PL165416B1

PL165416B1 - Sposób wytwarzania kompozycji leczniczej PL

Info

Publication number: PL165416B1
Application number: PL90286897A
Authority: PL
Inventors: Richard G Markham
Original assignee: Oxycal Lab
Priority date: 1988-09-19
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 1994-12-30
Also published as: JP2973365B2; JPH03504502A; DE68928488T2; AU4328889A; WO1990003167A1; CA1341434C; ZA904494B; NZ230700A; EP0417209A4; AU621672B2; RU2059410C1; DK124290D0; NO178056C; YU117890A; DK175783B1; EP0417209B1; DK124290A; RO108148B1; FI97950B; DE68928488D1

Abstract

SPOSÓB WYTWARZANIA KOMPOZYCJI LECZNICZEJ ZAWIERAJACEJ NIETOKSYCZNA SÓL METALU I KWASU ASKORBINOWEGO, ZNAMIENNY TYM, ZE WYTWARZA SIE WODNA MIESZANINE REAKCYJNA ZAWIERAJACA KWAS ASKORBINOWY I ROZPUSZCZALNY W WODZIE NIETOKSYCZNY WEGLAN METALU, MIESZANINE REAKCYJNA OGRZEWA SIE W TEMPERATURZE 40 - 98°C AZ DO ZAKONCZENIA REAKCJI SOLI METALU I KWASU ASKORBINO- WEGO, PO CZYM Z MIESZANINY REAKCYJNEJ WYOD REBNIA SIE PRODUKT REAKCJI ZAWIERAJACY SÓL METALU I KWASU ASKORBINOWEGO ORAZ ZWIAZEK Z GRUPY OBEJMUJACEJ KWAS L-TREONOWY, KWAS L-KSYLONOWY I KWAS L-LIKSONOWY I ICH NIETOKSYCZNE SOLE, ALDONO-LAKTONY I ALDONO-LAKTYDY. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych kompozycji leczniczych, charakteryzujących się ulepszoną skutecznością związku czynnego. Nowe kompozycje zapewniają osiągnięcie i utrzymanie w organizmie terapeutycznie efektywnego poziomu związku czynnego, a zwłaszcza witaminy C.

W profilaktycznej lub leczniczej terapii lekowej ogólnie pożądane jest ustalenie początkowego, fizjologicznie efektywnego poziomu leku lub innego związku terapeutycznie czynnego, a następnie utrzymywanie tego poziomu przez dłuższy okres czasu, wymagany dla osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego. Poprawa albo szybkości absorpcji /wychwytu/, albo retencji /zmniejszenie szybkości wydalania/, lub też obu czynników jednocześnie, daje ważne korzyści fizjologiczne i terapeutyczne. Bardzo korzystne jest także zmniejszenie lub wyeliminowanie niepożądanych efektów ubocznych związku czynnego.

Zidentyfikowano do tej pory ponad 300 różnych mechanizmów, poprzez które witamina C jest zaangażowana w procesy fizjologiczne, od działania przeciwszkorbutowego, zaobserwowanego po raz pierwszy przez dr Roberta Linda w 1740 r., aż do ostatnio odkrytych antyoksydacyjnych reakcji wyłapywania wolnych rodników, ko-reakcji z enzymami w tworzeniu kolagenu, udziału w metabolizmie energetycznym w leukocytach wielojądrzastych oraz ułatwienia absorpcji żelaza.

Efekty kliniczne takich reakcji metabolicznych były szeroko rozpoznawane i opisywane. Na przykład uważa się, że efekt wyłapywania wolnych rodników umożliwia organizmowi przekształcenie karcynogenów w pochodne nietoksyczne, eliminowane z moczem, a w konsekwencji złagodzenie wpływów palenia, działania zanieczyszczeń środowiska i ekstremalnych temperatur. Badania na zwierzętach wykazały, że enzymy endogenne przekształcają askorbiniany w produkty utlenienia, wykazujące zdolność hamowania wzrostu nowotworów.

W konsekwencji nie ma prawie wątpliwości naukowych, że ustalenie i utrzymanie w organizmie ludzkim efektywnego poziomu witaminy C daje duże korzyści zdrowotne. Obecność witaminy C w znacznych stężeniach stwierdzono w nadnerczach, jajnikach, przysadce mózgowej, śledzionie, komórkach krwi i pozakomórkowym płynie płucnym.

