KR960011919B1 - IgA 단백질 분해효소를 이용한 재조합 단백질의 효소적 절단방법 - Google Patents
IgA 단백질 분해효소를 이용한 재조합 단백질의 효소적 절단방법 Download PDFInfo
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Abstract
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Description
제 1 도는 커리어단백질 MS2 플리머라아제(polymerlase)(99개의 아미노산들) 및 N. gonorrhoeas MS11기원 IgA 단백질 분해효소 전구체(precursor)의 β-영역(아미노산 위치 1195-1505) 사이의 단백질 융합체선도(diagram)를 보여준다. 이들 두 성분들 사이의 접합지역은 12개의 아미노산들로 이루어지고, 이가체(Igase)의 절단배열-Pro-Pro· ! ·Thr-Pro-를 함유한다. 그 절단부위의 축조를 위해, 4개의 올리고뉴클레오타이드 등[(1)에서 (4)까지]이 그 제한절단 부위를 EcoR I 및 HindI II 사이에 첨입되어진다. 폴리펩타이드 생산 및 정제된 이가제(Igase)를 이용한 절단은 실시예 5에서 상세히 설명된다.
제 2 도는 커리어단백질(MS2 플리머라아제의 99개 아미노산들 및 플라스미드가 코드하는 6개의 아미노산들로 구성된) 및 인간 T-임파구 기원 CD 8 단백질의 206개 아미노산들로 구성된) 및 인간 T-임파구 기원 CD8 단백질의 206개 아미노산들로 이루어진 단백질 융합체를 보여준다. 이가제(Igase)에 의해 절단되어지는 천연 절단배열(natural ceavage sequence)은 CD 8 단백질의 아미노산 배열내에 위치되어진다(실시예 6 참조).
제 3 도는 발현 분비 시스템(expression secretion system)을 통해 E. Coli 세포들에 의해 생산되어진 단백질 융합체 B63*을 보여준다. 그것의 아미노말단(amino end)은 이가제(Igase) 절단부위를 함유한 연결부위(l1개의 아미노산들)가 뒤이어지는 콜레라독소 B-서브유니트(cholera toxin B-Submit)(103개의 아미노산들)로, 그리고 그것의 카르복실말단(carboxyl end)은 IgA 단백질 분해효소 전구체의 B-영역부분(아미노산 위치 1097-1160)으로 이루어진다. 그 이가제(Igase) 절단부위는 두개의 올리고뉴클레오타이드들 TK006 및 TK007에 의해 두개의 단백질 영역들 사이에 첨입된다.
제 4 도는 단백질 융합체들 B49 및 B59의 선도(diagram)를 보여준다. 그들은 IgA 단백질 분해효소 전구체의 B-영역 및 콜레라 독소 B-서브유니트로 이루어진다. 이들 성분들사이에 그들은 두개의 서로 상이한 이가제 (Igase) 절단배열들(-pro-pro-Ala-pro 및 pro-pro-Thr-Pro-을 지니는 두개의 서로 상이한 접합 지역들을 함유한다. 그 절단배열은 합성적 올리고뉴클레오타이드들(Synthetic oligonucleotides)로 축조된다(제 3 도 참조).
본 발명은 IgA 단백질 분해효소(IgA proteases)(또는 Igases로 표기되는)를 이용한 생물공학적으로 얻어진 단백질의 배열 특이적 절단(sequence-specifi cleavage)에 관한 방법에, 특히, 원핵생물내 재조합 단백질 또는 펩타이드의 생산 및 N-말단 배열의 순차적 제거(subsequent removal) 방법에 관계된 것이다.
단백질의 생물공학적 제조는 용이하게 배양되어질 수 있는, 그리고 간단한 방법(simple manner)으로 생산되는 단백질의 분리를 허용해주는 미생물들을 이용 바람직스럽게 행해진다. 이같은 목적을 위해 적합한 미생물들은, 예컨대 빵효모(baker's yeast)인 Saccharomyces cerevisiae 뿐만 아니라 그람-음성 세균인 Escherichia coli, 그람-양성 세균인 Streptococcus carnosus도 될 수 있다. 하지만, 그같은 미생물들내 진정(眞正) 외래유전자들(authentic foreign genes)의 발현은 종종 불이익을 초래한다. 예컨대, E. Coli에서는, 번역(translation) 결과물인 천연단백질(natural protein)의 아미노-말단 메티오닌 잔기가 단백질 분해효소에 의해서 대개 효율적으로 절단된다. 하지만 외래단백질의 경우에는, 그 첫번째 메티오닌 잔기(first methionine residue)가 대개는 단지 부분적으로만 절단된다. 정의된 아미노 말단(defined amino end)을 지니는 그같은 단백질의 생산을 위한 적합한 방법은, 그러므로, 우선, 융합단백질(fusion protein) 형태로 이들 단백질을 생산하고, 그리고 연이어 정의된 방법으로 배열 특이적 단백질 분해효소를 이용 융합 단백질을 절단하는 것이다.
진정단백질(authentic protein)에 비해, 그같은 융합단백질은 미생물 세포내에서 응집하고, 그로 인해 조밀 침전체[봉입체''inclusion bodies)(여타 세포성분들과 용이하게 분리(separated)될 수 있고, 따라서 목적 단백질의 분리와 정제를 용이하게 해주는]를 형성할 수 있는 부가적인 잇점을 지닌다. 다른 한편, 유전공학방법에 의해 실제적인 목적단백질에 초기에 융합되는 커리어단백질(carrier proteins)은 융합 파트너(fusion partner)의 비특이적 단백질 분해적 분해(unspecific proteolytic degradation)에 대한 특별한 안정성을 부여해 주는데; 외래적인 것으로 인지되는 폴리펩타이드의 분해문제는 특히 소(小) 펩타이드의 생물공학적 제조에 있어 중요한 것이다. 더우기, 다른 커리어 단백질은 목적단백질이 특수한 세포 구획(particular cell Compartment)(이곳으로부터는 목적단백질이 특별히 용이하게 정제될 수 있으며, 이곳은 목적단백질이 특별히 안정하게 존재할 수 있는 곳이고 및/또는 시험목적을 위해 이용이 용이한 곳인)으로 지항되도록 허용해준다. 끝으로, 커리어단백질은 또한 효율적인 정제(예컨대, 친화성 크로마토그래피법에 의한)를 허용해주는 특수한 특성들을 지닐 수 있다. 대부분의 사용목적을 위한 융합단백질은 아미노 말단에 커리어단백질을, 카르복실 말단에 목적단백질을 나르는 것이 바람직하다. 하지만, 특별한 경우에는, 그 반대 버전(opposite version) 또는 두개의 융합 파트너들과 목적단백질의 커플링(coupling)이 또한 바람직한것이 될 수도 있다. 그뿐 아니라, 한 융합체내 목적단백질의 반복이 유익한 것이 될 수 있다.
그같은 융합체(fusion)으로부터 유리형태(free form)의 목적단백질을 얻기 위해서는 반드시 공유결합적으로 결합된 융합 파트너들을 서로 절단해야만 한다. 원칙적으로 이것은 화학적 또는 생화학적(효소적) 방법들로 달성될 수 있다. 하지만, 목적단백질을 얻기 위해서는, 그같은 절단이 융합 파트너들 사이의 절단 배열(cleavage sequence) 즉, 접합지역에서 일어나야하고, 그외의 목적단백질 그 자체내 주변부위하에서는 일어나지 않는 것이 중요하기 때문에 지금까지 이용되어온 그 방법들의 제한된 특이성을 본 발명의 방법에 사용하는데는 한계가 있다. 그러므로 그 융합 파트너들의 절단은 반드시 굉장히 특이적으로 행해져야만 한다.
융합단백질의 배열-특이적 분리를 위해 지금까지 사용된 화학적 방법들은 예컨대 씨아노겐 브로마이드를 이용한 단백질내 아미노산 메티오닌(methionine)의 절단 및 포름산을 이용한 산성배지내 아미노산들 Asp· ! ·Pro 사이의 절단이다. 이들 방법들은 단지 목적하는 단백질내 특이적 절단부위가 그 융합 파트너에 대한 접합부위외에는 재차 존재치 않았을 경우에만 적합한 것이 될 수 있을 것이다. 하지만, 일반적으로, 화학적 방법들보다는 생화학적 절단방법이 더 낮다할 것인데, 이는 왜냐하면, 이 생화학적 절단방법은 대개가 목적단백질에 상해를 주지않는 생리적 또는 최소한 온화한 반응 조건들하에서 행해질 수 있기 때문이다.
융합단백질의 절단을 위한 생화학적 방법들은 단백질 분해효소(가능한 특이적인)의 사용에 기초한다. 예컨대, 트립신(trypsin)은 아미노산 알기닌 및 리신에 계속되는 단백질내 펩타이드 결합을 절단한다. 그 특이성은 아미노산 Lys의 선행 화학적 수정(prior chemical modification)(이로써, 그 특이적인지가 아미노산 알기닌에 제한되어질 수 있는)을 통해 증대될 수 있다. 생물공학적으로 사용되는 또다른 단백질 분해효소는 클로스트리페인(clostripain)인데, 이 효소는 아미노산 알기닌 및 이 알기닌 뒤에 오는 어떤 아미노산 사이의 펩타이드 결합을 절단한다. 지금까지 사용돼온 융합단백질의 절단을 위한 효소적 방법의 재검토는 F. A. O. Marston(In [D.M. Glover, E:DNA Cloning III, IRL Pres Oxford and Washington DC, 1987)에 의해 이루어졌다. 효소적 절단 방법들은 또한 절단부위에 특이적인 아미노산(들)이 동시에 목적 단백질 그 자체내에 존재할 수 있으므로 해서 그 사용이 제한된다. 그러므로 단백질 융합체의 생화학적 절단을 위해서는, 절단하기 위해, 한개의 아미노산뿐 아니라 아미노산들의 배열을 인지하는 효소들이 특별히 적합하다할 것인데, 이는 특수한 아미노산 배열이 융합 파트너들 사이의 절단부위뿐 아니라 목적단백질 부위에 또다시 존재할 가능성이 절단배열의 인지 및 절단을 위해 필수적인 아미노산들의 수가 크면 클수록 작아지기 때문이라 할 수 있다.
매우 특이적으로 특별한 단백질을 절단하는 단백질 분해효소들이 공지돼 있다. 대다수의 그같은 선택성을 지니는 단백질 분해효소들(예컨대, 인간의 보체 시스템(complement system) 및 혈액응고 시스템내에 존재하는)은 기질내 정의된 부위를 절단하지만, 해당 절단지역이 또다른 단백질(예컨대, 융합단백질)로 이전되어질 경우에는 일반적으로 더이상 절단할 수 없게된다. 이에대한 추론은 여러가지가 있는데, 그 가운데는,예컨대, 단백질 분해효소가 상기 기질내 특수한 2차 또는 3차 구조를 인지하기 때문이라는, 또는 융합단백질내 상기 절단부위의 난접근성(inaccessibility) 때문이라는 견해가 있다.
