DE69023494T2

DE69023494T2 - Verfahren zur Herstellung des alpha-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesters mittels isolierten N-Formyl-aspartylanhydrids.

Info

Publication number: DE69023494T2
Application number: DE1990623494
Authority: DE
Inventors: Yefim Gelman; John B Hill
Original assignee: Nutrasweet Co
Current assignee: Nutrasweet Co
Priority date: 1990-07-20
Filing date: 1990-07-20
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2010-07-21
Also published as: DE69023494D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von alpha-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid (alpha-APM(HCl)), welches verwendet wird, um alpha-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (alpha-APM) herzustellen, ein süssendes Mittel, welches etwa 200 mal süsser ist als Saccharose. Die Wirksamkeit dieser Verbindung, eines Dipeptids, ermöglicht es einem Nahrungsmittel und Getränke unter Verwendung einer wesentlich geringeren Menge zu süssen, als man dies mit Zucker könnte. Als Folge davon hat es Millionen von Konsumenten in die Lage versetzt ihre tägliche Kalorienaufnahme zu vermindern, ohne dass sie die süssen Dinge im Leben aufzugeben hatten. Es weist zudem den unbeliebten Nachgeschmack nicht auf, welcher mit anderen Süssstoffen wie Saccharin und Cyclamat in Verbindung gebracht wird. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren das alpha/beta-Verhältnis von APM (HCl) zu erhöhen und Verfahren um eine Reaktionsmischung von N-Formyl-alpha-L- aspartyl-L-phenylalanin (FAP) mit einer rührbaren Viskosität herzustellen.
Alpha-APM ist nicht neu und wurde in US-Patent 3 492 131 von Schlatter 1970 beschrieben. Zahlreiche andere Patente, die verschiedene Verfahren der Herstellung und verwandte Verbindungen einbeziehen, wurden seither veröffentlicht und viel Literatur wurde geschrieben, welche die Wirkung verkündet, die das Dipeptid auf die Niedrigkaloriensüssstoffindustrie hatte. Bis zum heutigen Zeitpunkt jedoch haben die Herstellungsverfahren teure lsolierungs- und Reinigungsverf ahren einbezogen, welche als Konsequenz durch den Konsumenten getragen werden müssen. Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung, welches die handlungsmässige Einfachheit eines Eintopfverfahrens aufweist sowie verbesserte Ausbeuten des gewünschten Endprodukts.
Alpha-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester ist ein Dipeptid, welches im wesentlichen aus zwei Aminosäuren, L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin zusammengesetzt ist. Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass die Süssstoffeigenschaft des Dipeptids von der Stereochemie dieser einzelnen Aminosäuren abhängig ist. Jede dieser Aminosäuren kann entweder in der D- oder L-Form existieren und es wurde festgestellt, dass die L-Aspartyl-L-phenylalaninester süss sind während die entsprechenden D-D-, D-L- und L-D-Isomeren dies nicht sind. Kombinationen der Isomeren, welche das L-L-Dipeptid, DL-Aspartyl-L-phenylalanin, L-Aspartyl-DL-phenylalanin und DL-Aspartyl-DL- phenylalanin enthalten sind süss, aber nur halb so süss, weil die Racemate die Hälfte des L-L-Teils enthalten.
Das Dipeptid wird durch eine Kopplungsreaktion hergestellt, in welcher L-Asparaginsäure mit L-phenylalanin oder dessen Methylester verbunden wird. Diese Kopplungsreaktion benötigt eine Aminoschutzgruppe, die an den Asparaginsäureteil gebunden ist, wie Formyl, Acetyl, Acetoacetyl, Benzyl, substituiertes und unsubstituiertes Carbobenzoxy, t-Butoxycarbonyl und das Hydrohalogenidsalz. Die Aminoschutzgruppe, auf die im Fachgebiet oft als auf die N-Schutzgruppe Bezug genommen wird, soll zum Zwecke dieser Offenbarung als N-Formyl bezeichnet werden, da der Formylteil das Blockierungsmittel der vorliegenden Erfindung ist. N-Formylasparaginsäureanhydrid ist ein weit verbreitet verwendetes Ausgangsmaterial und sein Verfahren wurde ausführlich beschrieben. Vergleiche US- Patent 4 173 562.
Das Erhalten von isoliertem N-Formylasparaginsäureanhydrid jedoch führte zu relativ tiefen Ausbeuten, wenn ein grosser Ueberschuss an Ameisensäure als Lösungsmittel verwendet wurde. Ein doppelter Ueberschuss von Ameisensäure zum Beispiel erzeugt die Notwendigkeit Toluol oder andere Lösungsmittel zuzugeben, um die Anhydridlöslichkeit zu vermindern, was ausgedehnte Lösungsmittelaufbereitungsschritte notwendig macht.
