alcoólico encontra-se entre 1,0 p/v% e 7,0 p/v%, mais preferencialmente entre 2,0 e 6,0 p/v%. De preferência, os aminoácidos incluem formas levógiras (L) da carnitina, arginina e betaína; no entanto, poderão ser adicionados outros aminoácidos. Os polímeros preferidos incluem a polivinilpirrolidona (PVP) com um peso molecular médio entre 2.000 e 3.000, ou o polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular médio entre 3.000 e 5.000. É ainda preferida a utilização de um tampão na composição para minimizar as alterações de pH da solução antes da liofilização ou após a reconstituição. Praticamente qualquer tampão fisiológico poderá ser usado, mas os tampões de citrato, fosfato, succinato e glutamato, ou suas misturas, são preferidos. O tampão de citrato é particularmente preferido. De preferência, 21 a concentração estará entre 0,01 e 0,03 molar. Os surfactantes que podem ser adicionados à formulação são apresentados nas EP Nos. 270.799 e 268.110. Adicionalmente, os anticorpos poderão ser quimicamente modificados por conjugação covalente com um polímero para aumentar a sua semi-vida de circulação, por exemplo. Os polímeros preferidos, e os métodos para a sua ligação aos péptidos, são apresentados nas Patentes US Nos. 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; e 4.609.546. Os polímeros preferidos são os polióis polioxietilados e o polietilenoglicol (PEG). O PEG é solúvel em água à temperatura ambiente e a sua fórmula geral corresponde a R(0—CH2 —CH2)n O—R, em que R poderá ser hidrogénio ou um grupo protector tal como um grupo alquilo ou alcanol. Preferencialmente, o grupo protector possui entre 1 e 8 carbonos e mais preferencialmente corresponde a metilo. O símbolo n é um número inteiro positivo, preferencialmente entre 1 e 1.000, mais preferencialmente entre 2 e 500. O PEG possui um peso molecular médio preferido entre 1000 e 40.000, mais preferencialmente entre 2000 e 20.000, ainda mais preferencialmente entre 3.000 e 12.000. De preferência, o PEG possui pelo menos um grupo hidroxi, mais preferencialmente um grupo hidroxi terminal. É este grupo hidroxi que é preferencialmente activado para reagir com um grupo amino livre do inibidor. No entanto, deve entender-se que o tipo e quantidade dos grupos reactivos poderá fazer-se variar para se obter um conjugado covalente de PEG/anticorpo segundo a presente invenção. Os polióis polioxietilados solúveis em água são também úteis no âmbito da presente invenção. Estes incluem sorbitol polioxietilado, glucose polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), etc. O POG é preferido. Uma das razões para tal é que a estrutura principal de glicerol do glicerol 22 polioxietilado é a mesma estrutura que ocorre naturalmente em, por exemplo, os mono-, di- e triglicéridos de animais e humanos. Deste modo, esta ramificação poderá não necessariamente ser vista como um agente estranho no organismo. 0 POG possui um peso molecular preferido na mesma gama que o PEG. A estrutura do POG é apresentada em Knauf et ai., J. Bio. Chem. 263:15064-15070 (1988), e uma exposição sobre conjugados de POG/IL-2 é encontrada na Pat. US No. 4,766,106. O lipossoma constitui outro sistema de administração de fármacos usado para aumentar a semi-vida de circulação. Os métodos para preparação de sistemas de administração com lipossomas são apresentados em Gabizon et al., Câncer Research 42:4734 (1982); Cafiso, Biochem Biophys Acta 649:129 (1981); e Szoka, Ann Rev Biophys Eng 9:467 (1980). Existem outros sistemas de administração de fármacos conhecidos neste campo técnico, os quais são descritos em, p.ex., Poznansky et al., Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. 1980), págs. 253-315; M. L.Poznansky, Pharm Revs 36:277 (1984). Depois de preparada a composição farmacêutica líquida, esta é preferencialmente liofilizada para evitar a degradação e para preservar a esterilidade. Os métodos para a liofilização de composições líquidas são já conhecidos dos técnicos de perícia média. Imediatamente antes do uso, a composição poderá ser reconstituída com um diluente estéril (solução de Ringer, água destilada ou soro fisiológico estéril, por exemplo), o qual poderá conter ingredientes adicionais. Após reconstituição, a composição é preferencialmente administrada aos indivíduos usando os métodos conhecidos dos peritos na técnica. Tal como acima se refere, os anticorpos e as composições desta invenção podem ser usadas no tratamento de pacientes humanos para a profilaxia ou tratamento de doenças mediadas 23 por anticorpos tais como alergias, LES, CBP e PTI. A via de administração preferida é a via parentérica. Na administração parentérica, as composições desta invenção serão formuladas numa forma de dosagem unitária injectável tal como uma solução, suspensão ou emulsão, em associação com um veiculo parentérico farmaceuticamente aceitável. Tais veículos são inerentemente não tóxicos e não terapêuticos. Como exemplos de tais veículos encontram-se o soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hanks. Poderão também ser usados veículos não aquosos, tais como óleos fixos e etiloleato. Um veículo preferido corresponde a dextrose a 5% em soro fisiológico. 0 veículo poderá conter quantidades menores de aditivos tais como substâncias que reforçam a isotonicidade e a estabilidade química, incluindo tampões e conservantes. A dosagem e a via de administração dependerão do indivíduo a tratar. Em geral, as composições são administradas de modo a que os anticorpos sejam fornecidos numa dose de entre 1 yg/kg a 20 mg/kg, mais preferencialmente entre 20 yg/kg e 10 mg/kg, e ainda mais preferencialmente entre 1 e 7 mg/kg. Apropriadamente, a dose é administrada sob a forma de infusão ou como uma dose de bólus, para aumentar os níveis circulantes em 10-20 vezes e durante 4-6 horas após a dose de bólus. Poderá ainda usar-se uma infusão contínua após a dose de bólus. Se assim for, os anticorpos podem ser infundidos a uma dose de entre 5 e 20 yg/kg/minuto, mais preferencialmente entre 7 e 15 yg/kg/minuto. Os regimes terapêuticos adequados estão expostos em WO 00/27428 e WO 00/27433. Uso da Terapêutica com Anticorpos Anti-CD40 para o Tratamento do Linfoma Não-Hodgkin O Linfoma Não-Hodgkin (LNH) tem origem em componentes do baço, timo e nódulos linfáticos ((Jandl J.H., Non-Hogkin's 24 lymphomas, em Jandl JH (ed) : Blood, Textbook of Hematology, Boston, MA, Little Brown, 1996, págs. 853-887). 0 LNH abrange um grupo de doenças linfocíticas malignas que derivam primariamente das células B e T. Os pacientes com LNH de baixo grau geralmente não respondem à radioterapia e à quimioterapia. Esta baixa taxa de resposta e a elevada probabilidade de recidivas contribuem para que o tempo médio de sobrevivência dos pacientes seja inferior a 9 anos. 0 desequilíbrio resultante da sinalização de crescimento/sobrevivência pelo CD40 e da invalidação do sinal de morte celular por Fas desempenha um importante papel na patogénese das doenças malignas de baixo grau da linhagem B, incluindo a leucemia linfocítica crónica (LLC) e o LNH (Ghia P., Adv. Câncer Res., 2000, 79:157-73). Os estudos sobre o LNH de baixo grau sugerem que o desencadear da doença se deve à acumulação das células de linfoma como resultado da redução da apoptose através da via de Fas e do aumento do sinal de sobrevivência através de CD40 (Ghia P., Adv. Câncer Res., 2000, 79:157-73). Este mecanismo poderá explicar a insensibilidade das células de linfoma à quimioterapia ou à radioterapia, as quais se dirigem especificamente às células em proliferação activa. A exposição relaciona-se ainda com uma nova terapêutica para o LNH que é caracterizada por compreender o uso de um anticorpo anti-CD40 para bloquear o sinal de sobrevivência para as células de LNH. Esta estratégia é apoiada por diversas observações publicadas na literatura científica. O CD40 é expresso à superfície das células B ao longo de todo o desenvolvimento da célula B. Os estudos têm demonstrado que o CD40 fornece um sinal de sobrevivência às células B malignas e estimula o seu crescimento in vitro (Romano M.F. et al., Leuk Lymphoma, 2000 Jan., 36(3-4):255-62,- Furman R.R., J. Immunol., 2000 Feb. 15, 164(4):2200-6/ Kitada S., Br. J. Haematol., 1999 25 Sep., 106(4):995-1004/ Romano M.F., Blood, 1998 Aug. 1, 92(3):990-5/ Jacob A., Leuk. Res., 1998 Apr., 22(4):379-82/ Wang D., Br. J. Haematol., 1997 May, 97(2):409-17/ Planken E. V., Leukemia, 1996 Mar., 10(3):488-93/ Greiner A., Am. J. Pathol., 1997 May, 150(5):1583-93). Os estudos em pacientes indicam existir um microambiente fornecedor de CD40L para a sinalização por CD40 in vivo: o CD40 é expresso pelas células de linfoma de 86% dos pacientes com LNH da linhagem B (Uckun F. M., Blood, 1990 Dec. 15, 76(12):2449-56). A descoberta da co-expressão de CD40/CD40L nas mesmas células de linfoma B levanta a possibilidade de existir um loop autócrino de sinal de crescimento nos pacientes com LNH (Clodi K., Br. J. Haematol., 1998 Oct., 103(1):270-5). Verifica-se também um aumento significativo de CD40L solúvel no soro dos pacientes com LNH (Younes A., Br. J. Haematol., 1998 Jan., 100(1):135-
41). O CD40L solúvel poderá induzir a proliferação das células de linfoma em culturas primárias de células de linfoma NH (Andersen N.S., Blood, 2000 Sep. 15, 96(6):2219-25/ Buske C., Leukemia, 1997 Nov., 11(11):1862-7). A expressão de CD40L está aumentada na zona marginal do tumor nos linfomas MALT de baixo grau (Carbone A., Am. J. Pathol., 1995 Oct., 147(4):912-22/ Greiner A., Dev. Immunol., 1998, 6(3-4):17-95). Dado o elevado grau de expressão de CD40 pelos tumores da linhagem celular B e a sua função como sinal de sobrevivência para estas células malignas, um anticorpo antagonista anti-CD40 poderá possuir valor terapêutico no LNH. O anticorpo 15B8 é um anticorpo monoclonal anti-CD40 humano do subtipo IgG2 humano que é gerado através da imunização de ratinhos transgénicos portadores do locus de cadeia pesada da IgG2 humana. Para demonstrar a potencial eficácia de 15B8 num modelo pré-clinico in vitro de LNH, o anticorpo 15B8 foi testado usando células B malignas (células de LNH) obtidas a partir de pacientes com LNH que haviam sido 26 tratados com rituximab ou que eram naive face ao rituximab. 0 rituximab é um anticorpo monoclonal anti-CD20 usado no tratamento de casos resistentes ou em recidiva de LNH de baixo grau ou folicular. Uma vez que as células primárias de linfoma não proliferam nos meios de cultura normais e sofrem apoptose após alguns dias em cultura, as células tumorais foram co-cultivadas com células alimentadoras transfectadas com ligando de CD40 (CD40L) irradiado (Arpin, C., Science, 1995, 268:720-722) na presença ou na ausência do factor de crescimento das células B Interleucina-4 (IL—4) . Os anticorpos (agonista anti-CD40 MS81 ou antagonista anti-CD40 15B8, ou controlo de isotipo huIgG2) à concentração indicada (de 0,01 mg/ml a 10 mg/ml) foram então adicionados à cultura. Após a incubação a 37 °C durante 48 horas, as células em cultura foram pulsadas com 3H-timidina durante 18 horas. As células foram então recolhidas e analisadas quanto à quantidade de 3H-timidina incorporada (Schultz, J.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, 92:8200-8204). Todas as amostras foram analisadas em triplicado. Nestes ensaios com culturas primárias de células de LNH, o anticorpo 15B8 isolado ou em combinação com IL-4 não estimulou a proliferação das células de LNH in vitro. Por contraste, o anticorpo agonista anti-CD40 MS81 induziu a proliferação de células de LNH sob as mesmas condições. O anticorpo 15B8 exibiu uma inibição estatisticamente significativa da proliferação das células de LNH estimuladas por CD40L (P=0,05) e por CD40L e IL-4 (P< 0,05) in vitro. Aos intervalos de concentração de 1-10 yg/ml ou 0,1-10 yg/ml, respectivamente, 15B8 exibiu uma inibição relacionada com a dose e estatisticamente significativa da proliferação de células de LNH estimuladas por CD40L ou por CD40L e IL-4 (P<0,005). Existem dois tipos de modelos pré-clinicos que são actualmente usados na avaliação de MAbs específicos para 27 antigénios humanos com o fim de desenvolver terapêuticas para linfomas. Um dos modelos é o modelo in vivo de xenotransplante em ratinhos, no qual as linhas celulares de linfoma transformadas por EBV, tais como as células Daudi (linfoma de Burkitt) ou Raji (linfoma de Burkitt), são xenotransplantadas sobre ratinhos SCID/nus. No entanto, nestes modelos, os resultados reflectem apenas os efeitos sobre aquela linha celular imortalizada em particular, a qual deriva de uma célula transformada por EBV. É sabido que as células do linfoma de Burkitt são células linfoblastóides (Ambinder R.F., Câncer Treat. Res., 1999, 99:27-45; Quintanilla-Martinez L., Leuk. Lymphoma, 1998 Jun., 30(1-2):111-21; Klein G., Acta Microbiol. Immunol. Hung., 1996, 43(2-3):97-105) , enquanto que as células de linfoma dos pacientes com LNH são consideradas como correspondendo ao estádio de célula B madura (Ghia P., Adv. Câncer Res., 2000, 79:157-73). A transformação por EBV das células B resulta na modificação de muitos componentes na via de sinalização por CD40 (Uchida J., Science, 1999 Oct. 8, 286(5438):300-3; Farrell P.J., Biomed. Pharmacother., 1997, 51(6-7):258-67). Em contraste com o efeito da sinalização por CD40 em células de LNH e em células B normais, a sinalização por CD40 leva à suspensão do crescimento em linhas celulares de linfoma de Burkitt transformadas por EBV (Fukuda M., Virai Immunol., 2000, 13(2):215-29; Baker M.P., Blood, 1998 Oct. 15, 92(8):2830-43). Assim, os resultados do teste de um MAb antagonista anti-CD40 (15B8) nos modelos de xenotransplante poderão não possibilitar a previsão da resposta ao anticorpo (15B8) por parte dos pacientes com LNH. O outro modelo, que corresponde ao ensaio in vitro da inibição do crescimento de células de linfoma obtidas a partir de pacientes com LNH, foi usado nesta invenção. Este modelo tem a vantagem de os resultados obtidos serem preditivos da 28 sensibilidade das células de linfoma de pacientes com LNH ao agente (15B8) testado. No entanto, os resultados são obtidos a partir de um estudo in vitro sob condições definidas. Um estudo anteriormente publicado referiu que um anticorpo de rato anti-CD40 de ratinho, que não exibiu a capacidade de induzir ADCC e CDC in vitro, evidenciou uma boa eficácia em dois modelos de linfoma B de ratinhos singénicos (BCLl e A31) (Tutt A.L., J. Immunol., 1998 Sep. 15, 161(6):3176-85). 