지금까지 융합단백질의 절단용으로 제한된 범위에서 사용돼왔던 배열 특이적 단백질 분해효소들의 리스트를 현재는 팩터 Xa(factor Xa)가 이끌고 있다. 이 단백질 분해효소는 절단배열 Ile_Glu_Gly-Arg· ! ·X를 특이적으로 절단하는데, 여기서 ·! ·는 절단부위를 나타내고, X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 하지만, 이같은 단백질 분해효소는 일반적으로 자신들의 접합부위내에 해당 절단배열을 지니는 융합단백질들의 절단용으로는 또한 사용될 수 없는 것으로 판명이 됐는데; 이는 왜냐하면 그같은 기질들(즉, 커리어단백질에 공유결합적으로 결합된 목적단백질을 함유하는 융합단백질)이 전혀 절단되지 않거나 또는 단지 제한된 한도까지만 절단되거나 또는 단지 가용성 형태로만 절단되기 때문이다. 융합단백질들의 효율적인 절단은 원핵생물내 재조합 단백질들의 생산에 있어 특히 중요하다. 이 경우, 실제적 DNA 배열 시작 이전에 이니시에이션 고돈(initiation codon)으로서 AUG를 함유하는 DNA 배열을 클론(clone)하는 것이 필연적이게 된다. 그 결과로 아미노산 위치 -1번에 메티오닌 잔기를 함유하는, 재조합 단백질이 예컨대, E. Coli와 같은 원핵생물내에서 발현되어지게 된다.
많은 경우에 있어서는, 하지만 위치 1에 메치오닌을 지니지 않는 재조합 단백질을 제조하는 것이 필연적이게 된다. 원핵생들로부터의 그같은 단백질의 분리는 예컨대 N-말단 메티오닌을 절단하는 메티오닌 특이적 단백질 분해효소를 통해 행해질 수 있다. 하지만, 이같은 방법은 상기 절단이 단지 단백질 시퀀싱(sequencing)에 의해서만 조사되어질 뿐이므로 해서 매우 성가신 일이 된다. 더우기 그뿐 아니라, 위치 -1(plsition -1)에 메티오닌을 함유하는 단백질과 메티오닌 결여 단백질의 분리는 그들의 거의 동일한 분자량으로 인하여 매우 곤란을 겪게되고, 따라서 단지 부분적인 정도까지 이루어질 수 있게 된다.
PCT 출원 WO84/02351은 융합단백질로부터의 N-말단 아미노산의 절단 방법을 기재하고 있다. 이 방법에서는 단백질의 여러가지 아미노산들이 엑소펩티다아제(exopeptidase) [바람직스럽기로는, 류신 단백질 분해효소(leucine peptidase)]에 의한 단계적 절단을 통해 배열 X-Pro에 이르기까지 N-말단으로부터 제거될 수 있다. 상기 배열 X-Pro는, 포스트 프롤린-디펩티딜-아미노펩티다아제(postproline-dipeptidy1-aminopeptidase)(EC3.4.l4.)를 이용한 두단계 또는 한단계 반응으로, 이같은 생성물로부터 절단된다. 하지만 이 방법은 상기 단백질의 N-말단으로부터의 아미노산들의 단계적 절단 결과로서 균일 생성물이 형성되지 않고, 그대신 생성물들의 혼합물(목적 생성물에 더하여 너무 많이 분해된 단백질뿐 아니라 불완전하게 분해된 단백질도 함유하는)이 항상 형성되는 불합리한 점을 지닌다.
융합단백질의 효소적 절단을 위한 또다른 방법은 유럽특허 NO.0 020 290에 공지된 바 있다. 이같은 방법에서는 효소 콜라게나아제(collagenase)가 특수한 인지배열로부터 단백질 융합성분을 절단키 위하여 사용된다. 그후, 융합성분의 또다른 아미노산들이 뒤이어 또다른 효소처리에 의해 제거될 수 있게 되었다. 하지만, 콜라게나아제 및 다른 엔도펩티다아제들 역시 단지 낮은 특이성만을 지닌다는 사실이 입증되기에 이르렀다(see Biochim. Biophys. Acta 271(1972), 133-144).더우기, 상기 콜라게나제들은 단지 특이적 공간구조를 지니는 단백질에만 활성을 띤다.
단백질의 N-말단 융합성분 절단용으로의 상기 팩터 Xa(factor Xa)의 사용은 이미 공지된 바 있다. 하지만, 절단효율에 관한 상기 문제점들 외에도, 이같은 방법은 단백질의 내부 배열들이 또한 인지되고 그에 따라 절단되어질 수도 있으므로 해서 또다른 불합리점을 지니게 된다. 뿐만 아니라, 팩터 Xa는 소의 혈청으로부터 분리되고, 그 결과로 팩터 Xa가 치로분야용 단백질을 절단키 위해 사용될 경우, 광범위한 정제 및 분석이 병원성 팩터 또는 바이러스(존재할는지도 모를)를 검측해내기 위해 차후 필연적으로 된다.
인간의 점막(粘膜)에 자라는 다양한 병원성 세균종들(예컨대, Neisseria gonorrhoea 및 Neisseriameningitis와 같은 Neisseria속 또는 Haemophilus influenzae 및 Haemophilus aegypticus와 같은 Haemophilus 속의)은 단백질 분해효소들[그들의 배열이 서로 밀접한 상관관계를 지니고 있고, 그리고 인간 IgAl에 특이적이므로 해서, 포팔적으로 IgA 단백질 분해효소(IgA protease) 또는 이가제(Igase)라 표기되어지는]을 분비한다. 상기 면역글로불린 IgAl(immunoglobulin IaAl)은 그같은 병원성 생물체에 의한 감열을 막아주는 분비성면역 응답의 중요성분이랄 수 있다(review; Kornfeld and Plaut, Rev.Infect. Dis.3(1981),52l-534). 그뿐 아니라, 상기 IgA 단백질 분해효소는 또한 자기 단백질 분해작용을 통해 자신의 전구체 단백질을 절단한다. 그람-음성숙주세포내 뿐만 아니라 진정세균주(authentic bacterial strain)내 Neisseria gonorrhoeae MS11 기원 상기 IgA 단백질 분해효소의 형성은 이미 상세하게 설명된 바 있다)DE 36 22 221.6).
IgA 단백질 분해효소는 예컨대 Pohlner 등(Nature 325(1987),458-462)에 의해 설명된 바와같이 다음의 인지배열들을 절단한다.
1. Pro-Ala-Pro· ! ·Ser-Pro
2. Pro-Pro· ! ·Ser-Pro
3. Pro-Pro· ! ·Ala-Pro
4. Plo-Pro· ! ·Thr-Pro
여기서, 심볼(symbo1)·! ·는 각기 경우에서의 IgA 단백질 분해효소 절단부위를 나타낸다. 상기 IgA단백질 분해효소의 클로닝은 예컨대 Pohlner 등(1987, supra)에 의해 설명되고 있다.
그러므로 본 발명의 목적은 임의의 어떤 융합 파트너들로 이루어지는 유전공학기법으로 생산된 융합단백질들 및 그 접합지역내 특이적 절단배열이 되도록 고수율로 그리고 반복적으로 목적단백질의 분리를 위한 기질로서 사용될 수 있도록 하기위한 융합단백질의 향상된 생화학적(효소적) 절단방법을 마련하고자 하는 것이다.
이러한 목적은 인지부위 또는 절단배열 Pro·!·X-Pro(이 X는 바람직스럽기로는 아미노산 Ser, Thr및 Ala를 나타내고, 특히 더 바람직스립기로는 Ser 또는 Thr를 나타내지만 다른 아미노산들을 또한 나타낼 수 있는)의 유전공학적 방법을 통한 융합단백질 접합부위내 도입에 의한 그리고 · ! ·로 표식된 절단부위에서의 IgA 단백질 분해효소를 통한 이같은 절단배열의 특이적 절단에 의해 이루어진다.
그러므로 본 발명은 (1) 아미노산 배열 Y-Pro·!·X-Pro(X는 어떠한 아미노산도 될 수가 있고 Y는 하나이상의 임의의 아미노산들이 될수 있는)를 지니는 최소한 하나의 IgA 단백질 분해효소 인지부위가 접합지역내에 형성되도록, 융합단백질의 두개 성분들이 함께 연결되는 접합지역을 유전공학적 방법을 통해 수정하고, (2) 단계 (l)로부터 결과된 융합단백질을 ·!·로 표식되는 인지부위내 위치에서 IgA 단백질 분해효소로 절단하여, (3) 절단후, 상기 융합단백질의 하나이상의 목적 성분들을 분리하는 것으로 특징지워지는 융합단백질의 효소적 절단 및 목적 성분 분리방법을 제공해준다.
본 발명과 일치하여 그 용어 IgA 단백질 분해효소(IgA protease)는 특이적으로 IgA를 절단하는 단백질 분해효소들 및 예컨대 Rev Infekt. Dis.3(1981) 521-534에 설명된 단백질 분해효소들을 포함한다. DE-A 36 22 221, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982) 7881-7885, Proc. Natl. Acad. Sci. 80(1983) 2681-2685, Nature 325(1987) 458-462 및 EMBO Jour.3(1984) 1595-l601에 설명된 재조합 IgA 단백질 분해효소들(Recombinant IgA proteases)과 같은 재조합 IgA 단백질 분해효소들은 또한 적합하다할 것이다.
본 발명의 방법에서 융합단백질 접합지역의 수정은 뉴클레오티드 배열들이 IgA 단백질 분해효소 인지부위 또는 그것의 일부를 코드(code)하는 융합단백질 접합지역으로 침입되고, 그에따라 이들 뉴클레오티드배열들이 상기 단백질 융합체의 목적 부분들을 암호화하는 하나이상 DNA 분절들의 엎스트림(upstream)또는/및 다운스트림쪽에 침입되는 방식으로 바람직스럽게 수행해진다. 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드배열들은 이같은 목적을 위해 바람직스럽게 사용된다.
놀랍게도, 본 발명의 방법은 또한 천연 IgA 단백질 분해효소 인지부위를 원래(즉, 접합부위의 수정전) 지니지 않았던 융합단백질들의 절단에도 또한 특별히 적합함이 입증됐다.
본 발명의 방법을 위해 사용되는 IgA 단백질 분해효소 인지부위는 아미노산 컨센서스 배열 Y-Pro·!· X-Pro를 지닌다. 이 경우에 X는 임의의 어떤 아미노산을 나타낼 수 있으며, Y는 하나 이상의 임의의 아미노산들을 나타낸다. X는 바람직하기로는 세린, 트레오닌 또는 알라닌을 나타내고 특별히 더 바람직하기로는 세린 또는 트레오닌을 나타낸다. Y는 바람직하게는 배열 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro 또는 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro로 끝나는 여러가지 아미노산들을 나타낸다. 본 발명의 방법은 그러므로 최소한 컨센서스 절단배열 Pro·!·X-Pro를 지니는 IgA 단백질 분해효소 인지부위(IgA 단백질 분해효소에 의한 목적 단백질의 절단 및 분리를 위해 사용되어 질수 있는)의 임의의 어떤 융합단백질 접합부위(예컨대, 커리어단백질과 목적단백질 사이)로의 첨입으로 이루어진다. 이를위해, 상기 아미노산 Ser, Ala 또는 Thr은 상기 절단배열 Pro·! ·-Pro내 위치 X(position X)에 바람직스럽게 사용된다. 표식부위에서 이루어지는 절단을 좀더 최적화시키기 위해, 또다른 특별한 아미노산들이 절단배열, 특히, 아미노산 Pro에 선행할 수 있다.
