PL166014B1 - Sposób wytwarzania chlorowodorku estru metylowego -L-aspartylo-L-fenyloalaniny - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania chlorowodorku estru metylowego -L-aspartylo-L-fenyloalaruny, ( -APM), bez 57) wyodrębniania produktu przejściowego jako substraty kwas asparajgnowy kwosmrówkoϋoo bszwodnńk octowy i L-fenyloalaninę, znamienny tym, że (a) formyluje się kwas L-asparaginowy w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 1,2-1,35 równoważników molowych kwasu mrówkowego na mol kwasu asparaginowego, 2,2-2,9 moli bezwodnika octowego na mol kwasu asparaginowego 1 co najmniej 0,3 równoważników molowych drugorzędowego alkoholu, w odniesieniu do całkowitej ilości dodanego kwasu octowego, ewentualnie w obecności katalizatora, przy czym bezwodnik octowy dodaje się albo jednorazowo w ilości 2,3-2,9 moli na mol kwasu asparaginowego albo w dwóch porcjach, najpierw w ilości co najmniej 2,0 moli na mol kwasu asparaginowego, a później w ilości około 0,2 moli na mol kwasu asparaginowego, następnie (b) sprzęga się in situ tak wytworzony bezwodnik N-foęmyldaspaęagmdwy z Lfenyloalaniną, w obecności co najmniej 7 równoważników molowych kwasu octowego, w odniesieniu do Lfenyloalanlno i ewentualniew obecności estru alkilowego i/lub alkoholu z zawadą przestrzenną, w temperaturze 5-60°C, otrzymując izomery , -N-fdęmolo-L-atpaętyldL-fenoldalanmo, (c) odformylowuje się powyższe izomery, dodając około 1,2 mola kwasu solnego na mol kwasu asparaginowego, (d) usuwa się z mieszaniny reakcyjnej pozostały kwas octowy i mrówkowy, (e) estryfikuje się odfdrmoldoanj izomery, dodając do mieszaniny reakcyjnej 1-10% wagowych metanolu,...

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania chlorowodorku estru metylowego a-Laspartylo-L-fenyloalaniny (α-APM (HCl)), bez wyodrębniania produktu przejściowego. Związek ten jest stosowany do wytwarzania estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny (a-APM) -środka słodzącego, który jest około 200 razy słodszy niż sacharoza. Siła słodząca tego dipeptydu umożliwia słodzenie produktów żywnościowych i napojów mniejszą jego ilością niż w przypadku słodzenia cukrem. W konsekwencji, umożliwia to milionom konsumentów zmniejszenie ilości pobranych kalorii bez zaprzestania spożywania słodyczy. Ponadto środek ten jest pozbawiony nieprzyjemnego posmaku, który mają inne środki słodzące, takie jak sacharyna i cyklaminian.

Sposób według wynalazku umożliwia zwiększenie stosunku α/β APM(HCl) i wytwarzanie końcowej mieszaniny reakcyjnej α/β APM(HCl) o lepkości umożliwiającej przelewanie.

a -APM nie jest nowym związkiem i znany jest z opisu patentowego Stanów Zjedn. Ameryki nr 3492131 z 1970 r. Od tego czasu zostały opublikowane liczne opisy patentowe dotyczące różnych sposobów jego wytwarzania i związków pokrewnych oraz obszerna literatura na temat wpływu, jaki wywarł ten dipeptyd na przemysł niskokalorycznych środków słodzących. Jednak aż do chwili obecnej sposoby wytwarzania obejmowały kosztowne procesy wydzielenia i odzyskiwania, które w konsekwencji obarczały konsumenta.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się porównywalną wydajność żądanego produktu końcowego bez potrzeby wyodrębniania produktów przejściowych, jak to było wymagane w znanych sposobach.

Ester metylowy α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny jest dipeptydem złożonym zasadniczo z 2 aminokwasów, kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny. Wiadomo, że słodzące własności dipeptydu zależą od stereochemii tych pojedynczych aminokwasów. Każdy z tych aminokwasów może występować w postaci D lub L i stwierdzono, że estry L-aspartylo-L-fenyloalaniny są słodkie, podczas gdy odpowiednie izomery D-D, D-L i L-D nie wykazują tej cechy. Kombinacje izomerów, które zawierają dipeptyd L-L, DL-aspartylo-L-fenyloalaninę, L-aspartylo-DL-fenyloalaninę i DLaspartylo-DL-fenyloalaninę są słodkie ale, tylko w połowie tak słodkie jak izomer L-L, ponieważ racemat zawiera 1/2 grup L-L.

166 014

Dipeptyd wytwarza się przez reakcję sprzęgania, w której kwas L-asparaginowy łączy się z L-fenyloalaniną lub jej estrem metylowym. Taka reakcja sprzęgania wymaga obecności grup zabezpieczających grupy aminowe w kwasie asparaginowym, takich jak grupa formylowa, acetylowa, acetyloacetylowa, benzylowa, podstawiona i niepodstawiona karbobenzoksy, tertbutoksykarbonylowa i grupa soli halogenowodorkowej. Grupy zabezpieczające grupy aminowe często określa się w literaturze jako grupy N-zabezpieczające, a w sposobie według wynalazku środkiem blokującym jest grupa formylowa stąd określa się ją jako N-formylową. Bezwodnik N-formyloasparaginowy jest szeroko stosowanym związkiem wyjściowym np. w procesie opisanym w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4173 562.

Reakcję sprzęgania prowadzi się w rozpuszczalniku i zwykle stanowi to etap w kilku opatentowanych sposobach wytwarzania estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny (α-APM); opisy patentowe Stanów Zjedn. Ameryki nr nr 3962207, 4173662 i opis patentowy EPO nr 127 411. Podczas reakcji sprzęgania dwóch aminokwasów powstają dwa izomery jako związki przejściowe o stechiometrii, która ostatecznie determinuje własności słodzące danej cząsteczki. Pożądanym produktem jest izomer a, który w wydzielonych frakcjach czystego α-APM ma 130-200 razy większą siłę słodzącą niż cukier. Frakcja izomeru fi, jednak, nie wykazuje takiej właściwości.

Celem wynalazku jest ulepszenie sposobu wytwarzania a-APM(HCl), które prowadzi do niższych kosztów produkcji i zwiększa wydajność izomeru a pożądanego produktu końcowego.

Izomery a i β APM są przedstawione odpowiednio wzorami 1 i 2.

Stwierdzono, że tworzenie się reakcji sprzęgania izomerów a i β i ich stosunek zależą od rodzaju, stosowanego do reakcji sprzęgania rozpuszczalnika, temperatury reakcji i jakości rozpuszczalników. Według opisu patentowego Stanów Zjedn. Ameryki nr 4173 562 uzyskuje się stosunek izomerów α/β 75:25, gdy jako rozpuszczalnik stosuje się kwas octowy, a reakcję sprzęgania prowadzi się w 50°C. Stosunek molowy kwasu octowego do fenyloalaniny musi wynosić co najmniej 10:1. Gdy stosunek molowy kwasu octowego do L-fenyloalaniny zmniejsza się do 6:1, stosunek izomerów α/β znacznie spada do 69/31.