0 efeito anti-tumoral com o anti-CD40 de ratinho desenvolveu-se mais lentamente do que o efeito de um anti-Id testado. 0 anticorpo anti-CD40 de ratinho poderá actuar bloqueando os sinais criticos de crescimento que são dependentes da expressão de CD40 de superfície, e não por sinalização directa como o anti-Id nos modelos de ratinho testados. Este estudo sugere que o bloqueio da sinalização por CD40/CD40L através de um anti-CD40 poderá ser eficaz in vivo. Quando testado, o anticorpo 15B8 não se ligou aos receptores Fcy in vitro e não induziu ADCC e CDC in vitro, uma vez que pertence ao subtipo IgG2 humano. 0 anticorpo 15B8 possui propriedades similares ao anticorpo de rato anti-CD40 de ratinho. Estes dados apoiam a hipótese de que 15B8 será benéfico para os pacientes com LNH, especialmente para os pacientes resistentes ao rituxan. EXEMPLOS MÉTODOS GERAIS Ensaio de ELISA para a Quantificação de Imunoglobulinas As concentrações de IgM e IgG humanas foram estimadas por ELISA. Revestiram-se placas de ELISA de 96 poços com 2 yg/ml de MAb de cabra anti-IgG humana (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) ou com 2 yg/ml do MAb 4102 de cabra anti-IgM humana (BioSource International, Calif.) em tampão de carbonato 0,05 M (pH 9,6), por incubação durante 16 horas a 29 4°C. As placas foram lavadas por 3 vezes com PBS-Tween 20 a 0,05% (PBS-Tween) e foram saturadas com BSA durante 1 hora. Após 2 lavagens, as placas foram incubadas durante 2 horas a 37°C com diferentes diluições das amostras de teste. Após 3 lavagens, a Ig ligada foi detectada por incubação durante 2 horas a 37°C com 1 yg/ml de MAb de cabra anti-IgG humana marcado com peroxidase ou com 1 pg/ml de MAb de cabra anti-IgG humana marcado com peroxidase. As placas foram lavadas 4 vezes e a actividade da peroxidase ligada foi revelada através da adição de O-fenilenodiamina como substrato. Foram usados padrões de IgG humana ou de IgM humana (Caltaq, Burlingame, CA) para estabelecer uma curva-padrão para cada ensaio. Isolamento das Células Mononucleares do Sangue Periférico (CMSP) a partir de Sangue Periférico Humano Adicionaram-se 20 ml de solução de Ficoll-Paque (baixas endotoxinas, Pharmacia) a cada um de 3 tubos de poliestireno de 50 ml, 30 minutos antes de adicionar o sangue. A solução de Ficoll-Paque foi aquecida até à temperatura ambiente. Prepararam-se 3 L de uma diluição de hipoclorito de sódio a 1:10, a qual foi usada para lavar todos os tubos e pipetas que contactaram com o sangue. Dispôs-se uma camada de sangue sobre a solução de Ficoll-Paque sem alterar a camada de Ficoll, a 1,5 ml de sangue/1 ml de Ficoll-Paque. Os tubos foram centrifugados a 1700 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente, com o travão da centrífuga desligado. Removeu-se o máximo possível da camada superior (plasma), minimizando o vácuo de modo a evitar remover a segunda camada de solução. A segunda camada, que contém os linfócitos B e T, foi recolhida usando uma pipeta Pasteur estéril e colocada em dois tubos de poliestireno de 50 ml. A recolha foi diluída em 3 x o volume de RPMI frio sem aditivos, e os tubos foram centrifugados a 1000 rpm durante 10 minutos. O meio foi removido por aspiração 30 e as células em ambos os tubos de 50 ml foram ressuspensas num total de 10 ml de RPMI frio (com aditivos) e foram transferidas para um tubo de 15 ml. As células foram contadas usando um hemacitómetro, sendo então centrifugadas a 1000 rpm durante 10 minutos. O meio foi removido e as células foram ressuspensas em 4 ml de RPMI. As CMSP estavam contidas nesta fracção. Isolamento das células B a partir das CMSP Colocaram-se 100 μΐ de Dynabeads (anti-hCD19) num tubo de plástico de 5 ml. Adicionaram-se 3 ml de PBS estéril às esferas, misturando; colocou-se então o tubo num suporte magnético, sendo ai deixado durante 2 minutos. A solução foi removida usando uma pipeta Pasteur. Adicionaram-se de novo 3 ml de PBS estéril, agitando; o tubo foi colocado no suporte magnético e foi ai deixado durante 2 minutos. Este procedimento com PBS estéril foi repetido uma outra vez, perfazendo um total de 3 lavagens. As CMSP foram adicionadas às esferas e incubadas, com agitação, durante 30 minutos a 4°C. O tubo contendo as CMSP e as esferas foi colocado no suporte magnético durante 2 minutos, transferindo-se a solução para um novo tubo de 5 ml no suporte magnético. Após 2 minutos, a solução foi transferida para um novo tubo de 15 ml. Este passo foi repetido por mais quatro vezes e as soluções das primeiras quatro vezes foram recolhidas no tubo de 15 ml, sendo então centrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos. Este passo produziu o pellet para a separação das células T. Adicionaram-se 100 μΐ de RPMI (com aditivos) para recolher as esferas, e a solução foi transferida para um tubo de 0,7 ml. Adicionaram-se 10 μΐ de DetachaBeads (Dynal) à suspensão à temperatura ambiente, deixando-se a suspensão em rotação durante 45 minutos. A suspensão foi transferida para um novo tubo de 5 ml e adicionaram-se 3 ml de RPMI (com aditivos) . O 31 tubo foi colocado no suporte magnético durante 2 minutos. A solução foi transferida para um novo tubo de 5 ml no suporte durante 2 minutos, e seguidamente para um tubo de 15 ml. 0 passo anterior foi repetido por mais três vezes, recolhendo-se a solução no tubo de 15 ml. 0 tubo de 15 ml foi centrifugado a 1000 rpm durante 10 minutos, sendo então as células ressuspensas em 10 ml de RPMI. O passo de lavagem foi repetido por mais duas vezes, para um total de 3 lavagens. As células foram contadas antes da última centrifugação. Este passo completou a purificação das células B. As células foram armazenadas em 90% FCS e 10% DMSO e congeladas a -80°C. Isolamento das Células T Foi preparada uma Coluna de Enriquecimento de células T humanas (R&D Systems, kit de coluna de anti-hCD3) usando 20 ml de IX tampão de lavagem da coluna, resultante da mistura de 2 ml de 10X tampão de lavagem da coluna com 18 ml de água destilada estéril. A coluna foi limpa com etanol a 70% e colocada sobre um tubo de 15 ml. A tampa superior da coluna foi removida em primeiro lugar para evitar o arrastamento de ar para a parte inferior da coluna. Seguidamente, a tampa inferior da coluna foi removida e a ponta foi limpa com etanol a 70%. Deixou-se escoar o fluido da coluna para o tubo de 15 ml. Foi colocado um novo tubo de 15 ml estéril sob a coluna após o tampão da coluna ter escoado até ao nível do filtro branco. A fracção de CMSP empobrecida em células B foi suspensa em 1 ml de tampão e adicionada pelo topo da coluna. Permitiu-se a incubação das células com a coluna à temperatura ambiente durante 10 minutos. As células T foram eluídas a partir da coluna por meio de 4 alíquotas com 2 ml cada de IX tampão de lavagem da coluna. As células T recolhidas foram centrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em 10 ml de RPMI. As 32 células foram contadas e centrifugadas uma outra vez. 0 sobrenadante foi removido, completando a purificação das células T. As células foram armazenadas em 90% FCS e 10% DMSO e foram congeladas a -80°C. Para os procedimentos acima, a composição de RPMI conteve 10% FCS (inactivado a 56°C durante 45 min), 1% Pen/Strep (lOOu/ml Penicilina, 0,1 yg/ml Estreptomicina) , 1% de Glutamato, 1% de piruvato de sódio, 50 μΜ 2-ME. Ensaio de Citofluorometria de Fluxo Incubaram-se células Ramos (106 células/amostra) em 100 μΐ de anticorpo primário (10 pg/ml em PBS-BSA) durante 20 min a 4°C. Após 3 lavagens com PBS-BSA ou HBSS-BSA, as células foram incubadas em 100 μΐ de fragmentos F(ab')2 de anticorpos de cabra anti-(IgG humana) marcados com FITC (Caltaq) durante 20 min a 4°C. Após 3 lavagens com PBS-BSA e uma lavagem com PBS, as células foram ressuspensas em 0,5 ml de PBS. As análises foram efectuadas com um FACSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, Calif.) . Geração de Clones de Hibridoma Os esplenócitos de ratinhos imunizados foram fundidos com células de mieloma murino SP2/0 ou P3 x 63Ag8.653 a uma razão de 10:1 usando polietilenoglicol a 50% tal como anteriormente descrito por de Boer e tal., J Immunol. Meth. 113:143 (1988). As células fundidas foram ressuspensas em meio IMDM completo suplementado com hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,01 mM), timidina (0,016 mM) e 0,5 ng/ml de hIL-6 (Genzyme, Cambridge, Mass.). As células fundidas foram então distribuídas entre os poços de placas de cultura de tecidos com 96 poços, de modo a que cada poço contivesse em média um hibridoma em desenvolvimento. 33 Após 10-14 dias, os sobrenadantes das populações de hibridoma foram rastreados quanto à produção de anticorpos específicos. Para o rastreio da produção de anticorpos específicos pelos clones de hibridoma, os sobrenadantes de cada poço foram reunidos num pool e testados quanto à especificidade da actividade anti-CD40 por ELISA, em primeiro lugar. Os positivos foram então usados para a marcação celular por fluorescência das células B transformadas por EBV, tal como descrito para o ensaio de FACS, acima. As células de hibridoma positivas foram clonadas duas vezes por diluição limitante em IMDM/FBS contendo 0,5 ng/ml de hIL-6. EXEMPLO 1 EXPRESSÃO DE CD40 HUMANO EM CÉLULAS SF9 Cultivaram-se células de insecto Sf9 infectadas com o baculovírus recombinante de Autographa californica (AcNPV) codificando para CD40, durante 48 horas em placas de 24 poços. Após a remoção do meio de cultura de tecidos, as placas foram incubadas durante 45 minutos à temperatura ambiente (TA) com 0,25 ml de anticorpo em PBS com 1% BSA (PBS-BSA) . Após três lavagens com PBS-BSA, as placas foram incubadas durante 35 minutos à TA com 250 μΐ de uma diluição a 1/250 de imunoglobulinas de cabra anti-(Ig total de ratinho) conjugadas com peroxidase de rábano (Zymed, San Francisco, Calif.) em PBS-BSA. A actividade da peroxidase não ligada foi removida por meio de cinco lavagens com PBS-BSA. A actividade da peroxidase ligada foi revelada pela adição de uma mistura de reacção que foi preparada diluindo 0,5 ml de uma solução de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina a 2 mg/ml em etanol até um volume de 10 ml com acetato de sódio 10 mM, tampão EDTA 10 mM (pH 5,0) e adicionando 0,03% (v/v) de H2O2. A reacção foi interrompida após 10 minutos pela adição de 100 μΐ de H2SO4 1 M. 34 EXEMPLO 2 ANTICORPOS PRODUZIDOS EM RATINHOS TRANSGÉNICOS PARA IMUNOGLOBULINAS HUMANAS Os ratinhos transgénicos para o locus de cadeia pesada de IgG2 humana e para o locus de cadeia leve K humana foram imunizados com células Sf9 expressando CD40 humano. 0 método de imunização foi efectuado tal como descrito por de Boer, Patente US N° 6.004.552. Abreviadamente, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente ao dia 0 e ao dia 14 com 5 x 106 células Sf9 infectadas com o virus AcCD40. Ao dia 21, obteve-se 100 μΐ de soro para pesquisa da presença de anticorpos específicos. Após um período de teste de pelo menos duas semanas, os ratinhos receberam uma injecção final com 5 x 106 células infectadas com o vírus AcCD40. Três dias após esta última injecção, as células de baço foram usadas para fusão celular. Os ratinhos foram seleccionados para fusão com base na reactividade dos seus soros com CD40 recombinante num ensaio ELISA. Os esplenócitos dos ratinhos imunizados foram fundidos com células de mieloma de ratinho (NS/0) através do método de Kohler e Milstein, Nature 256:495-96 (1975), com modificações. Os hibridomas cultivados em meio selectivo HAT foram seleccionados para caracterização mais detalhada com base na sua capacidade para se ligar a CD40 num ensaio ELISA. Os hibridomas produzindo anticorpos que se ligaram a um lisado de células Sf9 não transfectadas ou a anticorpo anti-cadeia leve de ratinho foram rejeitados. Os hibridomas produzindo anticorpos de ligação a CD40 que não se ligaram ao lisado de células Sf9 ou ao anticorpo anti-cadeia leve de ratinho foram subclonados. Os subclones foram usados para produzir anticorpos para caracterização mais detalhada. Os anticorpos de hibridoma foram ainda testados quanto à sua capacidade para marcar células de linfoma Ramos, as quais expressam CD40 35 humano à sua superfície. As concentrações de anticorpos que forneceram metade da ligação máxima ao CD40, tal como medido por ELISA, são abaixo apresentadas na Tabela 2. Tabela 2. Concentração de anticorpo anti-CD4Q que forneceu metade da ligação máxima ao CD40, avaliada por ELISA Anticorpo EC50 (ng/ml) 5H7 10 12D9 15 15B8 40 20C4 15 9F7 15 Os anticorpos de hibridoma foram então seleccionados com base na sua capacidade para inibir a produção de IgM pelas células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T humanas do sangue periférico activadas por anti-CD28 (Figura 1). Os anticorpos de hibridoma foram ainda rastreados quanto à sua capacidade para inibir a proliferação de células B humanas do sangue periférico induzidas por CD40L e por anti-IgM (Figura 2). Os hibridomas foram também rastreados quanto à sua capacidade para induzir a proliferação de células B humanas do sangue periférico em repouso (Figura 3) . Alguns hibridomas, como o 36C4-G2, exibiram uma actividade estimulatória marcada. Assim, mesmo possuindo a capacidade de se ligar a CD40, nem todos os anticorpos humanos exibiram o efeito inibitório desejado. Entre aproximadamente 36 hibridomas, foram seleccionados quatro hibridomas que possuíam uma actividade inibitória óptima. 