FR3139579A1 - Procédé de détection in vitro ou ex vivo d’un statut immunodéprimé chez un sujet - Google Patents
Procédé de détection in vitro ou ex vivo d’un statut immunodéprimé chez un sujet Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de détection in vitro ou ex vivo d’un statut immunodéprimé chez un sujet, comprenant la quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ; et l’identification de la présence ou non d’une variation de leur expression par comparaison à une valeur de référence ; ainsi que les outils pour le mettre en œuvre et les utilisations de ceux-ci.
Description
La présente invention concerne un procédé de détectionin vitroouex vivode la présence ou de l’absence d’un statut immunodéprimé chez un sujet comprenant une étape de quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2, et une étape de comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression.
Le sepsis touche près de 50 millions de personnes dans le monde chaque année, dont plus de 40% sont des enfants de moins de 5 ans. Il s’agit d’une des principales causes de décès dans le monde avec plus de 11 millions de décès chaque année. Pourtant, la majorité de ces décès sont évitables. En Europe, on estime que le sepsis est responsable chaque année de près de 700 000 décès, dont près de 57 000 décès en France avec un coût moyen d’environ 16 000 € par hospitalisation.
Le sepsis est une réponse inflammatoire systémique à une infection (bactérienne, virale, fongique ou parasitaire) qui se définit comme un état aigu de dysrégulation de la réponse de l’organisme à cette infection entraînant la perte de fonction des organes et un risque vital pour le patient, et dont la forme la plus grave est le choc septique. Le sepsis s’accompagne d’une production exacerbée de médiateurs inflammatoires. On parle par exemple d’un « orage cytokinique » pour évoquer la production massive de cytokines (médiateurs chimiques qui permettent la communication entre nos cellules), qui affectent le fonctionnement des organes vitaux de manière aigue, et peuvent entrainer des séquelles fonctionnelles à plus long terme. Les patients atteints de sepsis sont généralement admis en soins intensifs, où ils reçoivent notamment des antibiotiques et les supports nécessaires au maintien des fonctions vitales. Toutefois, depuis plus de vingt ans, malgré des progrès considérables accomplis dans la compréhension de la physiopathologie associée au sepsis, aucune nouvelle thérapie spécifique au sepsis n’a vu le jour.
La grande hétérogénéité des patients est pointée du doigt comme la principale raison expliquant l’échec de décennies de stratégies de traitement, dont les stratégies anti-inflammatoires, dans le sepsis. Cela souligne le besoin crucial de stratification des patients et d’une approche plus individualisée.
En ce qui concerne la physiopathologie du sepsis, après l’inflammation initiale, une immunosuppression persistante a été décrite à plusieurs reprises et il a été constaté qu’elle avait des conséquences néfastes sur les patients (augmentation du risque infectieux nosocomial, du risque de mortalité et de la durée de séjour) et sur les coûts des soins de santé. Par conséquent, une immunostimulation adjuvante est désormais envisagée pour contrebalancer cette réponse immunosuppressive et restaurer les fonctions immunitaires des patients. Cependant, cette nouvelle approche repose sur la capacité à identifier ou à enrichir les groupes de patients présentant les fonctions les plus immunosupprimées. Comme il n’existe pas de signe clinique d’immunosuppression, la stratification des patients doit être basée sur des biomarqueurs immunitaires.
Les monocytes sont par nature des cellules extrêmement « plastiques ». Ainsi, tout au long de la progression d’une maladie, les monocytes peuvent être alternativement des cellules pro- et anti-inflammatoires. La résultante de ces forces pro- et anti inflammatoires qui agissent sur les monocytes à un moment donné peut globalement être reflétée par le niveau d’expression du mHLA-DR à leur surface.
Par conséquent, un des tests de référence pour suivre les altérations immunitaires chez les patients en unité de soins intensifs (e.g. patients atteints de sepsis, de traumatismes, ayant subi une chirurgie lourde, brûlés, ou patients atteints de pancréatites) est la diminution de l’expression d’un récepteur de surface appartenant au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe II, à savoir le HLA-DR (human leucocyte antigen-D related), à la surface des monocytes (mHLA-DR), mesurée par cytométrie en flux. En effet, ce marqueur fournit des informations précieuses en terme de prédiction de mortalité ou encore de l’évaluation du risque d’infections secondaires chez ces patients (Venetet al.(2018) Nat Rev Nephrol 2018;14:121–137).
La mesure de l’expression du mHLA-DR est une méthode connue dans la littérature pour identifier si un patient, par exemple atteint de sepsis, est immunodéprimé ou non (Monneret et Venet (2016) Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 90B:376-386). Grâce à une mesure standardisée, un seuil de décision clinique a été proposé, à savoir un mHLA-DR d’au moins 5000 anticorps liés par cellule (en anglais :antibodies bound per cellouAB/C), comme par exemple 8000 AB/C, et utilisé pour identifier les patients immunodéprimés en soins intensifs.
À ce jour, la mesure du mHLA-DR est basée sur la cytométrie en flux, une technologie qui ne peut pas être mise en œuvre dans tous les sites hospitaliers pour la routine clinique en raison de nombreuses limitations. En effet, la cytométrie en flux présente des contraintes pré-analytiques et nécessite des techniciens qualifiés pour exploiter et interpréter les résultats. De plus, les carences en termes d’implantation des cytomètres en flux dans les hôpitaux n’est pas compensée par une accessibilité 24h/24 et 7j/7 lorsqu’ils sont présents (Monneret et Venet (2014),Crit Care 18:102). Enfin, c’est une technologie qui demande du temps dont on ne que rarement lorsque le patient est en service de réanimation ou en unités de soins intensifs.
Pour pallier ces inconvénients, d'autres biomarqueurs, utilisant des outils de biologie moléculaire, ont été proposés. Par exemple, on peut citer un biomarqueur basé sur le ratio du niveau d'expression, au niveau ARN messager (ARNm), de CD74 au jour J3 (suivant l'admission du patient au sein d'une structure médicale) sur le niveau d'expression de CD74 au jour J1. Le CD74 représente la chaîne invariante γ du HLA-DR. Il a été montré que le ratio d'expression CD74 J3/J1 est associé avec l'apparition d'infections secondaires acquises en soins intensifs (Peronnetet al.(2017) Intensive Care Medicine ;43(7):1013-20).
Il a également été proposé, dans le document WO2013/156627, une méthode de détermination du statut immunodéprimé ou non-immunodéprimé, à partir de la détermination de la charge en anellovirus, dans un échantillon biologique.
En parallèle, un prototype d’outil moléculaire multiplex permettant d’évaluer sur une plateforme automatisée l’expression d’un ensemble de 16 biomarqueurs, notamment des ARNm, a été mis en œuvre pour identifier le profil immunitaire de patients. (Tawfiket al.(2020) JID 2020 :222 (suppl 2)). Cependant, les biomarqueurs ne sont pas issus d’une étude sur cohorte dédiée et ne sont donc pas suffisamment fiables pour discriminer et stratifier les patients. De plus, les performances obtenues nécessitent d’être améliorées et aucune corrélation n’est faite entre les expressions des différents biomarqueurs et une valeur du mHLA-DR caractéristique de l’immunocompétence.