Sposobem według wynalazku można zwiększyć stosunek α/β nawet do około 80/20, jeżeli kwas octowy stosowany jako rozpuszczalnik w reakcji sprzęgania częściowo zastąpi się estrem alkilowym, alkoholem z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniną. Przez alkohol z zawadą przestrzenną należy rozumieć alkohol drugorzędowy lub trzeciorzędowy.

Problem związany ze stosowaniem tych rozpuszczalników polega na tym, że po 0,5-3 godzinach reakcji mieszanina reakcyjna zestala się i zasadniczo niemożliwe jest jej mieszanie lub usunięcie z reaktora. Z dwóch powodów niezbędny jest układ reakcyjny, który nadawałby się do mieszania. Po pierwsze mieszanie zapewnia skontaktowanie reagentów, dzięki czemu zachodzi całkowita reakcja. Po wtóre, rozpuszczalnik musi być później usunięty przez destylację.

Inny problem, który występuje w znanych sposobach polega na tym, że traci się 25% lub więcej α-APM, który pozostaje w roztworze reakcyjnym (patrz opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 4 173 562). Dalszy problem polega na tym, że w sposobie według tego opisu patentowego z mieszaniny reakcyjnej zawierającej kwas asparaginowy, duży nadmiar kwasu mrówkowego i bezwodnik octowy powstaje bezwodnik N-formylo-asparaginowy. W pewnym momencie nadmiar kwasu mrówkowego musi być usunięty przez destylację i oddzielony od kwasu octowego, co podnosi koszt produktu końcowego.

Z opisu patentowego Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 962 207 znany jest podobny proces, w którym chlorowodorek bezwodnika L-asparaginowego sprzęga się z estrem metylowym Lfenyloalaniny. W tym sposobie wymagana jest duża ilość estru metylowego L-fenyloalaniny, co podnosi koszt końcowego produktu. Po drugie, tworzy się znaczna ilość tripeptydów, które muszą być usunięte, a w związku z tym występuje konieczność zastosowania kosztownych i skomplikowanych technik rozdzielania. Niedogodności tych pozbawiony jest sposób według wynalazku.

Z opisu patentowego Stanów Zjedn. Ameryki nr 3933781 znany jest sposób wytwarzania chlorowodorku estru metylowego α, -L-aspartylo-L-fenyloalaniny przy zastosowaniu jako substratu wydzielonego bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego.

166 014

Ponadto, z opisu patentowego Stanów Zjedn. Ameryki nr 4810816 znany jest jednoreaktorowy proces, w którym stosuje się takie ilości kwasu mrówkowego i kwasu L-asparaginowego, że na końcu etapu formylowania bezwodnik N-formylo-L-asparaginowy znajduje się w stanie zawiesiny w kwasie octowym, wolnym od kwasu mrówkowego i bezwodnika octowego, która jest bardzo trudna do mieszania.

Wszystkie wady znynych sposobów eliminuje sposób według wynalazku.

Istotą niniejszego wynalazku jest wzajemne oddziaływanie określonych etapów procesu, który umożliwia łatwe prowadzenie procesu w jednym reaktorze; mianowicie, reguluje się w taki sposób poziom rozpuszczalników, że cały czas utrzymuje się mieszaninę reakcyjną w stanie nadającym się do mieszania, a jednocześnie uzyskuje się zaskakująco ulepszony stosunek izomerów α/β.

W znanych sposobach, rozpuszczalniki musiały być zawracanie po każdym etapie procesu. Tak np. gdy tworzono bezwodnik N-formylo-L-asparaginowy w znanym procesie, nadmiar kwasu mrówkowego i kwasu octowego musiał być usuwany przez destylację lub innymi metodami.

Żadna ze znanych publikacji nie ujawnia specyficznego etapu formylowania, zastosowanego w sposobie według niniejszego wynalazku, który umożliwia konwersję nadmiaru reagentów w rozpuszczalnik, nadający się do reakcji sprzęgania; żadna z nich nie sugeruje nawet takiej możliwości. Dzięki tej konwersji, mały nadmiar niektórych reagentów można zastosować dla ulepszenia kinetyki etapu formylowania, ajednocześnie nadmiar ten nie może niekorzystnie wpływać na etap sprzęgania, ponieważ przekształca się go w odpowiedni rozpuszczalnik.

W związku z tym, jednoreaktorowy sposób według wynalazku, w którym produkty uboczne reakcji formylowania wykorzystuje się jako rozpuszczalnik reakcji sprzęgania, eliminuje wiele problemów związanych z rozdzielaniem i znacznie ułatwia proces i obniża jego koszty. Jednocześnie rozcieńczanie środowiska reakcji sprzęgania estrem i/lub alkoholem z zawadą przestrzenną poprawia wydajność α-APM/HCl.

Według wynalazku jednoreaktorowy sposób wytwarzania chlorowodorku estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, przy zastosowaniu jako substratów kwasu asparaginowego, kwasu mrówkowego, bezwodnika octowego i L-fenyloalaniny polega na tym, że:

(a) formyluje się kwas L-asparaginowy w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 1,2-1,35 równoważników molowych kwasu mrówkowego na mol kwasu asparaginowego, 2,2-2,9 moli bezwodnika octowego na mol kwasu asparaginowego i co najmniej 1,3 równoważników molowych drugorzędowego alkoholu w odniesieniu do całkowitej ilości dodanego kwasu octowego, ewentualnie w obecności katalizatora, przy czym bezwodnik octowy dodaje się albo jednorazowo w ilości 2,3-2,9 moli na mol kwasu asparaginowego albo w dwóch porcjach, najpierw w ilości co najmniej 2,0 moli na mol kwasu asparaginowego, a później w ilości około 6,2 moli na mol kwasu asparaginowego, następnie (b) sprzęga się in situ tak wytworzony bezwodnik N-formylomyloasparaginowy z Lfenyloalaniną, w obecności co najmniej 7 równoważników molowych kwasu octowego, w odniesieniu do L-fenyloalaniny i ewentualnie w obecności estru alkilowego i/lub alkoholu z zawadą przestrzenną, w temperaturze 5-60°C, otrzymując izomery α, β-N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, (c) odformylowuje się powyższe izomery, dodając około 1,2 mola kwasu solnego na mol kwasu asparaginowego, (d) usuwa się z mieszaniny reakcyjnej pozostały kwas octowy i mrówkowy, (e) estryfikuje się odformylowane izomery, dodając do mieszaniny reakcyjnej 1-10% wagowych metanolu, 32-50% wagowych wody i HCl w ilości odpowiadającej 9-18% wagowych, przy czym otrzymuje się chlorowodorek α i β-APM, z którego wytrąca się chlorowodorek α-APM oraz (f) wydziela się wytrącony chlorowodorek α-APM.

Korzystnie, jako drugorzędowy alkohol w etapie (a) stosuje się alkohol izopropylowy.

Korzystnie etap sprzęgania (b) prowadzi się w obecności estru alkilowego, alkoholu z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniną, w ilości 1,2-4,7 moli na mol L-fenyloalaniny.

Ponadto, korzystnie etap odformylowania (c) obejmuje dodatkowo dodawanie metanolu w ilości skutecznie estryfikującej kwas mrówkowy i octowy znajdujące się w mieszaninie reakcyjnej, a etap (d) obejmuje usuwanie wytworzonego octanu i mrówczanu metylu, przy czym szczególnie

166 014 korzystnie etap sprzęgania.(b) obejmuje ponadto destylację próżniową kwasu octowego, alkoholu z zawadą przestrzenną i estrów obecnych w mieszaninie reakcyjnej, przed etapem odformylowania (c).