Większość zwierząt posiada enzym wątrobowy, który umożliwia im bieżące wytwarzanie witaminy C in situ poprzez konwersję cukrów z krwi do kwasu askorbinowego, jednakże ludzie nie posiadają tego enzymu. W konsekwencji witamina C, potrzebna w ludzkim organizmie do różnych reakcji metabolicznych omówionych powyżej, musi być przyjmowana z pożywieniem człowieka. Ponadto organizm ludzki nie ma zdolności magazynowania witaminy C, toteż jest ona wydalana, jeśli nie zostanie zmetabolizowana. Niski poziom witaminy C i jej pochodnych w organizmie ludzkim powoduje wiele niepożądanych reakcji fizjologicznych, a poziomy ekstremalnie niskie wywołują ekstremalne reakcje, które mogą prowadzić do śmierci, na przykład z powodu szkorbutu. Poza tym normalnym zapotrzebowaniem na witaminę C w pewnych jednostkach chorobowych ważne jest ustalenie i utrzymanie w organizmie wy2szego niż normalny poziomu witaminy C. Te wyższe niż normalne stężenia są trudne do osiągnięcia i utrzymania, ponieważ organizm ludzki posiada ograniczoną tolerancję na witaminę C /kwas askorbinowy/. Przekroczenie granicy tolerancji wyraża się w biegunkach i innych działaniach ubocznych, jak podrażnienie i stan zapalny żołądka.

165 416

Witaminę C przyjmuje się w postaci nietoksycznych soli kwasu askorbinowego i metali, np. askorbinianu wapnia. Askorbiniany wytwarza się w znanej reakcji kwasu askorbinowego z węglanem metalu zawierającym odpowiedni kation. Znane sposoby wytwarzania askorbinianów realizuje się tak, by za wszelką cenę uniknąć utlenienia reagentów i produktów. Stosuje się zatem temperaturę pokojową Lub niZszą, a ze środowiska reakcji starannie usuwa się powietrze i reakcję prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego. U literaturze z tej dziedziny podkreśla się znaczenie zachowania niskiej temperatury reakcji i atmosfery wolnej od tlenu.

Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 442 005 znany jest sposób wytwarzania askorbinianów drogą reakcji kwasu askorbinowego z węglanem metalu w temperaturze 21°C, w atmosferze ditlenku węgla. Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 596 103 znana jest reakcja kwasu askorbinowego z węglanem metalu prowadzona w mieszaninie reakcyjnej ochłodzonej do 25 - 30°C. W opisie tym znalazło się ostrzeżenie, iŻ temperatura reakcji nie powinna być-wyższa niż 30°C.

Podobnie, w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 631 115 opisano reakcję kwasu askorbinowego i węglanu wapnia prowadzoną w temperaturze 25 - 30°C.

Celem wszystkich znanych sposobów było zatem wytworzenie jak najczystszych askorbinianów, bez żadnych domieszek, które mogłyby powstać w razie zastosowania wyższej temperatury lub obecności czynnika utleniającego, np. powietrza, w środowisku reakcji.

Podstawą wynalazku stało się stwierdzenie, iż skuteczność, to jest ustalenie i/lub utrzymanie w organizmie poziomu związków terepautycznie czynnych, normalnie eliminowanych z organizmu w postaci niezmetabolizowanej szlakiem wydalania anionów organicznych kanalikami nerkowymi, może być poprawiona jeśli związki terapeutycznie czynne zostaną zastąpione w kompozycji co najmniej jednym ze związków z grupy składającej się z kwasu L-treonowego, kwasu L-ksylonowego i kwasu L-liksonowego, ich nietoksycznych i jadalnych soli, aldono-laktonów i aldonolaktydów. Dotyczy to zwłaszcza związków terapeutycznie czynnych o masie cząsteczkowej niższej niż około 5000, posiadających kwasową grupę funkcyjną o p<a około 6 przy fizjologicznym pH = 7,4. W szczególności metoda ta może być zastosowana w celu poprawy ustalania i utrzymywania wysokiego poziomu witaminy C /i jej pochodnych/ w organizmie ludzkim. W takim przypadku kompozycja składa się ze związku wykazującego czynność witaminy C i co najmniej jednego' związku wybranego z grupy, składającej się z kwasu L-treonowego, kwasu L-ksylonowego i L-liksonowego oraz ich jadalnych soli, aldono-laktonów i aldono-laktydów.

Nieoczekiwanie okazało się, że tę metodę terapeutyczną można z łatwością zrealizować z użyciem nowej kompozycji leczniczej wytworzonej sposobem według wynalazku.

Tak więc zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania nowej kompozycji leczniczej zawierającej nietoksyczną sól metalu i kwasu askorbinowego polega na tym, że wytwarza się wodną mieszaninę reakcyjną zawierającą kwas askorbinowy i rozpuszczalny w wodzie nietoksyczny węglan metalu, mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w temperaturze 40 - 98°C aż do zakończenia reakcji soli metalu kwasu askorbinowego, po czym z mieszaniny reakcyjnej wyodrębnia się produkt reakcji zawierający sól metalu i kwasu askorbinowego oraz związek z grupy obejmującej kwas L-treonowy, kwas L-ksylonowy i kwas L-liksonowy i ich nietoksyczne sole, aldono-laktony i aldonolaktydy.