특별히 바람직한 아미노산 배열들은 다음과 같다:
a) Pro-Ala-Pro· ! ·Ser-Pro,
b) Pro-Pro· ! ·Ser-Pro,
c) Pro-Arg-Pro-Pro· ! ·Ala-Pro
d) Pro-Pro· ! ·Thr-Pro,
e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro· ! ·Thr-Pro 또는
f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro· ! ·Thr-Pro.
본 발명의 방법이, 목적단백질이 커리어단백질의 다운스트림쪽에 있는 융합단백질들의 절단에 사용될 경우, 아미노말단이 배열 X-Pro로 특징지워지는 단백질이 IgA 단백질 분해효소에 의한 절단후 형성된다. 목적단백질의 일부분으로서의 이 배열은 유리한 것이 될 수도, 불리한 것이 될 수도 또는 아무런 결과도 가져오지 않는 것이 될 수도 있다. 이러한 배열은 유전공학적 방법으로 생산된 목적단백질이, 자신의 천연 형태내 아미노말단에 그 해당하는 두개의 아미노산들 X-Pro를 또한 함유할 경우 일반적으로 이롭게 작용한다. 생물공학적 중요성을 지니는 아미노말단 X-Pro(amino-terminal X-Pro)로 특징지워지는 단백질들은 물론 천연에 존재한다. 본 발명의 방법(놀랍게도, 접합지역내에 상기 절단배열을 지니는 융합단백질들에 보편적으로 사용되어질 수 있을 뿐아니라 불용성, 가용성, 막-회집된 그리고 세포-결합된 단백질 융합체들에도 사용될 수 있는)은 융합단백질들의 이미 공지된 다른 모든 절단방법들 보다도 뛰어난 잇점을 지닌다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법은 미생물내에서 형성되고, 그리고 그 미생물로부터 그 자체로 용이하게 농축될 수 있는 침전체들과 같은 침전체들의 형태로 융합단백질 또는 단백질 융합체들이 절단될 수 있도록 해주는 특별한 잇점이 있다. 본 발명의 또다른 잇점은 사용된 절단효소 이가제(IgaSe)가 비병원성 세균 배양비지로부터 용이하게 분리될 수 있다는 것이다.
이가제가 절단하는 저란배열의 단백질 융합체 접합지역내로의 점입은 유전공학적 방법으로 행해진다. 따라서, 예컨대, 절단배열 또는 그 부분을 코드하는 일련의 뉴클레오타이드들 또는 뉴클레오타이드 배열이 화학적으로 합성되어서는 커리어단백질 및 목적단백질을 암호화하는 DNA 분절들 사이로 공지된 유전공학적방법에 의해 첨입된다. 적합한 절단배열 또는 그 부분을 코드하는 천연 뉴클레이타드들의 배열 또한 본 방법을 통해 첨입될 수 있다. 단백질 융합체를 코딩(coding)하는 유전자는 융합단백질들이 필요에 따라 생산될 수 있도록 하기 위해 적합한(바람직스럽기로는 유도할 수 있는) 발현 시그널들의 통재하에 바람직스럽게 놓여진다. 바람직한 원핵 또는 진핵(동물뿐 아니라 식물도 포함되는) 세포들은 융합단백질들의 생산을 위한 숙주세포들로서 사용될 수 있다; 하지만 무세포 시스템들(cel1-free systems) 역시 가능하다. 이들 방법들에 사용되는 커리어단백질들은 임의의 어떤 기능을 지닐 수 있는데, 그 기능적 특성들에 따라 그들 커리어단백질들은 특수한 운송기능들, 단백질 융합체의 정제 또는 단백질 융합체 자체의 안정성 및 여타 다른것들을 향상시켜주는 기능들 같은 것을 단백질 융합체에 부여해 주게된다. 바람직한 커리어단백질들은 아래에 설명되고 있다.
본 발명에 일치하는 단백질 융합체들의 절단은 과잉생산(overproducing) 비병원성 세균주(non_pathogenic bacterial strain)에 의해 형성되는 그리고 배양상징액(culture supernatants)으로부터 정제에 의해 분리되는 이가제(Igase)를 통해 바람직스럽게 행해진다(예컨대, DE-36 22 221을 참조하시요).
본 발명의 방법은 분석목적 뿐아니라 제조목적(preparatire purpose)을 위해서도 사용될 수 있다. 제조분야에서 본 방법은 예컨대 의료, 연구, 환경보호 또는 산업공정들 또 생상물들에 사용될 수 있는 중요한 단백질들의 생물공학적 생산을 위해 사용된다. 분석분야에서 본 발명은, 예컨대 적합한 발현 시스템과 콤비네이션(combinafing) 으로, 유전자 융합체들(gene fusions)의 관례적인 조사, (routine examination)를 위해 사용될 수 있다.
융합단백질들의 효소적 절단 및 이들 융합단백질들의 목적 성분 분리(isolation)를 위한 본 발명에 따른 방법의 바람직스런 실시예는 (1) 세포를 접합지역내에 최소한 한개의 IgA 단백질 분해효소 인지부위를 함유한 융합단백질을 코드(code)하는 최소한 한개의 유전자 카피(copy)을 포함하고 있는 재조합 DNA 또는 재조합 벡터(vector)로 형질전환시키고, (2) 상기 형질전환된 세포를 적합한 배지내에서 배양되게해서는, (2) 융합단백질을 코딩(coding)하는 유전자를 상기 형질 전환된 세포내에서 발현시켜, (4) 상기 융합단백질을 IgA 단백질 분해효소로 절단한 후, (5) 상기 융합단백질의 하나이상의 목적 성분들을 분리(islation)하는 것으로 특징지워진다.
본 방법에서는, IgA 단백질 분해효소를 이용한 상기 융합단백질의 처리를, 세포용해(cell lysis)후 또는/및 세포 단백질의 부분적 또는 완전한 분리후, 배지(배양액 culture broth)내에서 행할 수 있다.
융합단백질(바람직스럽기로는 원핵생물기원 발현 생성물)을 처리하기 위하여는, 부가적으로, 상기 IgA 단백질 분해효소가 예컨대 EP-B 0 141 223 또는 EP-B 0 141 224에 설명된 바와같은 당전문가에 이미 공지된 방법으로 고정화되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법의 특별히 바람직한 이용은 아미노산 배열 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A[여기서 X는 임의의 어떤 아미노산을, 바람직스럽기로는 Thr, Ala 또는 ser을 나타내며, Y는 하나이상의 임의의 아미노산들을(이경우 Y는 X가 만일 Thr 또는 Ala를 나타낸다면 Pro로 끝나는 것이, 또는 X가 만일 Ser을 나타낸다면 Pro-Ala 또는 Pro-Pro 배열로 끝나는 것이 바람직스러운) 나타내고, 그리고 A는 임의의 아미노산 배열을 나타내는]를 지니는 융합단백질들 또는 팝타이드들로부터의 N-말단 메티오닌 잔기를 결여한 재조합 단백질들 또는 팝타이드들의 생산이다. 본 발명에서는, 상기 융합단백질 또는 팝타이드가 IgA 단백질 분해효소로 절단되어져서는, 아미노산 배열 X-Pro-A를 지니는 절단 생성물이 얻어지게 된다. 예컨대, 원핵세포들로부터의 N-말단 메티오닌 잔기를 지니지 않는(결한) 재조합 단백질들의 생산을 위한 본 방법은 다음 단계들로 이루어진다:
(1) 원핵세포를 아미노산 배열 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A(여기서, X,Y 및 A는 상기 언급한 의미들을 지니는) 지니는 단백질 또는 팝타이드를 코드(code)하는 유전자로 형질전환시키는 단계,
(2) 상기 형질전환된 세포를 적합한 배지내에서 배양하여, 그 결과로 형질전환된 유진자를 발현시키는 단계,
(3) 상기 형질 전환된 세포로부터 생산된 아미노산 배열 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A를 지니는 그 발현 생성물을 IgA 단백질 분해효소로 절단하는 단계 그리고
(4) N-말단 메티오닌 잔기를 결한 아미노산 배열 X-Pro-A를 지니는 그 결과된 절만 생성물을 분리하는 단계, 본 발명의 방법에 의해, 고수율로 그것도 흘륭한 특이성을 지니는 단백질들[N-말단 메티오닌잔기를 지님이 없이, N-말단배열 X-Pro(여기서 X는 바람직스럽게 Thr, Ala 또는 Ser을 나타내는)를 지니는] 한단계(one step)로 얻는 것이 가능하다.
융합단백질의 커리어 성분 Y는 lgA 단백질 분해효소에 의해 인지되는 절단배열로 끝나는 최소한 1개의, 바람직스럽기로는 최대 100개까지의 특히 더 바람직스럽기로는 1에서 50개까지의 아미노산들을 지니는 아미노산 배열을 나타낸다. 만일 X가 아미노산 세린(serine)을 나타낸다고 한다면, 그때 Y는 배열 Pro-Ala 또는 Pro로 끝나는 것이 바람직하고, 만일 X가 Thr 또는 Ala를 나타낸다고 한다면, 그때 Y는 Pro로 끝나는 것이 바람직하긴하나, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro 또는 Ala-Pro-Arg-Pro로 끝나는 것이 특히 더 바람직하다 하겠다.
특별히 바람직한 실시예에서, Y는 배열 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro로 끝나는 최소한 5개의 아미노산들을 나타낸다. 하지만, IgA 단백질 분해효소에 의해 인지되는 모든 절단부위들이 본 발명의 방법을 위해 적합한 것이 될 수 있다. 커리어 성분 Y는 부가적으로 또다른 임의의 아미노산들(바람직스럽기로는 최대 100개까지의 특히 바람직스럽기로는, 최대 50개까지의 아미노산들에 이르는)을 함유할 수 있다. 하지만, 이들 아미노산 배열들은, DNA 레벨(level)에서, 단백질 Me-Y-Pro· ! ·X-Pro-A의 발현을 증대시킬 목적으로 그리고 아미노산 레벨에서, 세포로부터의 단백질 정제를 용이하게 해줄 목적으로 바람직스럽게 사용된다.
단백질 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A의 발현은, 예컨대, DNA 레벨에서 β-갈락토시다아제 유전자 단편들과의 융합(즉, 커리어 성분 Y가 β-갈락토시다아제 단백질 부분을 함유케되는)에 의해 향상되어질 수있다. 상기 단백질 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A의 발현을 증대시키기 위한 또다른 대안적 방법들이 당업계의 전문가에 공지된바 있다. 발현생성물의 정제 및 분리는 다른 폴리펩타이드들과의 그 가운데서도 특히, 고친화성(high affinity)으로 특별한 물질들(예컨대, 스트렙타비딘)에 결합할 수 있는 또는 고하전된(highly charged)(예컨대, 폴리(lys, Arg)) 폴리펩타이드들 또는 단백질들과의 융합에 의해 용이해질 수 있다(예컨대, EP-A 0 089 626, EP-A 0 306 610을 참조하시요).
