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KR20240145485A - 세포-표면 수용체의 에피토프 조작 - Google Patents

세포-표면 수용체의 에피토프 조작 Download PDF

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Publication number
KR20240145485A
KR20240145485A KR1020247028868A KR20247028868A KR20240145485A KR 20240145485 A KR20240145485 A KR 20240145485A KR 1020247028868 A KR1020247028868 A KR 1020247028868A KR 20247028868 A KR20247028868 A KR 20247028868A KR 20240145485 A KR20240145485 A KR 20240145485A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
genetically engineered
antibody
flt3
hspcs
Prior art date
Application number
KR1020247028868A
Other languages
English (en)
Inventor
피에트로 제노베제
가브리엘레 카시라티
Original Assignee
다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크., 더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션 filed Critical 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
Publication of KR20240145485A publication Critical patent/KR20240145485A/ko

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Abstract

세포-표면 단백질의 하나 이상의 유전자 편집된 유전자를 갖는 조혈줄기세포와 같은 유전자 조작된 조혈 세포, 및 단독으로 또는 세포-표면 단백질(들)을 표적화하는 면역 요법과 병용하는, 이의 치료적 용도.

Description

세포-표면 수용체의 에피토프 조작
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2022년 2월 18일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/311,707호, 및 2022년 11월 17일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/426,138호의 우선권 유익을 주장하며, 이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
기술분야
면역요법과 병용하여 사용될 수 있는 세포-표면 단백질(즉, 세포독성제, 예컨대, 키메라 항원 수용체 T 세포)의 하나 이상의 유전자 편집된 유전자를 갖는 조혈줄기세포와 같은 유전자 조작된 조혈 세포, 및 이의 치료적 용도가 본 명세서에서 제공된다.
유전자 전달의 혁신으로 인해 암세포 상에서 발현된 표적 분자에 대해 면역 세포를 재프로그래밍이 가능해졌다. 매우 예외적인 결과로 인해 FDA는 B 림프모구성 백혈병의 치료를 위해 CD19 CAR-T 세포로 알려진 최초 입양 세포 면역요법을 승인하게 되었다. 이러한 성공은 종양학 분야에 혁명을 일으키는 것으로 예상되지만, 가장 적합한 후보가 종종 건강한 골수 세포와 공유되어, 면역억제 및 중증의 조혈 독성을 초래하기 때문에 이들의 적용에 방해를 받았다. 항-골수성/줄기세포 CAR-T-유발 독성은 HSCT 전의 제한된 시간 창에서 구제요법(salvage therapy)에 대한, 적용 가능성을 제한하며, 이는 질환 근절에 충분하지 않을 수도 있다. 따라서, 정상 세포 집단을 표적화하거나 해를 끼치는 일 없이 관심 표적 세포, 예를 들어, 암 세포를 효과적으로 표적화하는 충족되지 않은 요구가 남아있다.
본 개시내용은 일반적으로 유전자 조작된 조혈 세포, 예컨대, 세포-표면 단백질의 하나 이상의 유전자 편집된 유전자를 갖는 조혈줄기세포, 및 동일한 세포-표면 단백질을 표적화할 수 있는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자를 포함하는 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)가 제공되되, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 암호화된 단백질이 치료용 항-FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖도록 조작된다. 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 FLT3 유전자의 엑손 9에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자의 엑손 9에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 N399에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, 위치 N399의 돌연변이는 N399D 또는 N399G이다. 실시형태에서, 치료용 항-FLT3 항체는 항-FLT3 클론 4G8 항체이다. 실시형태에서, 치료용 항-FLT3 항체는 4G8 항체와 동일한 6개의 CDR을 갖거나, 4G8 항체와 경쟁하는 항체이다. 실시형태에서, 유전자 조작된 HSPC는 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된다. 실시형태에서, 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9: SpCas9), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus: SaCas9), 라크노스피라세아 박테리움 Cas12a(Lachnospiraceae bacterium Cas12a: LbCas12a) 또는 아시다미노코커스 종 BV3L6(Acidaminococcus sp. BV3L6: AsCas12a) 중 하나이다. 일 실시형태에서, CRISPR 시스템은 SpCas9를 포함한다. 실시형태에서, 가이드 핵산은 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, CRISPR 시스템은 주형 DNA를 더 포함한다. 실시형태에서, 주형 DNA는 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제이다. 실시형태에서, 뉴클레오타이드 데아미나제는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나이다. 다른 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함한다. 실시형태에서, 가이드 RNA는 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 서열번호 51 또는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 또한 위에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 HSPC를 포함하는 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단이 제공된다. 일부 실시형태에서, 조혈 악성종양을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 위에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단, 및 (b) 항- FLT3 항체 결합 도메인 또는 상기 항-FLT3 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 1종의 제제는 항-FLT3 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함한다. 실시형태에서, 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL)이다. 실시형태에서, 상기 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.
또한 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자를 포함하는 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)가 제공되되, 유전자 조작된 CD123 유전자는 암호화된 단백질이 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖도록 조작된다. 실시형태에서, 치료용 항-CD123 항체는 클론 7G3 항체 또는 이의 인간화된 상대 CSL362이다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자는 CD123 유전자의 엑손 2에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 2에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 S59에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, S59에서의 돌연변이는 S59P 또는 S59F이다. 실시형태에서, 치료용 항-CD123 항체는 항-CD123 클론 6H6 항체 또는 항-CD123 클론 S18016F 항체이다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자는 CD123 유전자의 엑손 3에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 3에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 P88에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, P88에서의 돌연변이는 P88L 또는 P88S이다. 실시형태에서, 유전자 조작된 HSPC는 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된다. 실시형태에서, 가이드 핵산은 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자는 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57 또는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 또한 위에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 HSPC를 포함하는 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단이 본 명세서에서 제공된다. 또한 조혈 악성종양을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 위에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단, 및 (b) 항-CD123 항체 결합 도메인 또는 상기 항-CD123 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 1종의 제제는 항-CD123 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함한다. 실시형태에서, 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN)이다. 실시형태에서, 상기 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.
일부 실시형태에서, (i) 유전자 조작된 FLT3 유전자로서, 치료용 항-FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 유전자 조작된 FLT3 유전자, 및 (ii) 유전자 조작된 CD123 유전자로서, 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 유전자 조작된 CD123 유전자를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단이 제공된다. 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 FLT3 유전자의 엑손 9에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자의 엑손 9에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 N399에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자는 CD123 유전자의 엑손 2에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 2에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 S59에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, 치료용 항-FLT3 항체는 항-FLT3 클론 4G8 항체이다. 실시형태에서, 치료용 항-CD123 항체는 항-CD123 클론 7G3 항체 또는 CSL362 항체이다. 실시형태에서, HSPC의 집단은 적어도 2개의 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된다. 실시형태에서, 적어도 2개의 가이드 핵산은 1) 서열번호 18 또는 서열번호 20 및 2) 서열번호 서열번호 24 또는 서열번호 27이다. 실시형태에서, 적어도 2개의 가이드 핵산은 서열번호 20 및 서열번호 27이다. 실시형태에서, 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함한다. 또한 조혈 악성종양을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 위에 기재된 바와 같은 HSPC의 집단, 및 (b) (1) 항-FLT3 항체 결합 도메인 또는 상기 항-FLT3 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 및/또는 (2) 항-CD123 항체 결합 도메인 또는 상기 항-CD123 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 1종의 제제는 항-FLT3 항체 결합 도메인 및/또는 항-CD123 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함한다. 실시형태에서, 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN)이다. 실시형태에서, 상기 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.
또한 실시형태에서, 유전자 조작된 KIT 유전자를 포함하는 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)가 제공되되, 유전자 조작된 KIT 유전자는 암호화된 단백질이 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖도록 조작된다. 실시형태에서, 유전자 조작된 KIT 유전자는 KIT 유전자의 엑손 7에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 KIT 유전자의 엑손 7에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 H378에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, 위치 H378의 돌연변이는 H378R이다. 실시형태에서, 치료용 항-KIT 항체는 항-KIT 클론 Fab79D 항체이다. 실시형태에서, 유전자 조작된 HSPC는 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된다. 실시형태에서, 가이드 핵산은 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함한다. 또한 위에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 HSPC를 포함하는 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단이 제공된다. 또한 조혈 악성종양을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 위에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단, 및 (b) 항-KIT 항체 결합 도메인 또는 상기 항-KIT 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 1종의 제제는 항-KIT 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함한다. 실시형태에서, 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 T 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL)이다. 실시형태에서, 상기 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.
또한, 일부 실시형태에서, (i) 유전자 조작된 KIT 유전자로서, 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 유전자 조작된 KIT 유전자, 및 (ii) 유전자 조작된 CD123 유전자로서, 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 유전자 조작된 CD123 유전자를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단이 제공된다. 실시형태에서, 유전자 조작된 KIT 유전자는 KIT 유전자의 엑손 7에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 KIT 유전자의 엑손 7에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 H378에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자는 CD123 유전자의 엑손 2에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 2에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 S59에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, 치료용 항-KIT 항체는 항-KIT 클론 Fab79D 항체이다. 실시형태에서, 치료용 항-CD123 항체는 항-CD123 클론 7G3 항체 또는 CSL362 항체이다. 실시형태에서, HSPC의 집단은 적어도 2개의 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된다. 실시형태에서, 적어도 2개의 가이드 핵산은 1) 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38 또는 서열번호 39 및 2) 서열번호 24 또는 서열번호 27이다. 실시형태에서, 적어도 2개의 가이드 핵산은 서열번호 37 및 서열번호 27이다. 실시형태에서, 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함한다. 또한 조혈 악성종양을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 위에 기재된 바와 같은 HSPC의 집단, 및 (b) (1) 항-KIT 항체 결합 도메인 또는 상기 항-KIT 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 및/또는 (2) 항-CD123 항체 결합 도메인 또는 상기 항-CD123 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 1종의 제제는 항-KIT 항체 결합 도메인 및/또는 항-CD123 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함한다. 실시형태에서, 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN)이다. 실시형태에서, 상기 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.
또한, 본 명세서에서, (i) 유전자 조작된 FLT3 유전자로서, 치료용 항-FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 유전자 조작된 FLT3 유전자, 및 (ii) 유전자 조작된 KIT 유전자로서, 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 유전자 조작된 KIT 유전자를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단이 제공된다. 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 FLT3 유전자의 엑손 9에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자의 엑손 9에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 N399에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 KIT 유전자는 KIT 유전자의 엑손 7에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 유전자 조작된 KIT 유전자의 엑손 7에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 H378에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 실시형태에서, 치료용 항-FLT3 항체는 항-FLT3 클론 4G8 항체이다. 실시형태에서, 치료용 항-KIT 항체는 항-KIT 클론 Fab79D 항체이다. 실시형태에서, HSPC의 집단은 적어도 2개의 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된다. 실시형태에서, 적어도 2개의 가이드 핵산은 1) 서열번호 18 또는 서열번호 20 및 2) 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38 또는 서열번호 39이다. 실시형태에서, 적어도 2개의 가이드 핵산은 서열번호 20 및 서열번호 37이다. 실시형태에서, 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제이다. 실시형태에서, 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9이다. 실시형태에서, 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함한다. 또한 조혈 악성종양을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 위에 기재된 바와 같은 HSPC의 집단, 및 (b) (1) 항-FLT3 항체 결합 도메인 또는 상기 항-FLT3 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 및/또는 (2) 항-KIT 항체 결합 도메인 또는 상기 항-KIT 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 1종의 제제는 항-FLT3 항체 결합 도메인 및/또는 항-KIT 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함한다. 실시형태에서, 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN)이다. 실시형태에서, 상기 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.
또는 (a) 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 에피토프 결합 단편, (b) 힌지 도메인, (c) 막관통 도메인, (d) 공자극 도메인 및 (e) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공되되, 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3, CD123 및/또는 KIT로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3이고, CAR은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 서열번호 73으로부터의 하나 이상의 에피토프 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: GYTFTSYWMH(서열번호 96), EIDPSDSYKDYNQKFK(서열번호 97), RAITTTPFDF(서열번호 98), RASQSISNNLH(서열번호 99), YASQSIS(서열번호 100) 및 QQSNTWPYT(서열번호 101). 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, CAR은 서열번호 75, 서열번호 86 또는 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 서열번호 75, 서열번호 86, 또는 서열번호 87로부터의 하나 이상의 에피토프 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: GYSFTDYYMK(서열번호 104), DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), ARSHLLRASWFAY(서열번호 106), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109). 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109). 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 KIT이고, CAR은 서열번호 69 또는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 KIT이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 서열번호 69 또는 서열번호 71로부터의 하나 이상의 에피토프 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 KIT이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: GFNISVYMMH(서열번호 88), SIYPYSGYTYYADSVKG(서열번호 89), ARYVYHALDY(서열번호 90), RASQRGLRNVAVA(서열번호 91), SASSLYS(서열번호 92) 및 QQWAVHSLIT(서열번호 93). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3 및 CD123이고, CAR은 서열번호 77 또는 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3 및 CD123이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 서열번호 77 또는 서열번호 79로부터의 하나 이상의 에피토프 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3 및 CD123이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: GYTFTSYWMH(서열번호 96), EIDPSDSYKDYNQKFK(서열번호 97), RAITTTPFDF(서열번호 98), RASQSISNNLH(서열번호 99), YASQSIS(서열번호 100), QQSNTWPYT(서열번호 101), GYSFTDYYMK(서열번호 104), DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), ARSHLLRASWFAY(서열번호 106), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109). 위에 기재된 임의의 CAR의 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지, IgG4 힌지 또는 CD8α 힌지이다. 위에 기재된 임의의 CAR의 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28 TM, CD8α TM 또는 4-1BB TM이다. 위에 기재된 임의의 CAR의 일부 실시형태에서, 공자극 도메인은 CD28z, 4-1BB, ICOS 또는 OX40이다. 위에 기재된 임의의 CAR의 일부 실시형태에서, 세포질 신호전달 도메인은 CD3z이다.
또한 임의의 위에 기재된 CAR을 발현시키는 세포가 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T-세포이다.
또한 조혈 악성종양을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되며, 상기 방법은 (a) 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단(예컨대, 임의의 위에 기재된 것), 및 (b) 임의의 위에 기재된 CAR을 발현시키는 세포(예컨대, 면역 세포)를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한 서열번호 51에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 N399D에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항- FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 서열번호 52에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 N399G에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항- FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 서열번호 54에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 S59P에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 서열번호 55에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 Y58H 및 S59P에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 서열번호 56에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 S59F에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 서열번호 57에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 P88S에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 서열번호 58에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 P88L에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 서열번호 67에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 F316S, M318V, I319K, V323I, I334V, E360K, P363V, E366D, E376Q 및 H378R에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 서열번호 68에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 H378R에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다.
또한 임의의 위에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 본 명세서에서 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 물질은 본 발명에서 사용하기 위해 본 명세서에 기재되며; 당업계에 알려진 다른, 적합한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며 제한하는 것으로 의도되지는 않는다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리 및 기타 언급된 참고문헌은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서로 조절할 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 도면으로부터 그리고 청구범위로부터 자명하게 될 것이다.
도 1은 FLT3 또는 KIT와 같은 유전자에 의해 암호화된 사이토카인 수용체 구조의 도시이다. 도 1(좌)은 세포외 도메인 상에 돌연변이를 도입함으로써 치료 항체의 결합을 제거하는 에피토프 조작 접근을 예시한다. 도 1(우)은 에피토프 조작된 표면 단백질의 주요 특징: 리간드 친화도, 단백질 기능 및 세포내 신호 전달의 보존과 함께 항체 인식의 상실을 나타낸다.
도 2는, 좌측에, 상이한 항체 클론에 의해 이러한 변이체의 인식을 평가하거나 유세포분석에 의해 리간드 친화도를 측정하기 위해, 인간 또는 뮤린 세포주에서 목적하는 수용체 변이체의 cDNA 서열을 도입하도록, 전달 벡터 설계를 포함하는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(sleeping beauty transposase) 실험의 개략도를 도시한다. Lonza 4D-Nucleofector를 사용하여 100ng 전달 플라스미드 및 500ng pSB100x 트랜스포사제로 K562 세포를 전기천공하였다. 도 2는, 우측에, 인간 야생형 FLT3 (hFLT3), 뮤린 FLT3(mFLT3) 및 세포외 도메인 4 내에서 아미노산 치환을 보유하는 에피토프 변형 변이체인 eFLT3-01과 함께 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 형질도입된 K562 세포의 유세포분석 플롯을 도시한다. 형질도입된 세포는 mCherry 형광(y 축)에 의해 식별된다. 세포를 FLT3 BV10A4 클론(대조군 항체, 결합 ECD2), FLT3 4G8 치료용 클론(결합 ECD4), 항-뮤린 FLT3 항체 및 AF488-접합체 인간 FLT3L 중 하나와 함께 염색하여 결합 친화도를 평가하였다.
도 3은, 상단에, 인간 FLT3 세포외 도메인 4와 여러 동물 종 오솔로그 유전자의 서열 정렬을 도시한다. 검정색 직사각형은 eFLT3-01에서 돌연변이되고 도 5에 나타낸 조합 라이브러리에 포함된 덜 보존된 잔기를 강조한다. 도 3은, 하단에, 인간 KIT 세포외 도메인 4와 여러 동물 종 오솔로그 유전자의 서열 정렬을 도시한다. 검정색 직사각형은 eKIT-01에서 돌연변이되고 클론 Fab79D에 의해 결합된 에피토프에 기여하는 것으로 예측된 덜 보존된 잔기를 강조한다.
도 4A는 대조군 항체(클론 BV10A4) 및 치료용 항체(클론 4G8)와 함께 슬리핑-뷰티 형질도입 K562 세포의 공동 염색을 나타내는 유세포분석 플롯이다. eFLT3-01 변이체 과발현은 4G8 클론에 의한 인식의 결여를 나타내는 한편, 야생형 FLT3은 치료적 그리고 대조군 Ab 모두에 의해 결합된다.
도 4B는 슬리핑-뷰티 형질도입 K562 세포에 의한 형광 FLT3-리간드 결합을 나타내는 유세포분석 플롯이다. 세포를 ECD2를 인식하는 대조군 항체 BV10A4 및 AF488-접합 인간 FLT3L과 함께 인큐베이션시켰다. 대조군 항체와 AF488-접합 인간 FLT3L 사이의 MFI 비는 플롯에서 보고된다. eFLT3-01 변이체는 야생형 FLT3로서 비슷한 리간드 결합 친화도를 입증한다.
도 4C는 슬리핑-뷰티 형질도입된 K562 세포 단백질 추출물의 웨스턴 블롯이다. 세포는 16시간 동안 혈청을 결핍시키고, FLT3L 100ng/㎖로 자극하거나 또는 비자극하였고, 용해시켜 단백질 추출물을 얻었다. K562(비형질도입), 야생형 FLT3을 과발현시키는 K562 및 eFLT3-01을 과발현시키는 K562를 FLT3 세포외 도메인, 포스포-FLT3 Y589-591 또는 액틴(대조군)을 인식하는 항체로 프로빙하였다. eFLT3-01 변이체는 야생형 FLT3과 유사한 FLT3L 자극에 반응하여 키나제 도메인 인산화를 나타낸다.
도 5(상단 좌측)는 슬리핑 뷰티 플라스미드에서 클로닝된 FLT3 조합 라이브러리의 설계를 나타낸다. 도 5(하단 좌측)는 대조군 항체(클론 BV10A4) 및 치료용 항체(클론 4G8)와 함께 염색한 야생형 FLT3 또는 FLT3 조합 라이브러리에 의해 형질도입된 K562 세포의 유세포분석 플롯을 나타낸다. 분류된 단일 양성 및 이중 양성 세포의 NGS 서열분석은 분류된 단일 양성 샘플에서만 N399D 돌연변이의 존재를 강조하였다. 도 5(우측)는 슬리핑 뷰티 형질도입을 통해 K562 세포에서 과발현된 FLT3 N399D 돌연변이의 검증이다. BV10A4 및 4G8 클론과의 공동 염색은 후자에 의한 결합의 결여를 나타내는 한편, 리간드 친화도는 AF488-접합 FLT3L에 의해 평가된 바와 같이 보존된다.
도 6A는 대조군 항체(클론 104D2) 및 치료용 항체(클론 Fab79D)와 함께 슬리핑-뷰티 형질도입 NIH3T3 세포의 공동 염색을 나타내는 유세포분석 플롯이다. eKIT-01 변이체 과발현은 Fab79D 클론에 의한 인식의 결여를 나타내는 한편, 야생형 KIT는 치료적 그리고 대조군 Ab 모두에 의해 결합된다.
도 6B는 슬리핑-뷰티 형질도입 NIH3T3 세포에 의한 형광 SCF 결합을 나타내는 유세포분석 플롯이다. 세포를 AF488-접합 인간 SCF 및 대조군 항체 104D2와 함께 인큐베이션시켰다. 대조군 항체와 AF488-접합 인간 SCF 사이의 MFI 비를 플롯에서 보고한다. eKIT-01 변이체는 야생형 KIT로서 비슷한 리간드 결합 친화도를 입증한다.
도 6C는 슬리핑-뷰티 형질도입된 NIH3T3 세포 단백질 추출물의 웨스턴 블롯이다. 세포는 16시간 동안 혈청을 결핍시키고, SCF 100ng/㎖로 자극하거나 또는 비자극하였고, 용해시켜 단백질 추출물을 얻었다. NIH3T3(비형질도입), 야생형 KIT를 과발현시키는 NIH3T3 및 eKIT-01을 과발현시키는 NIH3T3을 KIT 세포외 도메인, 포스포-KIT Y719 또는 액틴(대조군)을 인식하는 항체로 프로빙하였다. eKIT-01 변이체는 야생형 KIT와 유사한 SCF 자극에 반응하여 키나제 도메인 인산화를 나타낸다.
도 6D는 야생형 KIT에 추가로 여러 돌연변이된 KIT 변이체를 이용하는 슬리핑-뷰티 시스템에 의해 형질도입된 HEK-293T 세포의 유세포분석 플롯을 보고한다. 표면 발현을 보존하면서 Fab79D 결합을 제거하기 위한 최고의 후보 돌연변이를 확인하기 위해 세포를 대조군 항체(클론 104D2) 및 치료용 항체(Fab79D)와 함께 염색하였다.
도 7, 상단 좌측은 클론 Fab79D의 에피토프를 맵핑하기 위해 수행한 KIT 세포외 도메인 4 축중 라이브러리 선별을 위한 실험 설계이다. ECD 4 내의 각 아미노산 잔기는 완전히 축중된 코돈(NNN)으로 치환되어 임의의 아미노산 치환을 가능하게 하고, 형질도입 세포에 대한 공동 발현 마커로서 mTagBFP2를 이용하여 슬리핑 뷰티 플라스미드에서 클로닝시켰다. 라이브러리를 HEK-293T 세포에서 전기천공시켰다. 도 7, 하단 좌측은 NGS 서열분석을 위한 단일 양성 세포(KIT 대조군 항체 클론 104D2의 경우)를 단리시키기 위한 KIT 세포외 도메인 4 축중 라이브러리의 FACS 분류를 위한 게이팅 전략이다. 도 7은, 우측에서, 세포외 도메인 4 라이브러리 영역 내의 각 아미노산 위치를 열(column)로서 포함하며, 단일 양성 대 이중 양성 FACS-분류 및 서열분석된 세포에서 풍부한 아미노산 치환을 포함하는 히트맵 매트릭스를 도시한다. 가장 빈번하게 돌연변이된 아미노산 위치는 Fab79D 에피토프 인식에 참여하는 잔기를 나타낸다(플롯의 상부 부분 상에 보고됨).
도 8은 CRISPR-Cas9 또는 Cas12a 상동 유도 수선(homology directed repair)에 의해 매개되는 FLT3 및 IL3RA(CD123) 판독 프레임 상류의 표적화된 EF1-알파 프로모터 삽입을 위한 실험 레이아웃이다. 본 실험은 비변형 K562 세포는 유전자 중 하나를 발현시키지 않기 때문에, 유세포분석에 의한 편집 결과의 향상되고 더 빠른 평가를 가능하게 하기 위해 리포터 세포주를 생성하도록 수행하였다. 이를 내인성 좌위로부터 과발현시키기 위해 동일한 전략을 KIT 유전자에 적용하였다. FLT3 또는 IL3RA 프로모터 영역에 대해 상동성 아암을 갖는 dsDNA 공여자 주형과 함께 RNP 복합체를 이용하여 K562를 전기천공하였다. 이어서, 목적하는 유전자를 발현시키는 세포를 FACS 분류하고, 단일 세포-클로닝하고, 선별하여 가장 높은 발현을 갖는 클론을 식별하였다.
도 9는 CD123 N-말단 도메인 상의 항-CD123 클론 7G3 에피토프의 맵핑이다. 각각의 아미노산 위치를 알라닌 또는 진화적으로 보존된 아미노산 중 하나로 치환하였고, 7G3 결합을 위해 선별하였다. 백색 정사각형은 7G3 결합에 영향을 갖지 않는 잔기를 식별하는 한편, 점진적으로 더 어두운 회색 정사각형은 클론 7G3 결합의 25-50-75% 상실과 관련된다. 유사하게, 도 9의 하단 부분은 CD123 상의 IL3에 대한 결합 부위를 나타낸다.
도 10A는 CD123 표면 발현을 보존하면서 클론 7G3 결합을 제거할 수 있는 gRNA 및 돌연변이를 식별하기 위해 염기 편집 선별 실험에서 사용한 IL3RA 엑손 2 및 3에 관한 여러 sgRNA의 위치를 나타낸다. 각각의 sgRNA와 관련된 Cas 단백질의 유형을 범례에서 보고한다.
도 10B는 상이한 sgRNA 및 염기 편집기 쌍(각 플롯의 상단 및 좌측에 나타냄)에 의해 편집된 내인성 좌위로부터의 CD123을 발현시키는 K562 리포터 세포의 대표적인 유세포분석 플롯을 나타낸다. 세포를 대조군 항체, CD123 클론 9F5, 및 3개의 상이한 치료용 항체, CD123 클론 7G3, 6H6 및 S18016F와 함께 염색한다. 세포에 전기천공된 sgRNA 및 플라스미드 용량을 도면에 보고한다.
도 11은 여러 sgRNA - 염기 편집기 쌍을 이용하여 편집한 CD123 리포터 세포에 대한 염기 편집 선별 실험이다(각각 플롯의 좌측 또는 상단에서 보고됨). 세포를 Lonza 4D-Nucleofector를 이용하여 360p㏖의 sgRNA 및 500ng의 염기 편집기 플라스미드로 전기천공하였고 72시간 후에 유세포분석에 의해 평가하였다. 세포를 대조군 항체, CD123 클론 9F5, 및 3개의 상이한 치료용 항체, CD123 클론 7G3과 함께 염색한다.
도 12A는 FLT3 4G8 CAR 및 절단된 EGFR 형질도입(LV) 마커/안전성 스위치를 암호화하는 렌티바이러스 벡터의 설계를 보고한다. 제3 세대 LV 벡터를 생성하였고, CD3-CD28 Dynabeads를 이용한 2 내지 3일의 자극으로 신선한 PBMC-유래 T 세포를 형질도입하였고, IL7 및 IL15를 함유하는 배지에서 14일 동안 배양시켰다. 공동 배양 사멸 실험을 위해, FLT3 없음, 야생형 FLT3 또는 FLT3의 에피토프 조작 변이체 중 하나를 발현시키는 K562 세포를 상이한 효과기:표적비(ET)에서 4G8-CAR T 세포 또는 비형질도입(UT) T 세포와 함께 96-웰 플레이트에서 플레이팅하였다.
도 12B(상단 행)는 대조군 항체(클론 BV10A4) 및 치료용 항체(클론 4G8)와 함께 공동 염색함으로써 FLT3의 발현을 나타내는 플레이팅된 K562 세포의 유세포분석 플롯이다. 도 12B(중간 및 하단 행)는 플레이팅 후 4 및 48시간에 공동 배양 사멸 실험으로부터의 생세포(LiveDead yellow- AnnexinV-)의 유세포분석 플롯이다. 효과기 세포를 CellTrace 형광 또는 CD4/CD8 발현에 의해 식별하는 한편, 표적 세포는 CellTrace 및 CD4/CD8-음성 및 FSC-A high이다.
도 12C는 모든 시험 조건에서 4시간에 살아있는 표적 세포(LiveDead- AnnexinV-)의 백분율을 나타내는 플롯이다.
도 12D는 표적 세포와 함께 공동 배양 동안 탈과립화의 마커로서 4시간에 T 림프구에 대한 CD107a 표면 염색을 나타내는 플롯이다.
도 12E는 염료-희석에 의한 T 세포 증식을 평가하기 위해 표적 세포와 함께 공동 배양 후 48시간에 CellTrace yellow MFI를 보고하는 플롯이다.
도 13A는 CRISPR-Cas 상동 유도 수선(HDR) 편집 전략을 위한 FLT3 엑손 9에 대한 3개의 gRNA의 위치를 나타내는 개략도이다. 2개의 gRNA를 AsCas12a와 조합하여 사용하도록 설계하고, 1개는 SpCas9 뉴클레아제와 조합하여 사용하도록 설계한다. 단일 가닥 올리고-데옥시뉴클레오타이드는 (ssODN)이고, 주형 공여자로서 사용하고, 4개의 상이한 변이체의 설계를 보고한다. ssODN 서열 내의 검정색 정사각형은 야생형 서열과 상이한 돌연변이된 코돈을 식별한다(HDR 매개 수선 후에 Cas 뉴클레아제 재절단 비율을 감소시키기 위해 추가 돌연변이를 포함한다). 각각의 ssODN의 역보체를 또한 시험하였다.
도 13B는 도 13A에 보고된 gRNA 및 ssODN을 사용하여 FLT3을 발현시키는 리포터 K562 세포에서 수행한 CRISPR-Cas HDR 편집 편집 세포의 결과를 보고하는 유세포분석 플롯이다. 세포를 대조군 항체(클론 BV10A4) 및 치료용 항체(클론 4G8)와 함께 공동 염색하였다. 검정색 정사각형은 편집된 세포를 강조한다.
도 14A는 아데닌 염기 편집기(ABE)와 조합하여 사용되는 FLT3 엑손 9 및 N399 코돈에 대한 2개의 sgRNA의 위치를 나타내는 개략도이다.
도 14B는 N399 코돈 및 PAM 서열과 관련된 각 gRNA의 서열을 보고한다.
도 14C는 대안의 PAM 서열과 함께 사용을 가능하게 하는 돌연변이된 Cas9를 갖는 3개의 아데닌 염기 편집기 변이체의 개략도이다.
도 14D는 도 14A 및 도 14B에서 도시된 sgRNA 및 도 14C에서 보고된 ABE를 이용한 FLT3-발현 K562 리포터 세포 상의 염기 편집 실험 결과를 나타내는 유세포분석 플롯이다. 세포를 대조군 항체(클론 BV10A4) 및 치료용 항체(클론 4G8)와 함께 공동 염색하였다. 각 플롯은 편집된 세포에 대한 게이팅 및 편집된 세포의 백분율을 보고한다.
도 15A는 N399D 돌연변이를 도입하기 위해 아데닌 염기 편집기(ABE)와 조합하여 사용되는 FLT3 엑손 9 및 N399 코돈에 대한 5개의 sgRNA의 위치를 나타내는 개략도이다. 범례는 각 sgRNA에 대한 상이한 PAM 및 SpCas9 필요요건을 나타낸다.
도 15B는 N399 코돈 및 PAM 서열과 관련된 각 gRNA의 서열을 보고한다.
도 15C는 도 15A 및 도 15B에 도시된 sgRNA 및 2개의 아데닌 염기 편집기, 즉, NG-ABE8e 및 SpRY-ABE8e-V106W 3xNLS를 이용한 FLT3-발현 K562 리포터 세포 상에서의 염기 편집 실험 결과를 나타내는 유세포 분석 플롯이다. 세포를 대조군 항체(클론 BV10A4) 및 치료용 항체(클론 4G8)와 함께 공동 염색하였다. 각 플롯은 편집된 세포에 대한 게이팅 및 편집된 세포의 백분율을 보고한다.
도 16A는 슬리핑 뷰티 형질도입에 의한 상이한 FLT3 변이체를 과발현시키고 항-FLT3 대조군 항체(클론 BV10A4) 및 AF488-접합 인간 FLT3L과 함께 공동염색한 FLT3 리포터 K562 세포의 유세포분석 플롯이다. 이중 양성 집단의 기울기는 FLT3L 친화도와 비례한다(FLT3 대조군 항체와 FLT3L 염색 사이의 MFI 비를 각 플롯에서 보고함).
도 16B는 야생형 FLT3과 비교되는 FLT3 대조군 항체와 AF488-접합 FLT3L 염색 사이의 MFI 비의 분포를 나타내는 히스토그램이다(회색 오버레이).
도 17A는 인간 CD34+ 세포의 편집을 위해 염기 편집기 mRNA를 생성하도록 맞춤 클로닝된 pmRNA 플라스미드의 설계를 나타낸다.
도 17B는 BE mRNA를 생성하기 위해 사용된 시험관내 전사 프로토콜에 대한 작업 흐름도를 기재한다.
도 17C는 시험관내 전사된 SpRY-ABE8e-V106W mRNA의 Agilent Fragment Analyzer 프로파일이다. x축은 뉴클레오타이드 크기이고, y축은 상대 형광 단위(relative fluorescence unit: RFU) 신호이다.
도 18, 패널 A는 도 15(패널 B)에 도시된 FLT3-18-NRN sgRNA 및 IVT 아데닌 염기 편집기 mRNA(SpRY-ABE8e-V106W 3xNLS)를 이용하는 FLT3-발현 K562 리포터 세포 상의 염기 편집 실험 결과를 나타내는 유세포분석 플롯이다. 세포를 대조군 항체(클론 BV10A4) 및 치료용 항체(클론 4G8)와 함께 공동 염색하였다. 각 플롯은 편집된 세포에 대한 게이팅 및 편집된 세포의 백분율을 보고한다. 상이한 mRNA 및 sgRNA 용량을 이용하여 실험을 수행하였다(각각 플롯의 상단 및 좌측에 보고됨). 도 18B는 유세포분석에 의한 mRNA, gRNA와 편집 효율 사이의 용량-효과 상관관계를 도시하는 도트 플롯이다. 도 18(패널 C)은 편집 후 mRNA, gRNA와 세포 생존도 사이의 용량-효과 상관관계를 도시하는 도트 플롯이다.
도 19A는 FLT3-리포터 K562 세포 상에서 수행된(도 18와 동일), 상이한 mRNA 및 sgRNA 용량을 이용하는 FLT3-18-NRN sgRNA의 각 아데닌 염기 위치에서의 편집 효율을 보고하는 히트맵이다. gRNA 서열 및 예상된 편집 창은 히트맵 상단에서 보고된다.
도 19B는 gDNA 서열분석에 의한 mRNA, gRNA와 편집 효율 사이의 용량-효과 상관관계를 도시하는 도트 플롯이다(A6 및 A7 염기 위치 상의 편집만이 보고됨).
도 20A는 IVT mRNA 및 FLT3-18-NRN sgRNA를 사용하는 인간 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ HSPC 상의 FLT3 염기 편집 실험의 실험 설계이다. 배양 배지의 조성물은 우측에 보고되는 한편, 시각표는 유세포분석 및 gDNA 수집을 위한 시점을 보고한다.
도 20B는 배양된 CD34+ HSPC의 줄기세포 표현형의 유세포분석 평가를 위한 게이팅 전략을 보고한다.
도 20C는 편집 후 0일, 3일 및 6일차에 배양된 CD34+ HSPC의 배수 확장을 보고하는 막대 플롯이다.
도 20D는 유세포분석에 의한 편집 후 3일 및 6일차에 배양된 CD34+ HSPC의 조성물을 나타내는 막대 플롯이다(게이팅은 도 20B에서 보고됨).
도 21A는 (좌측에서 보고되는) 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ HSPC 상에서 수행된(도 20과 동일), 상이한 mRNA 및 sgRNA 용량에 따른 FLT3-18-NRN sgRNA의 각 아데닌 염기 위치에서의 편집 효율을 보고하는 히트맵이다.
도 21B는 CD34+ HSPC 상의 gDNA 서열분석에 의한 mRNA, gRNA와 편집 효율 사이의 용량-효과 상관관계를 도시하는 도트 플롯이다.
도 22A는 표적 세포가 비변형 또는 염기 편집된 FLT3 발현 K562 세포 중 하나인 CAR-T 공동 배양 사멸 분석을 나타내는 유세포분석 플롯이다. 표적 세포를 상이한 효과기:표적비로 4G8-CAR T 세포 또는 비형질도입 T 세포와 함께 플레이팅하고(상단에 보고), 6시간에 유세포분석에 의해 평가하였다. 생세포(AnnexinV-LiveDead yellow-)를 플롯팅하고, 상대 %를 보고한다.
도 22B는 공동 배양 후 6시간에 각각의 E:T 비에서의 표적 세포의 생존도(AnnexinV-LiveDead yellow-)를 보고한다.
도 22C는 공동 배양 후 6시간에 각각의 E:T 비에서의 CD107a 표면 염색에 의한 T 세포의 탈과립화를 보고한다.
도 23A는 표적 세포가 비변형 또는 기 편집된 인간 CD34+ HSPC(편집 효율 46%) 중 하나인 CAR-T 공동 배양 사멸 분석을 나타내는 유세포분석 플롯이다. 표적 세포를 상이한 효과기:표적비로 4G8-CAR T 세포 또는 비형질도입 T 세포와 함께 플레이팅하고(상단에 보고), 48시간에 유세포분석에 의해 평가하였다.
도 23B는 48시간에 4G8 CAR-T 세포에 의한 CD34+ 세포의 특이적 사멸을 보고한다.
도 23C는 48시간에 4G8 CAR-T 세포에 의한 CD34+CD90+ 줄기-세포 풍부 서브세트의 특이적 사멸을 보고한다.
도 24A는 4G8 CAR-T 세포에 대한 FLT3-에피토프 조작된 CD34+ HSPC의 저항성을 평가하기 위한 파일럿 생체내 실험의 실험적 설계를 보고한다. 실험 시각표 및 절차뿐만 아니라 치료 그룹의 수가 보고된다.
