KR910700335A - 자속된(self-sustained), 서열 복제 시스템 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

자속된(self-sustained), 서열 복제 시스템

본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음

제1도는 본 발명의 실시양태의 도식적 표현을 나타낸다.

Claims (31)

1. a) 타켓 핵산 서열의 단편의 보충물인 서열과 조작적으로 연관된 RNA 폴리머라제 프로모터서열을 함유하는 첫 번째 DNA 프라이머를 제공하고, b) 상기 타켓 핵산 서열을 함유할 수 있는 핵산 샘플과 상기 첫 번째 DNA 프라이머를 적합한 잡종화 조건하에서 접촉시키고, c) 상응하는 RNA/DNA 이중체 핵산을 형성하기 위해 DNA 폴리머라제 확장 반응에서 상기 첫 번째 DNA프라이머와 상기 타켓 핵산 서열의 임의 잡종화 생성물의 프라이머 확장을 허용하고, d) 상기 RNA/DNA 이중체 핵산의 RNA 스트랜드를 효조적으로 선택적으로 소화시키고, e) 상기 선택적으로 소화물이거나 조작적으로 프로모터 서열을 함유하는 외부적으로 유도된 올리고뉴클레오티드 프라이머인 두 번째 핵산 프라이머의 적합한 잡종화 조건하에 cDNA 스트랜드를 함유하는 자유롭게된 프로모터에 대한 잡종화를 허용하고, f) DNA 폴리머라제 확장 반응에서 상기 DNA 스트랜드와 프라이머의 잡종화 생성물의 프라이머 확장을 허용하는 것으로 구성되는, 조작적 폴리머라제 프로모터를 갖고 타켓 핵산 서열에 상응하는 서열을 암호화하는 이중-스트랜드 DNA를 제조하는 방법.
2. g) 다수의 RNA 전사체(각각은 상기 타켓 핵산 서열에 상응하는 RNA서열을 갖는다)의 제조를 위한 이중 스트랜드 DNA주형으로서 제1항의 제조된 이중-스트랜드 DNA를 사용하는 것으로 구성되는, 상기 핵산 타켓 서열을 함유할 수 있는 핵산 샘플내 적어도 하나의 특이한 타켓 핵산 서열의 검출에 유용한 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 RNA 서열의 존재를 검출하고 임의로 측정하는 부가적인 단계로 구성되는 방법.
4. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 핵산 샘플내 상기 타켓 핵산 서열이 그자체로서 고유로 존재하거나 프로모터 서열을 조작적으로 함유하는 프라이머와 상기 DNA 타켓 서열의 잡종화/프라이머 확장 생성물로부터 제조된 프로모터 서열을 조작적으로 함유하는 분리된 DNA 스트랜드에 잡종화된 프라이머의 폴리머라제 기재로 된 프라이머 확장에 의해 제조된 이중-스트랜드 DNA주형으로부터 전사에 의해 제조된 상응하는 DNA타켓서열 추정 생성물인 방법.
5. 제2항에 있어서, h) 상기 RNA전사체 서열의 단편의 보충물인 서열과 조작적으로 연관된 프로모터 서열을 함유하는 DNA프라이머와 적합한 잡종화 조건하에 상기 DNA전사체의 잡종화를 허용하고, l) 상응하는 RNA/DNA 이중체 핵산을 형성하기 위해 DNA 폴리머라제 확장 반응에서 단계 h)의 잡종화된 생성물의 프라이머 확장을 허용하고, j) 단계 l)의 상기 RNA/DNA 이중체 핵산의 RNA 스트랜드를 효소적으로 선택적으로 소화시키고, k) 단계 j)의 상기 선택적 소화의 생성물이거나 조작적으로 프로모터 서열을 함유하는 외부적으로 유도된 올리고뉴클레오티드 프라이머인 핵산 프라이머와 적합한 잡종화 조건하에 단계 j)의 DNA 스트랜드 생성물을 함유하는 자유롭게된 프로모터의 잡종화를 허용하고, l) DNA 폴리머라제 확장 반응에서 단계 k)의 잡종화 생성물의 프라이머 확장을 허용하고, m) 이로부터 다수의 RNA 전사체의 제조를 위한 이중-스트랜드 DNA 주형으로서 단계 l)의 이중-스트랜드 DNA를 사용하는 부가적인 단계들로 구성되는 방법.
6. 제5항에 있어서, RNA 전사체 생성물이 제2항의 RNA전사체 생성물과 반대되는 감지를 갖는 방법.
7. 제5항에 있어서, 1) 역 전사효소, 2) RNase H 활성을 갖는 효소, 3) DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 4) 프로모터 서열을 조작적으로 갖는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열에 의해 제공된 효소 활성의 반응 환경에서의 존재에 의해 연속적 및 자발적으로 진행시키도록 허용된 방법.
8. 제7항에 있어서, 본질적으로 등온적으로 수행되는 방법.
9. 그 프로모터를 인식하는 폴리머라제에 의해 축매화된 반응에서 이로부터 다수의 RNA전사체들(각각 상기 타켓 핵산 서열에 상응하는 RNA서열을 갖는다)의 제조를 위한 주형으로서 제1항 또는 제5항의 단계1)에 따른 이중-스트랜드 핵산을 사용하여, 상기 RNA 전사체의 존재를 검출하고 임의로 측정하는 것으로 구성되는 방법.
