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KR20210129048A - 계통 특이적 항원의 저해를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

계통 특이적 항원의 저해를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20210129048A
KR20210129048A KR1020217025362A KR20217025362A KR20210129048A KR 20210129048 A KR20210129048 A KR 20210129048A KR 1020217025362 A KR1020217025362 A KR 1020217025362A KR 20217025362 A KR20217025362 A KR 20217025362A KR 20210129048 A KR20210129048 A KR 20210129048A
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KR
South Korea
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cell
cells
grna
hematopoietic stem
genetically engineered
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020217025362A
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English (en)
Inventor
시드하르타 무케르지
플로렌스 보로트
압둘라 마흐무드 알리
Original Assignee
더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 filed Critical 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
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Abstract

본 명세서에는 혈액 악성종양의 면역요법을 위해서 계통-특이적 세포-표면 항원, 예를 들어, CD33을 표적으로 하는 작용제 및 계통-특이적 세포-표면 항원, 예를 들어, CD33이 결핍된 조혈 세포의 집단을 투여하는 방법이 개시된다. CD33을 표적으로 하는 gRNA와 같이, CD33에 돌연변이를 포함하는 세포가 또한 제공된다.

Description

계통 특이적 항원의 저해를 위한 조성물 및 방법
본 출원은 미국 가출원 제62/793,210호(출원일: 2019년 1월 16일) 및 미국 가출원 제62/852,573호(출원일: 2019년 5월 24일)에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷의 전자적으로 제출되고, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 서열 목록을 포함한다. 2020년 1월 16일에 작성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 01001-004965-WO1_SL.txt이고, 크기가 83 킬로바이트이다.
수 십 년간의 시도에도 불구하고, 암에 대한 치유적 면역학적 요법은 항체에 의한 또는 T 세포를 통한(T 세포 수용체를 통한) 항원-인식 능력을 근본적인 기초로 하여 달성하기가 매우 어려웠다(Cousin-Frankel, Science (2013) 342:1432). 항체-기반 면역요법은, 표적 항원이 정상 세포에 비해 종양 세포에서 상향조절되는 경우(예를 들어, Her-2 증폭 유방암에서의 Her-2) 또는 종양 세포가 항체 또는 항체-독소 접합체에 의해 인식될 수 있는 항원을 발현하는 경우(예를 들어, CD20에 대한 리툭시맙)에 암에 대해서 광범위하게 사용되어 왔다(예를 들어, 문헌[Baselga et al., Annals Oncology (2001) 12:S35]). 항체-기반 면역요법을 사용한 임상 시험은 제한된 수의 암 유형(일반적으로 표준 화학요법과 결합과 병용되는 경우)에서 환자 생존이 개선된 것으로 나타났지만, 이러한 효과는 종종 상당한 안전성 및 효능 문제를 동반한다(Cousin-Frankel Cancer, Science (2013) 342:1432).
암에 대한 효과적인 T 세포 요법은 임상적으로 달성하기가 훨씬 더 어려웠다(Schmitt et al., Hum. Gene Ther. (2009) 20(11):1240). 암에 대한 효과적인 T 세포 요법은 암세포 상의 항원에 대해 지향되는 높은 친화도 결합을 갖는 T 세포에 의존한다. 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T 세포)는 높은 친화도 및 특이성 둘 다를 갖고, 펩타이드를 "제시"하기 위한 HLA 항원과 같은 보조 인식 분자에 대한 요건이 없이 세포 상의 항원을 인식하는 데 널리 사용된다. CAR T 세포의 T 세포 수용체는 항원-결합 중쇄 및 경쇄로 "교환"되어, HLA 보조 분자가 필요하지 않다. 재조합 CAR T 수용체는 CAR T 수용체가 표적 항원에 결합할 때 T 세포의 활성화로 이어지는 신호전달 도메인에 융합된다.
CAR T 세포의 임상적 사용은 좁은 범위의 세포-표면 항원을 표적으로 하는 것으로 제한되어 있는데, 이는 암 치료에서 개선되고 신규한 접근법의 필요성을 더욱 뒷받침한다. 특히, 현재의 치료 표준인 집중 화학요법을 제공받을 수 없는 고령 환자의 결과가 매우 열악하고, 중위 생존이 5 내지 10개월에 불과한 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia: AML)과 같은 질환에 대한 새로운 접근법이 필요하다(Dohner et al., NEJM (2015) 373:1136).
종양 세포 상의 특정 부류의 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는 암 면역요법에 대한 신규 접근법이 본 명세서에 기재되어 있다. 이어서, CAR T 세포 치료는 계통-특이적 세포-표면 항원이 결핍된 변형된 세포 집단의 주입 또는 재주입에 의한 비-종양 세포의 대체와 조합된다. 종양의 재발은 CAR T 세포를 사용하여 생체내에서 환자의 감시를 유지함으로써 예방 또는 감소된다.
본 개시내용은 계통-특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제(예를 들어, CD33을 표적으로 하는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포)가 계통-특이적 세포-표면 항원을 발현하는 세포의 세포 사멸을 선택적으로 유발하는 반면, 이 항원이 결핍된 세포(예를 들어, 유전자 조작된 조혈 세포)는 이에 의해 유발되는 세포 사멸을 회피한다는 발견을 적어도 기초로 한다. 이러한 발견에 기초하여, 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는 작용제, 예를 들어, CD33을 표적으로 하는 CAR-T 세포와, 계통-특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)이 결핍된 조혈 세포의 조합물을 포함하는 면역요법이 조혈 악성종양에 대한 효과적인 치료 방법을 제공할 것이라고 예측되었다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하는 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 제공하며, 여기서 유전자 돌연변이는 본 명세서에 기재된 부위에 존재한다. 본 개시내용의 일 양상은 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하는 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포를 제공하며, 여기서 유전자 돌연변이는 AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67), GGCCGGGUUCUAGAGUGCCA(서열번호 68) 또는 CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 gRNA에 의해서 표적화되는 부위에 존재하고, 여기서 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포는 야생형 대응물과 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포는 야생형 대응물에 의해서 발현되는 CD33의 10% 미만을 발현한다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포는 CD33을 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포는 대상체(예를 들어, 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자 또는 건강한 공여자)의 골수 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래된다.
본 개시내용은, 일부 실시형태에서, 또한 본 명세서에 기재된 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포를 제공하는 단계, 및 (ii) 세포에 (a) 서열번호 67, 서열번호 68 및/또는 서열번호 70과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA); 및 (b) Cas9 엔도뉴클레아제를 도입하여, CD33의 감소된 발현 수준을 갖는 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 세포에 도입되는 하나의 벡터 상에 암호화되어 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, gRNA 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 사전 형성된 리보핵단백질 복합체로서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 리보핵단백질 복합체는 전기천공을 통해서 세포에 도입된다.
본 개시내용은 또한 일부 양상에서, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 조혈 세포 줄기세포 또는 전구세포의 샘플에서 CD33의 발현을 감소시키기 위한, 본 명세서에 기재된 gRNA의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 일부 양상에서, 조혈 세포 줄기세포 또는 전구세포의 샘플에서 CD33의 발현을 감소시키기 위한 CRISPR/Cas9 시스템의 용도를 제공하며, 여기서 CRISPR/Cas9 시스템의 gRNA는 본 명세서에 기재된 gRNA이다.
일부 실시형태에서 gRNA는 단일-분자 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 변형된 sgRNA이다. 일부 실시형태에서, 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포는 대상체의 골수 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 조혈 장애를 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 건강한 HLA-매칭된 공여자이다.
본 개시내용은, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 생산된, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 조혈 장애의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포 또는 세포 집단을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조혈 장애는 조혈 악성종양이다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체에게 유효량의 CD33을 표적으로 하는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD33을 표적으로 하는 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역세포이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 조혈 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 본 명세서에 기재된 세포 집단을 제공하며, 여기서 치료는 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 대상체에게 유효량의 CD33을 표적으로 하는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 CD33을 표적으로 하는 작용제를 제공하며, 여기서 작용제는 조혈 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 치료는 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 CD33을 표적으로 하는 작용제를 투여하는 단계를 포함하고, 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 본 명세서에 기재된 세포 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
조혈 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 본 명세서에 기재된 세포 집단과, CD33을 표적으로 하는 작용제의 조합물(여기서 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함함)이 제공되며, 여기서 치료는 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단 및 CD33에 결합하는 작용제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단은 CD33을 표적으로 하는 작용제와 동반하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단은 CD33을 표적으로 하는 작용제 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, CD33을 표적으로 하는 작용제는 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단 이전에 투여된다.
일부 실시형태에서, 면역세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역세포, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포 또는 둘 다는 동종이계(allogeneic)이다. 일부 실시형태에서, 면역세포, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포 또는 둘 다는 자가(autologous)이다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체 내의 항원-결합 단편은 인간 CD33에 특이적으로 결합하는 단일-쇄 항체 단편(scFv)이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종을 갖는 인간 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 또는 만성 림프모구성 백혈병인 백혈병을 갖는 인간 환자이다.
본 개시내용은, 또 다른 양상에서, 서열번호 67, 서열번호 68 또는 서열번호 70과 적어도 90% 동일한 스페이서 서열을 포함하는 가이드 리보핵산(gRNA)을 제공한다. 일부 실시형태에서 gRNA는 단일-분자 gRNA(sgRNA)이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 변형된다. 구체적인 실시형태에서, 스페이서 서열은 서열번호 67, 서열번호 68 또는 서열번호 70이다.
본 명세서에서 조성물 및 방법은 또한 하기 번호 매긴 실시형태에 기재되어 있다.
1. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 하기로부터 선택된 서열을 갖는 부위에 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포:
ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50),
ATCCCTGGCACTCTAGAACCCGG(서열번호 49),
GGCCGGGTTCTAGAGTGCCA(서열번호 51),
GGCCGGGTTCTAGAGTGCCAGGG(서열번호 29),
CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58); 또는
CCTCACTAGACTTGACCCACAGG(서열번호 48).
2. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50)의 서열을 갖는 부위에 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
3. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50)의 서열을 갖는 부위에 존재하고, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포와 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
4. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50)의 서열을 갖는 부위에 존재하고, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포에서의 CD33의 수준의 20% 미만인 CD33의 감소된 발현 수준을 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
5. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 ATCCCTGGCACTCTAGAACCCGG(서열번호 49)의 서열을 갖는 부위에 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
6. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
7. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에 존재하고, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포와 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
8. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에 존재하고, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포에서의 CD33의 수준의 20% 미만인 CD33의 감소된 발현 수준을 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
9. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 CCTCACTAGACTTGACCCACAGG(서열번호 48)의 서열을 갖는 부위에 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
10. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 상기 유전자 돌연변이는 AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67) 또는 CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 gRNA에 의해서 표적화되는 부위에 존재하고, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포는 야생형 대응물과 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 갖는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
11. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 상기 유전자 돌연변이는 CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 gRNA에 의해서 표적화되는 부위에 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
12. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 상기 유전자 돌연변이는 AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 gRNA에 의해서 표적화되는 부위에 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
13. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 임의의 예측된 표적외 부위, 예를 들어, 도 30에 열거된 임의의 부위에, 예를 들어, 서열번호 99 내지 112 중 임의의 것에 돌연변이를 포함하지 않는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
14. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 도 29에 열거된 임의의 예측된 표적외 부위에, 예를 들어, 서열번호 79 내지 98 중 임의의 것에 돌연변이를 포함하지 않는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
15. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전자 돌연변이는 치환(예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 변이체), 삽입 또는 결실 또는 이들의 조합물인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
16. 실시형태 15에 있어서, 결실은 서열번호 50, 서열번호 51 또는 서열번호 58 내에 완전히 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
17. 실시형태 15 또는 16에 있어서, 결실은 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16 또는 17개 뉴클레오타이드 길이인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
18. 실시형태 15에 있어서, 결실은 서열번호 50, 서열번호 51 또는 서열번호 58의 외부로 연장된, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
19. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전자 돌연변이는 프레임시프트(frameshift)를 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
20. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포와 비교할 때 야생형 CD33의 감소된 발현 수준(예를 들어, 야생형 대응물 세포에서의 수준의 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만)을 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
21. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포는 야생형 대응물 세포와 비교할 때 야생형 CD33의 감소된 발현 수준(예를 들어, 야생형 대응물 세포에서의 수준의 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만)을 갖는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
22. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포와 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준(예를 들어, 야생형 대응물 세포에서의 수준의 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만)을 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
23. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포는 야생형 대응물 세포와 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준(예를 들어, 야생형 대응물 세포에서의 수준의 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만)을 갖는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
24. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전자 돌연변이는 CD33의 결여를 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
25. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 야생형 대응물에 의해서 발현되는 CD33의 20% 미만을 발현하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
26. 상기 실시형태 중 어느 하나에 있어서, CD33의 감소된 발현 수준은 조혈 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된(예를 들어, 말단 분화된) 세포에서의 수준이고, 야생형 대응물 세포는 야생형 조혈 줄기세포 또는 전구세포 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된(예를 들어, 말단 분화된) 세포인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
27. 실시형태 26에 있어서, 조혈 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된 세포는 골수모세포, 단모세포, 단핵구, 대식세포 또는 자연 살해 세포인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
28. 상기 실시형태에 있어서, CD33을 발현하지 않는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
29. 상기 실시형태에 있어서, CD34+인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
30. 상기 실시형태에 있어서, 대상체의 골수 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래되는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
31. 실시형태 30에 있어서, 대상체는 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
32. 실시형태 30에 있어서, 대상체는 건강한 인간 공여자(예를 들어, HLA-매칭된 공여자)인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
33. 상기 실시형태에 있어서, (예를 들어, 세포를 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 핵산과 접촉시킴으로써) 내인성 CD33 유전자를 CRISPR 엔도뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기-기반 뉴클레아제(TALEN) 또는 메가뉴클레아제로부터 선택된 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해서 제조된, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
34. 상기 실시형태 중 어느 하나의 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는(예를 들어, 조혈 줄기세포, 조혈 전구세포 또는 이들의 조합물을 포함하는), 세포 집단.
35. 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 세포 집단으로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50)의 서열을 갖는 부위에 존재하는, 세포 집단.
36. 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 세포 집단으로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50)의 서열을 갖는 부위에 존재하고, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포 집단과 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 초래하는, 세포 집단.
37. 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 세포 집단으로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50)의 서열을 갖는 부위에 존재하고, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포 집단에서의 CD33의 수준의 20% 미만인 CD33의 감소된 발현 수준을 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
38. 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 세포 집단으로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에 존재하는, 세포 집단.