36 EXEMPLO 3 PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO DE HIBRIDOMAS SELECCIONADOS Foram seleccionados quatro hibridomas com base no seu efeito inibitório sobre a activação de células B, tal como acima se descreve no Exemplo 2. As suas propriedades de ligação foram determinadas por avaliação BIAcore, usando CD40 recombinante solúvel como fase móvel e sendo os anticorpos anti-CD40 capturados pela superfície do sensor. Os anticorpos inibitórios exibiram diversas afinidades de ligação, tal como mostra a Tabela 3. Tabela 3 Anticorpo Ka (M-ls-1) Kd (seg-1) KD (M) 5H7 Fab* 2.4 x 10b 3.5 x 10'3 1.4 x 10"y 5H7 Ab** 1.5 x 10b 4.1 x 10'3 2.8 x 10"y 15B8** 1.16 x 10b 3.6 x 10'3 3.1 x 10"y 20C4** 1.9 x 10b 3.6 x 10"* 1.8 x 10_/ 12D9** 1.5 x 10b 1.0 x 10"1 6.7 x 10"7 9F7** 1.35 x 10" 2.2 x 10'* 1.7 x 10'' * Fase fixa = CD40, Fase móvel = Fab ** Fase fixa = anticorpo, Fase móvel = sCD40 EXEMPLO 4 LIGAÇÃO VARIÁVEL DOS HIBRIDOMAS A CD40 As propriedades relativas de ligação dos anticorpos monoclonais seleccionados foram examinadas por citometria de fluxo. O sangue total foi incubado durante 30 minutos com várias concentrações de anticorpo de hibridoma não marcado mais 0,1 pg de 15B8 e de anti-CD20-PECy5 conjugados com FITC. Os glóbulos vermelhos foram então lisados, as populações de leucócitos foram fixadas e foram adquiridas as preparações para análise. 37 Estes estudos mostram que ο 15B8 não marcado bloqueia a ligação de 20C4 não marcado aos linfócitos CD20+ do sangue periférico humano (Tabela 4). Por contraste, o 20C4 não marcado bloqueou apenas fracamente a ligação de 15B8 marcado à mesma população celular. Assim, se bem que os dois anticorpos reconheçam os mesmos epitopos ou epitopos estreitamente relacionados, a diferença de afinidade evidenciada através da análise Biacore reflecte-se igualmente na capacidade competitiva mais fraca do anticorpo de mais baixa afinidade. Os MAbs marcados foram usados para marcar as células do sangue periférico de humanos, macacos Rhesus (Macaca mulatta) e macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) . Todas as três espécies foram marcadas pelos MAbs 15B8, 20C4, 12D9 e 9F7 (Figura 7). Tabela 4 huWB % redução Tubo # Anticorpo-1 v»g Anticorpo—2 pg #1219 IMF* da IMF 1 - - 15B6-FITC 0,1 100 yL 72,0 2 HuIgG2 0,1 15B8-FITC 0,1 100 pL 117,5 -63,19% 3 HuIgG2 0,5 15B8-FITC 0,1 100 pL 97,0 -34,72% 4 HuIgG2 1 15B8-FITC 0,1 100 pL 103,8 -44,17% 5 15B8 0,1 15B8-FITC 0,1 100 pL 22,0 69,44% 6 15B8 0,5 15B8-FITC 0,1 100 pL 20,5 71,53% 7 15B8 1 15B8-FITC 0,1 100 pL 25,9 64,03% 8 20C4 0,1 15B8-FITC 0,1 100 pL 91,6 -27,22% 9 20C4 0,5 15B8-FITC 0,1 100 pL 70,3 2, 36% 10 20c4 1 15B8-FITC 0,1 100 pL 61,0 15,28% 11 - - 20C4-FITC 0,1 100 pL 82,3 12 HuIgG2 0,1 20C4-FITC 0,1 100 pL 82,6 -0,61% 13 HuIgG2 0,5 20C4-FITC 0,1 100 pL 74,4 9, 60% 14 HuIgG2 1 20C4-FITC 0,1 100 pL 82,4 -0,12% 38 (Continuação) 15 15B8 0,1 20C4-FITC 0,1 100 pL 18,3 77,76% 16 15B8 0,5 20C4-FITC 0,1 100 pL 21,3 74,12% 17 15B8 1 20C4-FITC 0,1 100 pL 22,3 72,90% 18 20C4 0,1 20C4-FITC 0,1 100 pL 30,2 63,30% 19 20C4 0,5 20C4-FITC 0,1 100 pL 22,6 72,54% 20 20C4 1 20C4-FITC 0,1 100 pL 20,8 74,73% *IMF = intensidade média da fluorescência EXEMPLO 5 INIBIÇÃO DA SECREÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS PELAS CÉLULAS B HUMANAS DO SANGUE PERIFÉRICO Revestiram-se placas com anti-CD3 humano (2 pg/ml, UCHTi, NE/LE, Pharmingen) a 4°C durante 12 horas. As placas pré-revestidas foram lavadas 3 x com PBS. As células T foram irradiadas com 3000 Rad. As células B foram ressuspensas em RPMI(+) a 104 por ml. Adicionaram-se 100 μΐ de células B a cada poço, sendo então adicionados anticorpos anti-CD40 aos poços. As células T foram ressuspensas em RPMI (+) a 105 por ml. Adicionou-se IL2 recombinante humana a 200 u/ml (Chiron, solução a 10u/yl água, armazenada a -20°C) à suspensão celular. Depositaram-se 100 μΐ de suspensão em cada poço, misturando-se bem com as células B e os anticorpos. Adicionou-se RPMI( + ) aos poços até um total de 200 μΐ. As placas foram incubadas a 37°C durante 8 dias antes de se recolher o meio, após a centrifugação das células para o ensaio ELISA. Os resultados são abaixo apresentados na Tabela 5. 39 Tabela 5 Efeito dos anticorpos monoclonais na secreção de IqM pelas células B estimuladas por células T Anticorpo D. 0. Nenhum 0,67 15B8 0,35 20C4 0,43 12D9 0,47 13E4 0,37 Os resultados mostram que, na presença de um anticorpo de acordo com a invenção, a secreção da imunoglobulina IgM pelas células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T é diminuída. EXEMPLO 6 INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS B HUMANAS DO SANGUE PERIFÉRICO ESTIMULADAS POR CÉLULAS JURKAT As células B foram purificadas tal como acima se descreve. Adicionaram-se 104 células B purificadas, 105 células Jurkat irradiadas (3000 Rad) e os anticorpos em teste a placas de 96 poços revestidas com anti-CD3. As placas foram incubadas a 37°C durante quatro dias, marcando-se as células com 3H-timidina durante as últimas 18 horas. As células foram recolhidas e contadas. Os resultados são abaixo apresentados na Tabela 6. 40 Tabela 6 Efeito dos anticorpos sobre a proliferação de células B estimuladas por células Jurkat Anticorpo Contagens por minuto (cpm) Nenhum 14.000 5H7, 10 yg/ml 8.000 5H7, 0,1 yg/ml 9.000 15B8, 1 pg/ml 10.500 13E4, 1 yg/ml 11.000 20C4, 1 pg/ml 10.500 Os resultados indicam que na presença dos anticorpos da invenção, a proliferação de células B estimuladas por células Jurkat é inibida. EXEMPLO 7 INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS B HUMANAS DO SANGUE PERIFÉRICO ESTIMULADAS POR CD40L As células B foram purificadas tal como acima descrito. Adicionaram-se 104 células B purificadas, 2 x 104 células CHO-CD40L fixadas por formaldeido e os anticorpos em teste a placas de 96 poços revestidas com anti-CD3. As placas foram incubadas a 37°C durante quatro dias, marcando-se as células com 3H-timidina durante as últimas 18 horas. As células foram recolhidas e contadas. Os resultados são abaixo apresentados na Figura 1. EXEMPLO 8 ESTIMULAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS B As células B (1 x 104 por poço) foram cultivadas em 200 μΐ de RPMI suplementado com soro de bovino fetal a 10% em placas de microtitulação com 96 poços de fundo em U. As células B foram estimuladas pela adição de anticorpos imobilizados anti- 41 (IgM) (5 yg/ml, Sigma). Foram adicionadas concentrações variáveis de MAbs no inicio das microculturas e a proliferação foi avaliada ao dia 4 através da medição da incorporação de 3H-timidina depois de as microculturas terem sido pulsadas durante 18 horas. Os resultados são apresentados na Figura 2. EXEMPLO 9 EFEITO DOS ANTICORPOS ANTI-CD40 SOBRE A PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS B HUMANAS DO SANGUE PERIFÉRICO ESTIMULADAS POR ANTI-IGM Adicionaram-se 104 células B purificadas, esferas de anti-IgM (5 pg/ml, Sigma) e os anticorpos em teste a placas de 96 poços. As placas foram incubadas a 37°C durante quatro dias, marcando-se as células com 3H-timidina durante as últimas 18 horas. As células foram recolhidas e contadas, e os resultados são apresentados na Figura 3. EXEMPLO 10 EFEITO DO CROSSLINKING DOS ANTICORPOS ANTI-CD40 SOBRE A PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS B HUMANAS DO SANGUE PERIFÉRICO Adicionaram-se 104 células B purificadas a placas de 96 poços revestidas com anti-CD40. As placas foram incubadas a 37°C durante quatro dias, marcando-se as células com 3H-timidina durante as últimas 18 horas. As células foram recolhidas e contadas, e os resultados são apresentados na Figura 4 . EXEMPLO 11 SEQUÊNCIAS DE POLINUCLEÓTIDOS E DE AMINOÁCIDOS DOS ANTICORPOS HUMANOS ANTI-CD40 Prepararam-se mRNAs a partir dos hibridomas gerados tal como descrito no Exemplo 2 e efectuou-se um ensaio de RT-PCR com os mRNAs. Foram usados dois conjuntos de primers para 42 gerar produtos de PCR: um conjunto de primers universal ou de pool de famílias de cadeias pesadas e de cadeias leves; e um conjunto de primers específicos de família. Os produtos de PCR foram analisados em geles, sequenciados e traduzidos. As sequências de polinucleótidos e de aminoácidos são fornecidas na Listagem de Sequências, tal como resumido na Tabela 7. Tabela 7 SEQ ID NO: Anticorpo Região 1 12D9 Polinucleótido de região constante de cadeia pesada 2 12D9 Aminoácidos de região constante de cadeia pesada 3 20C4 Polinucleótido de VK1 4 20C4 Polinucleótido de VH1 5 9F7 Polinucleótido de VK1 6 9F7 Polinucleótido de VH1 7 15B8 Polinucleótido de VK3 8 15B8 Polinucleótido de VH1 9 13E4 Polinucleótido de VH1 10 12D9 Polinucleótido de VH1 11 9F7 Aminoácidos de VH1 12 12D9 Aminoácidos de VH1 13 15B8 Aminoácidos de VH1 14 20C4 Aminoácidos de VH1 15 9F7 Aminoácidos de VKl 16 12D9 Aminoácidos de VKl 17 15B8 Aminoácidos de VKl 18 20C4 Aminoácidos de VKl As regiões específicas dos anticorpos são apresentadas nas Figuras 5, 6 e 8-14. Esta informação pode ser usada para planear anticorpos monoclonais adicionais para uso de acordo com a invenção. Estes anticorpos monoclonais poderão diferir 43 dos aqui descritos, por substituição de uma ou mais das regiões de framework ou de CDR. Os anticorpos monoclonais poderão ainda diferir por substituição de um ou mais aminoácidos, os quais se verifica diferirem em certas zonas das regiões de framework e CDR (Figuras 5 e 6) . Uma vez planeada a sequência de aminoácidos, poderão usar-se procedimentos de rotina para construir uma sequência polinucleotidica correspondente para a expressão do anticorpo monoclonal. A expressão e purificação dos anticorpos monoclonais é efectuada usando métodos conhecidos da técnica, tais como os apresentados nas Patentes US Nos. 5.545.403, 5.545.405 e 5.998.144, as quais são aqui incorporadas para referência. EXEMPLO 12 EFEITO DE 15B8 SOBRE A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS B MALIGNAS IN VITRO Para testar se o anticorpo 15B8 fornece um sinal de crescimento, tal como acontece com CD40L, in vitro, foram obtidas células B de nódulos linfáticos infiltrados por tumor (células de LNH) a partir de um paciente naive para anticorpos, de um paciente sensível ao rituximab e de um paciente resistente ao rituximab. As células de LNH foram estudadas sob quatro condições de cultura distintas: sem anticorpo adicionado (meio); adição de anticorpo do isotipo IgG2 humano (controlo); adição do anticorpo anti-CD40 MS81 (anticorpo agonista); e adição de 15B8. Todos os anticorpos foram testados a 1, 2 e 5 yg/ml na presença ou na ausência de IL-4. As células de LNH de dois pacientes foram cultivadas tal como acima descrito sob as mesmas quatro condições na presença de IL-4 (2 ng/ml) . A proliferação de células B foi medida através da incorporação de 3H-timidina, tal como acima descrito. 44 0 anticorpo anti-CD40 15B8, às concentrações de 1, 2 e 5 yg/ml, não estimulou as células de LNH a proliferar tanto na presença como na ausência de IL-4. Por contraste, um anticorpo agonista anti-CD40 (MS81), testado às mesmas concentrações, estimulou a proliferação das células de LNH na presença e na ausência de IL-4 em todas as amostras de pacientes. Os resultados representativos de um paciente são abaixo apresentados (Fig. 15 e Fig. 16). Os resultados obtidos com as células de LNH dos dois pacientes na presença de IL-4 e dos três pacientes na ausência de IL-4 foram comparáveis. Estes resultados indicam que o anticorpo 15B8 não é um anticorpo agonista anti-CD40 e não estimula in vitro a proliferação de células de LNH de pacientes com LNH que sejam sensíveis ao rituximab, naive para o anticorpo ou resistentes ao rituximab. A análise por FACS das células de LNH foi efectuada com um 15B8-FITC directamente marcado ou com 15B8 e anti-HuIgG2-FITC para confirmar que o CD40 é expresso à superfície das células de LNH testadas e que 15B8 se liga às células de LNH. Foram testadas as células de lnh de dois pacientes sensíveis ao rituximab e e de quatro pacientes resistentes ao rituximab (6 pacientes no total). As células de LNH de todos os pacientes expressaram CD40 e ligaram-se ao anticorpo 15B8. A população celular positiva para a ligação a 15B8 em qualquer dos pacientes é de cerca de 66% a 91%. EXEMPLO 13 15B8 INIBE A PROLIFERAÇÃO, ESTIMULADA POR CD40L, DAS CÉLULAS DE LNH IN VITRO Para avaliar a capacidade de 15B8 para bloquear o sinal de crescimento fornecido por CD40L in vitro, as células de LNH dos pacientes foram cultivadas tal como descrito no Exemplo 12 em suspensão sobre células alimentadoras que expressam CD40 e sob quatro condições diferentes: sem anticorpo adicionado 45 (meio); adição de anticorpo do isotipo IgG2 humano (controlo); adição do anticorpo anti-CD40 MS81 (anticorpo agonista); e adição de 15B8. Todos os anticorpos foram testados a 1, 2 e 5 yg/ml na presença ou na ausência de IL-4. As células de LNH de um paciente naive para anticorpo, dois pacientes sensíveis ao rituximab e cinco pacientes resistentes ao rituximab (8 pacientes no total) foram cultivadas sob as mesmas quatro condições acima descritas na presença de IL-4 (2 ng/ml). As células de LNH de três pacientes sensíveis ao rituximab e de quatro pacientes resistentes ao rituximab (7 pacientes no total) foram cultivadas sob condições similares na ausência de IL-4. A proliferação de células de LNH foi medida através da incorporação de 3H-timidina. A Tabela 8, abaixo, mostra o efeito inibitório de 15B8 sobre a proliferação das células de LNH de dois pacientes sensíveis ao rituximab (dados de um paciente reprodutíveis em duas experiências separadas) e de quatro pacientes resistentes ao rituximab (6 pacientes no total) estimuladas por CD40L isoladamente in vitro. São apresentados os resultados representativos obtidos com as células de um paciente (A) (Fig. 17). 0 anticorpo 15B8 inibiu a proliferação em cerca de 12-68% por comparação com o controlo nos seis pacientes. 0 grau de inibição por 15B8 varia dependendo das amostras dos pacientes e da dose de 15B8. A análise estatística dos dados de seis das sete amostras de pacientes testadas mostra que a inibição, pelo anticorpo 15B8, da proliferação de células de LNH estimuladas por CD40L é significativa para a dose de 1 yg/ml (p=0,05). Existe uma resposta estatisticamente significativa à dose (p<0,005) , sendo que o efeito inibitório aumenta com o aumento da dose de 15B8. 