Sposób według wynalazku realizuje się zatem wbrew zaleceniom podanym w stanie techniki, gdyż temperatura reakcji wynosi aż 40 - 98°C. Nie podejmuje się też Żadnych środków ostrożności jeśli chodzi o atmosferę, w której reakcja zachodzi, a wręcz przeciwnie, zgodnie z korzystnym wariantem sposobu przez mieszaninę przepuszcza się pęcherzyki powietrza.

Suszenie gotowego produktu odbywa się także w podwyższonej temperaturze, np. około 120°C, i'suszenie to można prowadzić aż do uzyskania stałego produktu o pH bliskim obojętnego /6,0 - 7,5/.

Korzystnie stosuje się niewielki nadmiar metalu.

Dzięki sposobowi według wynalazku otrzymuje się kompozycję leczniczą zawierającą obok związku wykazującego czynność witaminy C także metabolity kwasu askorbinowego i ich pochodne.

'Użyty tu termin związek wykazujący czynność witaminy C oznacza witaminę C /kwas askorbinowy/ i dowolną z jej pochodnych wykazujących czynność przeciwszkorbutową. Do pochodnych takich należą na przykład produkty utlenienia witaminy C, jak kwas dehydroaskorbinowy,

165 416 jadalne sole kwasu askorbinowego, jak askorbiniany wapnia, sodu, magnezu, potasu i cynku, estry witaminy C z kwasami organicznymi i nieorganicznymi, na przykład 2-0-siarczan, 2-0fosforan, 3-0-fosforan, 6-heksanodekanian, mooootterrnian dipalmltynian kwasu askorbinowego oraz inne.

Do metabolitów kwasu askorbinowego i ich pochodnych należą kwasy aldonowe, aldono-laktony, aldono-laktydy oraz jadalne sole kwasów aldonowych. Kompozycje otrzymane sposobem według wynalazku charakteryzują się obecnością co najmniej jednego z tych metabolitów, odpowiadających trzem specyficznym kwasom aldonowym, L-treonowemu, L-ksylonowemu i L-liksonowemu.

Aldono-laktony są związkami o ogólnym wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza atom wodoru lub grupę -CH0H, a n oznacza liczbę od 1 do 3.

Obecność jednego lub więcej tych metabolitów w kompozycji otrzymanej sposobem według wynalazku można łatwo ustalić, identyfikując składniki kompozycji. Obecność ta jest niezbędna do osiągnięcia pożądanego rezultatu, czyli poprawy absorpcji i/lub retencji witaminy C lub pokrewnych związków terapeutycznie czynnych.

Oznaczona metodą jodometryczną zawartość atkorblniαou w otrzymanym produkcie wynosi 50 - 480 mg/500 mg próbki, zależnie od parametrów procesu, przy czym ze względów praktycznych preferowana jest wyższa zawartość askorbinianu. Dłuższe ogrzewanie w warunkach utleniających powoduje obniżenie wartości jodometrycznego miana askorbinianu.

Kompozycje otrzymane sposobem wedłu wynalazku mają zastosowanie do podawania witaminy C pacjentom o niskiej tolerancji na kwas askorbinowy. Zwłaszcza pacjenci mający tendencję do tworzenia się kamieni nerkowych, są szczególnie narażeni na trudności, związane ze spożywaniem kwasu askorbinowego i jego pospolitej pochodnej, askorbinianu wapnia, powodujących zwiększenie poziomu szczawianów w moczu. Nowe kompozycje nie powodują zwiększenia poziomu szczawianów w moczu do poziomów osiąganych przy podawaniu witaminy C innymi sposobami. Kompozycje te są szczególnie odpowiednie jako środek do ustalania i utrzymywania odpowiednich poziomów askorbinianu w moczu u osób podatnych na tworzenie się kamieni nerkowych. Są one także użyteczne w leczeniu chorób zapalnych, jak artretyzm.