39. 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 세포 집단으로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에 존재하고, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포 집단과 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 초래하는, 세포 집단.
40. 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 세포 집단으로서, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 유전자 돌연변이는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에 존재하고, 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포 집단에서의 CD33의 수준의 20% 미만인 CD33의 감소된 발현 수준을 초래하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
41. 실시형태 34 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 비-조작된 CD33 유전자를 포함하는 하나 이상의 세포를 더 포함하는, 세포 집단.
42. 실시형태 34 내지 41 중 어느 하나에 있어서, CD33에 대해서 동형접합성 야생형인 하나 이상의 세포를 더 포함하는, 세포 집단.
43. 실시형태 34 내지 42 중 어느 하나에 있어서, CD33에 대해서 이형접합성 야생형인 하나 이상의 세포를 더 포함하는, 세포 집단.
44. 실시형태 34 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 집단의 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%는 CD33의 2개의 카피에 유전자 돌연변이를 포함하는, 세포 집단.
45. 실시형태 34 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 야생형 대응물 세포 집단에 의해서 발현되는 CD33의 20% 미만을 발현하는, 세포 집단.
46. 실시형태 34 내지 45 중 어느 하나에 있어서, CD33의 감소된 발현 수준은 조혈 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된(예를 들어, 말단 분화된) 세포에서의 수준이고, 야생형 대응물 세포는 야생형 조혈 줄기세포 또는 전구세포 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된(예를 들어, 말단 분화된) 세포인, 세포 집단.
47. 실시형태 46에 있어서, 조혈 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화된 세포는 골수모세포, 단모세포, 단핵구, 대식세포 또는 자연 살해 세포인, 세포 집단.
48. 실시형태 34 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 조혈 줄기세포 및 조혈 전구세포를 포함하는, 세포 집단.
49. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
50. 실시형태 34 내지 48 중 어느 하나의 세포 집단을 포함하는, 약제학적 조성물.
51. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 실시형태 34 내지 48 중 어느 하나의 세포 집단의 제조 방법으로서,
(i) 조혈 줄기세포 또는 전구세포(예를 들어, 야생형 조혈 줄기세포 또는 전구세포)를 제공하는 단계, 및
(ii) 세포에 부위를 절단하는 뉴클레아제(예를 들어, 엔도뉴클레아제)를 도입하여,
유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
52. 실시형태 51에 있어서, (ii)는 세포에 부위에 결합하는 gRNA 및 gRNA에 결합하는 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
53. 실시형태 51에 있어서, 엔도뉴클레아제는 ZFN, TALEN 또는 메가뉴클레아제인, 방법.
54. 하기 중 어느 하나의 서열 또는 이의 역방향 상보체(reverse complement thereof) 또는 하기 중 어느 하나와 적어도 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열 또는 하기 중 어느 하나에 비해서 1, 2 또는 3개 이하의 돌연변이를 갖는 서열을 포함하는, 가이드 리보핵산(gRNA):
AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67),
GGCCGGGUUCUAGAGUGCCA(서열번호 68), 또는
CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70),
55. 서열번호 70과 적어도 90% 동일한 스페이서 서열을 포함하는, 가이드 리보핵산(gRNA).
56. 실시형태 55에 있어서, 스페이서 서열은 서열번호 70을 포함하는, gRNA.
57. 서열번호 67과 적어도 90% 동일한 스페이서 서열을 포함하는, 가이드 리보핵산(gRNA).
58. 실시형태 57에 있어서, 스페이서 서열은 서열번호 67을 포함하는, gRNA.
59. 하기 중 어느 하나의 서열로부터의 적어도 18(예를 들어, 19, 20, 21 또는 22)개의 순차적인 뉴클레오타이드 또는 이의 역방향 상보체 또는 하기 중 어느 하나와 적어도 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열 또는 하기 중 어느 하나에 비해서 1, 2 또는 3개 이하의 돌연변이를 갖는 서열을 포함하는, 가이드 리보핵산(gRNA):
CCUCAUCCCUGGCACUCUAGAACCCGGC(서열번호 71),
GAGUGGCCGGGUUCUAGAGUGCCAGGGA(서열번호 72), 또는
UUCUCCUCACUAGACUUGACCCACAGGC(서열번호 73)
60. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19, 20, 21 또는 22개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 1번 위치에서 시작하는, gRNA.
61. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19, 20, 21 또는 22개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 2번 위치에서 시작하는, gRNA.
62. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19, 20, 21 또는 22개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 3번 위치에서 시작하는, gRNA.
63. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19, 20, 21 또는 22개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 4번 위치에서 시작하는, gRNA.
64. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19, 20, 21 또는 22개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 5번 위치에서 시작하는, gRNA.
65. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19, 20, 21 또는 22개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 6번 위치에서 시작하는, gRNA.
66. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19, 20, 21 또는 22개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 7번 위치에서 시작하는, gRNA.
67. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19, 20 또는 21개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 8번 위치에서 시작하는, gRNA.
68. 실시형태 59에 있어서, 상기 적어도 18, 19 또는 20개의 순차적인 뉴클레오타이드는 상기 서열의 9번 위치에서 시작하는, gRNA.
69. 실시형태 54 또는 59 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 2개의 돌연변이는 서로에 인접하지 않는, gRNA.
70. 실시형태 54 또는 59 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 3의 돌연변이 중 어느 것도 서로에 인접하지 않는, gRNA.
71. 실시형태 54 또는 59 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 1, 2, 또는 3개의 돌연변이는 치환인, gRNA.
72. 실시형태 54 또는 59 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이 중 하나 이상은 삽입 또는 결실인, gRNA.
73. 실시형태 54 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 스페이서 서열은 약 18 내지 23, 예를 들어, 20개 뉴클레오타이드 길이인, gRNA.
74. 실시형태 54 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 스페이서 서열은 45% 내지 65% 또는 50 내지 60%, 예를 들어, 55%의 GC 함량을 갖는, gRNA.
75. 실시형태 54 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 화학적 변형(예를 들어, 핵염기, 당 또는 골격 부분에 대한 화학적 변형)을 포함하는, gRNA.
76. 실시형태 54 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 위치에 하나 이상의 2'O-메틸 뉴클레오타이드를 포함하는, gRNA.
77. 실시형태 54 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 위치에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 티오PACE 링키지를 포함하는, gRNA.
78. 실시형태 54 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 단일-분자 gRNA(sgRNA)인, gRNA.
79. 실시형태 54 내지 78 중 어느 하나에 있어서, Cas9에 결합하는, gRNA.
80. 실시형태 54 내지 79 중 어느 하나에 있어서, tracrRNA에 결합하는, gRNA.
81. 실시형태 54 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 스캐폴드 서열을 포함하는, gRNA.
82. 하기를 포함하는 키트 또는 조성물:
a) 실시형태 54 내지 81 중 어느 하나의 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산 및
b) 제2 gRNA 또는 제2 gRNA를 암호화하는 핵산.
83. 실시형태 82에 있어서, (a)의 gRNA는 CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70)의 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
84. 실시형태 82에 있어서, (a)의 gRNA는 AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67)의 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
85. 실시형태 82 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 제2 gRNA는 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는, 키트 또는 조성물.
86. 실시형태 82 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 제2 gRNA는 CD33 이외의 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는, 키트 또는 조성물.
87. 실시형태 82 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 제2 gRNA는 CLL-1을 표적으로 하는, 키트 또는 조성물.
88. 실시형태 82 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 제2 gRNA는 GUUGUAGAGAAAUAUUUCUC(서열번호 115), GGAGAGGUUCCUGAUCUUGU(서열번호 116) 또는UGAAUAUCUCCAACAAGAUC(서열번호 119)의 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
89. 실시형태 82 내지 88 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 70에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 115에 따른 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
90. 실시형태 82 내지 88 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 70에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 116에 따른 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
91. 실시형태 82 내지 88 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 67에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 115에 따른 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
92. 실시형태 82 내지 88 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 67에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 116에 따른 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
93. 실시형태 82 내지 88 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 67에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 70에 따른 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
94. 실시형태 82 내지 88 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 115에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 116에 따른 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
95. 실시형태 82 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 제3 gRNA 또는 제3 gRNA를 암호화하는 핵산을 더 포함하는, 키트 또는 조성물.
96. 실시형태 95에 있어서, 제3 gRNA는 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는, 키트 또는 조성물.
97. 실시형태 95에 있어서, 제3 gRNA는 CD33 또는 CLL-1을 표적으로 하는, 키트 또는 조성물.
98. 실시형태 95 내지 97 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 70에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 115에 따른 스페이서 서열을 포함하며, 제3 gRNA는 서열번호 116의 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
99. 실시형태 95 내지 97 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 67에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 115에 따른 스페이서 서열을 포함하며, 제3 gRNA는 서열번호 116의 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
100. 실시형태 95 내지 97 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 67에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 70에 따른 스페이서 서열을 포함하며, 제3 gRNA는 서열번호 116의 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
101. 실시형태 95 내지 97 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 67에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 70에 따른 스페이서 서열을 포함하며, 제3 gRNA는 서열번호 115의 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
102. 실시형태 95 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 제4 gRNA 또는 제4 gRNA를 암호화하는 핵산을 더 포함하는, 키트 또는 조성물.
103. 실시형태 102에 있어서, 제4 gRNA는 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는, 키트 또는 조성물.
104. 실시형태 102에 있어서, 제4 gRNA는 CD33 또는 CLL-1을 표적으로 하는, 키트 또는 조성물.
105. 실시형태 102에 있어서, (a)의 gRNA는 서열번호 67에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제2 gRNA는 서열번호 70에 따른 스페이서 서열을 포함하며, 제3 gRNA는 서열번호 115에 따른 스페이서 서열을 포함하고, 제4 gRNA는 서열번호 116에 따른 스페이서 서열을 포함하는, 키트 또는 조성물.
106. 실시형태 102 내지 105 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA, 제2 gRNA, 제3 gRNA 및 제4 gRNA는 혼합되는, 키트 또는 조성물.
107. 실시형태 102 내지 105 중 어느 하나에 있어서, (a)의 gRNA, 제2 gRNA, 제3 gRNA 및 제4 gRNA는 별개의 용기에 존재하는, 키트 또는 조성물.
108. 실시형태 82 내지 105 중 어느 하나에 있어서, (a) 및 (b)는 혼합되는, 키트 또는 조성물.
109. 실시형태 82 내지 105 중 어느 하나에 있어서, (a) 및 (b)는 별개의 용기에 존재하는, 키트 또는 조성물.
110. 실시형태 82 내지 109 중 어느 하나에 있어서, (a)의 핵산 및 (b)의 핵산은 동일한 핵산의 부분인, 키트 또는 조성물.
111. 실시형태 82 내지 109 중 어느 하나에 있어서, (a)의 핵산 및 (b)의 핵산은 별개의 핵산인, 키트 또는 조성물.
112. 하기 중 1개 이상(예를 들어, 2, 3개 또는 모두)을 포함하는, 유전자 조작된 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기세포 또는 전구세포):
(a) 유전자 돌연변이가 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50)의 서열을 갖는 부위에 존재하는, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3 내의 유전자 돌연변이;
(b) 유전자 돌연변이가 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에 존재하는, 내인성 CD33 유전자의 엑손 3 내의 유전자 돌연변이;
(c) GTTGTAGAGAAATATTTCTC(서열번호 117)의 서열을 갖는 부위에서의 CLL-1 내의 유전자 돌연변이;
(d) GGAGAGGTTCCTGATCTTGT(서열번호 118)의 서열을 갖는 부위에서의 CLL-1 내의 유전자 돌연변이.
113. 실시형태 112에 있어서, (a) 및 (b)를 포함하는, 조혈 세포.
114. 실시형태 112에 있어서, (a) 및 (c)를 포함하는, 조혈 세포.
115. 실시형태 112에 있어서, (a) 및 (d)를 포함하는, 조혈 세포.
116. 실시형태 112에 있어서, (b) 및 (c)를 포함하는, 조혈 세포.
117. 실시형태 112에 있어서, (b) 및 (d)를 포함하는, 조혈 세포.
118. 실시형태 112에 있어서, (c) 및 (d)를 포함하는, 조혈 세포.
119. 실시형태 112에 있어서, (a), (b) 및 (c)를 포함하는, 조혈 세포.
120. 실시형태 112에 있어서, (a), (b) 및 (d)를 포함하는, 조혈 세포.
121. 실시형태 112에 있어서, (a), (c) 및 (d)를 포함하는, 조혈 세포.
122. 실시형태 112에 있어서, (b), (c) 및 (d)를 포함하는, 조혈 세포.
123. 실시형태 112에 있어서, (a), (b), (c) 및 (d)를 포함하는, 조혈 세포.
124. 실시형태 112 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 50 내의 위치에서부터 서열번호 58 내의 위치에 걸쳐 있는 결실을 포함하는, 조혈 세포.
125. 실시형태 112 내지 124중 어느 하나에 있어서, 서열번호 117 내의 위치에서부터 서열번호 118 내의 위치에 걸쳐 있는 결실을 포함하는, 조혈 세포.
126. CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 조혈 세포 줄기세포 또는 전구세포의 샘플에서 CD33의 발현을 감소시키기 위한, 실시형태 54 내지 81 중 어느 하나의 gRNA 또는 실시형태 82 내지 111 중 어느 하나의 조성물 또는 키트.
127. 조혈 세포 줄기세포 또는 전구세포의 샘플에서 CD33의 발현을 감소시키기 위한, CRISPR/Cas9 시스템의 용도로서, CRISPR/Cas9 시스템의 gRNA는 실시형태 54 내지 81 중 어느 하나의 gRNA 또는 실시형태 82 내지 111 중 어느 하나의 조성물 또는 키트의 gRNA인, 용도.
128. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법으로서,
(i) 조혈 줄기세포 또는 전구세포(예를 들어, 야생형 조혈 줄기세포 또는 전구세포)를 제공하는 단계, 및
(ii) 세포에 (a) 실시형태 22 내지 39 중 어느 하나의 가이드 RNA(gRNA) 또는 실시형태 82 내지 111 중 어느 하나의 조성물 또는 키트의 gRNA; 및 (b) gRNA에 결합하는 뉴클레아제(예를 들어, 엔도뉴클레아제)(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제)를 도입하여,
유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
129. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법으로서,
(i) 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포를 제공하는 단계, 및
(ii) 세포에 (a) 서열번호 67 또는 서열번호 70과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA); 및 (b) Cas9 엔도뉴클레아제를 도입하여, CD33의 감소된 발현 수준을 갖는 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
130. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법으로서,
(i) 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 제공하는 단계, 및
(ii) 상기 세포에 (a) 서열번호 67 또는 서열번호 70과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA); 및 (b) Cas9 엔도뉴클레아제를 도입하여, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
131. CD33의 감소된 발현 수준을 갖는 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법으로서,
(i) 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 제공하는 단계, 및
(ii) 세포에 (a) 서열번호 67 또는 서열번호 70과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA); 및 (b) Cas9 엔도뉴클레아제를 도입하여, CD33의 감소된 발현 수준을 갖는 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
132. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법으로서,
(i) 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 제공하는 단계, 및
(ii) 상기 세포에 (a) 서열번호 67에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA); 및 (b) Cas9 엔도뉴클레아제를 도입하여, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
133. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법으로서,
(i) 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 제공하는 단계, 및
(ii) 상기 세포에 (a) 서열번호 70에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA); 및 (b) Cas9 엔도뉴클레아제를 도입하여, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
134. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 야생형 대응물 세포와 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 갖는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 초래하는, 방법 또는 용도.
135. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 야생형 대응물 세포에서의 CD33의 수준의 20% 미만인 CD33의 감소된 발현 수준을 갖는 비유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 초래하는, 방법 또는 용도.
136. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 복수의 조혈 줄기세포 또는 전구세포 상에서 수행되는, 방법 또는 용도.
137. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 복수의 조혈 줄기세포 및 복수의 조혈 전구세포를 포함하는 세포 집단 상에서 수행되는, 방법 또는 용도.
138. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 실시형태 34 내지 48 중 어느 하나에 따른 세포 집단을 생산하는, 방법 또는 용도.
139. 실시형태 128 내지 138 중 어느 하나에 있어서, (a) 및 (b)의 핵산은 세포에 도입되는 하나의 벡터 상에 암호화된, 방법.
140. 실시형태 139에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 방법.
141. 실시형태 139에 있어서, (a) 및 (b)는 사전 형성된 리보핵단백질 복합체로서 상기 세포에 도입되는, 방법.
142. 실시형태 141에 있어서, 상기 리보핵단백질 복합체는 전기천공을 통해서 상기 세포에 도입되는, 방법.
143. 실시형태 128 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제)는 세포에 Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, mRNA 분자)를 전달함으로써 세포에 도입되는, 방법.
144. 실시형태 128 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA는 단일-분자 가이드 RNA(sgRNA)인, 방법.
145. 실시형태 128 내지 144 중 어느 하나에 있어서, gRNA는 변형된 sgRNA인, 방법.
146. 실시형태 128 내지 145 중 어느 하나에 있어서, gRNA는 화학적으로 변형된 sgRNA인, 방법.
147. 실시형태 128 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 상기 조혈 줄기세포 또는 전구세포는 CD34+인, 방법.
148. 실시형태 128 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 상기 조혈 줄기세포 또는 전구세포는 대상체의 골수 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 유래되는, 방법.
149. 실시형태 148에 있어서, 상기 대상체는 조혈 장애를 갖는, 방법.
150. 실시형태 148에 있어서, 대상체는 건강한 공여자인, 방법.
151. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 야생형 대응물 세포와 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 야기하는 돌연변이를 초래하는, 방법.
152. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 야생형 대응물 세포와 비교할 때 야생형 CD33의 감소된 발현 수준을 야기하는 돌연변이를 초래하는, 방법.
153. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 야생형 대응물 세포와 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 갖는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는, 방법 또는 용도.
154. 실시형태 51 내지 53 또는 126 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 야생형 대응물 세포와 비교할 때 야생형 CD33의 감소된 발현 수준을 갖는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는, 방법 또는 용도.
155. 실시형태 51 내지53 또는 126 내지 154 중 어느 하나의 방법 또는 용도에 의해서 생산된, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
156. 조혈 장애의 치료 방법으로서, 조혈 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 실시형태 34 내지 48 중 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
157. 조혈 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포 집단, 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포로서, 치료는 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 대상체에게 유효량의 CD33을 표적으로 하는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는, 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 세포 집단 또는 조혈 세포.
158. CD33을 표적으로 하는 작용제로서, 작용제는 조혈 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하고, 치료는 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 CD33을 표적으로 하는 작용제를 투여하는 단계를 포함하고, 환자에게 유효량의 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포를 투여하는 단계를 더 포함하는, 작용제.
159. 조혈 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포 및 CD33을 표적으로 하는 작용제의 조합물로서, 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하고, 치료는 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단, 및 CD33에 결합하는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 조합물.
160. 암 면역요법에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포.
161. 환자는 조혈 장애를 갖는, 암 면역요법에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포.
162. 조혈 장애를 갖는 환자의 조혈 재증식에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포.
163. 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 본 명세서에 기재된 세포 집단은 환자를 다시 생존하게 하는, 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포.
164. 면역요법에서 CD33을 표적으로 하는 작용제의 세포독성 효과를 감소시키는 데 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포.
165. 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 본 명세서에 기재된 세포 집단은 CD33을 표적으로 하는 작용제의 세포독성 효과를 감소시키는, CD33을 표적으로 하는 작용제를 사용하는 면역요법 방법에 사용하기 위한 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포, 실시형태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포 집단 또는 실시형태 112 내지 125 중 어느 하나의 조혈 세포.
166. 실시형태 156 내지 제165 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단은 CD33을 표적으로 하는 작용제와 동반하여 투여되는, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
167. 실시형태 156 내지 제165 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단은 CD33을 표적으로 하는 작용제 이전에 투여되는, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
168. 실시형태 156 내지 165 중 어느 하나에 있어서, CD33을 표적으로 하는 작용제는 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 세포 집단 이전에 투여되는, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
169. 실시형태 156 내지 168 중 어느 하나에 있어서, 조혈 장애는 조혈 악성종양인, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
170. 실시형태 156 내지 169 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에게 유효량의 CD33을 표적으로 하는 작용제를 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
171. 실시형태 170항에 있어서, CD33을 표적으로 하는 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역세포인, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
172. 실시형태 171에 있어서, 면역세포는 T 세포인, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
173. 실시형태 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 면역세포, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포 또는 둘 다는 동종이계인, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
174. 실시형태 170 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 면역세포, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포 또는 둘 다는 자가인, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
175. 실시형태 170 내지 174 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체 내의 상기 항원-결합 단편은 인간 CD33에 특이적으로 결합하는 단일-쇄 항체 단편(scFv)인, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
176. 실시형태 170 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종을 갖는 인간 환자인, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
177. 실시형태 176에 있어서, 상기 대상체는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 또는 만성 림프모구성 백혈병인 백혈병을 갖는 인간 환자인, 방법, 세포, 작용제 또는 조합물.
본 개시내용의 하나 이상의 실시형태의 상세사항이 하기 설명에 기재된다. 본 개시내용의 다른 특징 또는 이점은 몇몇 실시형태의 상세한 설명 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 본 명세서에 제시된 구체적인 실시형태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 유형 0, 유형 1, 유형 2 및 유형 3 계통-특이적 항원의 예시적인 도면.
도 2는 유형 0 계통-특이적 세포-표면 항원인 CD307을 표적으로 하는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포를 도시한 개략도. CD307을 발현하는 다발성 골수종(MM) 세포 및 CD307을 발현하는 다른 세포, 예컨대, 형질 세포는 항-CD307 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포에 의해서 표적화된다.
도 3은 유형 2 계통-특이적 세포-표면 항원인 CD33을 표적으로 하는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포를 도시한 개략도. CD33을 발현하는 급성 골수성 백혈병(AML) 세포. 인간 조혈 줄기세포(HSC)는 CD33이 결핍되도록 유전자 조작되어 항-CD33 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포에 의해 인식되지 않는다. HSC는 골수 세포를 생성할 수 있다.
도 4는 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 게놈 편집을 도시한 개략도. sgRNA는 계통-특이적 세포-표면 항원의 엑손의 일부에 혼성화하고, Cas9 엔도뉴클레아제는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열(5'-NGG-3')의 상류를 절단한다. 서열은 위에서 아래로 서열번호 45 및 46에 상응한다.
도 5는 CD33을 파괴하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 게놈 편집 전략을 도시한 개략도. Cas9 단백질 및 CD33을 표적으로 하는 가이드 RNA를 암호화하는 PX458 벡터를 인간 백혈병 세포주인 K-562 세포에 뉴클레오펙션시켰다. Cas9 및 가이드 RNA를 세포에 전달하기 전(상단 플롯) 및 후(하단 플롯) 항-CD33 항체를 사용하여 세포 집단에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 게놈 편집은, 유전자의 암호 영역이 결실되었고, 세포 표면에서 CD33을 상당히 감소시켰다.
도 6은 CD45RA을 파괴하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 게놈 편집 전략을 도시한 개략도. Cas9 단백질 및 CD45RA를 표적으로 하는 가이드 RNA를 암호화하는 PX458 벡터를 TIB-67 세망 세포 육종 마우스 대식세포 유사 세포에 뉴클레오펙션시켰다. Cas9 및 가이드 RNA를 세포에 전달하기 전(상단 플롯) 및 후(하단 플롯) 항-CD45RA 항체를 사용하여 세포 집단에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 게놈 편집은, 유전자의 암호 영역이 결실되었고, 세포 표면에서 CD45RA를 상당히 감소시켰다.
도 7A 내지 도 7D는 CD33을 표적으로 하는 항원-결합 단편을 포함하는 예시적인 키메라 수용체의 개략도. 도 7A: 항-CD33 scFv, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공자극 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 CD33을 표적으로 하는 일반적인 키메라 수용체. 도 7B: 항-CD33 scFv, CD8로부터의 힌지 도메인, CD8로부터의 막관통 도메인 및 CD28 및 CD3ζ로부터의 세포내 도메인을 포함하는 CD33을 표적으로 하는 키메라 수용체. 도 7C: 항-CD33 scFv, CD8로부터의 힌지 도메인, CD8로부터의 막관통 도메인 및 ICOS(또는 CD27, 4-1BB 또는 OX-40) 및 CD3ζ로부터의 세포내 도메인을 포함하는 CD33을 표적으로 하는 키메라 수용체. 도 7D: 항-CD33 scFv, CD8로부터의 힌지 도메인, CD8로부터의 막관통 도메인 및 OX40, CD28 및 CD3ζ로부터의 세포내 도메인을 포함하는 CD33을 표적으로 하는 키메라 수용체.
도 8은 면역독소의 개략도.
도 9A 내지 도 9B는 빈 벡터 또는 항-CD33 키메라 수용체를 암호화하는 벡터가 형질도입된 K562 세포에서 발현되는 항-CD33 키메라 수용체의 발현을 도시한 도면. 도 9A: CD3ζ를 인식하는 1차 항체를 사용한 웨스턴 블롯. 표는 시험된 키메라 수용체 각각의 예측 분자량을 제공한다. 도 9B: 항-CD33 키메라 수용체에 대해 양성으로 염색되는 세포 집단의 증가를 나타낸 유세포 분석법 분석.
도 10A 내지 도 10C는 항-CD33 키메라 수용체가 CD33에 결합함을 도시한 도면. 도 10A: 폰소(Ponceau) 염색된 단백질 겔. 레인 1,3,5: CD33 분자. 레인 2,4,6: CD33 mol + APC 접합체. 도 10B: CD3ζ를 인식하는 1차 항체를 사용한 웨스턴 블롯. 레인 1, 3 및 5는 CD33 분자와 함께 인큐베이션된 키메라 수용체를 함유하고, 레인 2, 4 및 6은 CD33-APC 접합체와 함께 인큐베이션된 키메라 수용체를 함유한다. 도 10C: 항-CD33 키메라 수용체를 발현하고, CD33에 결합하는 세포 집단의 증가를 나타낸 유세포 분석법 분석.
도 11A 내지 도 11B는 제시된 키메라 수용체를 발현하는 NK92 세포에 의한 K562 세포의 세포독성을 도시한 도면. 도 11A: 빈 HIVzsG 벡터와 비교한 CART1 및 CART2. 도 11B: 빈 HIVzsG 벡터와 비교한 CART3.
도 12A 내지 도 12B는 제시된 키메라 수용체를 발현하는 NK92 세포에 의한 CD33가 결핍된 K562 세포의 세포독성(y-축 상에 세포독성 백분율로 나타냄)을 도시한 도면. 도 12A: CD33-표적화 CRISPR/Cas 시약으로 사전 처리된 K562 세포의 비분류 집단. 도 12B: CD33이 결핍된 K562 세포의 단일 클론. 칼럼은 좌측에서 우측으로 빈 HIVzsG 벡터, CART1, CART2 및 CART3에 상응한다.
도 13A 내지 도 13B는 1차 T 세포 집단의 유세포 분석법 분석을 도시한 도면. 도 13A: T 세포 마커인 C4+, CD8+, 또는 CD4+CD8+ 둘 다의 발현에 기초한 세포의 분류. 도 13B: 1차 T 세포의 제시된 집단에 대한 CD33의 상대적인 발현.
도 14A 내지 도 14B는 제시된 키메라 수용체를 발현하는 1차 T 세포에 의한 K562 세포의 세포독성을 도시한 도면. 도 14A: CD4+ T 세포. 도 14B: CD4+/CD8+ (CD 4/8) 및 CD8+ (CD8).
도 15는 CRISPR/Cas9 시스템 및 2개의 상이한 gRNA(Crispr3, 우측 상단 패널 및 Crispr5, 우측 하단 패널)를 사용하여 K562 세포에서 CD33 편집의 유세포 분석법 분석을 도시한 도면.
도 16A 내지 도 16C는 CD33이 결핍된 K562 세포가 정상 세포 증식 및 적혈구 생성 분화를 제공한다는 것을 도시한 도면. 도 16A: 1일 + 50μM 헤민(hemin)에서 제시된 세포 집단의 유세포 분석법 분석. 도 16B: 9일에서 제시된 세포 집단의 유세포 분석법 분석. 도 16C: MTT 세포 증식 검정.
도 17A 내지 도 17C는 CRISPR/Cas9 시스템 및 2개의 상이한 gRNA(crispr3, 좌측 하단 패널 및 crispr5, 우측 하단 패널)를 사용하여 인간 CD34+ 세포에서 CD33 편집의 유세포 분석법 분석을 도시한 도면. 도 17A: CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 인간 CD34+ 세포에서 CD33 편집의 유세포 분석법 분석. 도 17B: crispr3. 도 17C: crispr5.