46 Tabela 8 Efeito do MAb 15B8 sobre a Proliferação, Estimulada por CD40L, de Células de Pacientes com LNH na Ausência de IL-4- ID do paciente Tipo de paciente2 Dose de tratamento(ug/ml) % inib.l5B83 A RC 1 55, 61 2 58, 99 5 63, 16 A RC 1 61, 96 2 60,41 5 64,75 10 60,29 B RC 1 Nenhuma 2 Nenhuma 5 Nenhuma 10 12,11 D SR 1 52,22 2 61, 63 5 68, 04 10 68, 17 E SR 1 13, 07 2 22, 34 5 31, 04 10 31,87 F SR 1 24,51 2 27,43 5 38, 71 10 47,35 G SR 1 11, 12 2 22, 41 5 30, 61 10 43, 15 1. as células de LNH dos pacientes foram cultivadas com células L de murino expressando CD40L humano na presença de meio, agonista anti -CD40 (MS81), antagonista anti-CD40 (15B8) ou controlo de isotipo hu!gG2 in vitro. A proliferação das células de LNH foi medida pela incorporação de 3H-timidina (os dados de um paciente sensível ao rituximab não estão na tabela porque a contagem de cpm de CD40L é <2000). 2. Resposta dos pacientes à terapia com MAb anti-CD20: RC, resposta completa; SR, sem resposta. 3. % inibição por 15B8 = 100 - (cpm 15B8/cpm hu!gG2 x 100); representa a média de 3 determinações A Tabela 9 (abaixo) mostra o efeito inibitório de 15B8 sobre a proliferação de células de LNH de um paciente naive para o anticorpo, dois pacientes sensíveis ao rituximab (os testes de ambas as amostras de pacientes foram repetidos por duas vezes com resultados reprodutíveis) e cinco pacientes resistentes ao rituximab (8 pacientes no total), tendo as células sido estimuladas por CD40L e por IL-4 in vitro. À 47 concentração de 1 yg/ml, 15B8 inibiu significativamente (p<0,05) a proliferação mediada por CD40L e IL-4 das células de LNH. 0 grau de inibição variou entre 18-69% com a dose elevada (5 ou 10 yg/ml) nas amostras de todos os 8 pacientes in vitro. Existe uma resposta à dose que é estatisticamente significativa relativamente a este efeito inibitório exercido por 15B8 (p<0,005)(a Fig. 18 mostra uma curva de dose-resposta representativa), no intervalo de concentrações de 15B8 de 0,01 - 10 yg/ml. Estes resultados in vitro sugerem que o tratamento com 15B8 poderá bloquear o sinal de crescimento mediado por CD40 para as células de LNH nos pacientes. Tabela 9 Efeito do MAb 15B8 sobre a Proliferação, Estimulada por CD40L, de Células de Pacientes com LNH na Presença de IL-4- ID do paciente Tipo de paciente2 Dose de tratamento % inib.15B82 A RC 1 34,39 2 30,54 5 36,42 A RC 0,01 0,44 0,04 23,32 0,2 29,54 1 35,38 5 46,12 10 48, 63 C RC 1 34, 91 2 40,89 5 56,34 10 69,21 C RC 1 nenhuma 2 16,79 5 21, 64 10 12, 63 D SR 1 1, 95 2 6,43 5 20, 95 10 26,31 E SR 1 1, 91 2 2,74 5 28,36 10 28,26 48 continuação F SR 1 2 5 10 Nenhuma 11,76 27,54 34,07 G SR 1 39,38 2 32,74 5 36,48 10 37,78 H SR 1 Nenhuma 2 Nenhuma 5 7,81 10 18,47 I Naive 0,01 Nenhuma 0, 04 13,16 0,2 15, 64 1 16,20 5 21, 53 10 24, 51 1. as células de LNH dos pacientes foram cultivadas com células L de murino expressando CD40L humano na presença de IL-4 (interleucina 4 humana) a 2 ng/ml sob as condições descritas na Tabela 1. 2. Resposta dos pacientes à terapia com MAb anti-CD20: RC, resposta completa; SR, sem resposta; Náive, não tratado 3. % inibição comparada com hu!gG2. % Inibição por 15B8 = 100 - (cpm 15B8/cpm huIgG2 x 100) EXEMPLO 14 DEMONSTRAÇÃO DA ACTIVIDADE AGONISTA E ANTAGONISTA DE 15B8 EM ESPÉCIES DIFERENTES IN VITRO Para determinar se 15B8 é um anticorpo anti-CD40 agonista ou antagonista, este anticorpo foi testado em diversos ensaios in vitro abaixo descritos usando células humanas e de cinco diferentes espécies de primatas, incluindo chimpanzé, macaco titi, macaco cinomolgo, macaco rhesus e babuíno. 0 anticorpo 15B8 não activa as células B humanas do sangue periférico e não causa a proliferação de CMSP em seres humanos, no chimpanzé e no macaco titi. A activação de CD40 em 49 células B humanas obtidas a partir do sangue periférico conduz à proliferação das células B (van Kooten C., J. Leukoc. Biol., 2000 Jan., 67(1):2—17; Denton M.D., Pediatr. Transplant., 1998 Feb., 2 (1):6-15; Evans D.E., J. Immunol., 2000 Jan . 15, 164 (2) :688-97; Noelle R.J., Agents Actions Suppl., 1998, 49:17- 22; Lederman S. et al. , Curr. Opin. Hematol., 1996, 3(1):77-86). Para testar se 15B8 activa o CD40 nas células B, foi realizada uma série de ensaios de proliferação usando células B ou CMSP humanas isoladas de fresco a partir do sangue periférico. O efeito de 15B8 nestes ensaios foi medido através da incorporação de 3H-metiltimidina (John E. Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Vol. 13:12, John Wiley & Sons, Inc., 1991; Kwekkeboom J., Immunology, 1993 Jul, 79(3):439-444). Tal como mostra a Tabela 10, abaixo, às concentrações de 0,2, 1 e 5 yg/ml o anticorpo 15B8 teve um efeito mínimo sobre a proliferação de células B purificadas por comparação com o efeito de CD40L, que demonstrou um forte efeito promotor da proliferação de células B humanas. Tal como mostra a Tabela 3, os resultados sobre as células B purificadas provenientes de dois voluntários saudáveis são comparáveis. O anticorpo 15B8 foi ainda comparado com CD40L quanto à estimulação da proliferação de CMSP humanas usando CMSP humanas isoladas de fresco. Tal como sintetizado na Tabela 10, abaixo, 15B8 não estimula a proliferação de CMSP humanas in vitro, tal como medido através da incorporação de H-metiltimidina (John E. Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Vol. 13:12, John Wiley & Sons, Inc., 1991; Kwekkeboom J., Immunology, 1993 Jul, 79(3):439-444) em amostras testadas a partir de 16 voluntários e usando o intervalo de concentrações de 0,2-5 pg/ml. 50 Tabela 10 Estimulação da Proliferação de CMSP/Células B em humanos, chimpanzés e macacos titi pelo anticorpo 15B81 Espécie Fonte de células Número de amostras Dose (ug/ml) hIgG2, base CD40L, x de incremento3 15B8, x de incremento2 Humana B 2 5 1 70,58/36,33 1,77/4,37 2 1 1 70,58/36,33 3,1/5,4 2 0,2 1 70,58/36,33 1,16/4,63 Humana CMSP 5 5 1 9,36-91,60 0,40-2,28 15 1 1 9,36-91,60 0,35-2,38 12 0,2 1 9,36-91,60 0,41-3,74 Macaco titi CMSP 3 5 1 29,24-90,3 2,05-7,2 5 1 1 7,99-90,3 1,35-5,79 Chimpanzé CMSP 1 5 1 10,15 2,46 5 1 1 5,12-9,2 0,66-5,2 1. As células B/CMSP foram cultivadas in vitro na presença de CD40L, 15B8 ou controlo de isotipo huIgG2. 2. Os resultados da proliferação celular foram registados como a razão de incorporação de 3H-timidina entre 15B8 e os controlos de huIgG2. Os dados de algumas amostras não estão incluídos na tabela porque as cpm induzidas por CD40L (controlo positivo) <2000. 3. os nos. de x incremento com CD40L mostrados na tabela correspondem à razão entre as cpm com CD40L e as cpm com huIgG2 à concentração de 5 pg/ml. CD40L: células CHO transfectadas com CD40L, fixadas com formaldeído antes das experiências. Depois da activação das células B, diversas proteínas da superfície celular sofrem regulação positiva (Denton M.D., Pediatr. Transplant., 1998 Feb., 2(1):6-15; Evans D.E., J. Immunol., 2000 Jan. 15, 164(2):688-97; Noelle R.J., Agents Actions Suppl., 1998, 49:17-22; Lederman S. et al., Curr. Opin. Hematol., 1996, 3(1):77-86). Para confirmar gue 15B8 não activa as células B humanas e não induz um sinal agonista quando ligado a CD40, a sua capacidade para regular positivamente os marcadores de acivação das células B foi testada por análise FACS usando CMSP humanas purificadas. Não se verificou a ocorrência de regulação positiva na expressão dos marcadores de activação como CD25, CD69, CD86, HLA-DR e ICAM-1 (CD54) em células B humanas tratadas com 15B8 (Tabela 51 4). 0 nível destes marcadores foi semelhante quando as células foram tratadas com 15B8 ou com controlo de huIgG2 (Tabela 11). Por contraste, o marcador CD69 sofreu uma regulação positiva consistente por acção de CD40L nas amostras de CMSP dos três voluntários saudáveis testados. Tabela 11 Efeito de 15B8 sobre a regulação positiva dos marcadores de activação das células B in vitro, medido por FACS Espécie Fonte de células Tempo de incubação Número de indivíduos CD54 CD69 HLA- DR CD25 CD80 CD86 homem CD20 de CMSP 4h-24h 3 - - - - N/A - chimpanzé CD20 de CMSP 4h-24h 3 N/A - N/A N/A N/A N/A 1 significa sem regulação positiva. 2 "N/A" significa não medido ou medição sem êxito. As consequências adicionais da activação das células B são a regulação positiva do FasL de superfície e a apoptose (Revy P., Eur. J Immunol., 1998 Nov., 28(11) :3648-3654; Carey G.B., Immunol. Rev., 2000 Aug., 176:105-115; Ju S.T., Int. Rev. Immunol., 1999, 18(5-6):485-513; Baumgarth N., Immunol. Rev., 2000 Aug., 176:171-180). Para confirmar que 15B8 não constitui um anticorpo agonista anti-CD40, a sua capacidade para induzir a expressão de FasL e a apoptose de células B humanas foi igualmente testada. A marcação por Anexina V à superfície celular pode ser usada como um marcador precoce de apoptose (Ju S.T., Int. Rev. Immunol., 1999, 18(5-6):485-513). As células B humanas foram purificadas a partir do sangue periférico e incubadas com 15B8. Foi usada uma análise FACS para detectar células com marcação positiva por Anexina V e anti-FasL. Não se verificaram diferenças significativas em relação à marcação de superfície com os dois reagentes entre as células incubadas com 15B8 e as células incubadas com o 52 anticorpo de controlo de isotipo (huIgG2) . Este resultado mostra que 15B8 não induz a apoptose de células B humanas in vitro. Estes dados fornecem evidências adicionais de que 15B8 não constitui um anticorpo agonista anti-CD40 para as células B humanas. 0 anticorpo 15B8 exibe reacção cruzada com o CD40 expresso à superfície das CMSP CD20-positivas provenientes de primatas. Para testar se 15B8 tem a capacidade de activar o CD40 das células B de outras espécies de primatas, como os chimpanzés e os macacos titi, foi efectuado o mesmo ensaio de proliferação usando CMSP de chimpanzé e de macaco titi isoladas de fresco a partir de 15 chimpanzés e de 5 macacos titi. De modo semelhante ao observado com as CMSP humanas, 15B8 não estimulou a proliferação in vitro de CMSP de seis chimpanzés e de cinco macacos titi às concentrações de 1 e de 5 yg/ml (Tabela 3, acima). Do mesmo modo, 15B8 não exerceu regulação positiva sobre a expressão do marcador de activação, CD69, nas três amostras de CMSP de chimpanzé testadas (Tabela 4). 0 anticorpo 15B8 não evidenciou qualquer efeito sobre a expressão de FasL e a apoptose em CMSP de chimpanzé, obtendo-se resultados similares aos de controlos de CMSP humanas após uma estimulação de 24 e de 48 horas em todas as amostras dos seis chimpanzés testados. 0 cross-linking de 15B8 por um anticorpo secundário fixado a uma superfície de plástico não aumentou a sua potência para a estimulação da proliferação de células B (dados não apresentados). Quando testado usando CMSP de humanos e de chimpanzés neste ensaio de cross-linking, 15B8 não estimulou a proliferação das células. Esta observação indica um risco reduzido de o anticorpo 15B8 ser estimulador (agonista) da proliferação das células B no caso de indução da ligação de anti-15B8 (HAHA) ou de Fc a outras células que expressem o receptor Fc quando em administração in vivo. 53 Em resumo, 15B8 não inicia um sinal de activação em células B/CMSP humanas nem em CMSP de chimpanzé/macaco titi in vitro. Assim, 15B8 não constitui um anticorpo agonista anti-CD40 em humanos, chimpanzés e macacos titi. EXEMPLO 15 15B8 É UM ANTICORPO ANTAGONISTA ANTI-CD4 0 EM HUMANOS, CHIMPANZÉS E MACACOS TITI IN VITRO Para determinar se 15B8 é um antagonista anti-CD40, foi testada a sua capacidade para inibir a interacção CD40-CD40L num ensaio de proliferação de células B mediada por CD40L (Kwekkeboom J., Immunology, 1993 Jul, 79(3):439-444). Foi usada uma linha celular CHO transfectada expressando CD40L humano para estimular a proliferação de células B, ou de CMSP, humanas do sangue periférico purificadas. Foram testadas células B humanas de dez voluntários saudáveis e CMSP humanas de três voluntários saudáveis. Em todas as amostras testadas, 15B8, no intervalo de concentrações de 0,2 a 5 yg/ml, suprimiu a proliferação mediada pelas células CHO que expressam CD40L em 42-88% (Tabela 12) . A Figura 19 apresenta curvas de dose-resposta representativas usando células de três indivíduos. A dose sem efeito de 15B8 é de 0,008 yg/ml e a dose de saturação é atingida a 0,2 yg/ml (Figura 19). Esta observação indica que 15B8, como anticorpo antagonista anti-CD40, tem a capacidade de inibir os sinais de crescimento para células B e CMSP humanas que são fornecidos pelo CD40L expresso à superfície das células. 54 Tabela 12 Inibição pelo anticorpo 15B8 da Proliferação de CMSP/Células B ind uzida por CD40L1 Espécie Fonte de células Número de amostras Dose (ug/ml) CD40L (base) hIgG2, % de inibição 15B8, % de inibição2 Humana B 7 5 100 (-27) - 14% 45-85% 9 1 100 (-93) - 11% 42-87% 6 0,2 100 (-20)-(-6)% 44-82% Humana CMSP 1 5 100 13% 45% 2 1 100 3-32% 76-88% Macaco titi CMSP 3 1 100 1-35% 68-84% Chimpanzé CMSP 3 1 100 (-3) - 21% 55-73% 1. As células B/CMSP foram cultivadas in vitro com células CHO que expressam CD40L na presença de 15B8 ou de controlo de huIgG2. As células CHO transfectadas com CD40L foram fixadas com formaldeido antes das experiências. A proliferação celular foi medida através da incorporação de 3H-timidina. 