Skuteczność związków aldonowych w poprawianiu absorpcji, tolerancji i/lub retencji witaminy C może być także ogólnie wykorzystana do poprawy podobnych charakterystyk innych związków terapeutycznie czynnych o masie cząsteczkowej poniżej około 5000, posiadających grupę kwasową i pKa ^6. Reprezentatywnymi, lecz nie jedynymi przykładami związków terapeutycznie czynnych których działanie może być ulepszone, są związki mające kwasowe grupy funkcyjne, takie jak grupy karboksylowe, enodiolowe, fenolowe i tym podobne. Wydaje się, że mechanizmy fizjologiczne odpowiedzialne za taką poprawę polegają na hamowaniu normalnej eliminacji z organizmu oiezmetabolizowαnnch związków terepeutycznie czynnych szlakiem wydalania anionów organicznych kanalikami nerkowymi, oraz na poprawie absorpcji tych związków przez ściany komórkowe tkanek ciała. Związki aldonowe najwidoczniej działają zarówno poprawiając absorpcję, jak i hamując efekt wydalania nerkowego. Opis różnych szlaków wydalania nerkowego zawarty jest w artykule Hirsch'a i Hook’a, opublikowanym w Journal of pharmacology and Experimental Therapeutics /Vol. 171, str. 103 /1970/.

Ilość związku aldonowego wymagana w nowych kompozycjach jest ilością terapeutycznie efektywną. Dokładna zawartość zależy od rodzaju związku terapeutycznie czynnego oraz innych czynników. Ogólnie, zmniejszona szybkość wydalania nerkowego i/lub poprawa absorpcji może być w niewielkim stopniu osiągnięta nawet przy użyciu bardzo małych ilości związków aldonowych. Charakterystyki te mogą być poprawione przez zwiększenie zawartości związku aldonowego, przy czym górna granica uwarunkowana jest względami praktycznymi, takimi jak potrzeba uniknięcia niepożądanych rozcieńczeń związku terapeutycznie czynnego do takiego punktu, który uniemożliwia podanie minimalnej odpowiedniej dawki. Zgodnie z posiadanymi obecnie informacjami, zawartość związku aldonowego w kompozycjach może wynosić od mniej niż IV wag. do 24% wag. Praktycznie efekty terapeutyczne obserwowano przy stężeniach związku aldonowego w zakresie od 0,10% wag., a zwłaszcza 1% wag. do 7% wag. związku aldonowego.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady I - V. W przykładach VI - XI opisano próby biologiczne demonstrujące farmakologiczną aktywność kompozycji według wynalazku.

Przykład I. Do ogrzewanego parą wodną reaktora ze stali nierdzewnej o pojemności 303 1 wprowadzono 27,2 kg gorącej /44°C/ wody. Do gorącej wody dodano w jednej porcji 50 kg

165 416 3 kwasu askorbinowego według Farmakopei USA /U.S.P./. Powstałą zawiesinę mieszano mechanicznie i ogrzewano parą o ciśnieniu 103,4 kPa aż do uzyskania temperatury 70°.

□ wodnej zawiesiny kwasu askorbinowego dodano 10,4 kg węglanu wapnia. Dodawanie węglanu wapnia trwało 3-4 minuty. Mieszanina reakcyjna przybrała kolor szary i uległa silnemu spienieniu w związku z wyraźnym wydzielaniem się COj. Po 8 min, mieszania większość piany opadła a mieszanina reakcyjna przybrała kolor czerwono-brązowy. Temperatura roztworu wynosiła 80°C. Mieszanie i ogrzewanie kontynuowano przez 15 min. aż do osiągnięcia przez mieszaninę reakcyjną temperatury 98°C, którą utrzymywano przez dodatkowe 20 min., po czym dodano, mieszając, dodatkowe 3,7 kg węglanu wapnia. Po ustaniu pienienia mieszaninę reakcyjną przepompowano do dwu bębnowej suszarki ogrzewanej parą wodną /temperatura powierzchni w przybliżeniu 121°C/. Etap pompowania-suszenia trwał 35 min. Otrzymano w przybliżeniu 54,5 kg wysuszonego jasno-brązowego produktu.

Alternatywnie, dla zapoczątkowania reakcji kwasu askorbinowego przez mieszaninę reakcyjną mogą być przepuszczane pęcherzyki powietrza.

Natychmiast po zakończeniu reakcji przeprowadzono analizy, pobierając próbki o wadze 500 mg, które rozpuszczano w 500 ml wody destylowanej.

Produkt otrzymany w trakcie procesu suszenia zawiera 400 mg bezwodnego askorbinianu wapnia w 500 mg produktu, na podstawie oznaczenia standardową techniką miareczkowania jodometrycznego, pH roztworu wodnego wynosi 7,0,

Przykład II. Do 2-litrowego naczynia reakcyjnego, wyposażonego w mieszadło i termometr, wprowadzono 30 ml wody destylowanej i 440 g /2,5 mola/ kwasu askorbinowego. Do mieszanej zawiesiny dodano rozdrobniony węglan wapnia z taką szybkością, aby produkt uboczny reakcji-dwutlenek węgla - wydzielał się w sposób stały, utrzymując temperaturę około 20°C. Dodawanie węglanu wapnia wstrzymano po dodaniu około 25 do 37,5 /co stanowi 20 do 30% ilości potrzebnej do całkowitego przereagowania kwasu L-askorbinowego. Następnie temperaturę podniesiono do B0°C. Rozpoczęto dalsze dodawanie węglanu wapnia, utrzymując temperaturę w zakresie 60 do 70°C. Całkowita ilość wprowadzonego węglanu wapnia wyniosła 125 g /1,25 mola/.