A ce jour, plusieurs gènes sont identifiés comme un lien potentiel avec le statut immunitaire chez un sujet. A titre d’exemple,
- le gène TAP2 (Antigen peptide transporter 2) code pour une protéine associée aux membranes de la superfamille des transporteurs ABC (ATP-binding cassette), qui est impliquée dans le transport de peptides du cytoplasme au réticulum endoplasmique dans le cadre du processus de présentation de l’antigène des molécules de classe I. L’expression du transcrit de ce gène a par ailleurs été étudiée chez des patients septiques, chez lesquels il a été montré qu’elle permettait d’identifier des patients avec un endotype particulier associé à la survenue du décès à 28 jours (Sciclunaet al.(2017), Lancet Respir Med 5(10) : 816-826) ;
- le gène C3AR1 (complement component 3a receptor 1) code pour le récepteur du complément C3a, une protéine relarguée lors de l’activation du complément. La liaison de l’anaphylatoxin C3a sur son récepteur active la chimiotaxie et l’opsonisation des bactéries. Dans la littérature, il a été montré que le transcrit du gène C3AR1 était plus fortement exprimé chez les patients septiques que chez des volontaires sains (Napieret al.(2016) J. Exp. Med. 213(11):2365-2382) ;
- le gène CD177 code pour la glucoprotéine de membrane des neutrophiles CD177, découverte en 1971 chez un cas de neutropénie néonatale. Il a été mis en évidence dans une étude une augmentation du niveau d’expression de CD177, au niveau ARNm et protéine, dans les neutrophiles circulants de patients ayant eu un choc septique (Demaretet al.(2016), Immunol. Letters 178 :122-130) ;
- le gène IL1R2 code pour un récepteur de l’interleukine-1, et plus particulièrement l’interleukine-1α (IL1A) et l’interleukine-1β (IL1B), qui transmettent des signaux intracellulaires via des voies partagées par d’autres récepteurs comme le récepteur de l’Interleukine 18 (IL18), entrainant la sécrétion de facteurs médiateurs de l’inflammation. Le récepteur IL1R2 est décrit comme un récepteur « leurre », qui fixe IL1A et IL1B et les empêche donc de se lier à leurs récepteurs réguliers, ce qui se traduit par une inhibition de la traduction du signal médiée normalement par ces interleukines. Le transcrit d’IL1R2, a été identifié comme différentiellement exprimé dans les neutrophiles de patients septiques dans une étude bioinformatique (Heet al.(2019) 35(6):481-490). IL1R2 a été proposé comme marqueur de diagnostic du sepsis, sur la base de résultats de mesure de la concentration sérique d’IL1R2 chez des volontaires sains et des patients septiques (Langet al.(2017) Shock 47(1):119-124). Des analyses par immunoprécipitation de chromatine ont montré des différences au niveau de la chromatine (méthylation et acétylation des histones) du promoteur du gène d’IL1R2 entre des patients septiques et des volontaires sains (Weitereret al.(2015) PLoS One 10(3):e0121748).
- le gène TAP2 (Antigen peptide transporter 2) code pour une protéine associée aux membranes de la superfamille des transporteurs ABC (ATP-binding cassette), qui est impliquée dans le transport de peptides du cytoplasme au réticulum endoplasmique dans le cadre du processus de présentation de l’antigène des molécules de classe I. L’expression du transcrit de ce gène a par ailleurs été étudiée chez des patients septiques, chez lesquels il a été montré qu’elle permettait d’identifier des patients avec un endotype particulier associé à la survenue du décès à 28 jours (Sciclunaet al.(2017), Lancet Respir Med 5(10) : 816-826) ;
- le gène C3AR1 (complement component 3a receptor 1) code pour le récepteur du complément C3a, une protéine relarguée lors de l’activation du complément. La liaison de l’anaphylatoxin C3a sur son récepteur active la chimiotaxie et l’opsonisation des bactéries. Dans la littérature, il a été montré que le transcrit du gène C3AR1 était plus fortement exprimé chez les patients septiques que chez des volontaires sains (Napieret al.(2016) J. Exp. Med. 213(11):2365-2382) ;
- le gène CD177 code pour la glucoprotéine de membrane des neutrophiles CD177, découverte en 1971 chez un cas de neutropénie néonatale. Il a été mis en évidence dans une étude une augmentation du niveau d’expression de CD177, au niveau ARNm et protéine, dans les neutrophiles circulants de patients ayant eu un choc septique (Demaretet al.(2016), Immunol. Letters 178 :122-130) ;
- le gène IL1R2 code pour un récepteur de l’interleukine-1, et plus particulièrement l’interleukine-1α (IL1A) et l’interleukine-1β (IL1B), qui transmettent des signaux intracellulaires via des voies partagées par d’autres récepteurs comme le récepteur de l’Interleukine 18 (IL18), entrainant la sécrétion de facteurs médiateurs de l’inflammation. Le récepteur IL1R2 est décrit comme un récepteur « leurre », qui fixe IL1A et IL1B et les empêche donc de se lier à leurs récepteurs réguliers, ce qui se traduit par une inhibition de la traduction du signal médiée normalement par ces interleukines. Le transcrit d’IL1R2, a été identifié comme différentiellement exprimé dans les neutrophiles de patients septiques dans une étude bioinformatique (Heet al.(2019) 35(6):481-490). IL1R2 a été proposé comme marqueur de diagnostic du sepsis, sur la base de résultats de mesure de la concentration sérique d’IL1R2 chez des volontaires sains et des patients septiques (Langet al.(2017) Shock 47(1):119-124). Des analyses par immunoprécipitation de chromatine ont montré des différences au niveau de la chromatine (méthylation et acétylation des histones) du promoteur du gène d’IL1R2 entre des patients septiques et des volontaires sains (Weitereret al.(2015) PLoS One 10(3):e0121748).
Bien que ces marqueurs soient décrits individuellement, à ce jour, aucune étude n’a mis en évidence de lien suffisamment robuste entre leurs expressions combinées et l’immunodépression des patients, de même qu’aucune corrélation n’a été démontrée entre ces marqueurs et ceux de l’immunosuppression communément utilisés, tels que l’expression de HLA-DR à la surface des monocytes, le pourcentage des cellules T régulatrices ou le nombre de cellules T CD4+ (Demaretet al.(2016) Immunology Letters 178:122–130). En d’autres termes, il n’existe pas d’alternative aux techniques de cytométrie en flux.
Il subsiste donc un besoin évident d’identifier un moyen fiable (i.e. présentant une sensibilité et/ou une spécificité acceptable) et rapide, qui soit également facile à lire/interpréter, simple d’utilisation et intégrable en routine clinique, afin de statuer sur l’état immunitaire du patient, notamment pour identifier l’immunosuppression.
Après de nombreuses recherches, il est du mérite des inventeurs d’avoir pu identifier, de manière inattendue et surprenante, une signature de plusieurs gènes dont l’expression dérégulée est caractéristique d’un statut immunodéprimé.
Un objectif de la présente invention est d’identifier les mêmes patients immunodéprimés, notamment en service de soins intensifs, que ceux caractérisés par une expression mHLA-DR <8 000 anticorps liés/cellule (AB/C).