Die Kopplungsreaktion wird in einem Lösungsmittel ausgeführt und ist ein üblicher Schritt in verschiedenen patentierten Verfahren für die Herstellung von alpha-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (alpha-APM); vergleiche US-Patent 3 962 207 von Uchiyama, US-Patent 4 173 562 von Bachman und EPO Patent 127 411 von Yaichi et al. Während der Kopplungsreaktion der zwei Aminosäuren werden als Zwischenprodukte zwei Isomeren hergestellt und deren Stereochemie bestimmt schliesslich die Süssigkeit des speziellen Moleküls. Das alpha-Isomer ist das gewünschte Produkt, da isolierte Fraktionen von reinem alpha-APM eine Süssigkeit besitzen, die etwa 130-200 mal diejenige von Zucker beträgt. Die beta-Isomerfraktion jedoch hat keine solche Süssigkeit.
Diese Erfindung betrifft Verbesserungen bei der Herstellung von alpha-APM (HCl), welche zu tieferen Produktionskosten und höheren Ausbeuten an alpha-Isomer führen, welches das gewünschte Endprodukt ist. Die alpha- und beta-Isomeren von APM sind unten dargestellt. Alpha Isomer Beta IsomerCO&sub2;CH&sub3; CO&sub2;H
Es wurde festgestellt, dass die Bildung der alpha- und beta-Isomeren und deren entsprechenden Verhältnisse aus der Kopplungsreaktion von der Art des Lösungsmittels abhängig sind, welches verwendet wird, um die Reaktion auszuführen, der Temperatur, bei welcher die Reaktion eintritt und der Menge der verwendeten Lösungsmittel. Gemäss US-Patent 4 173 562 von Bachman, ist ein alpha/beta-Isomerenverhältnis von 75:25 erhältlich, wenn Essigsäure als Lösungsmittel in der Kopplungsreaktion bei 50ºC verwendet wird. Das molare Verhältnis von Essigsäure zu Phenylalanin muss mindestens 10:1 betragen. Wenn das molare Verhältnis von Essigsäure zu L-phenylalanin auf 6:1 reduziert wird, sinkt das alpha: beta-Isomerenverhältnis merklich auf 69:31.
FR-A-2 249 872 offenbart ebenfalls die Durchführung des Kopplungsschritts in Anwesenheit von Essigsäure, wobei z.B. 23,8 Mole und 15,2 Mole Essigsäure pro Mol L-Phenylalanin erwähnt werden. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass das alpha:beta-Verhältnis auf etwa 80:20 erhöht werden kann, wenn die als ein Lösungsmittel bei der Kopplungsreaktion verwendete Essigsäure teilweise durch einen Alkylester, einen gehinderten Alkohol oder Mischungen derselben ersetzt wird. Für die Zwecke dieser Offenbarung soll ein gehinderter Alkohol wie er hierin verwendet wird, einen sekundären oder tertiären Alkohol bedeuten.
Ein Problem, das der Verwendung dieser Lösungsmittel in diesem Verfahren innewohnt ist, dass nach 0,5-3 Stunden Reaktionszeit die Reaktionsmischung fest wird, und es wird im wesentlichen schwer diese zu rühren, zu konzentrieren, zu deformylieren oder aus dem Reaktor zu entfernen. Ein rührbares System ist aus mindestens zwei Gründen notwendig. Erstens stellt das Rühren ein Mischen der Reaktanten sicher, um eine vollständige Reaktion zu erzielen. Zweitens muss später das Lösungsmittel mittels Destillation entfernt werden.
Ein anderes Problem, welches im Stand der Technik auftritt, ist, dass bei gewissen Techniken 25 % oder mehr des alpha-APM verloren wird, weil es in der ursprünglichen Reaktionslösung verbleibt. Vergleiche US Nr. 4 173 562. Ein weiteres Problem ist, dass im '562 Patent N-Formyl-L-aspartylanhydrid mittels einer Reaktionsmischung aus Asparaginsäure, einem grossen Ueberschuss an Ameisensäure und Essigsäureanhydrid hergestellt wird. Die Ueberschussmenge Ameisensäure muss zu irgend einer Zeit mittels Destillation entfernt und von Essigsäure abgetrennt werden, welches die Kosten des Endprodukts erhöht.
US-Patent 3 962 207 beschreibt ein ähnliches Verfahren, in welchem L-Aspartylanhydridhydrochlorid mit L-Phenylalaninmethylester gekoppelt wird. Ein Problem, welches im '207 Verfahren auftritt, ist, dass eine grosse Menge L-Phenylalaninmethylester benötigt wird, welches die Kosten des Verfahrens erhöht. Zweitens führt dies zur Bildung wesentlicher Mengen an Tripeptiden, welche entfernt werden müssen und dadurch teure und arbeitsintensive Trennverf ahren notwendig machen. Dies ist bei der vorliegenden Erfindung nicht nötig.
US-Serien Nr. 156 268 beschreibt ein Eintopf- Verfahren für die Herstellung von alpha-APM, in welchem Reaktionsnebenprodukte, welche aus der Bildung von formyliertem L-Aspartylanhydrid entstehen, auch als Lösungsmittel für die Kopplungsreaktion mit L-Phenylalanin dienen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von alpha-APM(HCl). Dies ist ein Verfahren, in dem N-Formyl-L-aspartylanhydrid gebildet und vor der Kopplung mit L-Phenylalanin von Reaktionsnebenprodukten isoliert wird. Diese Isolierung wird durch Filtration des N-Formyl-L-aspartylanhydrids vervollständigt, um überschüssige Ameisensäure zu entfernen. Da die Menge Ameisensäure, die verwendet wird, minimalisiert ist, werden keine weiteren Lösungsmittel benötigt, um die Löslichkeit des N-Formyl-L-aspartylanhydrids zu vermindern. Durch die Verwendung isolierten N-Formyl-L-aspartylanhydrids werden erhöhte Ausbeuten an alpha-APM(HCl) ermöglicht. Verdünnen der Kopplungsreaktion mit einem Ester oder gehinderten Alkohol ist ebenfalls als wirksam im vorliegenden Fall offenbart, um die Ausbeute an alpha- APM(HCl) zu verbessern.