부가적으로 본 발명은 여러가지 폴리펩타이드 성분들을 함유하고, 서로 상이한 폴리펩타이드 성분들 사이에 최소한 한개의 접합지역으로 첨입되어진 아미노산 배열 Pro·!·X-Pro(X는 임의의 어떤 아미노산을 나타내나, 바람직스럽기로는 Ser, Thr 또는 Ala를 나타내는)를 지니는 하나이상의 IgA 단백질 분해효소 인지부위들을 갖는 융합단백질을 제공해준다. 그 인지부위(recognition site)는 아미노산 배열,(a) Pro-Ala-Pro· ! ·Ser-Pro, (b) Pro-Pro· ! ·Ser-Pro, (c) Pro-Arg-Pro-Pro· ! ·Ala-Pro, (d)Pro-Pro· ! ·Thr-Pro, (e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro· ! ·Thr-Pro 또는 (f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro·!·Thr-Pro(여기서 ·!·는 절단부위를 나타내는) 지니는 것이 특히 더 바람직하다. 본 발명은 또한 특별히 아미노산 배열 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A(X는 바람직스럽게 Thr, Ala 또는 Ser을 나타내며, Y는 하나이상의 임의의 아미노산들을 나타내는데, 이 Y는 만일 X가 Thr 또는 Ala를 나타낸다면 Pro로 끝나는 것이 또는 만일 X가 Ser을 나타낸다면 배열 Pro-Ala로 끝나는 것이 바람직하고, A는 임의의 어떤 아미노산 배열을 나타내는)를 지니는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 그같은 단백질 또는 펩이드는, 본 발명의 방법에 따라 그같은 단백질 또는 펩타이드를 코드(code)하는 최소한 한개의 유전자 카피(copy)를 함유하고 있는 재조합 벡터(vector)를 사용하여 원핵세포를 형질전환 시킴으로서 발현된다.
그 배열 A(sequence A)는 임의의 어떤 아미노산 배열을 나타내는데, 이 아미노산 배열 순서내에는 또다른 IgA 단백질 분해효소 절단부위가 존재치 않는 것이 바람직스럽다 하겠다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 단백질 또는 펩타이드를 코드하는, 그리고 하나이상의 IgA 단백질 분해효소 인지부위들 또 절단배열들이 그 융합단백질의 최소한 한개의 접합지역내로 첨입되는 재조합 DNA를 제공해준다.
본 발명에 따른 재조합 DNA는 분자생물학 분야에 정통한(숙련된) 전문가에 이미 공지된 방식으로 얻어질 수 있다. 이같은 목적을 위해, 상기 아미노산 배열 A를 코딩(coding)하는 DNA 배열을 지닌 벡터를, 제한 엔도뉴클리아제로 절단(이 유전자의 5' 말단지역내에서)시켜, 목적하는 배열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드와 재결찰(再結察, religation)시키게 된다. 이 방법에서, 상기 올리고누클레오타이드는 반드시 IgA 단백질 분해효소 절단부위 또는 그 부분을 코드하는 배열을 함유하고 있어야만 한다. 게다가, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 DNA의 최소한 한개 카피(copy)를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 원핵생물체내 단백질 발현을 위한 토대로서 적합한 벡터들은 당업계의 전문가에게 이미 공지된바 있다. 이 벡터는 바람직하게 본 발명에 따른 재조합 DNA의 고발현을 허용해주는 벡터이다. 그 벡터상의 재조합 DNA는 유도할 수 있는 발현 시그널(inducible expresion signal)(예컨대, λ, tac,lac 또는 trp 프로모터)의 통제하에 바람직하게 놓여진다.
본 발명에 따른 벡터는 숙주생물체의 게놈(genome)내로 합체[예컨대, 박테리오파아지 람다(bacteriophage lambda)]될 수 있을 뿐만 아니라, 염색체 외적(ectrachromosomally)으로도 존재(예컨대, 플라스미드)할 수 있다. 본 발명에 따른 벡터는 플라스미드(plasimid)가 바람직하다. 각각의 경우에 있어서의 특별한 숙주 생물체내 유전자 발현을 위해 적합한 벡터들이 분자 생물학분야에 정통한(숙련된) 전문가에 이미공지된 바 있다. 벡터는 진핵벡터(eukaryotic vector)가 될 수도 있으나, 원핵벡터가 바람직하다 할 것이다. 원핵생물내에서의 본 발명에 따른 DNA의 발현을 위해 적합한 벡터들의 예들은, 예컨대, 상업적으로 유용하며 입수가능한 pUC 및 pUR 벡터들이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 DNA로 또는/및 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환되어지는 세포(바람직스럽기로는 원핵세포, 특히 더 바람직하기로는 E. Coli 세포)를 제공해 준다.
N-말단배열 X-Pro(X는 Thr, Ala 또는 Ser을 나타내는)를 지니고, 그리고 본 발명의 방법에 의해 한단계로 얻어질 수 있는 단백질들의 예들은, 예컨대, 인간의 적혈구 조혈 단백질(crythropoietin), 인간 T세포 수용체(T-cell receptor)의 β-체인, 그리고 특별히 인간의 과립구 자극인자(G-CSF) 들이다.
G-CSF는 다른 일련의 세포 계통들에 의해서 뿐만 아니라, 활성화된 단구들(monocytes), 대식구들(macrophages)에 의해서도 림포킨(lymphokine)으로서 합성되어진다. 림포킨은 면역 또는 혈액세포 시스템의 세포성숙에 참여한다. 그들은 훌륭히-분화된 세포들에 이르도록 골수의 간세포(bone marrow stemcell)의 성숙을 자극해준다. 따라서, G-CSF는 예컨대, 호중구들(neutrophils) 및 과립구들(granulocytes)의 형성을 유발(촉진) 한다.
G-CSF는 단기간내에 호중구세포집단을 증대시킬 수 있기 때문에, 이것은 G-CSF 사용 치료분야를 현저하게 하는 결과를 낳게 되었다. 따라서, G-CSF, 예컨대, 암(caner)(면역 시스템의 세포들이 파괴된)의 화학요법 치료후 사용될 수 있다. 그뿐 아니라, 우리는 G-CSF를 골수이식시에, 심한 화상에, 면역결여에 의해 야기된 조건적 감염에, 그리고 백혈병에 사용할 수도 있다.
G-CSF는 분비성 단백질 분자이다. 그러므로 그 일차 번역생성룰은 분비되어졌을 때 절단되고, 그 결과로 성숙한 G-CSF의 배열이 아미노산들 Thr(+)-Pro(+2)(+1 및 +2는 아미노산 위치를 나타내는)로 시작하게 되는 N-말만시그널 배열을 함유케 된다. G-CSF가 원핵생들내에서 생산될 경우, 이같은 시그널 펩타이드는 빈약하게(불충분하게) 절단되거나 또는 전혀 절단되지 않으므로 해서, 원핵생물로부터 시그널 배열을 결하는 G-CSF를 제조키 위해서는, AUG(Met)가 성숙 G-CSF를 고팅하는 DNA 배열의 시작[단백질 레벨에서는 Thr(+)-Pro(+2)로 시작되는]에 앞서 이니시에이션 코돈으로서 클론 되어져야만 한다. 그 결과로 아미노산 위치-1에 메티오닌을 함유하는 G-CSF가 E. coli와 같은 원핵생물들내에서 발현되게 된다. 본 발명의 방법에 의해, 아미노산 위치 -l에 메티오닌을 결하고, 그리고 아미노산들 Thr(+1)-Pro(+2)로 시작하는 G-CSF가 원핵생물로부터 간단한 방법으로 생산될 수 있게 되었다.
이 방법은 아미노산 배열 위치 +1과 +2에 아미노산들 Thr(+)-Pro(+2)를, 그리고 그 앞(즉, 아미노산 배열위치 -1 이후)에는 IgA 단백질 분해효소에 의해 인지될 수 있고 그러므로 Thr(+)-Pro(+2)로 시작되는 아미노산 배열로부터 절단되어질 수 있는 아미노산 배열을 지니는 G-CSF 유도체(G-CSFderivafine) 를 원핵 생물로부터 분리해냄으로서 실행된다.
바람직한 실시예에서, 상기 유도체는 위치 -1 및 -2 각각에 Pro를, 위치 -3-에서 -1까지에 아미노산 배열 Arg-Pro-Pro를 위치 -4에서 위치 -1까지에 아미노산 배열 Pro-Arg-Pro-Pro를 또는 위치 -5에서 위치 -1까지에 아미노산 배열 Ala-Pro-Arg-Pro-Pro를 함유한다.
특별히 더 바람직한 실시예에서, 상기 유도체는 위치 -6에서 위치 -1까지 아미노산 배열
-6 -5 -4 -3 -2 -l
Pro - Ala - Pro - Arg - Pro - Pro
를 함유한다.
본 발명의 의도내에서, G-CSF는 아미노산 배열이 X(+1)-Pro(+2)(여기서 X는 Thr, Ser 또는 Ala를, 특히 더 바람직스럽기는 Thr을 나타내는)로 시작되는 과립극 자극활성(graunlocyte stimulatingactiuity)을 지닌 G-CSF로부터 유도된 유도체들 뿐만 아니라 천연적으로 존재하는 G-CSF[배열은, 예컨대 Science 232(1986) 61에 설명되어진]를 포함하는 것으로 이해되어져야만 한다. 본 발명의 방법에 따른 상기 G-CSF 유도체는 위치 +1과 -1사이(Thr(+)과 Pro(-1)사이)가 원핵생물내 발현후 lgA 단백질 분해효소 처리로 절단될 수 있다. 따라서 위치 -1에 메티오닌을 결한, 그리고 N-말단 아미노산 배열이 천연적으로 존재하는 G-CSF의 아미노산들 Thr(+)-Pro(+2)로 시작되는 G-CSF가 만일 가수분해단계(single hydrolysis step)에서 얻어지게 된다.
G-CSF가 원핵생물내에서 발현됐을때, 자신히 녹는 응집물들(굴절체들)(불활성적인)이 형성되어진다. 그 단백질은, 예컨대, 치료목적을 위해 사용되어지기에 앞서, 활성 형태로 형질전환되어야만 한다. 당업계에 숙련된 전문가들에 잘 알려진 방법들(예컨대, EP-A 0 219 874, EP-A 0 114 506, WO 84/037 11 등을 비교검토 하시요)을 이용, 우선, 변성제 첨가에 의한 가용화가 수행돼야하고, 그 다음에는 복원이, 그리고 원한다면, 또다른 정제 단계들이 수행돼야 한다. IgA 단백질 분해효소를 이용한 본 발명에 따른 단백질의 처리는, 가용화 전에, 가용화 후에, 또는 복원시에 이르러 비로서 실행될 수도 있다. 만일 IgA 단백질 분해효소를 이용한 처리가 가용화 후 곧바로 수행되게 된다고 한다면, 그 가용화제(예컨대, 구아니딘 염산 또는 유레아(urea))는 반드시 IgA 단백질 분해효소 첨가이전에 투석에 의해 제거되어야만 한다. 하지만, IgA 단백질 분해효소 처리는 복원후(이는 이 경우가 G-CSF의 수율이 특히 높기 때문인) 행해진다.
G-CSF 또는 절단되어질 또다른 단백질의 IgA 단백질 분해효소 처리를 위해 필요로 되는 조건들이 결정적 중요성을 지니지는 않는다. 하지만 본 방법에서는, IgA 단백질 분해효소에 대한 G-CSF(또는 또다른 단백질)의 중량비가 1:1에서 100:1까지인 것이 바람직하다. 그 반응은 pH 6.5에서 8.5로 완충된 수성용액 내에서 일어나는 것이 바람직하다. 완충액 농도 범위는 50에서 300mmol/l 사이가 바람직하나, 만일 원한다면, 20-100mmol/l의 염화나트륨 첨가도 가능하다. 그 절단은 실온에서 20-60분 동안 수행되는 것이 바람직하다.