Ainsi, un premier objet de la présente invention concerne un procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunodéprimé chez un sujet , comprenant les étapes suivantes :
a. Quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
b. Comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression.
a. Quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
b. Comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression.
La présente invention présente donc divers avantages, notamment le fait de permettre une généralisation de l’immunosurveillance des sujets, comme celle des patients en soins intensifs, de manière simple et rapide au moyen d’une technologie (outils et procédé) qui peut être mise en œuvre sur tous les sites hospitaliers, à l’inverse de la cytométrie en flux. La présente invention permet également d’identifier les patients immunodéprimés, pour lesquels il serait pertinent d'administrer des traitements immunostimulants dans le cadre d’essais cliniques, et de permettre ainsi de démontrer l’efficacité de tels traitements. En outre, l’invention ouvre la voie à la médecine personnalisée chez les patients, notamment ceux en soins intensifs.
A la connaissance des inventeurs, il n'a jamais été décrit ni suggéré que la mise en évidence d’une variation de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par les gènes TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 permet de détecter,in vitroouex vivo, un statut immunodéprimé chez un sujet. De surcroît, il n'a jamais été décrit ni suggéré que le résultat de cette détection est corrélé avec une quantification de l’expression du HLA-DR à la surface des monocytes (mHLA-DR) inférieure à 8000 AB/C, avantageusement inférieure à 7500 AB/C , inférieure à 7500 AB/C, de préférence inférieure à 7000 AB/C, inférieure à 6500 AB/C, voire même inférieure à 6000 AB/C, inférieure à 5500 AB/C ou encore inférieure à 5000 AB/C, mesurée par cytométrie en flux.
Les gènes cibles dont l’expression est quantifiée dans le procédé objet de la présente invention sont connus de la personne du métier et les localisations chromosomiques sont notamment données dans le tableau 1 ci-dessous.
| Biomarqueurs | Localisation chromosomique (GRCh38/hg38) |
| TAP2 | chr6:32,821,833-32,838,823 |
| C3AR1 | chr12:8,058,302-8,066,471 |
| CD177 | chr19:43,353,659-43,363,172 |
| IL1R2 | chr2:101,991,816-102,028,544 |
Dans le cadre de l’invention, et par opposition à un statut immunitaire normal, qualifié d’immunocompétent, les expressions « immunodéprimé », « immunosupprimé », « immunodéficient », « statut immunitaire hypoactif » ou « paralysie immunitaire » sont utilisées indifféremment et désignent un système immunitaire/une réponse immunitaire moins actif que la normale en réponse à une infection ou un état inflammatoire. En particulier, il s’agit d’une immunodépression caractérisée par une altération des réponses immunitaires innées et adaptatives, notamment une apoptose accrue et un dysfonctionnement des lymphocytes, une altération des fonctions phagocytaires, une désactivation des monocytes avec diminution de l’expression de surface du HLA de classe II et une altération de la production de cytokines.
Dans le cadre de l’invention, le terme « sujet » désigne un être humain et de préférence, le sujet est un patient. Le patient est défini comme une personne entrée en contact avec un professionnel de santé, notamment un médecin, une structure médicale ou un établissement de santé.
Selon un mode de réalisation particulier, le sujet est un patient au sein d’un établissement de santé, de préférence au sein d’un hôpital, de préférence encore au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs (USI) ou en unité de soins continus, et tout particulièrement, le sujet est un patient en USI.
Dans le cadre de l’invention, les expressions « biomarqueur » et « marqueur » sont utilisées indifféremment et désignent une caractéristique biologique mesurable objectivement qui représente un indicateur des processus biologiques normaux ou pathologiques. Il peut s'agir en particulier d'un biomarqueur moléculaire, de préférence détectable au niveau ARNm. Plus particulièrement, le biomarqueur peut être un biomarqueur endogène ou loci, tel qu'un HERV ou un gène.
Le « sepsis » est une pathologie dans laquelle la réponse immunitaire est dérégulée chez un individu, suite à une infection, conduisant à une défaillance et des dysfonctions d'organes multiples et potentiellement mortelles. Le « choc septique » est un sous-type de sepsis, dans lequel une hypotension persiste, malgré un remplissage vasculaire adéquat.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « échantillon biologique » désigne tout échantillon provenant d’un sujet, et pouvant être de différentes natures, comme le sang ou ses dérivés, les expectorations, l’urine, les selles, la peau, le liquide céphalo-rachidien, le liquide de lavage broncho-alvéolaire, le liquide de ponction de la cavité abdominale, la salive, les sécrétions gastriques, le sperme, le liquide séminal, les larmes, la moelle épinière, ganglion du nerf trijumeau, tissu adipeux, tissu lymphoïde, tissu placentaire, tissu du tractus gastro-intestinal, tissu du tractus génital, tissu du système nerveux central. En particulier, cet échantillon peut être un fluide biologique, comme un échantillon de sang ou un échantillon dérivé du sang, qui peut notamment être choisi parmi le sang total (tel que collecté de la voie veineuse, c’est-à-dire contenant les cellules blanches et rouges, les plaquettes et le plasma), le plasma, le sérum, ainsi que tout(tous) type(s) de cellules extraites à partir du sang, telles que les cellules mononuclées sanguines périphériques (ou PBMC, contenant les lymphocytes (B, T et cellules NK), les cellules dendritiques et les monocytes), des sous-populations de cellules B, des monocytes purifiés, ou des neutrophiles.
Dans le cadre de l’invention, les expressions « valeur de référence », « valeur normale », « norme », « valeur usuelle » ou « échantillon biologique de référence » sont utilisées indifféremment et désignent une valeur ou une moyenne des valeurs d’un paramètre (e.g. expression de gène, notamment au niveau ARNm, …) issue d’un ou plusieurs sujets sains, présentant un statut immunitaire normal ou immunocompétent, c’est-à-dire un sujet dont on sait que le statut immunitaire n’est pas immunodéprimé avec notamment une valeur du mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, supérieure à 6000 AB/C, supérieure à 6500 AB/C, voire même supérieure à 7000 AB/C, supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement, supérieure à 8000 AB/C, que le sujet ne présente pas de réponse immunitaire altérée consécutive à une inflammation ou sepsis, par opposition à une « valeur testé », « valeur test » ou « échantillon biologique test ». La valeur de référence et la valeur test sont obtenues par la mise en œuvre du même procédé de détection, quantification, identification…
Dans le cadre de l’invention, l’expression « variation de l’expression » désigne une surexpression ou une sous-expression du gène. En particulier :
- le terme « surexpression » signifie que l’expression d’un gène est augmentée par rapport à une valeur de référence, c’est-à-dire obtenue chez un sujet immunocompétent défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C;
- le terme « sous-expression » signifie que l’expression d’un gène est diminuée par rapport à une valeur de référence, c’est-à-dire obtenue chez un sujet immunocompétent défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C.
- le terme « surexpression » signifie que l’expression d’un gène est augmentée par rapport à une valeur de référence, c’est-à-dire obtenue chez un sujet immunocompétent défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C;
- le terme « sous-expression » signifie que l’expression d’un gène est diminuée par rapport à une valeur de référence, c’est-à-dire obtenue chez un sujet immunocompétent défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C.