도 18는 인간 CD34+/CD33+ 세포와 비교하여 인간 CD34+/CD33- 세포에 대한 집락 형성을 도시한 도면. 칼럼은 좌측에서 우측으로 렌티바이러스 감염 없음, 빈 벡터, 대조군, crispr1, crispr 3 및 crispr5에 상응한다.
도 19A 내지 도 19F는 CD33 항원의 CRISPR/Cas9-매개된 유전자 절제를 도시한 도면. 도 19A는 접근법을 도시한다: 동원된 줄기세포 또는 기증자로부터 얻은 제대혈을 유전자 조작하여 CRISPR/Cas9와 같은 유전자 편집 기술을 사용하여 CD33 발현을 절제하고, HSCT에 적합한 재발 환자에게 이식한다. 이식 후, 동종이계 공여자로부터의 T 세포를 바이러스 전달 시스템을 사용하여 유전자 조작하여 CD33을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체를 발현시키고, 수용자에게 주입할 것이다. 대안적으로, 환자는 ADC(GO)를 단독으로 또는 CAR-T와 함께 제공받을 수 있다. 도 19B 내지 도 19F는 인간 세포에서 CD33 발현 및 이의 절제를 도시한 도면. 도 19B: CRISPR/Cas9 매개 절제 후 골수(BM) 및 제대혈(CB) 및 인간 1차 CD34+CD33Del로부터의 인간 1차 CD34+CD33WT 세포에서 인간 AML 세포주 HL-60에서 CD33의 발현. 도 19C: 엑손 2 내지 4 및 CD33을 표적으로 하는 sgRNA의 위치 및 서열(굵은 글씨)을 도시한 CD33 게놈 유전자좌의 개략적인 표현. 서열은 위에서 아래로 서열번호 52 및 53에 상응한다. 도 19D: CD34+CD33WT 세포 및 CD34+CD33Del에서 전기천공 후 유세포 분석법에 의한 CD33의 표면 발현. 모든 세포는 CD90 발현에 의해 평가된 바와 같이 줄기세포 표현형을 유지한다. 도 19E: DNA 이중 가닥 브레이크 부위를 둘러싸는 영역을 도시한 생어 서열결정의 크로마토그램, 상단: CD34+CD33WT 세포 및 하단: CD34+CD33Del. 서열은 위에서 아래로 서열번호 54 및 55에 상응한다. 도 19F: 전기천공 5 내지 7일 후, CD34+ 배양 세포는 대조군과 비교하여 CD33의 일관된 결실을 나타낸다.
도 20A 내지 도 20E는 CD33의 결실이 NSG-SGM3 마우스에서 생착 및 조혈 재증식을 손상시키지 않는다는 것을 도시한 도면. 도 20A: 실험 설계의 개략도. 도 20B 내지 도 20C는 골수 유래 CD34+ 세포 생착 및 재증식을 도시한다: 이식 후 말초 혈액(7주; 도 20B) 및 전골수(21주; 도 20C)를 제시된 바와 같이 다양한 계통의 세포에 대해 분석하였다. CD34+CD33Del 세포는 대조군 세포와 동일한 생착(CD45+)뿐만 아니라 성숙한 골수성 및 림프성 세포의 대등한 백분율을 나타낸다. 골수 CD34+CD33Del 세포는 골수(전구 CD123+, 성숙 CD14+) 및 림프구(전구 CD10+, 성숙 CD19+), T 세포(CD3+) 및 줄기세포 CD34+38-의 대등한 비율을 나타낸다. 도 20D 내지 도 20E는 제대혈 유래 CD34+ 세포 생착 및 재증식을 도시한다: 이식 후 말초 혈액(9주; 도 20D) 및 골수(21주; 도 20E)를 제시된 바와 같이 다양한 계통의 세포에 대해 분석하였다. CD34+CD33Del 세포는 대조군 세포와 동일한 생착(CD45+)뿐만 아니라 성숙한 골수성 및 림프성 세포의 대등한 백분율을 나타낸다. 골수 CD34+CD33Del 세포는 골수(전구 CD123+, 성숙 CD14+) 및 림프구(전구 CD10+, 성숙 CD19+), T 세포(CD3+) 및 줄기세포 CD34+38-의 대등한 비율을 나타낸다. 데이터는 언페어드 t 검정(unpaired t test)을 사용하여 분석하였고, 조사된 모든 군에서 유의한 차이가 발견되지 않았다(p>0.05). 모든 데이터를 평균 ± SEM으로 나타낸다.
도 21A 내지 도 21D는 좌측에 제시된 바와 같은 Cas9+sgRNA(상단) 및 Cas9 단독(하단) 세포에서 가이드를 둘러싼 CD33(도 21A) 및 SIGLEC9(도 21B) 유전자의 게놈 영역의 통합 게놈 뷰어(integrated genomic viewer: IGV) 스크린샷을 도시한 도면. 커버리지 트랙의 회색 막대(우측에 표시)는 각각의 유전자좌에 표시된 판독 깊이를 나타낸다. 일반적으로 커버리지는 균일해야 하므로, 막대 높이가 동일해야 하지만, 결실은 높이가 낮아진다. 판독 트랙은 이 영역에 매핑된 모든 판독물(회색 상자)을 나타낸다. 결실은 흑색 실선으로 표시되고, 삽입은 대각선으로 빗금친 상자로 표시된다. 두꺼운 테두리가 있는 판독물은 매핑된 메이트가 없는 것이다. 각각의 군에서 하나의 판독물은 매핑된 메이트가 없다. 미스매치 염기는 각각 뉴클레오타이드 A, C, G 및 T에 대해 다이아몬드, 열린 원, 닫힌 원 및 흰색으로 채워진다. SIGLEC9 게놈 영역은, 1) 그것이 CD33과 상동성을 갖는 SIGLEC 패밀리에 속하고, 2) 그것이 임의의 다른 가이드에 비해서 예측되는 절단 부위의 10bp 이내에서 가장 높은 상동성을 가지고 있기 때문에 표적외 부위에서 인델(indel)의 부재를 나타내기 위한 대표적은 영역으로서 선택되었다. 하단의 염색체 좌표는 hg38을 기준으로 한다. 도 21C: CD33 편집 세포와 대조군 세포 사이에서 DEseq2 방법을 사용하여 정규화된 log 10 평균 정규화 계수치 간의 상관관계를 도시한 산점도. 도 21D: edgeR 방법을 사용하여 분석된 유전자에 대한 log2 배수 변화 및 -log 10 p-값을 도시한 화산 플롯(유의하게 차별적으로 발현된 유전자(p<0.05)는 적색 개방 원으로 표시되고, CD33 유전자는 왼쪽 화살표로 표시됨).
도 22A 내지 도 22F는 CD33 결실이 시험관내에서 CART33 세포독성으로부터 CD34+ 세포를 보호함을 도시한 도면. 도 22A: CART33 작제물의 개략도. 도 22B: 대조군(흑색) 또는 CART33(녹색 또는 청색) 바이러스를 사용한 렌티바이러스 형질도입 후 인간 1차 T 세포에서 CAR 발현을 도시한 등고선 플롯. 각각의 군의 형질도입 백분율을 플롯 옆에 명시한다. CD4+ 및 CD8+ 세포를 실험 전에 독립적으로 형질도입시켰고, 1:1로 혼합하였다. 도 22C 내지 도 22F: 세포독성 검정. 도 22C: CART33 세포 또는 대조군 T를 HL-60 또는 CD34+CD33WT 또는 CD34+CD33Del 과 함께 인큐베이션시키고, 세포독성을 유세포 분석법에 의해 검정하였다. 도 22D 내지 도 22F: 삼중 배양 세포독성 검정. CART33 세포 또는 대조군 T 세포를 HL-60 및 CD34+CD33WT(도 22D), 또는 HL-60 및 CD34+CD33De (도 22E) 또는 CD34+CD33WT 및 CD34+CD33Del(도 22F) 세포와 함께 공동 인큐베이션시켰다.
도 23A 내지 도 23F는 요법 모델을 도시한 도면: CD34+CD33Del 세포는 CD33-표적화 면역요법에 내성이다. 도 23A: 실험 설계의 개략도. 5*105 HL-60 및 5*105 CD34+CD33Del를 0일에 NSGM3 마우스에게 주사하였다. 1주 후 마우스를 PBS 또는 동종이계 CART33 또는 대조군 T 세포로 처리하였다. 새로운 군이 GO만을 제공받은 지 3일 후, 동종이계 CART33 및 대조군 T 세포가 주사된 마우스에게 GO 또는 PBS를 제공하였다. 처리는 3주차에 반복되었다. 이어서 백혈병 진행 및 CD34+CD33Del 생착을 연속 골수 흡인으로 모니터링하였다. 도 23B: 골수 흡인물의 백혈병 부담 모니터링. 백혈병 세포를 Ter119-dtomato+에서 게이팅하였다. 도 23C: 3.5주(도 23D) 및 8주(도 23E)에 나타낸 영상의 epi-형광 정량화를 통한 백혈병 부담 측정. 미처리 마우스(* 영상화 대조군)로 배경을 제거하였다. 도 23F: 골수 흡인물의 유세포 분석법에 의해 나타난 바와 같이, CART33 또는 GO 백혈병 제거는 시간 경과에 따른 CD34+CD33Del 세포의 생착(% hCD45+ 세포)을 손상시키지 않는다. CD34+ 주사 유래된 인간 세포를 Ter119-dtomato-, Ly5-/H2kd-인간 CD45+CART-에 게이팅하였다.
도 24A 내지 도 24D는 CD34+CD33Del HSPC가 요법 모델에서 다계통 생착 및 분화를 나타낸다는 것을 도시한 도면. 도 24A: CD34+CD33Del 세포는 CD33-표적화 면역요법에 저항하고, 골수형성 및 림프구형성에 기여한다. 각각의 조건에서 좌측 2개의 패널은 시간 경과에 따른 골수성 전구의 재증식 및 우측 2개의 패널은 림프구 전구 및 BM 흡인물의 성숙한 세포를 모니터링한다. 분석된 모든 시점에서 상이한 처리군 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 도 24B 내지 도 24D는 CD34+CD33WT 세포가 CD33-표적화 면역요법에 민감함을 도시한 도면. 도 24B: 실험 설계의 개략도. 5*105 CD34+CD33WT 단독을 또는 5*105 HL-60과 조합하여 제0일에 NSG-SGM3 마우스에 주사하였다. 1주 후 마우스를 PBS 또는 동종이계 CART33 세포로 처리하였다. 이어서 백혈병 진행 및 CD34+CD33WT 생착을 CART33의 경우 제3주에 골수 흡인으로 모니터링하였다. 같은 날 마우스의 군에 GO를 주사하고, 4일 후에 분석하였다. 도 24C 내지 도 24D: BM 흡인물은 PBS 단독과 비교하여 CART33 또는 GO로 처리된 마우스에서 CD33WT 백혈병 세포(도 24C) 및 CD33WT 1차 세포(도 24D)의 완전한 제거를 나타낸다. PBS와 비교하여 CART33과 GO 간에 상당한 차이가 관찰되었다. CD34+ 주사 유래된 인간 세포를 Ter119-dtomato-, Ly5 - /H2kd - 인간 CD45 + CART - 에 게이팅하였다. 모든 데이터를 평균 ± SEM으로 나타낸다.
도 25A 내지 도 25B는 CD33 발현을 절제하도록 시험된 추가 sgRNA가 높은 수준의 인델을 나타낸다는 것을 도시한 도면. 도 25A 내지 도 25B: 엑손 2 내지 4 및 CD33 유전자좌를 표적으로 하는 2개의 추가 sgRNA의 위치 및 서열을 도시한 CD33 게놈 유전자좌의 개략적인 표현. 하단의 크로마토그램은 DNA 이중 가닥 브레이크 부위를 둘러싸는 영역을 도시한 생어 서열결정의 스크린샷이다(좌측: CD34+CD33WT 세포 및 우측: CD34+CD33Del). 가이드 서열은 크로마토그램에서 파란색으로 강조하고, 인델의 외관은 적색 하향 화살표로 표시한다. 서열은 나타낸 순서대로 각각 서열번호 56 내지 57, 75 내지 76, 113, 59 및 77 내지 78에 상응한다.
도 26A 내지 도 26D는 CD33의 결실이 NSGM3 마우스에서 생착 및 조혈 재증식을 손상시키지 않는다는 것을 도시한 도면. 도 26A 내지 도 26B는 골수 유래 CD34+ 세포 생착 및 재증식을 도시한다: 도 26A: 제시된 바와 같이 다양한 계통의 세포에 대해 이식 후 골수 흡인물(15주)을 분석하였다. CD34+CD33Del 세포는 대조군 세포와 동일한 생착(CD45+)뿐만 아니라 성숙한 골수성 및 림프성 세포의 대등한 백분율을 나타낸다. 막대 다이어그램은 개별 패널의 요약을 나타낸다. 도 26B: 주요 도 20C로부터의 데이터의 요약. 도 26C 내지 도 26D는 제대혈 유래 CD34+ 세포 생착 및 재증식을 도시한다: 도 26C: 제시된 바와 같이 다양한 계통의 세포에 대해 이식 후 골수 흡인물(16주)을 분석하였다. CD34+CD33Del 세포는 대조군 세포와 동일한 생착(CD45+)뿐만 아니라 성숙한 골수성 및 림프성 세포의 대등한 백분율을 나타낸다. 막대 다이어그램은 개별 패널의 요약을 나타낸다. 도 26D: 도 20E로부터의 데이터의 요약. 분석된 모든 세포 유형에서 두 군 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(p>0.05, 언페어드 t 검정). 모든 데이터를 평균 ± SEM으로 나타낸다.
도 27은 RNAseq 데이터의 판독 커버리지를 도시한 도면. 좌측에 표시된 바와 같이 Cas9+sgRNA(n=5; 하단) 및 Cas9 단독(n=5; 상단) 세포의 가이드를 둘러싼 CD33 게놈 영역을 도시한 커버리지 트랙의 통합 게놈 뷰어(IGV) 스크린샷. 커버리지 트랙의 회색 막대(우측에 표시)는 각각의 유전자좌에 표시된 판독 깊이를 나타낸다. 일반적으로 커버리지는 균일해야 하므로, 막대 높이가 동일해야 하지만, 결실은 막대의 높이가 낮아지는데, 이는 하단 패널에서 점선 직사각형으로 표시된다. 도 27은 나타나는 순서대로 각각 서열번호 114 및 114를 개시한다.