가용화, 복원(renafuration) 및 IgA 단백질 분해효소를 이용한 절단 후, 이같은 방법으로 얻어진 절단생성물은 이온교환 및 사이즈별 분획화 방법을 통해 바람직스럽게 정제된다. 위치 -1에 메티오닌을 결한 이같은 방법으로 생산된 G-CSF는 0.1% 이하로, 바람직스럽기로는 10-3% 이하로 다른 단백질들로 오염된다.
위치 -1에 메티오닌을 결하는 G-CSF는 그러므로 IgA 단백질 분해 효소를 이용한 절단에 의해 메티오닌을 항유하는 융합단백질로부터 거의 정량적으로 분리 또는 정제되어질 수 있게 된다. 본 발명의 방법에 의해, 0.1% 이하로, 바람직스럽기로는 10-3% 이하로, 다른 단백질들로 오염되어진, 그리고 위치 -1에 메티오닌을 함유하는 원핵생물 기원의 G-CSF가 정량적으로 결여된 재조합 G-CSF가 원핵생성물로부터 얻어질 수 있게 된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 활성물질로서의 원핵생물기원 G-CSF에 기초된 [필요하다면, 전통적 제약 담체들, 충전물질들(filling materials) 및 보조제들과 같이] 제약제제를 제공해 준다. 그같은 제약제제는 과립구들, 그중에서도 특히, 호중구들의 형성이 자극되어야만 하는 치료적 처리에 특별히 적합하다.
본 발명에 따른 제약제제들은 주사액(injection solutions) 및 주입액(infusion solutions)으로 바람직스럽게 사용될 수 있다. 이것은 이미 주사가능하고, 그리고 본 발명에 따른 조성물을 함유하는 용액을 마련함으로서 실행될 수 있다. 하지만 친액성 물질(lyophiliate) 형태의 제약제제들을 제공하는 것 또한 가능하다. 이들은 주사목적(injection purpose)를 위해 적합한 공지된 제제(agents) 및 용액으로 재조성(reconstitution) 된다. 물(水)은 안정화제(stabilizing agents), 가용화제, 완충액과 같은 주사액용 일상적 부가제들 및 생리식염농도(physiological Nacl concentration)와 같은 등장적 첨가제들(isotonic additives) 을 함유하는 주사매질(additives)로는 점성조절용 액상 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 고분자 중합체들 뿐아니라, 예컨대, 만니톨, 타트르산 또는 시트르산 완충액, 에탄올, 콤플렉싱제제들(complexing agents) (예컨대, 에틸렌디아민, 테트라아세트산 및 그것의 비독성 염들과 같은) 등이 있다. 주사액용 액상 커리어(liquid carriers)는 반드시 살균돼서, 앰퓰(ampoule)로 분배되는 것이 바람직하다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명에 따른 제약제제들의 생산을 위한, 위치 -1에 메티오닌을 결하는 원핵생물기원 G-CSF 사용을 또한 포함한다.
본 발명의 방법에 의한 임의의 어떤 융합단백질 절단으로부터 결과된 생성물로서 단백질 X-Pro-A(여기서 X는 임의의 어떤 아미노산을 나타내고, A는 어떤 임의의 아미노산 배열을 나타내는)가 얻어지는 경우엔 하지만 그 단백질이 자신의 아미노말단에 바람직스럽지 못한 디펩타이드 X-Pro를 나르게 되는데, 그때 이같은 바람직스럽지 못한 단백질은 본 발명의 방법의 일부인 디펩티딜 아미노 펩티다아제(dipeptidyl aminopeptidase)(DPAP)를 이용한 또다른 처리로 분리될 수 있게 된다. 디펩티딜 아미노 펩티다아제들은 최근까지 분리될 수 있게 된다. 디펩티딜 아미노 펩티다아제들은 최근까지 일련의 미생물들, 곤충들, 양서류 및 서로 상이한 인간조직에서 발전돼 왔다. 그들은, 예컨대, 전구단백질(precursor proteins)의 단계적 가공에 도움을 주고 있는데, 그 가운데 일부는 상기 디펩타이드 X-Pro의 아미노말단 분해를 위한 본질적 특이성을 지니기도 한다(X-Pro-DPAPase; G. Kreil, Trendsing Biochemical Sciences 15,23-26,1990). 따라서, 본 발명의 방법에 다른 이가제(Igase) 및 X-Pro-DPAP의 콤비네이션에 의해 임의의 어떤 아미노말단 아미노산들을 지니는 목적하는 단백질들이 생산될 수 있게 된다.
그때, 상기 설명된 이가제 및 X-Pro-DPAP의 콤비네이션을 이용, 원핵생물로부터 위치 -1에 메티오닌을 결한 또다른 N-말단 아미노산 배열을 지니는 단백질들을 생산하는 것 역시 가능하다. 이같은 목적을 위해, 아미노산 배열 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A를 지니는 융합단백질이 우선 얻어지게 되는데, 이경우, 두개의 N-말단 아미노산들 X-Pro를 지니지 않는 아미노산 배열 A가 발현될 단백질의 목적하는 성분이 되게 된다.
상기 아미노산 배열 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A를 지니는 원핵세포 발현 형성물은 우선 IgA 단백질 분해효소로 절단됨으로 해서, 아미노산 배열 X-Pro-A를 지니는 첫번째 절단 생성물이 형성되게 된다. 이같은 단백질은 그다음 배열 X-Pro를 특이적으로 인지해서는, Pro 뒤를 절단하는 상기에 설명된 디펩티딜 아미노펩티다아제(dipeptidyl aminoptidase)로 처리될 수 있다. 이같은 방법으로, 임의의 배열 A를 지니는 2차 절단 생성물이 형성되게 된다. 본 발명의 방법은 따라서 N-말단 메티오닌잔기를 형성되게 된다. 본 발명의 방법은 따라서 N-말만 메티오닌잔기를 지니지 않는 매우 서로 상이한 단백질들의 생산[그러므로 N-말단 배열 X-Pro(여기서 X는 바람직스럽게 Ser, Thr 또는 Ala를 나타내는)를 지니는 단백질들의 생산에만 그치는 것이 아닌]을 위해 극단적으로 유용함이 입증되게 됐다.
끝으로, 본 발명은 또한 IgA 단백질 분해효소 인지부위(상기 정의된)를 코딩하는 지역을 함유하고, 그리고 융합단백질들의 접합부위내 첨입을 위해 적합한 재조합 DNA를 포함한다. 이같은 재조합 DNA로는 화학적으로 형성된 DNA 단편(양말단상에 바람직스럽게 하나이상의 적합한 제한 절단부위들을 지니는)이 바람직하다.
용어의 정의:
본 발명의 방법은 목적하는 단백질의 생물 공학적 생산을 포함한다. 이와 관련하여 생물공학적(biotechnological)이란 유전공학적 방법들 및 다른 여타 생물공학적 방법들(예컨대, 미생물들의 발효)의 사용을 통한 동일의 목적단백질 또는 중간 생성물의 생산으로 이해돼야 한다. 목적단백질(desired protein)이란, 예컨대, 의료분야에 연구목적용으로, 환경보호에 또는 산업공정들 또는 생산품들에 사용될 수 있는 중간생성물 또는 최종 생성물이다.
본 발명의 방법은 서로 공유결합적으로 결합된 여러가지 융합 파트너들로 이루어지는 융합단백질(fusionprotein)[또는 단백질 융합체로 표기되는]로부터의 목적하는 단백질의 형성을 포함한다. 이와 관련하여 상기 융합 파트너들 가운데 최소한 하나는 목적하는 단백질을 나타낸다. 융합 파트너들의 배열 상태(order)및 융합 단백질내 그들의 융합 파트너들의 반복정도는 임의적인 것이랄 수 있으나, 되도록이면 아미노말단 커리어단백질 및 카르복시말단 목적하는 단백질로 이루어지는 것이 바람직하다. 커리어단백질 또는 커리어성분은 목적하는 단백질을 어떤 특정 특성들을 지니는 융합단백질 형태로 마련키 위해 사용된다. 그같은 특성들은 예컨대 특수한 구조적 특색(structural features)에 기초된 융합단백질들의 증대된 안정성으로, 따라서 또한 세포적 단백질 분해효소들(cellular proteases)에 대한 증대된 저항성으로 귀결될 수도 있고, 심지어는 다소 떨어지는 단백질 분해 활성을 지니는 환경으로 융합단백질들의 운송을 이끌어낼 수도 있다. 그뿐만 아니라, 상기 커리어단백질은 효율적인 융합단백질 정제를 허여해주는 특성들을 포함할 수도 있다. 이들은, 예컨대, 진화성 크로마토그래피 방법들과 관련한 특수한 리간드들의 결합, 용이하게 분리될 수 있는 침전체로의 융합단백질 침착 및 용이하게 접근가능한 부위들로의 단백질 운송등을 포함한다.
융합단백질의 성분들(커리어단백질들 및 목적 단백질들)이 서로 연결되는 융합단백질내 지역들은 접합지역 들(junction regions)로 표기된다.
각각의 접합지역은 하나이상의 아미노산 배열들(amino acid sequences)로 규정될 수 있다. 그 아미노산 배열들(그리고 또한 모든 여타 아미노산들 및 단백질들의 배열들)은 아미노 말단(왼쪽)으로부터 카르복시말단(오른쪽) 방향으로 해석되고 보여진다.
본 발명의 방법 범주내에서는, IgA 단백질 분해효소에 의해 절단되어야만 하는 접합지역들내 모든 이들 아미노산 배열들이 본 발명에 따른 절단배열(cleavage sequence) 또는 인지 배열을 함유한다.
융합단백질들 또는 단백질 융합체들의 절단이 행해지는 아미노산 배열중 두개의 아미노산들 사이의 부위는 절단부위(cleavage site)로 표기된다.
본 발명의 방법은 IgA 단백질 분해효소(IgA protease)에 의한 접합지역내 융합단백질들의 효소적 절단을 포함한다. 본 발명의 방법 범주내에서는 lgA 단백질 분해효소(lgA protease) 또는 이가제(lgase)가 Neisseria gonorrhoeae MS11 균주의 IgA 단백질 분해효소 및 뉴클레오타이드 레벨에서 그리고 형성방법에 관한 관점에서 이 단백질 분해효소에 관계되는(관련된) 모든 여타 효소들인 것으로 이해되어야 한다. 이들은 또한 특히 Neisseria 및 Haemophilus 속들(genera)의 IgA 단백질 분해효소들을 포함한다. 그 미생물 E. (Oli ED 8654는 German Collection for Microorganisms, Griesebachstraβe 8,3400 Gottingen under the number DSM 2102에 기탁됐다.
본 발명은 다음 도면들과의 콤비네이션으로 다음 실시예들에 의해 설명되어진다.
메티오닌결여 G-CSF(methionine-free G-CSF) 발현용 플라스미드의 축조
그 축조는 발현벡터(expression vestor) pPz07-mg112c(wo 88/09373)를 이용해 행하였다. 이 목적을 위해, 우리는 상기 발현벡터 pPZ07-nnllac를 NcoI로 절단하고, 그때 돌출된 말단들(protruding ends)을 멍빙 뉴클리아제(mung bean nuclease)로 제거했다. 그다음 계속해 상기 벡터를 BamH I로 재차 절단하였다. IgA 인지 배열은 DNA 레벨에서 하기 올리고뉴클레오타이드들을 이용하여 제조하였다.