Zu Beginn wird N-Formyl-L-aspartylanhydrid mittels Verbinden von Asparaginsäure mit Essigsäureanhydrid und Ameisensäure in einem Reaktionsverfahren ähnlich denjenigen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt. Vergleiche US-Patente Nrn 3 933 781, 3 962 207 und 4 173 562. Die vorliegende Erfindung jedoch verwendet eine minimale Menge Ameisensäure (1,33 - 1,35 molare Equivalente pro Mol Asparaginsäure) und der Ueberschuss Ameisensäure kann mittels einer von zahlreichen Verfahren wie Filtration oder Zentrifugation entfernt werden.
Der N-Formyl-aspartylanhydrid kann dann in Essigsäure suspendiert oder gelöst werden und durch Zugabe von L-Phenylalanin (L-Phe) gekoppelt werden. Ein Alkylester oder gehinderter Alkohol wird der Kopplungsreaktion zugegeben und verbessert überraschenderweise das alpha/beta-Verhältnis. Während ein Ester normalerweise durch Reaktion eines Alkohols mit einem Anhydrid hergestellt wird, wird nicht erwartet, dass der gehinderte Alkohol den N-Formyl-aspartylanhydrid im Laufe der Reaktion angreift. Essigsäure wird ebenfalls zugegeben, um ein Lösungsmittel der Reaktion bereitzustellen. Diese Kopplungsreaktion kann unter schwachen oder ohne Rührbedingungen ausgeführt werden, um die Viskosität der Reaktionsmischung tief zu halten, was zu einer rührbaren Endreaktionsmischung führt.
Das entstehende Dipeptid wird dann mittels Destillation konzentriert und mit HCl deformyliert und unter Einstellen der Konzentrationen an Methanol, Wasser und HCl auf Mengen, die wirksam sind um eine hohe Ausbeute an alpha-APM(HCl) zu ergeben, verestert. Das alpha- APM(HCl) fällt aus der Reaktionsmischung aus und wird isoliert und mit einer Base neutralisiert, um alpha-APM zu ergeben.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von alpha-APM (HCl). Das Verfahren beginnt durch Mischen von L-Asparaginsäure mit einer minimalen Menge an Ameisensäure (mindestens 1,33 molare Equivalente bezogen auf Asparaginsäure) und Essigsäureanhydrid (mindestens etwa 2,0 molare Equivalente bezogen auf Asparaginsäure) in Anwesenheit eines Katalysators wie Magnesiumoxid, was zur Bildung von N-Formyl-L-aspartylanhydrid führt. Geeignete Katalysatoren umfassen Oxide, Hydroxide und Salze von Metallen und sind in den US-Patenten 4 508 912 und 4 550 180 offenbart, welche hier mittels Referenz eingeschlossen sind. Diese Reaktion wird bei Temperaturen bis etwa 52ºC ausgeführt. Die Mischung wird vorzugsweise bei etwa 50ºC während mindestens etwa 2,5 Stunden gerührt und vorzugsweise während etwa 6 Stunden. Die Menge verwendeter Ameisensäure ist vorzugsweise 1,33 bis 1,35 molare Equivalente bezogen auf Asparaginsäure.
Die letzte Reaktionsmischung wird dann auf 10ºC bis 20ºC gekühlt und der entstehende Feststoff wird isoliert. Isolierung kann mittels Zentrifugation oder Filtration und Was6hen mit Essigsäure vervollständigt werden. Das feste N-Formyl-L-aspartylanhydrid wird isoliert, wobei möglicherweise Essigsäure in der Mischung zurückbleibt. Das isolierte Anhydrid wird zu einem Alkylester oder gehinderten Alkohol oder einer geeigneten Mischung der beiden und zusätzlicher Essigsäure gegeben. Die gebildete Aufschlämmung wird dann mit L-Phenylalanin zur Reaktion gebracht, vorzugsweise in equimolaren Mengen.
Es wurde festgestellt, dass der Alkylester und/oder gehinderte Alkohol das alpha/beta-Verhältnis verbessert, wenn dieser in einer Menge zugegeben wird, die mindestens etwa 1,2 Mol pro Mol L-Phenylalanin entspricht. Das alpha/beta-Verhältnis nimmt mit zunehmenden Mengen Ester oder Alkohol bis zu einem Punkt, wo die molare Menge an Ester, Alkohol oder Kombinationen derselben, etwa 4,7 mal jener von L-Phenylalanin entspricht, zu. An diesem Punkt wird ein Sättigungsgrad erreicht, bei dem das Isomerenverhältnis konstant bleibt, unabhängig davon, wieviel mehr Ester oder Alkohol zugegeben wird.