Najkorzystniej etap usuwania (d) prowadzi się na drodze destylacji pod ciśnieniem atmosferycznym.

Etap sprzęgania (b) prowadzi się bez mieszania lub stosując mieszanie. Korzystnie, stosuje się mieszanie za pomocą mieszadła mechanicznego, zwłaszcza obracającego się z prędkością mającą od około 40 obrotów na minutę. Można też stosować mieszadło mechaniczne w sposób okresowy.

Korzystnie miesza się energicznie przez około pierwsze 1/2 godziny po dodaniu Lfenyloalaniny i b/ następnie powoli lub stosując przerywanie mieszania.

Korzystne jest też mieszanie za pomocą mieszadła mechanicznego, przy czym energiczne mieszanie uzyskuje się przy prędkości mieszadła około 60 obrotów na minutę, powolne mieszanie przy prędkości mieszadła około 20 obrotów na minutę, a przerywane mieszanie wówczas, gdy mieszadło pracuje co najmniej jeden raz w ciągu co najmniej 1 minuty co każde 15 minut.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku etap sprzęgania (b) prowadzi się w temperaturze około 5-40°C, otrzymując izomery α,β-N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, etap odformylowania (c) prowadzi się w obecności metanolu oraz etap (d) prowadzi się przez destylację próżniową nadmiaru kwasu octowego, kwasu mrówko wego, octanu metylu i mrówczanu etylu z mieszaniny reakcyjnej.

Ponadto, korzystnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się metanol podczas etapu destylacji próżniowej (d), w ilości skutecznie ułatwiającej usuwanie kwasu octowego i mrówkowego przez tworzenie odpowiednich estrów metylowych.

Najkorzystniejsze jest prowadzenie etapu sprzęgania (b) z zastosowaniem mieszania mieszadłem mechanicznym z prędkością poniżej około 30 obrotów na minutę.

Reasumując, początkowo wytwarza się bezwodnik N-formylo-L-asparaginowy przez połączenie kwasu asparaginowego z bezwodnikiem octowym i kwasów mrówkowych w reakcji podobnej do znanych procesów, patrz opisy patentowe Stanów Zjedn. Ameryki nr nr 3 933 781,3 962 207 i 4 173 562 i 4810816. W sposobie według wynalazku stosuje się minimalną ilość kwasu mrówkowego (1,2-1,35 równoważników molowych na mol kwasu asparaginowego), a nadmiar przeprowadza się w mrówczan izopropylu, dodając bezwodnik octowy i alkohol izopropylowy. Formylowany bezwodnik asparaginowy następnie sprzęga się in situ dodając L-fenyloalaninę (L-Phe). Do reakcji sprzęgania ewentualnie dodaje się estru alkilowego lub alkoholu z zawadą przestrzenną, co nieoczekiwanie znacznie poprawia stosunek α/β.

Podczas gdy zwykle w reakcji alkoholu z bezwodnikiem powstaje ester, nieoczekiwanie alkohol z zawadą przestrzenną nie reaguje z bezwodnikiem N-formylo-asparaginowym podczas przebiegu reakcji. Reakcję sprzęgania można prowadzić słabo mieszając lub bez mieszania, aby utrzymać niską lepkość mieszaniny reakcyjnej, co daje w rezultacie nadającą się do przelewania końcową mieszaninę reakcyjną.

Wytworzony dipeptyd następnie odformylowuje się za pomocą HCl i estryfikuje się doprowadzając stężenie metanolu, wody i HCl do ilości, które skutecznie doprowadzają do wytworzenia a-APM(HCl) z wysoką wydajnością. Z mieszaniny reakcyjnej wytrąca się a-APM(HCl), który wydziela się i zobojętnia zasadą z wytworzeniem α-APM.

W praktyce, korzystnie sposób według wynalazku zaczyna się od zmieszania kwasu Lasparaginowego z minimalną ilością kwasu mrówkowego (co najmniej 1,2 równoważnika molowego w przeliczeniu na kwas asparaginowy) i bezwodnika octowego (co najmniej 2,0 równoważniki molowe w przeliczeniu na kwas asparaginowy) w obecności katalizatora takiego jak tlenek magnezu, w wyniku czego powstaje bezwodnik N-formylo-L-asparaginowy. Odpowiednie katalizatory obejmują tlenki, wodorotlenki i sole metali i są opisane w opisach patentowych Stanów Zjedn. Ameryki nr nr 4 508 912 i 4 550 180. Reakcję tę przeprowadza się w temperaturze do około 52°C. Mieszaninę korzystnie miesza się w temperaturze około 50°C przez co najmniej około 2,5 godziny. Po około 2,5 godzinach dodaje się jeszcze około 0,2 mola bezwodnika octowego w celu przeprowadzenia nadmiaru nieprzereagowanego kwasu mrówkowego w mieszany bezwodnik mrówkowo-octowy. Po dalszych 2,5 godzinach dodaje się nadmiar alkoholu izopropylowego (co

166 014 najmniej około 0,3 równoważnika molowego w przeliczeniu na całkowity dodany kwas mrówkowy) w celu przeprowadzenia bezwodnika mrówkowego-octowego w mrówczan izopropylu. Korzystnie stosuje się 1,3 do 1,35 równoważników molowych kwasu mrówkowego w przeliczeniu na kwas asparaginowy.

Alternatywnie do mieszaniny reakcyjnej można dodać od razu cały bezwodnik octowy (2,3-2,9 moli na mol kwasu asparaginowego) na początku reakcji, a drugorzędowy alkohol można dodać potem, aby zużyć nadmiar kwasu mrówkowego przez reakcję z mieszanym bezwodnikiem, w wyniku czego tworzy się odpowiedni ester. Mniejszą część bezwodnika octowego można także dodać z drugorzędowym alkoholem w jednym etapie. Korzystnie, jednak kwas mrówkowy, większą część bezwodnika octowego i katalizator miesza się przez około 2-3 godziny, po czym dodaje się mniejszą część bezwodnika octowego. Następnie reakcję prowadzi się przez dalsze 2-3 godziny mieszając, po czym dodaje się drugorzędowy alkohol (izopropanol). Taką końcową mieszaninę reakcyjną miesza się, korzystnie w około 50°C, przez dalsze 2-3 godziny aż do zakończenia.

Produkt, bezwodnik N-formylo-L-asparaginowy poddaje się następnie reakcji z N-fenyloalaniną in situ, przez co unika się stosowania kosztownych i czasochłonnych technik rozdzielania. Uboczne produkty reakcji służą jako korozpuszczalniki w reakcji sprzęgania.

L-fenyloalaninę sprzęga się z bezwodnikiem N-formylo-L-asparaginowym w równomolowych ilościach, ewentualnie w obecności estru alkilowego lub alkoholu z zawadą przestrzenną lub ich odpowiednich mieszanin.Stwierdzono, że ester alkilowy i/lub alkohol z zawadą przestrzenną zwiększają stosunek α/β, gdy dodaje się je w ilości odpowiadającej co najmniej około 1,2 mola na mol L-fenyloalaniny. Stosunek α/β wzrasta ze wzrastającą ilością estru lub alkoholu do momentu, w którym molowa ilość estru, alkoholu lub ich kombinacji jest w przybliżeniu 4,7 razy większa niż ilość L-fenyloalaniny. W tym momencie osiąga się poziom nasycenia, w którym stosunek izomerów pozostaje stały, niezależnie od ilości dodawanego estru lub alkoholu.