10. 제2항 또는 제9항에 있어서, 상기 전사체가 RNA레플리카제 유도에 의한 상기 전사체의 복제에 대한 RNA레플리카제인식 부분을 함유하는 방법.
11. 제2항, 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 RNA 전사체의 검출된 RNA 성려이 이중-스트랜드 핵산 주형 제조시 사용된 핵산 샘플내 함유된 타켓 핵산 서열의 양을 측정하기위해 표준화된 방식으로 측정되는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 RNA 전사체의 검출된 RNA 서열이 상기 샘플안에 함유된 핵산의 공지된 복사수의 존재를 내부적으로 표준화된 방식으로 측정되는 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 타켓 핵산 서열이 특징적인 유전 또는 발병적 질병 또는 조건과 연관되는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 타켓 핵산 서열이 인간의 면역결핍 비루스와 연관되는 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 타켓 핵산 서열이 검출성 유전자와 연관되는 방법.
16. 제1항 또는 제5항에 있어서, 프로모터가 박테리오파지 T7 프로모터이고 RNA 전사체가 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 생산되는 방법.
17. 제1항 또는 제5항에 있어서, 선택적 소화가 RNase H 효소로 수행되는 방법.
18. 제1항 또는 제5항에 있어서, 확장 반응이 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I의 의해 촉매화된 방법.
19. 제1항 또는 제5항에 있어서, 확장 반응이 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편에 의해 촉매화되는 방법.
20. 제1항 또는 제5항에 있어서, 확장 반응이 T7 DNA 플리머라제에 의해 촉매화되는 방법.
21. 제1항 또는 제5항에 있어서, 확장 반응이 역 전사효소에 의해 촉매화되는 방법.
22. 제2항 또는 제5항에 있어서, 상기 DNA 전사체가 검출되지 전 라벨링되는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 RNA 전사체가 방사(radio)- 라벨링되는 방법.
24. 제24항에 있어서, 상기 RNA 전사체가 발색단 라벨링되는 방법.
25. DNA 스트랜드가 그 5′-말단에서 조작적으로 프로모터 서열을 갖는, RNase H 활성을 갖는 효소로 RNA/DNA 이중체 DNA를 처리하는 것으로 구성되는 방법의 생성물.
26. 제25항에 있어서, 상기 효소가 RNase H인 생성물.
27. 조작적으로 연관된 프로모터 서열을 갖는 DNA 프라이머와 잡종화시킨 다음 폴리머라제 프라이머 확장시켜 상응하는 RNA/DNA 이중체를 얻고 이중체의 프로모터 서열을 갖는 상기 DNA확장 생성물과 두 번째 프라이머와의 잡종화에 뒤따른 폴리머라제 프라이머 확장에 의해 상기 반응에서 더 사용하기 위해 또는 그자체로 검출하기 위해 이로부터 임의로 복제가능한 RNA 전사체의 제조에 유용한 이중-스트랜드 DNA주형을 형성하는 단계들로 구성되는, 상응하는 타켓 DNA 서열로부터 추정 생성물로서 도는 그 자체로서 생겨난, 타켓 핵산 사열을 증폭하는 방법에 있어서, 상기 RNA/DNA 이중체의 프로모터 서열을 자는 상기 DNA 확장 생성물 스트랜드가 RNase H 효소의 활성을 갖는 효소로의 상기 RNA/DNA 이중체의 RNA 스트랜드의 선택적 효소적소화에 의한 상기 두 번째 프라이머와 다음의 그 잡종화에 유용하게 만들어지는 개선점을 갖는 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 효소가 RNase H인 개선점을 갖는 방법.
29. 역 전사효소. RNase H 활성을 갖는 효소. DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 타켓 핵산 서열의 단편에 보충적인 서열 또는 그 보충물과 조작적으로 연관된 프로모터 서열을 함유하는 적어도 하나의 DNA 프라이머로 구성되는 반응 혼합물 및 수단으로 구성됨으로써, 타켓 핵산 서열의 검출을 위해 상기 혼합물과 샘플을 접촉시킴에 따라, 타켓 핵산 서열이 증폭후 검출되는 상기 핵산 타켓 서열을 함유할 수 있는 RNA 샘플내 적어도 하나의 특이한 핵샅 타켓 서열의 검출에 유용한 키트(kit).
30. 제29항에 있어서, 등온 조건에서 RM 성분들을 포함하는 반응을 수행하기 위한 수단을 갖는 키트.
31. 제30항에 있어서, RNase H 활성을 갖는 상기 효소가 RNase H인 키트.

    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.