Vorzugsweise ist der in der Kopplungsreaktion verwendete Alkylester ausgewählt aus der Gruppe umfassend Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, N-Butylacetat und Isopropylformiat. Methylacetat (MeOAc) ist ein bevorzugter Alkylester. Falls Methylacetat verwendet wird, sollte die zugegebene Menge 1,2 bis 4,7 mal die Menge von L-Phenylalanin auf einer Mol:Mol-Basis betragen. Gehinderte Alkohole, die verwendet werden können, schliessen Isopropylalkohol und sekundären oder tertiären Butylalkohol ein. Isopropylalkohol ist ein bevorzugter gehinderter Alkohol. Diese sind die bevorzugten Ausführungsformen und sind in keiner Weise dazu gedacht, die Verwendung anderer Alkylester oder gehinderte Alkohole einzuschränken, noch sind sie dazu gedacht, den Umfang dieser Erfindung zu beschränken.
Die Kopplungsreaktion wird dann unter Rühren der zuvor genannten Mischung während etwa 4-6 Stunden bei einer Temperatur zwischen etwa 0-60ºC, und vorzugsweise zwischen 15-40ºC, ausgeführt. Ein Problem, welches während der Kopplungsreaktion auftritt, ist, dass, wenn die Reaktion unter Bildung von N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin stattfindet, die Mischung oder Aufschlämmung fest zu werden beginnt, d.h. Erhöhung der Viskosität auf einen Punkt, an dem Rühren sehr schwierig wenn nicht unmöglich wird. Hohe Viskosität dieses Ausmasses macht Rühren sehr schwierig und verhindert die Wärmeübertragung, welches die Destillation von Essigsäure, Estern und/oder gehindertem Alkohol wie oben beschrieben verhindert. Es wurde entdeckt, dass die Essigsäure, welche gerade vor oder während der Kopplungsreaktion zugegeben wurde, diese Verfestigung verhindert, d.h. die Viskosität wird herabgesetzt. Dies ist deshalb wichtig, weil Mischen die Vollständigkeit der Reaktion sicherstellt. Zudem müssen die Säure und die Ester vor der Deformylierung aus der Mischung mittels Destillation entfernt werden. Die Reaktionsmischung muss rührbar sein, um die Reaktion wirksam zu vervollständigen.
Die Menge an Essigsäure, die zugegeben wird, hängt davon ab, wieviel N-Formyl-L-aspartylanhydrid synthetisiert wurde. Wenn der N-Formyl-L-aspartylanhydrid mittels Filtration in Gegenwart von Essigsäure isoliert wird, kann bereits etwas Essigsäure anwesend sein. Die gesamte Menge Essigsäure im System sollte etwa 6-16 mal jener von L-Phenylalanin auf einer Mol:Mol-Basis betragen, vorzugsweise etwa 11,1 mal jener von L-Phenylalanin auf einer Mol:Mol-Basis. Deshalb würde man nicht notwendigerweise Essigsäure in einer Menge von 11,1 mal jener von zugegebenem N-Phenylalanin zugeben. Eine geringere Menge, so dass die gesamte molare Menge an Essigsäure, die im System anwesend ist, etwa 11,1 mal jener des L- Phenylalanins beträgt, ist ausreichend.
Ein anderer einzigartiger Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Absenken der Viskosität der Kopplungsreaktionsmischung mittels Kontrollieren des Rührens der Kopplungsreaktionsmischung. Es wurde entdeckt, dass Stoppen oder Vermindern der Geschwindigkeit des Rührers während der Kopplungsreaktion ein dramatisches Absenken der Viskosität der Kopplungsreaktionsmischung bewirkt. In einem grossen Reaktor (304.8 cm (10 Fuss) Durchmesser-Reaktor), ausgestattet mit einem mechanischen Rührer mit 152.4 cm (5 Fuss) langen Schaufeln, sehr langsamem Rühren, wie 5-40 U/ Min. (rpm) und gelegentliches Rühren, wie kurzes Laufenlassen des Rührers alle 5-15 Minuten, vermindert die Viskosität der Kopplungsreaktionsmischung im Vergleich zu Reaktionen, die mit einer Rührergeschwindigkeit von etwa 60 oder mehr rpm durchgeführt werden, drastisch. In Labormassstabreaktoren (10.16 cm (4 Inch) Rundkolben mit 7.62 cm (3 Inch) Paddeln) bewirken 200-300 rpm eine sehr dicke Reaktionsmischung während Rühren bei 5-15 rpm eine gut rührbare niedrigviskose Reaktionsmischung bewirkt. Auch Ausschalten des Rührers nach etwa einer Stunde, nachdem das L-Phe zur Reaktionsmischung zugegeben worden ist, und dessen Wiederanlassen nach der Reaktion, d.h., nach etwa 6 Stunden, bewirkt eine Reaktionsmischung mit niedriger Viskosität. Bei einem Verfahren im kommerziellen Massstab jedoch, kann es schwierig sein das Rührwerk wieder abzulassen, wenn der Rührer während eines Zeitraums von einer Stunde gestoppt worden ist, die Ausfällung absinkt und zusammenbackt. Deshalb sind langsames Rühren und periodisches Rühren bevorzugt.
Die Begriffe "rührbar" oder "niedrige Viskosität" bedeuten, wenn sie hier verwendet werden und wenn sie sich auf Kopplungsreaktionsmischungen beziehen, eine Flüssigkeit, welche gerührt oder in einen Glas- oder Reaktorkessel geleert werden kann. Solche Flüssigkeiten haben im allgemeinen eine Viskosität von weniger als 15'000 Centipoise (cp), vorteilhafterweise zwischen 1'000-10'000 cp und vorzugsweise zwischen 150-500 cp.