Korzystnie ester alkilowy, stosowany w reakcji sprzęgania, jest wybrany z grupy obejmującej octan metylu, etylu, izopropylu, n-butylu i mrówczan izopropylu. Korzystny jest octan metylu (MeOAc). Alkohole z zawadą przestrzenną, które można stosować, obejmują alkohol izopropylowy i drugo- lub trzeciorzędowy alkohol butylowy. Korzystny jest alkohol izopropylowy. Wymienione związki są korzystnymi środkami w sposobie według wynalazku i nie ograniczają możliwości stosowania innych estrów alkilowych lub alkoholi ani nie ograniczają zakresu wynalazku.

Następnie przeprowadza się reakcję sprzęgania przez mieszanie wyżej określonej mieszaniny przez około 4-6 godzin w temperaturze pomiędzy około 5-60°C, korzystnie pomiędzy 15-30°C, tj. w temperaturze pokojowej. Problem, który powstaje podczas reakcji sprzęgania, polega na tym, że gdy zachodzi reakcja z wytworzeniem N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, mieszanina lub zawiesina zaczyna zestalać się, tj. wzrasta jej lepkość do punktu, w którym mieszanie staje się wyjątkowo trudne, a nawet niemożliwe. Tak wysoka lepkość bardzo utrudnia sączenie i hamuje przenoszenie ciepła, co powstrzymuje destylację kwasu octowego, estrów i/lub alkoholu z zawadą przestrzenną, opisanych poniżej. Stwierdzono, że przez dodawanie kwasu octowego do reakcji sprzęgania hamuje się zestalanie tj. uzyskuje się obniżenie lepkości. Jest to istotne, ponieważ mieszanie zapewnia przebieg reakcji do końca. Ponadto kwas i estry muszą być usunięte z mieszaniny przez destylację przed odformylowaniem. Mieszanina musi nadawać się do mieszania, aby można było to przeprowadzić.

Ilość dodawanego kwasu octowego zależy od ilości zsyntetyzowanego bezwodnika Nformylo-L-asparaginowego. Ponieważ reakcję sprzęgania przeprowadza się in situ w produktach ubocznych, w środowisku znajduje się już pewna ilość kwasu octowego z początkowej reakcji pomiędzy kwasem L-asparaginowym i bezwodnikiem octowym. Całkowita ilość kwasu octowego w układzie powinna być około 7 razy większa od ilości L-fenyloalaniny w przeliczeniu mol/mol. A zatem ilość dodawanego kwasu octowego nie musi być 7-krotną ilością L-fenyloalaniny. Wystarczająca jest mniejsza ilość, byleby całkowita ilość kwasu octowego w układzie była około 7-krotnie większa od ilości L-fenyloalaniny.

Aczkolwiek reakcję sprzęgania można prowadzić w temperaturze otoczenia, korzystna jednak jest podwyższona temperatura, która także przyczynia się do obniżenia lepkości mieszaniny reakcyjnej. Dogodnie stosuje się temperatury pomiędzy 25°C-40°C, korzystnie około 30°C.

166 014

Inna wyjątkowa cecha sposobu według wynalazku polega na obniżeniu lepkości mieszaniny reakcyjnej podczas reakcji sprzęgania przez kontrolowane mieszanie mieszaniny. Stwierdzono, że zatrzymywanie mieszadła lub zmniejszenie jego prędkości podczas reakcji sprzęgania istotnie obniża lepkość mieszaniny reakcyjnej. W dużym reaktorze (reaktor o średnicy 3 m zaopatrzony w mieszadło mechaniczne o długości łopatek 1,5 m) bardzo powolne mieszanie, takie jak 5-40 obrotów na minutę i okresowe mieszanie, takie jak krótko pracujące mieszadło co 5-15 minut, drastycznie zmniejsza lepkość mieszaniny reakcyjnej w porównaniu z reakcją prowadzoną przy szybkości mieszania około 60 obrotów na minutę lub większej. W reaktorach w skali laboratoryjnej (kolba okrągłodenna o średnicy 10 cm z łopatkami o długości 7,6 cm) mieszanie z szybkością 200-300 obrotów na minutę powoduje duże zgęszczenie mieszaniny reakcyjnej, podczas gdy przy

5-15 obrotach na minutę uzyskuje się mieszaninę reakcyjną o niskiej lepkości i bardzo łatwo przelewalną. Także wyłączenie mieszadła po około 1 godzinie po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej L-Phe i ponowne włączenie po reakcji, tj. po około 6 godzinach, prowadzi do mieszaniny reakcyjnej o niskiej lapkości. Jednakże, podczas procesu w skali handlowej, gdy mieszadło zatrzyma się na ponad 1 godzinę, ponowne jego uruchomienie może być bardzo trudne z powodu zestalenia się i zbrylenia wytrąconego osadu. Zatem powolne mieszanie i okresowe mieszanie są korzystne.

Stosowane określenie „nadająca się do przelewania lub „o niskiej lepkości w odniesieniu do mieszaniny reakcyjnej oznacza ciecz, którą można przelać do szklanej kolby lub reaktora. Takie ciecze zwykle mają lepkość do około 15 000 cp, korzystnie pomiędzy 1000-10 000 cp, a szczególnie pomiędzy 15(^^500 cp.

Sposób mieszania w sposobie według wynalazku nie jest krytyczny. Można stosować standardowe środki do mieszania, tj. wstrzykiwanie gazu obojętnego, wytrząsanie, reaktor w postaci bębna, mieszadło mechaniczne itd. Korzystne są mieszadła mechaniczne. Dokładna konfiguracja mieszadła także nie jest krytyczna. Dla mieszadeł łopatkowych szybkość mieszania korzystnie ustala się od około 5 do około 40 obrotów na minutę, a zwłaszcza około 20 obrotów na minutę. Ponieważ szybkość końca łopatek w m/sek. zmienia się przy ustalonej liczbie obrotów na minutę w zależności od długości łopatki, stwierdzono, że bardziej dokładnie określa się tę szybkość podając liczbę obrotów na minutę. W celu zmniejszenia lepkości mieszaniny reakcyjnej dopuszcza się dowolną szybkość mieszadła do około 40 obrotów na minutę. Jednak należy zauważyć, że w urządzeniu w skali laboratoryjnej (kolba o średnicy 10 cm) mieszaninę o dobrej przelewalności uzyskuje się przy szybkości mieszania pomiędzy 40-150 obrotów na minutę.

Izomery α i β N-formylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, (α/β F-AP) wytworzone powyższym sposobem według wynalazku można analizować metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), która wykazuje, że uzyskuje się niezwykle wysoki stosunek α/β, w przybliżeniu 79,5:20,5.