Mieszaninę reakcyjną przeniesiono do płytkiego pojemnika, który utrzymywano w temperaturze między 60 a 80°C w okresie od 12 do 36 godzin. W tym czasie pH mieszaniny wzrosło do wartości 6,0 - 7,0. Następnie nadmiar wody usunięto pod próżnią.

Suchy produkt ma kolor jasno - brązowy i jest łatwo rozpuszczalny w wodzie /z wyjątkiem nieprzereagowanego węglanu wapnia/, tworząc roztwory obojętne.

Przykład III. Analizę jakościową produktów otrzymanych w przykładach I i II przeprowadzono w sposób opisany poniżej.

Po odsączeniu nadmiaru nierozpuszczalnego węglanu wapnia, askorbinian wapnia wydzielano z produktu za pomocą chromatografu, a pozostałość poddano analizie za pomocą spektroskopu magnetycznego rezonansu jądrowego. Ustalono prawdopodobne struktury związków wykrytych za pomocą spektroskoon oraz zsyntetyzowano ich wzorce. Następnie porównano widma związków wzorcowych z widmami substancji badanych. Składniki substancji badanej zidentyfikowano przez porównanie widm.

Zastosowano techniki ^H i 13β - NMR. Zidentyfikowanymi solami kwasu aldonowego są sole wapniowe kwasów L-treonowego, L-ksylonowego i L-liksonowego.

Przykład IV. Postękując w sposób opisany w przykładzie I i stosując różne reagenty dodawane do kwasu askorbinowego, otrzymano różne sole kwsau askorbinowego, nietoksyczne i jadalne w rozsądnych ilościach. Reagent Sól węglan sodu askorbinian sodu węglan magnezu askorbinian magnezu węglan potasu askorbinian potasu tlenek cynku askorbian cynku

Produkty te zawierając sole kwasu aldonowego, odpowiadające solom zidentyfikowanym w przykładzie 5.

Przykład V. Przeprowadzono analizę ilościową produktów otrzymanych w przykładach I, II i IV. Skład produktów przedstawiono poniżej.

% wagowy

Bezwodny askorbinian metalu

- 92

165 416

Nieprzereagowany reagent

- sil metalu 0-7

Kwas dehydroaskorbinowy 3-9

Pochodne kwasu aldonowego 5-6

Przybliżony układ poszczególnych kwasów w pozostałości stanowiącej pochodne kwasu aldonowego jest następujący:

Kwas /pochodna/ części wagowe

Treonowy 8

Ksylonowy 3

Liksonowy 1

Niektóre z tych kwasów aldonowych mogą być połączone ze sobą lub z askorbimanami, lub połączone mogą być askorbiniany.

Przykład VI. W przykładzie poniższym opisano badania kliniczne, w których porównano produkt otrzymany według przykładu I /substancja testowa/ z kwasem L-askorbinowym i kwasem cytrynowym /placebo/. Mierzono poziomy askorbinianu wewnątrzkomórkowy i w surowicy krwi, ilość askorbinianu wydalanego z moczem oraz ilość szczawianów wydalanych z moczem po różnych czasach od przyjęcia standardowych dawek substancji testowej, kwasu L-askorbinowego i placebo.

Protokół badania

Przebadano 12 mężczyzn w wieku od 27 do 45 lat.

Wszystkich mężczyzn poinstruowano, że w czasie tygodnia przed rozpoczęciem badań powinni pozostać na diecie ubogiej w witaminę C /bez produktów cytrusowych i większych ilości zielonych warzyw liściastych/.

Na czczo pobrano próbki krwi oraz moczu z 24 godz. Oznaczono białe ciałka krwi i poziom askorbinianu i szczawianu w moczu z 24 godz., oraz skorelowano je z poziomem askorbinianu w surowicy krwi.

mężczyzn podzielono na trzy grupy i podano im następujące dodatki do pożywienia: /a/ grupa testowa: 4000 mg dziennie produktu otrzymanego według przykładu I /4000 mg askorbinianu jest równoważne 3000 mg kwasu L-askorbinowego według próby jodowej/ /b/ grupa askorbinianu: 3000 mg dziennie kwasu L-askorbinowego /c/ grupa kwasu cytrynowego: 3000 mg kwasu cytrynowego dziennie.