Die Rührmittel sind bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht kritisch. Jedes Standardrührmittel kann verwendet werden, d.h. Einspritzung eines Inertgases, Schütteln, Stürzen des Reaktors, mechanische Rührer etc. Mechanische Rührer sind bevorzugt. Auch die genaue Auslegung des Rührers ist nicht kritisch. Bei Paddel- oder Flügelrührern wird die Rührergeschwindigkeit vorteilhafterweise von etwa 5 bis etwa 40 rpm gesetzt und vorzugsweise auf etwa 20 rpm. Während die Geschwindigkeit der Paddelspitze in Metern pro Sekunde (m/sec) bei einer gegebenen rpm basierend auf der Paddellänge variieren wird, wurde gefunden, dass rpm eine angemessenere Beschreibung der Rührergeschwindigkeit bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung ist. Jede Rührergeschwindigkeit unter etwa 40 rpm ist für die Verminderung der Viskosität der Reaktionsmischung annehmbar. Es sollte jedoch bemerkt werden, dass bei Ausrüstungen im Labormassstab (10.16 cm (4 Inch)-Kolben) eine Rührergeschwindigkeit zwischen 40-150 rpm eine rührbare Reaktionsmischung ergibt.
Die alpha- und beta-Isomeren von N-Formylalpha-L-aspartyl-L-phenylalanin (alpha/beta F-AP), die mittels der oben beschriebenen Erfindung hergestellt werden, können mittels Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) analysiert werden und zeigen, dass diese Verfahren ein aussergewöhnlich hohes alpha/beta-Verhältnis von annähernd 79,5:20,5 ergeben.
Gegebenenfalls werden Essigsäure und irgendwelche Ester (Methylacetat, Isopropylformiat etc.) oder gehinderter Alkohol aus der Reaktionsmischung vor dem unten beschriebenen Deformylierungsschritt entfernt. Vorzugsweise werden Essigsäure und Ester bei etwa 31.1 cm (15 Inch) bis etwa 63.5 cm (25 Inch) Quecksilber destilliert. Die Vakuumdestillation wird vor der Zugabe von HCl ausgeführt, welches verwendet wird um das alpha/beta F-AP zu deformylieren. Die Essigsäure, die Ester und/oder der Alkohol werden entfernt und für die Verwendung bei folgenden Kopplungsreaktionen wiedergewonnen.
Die alpha- und beta-Isomeren von N-Formyl-L- aspartyl-L-phenylalanin werden dann deformyliert. Salzsäure und gegebenenfalls Methanol werden zur Isomerenmischung zugegeben, um das alpha/beta F-AP zu deformylieren, was zur Bildung von alpha/beta-AP führt. Ueberschussmethanol reagiert auch mit irgendwelcher übriggebliebenen Essigsäure und Ameisensäure, die in der Reaktionsmischung anwesend ist, um Methylacetat und Methylformiat zu ergeben, welche viel tiefere Siedepunkte als Essigsäure oder Ameisensäure haben und dadurch mittels Destillation bei tieferen Temperaturen aus dem System entfernt werden können.
Die entstehende Mischung von alpha/beta-AP und deren verschiedene Methylester wird dann durch Einstellen der Konzentration von HCl, Methanol und Wasser auf Mengen, die ausreichend sind, um hohe Ausbeuten an alpha-APM(HCl) zu ergeben, verestert. Die Methanolkonzentration sollte von etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% und vorzugsweise von etwa 3 bis etwa 5 Gew.-% betragen. Die HCl-Konzentration sollte von etwa 9 Gew.-% bis etwa 18 Gew.-% und vorzugsweise von etwa 12,5 Gew.-% bis etwa 14,5 Gew.- % betragen. Die Wasserkonzentration sollte von etwa 32 bis etwa 50 Gew.-% und vorzugsweise von etwa 37 bis etwa 42 Gew.-% betragen. Nachdem die Konzentrationen von Wasser, HCl und Methanol entsprechend angepasst worden sind, wird die Reaktionsmischung bei Temperaturen unter etwa 35ºC und vorzugsweise bei Umgebungstemperatur (20-30ºC) leicht gerührt. Die Veresterung ist etwa nach 4 bis etwa 10 Tagen und üblicherweise in etwa 6 Tagen abgeschlossen. Das entstehende Hydrochloridsalz von alpha-L- Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (alpha-APM(HCl)) wird dann leicht vom beta-Isomeren abgetrennt, weil alpha- APM HCl 2H&sub2;O eine geringere Löslichkeit in wässrigen Lösungen hat als beta-APM(HCl). Vergleiche US-Patent Nr. 3 798 207 von Ariyoshi. Das alpha-Isomer fällt aus der Lösung aus und wird mittels Filtration, Zentrifugation, Dekantieren oder eine von vielen anderen üblichen Verfahren abgetrennt.
Das alpha-APM(HCl) wird dann mit einer Base neutralisiert, um APM zu bilden, welches dann mittels dem Fachmann gut bekannter Kristallisationstechniken gereinigt wird.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt um die vorliegende Erfindung spezifisch vorzuzeigen. Diese Beispiele werden ausschliesslich zum Zweck der Veranschaulichung vorgelegt und es ist beabsichtigt, dass die Erfindung nicht derart ausgelegt wird, dass sie entweder in ihrem Geist oder in ihrem Umfang durch die Einzelheiten durch die hier als Modifikationen enthaltenen Einzelheiten eingeschränkt wird. Die Materialien und Verfahren sind dem Fachmann aus dieser Offenbarung ersichtlich.