Kwas octowy i estry (octan metylu, mrówczan izopropylu itd.) lub alkohol z zawadą przestrzenną ewentualnie usuwa się z mieszaniny reakcyjnej przed opisanym poniżej etapem odformylowania. Korzystnie kwas octowy i estry oddestylowuje się pod próżnią przy ciśnieniu od około 381 mm Hg do około 635 mm Hg. Destylację próżniową prowadzi się przed dodaniem HCl stosowanego do odformylowania α/β F-AP. Kwas octowy, estry i/lub alkohol usuwa się i zawraca do stosowania w następnych reakcjach sprzęgania.

Następnie odformylowuje się izomery α i β N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny. Do mieszaniny izomerów dodaje się kwasu solnego i ewentualnie metanolu w celu odformylowania α/β F-AP, prowadzącego do wytworzenia α/β -AP. Nadmiar metanolu reaguje także z pozostałym kwasem octowym i mrówkowym, znajdującymi się w mieszaninie reakcyjnej, dając octan metylu i mrówczan metylu, których temperatury wrzenia są dużo niższe niż kwasu octowego lub mrówkowego i dzięki temu mogą być usunięte z układu przez destylację w niższych temperaturach.

Następnie wytworzoną mieszaninę α/β -AP i ich różnych estrów metylowych estryfikuje się doprowadzając stężenie HCl, metanolu i wody dc wartości wystarczających, aby powstał c-APM(HCl) z wysoką wydajnością. Stężenie metanolu powinno wynosić od około 1 do około 10%o wagowych, korzystnie od około 3 do około 5% wagowych. Stężenie HC1 powinno być w zakresie od około 9 do 18% wagowych, korzystnie od około 12,5 do około 14,5% wagowych, a stężenie wody od około 32 do około 50% wagowych, korzystnie około 37-42% wagowych. Po odpowiednim ustaleniu stężeń wody, HCl i metanolu mieszaninę reakcyjną miesza się łagodnie

166 014 9 w temperaturze do około 35°C, korzystnie w temperaturze otoczenia (20-30°C). Całkowita estryfikacja zachodzi w ciągu około 4-10 dni, zwykle około 6 dni.

Wytworzony chlorowodorek estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny fo-APM(HCl)) łatwo oddziela się od izomeru fi, ponieważ α -APM • HCl • 2H 2O ma mniejszą rozpuszczalność w roztworach wodnych niż/J -APM(HCl), patrz opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 798 207. Izomer α wytrącony z roztworu oddziela się przez sączenie, odwirowanie, dekantację lub jedną z wielu innych konwencjonalnych metod.

Następnie α - APM(HCl) zobojętnia się zasadą do utworzenia APM, który odzyskuje się przez krystalizację.

Następujące przykłady ilustrują sposób według wynalazku, nie ograniczając jego zakresu. Przykładl. 0,12g (0,003 mola) tlenku magnezu, stanowiącego katalizator, rozpuszczono w ml (0,405 mola) 95% kwasu mrówkowego. Następnie do wytworzonego roztworu, który ogrzewano do 35°-40°C przez 10-15 minut dodano 60,2 ml bezwodnika octowego, po czym dodano 39,93 g (0,3 mola) kwasu L-asparaginowego i mieszano przez 2,5 godziny w 50±2°C. W tym momencie dodano jeszcze 8,6 ml bezwodnika octowego i reakcję prowadzono przez dalsze 2,5 godziny w 50±2°C. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 9,2 ml (0,120 mola) alkoholu izopropylowego i ogrzewano przez dalsze 2 godziny. Wysokosprawna analiza chromatograficzna (HPLC) wykazała utworzenie się bezwodnika N-formyloasparaginowego.

Mieszaninę z bezwodnikiem N-formyloasparaginowym następnie oziębiono do temperatury pokojowej, 20-25°C, i dodano 150ml (1,89 mola) octanu metylu, a następnie 44,6g (0,27 mola) L-fenyloalaniny. Mieszaninę mieszano przez 3 godziny w pokojowej temperaturze (20-30°C). Po 3 godzinach mieszania pozostawiono mieszaninę do odstania na noc (18-24 godziny) w pokojowej temperaturze i zestalenia się.

Zestalony produkt rozpuszczono w roztworze metanolu i wody (9:1). Wytworzoną mieszaninę izomerów α i β N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny poddano analizie HPLC i stwierdzono, że stosunek izomerów a/fi wynosi 79,2:20,8.

Przykład II. Porównywano stosunki α/β N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny wytworzonej w reakcji sprzęgania in situ, uzyskanej przy stosowaniu różnych estrów/alkoholi jako korozpuszczalników.

0,121 g (0,003 mola) tlenku magnezu rozpuszczono w 16,4 ml (0,406 mola) 93,4% kwasu mrówkowego, w atmosferze azotu. Następnie podczas mieszania dodano 62,5 ml (0,655 mola) bezwodnika octowego powodując utworzenie się białego osadu. W ciągu dalszych 30 minut temperatura mieszaniny wzrosła do 37-38°C. Dodano 39,93 g (0,30 mola) kwasu L-asparaginowego i ogrzewano mieszaninę do 48-50°C przez 2,5 godziny. Następnie dodano dodatkowo 8,6 ml (0,09 mola) bezwodnika octowego i ogrzewano przez dalsze 2,5 godziny, po czym dodano 9,2 ml (0,120 mola) alkoholu izopropylowego i ogrzewano w 50±2°C przez następnie 2 godziny. Następnie miszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury pokojowej (22-27°C).

Wytwarzanie bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego powtórzono kilka razy w celu przygotowania kilku pierwszych mieszanin reakcyjnych. Do każdej z tych pierwszych mieszanin dodano 100 ml jednego z estrów alkilowych lub alkoholi z zawadą przestrzenną, zestawionych w tabeli 1, a następnie dodano 44,6 g (0,27 mola) L-fenyloalaniny. Wytworzone zawiesiny utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin do zakończenia procesu sprzęgania in situ. W każdej reakcji, w miarę jej postępu, zawiesina coraz bardziej zestalała się i dodano pewną ilość roztworu metanolu i wody (10:1) w celu rozpuszczenia całej substancji stałej. 2,0 g próbki każdej mieszaniny reakcyjnej poddawano analizie HPLC. Stosunki α/β N-formyio-L-aspartylo-Lfenyloalaniny uzyskane w każdej reakcji przedstawione są w tabeli 1.

Tabela 1

Rozpuszczalnik	Stosunek α/β
1	2
Octan metylu	79:21
Octan etylu	79:21
Octan etylu	79:21
Octan izopropylu	80:20

166 014

1	2
Octan n-butylu	78:22
Mrówczan metylu	75,5:24,5
Mrówczan izopropylu	78:22
Alkohol izopropylowy	78:22
Alkohol sek-butylowy	76:24
Alkohol tjrt-butoldoy	78:22
Nie dodawano rozpuszczalnika	71:29

Przykład III. Sposobem według przykładu I wytworzono znów bezwodnik N-formyloasparaginowy. W początkowej mieszaninie reakcyjnej, która ma być poddana reakcji sprzęgania in situ z fenyloalaniną, pozostał bezwodnik asparaginowy. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 100 ml octanu metylu, 44,6 (0,27 mola) L-fenyloalaniny i 84 ml (1,47 mola) kwasu octowego. Całkowita ilość kwasu octowego w mieszaninie reakcyjnej wynosiła 166,4 ml (2,912 moli), ponieważ pewna ilość kwasu już znajdowała się w mieszaninie jako produkt uboczny reakcji wytwarzania bezwodnika N-foęmoloatparaginowego, gdy bezwodnik octowy reagował z kwasem L-asparaginowym.