도 24B는 각 치료 그룹에 대한 희생 시 골수(BM)에서의 인간 CD45+ 생착의 상대 존재비 및 절대수를 보고하는 막대 플롯이다.
도 24C는 비변형 또는 FLT3 유전자에서 염기 편집된, 이종이식된 CD34+ HSPC로부터 유래된 인간 생착의 계통 구성을 설명하는 막대 플롯이다.
도 25A는 희생 시 골수에서 인간 CD45+ 생착 내의 인간 CD34+CD38- 전구체의 상대 존재비 및 절대수를 보고하는 막대 플롯이다(도 24와 동일한 실험). 비변형 CD34+ HSPC가 이종이식된 마우스는 4G8 CAR-T 투여 시 CD34+CD38- 전구체의 유의미한 감소를 나타낸다.
도 25B는 처리 마우스의 비장에서 CAR-T 세포에 대한 CD69+ 세포(T 세포 활성화 마커)의 백분율을 보고하는 막대 플롯이다(도 24와 동일한 실험).
도 25C는 중심 기억(CD45RA-CD62L+, CM), 효과기 기억(CD45RA-CD62L-, EM), 미경험(CD45RA+CD62L+) 또는 CD45RA를 재발현시키는 효과기 기억 세포(CD45RA+CD62L-, TEMRA)로 나누어지는 T 세포 표현형(CD62L 및 CD45RA의 표면 발현으로 평가)을 보고하는 막대 플롯이다.
도 25D는 계통 음성 인간 전구체(생/hCD45+/CD3-/CD19-/CD33-/CD34+/CD38-)를 식별하기 위해 생체내 이종이식 실험으로부터의 골수 샘플의 유세포분석을 위한 게이팅 전략을 도시한다(도 24와 동일).
도 25E는 희생 시 골수에서 인간 CD34+CD38- 전구체의 백분율을 나타내는 동일한 조건으로부터 마우스의 풀링된(pooled) 사건으로부터 얻은 누적 유세포분석 플롯을 보고한다(도 24와 동일한 실험).
도 26A는 IVT mRNA 및 FLT3-18-NRN 및 CD123-N sgRNA를 사용하는 인간 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ HSPC에 대한 FLT3 및 CD123 이중 염기 편집 실험의 실험 설계이다. 배양 배지의 조성물은 우측에 보고되는 한편, 시각표는 유세포분석 및 gDNA 수집을 위한 시점을 보고한다.
도 26B는 편집 후 0일, 3일 및 7일차에 배양된 CD34+ HSPC의 배수 확장을 보고하는 막대 플롯이다.
도 26C는 CD123 염기 편집 조건에서 CD123 클론 7G3 인식의 상실을 강조하기 위한 편집된 CD34+ HSPC의 유세포분석 플롯이다. 세포를 대조군 CD123 항체(클론 9F5) 및 치료용 항체(7G3)와 함께 공동 염색하였다. 세포를 CD34+CD90+CD45RA-에 대해 사전 게이팅하였다.
도 27은 (좌측에서 보고되는) 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ HSPC 상에서 수행된(도 26과 동일), 상이한 mRNA 및 sgRNA 용량에 따른 FLT3-18-NRN 및 D123-N sgRNA의 각 아데닌 염기 위치에서의 편집 효율을 보고하는 히트맵이다.
도 28A는 CD123 염기 편집 효율의 개선을 나타내기 위해 SpRY-ABE8e-V106W 또는 SpRY-K918-ABE8e-V106W 중 하나와 조합한 FLT3-18-NRN sgRNA 또는 CD123-N sgRNA로 편집된 K562 세포 염기의 유세포분석 플롯이다.
도 28B는 CD123 S59 잔기를 표적화하는 3개의 상이한 gRNA에 대한 서열을 보고한다.
도 28C는 더 높은 충실도 변이체(HF1, Sniper), K918N 변이체, BlackJack 변이체(더 긴 gRNA에 대해 더 용인됨) 및 이러한 돌연변이의 조합을 포함하는, 변형된 SpCas9를 이용하는 여러 상이한 아데닌 염기 편집기 설계를 도시한다.
도 28D는 도 28B로부터의 3개의 gRNA(+ 대조군으로서 FLT3-18-NRN) 및 도 28C로부터의 염기 편집기 변이체를 사용한 편집 효율을 보고하는 히트맵이다.
도 29A는 IVT mRNA 및 FLT3-18-NRN 및 CD123-R sgRNA를 사용하는 인간 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ HSPC에 대한 FLT3 및 CD123 이중 염기 편집 실험의 실험 설계이다. 배양 배지의 조성물은 우측에 보고되는 한편, 시각표는 유세포분석 및 gDNA 수집을 위한 시점을 보고한다.
도 29B는 배양된 CD34+ HSPC에서 CD123 염기 편집 효율을 얻기 위한 게이팅 전략을 입증하는 유세포분석 플롯이다.
도 29C는 편집 후 0일, 3일 및 6일차에 배양된 CD34+ HSPC의 배수 확장을 보고하는 막대 플롯이다.
도 30은 FLT3-18-NRN 및 CD123-R sgRNA에 대해 각 아데닌 위치에서 염기 편집 효율을 보고하는 히트맵이다(도 29와 동일한 실험). 표적 염기는 히트맵 하단에 보고된다. 우측에서, 히트맵은 유세포분석에 의해 편집된 CD123 염기의 %를 보고한다.
도 31은 도 29와 동일한 실험으로부터의 KIT-gRNA-Y 표적화 잔기 H378에 대한 각 아데닌 위치에서 CD34+ HSPC에 대한 염기 편집 효율을 보고하는 히트맵이다.
도 32A는 4G8 CAR-T 세포에 대한 FLT3-에피토프 조작된 인간 CD34+ HSPC의 저항성을 확인하기 위한 생체내 이종이식 실험에 대한 실험 설계를 보고한다. 실험 시각표 및 치료 그룹 및 숫자를 보고한다.
도 32B는 모든 마우스에 대해 이식후 8주차 말초 혈액 샘플에 대한 FLT3 염기 편집 효율을 보고한다.
도 33A는 희생 시 골수에서 인간 CD45+ 생착에 대한 다형핵(polymorphonucleate) 과립구(CD3-CD19-CD33+SSChi, PMN) 및 과립-단일 전구체(granulo-mono progenitor)(계통-CD34+CD38+CD45RA+FLT3+, GMP)의 백분율을 보고한다(도 32와 동일한 실험).
도 33B는 4G8 CAR-T 세포 처리 및 비처리 마우스에 대해 여러 시점에서 게놈 DNA에 대한 FLT3 편집 효율을 나타낸다. LC, 액체 배양(사전 이식 샘플); W8, W12, 8주차 및 12주차 출혈; BM, 골수; CFU, 콜로니 형성 단위-유래 세포(희생 시 골수 샘플로부터 플레이팅).
도 34는 FLT3 또는 AAVS1 편집 CD34+ HSPC를 이종이식한 마우스의 골수에서의 다형핵 과립구(CD3-CD19-CD33+SSChi, PMN), 과립-단핵 전구체(계통-CD34+CD38+CD45RA+FLT3+, GMP) 및 조혈줄기세포(계통-CD34+CD38-CD90+CD45RA-, HSC)의 상대 존재비를 나타내는 대표적인 유세포분석 플롯이다.
도 35는 2개의 별개의 작제물로서 또는 탠덤-CAR(링커에 의해 분리되는 동일한 분자 상의 2개의 scFv)로서 발현되는, 단일 또는 이중 특이성 키메라 항원 수용체(CAR)에 대한 여러 대안의 설계를 도시한다.
도 36A는 대조군 또는 치료적(마젠타) 단클론성 항체에 의해 인식되는 세포외 도메인(ECD)과 III형 수용체 타이로신 키나제(FLT3, KIT)의 개략도이다. AF488-접합 FLT3L 또는 SCF 리간드를 사용하여 돌연변이된 수용체의 결합 친화도를 평가하였다.
도 36B는 각각 16 또는 10개의 아미노산 치환을 갖는 키메라 수용체에 대한 치료적 mAb(FLT3 및 KIT에 대해 각각 4G8 및 Fab79D)의 상실을 나타내는 유세포분석 플롯(상단); 및 야생형(WT) 및 돌연변이된 수용체 변이체에 대한 형광 리간드 결합 분석(하단)이다.
도 36C는 비자극이거나 100ng/㎖ FLT3L 또는 SCF와 함께 인큐베이션시킨 FLT3 및 KIT 변이체를 발현시키는 세포주의 pFLT3 Y589-591 및 pKIT Y719의 웨스턴 블롯이다.
도 36D는 ECD4의 16개 아미노산 위치에서 인간 또는 뮤린 코돈 중 하나와 함께 FLT3 cDNA를 함유하는 슬리핑 뷰티 플라스미드의 개략도(상단 좌측); 라이브러리 영역의 NGS 서열분석을 위한 FLT3 라이브러리 및 FACS-분류된 (4G8- 및 4G8+)로 형질도입된 K562 세포(상단 우측); 및 384 내지 413번 위치에서 상대 아미노산 빈도를 나타내는 서열 로고(sequence logo)(하단)이다.
도 36E는 ECD4의 각 위치에서 축중 코돈(NNN)을 함유하는 슬리핑 뷰티 플라스미드의 개략도(상단 좌측); 라이브러리 영역의 NGS 서열분석을 위해 KIT 라이브러리 및 FACS-분류된 (Fab79D- 및 Fab79D +)로 형질도입된 K562 세포(상단 우측); 및 이중 양성 세포(aa. 314 내지 381)에 비해 Fab-79Dlow에서 풍부한 아미노산 치환의 log-배수 변화를 나타내는 서열 로고(하단; 여러 개의 풍부한 아미노산 치환을 갖는 위치는 이전에 예측된 접촉점과 일치됨)이다.
도 36F는 FLT3 코돈 N399를 표적화하는 시험된 gRNA의 개략도(좌); 및 편집 72시간 후에 유세포분석에 의해 평가한 염기 편집기 발현 플라스미드(NG-ABE8e 또는 SpRY-ABE8e) 및 sgRNA를 이용하여 전기천공된 K562 FLT3 리포터 세포의 대표적인 플롯이다(우; 대조군 mAb BV10A4에 대해 양성이고 클론 4G8에 대해 음성인 세포의 %를 각 플롯에서 보고하고; 편집되지 않은 상태는 게이팅 전략을 나타냄).
도 36G는 염기 편집에 의한 CD123 에피토프 선별을 나타낸다. 상단: 선별을 위해 사용한 7G3 접촉 잔기의 표적화된 염기 편집을 위한 sgRNA. 진한 청색, NGG PAM; 회색, NGN PAM; 밝은 청색, NRN PAM. PAM 위치는 화살촉으로 표시된다. 하단: SpRY- 사이티딘(상단 행) 또는 아데닌(하단 행) 염기 편집기로 처리한 CD123-리포터 K562 세포의 FACS 플롯. 대조군 mAb 9F5에 대해 양성이고 치료용 클론 7G3에 대해 음성인 세포의 %를 각 플롯의 하단 우측에 보고한다.
도 36H는 수용체 변이체를 발현시키는 (FLT3 및 CD123에 대해) K562 또는 (KIT에 대해) NIH-3T3 세포에 대해 측정된 스텔스(stealth) 수용체 변이체에 대한 치료용 항체의 친화도를 나타낸다. 배경 차감 후 대조군 mAb에 대해 정규화된 치료적 mAb의 MFI의 평균±SD(N=3). 이원 ANOVA에 의한 비교.
도 36I는 FLT3, SCF 및 IL3 친화도 분석이다. 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 통해 수용체 변이체를 발현시키는 세포주를 형광 리간드와 함께 인큐베이션시키고, 유세포분석으로 평가하였다. 리간드의 MFI의 평균±SD(N=3 FLT3/CD123; N = 4 KIT). 이원 ANOVA에 의한 비교.
도 37A는 FACS-분류 4G8- 및 4G8+ 세포에서 ECD4의 각 위치(357 내지 421번)에서 아미노산 빈도를 나타내는 FLT3 EC4 조합 라이브러리의 전장 서열 로고이다.
도 37B는 mCherry 및 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제(PAC) 리포터/저항성 카세트를 이용하여 FLT3 변이체를 암호화하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존의 설계(상단) 및 K562 세포에서 발현된 N399D 및 N399G 변이체에 대해 4G8 인식의 상실을 나타내는 유세포분석(하단)을 나타낸다.
도 37C는 유전자 전사 개시 부위(TSS) 상류의 EF1α 프로모터의 표적화된 상동-직접 수선 통합을 통한 FLT3, KIT 및 CD123 리포터 K562 세포의 생성을 나타낸다. 50-bp 길이 상동성 아암을 갖는 dsDNA 공여자는 전체 EF1α 프로모터를 암호화하는 플라스미드 주형에서 PCR에 의해 생성되었다. K562 세포를 각각의 유전자의 암호화 서열 상류의 영역을 인식하는 SpCas9(FLT3, KIT) 또는 AsCas12a 뉴클레아제(CD123) 및 gRNA로 전기천공하였다. 0.5 내지 10ug의 dsDNA 공여자 주형을 20㎕ 전기천공 용적에서 Cas RNP와 함께 공동전기천공하였다. 대표적인 유세포분석 플롯은 FACS-분류 및 확장된 과발현된 유전자에 대해 양성인 세포의 집단을 나타낸다. FLT3 및 CD123의 경우, 분류된 세포의 단세포 클로닝을 수행하여 가장 높은 표면 발현을 갖는 클론을 단리시켰다. 달리 명시되지 않는 한, K562 리포터 세포에 대한 모든 에피토프-편집 시험 및 최적화를 수행하였다. FLT3-발현 K562 세포 상에서 CD123-표적화된 RNP+공여자 전기천공의 두 번째 라운드를 통해 이중 FLT3/CD123 리포터를 얻었다(데이터를 도 49B에 나타냄).
도 37D는 CRISPR-Cas 매개 상동 유도 수선을 통한 FLT3 N399D 돌연변이의 도입을 나타낸다. K562 리포터 세포를 N399D 돌연변이를 암호화하는 SpCas9 또는 AsCas12a 뉴클레아제, gRNA 및 200-bp ssODN 주형 공여자(또는 이들의 역보체, rev.comp.)로 전기천공하였다. HDR 수선 후에 뉴클레아제 재절단 위험을 감소시키기 위해 추가 침묵 돌연변이를 포함시켰다. 편집 72시간 후 유세포분석에 의해 세포를 평가하였다. 4G8-을 제외하고 (대조군 mAb BV10A4에 의한) FLT3+ 세포의 백분율을 우측 하단 모서리에서 보고한다.
도 37E는 에피토프 맵핑으로부터 유래된 KIT 돌연변이의 특성규명을 나타낸다. KIT 에피토프 맵핑으로부터 유래된 아미노산 위치에 대해서, 아데닌 BE(ABE, 적색) 또는 사이티딘 BE(CBE, 청색)에 의해 얻을 수 있는 치환을 슬리핑 뷰티 트랜스포존에서 개개로 클로닝하고, HEK-293T 세포에 전기천공하였다. 퓨로마이신 선택 후에, 세포를 Fab-79D와 대조군 Ab 104D2 모두와 함께 염색하였다. Fab-79D MFI와 104D2 MFI 사이의 비를 각 돌연변이에 대해 보고한다. KIT에 대한 SCF 결합에 영향을 미치는 변이체를 제외하기 위해, 동일한 변이체를 AF488-접합 SCF 및 대조군 mAb 104D2(SCF 결합을 손상시키지 않음)와 함께 인큐베이션시켰다. SCF 대 104D2 중앙값 형광의 비를 막대 플롯에 보고한다. 수평선은 참조 돌연변이 H378R을 나타낸다.
도 37F는 KIT H378R 아데닌 염기 편집 최적화를 나타낸다. 엑손 7 내에서 코돈 H378을 표적화하는 sgRNA를 K562 세포에서 SpRY-ABE8e와 함께 공동 전기천공시켰다. gDNA에 대한 편집 효율을 프로토스페이서 내의 각 아데닌에 대해 보고한다(위치 번호는 KIT-Y sgRNA에 상대적임).
도 37G는, 상단에서, mTagBFP2 및 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제(PAC) 리포터/저항성 카세트를 이용하여 KIT 변이체를 암호화하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존의 설계를 나타내고; 하단에서, HEK-293T 세포에서 발현된 KIT H378R에 대한 Fab79D 인식의 상실을 나타내는 유세포분석 플롯을 나타낸다.
도 37H는 염기 편집에 의한 CD123 에피토프 선별을 나타낸다. 도 1G에 보고된 7G3 접촉 잔기의 표적화된 염기 편집을 위한 sgRNA를 CD123-리포터 K562 세포에서 아데닌(ABE) 또는 사이티딘 염기 편집기(CBE) 발현 플라스미드와 함께 공동 전기천공시켰다. 대조군 mAb 9F5에 양성이고 치료용 클론 7G3에 음성인 세포의 백분율을 각 플롯에 보고한다. 비편집 조건은 게이팅 전략을 나타낸다. BE4, evoApobec-1 BE4max.
도 37I는 sgRNA-F가 있는 CD123 CBE가 클론 6H6 및 S18016F 결합의 상실을 초래한다는 것을 나타낸다. 도 37H에서 보고된 BE 선별로부터의 동일한 조건을 클론 7G3과 상이한 에피토프를 갖는 CD123-표적화 클론 6H6 및 S18016F로 염색하였다.
도 37J는 세포내 신호 전달을 가능하게 하기 위해 공통 β-사슬 CSFR2B의 공동 발현을 갖는 CD123 변이체를 암호화하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존의 설계를 나타낸다.
도 38A는 FLT3 에피토프 조작된 변이체가 키나제 활성화를 보존한다는 것을 나타낸다. 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 FLT3 변이체를 발현시키는 K562 세포로부터의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯. 세포에서 밤새 혈청을 결핍시키고, 10분 동안 37℃에서 다양한 농도의 인간 FLT3L로 자극하였다. pFLT3 Y589-591, 총 FLT3 및 액틴을 동일한 용해물 상에서 프로빙하였다. pFLT3 막을 제거한 후에 총 FLT3을 프로빙하였다. (액틴 상에서) 정규화된 pFLT3 신호 강도를 우측에 보고한다. 2원 ANOVA에 의한 비교.
도 38B는 KIT 에피토프 조작된 변이체가 키나제 활성화를 보존한다는 것을 나타낸다. 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 KIT 변이체를 발현시키는 NIH-3T3 세포로부터의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯. 세포에서 밤새 혈청을 결핍시키고, 10분 동안 37℃에서 다양한 농도의 인간 SCF로 자극하였다. pFLT3 Y719, 총 KIT 및 액틴을 동일한 용해물 상에서 프로빙하였다. (총 KIT에 대한) 정규화된 pKIT 신호 강도를 우측 플롯에 보고한다. 2원 ANOVA에 의한 비교.
도 38C는 CD123 에피토프 조작된 변이체가 STAT5 활성화를 보존한다는 것을 나타낸다. 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 CD123 변이체를 발현시키는 BaF3 세포는 뮤린 IL-3이 결핍되어 있었고, 상이한 농도의 인간 IL-3으로 자극하였다. 세포를 48시간 후에 세포내 유세포분석에 의해 STAT5 인산화를 평가하였다(좌측, 대표적인 FACS 플롯은 상이한 hIL-3 용량에서 CD123 S59P 조건을 나타냄; 우측, pSTAT5 PE MFI).
도 38D는 FLT3, KIT, CD123 에피토프 조작된 변이체가 WT 수용체와 유사한 증식성 반응을 유발한다는 것을 나타낸다. 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 FLT3, KIT 및 CD123 변이체를 발현시키는 BaF3 세포는 밤새 뮤린 IL-3이 결핍되었고, 각각 상이한 농도의 인간 FLT3, SCF 및 IL-3으로 자극하였다. 세포를 5일 동안 배양시켰고, 유세포분석에 의해 분석하여 절대수(CountBeads)를 얻었다. 플롯은 비자극 조건에 의해 정규화된 절대수를 보고한다.
도 39A는 상단에서 2세대 CAR 및 절단된 인간 상피 성장 인자 수용체(EGFRt)를 공동 발현시키는 양방향 렌티바이러스 벡터(LV)의 개략도를 나타내고; 하단에서, CAR-T 세포의 생성에 대한 T 세포 배양, 형질도입 및 분석의 개략도를 나타낸다.
도 39B는 상이한 감염 다중도(MOI)에서 LV 4G8-CAR에 의한 형질도입 후 표시된 일수(D)에 T 세포에 대한 EGFRt 표면 발현의 백분율(좌) 및 배수 확장(우)을 나타낸다.
도 39C는 FLT3 N399D 또는 N399G가 4G8 CAR 사멸을 피한다는 것을 나타낸다. 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 FLT3 변이체를 발현시키는 K562 세포를 상이한 효과기:표적비(E:T)에서 4G8 CAR-T 세포와 함께 배양시켰다. 좌: 4G8 CAR과 함께 48시간의 공동 배양 후에, FLT3 WT 또는 N399D 중 하나를 발현시키는 K562 세포의 대표적인 유세포분석 플롯. CD3 및 FLT3 염색에 의해 T 세포 및 표적 세포를 각각 식별한다. 좌에서 우로, i) E:T = 0에 대한 지속적인 살아있는 표적 세포(AnnexinV-7AAD- 세포의 절대수)의 분율을 보고하는 플롯; ii) CD69 염색에 의한 T 세포 활성화(%) 및 iii) E:T = 0에 대해 정규화된 잔여 살아있는 표적 세포에 대한 BV10A4 염색에 의한 FLT3의 표면 발현. 평균±SD (N=4). 이원 ANOVA에 의한 비교.
도 39D는 KIT H378R이 79D CAR 사멸을 피한다는 것을 나타낸다. 좌: 79D CAR과 함께 48시간의 공동 배양 후에, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 KIT WT 또는 H378R 중 하나를 발현시키는 K562 세포의 대표적인 유세포분석 플롯. CD3 및 KIT 염색에 의해 T 세포 및 표적 세포를 각각 식별한다. 좌에서 우로, i) E:T = 0에 대한 지속적인 살아있는 표적 세포(AnnexinV-7AAD- 세포의 절대수)의 분율을 보고하는 플롯; ii) CD69 염색에 의한 T 세포 활성화(%) 및 iii) E:T = 0에 대해 정규화된 잔여 살아있는 표적 세포에 대한 104D2 염색에 의한 KIT의 표면 발현. K562: 비형질도입. 평균±SD (N=4). 이원 ANOVA에 의한 비교.
도 39E는 CD123S59 BE 세포가 CSL362 CAR에 저항성이라는 것을 나타낸다. 좌: CSL362 CAR과 함께 48시간의 공동 배양 후에 CD123 또는 비변형에 대해 염기-편집된 CD123-리포터 K562의 대표적인 유세포분석 플롯. T 세포를 CD3/4/8 염색에 의해 식별한다. 좌에서 우로, i) E:T = 0에 대한 지속적인 살아있는 표적 세포(AnnexinV-7AAD- 세포의 절대수)의 분율을 보고하는 플롯; ii) CD69 염색에 의한 T 세포 활성화(%) 및 iii) 잔여 살아있는 표적 세포에 대한 9F5 염색에 의한 CD123의 표면 발현. 평균±SD (N=4). 이원 ANOVA에 의한 비교.
도 40A는 시험관내 배양 동안의 CAR-T 세포 CD4/CD8 조성을 나타낸다. 신선한 건강한 공여자-유도 PBMC를 CD3/CD28 Dynabeads(비드:세포비 = 3:1), IL-7 5ng/㎖ 및 IL-15 5ng/㎖와 함께 배양시키고, 4G8 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터(LV)를 이용하여 2일차(D)에 형질도입하였다. 2, 4, 6, 12일차에 유세포분석에 의해 배양물 조성을 평가하였다. 플롯은 상이한 감염 다중도(MOI)로 LV 형질도입된 N = 5 조건을 보고한다. 평균±SD.
도 40B는 유세포분석에 의한 CAR-T 세포 표현형을 나타낸다. T 세포 서브세트를 CD62L 및 CD45RA 염색에 의해 평가하였다(CD45RA+62L+, 미경험/T 줄기 기억 세포; CD45RA-62L+, 중심 기억, CM; CD45RA-62L-, 효과기 기억, EM; CD45RA+62L-, 말단 분화된 EM 세포 재-발현 CD45RA, EMRA). 대표적인 FACS 플롯(좌) 및 CD4+ 및 CD8+ 서브세트에 의한 배양물 조성(우)을 보고한다. D0는 Ficoll 분리 후의 비배양 말초 혈액 T 세포를 지칭한다. 평균±SD (N = 5).
도 40C는 FLT3N399 BE 세포가 보호되는 동안 FLT3WT 세포는 4G8 CAR-T 세포에 의해 제거된다는 것을 나타낸다. FLT3 리포터 K562 세포와의 4G8 CAR-T 세포 공동 배양 분석물은 비변형 또는 FLT3N399 염기 편집된다. (좌) 생세포(AnnexinV-7AAD-) 상에서 게이팅된 초기 시점(6h)에서의 대표적인 유세포분석 플롯. T 세포를 CellTrace 마킹에 의해 식별하는 한편, K562 표적은 FLT3+이다. (좌에서 우) 6시간에 표적 세포 생존도(%), 6시간에 CD107a 표면 염색에 의한 T 세포 탈과립화(%) 및 48시간에 생존 표적 세포에 대한 FLT3 발현(MFI, E:T = 0로 정규화). N = 2. 2원 ANOVA에 의한 비교.
도 40D는 에피토프 조작된 수용체가 CAR-T 세포로부터의 보호를 제공한다는 것을 나타낸다. 각 행은 K562 세포를 발현시키는 FLT3, CD123 및 KIT와의 공동배양물로부터의 추가 플롯을 보고한다(도 39 C, 도 39D, 도 39E에서 보고된 동일한 실험). 좌에서 우로 열에 따라: 48시간의 공동 배양 시 CAR-T 세포의 CellTrace MFI, CAR-T 세포와 48시간의 공동 배양 후 표적 세포 생존도(%), 비형질도입 T 세포와 48시간의 공동 배양 후 표적 세포 생존도(%), 비형질도입 T 세포와 48시간의 공동 배양 후 생세포의 절대수(AnnexinV-7AAD-, E:T = 0에 대해 정규화), 48시간의 공동 배양 후 CD69+ 비형질도입 T 세포(%), 비형질도입 T 세포와 48시간의 공동 배양 후 표적 세포에 대한 (비정규화된) FLT3, CD123 및 KIT MFI. 평균±SD, N=4.
도 40E는 표적 세포의 2개 집단, 즉, FLT3을 발현시키는 하나 및 CD123을 발현시키는 다른 하나와의 공동 배양 분석을 위한 실험 레이아웃을 나타낸다. 비변형 또는 에피토프 편집된 FLT3 및 CD123 K562 리포터 세포를 대략 1:1 비로 혼합하고 나서, 4G8 CAR, CSL362 CAR 또는 비형질도입 T 세포를 발현시키는 것 중 하나와 함께 공동 배양시켰다. 살아있는 표적 세포의 FLT3+/CD123+ 조성%(FLT3+ 또는 CD123+ 상의 사전 게이팅)는 상이한 효과기:표적(E:T) 비에서 각 조합에 대해 막대 플롯으로서 보고한다. 평균±SD, N=4.
도 41A는 CD34+ HSPC 배양물, 염기 편집 및 분석의 개략도이다. mPB, 동원된 말초 혈액; HSPC, 조혈 줄기 및 전구 세포; FLT3L, FLT3 리간드; SCF, 줄기세포 인자; TPO, 트롬보포이에틴; SR-1, StemRegenin.
도 41B는 상이한 용량의 아데닌 BE mRNA를 이용한 전기천공 후에 측정된 FLT3, KIT 및 CD123에 대한 gRNA 서열 내의 각 아데닌에서 CD34+ HSPC의 편집창 및 편집 효율을 보고하는 대표적인 플롯이다. 평균±SD.
도 41C는 벌크 CD34+ 세포 또는 FACS-분류된 줄기- 풍부 CD90+ 또는 줄기-고갈 CD90- 서브세트에서의 편집 효율을 나타낸다. 평균±SD (N=2 공여자).
도 41D는 에피토프 편집 CD34+ HSPC의 면역표현형을 나타낸다. 좌: 염기 편집 후 5일차에 시험관내 배양 동안 CD34+133+ HSPC 내의 CD90/CD45RA 서브세트를 나타내는 대표적인 유세포분석 플롯. 우측, FLT3N399, KITH378R, CD123S59 에피토프 편집 CD34+ 세포의 CD90/CD45RA 서브세트 조성을 나타내는 막대 플롯. 평균±SD. 샘플 크기는 막내 내에서 보고된다.
도 41E는 FLT3N399 에피토프 편집 HSPC에 대한 시험관내 4G8 CAR 사멸 분석이다. 4G8 CAR 또는 비형질도입 T 세포와 48시간의 공동 배양 후 FLT3- 또는 AAVS1-염기 편집됨 CD34+45RA+ 세포의, 지속적으로 생세포의 분율(좌) 및 AnnexinV-7AAD 염색에 의한 생존도(우). 평균±SD (N=4). 2원 ANOVA에 의한 비교.
도 41F는 CD123S59에피토프 편집된 HSPC에 대한 시험관내 CSL362 CAR 사멸 분석이다. CSL362 CAR 또는 비형질도입 T 세포와 48시간의 공동 배양 후 CD123S59 또는 AAVS1-BE HSPC의, 지속적으로 살아있는 CD90+ 세포의 분율(좌) 및 AnnexinV-7AAD 염색에 의한 CD34+ 세포의 생존도(우). 2명의 상이한 HSPC 공여자에 대해 N = 8. 2원 ANOVA에 의한 비교
도 41G는 증가된 농도의 Fab-79D mAb와 함께 플레이팅하고 48시간 동안 배양시킨 KITH378 BE 또는 AAVS1 BE HSPC의 mAb 없음 대조군에 대한 절대 생존 CD34+ 세포의 분율을 나타낸다. 평균±SD. 2명의 상이한 HSPC 공여자에 대해 N = 6. 2원 ANOVA에 의한 비교
도 41H는 총 CD34+ 및 CD90+45RA- 세포의 절대수(상단 좌측) 및 염기 편집된 HSPC의 골수 및 적혈구 콜로니의 절대수(N = 2, 하단 좌측)를 나타낸다. 우: 플레이팅 후 14일에 CFU 플레이트의 대표적인 영상(2개의 복제물 중 하나).
도 41I는 FLT3N399 또는 AAVS1 BE HSPC의 1차 및 2차 이종이식 및 분석의 개략적 표현이다.
도 41J는 좌측에서, 1차 수용자에서 상이한 시점에 유세포분석에 의한 인간 생착 (hCD45+ 세포); 우측에서, 유세포분석에 의한 총 인간 (hCD45+) 세포의 백분율로서 BM 계통 조성을 나타낸다. PMN, 다형핵 과립구; 모노(mono), 단핵구; lin-, 계통 음성. 평균±SD. FLT3N399 N = 7, AAVS1 BE N = 4. 2원 ANOVA에 의한 비교.
도 41K는 1차 및 2차 이식 마우스에 대해 상이한 시점에 총 순환 세포, 조혈 기관 또는 CFU에 대해 측정된 FLT3 편집 수준을 나타낸다. 평균±SD. LC, 액체 배양물; W8, 8주차; W12, 12주차; SP, 비장; BM, 골수; CFU, 콜로니 형성 단위.
도 42A는 염기 편집기 mRNA의 시험관내 이식(IVT)을 위해 사용된 플라스미드 주형의 개략적 표현이다. 주형을 선형화하기 위해 IIS형 제한 효소 BbsI를 사용하였다. T7, T7 RNA 중합효소 프로모터; UTR, 비번역 영역; HBB, 헤모글로빈 β 유전자; 폴리A, 폴리-아데닌 서열(대략 110 내지 120 nt).
도 42B는 품질 관리를 위해 Agilent Fragment Analyzer RNA로 분석된 정제된 IVT SpRY-ABE8e mRNA의 대표적인 플롯이다. 90% 초과의 IVT mRNA는 예측된 크기에 상응한다.
도 42C는 sgRNA-18을 이용하여 FLT3N399에 대해 편집된 FLT3-리포터 K562 세포 염기에 대한 SpRY-ABE8e V106W mRNA 적정 용량 시험(dose finding test)이다. 우측, 유세포분석에 의한 FLT3 편집 효율과 mRNA×sgRNA 용량의 상관관계 및 유세포분석에 의한 FLT3 편집 효율과 gDNA 분석에 의한 편집 효율의 상관관계. 스피어만(Spearman) r2 및 p 값을 보고한다.
도 42D는 CD34+ HSPC 염기 편집 mRNA 최적화를 나타낸다. 여러 SpRY-ABE8e mRNA 변이체를 이중 FLT3/CD123 편집 실험에서 시험하였다. 시험한 변수는 mRNA 정제 방법(비드, sparQ PureMag 자기 비드; 칼럼, NEB Monarch RNA 칼럼), 탈인산화, UTP의 N1-메틸-슈도-유리딘(N1m-U) 또는 5-메톡시-유리딘(5me-U)으로의 치환, 캡핑 기술(CleanCap, Trilink CleanCap AG; ARCA, NEB 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog) 및 K918N SpCas9 돌연변이의 첨가(이는 뉴클레아제 효율을 개선시키는 것으로 보고됨)를 포함한다64. 게놈 DNA(gDNA) 분석에 의한 FLT3 및 CD123 편집 효율(%) 및 시험관내 배양의 종료 시 벌크의 절대수(CD34+) 및 줄기-풍부(CD90+45RA-) 세포를 나타내는 막대 플롯.
도 42E는 염기 편집의 배양 조건의 최적화를 나타낸다. CD34+ HSPC는 전기천공법 동안 보충물(RNAsin, Promega RNAsin RNAse-저해제; 글리세롤)을 첨가하거나 또는 사이토카인 농도(표준: 100ng/㎖ FLT3L, SCF 및 50ng/㎖ TPO; 1.5x: 150ng/㎖ FLT3L, SCF 및 75ng/㎖ TPO; 3x: 300ng/㎖ FLT3L, SCF 및 150ng/㎖ TPO; + IL-3: hIL-3 20ng/㎖를 첨가한 표준)의 조절, 상이한 줄기세포 보존 화합물(표준: SR-1 0.75μM, UM171 35nM; SR-1 단독 0.75μM; UM171 단독 35nM; SR-1/UM171 없음), 항염증 화합물(PGE2, 프로스타글란딘-E2 10μM; DEX, 덱사메타손 1μM)의 첨가를 포함하는 상이한 배양 조건으로 SpRY-ABE8e mRNA 및 FLT3N399 sgRNA에 의해 염기 편집되었다. gDNA 분석에 의한 FLT3 편집 효율(%) 및 시험관내 배양의 종료 시 벌크의 절대수(CD34+) 및 줄기-풍부(CD90+45RA-) 세포를 나타내는 막대 플롯.
도 42F는 막대 플롯이다. CD34+ HSPC는 해동 후 상이한 시점(24h, 48h, 72h)에 전기천공되었다. 각 조건을 본 발명자들의 선택 표적(FLT3, CD123, KIT) 중 둘의 모든 조합물에 대해 편집하였다. gDNA 분석에 의한 편집 효율(%) 및 시험관내 배양의 종료 시 벌크의 절대수(CD34+) 및 줄기-풍부(CD90+45RA-) 세포를 나타내는 막대 플롯.
도 42G는 편집된 CD34+ HSPC의 분석을 위해 사용한 게이팅 전략을 나타내는 대표적인 유세포분석 플롯이다. 좌에서 우로, 세포를 단일선(FSC-H/FSC-A 플롯), 생(PI/FSC-A 플롯; PI, 프로피듐 아이오다이드), 물리적 매개변수(SSC-A/FSC-A plot), CD34+ (CD34/CD90 플롯), CD133+(CD34/CD133 플롯) 및 CD45RA-90+, CD45RA-90-, CD45RA+90- (CD45RA/90 플롯)에 대해 게이팅하였다. 단일선(S) 상에서 사전 게이팅 후에, 비드(B) 게이팅은 CountBeads(FSC-AlowPIhigh, 파편을 제거하기 위해 2개의 추가 형광 매개변수 상에서 추가로 게이팅됨)를 식별한다(제시하지 않음).
도 42H는 에피토프-편집 HSPC가 사이토카인 자극에 대한 증식 반응을 보유한다는 것을 나타낸다. FLT3, KIT 및 CD123 염기 편집된 CD34+ HSPC를 상이한 농도의 각 리간드와 함께 플레이팅하고, 4일 동안 배양하였다. CountBeads를 사용하여 유세포분석에 의해 절대수를 얻었다.
도 42I는 실험 종료 시 편집 효율을 나타낸다(gDNA 분석을 위해 기술적 삼중물을 함께 모았음)(도 42H 참조). 평균±SD. 2명의 건강한 공여자에 대해 N=4. 2원 ANOVA 다중 비교.
도 43A는 12주차(W12)에 말초 혈액에서 그리고 도 3I에 도시된 실험으로부터의 BM 세포를 이종이식한 2차 수용자 NBSGW 마우스의 종점에서의 골수(BM)에서 유세포분석에 의한 인간 생착(hCD45+%)을 나타낸다(각 1차 수용자가 1명의 2차 수용자에 이식함). 평균±SD. 2원 ANOVA에 의한 비교.
도 43B는 2차 이종이식 마우스의 BM에서 골수(좌) 및 림프구(우) 계통의 절대수를 나타낸다. AAVS1 BE N = 4, FLT3N399 N = 7. 평균±SD. 2원 ANOVA에 의한 비교. HSC, 조혈줄기세포; MPP, 다능성 전구체; LMPP, 림프구-프라이밍 다능성 전구체; CMP, 공통 골수 전구체; GMP, 과립-모노 전구체; CD33/66b+19-14-11c-34-SSClow로 정의되는 골수아세포; 모노, 단핵구; iPMN, 미숙 다형핵 과립구; 성숙 PMN, 성숙 과립구.