Beispiel 1

Magnesiumoxid (0,121 Gramm; 0,003 Mol) wurde in 19,3 Gramm (0,4 Mol) 95 %iger Ameisensäure unter Stickstoff gelöst. Essigsäureanhydrid (69,3 Gramm; 0,655 Mol) wurde dann zur Lösung zugegeben, welche während 10- 15 Minuten gerührt wurde. Die Temperatur der Mischung stieg auf 40ºC. L-Asparaginsäure (39,93 Gramm; 0,30 Mol) wurde zur Mischung zugegeben und die entstehende Aufschlämmung wurde bei etwa 50ºC während etwa 6 Stunden gerührt. N-Formyl-L-aspartylanhydrid wurde an diesem Punkt gebildet, wie mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gezeigt wurde. Die Mischung wurde dann filtriert und mit 30 Gramm Essigsäure gewaschen, um das N-Formyl-L- aspartylanhydrid zu isolieren. Die Ausbeute an N-Formyl- L-aspartylanhydrid aus L-Asparaginsäure war 80 %. Das N- Formyl-L-aspartylanhydrid wird etwas Essigsäure enthalten, welches für die Verwendung als ein Lösungsmittel im Kopplungsschritt verbleibt.
Methylacetat 46,35 Gramm, 49,8 ml und Essigsäure (159,8 Gramm, 152,1 ml) wurden zum N-Formyl-L- aspartylanhydrid (41,1 Gramm, welche 4,36 Gramm Essigsäure enthalten) zugegeben. L-Phenylalanin (39,65 Gramm, 0,24 Mol) wurde zur oben genannten Mischung zugegeben, welche bei etwa 25ºC während etwa 5 Stunden gerührt wurde. HPLC-Analyse zeigte N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin mit etwa 78 % des alpha-Isomeren und etwa 22 % des beta-Isomeren. Die Mischung wurde unter 6.77 104 Pa Vakuum (22 Inch Quecksilbervakuum) bei 60-73ºC destilliert, um 120 ml Lösungsmittel zu entfernen. Methanol (58,5 ml) und 35 % HCl (26,7 ml) wurden zum N-Formyl-L- aspartyl-L-phenylalanin zugegeben und die Mischung wurde bei 60ºC erwärmt und während 30 Minuten gerührt. Die Mischung wurde bei Atmosphärendruck bei einer Temperatur von 70-75ºC destilliert, um Methylformiat und Methylacetat zu entfernen. Die Destillation wurde weitergeführt, während zusätzliche 108 ml Methanol zugegeben wurden. Die Destillation wurde bei Atmosphärendruck weitergeführt, bis die Temperatur 85ºC erreichte und dann wurde ein Vakuum angelegt, bis die Temperatur auf 30ºC abfiel. Salzsäure (32,4 ml), Wasser (21,7 ml) und Methanol (9 ml) wurden zugegeben und die Mischung wurde während sechs Tagen bei Raumtempeatur (22º-27ºC) gerührt, während welcher Zeit das Hydrochloridsalz von alpha-L- Aspartyl-L-phenylalaninmethylester gebildet wurde und ausfiel. Gesättigte Kochsalzlösung (50 ml) wurde verwendet, um das Produkt zu waschen. Das Produkt, weisses kristallines alpha-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochloriddihydrat wog 58,8 Gramm und enthielt 72 Gew.-% alpha-L-Aspartyl-L-phenylalanin, eine 60 % Ausbeute bezogen auf die Ausgangsmenge an L-Phenylalanin.

Beispiel 2

N-Formyl-L-aspartylanhydrid wurde mittels Filtration und Waschen mit Essigsäure isoliert. Verschiedene Alkylester und gehinderte Alkohole wurden als Lösungsmengen in verschiedenen Mengen verwendet, um die Wirkung von Estern und Alkoholen anders als Methylacetat auf die alpha/beta-Isomerenverhältnisse zu bestimmen. Die veschiedenen Ester und Alkohole sind in Tabelle 1 mit den verwendeten Mengen aufgeführt, sowie das alpha/beta-Isomerenverhältnis, welches bei Verwendung jeden Lösungsmittels erhalten wurde.
N-Formyl-L-aspartylanhydrid (28,6 Gramm; 0,20 Mol) wurde mit 100 ml Essigsäure und 0,90 Mol des entsprechenden Cosolvens unter Stickstoffatmosphäre aufgeschlämmt. L-Phenylalanin (33,04 Gramm; 0,20 Mol) wurde zu jeder entsprechenden Reaktionsmischung gegeben, welche dann mit 20 ml zusätzlicher Essigsäure gespült wurde. Jede Mischung wurde bei Raumtemperatur (22º-27ºC) während etwa 5 Stunden gerührt. Als die Kopplungsreaktionen dem Ende zu gingen, wurden die Aufschlämmungen dicker und voluminöser. Jede Auf schlämmung wurde dann während einer Stunde auf etwa 50ºC erwärmt und eine 10:1 Mischung von Ethanol und Wasser wurde zugegeben, bis alle Feststoffe aufgelöst waren. Jede Mischung wurde gewogen und 1 Gramm Mengen wurden entnommen und mittels HPLC analysiert. Die alpha/beta-Verhältnisse, die bei der Verwendung jedes Lösungsmittels erhalten wurden, sind in Tabelle 1 aufgelistet. TABELLE 1 Lösungsmittel Menge alpha/beta-Verhältnis Methylacetat Ethylacetat Isopropylacetat n-Butylacetat Methylformiat Isopropylformiat Isopropylalcohol sec-Butylalcohol tert-Butylalcohol Essigsäure alleine