Wszyscy mężczyźni otrzymywali dietę ubogą w witaminę C. Próbki krwi pobierano po 0, 4,8 i 24 godz. od przyjęcia przeznaczonych dodatków żywieniowych. Oznaczono poziom askorbinianu i szczawianu w moczu po 24 godzinach.

Po okresie wymywania /wynoszącym zależnie od rodzaju wykonywanej pracy od' dwu do kilkunastu dni/ grupy przestawiono na inne dodatki żywieniowe w sposób następujący:

/a/ grupa testowa - zmiana na kwas cytrynowy /b/ grupa kwasu cytrynowego - zmiana na askorbinian /c/ grupa askorbinianu - zmiana na substancję testową

Dodatki przyjmowano w takiej samej ilości /4000 mg produktu otrzymanego według przykładu I,

3000 mg kwasu L-askorbinowego i 3000 mg kwasu cytrynowego/ przez wszystkie trzy grupy. Ponownie pobrano próbki krwi po 0, 4, 8 i 24 godz. od czasu zjedzenia. Od wszystkich uczestników zebrano też 24-godzinne próbki moczu. Zebrane próbki ponownie przeanalizowano na zawartość askorbinianu i szczawianu.

Procedury analityczne

Stosowane procedury analityczne są opisane w następujących książkach: Clinical Chemistry, Principles and Techniques, ed. R.J. Henry, D.O. Cannon i J.W. Windelman, Herper and Row, 1974, str. 1393 - 1398 oraz w Standard Methods of Clinical Chemistry, J.S. Roe, ed. 0. Seligson, New York, Academic Press, 1961, str. 35.

Przy ilościowym oznaczaniu szczawianu w moczu, podwielokrotność ilości moczu mieszano z adsorbentem, wiążącym w sposób selektywny szczawiany. Wyekstrahowany mocz odrzucano a szczawiany wymywano z adsorbenta rozcieńczonym roztworem zasady.

165 416

Szczawiany utleniano do nadtlenku wodoru 1 dwutlenku węgla za pomocą oksydazy szczawianowej. Nadtlenek wodoru reaguje w obecności peroksydazy z hydrazonem 3-metylo-2-benzotiozolinonu /MBTH/ i z kwasem 3-/dimetyloamino/benzoesowym, dając barwnik indaminowy o maksimum absorbancji przy 590 nm.

Oznaczanie szczawianów w moczu opisano w następujących pozycjach: A. Hodgekinson, Oxalic Acid in Biology and Medicine, Academic Press, New York, 1977

W.D. Robertson, G.A. Chrystowski, Urinary Oxalate Excretion by Main Following Ascorbine Acid Ingestion, Prog. Soc. Exp. Biol. Med. 85 : 190, 1954

J. Costello, The Effect of Ascorbic Acid on Oxalate Metabolism in Human Biochemistry and Clinical Pathology, ed. G.A. Rose, W.G. Robertson i R.W.E. Watts, Proceedings of an Internatiolan Meeting in London, 1971, str. 270 - 273.

Wyniki badania klinicznego przedstawiono poniżej w tabeli 1.

Tabela 1

Poziom askorbinianu u	Procent	zmiany w grupie
surowicy krwi	kwas cytrynowy	Kwas L-as- korbinowy	test
4 -ta godzina	10	180,3	264,8
8 -ma godzina	19,6	91,6	144,2
24 -ta godzina	5,9	24,6	56,2
7 -my dzień Poziom askorbinianu w białych krwinkach /WBC/		45,3	102,5
4 -ta godzina	-40,5	34,1	38
8 -ma godzina	- 21,2	-21,9	- 6,8
24 -ta godzina	-6,3	-5,3	18,2
7 -my dzień 24-godzinny poziom askorbinianu w moczu		27,6	30,5
k zmiany	27,7	2760,6	486,3
mg/24 godziny Poziom askorbinianu w moczu 7 -go dnia	43,65	314,5	252
\ zmiany		4583	617
mg/24 godziny 24-godzinny poziom szczawianu w moczu		459	321
% zmiany	7	162	35,9
mg/24 godziny	25,9	63,8	41,6

* wzrost, jeśli nie zaznaczono inaczej

Z powyższych badań wyciągnięto następujące wnioski.

Poziom askorbinianu w surowicy krwi

Po 4, 8 i 24 godzinach oraz 7 dni później grupy testowe miały wyższy poziom askorbinianu w surowicy krwi wporównaniu zarówno z grupą testową jak i grupą askorbinianową.

Poziom askorbinianu w białych krwinkach

We wszystkich grupach stwierdzono obniżenie poziomu askorbinianu w białych krwinkach po 8 godzinach, jednakże w grupie testowej obniżenie to było najmniejsze procentowo. Pomiary po 4 i 24 godzinach oraz po 7 dniach wykazały, że w grupie testowej utrzymuje się najwyższy poziom askorbinianu w białych krwinkach.