도 43C는 9, 11주차(W9, W11)에 말초혈액에서 그리고 AAVS1 또는 KITH378 편집된, 1M CD34+ HSPC가 이종이식된 NBSGW의 BM에서 유세포분석에 의한 인간 생착(hCD45+%)을 나타낸다. 평균±SD. 2원 ANOVA에 의한 비교.
도 43D는 C로부터의 마우스의 BM에서 골수(좌) 및 림프구(우) 계통의 절대수를 나타낸다. 2-원 ANOVA에 의한 비교. AAVS1 N = 5, KITH378 N = 4.
도 43E는 액체 배양물(LC)에 대해 측정된 KIT 편집 효율, 이식 후 9주차(W9)에 총 혈액 세포 및 실험 종료 시 FACS-분류된 B (CD19) 및 골수성(CD33) BM 세포를 나타낸다. 평균±SD.
도 43F는 인간 PDX를 형질도입하기 위해 사용한 hPGK 프로모터 하의 mNeonGreen 형광 단백질을 암호화하는 렌티바이러스 벡터의 개략적 표현(좌); 및 및 골수(PDX-1) 또는 비장 (PDX-2) 샘플에 대한 환자-유래 AML 이종이식편의 형질도입 효율을 보여주는 대표적인 유세포분석 플롯(우)이다. PDX 세포에 밤새 생체외로 형질도입하고, 발현을 위해 NBSGW 마우스에 이식하고 나서, mNeonGreen+ 세포에 대해 FACS-분류하고, 2차 수용자에게 주사하였다.
도 43G는 생체내 실험을 위해 사용한 AML PDX의 해동 시 유전적 특징(좌) 및 표면 면역표현형(우)을 나타낸다. 유전적 돌연변이 및 각 마커에 대한 양성 세포의 %를 히트맵에 보고한다. ITD, 내부 탠덤 복제; TKD, 타이로신 키나제 도메인 돌연변이.
도 44A는 이종이식의 개략적 표현 및 AML PDX-1과 공동 생착되고 4G8 CAR-T 세포로 처리한 FLT3N399 또는 AAVS1 BE HSPC의 분석이다.
도 44B는 4G8 CAR-T 세포로 처리 또는 비처리된 마우스의 종점에서 액체 배양물(LC), 총 혈액 세포(8, 9주차)에서 그리고 분류된 CD33+ 및 CD19+ 골수(BM) 세포 상에서 측정된 FLT3 염기 편집을 나타낸다. 다중 독립표본 t 검정(unpaired t test). 평균±SD.
도 44C는 CD34+ HSPC, CD34+ HSPC + AML PDX-1, 또는 CD34+ HSPC + AML PDX-1을 생착시키고 4G8 CAR-T로 처리한 마우스로부터의 BM 샘플의 대표적인 유세포분석 플롯이다. 플롯은 인간 CD45+ 상에서 사전 게이팅되고; CAR T 세포는 CD3 염색에 의해 식별되며, AML PDX 세포는 mNeonGreen+이다. 평균±SD. 1원 ANOVA에 의한 비교.
도 44D는 hCD45+mNeonGreen- BM 세포 내의 CD3+ 세포%를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD. 1원 ANOVA에 의한 비교.
도 44E는 hCD45+CD3- BM 세포 내의 AML 세포의 백분율을 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD.
도 44F는 총 BM-유래 CFU에 대해 유세포분석에 의해 측정된 AML(mNeonGreen+) 세포의 백분율을 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD. 일원 ANOVA에 의한 FLT3N399 대 AAVS1 BE 조건의 통계학적 비교.
도 44G는 FLT3N399 또는 AAVS1 BE HSPC를 이식한 마우스에서 4G8 CAR-T에 의한 BM B 세포(CD19+)의 고갈을 나타내는 대표적인 FACS 플롯이다. 플롯은 hCD45+CD3-mNeonGreen-에 대해 사전 게이팅되어 있다.
도 44H, 도 44I 및 도 44J는 프레-B(CD19+10+34-)(도 44H), hCD45+CD3-mNeonGreen- 내의 프로-B(CD19+10+34+) 세포(도 44I), 및 골수성 세포(CD33/66b+) 내의 미숙 과립구(CD33/66b+14-10-11c-SSChigh)(도 44I)의 %를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD. 일원 ANOVA에 의한 FLT3N399 대 AAVS1 BE 조건의 통계학적 비교.
도 44K는 계통-CD34+38+10- 전구체의 조성을 나타내는 대표적인 FACS 플롯이다. 과립-단일 전구체(GMP)는 CD45RA+FLT3+으로 정의되고, 공통 골수성 전구체(CMP)는 CD45RA-FLT3+로서 그리고 메가-적혈구 전구체(MEP)는 CD45RA-FLT3-로서 정의된다.
도 44L은 lin-CD34+38+ 내의 GMP%를 나타내는 막대 블롯이다. 평균±SD.
도 44M은 HSC에서 분화 백혈구까지 BM의 골수성 계통 서브세트의 절대수를 나타낸다. 비처리 마우스를 함께 모으고(회색 막대), 4G8-처리 FLT3N399 및 AAVS1 BE 마우스를 각각 핑크 및 황색으로 보고한다. 평균±SD. CAR 처리 그룹에 대한 절대수의 배수 변화(FLT3N399 /AAVS1)를 각 집단 막대 플롯 위에 보고한다. 다중 비교에 의한 일원 ANOVA. 4G8 CAR로 처리한 FLT3N399 대 AAVS1 BE 조건 간 비교의 FDR-조절 p 값을 보고한다(p < 0.05는 볼드체임).
도 44N는 계통-CD34+38-10- 전구체의 조성을 나타내는 대표적인 FACS 플롯이다. 줄기세포(HSC)를 CD45RA-90+로서 정의하고, 다능성 전구체(MPP)를 CD45RA-90-로서 그리고 림프구-프라이밍된 MPP (LMPP)를 CD45RA+90-로서 정의한다.
도 44O는 lin-CD34+38- 내의 LMPP%를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD.
도 44P는 HSC에서 분화 백혈구까지 BM의 림프구 계통 서브세트의 절대수를 나타낸다. 프레B/NK는 CD33/66b-19-56-34+38+10+로서 정의되고, B-전림프구(prolymphocyte)는 CD33/66b-19-56-34-10+로, 프로-B 세포는 CD33/66b-19+10+34+로, 프레-B 세포는 CD33/66b-19+10+34-로, 성숙 B 세포는 CD33/66b-19+10-34-로 정의된다. 비처리 마우스를 함께 모으고(회색 막대), 4G8-처리 FLT3N399 및 AAVS1 BE 마우스를 각각 핑크 및 황색으로 보고한다. CAR 처리 그룹에 대한 절대수의 배수 변화(FLT3N399 /AAVS1)를 각 집단 막대 플롯 위에 보고한다. 평균±SD. 다중 비교에 의한 일원 ANOVA. 4G8 CAR로 처리한 FLT3N399 대 AAVS1 BE 조건 간 비교의 FDR-조절 p 값을 보고한다(p < 0.05는 볼드체임).
도 45A는 8주차에 AAVS1 BE 및 FLT3N399 HSPC를 이종이식한 NBSGW 마우스의 말초 혈액 계통 조성을 나타낸다. 평균±SD. AAVS1 BE N = 13, FLT3N399 N = 18. 다중 독립표본 t 검정에 의한 통계학적 비교.
도 45B는 계통-음성 CD34+ 전구체는 생체내에서 4G8 CAR-T에 의해 고갈되고 FLT3N399 편집에 의해 보호된다는 것을 나타낸다(도 44로부터의 실험). CD34+ 전구체의 게이팅이 있는 계통-neg 세포(mNeonGreen-CD3-19-14-11c-56-)의 대표적인 유세포분석 플롯(게이트 내에서 보고된 %).
도 45C는 hCD45+3-mNeonGreen- BM 세포 내의 lin-CD34+ 세포의 %를 나타낸다. 평균±SD. 1원 ANOVA에 의한 비교.
도 45D는 도 44로부터의 마우스의 BM lin-CD34+의 상대 조성을 나타낸다. 평균±SD. 다중 비교에 의한 2원 ANOVA(AAVS1 단독 대 FLT3N399 비교를 보고함). HSC, 조혈줄기세포; MPP, 다능성 전구체; LMPP, 림프구-프라이밍된 다능성 전구체; CMP, 공통 골수 전구체; GMP, 과립-모노 전구체; MEP, 메가-적혈구 전구체.
도 45E는 종점에서의 골수(좌) 및 림프구(우) BM 서브세트에 대한 FLT3 발현(MFI)을 나타낸다. 4G8 CAR 처리 AAVS1 BE 조건으로부터의 LMPP, MPP 및 HSC는 낮은 세포 수로 인해 평가 가능하지 않다(NE). 평균±SD. 다중 독립표본 t 검정에 의한 통계학적 차이를 보고한다.
도 45F는 도 44로부터의 마우스의 BM에서 유세포분석에 의한 CAR 세포 표현형을 나타낸다. CD45RA+62L+, 미경험; CD45RA-62L+, 중추 기억, CM; CD45RA-62L-, 효과기 기억, EM; CD45RA+62L, 말단 분화된 EM 세포 재발현 CD45RA, EMRA.
도 45G는 (좌에서 우로) BM CD3+ 세포 내의 EGFRt+, BM CD8+ CAR T 세포 상의 PD1(CD279) MFI 및 BM CD4+ CAR T 세포 상의 PD1(CD279) MFI의 %를 보고하는 막대 플롯이다. 평균±SD. 1원 ANOVA에 의한 AAVS1 BE와 FLT3N399 조건 사이의 비교를 보고한다.
도 45H는 10주차에 AAVS1 BE 및 CD123S59 HSPC를 이종이식한 NBSGW 마우스의 말초 혈액 계통 조성을 나타낸다(도 46으로부터의 실험). 평균±SD(N = 11). 다중 독립표본 t 검정에 의한 통계학적 비교를 보고한다.
도 45I는 계통-음성 CD34+ 전구체가 생체내에서 CSL362 CAR-T에 의해 고갈된다는 것을 나타낸다(도 46으로부터의 실험). 좌, CD34+ 전구세포의 게이팅이 있는 계통-음성 세포(mNeonGreen-CD3-19-14-11c-56-)의 대표적인 유세포분석 플롯. 우, HSC(CD45RA-90+), MPP(CD45RA-90-), LMPP(CD45RA+90-) 서브세트의 게이팅이 있는 lin-CD34+38-10- 세포의 대표적인 유세포분석 플롯.
도 45J는 도 46으로부터의 마우스의 BM lin-CD34+의 상대 조성을 나타낸다. 평균±SD. 다중 비교에 의한 2원 ANOVA(AAVS1 단독 대 CD123S59 비교를 보고함). HSC, 조혈줄기세포; MPP, 다능성 전구체; LMPP, 림프구-프라이밍된 다능성 전구체; CMP, 공통 골수 전구체; GMP, 과립-모노 전구체; MEP, 메가-적혈구 전구체.
도 46A는 이종이식의 개략적 표현 및 AML PDX-1과 공동 생착되고 5M CSL362 CAR-T 세포로 처리한 CD123S59 또는 AAVS1 BE HSPC의 분석이다.
도 46B는 CSL362 CAR-T 세포로 처리 또는 비처리된 마우스의 종점에서 총 혈액 세포(8, 10주차)에 대해 그리고 CD33+ 및 CD19+ 골수(BM) 세포에 대해 분류된 측정된 CD123 염기 편집을 나타낸다. CD123S59 N = 6, AAVS1 BE N = 5. 평균±SD. 다중 독립표본 t 검정에 의한 통계학적 비교.
도 46C는 CSL362 CAR-T로 처리 또는 비처리한 CD34+ HSPC + AML PDX-1을 생착시키고 AML PDX-1 단독을 생착시킨 마우스로부터의 BM 샘플의 대표적인 유세포분석 플롯을 나타낸다. 플롯은 총 인간 CD45+ 상에서 사전 게이팅되고; CAR-T 세포는 CD3 염색에 의해 식별되며, AML PDX 세포는 mNeonGreen+이다.
도 46D는 hCD45+CD3- BM 세포 내의 AML PDX 세포의 %를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD.
도 46E는 hCD45+mNeonGreen- BM 세포 내의 CD3+ 세포%를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD.
도 46F는 BM에서 총 hCD45+3-mNeonGreen- 세포의 절대수를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD.
도 46G는 인간 CD45+3-mNeonGreen- BM 세포 내의 프로-B 세포(CD19+10-34-)의 %를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD. 일원 ANOVA에 의한 CD123S59 대 AAVS1 BE 조건의 통계학적 비교.
도 46H는 좌측에서 CD123S59 또는 AAVS1 BE HSPC를 이식한 마우스에서 CSL362 CAR-T에 의한 BM 골수성 세포(CD33/66b+19-, 오렌지색 게이트로 강조)의 고갈을 나타내는 대표적인 FACS 플롯; 우측에서, 과립구(PMN, CD33/66b+19-14-SSChigh, 오렌지색 게이트)의 고갈을 나타내는 대표적인 FACS 플롯을 나타낸다.
도 46I, 도 46J 및 도 46K는 총 골수 세포(hCD45+ 세포 내의 CD33/66b+19-) (46I), PMN (CD33/66b+19- 세포 내의 CD33/66b+19-)(46J), 미숙 PMN (CD33/66b+19- 세포 내의 CD33/66b+19-14-10-11c-SSChigh)(46K)의 %를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD. 일원 ANOVA에 의한 CD123S59 대 AAVS1 BE 조건의 통계학적 비교.
도 46L은 CD123S59 또는 AAVS1 BE HSPC를 이식한 마우스에서 CSL362 CAR-T에 의한 수지상 세포(DC) 서브세트의 상실을 나타내는 대표적인 유세포분석 플롯이다. 좌: 통상적인 DC(cDC, CD33/66b+14-11c+FLT3+SSClow), 플롯은 CD33/66b+14-SSClow 세포에 대해 게이팅된다. 우: 형질세포양 DC(pDC, CD33/66b+14-11c-FLT3+CD123highSSClow), 플롯은 CD33/66b+14-11c-SSClow 세포에 대해 게이팅된다.
도 46M 및 도 46N은 각각 hCD45+3-mNeonGreen- 세포 내의 cDC 및 pDC의 백분율을 나타내는 막대 블롯이다.
도 46O는 hCD45+3-mNeonGreen- 세포 내의 계통-CD34+ 전구체의 백분율을 나타낸다. 평균±SD. 일원 ANOVA에 의한 CD123S59 대 AAVS1 BE 조건의 통계학적 비교.
도 46P 및 도 46Q는 HSC에서 분화 백혈구까지 BM의 골수(P) 및 림프구(Q) 계통 서브세트의 절대수를 나타낸다. 비처리 마우스를 함께 모은 한편(회색 막대), CSL362-처리 CD123S59 및 AAVS1 BE 마우스를 각각 핑크 및 청색으로 보고한다. CAR 처리 그룹에 대한 절대수의 배수 변화(CD123S59 /AAVS1)를 각 집단 막대 플롯 위에 보고한다. 평균±SD. 다중 비교에 의한 일원 ANOVA. 4G8 CAR로 처리한 CD123S59 대 AAVS1 BE 조건 간 비교의 FDR-조절 p 값을 보고한다(p < 0.05는 볼드체임).
도 47A는 종점에서의 골수(좌) 및 림프구(우) BM 서브세트에 대한 CD123 발현(MFI)을 나타낸다. 평균±SD. 다중 독립표본 t 검정에 의한 통계학적 차이를 보고한다.
도 47B는 4G8 CAR T 세포가 생체내에서 PDX-1을 고갈시키지만, PDX-2를 근절하지 못한다는 것을 나타낸다. NSBGW 암컷 마우스에 AML PDX 세포를 이종이식하고, 10일 후에, 4G8 CAR-T 세포로 처리하였다. 실험 종점은 CAR-T 투여 후 14일이었다. 좌에서 우로, 골수(BM)에서 총 CD45+ 세포 내의 AML PDX 세포의 %, 비장(SP)에서 총 CD45+ 세포 내의 AML PDX 세포의 %, BM T 세포의 절대수, BM에서 살아있는 AML 세포에 대한 FLT3 MFI 및 SP에서 살아있는 AML 세포에 대한 FLT3 MFI를 나타내는 막대 플롯. 평균±SD. 1원 ANOVA에 의한 비교.
도 47C는 AAVS1 BE 및 FLT3N399 HSPC를 사전 생착시킨 마우스에서 4G8 CAR T 세포가 생체내에서 PDX-1을 고갈시키지만, PDX-2를 근절하지 못한다는 것을 나타낸다. NBSGW 마우스에 편집된 HSPC를 이종이식하였고, 11주 후에, PDX-1 또는 PDX-2 세포를 주사하였다. 10일 후에, 마우스를 2.5 M 4G8 CAR-T 세포로 처리하고, 2주 후에 결과를 평가하였다. 막대 플롯에서 보고한 총 BM hCD45+ 세포 내의 AML 세포의 %. 평균±SD. 1원 ANOVA에 의한 비교.
도 47D는 CAR T 세포의 조합물이 생체내에서 PDX-2에 대해 개선된 효능을 갖는다는 것을 나타낸다. NBSGW 마우스에 0.75 M PDX-2 세포를 이종이식하고, 10일 후에, 2.5M 4G8 CAR 또는 4G8 + CSL362, 4G8 + Fab79D 또는 CSL362 + Fab79D CAR T 세포의 조합물(각각 2.5M)로 처리하였다. 결과를 2주 후에 평가하였다. 막대 플롯은 총 BM hCD45+ 세포 내의 AML 세포%를 나타낸다. 평균±SD. 1-원 ANOVA에 의한 다중 비교 대 비처리 조건.
도 47E는 9주차에 AAVS1 BE 및 이중-편집 FLT3N399/CD123S59 HSPC를 이종이식한 NBSGW 마우스의 말초혈액 계통 조성물을 나타낸다(도 49D로부터의 실험). 다중 독립표본 t 검정에 의한 통계학적 비교. 평균±SD.
도 48A는 편집된 HSPC 및/또는 AML PDX롤 이종이식한 마우스로부터의 골수 분석에 대한 대표적인 유세포분석 게이팅 전략이다(도 46으로부터의 실험). 세포를 단일, 살아있는 그리고 물리적 매개변수 게이트에 대해 사전 게이팅한다. 집단: 1. 인간 CD45+; 2.T 세포(CAR); 3. mNeonGreen+(AML PDX); 4. CAR 또는 AML 없이 인간 CD45+; 5. 총 CD19+; 6. 총 골수성 세포(CD33/66b+); 7. 과립구 + 비만 세포; 8. 단핵구; 9. 비만 세포; 10. 총 과립구; 11. 성숙 과립구(CD10+/11c+); 12. 미숙 과립구(CD10-/11c-); 13. 고전적 수지상 세포, cDC; 14. 프로-B 세포; 15. 프레-B 세포; 16. 성숙 B 세포; 17. 자연살해 세포, NK; 18. 전림프구; 19. 골수아세포; 20. lin-CD34+(CD33/66+ lin-CD34+ 및 CD33/66-lin-CD34+는 하류 게이팅을 위해 풀링됨); 21. Lin-CD34+38+; 22. Lin-CD34+38-; 23. 프레-B/NK; 24. 과립-모노 전구체, GMP; 25. 공통 골수 전구체, CMP; 26. 메가-적혈구 전구체, MEP; 27. 조혈줄기세포, HSC; 28. 다능성 전구체, MPP; 29. 림프구-프라이밍 다능성 전구체, LMPP; 30. 비드 게이트; 31. 뮤린 CD45+; 32. 형질세포양 DC; 33. 다능성 림프구 전구체 MLP. CountBeads는 단일선에서 FSC-AlowPIhigh로 처음 게이팅되고, 이어서, 2개의 추가 형광 매개변수로 게이팅된다(하단 좌측 모서리의 플롯).
도 48B는 골수 및 비장에 대한 T 세포 패널에 대한 대표적인 유세포분석 게이팅 전략이다. 세포를 단일, 살아있는 그리고 물리적 매개변수 게이트에 대해 사전 게이팅한다. 인간 CD45+ 세포를 CD3+(T 세포) 및 CD3-에서 분리시키고, 이 안에서 잔여 AML은 mNeonGreen+로서 게이팅된다. CAR+ 세포를 EGFR 염색에 의해 식별한다. T 세포 표현형을 CD45RA 및 CD62L에 의해 게이팅된 CD8+ 및 CD4+ 세포에 대해 평가한다.
도 49A는 FLT3N399 단독에 대해 또는 KITH378R과 조합한 CD34+ HSPC 염기 편집의 효율을 나타내며, 벌그 세포 또는 FACS-분류 CD90+ 원시 전구체에 대해 측정된다. 비교를 위해 KITH378R 단일 편집이 도 41C로부터 보고된다. 평균±SD.
도 49B는 다중복합 에피토프 편집 후에 4G8 및 7G3 mAb에 의한 인식의 상실을 나타내는 이중 FLT3/CD123 리포터 K562 세포의 대표적인 유세포분석 플롯이다.
도 49C는 B의 각 사분면에서 편집된 세포가 FACS-분류되고, 이어서, 이중-특이적 FLT3/CD123 CAR-T 세포와 함께 공동 배양되었다는 것을 나타낸다. 생 표적 세포의 분율(좌), T 세포 활성화 %(CD69 발현, 중간) 및 탈과립(CD107a 표면 발현, 우), T 세포 상의 CellTrace 마킹의 중앙값 형광 강도(MFI) 및 표적 세포 상의 FLT3 및 CD123 표면 발현(MFI)을 나타내는 플롯을 상이한 E:T 비로 보고한다. 평균±SD (N=4). 이원 ANOVA에 의한 통계학적 비교.
도 49D는 에피토프-편집된 이중 FLT3N399/CD123S59 또는 AML PDX-2와 공동 생착되고 4G8 및 CSL362 CAR-T 세포의 1:1 풀로 처리한 AAVS1 BE HSPC의 이종이식 및 분석의 개략적 표현이다.
도 49E는 4G8/CSL362 CAR로 처리한 CD34+ HSPC, CD34+ HSPC + AML PDX-2, 또는 CD34+ HSPC + AML PDX-2를 생착한 마우스로부터의 BM 샘플의 대표적인 유세포분석 플롯을 나타낸다. 플롯은 총 인간 CD45+ 상에서 사전 게이팅되고; CAR T 세포는 CD3 염색에 의해 식별되며, AML PDX 세포는 mNeonGreen+이다.
도 49F는 hCD45+CD3- BM 세포 내의 AML PDX 세포의 %를 나타내는 막대 플롯이다. 평균±SD. 일원 ANOVA에 의한 통계학적 비교.
도 49G는 D로부터의 마우스의 종점에서 총 혈액 세포에 대해(9, 10주차) 및 분류된 CD33+ 및 CD19+ BM 세포에 대해 측정된 FLT3(좌) 및 CD123(우) 염기 편집을 나타낸다. 평균±SD. 다중 독립표본 t 검정에 의한 통계학적 비교.
도 49H는 HSC에서 분화 백혈구까지 BM의 골수성(좌) 및 림프구(우) 계통 서브세트의 절대수를 나타낸다. 비처리 마우스를 모으고(회색 막대), CAR-처리 FLT3N399+CD123S59 마우스를 핑크색으로 보고하고, CAR-처리 AAVS1 BE 마우스를 청색으로 보고한다. CAR 처리 그룹에 대한 절대수의 배수 변화(FLT3N399+CD123S59 /AAVS1)를 각 집단 막대 플롯 위에 보고한다. 평균±SD. 다중 비교에 의한 일원 ANOVA. 4G8 CAR로 처리한 FLT3N399/CD123S59 대 AAVS1 BE 조건 간 비교의 FDR-조절 p 값을 보고한다(p < 0.05는 볼드체임).
표적화된 암 요법을 위한 적합한 단백질을 식별하는 것은 상당한 문제를 제기한다. 다수의 잠재적인 표적 단백질이 암 세포의 세포 표면과 정상, 비암 세포의 세포 표면 모두에 존재하며, 이는 대상체의 발달 및/또는 생존에 필요하거나 결정적으로 관련될 수 있다. 많은 표적 단백질이 이러한 필수세포의 기능성에 기여한다. 따라서, 이러한 단백질을 표적화하는 요법은 대상체에서 해로운 효과, 예컨대, 상당한 독성 및/또는 다른 부작용으로 이어질 수 있다. 추가로, CAR-T 요법에 대한 저항성은 암세포에 대한 암 항원의 전환으로 인해 혈액학적 악성종양, 예컨대, 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에서 어려움으로 남아있으며, 이에 의해 CAR-T 요법을 피한다.
따라서, 본 개시내용은 적어도 위에 언급된 문제를 해결하는 것을 목표로 하는 방법, 세포, 조성물 및 키트를 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법, 세포, 조성물 및 키트는 혈액학적 악성종양에 대한 안전하고 효과적인 치료를 제공하여, 암세포뿐만 아니라 대상체의 발달 및/또는 생존에 중요한 세포 상에 존재하는 하나 이상의 세포 표면 단백질의 표적화를 가능하게 한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 조혈 세포, 예컨대, 세포-표면 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자, 예를 들어, FLT3, CD123 및/또는 KIT에 유전자 편집을 갖는 조혈줄기세포(HSPC); 예를 들어, 특정 가이드 RNA를 사용하는 CRISPR 접근을 통해 이들을 생산하는 방법; 단독으로, 또는 야생형 세포-표면 항원을 표적화하지만 조작된 조혈 세포에서 편집된 유전자에 의해 암호화된 것이 아닌 하나 이상의 세포독성제(예를 들어, CAR-T 세포)와 조합하여 사용되는 조작된 조혈 세포를 사용하여 조혈 악성 종양을 치료하는 방법; 및 조작된 조혈 세포를 포함하는 키트가 본 명세서에서 기재된다.
I. 유전자 조작된 조혈 세포
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 세포는 편집된 FLT3 유전자, CD123 유전자, 또는 KIT 유전자를 갖는다. 일부에서, 이러한 유전자 중 하나 이상은 돌연변이된다. 일부 예에서, 돌연변이된 FLT3 유전자, CD123 유전자 또는 KIT 유전자는 FLT3 유전자, CD123 유전자 또는 KIT 유전자의 생활성을 (전체적 또는 부분적으로) 유지하기 위해 하나 이상의 비필수 에피토프에 돌연변이 또는 결실을 포함한다.
i. 조혈줄기세포
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조혈 세포는 조혈줄기세포이다. 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)는 각각 골수성 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 등) 및 림프구 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포)를 추가로 생성하는 골수와 림프구 전구세포를 모두 생성할 수 있다. HSPC는 HSPC의 식별 및/또는 단리를 위해 사용될 수 있는 세포 표면 마커 CD34(예를 들어, CD34+)의 발현을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, HSPC는 포유류 대상체와 같은 대상체로부터 얻는다. 일부 실시형태에서, 포유류 대상체는 비-인간 영장류, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 소, 돼지, 말 또는 가축 동물이다. 일부 실시형태에서, HSPC는 인간 환자, 예컨대, 조혈 악성종양을 앓고 있는 인간 환자로부터 얻는다. 일부 실시형태에서, HSPC는 건강한 공여자로부터 얻는다. 일부 실시형태에서, HSPC는 유전자 조작된 HSPC가 후속적으로 투여될 대상체로부터 얻는다. 세포를 얻은 동일한 대상체에게 투여되는 HSPC는 자가 세포로 지칭되는 반면, 세포를 투여한 대상체가 아닌 대상체로부터 얻은 HSPC는 동종이계 세포로 지칭된다(거부 적응증을 감소시키는 방법은 표준이고, 당업계에 잘 알려져 있다).
HSPC는 당업계에 알려진 협약 수단을 사용하여 임의의 적합한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, HSPC는 대상체로부터의 샘플(또는 공여자), 예컨대, 골수 샘플로부터 또는 혈액 샘플로부터 얻는다. 대안적으로 또는 추가로, HSPC는 탯줄(즉, 제대혈 세포)로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, HSPC는 골수, 제대혈 세포 또는 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 유래된다. 일반적으로, 골수 세포는 대상체(또는 공여자)의 장골능, 대퇴골, 경골, 척추, 갈비뼈 또는 다른 골수 공간으로부터 얻을 수 있다. 골수는 환자로부터 수득하고, 당업계에 알려진 다양한 분리 및 세척 절차를 통해 단리시킬 수 있다. 골수 세포의 단리를 위한 예시적인 절차는 다음의 단계를 포함한다: a) 골수 샘플을 추출하는 단계; b) 3개 분획에서 골수 현탁액의 원심분리 및 중간 분획 또는 버피 코트를 수집하는 단계; c) 단계 (b)에서 얻은 버피 코트 분획을 분리액, 통상적으로 Ficoll™에서 한 번 더 원심분리시키고, 골수 세포를 함유하는 중간 분획을 수집하는 단계; 및 d) 재수혈 가능한 골수 세포의 회수를 위해 단계 (c)에서 수집된 분획을 세척하는 단계.
HSPC는 전형적으로 골수에 존재하지만, 말초 혈액으로부터 HSPC를 수집하기 위해 가동화제(mobilizing agent)를 투여함으로써 순환 혈액으로 동원될 수 있다. 일부 실시형태에서, HSPC를 얻은 대상체(또는 공여자)는 가동화제, 예컨대, 과립구 집락자극인자(G-CSF)가 투여된다. 가동화제를 사용하는 동원 후 수집된 HSPC의 수는 전형적으로 가동화제의 사용 없이 얻은 세포의 수보다 많다.
일부 실시형태에서, 샘플은 대상체(또는 공여자)로부터 얻고, 이어서, 목적하는 세포 유형(예를 들어, CD34+, CD34+CD38-, CD133+, CD90+, CD49f+)에 대해 풍부화된다. 예를 들어, PBMC 및/또는 CD34+ 조혈 세포는 본 명세서에 기재된 혈액으로부터 단리될 수 있다. 세포는 또한 다른 세포로부터, 예를 들어, 목적하는 세포 유형의 세포 표면 상의 에피토프에 결합하는 항체에 의한 단리 및/또는 활성화에 의해 단리될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 수용체 관여(engagement)에 의해 세포를 활성화시키는 일 없이 특정 세포 유형을 선택적으로 풍부화하는 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하는 음성 선택을 포함한다.
ii. 돌연변이된 세포-표면 항원
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조혈줄기세포(HSPC)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포독성제(예를 들어, 항-FLT3 항체, 항-CD123 항체, 항-KIT 항체)에 대한 결합이 감소되거나 결합이 없는 돌연변이된 형태(본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용되는 돌연변이체 또는 변이체)로 관심의 하나 이상의 세포-표면 단백질을 암호화하는 편집된 유전자(예를 들어, FLT3, CD123, KIT)를 포함할 수 있다. 돌연변이체는, 세포독성제에 대한 결합이 천연 또는 야생형 세포-표면 단백질 상대와 비교할 때 감소되거나 제거되도록, 세포독성제가 결합하는 에피토프의 하나 이상의 돌연변이를 지닐 수 있다. 이러한 돌연변이체는 야생형 상대와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 유지하는 데 바람직하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "감소된 결합"은 적어도 25%까지 감소되는 결합을 지칭한다. 결합 수준은 조혈줄기세포에 대한 세포독성제의 결합의 양 또는 야생형(즉, 비조작, 비돌연변이) 단백질과 비교할 때 세포-표면 단백질에 대한 세포독성제의 결합의 양을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합은 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 감소된다. 일부 실시형태에서, 통상적인 분석에서 검출 가능한 결합이 실질적으로 없도록, 결합이 감소된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "결합 없음"은 실질적으로 결합 없음, 예를 들어, 통상적인 결합 분석에서 결정할 때 검출 가능한 결합 없음 또는 기준선 결합 단독을 지칭한다.
일부 예에서, 돌연변이된 에피토프에 결합하지 않거나 감소된 결합을 갖도록, 변이체가 관심 에피토프 내에 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의) 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 이러한 돌연변이체는 세포독성제에 대해 실질적으로 감소된 결합 친화도를 가질 수 있다(예를 들어, 이의 야생형 상대보다 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 낮은 결합 친화도를 가짐). 일부 예에서, 이러한 변이체는 세포독성제에 대해 결합 활성이 없을 수 있다. 다른 예에서, 돌연변이체는 관심 에피토프를 포함하는 영역의 결실을 포함한다. 이러한 영역은 엑손에 의해 암호화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 영역은 에피토프를 암호화하는 관심의 세포-표면 단백질의 도메인이다. 일례에서, 변이체는 단지 결실된 에피토프를 갖는다. 결실 영역의 길이는 3 내지 60개의 아미노산, 예를 들어, 5 내지 50, 5 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20 등의 범위일 수 있다.
돌연변이(들) 또는 결실(들)이 단백질의 생활성에 실질적으로 영향을 미치지 않도록 세포-표면 항원의 돌연변이체에서 돌연변이(들) 또는 결실은 비필수 에피토프 내에 또는 주변에 있을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "에피토프"는 항체의 CDR에 의해 결합되는 세포-표면 항원과 같은 단백질의 아미노산 서열(선형 또는 입체구조)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 세포독성제는 세포-표면 항원의 하나 이상의(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5개 이상의) 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 세포독성제는 세포-표면 항원의 하나 초과의 에피토프에 결합하고, 에피토프 각각이 존재하지 않고/않거나 세포독성제에 의한 결합에 이용 가능하지 않도록 조혈 세포가 조작된다.
일부 실시형태에서, 편집된 유전자가 하나 이상의 비필수 에피토프에서 돌연변이를 갖는 돌연변이된 세포-표면 항원을 발현시키도록, 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 HSPC는 세포-표면 항원의 하나 이상의 편집된 유전자를 갖는다. "비필수 에피토프"(또는 이들을 포함하는 단편)는 세포 표면 단백질의 생활성에 실질적으로 영향을 미칠 가능성이 적은 돌연변이인, 세포 표면 단백질/항원 내의 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 조혈 세포는 세포-표면 항원의 비필수 에피토프의 결실 또는 돌연변이를 포함하고, 이러한 조혈 세포는 야생형 세포-표면 항원을 발현시키는 조혈 세포와 유사한 수준으로 증식되고/되거나 적혈구생성 분화를 거칠 수 있다.
세포-표면 항원에서 비필수 에피토프를 식별 및/또는 확인하기 위한 방법은 당업자에 의해 알려지고 인식되고, 또한 본 개시내용의 범주 내이다. 추가로, 세포-표면 항원 및 조혈 세포의 기능성을 평가하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 증식 분석, 분화 분석, 콜로니 형성, 발현 분석(예를 들어, 유전자 및/또는 단백질), 단백질 국재화, 세포내 신호전달, 기능성 분석 및 생체내 인간화된 마우스 모델을 포함한다.
iii. 유전자 조작된 조혈 세포의 제조
하나 이상의 세포-표면 항원의 편집된 유전자를 지니는 임의의 유전자 조작 조혈 세포, 예컨대, HSPC는 일상적인 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작은 게놈 편집을 사용하여 수행된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "게놈 편집"은 표적 유전자를 발현시키기 위해 유기체의 임의의 단백질-암호화 또는 비-암호화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 게놈을 변형시키는 방법을 지칭한다. 일반적으로, 게놈 편집 방법은, 예를 들어, 표적화된 뉴클레오타이드 서열에서 게놈의 핵산을 절단할 수 있는 엔도뉴클레아제의 용도에 관한 것이다. 일부 예에서, 게놈 편집 방법은 사멸 뉴클레아제 또는 틈내기효소인 뉴클레아제의 용도에 관한 것이다. 게놈에서 이중가닥 파손의 수선은 돌연변이를 도입하여 수선될 수 있고/있거나 외인성 핵산이 표적화된 부위에 삽입될 수 있다. 일부 경우에, 게놈 편집 방법은 염기 편집기의 경우에 기능적 도메인, 예를 들어, 아데닌 또는 사이티딘 데아미나제 도메인에 융합된 촉매적 비활성 또는 부분적 비활성 엔도뉴클레아제의 용도에 관한 것이다. 다른 기능적 도메인은 프라임 편집기, CRISPR-Cas 활성체 또는 리프레서 등을 포함한다.
게놈 편집 방법은 일반적으로 표적 핵산에서 이중가닥 파손을 생성하는 데 관련되는 엔도뉴클레아제의 유형에 기반하여 분류된다. 이러한 방법은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성체-유사 효과기-기반 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 및 CRISPR/Cas 시스템의 용도를 포함한다.
본 개시내용의 일 양상에서, 세포가 세포독성제에 결합하지 않도록, 암세포를 정상 세포의 변형된 집단으로 대체하는 것은 조작된 정상 세포를 사용하여 수행된다. 이러한 변형은 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 특정 세포-표면 단백질의 에피토프의 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서, 규칙적으로 간격을 두어 분포하는 짧은 회문구조 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat: CRISPR)-Cas 시스템은 조작된, 비자연발생적 CRISPR-Cas 시스템이다.
CRISPR 시스템은 박테리아 적응 면역에 필수적인 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 암호화한다. CRISPR-관련(Cas) 뉴클레아제는 다양한 게놈 편집을 위해 표적 DNA 서열을 절단하도록 용이하게 프로그래밍될 수 있다. 이러한 뉴클레아제 중 한 부류는 2개의 짧은 RNA, 즉, crRNA 및 트랜스 활성화 crRNA(tracrRNA)와의 복합체인 Cas9 단백질로 지칭된다. 가장 통상적으로 사용되는 Cas9 오솔로그인 SpCas9는 표적 DNA 부위의 "프로토스페이서" 영역에 상보적인 5' 단부에 20 뉴클레오타이드(nt)를 갖는 crRNA를 사용한다. 효율적인 절단은 또한 SpCas9가 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)를 인식하는 것을 필요로 한다. crRNA 및 tracrRNA는 보통 SpCas9의 DNA 절단 활성을 지시하는 단일 대략 100-nt 가이드 RNA(gRNA)와 조합된다. 또한 표적 DNA 서열을 절단하도록 프로그래밍될 수 있는 Cpf1로 명명된 Cas 단백질이 식별되었다. SpCas9와 달리, Cpf1은 표적 DNA 서열의 프로토스페이서에 상보적인 3' 단부에 23 nt를 갖는 단일 42-nt crRNA만을 필요로 한다.