Beispiel 3

N-Formyl-L-aspartylanhydrid wurde gemäss den in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehen hergestellt und wurde aus der ursprünglichen Reaktionsmischung mittels Filtrieren und Waschen mit Essigsäure isoliert. 13,3 Gramm (0,1 Mol) N-Formyl-L-aspartylanhydrid wurden mit 34,41 Gramm (0,405 Mol) Methylacetat gemischt, gefolgt von der Zugabe von 14,57 Gramm (0,09 Mol) L-Phenylalanin zur Mischung. Nach ungefähr 3 Stunden Rühren, wurde die Aufschlämmung über Nacht bei Raumtemperatur (20º-25ºC) stehengelassen. Die entstehende Mischung wurde in einer 9:1- Mischung von Methanol und Wasser gelöst. Das alpha/beta- Isomerenverhältnis des N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalanin war mittels HPLC als bei 80:20 bestimmt werden.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung von alpha- APM-hydrochlorid, welches die Schritte umfasst:

(a) Formylieren von L-Asparaginsäure in einer Reaktionsmischung von Ameisensäure und Essigsäureanhydrid, um N-Formyl-L-aspartylanhydrid zu ergeben;

(b) Isolieren des genannten N-Formyl-L-aspartylanhydrid;

(c) Kopplung des genannten L-Formyl-L-aspartylanhydrid mit L-Phenylalanin in Anwesenheit eines Lösungsmittels bei einer wirksamen Temperatur, um alpha,beta-N-Formyl-L-aspartyl-L-phenylalaninisomeren zu ergeben;

(d) Deformylieren der genannten Isomeren mittels Zugabe einer wirksamen Menge Salzsäure;

(e) Entfernen überschüssiger Essigsäure und Ameisensäure aus der Reaktionsmischung;

(f) Veresterung der deformylierten Isomeren mittels Zugabe einer wirksamen Menge an Methanol, Wasser und Salzsäure zur Reaktionsmischung, um alpha- und beta- APM-hydrochlorid zu ergeben, worin das alpha-APM-hydrochlorid ausfällt; und

(g) Isolieren des alpha-APM-hydrochlorids, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel im Kopplungsschritt (c) eine Mischung von (i) Essigsäure und (ii) eines Alkylesters, eines gehinderten Alkohols oder Mischungen derselben ist, wobei die Menge an zugegebener Essigsäure ausreichend ist, um die Viskosität der Reaktionsmischung derart zu vermindern, dass die genannte Reaktionsmischung rührbar ist.

2. Das Verfahren gemäss Anspruch 1, in dem der Kopplungsschritt (c) zudem Vakuumdestillation von Essigsäure, gehindertem Alkohol und Estern, die in der Reaktionsmischung vor dem Deformylierungsschritt (d) anwesend sind, umfasst; wobei der Deformylierungsschritt (d) zudem die Zugabe einer Menge Methanol umfasst, die wirksam ist, um irgendwelche Ameisensäure und Essigsäure zu verestern, die in der Reaktionsmischung anwesend ist; und Schritt (e) schliesst die Entfernung des entstehenden Methylacetats und Methylformiats ein.

3. Das Verfahren von Anspruch 2, in dem der Entfernungsschritt (e) mittels atmosphärischer Destillation ausgeführt wird.

4. Das Verfahren gemäss Anspruch 2, in dem der Entfernungsschritt (e) mittels Vakuumdestillation durchgeführt wird.

5. Das Verfahren gemäss Anspruch 2, welches zudem die Neutralisierung isolierten alpha-APM-Hydrochlorids mit einer Base zur Bildung von APM umfasst.

6. Das Verfahren gemäss Anspruch 2, in dem die gesamte molare Menge anwesender Essigsäure mindestens 6 mal jene von L-Phenylalanin beträgt.

7. Das Verfahren gemäss Anspruch 6, in dem die gesamte molare Menge anwesender Essigsäure etwa 11 mal jene von L-Phenylalanin beträgt.

8. Das Verfahren nach Anspruch 2, in dem der Alkylester in Schritt (c) in einer molaren Menge von mindestens 1,2 mal jener von L-Phenylalanin zugegeben wird.

9. Das Verfahren von Anspruch 8, in dem der Alkylester Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, N- Butylacetat, Isopropylformiat oder Mischungen derselben ist.

10. Das Verfahren von Anspruch 2, in dem der gehinderte Alkohol in Schritt (c) in einer molekularen Menge von mindestens 1,2 mal jener von L-Phenylalanin zugegeben wird.

11. Das Verfahren von Anspruch 10, in dem der gehinderte Alkohol Isopropylalkohol, sekundärer Butylalkohol, tertiärer Butylalkohol oder Mischungen derselben ist.

12. Das Verfahren von Anspruch 2, in dem die genannte Mischung von Alkylester und gehindertem Alkohol in Schritt (c) in einer molekularen Menge von mindestens 1,2 mal jene von L-Phenylalanin zugegeben wird.