165 416

Poziom askorbinianu w białych krwinkach po 24 godzinach

Po 24 godzinach we wszystkich grupach otrzymano podobne wyniki. W grupach cytrynianowej’ i askorbinianowej stwierdzono zmniejszenie poziomu askorbinianu w białych krwinkach. W grupie testowej utrzymał się poziom znacznie wyższy w porównaniu z poziomem odniesienia.

Poziom askorbinianu po 7 dniach średnia procentowa zmiany poziomu askorbinianu w białych krwinkach jest w dalszym ciągu wyższa w grupie testowej niż w grupie askorbinianowej.

24-godzinne wydalanie askorbinianu w moczu

W grupach testowych wydalanie askorbinianu z moczem było mniejsze niż w grupach cytrynianowej i askorbinianowej.

24-godzinne wydalanie askorbinianu w moczu po 7 dniach

Wydalanie askorbinianu było niższe w grupach testowych niż w grupach cytrynianowej i askorbinianowej.

24-godzinne wydalanie szczawianu moczu

Wydalanie szczawianu zwiększa się znacznie w grupie testowej w porównaniu z grupą askorbinianową. Oznacza to, że przy stosowaniu testowanego produktu jako dodatku do pożywienia istnieje mniejsze prawdopodobieństwo tworzenia się szczawianowych kamieni nerkowych niż przy stosowaniu kwasu askorbinowego.

24-godzinne wydalanie szczawianu po 7 dniach

Przedłużona suplementacja produktem testowym prowadzi do mniejszego wydalania szczawianów z moczem niż w przypadku suplementacji kwasem L-askorbinowym.

Przykład VII. Badania kliniczne z zastosowaniem produktu otrzymanego w sposób opisany w przykładzie II dały wyniki podobne do wyników przedstawionych w przykładzie VI.

Przykład VIII. Badania zwierząt, żywionych produktem otrzymanym w przykładzie I, dały wyniki podobne do wyników takich badań na ludziach, przedstawionych w przykładzie VI.

Przykład IX. Badania, opisane w przykładzie VI powtórzono, stosując jako produkt testowy produkty otrzymane przez mieszanie chemicznie czystego askorbinianu wapnia z:

Test A - kwasem treonowym /solą sodową/

Test B - kwasem ksylonowym /solą sodową

Test C - kwasem liksonowym /solą sodową/

W takich samych proporcjach wagowych, jak składniki oznaczone w przykładzie V.

Stosując te substancje testowe, powtórzono badania opisane w przykładzie VI. Jako dodatkową substancję kontrolną użyto czysty askorbinian wapnia.

Badania te potwierdziły, że czynność fizjologiczna mieszanego produktu ast^f^j^tu^rnanowoaldonowego związana jest ze składnikiem aldonowym, oraz że każdy ze składników aldonowych powoduje podobną poprawę absorpcji i retencji witaminy C.

Przykład X. Sto psów różnej rasy i wieku nakarmiono 3 x 30 mg/kg produktu otrzymanego według przykładu I. Wszystkie psy cierpiały na zaburzenia ruchowe.

Efekt suplementowania produktem z przykładu I mierzono zmianami w symptomach choroby, na podstawie nowych obserwacji klinicznych łub sprawozdai właścicieli co do stanu zwierzęcia. Efekt oceniano siedem dni po nakarmieniu i później znów po 6 tygodniach). Ostatnia ocena miała miejsce po 6 miesiącach.

Grupy diagnostyczne

Leczeniu poddano różnego rodzaju choroby, zarówno ostre jak i przewlekłe. W chorobie ostrej, w której objawy zmieniają się gwałtownie, trudno jest rozróżnić wpływy suplementacji i innych czynników. Zatem w teście tym badano tylko takie choroby, które miały długotrwałą i znaną przyczynę, których objawy były stabilne w czasie i co do których można było założyć, że bez suplementacji będą się dalej rozwijać:

Wybrano zwierzęta z następującymi przewlekłymi chorobami, takimi jak urazy stawów z trwałymi zmianami wtórnymi, choroba zwyrodnieniowa stawów, spondyloza, dysplazja stawu biodrowego, zastarzałe wypadnięcie dysku z trwałymi zmianami wtórnymi, atrofia mięśni spowodowana

165 416 functio laesa oraz starcze zmiany układu podtrzymującego i ruchowego.

Sto psów odpowiadało powyższym kryterium. W sprawozdaniu nie brano pod uwagę płci ani wieku., ,

Wyniki prób przedstawiono u tabeli 2.