Mieszaninę reakcyjną podczas sprzęgania mieszano w temperaturze pokojowej (20-25°C) przez około 6 godzin. Mieszanina ta nie zestaliła się po zakończeniu reakcji sprzęgania. Produkt poddano analizie HPLC, która wykazała stosunek izomerów α/β 79,5:20,5.

Przykład IV. Sposobem według przykładu I wytworzono bezwodnik N-formyloasparaginowy (F-Asp = 0) i pozostawiono go w początkowej mieszaninie reakcyjnej. Następnie prowadzono reakcję sprzęgania in situ dodając 44,6 g (0,27 mola) L-fjnyloalanino, 106,89 g (1,26 mola) octanu metylu i taką ilość kwasu octowego, aby całkowita ilość kwasu w układzie wynosiła 2,91 mola (patrz przykład III).

Reakcję sprzęgania prowadzi się mieszając mieszaninę reakcyjną przez około 6 godzin w temperaturze pokojowej (20-25°C). Mieszanina nie zestaliła się po zakończeniu reakcji sprzęgania. Uzyskano stosunek izomerów α/β 79,5:20,5.

W tabeli 2 przedstawiono wyniki w zakresie stosunków α/β, jakie uzyskano stosując różne stężenia octanu metylu i kwasu octowego (HOAc) wprowadzane do reakcji sprzęgania. Ilość bezwodnika N-formoldasparaglnowego i L-fenyloalaniny były stałe i wynosiły 0,27 mola każdego ze związków. Temperatury i czasy reakcji były także stałe. Odpowiednie stężenia octanu metylu i kwasu octowego w każdej reakcji podano w molach rozpuszczalnika na mol L-fjnoloalaniny Odpowiednie stosunki α/β uzyskane z każdej mieszaniny przedstawiono, aby potwierdzić, że sposobem według wynalazku zawsze uzyskuje się wysoki stosunek izomerów α/β.

Tabela 2

Stosunki α/β uzyskane przy różnych stężeniach HOAc i MeOAc w reakcji sprzęgania L-Phe i F-Asp = O

Doświadczenie nr	Stężenie mole/mole L-Phe	Stosunek α/β
MeOAc	HOAc
1	4,65	0,00	80,0/20,0
2	4,65	5,34	78,6./21,4
3	7,00	5,34	79,2/20,8
4	4,60	10,79	79,5/20,5
5	3,49	10,79	79,2./20,8
6	2,33	10,79	77,9/22,1
7	1,17	10,79	77,1/22,9
8	2,94	9,00	77,4,/22,6
9	3,50	9,00	78,0/22,0
10	2,28	7,00	77,15/22,85
11	1,17	8,58	76,3/23,7
12	2,61	7,67	77,8./22,2
13	0,00	5,34	69,0/31,0
14	0,00	10,50	74,0./26,0

166 014

Przykład V. Aczkolwiek zaleca się, aby ilość kwasu octowego w reakcji sprzęgania stanowiła 7-krotną ilość L-fenyloalaniny, wykazano, że nawet mniejsza ilość działa jako katalizator. 31,^g (0,217 mola) bezwodnika N-formyloasparaginowego, wytworzonego sposobem według przykładu II, zmieszano ze 150 ml octanu metylu i 25,8 ml (0,45 mola) kwasu octowego, w atmosferze azotu. Następnie dodano 33,0 g (0,20 mola) L-fenyloalaniny i mieszaninę mieszano w około 25°C. Po 3,5 godzinach dodano jeszcze 100 ml octanu metylu aby zapobiec zestaleniu i powtórzono to po 4,5 godzinach. Po 6 godzinach zawiesinę reakcyjną rozpuszczono w wystarczającej ilości metanolu i wody (10:1). Roztwór poddano analizie HPLC i uzyskano stosunek izomerów α/β 80:20.

Przy kład VI. 0,4g (0,01 mola) tlenku magnezu rozpuszczono w 53,3 ml (1,35 mola) 95% kwasu mrówkowego i 200 ml (2,10 moli) bezwodnika octowego. Zachodząca reakcja spowodowała wzrost temperatury do 40°C (od 20-22°C) w ciągu 15 minut. Do mieszaniny reakcyjnej dodano

133,1 g (1,0 mol) kwasu L-asparaginowego i ogrzewano wytworzoną zawiesinę w 48-50°C przez 2,5 godziny, po czym dodano jeszcze 28,9 ml (0,303 mola) bezwodnika octowego. Ogrzewano przez następne 2,5 godziny, po czym zmieszano z 30,7 ml (0,4 mola) alkoholu izopropylowego. Mieszaninę mieszano przez 1,5 godziny w 48-50°C, po czym pozostawiono do oziębienia do temperatury pokojowej (25±2°C). Wytworzona mieszanina zawierała bezwodnik N-formyloasparaginowy.

Do mieszaniny reakcyjnej dodano 187 ml octanu metylu i 148,68 g (0,9 mola) L-fenyloalaniny uzyskując zawiesinę, którą mieszano przez 1,5 godziny. W celu ułatwienia mieszania dodano 120 ml kwasu octowego i utrzymywano mieszaninę w 25-26°C przez dalsze 4,5 godziny. Następnie poddano mieszaninę destylacji próżniowej (558,8 mm Hg) aż do osiągnięcia 65°C.

Do zawiesiny, którą ogrzewano do około 60°C przez 1 godzinę dodano 220 ml metanolu i 100 ml (1,2 mola) kwasu solnego. Uzyskano przezroczysty roztwór, który poddano destylacji aż do temperatury czoła 63°C i uzyskania temperatury mieszaniny reakcyjnej 85°C. Uzyskaną pozostałość oziębiono do temperatury pokojowej (ok. 25°C) poddając działaniu próżni ok. 660,4 mm Hg przez 45 minut. Następnie do oziębionej pozostałości dodano 120 ml 37% kwasu solnego, 19 ml metanolu i 94,8 ml wody. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 dni. Wytworzoną zawiesinę przesączono i przemyto uzyskując 197,54 g białego ciała stałego po suszeniu w 50°C przez 10 godzin. Otrzymany produkt poddano analizie HPLC w celu stwierdzenia, że zawiera 61,5% a-APM.

Przykład VII. Przeprowadzono sposób według przykładu VI, z tą różnicą, że 400ml metanolu dodawano z szybkością wystarczającą do utrzymania stałej objętości. Uzyskane ciało stałe (197,85 g) poddano analizie HPLC, która wykazała 67,18% zawartości α-APM.

Przykład VIII. Przeprowadzono sposób według przykładu VII, z tą różnicą, że końcową destylację prowadzono całkowicie pod próżnią przy maksymalnej temperaturze kotła 55-56°C. Wydajność chlorowodorku estru metylowego L-aspartylo-L-fenyloalaniny wynosiła 51% wydajności teoretycznej.

P r z y k ł a d IX. Przeprowadzono sposób według przykładu VII, z tą różnicą, że destylację po dodaniu metanolu prowadzono pod próżnią (508 mm Hg) przez 2 godziny w 55-67°C. Wydzielono 186,15 g dwuwodzianu chlorowodorku estru metylowego a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny i poddano analizie, która wykazała zawartość 64,68% estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.