2. "% inibição por 15B8" = 100 - (cpm 15B8/cpm CD40L x 100). Os dados de algumas amostras não estão na tabela porque a proliferação induzida por CD40L (controlo positivo) é -vezes. Foram realizados ensaios adicionais usando CMSP isoladas de fresco a partir de nove chimpanzés e três macacos titi. Tal como acontece com as CMSP humanas, o anticorpo 15B8, a uma concentração de 1 pg/ml, teve a capacidade de inibir a proliferação de CMSP de chimpanzé e de macaco titi estimuladas por células CHO que expressam CD40L (Tabela 5, acima). A inibição por 15B8 foi aproximadamente de 55-73% e de 68-84% nas amostras de CMSP de três chimpanzés e de três macacos titi, respectivamente (Tabela 5, acima). As células B activadas exibem diversas respostas biológicas, tais como a proliferação e a produção de anticorpos. A activação de células B por antigénios dependentes das células T envolve as células T-helper (Th) CD4+. Este processo das células T helper é mediado por um 55 esforço concertado da interacção do CD40 das células B com o CD40L à superfície das células Th em conjunto com as interacções de outros factores co-estimulatórios e de citocinas (Denton M.D., Pediatr. Transplant., 1998 Feb., 2(1):6-15; Evans D.E., J. Immunol., 2000 Jan. 15, 164(2):688-97; Noelle R.J., Agents Actions Suppl., 1998, 49:17-22; Lederman S. et al., Curr. Opin. Hematol., 1996, 3(1):77-86,· Mackey M.F., et al., J. Leukoc. Biol., 1998, 63(4):418-428). Para testar se 15B8 consegue bloquear a produção de anticorpos pelas células B mediada pelas células T helper, foram cultivadas células B humanas do sangue periférico purificadas na presença de células T purificadas irradiadas, activadas por anticorpo anti-CD3. Foi usado um ensaio ELISA para medir o nível de produção de IgM. O anticorpo 15B8 reduziu a produção de IgM em cerca de 30% neste ensaio (dados não apresentados) . Assim, 15B8 tem a capacidade de reduzir a produção de imunoglobulinas pelas células B que é mediada pelas células T. Em resumo, 15B8 inibe a proliferação de células B/CMSP induzida por CD40L em seres humanos, em chimpanzés e em macacos titi, e inibe a produção de anticorpos, induzida por células T, por parte de células B humanas purificadas in vitro. Estes dados demonstram que 15B8 actua como um anticorpo antagonista anti-CD40 em células B humanas e em CMSP de chimpanzés e de macacos titi in vitro. EXEMPLO 16 15B8 É UM ANTICORPO AGONISTA ANTI-CD40 DE MACACOS (CINOMOLGOS, RHESUS E BABUÍNO) IN VITRO A análise por FACS demonstra que 15B8 se liga ao CD40 expresso à superfície de células B do sangue periférico de macacos (rhesus, cinomolgo e babuíno). O efeito de 15B8 sobre as CMSP de macaco cinomolgo isoladas de fresco foi testado no mesmo ensaio de proliferação que foi acima descrito para as 56 células humanas e de chimpanzé (John E. Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Vol. 13:12, John Wiley & Sons, Inc., 1991; Kwekkeboom J., Immunology, 1993 Jul, 79(3):439-444). Em contraste com o verificado nas CMSP humanas, observou-se que 15B8 estimulava a proliferação de CMSP do macaco cinomolgo in vitro, tal como medido pela incorporação de 3H metil-timidina (Tabela 13, abaixo) . À concentração de 1 yg/ml, 15B8 estimulou a produção das CMSP em 6 - 129,7 vezes por comparação com o controlo de huIgG2 em vinte e duas amostras dos 17 macacos testados (as amostras de cinco dos macacos foram testadas duas vezes) (Tabela 13, abaixo). À concentração de 5 yg/ml, a proliferação estimulada por 15B8 é de 14 - 24 vezes em quatro amostras de dois macacos e de cerca de 1,25 ou 1,85 vezes em duas amostras de dois macacos (Tabela 13) . Isto sugere que, à concentração de 5 yg/ml, 15B8 poderá estar no limite da dose de sobresaturação no que respeita ao efeito estimulador da proliferação de CMSP do macaco cinomolgo. Adicionalmente, a análise por FACS das células B para avaliação do status de activação pelos marcadores de superfície indicou que 15B8 induz a regulação positiva de CD69, CD86 e HLA-DR em células B de macaco (Tabela 14). Estes dados sugerem que 15B8 é um anticorpo agonista face ao CD40 expresso pelas células B do sangue periférico de macacos cinomolgos in vitro. Para confirmar que este efeito agonista de 15B8 não é específico do macaco cinomolgo, foram efectuados os mesmos ensaios usando CMSP de macacos rhesus e de babuínos. Observaram-se resultados similares aos obtidos com as células de macacos cinomolgos, tal como exposto na Tabela 13, abaixo. 0 anticorpo 15B8 estimulou a proliferação de CMSP de macacos rhesus e de babuínos in vitro (Tabela 13, abaixo). A actividade agonista de 15B8 é evidenciada usando as CMSP de cinco macacos rhesus e de três babuínos (Tab. 13). 57 Tabela 13 Proliferação de CMSP humanas, de macacos cinomolgos e rhesus e de babuínos, estimuladas por 15B81 Espécie Fonte de células Número de amostras Dose (ug/ml) hIgG2, base CD40L, x de aumento3 15B8, x de aumento2 Humana CMSP 5 5 1 9.36-91.60 0,49-2,28 15 1 1 9.36-91.60 0,35-2,38 12 0,2 1 9.36-91.60 0,41-3,74 Macaco rhesus CMSP 5 1 1 12,71-89,67 27,34-50,9 Macaco cino CMSP 5 5 1 14,57-124,01 1,25-24,53 22 1 1 5,15-167,73 6,13-129,74 3 0,2 1 77,01-124,01 0, 9-67,56 Babuíno CMSP 3 1 1 5,19-175,07 3,32-113,28 1. As CMSP foram cultivadas in vitro na presença de CD40L, 15B8 ou controlo de huIgG2. 2. Os resultados de proliferação são registados como a razão de incorporação de 3H-timidina entre 15B8 e o controlo de huIgG2. Os dados de algumas amostras não estão na tabela porque as cpm induzidas por CD40L (controlo positivo) <2000. 3. A x aumento com CD40L apresentada na tabela corresponde à razão entre as cpm de CD4 0L e as cpm de huIgG2 à concentração de 5 pg/ml. As células CHO transfectadas com CD40L foram fixadas com formaldeído antes das experiências. Tabela 14 Efeito de 15B8 sobre a regulação positiva dos marcadores de activação das células B in vitro, medido por FACS Espécie Fonte de células Tempo de incubação N° de individ. CD54 CD69 HLA-DR CD25 CD80 CD86 homem CD20 de CMSP 4h-24h 3 - - - - N/A - Macaco cino CD20/19 de CMSP 4h-3 dias 2 N/A 1/2 posit 1/1 posit (dia 3) - - 1/1 posit (dia 3) 1 significa sem regulação positiva. 2 "N/A" significa não medido ou medição sem êxito. 3 Apenas as células de 1 cino, analisadas por FACS ao dia 3. 58 EXEMPLO 17 15B8 É UM ANTICORPO AGONISTA ANTI-CD40 IN VIVO EM MACACOS CINOMOLGOS O anticorpo 15B8 tem a capacidade de estimular a proliferação e a regulação positiva dos marcadores de activação da superfície celular nas CMSP dos macacos cinomolgos in vitro. Para determinar se 15B8 constitui um anticorpo agonista anti-CD40 nos macacos in vivo, foi efectuado um estudo para examinar a biodistribuição de 15B8 e o destino das células B do sangue periférico afectadas (i.e., extravasação, apoptose, estado de activação ou lise do complemento) [Biodistribution 15B8.72 Antibodies following Intravenous Administration to Non-Naive Male and Female Cynomolgus Monkeys (SNBL.218.3, SNBL USA)]. Os macacos cinomolgos (1 fêmea e 2 machos) receberam uma administração intravenosa única de 15B8 a 3 mg/kg. Foram monitorizados os seguintes parâmetros: sinais clínicos, consumo de alimentos, peso corporal, farmacocinética, complemento sérico (CH50), citometria de fluxo das células B (incluindo as células B em apoptose), células T e monócitos. Foi também medida a saturação dos receptores CD40 das células B pelo anticorpo 15B8. Os animais foram necropsiados 24 horas após terem recebido a dose única de 15B8, e os órgãos-padrão foram pesados. Como pré-estudo, foram efectuadas biópsias cirúrgicas do baço e dos nódulos linfáticos axilares para servirem como controlos basais. Na necropsia, foram recolhidas amostras de tecidos linfóides e não linfóides para estudos de histopatologia e de imunohistoquímica. Os tecidos foram imuno-marcados com anticorpos contra os antigénios CD3, CD40, CD20, CD27 e CD38. Os resultados preliminares do estudo são abaixo apresentados. Todos os animais sobreviveram à necropsia agendada e não se registaram efeitos sobre o consumo de alimentos, peso 59 corporal, níveis de CH50 nem sobre as contagens de células T ou de monócitos. Não se verificaram alterações de peso dos órgãos. 0 exame microscópico do baço evidenciou hiperplasia folicular difusa moderada com necrose e/ou infiltrados neutrofílicos nos centros germinais de todos os animais tratados com 15B8. 0 exame dos nódulos linfáticos mesentéricos e inguinais revelou uma leve hiperplasia folicular em 2/3 animais. Não se observaram efeitos microscópicos relacionados com o tratamento nos outros tecidos (fígado, pele, cérebro, tiróide, pulmão, medula óssea, glândula suprarenal e rim). A imuno-marcação com anticorpos para CD20, CD27, CD40 e CD86 revelou incrementos destes marcadores nos folículos esplénicos e dos nódulos linfáticos, os quais se correlacionaram com a hiperplasia folicular observada nestes mesmos tecidos. A marcação aumentada de CD20 e de CD40 limitou-se ao baço e aos nódulos linfáticos, registando-se alguma marcação adicional do tecido hepático com CD27 e das células de Kupffer hepáticas e células inflamatórias pelo CD86. A marcação de CD86 esteve também aumentada nas células medulares do timo e nos leucócitos intersticiais da suprarenal. Não se registaram alterações da imuno-marcação de CD3 nos animais tratados com 15B8 por comparação com os controlos. Estes achados indicam que uma dose única de 3 mg/kg de 15B8 administrada ao macaco cinomolgo pode causar a proliferação dos folículos linfóides e/ou a redistribuição de células B do sangue periférico pelo baço e nódulos linfáticos num período de 24 horas. Os anticorpos contra CD20, CD27, CD40 e CD86 reconhecem os antigénios expressos pelas células B e/ou pelas células B activadas, reconhecendo ainda outros tipos celulares. Observaram-se números aumentados de células expressando estes antigénios no baço e nos nódulos linfáticos dos animais tratados, o que sugere um aumento das células B 60 CD20+ activadas. Este estudo sugere que 15B8 é um anticorpo agonista anti-CD40 no macaco cinomolgo in vivo. Os resultados obtidos in vivo e in vitro são consistentes nos macacos cinomolgos. Os resultados sugerem que 15B8 é um anticorpo agonista anti-CD40 nos macacos cinomolgos e rhesus e nos babuínos, e um anticorpo antagonista nos humanos, chimpanzés e macacos titi. 15B8 é um anticorpo monoclonal específico anti-CD40 humano que pertence ao subtipo IgG2 humano e que apenas exibe reactividade cruzada com o CD40 de primatas não humanos. Através de exaustivos testes in vitro, demonstrou-se que 15B8 constitui um anticorpo antagonista anti-CD40 face ao CD40 expresso em células B humanas e em CMSP humanas, de chimpanzé e de macaco titi. No entanto, verificou-se que 15B8 possuía actividade agonista quando ligado ao CD40 expresso pelas CMSP de macacos (cinomolgos, rhesus e babuínos) in vitro. Esta actividade agonista de 15B8 foi confirmada in vivo nos macacos cinomolgos. Quando testado em culturas primárias de células de linfoma de pacientes com LNH sensíveis ao Rituxan e resistentes ao Rituxan, 15B8 não exibe actividade agonista na presença e na ausência de IL-4. 0 anticorpo 15B8 tem ainda a capacidade de inibir o crescimento, estimulado por CD40L, das células de linfoma obtidas de um grupo similar de pacientes sob ambas as condições. 0 anticorpo 15B8 terá potencial para a modificação de doenças malignas das células B, tal como o linfoma não-Hodgkin (LNH), sendo que a via de CD40/CD40L poderá desempenhar um papel na patogénese destas doenças. Os resultados foram resumidos nas Tabelas abaixo. 61 Tabela 15 Ensaios para Medição da Actividade Aqonista Ensaio Metodologia Espécies Testadas (Actividade Agonista + ou -) Efeito de 15B8 sobre a proliferação celular Comparação da incorporação de 3H-timidina por células B purificadas do sangue periférico na presença de 15B8 com a incorporação na presença de CD40L ou de um anticorpo agonista 626.1 .Humano (-) Efeito de 15B8 sobre a proliferação de CMSP Comparação da incorporação de 3H-timidina pelas CMSP na presença de 15B8 com a incorporação na presença de CD40L ou do controlo de isotipo .Humano(-) .chimpanzé(-) .macaco cinomolgo(+) .macaco rhesus (+) .babuíno (+) .macaco titi (-) Efeito de 15B8 sobre a regulação positiva dos marcadores de activação das células B Medição da regulação positiva da expressão de marcadores de activação das células B em CMSP estimuladas por 15B8 ou pelo seu controlo de isotipo usando a análise FACS; comparação do efeito de 15B8 com o do controlo de isotipo .Humano(-) .chimpanzé(-) .macaco cinomolgo(+) .macaco rhesus (+) .babuíno (+) .macaco titi (-) Efeito sobre a proliferação de CMSP causado pelo cross-linking de 15B8 com um anticorpo secundário fixado a uma superfície de plástico Comparação da incorporação de 3H-timidina pelas CMSP na presença de 15B8 em crosslinking com um segundo Ab com a incorporação na presença de CD40L, de 15B8 isolado ou do controlo de isotipo .Humano (-) .Chimpanzé (-) Efeito de 15B8 sobre a regulação positiva de FasL e da apoptose Medição da regulação positiva da expressão de FasL e da apoptose através da detecção por FACS das células B com marcação positiva de anti-FasL e Anexina V (marcador da apoptose) por estimulação com CD40L, 15B8 e controlo de isotipo. .Humano (-) .Chimpanzé (-) .Macaco cinomolgo (-/ + ) 62 Tabela 16 Ensaios para Medição da Actividade Antagonista Ensaio Metodologia Espécies Testadas (Actividade Agonista + ou -) Inibição por 15B8 da proliferação de células B mediada por CD40L A estimulação da proliferação de células B por células CHO expressando CD40L foi medida através da incorporação de 3H-timidina. Comparação da incorporação de 3H-timidina na presença de 15B8 com a ocorrida na presença do controlo de isotipo .Humano (+) .macaco titi (+) .chimpanzé (+) Inibição por 15B8 sobre a produção de anticorpos pelas células B mediada pelas células T helper As células B foram cultivadas com células T purificadas irradiadas activadas com anticorpo anti-CD3 na presença de 15B8. 