Les termes « codant » ou « codant pour », « code » ou « code pour » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à la propriété inhérente aux séquences spécifiques de nucléotides dans un polynucléotide, tel qu’un gène, un ADNc ou un ARNm, à servir de matrice pour la synthèse d’autres polymères ayant une séquence définie d’acides aminés, et les propriétés biologiques qui en découlent. Ainsi, un gène code pour une protéine si la transcription et la traduction de l’ARNm correspondant à ce gène produisent la protéine dans une cellule ou un autre système biologique. Tant le brin codant, dont la séquence nucléotidique est identique à la séquence d’ARNm et qui est généralement décrite dans les listages de séquences et bases de données, que le brin non codant, utilisé comme matrice pour la transcription d’un gène ou de l’ADNc, peuvent être désignés comme codant pour la protéine ou un autre produit de ce gène ou ADNc.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « amorce d'amplification » désigne un fragment nucléotidique pouvant comprendre de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides, et possédant une spécificité d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible, dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique de la séquence nucléotidique cible. Généralement, on utilise des « couples d'amorces », constitués de deux amorces. Lorsque l'on souhaite réaliser l'amplification de plusieurs gènes différents, plusieurs couples d'amorces différents sont de préférence utilisés, ayant préférentiellement chacun une capacité à s'hybrider spécifiquement avec un gène différent.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « sonde d'hybridation » désigne un fragment nucléotidique comprenant typiquement de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 90 nucléotides, de manière encore plus préférée de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible. La sonde comporte également un rapporteur (tel qu'un fluorophore, une enzyme ou tout autre système de détection), qui va permettre la détection de la séquence nucléotidique cible. Dans la présente invention, la séquence nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager (ARNm) ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse dudit ARNm. Lorsque l'on souhaite cibler plusieurs gènes différents, plusieurs sondes différentes sont de préférence utilisées, ayant préférentiellement chacune une capacité à s'hybrider spécifiquement avec un gène différent.
Dans le cadre de l’invention, par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires, sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « réaction d'amplification enzymatique » désigne un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible, par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes :Polymerase Chain Reaction(PCR),Ligase Chain Reaction(LCR),Repair Chain Reaction(RCR),Self Sustained Sequence Replication(3SR) avec la demande de brevet WO-A-90/06995,Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(NASBA),Transcription Mediated Amplification(TMA) avec le brevet US-A-5,399,491, etLoop mediated isothermal amplification(LAMP) avec le brevet US6410278. Lorsque la réaction d'amplification enzymatique est une PCR, on parlera plus particulièrement de RT-PCR (RT pour « reverse transcription »), lorsque l'étape d'amplification est précédée d'une étape de reverse-transcription d'ARN messager (ARNm) en ADN complémentaire (ADNc), et de qPCR ou RT-qPCR lorsque la PCR est quantitative.
De préférence, la présente invention a pour objet un procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunitaire déprimé chez un sujet, tel que défini précédemment et présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaisons :
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles TAP2 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles TAP2 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles TAP2 et C3AR1 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles TAP2 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles C3AR1 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles C3AR1 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression d’au moins 3 gènes cibles choisis dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression du gène cible TAP2 et d’au moins un autre gène cible choisi parmi C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression du gène cible TAP2 et d’au moins deux autres gènes cibles choisi parmi C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, C3AR1 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, C3AR1 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 4 gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- la valeur de référence correspond à l’expression dudit gène cible chez un sujet présentant un statut immunitaire normal ou un sujet dont on sait que le statut immunitaire n’est pas immunodéprimé ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base d’au moins deux variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base de deux variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base de trois variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base d’une sous-expression de TAP2, d’une surexpression de C3AR1, d’une surexpression de CD177, et d’une surexpression de IL1R2 ;
- le procédé de l’invention comprend, en outre, une étape de quantification de l’expression d’au moins un gène cible additionnel sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ; le statut immunodéprimé est alors en outre détecté en tenant compte d’au moins une variation d’au moins un gène cible additionnel, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de CD3D, une sous-expression de CIITA, une sous-expression de CD74, une sous-expression de CTLA4, une sous-expression de CX3CR1, une surexpression de IFNγ, et une surexpression de S100A9 ;
- le procédé de l’invention comprend une étape de quantification de l’expression de l’ensemble des gènes cibles suivants : TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ;
- le sujet est un patient, notamment un patient gravement malade en état septique, plus particulièrement, en choc septique ; atteint de brûlures, plus particulièrement, de brûlures graves ; atteint de traumatismes, plus particulièrement, de traumatismes graves ; ou opéré par chirurgie, plus particulièrement, une chirurgie lourde ;
- l’échantillon biologique est un échantillon de sang ;
- l’échantillon biologique est un échantillon de sang total ;
- l’échantillon biologique est un échantillon issu d’un patient au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs (USI) ou en unité de soins continus, et de préférence, d’un patient en USI ;
- l'échantillon biologique test et/ou l'échantillon biologique de référence selon l'invention est un échantillon de sang, de préférence un échantillon de sang total, de plasma ou de sérum, ou un échantillon de cellules mononucléées sanguines périphériques, extraites à partir d'un échantillon de sang ;
- la valeur de référence d’un gène cible correspond à l’expression dudit gène cible chez un sujet présentant un statut immunitaire normal défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C ;
- l’expression des gènes cibles est quantifiée au niveau transcrit ARN ou ARN messager (ARNm ) ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée au niveau ADN ou ADN complémentaire (ADNc) ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée par la mise en œuvre d’une méthode de détection moléculaire et/ou quantification directe par tout procédé connu de l'Homme du métier permettant de déterminer la présence d’un transcrit ARNm dans un échantillon telles que des méthodes d'hybridation, de préférence avec une puce d'hybridation, par hybridationin situou parNorthern blot; des méthodes d'amplification, de préférence parReverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(RT-PCR), de préférence encore par RT-PCR quantitative (RT-qPCR), notamment la PCR emboîtée (ou PCR nichée,nested PCR), les réactions de PCR peuvent également être multiplexées ; des méthodes de séquençage, de préférence par séquençage haut débit ;
- la quantification de l’expression des gènes cibles est réalisée par RT-PCR, par séquençage ou par hybridation. De préférence, la quantification est réalisée par RT-PCR, et notamment par RT-qPCR ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée par la mise en œuvre d’une méthode de détection et/ou quantification indirecte du transcrit ARNm après transformation de ce dernier en ADN, ou après amplification dudit transcrit ou après amplification de l'ADN obtenu après transformation dudit transcrit ARNm en ADN ;
- l’expression des gènes cibles est normalisée par rapport à l’expression d’un ou plusieurs gènes de ménage, avantageusement par rapport à l’expression d’un des gènes de ménage sélectionné dans le groupe constitué par DECR1, HPRT1, PPIB, GAPDH, ACTB et leurs combinaisons ;
- l’expression des gènes cibles est normalisée par rapport à la combinaison de l’expression des gènes de ménage DECR1, HPRT1 et PPIB ;
- le procédé selon l’invention permet d’identifier le statut immunodéprimé chez un sujet avec une sensibilité d’au moins 70%, et une spécificité d’au moins 80% ;
- le procédé de l’invention comprend, en outre, une étape d'administration d'un traitement, de préférence un traitement immunomodulateur et/ou un traitement anti-inflammatoire, adapté au statut immunitaire de l'individu ;
- le traitement immunostimulant est choisi dans le groupe constitué par des interleukines, en particulier IL-7, IL-15 ou IL-3 ; des facteurs de croissance, en particulier le GM-CSF ; des interférons, en particulier IFNy, des Toll agonistes ; des anticorps, en particulier des anticorps anti-PD1, anti-PDL1, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 ou anti-CTLA4 ; des transferrines et des molécules inhibitrices de l'apoptose ; FLT3L ; Thymosin α1 ; des antagonistes adrénergiques ;
- le traitement anti-inflammatoire est choisi dans le groupe constitué par des glucocorticoïdes, des agents cytostatiques, des molécules agissant sur les immunophilines et les cytokines, des molécules bloquant le récepteur à l'IL-1 et des traitements anti-TNF.