일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제 또는 이의 변이체이다. Cas9 엔도뉴클레아제는 표적 핵산의 이중가닥 DNA를 절단하여 평활말단을 생성한다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제 또는 이의 변이체이다. Cleavage with Cpf1 뉴클레아제에 의한 절단은 핵산의 엇갈린 말단(staggered end)을 생성한다.
Cas9
일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 효소 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스(SpCas9) 또는 스타필로코커스 아우레우스(SaCas9)로부터 유래된다.
SpCas9 야생형 서열은 다음과 같다(서열번호 1):
SaCas9 야생형 서열은 다음과 같다(서열번호 2):
일반적으로, 표적 핵산은 엔도뉴클레아제와 상호작용할 수 있고 표적 핵산에 대한 엔도뉴클레아제 활성을 표적화하는 데 추가로 관련될 수 있는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 의해 3' 측면 또는 5' 측면 상에 측접된다. 일반적으로 표적 핵산에 측접하는 PAM 서열은 엔도뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제가 유래된 공급원에 따르는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래된 Cas9 엔도뉴클레아제의 경우, PAM 서열은 NGG이지만, PAM 서열 NAG 및 NGA는 더 낮은 효율로 인식될 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래된 Cas9 엔도뉴클레아제의 경우, PAM 서열은 NNGRRT(서열번호 3)이다.
따라서, 일부 예에서, 하나 이상의 PAM 서열을 인식할 수 있도록 엔도뉴클레아제가 조작/변형된다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제가 조작/변형 없이 인식하는 PAM 서열과 상이한 하나 이상의 PAM 서열을 인식하도록 조작/변형되었다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 효소의 비표적 활성을 감소시키도록 조작/변형되었다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 엔도뉴클레아제의 PAM 인식을 변경시키도록 변형된다. 예를 들어, Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, SpCas9)는 다음의 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 갖는다: A61, L1111, D1135, S1136, G1218, E1219, N1317, A1322, R1333, R1335, T1337. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2016/141224 및 WO 2017/040348, 미국 특허 출원 공개 제2021/0284978A1호를 참조하며, 이들 모두는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제의 야생형 형태이다. 예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제는 서열번호 1에서 위에 나타낸 서열을 갖는 SpCas9 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, SpCas9 엔도뉴클레아제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일하고, 예를 들어, 예를 들어, 보존적 돌연변이로 대체된 서열번호 1의 잔기의 최대 5%, 10%, 15% 또는 20%의 차이를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 모체의 목적하는 활성, 예를 들어, 뉴클레아제 활성(모체가 틈내기효소 또는 사멸 Cas9인 경우를 제외), 및/또는 가이드 RNA 및 표적 DNA와 상호작용하는 능력)를 보유한다. 다른 예에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 서열번호 2에서 위에 나타낸 서열을 갖는 SaCas9 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, SaCas9 엔도뉴클레아제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일하고, 예를 들어, 예를 들어, 보존적 돌연변이로 대체된 서열번호 2의 잔기의 최대 5%, 10%, 15% 또는 20%의 차이를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 모체의 목적하는 활성, 예를 들어, 뉴클레아제 활성(모체가 틈내기효소 또는 사멸 Cas9인 경우를 제외), 및/또는 가이드 RNA 및 표적 DNA와 상호작용하는 능력)를 보유한다.
일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 촉매적으로 비활성인 Cas9이다. 예를 들어, dCas9는 촉매적으로 활성인 잔기(D10, E762, D839, H983 또는 D986; 및/또는 H840 또는 N863)에 돌연변이를 포함하고, 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. 예를 들어, 돌연변이는 (i) D10A 또는 D10N, 및/또는 (ii) H840A, H840N 또는 H840Y이다.
일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 K918에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이는 K918N이다.
일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 단백질의 활성을 변경시키도록 추가로 변형된다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 촉매적 잔기를 비활성화시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 "틈내기효소" 또는 "Cas9n"로 지칭되는 엔도뉴클레아제 촉매적 잔기 중 하나를 비활성화시키도록 변형되었다. Cas9 틈내기효소 엔도뉴클레아제는 표적 핵산의 하나의 DNA 가닥을 절단한다.
일부 예에서, 엔도뉴클레아제는 NG-SpCas9 틈내기효소이고, 다음의 돌연변이를 갖는다: D10A, L1111R, D1135V, G1218R, E1219F, A1322R, R1335V, T1337R(야생형 SpCas9에 대해). 일부 예에서, 엔도뉴클레아제는 SpRY-Cas9 틈내기효소이고, 다음의 돌연변이를 갖는다: D10A, A61R, L1111R, D1135L, S1136W, G1218K, E1219Q, N1317R, A1322R, R1333P, R1335Q, T1337R(야생형 SpCas9에 대해).
Cpf1(Cas12a)
일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제 또는 이의 변이체이다. Cpf1 엔도뉴클레아제는 표적 핵산의 5' 단부에 위치된 PAM 서열을 일반적으로 인식한다. Cpf1 뉴클레아제의 경우, PAM 서열은 TTTN이다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, Cas 엔도뉴클레아제 Cpf1 뉴클레아제는 또한 Cas12a로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 라크노스피라세아 박테리움(LbCpf1), 아시다미노코커스 종(AsCpf1) 또는 프란시셀라 투라렌시스(Francisella tularensis)(FnCpf1)로부터 유래된 Cpf1 뉴클레아제를 발현시킨다. 각각에 대해 야생형 서열을 아래에 나타낸다.
V형 CRISPR-관련 단백질 Cpf1 [라크노스피라세아 박테리움 ND2006], GenBank 수탁번호 WP_051666128.1(서열번호 4)
V형 CRISPR-관련 단백질 Cpf1 [아시다미노코커스 종 BV3L6], NCBI 참조 서열: WP_021736722.1(서열번호 5)
Type V CRISPR-관련 단백질 Cpf1 [프란시셀라 투라렌시스], GenBank 수탁번호 WP_003040289.1(서열번호 6)
일부 실시형태에서, Cpf1 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제의 야생형 형태이다. 예를 들어, Cpf1 엔도뉴클레아제는 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6에서 위에 나타낸 서열을 갖는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cpf1 엔도뉴클레아제는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일하고, 예를 들어, 예를 들어, 보존적 돌연변이로 대체된 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 잔기의 최대 5%, 10%, 15% 또는 20%의 차이를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 모체의 목적하는 활성, 예를 들어, 뉴클레아제 활성(모체가 틈내기효소 또는 사멸 Cas9인 경우를 제외), 및/또는 가이드 RNA 및 표적 DNA와 상호작용하는 능력을 보유한다.
Cpf1의 촉매적으로 비활성인 변이체(Cas12a)는 dCas12a로 지칭될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, AsCpf1의 경우, 촉매 활성-파괴 돌연변이는 D908 및 E993에서, 예를 들어, D908A 및 E993A에서 이루어지고; LbCpf1 촉매적 활성-파괴 돌연변이의 경우, D832 및 E925에서, 예를 들어, D832A 및 E925A에서 이루어지고; FnCpf1 촉매적 활성-파괴 돌연변이의 경우, D917A 및 E1006A에서 이루어진다.
기능적 도메인
대안적으로 또는 추가로, Cas 엔도뉴클레아제(즉, Cas9 또는 Cas12a)는 다른 단백질 또는 이의 일부, 예를 들어, 이종성 기능적 도메인에 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 전사 활성화 도메인(예를 들어, VP64 또는 NF-KB p65)이다. 일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 전사 사일런서 또는 전사 억제 도메인이다(예를 들어, 전사 억제 도메인은 Krueppel-관련 박스(KRAB) 도메인, ERF 리프레서 도메인(ERD) 또는 mSin3A 상호작용 도메인(SID)이되; 전사 사일런서는 이질염색질 단백질 1(HP1)임). 일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 DNA의 메틸화 상태를 변형시키는 효소(예를 들어, DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 또는 TET 단백질(예컨대, TET1)이다). 일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 히스톤 서브유닛을 변형시키는 효소(예를 들어, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT), 히스톤 데아세틸라제(HDAC), 히스톤 메틸트랜스퍼라제(HMT) 또는 히스톤 데메틸라제)이다. 일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 생물학적 테더(예를 들어, MS2, Csy4 또는 람다 N)이다. 일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 FokI이다.
일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 염기 편집기, 예컨대, 사이토신 DNA 염기를 변형시키는 데아미나제, 예를 들어, 아포지질단백질 B mRNA-편집 효소로부터의 사이티딘 데아미나제, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D/E, APOBEC3F, APOBEC3G, APOBEC3H, APOBEC4, 활성화-유도 사이티딘 데아미나제(AID), 사이토신 데아미나제 1(CDA1) 및 CDA2, 및 tRNA에 작용하는 사이토신 데아미나제(CDAT)를 포함하는 데아미나제의 촉매적 폴리펩타이드-유사(APOBEC) 패밀리이다. 구체적인 예는 evoAPOBEC1-BE4max, eA3A-BE5 및 EA-BE4max를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 아데노신 DNA 염기를 변형시키는 데아미나제이고, 예를 들어, 데아미나제는 아데노신 데아미나제 1(ADA1), ADA2; RNA 1에 작용하는 아데노신 데아미나제(ADAR1), ADAR2, ADAR3; tRNA 1에 작용하는 아데노신 데아미나제(ADAT1), ADAT2, ADAT3; 및 자연 발생적 또는 조작된 tRNA-특이적 아데노신 데아미나제(TadA)이다. 예를 들어, ABE8e-TadA-8e. 일부 실시형태에서, TadA 아데노신 데아미나제 도메인은 V106W 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인은 내인성 DNA 수선 또는 염기 절단 수선(BER) 경로를 저해 또는 향상시키는 효소, 도메인 또는 펩타이다, 예를 들어, BER을 개시하기 위해 유라실의 유라실 DNA 글리코실라제(UDG, 유라실 N-글리코실라제 또는 UNG로도 알려짐) 매개 절단을 저해하는 유라실 DNA 글리코실라제 저해제(UGI); 또는 DNA 말단-결합 단백질, 예컨대, 박테리오파지 Mu로부터의 Gam이다.
일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 염기 편집기이다. 염기 편집기 엔도뉴클레아제는 일반적으로 염기 편집기에 융합된 촉매적으로 비활성인 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, 엔도뉴클레아제는 D10, E762, D839, H983 또는 D986에서; 그리고/또는 H840 또는 N863에서 돌연변이를 갖는 SpCas9이고, 염기 편집기, 예컨대, 위에 언급된 것에 융합된다.
일부 예에서, 엔도뉴클레아제(Cas9 또는 Cas12a)는 핵 국제화 서열, 세포 침투 펩타이드 서열, 친화도 태그 및/또는 형광 단백질 중 하나 이상에 융합된다. 예를 들어, 핵 국제화 서열은 SV40 거대 T-항원 핵 국제화 서열(PKKKRKV; 서열번호 82), 뉴클레오플라스민 핵 국제화 서열(KRPAATKKAGQAKKKK; 서열번호 83) 또는 c-Myc 핵 국제화 서열(PAAKRVKLD; 서열번호 84)이다. 예를 들어, 핵 국제화 서열(들)은 Cas9 또는 Cas12a 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종성 기능적 도메인이 Cas9 또는 Cas12a 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합될 때, 핵 국제화 서열(들)은 이종성 기능적 도메인-Cas 단백질 복합체의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되거나, 이종성 기능적 도메인과 Cas 단백질 사이에 개재된다.
예시적인 Cas 엔도뉴클레아제의 서열은 아래에 제공된다:
서열번호 7(SpRY-ABE8e-V106W 3xNLS 아데닌 염기 편집기의 아미노산 서열):
서열번호 85(SpRY-ABE8e 3xNLS 아데닌 염기 편집기의 아미노산 서열):
서열번호 8 - SpRY-evoAPOBEC1-BE4 3xNLS 아데닌 염기 편집기의 아미노산 서열
서열번호 9 - SpRY-K918N-ABE8e-V106W 3xNLS 아데닌 염기 편집기의 아미노산 서열
서열번호 10 - SpRY-ABE8e-V106W 3xNLS 아데닌 염기 편집기의 뉴클레오타이드 서열:
서열번호 11 - SpRY-evoAPOBEC1-BE4 3xNLS 아데닌 염기 편집기의 뉴클레오타이드 서열:
서열번호 12 - SpRY-K918N-ABE8e-V106W 3xNLS 아데닌 염기 편집기의 뉴클레오타이드 서열
gRNA
용어 "gRNA", "가이드 RNA" 및 "CRISPR 가이드 서열"은 전체적으로 상호 호환 가능하게 사용될 수 있고, CRISPR/Cas 시스템의 Cas DNA 결합 단백질의 특이성을 결정하는 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. gRNA는 숙주 세포 게놈에서 표적 핵산 서열에 (상보적으로, 부분적 또는 완전히) 혼성화된다. 일부 예에서, gRNA는 crRNA 및 tracrRNA를 총괄적으로 지칭한다(예를 들어, Cas9 뉴클레아제가 사용될 때 - 해당 경우에, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA, 즉, sgRNA로 지칭될 수 있음). 다른 예에서, gRNA는 crRNA만을 지칭한다(예를 들어, Cpf1 엔도뉴클레아제가 사용되는 경우). 표적 핵산에 혼성화하는 gRNA 또는 이의 일부는 15 내지 25개의 뉴클레오타이드, 18 내지 22개의 뉴클레오타이드, 또는 19 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산에 혼성화하는 gRNA 서열은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산에 혼성화하는 gRNA 서열은 10 내지 30, 또는 15 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열은 핵산에 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 적어도 100% 상보성이다.
FLT3, CD123 및 KIT를 편집하기 위한 예시적인 가이드 RNA는 아래의 표 1에 제공된다. 당업자에게 분명한 바와 같이, gRNA 서열의 선택은 예측된 표적 그리고/또는 비표적의 결합 부위 수와 같은 인자에 따를 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열은 잠재적인 표적 부위를 최대화하고 잠재적인 비표적 부위를 최소화하도록 선택된다.
일부 실시형태에서, 여러 개의 gRNA가 세포에 도입된다(예를 들어, FLT3에 대해 1개 및 CD123에 대해 1개). 일부 실시형태에서, 2개 이상의 가이드 RNA가 등몰량으로 세포에 형질감염된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 가이드 RNA가 등몰이 아닌 양으로 제공된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 가이드 RNA는 각 표적의 편집이 동일한 빈도로 일어나도록 최적화되는 양으로 제공된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 가이드 RNA는 각 표적의 편집이 최적의 빈도로 일어나도록 최적화되는 양으로 제공된다.
주형 공여자 서열
일부 실시형태에서, "주형" 공여자 서열이 본 명세서에 제공된다. 주형 공여자 서열은, 목적하는 돌연변이가 특정 유전자에 도입되도록, 상동 유도 수선(HDR)을 위한 공여자 주형으로 작용하는 100 내지 500개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 200 뉴클레오타이드) 길이 단일 가닥 올리고-데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 포함한다. 각각의 공여자 주형은 성공적인 DNA 수선 후에 CRISPR-Cas 리보뉴클레오단백질 뉴클레아제 복합체에 의한 재절단 위험을 감소시키기 위해 방관자(bystander) 아미노산의 선택된 침묵 돌연변이를 추가로 포함한다.
FLT에서 돌연변이 N399D의 도입을 위한 예시적인 주형 공여자 서열은 아래의 표 2에 제공된다.
iv. 유전자 조작된 조혈 세포
하나 이상의 세포-표면 항원을 발현시키기 위한 편집 유전자를 돌연변이 형태로 지니는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 조혈 세포를 생성하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법은 세포를 제공하는 단계 및 게놈 편집에 대한 CRISPR Cas 시스템의 세포 구성성분에 도입되는 단계를 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부에 혼성화하거나 혼성화하는 것으로 예측되는 CRISPR-Cas 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 핵산이 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 벡터 상의 세포이 도입된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산으로서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, gRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드는 동일한 핵산(예를 들어, 동일한 벡터) 상의 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 단백질의 형태로 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 시험관내에서 사전형성되고, 리보뉴클레오단백질 복합체로서 세포에 도입된다.
v. 돌연변이체 FLT3
일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질은 FLT3이다. 야생형 FLT3의 아미노산 서열을 아래에 나타낸다:
서열번호 48 (FLT3 야생형 아미노산 서열)
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제(또는 이의 변이체)를 사용하여 조혈 세포의 집단을 유전자 조작하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체(예를 들어, SpCas9 또는 AsCpf1)를 사용하여 조혈 세포 집단에서 세포-표면 항원을 암호화하는 유전자를 유전자 조작하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 FLT3 유전자를 유전자 변형 또는 편집하거나, CD123 유전자를 유전자 변형 또는 편집하거나, KIT 유전자를 유전자 변형 또는 편집하거나, Cas 뉴클레아제를 사용하여 조혈 세포의 집단에서 FLT3 유전자 및 CD123 유전자를 유전자 변형하거나 편집하는 단계를 수반한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 사용하여 조혈 세포의 집단에서 돌연변이체 FLT3 유전자를 유전자 조작하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 사용하여 조혈 세포의 집단에서 FLT3의 엑손 9에서 돌연변이를 유전자 조작하는 단계를 수반한다(예를 들어, 암호화된 폴리펩타이드에서 위치 N399의 돌연변이를 초래함). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체 및 서열번호 13 내지 23 중 어느 하나에 의해 제공된 가이드 서열을 사용하여 조혈 세포 집단에서 돌연변이체 FLT3 유전자를 유전자 조작하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 주형 공여자 DNA 서열이 또한 제공된다. 예를 들어, 주형 공여자 DNA 서열은 서열번호 40 내지 43 중 어느 하나에 의해 제공된다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 치료용 항-FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 FLT3 유전자의 엑손 9에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자의 엑손 9에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 N399에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 예에서, 위치 N399의 돌연변이는 N399D 또는 N399G이다. 유전자 조작된 FLT3의 예시적인 아미노산 서열은 아래에 제공된다:
서열번호 49 FLT3 N354S, S356Q, D358E, Q363P, E366K, Q378R, T384I, R387Q, K389A, K395R, D398E, N399D, N408D, H411N, Q412K, H419Y; FLT3 - ECD4 변이체(N399D을 포함하여, 클론 4G8의 결합을 감소시키는 세포외 도메인 4 내의 16개의 아미노산 치환을 보유)
서열번호 50 FLT3 N354S, S356Q, D358E, Q363P, E366K, Q378R, T384I, R387Q, K389A, K395R, D398E, N399D(FLT3 엑손 9 돌연변이)
서열번호 51 (FLT3 N399D 변이체 아미노산 서열)
서열번호 52 (FLT3 N399G 변이체 아미노산 서열)
일부 실시형태에서, 서열번호 51에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 N399D에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항- FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 52에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 N399G에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항- FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
vi. 돌연변이체 CD123
일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질은 CD123이다. 야생형 CD123의 아미노산 서열을 아래에 나타낸다:
서열번호 53 (CD123 야생형 아미노산 서열)
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 사용하여 조혈 세포의 집단에서 돌연변이체 CD123 유전자를 유전자 조작하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 사용하여 조혈 세포의 집단에서 CD123의 엑손 2에서(예를 들어, 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드에서 위치 S59의 돌연변이를 초래함) 또는 CD123의 엑손 3에서(예를 들어, 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드에서 위치 P88의 돌연변이를 초래함) 돌연변이를 유전자 조작하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체 및 서열번호 24 내지 35 중 어느 하나에 의해 제공된 가이드 서열을 사용하여 조혈 세포 집단에서 돌연변이체 CD123 유전자를 유전자 조작하는 단계를 수반한다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 HSPC는 유전자 조작된 CD123 유전자를 포함하되, 유전자 조작된 CD123 유전자는 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 CD123 유전자의 엑손 2 또는 엑손 3에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 2에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 S59에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 예에서, 위치 S59의 돌연변이는 S59P 또는 S59F이다. 일부 예에서, 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 3에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 P88에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 예에서, 위치 P88의 돌연변이는 P88L 또는 P88S이다. 유전자 조작된 CD123의 예시적인 아미노산 서열은 아래에 제공된다:
서열번호 54 (CD123 S59P 변이체 아미노산 서열)
서열번호 55 (CD123 Y58H S59P 변이체 아미노산 서열)
서열번호 56 (CD123 S59F 변이체 아미노산 서열)
서열번호 57 (CD123 P88S 변이체 아미노산 서열)
서열번호 58 (CD123 P88L 변이체 아미노산 서열)
뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:
CD123 엑손2 야생형 서열(서열번호 59)
IL3RA_gRNA_N 또는 IL3RA_gRNA_R 및 SpRY_ABE8e_V106W에 의해 유도된 염기 편집을 갖는 CD123 엑손2 서열(I 변이체)(서열번호 60)
IL3RA_gRNA_N 또는 IL3RA_gRNA_R 및 SpRY_ABE8e_V106W에 의해 유도된 염기 편집을 갖는 CD123 엑손2 서열(II 변이체)(서열번호 61)
IL3RA_gRNA_N 또는 IL3RA_gRNA_R 및 SpRY_ABE8e_V106W에 의해 유도된 염기 편집을 갖는 CD123 엑손2 서열(III 변이체)(서열번호 62)
IL3RA_gRNA_N 또는 IL3RA_gRNA_R 및 SpRY_ABE8e_V106W에 의해 유도된 염기 편집을 갖는 CD123 엑손2 서열(IV 변이체)(서열번호 63)
IL3RA_gRNA_N 또는 IL3RA_gRNA_R 및 SpRY_ABE8e_V106W에 의해 유도된 염기 편집을 갖는 CD123 엑손2 서열(V 변이체)(서열번호 64)
IL3RA_gRNA_N 또는 IL3RA_gRNA_R 및 SpRY_ABE8e_V106W에 의해 유도된 염기 편집을 갖는 CD123 엑손2 서열(VI 변이체)(서열번호 65)
일부 실시형태에서, 서열번호 54에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 S59P에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 55에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 Y58H 및 S59P에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 56에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 S59F에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 57에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 P88S에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 58에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 P88L에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
vii. 돌연변이체 KIT
일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질은 KIT이다. 야생형 KIT의 아미노산 서열을 아래에 나타낸다:
서열번호 66 (KIT 야생형 아미노산 서열)
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 사용하여 조혈 세포의 집단에서 돌연변이체 KIT 유전자를 유전자 조작하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체를 사용하여 조혈 세포의 집단에서 KIT의 엑손 7(예를 들어, 돌연변이 위치 H378)에서의 돌연변이를 유전자 조작하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체 및 서열번호 36 내지 47 중 어느 하나에 의해 제공된 가이드 서열을 사용하여 조혈 세포 집단에서 돌연변이체 KIT 유전자를 유전자 조작하는 단계를 수반한다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 HSPC는 유전자 조작된 KIT 유전자를 포함하되, 유전자 조작된 KIT 유전자는 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 KIT 유전자는 KIT 유전자의 엑손 6 및/또는 엑손 7에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 KIT 유전자의 엑손 7에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 H378에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 예에서, 위치 H378에서의 돌연변이는 H378R 또는 H378S 또는 H378P 또는 H378A 또는 H378F 또는 H378K 또는 H378G 또는 H378L 또는 H378M이다. 일부 예에서, KIT의 엑손 6에서의 돌연변이는 다음의 돌연변이 F316S, M318V, I319K, V323I, I334V, E360K, P363V, E366D 중 하나 이상을 갖는 암호화된 폴리펩타이드를 초래한다. 일부 예에서, KIT 엑손 7 돌연변이는 E376Q 및/또는 H378R에 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드를 초래한다.
유전자 조작된 KIT의 예시적인 아미노산 서열은 아래에 제공된다:
서열번호 67 KIT F316S, M318V, I319K, V323I, I334V, E360K, P363V, E366D, E376Q, H378R (KIT-ECD4 변이체 아미노산 서열)
서열번호 68 (KIT H378R 변이체 아미노산 서열)
일부 실시형태에서, 서열번호 67에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 F316S, M318V, I319K, V323I, I334V, E360K, P363V, E366D, E376Q 및 H378R에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 68에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에 제공되되, 폴리펩타이드 서열은 H378R에 돌연변이를 포함하고, 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는다. 또한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
viii. 돌연변이체 FLT3, CD123 및/또는 KIT 유전자를 발현시키는 유전자 조작된 조혈 세포
일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질은 FLT3 및 CD123이다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질은 FLT3 및 KIT이다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질은 KIT 및 CD123이다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 가이드는 서로 동시에 형질감염된다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 가이드는 순차적으로 또는 연속적으로, 즉, 둘 이상의 별개의 형질감염으로 제공된다. 예를 들어, FLT3 가이드 RNA(서열번호 13 내지 23 중 어느 하나), CD123 가이드 RNA(서열번호 24 내지 35 중 어느 하나), KIT 가이드 RNA(서열번호 36 내지 47 중 어느 하나).
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 HSPC는 유전자 조작된 FLT3 유전자를 포함하되, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 치료용 항-FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자는 FLT3 유전자의 엑손 9에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 FLT3 유전자의 엑손 9에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 N399에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 예에서, 위치 N399의 돌연변이는 N399D 또는 N399G이다. 유전자 조작된 FLT3의 예시적인 아미노산 서열은 위에 나타낸다(서열번호 49 내지 52 참조).
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 HSPC는 유전자 조작된 CD123 유전자를 포함하되, 유전자 조작된 CD123 유전자는 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 CD123 유전자는 CD123 유전자의 엑손 2 또는 엑손 3에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 2에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 S59에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 예에서, 위치 S59의 돌연변이는 S59P 또는 S59F이다. 일부 예에서, 돌연변이는 S59P 및 Y58H이다. 일부 예에서, 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 3에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 P88에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 예에서, 위치 P88의 돌연변이는 P88L 또는 P88S이다. 유전자 조작된 CD123의 예시적인 아미노산 서열은 위에 나타낸다(서열번호 54 내지 58 참조).
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 HSPC는 유전자 조작된 KIT 유전자를 포함하되, 유전자 조작된 KIT 유전자는 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 KIT 유전자는 KIT 유전자의 엑손 6 및/또는 엑손 7에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 예에서, 유전자 조작된 KIT 유전자의 엑손 7에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 H378에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 예에서, 위치 H378에서의 돌연변이는 H378R 또는 H378S 또는 H378P 또는 H378A 또는 H378F 또는 H378K 또는 H378G 또는 H378L 또는 H378M이다. 일부 예에서, KIT의 엑손 6에서의 돌연변이는 다음의 돌연변이 F316S, M318V, I319K, V323I, I334V, E360K, P363V, E366D 중 하나 이상을 갖는 암호화된 폴리펩타이드를 초래한다. 일부 예에서, KIT에서 엑손 7의 돌연변이는 E376Q 및 H378R 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드를 초래한다. 유전자 조작된 KIT의 예시적인 아미노산 서열은 위에 나타낸 바와 같이 제공된다(서열번호 67 내지 68 참조).
II. 세포-표면 항원에 특이적인 면역요법제
세포-표면 항원을 발현시키는 세포독성제 표적화 세포(예를 들어, 암세포)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 조혈 세포와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제"는 특정 세포-표면 항원(예를 들어, 표적 암세포)를 발현시키는 표적 세포의 세포독성을 직접적 또는 간접적으로 유도할 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 이러한 세포독성제는 특정 세포-표면 항원의 에피토프에 결합하고 이를 표적화하는 단백질-결합 단편을 포함할 수 있다.
i. 치료 항체/항체-약물 접합체
일부 예에서, 세포독성제는 약물(예를 들어, 항암 약물)에 접합되어 항체-약물 접합체(ADC)를 형성할 수 있는 치료용 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제제는 항체-약물 접합체이다. 일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 표적 세포에서 세포독성을 유도하는 에피토프 결합 단편 및 독소 또는 약물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료용 항-FLT3 항체는 항-FLT3 클론 4G8 항체이다. 일부 실시형태에서, 치료용 항-CD123 항체는 론 7G3 항체 또는 이의 인간화된 상대 CSL362("탈라코투주맙(talacotuzumab)")이다. 일부 실시형태에서, 치료용 항-CD123 항체는 항-CD123 클론 6H6 항체 또는 항-CD123 클론 S18016F 항체이다. 일부 실시형태에서, 치료용 항-KIT 항체는 항-KIT 클론 Fab79D 항체이다.
항체-약물 접합체에서 사용하기에 적합한 독소 또는 약물은 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 문헌[Peters et al. Biosci. Rep. (2015) 35(4): e00225, Beck et al. Nature Reviews Drug Discovery (2017) 16:315-337; Marin-Acevedo et al. J. Hematol. Oncol. (2018) 11: 8; Elgundi et al. Advanced Drug Delivery Reviews (2017) 122: 2-19] 참조. 일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 항체 및 약물 분자에 부착하는 링커(예를 들어, 펩타이드 링커, 예컨대, 절단 가능 링커 또는 비-절단 가능 링커)를 추가로 포함할 수 있다. 항체-약물 접합체의 예는 브렌툭시맙 베도틴, 글렘바투무맙 베도틴/CDX-011, 데파툭시주맙 마포도틴/ABT-414, PSMA ADC, 폴라투주맙 베도틴/RG7596/DCDS4501A, 데닌투주맙 마포도틴/SGN-CD19A, AGS-16C3F, CDX-014, RG7841/DLYE5953A, RG7882/DMUC406A, RG7986/DCDS0780A, SGN-LIV1A, 엔포르투맙 베도틴/ASG-22ME, AG-15ME, AGS67E, 텔리소투주맙 베도틴/ABBV-399, ABBV-221, ABBV-085, GSK-2857916, 티소투맙 베도틴/HuMax-TF-ADC, HuMax-Axl-ADC, 피나투주맙 베오드틴/RG7593/DCDT2980S, 리파스투주맙 베도틴/RG7599/DNIB0600A, 인두사투맙 베도틴/MLN-0264/TAK-264, 반도르투주맙 베도틴/RG7450/DSTP3086S, 소피투주맙 베도틴/RG7458/DMUC5754A, RG7600/DMOT4039A, RG7336/DEDN6526A, ME1547, PF-06263507/ADC 5T4, 트라스투주맙 엠탄신/T-DM1, 미르베툭시맙 소라브탄신/IMGN853, 콜툭시맙 라브탄신/SAR3419, 나라툭시맙 엠탄신/IMGN529, 인단툭시맙 라브탄신/BT-062, 아네투맙 라브탄신/BAY 94-9343, SAR408701, SAR428926, AMG 224, PCA062, HKT288, LY3076226, SAR566658, 로르보투주맙 머탄신/IMGN901, 칸투주맙 머탄신/SB-408075, 칸투주맙 라브탄신/IMGN242, 라프리툭시맙 엠탄신/IMGN289, IMGN388, 비바투주맙 머탄신, AVE9633, BIIB015, MLN2704, AMG 172, AMG 595, LOP 628, 바다스툭시맙 탈리린/SGN-CD33A, SGN-CD70A, SGN-CD19B, SGN-CD123A, SGN-CD352A, 로발피투주맙 테시린/SC16LD6.5, SC-002, SC-003, ADCT-301/HuMax-TAC-PBD, ADCT-402, MEDI3726/ADC-401, IMGN779, IMGN632, 겜투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조가미신/CMC-544, PF-06647263, CMD-193, CMB-401, 트라스투주맙 듀오카마진/SYD985, BMS-936561/MDX-1203, 사시투주맙 고비테칸/IMMU-132, 라베투주맙 고비테칸/IMMU-130, DS-8201a, U3-1402, 밀라투주맙 독소루비신/IMMU-110/hLL1-DOX, BMS-986148, RC48-ADC/허투주맙-vc-MMAE, PF-06647020, PF-06650808, PF-06664178/RN927C, 루파르투맙 아마도틴/BAY1129980, 아프루투맙 익사도틴/BAY1187982, ARX788, AGS62P1, XMT-1522, AbGn-107, MEDI4276, DSTA4637S/RG7861을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일례에서, 항체-약물 접합체는 겜투주맙 오조가미신이다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질의 에피토프에 대한 항체-약물 접합체의 결합은 항체-약물 접합체의 내재화를 유도하고, 약물(또는 독소)는 세포내로 방출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질의 에피토프에 대한 항체-약물 접합체의 결합은 독소 또는 약물의 내재화를 유도하고, 이는 독소 또는 약물이 세포 표면 단백질을 발현시키는 세포(표적 세포)를 사멸시키는 것을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질의 에피토프에 대한 항체-약물 접합체의 결합은 독소 또는 약물의 내재화를 유도하고, 이는 독소 또는 약물이 세포 표면 단백질을 발현시키는 세포(표적 세포)의 활성을 조절할 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체-약물 접합체에서 사용되는 독소 또는 약물의 유형은 임의으 특정 유형으로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 항원의 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의) 에피토프는 변형되어, 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의) 상이한 세포독성제(예를 들어, 2개의 ADC)가 둘 이상의 에피토프에 표적화되는 것을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, ADC에 의해 운반되는 독소는 효능(예를 들어, 표적 세포의 사멸)을 향상시키기 위해 상승적으로 작용할 수 있었다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의) 세포-표면 단백질의 에피토프는 변형되어, 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의) 상이한 세포독성제(예를 들어, 2개의 ADC)가 둘 이상의 세포-표면 항원의 에피토프에 표적화되는 것을 가능하게 하였다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의) 에피토프가 변형되고, 추가 세포-표면 단백질의 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의) 에피토프는 변형되어, 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의) 상이한 세포독성제(예를 들어, 2개의 ADC)가 세포-표면 항원의 에피토프 및 추가 세포-표면 항원의 에피토프에 표적화되는 것을 가능하게 하였다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 세포-표면 항원 또는 세포-표면 항원 및 하나 초과의 추가 세포-표면 단백질/항원의 표적화는 조혈 악성종양의 재발을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 유전자 조작된 조혈 세포의 집단에서 돌연변이된 세포-표면 항원의 에피토프를 표적화하는 ADC를 투여하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 유전자 조작된 조혈 세포의 집단에서 돌연변이된 세포-표면 항원의 에피토프를 표적화하는 ADC 및 세포-표면 단백질을 표적화할 수 있는 하나 이상의 추가 세포독성제를 투여하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 제제는 하나 초과의 세포-표면 단백질을 표적화함으로써 효능을 향상시키기 위해 상승적으로 작용할 수 있었다.
본 명세서에 기재된 ADC는 본 명세서에 기재된 바와 같은 병용요법을 받은 대상체에 대한 후속 치료로서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 세포-표면 항원에서 비필수 에피토프를 결여하는 유전자 조작된 세포의 집단 및 세포-표면 항원을 발현시키는 세포를 표적화하는 하나 이상의 면역치료제(예를 들어, ADC)를 대상체에게 투여하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 1형 세포-표면 항원에서 비필수 에피토프를 결여하는 유전자 조작된 세포의 집단 및 세포-표면 항원을 발현시키는 세포를 표적화하는 하나 이상의 면역치료제(예를 들어, ADC)를 대상체에게 투여하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 2형 세포-표면 항원에서 비필수 에피토프를 결여하는 유전자 조작된 세포의 집단 및 세포-표면 항원을 발현시키는 세포를 표적화하는 하나 이상의 면역치료제(예를 들어, ADC)를 대상체에게 투여하는 단계를 수반한다. 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에서, 예를 들어, 조혈 악성종양이 재발되는 경우, 1종 이상의 추가 면역치료제가 대상체에게 추가로 투여될 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 추가 에피토프 및/또는 항원을 표적화).
ii. 키메라 항원 수용체를 발현시키는 면역 세포
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 세포-표면 항원의 에피토프를 표적화하는 세포독성제는 세포 표면 단백질의 에피토프(예를 들어, FLT3, CD123 또는 KIT)에 결합할 수 있는 에피토프 결합 단편(예를 들어, 단일쇄 항체)를 포함하는 키메라 수용체를 발현시키는 면역 세포이다. 키메라 수용체의 에피토프 결합 단편에 의해 세포 표면 상에서 특정 단백질의 에피토프를 갖는 표적 세포(예를 들어, 암세포)의 인식은 키메라 수용체의 신호전달 도메인(들)(예를 들어, 공자극 신호전달 도메인 및/또는 세포질 신호전달 도메인)에 활성화 신호를 전달하고, 이는 키메라 수용체를 발현시키는 면역 세포의 효과기 기능을 활성화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 이중특이적 또는 다중특이적 면역 세포로 지칭되는 하나 초과의 키메라 수용체(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 하나 초과의 키메라 수용체를 발현시키고, 이 중 적어도 하나는 세포-표면 항원의 에피토프를 표적화한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 하나 초과의 키메라 수용체를 발현시키고, 이들 각각은 특정 세포-표면 항원의 에피토프를 표적화한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 하나 초과의 키메라 수용체를 발현시키고, 이 중 적어도 하나는 세포-표면 항원의 에피토프를 표적화하고, 이 중 적어도 하나는 추가 세포-표면 항원의 에피토프를 표적화한다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 세포-표면 단백질 또는 세포-표면 단백질 및 하나 이상의 추가 세포-표면 단백질을 표적화하는 것은 조혈 악성종양의 재발을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 이중특이적 키메라 수용체로 지칭되는 하나 초과의 에피토프(예를 들어, 하나의 항원의 하나 초과의 에피토프 또는 하나 초과의 항원의 에피토프)를 표적화하는 키메라 수용체를 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 둘 이상의 계통-특이적 세포-표면 단백질의 에피토프는 세포독성제에 의해 표적화된다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 키메라 수용체는 동일한 면역 세포, 예를 들어, 이중특이적 키메라 수용체에서 발현된다. 이러한 세포는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체를 발현시키는 세포는 "풀링되고", 즉, 세포의 둘 이상의 그룹은 둘 이상의 상이한 키메라 수용체를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상이한 키메라 항원 수용체를 발현시키는 둘 이상의 세포는 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 상이한 키메라 항원 수용체를 발현시키는 둘 이상의 세포는 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, FLT3, CD123 및/또는 KIT의 에피토프는 세포독성제에 의해 표적화된다. 일부 실시형태에서, FLT3, CD123 및/또는 KIT를 표적화하는 키메라 수용체는 동일한 면역 세포(즉, 이중특이적 면역 세포)에서 발현된다. 이러한 세포는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, FLT3, CD123 및/또는 KIT를 표적화하는 키메라 수용체를 발현시키는 세포는 "풀링되고", 즉, 세포의 둘 이상의 그룹은 둘 이상의 상이한 키메라 수용체를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, FLT3, CD123 및/또는 KIT를 표적화하는 키메라 수용체를 발현시키는 세포의 둘 이상의 그룹은 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, FLT3, CD123 및/또는 KIT를 표적화하는 키메라 수용체를 발현시키는 세포의 둘 이상의 그룹은 순차적으로 투여된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 키메라 수용체는 숙주 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고 키메라 수용체의 특이성을 제공하는 결합 도메인(예를 들어, 세포-표면 계통-특이적 단백질의 에피토프에 결합하는 에피토프 결합 단편)을 포함하는 비자연 발생적 분자를 지칭한다. 일반적으로, 키메라 수용체는 상이한 분자로부터 유래된 적어도 2개의 도메인을 포함한다. 본 명세서에 기재된 에피토프-결합 단편에 추가로, 키메라 수용체는 다음 중 하나 이상의 추가로 포함할 수 있다: 힌지 도메인(예를 들어, CD28 힌지, IgG4 힌지 또는 CD8α 힌지), 막관통 도메인(예를 들어, CD28 TM, CD8α TM, 4-1BB TM), 공자극 도메인(예를 들어, CD28z, 4-1BB, ICOS, OX40), 세포질 신호전달 도메인(예를 들어, CD3z), 및 이들의 조합물.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체는 하나 이상의 힌지 도메인(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 에피토프 결합 단편과 막관통 도메인 사이에 위치될 수 있다. 힌지 도메인은 단백질의 두 도메인 사이에서 일반적으로 발견되고 단백질의 유연성 및 서로에 대해 단백질 중 하나 또는 둘 다의 움직임을 가능하게 할 수 있는 아미노산 세그먼트이다. 키메라 수용체의 다른 도메인에 대해 에피토프 결합 단편의 이러한 유연성 및 움직임을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10 내지 200개의 아미노산, 예를 들어, 15 내지 150개의 아미노산, 20 내지 100개의 아미노산, 또는 30 내지 60개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200개의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 자연 발생적 단백질의 힌지 도메인이다. 힌지 도메인을 포함하는 당업계에 알려진 임의으 단백질의 힌지 도메인은 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 자연 발생적 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이고, 키메라 수용체에 유연성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 또는 CD28의 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 일부, 예를 들어, CD8α 또는 CD28의 힌지 도메인의 적어도 15(예를 들어, 20, 25, 30, 35 또는 40)개의 연속 아미노산을 포함하는 단편이다.