0 nível de produção de IgM pelas células B foi avaliado por ELISA. .Humano(+) LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Chu, Keting Wang, Changyu Yoshihara, Corrine Donnelly, John J. <120> ANTICORPOS HUMANOS ANTI-CD40 <140> US <141> 2000-10-02 <160> 18 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 978 63 < 212 > DNA <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1 gcctccaccâ agçgnceatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcecagccg ccctgggctg cctggtcaag gactact.tcc ccgasccggt gacggtgtcq 120 tggsactcag gcgcfcctgac eagcggcgtg cecacctt.ee cagctgtcct scagtcctea 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca açgtagatca caagccc.agc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aastgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacecaa ggacaccctc atgatetecc ggaeccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagaea ogggaggaçe agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgeaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggfcctccá ãcaaaggcct cccagccocc «tcgagaaaa ccatctccaa aaecaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagasc 720 caggteagce tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagageaatg ggcagcegga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctcfcaeag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaae SOO gtcttctcat gctccgtgafc gcatgaggct ctgeacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaa 978 < 210 > 2 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2 Ai a Ser Thr Lys Giy Pro Ser Vyal Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15 Ser Thr Ser Giu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vel Lys Asp Tyr 64 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Vâl Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn vai Asp BiS Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 > 95 Thr Vai Glu Arg Lys Cyç Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys' Asp 115 120 125 Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Val Val Asp 130 135 140 Vai Ser Eis Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 145 150 155 160 Vai Glu Vai Eis Asn Ala iys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai Mis Gin Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Ly$ Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro 11« Glu Lys Thr He Ser Lys Thr Lys Gry Gin Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Glh Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ila 245 250 255 Ma Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Vai Met EiS Glu Ala Leu HiS Asn Eis Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> Homo < 4 0 0> 3 65 gaaattgtfct tgacgcâgtc tccaggcacc ctgtctttgt ctceagggga aggagccacc 60 ctctcctgça gggccagtca gagtgttagc tacagctact tagcctggta ceagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct ccteatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca ISO çacaçgttca gtggcagtgg gtctggaaca gacr.tcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactçtc.at cagtatggta actcatttcg gacgttcggc 300 caagggagca aggtggaaat caaa 324 <210> 4 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 caggtgcfcgc aggagtctgg gggaggcgtg stccagcctg ggaggtçcct gagactctec 60 tgtgcagcct ctggattsac cttcagtagc tatggcatgg actgggtccg coaggctcca 120 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagtttta tcatatgctg gaagtaat.aa atactatgca 100 gaetcagtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gçctgagace tgaggacacg gçtgtgtatt actgtgcgcg agatacagtg 300 aggggctttg actactgggg ccagggaatc ctçgfccaccg tctcctca 348 <210> 5 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtctfcggaga tcaagccfccc 60 stçtcttgca gatctagtca gaccattgta catagtaatg gacacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatcfc ccaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaçgtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac sctcaagatc 240 ageagagtgg agcctgagça tctgggaatt tattattgct ttcaaggttc acatgttcea 300 ttcactttcq qccctgqqac caaagtqtat atear»a 33S <210> 6 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens 66 <400> 6 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc gtggtecagc ctgggaggtc cctgagactc çq tcctgtgcag cctctçgatt cacettcagt agctatggca tgcactgggt cogccaggct 120 ocaggcaagq ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtat taaataetat igo gctgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat Z40 ctgcaaatga acagcctgag agcfcgaggac acggctgtgt actactçtgc gagagateafc 300 gggagtaacc- cecttgaeta ctggggcçag ggaaccctgg teaccgtctc ct ca 354 <210> 7 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gatattgtga tgacceagte tccactctet ctgtccgtcg cccctggaca gccggcctcc 60 atctcctgta agfcctaçtca gagcetcctg gagagttatg gagagaccta tttgtattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gcctccscaq cteetgatct atgcagtttt taagcggttc 160 tctggagtgç caggt&ggtt eaqtggcagc gggtcaggaa cagatttcac sctgaaaatc 240 agccgggtgg ággctgagga tgttggggtt tatfeaetges tgcaaagtat geagcttcct 30Ô ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336 <210> 8 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 caggtgcagc tgcaggagte tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcaat aactttggca iacactgggt eegccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg afcggaagtga taaatattat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgetgaat 240 ctgcaaatga atagtctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagãtcgt 300 cggtattact accactaeta cggtatggac gtctggggcc aagggaccat ggtcsccgte 350 tccfcca , . 366 <210> 9 <211> 527 <212> DNA 67 <213> Homo sapiens <400> 9 tggacatata tatgggtgac aatgacatcc actttgcctt tctctccaca ggcgcgcact 60 cccaggtgca gcfcgcagcag tctggggetg aggtgaagaa gcctggggcc tcagtgaagg 120 tctcctgcaa ggcttctgga tacaccttca ccgactacta tatgcactgg gtgcgacagg ISO ccectggaea aggacttgag tggatgggafc ggatcaaccc taacagfcggt ggeacaaaet 240 atgcacagaa gtttcagggç agggtcacca tgaecaggga cacgtccatc agtatagcet 300 acatggsgcfc ggacaggctg agatctgacg acacggcegt gtattactgt gcgagagstg 360 agatcctagc agcagatggt atctactatt tctacggtct ggaegtotgg ggccaaggga 420 ccacggtcae cgtctcetca ggtgagtcct gtcqacggat ccacccaatg cccatgagcc 480 eagacaefcgg acgctgaacc tcgcggacag ttaagasece aggggcc 52? <210> 10 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc gtggtccagc cfcgggaçgtc ectgagaetc 60 tcctgtqcag cctctggatt caccttcagt 3gctatggca tggactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaigg ggctggagtg ggtggcagtt ttatcatatg atggaagtaa taagtactat 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240 ctgcaattga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gcgagataca 300 çtgagçggct ttgactactg gggccaggga afcectggtca ocgtctcotc a 351 <210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 68 Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Vai Val Gin Pra Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 ,30 Gly Ket His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly 55 Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val sn 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Het Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Gly Ser Asn Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 12 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala val Leu Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 5o 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyx Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Val Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ile Leu 100 105 110 val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 122 <212> PRT 69 <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 13 Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20 Gly Ile HÍS Trp Vai Arg Gin Ala 35 40 Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser 50 55 tys Gly Arg Phe thr Ile Ser Arg 65 70 leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85 Ala Arg Asp Arg Arg tyr Tyr Tyr 100 Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai 115 120 Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu a S Glu Trp Vai Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 60 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 75 80 Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 35 His Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp 105 UG Ser Ser <210> 14 <211> 117 <212> PRT <213> Homo < 4 0 0 > 14 Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20 Gly Met Asp Trp Vai Arg Gin Ala 35 40 Ala vai Leu Ser Tyr Ala Gly Ser 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu m Pro 85 Ala Arg Asp Thr Vai Arg Gly Phe 100 Vai Thr Vai Ser Ser 115 Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp· Vai 45 Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser ^al 60 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 . 95 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ile Leu 105 110 70 < 210 > 15 <211> 112 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gin Ala Sar Xle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Thr Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys val Tyr Ile Lys 100 105 110 < 210 > 16 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 i$ Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Tyr Ser 71 20 25 30 Tyr Leu Ma Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Giy Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Phe 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Gin 100 105 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 17 Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Ser Vai Ala Pro Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ue Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30 Tyr: Gly Glu Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Ala Vai Phe Lys Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95 Mel Gin Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 72 Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Gly' Ala thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Tyr Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly ile Fro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Gly Asn Ser Phe 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 Lisboa, 24 de Fevereiro de 2011 73 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento que tem a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula B humana normal, estando o dito anticorpo monoclonal ou fragmento isento de actividade agonista significativa quando o dito anticorpo monoclonal ou fragmento se liga ao antigénio CD40 expresso à superfície da dita célula B normal; sendo que, quando o dito anticorpo monoclonal ou fragmento se liga ao antigénio CD40 expresso à superfície da dita célula B normal, o crescimento ou diferenciação da dita célula B normal é inibido, caracterizado por o dito anticorpo monoclonal ou seu fragmento compreender uma região variável de cadeia pesada contendo os resíduos 31-35, 50-66 e 99-111 da SEQ ID NO:13, e compreende uma região variável de cadeia leve contendo os resíduos 24-39, 55-61 e 94-102 da SEQ ID NO:17.
2. O anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com a Reivindicação N°.l, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:13.
3. O anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com a Reivindicação N°.l, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:17.
4. O anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com a Reivindicação N°l, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:13 e a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:17.
5. O anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, caracterizado por possuir pelo menos uma das seguintes actividades biológicas: 1 (i) Inibição da secreção de imunoglobulinas pelas células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T; (ii) Inibição da proliferação de células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T Jurkat; e (iii) Inibição da proliferação de células B humanas do sangue periférico estimuladas por células que expressam CD40L. 6. 0 anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, caracterizado por possuir as seguintes actividades biológicas: (i) Inibição da secreção de imunoglobulinas pelas células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T; (ii) Inibição da proliferação de células B humanas do sangue periférico estimuladas por células T Jurkat; e (iii) Inibição da proliferação de células B humanas do sangue periférico estimuladas por células que expressam CD40L. 7. 0 anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, caracterizado por o dito anticorpo ou seu fragmento se liga ao dito antigénio CD40 humano com uma afinidade (KD) seleccionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 10“5 M, pelo menos IO”7 M, pelo menos 10’9 M e pelo menos 10”11 M. 8. 0 fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, caracterizado por o dito fragmento ser um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fab ou um fragmento Fv do dito anticorpo monoclonal. 2
9. Um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l-N°.8, caracterizado por se destinar a ser utilizado em terapêutica.
10. Um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l-N°.8, caracterizado por se destinar a ser utilizado na (i) profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por anticorpos num paciente, (ii) profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por IgE num paciente, ou (iii) profilaxia ou tratamento de uma doença autoimune num paciente.
11. O uso de um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l-N°.8, caracterizado por ser utilizado no fabrico de um medicamento para (i) profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por anticorpos num paciente, (ii) profilaxia ou tratamento de uma doença mediada por IgE num paciente, ou (iii) profilaxia ou tratamento de uma doença autoimune num paciente.
12. Um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l-N°.8, caracterizado por se destinar a ser utilizado na inibição da produção de anticorpos pelas células B num paciente humano.
13. Um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l-N°.8, caracterizado por ser utilizado no fabrico de um medicamento para a inibição da produção de anticorpos pelas células B num paciente humano.
14. Um método para inibir o crescimento ou diferenciação de uma célula B humana normal, ou para inibir o crescimento ou diferenciação de uma célula B humana normal, sendo a dita proliferação aumentada pela interacção de um ligando de CD40 com um antigénio CD40 expresso à superfície de uma célula B, e sendo o dito método caracterizado por compreender o contacto 3 da dita célula B in vitro com uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal humano anti-CD40 ou de um seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l-N°.8.
15. Um hibridoma, caracterizado por possuir a capacidade de produzir um anticorpo monoclonal humano, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l a N°.7.
16. Um ácido nucleico, caracterizado por compreender um polinucleótido que codifica para um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l a N°.8. 17. 0 ácido nucleico, de acordo com a Reivindicação N°.l6, caracterizado por compreender a sequência polinucleotidica apresentada em SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8.
18. Uma composição farmacêutica, caracterizada por compreender um anticorpo monoclonal humano ou seu fragmento, de acordo com qualquer das Reivindicações N°.l-N°.8, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 24 de Fevereiro de 2011 4 1/13 Efeito dos MAbs antMiCD4Ô sobre a proliferação d® células 8 estimulada por GD4QL CPM