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles TAP2 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles C3AR1 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles C3AR1 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des gènes cibles CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression d’au moins 3 gènes cibles choisis dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression du gène cible TAP2 et d’au moins un autre gène cible choisi parmi C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression du gène cible TAP2 et d’au moins deux autres gènes cibles choisi parmi C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, C3AR1 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, C3AR1 et CD177 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 3 gènes cibles TAP2, CD177 et IL1R2 ;
- l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 4 gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- la valeur de référence correspond à l’expression dudit gène cible chez un sujet présentant un statut immunitaire normal ou un sujet dont on sait que le statut immunitaire n’est pas immunodéprimé ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base d’au moins deux variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base de deux variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base de trois variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de TAP2, une surexpression de C3AR1, une surexpression de CD177, et une surexpression de IL1R2 ;
- le statut immunodéprimé est détecté sur la base d’une sous-expression de TAP2, d’une surexpression de C3AR1, d’une surexpression de CD177, et d’une surexpression de IL1R2 ;
- le procédé de l’invention comprend, en outre, une étape de quantification de l’expression d’au moins un gène cible additionnel sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ; le statut immunodéprimé est alors en outre détecté en tenant compte d’au moins une variation d’au moins un gène cible additionnel, lesdites variations étant choisies parmi une sous-expression de CD3D, une sous-expression de CIITA, une sous-expression de CD74, une sous-expression de CTLA4, une sous-expression de CX3CR1, une surexpression de IFNγ, et une surexpression de S100A9 ;
- le procédé de l’invention comprend une étape de quantification de l’expression de l’ensemble des gènes cibles suivants : TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ;
- le sujet est un patient, notamment un patient gravement malade en état septique, plus particulièrement, en choc septique ; atteint de brûlures, plus particulièrement, de brûlures graves ; atteint de traumatismes, plus particulièrement, de traumatismes graves ; ou opéré par chirurgie, plus particulièrement, une chirurgie lourde ;
- l’échantillon biologique est un échantillon de sang ;
- l’échantillon biologique est un échantillon de sang total ;
- l’échantillon biologique est un échantillon issu d’un patient au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs (USI) ou en unité de soins continus, et de préférence, d’un patient en USI ;
- l'échantillon biologique test et/ou l'échantillon biologique de référence selon l'invention est un échantillon de sang, de préférence un échantillon de sang total, de plasma ou de sérum, ou un échantillon de cellules mononucléées sanguines périphériques, extraites à partir d'un échantillon de sang ;
- la valeur de référence d’un gène cible correspond à l’expression dudit gène cible chez un sujet présentant un statut immunitaire normal défini par une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C ;
- l’expression des gènes cibles est quantifiée au niveau transcrit ARN ou ARN messager (ARNm ) ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée au niveau ADN ou ADN complémentaire (ADNc) ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée par la mise en œuvre d’une méthode de détection moléculaire et/ou quantification directe par tout procédé connu de l'Homme du métier permettant de déterminer la présence d’un transcrit ARNm dans un échantillon telles que des méthodes d'hybridation, de préférence avec une puce d'hybridation, par hybridationin situou parNorthern blot; des méthodes d'amplification, de préférence parReverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(RT-PCR), de préférence encore par RT-PCR quantitative (RT-qPCR), notamment la PCR emboîtée (ou PCR nichée,nested PCR), les réactions de PCR peuvent également être multiplexées ; des méthodes de séquençage, de préférence par séquençage haut débit ;
- la quantification de l’expression des gènes cibles est réalisée par RT-PCR, par séquençage ou par hybridation. De préférence, la quantification est réalisée par RT-PCR, et notamment par RT-qPCR ;
- l’expression des gènes cibles est mesurée par la mise en œuvre d’une méthode de détection et/ou quantification indirecte du transcrit ARNm après transformation de ce dernier en ADN, ou après amplification dudit transcrit ou après amplification de l'ADN obtenu après transformation dudit transcrit ARNm en ADN ;
- l’expression des gènes cibles est normalisée par rapport à l’expression d’un ou plusieurs gènes de ménage, avantageusement par rapport à l’expression d’un des gènes de ménage sélectionné dans le groupe constitué par DECR1, HPRT1, PPIB, GAPDH, ACTB et leurs combinaisons ;
- l’expression des gènes cibles est normalisée par rapport à la combinaison de l’expression des gènes de ménage DECR1, HPRT1 et PPIB ;
- le procédé selon l’invention permet d’identifier le statut immunodéprimé chez un sujet avec une sensibilité d’au moins 70%, et une spécificité d’au moins 80% ;
- le procédé de l’invention comprend, en outre, une étape d'administration d'un traitement, de préférence un traitement immunomodulateur et/ou un traitement anti-inflammatoire, adapté au statut immunitaire de l'individu ;
- le traitement immunostimulant est choisi dans le groupe constitué par des interleukines, en particulier IL-7, IL-15 ou IL-3 ; des facteurs de croissance, en particulier le GM-CSF ; des interférons, en particulier IFNy, des Toll agonistes ; des anticorps, en particulier des anticorps anti-PD1, anti-PDL1, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 ou anti-CTLA4 ; des transferrines et des molécules inhibitrices de l'apoptose ; FLT3L ; Thymosin α1 ; des antagonistes adrénergiques ;
- le traitement anti-inflammatoire est choisi dans le groupe constitué par des glucocorticoïdes, des agents cytostatiques, des molécules agissant sur les immunophilines et les cytokines, des molécules bloquant le récepteur à l'IL-1 et des traitements anti-TNF.