도 28은 전체 게놈 서열결정에서 발견된 판독물 및 변이체의 요약을 도시한 도면.
도 29는 sgRNA 846(sgRNA: AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67); PAM: CGG)에 대한 표적외 부위를 도시한 도면. 전체 게놈 서열결정 분석에서 예상되는 표적외 절단 부위의 100bp 내에서 인델이 발견되지 않았다. 가이드 서열과의 미스매치를 굵게 표시한다. 도 29는 나타나는 순서대로 각각 서열번호 79 내지 98을 개시한다.
도 30은 sgRNA 811(sgRNA: CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70); PAM: AGG)에 대한 표적외 부위를 도시한 도면. 전체 게놈 서열결정 분석에서 예상되는 표적외 절단 부위의 100bp 내에서 인델이 발견되지 않았다. 가이드 서열과의 미스매치를 굵게 표시한다. 도 30은 나타나는 순서대로 각각 서열번호 99 내지 107, 106, 107, 107, 107, 107, 107 내지 112를 개시한다.
도 31은 CD33 결실된 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자의 목록. CD33 야생형 세포와 비교하여 CD33 결실된 세포에서 발현이 낮은 유전자를 음성 부호로 나타낸다.
도 32A 내지 도 32C는 GO 표적화 면역요법이 원발성 AML을 제거하고, CD33Del 세포를 구제한다는 것을 도시한 도면. 도 32A: 실험 설계의 개략도. 제1일에 50만 개의 원발성 AML 세포를 NSGS 마우스에 주사하였다. 최소 잔류 질환이 평가되면, 처리된 마우스 군에게 만성 용량의 GO(10일마다 1㎍)를 제공하였다. 처리군의 제1 GO 주사 10일 후, 마우스에게 50만 개의 CD34+CD33Del 세포를 이식하였다. 도 32B, 좌측 패널: 치료 전 골수 흡인물의 유세포 분석법에 의해 평가된 AML(최소 잔류 질환) 부담. 백혈병 세포를 Ter119 - hCD45+hCD33+에 게이팅하였다. 우측 패널: GO 만성 치료 후 BM 흡인물에서 AML 부담 및 hCD45+hCD33Del 생착. 도 23B: Ter119-, Ly5-/H2kd-, hCD45+, hCD33-에 게이팅된 CD34+CD33Del 세포의 조혈 재증식(골수성/림프성 전구세포 및 성숙 세포). 도 32C. 사망 시 대조군의 전골수(BM), 비장 및 말초 혈액(PB)의 생존 곡선 및 분석(실선, 미처리; 점선, 처리).
도 33A 내지 도 33D는 CD33 및 CLL-1이 결핍된 세포가 성공적으로 생착될 수 있음을 나타낸 도면. 도 33A는 CD33 및 CLL-1 수준이 개별적으로 또는 조합하여 감소될 수 있음을 나타내는 일련의 유세포 분석법 플롯이다. 도 33B는 마우스에 생착되도록 허용된 세포에서 CD33 및 CLL-1 수준을 나타낸 일련의 유세포 분석법 플롯이다. 도 33C 및 도 33D: 전골수 샘플(도 33C) 또는 비장 샘플(도 34d)에서 제시된 세포 유형의 hCD45+ 세포 집단 내의 빈도. 좌측에서 우측으로, 4개의 막대의 각각의 세트는 다음 세포 유형을 나타낸다: CD34+WT(원); CD34+CD33Del(정사각형), CD34+CLL1Del(삼각형) 및 CD34+CD33DelCLL1Del(역삼각형).
암 세포의 세포 표면에 존재하는 항원을 표적으로 하는 암 면역요법은, 표적 항원이 대상체의 발달 및/또는 생존에 필요하거나 결정적으로 관여하는 정상 비-암 세포의 세포 표면에도 존재하는 경우 특히 도전적이다. 이들 항원을 표적으로 하는 것은 암 세포에 더하여 이러한 세포에 대한 면역요법의 세포독성 효과로 인해서 대상체에서 유해한 효과를 초래할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법, 핵산 및 세포는 암 세포뿐만 아니라 대상체의 발달 및/또는 생존에 중요한 세포 상에 존재하는 항원(예를 들어, 유형 1 또는 유형 2 항원)의 표적화를 허용한다. 이 방법은 하기를 포함한다: (1) 이러한 항원을 표적으로 하는 작용제를 사용하여 표적 계통-특이적 세포-표면 항원을 운반하는 세포의 수를 감소시키는 단계; 및 (2) 작용제를 투여함으로써 항원을 제시하여 사멸될 수 있는 정상 세포(예를 들어, 비-암 세포)를 계통-특이적 세포-표면 항원이 결핍된 조혈 세포로 대체하는 단계. 본 명세서에 기재된 방법은 관심대상 계통-특이적 세포-표면 항원을 발현하는 암세포를 포함한 표적 세포에 대한 감시를 유지하고 또한 대상체의 발달 및/또는 생존에 중요할 수 있는 계통-특이적 항원을 발현하는 비-암 세포 집단을 유지할 수 있다.
따라서, 본 명세서에는 조혈 악성종양을 치료하기 위해서, 계통-특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)을 표적으로 하는 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 면역세포 및 계통-특이적 세포-표면 항원이 결핍된 조혈 세포, 예컨대, 조혈 줄기세포(HSC) 또는 조혈 전구세포(HPC)를 공동으로 사용하는 것이 기재되어 있다. 또한 본 명세서에는 키메라 수용체, 이를 암호화하는 핵산, 이를 포함하는 벡터 및 이러한 키메라 수용체를 발현하는 면역세포(예를 들어, T 세포)가 제공된다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 것과 같은 계통-특이적 항원이 결핍된 유전적으로 조작된 조혈 세포, 뿐만 아니라 이를 제조하는 방법(예를 들어, 게놈 편집 방법)을 제공한다.
정의
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호 교환적으로 사용되며, 척추동물, 바람직하게는 인간과 같은 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 인간 영장류, 비인간 영장류 또는 뮤린, 소, 말, 개 또는 고양이과 종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 "대상체"는 또한 시험관내 또는 생체외에서 배양되거나 생체내에서 조작될 수 있는 조직 및 세포를 포함한다. 용어 "대상체"는 "유기체"라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 예는 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀, RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머의 암호 또는 비암호 영역을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 추가로 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들어 표지제와의 접합에 의해 중합 후에 변형될 수 있다.
용어 "혼성화"는 용어는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기 짝짓기, 후그스타인(Hoogstein) 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오타이드 절단과 같은 보다 광범위한 과정의 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보체"로 지칭된다.
용어 "재조합 발현 벡터"는 작제물이 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 벡터가 세포 내에서 발현된 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 갖기에 충분한 조건 하에 세포와 접촉되는 경우, 숙주 세포에 의해서 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현을 허용하는 유전자-조작된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 의미한다. 본 개시내용의 벡터는 전체적으로 자연 발생적이지 않다. 벡터의 일부는 자연적으로 발생적일 수 있다. 본 개시내용의 비-자연 발생 재조합 발현 벡터는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 합성되거나 부분적으로 자연 공급원으로부터 수득될 수 있고, 자연, 비자연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "형질감염", "형질전환" 또는 "형질도입"은 물리적 또는 화학적 방법을 사용한 숙주 세포 내로의 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 도입을 지칭한다.
"항체", "항체의 단편", "항체 단편", "항체의 기능적 단편" 또는 "항원 결합 부분"은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 부분을 의미하도록 상호교환적으로 사용된다(Holliger et al., Nat. Biotech. (2005) 23(9): 1126). 본 발명의 항체는 항체 및/또는 이의 단편일 수 있다. 항체 단편은 Fab, F(ab')2, scFv, 다이설파이드 연결된 Fv, Fc 또는 변이체 및/또는 혼합물을 포함한다. 항체는 키메라, 인간화, 단일 사슬 또는 이중 특이적일 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하는 모든 항체 아이소타입이 본 개시내용에 포함된다. 적합한 IgG 하위유형은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 프레임워크 영역으로 이루어진다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분의 CDR은 비-인간 또는 인간 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분의 프레임워크는 인간, 인간화, 비인간(예를 들어, 인간에서 항원성을 감소시키도록 변형된 뮤린 프레임워크), 또는 합성 프레임워크(예를 들어, 공통 서열)일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분은 약 10-7M 미만, 약 10-8M 미만, 약 10-9M 미만, 약 10-10M 미만, 약 10-11M 미만 또는 약 10-12M 미만의 해리 상수(KD)로 특이적으로 결합할 수 있다. 본 개시내용에 따른 항체의 친화도는 통상적인 기술을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다(예를 들어, 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. (1949) 51:660]; 및 미국 특허 제5,283,173호, 제5,468,614호 또는 이의 등가물 참고).
용어 "키메라 수용체", "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 전체에 걸쳐 상호교환적으로 사용되며, 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 하기에 정의된 바와 같은 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(또한 본 명세서에서 "세포내 신호전달 도메인"으로 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩타이드 작제물을 지칭한다(문헌[Lee et al., Clin. Cancer Res. (2012) 18(10):2780; Jensen et al., Immunol Rev. (2014) 257(1):127]; www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells). 일 실시형태에서, 자극성 분자는 T 세포 수용체 복합체와 회합된 제타 쇄이다. 일 양상에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공자극성 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 공자극성 분자는 또한 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28 또는 이들 분자의 단편일 수 있다. 또 다른 양상에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인 및 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인 및 공자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 대안적으로, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 공자극성 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. CAR은 또한 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 공자극성 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함할 수 있다. 핵산 서열에 의해 암호화되는 CAR의 항원 인식 모이어티는 임의의 계통-특이적 항원-결합 항체 단편을 함유할 수 있다. 항체 단편은 하나 이상의 CDR, 가변 영역(또는 이의 일부), 불변 영역(또는 이의 일부), 또는 이들 중 임의의 것의 조합물을 포함할 수 있다.
용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 반응하여 효과기로 기능함으로써 정의된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에서 정보를 전송함으로써 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 GenBank 수탁 번호 NP_932170, NP_000725 또는 XP_011508447로 제공된 단백질로 정의되거나; 또는 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등의 등가 잔기, 및 "제타 자극성 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극성 도메인" 또는 "TCR-제타 자극성 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 쇄의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로 정의된다.
용어 "유전자 조작된" 또는 "유전자 변형된"은 유전자 조작, 예를 들어, 게놈 편집에 의해 조작되는 세포를 지칭한다. 즉, 세포는 상기 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 이종 서열을 함유한다. 전형적으로, 이종 서열은 핵산 분자를 리포솜을 포함하는 세포 내로 도입하기 위한 벡터 시스템 또는 다른 수단을 통해 도입된다. 이종 핵산 분자는 세포의 게놈 내로 통합될 수 있거나, 예를 들어 플라스미드 형태로 염색체외에 존재할 수 있다. 이 용어는 또한 유전자 조작되고 단리된 CAR 폴리펩타이드를 세포 내로 도입하는 실시형태를 포함한다.
용어 "자가"는 추후에 동일한 개체에게 재도입되는 동일한 개체로부터 유래된 모든 물질을 지칭한다.
용어 "동종이계"는 물질이 도입된 개체와 동일한 종의 다른 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 이상의 개체는 하나 이상의 유전자좌에 있는 유전자가 동일하지 않은 경우 서로 동종이계라고 한다.
용어 "세포 계통"은 공통 조상을 갖고, 동일한 유형의 식별 가능한 세포에서 특정 식별 가능한/기능하는 세포로 발달하는 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 세포 계통은 호흡기, 전립선, 췌장, 유방, 신장, 장, 신경, 골격, 혈관, 간, 조혈, 근육 또는 심장 세포 계통을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
계통-특이적 항원의 유전자 발현 또는 기능과 관련하여 사용될 때 용어 "저해"는 계통-특이적 항원의 유전자 발현 수준 또는 기능의 감소를 지칭하며, 여기서 저해는 유전자 발현 또는 기능에 대한 간섭의 결과이다. 저해는 완전할 수 있으며, 이 경우 검출 가능한 발현이나 기능이 없거나 부분적일 수 있다. 부분 저해는 거의 완전한 저해에서 저해가 거의 없는 것까지의 범위일 수 있다. 특정 표적 세포를 제거함으로써 CAR T 세포는 특정 세포 계통의 전체 발현을 효과적으로 저해할 수 있다.
"계통-특이적 항원이 결핍된" 조혈 세포와 같은 세포는 자연 발생 대응물, 예를 들어, 동일한 유형의 내인성 조혈 세포와 비교할 때 계통-특이적 항원의 발현 수준이 실질적으로 감소된 세포 또는 계통-특이적 항원을 발현하지 않는 세포, 즉 FACS와 같은 일상적인 분석에 의해 검출할 수 없는 세포를 지칭한다. 일부 예에서, "항원이 결핍된" 세포의 계통-특이적 항원의 발현 수준은 자연 발생 대응물의 동일한 계통-특이적 항원의 발현 수준의 약 40% 미만(예를 들어, 30%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 그 미만)일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 +/- 5%의 특정 값을 지칭한다. 예를 들어, 약 40%의 발현 수준은 35% 내지 45% 사이의 임의의 발현양을 포함할 수 있다.
계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는 작용제
본 개시내용의 양상은 예를 들어, 표적 암 세포 상의 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는 작용제(예를 들어, CD33을 표적으로 하는 작용제, 예를 들어, 여기서 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함함)를 제공한다. 이러한 작용제는 계통-특이적 세포-표면 항원에 결합하고, 이를 표적으로 하는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항원-결합 단편은 계통-특이적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체(scFv)일 수 있다.
A. 계통-특이적 세포-표면 항원
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "계통-특이적 세포-표면 항원" 및 "세포-표면 계통-특이적 항원"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 세포의 표면에 충분히 존재하고, 하나 이상의 세포 계통(들) 집단과 회합되는 임의의 항원을 지칭한다. 예를 들어, 항원은 세포 계통(들)의 하나 이상의 집단에 존재하고, 다른 세포 집단의 세포-표면 상에는 부재(또는 감소된 수준으로 존재)할 수 있다.
일반적으로, 계통-특이적 세포-표면 항원은 항원 및/또는 항원을 제시하는 세포 집단이 숙주 유기체의 생존 및/또는 발달에 필요한지 여부와 같은 다수의 인자에 기초하여 분류될 수 있다. 계통-특이적 항원의 예시적인 유형의 요약을 하기 표 1에 제공한다. 또한 도 1을 참고하기 바란다.