항체의 힌지 도메인, 예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체는 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2에 결합하는 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인이고, 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체는 하나 이상의 막관통 도메인(들)을 포함할 수 있다. 키메라 수용체에서 사용하기 위한 막관통 도메인은 당업계에 알려진 임의의 형태일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정적인 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 키메라 수용체에서 사용하기에 적합한 막관통 도메인은 자연 발생적 단백질로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성, 비-자연 발생적 단백질 세그먼트, 예를 들어, 세포막에서 열역학적으로 안정적인 소수성 단백질 세그먼트이다.
막관통 도메인은, 단백질의 막 및 배향을 가로질러 만드는 통과 횟수를 포함하여, 막관통 도메인 위상에 기반하여 분류된다. 예를 들어, 단일 통과 막 단백질은 세포막을 한 번 통과하고, 다회 통과 단백질은 세포막 적어도 2회(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 이상) 통과한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 단일 통과 막관통 도메인이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 키메라 수용체의 N 말단을 세포의 세포외측으로 그리고 키메라 수용체의 C 말단을 세포의 세포내측으로 배향시키는 단일-통과 막관통 도메인이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 단일 통과 막관통 단백질로부터 배향된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28 또는 4-1BB 또는 CD8α의 막관통 도메인이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체는 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "공자극 신호전달 도메인"은 효과기 기능과 같은 면역 반응을 유도하기 위해 세포 내에서 신호 전달을 매개하는 단백질의 적어도 일부를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 키메라 수용체의 공자극 신호전달 도메인은 신호를 전달하고 면역 세포, 예컨대, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구에 의해 매개되는 반응을 조절하는 공자극 단백질로부터의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 하나 초과의(적어도 2, 3, 4개 이상의) 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 상이한 공자극 단백질로부터 얻은 하나 초과의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 공자극 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
일반적으로, 다수의 면역 세포는, 항원-특이적 신호의 자극에 추가로, 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진시키고, 세포의 효과기 기능을 활성화시키기 위해 공자극을 필요로 한다. 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 공자극 신호전달 도메인의 활성화는 세포가 사이토카인의 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키도록 유도할 수 있다. 임의의 공자극 단백질의 공자극 신호전달은 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서 사용하기에 적합할 수 있다. 공자극 신호전달 도메인의 유형(들)은 키메라 수용체가 발현되는 면역 세포(예를 들어, 1차 T 세포, T 세포주, NK 세포주) 및 목적하는 면역 효과기 기능(예를 들어, 세포독성)의 유형과 같은 인자에 기반하여 선택된다. 키메라 수용체에서 사용하기 위한 공자극 신호전달 도메인의 예는 CD27, CD28ζ(CD28z), 4-1BB, OX40, CD30, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공자극 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체는 하나 이상의 세포질 신호전달 도메인(들)을 포함한다. 임의의 세포질 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포질 신호전달 도메인은 세포의 효과기 기능(예를 들어, 세포독성)을 유도하는 것과 같이 세포 반응을 자극하기 위해, 세포외 리간드-결합 도메인과 이의 리간드의 상호작용과 같은 신호를 전달한다. 일부 실시형태에서, 세포질 신호전달 도메인은 CD3ζ(CD3z)로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, FLT3, CD123, FLT3+CD123, KIT, FLT3+KIT 또는 KIT+CD123을 표적화하는 키메라 수용체 작제물이 본 명세서에서 제공된다. 작제물은 적어도 힌지 도메인(예를 들어, CD28, CD8α, 또는 항체로부터 유래), 막관통 도메인(예를 들어, CD28로부터 유래), 하나 이상의 공자극 도메인(CD28z 중 하나 이상으로부터 유래) 및 세포질 신호전달 도메인(예를 들어, CD3z), 또는 이들의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 힌지 도메인(예를 들어, CD28, CD8α, 또는 항체로부터 유래), 막관통 도메인(예를 들어, CD28로부터 유래), 하나 이상의 공자극 도메인(CD28z 중 하나 이상으로부터 유래) 및 세포질 신호전달 도메인(예를 들어, CD3z로부터 유래), 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있는, 유전자 조작된 조혈 세포(돌연변이체 FLT3, CD123, FLT3+CD123, KIT, FLT3+KIT 또는 CD123+KIT를 갖도록 조작됨) 및 각각 FLT3, CD123, FLT3+CD123, KIT, FLT3+KIT 또는 CD123+KIT를 표적화하는 키메라 수용체를 발현시키는 면역 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 수반한다. 일부 실시형태에서, 투여된 면역치료 제품은 FLT3, CD123 및/또는 KIT를 표적화하는 개개 키메라 수용체를 발현시키는 면역 세포의 조합물이다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 수용체는 재조합 기술과 같은 일상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서의 키메라 수용체의 제조 방법은 에피토프 결합 단편 및 선택적으로 힌지 도메인, 막관통 도메인, 적어도 하나의 공자극 신호전달 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체의 도메인을 각각 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 생성에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체의 구성성분을 암호화하는 핵산은 재조합 기술을 사용하여 함께 결합된다.
추가적으로, 임의의 키메라 수용체는 면역 세포에서 발현될 수 있고, 일상적인 방법에 의해 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 대상체 자신의 혈액(자가) 중 T 세포로부터 유래되거나, 다른 건강한 공여자의 T 세포(동종이계)로부터 유래될 수 있다. 일단 대상체로부터 단리되면, 이러한 T 세포는 종양 표면 상에 존재하는 항원을 이들이 표적화하도록 프로그래밍하는 특정 CAR을 발현시키도록 유전자 조작된다. 이어서, CAR-T 세포는 관행에 따라 대상체에게 주입된다.
일부 실시형태에서, CAR은 서열번호 69, 71, 73, 75, 77, 79, 86 또는 87 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하되, CAR은 이의 각각의 세포-표면 계통-특이적 단백질(예를 들어, KIT, CD123, FLT3 또는 이의 조합)에 결합하는 능력을 보유한다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 KIT이고, 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: GFNISVYMMH(서열번호 88), SIYPYSGYTYYADSVKG(서열번호 89), ARYVYHALDY(서열번호 90), RASQRGLRNVAVA(서열번호 91), SASSLYS(서열번호 92) 및 QQWAVHSLIT(서열번호 93). 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 GFNISVYMMHWVRQAPGKGLEWVASIYPYSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYVYHALDY(서열번호 94)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 KIT 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 RASQRGLRNVAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAVHSLIT(서열번호 95)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 KIT 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 서열번호 94와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 95와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에피토프 결합 단편은 서열번호 94와 95를 둘 다 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3이고, 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: GYTFTSYWMH(서열번호 96), EIDPSDSYKDYNQKFK(서열번호 97), RAITTTPFDF(서열번호 98), RASQSISNNLH(서열번호 99), YASQSIS(서열번호 100) 및 QQSNTWPYT(서열번호 101). 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 GYTFTSYWMHWVRQRPGHGLEWIGEIDPSDSYKDYNQKFKDKATLTVDRSSNTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARAITTTPFDF(서열번호 102)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 FLT3 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 RASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFCQQSNTWPYT(서열번호 103)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 FLT3 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 서열번호 102와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 103과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에피토프 결합 단편은 서열번호 102와 103을 둘 다 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: GYSFTDYYMK(서열번호 104), DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), ARSHLLRASWFAY(서열번호 106), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109). 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 GYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSNGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAY(서열번호 110)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 CD123 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 ESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYT(서열번호 111)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 CD123 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 서열번호 110와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 111과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에피토프 결합 단편은 서열번호 110과 111을 둘 다 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3 및 CD123이고, 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: GYTFTSYWMH(서열번호 96), EIDPSDSYKDYNQKFK(서열번호 97), RAITTTPFDF(서열번호 98), RASQSISNNLH(서열번호 99), YASQSIS(서열번호 100), QQSNTWPYT(서열번호 101), GYSFTDYYMK(서열번호 104), DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), ARSHLLRASWFAY(서열번호 106), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109). 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 GYTFTSYWMHWVRQRPGHGLEWIGEIDPSDSYKDYNQKFKDKATLTVDRSSNTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARAITTTPFDF(서열번호 102)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 FLT3 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 RASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFCQQSNTWPYT(서열번호 103)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 FLT3 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 GYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSNGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAY(서열번호 110)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 CD123 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 ESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYT(서열번호 111)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하되, 에피토프 결합 단편은 이의 각각의 CD123 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 예에서, 에피토프 결합 단편은 서열번호 102와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열, 서열번호 103과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열, 서열번호 110과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열 및 서열번호 111과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 에피토프 결합 단편은 서열번호 102, 103, 110 및 111 중 모두 넷을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함한다: DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109).
예시적인 CAR 서열은 아래에 제공된다:
서열번호 69 - KIT 도메인 4를 표적화하는 Fab79D-CAR(CD28 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 아미노산 서열, 변이체 I(에피토프 결합 영역은 이탤릭체이고, CDR은 볼드체임)
서열번호 70 - KIT 도메인 4를 표적화하는 Fab79D- CAR(CD28 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 뉴클레오타이드 서열, 변이체 I
서열번호 71 - KIT 도메인 4를 표적화하는 Fab79D-CAR(CD28 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 아미노산 서열, 변이체 II(에피토프 결합 영역은 이탤릭체이고, CDR은 볼드체임)
서열번호 72 - KIT 도메인 4를 표적화하는 Fab79D- CAR(CD28 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 뉴클레오타이드 서열, 변이체 II
서열번호 73 - FLT3 도메인 4를 표적화하는 4G8-CAR(IgG4 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 아미노산 서열(에피토프 결합 영역은 이탤릭체이고; CDR은 볼드체임)
서열번호 74 - FLT3 도메인 4를 표적화하는 4G8-CAR(IgG4 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 뉴클레오타이드 서열
서열번호 75 - CD123 N-말단 도메인을 표적화하는 CSL362-CAR(CD8a 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 아미노산 서열(에피토프 결합 영역은 이탤릭체이고, CDR은 볼드체임)
서열번호 76 - CD123 N-말단 도메인을 표적화하는 CSL362-CAR(CD8a 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 뉴클레오타이드 서열
서열번호 77 - FLT3과 CD123을 둘 다 표적화하는 4G8-CSL362-이중특이적 CAR(CD8a 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 아미노산 서열, 변이체 I(에피토프 결합 영역은 이탤릭체이고, CDR은 볼드체임)
서열번호 78 - FLT3과 CD123을 둘 다 표적화하는 4G8-CSL362-이중특이적 CAR(CD8a 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 뉴클레오타이드 서열, 변이체 I
서열번호 79 - FLT3과 CD123을 둘 다 표적화하는 4G8-CSL362-이중특이적 CAR(CD8a 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 아미노산 서열, 변이체 II(에피토프 결합 영역은 이탤릭체이고, CDR은 볼드체임)
서열번호 80 - FLT3과 CD123을 둘 다 표적화하는 4G8-CSL362-이중특이적 CAR(CD8a 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 뉴클레오타이드 서열, 변이체 II
서열번호 86 - CD123 N-말단 도메인을 표적화하는 CSL362-CAR 제2 변이체(IgG4 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 아미노산 서열(CDR은 볼드체임)
서열번호 87 - CD123 N-말단 도메인을 표적화하는 CSL362-CAR 제3 변이체(IgG4 힌지, CD28 TM, CD28z, CD3z) 아미노산 서열(CDR은 볼드체임)
III. 대상체의 치료 방법
유전자 조작된 조혈 세포, 예컨대, HSC는 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 세포-표면 항원을 표적화하는 하나 이상의 세포독성제와 조합하여 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 조혈 세포는 하나 이상의 세포-표면 항원의 유전자에서 유전자 편집되기 때문에, 조혈 세포 및/또는 이의 자손 세포는 하나 이상의 세포-표면 항원을 돌연변이 형태(예를 들어, 기능적)로 발현시키므로, 이들이 세포독성제, 예를 들어, CAR-T 세포에 의해 표적화되는 것을 피할 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 조혈 악성종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 조혈 세포의 집단, 및 선택적으로 (ii) 세포독성제, 예컨대, 세포-표면 항원을 표적화하는 CAR-T 세포를 악성종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 세포독성제가 조혈 세포 또는 이의 자손 세포를 표적화하지 않도록 이의 유전자는 조혈 세포에서 유전자 편집된다. (i) 및 (ii)의 투여는 동시에 또는 임의의 순서로 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포독성제 및/또는 조혈 세포는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되어 약제학적 조성물을 형성하고, 이는 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다.
본 명세서에서 사용되는, "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호 호환 가능하게 사용되고, 척추동물, 바람직하게는 포유류, 예컨대, 인간을 지칭한다. 포유류는 인간 영장류, 비-인간 영장류 또는 뮤린, 소, 말, 개 또는 고양이 종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자이다.
본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해, 유효량의 유전자 조작된 조혈 세포는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 조혈 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포독성제와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 용어 "치료적 유효량"과 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여 시 목적하는 활성을 초래하는 데 충분한 세포독성제, 조혈 세포 집단 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 세포독성제 및/또는 조혈 세포를 포함하는 조성물)의 양을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락 내에서, 용어 "유효량"은 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 장애의 징후를 지연시키거나, 진행을 저지하거나, 장애의 적어도 하나의 증상을 완화 또는 경감시키는 데 충분한 화합물, 세포 집단 또는 약제학적 조성물의 양을 지칭한다. 활성 성분의 조합물이 투여될 때, 유효량의 조합물은 개개로 투여되는 경우에 유효한 각 성분의 양을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다는 것을 유념한다.
유효량은 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 의료인의 지식 및 전문 기술 내에서 치료 중인 특정 병태, 병태의 중증도, 연령, 신체 조건, 크기, 성별 및 체중을 포함하는 개개 환자 매개변수, 치료의 지속기간, (만약에 있다면) 병행 요법의 특성, 특정 투여 경로 등의 인자에 따라 다르다. 일부 실시형태에서, 유효량은 대상체의 임의의 질환 또는 장애를 경감하거나, 완화하거나, 좋아지게 하거나, 개선시키거나, 증상을 감소시키거나, 진행을 지연시킨다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 키메라 수용체를 발현시키는 조혈 세포 및/또는 면역 세포는 대상체에 대해 자가일 수 있고, 즉, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 얻고, 세포가 세포독성제에 결합하지 않도록 조작되며, 이어서, 동일한 대상체에게 투여된다. 대상체에 대한 자가 세포의 투여는 비-자가 세포의 투여와 비교할 때 숙주 세포의 감소된 거부를 초래할 수 있다. 예를 들어, HSPC는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 얻고, HSPC는 유전자 조작되고, 유전자 조작된 HSPC는 동일한 대상체에게 투여된다. 일부 예에서, HSPC는 생물학적 샘플로부터 얻되, 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.
대안적으로, 숙주 세포는 동종이계 세포이고, 즉, 세포는 제1 대상체로부터 얻으며, 유전자 조작되고, 이어서, 제1 대상체와 상이하지만, 동일한 종인 제2 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 동종이계 면역 세포는 인간 공여자로부터 유래되고, 공여자와 상이한 인간 수용체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포는 이식편대숙주 효과를 감소시키기 위해 추가로 유전자 조작되었다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역 세포 및/또는 조혈 세포는 숙주 면역 반응을 유도하는 데 관련된 하나 이상의 단백질의 발현을 감소 또는 제거하기 위해 유전자 편집 또는 침묵 방법이 가해질 수 있다.
포유류(예를 들어, 인간)에 투여되는 세포, 즉, 면역 세포 또는 조혈 세포의 전형적인 양은, 예를 들어, 약 106 내지 1011개의 세포 범위에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 106개 미만의 세포가 투여되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 1011개 초과의 세포가 투여되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포의 1회 이상의 용량은 약 106개의 세포 내지 약 1011개의개의 세포, 약 107개의 세포 내지 약 1010개의 세포, 약 108개의 세포 내지 약 109개의 세포, 약 106개의 세포 내지 약 108개의 세포, 약 107개의 세포 내지 약 109개의 세포, 약 107개의 세포 내지 약 1010개의 세포, 약 107개의 세포 내지 약 1011개의 세포, 약 108개의 세포 내지 약 1010개의 세포, 약 108개의 세포 내지 약 1011개의 세포, 약 109개의 세포 내지 약 1010개의 세포, 약 109개의 세포 내지 약 1011개의 세포 또는 약 1010개의 세포 내지 약 1011개의 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 유전자 조작된 조혈 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계 및 1종 이상의 면역치료제(예를 들어, 세포독성제)를 투여하는 단계를 포함한다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 면역치료제는 동일 또는 상이한 유형(예를 들어, 치료용 항체, 키메라 항원 수용체(들)를 발현시키는 면역 세포의 집단, 및/또는 항체-약물 접합체)을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 발현시키는 면역 세포)의 에피토프에 결합하는 에피토프 결합 단편을 포함하는 세포독성제는 조혈 세포의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 발현시키는 면역 세포)의 에피토프에 결합하는 에피토프 결합 단편을 포함하는 세포독성제는 조혈 세포의 투여의 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상 전에 투여된다.
대안적으로, 일부 실시형태에서, 조혈 세포는 세포-표면 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 발현시키는 면역 세포)의 에피토프에 결합하는 에피토프 결합 단편을 포함하는 세포독성제 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포의 집단은 세포-표면 단백질의 에피토프에 결합하는 에피토프 결합 단편을 포함하는 세포독성제의 투여의 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상 전에 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질 및 조혈 세포의 집단을 표적화하는 세포독성제는 실질적으로 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 단백질을 표적화하는 세포독성제는 투여되고, 환자는 일정 기간 동안 평가되고, 이 후에 조혈 세포의 집단이 투여된다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포의 집단은 투여되고, 환자는 일정 기간 동안 평가되고, 이 후에, 세포-표면 단백질을 표적화하는 세포독성제가 투여된다.
또한 세포독성제 및/또는 조혈 세포의 다회 투여(예를 들어, 용량)는 본 개시내용의 범주 내이다. 일부 실시형태에서, 세포독성제 및/또는 조혈 세포의 집단은 대상체에게 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포독성제 및/또는 조혈 세포의 집단은 대상체에게 1회 초과(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5회 이상)로 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포독성제 및/또는 조혈 세포의 집단은 대상체에게 규칙적인 간격으로, 예를 들어, 6개월마다 투여된다.
투여 경로의 예는 정맥내, 주입, 진피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법은 대상체의 혈액학적 악성종양의 치료 방법일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다" 또는 "치료" 또는 "치료하는" 또는 "치료하는 것"은 병적 병태 또는 장애를 완화시키고/시키거나, 진행을 늦추고/늦추거나, 증상을 줄이고/줄이거나 진행을 중단시키는 것을 목적으로 하는 치료적 척도를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상체는 장애를 이미 갖는 대상체를 포함한다. 예를 들어, 일부 예에서, 암을 치료하는 것은 암의 진행을 안정화시키는 것을 의미한다. 일부 예에서, 암을 치료하는 것은 암의 진행을 늦추는 것을 의미한다. 일부 예에서, 암을 치료하는 것은 암의 진행을 중단시키는 것을 의미한다. 일부 예에서, 암을 치료하는 것은 암 크기를 줄어들게 하는 것을 의미한다. 일부 예에서, 암을 치료하는 것은 암으로 진단된 대상체의 전반적인 생존을 증가시키는 것을 의미한다. 암의 진행을 평가하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 영상화(예를 들어, X-선, 컴퓨터 단층촬영 스캔, 자기 공명 영상화, 캘리퍼 측정 또는 양전자 방사 단층촬영 스캔)를 사용하는 표적 병변의 평가, 세포학 또는 조직학, 또는 종양 마커(들)의 발현을 포함한다(예를 들어, 문헌[Eisenhauer et al., 2009, European Journal of Cancer 45:228-247 및 Schwartz et al., 2016, European Journal of Cancer 62:132-137] 참조; 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨).
일부 실시형태에서, 대상체는 조혈 악성종양을 갖는 인간 대상체이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조혈 악성종양은 조혈 세포(예를 들어, 전구체 및 줄기세포를 포함하는 혈액 세포)를 포함하는 악성 이상을 지칭한다. 혈액학적 악성종양의 예는 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 백혈병 또는 다발성골수종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 또는 만성 림프모구성 백혈병, 및 만성 림프구 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 조혈 악성종양에 관련된 세포는 악성종양을 치료하기 위해 사용되는 통상적인 또는 표준 치료제에 저항성이다. 예를 들어, 세포(예를 들어, 암세포)는 악성종양을 치료하기 위해 사용되는 화학치료제 및/또는 CAR T 세포에 저항성일 수 있다.
일부 예에서, 조혈 악성종양은 하기를 포함한다: B-림프모구성 백혈병(B-ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN).
IV. 조성물 및 키트
본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 발현시키는 임의의 면역 세포는 약제학적 조성물로서 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 중에서 투여될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및/또는 세포와 관련하여 사용되는 바와 같이, 어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여될 때 생리적으로 허용되고 전형적으로 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 이러한 조성물의 분자 독립체 및 다른 성분을 지칭한다. 바람직하게는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 포유류, 더 구체적으로는 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식되는 약전에서 열거되는 것을 의미한다. "허용 가능한"은 담체가 조성물의 활성 성분(예를 들어, 핵산, 벡터, 세포 또는 치료용 항체)와 양립 가능하고 조성물(들)이 투여되는 대상체에게 유해하게 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 본 방법에서 사용될 임의의 약제학적 조성물 및/또는 세포는 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제를 포함할 수 있다.
완충제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제; 저분자량 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 아미노산; 소수성 중합체; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물; 금속 복합체; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover] 참조.
또한 조혈 악성종양을 치료하는 데 사용하기 위한 키트는 본 개시내용의 범주 내이다. 이러한 키트는 유전자 조작된 조혈 세포, 예컨대, HSPC, 및 선택적으로 하나 이상의 세포독성제 표적화 세포-표면 항원을 포함할 수 있고, 이의 유전자는 조혈 세포에서 편집된다. 이러한 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 유전자 조작된 조혈 세포를 포함하는 제1 약제학적 조성물을 포함하는 용기, 및 선택적으로 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포-표면 항원을 표적화하는 하나 이상의 세포독성제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 발현시키는 면역 세포)를 포함하는 하나 이상의 추가 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 포함된 지침은 유전자 조작된 조혈 세포 투여의 설명 및 선택적으로 대상체에서 의도된 활성을 달성하기 위한 대상체에 대한 하나 이상의 세포독성제의 투여 설명을 포함할 수 있다. 키트는 대상체가 치료를 필요로 하는지의 여부를 식별하는 것에 기반하여 치료에 적합한 대상체를 선택하는 것의 설명을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지침은 유전자 조작된 조혈 세포 및 선택적으로 하나 이상의 세포독성제를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것의 설명을 포함한다.
유전자 조작된 조혈 세포 및 선택적으로 본 명세서에 기재된 세포독성제의 사용에 관한 지침은 일반적으로 의도된 치료를 위한 투약량, 투약 스케줄 및 투여 경로와 같은 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회 용량 패키지) 또는 하위 단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 공급된 지침은 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물 상의 기재된 지침이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 약제학적 조성물이 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하고/하거나, 발병을 지연시키고/시키거나 경감하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 제공된 키트는 적합한 포장에 들어있다. 적합한 포장은 바이알, 보틀, 단지, 가요성 포장 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한 특정 장치, 예컨대, 흡입기, 비강 투여 장치 또는 주입 장치와 조합하여 사용하기 위한 포장이 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 약제학적 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체 변이체이다.
키트는 선택적으로 완충제와 같은 추가 구성성분 및 설명적 정보를 제공할 수 있다. 정상적으로, 키트는 용기 및 용기 상의 또는 용기에 결합된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
실시예
특허청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 다음의 실시예를 제공하며, 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특정 물질이 언급되는 정도로, 이는 단지 예시의 목적을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 당업자는 독창적인 능력을 행사하지 않고 본 발명의 범주를 벗어나는 일 없이 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.
실시예 1: 다음의 실시예에서 사용되는 일반적 프로토콜
플라스미드 클로닝
WT-Cas9 및 NG-Cas9 염기 편집기 플라스미드를 Addgene(플라스미드 # 138495, 138491)을 통해 얻었다. NEB HiFi 어셈블리 마스터 믹스를 사용하여 SpRY-ABE8e-V106W 3xNLS 및 다른 염기 편집기 변이체(아래의 완전한 목록 참조)를 클로닝하였고, dsDNA 삽입물(IDT gBlocks)을 합성하였다. 단일 아미노산 변화(즉, K918N) 또는 결실(Blackjack 변이체)을 표준 부위-특이적 돌연변이유발 기법을 통해 도입하였다. 필요한 경우, sgRNA를 BsmBI 제한 효소를 사용하여 pLentiguide-Puro 골격(Addgene) 또는 pLKO-mTagBFP2 골격(cloned)에서 클로닝하였고, 어닐링하고 나서, 목적하는 스페이서 서열을 갖는 DNA 올리고를 인산화하였다. Mackarey Nagel NucleoBond Xtra Maxi 키트를 이용하여 플라스미드 maxipreps를 정제하였다.
유세포분석 리간드 친화도 분석
리간드에 대한 돌연변이 수용체의 결합 친화도를 평가하기 위해, 형광 리간드 결합 분석을 개발하였다. 인간 SCF 및 FLT3L(Peprotech)을 제조업자의 권고에 따라서 Alexa Fluor 488 항체 라벨링 키트(Invitrogen cat. A20181)와 접합시켰다. FLT3 또는 KIT 변이체 중 하나를 발현시키는 세포를 실온에서 15분 동안 FcR-차단제(Miltenyi 130-059-901), LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967), 대조군 항체(KIT 104D2 PE-Cy7, Biolegend, 또는 FLT3 BV10A4 PE-Cy7, Biolegend) 및 각각의 AF488-접합 리간드와 함께 인큐베이션시켰다. 샘플을 PBS + 2% FBS로 세척하고, BD Fortessa 유세포분석기로 분석하였다.
FLT3 및 CD123 편집을 위한 리포터 세포주
K562 세포는 FLT3 또는 CD123을 구성적으로 발현시키지 않기 때문에, 유전자에 대한 유전자 편집을 위한 모델로서 작용하도록 이러한 세포를 FLT3, CD123, KIT 또는 이들의 내인성 게놈 좌위로부터의 3개의 유전자의 임의의 조합을 과발현시키기 위해 유전자 조작하였다. 이러한 유전자의 구성적 강한 발현을 얻기 위해, 전체 인간 EF1 알파 프로모터를 CRISPR-Cas9(FLT3, KIT) 또는 CRISPR-AsCas12a(CD123) 유전자 편집 전략을 통해 FLT3, CD123 또는 KIT 유전자의 전사 개시 부위 상류에 통합시켰다(도 8). 표적화된 영역에 대해 50-bp 상동성 아암을 보유하는 dsDNA 선형 공여자를 EF1 알파 프로모터를 암호화하는 슬리핑 뷰티 플라스미드에 대해 PCR에 의해 준비하였다. 각 유전자의 프로모터 영역을 표적화하는 gRNA와 함께 Cas9(FLT3, KIT) 또는 Cas12a(CD123) RNP를 이용하는 Lonza 4D-Nucleofector 시스템을 사용하여 야생형 K562 세포를 전기천공하였다. 매칭된 상동성 아암이 있는 5 내지 10ug의 dsDNA 선형 공여자를, 상동 유도 수선 통합을 위한 주형으로서 작용하도록 전기천공법 반응에 포함시켰다. 세포를 FLT3 BV10A4 PE-Cy7(Biolegend), KIT 104D2 PE-Cy(Biolegend) 또는 CD123 9F5 BV421 및 CD123 7G3 BV711(BD)로 염색하고, 유세포분석에 의해 평가하였다. FLT3, CD123 또는 KIT-높음 집단을 FACS-분류하고, 제한 희석에 의해 단일 클론을 단리시켰다(도 8). 확장을 위해 FLT3(클론 AH11) 및 CD123(클론 3D5)에 대해 유세포분석에 의해 가장 높은 MFI를 갖는 클론을 선택하였다.
웨스턴 블롯
FLT3/CD123 변이체 또는 NIH-3T3을 과발현시키는 K562 세포 또는 KIT를 과발현시키는 HEK-293T 세포를 FBS 없이(혈청 기아(serum starvation)) 배지에서 밤새 배양시켰고, 이어서, 각 조건으로부터 1백만개의 세포를 5'에 대해 37℃에서 100ng/㎖ FLT3L, IL3 또는 SCF(평가한 수용체에 따름)로 자극하거나 자극하지 않았다. 이어서, 세포를 빙랭 PBS로 3x 세척하고, 용해시키고 나서, 단백질을 웨스턴 블롯을 위해 추출하였다(세포 추출 완충제, ThermoFisher FNN0011 + 1 mM PMSF). BCA 분석으로 정량화 후에, 단백질 추출물을 Laemmli 로딩 염료(Biorad 161-0747)와 혼합하고, Novex Tris-Glycine Gel(Invitrogen) 상에서 실행하였다. 전달 후에, 막을 TBST 중 5% w/v BSA로 차단하였고, pKIT(Y719, Cell Signaling 3391T) 또는 pFLT3 (Tyr589/591 클론 30D4, Cell Signaling 3464S)를 인식하는 1차 항체와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 세척 후에, 막을 항-토끼 IgG, HRP-연결 항체(Cell Signaling 7074)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 이후에 SuperSignal West Femto 화학발광 HRP-기질(Thermo Scientific 34096)과 함께 인큐베이션시키고 나서, ImageQuant LAS4000로 분석하였다. 후속적으로 동일한 막을 위에 기재한 것과 동일한 절차로 항-KIT(클론 1C5, Invitrogen MA5-15894) 또는 항 FLT3(클론 OTI7D6, Origene TA808157) 1차 항체에 의한 2차 염색을 위해 Restore (ThermoScientific #21059) 스트리핑 완충제와 함께 20분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 1차 Ab에 따라서 항-토끼 또는 항-마우스 IgG HRP-접합 Ab를 이용하여 2차 Ab 염색을 수행하였고, 막을 전개하였고, 위와 같이 획득하였다. 로딩 정규화를 위한 내부 대조군으로서 항-액틴 염색을 사용하였다.
유세포분석(시험관내 실험)
편집 후 72시간에 유세포분석에 의해 편집된 세포주를 평가하였고, 치료적 에피토프 또는 편집된 단백질의 표면 발현을 위한 대조군 항체로서 작용하는 관련없는 에피토프에 결합하는 항체 클론으로 염색하였다. FLT3 편집을 위해, 세포를 FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967) 1/1000, FLT3 BV10A4 PE-Cy7 2/100(Biolegend 313314) 및 FLT3 4G8 BV711 (BD 563908)과 함께 인큐베이션시켰다. CD123 편집을 위해, 세포를 FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967) 1/1000, CD123 9F5 PE 또는 BV421(BD 555644) 1/100, CD123 7G3 BV711 또는 BV421 (BD 740722) 1/100과 함께 인큐베이션시켰다. KIT 편집을 위해, 세포를 FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967) 1/1000, KIT 104D2 PE-Cy7 또는 BV711 2/100(Biolegend 313212), KIT Fab79D AF488 또는 PE(Creative Biolabs) 2/100과 함께 인큐베이션시켰다. 4℃에서 30분 동안 100uL/샘플 용적으로 염색을 수행하였다. 배양된 인간 CD34+ HSPC의 줄기세포 표현형을 평가하기 위해, 세포를 채취하고, 100uL PBS 중에서 재현탁시키고, FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967) 1/1000, CD34 BV421(Biolegend) 1.5/100, CD90 APC(BD) 3.5/100, CD45RA APC-Cy7(Biolegend) 3.5/100, CD133/2 PE(Miltenyi) 4/100으로 염색하였다. 4℃에서 30분 동안 100 uL/샘플 용적으로 염색을 수행하였다. 샘플을 4- 또는 5-레이저 BD Fortessa 유세포분석기에서 분석하였다.
유세포분석(생체내 실험)
이종이식된 NSG 마우스로부터의 말초혈액을 10uL 0.5M EDTA가 있는 1.5 mL 에펜도르프관에서 수집하였고, 15분 동안 실온에서 FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967) 1/1000, 인간 CD45 BV786(Biolegend) 1.5/100, 마우스 CD45 BV570(Biolegend), CD34 BV421(Biolegend) 1.5/100, CD19 BV650(Biolegend) 3/100, CD3 BV711(Biolegend) 2/100, CD33 BB515(BD) 2/100로 염색하였다. 이어서, 혈액 샘플을 ACK 시약(StemCell technologies)을 이용하여 5분 동안 실온에서 용해시키고, PBS + 2% FBS로 2회 세척하였다. 샘플을 4-레이저 BD Fortessa 유세포분석기에서 분석하였다.
뒷다리 뼈를 절구에서 으깨고, 40-um 셀 스트레이너를 통해 여과하고 나서, Miltenyi MACS 실행 완충제에서 세포를 재현탁시켜 이종이식 마우스로부터 골수를 얻었다. 유세포분석을 위해 세포의 분획을 FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, 7-AAD(BD Pharmigen) 3/100, 인간 CD45 BV786(Biolegend) 1.5/100, 마우스 CD45 BV570(Biolegend), CD34 BV421(Biolegend) 1.5/100, CD19 BV650(Biolegend) 또는 CD19 BV605(Biolegend) 3/100, CD3 BV711(Biolegend) 또는 CD3 PE-Cy7(Biolegend) 2/100CD33 BB515(BD), CD38 BV480(BD) 1.5/100 또는 CD38 BUV396(BD) 2/100, FLT3 BV10A4 PE-Cy7(Biolegend), CD123 9F5 PE(BD), CD90 APC(BD) 3.5/100, CD45RA APC-Cy7(Biolegend) 3/100로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 비장을 40um 셀 스트레이너에서 분쇄하고, Miltenyi MACS 실행 완충제에서 재현탁시켰다. 회수한 세포를 FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967) 1/1000, 인간 CD45 Pacific Blue(Biolegend) 1.5/100, 마우스 CD45 BV570(Biolegend), CD3 BV711(Biolegend) 2/100, EGFR AF488(R&D) 1.5/100, CD62L PE(BD) 2/100, CD4 APC(BD) 2/100, CD8 BV750(Biolegend) 2/100, CD45RA APC-Cy7(Biolegend) 3/100, CD69 PerCP-Cy5.5(Biolegend) 3/100으로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 샘플을 4-레이저 BD Fortessa 유세포분석기에서 분석하였다. 일부 실험에서, BM 세포를 50 uL/샘플 Brilliant 염색 완충제(BD 카탈로그 번호 659611)를 첨가하면서 hCD45 BV786, mCD45 PerCP-Cy5.5, CD3 PE-Cy5, CD7 AF700, CD10 BUV737, CD11c BUV661, CD14 BV510, CD19 BV605, CD33 PE-Cy7, CD38 BUV396, CD45RA APC-Cy7, CD56 BUV496, CD90 APC, FLT3 PE 또는 BV711 및 KIT BV711 또는 CD123 PE 항체 중 하나로 염색하였다.
gDNA 추출, PCR 증폭 및 Sanger 서열분석
Qiagen DNeasy Blood & Tissue 키트 또는 Lucigen QuickExtract 시약을 사용하여 건조 펠릿 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하였고, Nanodrop 8000에 의해 정량화하고, Promega GoTaq G2 및 각각의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 관심 서열을 증폭시켰다. Promega SV Wizard 겔 및 PCR Clean-Up 시스템을 사용하여 PCR 산물을 정제하였고, Genewiz를 통한 Sanger 서열분석을 위해 보냈다. 고속대량 샘플 분석을 위한 커스텀 스크립트를 사용하는 EditR R 패키지를 이용한 디콘볼루션(deconvolution)에 의해 Sanger 추적으로부터 기본 편집 효율을 계산하였다.