Selon l’invention :
- le gène CD3D (CD3 Delta Subunit Of T-Cell Receptor Complex) code pour une protéine constitutive du complexe récepteur des lymphocytes T/CD3 (complexe TCR/CD3) et est impliquée dans le développement des lymphocytes T et la transduction du signal. La protéine codée par ce gène est la sous-unité delta du complexe CD3 et, avec quatre autres sous-unités CD3, se lie soit au TCR alpha/bêta, soit au TCR gamma/delta pour former le complexe TCR/CD3 à la surface des lymphocytes T. La localisation chromosomique de CD3D est la suivante : chr11:118,338,954-118,342,744 ;
- le gène CIITA (Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator) code pour un transactivateur du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II. La protéine, une fois dans le noyau cellulaire, agirait comme un co-régulateur positif pour la transcription de gènes du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II, un composant majeur de la défense immunitaire. La localisation chromosomique de CIITA est la suivante : chr16:10,866,212-10,943,021 ;
- le gène CD74 (Invariant Polypeptide Of Major Histocompatibility Complex, Class II Antigen-Associated or HLA class II histocompatibility antigen gamma chain) code pour une protéine qui s'associe au complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II et est une protéine chaperon importante qui régule la présentation de l'antigène pour la réponse immunitaire. Il sert également de récepteur de surface cellulaire pour le facteur inhibiteur de la migration des cytokines macrophages (MIF) qui, lorsqu'il est lié à la protéine codée par le gène CD74, initie les voies de survie et la prolifération cellulaire. Cette protéine interagit également avec la protéine précurseur de l'amyloïde (APP pouramyloid precursor protein) et supprime la production du peptide amyloïde bêta ou β-amyloïde. La localisation chromosomique de CD74 est la suivante : chr5:150,400,041-150,412,936 ;
- le gène CTLA4 (ou CTLA-4 ;Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4) fait partie de la superfamille des immunoglobulines et code pour une protéine qui transmet un signal inhibiteur aux lymphocytes T.; La localisation chromosomique de CTLA4 est la suivante : chr2:203,867,771-203,873,965 ;
- le gène CX3CR1 (C-X3-C Motif Chemokine Receptor 1) code le récepteur à la fractalkine (ou CX3CL1). La fractalkine est une protéine transmembranaire et une chimiokine notamment impliquée dans l'adhésion et la migration des leucocytes. La localisation chromosomique de CX3CR1 est la suivante : chr12:8,058,302-8,066,471.
- le gène IFNγ (Interferon γ) code pour une cytokine soluble appartenant à la classe des interférons de type II. La protéine codée est sécrétée par les cellules des systèmes immunitaires inné et adaptatif. La protéine active est un homodimère qui se lie au récepteur de l'interféron gamma qui déclenche une réponse cellulaire aux infections virales et microbiennes. La localisation chromosomique de IFNG est la suivante : chr12:68,154,768-68,159,741; et
- le gène S100A9 (S100 Calcium Binding Protein A9ou MRP14 pourmigration inhibitory factor-related protein 14) code pour une protéine appartenant à la famille S100 de protéines contenant 2 motifs de liaison au calcium en main EF (i.e. un domaine structurel ou un motif hélice-boucle-hélice). La localisation chromosomique de S100A9 est la suivante : chr12:68,154,768-68,159,741.
- le gène CD3D (CD3 Delta Subunit Of T-Cell Receptor Complex) code pour une protéine constitutive du complexe récepteur des lymphocytes T/CD3 (complexe TCR/CD3) et est impliquée dans le développement des lymphocytes T et la transduction du signal. La protéine codée par ce gène est la sous-unité delta du complexe CD3 et, avec quatre autres sous-unités CD3, se lie soit au TCR alpha/bêta, soit au TCR gamma/delta pour former le complexe TCR/CD3 à la surface des lymphocytes T. La localisation chromosomique de CD3D est la suivante : chr11:118,338,954-118,342,744 ;
- le gène CIITA (Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator) code pour un transactivateur du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II. La protéine, une fois dans le noyau cellulaire, agirait comme un co-régulateur positif pour la transcription de gènes du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II, un composant majeur de la défense immunitaire. La localisation chromosomique de CIITA est la suivante : chr16:10,866,212-10,943,021 ;
- le gène CD74 (Invariant Polypeptide Of Major Histocompatibility Complex, Class II Antigen-Associated or HLA class II histocompatibility antigen gamma chain) code pour une protéine qui s'associe au complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II et est une protéine chaperon importante qui régule la présentation de l'antigène pour la réponse immunitaire. Il sert également de récepteur de surface cellulaire pour le facteur inhibiteur de la migration des cytokines macrophages (MIF) qui, lorsqu'il est lié à la protéine codée par le gène CD74, initie les voies de survie et la prolifération cellulaire. Cette protéine interagit également avec la protéine précurseur de l'amyloïde (APP pouramyloid precursor protein) et supprime la production du peptide amyloïde bêta ou β-amyloïde. La localisation chromosomique de CD74 est la suivante : chr5:150,400,041-150,412,936 ;
- le gène CTLA4 (ou CTLA-4 ;Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4) fait partie de la superfamille des immunoglobulines et code pour une protéine qui transmet un signal inhibiteur aux lymphocytes T.; La localisation chromosomique de CTLA4 est la suivante : chr2:203,867,771-203,873,965 ;
- le gène CX3CR1 (C-X3-C Motif Chemokine Receptor 1) code le récepteur à la fractalkine (ou CX3CL1). La fractalkine est une protéine transmembranaire et une chimiokine notamment impliquée dans l'adhésion et la migration des leucocytes. La localisation chromosomique de CX3CR1 est la suivante : chr12:8,058,302-8,066,471.
- le gène IFNγ (Interferon γ) code pour une cytokine soluble appartenant à la classe des interférons de type II. La protéine codée est sécrétée par les cellules des systèmes immunitaires inné et adaptatif. La protéine active est un homodimère qui se lie au récepteur de l'interféron gamma qui déclenche une réponse cellulaire aux infections virales et microbiennes. La localisation chromosomique de IFNG est la suivante : chr12:68,154,768-68,159,741; et
- le gène S100A9 (S100 Calcium Binding Protein A9ou MRP14 pourmigration inhibitory factor-related protein 14) code pour une protéine appartenant à la famille S100 de protéines contenant 2 motifs de liaison au calcium en main EF (i.e. un domaine structurel ou un motif hélice-boucle-hélice). La localisation chromosomique de S100A9 est la suivante : chr12:68,154,768-68,159,741.
Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation pour détecterin vitroouex vivo,un statut immunodéprimé chez un sujet, de la quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ; et la comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression, tel que décrit précédemment. L’utilisation selon l’invention comprend, en outre, une étape de quantification de l’expression d’au moins un autre gène cible sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9.
Un autre objet de la présente invention concerne également un kit pour la mise en œuvre du procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunitaire déprimé chez un sujet, tel que défini précédemment, comprenant des moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2.
De préférence, la présente invention a pour objet un kit pour la mise en œuvre du procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunitaire déprimé chez un sujet, tel que défini présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison :
- ledit kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins 3 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- le kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression des 4 gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- le kit comprend, en outre, des moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins un autre cible gène sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 et leurs combinaisons ;
- le kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression des 11 gènes cibles suivants : TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ;
- les moyens d’amplifications et/ou de détection sont des réactifs spécifiques des produits d’expression desdits gènes cibles choisis parmi les amorces d’amplification ou les sondes d’hybridation ;
- le kit comprend en outre un échantillon biologique test (échantillon contrôle positif) calibré pour contenir les quantités des ARNm des gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 qui correspondent à la quantité ou la concentration représentative du niveau d’expression mesuré dans un pool d’échantillon de sujet présentant un statut immunitaire immunocompétent avec une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C.