nr to x—" -d -x o t> ° W g*j o 4 o CM CM 2ccS eq od co m ^ O O V“ ·*“^ **? m r4 £o c& Kfi f F-*· h'». :r x x ít> <r> mo cm CQ 03 LTJ »» 0> 0> r*v KJ ε £ E „ £ „ ε „ E _ ε „ £ ε 6 ε i o> -L <. t ^ §* S* ΐ3ι crc sl o<» e& W™ uO «F— O O O ·*“* O »“ O *** O r* O ♦*- CD 4- 4* 4- 4* * 4* 4- 4* 4·* 4" 4- 4- 4- 4· —J «u •X .4 „J -4 ca o O O o O O O O O O O O O O O "*· M -sa ·*? ^«r *r Μ- -M •Μ· ·*φ Μ' M o <ss <£3 ca £3 £0 o o o CS O O Cs CS £3 >«3- o O cc MJ o o u o M> CO O í í Ϊ 1 i í t i i i ( í ! ! í 1 o o O O o O o o o o o o o O O o o t X C3w X X X C3C X£ 3X X X X X X XG o CJ> o o O L.7 O O O O CJ o o O CJí X -f- + 4- Hr ~T -f -t- 4· 4* 4- 4- 4-, -4- • Ψ- ·(- βϋβ 03 CD £» CD 03 CD 03 CD CD co m CD CD CD X 1 Efeito dos novos MAbs aoíi-CD40 sobre a proliferação de células B induzida por antHgjyí