올리고뉴클레오타이드 A :
5' AAT TCG CAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CCA CCT CCT ACA CCA CTG GGC CCT G 3'
올리고뉴클레오타이드 B :
5' GAT CC AGG GCC CGA TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT TAA TTT TTC CTC CGA ATT 3'
상기 두개의 올리고뉴클레오타이드들을 등몰량(equimolar amounts)으로 첨가하고, 그들이 약 100배 정도의 과량으로 상기 설명된 바와같이 절단된 상기 벡터 pPZ07-mallac 내로 삽입되도록 하였다. 재결찰(religation)시킨 후, 통상의 방법으로 수용능력(competent)을 지닌 E. Coli Klz 세포들을 형질 전환시킨다. 전통적인 방법으로 상기 세포들로부터 DNA를 분리해서는, Apa I 및 BamH I를 이용해 절단하였다.G-CSF단 핀(길이가 약 520bp인)을 제한 엔도뉴클라아제 Apa I 및 BamH l (Science 232(1986),61-65)를 이용 G-CSF 배열로부터 분리해 내었다. 이 단편을 Apa I 및 BamH I로 역시 마찬가지로 절단된 벡터에 결찰시켰다.
[실시예 2]
융합단백질은 IpAl 배열뿐만 아니라 정제를 용이하게 해주는 펩타이드들을 함유할 수 있다. 이들은 스트렙타비딘(strepavidin)을 암호화(encode)하는 DNA로 이루어질 수 있다. 이같은 목적을 위해, 우리는 스트렙타비딘유전자(streptavidin gene)(wo 89-03422)를 그 IpA 단백질 분해효소인지 배열이전의 정확한 번역프레임내에 클론(clone)되도록 하였다.
[실시예 3]
E. ColiK12 세포들(ED8564, DSM2102)을 실시예 1에 설명된 플라스미드로 형질 전환시킨뒤, 이를 항생제표식기(antibiotic marker) [암피실린(ampicilin)]상에서 선별한 다음, 그 플라스미드의 특성을 제한분석(restriction analysis)을 이용해 규명하였다. 그같은 클론(clone)을 G-CSF 배양 및 발현을 위해 사용하였다. 상기 세포들을 완전 배지(complete medicun)에서 성장시켰다. 이 배지(medium)는 리터(litre)당 16g의 박토트립톤(bactotryptone)(Difco), 10g의 이스트 추출물(yeast extract)(Difco) 및 5g의 염화나트륨을 함유한다. 상기 세포들을 최고 OD 546 cf 2.0까지 성장시킨 뒤에, 10-3mo1/l의 IPTG로 유도하였다. 4시간이 더 경과한 후, 상기 세포들을 원심분리시켜둔 다음에 리소자임(lysozyme)/EDTA로 용균시킨뒤 G-CSF를 봉입체(IB'S cf. EP-A 0 219874)로서 분리해 내었다.
상기 분리된 불용성 G-CSF 융합입자들의 변성 또는 복원은 EP-A 0 219 874에 설명된 바와같이 행하였다. 변성은 6mol/l의 구아니딘 염산에 대한 투석으로 행하였다. 이 시점에서 일정 분취량(aliquot)을 미리 취해, 이를 5mmol/l의 포타슘 포스페이트(potassium phosphate) 단층액(pH 7짜리)에 투석시킨뒤, IgA 단백질 분해효소를 이용한 절단용으로 사용하였다(실시예 4).
대안적 방법으로서는, 구아니딘 염산을 이용한 변성후의 투석이 1mmol/l의 GSH 및 3mmol/l의 GSSG를 함유하는 5mmol/l의 포나슘 포스페이트 완충액(pH 7짜리)에 대해 행해지게 된다. 복원후에는 이것이 5mmol/l의 포타슘 포스테이트 완충액(pH 7짜리)에 또 투석되도록 하였다.
[실시예 4]
위치 -1에 메티오닌을 지니지 않는 천연 -G-CSF 생산을 위한 융합단백질의 IgAl 단백질 분해효소 절단
IgAl 단백질 분해효소를 EMBo Jour.3(1984),1595-1601에 설명된 방법으로 분리하였다. 2-5μg의 IgA 단백질 분해효소를 실시예 3의 방법으로 복원 또는 변성된 10μg의 G-CSF에 첨가하고, 이를 실온에서 30분 동안 배양하였다. 상기 메티오닌-결여 G-CSF(methionine-free G-CSF)는 Mono-Q 또는 Mono-S와 같은 서로 상이한 이온교환 칼럼들 상에서 분리될 수 있었다. 아미노 말단의 단백질 시퀀싱(sequencing)은 정제된 G-CSF가 올바른 아미노산 배열 Thr(+)-pro(+2)로 시작하고 있음을 보여주었다.
[실시예 5]
단백질 융합체 생산 및 봉입체(inclusion bodies) 기원 불용성 단백질의 이가제(Igase) 특이적 절단부위 절단
우리는 원핵생물 발현벡터 pEX31C(K. Strebel, Journaf of virology 57,983-991,1986)를 수정 (즉, 이같은 발현 벡터 시스템을 이용해 E. Coli 세포들에서 과잉생산되어지는 단백질 융합체가 이가제에 의해 커리어단백질과 소망되는 단백질로 절단되어질 수 있도록) 시켰다. 이같은 목적을 위해 아미노산 배열 Thr-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro·!·Thr-Pro를 코드하는 이본쇄 DNA 단편을 합성적으로 제조된 올리고뉴클레오타이드들로 축조했다. 이 DNA 단편을 유전공학 방법 사용 발현 벡터 pEX31C의 EcoRI 절단부위로 삽입시켰다. 부가적으로, 이 단편에 바로 이웃하는, 두개의 또다른 합성적 DNA 단편들[제한 엔도뉴클리아제용의 일련의 적합한 절단부위들 및 유전자발현에 참여하는 세균효소용의 종지 시그널을 함유하는]을 그 HindIII 절단부위에 삽입시켰다. Neisseriz gonorrhoea NIS11 기원 IgA 단백질 분해효소 전구체의 β 영역(β-domain)을 코드하는 DNA 단편을, Sma I 및 HindIII용 절단부위들을 이용, 이렇게하여 형성된 발현 플라스미드 pEV37에 삽입시켰다. 이같은 방법을 통해 우리는 E. Coli 내에서 발현되어질 경우 융합단백질을 형성하는 잡종 유전자를 만들게 되었다. 이것은 자신의 아미노 말단에 커리어단백질로서 MS2 폴리머라아제(99개의 아미노산들로 이루어진)[이 폴리머라아제 뒤에는 이가제 절단배열을 지니는 12개의 아미노산들로 이루어진 중앙 접합지역이 뒤를 있는]를, 카르복실 말만엔 소망되는 β 영역을 함유한다(제 1 도 참조). 상기 융합단백질의 카르복실 말단에 존재하는 β-영역은 접합지역내 절단부위 pro·!·Thr을 정제된 이가제로 절단함으로서 절단될 수 있게 된다.
상기 합성 유전자를 지니는 상기 플라스미드를 단백질 융합체의 통제적 과잉생산을 위한 박테리오파아지람다(bacteriophage lambda) 기원 조절인자 CI857(regulafion factor CI857)(E. Remaut, Gene 22,103-113,1983)을 함유하는 E. Coli 세포로 형질전환방법에 의해 도입시켰다. 상기 CI857리프레서(CI857repressor)는 28℃로부터 42℃까지의 온도 상승에 의해 불활성화 되게되고, 그 결과로, 재조합 E. Coli 세포내 단백질 생산이 활성화되게 된다. 이같은 목적을 위해, 28℃에서 12시간 동안 성장된 E. Coli 배양액 50ml를 앞서 45℃까지 예열된 200ml의 배지로 옮기고, 42℃에서 두시간 더 배양하였다. 이 단계에서, 상기 단백질 융합체는 봉입체 Tnclusion bodies형태를 상기 세균들의 세포질(cytoplasm)내에 다량으로 축적된다. 상기 세균을 원심분리로 거둔 다음에 이를 20ml의 용균완충액(lysis buffer)[10%의 사카로즈, 50mM의 pH 8.0짜리 트리스/염산, 1mM의 EDTA로 이루어진]에 현탁시킨뒤, 여기에 400μl의 라이소자임(lysozyme) 용액(5mg/ml)을 첨가하고, 이를 22℃에서 30분 동안 배양하였다. 최종 농도가 0.1%가 되도록하기 위해 세제 Triton X-100을 첨가한뒤, 상기 용액을 재차 30분 동안 배양하였다. 세포 용해에 의해 방출된 DNA를 초음파 처리로 파괴하고, 침전체내 단백질 융합체를 포함하는 불용성 성분들을 원심분리하여 분리해낸 다음, 연이어 이를 5ml의 UINTE 완충액[1M의 유레아(urea), 50mM의 염화나트륨, 50mM의 pH 8.0짜리 트리스/염산, 1mM의 EDTA로 이루어진] 세척하였다.
다시 원심분리를 행한 후, 그때 생긴 침전물을 초음파 처리를 통해 5ml의 PBS 완충액(20mM의 포타슘포스페이트, 140mM의 염화나트륨으로 이루어지고, pH 7.5를 지니는)에 현탁시킨뒤, 세척하였다. 잔존 유레아를 완전히 제거할 목적하는 이 방법을 여러번 반복하였다. 끝으로, 상기 융합단백질을 함유하는 상기 불용성 분획을 초음파 처리를 통해 5ml의 PBS 완충액내에 현탁시켰다. 현탁액 단백질 융합체의 질(quality)과 양을 SDS 폴리아크릴아마이드 셀 전기영동법(12.5%) 및 그뒤에 이어지는 Comassie blue를 이용하는 염색법으로 결정하였다. 절단을 위해, 상기 단백질 현탁액을 1/100(w/w)의 효소/기질 비로 37℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 상기 비정제된 그리고 불용성인 단백질 융합체 절단 생성물을 SDS 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동 분석법을 이용해 검토했는데, 이 결과 상기 β-단백질의 예견된 사이즈를 지니는 폴리펩타이드가 형성됐음이 판명되어졌다. 이단백질을 니트로셀룰로오즈막(nitrocellulose membrane)상에 옮기고, 자동배열문석(automated sequnce analysis)을 행하였다. 그 결과 말단 아미노산 배열이 이가제(Igase) 절단부위의 정확한 절단에 의해 단백질 융합체로부터 형성됐음이 확인되게 됐다.
하지만, 절단시에 사용된 전체 기질량 가운데 단지 최고 약 50% 정도까지만이 전환되어졌다. 비교적 많은 량의 이가제(Igase) 첨가 및 비교적 장시간의 반응시간 그 어느것에 의해서도 전환증가는 이루어지지 아니하였다. 이것은 상기 융합단백질의 비절단부분에 이가제(Igase)가 접근할 수 없는 이가제(igase) 절단부위가 있음을 시사해주는 것이라 하겠다. 잡종 단백질 및 절단 생성물들은 심지어 이가제(Igase)로 배양된뒤에도 여전히 불용성 응집물 형태로 존재하므로하여 결과적으로 원심분리에 의해 현탁액으로부터 침전되게 된다.