- ledit kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins 3 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- le kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression des 4 gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- le kit comprend, en outre, des moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins un autre cible gène sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 et leurs combinaisons ;
- le kit comprend les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression des 11 gènes cibles suivants : TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9 ;
- les moyens d’amplifications et/ou de détection sont des réactifs spécifiques des produits d’expression desdits gènes cibles choisis parmi les amorces d’amplification ou les sondes d’hybridation ;
- le kit comprend en outre un échantillon biologique test (échantillon contrôle positif) calibré pour contenir les quantités des ARNm des gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 qui correspondent à la quantité ou la concentration représentative du niveau d’expression mesuré dans un pool d’échantillon de sujet présentant un statut immunitaire immunocompétent avec une valeur de mHLA-DR supérieure à 5000 AB/C, notamment supérieure à 5500 AB/C, avantageusement supérieure à 6000 AB/C, en particulier supérieure à 6500 AB/C, de préférence supérieure à 7000 AB/C, notamment supérieure à 7500 AB/C, et tout particulièrement par une valeur mHLA-DR supérieure à 8000 AB/C.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un kit tel que décrit précédemment, pour détecterin vitroouex vivoun statut immunitaire déprimé chez un sujet, de préférence un patient , notamment un patient gravement malade en état septique (plus particulièrement, en choc septique), atteint de brûlures (plus particulièrement, de brûlures graves), atteint de traumatismes (plus particulièrement, de traumatismes graves), ou opéré par chirurgie (plus particulièrement, une chirurgie lourde.
Exemple 1 : Détection
ex vivo
d’un statut immunodéprimé chez un sujet par la mise en œuvre du procédé de l’invention
Les patients et les échantillons proviennent de l'étude REALISM, dans laquelle 377 patients gravement malades de différentes étiologies (sepsis, traumatisme, chirurgie élective, brûlures) ont été recrutés, ainsi que 175 volontaires sains. Du sang total périphérique a été prélevé dans des tubes EDTA et dans des tubesPAXgene Blood RNAà différents moments entre l'inclusion dans l'étude et le jour 60 (J60), avec jusqu'à 7 échantillons par patient. Les volontaires sains ont été prélevés une fois.
La détermination du nombre de molécules HLA-DR par monocyte a été réalisée à l'aide de la méthode standardiséeBD Quantibrite(HLA-DR:340827 ; Quantibrite : 340495 ; Becton Dickenson, New Jersey, USA) sur des échantillons de sang EDTA frais, dans les 3h suivant le prélèvement, comme décrit précédemment.
1.3. Quantification de l’expression des gènes cibles
Les échantillonsPAXgeneont été stabilisés pendant au moins 2h après le prélèvement à température ambiante et congelés à -80°C selon les recommandations du fabricant. L'ARN a ensuite été isolé en utilisant le kitMaxwell® HT simplyRNA(AX2420,Promega Corporation,Madison,WI,USA). La concentration d'ARN a été déterminée à l'aide du systèmeQuantiFluor RNA(E3310,Promega) sur le lecteur de microplaquesGloMax® Discover(Promega). L'intégrité de l'ARN a été évaluée à l'aide du kitRNA 6000 Nano(Agilent Technologies,Santa Clara, CA, USA) sur le bioanalyseurAgilent 2100(Agilent Technologies).
Les échantillons ont été testés en utilisant un prototype de poche FilmArray® optimisée pour détecter par nested PCR les gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2, et les gènes cibles additionnels CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9.
La détermination du niveau d'expression des ARNm des gènes cibles a été réalisée sur avec le prototype de poche sur l'instrument FilmArray® Torch (BioFire®, USA), en suivant les recommandations du fabriquant, en injectant 200 ng d'ARN dans ledit prototype de poche. Les résultats des niveaux d’expression sont obtenus de manière automatisée, en moins d’une heure, avant d’être compilés pour être analysés. Les valeurs d'expression normalisées des marqueurs cibles (par rapport aux gènes de références DECR1, HPRT1 et PPIB) ont été calculées et utilisées pour les analyses.
Modèle pour l'identification des échantillons avec mHLA-DR <8,000 AB/C : Tous les échantillons pour lesquels les mesures de mHLA-DR étaient disponibles ont été utilisés dans l'analyse. Les échantillons ont été considérés comme immunodéprimés lorsque la quantification de mHLA-DR est inférieure à 8 000 AB/C, sinon, ces échantillons ont été considérés comme immunocompétents. Les données ont été divisées en un set d’apprentissage contenant 1300 échantillons (70%) et un set de test contenant 541 échantillons (30%). La répartition entre le set d’apprentissage et le set de test était équilibrée en fonction de la distribution des valeurs de mHLA-DR, du moment de l'échantillonnage et de l'étiologie du patient. Un modèle de régressionPLS(Partial Least Square) combinant le niveau d'expression des marqueurs de la poche prototype a été entraîné par validation croisée répétée 20X-5 fois pour la prédiction de mHLA-DR inférieur à 8 000 AB/C. Le suréchantillonnage SMOTE (Synthetic Minority Over-Sampling Technique) a été utilisé pour équilibrer le set d’apprentissage entre les catégories. Le nombre de composantes a été évalué manuellement de 1 jusqu'au maximum possible Les performances du modèle ont été évaluées sur l'ensemble de test en calculant l'aire sous la courbe ROC (AUC), la précision, la sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative.
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel R, version 3.6.2.
Les données du mHLA-DR et de l’expression des gènes cibles étaient toutes deux disponibles pour 1841 échantillons répartis comme suit : 163 échantillons provenant de volontaires sains et 1678 échantillons de patients correspondant à 106 sepsis, 136 traumatismes, 109 chirurgies et 24 brûlures.
Dans l’ensemble, les valeurs mHLA-DR variaient de 439 à 80 066 AB/C, avec 36 % des valeurs inférieures à 8 000 AB/C.
La détection de variations de l’expression des marqueurs du prototype de poche (gènes cibles et additionnels) selon l’invention a été effectuée.
Les données sont représentées par la .
Dans le groupe immunodéprimé, une régulation à la baisse de l’expression de: CD3D, CD74, CIITA, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et TAP2 a été observée; tandis que les marqueurs suivant ont vu leur expression régulée à la hausse: C3AR1, CD177, IL1R2, S100A9.
Les niveaux d’expression normalisés individuels des marqueurs d’ARNm TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2, ainsi que ceux des différentes combinaisons des marqueurs TAP2, C3AR1, CD177, IL1R2, CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3AR1, IFNγ et S100A9 ont été combinés dans un modèle entraîné pour l’identification des patients immunodéprimés (mHLA-DR <8 000 AB/C).