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표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 유형 0 계통-특이적 세포-표면 항원은 조직 항상성과 생존에 필수적이고, 유형 0 계통-특이적 세포-표면 항원을 보유하는 세포 유형이 또한 대상체의 생존을 위해 필요할 수 있다. 따라서, 항상성 및 생존에서 유형 0 계통-특이적 세포-표면 항원 또는 유형 0 계통-특이적 세포-표면 항원을 보유하는 세포의 중요성을 고려할 때 이러한 카테고리의 항원을 표적으로 하는 것은 종래의 CAR T 세포 면역요법을 사용하는 것이 도전적일 수 있는데, 그 이유는 이러한 항원 및 이러한 항원을 보유하는 세포의 저해 또는 제거가 대상체의 생존에 해로울 수 있기 때문이다. 결과적으로, 계통-특이적 세포-표면 항원(예컨대, 유형 0 계통-특이적 항원) 및/또는 이러한 항원을 보유하는 세포 유형은 생존을 위해 필요할 수 있고, 예를 들어, 그것은 대상체에서 중요한 필요한 기능을 수행할 수 있기 때문에, 이러한 유형의 계통-특이적 항원은 CAR T 세포 기반 면역요법에 대한 불량한 표적이 될 수 있다.
유형 0 항원과 대조적으로, 유형 1 세포 표면 계통-특이적 항원 및 유형 1 세포 표면 계통-특이적 항원을 보유하는 세포는 조직 항상성 또는 대상체의 생존에 필요하지 않다. 유형 1 세포 표면 계통-특이적 항원을 표적으로 하는 것은 대상체에게 해로운 결과를 초래할 가능성이 없다. 예를 들어, 정상 형질 세포와 다발성 골수종(MM) 세포 모두에서 고유하게 발현되는 유형 1 항원인 CD307을 표적으로 하도록 조작된 CAR T 세포는 두 세포 유형 모두의 제거로 이어질 것이다(도 2)(Elkins et al., Mol Cancer Ther. 10:2222 (2012)). 그러나, 형질 세포 계통은 유기체의 생존을 위해 소모될 수 있기 때문에, CD307 및 다른 유형 1 계통-특이적 항원은 CAR T 세포 기반 면역 요법에 적합한 항원이다. 유형 1 클래스의 계통-특이적 항원은 난소, 고환, 전립선, 유방, 자궁내막 및 췌장을 포함하는 매우 다양한 조직에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 유형 1 항원인 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적으로 한다.
유형 2 항원을 표적으로 하는 것은 유형 1 항원에 비해 상당한 어려움을 나타낸다. 유형 2 항원은 하기를 특징으로 하는 것이다: (1) 항원이 유기체의 생존을 위해 필수적이 아니고(즉, 생존을 위해 필요하지 않음), (2) 항원을 보유하는 세포 계통이 유기체의 생존에 필수 불가결함(즉, 특정 세포 계통이 생존을 위해 필요함). 예를 들어, CD33은 정상 골수 세포뿐만 아니라 급성 골수성 백혈병(AML) 세포 모두에서 발현되는 유형 2 항원이다(Dohner et al., NEJM 373:1136 (2015)). 결과적으로, CD33 항원을 표적으로 하도록 조작된 CAR T 세포는 정상 세포뿐만 아니라 AML 세포 둘 다를 사멸시킬 수 있으며, 이는 대상체의 생존과 양립할 수 없을 수 있다(도 3). 일부 실시형태에서, 작용제는 유형 2 항원인 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적으로 한다.
매우 다양한 항원이 본 개시내용의 방법 및 조성물에 의해 표적화될 수 있다. 이들 항원에 대한 단클론성 항체는 상업적으로 구입하거나, 동물을 관심대상 항원으로 면역화한 후 통상적인 단클론성 항체 방법론, 예를 들어, 상기에 논의된 바와 같은 문헌[Kohler and Milstein, Nature (1975) 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 표준 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 항체 또는 항체를 암호화하는 핵산은 임의의 표준 DNA 또는 단백질 서열결정 기술을 사용하여 서열결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 세포를 사용하여 표적화되는 세포-표면 계통-특이적 항원은 백혈구의 세포-표면 계통-특이적 항원 또는 백혈구의 하위집단이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 계통-특이적 항원은 골수 세포와 회합된 항원이다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원은 분화 항원(CD)의 클러스터이다. CD 항원의 예는 비제한적으로 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD16, CD16b, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32a, CD32b, CD32c, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RO, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD60a, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64a, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66F, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD75S, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85A, CD85C, CD85D, CD85E, CD85F, CD85G, CD85H, CD85I, CD85J, CD85K, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD99R, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CD127, CD129, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CD150, CD152, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156a, CD156b, CD156c, CD157, CD158b1, CD158b2, CD158d, CD158e1/e2, CD158f, CD158g, CD158h, CD158i, CD158j, CD158k, CD159a, CD159c, CD160, CD161, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167a, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179a, CD179b, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CDw198, CDw199, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210a, CDw210b, CD212, CD213a1, CD213a2, CD215, CD217, CD218a, CD218b, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235b, CD236, CD236R, CD238, CD239, CD240, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245, CD246, CD247, CD248, CD249, CD252, CD253, CD254, CD256, CD257, CD258, CD261, CD262, CD263, CD264, CD265, CD266, CD267, CD268, CD269, CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD286, CD288, CD289, CD290, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300a, CD300c, CD300e, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, 306, CD307a, CD307b, CD307c, D307d, CD307e, CD309, CD312, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD324, CD325, CD326, CD327, CD328, CD329, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD339, CD340, CD344, CD349, CD350, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD359, CD360, CD361, CD362 및 CD363을 포함한다. 또한 www.bdbiosciences.com/documents/BD_Reagents_CDMarkerHuman_Poster.pdf를 참고하기 바란다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원은 CD19, CD20, CD11, CD123, CD56, CD34, CD14, CD33, CD66b, CD41, CD61, CD62, CD235a, CD146, CD326, LMP2, CD22, CD52, CD10, CD3/TCR, CD79/BCR, 및 CD26이다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원은 CD33이다.
대안적으로 또는 추가로, 세포-표면 계통-특이적 항원은 암 항원, 예를 들어, 암 세포에 차별적으로 존재하는 세포-표면 계통-특이적 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 항원은 조직 또는 세포 계통에 특이적인 항원이다. 특정 유형의 암과 연관된 세포-표면 계통-특이적 항원의 예는 비제한적으로 CD20, CD22(비호지킨 림프종, B 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL)), CD52(B 세포 CLL), CD33(급성 골수성 백혈병(AML)), CD10(gp100)(공통(프리(pre)-B) 급성 림프구성 백혈병 및 악성 흑색종), CD3/T 세포 수용체(TCR)(T-세포 림프종 및 백혈병), CD79/B-세포 수용체(BCR)(B-세포 림프종 및 백혈병), CD26(상피 및 림프 악성종양), 인간 백혈구 항원(HLA)-DR, HLA-DP 및 HLA-DQ(림프 악성종양), RCAS1(부인과 암종, 담도 선암종 및 췌장의 관 선암종)뿐만 아니라 전립선 특이적 막 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 항원 CD33은 AML 세포와 회합된다.
B. 항원-결합 단편
임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, CD33에 결합함)이 본 명세서에 기재된 바와 같은 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는 작용제를 작제하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체 또는 항원-결합 단편은 통상적인 방법, 예를 들어 하이브리도마 기술 또는 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
예를 들어, 관심대상 계통-특이적 항원에 특이적인 항체는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. KLH와 같은 담체 단백질에 커플링될 수 있는 계통-특이적 항원은 숙주 동물을 면역화하여 그 복합체에 결합하는 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있다. 숙주 동물의 면역화 경로 및 일정은 일반적으로 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 항체 자극 및 생산을 위한 확립되고 통상적인 기술과 일치한다. 마우스, 인간화 및 인간 항체의 생산을 위한 일반적인 기술은 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있다. 인간 또는 이로부터의 항체 생산 세포를 포함하는 임의의 포유동물 대상체는 인간 하이브리도마 세포주를 포함하는 포유동물의 생산을 위한 기초로서 작용하도록 조작될 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 숙주 동물은 본 명세서에 기재된 것을 포함하여 일정량의 면역원으로 복강내, 근육내, 경구, 피하, 발바닥내(intraplantar) 및/또는 피부내로 접종된다.
하이브리도마는 문헌[Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497]의 일반적인 체세포 혼성화 기술을 사용하거나 또는 문헌[Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)]에 의해서 변형된 바와 같이 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 솔크 연구소 세포 분배 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center)(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)를 포함하나 이에 제한되지 않는 입수 가능한 골수종 세포주가 혼성화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 이 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합원을 사용하거나, 또는 당업자에게 널리 공지된 전기적 수단을 사용하여 골수종 세포 및 림프성 세포를 융합시키는 것을 포함한다. 융합 후, 세포는 융합 배지로부터 분리되고, 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지와 같은 선택적 성장 배지에서 성장하여 혼성화되지 않은 모세포를 제거한다. 혈청이 있거나 없는 본 명세서에 기재된 임의의 배지는 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는 데 사용할 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B 세포를 사용하여 본 명세서에 기재된 TCR-유사 단클론성 항체를 생산할 수 있다. 원하는 경우 하이브리도마를 확장시키고, 서브클로닝하고, 상청액을 기존의 면역검정 절차(예를 들어, 방사선면역검정, 효소 면역검정 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정한다.
항체의 공급원으로 사용될 수 있는 하이브리도마는 계통-특이적 항원에 결합할 수 있는 단클론성 항체를 생성시키는 모 하이브리도마의 자손 세포인 모든 유도체를 포함한다. 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 성장할 수 있다. 단클론성 항체는 원하는 경우 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 존재하는 경우 원하지 않는 활성은 예를 들어, 고체상에 부착된 면역원으로 제조된 흡착제 위에 제제를 전개시키고, 면역원에서 원하는 항체를 용리시키거나 방출시킴으로써 제거될 수 있다. 이작용성 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(라이신 잔기를 통한), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl, 또는 R1N=C=NR(여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)를 사용한 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 저해제에 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편 또는 표적 항원으로의 숙주 동물의 면역은 항체의 집단(예를 들어, 단일클론 항체)을 생성시킬 수 있다.
원하는 경우, 관심대상 항체(예를 들어, 하이브리도마에 의해 생산됨)의 서열을 서열결정하고, 이어서 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현 또는 증식을 위해 벡터에 클로닝할 수 있다. 관심대상 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포의 벡터에서 유지될 수 있고, 이후 숙주 세포는 확장되고, 향후 사용을 위해 동결될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체를 "인간화"하거나 항체의 친화도(친화도 성숙) 또는 기타 특성을 개선시키기 위한 유전자 조작을 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우, 불변 영역은 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 더 유사하도록 조작될 수 있다. 계통-특이적 항원에 대한 더 큰 친화도를 얻기 위해 항체 서열을 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 변화가 항체에 대해 이루어질 수 있고 여전히 표적 항원에 대한 그의 결합 특이성을 유지할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
다른 실시형태에서, 완전 인간 항체는 특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수 가능한 마우스를 사용하여 얻을 수 있다. 보다 바람직한(예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 보다 강력한 면역 반응을 생성하도록 설계된 트랜스제닉 동물이 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 암젠사(Amgen, Inc.)(미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)의 Xenomouse™ 및 메다렉스사(Medarex, Inc.)(미국 뉴저지주 프린스톤 소재)의 HuMAb-Mouse™ 및 TC Mouse™이다. 또 다른 대안에서, 항체는 파지 디스플레이 또는 효모 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 문헌[Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455] 참고. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553)은 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산하는 데 사용될 수 있다.
온전한 항체(전장 항체)의 항원-결합 단편은 일상적인 방법을 통해 제조할 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있고, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 다이설파이드 브리지를 환원시켜 생성될 수 있다.
인간화 항체, 키메라 항체, 단일-쇄 항체 및 이중특이적 항체와 같은 유전자 조작된 항체는 예를 들어, 통상적인 재조합 기술을 통해 생산될 수 있다. 일례에서, 표적 항원에 특이적인 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 (예를 들어, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열결정될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 하나 이상의 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 그 다음 이것은 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 얻는다. 예를 들어, PCT 공개 제WO 87/04462호 참고. 이어서 다음 DNA는 예를 들어, 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호 서열을 대체(Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851)함으로써 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호 서열의 전부 또는 부분을 면역글로불린 암호 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 방식으로 표적 항원의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "혼성체" 항체와 같은 유전자 조작된 항체가 제조될 수 있다.
"키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; 및 Takeda et al. (1984) Nature 314:452]을 참조한다.
인간화 항체를 작제하는 방법은 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)] 참고. 일례에서, 모 비-인간 항체의 VH 및 VL의 가변 영역은 당업계에 공지된 방법에 따라 3차원 분자 모델링 분석에 적용된다. 다음으로, 동일한 분자 모델링 분석을 사용하여 올바른 CDR 구조의 형성에 중요할 것으로 예측되는 프레임워크 아미노산 잔기를 식별한다. 병행하여, 모 비-인간 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 갖는 인간 VH 및 VL 쇄는 검색 질의로서 모 VH 및 VL 서열을 사용하여 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 식별된다. 그런 다음 인간 VH 및 VL 수용체 유전자가 선택된다.
선택된 인간 억셉터 유전자 내의 CDR 영역은 모 비인간 항체 또는 이의 기능적 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요한 경우, CDR 영역과의 상호작용에 중요할 것으로 예측되는 모 쇄의 프레임워크 영역 내의 잔기(상기 설명 참조)가 인간 억셉터 유전자의 상응하는 잔기를 대체하기 위해 사용될 수 있다.
단일-쇄 항체는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 연결하여 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 가요성 링커가 2개의 가변 영역 사이에 혼입된다. 대안적으로, 단일 쇄 항체의 생산에 대해 기술된 기술(미국 특허 제4,946,778호 및 제4,704,692호)을 적용하여 파지 또는 효모 scFv 라이브러리를 생성할 수 있고, 계통-특이적 항원에 특이적인 scFv 클론을 하기 일상적인 절차에 따라 라이브러리로부터 식별할 수 있다. 양성 클론은 계통-특이적 항원에 결합하는 클론을 식별하기 위해 추가 스크리닝될 수 있다.
일부 경우에, 관심대상 계통-특이적 항원은 CD33이고, 항원-결합 단편은 CD33, 예를 들어, 인간 CD33에 특이적으로 결합한다. 항-인간 CD33 항체의 예시적인 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 및 핵산 서열을 하기에 제공한다. CDR 서열은 볼드체로 표시되고 아미노산 서열에 밑줄이 그어져 있다.