Przykład X. Do 60,2ml (0,631 mola) bezwodnika octowego w ciągu 5 minut wkraplano 16 ml (0,405 mola) 95,7% kwasu mrówkowego, w tym czasie temperatura wzrosła do 40°C. Mieszaninę mieszano przez 55 minut i dodano 0,43 g (0,003 mola) octanu magnezu i 39,93 g (0,3 mola) kwasu L-asparaginowego. Wytworzoną zawiesinę ogrzewano w 47-48°C przez 2,5 godziny. Dodano 7,1 ml (0,0744 mola) bezwodnika octowego i ogrzewano dalej przez 2,5 godziny. Dodano 7,21 g (0,120 mola) alkoholu izopropylowego i ogrzewano przez dalsze 1,5 godziny. Przerwano ogrzewanie i dodano 130 ml kwasu octowego i 44,6 g (0,270 mola) L-fenyloalaniny. Mieszaninę mieszano w temperaturze otoczenia przez całą noc. Wytworzoną zawiesinę rozpuszczono w 750 ml wody i 1,051 metanolu i zważono. Pobrano próbkę i poddano analizie HPLC na zawartość α/β -N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny. Oznaczona wydajność izomeru a wynosiła 71,5%.

Przykład XI. Do 0,121 g (0,003 mola) tlenku magnezu dodano w atmosferze azotu 16,0ml (0,405 mola) kwasu mrówkowego i mieszano aż do rozpuszczenia całego ciała stałego. Dodano

166 014

60,2 ml (0,631 mola) bezwodnika octowego powodując od razu wytrącenie osadu i wzrost temperatury do 40°C przez 15 minut. Dodano 39,93 g (0,3 mola) kwasu L-asparaginowego i ogrzewano zawiesinę do 48-50°C przez 2,5 godziny. Dodano dodatkowo 9,3 ml (0,0974 mola) bezwodnika octowego i ogrzewano dalej przez 2,5 godziny. Dodano 11,9 ml (0,155 mola) alkoholu izopropylowego i ogrzewano mieszaninę przez 1,5 godziny. Temperatura wzrasta do 53°C i w 4 porcjach w ciągu 15 minut dodano 44,6 g (0,27 mola) L-fenyloalaniny. W ciągu 10 minut temperatura wzrosła do 58°C i dalej mieszano przez 50 minut. Następnie mieszaninę reakcyjną pozostawiono do oziębienia do temperatury otoczenia. Dodano 30,1 ml 37% kwasu solnego i 70 ml wody. Zawiesinę ogrzewano do 60°C i utrzymywano w tej temperaturze przez 1 godzinę, w ciągu której rozpuściło się całkowicie ciało stałe. Usunięto rozpuszczalnik przez destylację próżniową przy temperaturze kotła 55±2°C. Pozostałość ważyła 119 g. Do pozostałości dodano 100 g wody i powtórzono destylację uzyskując 107 g pozostałości. Dodano 50,5 ml kwasu solnego, 41,2 ml wody i 31,5 ml metanolu i mieszano zawiesinę w 20-30°C przez 4 dni. Odsączono ciało stałe i przemyto je 50 ml nasyconej solanki. Po suszeniu przez noc uzyskano 43,95 g białego, krystalicznego dwuwodzianu chlorowodorku estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.

Przykład XII. Sposób według przykładu I wytworzono zawiesinę bezwodnika N-formyloasparaginowego. Przed dodaniem 44,6 g L-fenyloalaniny dodano 75 ml octanu metylu i 84 ml kwasu octowego i mieszano wytworzoną zawiesinę przez 6 godzin w 20-30°C. 350 g rozpuszczalnika usunięto przez destylację próżniową pod ciśnieniem 50 mm Hg. Dodano 30 ml 37% kwasu solnego i 66,7 ml metanolu i ogrzewano w 60-62°C przez 1 godzinę. Dodano jeszcze 528 ml metanolu i poddano destylacji do temperatury kotła 85°C. Pod próżnią 26 mm Hg oddestylowano rozpuszczalnik do temperatury kotła 30°C. Następnie dodano 36,4 ml kwasu solnego, 24,4 ml wody i 5,5 ml metanolu i mieszano wytworzoną mieszaninę przez 4 dni. Wytworzony osad odsączono, przemyto i wysuszono uzyskując 63,1 g białego ciała stałego. Analiza HPLC wykazała zawartość 63% α-APM.

Przykład XIII. Sposobem według przykładu I przygotowano różne zawiesiny bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego (F-Asp = 0) i umieszczono w 500 ml kolbach okrągłodennych wyposażonych w mieszadło mechaniczne Talboys model 134-2. Do mieszanin tych dodano octanu metylu (MeOAc), kwasu octowego (HOAc) i L-fenyloalaniny (Phe) w ilościach, przy których stosunek molowy MeOAc/HOAc(całkowity) (Phe)F-Asp=0 wynosił 2,73/10,64/1,0/1,0. Mieszaniny reakcyjne mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny z szybkością mieszadła 200-300 obrotów na minutę. Po 1 godzinie temperatura wzrosła do 40°C i obroty mieszadła zmniejszono do 5-15 na minutę. Zasadniczo całkowita konwersja Phe nastąpiła w ciągu 3 godzin. Za pomocą wiskozymetru Brookfielda LV zmierzono lepkość w temperaturze pokojowej po 6 godzinach reakcji, włączając w to 1,5-2,0 godzin kończącej się w temperaturze 50-55°C. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Szybkość mieszadła po 1 godz. (obr./min.)	Temperatura po 1 godz.	Lepkość w cp (obr./min.) - wrzeciono 2
6“	12“	30“	60“
200-300
(próba kontrolna)	pokojowa	2860	1587	819	483
5-15	25°C	1225	937	490	301
5-15	40°C	690	485	287	170

“obr./min. wrzeciona

Przykład XIV. Postępowano zasadniczo sposobem według przykładu XIII, z tą różnicą, że po 1 godzinie reakcji w ogóle nie mieszano mieszaniny reakcyjnej. Po 6 godzinach mieszaninę można byłoby mieszać, jednak rozpuszczenie miszania wymagało pomocy. Gdy rozpoczęto mieszanie mieszanina reakcyjna była bardzo płynna i nadająca się do przelewania i o wiele mniej lepka niż mieszanina mieszana przez całe 6 godzin z prędkością 200-300 obrotów na minutę. Analiza mieszaniny reakcyjnej wykazała całkowitą konwersję Phe.

166 014

Przykład XV. Postępowano zasadniczo sposobem według przykładu XIII, z tą różnicą, że mieszaninę reakcyjną krótko mieszano, tj. przez 12 sekund, z małą prędkością, co 5-15 minut po 45 minutach reakcji. Przez 1 godzinę mieszaninę reakcyjną mieszano z prędkością 200-300 obrotów na minutę. Pod koniec reakcji mieszanina była cieczą nadającą się do przelewania. Analiza mieszaniny reakcyjnej wykazała całkowitą konwersję Phe.