콜로니 형성 분석
달리 언급되지 않는 한 시험관내 CD34+ HSPC 실험을 위해 1000 CD34+ 세포/웰을 플레이팅하거나, 이종이식된 BM-유래 분석을 위해, 25000개의 총 골수 세포/웰을 플레이팅함으로써, 콜로니 형성 단위 분석(CFU)을 수행하였다. 세포를 Methocult H4034 배지(StemCell 카탈로그 번호 04034)에서 재현탁시키고, SmartDish meniscus-free 6-웰 플레이트에서 플레이팅하였다. StemCell STEMvision 시스템을 사용하여 2주 후에 웰을 영상화하였다. 유세포분석을 위해, 따뜻한 PBS로 메틸셀룰로스 배지를 부드럽게 하였고, 수집하고 나서, 분석 전에 2회 세척하였다.
실시예 2: 수용체 변이체 설계
선택한 단클론성 항체 클론에 의해 인식되지 않는 돌연변이 수용체 변이체를 설계하기 위해, 문헌에서 입수 가능한 정보에 따라 또는 개개 돌연변이된 수용체 변이체 또는 돌연변이 라이브러리를 선별함으로써 상이한 mAb에 의해 표적화된 에피토프를 식별하였다. 전체 목표는 선택한 치료용 항체 클론에 의한 인식을 결여하는 동안 표면 발현, 유전자 조절 및 신호 전달 기능성을 보존하는 최소로 변형된 표적 변이체의 식별이었다(도 1). 이러한 변형된 표면 표적을 보유하는 세포는 표적 분자(네이키드 단클론성 항체, 독소 접합 항체, 이중특이적 항체 작제물 및 키메라 항원 수용체 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)에 대한 면역요법에 노출될 때 선택적 저항성을 부여받았다.
FLT3 에피토프 조작 :
FLT3은 i) 5개의 면역글로불린-유사 도메인의 존재를 특징으로 하는 세포외 리간드 결합 도메인; ii) 단일 스패닝(spanning) 막관통 영역; iii) 분할 타이로신 키나제 도메인을 포함하는 세포내 부분에 의해 구성된 III형 타이로신 키나제 수용체이다. 처음 3개의 세포외 도메인은 이의 이량체 리간드인 FLT3-리간드(FLT3L)와의 결합에 관련되며, 이 상호작용은 수용체의 이량체화를 유도하였다. 이량체화 후에, FLT3 활성화는 서로 세포내 타이로신 키나제 도메인을 가깝게 위치시킴으로써 매개되고, 이는 이들의 후속 인산기전이반응을 촉진시킨다.
정렬은 마우스 및 인간 FLT3/FLT3L은 아미노산 수준이 85.5% 동일하고, 마우스 및 인간 FLT3 IgG-유사 도메인 4는 아미노산 수준이 82% 동일하다(95.5% 유사)는 것을 나타낸다(도 3). 더 나아가, 마우스 및 인간 FLT3/FLT3L 쌍은 상호간에 교차 반응성이다. 항-인간 FLT3 치료용 항체 클론 4G8은 인간 FLT3을 특이적으로 인식하고, 에피토프는 세포외 도메인 4 내에서 국재화된다. 클론 4G8은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템을 통해 야생형 인간 또는 뮤린 FLT3을 과발현시키는 K562 세포를 염색함으로써 다른 오솔로그 변이체(즉, 마우스 Flt3)를 인식하지 않으며, 이때 인간 FLT3 또는 뮤린 Flt3 cDNA 서열은 구성적 EF1a 프로모터의 하류에서 클로닝된다는 것을 확인하였다(도 2). 슬리핑 뷰티 트랜스포존에 의해 암호화된 mCherry 형광 리포터를 사용하여 형질도입된 세포를 식별하였다. 이 증거에 기반하여, 오솔로그 서열에 걸쳐 상대적으로 덜 보존된 세포외 도메인 4에 위치된 16개의 잔기(도 3)를 상응하는 뮤린 아미노산으로 치환하였고, 생성된 변이체(eFLT3-01, 서열번호 49)는 클론 4G8에 의해 인식되지 않았다(도 2). 생성된 변이체는 표면 발현(세포외 도메인 2에 결합하는 대조군 항-FLT3 클론 BV10A4를 사용하여 확인됨), FLT3L 결합(도 4A 및 도 4B 참조) 및 세포내 신호 전달 특성을 여전히 보존하였다. (도 4C 참조).
두 번째 단계로서, eFLT3-01을 생성하기 위해 도입한 16개의 돌연변이(서열번호 49)를 FLT3 엑손 9 또는 엑손 10(FLT3 세포외 도메인 4에 대해 함께 암호화) 중 하나 내에서 이들의 게놈 국재화에 의해 돌연변이의 두 풀에서 분리시켰다. 이러한 두 FLT3 변이체의 과발현은 showed that FLT3 엑손 9로 제한된 돌연변이(서열번호 50)가 서열번호 49와 유사하게 항 FLT3 클론 4G8을 제거하는 데 충분하였다는 것을 나타냈다. 엑손 10으로 제한된 돌연변이를 갖는 FLT3 변이체는 클론 4G8 결합을 제거하지 않았다.
FLT3 세포외 도메인 4의 항-FLT3 항체 FLT3 4G8 클론 인식에 관련된 중요한 잔기를 식별하기 위해, 야생형 또는 돌연변이된 모두 16개의 이전에 식별된 잔기를 이용하여 조합 라이브러리를 설계하였고, EF1 알파 프로모터하에서 슬리핑 뷰티 트랜스포존 전달 벡터에서 클로닝하였다(GeneScript - 도 5). RPBSA 프로모터하에서 mCherry 및 퓨로마이신 저항성을 발현시키는 안티센스 카세트는 형질도입 마커 및 선택 방법으로 작용하였다. 5, 10 또는 100ng의 전달 벡터 및 500ng의 SB100x 트랜스포사제-발현 플라스미드를 이용하는 Lonza 4D-Nucleofector 시스템을 사용하여 K562 세포를 전기천공하였다. 7일 동안 퓨로마이신 1ug/㎖로 뉴클레오펙션된 세포를 선택하였고, 이어서, 유세포분석에 의해 평가하였다. 대조군 항체(FLT3 BV10A4 PE-Cy7)에 대해 양성이고 치료용 항체(FLT3 4G8 BV711)에 대해 음성인 세포를 BD Aria II 분류기로 FACS-분류하였고, 시험관내에서 확장시켰다. 통합된 FLT3 라이브러리 영역을 비분류, 단일 양성 분류 및 이중 양성 분류 세포의 gDNA 샘플로부터 PCR 증폭시켰고, 부분적 Illumina 어댑터를 앰플리콘에 첨가하고, Illumina 플랫폼(GeneWiz)에서 NGS를 위해 제출하였다. 3개의 샘플을 비교함으로써, 1개의 코돈(N399)만이 단일 양성 대 이중 양성 세포에서 차별적인 돌연변이 풍부화를 나타냈다(도 5). 슬리핑 뷰티 과발현 시스템에서 후보 돌연변이(N399D)의 검증은 이것이 4G8 클론 결합의 제거에 충분하다는 것을 확인하였다(도 5). FLT3 N399D 변이체를 과발현시키는 K562 세포와 AF488과 접합된 형광 FLT3L의 인큐베이션은 야생형 FLT3과 비슷한 리간드 결합을 나타냈다(도 5).
KIT 에피토프 조작 :
이용 가능한 문헌에 기반하여, 항-KIT 항체 클론 Fab79D는 KIT의 세포외 도메인 4에서 추정적 아미노산 접촉점을 인식한다(도 3). 이렇게 해서, 오솔로그 서열에 걸쳐 보존성이 낮은 예측된 접촉 아미노산 중 10개를 대체함으로써, 항-KIT 항체 클론 Fab79D에 의해 인식되지 않는 KIT 변이체(eKIT-01)를 생성하였다(도 6A). 이 변이체는 인간 줄기세포 인자(SCF) 친화도(도 6B) 및 SCF 자극 시 세포내 도메인 인산화를 보존하였다(도 6C). 클론 Fab79D 결합에 기본이 되는 특정 아미노산을 확인하기 위해, 각각의 단일 아미노산 변화를 mCherry 및 Puromycin 저항성을 공동 발현시키는 슬리핑 뷰티 전달 벡터에 개개로 클로닝했다. 100ng 전달 벡터 및 SB100x 트랜스포사제를 발현시키는 500ng 플라스미드를 이용하여 SF 용액 중 Lonza 4D-Nucleofector 시스템을 사용하여 293T 세포를 전기천공시켰다(도 6D). 세포를 퓨로마이신(2ug/㎖)으로 선택하였고, KIT Fab79D 및 KIT 104D2 대조군 항체로 염색하는 유세포분석에 의해 분석하였다. 클론 104D2 염색에 의한 KIT 발현(KIT H378R)과 비교되는 가장 낮은 Fab79D MFI를 갖는 돌연변이를 염기 편집 전략 개발을 위한 후보 변이체로서 선택하였다(도 6D).
이러한 결과를 확장시키기 위해, Fab79D 결합에 관련되는 대안의 코돈을 추가로 정하기 위한 종합적 라이브러리 접근을 설계하였다. KIT 세포외 도메인 4 내의 각 코돈이 축중 염기(NNN)로 구성된 축중 라이브러리를 인간 KIT cDNA, mTagBFP 리포터 및 퓨로마이신 저항성을 발현시키는 슬리핑 뷰티 전달 플라스미드에서 클로닝하였다(도 7). HEK-293T 세포를 라이브러리 플라스미드 및 pSB100X 트랜스포사제 플라스미드로 전기천공하여 이식유전자의 안정한 통합을 가능하게 하였다. 퓨로마이신 선택 후에, 세포를 FACS-분류하여 단일 양성 및 이중 양성 집단을 얻었다. 라이브러리 영역을 PCR 증폭시키고, NGS-서열분석하였다. 단일 양성 대 이중 양성 집단 내의 아미노산 변이체의 상대 풍부화의 비교는 H378에 추가로 Fab79D 결합에 관련된 추가 코돈(M318, I319, V323, D332, E360, Y362, E376)을 식별하였다.
CD123 에피토프 조작 :
CD123(CD123)의 경우, 항-CD123 항체 클론 7G3 및 이의 인간화된 형태인 CSL362가 CD123 N-말단 도메인 내에서 추정적 아미노산 접촉점을 인식한다는 것이 문헌에서 보고되었다(도 9). 유사하게, 다른 상업적으로 입수 가능한 클론인 6H6 및 S18016E는 CD123와 이들의 접촉점에 대해 제한된 정보를 갖는 N-말단 도메인에 결합하는 것으로 보고된다. IL3은 CD123에 대한 리간드이고, IL3 결합에 중요한 CD123 잔기는 Ala-스캔 또는 진화적으로 보존된 아미노산 변화를 통해 맵핑되었다(도 9).
CD123 세포외 도메인 내의 표적 에피토프를 조작하기 위해, CD123 N-말단 도메인에서 I50, E51, Y58, S59, R84, P88 또는 P89를 표적화하는 sgRNA의 세트를 설계함으로써 직접 염기 편집기 선별 접근을 사용하였다(도 10). 사이티딘 또는 아데닌 염기 편집기(evo-APOBEC1-BE4, ABE8e-V106W)로 CD123을 과발현시키는 K562 세포에 대해 이러한 gRNA를 시험하였다. 간략하게, 제조업자의 지침에 따라 SF 용액 중 Lonza 4D-Nucleofector 시스템을 사용하여 0.5M 세포를 전기천공하였다. 500ng의 염기 편집기 발현 플라스미드 및 300 내지 360p㏖의 sgRNA(Integrated DNA Technologies)를 전기천공법 반응에 포함시켰다. 이어서, 세포를 배양시키고, 게놈 DNA 및 유세포분석을 위한 샘플을 편집 후 72시간에 채취하였다. 여러 mAb 클론(7G3/CSL362, 6H6, S18016F)에 의한 인식을 결여하지만 대조군 항체 클론 9F5에 의한 염색에 의해 표면 발현을 보유한 CD123 돌연변이체를 생성한 sgRNA를 추가 개발을 위해 선택하였다(도 10, 후보 gRNA를 가장 잘 수행하는 것만을 보고함: 서열번호 24, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34).
이전 라운드에서 식별한 sgRNA에 근접하여 추가 서열을 포함하는 sgRNA 선별의 두 번째 라운드를 수행하였고, 이완된 PAM 특이성을 갖는 변이체를 포함하는 여러 BE(evo-APOBEC1-BE4, NG-EA-BE4max, NG-A3A-BE5, SpRY-evo-APOBEC1-BE4 - 서열번호 8 및 서열번호 11, NG-ABE8e, SpRY-ABE8e-V106E - 서열번호 7 및 서열번호 10, LbCas12a-ABE8e - 도 11)를 이용하여 시험하였다. 표면 발현을 위한 정규화군으로서 클론 9F5를 사용하여 앞서 기재한 바와 같이 클론 7G3, 6H6 및 S18016E 결합의 유세포분석 평가를 수행하였다. 인식의 목적하는 상실을 나타내는 조건으로부터의 gDNA를 추출하였고, CD123 엑손 2 및 3 영역을 Sanger 서열분석하여 관찰된 표현형과 관련된 아미노산 변형을 얻었다. 항체 클론 7G3 또는 이의 인간화된 상대의 경우, CSL362, CD123 S59P(ABE를 이용하여 gRNA-N, gRNA-R 및 관련 변이체에 의해 도입) 및 S59F(CBE를 이용하여 gRNA-L 및 변이체에 의해 도입)는 최고의 후보 변이체였다. 방관자 아데닌의 A의 G로의 전환으로 인해 Y58H 돌연변이가 또한 gRNA-N 및 gRNA-R에 의해 도입되었다. 항체 클론 6H6 및 S18016F의 결합을 제거하기 위해, (CBE를 이용하여 gRNA-F 및 관련 변이체에 의해 도입된) P88L/P89L은 최고 성능을 발휘하는 아미노산 치환이었다. 사이티딘 염기 편집을 통해 다른 아미노산 치환(R84Q, V85M, V85I, A86T)의 풀을 도입한 추가 gRNA(gRNA-H 및 관련 변이체)를 식별하였고, 클론 7G3, 6H6 및 S18016F에 대해 감소된 친화도를 초래하였다(도 11).
실시예 3: FLT3 변이체는 FLT3-표적화 CAR-T 세포에 저항성이다
FLT3 변이체가 FLT3-표적화 CAR-T 세포에 선택적으로 저항성이었는지를 시험하기 위해, 시험관내 사멸 분석을 수행하였다.
CAR-T 세포 생산
구성적 hPGK 프로모터하에 CD28 막관통 영역 및 CD28 공자극 도메인과 함께 2세대, FLT3-특이적 4G8 클론 키메라 항원 수용체를 발현시키는 III-세대 렌티바이러스 작제물을 합성한 dsDNA 단편(IDT gBlocks)을 사용하여 클로닝하였다. 항-EGFR 항체 세툭시맙을 사용함으로써 생체내 결실을 위한 형질도입 및 안전성 스위치의 마커로서 작용하도록 최소-CMV 프로모터하에 인간 EGFR cDNA의 절단된 변이체를 발현시키는 안티센스 카세트를 포함시켰다. HEK-293T 세포에서 5개 플라스미드(전달 벡터, pMD2, pMDL-RRE, pREV 및 pAdvantage 플라스미드)의 인산칼슘 일시적 공동형질감염에 의해 공개된 방법에 따라 VSV-G 위형 자기-비활성화 렌티바이러스 입자를 제조하였다. 바이러스 입자-함유 상청액을 초원심분리(2시간 동안 20℃에서 20000rpm)에 의해 500배 농축시키고, PBS에서 재현탁시켰다. 상이한 농도에서 293T 세포를 형질도입하고 유세포분석 또는 ddPCR에 의해 형질도입 효율을 계산함으로써 농축된 LV를 적정하였다.
전혈로부터 ficoll 구배 분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리시켰다. 유세포분석에 의한 T 세포 분획의 추정 후에, 새로 단리 또는 해동시킨 PBMC를 45분 동안 실온에서 느리게 교반하면서 3:1 비드:T 세포비(Gibco 11131D)로 CD3-CD28 Dynabeads와 함께 인큐베이션시키고, 이어서, 자기로 분리시켰다(DynaMag-5 Magnet, Invitrogen 12303D). 양성 선택된 세포를 10% FBS, 1% P/S, 인간 IL-7 5ng/㎖(Peprotech) 및 인간 IL-15 5ng/㎖(Peprotech)를 보충한 IMDM 중 1M/㎖에서 Dynabeads와 함께 배양시켰다. Dynabeads 자극 개시의 48시간 후에, 선택 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 입자를 이용하는 실험에 따라서 T 세포를 MOI 5 내지 MOI 10에서 형질도입하였다. Dynabeads를 자극의 개시 이후로 7일차에 자기 분리에 의해 배양물로부터 제거하였고, T 세포를 10% FBS, 1% P/S, 인간 IL-7 5ng/㎖(Peprotech) 및 인간 IL-15 5ng/㎖(Peprotech)를 보충한 IMDM에서 추가 5 내지 7일 동안 확장시켰다. T 세포 표현형 및 형질도입 효율(EGFR 표면 염색에 의함)을 유세포분석에 의해 주기적으로 평가하였다. 확장된 CAR-T 세포 또는 비형질도입 T 세포를 사멸 분석, 생체내 투여을 위해 사용하거나, 자극 개시 이후 12 내지 14일 후에 완전히 냉동시켰다.
K562 세포(슬리핑-뷰티 형질도입 후에 비변형, 염기 편집 또는 수용체 변이체를 과발현)를 96-웰 플레이트(25000개 표적 세포/웰)에서 플레이팅하였다. CD28 공자극 도메인이 있는 2세대 4G8-CAR 작제물을 암호화하고, EGFRt(절단된 EGFR) 안전성 스위치를 공동발현시키는 렌티바이러스 벡터로 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 형질도입함으로써 항-FLT3 CAR-T 세포를 생성하였다(상기 프로토콜 참조). FLT3-표적화 4G8 CAR-T 세포 또는 비형질도입 T 세포를 제조업자의 권고에 따라 CellTrace yellow(Invitrogen C34567)로 표시하였다. 이어서, FLT3-표적화 4G8 CAR-T 세포 또는 비형질도입 T 세포를 동일한 웰에서 전형적으로 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625의 상이한 효과기:표적비(E:T 비)로 공동 플레이팅하였고, 가습 인큐베이터에서 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션시켰다. 4시간 후에, FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967) 1/1000, FLT3 BV10A4 PE-Cy7 2/100(Biolegend 313314), CD4 APC (BD) 2/100, CD8 BV750(Biolegend) 2/100, CD107a BV711(Biolegend) 2/100, CD69 PerCP-Cy5.5(Biolegend) 2/100으로 염색함으로써 유세포분석을 위해 배양물 용적의 50%를 채취하였다. 염색 혼합물은 세포수를 정규화하기 위해 유동 계수 비드(Biolegend Precision Count Beads)를 포함하였다. 이어서, 세포를 세척하였고, AnnexinV FITC(Biolegend) 3/100을 보충한 AnnexinV 결합 완충제(Biolegend)에서 재현탁시켰다. 샘플을 4- 또는 5-레이저 BD Fortessa 유세포분석기에서 분석하였다. FcR-차단 시약(Miltenyi 130-059-901) 2/100uL, LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead 세포 염색(Invitrogen L34967) 1/1000, FLT3 BV10A4 PE-Cy7 2/100(Biolegend 313314), CD4 APC(BD) 2/100, CD8 BV750(Biolegend) 2/100, CCR7 BV421(Biolegend) 2/100, CD45RA APC-Cy7(Biolegend) 3/100, CD33 PerCP-Cy5.5(Biolegend)으로 염색한 유세포분석에 의해 플레이팅 후 48시간에 남아있는 배양물 용적을 평가하였다. 이어서, 세포를 세척하였고, AnnexinV FITC(Biolegend) 3/100을 보충한 AnnexinV 결합 완충제(Biolegend)에서 재현탁시켰다.
도 12A는 CAR-T 세포 매개 사멸에 대한 변형된 FLT3 변이체의 저항성을 평가하기 위한 공동 배양 사멸 분석을 위한 실험 설계를 나타낸다. 도 12B는 인큐베이션의 4시간 및 48시간 후에 생세포의 공동 배양 조성물을 나타내는 유세포분석 플롯이다. 상단 행은 WT 또는 조작된 K562 세포에 대한 유세포분석에 의한 FLT3 발현을 나타낸다. 비변형 야생형 FLT3을 발현시키는 세포를 선택적으로 사멸시키는 한편, 조작된 FLT3(e9-FLT3)은 남겨두었다. 도 12C는 인큐베이션의 후 4시간에 AnnexinV and LiveDead yellow 염색에 의한 표적 세포 생존도를 나타낸다. 도 12D는 비변형 FLT3을 발현시키는 표적 세포에 노출된 FLT3-CAR-T에 대해서만 4시간에 CD107a 표면 염색에 의한 선택적 T 세포 탈과립화를 나타낸다. 도 12E는 비변형 FLT3을 발현시키는 표적 세포에 노출된 FLT3-CAR-T에 대해서만 공동배양 후 48시간에 염료-희석(CellTrace yellow)에 의한 선택적 T 세포 증식을 나타낸다. 비변형 K562: 야생형 세포; WT FLT3 OE: 내인성 프로모터로부터의 FLT3 과발현이 있는 K562 리포터 세포주(리포터 세포주 생성 참조); 'WT FLT3 OE(슬리핑 뷰티)' 및 'e9 FLT3 OE(슬리핑 뷰티)': FLT3 변이체의 과발현을 유도하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존으로 형질도입한 K562 세포. e9-FLT3 변이체는 N399D(서열번호 50)를 포함하는 WT-FLT3와 비교할 때 12개의 아미노산 변화를 가졌다.
실시예 4: FLT3에서 N399D를 도입하기 위한 상동 유도 수선
FLT3 N399D가 상동 유도 수선에 의해 도입될 수 있는지를 시험하기 위해, CRISPR Cas 상동 유도 수선(HDR) 전략을 설계하였다. FLT3 엑손 9 좌위를 표적화하는 여러 gRNA와 조합한 SpCas9 or AsCas12a 뉴클레아제를 HDR을 위한 공여자 주형으로서 200-nt 길이 단일 가닥 올리고-데옥시뉴클레오타이드(ssODN)와 조합하여 시험하였다. 각각의 공여자 주형은 성공적인 DNA 수선 후에 CRISPR-Cas9 RNP 뉴클레아제 복합체에 의한 재절단 위험을 감소시키기 위해 방관자 아미노산의 선택된 침묵 돌연변이를 추가로 포함하였다. 각 ssODN 공여자(A, C, H, F로 칭함)의 역 상보성을 또한 시험하였다. ssODN 주형 공여자의 서열을 서열번호 40 내지 43으로 보고한다(상기 표 2 참조). 내인성 FLT3 좌위 상류의 EF1-a 프로모터의 표적화된 통합에 의해 FLT3을 과발현시키는 K562 리포터 세포를 62.5p㏖ 어닐링된 trRNA:gRNA와 복합체화한 50p㏖의 3xNLS Cas9 뉴클레아제(IDT) 또는 실험 조건에 따라 62.5p㏖ sgRNA와 복합체화한 50p㏖ AsCas12a Ultra(IDT)를 보충한 SF 용액 중 Lonza 4D-Nucleofector 시스템을 사용하여 전기천공하였다. ssODN-A 및 C 및 이들의 역보체(5uM 최종 농도)와 조합하여 Cas9 gRNA e9-4-NGG를 시험하였다. Cas12a gRNAs e9-15-TTTV 및 e9-16-TTTV를 ssODN-H 및 F 및 이들의 역보체(5uM 최종 농도)와 조합하여 시험하였다. IDT HDR-인핸서 0.2uL/20uL를 전기천공법 반응(30uM)에 포함시켰다. 편집 절차의 결과를 전기천공법의 72시간 후에 유세포분석에 의해 평가하였다. 도 13A(상단)는 N399 잔기가 강조 표시된 FLT3의 엑손 9 및 3개의 gRNA(1개의 SpCas9 gRNA(e9-4-NGG) 및 2개의 Cas12a gRNA(e9-15-TTTV 및 e9-16-TTTV))에 대한 상대적 위치를 나타낸다. gRNA를 표적화하는 FLT3 엑손9는 서열번호 13 내지 16으로 보고한다(상기 표 1 참조). 도 13A(하단)는 상동 유도 수선에 의해 N399D(화살표) 돌연변이를 삽입하기 위해 이용한 단일 가닥 올리고-데옥시뉴클레오타이드 공여자 주형을 나타낸다. Cas9-gRNA 복합체에 의한 재절단 속도를 감소시키기 위해 추가 침묵 단일 뉴클레오타이드 변화를 주형 설계에 포함시켰다(어두운 색 정사각형).
도 13B는 N399D 돌연변이의 효율을 평가하기 위해 표면 발현 및 클론 4G8에 대한 정규화군으로서 FLT3 클론 104D2로 염색한 K562 리포터 세포의 천기천공법 후 72시간의 FACS 플롯을 나타낸다. 성공적으로 편집된 세포는 검정색 직사각형으로 강조표시하고, 이는 N399D 돌연변이가 mAb 클론 4G8에 의한 인식의 상실을 초래하는 CRISPR-Cas 상동 유도 수선을 통해 인간 세포주에 삽입될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5: N399 위치에서 FLT3 돌연변이는 CRISPR 아데닌 염기 편집기에 의해 도입될 수 있다
이중가닥 DNA 파손의 도입없이 높은 효율 및 낮은 독성으로 FLT3 좌위에 목적하는 단일 코돈 변화를 도입하기 위해, 본 발명자들은 CRISPR-Cas 염기 편집을 시험하였다. 본 발명자들은 아데닌 염기 편집기와 조합하여 N399D 또는 N399G 돌연변이를 도입하는 것으로 예측된 sgRNA의 패널을 설계하였다. 편집 전략의 개발을 위해 CRISPR-Cas9 염기 편집기 ABE8e(TadA-8e V106W)를 선택하였고, 통상적인 NGG PAM의 부재하에 편집을 가능하게 하기 위해 PAM 특이성을 이완시키도록 Cas9 틈내기효소 단백질을 돌연변이시킴으로써 추가로 최적화하였다. 이를 위하여, 염기 편집기의 NG-SpCas9와 SpRY-Cas9 변이체를 둘 다 클로닝하였다. 효율을 추가로 증가시키기 위해, 제3 핵 국재화 부위(NLS)를 단백질의 C-말단 부분에 융합시켰다. 달리 언급되지 않는 한, 500ng의 염기 편집기 플라스미드 및 300 내지 360p㏖의 sgRNA 중 하나를 이용하여 FLT3 유전자를 과발현시키는 리포터 K562의 전기천공법에 의해 염기 편집 실험을 수행하였다(Integrated DNA Technologies). 이어서, 세포를 배양시키고, 게놈 DNA 및 유세포분석을 위한 샘플을 편집 후 72시간에 채취하였다.
도 14는 N399 염기 편집을 위한 PAM 요건을 예시하는 대표적인 실험을 나타낸다. NG PAM을 갖는 2개의 SpCas9 sgRNA(서열번호 17 및 서열번호 18, 상기 표 1 참조)를 WT-SpCas9 틈내기효소(PAM 요건: NGG), NG-SpCas9 틈내기효소(PAM 요건: NG), 및 SpRY-Cas9 틈내기효소(PAM 요건: NRN), ABE 작제물로 시험하였다. 도 14A는 FLT3 유전자에서 sgRNA 및 N399 코돈의 상대 위치를 나타낸다. 도 14B는 표적 아데닌을 밑줄표시한 gRNA 프로토스페이서 서열이다. 도 14C는 3개의 아데닌 염기 편집기 작제물(V106W 돌연변이 유무와 상관없이 TadA 데아미나제 도메인과 연결된 야생형 Cas9, NG-Cas9 또는 SpRY-Cas9 변이체)의 설계를 나타낸다. V106W 돌연변이는 아데닌 염기 편집기의 알려진 원치않는 효과인 감소된 RNA 편집과 관련된다. ABE8e-V106W 및 NG-ABE8e는 또한 Addgene을 통해 입수 가능하다(각각 카탈로그 제품 #138495 및 #138491). 클로닝된 SpRY-ABE8e-V106W(서열번호 7 및 서열번호 8)은 추가적인 C-말단의 뉴클레오플라스민 핵 국제화 서열(NLS)을 포함하였다. 전기천공법 후 72시간에 염기 편집 결과의 FACS 플롯을 도 14D에 나타내며, 여기서 K562 세포를 항-FLT3 클론 BV10A4 (정규화군) 및 4G8(치료적 Ab)로 염색하였다. 편집 세포의 백분율을 각 조건의 FACS 플롯의 하단 우측에 보고한다. 이완된 PAM 특이성을 갖는 염기 편집기 변이체(NG-ABE8e 및 SpRY-ABE8e-V106W)만이 클론 4G8 염색에 대해 음성이 되는 세포의 최대 41.1%로 효율적인 편집을 나타낸다.
N399 코돈의 염기-편집 효율을 개선시키기 위해, 맞춤된 편집 창 위치화를 근처의 PAM이 적은 SpRY-Cas9 변이체와 조합하여 추가 sgRNA를 선별함으로써 달성하였다. 도 15A는 FLT3 N399의 게놈 컨텍스트, 및 이전 실시예로부터의 2개(서열번호 17 및 서열번호 18) 및 NRN PAM을 갖는 3개의 추가 gRNA(서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 23)를 포함하는 5개의 sgRNA에 대한 이의 위치를 나타낸다. 도 15B는 표적 아데닌을 밑줄표시한 sgRNA 프로토스페이서 서열을 나타낸다. 도 15C는 K562 세포에 500ng 염기 편집기-발현 플라스미드 및 360p㏖의 sgRNA의 전기천공법에 의한 염기 편집 실험의 FACS 플롯이다. 편집 세포의 백분율을 각 조건의 FACS 플롯의 하단 우측에 보고한다. sgRNA FLT3_e9_18과 조합한 SpRY-ABE8e-V106W는 유세포분석에 의해 가장 높은 효율을 달성하고, 최대 66.3%의 편집 세포는 클론 4G8에 의해 인식되지 않는다.
실시예 6: ABE에 의해 도입된 FLT3 돌연변이는 단백질 발현 및 리간드 결합을 보존한다
실시예 5로부터의 염기 편집 세포의 Sanger 서열분석은 N399D 또는 N399G 돌연변이 중 하나의 잠재적 생성과 함께 N399 코돈(서열: AAC) 내의 아데닌 모두의 A에서 G 편집을 나타냈다. N399 위치에서 돌연변이를 포함하는 FLT3 변이체가 생리적 FLT3L 결합을 여전히 보존하는지를 추가로 시험하기 위해, 형광 리간드 결합 분석을 수행하였다. 도 16A는 다양한 FLT3 변이체를 발현시키는 K562 세포를 이용하여 수행한 형광 리간드 결합 분석을 나타낸다: N339D(서열번호 51), N399G(서열번호 52), 엑손 9 돌연변이(서열번호 50) 또는 WT FLT3(서열번호 48). FLT3L AF488과 FLT3 BV10A4 PE-Cy7 사이의 형광비를 각 플롯에서 보고한다. 도 16B는 각 변이체에 대해 FLT3L AF488과 FLT3 BV10A4 PE-Cy7 사이의 형광비 분포를 나타낸다(히스토그램). 데이터는 FLT3 아데닌 염기 편집으로부터 초래된 N399D 및 N399G 변이체가 생리학적 FLT3L 결합 친화도를 보존한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: SpRY-ABE8e-V106W mRNA의 사용은 인간 백혈병 세포주 및 인간 CD34+ HSPC에서 고도로 효율적인 염기 편집을 초래한다
1차 세포에 대한 염기 편집 절차를 번역하기 위해, 박테리아 플라스미드 형질감염이 줄기세포에 독성인 것으로 보고되기 때문에, 염기 편집기에 대한 적합한 전달 방법은 개발될 필요가 있다.
본 발명자들은 인간 CD34+ HSPC에 대한 염기 편집 프로토콜을 번역하기 위해 시험관내 전사에 의해 생성된 염기 편집기 mRNA를 사용하였다. MEGAscript T7 전사 키트(Invitrogen AM1333) 또는 NEB T7 HiScribe 키트(E2040S) 및 T7 프로모터 서열, 최소 5' UTR에 대해 하류이고 HBB(헤모글로빈 B) 3' UTR 및 폴리A 서열의 2개 복제물(60 내지 120 bp 길이)에 대해 상류의 염기 편집기 리딩 프레임을 암호화하는 맞춤 플라스미드(서열번호 81; 도 17A 및 이하 참조) 주형을 사용하여 시험관내 전사(IVT)에 의해 아데닌 염기 편집기(SpRY-ABE8e-V106W 3xNLS 또는 SpRY-K918N-ABE8e-V106W 3xNLS)를 암호화하는 기능적 mRNA를 생성하였다. 도 17B는 1차 인간 CD34+ 염기 편집에 대해 공동 전사에 의해 5'-캡핑되고 3'-폴리아데닐화된 mRNA의 생성을 위해 이용한 시험관내 전사 작업 흐름을 예시한다. 80%의 GTP를 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 캡 구조 유사체(NEB S1411)로 대체함으로써 공동 전사 캡핑을 달성하였다. Qiagen RNAesy 미니 키트 또는 NEB Monarch mRNA CleanUp(T2050L)을 사용하여 IVT 반응 생성물을 정제하였고, Nanodrop에 의해 정량화하고, 품질 관리를 위해 Agilent 단편 분석기(전형적 전기영동도를 도 17C에 나타냄)에 의해 분석하였다.
서열번호 81 - 5'UTR, HBB 3'UTRx2 및 120 bp 길이 폴리A 꼬리를 포함하는 SpRY_ABE8e_V106W 아데닌 염기 편집기의 시험관내 전사를 위한 pmRNA 플라스미드
도 18은 상이한 용량(20uL 전기천공법 용적 중 0.5 내지 5ug) 및 FLT3-e9-18 sgRNA의 180 또는 360p㏖ 중 하나에서 전기천공된 IVT SpRY-ABE8e-V106W 3xNLS 염기 편집기 mRNA를 사용하는 K562 리포터 세포에 대한 염기 편집 실험을 예시한다. 편집 세포를 발현 정규화를 위해 4G8 클론(표적화 항체) 및 BV10A4 클론으로 염색하였다(도 18A). 유세포분석에 의한 편집 세포의 백분율을 각 플롯의 하단 우측에 보고한다. 도 18B는 유세포분석에 의한 mRNA/gRNA 용량과 편집 효율 사이의 관계를 나타내는 한편, 도 18C는 mRNA/gRNA 용량과 유세포분석(LiveDead yellow 염색)에 의한 세포 생존도 사이의 관계를 나타낸다. 도 19A의 실험 샘플로부터의 PCR-증폭 gDNA의 Sanger 서열분석에 의한 염기 편집 효율을 나타내는 히트맵. A에서 G로의 전환 효율을 계산하기 위해 EditR 패키지를 사용하여 Sanger 추적을 디콘볼루션하였다. gRNA 및 mRNA 용량을 좌측에 보고하는 한편 gRNA 서열 내의 표적화된 아데닌의 넘버링을 열로 보고한다(PAM은 21 내지 23번 위치에 상응함). 도 19B는 유세포분석(4G8- 세포)와 Sanger 서열분석에 의한 편집 효율 사이의 관계를 보고한다.
1차 인간 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 FLT3 염기 편집이 실현 가능하다는 것을 확인하기 위해, 시험관내 염기 편집 및 확장 배양 실험을 수행하였다. 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ HSPC를 해동시키고, 1% 페니실린/스트렙토마이신, SCF 100ng/㎖(Peprotech), FTL3L 100ng/㎖(Peprotech), TPO 50ng/㎖(Peprotech), Stemregenin-1 0.75uM(StemCell technologies), UM171 35nM(Selleckhem)을 보충한 StemCell SFEMII 배지에서 5십만 내지 7십 5만개/㎖로 배양하였다. 20uL 반응물당 2.5 내지 7.5ug 염기 편집기 mRNA(SpRY-ABE8e-V106W) 및 sgRNA(Integrated DNA Technologies) 250 내지 450p㏖을 보충한 P3 전기천공법 용액(Lonza)에서 Lonza 4D-Nucleofector 시스템을 사용하여 해동시킨 후에 1십 5만 내지 2십 5만개(M)의 HSPC 48시간으로 전기천공하였다. 5 내지 7일 동안 앞서 언급한 배지에서 세포를 배양시켰다. CAR-T 세포 사멸에 대한 특정 저항성을 시험하기 위해, 편집 또는 비편집 CD34+ 세포를 편집 후 3일 동안 시험관내에서 확장시키고, 이어서, 항-FLT3 CAR-T 세포 또는 비형질도입 T 세포 중 하나와 함께 공동배양시켰다.
도 20A는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ HSPC의 시험관내 확장 배양 및 FLT3 염기 편집을 위한 실험 레이아웃 및 시각표를 나타낸다. 세포를 1, 2.5 또는 5ug의 SpRY-ABE8e-V106W 3xNLS mRNA 및 180 또는 360p㏖의 FLT3-e9-18 sgRNA 중 하나로 전기천공하였다. 도 20B는 시험관내 확장 배양 동안 CD34+ 세포의 유세포분석 면역표현형에 대한 게이팅 전략을 예시한다. 도 20C는 상이한 염기 편집 조건에 대한 CD34+ 세포의 시험관내 배수 확장을 나타내며, 이는 비처리 대조군에 비한 염기 편집 절차의 제한된 독성을 입증한다. 도 20D는 편집 후 3일차 및 6일차에 배양된 CD34+의 유세포분석에 의한 조성을 요약하며, 전기천공법 및 mRNA 염기 편집 시 줄기세포 및 전구체 서브세트의 왜곡(skewing)이 없음을 나타낸다.