X X cn ÈNÍ - i »*** tr> rM »rW V" O _ ε CD o es) tó XI £ OG oq o £à fW 0> -< ’vvv Cf> 00 sd '«j· 'M cn eft ÃSJ. (i*S w CD o c LU o £X3 O SJL w Ch tn *í— O CM e ΙΛ ♦— κ*ϊ ^g/mí Fig, 3 2/13 Efeito dos novos MADs anif-CD40 sobre a proliferação de céiuias 8 CPM

2 Efeito do cross-linking de anticorpos sobre a proliferação de células B a. to

O Oí v-~ O o <á 'Τ’* m td íd cá V*·· crí o> m oq oó cá a> o cn £“3 04: GO m tá m m <3V ϊΧ CS CS U‘> Lw Ê I <55 1 E X I ε 05 X Õí SSL Çft TX 05 CN o? Oft 04 05 St dL SSL sl in O tn X—V o tn m u. €T> £ m sx 04 o

o> o*. *r> o» SL tn CD ts O 4 3/13 Sequência 2, Sequência deduzida dos amínoé eidos de cadeia leva de hibridomas selecionados em comparação com SHT Fril m Frtó m SM? QIVITQmSlPfôlSgqASISCRSSqSLV^SÍtSfffYLHÍllflQSITOP^lITKVS^RFS 9F? 'Vtlí—T— --------Tí-H- 'Ή—£—-..........S....... 15B8 lE-«-Q-”Y*r......P4--.AYR7- m ε--ι--$·δτ·$ι·ρ·£ΐΗΐ-Α- mn~4-~M~-m-hT 2SJC4 E-L-S-GT-SL-P-EM-U—A- - VSÍSftM.....A-fi—SA-S-AT Frtó CDR3 Fr®f SH7 . *«mKISiWBCVrFCS^TtPiMM 9F? :::::::7r:;7;""3^7:7qp::::f-vti - 1588 ........................*-¥—Y-H-‘HQL-L------*V*I* I2D9- ‘ -I— ------T. -TA-r-Q-JfSSSTR-^-O—Q-l- 2004 -I......^.......v.T...L.p.-rA..y.H«FR*-0·;^!. 13E4 S * í. T- - SUS* PAI- R -HS$-CS--Q.....I- Fig. 5 o 4/13 Cadeia Pesada FM €DR1 m m m RYSVY mmmmus 9F? .....-δ-V^-g-tS-M—1F- $ m —-A.......m nm-mmm 121#. — S-V4M$-M---Tl· S-GMD —a—m VLSYD.....NK-YADSVXS 13E4 ......... ii-m —A—O—H- > «®1ΥΑ« 1583 -.......- V - O-GP, - - RLS - AA—IFfs! wm --A—--¾ YISYMMSIS 2604 ........ff-V-q-eR-iíLS-M—TF- sm —A.....-«A Frui 5H7 013 16 0Y Fr®4 «GQGTSVTfôS 91 -FT-Í1-»- -»ay*Q—8AE—V—A* DH-m *> ......L..... 1209 -FT-H-H-mV-a-RAE—y-A- vrn -- 13E4 *¥TK!8—I-IAVHELOR-«S-—V—A- mummm-y .....I.......... 1583 - FT · -R-N--KTIN-0--- -&A£- - -Y—-A- 1RIYYM -V —H— 20C4 - FT- -R-H- -ffTLY-Q—RPE—V- - -A- PMSf -y Cadeia Lave Fra! Sffl CBRI OIVITQAPLSLPVSLfiOQASISC SSSQSIÍ»UYLH Fnrí «YLOKPGQSPILlLiY C0R2 mm 9f? ΎΙΗ-Τ.....-..............-I Í4-4-E .........*-s 12® £-t'-S-6T-SÍ'F'£8-Tl*' -A- VSYSYIA -Q— GA-S-ÂT 114 ••qi-S-S-SA-V-m-T· 4-G 11016 -Q.....A*- M-SIQ- 15BS —H—S—S-AP-Q^----- K—- ΊΕ*Υ*Ε-Ϊ .....N— AVE--- 2604 Ε--1"Β-6ϊ·5ί'Μδ'ΤΙ" .-A— VSYSYIA ..Q-----A-R— GA4AT Fn$ 5H7 Mmmwmms&mc 013 SQSTHW fíWf FMIEU f7 -......................p-—i-t- F_gS—f- ••p—yyi- 1209 *1—.......-—I—L-P--FA--Y- 0-YGSSfR- -4-41- 13E4 —s—K—E—T- -aíP-FAT-Y- Í-WMS -0.....Ϊ- 15B3 --------------------------------y—Y- 8-HHL-L* ......V-I- 20C4 -I—........T—t-P-FA-Y- MF1 -4-44 6 5/13

1588-FiTC eLinfócitos 1588-F1TC eLinfódtos

S^03d“0ZGD

6/13 imt *2 í IV l T Q S P fi T L S1 mm mmm mmm accctgtctí GGCTTTAAC ACAACTGCGT (MICÍS TMAGAA +2 L $ P S E R A I í S C RÃS Q S ¥ si isTcms etc AcccTcTccí mm& mmm mmm cctttctcgs mmm mame rncmm +2 S' V S Y L I 1 Y o Q π G (S A P R 101 AMEI ACTTAGCCTG GTACCAGCAG AWCTGffiC ASSCTCCCAG TCffilTCSA MCfiSAC O.TGGTCGTC TTTGGACCGG TCCGAGGGTC +2 L L I Y S A $ S R A T δ i P D K 151 AOTATC TATGGTGCAT CCAGCAGGGC TOCATC T&AGMAG ATACCACGÍA GGTCGTCCCG SIBftDOSIWS ffiCTGTCCA +2 F S fi S δ $ δ T D F T ί I I SSL 231 IWTOS TGGGTCTSG.A «ΜΠΤΕΑ CíCTCACCAI CA8MHS AGIGACCGTC ÃffiáSACCT TTOAST «ffi STOTGAC +2 E P E 0 F A ¥ Y Y C Q Q Y 6 $ $ F 251 StâCmS ATTTTSCAST êTATíâCTST CASCASTAT6 STAfOTT CTCGGACTCC TAAMCGTCA CATMFGACA GTCSTCÂTÂC CATCGAGTAA +2 RTF S Q S T t 0 E í K 3DÍ T03SACG1TC GGCCAAGGGA CCAAGCASGA GATCAAA AffiCIM COTCCCT 0fffTOt€CÍ CÍASTTT 7/13 ÍÃSConst scctccacca msxm mmm cisgcgccct sctcow cacctccgas mmm ram cctggtcaag «ettcc ccgaaccsst gacsstgtcg

mmtú cccrcASCAG mmm «cm gcmcttc&s cac mm mccwm mmm cmscccagc mttm mwmc mmm mmm mgigccc mmm mmm wmmx mmmc CTcrrccctc tmcm gsacaccctc atsatctccc &sacccctsa itcacstgc δβτεδ m&m cgmgacccc «iccast tcmctgsta cêi»c mmm mim mmm mam mmm mmm mmm icmcgt mmm gactssctga mmm gtacaagigc m\cm ί&ΜΠ CCCAfiCCCCC AíCSÂGMM CCATCTCCM AACCAA^SG «cgccság mmm GBficccis cccccATccc mmm mmm mmm mmm mmm Tímm mmm cgtgsastgg GÁSA8CMTG GSCASCCSGA SMCAACTAC ÃAfôíXÂCAC CTCCCATGCT OGACICCGAC GGC1CCTTCT TCCTCM CMSCTCACC MCAA» GCAGGTCEÂ GtffiGSAAC stcttcw cíotkf acATMT ctscacmcc mmm mmm MlICie CSSSTAM ASTOSP LÂPCSRSTSE SXMLGCLVK DVFPMS 1MJS HTFPAVLQSS avsusswT vpssrar otohkk mot kccvecppcp appwsyf LFPPKPKQTL HISRTPEVTC VVVDVSHtDP E1F1WS eiffl® IEQFNSTFR Mi aiiffitc KvsmssLMP mm roorni ppsreem QVSLTCt.VKS FYPSQIAVEW ESWEffiY KÍTWHLDS) GSfFLVSKLT WMm !FSC$1«Ã IHSTOL SL5PGK 68 128 188 248 388 368 428 488 548 680 668 720 718 848 10 978 68 128 180 248 388 326

8/13 28C4vk,l «μιικπτ wmm. mmm císicimr rasas» mmm so ctctcctgca mmm mmm immm tascctssta tmmm m cnasm ctcccaggct cctcatciaí otatexa mmx mmm m mmm mimwi mmm gcttcctc imm «?« 240 ÇÇfGMT TTSCAGTGTA TTACTGTCAT ÇASWSS1OTTKB GACGTTCSGC 300 mim AffiMT cm 324 20C4vfíÍ cabsito mmm mmm mmm «tcccí mctctcc ' so T6T3CAGCCT CTGGATTCAC CTTCA3TA3C IAM® fflPCCS CCASSCTCCA 120 TOS TSSAST88STGSCAGUTO MATO SWSTAATM ATACTATGCA. ISO scícas!» mmm acaicTcc msm ccaagaaeac gcitatci 240 CAAATfiftftCA 6CCMC T«ffi SCTSIÍMT /OTBC8GG ASATACASTS 300 fflcrrrG acio» ccagggaatc «m tctcctca 34a 2¾. 10 9FM.1 «to tgacccaaac itfôcicicc cisccTGTCA mmm rawsm as áicicTíGCA mama saccattgta mmm sacacaccta tttasaato m TACCTGCAGA MCCASGCCÂ GTCTCCAAAô CTOTCI mmC CAACCSATfT 180 TCTGQGGTCC MCáGSTT fflSlSBWST ®T« CfiSATÍTGC ACICAAmiC 240 mmm mmm tctessaatt tattatígci m*nc aco ifCAciiTcs ranrn tmmm mm m wm mw& tgcamtc gtggiccagc cisgwtc cctmctc so rases cctctssatf caccttcagt asctato mmm ccosscr 120 mmm mmm otmt aiatcatãts hmmm immm iso ora tbmgskxs aitcaccatc tcc«câ hvrnm mmm 240 ogcamb mmm mmm mmm actactgtssc «ií m mmmi coara crasssaas mm® icaccgtctc ctca fíg. 11 354 9/13 158Μ.3 ffltsmk TSACCCAGTC TCCACTCTCT CTGTCCGTCG CEXCWfà OTOT 68 ATCTccTGift mmizk mtccts mmm mmm toatíss 120 tacctma mmk mctm ctcctsatct mm mmm lee tctotc mmrí mmm: mmm mmckc mmmt 240 imm m.mm mmm tatota mmm «mxr 300 ctcacttícXí mmM mmm atcm 335 ISSSvh! caggtgcagc isae towc stocasc we ccreic a mmm mim cacchcmi moito tacactgggt mmm ias tsmm ra* mmm mmm mmm tmattat m mcm Tmccs mm mmm mmm cmewt m cmmm mam mmmt adbbctktst hmmm mmm 3» mmm accactacta mmm stctocc mm mmzm 368 TOA 366 Fig, 12 «TM TOA® IffiOT 6TGMSAAGC CTGGGGCCTC AGTGAAGGTC 68 tcctsom mmm caccttcacc wmtsh mmm mim: ião mmm mimi mmm âtcaacccta mmm mmm m mmmi Timm mmm mm tmm mmm 248 mmm Mmm mmmt acggccgtst attacigtgc mmm soe ATCCTAfíCAG CÃSWGGTAT CTACTATTTC Wmm MOTOS CCAMCC 368 OTCÁCCS TCTCCICA 378 120§vhl mmm isceic íggsgsâggc gtggtccagc csssm cci«ctc 68 mmm octomít caccttcast aotssca wcm zmm m mmm μα® smcastt ttaicatatg himmm mm® m mmm toscos mmm mmm mmm mmmi 21 CTSCAATTSA ACAGCCTfiAS MC .ACGGCTGTGT ATT#m fiCSSGATACA 308 STGAGGGGCI TTSACTACTe mum ATMIffi OCSTCTO A 351 13 10/13 9F7VH1 «SéOTfM mmBmmmmmmsims mm imMíifflmmmmwfà mm mmmmMmmmvmmÊmmmmmmismm msimmmwmmmmwmyms 20C4VH1 immmwKmmmmmítt mm mtmmmmmmmií imm mtmmmmwmm mm DÍVHÍQSPLSf.SVAPGQPASISCKSSaSLLESYeErYLyWLQKPGQP^LUY/WFKRFSfiVPORrSGSSSSTDniKI zmm mmmmmwmmmi Fig. 14 11/13 Efeito dos anticorpos anfí-CD40 sobre a proliferação de oéiuias de Inferna {sem íl-4) Msei mn sm

Efeito cios anticorpos aníi-CD4Q sobre a proiifaragão de ceioias de iinfoma (+ 11-4)

Fig, 16 12/13 Efeito dos anticorpos antí-CDC sobre a proliferação de céluias de Morna cpm cpm 70000*1 60000- 50000* 40000- 30000- 20000*

MS81

i___2____5 1 2 5 jug/mt Anticorpo

Curva de Dose-Resposta a 15B8 na proliferação das Células de LNH do Paciente A Sensível ao Riiuxans estimuladas por CD40 e iL-4

—hlgS2 Fig. 18 ug/mt 13/13 Curva de Dose*Resposta a 15B8 na proliferação de Células B Humanas Estimuladas por C040L cpm

0,001 0.01 0.1 10 indivíduo 12 IndivíduoS lndívíduo13 1588 19