13. Das Verfahren von Anspruch 2, in dem der Kopplungsschritt (c) in Abwesenheit von Rühren durchgeführt wird.

14. Das Verfahren von Anspruch 2, in dem der Kopplungsschritt (c) unter Rührbedingungen ausgeführt wird, die ausreichend sind, um eine Endreaktionsmischung zu bilden, welche rührbar ist.

15. Das Verfahren von Anspruch 14, in dem das Rühren mittels eines mechanischen Rührers erzielt wird.

16. Das Verfahren von Anspruch 15, in dem der mechanische Rührer bei weniger als etwa 40 Umdrehungen pro Minute (rpm) gedreht wird.

17. Das Verfahren von Anspruch 15, in dem der mechanische Rührer periodisch während der Reaktion betrieben wird.

18. Das Verfahren von Anspruch 14, in dem die genannten Rührbedingungen umfassen:

(a) starkes Rühren während etwa der ersten halben Stunde nach der Zugabe von L-Phenylalanin; und

(b) langsames oder unterbrochenes Rühren danach.

19. Das Verfahren von Anspruch 18, in dem das Rühren mittels eines mechanischen Rührers erzielt wird und:

(a) starkes Rühren bei einer Rührergeschwindigkeit von etwa 60 rpm erzielt wird,

(b) langsames Rühren bei einer Rührergeschwindigkeit von etwa 20 rpm erzielt wird, und

(c) unterbrochenes Rühren durch Laufenlassen des Rührers mindestens einmal alle 15 Minuten während mindestens einer Minute erzielt wird.

20. Ein Verfahren für die Herstellung von alpha-APM-hydrochlorid welches umfasst:

(a) Formylieren von L-Asparaginsäure in einer ersten Reaktionsmischung von Ameisensäure und Essigsäureanhydrid, um N-Formyl-L-aspartylanhydrid zu ergeben;

(b) Isolieren des genannten L-Formyl-L-aspartylanhydrids;

(c) Kopplung des genannten L-Formyl-L-aspartylanhydrids mit L-Phenylalanin in Anwesenheit von (i) Essigsäure und (ii) einer geeigneten Menge Alkylesters, gehinderten Alkohols oder Mischung derselben bei einer Temperatur von etwa 5ºC bis etwa 40ºC, um alpha,beta-N- Formyl-L-aspartyl-L-phenylalaninisomeren zu ergeben;

(d) Vakuumdestillation von Essigsäure und Methylacetat aus der Reaktionsmischung;

(e) Deformylierung der Isomeren mittels Zugabe wirksamer Mengen an HCl und Methanol;

(f) Vakuumdestillation von Ameisensäure und Essigsäure aus der Reaktionsmischung;

(g) Veresterung der deformylierten Isomeren durch Zugabe wirksamer Mengen an Methanol und HCl zur Reaktionsmischung, um alpha,beta-APM-hydrochlorid zu ergeben, worin das alpha-APM-hydrochlorid ausfällt; und

(h) Isolierung des alpha-APM-hydrochlorids.

21. Das Verfahren von Anspruch 20, in dem (l) das molare Verhältnis von Essigsäure zu L-Phenylalanin mindestens etwa 11:1 ist und (2) Methanol während dem Vakuumdestillationsschritt (f) zur Reaktion zugegeben wird, in Mengen, die wirksam sind, um die Entfernung von Essigsäure und Ameisensäure durch Bildung der entsprechenden Methylester zu erleichtern.

22. Das Verfahren von Anspruch 21, in dem das molare Verhältnis gehinderten Alkohols, Alkylesters oder Mischungen derselben zu L-Phenylalanin mindestens etwa 1,2:1 ist.

23. Das Verfahren von Anspruch 22, in dem der Alkylester Methylacetat, Ethylacetat, Isopropylacetat, n- Butylacetat, Isopropylformiat oder Mischungen derselben ist.

24. Das Verfahren von Anspruch 22, in dem der gehinderte Alkohol Isopropylalkohol, sekundärer Butylalkohol, tertiärer Butylalkohol oder Mischungen derselben ist.

25. Das Verfahren von Anspruch 21, in dem der Kopplungsschritt (c) unter Rührbedingungen ausgeführt wird, die ausreichend sind, um eine Endreaktionsmischung zu bilden, welche rührbar ist.

26. Das Verfahren von Anspruch 24, in dem das Rühren mit einem mechanischen Rührer bei einer Geschwindigkeit von weniger als etwa 30 rpm erzielt wird.

27. Das Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) ohne die Zugabe von irgendwelchen Lösungsmitteln ausgeführt wird.

28. Das Verfahren von Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge anwesender Ameisensäure in der Mischung von Schritt (a) 1,35 molare Equivalente pro Mol L-Asparaginsäure nicht übersteigt.

29. Ein Verfahren für die Herstellung von N- Formyl-L-aspartylanhydrid, welcher im wesentlichen von Nebenprodukten isoliert ist, für die Verwendung in der Herstellung von alpha-APM-hydrochlorid, wobei das genannte Verfahren die Schritte umfasst: Formylieren von L- Asparaginsäure in einer Reaktionsmischung, die Essigsäureanhydrid und eine Menge an Ameisensäure einschliesst, welche 1,35 molare Equivalente pro Mol L-Asparaginsäure nicht überschreitet, um N-Formyl-L-aspartylanhydrid zu ergeben; und Isolieren des genannten N-Formyl-L-aspartylanhydrids ohne die Zugabe irgendwelcher Lösungsmittel.