만일, 상기 비정제된 봉입체 분획 대신에 앞서 부가적인 정제단계를 거쳤던 단백질 융합체가 사용된다면 절단수율은 최고 90%에 이르게 된다. 이러한 목적을 위해, 우리는 U1NTE 완충액으로 상기 불용성 침전물을 세척(상기 참조)한뒤, 이를 5ml의 U7NTE 완충액(7M의 유레아, 50mM의 염화나트륨, pH 8.0짜리 50mM의 트리스/염산, lmM의 EDTA로 이루어진)에 취해 넣었다. 불용성 성분을 원심분리로 제거한뒤, 가용성 분획을 4℃에서 5/의 pBS 완충액에 대해 투석시켰다. 투석에 의해 유레아(urea)가 제거되는 동안, 그 융합단백질이 불용성 응집물 형태로 용액으로부터 침전했다. 우리는 상기 침전 응집물을 초음파처리하여 미세현탁액으로 전환시킨뒤, 이를 이가제(Iga또)로 처리하고, 그리고 상기 설명된 바와같이 분석하였다.
[실시예 6]
이가제(Igase)를 이용한 복원된, 가용성 단백질 융합체의 특이적 절단
pEX 발현 시스템을 이용, 잡종단백질[MS2 풀리미다제와 인간 세포독성 T-림프구(cytotoxic T-lymphocytes) 기원 CD8 단백질의 일부로서 이루어진(제 2 도 참조)]을 생산하였다(실시예 1 참조). U7NTE 완충액내 봉입체기원 단백질의 초기정제 및 가용화후 예비의 12.5% SDS 폴리아크릴아미이드 겔을 또다른 정제단계로서 사용했다. 상기 융합단백질을 Coomassie blue를 이용해 염색한후 단독밴드(single band)로 겔로부터 절단해 내고, 이를 Hunkapiller법 (Methods in Enzymology 91,227-235,1983)에 따라 상기 겔 물질에서 연이어 분리해 내었다. 이 과정중에, 그 일렉트롤루션(electrolution)은 0.1%의 SDS가 첨가된 TAE 완충액(40mM의 트리스/아세트산, pH 7.9) 내에서 행했고, 상기 SDS는 22℃에서 5l/의 TAE 완충액에 대한 투석으로 뒤에 제거되도록 했으며 상기 단백질을 또다른 투석을 통해 저장용 완충액(storage buffer)(20mM의 포타슘포스페이트, 140mM의 염화나트륨, 50%의 글리세롤로 이루어지고, pH가 7.5인)으로 옮겼다. 이같은 방법으로 얻어진 그 가용성 융합단백질을 정제된 이가제(Igase)로 배양시켰는데(실시예 5 참조), 이 과정에서, 상기 가용성 융합단백질은 CD8 분자에 함유된 절단부위(-Pro-Pro·!·Thr-Pro-Ala, 제 2 도를 보라)에서 두개의 폴리펩타이드 단편들로 완전히 절단되었다. 그 절단의 특이성을 비교적 작은 절단 생성물의 아미노말단 부위에 대한 아미노산 배열문석으로 조사하였다. 예상했던 바와같이, 이 조사의 결과는 배열 Thr-Pro-Ala-Pro-Thr-Ile 이었다.
[실시예 7]
이가제(Igase)를 이용한 배양 상징액(culture superatants)으로부터 분리된 가용성 단백질 융합체의 특이적 절단
콜레라 독소 B-서브유니트와 N. gononhoeas MS11 기원 이가제(Igase) 단백질 분해효소 전구체의 β-영역(Pos.1097-1160; J. Pohlner, Nature 325,458-462, 1987)중 일부로 이루어진 단백질 융합체를 재조합 E. coli 세포의 배양 상징액으로부터 가용성 형태로 분리하였다. 두개의 단백질 성분들을 서로 분리시킬 목적으로 이가제(Igase)용 인위적 절단 배열(Pro-Pro·!·Thr-Pro-) 유전공학방법을 이용, 콜레라 독소 B-서브유니트와 메타-영역사이의 접합지역내에 삽입하였다. 이같은 목적을 위해, 올리고뉴클레오타이드들 TK006과 TH007을 접합지역내 제한 절단부위들 ECORI와 SacII 사이에 삽입하였다(제 3 도를 보시요). 상기 융합단백질을 37℃에서 12시간 동안 성장시킨 세균배양(bacterial cultrue)의 2l 상징액으로부터 암모눔 설페이트(ammonium sulpate)로 침진 농축시킨뒤, 계속해서 이를 5l PBS 완충액에 대해 투석시켰다. 절단을 위해, 투석후 이를 PBS 완충액내 농도 50μg/ml, 효소/기질비 1/50(w/w)이 되도록 하여, 37℃에서 2시간 동안 정제된 이가제(Igase)와 함께 배양시켰다. 면역블롯 분석법(immunoblot anaysis)은 완전절단으로 생긴 비교적 큰 절단 단편이 그것의 분자량 및 항 혈청과의 반응관계에서 천연 콜레라 독소 B-서브유니트(cholera toxin B-subunit)에 해당됨을 보여주었다.
[실시예 8]
그람-음성 세균표면상에서의 이가제(Igase)를 이용한 단백질 융합체들의 특이적 절단
재조합 Salmonellase 균주표면 외측으로 단백질 융합체들 TK84이 TKB59(콜레라 독소 B-서브 유니트 및 IgA 단백질 분해효소의 베타-영역으로 이루어진)를 노출시킨 목적으로 발현 분비시스템(expression-secretion system)을 사용하였다. TKB49를 코딩(coding)하는 잡종 유전자는 상기 독소(toxin)과 상기 베타-영역(β-domain) 사이의 접합지역내에 이가제용 고유절단배열(c)(-Pro-Pro·!·Ala-Pro-)를 함유케하고, 그와 반대로 올리고뉴클레오타이드들 TK006과 TK007로 이루어진, 그리고 절단배열(-Pro-Pro·!·Thr-Pro-Pro-)를 코드(code)하는 합성적 DNA 단편을 제한 절단부위들 ECORI와 SacII사이의 TKB59용 유전자에 삽입시켰다(제 3 도 참조). 자신의 포면에 고찰된 상기 단백질 융합체들은 나르는 완전 세균들(intact bactria)을 정제된 이가제와 함께 배양시켜 이가제 절단 부위들에서의 특이적 절단을 관찰할 수 있는 면역 블롯 분석은 절단으로 생긴 작은 절단단편들이 그들의 사이즈(size) 및 황혈청과의 반응관계에서 천연 콜레라 독소 B-서브유니트에 해당됨을 보여주었다.
[실시예 9]
재조합 E. coli 세포 배양 상징액들로부터의 활성 이가제 정제
수정된 IgA 단백질 분해효소 유전자를 지닌 플라스미드 pEX1070(DE 36 22 221.6)을 함유하는 재조합 E. coli C600 세포들은 배양성 경액으로 활성 이가제를 분비한다. 우리는 그 효소를 막 여과법(membrare filtration) 이용 배양상징액내에 농축시킨뒤, 이를 뒤이어 암모늄 설페이트(0.42g/ml)를 이용 그 용액으로부터 침전시켰다. 원심분리후에, 상기 침전물을 Biorex 완충액(50mM의 포타슘 폰스페이트와 8.6%의 글리세롤로 이루어지고, pH가 7.0인)(1l의 배양 상징액당 1ml의 완충액 사용)에 용해시킨뒤, 이를 2l.의완충액에 대한 투석으로 평행시키고, 다시 뒤이어 양이온 교환 크로마토그라피(cation-exchangechromafography)(Biorex 70)를 행하였다. 그 결합된 IgA 단백질 분해효소를 그 칼럼으로부터 용리완충액(elution buffer)(500mM의 포타슘포스페이트와 8.6% 글리세롤 이루어지고, pH가 7.0인)을 사용 한번에 용리(elution) 시킨뒤, 이를 분획시켰다. IgA 단백질 분해효소를 함유하는 분획들을 SDS 폴리아크릴아미이드겔 전기 영동법(SDS polyacrylamide gel electrophoresis)(12.5%)을 사용해 순차적으로 분석하였다. 여기까지의 정제로 90% 이상의 평균순도를 얻었다. 이가제를 순수한 형태(pure form)로 제조할 목적으로 Biorex 완충액내 Sephacryl HR 300을 사용하여 겔여과(gel filtration)시킨뒤, 또 다시 양이온 교환 크로마토그래피를 행하였다(상기 참조). 이렇게 하여 얻어진 이가제 활성을 IgAl 항체와의 배양 및 그 배양후 결과된 절단 생성물의 SDS 폴리아크릴아마이드 겔내 분리를 통해 조사하였다.
[실시예 10]
메티오닌결여 인터루킨 3 발현용 플라스미드 축조
그 축조는 발현벡터 pPZ07-mgllac(wo 88/09373)을 사용하여 행하였다. 이같은 목적을 위해 상기 발현벡터 pPZ07-mgllac를 NCOI를 절단시키고, 그때 돌출말단들을 mung bean 뉴클리아제(mung bean nuclase)로 제거시켰다. 상기 벡터를 뒤이어 BamHI로 재절단시켰다. 융합단백질의 최적 아미노말단 지역을 하기의 올리고뉴클레인타이드들을 사용하여 DNA 레벨에서 제조하였다.
프라이머 1A :
5'AATTCGGAGGAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGTCGACCATGGAG 3'
프라이머 1B :
5'GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAATTTTTCCTCCGAATT 3'
양 올리고뉴클레오타이드들을 등몰량(equimolar amounts)으로 함께 첨가하고, 이를 위에 설명된 바와같이 절단된 벡터 pPZ07-mgllac에 약 100배의 과량으로 삽입시켰다. 결찰(ligation)후, 수용능력(competent)이 있는 E. coli Klz 세포들을, 통상적인 방법을 사용해 형질전환시켰다. 공지된 방법으로 IDNA를 세포들로부터 분리해내어, 이를 Sa I/BamH I로 절단한 뒤, 시그널배열을 지니지 않는 인터루킨 3(interleukin 3) 코딩지역을 함유하는 DNA 한편(아래에 설명된)과 결착시켰다.
IgA 단백질 분해효소 인지지역을 지니는 인터루킨 3 코딩지역은 이미 잘 알려진 PCR 방법[여기서 PCR반응은 주형(template)으로 사용되는 인터루틴 3의 CDNA 및 다음의 프라이머들(primers)을 사용하여 행하는]을 사용해 DNA 레벨에서 만들었다.
프라이머 2A :
5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3'
프라이머 2B :
5' TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3'
그렇게 하여 결과된 PCR 단편을 효소들 Sal I 및 BamH I로 재절단시키고, 이를 상기 설명된 벡터 DNA를 직접 삽입시킨뒤, 리가아제(ligase)를 사용 공유결합적으로 결합시켰다.
예컨대, E. Colik12 C600과 같은, 적합한 속주내의 DNA를 형질 전환시킨후, E. Coli 내에서 Rb,s 형태로 I13를 합성하고 이를 계속해 분리해낼 수 있다. G-CSF에 대해 설명한 것처럼 상기 단백질의 변성과 복원을 행한후, 그 변성된 단백질을 IgA 단백질 분해효소를 절단한다. 이같은 방법으로 제조된 메티오닌 결여 I13는 또다른 정제단계들을 거친후 치료 목적으로 사용할 수 있다.