Les données des performances des différentes combinaisons de gènes cibles selon l’invention sont représentées dans le tableau 2.
| Marqueurs | AUC [IC 95%] | Sensibilité | Spécificité | Valeur prédictive négative (VPN) | Valeur prédictive positive (VPP) |
| TAP2 ; C3AR1 | 0,85 (0,82-0,88) |
0,71 | 0,83 | 0,83 | 0,71 |
| TAP2 ; IL1R2 | 0,85 (0,81-0,88) |
0,68 | 0,85 | 0,82 | 0,73 |
| TAP2 ; CD177 | 0,82 (0,78-0,85) |
0,70 | 0,82 | 0,82 | 0,69 |
| C3AR1 ; CD177 | 0,82 (0,79-0,86) |
0,72 | 0,80 | 0,83 | 0,68 |
| C3AR1 ; IL1R2 | 0,82 (0,79-0,86) |
0,65 | 0,82 | 0,80 | 0,68 |
| CD177 ; IL1R2 | 0,82 (0,78-0,85) |
0,71 | 0,79 | 0,82 | 0,66 |
| C3AR1 ; IL1R2 ;TAP2 | 0,86 (0,83-0,89) |
0,73 | 0,83 | 0,84 | 0,71 |
| C3AR1 ; IL1R2 ;CD177 | 0,83 (0,80-0,87) |
0,73 | 0,81 | 0,84 | 0,69 |
| IL1R2 ;CD177 ; TAP2 | 0,84 (0,81-0,88) |
0,71 | 0,81 | 0,82 | 0,69 |
| C3AR1 ; CD177 ; TAP2 | 0,85 (0,81-0,88) |
0,71 | 0,81 | 0,83 | 0,68 |
| C3AR1 ; IL1R2 ; CD177 ; TAP2 | 0,86 (0,83-0,89) |
0,74 | 0,81 | 0,84 | 0,70 |
| Prototype de poche (TAP2 ; C3AR1 ; CD177 ; IL1R2 ; CD3D ; CIITA ; CD74 CTLA4 ; CX3AR1 ; IFNγ ; S100A9) sur set d’apprentissage (n=1300) | 0,87 (0,85-0,89 | 70% | 85% | 84% | 72% |
| Prototype de poche (TAP2 ; C3AR1 ; CD177 ; IL1R2 ; CD3D ; CIITA ; CD74 CTLA4 ; CX3AR1 ; IFNγ ; S100A9) sur set de test (n=541) | 0,86 (0,82-0,89) | 72% | 85% | 84% | 73% |
Le modèle a obtenu de très bonnes performances pour l’identification des patients ayant un statut immunodéprimé, avec une AUC supérieure à 0,82 pour l’ensemble des jeux de gènes testés.
A titre de comparatif, la performance obtenue sur le set de test avec CD74 (qui représente la chaîne invariante γ du HLA-DR) en tant qu’unique substitut du mHLA-DR dans un modèle linéaire généralisé, était plus faible, avec une AUC de 0,77 (IC 95% [0,73-0,81]), démontrant ainsi tout l’intérêt des combinaisons de gènes cibles selon l’invention.
La concordance a été effectuée entre les résultats du mHLA-DR et l’identification avec les gènes cibles sur le set d’apprentissage (n=1300 échantillons ; ) et sur le set de test (n=541 ; ). Les groupes d'échantillons basés sur la valeur mHLA-DR (<8 000 AB/C pour l'immunodépression et ou 8 000 AB/C pour l'immunocompétence) sont représentés à gauche et la prédiction à l'aide du jeu de gènes cibles selon l’invention est représentée à droite. Il apparait que la concordance obtenue dans l’ensemble des échantillons entre le modèle mHLA-DR et les gènes cibles est de 80%, que ce soit sur le set d’apprentissage ou le set de test.
Il apparait clairement que le procédé de l’invention de détectionin vitroouex vivod’un statut immunodéprimé chez un sujet est efficace et apparait comme une excellente alternative à la quantification mHLA-DR, puisque la corrélation des données de la poche prototype et du mHLA-DR montre une similitude dans l’identification des patients immunodéprimés ou immunocompétents.
Plus important encore, le procédé de l’invention présente plusieurs autres avantages. Par exemple, le processus pré-analytique est facilité par la stabilisation de l'ARN du sang total dans le tubePAXgene, ne nécessitant aucune préparation de l'échantillon. En outre, les résultats sont obtenus en une heure, sans manipulation, grâce à sa mise en œuvre sur la plateforme entièrement automatisée telle que leFilmArray®(BioFire®),déjà largement utilisée dans les cliniques pour le diagnostic microbiologique. A minima, le procédé selon l’invention permet ainsi une identification précoce du statut immunodéprimé d’un patient, le temps par exemple qu’il soit possible de réaliser la mesure mHLA-DR.
Malgré une bonne concordance entre les données issues de la quantification mHLA-DR et ceux du procédé de l’invention, quelques échantillons sont mal classés. Cela pourrait être dû à la variabilité intrinsèque des deux techniques. Une autre explication pourrait être les différences de régulation entre une protéine (mHLA-DR) et l'expression de plusieurs marqueurs ARNm. En outre, alors que le HLA-DR est mesuré au niveau cellulaire uniquement dans les monocytes, le procédé de l’invention permet la quantification au niveau ARNm dans le sang total, comprenant les monocytes mais aussi d'autres cellules exprimant HLA-DR (par exemple les lymphocytes B), et capte ainsi d'autres altérations immunitaires, non nécessairement liées à la régulation de mHLA-DR. Cependant, cela n’enlève en rien les avantages du procédé selon l’invention pour l’identification d’un statut immunodéprimé chez un sujet.
Claims (16)
- Procédé de détectionin vitroouex vivod’un statut immunodéprimé chez un sujet, comprenant les étapes suivantes :
- Quantification, dans un échantillon biologique dudit sujet, de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2 ;
- Comparaison de l’expression de chacun des gènes respectivement à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d’une variation de l’expression.
- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étape a) comprend la quantification de l’expression d’au moins 3 gènes cibles choisis dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2.
- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’étape a) comprend la quantification de l’expression du gène cible TAP2 et d’au moins un autre gène cible choisi parmi C3AR1, CD177 et IL1R2.
- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étape a) comprend la quantification de l’expression des 4 gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la valeur de référence correspond à l’expression dudit gène cible chez un sujet présentant un statut immunitaire normal défini par un mHLA-DR supérieur à 5000 AB/C, de préférence, supérieur à 8000 AB/C.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le statut immunodéprimé est détecté sur la base d’au moins deux variations de l’expression, lesdites variations étant choisies parmi :
- une sous-expression de TAP2,
- une surexpression de C3AR1,
- une surexpression de CD177, et
- une surexpression de IL1R2. - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il comprend en outre, une étape de quantification de l’expression d’au moins un autre gène cible sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est un échantillon de sang, de préférence un échantillon de sang total.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est issu d’un patient au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs (USI) ou en unité de soins continus, de préférence, d’un patient en USI.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’expression est mesurée au niveau ARN ou ARN messager.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l’expression est mesurée par RT-PCR, de préférence RT-qPCR, par séquençage ou par hybridation.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’expression est normalisée par rapport à l’expression d’un ou plusieurs gènes de ménage sélectionné dans le groupe constitué par DECR1, HPRT1, PPIB, GAPDH, et ACTB.
- Kit pour la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 comprenant des moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins 2 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2.
- Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce qu’il comprend des moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins 3 gènes cibles sélectionnés dans le groupe constitué par TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2, de préférence, les moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression
des gènes cibles TAP2, C3AR1, CD177 et IL1R2. - Kit selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu’il comprend en outre des moyens d’amplification et/ou des moyens de détection de l’expression d’au moins d’au moins un autre cible gène sélectionné dans le groupe constitué par CD3D, CIITA, CD74, CTLA4, CX3CR1, IFNγ et S100A9.
- Kit selon l’une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que les moyens d’amplifications et/ou de détection sont des réactifs spécifiques des produits d’expression desdits gènes cibles choisis parmi les amorces d’amplification ou les sondes d’hybridation.
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