전기천공법 후 6일차에 Sanger 서열분석에 의한 편집 효율을 도 21A에 나타낸다. gRNA 및 mRNA 용량을 좌측에 보고하는 한편 gRNA 서열 내의 표적화된 아데닌의 넘버링을 열로 보고한다(PAM은 21 내지 23번 위치에 상응함). 인간 CD34+ HSPC에서 염기 편집 효율과 상이한 gRNA x mRNA 용량 사이의 관계를 도 21B의 산점도로서 보고한다.
실시예 8: SpRY-ABE8e-V106W mRNA에 의한 인간 FLT3-발현 백혈병 세포주 또는 인간 CD34+ HSPC의 FLT3 염기 편집은 4G8 CAR-T 세포에 저항성을 부여한다
도 18에서 행한 실험으로부터 얻은 염기 편집 세포가 4G8 CAR-T 세포에 저항성이 있는지를 시험하기 위해, 앞서 보고한 바와 같이 공동 배양 실험을 수행하였다. 상이한 효과기:표적비로 공동 배양 4시간 후에 생세포의 유세포분석 플롯을 도 22A에 보고한다. 편집 세포(편집 효율 대략 89%)는 CAR-T 세포 사멸로부터 보호되고, 더 높은 E:T 비의 사건에서 생존한다. 도 22B는 4G8 항 FLT3 CAR-T 세포 또는 비형질도입 T 세포 중 하나와 함께 공동 배양의 4시간 후에 AnnexinV 및 LiveDead yellow 염색에 의해 표적 세포(비편집 또는 FLT3 염기 편집 K562) 생존도를 보고하며, 비변형 세포의 선택적 사멸을 강조 표시한다. 비편집 또는 FLT3 염기 편집된 K562 세포 중 하나와 함께 공동 배양의 4시간에 표면 CD107a 염색에 의한 CAR-T/T 세포 탈과립을 도 22C에 보고한다. 비변형 세포에 노출된 CAR-T 세포만이 유의미한 탈과립을 나타낸다.
유사하게, 염기 편집된 인간 조혈 줄기 및 전구 세포가 FLT3-표적화 면역요법에 저항성인지를 시험하기 위해, 도 20에서 수행한 실험에서 편집한 CD34+를 4G8 CAR-T 세포 또는 비형질도입 T 세포와 공동 배양시켰다. 도 23은 도 20에서 실험의 3일차 배양물로부터의 비변형 또는 FLT3 염기 편집 mPB CD34+ 세포와의 CAR-T 세포 공동 배양 실험을 나타낸다(편집 효율 대략 46%). 4G8 항 FLT3 CAR-T 세포 또는 비형질도입 T 세포 중 하나와의 상이한 효과기:표적비의 48시간 공동배양물에서 생존 세포의 유세포분석 플롯을 도 23A에서 보고한다. 4G8 항 FLT3 CAR-T 세포 또는 비형질도입 T 세포 중 하나와 함께 상이한 효과기:표적비에서 공동 배양시킨 CD34+ 세포의 특이적 사멸을 도 23B에서 보고한다. 줄기세포 풍부 CD34+90+ 서브세트에 대한 특이적 사멸을 도 23C에서 보고한다. FLT3L에 노출된 배양된 CD34+ HSPC에 의한 FLT3의 상대적으로 더 낮은 발현으로 인해, CAR-T 매개 사멸의 차이는 세포주에 대해 수행한 실험과 비교할 때 덜 현저하지만, 변형된 HSPC는 FLT3 편집에 의해 부여된 저항성을 나타내고, 더 줄기-풍부화된 CD90+ 세포 내에서 차이가 더 크다.
실시예 9: FLT3-편집 HSPC는 생체내에서 CAR-T 세포 매개 사멸에 의해 보호된다
항-FLT3 CAR-T 세포에 의해 매개되는 표적 사멸에 대한 보호 역할을 추가로 확인하기 위해, 면역결핍 NSG 마우스에서의 생체내 이종이식 실험을 수행하였다(도 24A는 실험 설계를 나타냄). 인간 동원된 말초 혈액 유래 CD34+ HSPC를 앞서 예시한 바와 같이 편집하고, 치사량에 가까운 방사선 조사(2.5Gy)의 24시간 후 꼬리 정맥 주사에 의해 마우스당 1백만개를 이식하였다. 비편집 HSPC를 이종이식한 마우스는 대조군으로서 작용하였다. 각 그룹을 이식 후 7주차에 2개의 처리 서브세트, 즉, 마우스당 1백 5십만개의 세포로 비히클(PBS) 또는 4G8-CAR T 세포 중 하나로 추가로 나누었다. 마우스를 8주차에 안락사시켰다(CAR-T 세포 처리 후 1주). 유세포분석에 의한 인간 골수 생착(CD3+ 세포를 제외한 인간 CD45+ 세포의 %) 및 인간 절대 CD45+ 세포수를 도 24B에서 보고한다. CD3+는 주사한 CAR-T 세포로부터 유래하기 때문에 인간 생착로부터 제외하였다. 비편집 세포를 이식한 마우스에서 인간 생착의 더 심각한 고갈이 관찰되었다. 골수 상에서 CD3+ 세포를 제외한 인간 생착 조성물을 도 24C에서 보고하며, 이는 편집된 HSPC에 의해 생성된 다중계통 생착을 입증한다.
조혈 줄기 및 전구체 세포 빈도(CD34+CD38-) 및 희생 시 골수 내 절대 존재비를 도 25A에서 보고하며, 이는 CAR-T 매개 사멸에 대한 FLT3 염기 편집의 보호 효과를 입증한다. 각 그룹으로부터의 마우스의 골수 분석으로부터 모은 사건으로부터 초래된 예시적인 유세포분석 플롯을 도 25D(게이팅 전략) 및 도 25E(계통-CD34+38- 지속 세포의 분획)에서 보고한다. 표면 CD69 염색에 의한 처리 마우스의 비장에서의 CAR-T 세포의 상대적으로 더 높은 활성화를 도 25B에 나타낸다. CAR-T 세포를 EGFR 염색에 의해 확인하였다(마커로서 CAR 및 안전성 스위치로서 CAR과 함께 공동 발현). 처리 마우스의 비장에서 CD62L 및 CD45RA 발현에 의한 CAR-T 세포 표현형을 도 25C에서 보고한다. 미경험: CD45RA+CD62L+, 중심 기억(CM): CD45RA-CD62L+; 효과기 기억(EM): CD45RA-CD62L-; 최종적으로 분화된 효과기 기억(TEMRA): CD45RA+CD62L-. 비편집 HSPC를 이종이식한 처리 마우스에서 효과기 서브세트에 대한 상대적 왜곡이 분명하다.
CAR-T 세포 사멸에 대한 N399의 FLT3 염기 편집에 의한 CD34+ HSPC의 보호를 추가로 평가하기 위해, 제2 실험 생체내 실험을 NBSGW 마우스에서 수행하였고, 이는 방사선 조사 없이 인간 HSPC의 이종이식 및 생착을 가능하게 하고, 뮤린 HSPC의 저형성 키트 돌연변이(동형접합성 W41 대립유전자) 덕분에 더 높은 수준의 인간 조혈 재구성을 가능하게 한다. 도 32는 8주차 방혈 시 생착 인간 세포에 대한 실험 설정 및 FLT3 염기 편집 효율을 보고한다. 처리한 그룹은 이식 후 11주에 2백 5십만개의 4G8 CAR-T 세포를 받았고, 후속적으로 이식 후 13주에 안락사시켰다. 이 실험 설정은 FLT3 염기 편집에 의해 부여된 골수 전구체 및 계통 보호의 개선된 평가를 가능하게 하였다. 도 33A는 AAVS1-대조군 편집 세포와 비교할 때 FLT3 편집 HSPC를 이식한 마우스에서 명확한 보호와 함께, 희생 시 골수에 대한 유세포분석에 의한 과립구(다형핵 세포, PMN)의 상대 존재비를 나타낸다. 성숙 과립구는 FLT3을 발현시키지 않기 때문에, 이는 전구체 세포에서 일부 보호 정도를 나타낸다. 이 가설과 일치되게, 계통-CD34+CD38+FLT3+CD45RA+로 정의되는 과립-모노 전구체(GMP)는 모의-편집 HSPC를 이종이식한 마우스에서만 FLT3 CAR-T 세포에 의해 선택적으로 고갈된다(도 33A). 도 33B는 4G8-CAR 처리 또는 비처리 그룹에서 여러 시점에 FLT3 염기 편집 효율을 보고한다. 4G8-CAR 투여 시, 비변형 세포의 점진적 음성 선택으로, FLT3-편집 세포의 선택을 초래한다(이는 처리 마우스의 골수 샘플을 플레이팅한 콜로니 형성 단위 분석으로부터 유래된 자손에서 더 분명함). 과립구, 과립-모노 전구체(GMP) 및 HSPC(계통-CD34+CD38-CD90+CD45RA-) 집단을 나타내는 대표적인 FACS 플롯을 도 34에서 보고한다.
실시예 10: SpRY-ABE8e-V106W mRNA에 의한 인간 CD34+ HSPC의 CD123 염기 편집은 실현 가능하고, FLT3 염기 편집에 의해 다중복합화될 수 있다
FLT3- 염기 편집 실험과 유사하게, 본 발명자들은 인간 CD34+ HSPC에서 단독으로 또는 FLT3 N399 염기 편집과 조합하여 SpRY-ABE8e-V106W mRNA 및 CD123 gRNA-N을 사용하여, S59P 돌연변이를 도입하였다. 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ HSPC를 해동시키고, 1% 페니실린/스트렙토마이신, SCF 100ng/㎖(Peprotech), FTL3L 100ng/㎖(Peprotech), TPO 50ng/㎖(Peprotech), Stemregenin-1 0.75uM(StemCell technologies), UM171 35nM(Selleckhem)을 보충한 StemCell SFEMII 배지에서 5십만 내지 7십 5만개/㎖로 배양하였다. 20uL 반응물당 5 내지 7.5ug 염기 편집기 mRNA(SpRY-ABE8e-V106W) 및 sgRNA(Integrated DNA Technologies) 420 내지 450p㏖을 보충한 P3 전기천공법 용액(Lonza)에서 Lonza 4D-Nucleofector 시스템을 사용하여 해동시킨 후에 1십 5만 내지 2십 5만개(M)의 HSPC 48시간으로 전기천공하였다. 7일 동안 앞서 언급한 배지에서 세포를 배양시켰다. 도 26A는 실험 레이아웃 및 배양 배지 조성을 예시한다. 도 26B는 배양된 CD34+ HSPC의 시험관내 확장을 나타내는 한편, 도 26C는 성공적으로 염기 편집된 CD34+ HSPC에 결합하는 7G3 클론의 상실을 나타낸다. 유세포분석 플롯을 줄기-풍부화된 CD90+ 서브세트 상에서 게이팅하고, 이는 클론 9F5 염색에 의해 정규화될 때 7G3의 상실에 의한 HSPC의 CD123 염기 편집을 나타낸다. FLT3 단일 편집, CD123 단일 편집 및 FLT3 + CD123 이중 염기 편집 조건의 편집 효율을 도 27에서 보고한다. 염기 편집을 통해 S59P 돌연변이를 도입하는 것이 실현 가능한 반면, FLT3 N399(>64%)와 비교할 때 본 발명자들의 설정에서 얻은 효율은 상대적으로 낮다(최대 29.3%).
실시예 11: CD123 염기 편집 효율은 sgRNA 위치의 최적화 및 아데닌 염기 편집기의 Cas9 단백질 내의 K918N 치환의 도입에 의해 개선될 수 있다
CD123 S59 코돈의 편집 효율이 개선될 수 있었는지를 알아보기 위해, 개선된 Cas9 촉매적 활성과 관련된 K918N 돌연변이를 포함하는 Cas9 단백질을 본 발명자들의 SpRY-ABE8e 설계와 조합하여 시험하였다. 도 28A에 나타낸 바와 같이, K918N 돌연변이의 도입은 편집 효율에 대해 서열-특이적 효과를 초래하였고, FLT3-gRNA-18 편집이 약간 감소되는 동안 CD123-gRNA-N에 대해서는 개선되었다. 도 28A는 500ng 염기 편집기-발현 플라스미드 및 360p㏖의 sgRNA를 K562 리포터 세포 내로 전기천공하고 3일 후에 유세포분석에 의한 염기 편집 결과를 나타낸다. 편집 세포를 CD123에 대해 7G3(표적화 항체)에 9F5 클론(정규화)을 더한 것으로 염색하였다. gRNA CD123-N(CD123_gRNA_N, 서열번호 24)를 이전 실험에서와 같이, SpRY-ABE8e-V106W-3xNLS BE와 조합하여, 또는 SpRY-K3918N-ABE8e-V106W-3xNLS(서열번호 9 및 서열번호 12, 서열은 위에 있음)로 시험하였다. 유세포분석에 의한 편집 세포의 백분율을 각 플롯의 하단 우측에 보고한다.
CD123 편집 효율을 추가로 개선시키기 위해, 2개의 추가 sgRNA(CD123-gRNA-R 및 이의 21-bp 길이 형태, CD123-gRNA-R21)를 인간 U6 프로모터 하에 pHKO-mTagBFP2 플라스미드에서 기준 CD123-gRNA-N 및 FLT3-gRNA-18과 함께 클로닝하였다. 도 28B는 CD123 S59 표적화 gRNA의 상대적 위치 및 서열을 보고한다. 더 나아가, 추가적인 아데닌 염기 편집기 설계를 클로닝하고, SpRY-ABE8e-V106W와 함께 시험하였다(도 28C): SpRY-K918N-ABE8e-V106W, SpRY-HF1-ABE8e-V106W, SpRY-HF1-BlackJack-ABE8e-V106W, SpRY-BlackJack-ABE8e-V106W, SpRY-Sniper-ABE8e-V106W SpRY-Sniper-BlackJack-ABE8e-V106W. HF1 변이체는 gRNA 스페이서 미스매칭 염기에 대한 낮은 내성 및 더 낮은 비표적 편집(고충실도)과 관련된 N497A, R661A, Q695A, Q926A 치환을 포함한다. Sniper 변이체는 F539S, M763I, K890N 치환을 포함하고, 이는 표적 효율이 보존된 다른 더 고충실도 SpCas9 변이체를 생성한다. BlackJack는 21-bp 이상의 sgRNA에 내성을 갖도록 설계된 Cas9 변이체이고, 이는 더 높은 충실도 변이체에 대해 상대적으로 더 중요하다. K562 리포터 세포에서 500ng의 염기 편집기 플라스미드 및 500ng의 sgRNA 발현 플라스미드의 공동 전기천공법을 sgRNA의 모든 조합(CD123-gRNA-N, CD123-gRNA-R, CD123-gRNA-R21, FLT3-gRNA-18)에 대해 수행하였고, 유세포분석에 의한 편집 72시간 후에 결과를 평가하였다. 도 28D는 선별 절차의 결과를 요약하고, 이는 CD123 S59 염기 편집에 대해 개선된 조합을 강조한다. 특히, HF1 변이체를 제외하고, CD123-gRNA-R은 CD123-gRNA-N보다 평균적으로 1.42x 더 효율적이지만, 이의 21-bp 길이 상대(CD123-gRNA-R21)는 단지 1.21x 더 효율적이다. K918N 돌연변이의 도입은 gRNA-R에 대해 1.08x 그리고 gRNA-N에 대해 1.05x까지 CD123 편집을 개선시킨다. Sniper 돌연변이와 조합하여, K918N은 gRNA-R에 대해 1.22x 그리고 gRNA-N에 대해 1.16x까지 효율을 개선시킨다. 결론적으로, CD123-gRNA-R로의 전환 및 K918N 돌연변이의 도입은 K918N 치환에 의해 상대적으로 영향받지 않는 것으로 나타난 FLT3과 비교할 때 CD123 편집에 대해 관찰한 더 낮은 효율을 부분적으로 보상하였다.
실시예 12: CD34+ HSPC에서 SpRY-K918N-ABE8e-V106W mRNA에 의한 개선된 듀플렉스 염기 편집 효율
SpRY-K918N-ABE8e-V106W 시험관내 전사된 mRNA를 이용하여 FLT3 및 CD123 좌위에 대한 CD34+ HSPC 염기 편집 효율의 개선은 다중 매개변수(mRNA 제조, K918N 돌연변이 도입, sgRNA 선택)의 최적화를 통해 달성되었다. 예시적인 실험을 도 29에서 보고한다. 도 29A는 실험 설계를 요약하고, 도 29B는 유세포분석에 의한 CD123 편집 평가에 대한 게이팅 전략을 보고하는 한편, 도 29C는 비처리(전기천공법 단독) 대조군과 비교할 때 FLT3+CD123 염기 편집 세포에 대해 유사한 확장을 입증한다. Sanger 서열분석은 FLT3 N399 편집의 경우 최대 85% 및 CD123 S59 편집의 경우 최대 41% 효율을 나타냈다(도 30).
실시예 13: KIT H378R 돌연변이는 CD34+ HSPC에서 아데닌 염기 편집을 통해 도입될 수 있다
실시예 12와 동일한 실험 설정을 사용하여, 본 발명자들은 H378R 돌연변이가 인간 CD34+ HSPC에서 염기 편집을 통해 도입될 수 있는지를 시험하였다. SpRY-K918N-ABE8e-V106W 시험관내 전사된 mRNA(4ug/20uL 전기천공법 용적) 및 KIT-gRNA-Y(서열번호 37)를 전기천공함으로써, 최대 60%의 편집 효율을 달성하였다.
실시예 14: 항-FLT3 및 CD123 이중특이적 키메라 항원 수용체의 생성
합리적으로 설계된 항-FLT3 및 CD123 이중특이적 키메라 항원 수용체는 강력한 항백혈병 효능을 초래하여야 한다. 도 29A는 FLT3 도메인 4와 CD123 N-말단 도메인을 둘 다 표적화하는 추정적 2세대 이중특이적 키메라 항원 수용체의 개략도이다. 도 29B는 CD123(CSL362 클론, 서열번호 75 내지 76) 및 FLT3(4G8 클론, 서열번호 73 내지 74) 및 상이한 배향의 scFv 도메인 및 또는 상이한 세포외 링커, 막관통 도메인, 세포내 공자극 도메인을 갖는 이중특이적 키메라 항원 수용체(서열번호 77 내지 80)를 표적화하는 2세대 단일 특이성 CAR의 설계이다.
실시예 15: 염기 편집은 스텔스 수용체를 생성한다
본 발명자들의 에피토프 조작 전략에 대한 표적으로서, 본 발명자들은 사이토카인 수용체 FLT3, KIT 및 CD123(IL3RA)을 선택하였다. Fms-유사 타이로신 키나제 3(FLT3, CD135) 및 원종양유전자 c-KIT(KIT, CD117)는 각각 AML 사례의 93% 및 85%의 야생형(WT) 또는 돌연변이 형태로 발현되는 부류 III 수용체 타이로신 키나제이다32-37. CD123은 AML 사례의 75% 초과의 표면 상에서 발견되고 백혈병 줄기세포 표면 상에서 발현되는 IL-3 수용체(IL3RA), I형 사이토카인 수용체의 알파 서브유닛이다38-40. 이러한 유전자는 정상 조혈 발생의 다양한 단계에서 존재하고, AML 세포 상에서의 이들의 과발현은 불량한 예후, HSCT 후 더 높은 재발 발생률 및 성인과 소아 환자 모두에서의 더 낮은 전체 생존율과 관련된다33,36,41-43. 본 발명자들의 접근을 개발하기 위해, 본 발명자들은 현재 항-AML 면역요법의 개발을 위한 평가하에서 단클론성 항체(mAb)를 선택하였다: 클론 4G822,44(FLT3), Fab-79D21,45(KIT) 및 7G346-48(CD123). 이전의 연구는 4G8이 FLT3 세포외 도메인(ECD) 4를 인식하는 한편, 클론 BV10A4가 ECD2 내에서 관련없는 에피토프를 인식하고, 따라서 FLT3 표면 발현을 평가하기 위한 대조군으로서 작용할 수 있다는 것을 보고하였다44. 인간 FLT3 형질감염 세포주로 BALB/c 마우스를 면역화시킴으로써 4G8을 생성하였기 때문에, 본 발명자들은 인간과 마우스 FLT3 사이의 높은 상동성 정도(85.8% 동일성 및 91.5% 유사성) 및 FLT3 리간드 (FLT3L) 교차 반응성에도 불구하고 4G8이 인간-특이적 에피토프를 인식한다는 것을 추론하였다49.
본 발명자들은 우선 ECD4가 이의 뮤린 오솔로그(16개 코돈 변화)로 치환된 키메라 인간 FLT3이 FLT3L 결합 및 세포내 키나제 인산화에 영향을 미치는 일 없이 4G8 결합의 상실을 초래한다는 것을 확인하였다(도 36A, B 좌측, C 상단). 4G8 결합에 관련된 잔기의 최소 수를 확인하기 위해, 본 발명자들은 ECD4 내의 16개의 미스매칭 위치 각각에서 인간 또는 뮤린 코돈을 갖는 슬리핑 뷰티 트랜스포존-기반 조합 라이브러리를 설계하였다(도 36D, 상단 좌측). 이 라이브러리로 형질도입한 K562 세포의 유세포분석은 대조군 항체(BV10A4)에 대해 양성이고 4G8에 대해 음성인 세포의 집단을 나타냈다(도 36D, 상단 우측). 정렬된 단일(BV10A4+4G8-) 및 이중 양성(BV10A4+4G8+) 세포의 표적화된 심층 서열분석에 의해 측정한 각 위치에서 인간 대 뮤린 코돈의 상대 존재비의 비교는 단일 아미노산 치환에 대한 풍부화를 나타냈다(N399D; 도 36D, 하단 및 도 37A). 이 결과를 검증하기 위해, 본 발명자들은 FLT3 N399D 변이체로 K562 세포를 형질도입하였고, 4G8 결합의 상실이 있는 것을 제외하고 야생형과 비슷한 수준에서 FLT3의 표면 발현을 확인하였다(도 37B).
다음에, 본 발명자들은 N399D 치환을 도입하기 위한 유전자 편집 전략을 평가하였다. FLT3 신호전달에 따르지 않는 세포에 대한 본 발명자들의 게놈 조작 절차 결과를 용이하게 평가하기 위해, 본 발명자들은 전사 개시 부위에 대해 상류의 EF1α 구성적 프로모터의 표적화된 통합에 의해 이들의 내인성 좌위로부터 FLT3을 발현시키는 K562 리포터 세포를 생성하였다(도 37C). 이어서, 본 발명자들은 N399D 돌연변이가 SpCas9 또는 AsCas12a 뉴클레아제 및 200-bp ssODN 공여자 주형 중 하나를 사용하여 상동 유도 수선(HDR)에 의해 삽입될 수 있다는 것과 성공적으로 편집된 세포가 FLT3 표면 발현을 보존하면서 4G8 결합의 상실을 나타낸다는 것을 확인하였다(도 37D). 그렇더라도, 뉴클레아제의 사용은 DNA 이중 가닥 파손(DSB) 및 큰 비율의 비-편집 세포에서 일어나는 유전자 넉아웃과 관련된 게놈독성의 고유한 위험을 보유한다(도 37D).
에피토프 조작은 단일 점 돌연변이의 도입에 의해 달성될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 염기 편집(BE)이 DSB에 대한 필요를 피함으로써 에피토프 편집에 대한 적합하고 더 안전한 선택일 수 있다는 것을 추론하였다. 399번 위치에서 아스파라긴은 AAC 코돈에 의해 암호화되고, 이는 아데닌 염기 편집(Adenine Base Editing: ABE)에 의해 GAC(아스파르테이트) 또는 GGC(글리신)로 전환될 수 있다. 본 발명자들은 SpCas9 틈내기효소(NGG PAM) 또는 이완된 PAM-특이성을 갖는 Cas9 변이체(NG-SpCas9n 및 SpRY-Cas9n, 도 36F)와 연결된 진보된 세대 TadA-8e 데아미나제와 조합하여 FLT3-리포터 세포를 여러 sgRNA를 이용하여 전기첨공함으로써(1-bp 엇갈린 방식으로, 프로토스페이서의 3 내지 9번 위치에 표적 아데닌이 있음) 이 가설을 시험하였다. 유세포분석에 의한 평가는 4G8 인식의 상실과 함께 성공적인 에피토프 편집을 나타냈고, FLT3-sgRNA-18과 조합된 SpRY-ABE8e에 의해 가장 높은 효율이 달성되었다(66.3%, 도 36F). HDR-기반 전략과 대조적으로, 염기 편집과 비-염기 편집 세포는 둘 다 상당한 유전자 넉아웃 없이 정상 표면 FLT3 발현을 보유하였다. N399D와 N399G는 둘 다 본 발명자들의 편집 전략의 잠재적인 결과이기 때문에, 본 발명자들은 모든 추가 타당성 검증에서 이 돌연변이를 포함하였다.
유사한 전략을 KIT ECD4에 결합하고 리간드-유도 이량체화를 차단하는 것으로 보고된 KIT-표적화 mAb인 Fab-79D의 에피토프 맵핑에 적용하였다45. 본 발명자들은 우선 KIT ECD4이 있는 잠재적인 접촉 지점(F316S, M318V, I319K, V323I, I334V, E360K, P363V, E366D, E376Q, H378R)으로서 이전에 예측한 위치에서 10개의 아미노산 변화(KIT 오솔로그)를 도입함으로써 Fab-79D 결합의 상실을 확인하였고, 줄기세포 인자(SCF) 결합 및 세포내 키나제 인산화의 보존을 검증하였다(도 36B 우측, C 하단). ECD4 돌연변이와 클론 Fab-79D 사이의 상호작용을 총괄적으로 선별하기 위해, 본 발명자들은 KIT ECD4의 각 위치가 무작위 아미노산으로 치환되는 축중 코돈을 사용하는 선별을 수행하였다(도 36E 좌측). 본 발명자들은 라이브러리로 HEK-293T 세포를 형질도입하고, 보존된 KIT 발현을 제외하고 Fab-79D에 대해 감소된 결합을 갖는 세포 및 Fab-79D 염색이 보존된 세포를 분류하였다(도 36E 우측). 라이브러리 영역의 NGS 서열분석 및 단일 양성 세포 내의 각 위치에서 특정 코돈의 풍부화의 비교는 Fab-79D의 친화도를 감소시킬 수 있는 여러 돌연변이를 나타냈다(도 36E 하단). 이러한 결과를 검증하기 위해, 본 발명자들은 라이브러리에 의해 식별되는 10개 위치(M318, I319, V323, D332, I334, D357, E360, E376 및 H378)에서 아데닌- 또는 사이티딘-염기 편집에 의해 복제되고 추가 개발을 위해 H378R을 선택한 돌연변이를 선택함으로써 20개의 아미노산 치환을 개별적으로 클로닝하였는데, 이것이 SCF에 대한 결합을 보존하면서 KIT 대조군 Ab에 대해 정규화할 때 Fab-79D 결합의 가장 높은 감소를 나타냈기 때문이다(클론 104D2)(도 37E). 더 나아가, H378R은 FLT3 N399D와 유사하게 ABE에 의해 삽입될 수 있고, 따라서 잠재적 조합 및 이중 에피토프-조작을 가능하게 한다. FLT3에 대해 행한 것과 같이, 본 발명자들은 SpRY-ABE8e와 조합하여 H378(5, 6 또는 7번 위치에서 표적 A)에서 목표로 한 편집 창을 사용하여 K562 세포 상에서 3개의 상이한 sgRAN를 선별하였고, 가장 높은 효율을 갖는 조합으로서 KIT-Y를 식별하였다(도 37C, 도 37F).
CD123의 경우, 에피토프와 치료용 클론 7G3(또는 이의 인간화된 상대, CSL362 - 탈라코투주맙)의 결합에 영향을 미치는 아미노산 치환은 이전에 보고된 적이 있다48. 본 발명자들의 에피토프-편집 전략을 개발하기 위해, 본 발명자들은 K562 리포터 세포(도 37E) by CD123 N-말단 도메인의 위치 E51, Y58, S59, R84, P88 및 P89에서 목표로 한 sgRNA를 시험함으로써 표적화된 BE 선별을 설계하였고, 이들을 CBE(NGG, NG 및 SpRY Cas 변이체를 갖는 evo-APOBEC1-BE4)와 ABE(ABE8e, NG 및 SpRY 변이체, 도 36G)와 합리적으로 조합하였다. 여러 조합이 CD123에 대한 7G3의 친화도를 감소시킨 돌연변이를 도입하였지만, gRNA CD123-N 단독 및 SpRY-ABE8e와 조합한 CD123-R 및 SpRY-evo-APOBEC1-BE4와 조합한 gRNA CD123-L은 7G3 결합을 완전히 제거할 수 있었다(도 36G 및 도 37H). 편집 세포의 서열분석은 ABE 및 CBE가 각각 S59P 및 S59F 치환을 초래하였다는 것을 나타냈다. 방관자 돌연변이(Y58H)를 또한 아데닌 염기 편집에 의해 CD123-N을 이용할 때보다 gRNA CD123-R을 이용할 때 더 높은 효율로 도입할 수 있었고, 따라서 추가 검증에 포함되었다. FLT3 및 KIT ABE와 조합한 다중 에피포프의 편집 가능성으로 인해, 본 발명자들은 추가 개발을 위해 ABE와 함께 gRNA CD123-R에 의해 도입된 S59P를 선택하였다. 최종적으로, 2개의 추가적인 CD123-표적화 mAb를 갖는 본 발명자들의 염기 편집된 CD123 리포터 세포를 시험함으로써, 본 발명자들은 P88S/P89S 또는 P88L/P89L의 조합을 초래하는 P88/P89의 사이티딘 염기 편집이 클론 6H6 및 S18016E에 의한 인식이 거의 완전한 상실을 야기하고, 따라서 에피토프-조작 세포와 조합하여 잠재적으로 적용하는 mAb의 풀을 확대한다는 것을 발견하였다(도 37I).
에피토프-조작 수용체에 대한 본 발명자들의 선택 Ab의 친화도 상실을 정확하게 정량화하기 위해, 본 발명자들은 각 수용체 변이체(FLT3 WT, N399D, N399G; KIT WT, H378R; CD123 WT, S59P 및 Y58H-S59P)를 사용하여 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 K562 세포를 형질도입하였고, WT 수용체에 대한 포화 농도의 mAb에서도 모든 시험한 변이체의 인식이 거의 완전히 없다는 것을 관찰하였다(>5000ng/㎖, 도 36H). 특히, FLT3 N399G(399번 위치에서 AAG 코돈에서 아데닌 둘 다의 편집에 의해 도입됨)는 4G8 결합을 감소시키는 이의 능력이 N399D와 다르지 않았다. 유사하게, CD123 S59P에 대한 Y58H 방관자 돌연변이의 첨가는 세포막에 대한 CD123 발현에 영향을 미치지 않고, 7G3 결합에서 유사한 감소를 나타냈다.
전반적으로, 본 발명자들은 FLT3, KIT 및 CD123의 에피토프 조작이 실현 가능하고, gRNA 및 염기 편집 효소의 적절한 조합을 선택함으로써 DSB에 대한 필요 없이 고효율로 달성될 수 있다는 결론을 내렸다.
실시예 16: 에피토프 편집은 수용체 기능성을 보존한다
선택된 표적은 인간 HSPC 상에서 발현된 기본 사이토카인/성장 인자 수용체이고 줄기세포 유지 및 계통 분화에서 적절한 역할을 갖기 때문에, 본 발명자들은 본 발명자들의 조작 절차가 수용체 기능성을 변경하는지를 엄격하게 평가하였다. 형광으로 접합된 FLT3L, SCF 및 IL-3 리간드를 사용함으로써, 본 발명자들은 모든 시험 농도에 걸쳐 이들 각각의 WT 또는 에피토프 조작된 수용체에 대한 비슷한 결합을 확인하였다(1 내지 >1000ng/㎖; 도 36I). CD123 변이체를 공통 베타 서브유닛을 공통 베타 서브유닛(CSF2RB/CD131)과 공동 발현시켜 이형이량체 IL-3 수용체를 형성하고 신호 형질도입을 가능하게 하는데, K562 세포가 유세포분석에 의해 CSF2RB를 발현시키지 않기 때문이다(도 37J). FLT3 및 KIT의 세포내 신호전달 캐스케이드의 활성화는 웨스텃 블롯으로 확인하였는데, 이는 리간드 결합 시 비슷하고 용량 의존적인 키나제 인산화를 나타냈다(도 38A, 도 38B). CD123에 대해서, 본 발명자들은 모든 시험한 IL-3 농도에서 WT와 에피토프 조작 변이체 모두에서 동일하게 활성화된 하류의 STAT5 신호전달자의 인산화를 측정함으로써 리간드-매개 수용체 활성화를 확인하였다(도 38C). 최종적으로, 리간드-의존적 증식 반응의 완전한 보존을 확인하기 위해, 본 발명자들은 증식 및 생존을 위해 STAT5 경로를 통한 신호전달을 필요로 하는 뮤린 IL-3-의존적 림프아구 세포주인 BaF3 세포에 대한 키나제 상보성 분석을 수행하였다50. 본 발명자들은 뮤린 IL-3 기아 동안 인간 FLT3L, SCF 및 인간 IL-3에 대한 노출 후 WT 및 에피토프 조작 수용체 변이체에 의한 세포 증식의 비슷하고 용량 의존적인 구조(rescue)를 확인하였다(도 38D).
실시예 17: 스텔스 수용체는 CAR-T 세포에 저항성이다
최근의 연구는 항-FLT3 클론 4G822, 항-KIT Fab-79D21 또는 항-CD123 CSL362 - 클론 7G3의 인간화된 변이체48,51로부터 생성된 CAR-T 세포 - mAb가 인간 AML 세포에 대해 주목할 만한 효능을 갖는다는 것을 나타냈다. 표적화된 CAR-T 요법에 대한 에피토프 조작된 세포의 저항성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 CD28 공자극 도메인을 갖는 2세대 CAR 작제물에서 4G8, Fab79D 및 CSL362 단일쇄 가변 단편(scFv)을 클로닝하였고, 최적화된52 절단된 EGFR 선택/고갈 마커(tEGFR; 도 39A)를 공동 발현시키기 위해 양방향 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터를 사용하였다. CAR-T 세포 생산에 대해서, 본 발명자들은 T 줄기 기억 표현형을 갖는 세포를 확장시키는 IL-7 + IL-15의 존재하에 CD3-CD28 비드 자극에 기반하여 배양 프로토콜을 사용하였다53(도 39A, 도 40A, 도 40B). 본 발명자들은 배양 시작에 비해서 20배 초과의 시험관내 확장을 갖는 높은 CAR 형질도입 효율(tEGFR 염색에 의해 85% 초과)을 얻었다(도 39B).
K562 리포터 세포에 대한 시험관내 사멸 분석을 수행함으로써, 본 발명자들은 WT FLT3, KIT 또는 CD123을 과발현시키는 대다수의 세포가 이들 각각의 특이적 CAR-T에 의해 사멸되었지만(E:T = 10에서, E:T = 0과 비교할 때 2% 미만의 생존 세포), 에피토프-조작 변이체를 발현시키는 K562 세포는 상이한 효과기:표적비(E:T 0.625 대 10)에 걸쳐서 CAR-T 세포 사멸에 저항성이 있었고(절대수와 세포 생존도 둘 다), 실험 종결까지 생존하였다는 것을 발견하였다(도 39C 내지 도 39E 및 도 40C, 도 40D). T 세포 활성화(CD69 발현) 및 탈과립화(CD107a 표면 발현)는 WT 유전자를 발현시키는 세포와 함께 배양한 조건에서 유의미하게 더 높았고, 이는 CAR-T에 의한 에피토프 편집 변이체의 인식 결여와 일치된다(도 40C, 도 40D). 또한, 살아있는 K562 리포터 세포는 비처리 대조군과 비슷한 수준에서 표적화된 수용체를 여전히 발현시켰다(도 39C, 도 39D, 도 39E 우측). 비형질도입 T 세포는 모든 시험 조건과 함께 배양시켰을 때 표적 사멸도 CD69 상향조절도 나타내지 않았다(도 40D). CAR-T 세포에 의한 엄격한 에피토프-특이적 사멸을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 비변형 또는 염기 편집된 이중 표적 세포(FLT3- 및 CD123-발현 K562 세포)의 혼합 집단을 공동 배양시켰고, 상응하는 CAR-T 세포와 함께 플레이팅할 때 에피토프-편집 집단의 선택적 저항성을 관찰하였다(도 40E).
전반적으로, 이들 데이터는 에피토프 조작 FLT3, KIT 및 CD123 변이체를 과발현시키는 세포가 CAR-T 세포 인식 및 사멸에 저항성이라는 엄격한 검증을 제공한다.
실시예 18: 인간 HSPC의 효율적인 에피토프 편집
인간 1차 HSPC의 내인성 유전자에 본 발명자들의 뉴클레오타이드 변이체를 효과적으로 도입하기 위해, 본 발명자들은 화학적으로 변형된 sgRNA 및 시험관내 전사된(IVT) SpRY-ABE8e mRNA의 공동 전기천공법에 기반하여 동원-말초 혈액(mPB)-유래 CD34+ 세포에 대한 염기 편집 프로토콜을 최적화하였다(도 41A 및 도 42A 내지 도 42C). mRNA 시험관내 전사, 배양 및 전기천공 조건 및 HSPC 자극 후 편집 시점의 최적화 후에(도 42D, 도 42E, 도 42F), 본 발명자들은 각각 FLT3, KIT 및 CD123에 대한 표적 A>G 전환의 최대 86.6%, 78.6% 및 67.9%를 달성하였다. 본 발명자들은 FLT3-18, KIT-Y 및 CD123-R sgRNA의 창 내에서 표적 아데닌을 효율적으로 편집할 수 있다(도 41B). 처리 세포의 분석은 줄기 보존 화합물의 존재하에 시험관내 배양 동안 표현형이 확인된 전구세포 조성(LMPP, CD90-45RA+; MPP, CD90-45RA-; HSC, CD90+45RA-)의 왜곡이 없다는 것을 나타냈다(StemRegenin, SR-1 및 UM171; 도 41D 및 도 42E). 본 발명자들이 HDR-매개 편집에 의해 이전에 관찰한 것과 대조적으로54, 염기 편집 효율은 벌크 세포, 수임전구세포(CD90-)에서 그리고 더 원시적인 HSPC 서브세트(CD90+45RA-; 도 41C)에서 동일하였다.