[실시예 11]
메티오닌 결여 인터루킨 2 발현용 플라스미드의 축조
그 축조는 실시예 10에 설명된 것처럼 상기 프라이머들 1A 및 1B를 삽입한후 발현 벡터 pPZ07-mgllac(wo 88/09373)(Sal I/BanH I로 절단됨)를 사용해 행하였다.IgA 단백질 분해효소 인지지역을 지니는 인터루킨 2 코딩지역은 PCR 방법[여기서 PCR 반응은 주형(template)으로 사용하는 인터루킨 2의 CDNA와 IgA 단백질 분해효소 인지지역을 또한 코드하는 프라이머들 3A 및 3B를 이용해 행하는]을 사용해 DNA레벨에서 제조했다.
프라이머 3A :
5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3'
프라이머 3B :
5'TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3'
이같은 방법으로 얻어진 PCR 단편을 효소들 SaI I 및 BamH I로 절단하여 상기 설명된 벡터 DNA 내로 직접 삽입할 수 있도록 했다. 또 다른 방법은 I13에 대해 설명된 방법을 사용하는 것이다. 앞선 실시예는 IgA 단백질 분해효소 인지 절단부위 및 또 다른 방법을 적합하게 사용하여 메티오닌 결여치료 단백질들(아미노식 배열 AIa Pro로 시작하는)을 생산할 수 있는 방법을 설명해준 것이었다. 앞서 설명된 실시예들에 유사한 방법(즉, 공지배열의 5' 또는 3' 말단에 해당하는 지역뿐만 아니라 IgA 단백질 분해효소용 인지지역을 우신적으로 함유하는, 그러므로 PCR 증폭을 통해 제조할 수 있는 올리고뉴클레오타이드들을 사용하는)을 사용하여 메티오닌을 결여하는 또다른 단백질들을 생산할 수 있다. 다음에 그들의 성숙한 천연형태에서 Ala-Pro로 시작하는, 그러므로 본 발명의 방법에 유사한 방법으로 생산할 수 있는 또 다른 치료적으로 연관성 있는 단백질들을 기재한다.
cathepsin L(EC 3.4.22.l5), Mason, R.W. et al. Biochem. J.240, 373-377,1986.
Erythropoietion, Lai, P.H. et aI. J. Biol. chem.261, 3116-3121 1986.
Interleukin-1 beta Zsebo, K.M. et al. Blood 71, 962-968, 1988.
Ostenonectin, Fisher, L.W. et a1. J.Biol. chem. 262, 9702-9708, 1987.
Type IV Collagenase, Collier I.E. et al, J. Biol. chem. 263, 6579-6587, 1988.
부가적으로, 그들의 성숙한 형태에서 아미노산 배열 ser, Pro로 시작하는 단백질들은 이같은 방법으로 생산할 수 있다. 이들의 예들은 다음과 같다.
Alpha-1 antitrypsin, Hil1, R.E. et al., Nature 311, 175-177, 1984.
Atrial natriuretic factor, Kambayashi, Y. et a1. FEBS Lett, 259, 341-354, 1990.
그들의 성숙한 형태에서 Thr pro로 시작하고, 치료적으로 연관성 있는 또 다른 단백질들의 예들은 예건대 다음과 같다:
Complement factor B, Campel1, R.D. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 80, 4464-4468, 1983.
Apolipoprotein A, Easton, D.L. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 3224-3228, 1987.
앞서 언급된 미생물의 기탁에 관한 상세한 점들은 다음에 추가하겠다.
Claims (34)
- (1) 아미노산 배열 Y-Pro·!·X-Pro(X는 아미노산 Ser, Thr 또는 Ala이고, Y는 배열 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro 또는 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro로 종결되는 아미노산임)를 갖는 하나 이상의 IgA 단백질 분해효소 인지부위가 접합지역내에 형성되도록, IgA 단백질 분해효소 인지부위 또는 그것의 일부를 코드(code) 하는 융합단백질 접합지역으로 누클레오티드 배열들을 첨입시켜 상기 단백질 융합체의 목적 부분들을 암호화하는 하나이상 DNA 분절들의 업스트림(upstream) 또는/및 다운스트림쪽에 누클레오티드 배열들이 첨입되게 되는 유전공학적 방법을 통해 융합단백질의 두 성분이 함께 연결되는 접합지역을 수정하는 단계;(2) 단계(1)에서 얻어진 상기 융합단백질을 ·! ·로 표식된 인지 부위내 위치에서 IgA 단백질 분해효소로 절단하는 단계;(3) 절단후, 상기 융합단백질의 하나이상의 목적 성분을 분리하는 단계로 이루어지는 융합단백질의 효소적절단 및 목적성분 분리방법.
- 제 1 항에 있어서, 융합단백질 접합지역의 수정이 상기 융합단백질의 목적 성분을 코드(code)하는 하나이상의 DNA 분절 전 또는/및 뒤에 첨입되는 누클레오티드 배열(IgA 단백질 분해효소인지 부위를 코드하는)의 첨입에 의해 이루어지는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 고유의 천연 IgA 인지부위를 지니지 않았던 융합단백질을 수정하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 목적 성분뿐만 아니라 하나이상의 커리어 성분을 함유한 융합단백질의 접합지역이 수정되는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 융합단백질의 커리어 성분이 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 부분을 함유하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 융합단백질의 커리어 성분이 여러개의 하전된 아미노산들을 또는/및 특정물질에 고친화성(high affirity)로 결합하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 함유하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어 서, X가 Ser, Thr 또는 Ala를 나타내는 방법.
- 제 7 항에 있어서, X가 Ser 또는 Thr을 나타내는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Y가 배열 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro 또는 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro로 끝나는 방법.
- 제 9 항에 있어서, IgA 단백질 분해효소 인지부위가 아미노산 배열a) Pro-Ala -Pro· ! ·Ser-Pro,b) Pro-Pro· ! ·Ser-Pro,c) Pro-Arg-Pro-Pro· ! ·Ala-Pro,d) Pro-Pro· ! ·Thr-Pro,e) Ala-Pro-Arg-Pro-Pro· ! ·Thr-Pro 또는f) Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro· ! ·Thr-Pro를 지니는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,(1) 세포를 접합지역내에 한개 이상의 IgA 단백질 분해효소 인지부위를 함유한 융합단백질을 코드하는 한개 이상의 유전자 카피(copy)를 포함하고 있는 재조합 DNA 또는 재조합 벡터로 형질 전환시키는 단계;(2) 상기 형질전환된 세포를 적합한 배지내에서 배양하는 단계;(3) 융합단백질을 코딩하는 유전자를 상기 형질전환된 세포내에서 발현시키는 단계;(4) 상기 융합단백질을 IgA 단백질 분해효소로 절단하는 단계;(5) 상기 융합단백질의 하나이상의 목적 성분들을 분리하는 단계로 이루어지는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 융합단백질이 세포용 해후 또는/및 세포단백질의 제거후 IgA 단백질 분해효소를 지니는 배지내에서 절단되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 특별히, Neisseria gonorrhoease 및 Neiseria meningitidis와 같은 Neisseria 속 또는 특별히 Haemophilus influenzae 및 Haemophilus aegypticus와 같은 Haemophilus속등의 병원성 세균종들로부터 얻어진 IgA 단백질 분해효소나 그같은 IgA 단백질 분해효소의 수정으로 얻어진 단백질이 융합단백질 절단용으로 사용되는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 과잉생산 비병원성 세균주로부터 얻어진 IgA 단백질 분해효소가 융합단백질 절단용으로 사용되는 방법.
- 제 13 항에 있어서, IgA 단백질 분해효소를 융합단백질 절단을 위해 고정화된 형태로 사용하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 가용성, 불용성, 만 회집된 또는 세포결합된 형태로 존재하는 융합단백질을 절단시키는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 불용성 침전체로 존재하는 융합단백질을 절단시키는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 원핵세포로부터 N-말단 메티오닌 잔기를 결하는 재조합 단백질을 제조하기 위해, 배열 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A(X는 아미노산 Ser, Thr 또는 Ala이고, Y는 배열 Pro, Pro-Ala, Arg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro 또는 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro로 종결되는 아미노산임)를 지니는 융합단백질을 IgA 단백질 분해효소로 절단함으로서, 아미노산 배열 X-Pro-A를 지니는 단백질 또는 펩티다이드가 절단생성물로 얻어지는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 융합단백질의 목적성분이 아미노산 배열 X-Pro로 시작되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, X-Pro-A가 인간 과립구집락 자극인자(G-CSF) 또는 그의 유도체를 나타내는 방법.
- 제 18 항에 있어서, IgA-단백질 분해효소를 이용한 절단후, 융합단백질의 목적성분을 디펩티딜 아미노펩티다아제를 이용한 또다른 단계에서 처리해, 그 N-말단배열 X-Pro를 절단하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, X-Pro-디펩티딜 아미노펩티다아제가 N-말단 배열 X-Pro 절단용으로 사용되는 방법.
- 각각의 폴리펩타이드 성분사이의 한개이상의 접합지역내에 유전공학적 방법으로 도입된 아미노산 배열 Y-Pro·!·X-Pro(X는 아미노산 Ser, Thr 또는 Ala이고, Y는 배열 Pro, Pro-Ala, Alg-Pro, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro 또는 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro로 종결되는 아미노산임)인 하나이상의 IgA 단백질 분해효소 인지부위를 지니는, 여러가지 폴리펩타이드 성분을 함유하는 융합단백질.
- 제 23 항에 있어서, 아미노산 배열 Met-Y-Pro·!·X-Pro-A(X 및 Y는 상기에서 정의한 바와같고, A는 임의의 아미노산 배열을 나타냄)를 지니는 융합단백질.
- 제 23 또는 제 24항에 있어서, Y가 자신의 말단에 배열 Pro, Pro-AIa, Pro-Arg-Pro, Ala-Pro-Arg-Pro 또는 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro를 지니는 융합단백질.
- 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 아미노산 배열 X-Pro-A가 과립구집락자극인자(G-CSF) 또는 그의 유도체를 나타내는 융합단백질.
- G-CSF 또는 G-CSF 유도체가 아미노산 배열 X-Pro(X는 아미노산 Ser, Thr 또는 Ala임)로 시작되는 재조합 G-CSF 또는 재조합 G-CSF 유도체.
- 제 27 항에 있어서, G-CSF 또는 G-CSF 유도체가 타단백질에 의해 0.1% 이하로 오염된 재조합 G-CSF 또는 G-CSF 유도체.
- 제 27 항 또는 제 28항에 있어서, 상기 G-CSF 또는 상기 G-CSF 유도체가 타단백질에 의해 10-3% 이하로 오염되고, N-말단메티오닌 잔기를 나르는 G-CSF를 정량적으로 결하는 재조합 G-CSF 또는 G-CSF 유도체.
- 제약용 첨가제, 보조제, 및 충전제, 또는/및 커리어와 함께 활성물질로서 제 26 항 또는 제 27 항에 따른 G-CSF 또는 G-CSF 유도체를 함유하는 제약제제.
- 제약용 첨가제, 보조제, 및 충전제, 또는/및 커리어와 함께 제약제제를 제조하는데 사용되는 26 항 또는 27 항에 따른 G-CSF 유도체의 용도.
- 제 23 항 또는 24 항의 융합단백질을 코드하는 재조합 DNA.
- 제 32 항의 재조합 DNA 카피를 하나이상 함유하는 플라스미드(plasmid).
- 제 32 항의 재조합 DNA 또는 제 33 항의 플라스미드로 형질전환시킨 E. coli 세포.
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