Tabela 2

Ilość psów, u których stwierdzono:	Duża popra- wa/zanik objawów	Niewielka poprawa/brak efektu	Całkowita ilość
po 1 tygodniu	75 /75%/	25 /25%/	100 /100%/
po 6 tygodniach	79 /79%/	21 /11%/	100 /100%/
po 6 miesiącach	65 /77,5%/	20/22,5%/	85 /100%/

Wyniki w różnych rodzajach chorób są następujące:

Chromanie i ból wywołane dysplazją stawu biodrowego:

po 1 tygodniu	32 /72H/	13	/28%/	45	/100%/
po 6 tygodniach	35 /78%/	10	/22%/	45	/100%/
Spondyloza i wypadnięcie kręgosłupa:
po 1 tygodniu	13 /76,5%/	4	/23,5%/	17	/100%/
po 6 tygodniach	13 /76,5%/	4	/23.5%/	17	/100%/
Zmiany artretyczne:
po 1 tygodniu	30 /79%/	8	/21%/	38	8100%/
po 6 tygodniach	31 /81,6%/	7	/18,4%/	38	/100%/

Przykład ten pokazuje, że produkt z przykładu I podany doustnie powoduje symptomatyczne usunięcie bólu towarzyszącego chronicznym deformacyjnym zmianom w stawach i układzie szkieletowym w większości przypadków w tej grupie pacjentów.

Przykład XI. Kolby w kształcie litery T o pojemności 25 cm3, zawierającą mysie fibroblasty 3T3 inkubowano przez 1 godz. roztworem treonianu wapnia o stężeniu 100 mg % /1 mg/ml/ /pH 7,4/ w temperaturze 37°C. Grupę kontrolną inkubowano roztworem Ringera.

Płyn inkubacyjny odrzucono i do każdej kolby dodano roztwór kwasu askorbinowego o stężeniu 1,25 mg% /5 1 kwasu 14c -L-askorbinowego, 10,0 mCi/mmol, 0,05 mCi/ml/. pH doprowadzono do wartości 7,62 i kolby utrzymywano w temperaturze 37°C przez 20 min.

Następnie zawartość kolb przemyto 4 ml HBSS/-/ i trypsynowano 0,1 ml kompleksu trypsyna EDTA przez 5 min. Komórki ponownie zawieszono w 4 ml lodowatego HBSS/-/ dla zatrzymania reakcji enzymatycznej i wirowano przez 10 min przy 1000 g, przemyto i zawieszono w 4 ml HBSS/-/, ponownie wirowano /10 min, 1000 g/, po czym zawieszono w 1,0 ml wody destylowanej i poddano działaniu ultradźwięków przez 90 sek.

0,5 ml każdej z próbek użyto do zliczenia 14c, a 0,5 ml do analizy białek metodą Bradforda 14

Obliczono wychwyt C przez komórki, otrzymując wyniki podane w tabeli 3.

Tabela 3

	Kolba	DPM/pg	Współczynnik wychwytu
1	2	3	4
L-treonian	3, 5, 15	0,835	1,30
wapnia	3, 5, 5	1,341	2,09
	33 5, 1	1,834	2,16
Próba	33 5, 10	0,697	1,09
kontrolna	33 5, 7	0,626	0,976
	3. 5, 8	0,601	0,937

średnia /L-treonian wapnia/ = 1,19 1,86 średnia /płyn Ringera/ = 0,641 1,00

165 416

Tak więc wychwyt kwasu C-L-askorbinowego przez komórki z kolb zawierających treonian wapnia był 1,86 razy wyższy niż wychwyt przez komórki z kolb zawierających roztwór kontrolny. Wyniki te są statystycznie istotne /test t-Studenta, alfa = 0,05/. Wyniki te przedstawiono w formie wykresu na Figurze rysunku.

i—⁰—1

R-CH-(CH0H)_n-C=0

Wzór

I ’·⁵°τ ίο g V0I 0.90 I 0,60

Ό <U tn 0.30

0,00□ treonian wapnia BS próba kontrolna

FIG.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania kompozycji leczniczej zawierającej nietoksyczną sól metalu i kwasu askorbinowego, znamienny tym, że wytwarza się wodną mieszaninę reakcyjną zawierającą kwas askorbinowy i rozpuszczalny w wodzie nietoksyczny węglan metalu, mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w temperaturze 40 - 98°C aż do zakończenia reakcji soli metalu i kwasu askorbinowego, po czym z mieszaniny reakcyjnej wyodrębnia się produkt reakcji zawierający sól metalu i kwasu askorbinowego oraz związek z grupy obejmującej kwas L-treonowy, kwas L-ksylonowy i kwas L-liksonowy i ich nietoksyczne sole, aldono-laktony i aldono-laktydy.