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본 명세서에 기재된 바와 같은 CD33을 표적으로 하는 작용제를 작제하는 데 사용하기 위한 항-CD33 항체 결합 단편은 서열번호 12 및 서열번호 13의 것과 동일한 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 영역을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 프레임워크 영역 중 하나 이상에 아미노산 잔기 변이를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항-CD33 항체 단편은 서열번호 12와 적어도 70%의 서열 동일성(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과)을 공유하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 13과 적어도 70%의 서열 동일성(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과)을 공유하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
두 아미노산 서열의 "백분율 동일성"은 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된, 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어 길이=3으로 수행되어 본 개시내용의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, Gapped BLAST를 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다.
C. 키메라 수용체를 발현하는 면역세포
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적으로 하는 작용제는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포이며, 이것은 계통-특이적 항원(예를 들어, CD33)에 결합할 수 있는 항원-결합 단편(예를 들어, 단일-쇄 항체)를 포함한다. 키메라 수용체의 항원-결합 단편에 의한 세포 표면 상에 계통-특이적 항원을 갖는 표적 세포(예를 들어, 암 세포)의 인식은 키메라 수용체의 활성화 신호를 신호전달 도메인(들)(예를 들어, 공자극성 신호전달 도메인 및/또는 세포질 신호전달 도메인)에 전달하는데, 이는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포에서 효과기 기능을 활성화할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 키메라 수용체는 숙주 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고, 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 비-자연 발생 분자를 지칭한다. 일반적으로, 키메라 수용체는 상이한 분자로부터 유래된 적어도 2개의 도메인을 포함한다. 본 명세서에 기재된 항원-결합 단편에 더하여, 키메라 수용체는 힌지 도메인, 막관통 도메인, 적어도 하나의 공자극성 도메인 및 세포질 신호전달 도메인 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 N 말단에서부터 C 말단으로, 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 적어도 하나의 공자극성 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체는 항원-결합 단편과 막관통 도메인 사이에 위치할 수 있는 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 일반적으로 단백질의 두 도메인 사이에서 발견되는 아미노산 분절이며, 단백질의 유연성 및 서로에 대한 도메인 중 하나 또는 둘 다의 이동을 허용할 수 있다. 키메라 수용체의 또 다른 도메인에 대한 항원-결합 단편의 이러한 유연성 및 움직임을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10 내지 200개 아미노산, 예를 들어 15 내지 150개 아미노산, 20 내지 100개 아미노산, 또는 30 내지 60개 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 약 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200개 아미노산 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인이다. 힌지 도메인을 포함하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인이 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이고, 키메라 수용체에 유연성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 또는 CD28 α를 갖는다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 일부, 예를 들어, CD8α 또는 CD28α의 힌지 도메인의 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30, 35, 또는 40개)의 연속 아미노산을 함유하는 단편이다.
항체, 예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체의 힌지 도메인이 또한 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 것이고, 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 힌지 영역 및 IgG1 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 힌지 영역 및 IgG1 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다.
또한 본 개시내용의 범위 내에 비-자연 발생 펩타이드인 힌지 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 있다. 일부 실시형태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이의 힌지 도메인은 펩타이드 링커, 예컨대, (GlyxSer)n 링커(서열번호 74)(여기서 x 및 n은 독립적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 초과를 포함하는 3과 12 사이의 정수일 수 있음)이다.
본 명세서에 기재된 키메라 수용체의 힌지 도메인에서 사용될 수 있는 추가의 펩타이드 링커는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Wriggers et al. Current Trends in Peptide Science (2005) 80(6): 736-746] 및 PCT 공개 제WO 2012/088461호 참고).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 수용체에 사용하기 위한 막관통 도메인은 당업계에 공지된 임의의 형태일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정적인 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 키메라 수용체에 사용하기에 적합한 막관통 도메인은 자연 발생 단백질로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성, 비-자연 발생 단백질 단편, 예를 들어, 세포막에서 열역학적으로 안정적인 소수성 단백질 단편일 수 있다.
막관통 도메인은 막관통 도메인이 막을 가로질러 만드는 통과 횟수 및 단백질의 배향을 포함하여 막관통 도메인 토폴로지에 기초하여 분류된다. 예를 들어, 단일-통과 막 단백질은 세포막을 한 번 통과하고 다중 통과 막 단백질은 적어도 두 번(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 이상) 세포막을 통과한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 단일-통과 막관통 도메인이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 키메라 수용체의 N 말단을 세포의 세포외 측에 그리고 키메라 수용체의 C 말단을 세포의 세포내 측에 배향시키는 단일-통과 막관통 도메인이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 단일 통과 막관통 단백질로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α를 갖는다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28을 갖는다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 ICOS를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체는 하나 이상의 공자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "공자극성 신호전달 도메인"은 효과기 기능과 같은 면역 반응을 유도하기 위해 세포 내에서 신호 전달을 매개하는 단백질의 적어도 일부를 지칭한다. 본 명세서에 기술된 키메라 수용체의 공자극성 신호전달 도메인은 신호를 전달하고, 면역세포, 예컨대, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구에 의해서 매개된 반응을 조절하는 공자극성 단백질로부터의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 하나 초과(적어도 2, 3, 4 또는 그 초과)의 공자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 상이한 공자극성 단백질로부터 얻은 1개 초과의 공자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 공자극성 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
일반적으로, 다수의 면역 세포는 항원-특이적 신호의 자극 외에 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진하고 세포의 효과기 기능을 활성화하기 위해 공자극을 필요로 한다. 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 공자극성 신호전달 도메인의 활성화는 세포가 사이토카인의 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키도록 유도할 수 있다. 임의의 공자극성 단백질의 공자극성 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서의 사용에 상용성일 수 있다. 공자극성 신호전달 도메인의 유형(들)은 키메라 수용체가 발현될 면역 세포의 유형(예를 들어, 1차 T 세포, T 세포주, NK 세포주) 및 원하는 면역 효과기 기능(예를 들어, 세포독성)과 같은 인자에 따라 선택된다. 키메라 수용체에 사용하기 위한 공자극성 신호전달 도메인의 예는 비제한적으로, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, Cd40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3을 포함하는, 공자극성 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 공자극성 도메인은 4-1BB, CD28, 또는 ICOS로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 공자극성 도메인은 CD28로부터 유래되고, 키메라 수용체는 4-1BB 또는 ICOS로부터의 제2 공자극성 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 공자극성 도메인은 하나 초과의 공자극성 도메인 또는 하나 초과의 공자극성 도메인의 일부를 포함하는 융합 도메인이다. 일부 실시형태에서, 공자극성 도메인은 CD28 및 ICOS로부터의 공자극성 도메인의 융합이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체는 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 임의의 세포질 신호전달 도메인이 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 세포질 신호전달 도메인은 세포의 효과기 기능(예를 들어, 세포독성)을 유도하는 것과 같은 세포 반응을 자극하기 위해서, 세포외 리간드-결합 도메인과 이의 리간드의 상호작용과 같은 신호를 전달한다.
당업자에게 명백한 바와 같이, T 세포 활성화에 관여하는 인자는 세포질 신호전달 도메인의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)의 인산화이다. 당업계에 공지된 임의의 ITAM-함유 도메인을 사용하여 본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 작제할 수 있다. 일반적으로, ITAM 모티프는 6 내지 8개의 아미노산으로 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개의 반복부를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 x는 독립적으로 임의의 아미노산이며, 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 생산한다. 일부 실시형태에서, 세포질 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
예시적인 키메라 수용체를 하기 표 2 및 표 3에 제공한다.
Figure pct00003
키메라 수용체의 작제에 대한 예시적인 성분의 핵산 서열을 하기에 제공한다.
Figure pct00004
일부 실시형태에서, 핵산 서열은 CD33에 결합하고, 서열 12의 CDR과 동일한 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13에서의 CDR과 동일한 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 서열번호 12에 의해 제공되는 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13에 의해 제공되는 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 적어도 막관통 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 힌지 도메인 및/또는 공자극성 신호전달 도메인을 더 포함한다.
표 3은 본 명세서에 기재된 예시적인 키메라 수용체를 제공한다. 예시적인 작제물은 N-말단에서부터 C-말단으로, 항원-결합 단편, 막관통 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 갖는다. 일부 예에서, 키메라 수용체는 항원-결합 단편과 막관통 도메인 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 키메라 수용체는 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이에 위치할 수 있는 하나 이상의 공자극성 도메인을 추가로 포함한다.
Figure pct00005
상기 표 3에 열거된 예시적인 키메라 수용체의 아미노산 서열을 하기에 제공한다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
상기 표 3에 열거된 예시적인 키메라 수용체의 핵산 서열을 하기에 제공한다:
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 수용체는 재조합 기술과 같은 일상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에서 키메라 수용체를 제조하는 방법은 항원-결합 단편 및 선택적으로, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 적어도 하나의 공자극성 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체의 도메인 각각을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 생성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체의 각각의 성분을 암호화하는 핵산을 재조합 기술을 사용하여 함께 연결한다.
키메라 수용체의 성분 각각의 서열은 일상적인 기술, 예를 들어 당업계에 공지된 다양한 공급원 중 임의의 하나로부터의 PCR 증폭을 통해 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체의 성분 중 하나 이상의 서열은 인간 세포로부터 얻어진다. 대안적으로, 키메라 수용체의 하나 이상의 성분의 서열이 합성될 수 있다. 각각의 성분(예를 들어, 도메인)의 서열은 PCR 증폭 또는 결찰과 같은 방법을 사용하여 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 형성하기 위해 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 펩타이드 링커를 암호화하는 핵산 서열을 사용하여) 연결될 수 있다. 대안적으로, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산이 합성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 DNA이다. 다른 실시형태에서, 핵산은 RNA이다.
성분 각각의 서열을 연결하기 전 또는 후에, 키메라 수용체의 성분(예를 들어, 항원-결합 단편 등) 중 하나 이상 내의 하나 이상의 잔기의 돌연변이. 일부 실시형태에서, 표적(예를 들어, 표적 항원에 대한 항원-결합 단편)에 대한 성분의 친화도를 조절(증가 또는 감소)하고/하거나 성분의 활성을 조절하도록 키메라 수용체의 성분에서 하나 이상의 돌연변이가 만들어질 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 수용체는 통상적인 기술을 통한 발현을 위해 적합한 면역 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 1차 T 세포 또는 T 세포주와 같은 T 세포이다. 대안적으로, 면역 세포는 확립된 NK 세포주(예를 들어, NK-92 세포)와 같은 NK 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CD8(CD8+) 또는 CD8 및 CD4 (CD8+/CD4+)를 발현하는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 확립된 T 세포주의 T 세포, 예를 들어 293T 세포 또는 Jurkat 세포이다.
1차 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 조직, 예컨대, 비장, 림프절, 흉선 또는 종양 조직과 같은 조직과 같은 임의의 공급원에서 얻을 수 있다. 원하는 유형의 면역 세포를 얻기에 적합한 공급원은 당업자에게 자명할 것이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포의 집단은 환자로부터 얻은 골수 또는 PBMC와 같은 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포의 집단은 건강한 공여자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포가 후속적으로 투여될 대상체로부터 얻어진다. 세포가 얻어진 동일한 대상에게 투여되는 면역 세포를 자가 세포라고 하는 반면, 세포가 투여될 대상체가 아닌 대상체로부터 얻은 면역 세포를 동종이계 세포라고 한다.
원하는 숙주 세포의 유형은 세포를 자극 분자와 공동 인큐베이션시킴으로써 얻은 세포 집단 내에서 확장될 수 있으며, 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체가 T 세포의 확장에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 수용체 작제물을 발현하는 면역 세포를 작제하기 위해, 키메라 수용체 작제물의 안정하거나 일시적인 발현을 위한 발현 벡터가 본 명세서에 기술된 바와 같은 통상적인 방법을 통해 작제될 수 있고, 면역 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산은 적합한 프로모터에 작동 가능한 링키지로 바이러스 벡터와 같은 적합한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 핵산 및 벡터는 적합한 조건 하에서 제한 효소와 접촉되어 서로 쌍을 이루고, 리가아제와 연결될 수 있는 각각의 분자에 상보적인 단부를 생성할 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산의 말단에 결찰될 수 있다. 합성 링커는 벡터의 특정 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터/플라스미드/바이러스 벡터의 선택은 키메라 수용체의 발현을 위한 숙주 세포의 유형에 따라 다르지만, 진핵 세포에서 통합 및 복제에 적합해야 한다.
비제한적으로 사이토메갈로바이러스(CMV) 중간 초기 프로모터, 바이러스 LTR, 예컨대, 라우스 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) LTR, 골수증식성 육종 바이러스(MPSV) LTR, 비장 초점 형성 바이러스(SFFV) LTR, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 단순 포진 tk 바이러스 프로모터, EF1-α 인트론이 있거나 없는 신장 인자 1-알파(EF1-α) 프로모터를 포함하는 본 명세서에 기재된 키메라 수용체의 발현을 위해서 다양한 프로모터가 사용될 수 있다. 키메라 수용체의 발현을 위한 추가 프로모터는 면역 세포에서 임의의 구성적으로 활성인 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 발현이 면역 세포 내에서 조절될 수 있도록 임의의 조절 가능한 프로모터가 사용될 수 있다.
추가로, 벡터는 예를 들어, 다음 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다: 숙주 세포에서 안정적이거나 일시적인 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자와 같은 선택 가능한 마커 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 극 초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40의 전사 종결 및 RNA 처리 신호; α-글로빈 또는 β-글로빈과 같은 고발현 유전자의 mRNA 안정성 및 번역 효율을 위한 5' 및 3' 미번역 영역; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제 기점 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위(IRES), 다양한 다중 복제 부위; 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터; 촉발될 때 벡터를 보유하는 세포를 사멸시키는 "자살 스위치" 또는 "자살 유전자"(예를 들어, HSV 티미딘 키나제, 유도성 카스파제, 예컨대, iCasp9), 키메라 수용체의 발현을 평가하기 위한 리포터 유전자. 하기 섹션 VI를 참고. 트랜스진을 함유하는 벡터를 생산하기에 적합한 벡터 및 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 입수 가능하다. 키메라 수용체의 발현을 위한 벡터의 제조의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제US2014/0106449호에서 찾아볼 수 있으며, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체 작제물 또는 상기 키메라 수용체를 암호화하는 핵산은 DNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체 작제물 또는 상기 키메라 수용체를 암호화하는 핵산은 DNA 벡터이고, 면역 세포에 전기천공될 수 있다(예를 들어, 문헌[Till, et al. Blood (2012) 119(17): 3940-3950] 참고). 일부 실시형태에서, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산은 면역 세포에 전기천공될 수 있는 RNA 분자이다.