면역요법에 대한 FLT3N399 및 CD123S59 에피토프-조작된 HSPC의 저항성을 확인하기 위해, 본 발명자들은, 전기천공법 후 3 내지 5일에, 편집된 HSPC와 4G8 및 CSL362 CAR-T 세포를 상이한 E:T 비로 플레이팅함으로써 사멸 분석을 수행하였다. FLT3- 및 CD123 CAR-T에 의한 특이적 사멸은 각각 CD45RA+ 및 CD90+ 서브세트 내에서 가장 확연하였고, 따라서 절대수에 의한 이러한 실험 결과를 평가하는 데 사용하였다. 대조군 부위에서 편집된 세포(AAVS1 안전 게놈 항만(safe genomic harbor))를 CAR-T 세포 공동 배양에 의해 제거하였고, 에피토프-편집 세포는 본 발명자들이 K562 공동 배양물에 의해 관찰한 것과 유사한, 더 높은 생존도 및 절대수를 나타냈다(도 41E, 도 41F). KIT가 인간에서 조혈 외 발현으로 알려져 있기 때문에55 본 발명자들은 CAR-T 세포 대신에 mAb의 사용에 중점을 두었고, 이는 덜 심한 표적 상의 독성을 초래하고 비-게놈독성 조건화 또는 에피토프-조작 세포의 생체내 선택을 위해 사용할 수 있다. 증가된 농도의 이량체화-차단 Fab-79D mAb와 함께 편집 HSPC를 플레이팅함으로써, 본 발명자들은 SCF에 반응한 KITH378 편집 HSPC의 보존된 확장 동력학을 관찰한 한편, AAVS1 BE 세포는 용량 의존적 방식으로 저해되었다(도 41G).
수용체 조작된 CD34+ HSPC의 기능성 보존을 확인하기 위해, 처리 세포를 증가된 농도의 이들 각각의 리간드와 함께, 다른 사이토카인 없이, 추가 4일 동안 배양시켰다. 배양의 종료 시, 본 발명자들은 1 내지 10ng/㎖의 IL-3 농도에서 CD123S59 BE를 제외하고 수용체-편집과 AAVS1-편집 대조군 사이에 차이가 없다는 것과 함께, 모두 3개의 표적에 대해 용량-의존적 HSPC 증식 확장을 관찰하였다(도 42H). 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 BE HSPC의 반대-선택을 관찰하지 못하였는데, CD123 에피토프 편집과 상관없이 CD34+ 세포의 균일한 확장을 확인하였다(도 42I). 증식에 대한 최소 영향을 추가로 확인하고 수용체 편집 HSPC의 분화 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 FLT3, CD123, KIT 또는 AAVS1 유전자에 대해 염기 편집된 HSPC에 대해 세포 배양 및 콜로니-형성 단위(CFU) 분석을 수행하였고, 시험관내 확장 후 절대 세포수 및 비처리 대조군과 비슷한 골수 및 적혈구 콜로니의 수를 관찰하였다(도 41H). 암컷 NBSGW 면역결핍 마우스에 처리된 HSPC의 이종이식은 FLT3N399 HSPC의 보존된 생착, 재증식 및 다중계통 분화 능력을 나타냈고(도 41I, 도 41J), 이는 AAVS1 편집 대조군과 비슷하였다. FLT3 편집의 백분율은 투입 세포에서 측정된 것과 비슷하였고(BE 효율 대략 35%) 이식 후 13주에 안정하였고(도 41K), 이는 가장 원시적인 HSPC 서브세트의 성공적인 편집 및 FLT3N399 세포의 상대 선택 없음을 확인하였다. 2차 수용자에 골수(BM) 세포의 이식은 높은 인간 조혈 생착을 초래하였고, 2차 이식 후 최대 17주에 계통 분포의 차이는 없었으며(도 43A, 도 43B), FLT3 편집 수준은 1차 수용자에서 관찰된 것과 비슷하게 남아있었다(도 41K). 뮤린 Flt3l는 인간 FLT3과 교차 반응성이기 때문에, 이러한 결과는 에피토프 조작된 FLT3N399 변이체의 기능성을 추가로 확인한다. 유사하게, KITH378 편집 HSPC의 생체내 재증식 능력 및 다중계통 분화는 매칭된 AAVS1 BE 대조군과 비슷하였고(도 43C 내지 도 43E), 계통 분화의 왜곡이 없고 편집된 세포의 상대 선택이 없었으며, 염기 편집 절차가 처리 세포의 적합함 및 기능성에 영향을 미치지 않는다는 것을 추가로 입증한다.
전반적으로, 이러한 데이터는 에피토프 조작된 HSPC가 줄기세포 기능성 및 분화 능력에 영향을 미치는 일 없이 아데닌 염기 편집기에 의해 효율적으로 달성될 수 있다는 것을 나타냈다.
실시예 19: FLT3 BE HSPC는 4G8 CAR-T 생체내 처리에 저항성이 있다
FLT3N399 조혈작용이 결핍된 동안에 AML을 치료하기 위해 FLT3 CAR-T 세포가 효과적으로 사용될 수 있는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 NBSGW 마우스에 CD34+ HSPC(FLT3BE 또는 AAVS1 BE 중 하나) 및 인간 환자-유래 AML 이종이식편(PDX-1)을 순차적으로 생착시켰고, 이는 MLL-AF9 및 FLT3-ITD 돌연변이를 특징으로 하고 리포터 유전자 - mNeonGreen -를 이전에 형질도입하여, 혼합 조혈작용에서 이의 검출을 촉진시켰다(도 43F, 도 43G). PDX 시험감염으로부터 10일 후에, 마우스를 4G8 CAR-T 세포로 처리하였고, 실험 종료 시 조혈 기관(BM, 비장, SP; 도 44A)에 대해 연속 혈액 샘플에 대한 세포형광(cytofluorimetric) 분석에 의해 이들의 조혈 조성물을 모니터링하였다. 이전의 실험에서 관찰된 바와 같이, AML PDX 또는 CAR-T 세포 투여 전에, 이식 마우스는 편집 그룹 모두에서 유사한 말초 혈액 조성을 나타냈고(도 45A), 편집 수준은 투입 세포와 비슷하였고(대략 85%), 골수 및 림프구 계통에서 차이는 없었다(각각 FACS-분류 CD33+ 및 CD19+ 세포; 도 44B). 4G8 CAR-T로 처리한 마우스는 BM과 SP 둘 다에서 CAR-T 세포 생착 및 완전한 AML 근절을 나타냈고(도 44C 내지 도 44F), BM에서 FLT3N399 세포 분획의 작지만 유의미한 증가가 있었다(골수성 세포에서 88% 대 90% 및 림프구 세포에서 89% 대 94%; 도 44B). BM의 다중 매개변수 유세포분석은 4G8 CAR로 처리한 AAVS1 BE 그룹에서만 CD19+ B 세포(프레-B 및 프로-B 세포)의 상대 고갈을 나타낸 한편, FLT3N399 HPSC가 생착된 마우스는 보호되었다(도 44G 내지 도 44I). 분화된 골수성 세포(AML 세포를 제외한 CD33/66b+)에서, 미숙 과립구(CD14-10-11c-SSChigh)56의 비율은 FLT3N399 마우스와 비교할 때 AAVS1 BE가 감소되었다(도 44J). FLT3N399 BE는 계통-음성 전구 세포(lin-CD34+, 도 45B 내지 도 45D) 및 특히 과립-모노 전구체(GMP, lin-CD34+38+45RA+FLT3+, 도 44K, 도 44L) 및 림프구-프라이밍 다능성 전구세포s (LMPP, lin-CD34+38-45RA+90-10-, 도 44N, 도 44O)에 대해 선택적인 저항성을 부여하였고, 대신에 AAVS1 BE 그룹에서 거의 완전하게 제거되었다(각각 AAVS1 BE 대 FLT3N399에서 lin-CD34+38+내에서 1.4% 대 26.6% GMP 및 lin-CD34+38-내에서 4.8% 대 43.3% LMPP). 4G8 CAR에 의해 고갈되는 - 에피토프-조작에 의해 선택적으로 보호되는 - 조혈 서브세트를 더 정확하게 확인하기 위해, 본 발명자들은 처리 FLT3N399와 AAVS1 BE 그룹 간의 상이한 계통의 절대수를 비교하였다. 공통 골수 전구세포(CMP, lin-CD34+38+CD45RA-FLT3+), 수지상 세포(CD33+14-11c+FLT3+SSClow) 및 GMP의 절대수는 AAVS1 BE 조건에서 감소되었다(AAVS1 BE 대 FLT3N399에서 CMP 0.48x, GMP 0.01x, cDC 0.41x 배수 감소, 도 44M). 림프구 계통 및 전구세포 LMPP 내에서, 프레-B/NK(lin-CD34+38+10+) 및 하류의 서브세트(B-전림프구, 프로-B 및 프레-B)는 FLT3N399 대 AAVS1 BE 그룹에서 보호되었다(AAVS1 BE 대 FLT3N399에서 LMPP 0.02x, 프레-B/NK 0.19x, 프로-B 0.2x, 프레-B 0.18x 배수 변화, 도 44P). CAR-처리 조건에서 성숙 B 세포(FLT3-임)의 증가는 CAR-매개 크로스-노크(cross-talk)에 반응하여 확장을 반영할 가능성이 있다. 더 나아가, 4G8 CAR에 노출된 AAVS1 BE에서 지속적 프레-B/NK, B-전림프구, 프로-B 및 프레-B 세포, 단핵구 및 골수아세포(CD33/66b+14-11c-34-SSClow)의 FLT3 중앙값 형광 강도(MFI)는 FLT3N399 편집 그룹의 동일한 집단에서 측정한 것보다 더 낮았고(도 45E), FLT3N399 세포가 CAR-매개 사멸을 피하면서 FLT3 발현을 보유할 수 있다는 추가 증거를 제공하였다. 흥미롭게도, 실험의 종료 시 검출된 CAR-T 세포는 모든 그룹에서 유사한 표현형(주로 효과기 및 중심 기억)을 나타냈지만(도 45F), FLT3N399 조혈작용에 노출된 것은 AAVS1 BE 대조군에 비해 더 낮은 확장 및 PD-1 확장의 유의미한 감소를 나타냈고(도 45G), 이는 CAR-T가 에피토프-조작 조혈작용의 인식 결여로 인해 노출된 더 낮은 항원 부담에 의해 야기된 활성화 및/또는 고갈의 전반적 감소를 시사한다. 중요하게는, FLT3N399 에피토프 편집이 인간 PDX 생착의 존재와 상관없이 4G8 CAR 사멸에 대해 동일한 보호를 제공하였고, 조혈 재구성을 보존하면서 AML 세포를 선택적으로 제거할 가능성을 강조한다.
전반적으로, 이러한 데이터는 NBSGW 모델에서, FLT3 CAR-T 세포 면역요법이 B 세포 및 전구체 서브세트(GMP, LMPP)를 우선적으로 고갈시키는 한편, FLT3N399 에피토프 편집이 이러한 하위집단에 대한 보호를 부여한다는 것을 확인하였다.
실시예 20: CD123 BE HSPC는 CSL362 CAR-T 생체내 처리에 저항성이다
FLT3 에피토프 편집에 대해 행한 것과 같이, 본 발명자들은 NBSGW 마우스에 CD123S59 HSPC의 이종이식을 수행하였고, AAVS1 BE HSPC와 유사한 생착 및 다중계통 재증식 능력(도 46A 및 도 45H)과, 편집 세포의 높고 안정한 분획을 확인하였다(도 46B). 이어서, 이식된 마우스에 PDX-1 - 또한 CD123+를 발현시킴(도 43G)-를 주사하였고, 10일 후에 CSL362 CAR-T 세포로 처리하였다. 4G8 CAR-T 요법과 유사하게, CSL362 CAR-T 세포는 AML 세포를 거의 완전히 근절시켰고(도 46C, 도 46D), CD123S59와 비교할 때 AAVS1 BE HSPC를 생착시킨 마우스에서 더 높은 확장을 나타낸다(도 46E). 종점에서 BM의 유세포분석은 AAVS1 BE HSPC를 이식한 마우스에서 인간 조혈 세포의 절대수의 상당한 감소(AML 및 CAR T 세포의 제외 후 CD45+; 도 46F) 및 CD123S59 HSPC의 자손이 보호되는 동안 성숙 및 미숙 과립구를 포함하는 골수성 세포(CD33/66b+)의 상대 고갈을 강조하였다(도 46H 내지 도 46K). 4G8 CAR에 의해 관찰된 사멸 패턴과 다르게, 림프구 계통 내에서, 프로-B 세포의 백분율만이 CSL362 CAR-T 처리 AAVS1 BE 마우스에서 감소되는 경향을 나타냈다(도 46G). CD123high 형질세포양 DC를 포함하는 수지상 세포(DC)는 CSL362 CAR-T에 의한 처리에 의해 고갈된 한편, 이들은 CD123S59 BE 그룹에서 보존되었다(도 46L 내지 도 46N). FLT3 에피토프 편집과 유사하게, lin-CD34+ 전구세포는 CD123S59 그룹에서 상대적으로 보존되었다(도 46O 및 도 45F, 도 45G). CMP, GMP, 골수아세포, 과립구 및 DC 서브세트를 포함하는 골수 집단의 절대수는 AAVS1 BE에서 유의미하게 감소되었고, CD123S59 에피토프 편집에 의해 보호되었다. 림프구 세포 중에서, AAVS1 BE를 CD123S59와 비교할 때, 본 발명자들은 성숙 B 세포에 대한 B-전림프구의 부분적 고갈을 관찰하였다(도 46P, 도 46Q). FLT3에 대해 관찰한 바와 같이, 지속적 GMP, 골수아세포, 단핵구, cDC 및 pDC의 CD123 중앙값 형광 강도(MFI)는 CSL362 CAR로 처리한 AAVS1 BE 조건에 비해서 CD123S59 편집에서 더 높았지만, 본 발명자들은 림프구 서브세트에서 관련있는 차이를 관찰하지 못했다(도 47A).
전반적으로, 이러한 데이터는 CD123S59 에피토프 편집 조혈작용에 대해 CD123 CAR-T 세포에 의해 유도된 표적 독성의 감소를 나타냈고, 이는 다르게는 골수 계통, DC의 고갈 및 조혈 세포 절대수의 전반적 감소를 초래한다.
실시예 21: 다중복합 편집은 더 효과적인 AML 요법을 가능하게 한다
본 발명자들은 둘 이상의 에피토프의 편집이 조혈 독성 증가 없이 여러 AML 표적을 동시에 공격함으로써 훨씬 더 효과적인 면역요법을 가능하게 한다는 것을 추론하였다. 1차 HSPC에 대한 다중 에피토프-편집의 실현 가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 CD34+ 세포에 대해 2개의 gRNA와 SpRY-ABE8e mRNA를 공동 전기천공하였고, 세포 독성의 분명한 증가 없이, 단일 BE 후에 동일한 표적 상에서 측정된 것과 비슷한 편집 효율을 관찰하였다(도 48A 및 도 42D, 도 42F). 다중 CAR-T 요법으로부터의 보호 개념증명을 얻기 위해, 본 발명자들은 이중 리포터 K562 세포주에 대한 FLT3 및 CD123의 이중 편집을 수행하였고(55% 초과의 이중-편집된 세포를 달성, 도 48B), 분류된 단일 및 이중 편집 세포를 4G8과 CSL362 CAR 모두와 공동 형질도입에 의해 얻은 이중 특이성 CAR-T 세포로 처리하였다. 2일의 공동 배양 후에, 이중 에피토프 편집 세포만이 T 세포 활성화(CD69), 탈과립화(CD107a) 또는 증식(CellTrace 희석)을 유도하지 않았고, FLT3 및 CD123의 발현을 보존하면서 사멸로부터 완전한 보호를 나타냈다(도 48B, 도 48C).
이중-표적화 면역요법에 의해 부여되는 증가된 효능을 모델링하기 위해, 본 발명자들은 단독으로 또는 인간 FLT3N399 에피토프 편집 조혈작용과 조합하여 이종이식할 때(도 47B, 도 47C), 4G8 CAR-T 세포 처리에 의해 효과적으로 근절되지 않는 AML PDX(MLL-AF10 및 돌연변이된 TP53을 특징으로 하는 PDX-2, 도 43F, 도 43G)을 확인하였다. 4G8 CAR은 FLT3N399 생착 마우스에 투여할 때, PDX-2에 대해 더 높은 항-백혈병 효능의 경향을 나타냈는데(도 47C), 이는 치료적 성공에 대한 비종양 CAR 활성화의 해로운 역할을 시사한다. 다음에, 본 발명자들은 본 발명자이 선택한 항원 중 둘을 표적화하는 CAR-T 세포의 임의의 조합이 PDX-2 AML 세포의 더 효과적인 제거를 제공할 수 있는지의 여부를 시험하였고, Fab79-D와 CSL362 CAR-T 둘 다와 4G8 CAR-T의 조합이 가장 효과적이었다는 것을 발견하였는데(도 47D), 이는 2개의 필수 AML 항원이 동시에 표적화될 때 개선된 사멸과 일치된다. 이중 편집된 HSPC가 조합된 CAR-T 세포 요법에 저항성이라는 형식적 증거를 얻기 위해, 본 발명자들은 이중 FLT3N399/CD123S59 에피토프 편집 HSPC 또는 AAVS1 BE 대조군을 NBSGW 마우스에 이종이식하였다. 다중계통 생착의 확인(도 47E) 및 PDX-2 AML 세포의 주사 후에, 본 발명자들은 마우스를 4G8과 CSL362 CAR-T 세포(1:1 비 공동 주입, 도 48D) 모두로 처리하였다. 본 발명자들의 CAR-조합 실험에 의해 시사되는 바와 같이, 이중 CAR-T 요법은 BM 및 SP로부터의 AML 세포를 완전히 근절시킬 수 있었다(도 48E, 도 48F). FLT3과 CD123 편집 세포 둘 다 종점까지 지속되었고, 림프구 및 골수성 세포 내에서 동일하게 검출되었다(도 48G). 비악성 조혈작용을 분석함으로써, 본 발명자들은 거의 모든 다른 하위집단에 걸쳐 GMP, 과립구, cDC, LMPP, 프레-B/NK, 프로-B 및 프레-B 세포의 가장 강한 고갈 및 덜 확연하지만 상당한 감소와 함께 이중-CAR-T 세포로 처리한 AAVS1 BE 마우스에서 골수 및 림프구 조혈 계통의 광범위한 감소를 관찰하였고, 이는 본 발명자들이 4G8 및 CSL362 CAR 단독에 의해 관찰한 것 간의 혼합된 고갈 패턴을 시사한다(도 48H).
전체적으로, 이러한 데이터는 다중복합 에피토프 조작이 HSPC에서 효율적으로 얻어질 수 있고 중복되는 표적 상 비종양 조혈 독성을 감소시켜 강력한 다중 표적 면역요법을 가능하게 하는 개념증명을 제공한다.
기타 실시형태
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 앞서 언급한 설명은 예시하기 위한 의도이며 첨부되는 청구범위의 범주에 의해 정해지는 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니라는 것이 이해될 것이다. 다른 양상, 이점 및 변형은 다음의 청구범위의 범주 내이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (164)

  1. 유전자 조작된 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell: HSPC)로서, 유전자 조작된 FLT3 유전자를 포함하되, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자는 암호화된 단백질이 치료용 항-FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖도록 조작된, 유전자 조작된 조혈줄기세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자는 상기 FLT3 유전자의 엑손 9에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자의 엑손 9에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 N399에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, 유전자 조작된 HSPC.
  4. 제3항에 있어서, 위치 N399에서의 상기 돌연변이는 N399D 또는 N399G인, 유전자 조작된 HSPC.
  5. 제1항에 있어서, 상기 치료용 항-FLT3 항체는 항-FLT3 클론 4G8 항체인, 유전자 조작된 HSPC.
  6. 제1항에 있어서, 상기 치료용 항-FLT3 항체는 4G8 항체와 동일한 6개의 CDR을 갖거나, 4G8 항체와 경쟁하는 항체인, 유전자 조작된 HSPC.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유전자 조작된 HSPC는 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된, 유전자 조작된 HSPC.
  8. 제7항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9: SpCas9), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus: SaCas9), 라크노스피라세아 박테리움 Cas12a(Lachnospiraceae bacterium Cas12a: LbCas12a) 또는 아시다미노코커스 종 BV3L6(Acidaminococcus sp. BV3L6: AsCas12a) 중 하나인, 유전자 조작된 HSPC.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CRISPR 시스템은 SpCas9를 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 가이드 핵산은 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된, 유전자 조작된 HSPC.
  11. 제10항에 있어서, CRISPR 시스템은 주형 DNA를 더 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  12. 제11항에 있어서, 상기 주형 DNA는 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43으로 이루어진 군으로부터 선택된, 유전자 조작된 HSPC.
  13. 제7항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9인, 유전자 조작된 HSPC.
  14. 제13항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제인, 유전자 조작된 HSPC.
  15. 제14항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 데아미나제는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나인, 유전자 조작된 HSPC.
  16. 제13항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9인, 유전자 조작된 HSPC.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  18. 제17항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택된, 유전자 조작된 HSPC.
  20. 제1항에 있어서, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자는 서열번호 51 또는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 유전자 조작된 HSPC.
  21. 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단으로서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 HSPC를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단.
  22. 조혈 악성종양의 치료 방법으로서,
    (a) 제21항의 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단, 및
    (b) 항-FLT3 항체 결합 도메인 또는 상기 항-FLT3 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제
    를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 적어도 1종의 제제는 항-FLT3 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL)인, 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 상기 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 상기 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포인, 방법.
  27. 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)로서, 유전자 조작된 CD123 유전자를 포함하되, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자는 암호화된 단백질이 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖도록 조작된, 유전자 조작된 조혈줄기세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 치료용 항-CD123 항체는 클론 7G3 항체 또는 이의 인간화된 상대 CSL362인, 유전자 조작된 HSPC.
  29. 제28항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자는 상기 CD123 유전자의 엑손 2에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  30. 제29항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 2에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 S59에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, 유전자 조작된 HSPC.
  31. 제30항에 있어서, S59에서의 상기 돌연변이는 S59P 또는 S59F인, 유전자 조작된 HSPC.
  32. 제27항에 있어서, 상기 치료용 항-CD123 항체는 항-CD123 클론 6H6 항체 또는 항-CD123 클론 S18016F 항체인, 유전자 조작된 HSPC.
  33. 제32항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자는 상기 CD123 유전자의 엑손 3에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  34. 제32항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 3에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 P88에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, 유전자 조작된 HSPC.
  35. 제34항에 있어서, P88에서의 상기 돌연변이는 P88L 또는 P88S인, 유전자 조작된 HSPC.
  36. 제31항에 있어서, 상기 유전자 조작된 HSPC는 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된, 유전자 조작된 HSPC.
  37. 제36항에 있어서, 상기 가이드 핵산은 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택된, 유전자 조작된 HSPC.
  38. 제35항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9인, 유전자 조작된 HSPC.
  39. 제38항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제인, 유전자 조작된 HSPC.
  40. 제38항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나인, 유전자 조작된 HSPC.
  41. 제38항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9인, 유전자 조작된 HSPC.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  43. 제42항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  44. 제27항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자는 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57 또는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 유전자 조작된 HSPC.
  45. 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단으로서, 제27항 내지 제44항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 HSPC를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단.
  46. 조혈 악성종양의 치료 방법으로서,
    (a) 제45항의 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단, 및
    (b) 항-CD123 항체 결합 도메인 또는 상기 항-CD123 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제
    를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 적어도 1종의 제제는 항-CD123 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함하는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN)인, 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 상기 인간 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플로부터의 상기 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포인, 방법.
  51. 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단으로서,
    (i) 유전자 조작된 FLT3 유전자로서, 치료용 항-FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자, 및
    (ii) 유전자 조작된 CD123 유전자로서, 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자
    를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단.
  52. 제51항에 있어서, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자는 상기 FLT3 유전자의 엑손 9에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  53. 제52항에 있어서, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자의 엑손 9에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 N399에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, HSPC의 집단.
  54. 제51항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자는 상기 CD123 유전자의 엑손 2에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  55. 제54항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 2에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 S59에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, HSPC의 집단.
  56. 제51항에 있어서, 상기 치료용 항-FLT3 항체는 항-FLT3 클론 4G8 항체인, HSPC의 집단.
  57. 제51항에 있어서, 상기 치료용 항-CD123 항체는 항-CD123 클론 7G3 항체 또는 CSL362 항체인, HSPC의 집단.
  58. 제51항에 있어서, 상기 HSPC의 집단은 적어도 2개의 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된, HSPC의 집단.
  59. 제58항에 있어서, 상기 적어도 2개의 가이드 핵산은 1) 서열번호 18 또는 서열번호 20 및 2) 서열번호 서열번호 24 또는 서열번호 27인, HSPC의 집단.
  60. 제59항에 있어서, 상기 적어도 2개의 가이드 핵산은 서열번호 20 및 서열번호 27인, HSPC의 집단.
  61. 제58항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9인, HSPC의 집단.
  62. 제61항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제인, HSPC의 집단.
  63. 제61항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나인, HSPC의 집단.
  64. 제61항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9인, HSPC의 집단.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  66. 제65항에 있어서, 상기 SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함하는, HSPC의 집단.
  67. 조혈 악성종양의 치료 방법으로서,
    (a) 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항의 HSPC의 집단, 및
    (b) (1) 항-FLT3 항체 결합 도메인 또는 상기 항-FLT3 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 및/또는 (2) 항-CD123 항체 결합 도메인 또는 상기 항-CD123 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제
    를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 적어도 1종의 제제는 상기 항-FLT3 항체 결합 도메인 및/또는 상기 항-CD123 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함하는, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN)인, 방법.
  70. 제67항에 있어서, 상기 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 상기 인간 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플로부터의 상기 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포인, 방법.
  72. 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)로서, 유전자 조작된 KIT 유전자를 포함하되, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자는 암호화된 단백질이 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖도록 조작된, 유전자 조작된 조혈줄기세포.
  73. 제72항에 있어서, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자는 상기 KIT 유전자의 엑손 7에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  74. 제73항에 있어서, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자의 엑손 7에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 H378에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, 유전자 조작된 HSPC.
  75. 제74항에 있어서, 위치 H378에서의 상기 돌연변이는 H378R인, 유전자 조작된 HSPC.
  76. 제72항에 있어서, 상기 치료용 항-KIT 항체는 항-KIT 클론 Fab79D 항체인, 유전자 조작된 HSPC.
  77. 제72항에 있어서, 상기 유전자 조작된 HSPC는 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된, 유전자 조작된 HSPC.
  78. 제72항에 있어서, 상기 가이드 핵산은 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택된, 유전자 조작된 HSPC.
  79. 제77항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9인, 유전자 조작된 HSPC.
  80. 제79항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제인, 유전자 조작된 HSPC.
  81. 제79항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나인, 유전자 조작된 HSPC.
  82. 제79항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9인, 유전자 조작된 HSPC.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  84. 제83항에 있어서, 상기 SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함하는, 유전자 조작된 HSPC.
  85. 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단으로서, 제72항 내지 제84항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 HSPC를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단.
  86. 조혈 악성종양의 치료 방법으로서,
    (a) 제85항의 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단, 및
    (b) 항-KIT 항체 결합 도메인 또는 상기 항-KIT 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제
    를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 적어도 1종의 제제는 항-KIT 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함하는, 방법.
  88. 제86항에 있어서, 상기 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL)인, 방법.
  89. 제86항에 있어서, 상기 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 상기 인간 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플로부터의 상기 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포인, 방법.
  91. 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단으로서,
    (i) 유전자 조작된 KIT 유전자로서, 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자, 및
    (ii) 유전자 조작된 CD123 유전자로서, 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자
    를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단.
  92. 제91항에 있어서, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자는 상기 KIT 유전자의 엑손 7에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  93. 제92항에 있어서, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자의 엑손 7에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 H378에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, HSPC의 집단.
  94. 제91항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자는 상기 CD123 유전자의 엑손 2에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  95. 제94항에 있어서, 상기 유전자 조작된 CD123 유전자의 엑손 2에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 S59에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, HSPC의 집단.
  96. 제91항에 있어서, 상기 치료용 항-KIT 항체는 항-KIT 클론 Fab79D 항체인, HSPC의 집단.
  97. 제91항에 있어서, 상기 치료용 항-CD123 항체는 항-CD123 클론 7G3 항체 또는 CSL362 항체인, HSPC의 집단.
  98. 제91항에 있어서, 상기 HSPC의 집단은 적어도 2개의 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된, HSPC의 집단.
  99. 제98항에 있어서, 상기 적어도 2개의 가이드 핵산은 1) 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38 또는 서열번호 39 및 2) 서열번호 24 또는 서열번호 27인, HSPC의 집단.
  100. 제99항에 있어서, 상기 적어도 2개의 가이드 핵산은 서열번호 37 및 서열번호 27인, HSPC의 집단.
  101. 제98항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9인, HSPC의 집단.
  102. 제101항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제인, HSPC의 집단.
  103. 제101항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나인, HSPC의 집단.
  104. 제101항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9인, HSPC의 집단.
  105. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  106. 제105항에 있어서, 상기 SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함하는, HSPC의 집단.
  107. 조혈 악성종양의 치료 방법으로서,
    (a) 제91항 내지 제106항 중 어느 한 항의 HSPC의 집단, 및
    (b) (1) 항-KIT 항체 결합 도메인 또는 상기 항-KIT 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 및/또는 (2) 항-CD123 항체 결합 도메인 또는 상기 항-CD123 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제
    를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 적어도 1종의 제제는 상기 항-KIT 항체 결합 도메인 및/또는 상기 항-CD123 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함하는, 방법.
  109. 제107항에 있어서, 상기 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN)인, 방법.
  110. 제107항에 있어서, 상기 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 상기 인간 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플로부터의 상기 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포인, 방법.
  112. 유전자 조작된 조혈줄기세포(HSPC)의 집단으로서,
    (i) 유전자 조작된 FLT3 유전자로서, 치료용 항-FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자, 및
    (ii) 유전자 조작된 KIT 유전자로서, 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자
    를 포함하는, 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단.
  113. 제112항에 있어서, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자는 상기 FLT3 유전자의 엑손 9에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  114. 제113항에 있어서, 상기 유전자 조작된 FLT3 유전자의 엑손 9에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 N399에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, HSPC의 집단.
  115. 제112항에 있어서, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자는 상기 KIT 유전자의 엑손 7에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  116. 제115항에 있어서, 상기 유전자 조작된 KIT 유전자의 엑손 7에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 H378에 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드를 생성하는, HSPC의 집단.
  117. 제112항에 있어서, 상기 치료용 항-FLT3 항체는 항-FLT3 클론 4G8 항체인, HSPC의 집단.
  118. 제112항에 있어서, 상기 치료용 항-KIT 항체는 항-KIT 클론 Fab79D 항체인, HSPC의 집단.
  119. 제112항에 있어서, 상기 HSPC의 집단은 적어도 2개의 가이드 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 유전자 조작된, HSPC의 집단.
  120. 제119항에 있어서, 적어도 2개의 가이드 핵산은 1) 서열번호 18 또는 서열번호 20 및 2) 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38 또는 서열번호 39인, HSPC의 집단.
  121. 제120항에 있어서, 상기 적어도 2개의 가이드 핵산은 서열번호 20 및 서열번호 37인, HSPC의 집단.
  122. 제119항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 염기 편집기 효소에 연결된 촉매적으로 손상된 SpCas9인, HSPC의 집단.
  123. 제122항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 뉴클레오타이드 데아미나제인, HSPC의 집단.
  124. 제122항에 있어서, 상기 염기 편집기 효소는 사이토신 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 중 하나인, HSPC의 집단.
  125. 제122항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 NG-SpCas9 또는 SpRY-SpCas9인, HSPC의 집단.
  126. 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매적으로 손상된 SpCas9는 위치 D10A에 돌연변이를 포함하는, HSPC의 집단.
  127. 제126항에 있어서, 상기 SpCas9는 위치 K918N에 돌연변이를 더 포함하는, HSPC의 집단.
  128. 조혈 악성종양의 치료 방법으로서,
    (a) 제112항 내지 제127항 중 어느 한 항의 HSPC의 집단, 및
    (b) (1) 항-FLT3 항체 결합 도메인 또는 상기 항-FLT3 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 및/또는 (2) 항-KIT 항체 결합 도메인 또는 상기 항-KIT 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 치료적 유효량의 적어도 1종의 제제
    를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 적어도 1종의 제제는 상기 항-FLT3 항체 결합 도메인 및/또는 상기 항-KIT 항체 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체-T(CAR-T) 세포를 포함하는, 방법.
  130. 제128항에 있어서, 상기 조혈 악성종양은 B-림프모구성 백혈병(BLL), 급성 골수성 백혈병(AML), T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 또는 모구 형질세포양 수지상 세포 백혈병(BPCDN)인, 방법.
  131. 제128항에 있어서, 상기 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 HSPC를 얻는 단계 및 상기 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터의 HSPC를 유전자 조작하여, 유전자 조작된 HSPC의 집단을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  132. 제131항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수 세포, 혈액, 제대혈 세포 또는 동원된 말초 혈액-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포인, 방법.
  133. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (a) 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 에피토프 결합 단편,
    (b) 힌지 도메인,
    (c) 막관통 도메인,
    (d) 공자극 도메인 및
    (e) 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3, CD123 및/또는 KIT로부터 선택되는, 키메라 항원 수용체.
  134. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3이고, 상기 CAR은 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  135. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3이고, 상기 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 서열번호 73으로부터의 하나 이상의 에피토프 결합 단편을 포함하는, CAR.
  136. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3이고, 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열: GYTFTSYWMH(서열번호 96), EIDPSDSYKDYNQKFK(서열번호 97), RAITTTPFDF(서열번호 98), RASQSISNNLH(서열번호 99), YASQSIS(서열번호 100) 및 QQSNTWPYT(서열번호 101)를 포함하는, CAR.
  137. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 상기 CAR은 서열번호 75, 서열번호 86 또는 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  138. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 상기 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 서열번호 75, 서열번호 86, 또는 서열번호 87로부터의 하나 이상의 에피토프 결합 단편을 포함하는, CAR.
  139. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 상기 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열: GYSFTDYYMK(서열번호 104), DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), ARSHLLRASWFAY(서열번호 106), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109)를 포함하는, CAR.
  140. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 CD123이고, 상기 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열: DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109)를 포함하는, CAR.
  141. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 KIT이고, 상기 CAR은 서열번호 69 또는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  142. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 KIT이고, 상기 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 서열번호 69 또는 서열번호 71로부터의 하나 이상의 에피토프 결합 단편을 포함하는, CAR.
  143. 제133항에 있어서, 상기 세포-표면 계통-특이적 단백질은 KIT이고, 상기 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열: GFNISVYMMH(서열번호 88), SIYPYSGYTYYADSVKG(서열번호 89), ARYVYHALDY(서열번호 90), RASQRGLRNVAVA(서열번호 91), SASSLYS(서열번호 92) 및 QQWAVHSLIT(서열번호 93)를 포함하는, CAR.
  144. 제133항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3 및 CD123이고, 상기 CAR은 서열번호 77 또는 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  145. 제133항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3 및 CD123이고, 상기 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 서열번호 77 또는 서열번호 79로부터의 하나 이상의 에피토프 결합 단편을 포함하는, CAR.
  146. 제133항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포-표면 계통-특이적 단백질은 FLT3 및 CD123이고, 상기 하나 이상의 에피토프 결합 단편은 다음의 CDR 서열: GYTFTSYWMH(서열번호 96), EIDPSDSYKDYNQKFK(서열번호 97), RAITTTPFDF(서열번호 98), RASQSISNNLH(서열번호 99), YASQSIS(서열번호 100), QQSNTWPYT(서열번호 101), GYSFTDYYMK(서열번호 104), DIIPSNGATFYNQKFKG(서열번호 105), ARSHLLRASWFAY(서열번호 106), SQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 107), WASTRES(서열번호 108) 및 QNDYSYPYT(서열번호 109)를 포함하는, CAR.
  147. 제133항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 도메인은 CD28 힌지, IgG4 힌지 또는 CD8α 힌지인, CAR.
  148. 제133항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28 TM, CD8α TM 또는 4-1BB TM인, CAR.
  149. 제133항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 CD28z, 4-1BB, ICOS 또는 OX40인, CAR.
  150. 제133항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포질 신호전달 도메인은 CD3z인, CAR.
  151. 제133항 내지 제150항 중 어느 한 항의 CAR을 발현시키는 세포.
  152. 제151항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포인, 세포.
  153. 제152항에 있어서, 상기 면역 세포는 T-세포인, 세포.
  154. 조혈 악성종양의 치료 방법으로서,
    (a) 유전자 조작된 조혈줄기세포의 집단, 및
    (b) 제151항 내지 제153항 중 어느 한 항의 세포
    를 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  155. 서열번호 51에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 N399D에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항- FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  156. 서열번호 52에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 N399G에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항- FLT3 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  157. 서열번호 54에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 S59P에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  158. 서열번호 55에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 Y58H 및 S59P에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  159. 서열번호 56에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 S59F에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  160. 서열번호 57에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 P88S에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  161. 서열번호 58에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 P88L에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-CD123 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  162. 서열번호 67에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 F316S, M318V, I319K, V323I, I334V, E360K, P363V, E366D, E376Q 및 H378R에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  163. 서열번호 68에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열로서, 상기 폴리펩타이드 서열은 H378R에 돌연변이를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 서열은 치료용 항-KIT 항체에 대해 감소된 결합을 갖는, 폴리펩타이드 서열.
  164. 제155항 내지 제163항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는, 핵산.
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