Przykład XVI. Sposobem według przykładu I wytworzono zawiesinę bezwodnika Nformylo-L-asparaginowego (F-Asp = 0) i umieszczono w 500 ml okręgłodennej kolbie wyposażonej w mieszadło mechaniczne Talboys model 134-2. Do mieszaniny dodano MeOAc, HOAc i Phe w ilościach, przy których molowy stosunek MeOAc/HOAc(całkowity) (Phe)F-Asp = 0 wynosił 2,73/7,84/1,0/1,0. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny z prędkością mieszadła 200-300 obrotów na minutę. Pod koniec 1 godziny prędkość mieszadła zmniejszono do 5-15 obrotów na minutę. Całkowita konwersja Phe zaszła w ciągu około 5 godzin. Przeprowadzono także 2 próby kontrolne, w których w ciągu 6 godzin mieszano z prędkością 200-300 obrotów na minutę. Za pomocą wiskozymetru Brookfielda LV zmierzono lepkość w temperaturze pokojowej po 6 godzinach reakcji wliczając w to 1,5-2,0 godzin reakcji kończącej się w temperaturze 50-55°C. Wyniki przedstawione są w tabeli 4.

Tabela 4

Szybkość mieszadła po 1 godz. (obr./min.)	Lepkość w cp (obr./min. - wrzeciono 4)
12x	30x	60x
200-300
(próba kontrolna)	9,100	6,740	5,110
200-300
(próba kontrolna)	12,000	8,000	6,000
5-15	6,850	3,740	2,410

^xobr /min. wrzeciona

Przykład XVII. Postępowano zasadniczo sposobem według przykładu XVI, z tą różnicą, że temperaturę mieszaniny reakcyjnej podniesiono do 40°C, gdy zmniejszono szybkość mieszadła do 5-15 obrotów na minutę. Wytworzona mieszanina reakcyjna nadawała się do przelewania i była dużo mniej lepka niż w próbach kontrolnych, które były mieszane z prędkością 200-300 obrotów na minutę. Analiza wykazała całkowitą konwersję Phe.

Podobnymi sposobami wytworzono α-APM/HClZ z dorbą wydajnością stosując różne estry alkilowe, alkohole z zawadą przestrzenną, parametry mieszania i techniki destylacji opisane powyżej.

co₂ch₃

CCNH-C-H I I

H2N-C-H ch₂-o CH2

WZÓR 1

CO₂H

I

H₀N-C-H C0₉CHo

Z | | ^{z ó} ch₂conh-c-h

I ch₂o

WZÓR 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims (19)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania chlorowodorku estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, (α-APM), bez wyodrębniania produktu przejściowego jako substraty kwas asparaginowy, kwas mrówkowy, bezwodnik octowy i L-fenyloalaninę, znamienny tym, że (a) formyluje się kwas L-asparaginowy w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 1,2-1,35 równoważników molowych kwasu mrówkowego na mol kwasu asparaginowego, 2,2-2,9 moli bezwodnika octowego na mol kwasu asparaginowego i co najmniej 0,3 równoważników molowych drugorzędowego alkoholu, w odniesieniu do całkowitej ilości dodanego kwasu octowego, ewentualnie w obecności katalizatora, przy czym bezwodnik octowy dodaje się albo jednorazowo w ilości 2,3-2,9 moli na mol kwasu asparaginowego albo w dwóch porcjach, najpierw w ilości co najmniej 2,0 moli na mol kwasu asparaginowego, a później w ilości około 0,2 moli na mol kwasu asparaginowego, następnie (b) sprzęga się in situ tak wytworzony bezwodnik N-formyloasparaginowy z L-fenyloalaniną, w obecności co najmniej 7 równoważników molowych kwasu octowego, w odniesieniu do L-fenyloalaniny i ewentualnie w obecności estru alkilowego i/lub alkoholu z zawadą przestrzenną, w temperaturze

   5-60°C, otrzymując izomery α, β-N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, (c) odformylowuje się powyższe izomery, dodając około 1,2 mola kwasu solnego na mol kwasu asparaginowego, (d) usuwa się z mieszaniny reakcyjnej pozostały kwas octowy i mrówkowy, (e) estryfikuje się odformylowane izomery, dodając do mieszaniny reakcyjnej 1-10% wagowych metanolu, 32-50% wagowych wody i HCl w ilości odpowiadającej 9-18% wagowych, przy czym otrzymuje się chlorowodorek a i β-APM, z którego wytrąca się chlorowodorek α-APM oraz (f) wydziela się wytrącony chlorowodorek α-APM.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drugorzędowy alkohol w etapie (a) stosuje się alkohol izopropylowy.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap sprzęgania (b) prowadzi się w obecności estru alkilowego, alkoholu z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniną, w ilości 1,2-4,7 moli na mol L-fenyloalaniny.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że etap odformylowania (c) obejmuje dodatkowo dodawanie metanolu w ilości skutecznie estryfikującej kwas mrówkowy i octowy znajdujące się w mieszaninie reakcyjnej, a etap (d) obejmuje usuwanie wytworzonego octanu i mrówczanu metylu.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap sprzęgania (b) obejmuje ponadto destylację próżniową kwasu octowego, alkoholu z zawadą przestrzenną i estrów obecnych w mieszaninie reakcyjnej, przed etapem odformylowania (c).
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap usuwania (d) prowadzi się na drodze destylacji pod ciśnieniem atmosferycznym.
7. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap usuwania (d) prowadzi się na drodze destylacji próżniowej.
8. 8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako ester alkilowy dodaje się octan metylu, etylu, izopropylu, n-butylu, mrówczan izopropylu lub ich mieszaniny.
9. 9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako alkohol z zawadą przestrzenną stosuje się alkohol izopropylowy, sec-butylowy, tert-butylowy lub ich mieszaniny.
10. 10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap sprzęgania (b) przeprowadza się bez mieszania.
11. 11. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że etap sprzęgania (b) przeprowadza się podczas mieszania.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że miesza się za pomocą mieszadła mechanicznego.

    166 014 3
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że mieszadło mechaniczne obraca się z prędkością mniejszą od około 40 obrotów na minutę.
14. 14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że mieszadło mechaniczne podczas reakcji pracuje okresowo.
15. 15. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że miesza się a/ energicznie przez około pierwsze 1/2 godziny po dodaniu L-fenyloalaniny i b/ następnie powoli lub stosując przerywanie mieszania.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że miesza się za pomocą mieszadła mechanicznego i energiczne mieszanie uzyskuje się przy prędkości mieszadła około 60 obrotów na minutę, powolne mieszanie przy prędkości mieszadła około 20 obrotów na minutę, a przerywane mieszanie wówczas, gdy mieszadło pracuje co najmniej jeden raz w ciągu co najmniej 1 minuty co każde 15 minut.
17. 17. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że etap sprzęgania (b) prowadzi się w temperaturze około 5-40°C, otrzymując izomery a, β-N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, etap odformylowania (c) prowadzi się w obecności metanolu oraz etap (d) prowadzi się przez destylację próżniową nadmiaru kwasu octowego, kwasu mrówkowego, octanu metylu i mrówczanu etylu z mieszaniny reakcyjnej.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że do mieszaniny reakcyjnej dodaje się metanol podczas etapu destylacji próżniowej (d) w ilości skutecznie ułatwiającej usuwanie kwasu octowego i mrówkowego przez tworzenie odpowiednich estrów metylowych.
19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że etap sprzęgania (b) prowadzi się stosując mieszanie mieszadłem mechanicznym z prędkością poniżej około 30 obrotów na minutę.