본 명세서에 기재된 키메라 수용체 작제물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 임의의 벡터가 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 벡터는 적합한 방법에 의해 숙주 면역 세포와 같은 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 면역 세포에 벡터를 전달하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, DNA, RNA 또는 트랜스포존 전기천공법, DNA, RNA 또는 트랜스포존을 전달하기 위한 리포솜 또는 나노입자와 같은 형질감염 시약; 기계적 변형에 의한 DNA, RNA, 또는 트랜스포존 또는 단백질의 전달(예를 들어, 문헌[Sharei et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2013) 110(6): 2082-2087) 참조); 또는 바이러스 형질도입을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체의 발현을 위한 벡터는 바이러스 형질도입에 의해 숙주 세포에 전달된다. 전달을 위한 예시적인 바이러스 방법은 재조합 레트로바이러스(예를 들어, PCT 공개 제WO 90/07936호; 제WO 94/03622호; 제WO 93/25698호; 제WO 93/25234호; 제WO 93/11230호; 제WO 93/10218호; 제WO 91/02805호; 미국 특허 제5,219,740호 및 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 및 유럽 특허 제0 345 242호), 알파바이러스-기반 벡터 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개 제WO 94/12649호, 제WO 93/03769호; 제WO 93/19191호; 제WO 94/28938호; 제WO 95/11984호 및 제WO 95/00655호)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체의 발현을 위한 벡터는 레트로바이러스이다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체의 발현을 위한 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체의 발현을 위한 벡터는 아데노-연관 바이러스이다.
키메라 수용체를 암호화하는 벡터가 바이러스 벡터를 사용하여 숙주 세포에 도입되는 예에서, 면역 세포를 감염시킬 수 있고, 벡터를 운반할 수 있는 바이러스 입자는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있고, 예를 들어, PCT 출원 제WO 1991/002805A2호, 제WO 1998/009271 A1호 및 미국 특허 제6,194,191호에서 찾아볼 수 있다. 바이러스 입자는 세포 배양 상청액으로부터 수거되고, 바이러스 입자를 면역 세포와 접촉시키기 전에 단리 및/또는 정제될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 수용체를 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법은 생체외에서 면역 세포를 활성화 및/또는 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포를 활성화시키는 것은 숙주 세포를 세포가 효과기 기능(예를 들어, 세포독성)을 수행할 수 있는 활성화 상태로 자극하는 것을 의미한다. 숙주 세포를 활성화시키는 방법은 키메라 수용체의 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 숙주 세포를 확장하는 것은 키메라 수용체를 발현하는 세포의 수를 증가시키는 임의의 방법을 수반할 수 있으며, 예를 들어, 숙주 세포가 증식하도록 하거나 숙주 세포가 증식하도록 자극할 수 있다. 숙주 세포의 확장을 자극하는 방법은 키메라 수용체의 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 의존할 것이며, 당업자에게 자명할 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 수용체를 발현하는 숙주 세포는 대상체에 투여하기 전에 생체외에서 활성화 및/또는 확장된다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적으로 하는 작용제는 항체-약물 접합체(conjugate: ADC)이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 용어 "항체-약물 접합체"는 "면역독소"와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 독소 또는 약물 분자에 접합된 항체(또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 융합 분자를 지칭한다. 상응하는 항원에 대한 항체의 결합은 독소 또는 약물 분자를 이의 세포 표면 상에 항원을 제시하는 세포(예를 들어, 표적 세포)로 전달하여 표적 세포의 사멸을 초래한다.
일부 실시형태에서, 작용제는 항체-약물 접합체이다. 일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 항원-결합 단편 및 표적 세포에서 세포독성을 유도하는 독소 또는 약물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 유형 2 항원을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 CD33 또는 CD19를 표적으로 한다.
일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체의 항원-결합 단편은 서열 12에 의해 제공되는 중쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 CDR 및 서열번호 13에 의해 제공되는 경쇄 가변 영역과 동일한 경쇄 CDR을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체의 항원-결합 단편은 서열 12에 의해 제공되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13에 의해 제공되는 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는다.
항체-약물 접합체에 사용하기에 상용성인 독소 또는 약물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 문헌[Peters et al. Biosci. Rep.(2015) 35(4): e00225; Beck et al. Nature Reviews Drug Discovery (2017) 16:315-337; Marin-Acevedo et al. J. Hematol. Oncol.(2018)11: 8; Elgundi et al. Advanced Drug Delivery Reviews (2017) 122: 2-19] 참고.
일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체는 항체 및 약물 분자를 부착하는 링커(예를 들어, 펩타이드 링커, 예컨대, 절단 가능한 링커)를 추가로 포함할 수 있다. 항체-약물 접합체의 예는 비제한적으로 브렌툭시맙 베도틴, 글렘바투무맙 베도틴/CDX-011, 데파툭시주맙 바포도틴/ABT-414, PSMA ADC, 폴라투주맙 베도틴/RG7596/DCDS4501A, 데닌투주맙 마포도틴/SGN-CD19A, AGS-16C3F, CDX-014, RG7841/DLYE5953A, RG7882/DMUC406A, RG7986/DCDS0780A, SGN-LIV1A, 엔포르투맙 베도틴/ASG-22ME, AG-15ME, AGS67E, 텔리소투주맙 베도틴/ABBV-399, ABBV-221, ABBV-085, GSK-2857916, 티소투맙 베도틴/HuMax-TF-ADC, HuMax-Axl-ADC, 피나투주맙 베도틴/RG7593/DCDT2980S, 리파스투주맙 베도틴/RG7599/DNIB0600A, 인두사투맙 베도틴/MLN-0264/TAK-264, 반도투주맙 베도틴/RG7450/DSTP3086S, 소피투주맙 베도틴/RG7458/DMUC5754A, RG7600/DMOT4039A, RG7336/DEDN6526A, ME1547, PF-06263507/ADC 5T4, 트라스투주맙 엠탄신/T-DM1, 미르베툭시맙 소라브탄신/IMGN853, 콜툭시맙 라브탄신/SAR3419, 나라툭시맙 엠탄신/IMGN529, 인다툭시맙 라브탄신/BT-062, 아네투맙 라브탄신/BAY 94-9343, SAR408701, SAR428926, AMG 224, PCA062, HKT288, LY3076226, SAR566658, 로보투주맙 머탄신/IMGN901, 칸투주맙 머탄신/SB-408075, 칸투주맙 라브탄신/IMGN242, 라프리툭시맙 엠탄신/IMGN289, IMGN388, 비바투주맙 머탄신, AVE9633, BIIB015, MLN2704, AMG 172, AMG 595, LOP 628, 바다스툭시맙 탈리린/SGN-CD33A, SGN-CD70A, SGN-CD19B, SGN-CD123A, SGN-CD352A, 로발피투주맙 테시린/SC16LD6.5, SC-002, SC-003, ADCT-301/HuMax-TAC-PBD, ADCT-402, MEDI3726/ADC-401, IMGN779, IMGN632, 젬투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조카미신/CMC-544, PF-06647263, CMD-193, CMB-401, 트라스투주맙 두오카르마진/SYD985, BMS-936561/MDX-1203, 사시투주맙 고비테칸/IMMU-132, 라베투주맙 고비테칸/IMMU-130, DS-8201a, U3-1402, 밀라투주맙 독소루비신/IMMU-110/hLL1-DOX, BMS-986148, RC48-ADC/허투주맙-vc-MMAE, PF-06647020, PF-06650808, PF-06664178/RN927C, 루파투맙 아마도틴/BAY1129980, 아프루투맙 익사도틴/BAY1187982, ARX788, AGS62P1, XMT-1522, AbGn-107, MEDI4276, DSTA4637S/RG7861을 포함한다. 일례에서, 항체-약물 접합체는 젬투주맙 오조가마이신이다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질의 에피토프에 대한 항체-약물 접합체의 결합은 항체-약물 접합체의 내재화를 유도하고, 약물(또는 독소)이 세포내로 방출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질의 에피토프에 대한 항체-약물 접합체의 결합은 독소 또는 약물의 내재화를 유도하여, 독소 또는 약물이 계통-특이적 단백질을 발현하는 세포(표적 세포)를 사멸시키게 한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 단백질의 에피토프에 대한 항체-약물 접합체의 결합은 독소 또는 약물의 내재화를 유도하여, 계통-특이적 단백질을 발현하는 세포(표적 세포)의 활성을 조절할 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체-약물 접합체에 사용되는 독소 또는 약물의 유형은 임의의 특정 유형으로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 ADC는 본 명세서에 기재된 바와 같은 병용 요법을 받았던 대상체에 대한 후속 치료로서 사용될 수 있다.
계통-특이적 세포-표면 항원이 결핍된 조혈 세포
본 개시내용은 또한 계통-특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 gRNA를 사용하는 것, 예를 들어, 여기서 gRNA는 AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67) 또는 CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70)?)의 뉴클레오타이드 서열을 포함함)이 결핍되도록 유전자 변형되었던 조혈 줄기세포(HSC) 및/또는 조혈 전구세포(HPC)와 같은 조혈 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50) 또는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에서 유전자 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포는 본 명세서에서 "HSPC"("조혈 줄기세포 및/또는 전구세포")로 지칭되는 HSC, HPC 또는 이들의 조합물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 세포의 집단은 복수의 조혈 줄기세포를 포함하고; 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 복수의 조혈 전구세포를 포함하고; 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 복수의 조혈 줄기세포 및 복수의 조혈 전구세포를 포함한다. HSC는 골수 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 수지상 세포, 적혈구, 혈소판 등) 및 림프 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포)를 추가로 발생시키는 골수 및 림프구 전구세포 둘 다를 발생시킬 수 있다. HSC는 HSC의 식별 및/또는 단리에 사용될 수 있는 세포 표면 마커 CD34(예를 들어, CD34+)의 발현 및 세포 계통에 대한 헌신과 관련된 세포 표면 마커의 부재를 특징으로 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, HSC는 CD34+이다.
일부 실시형태에서, HSC는 대상체, 예컨대, 포유동물 대상체로부터 얻어진다. 일부 실시형태에서, 포유동물 대상체는 비인간 영장류, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 소, 돼지, 말, 또는 가축이다. 일부 실시형태에서, HSC는 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자와 같은 인간 환자로부터 얻어진다. 일부 실시형태에서, HSC는 건강한 공여자로부터 얻어진다. 일부 실시형태에서, HSC는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포가 후속적으로 투여될 대상체로부터 얻어진다. 세포가 얻어진 동일한 대상에게 투여되는 HSC를 자가 세포라고 하는 반면, 세포가 투여될 대상체가 아닌 대상체로부터 얻은 HSC를 동종이계 세포라고 한다.
HSC는 당업계에 공지된 통상적인 수단을 사용하여 임의의 적합한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, HSC는 골수 샘플 또는 혈액 샘플과 같은 대상체로부터의 샘플로부터 얻어진다. 대안적으로 또는 추가로, HSC는 탯줄에서 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, HSC는 골수 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 유래된다. 일반적으로 골수 세포는 대상의 장골능, 대퇴골, 경골, 척추, 늑골 또는 기타 수질 공간에서 얻어질 수 있다. 골수는 환자로부터 채취되어, 당업계에 공지된 다양한 분리 및 세척 절차를 통해 단리될 수 있다. 골수 세포의 단리를 위한 예시적인 절차는 다음 단계를 포함한다: a) 골수 샘플을 추출하는 단계; b) 3개의 분획으로 골수 현탁액을 원심분리시키고, 중간 분획 또는 버피코트를 수집하는 단계; c) 단계 (b)로부터의 버피코트 분획을 분리 유체, 일반적으로 Ficoll™에서 한 번 더 원심분리시키고, 골수 세포를 포함하는 중간 분획을 수집하는 단계, 및 d) 재수혈 가능한 골수 세포의 회수를 위해 단계 (c)로부터 수집된 분획을 세척하는 단계.
HSC는 일반적으로 골수에 존재하지만 말초 혈액에서 HSC를 수거하기 위해 이동제를 투여함으로써 순환 혈액으로 이동될 수 있다. 일부 실시형태에서, HSC가 얻어진 대상체는 과립구 집락-자극 인자(G-CSF)와 같은 이동제를 투여받는다. 이동제를 사용한 이동 후 수집된 HSC의 수는 일반적으로 이동제를 사용하지 않고 얻은 세포의 수보다 많다. 일부 실시형태에서, HSC는 말초혈 HSC이다.
일부 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 얻어진 다음 원하는 세포 유형(예를 들어, CD34+/CD33- 세포)가 농축된다. 예를 들어, PBMC 및/또는 CD34+ 조혈 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 혈액으로부터 단리될 수 있다. 세포는 또한 예를 들어, 원하는 세포 유형의 세포 표면 상의 에피토프에 결합하는 항체를 사용한 단리 및/또는 활성화에 의해 다른 세포로부터 단리될 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 수용체 결합에 의해 세포를 활성화하지 않고 특정 세포 유형을 선택적으로 풍부하게 하기 위해 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하는 음성 선택을 포함한다.
HSC의 집단은 혈통 특이적 세포-표면 항원이 결핍되도록 HSC를 유전자 조작하기 전이나 후에 확장될 수 있다. 세포는 1종 이상의 사이토카인, 예컨대, 줄기세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨 3(IL-3) 또는 인터루킨6(IL-6)을 포함하는 확장 배지를 포함하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25일 또는 임의의 필요한 범위 동안 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, HSC는 대상체로부터 얻은 샘플로부터 원하는 세포 집단(예를 들어, CD34+/CD33-)의 단리 후 및 유전자 조작 이전에 확장된다. 일부 실시형태에서, HSC는 유전자 조작 후에 확장되고, 이에 의해 유전자 변형을 겪었고, 계통-특이적 세포-표면 항원이 결핍된 세포를 선택적으로 확장시킨다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형 후 원하는 특성(예를 들어, 표현형 또는 유전자형)을 갖는 세포("클론") 또는 여러 세포가 선택되고 독립적으로 확장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조혈 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원(예를 들어, CD33)이 결핍되도록(예를 들어, 발현하지 않도록) 유전자 조작된다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포는 작용제에 의해 표적화되는 동일한 세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍되도록 유전자 조작된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 조혈 세포가 유전자 조작된 조혈 세포(예를 들어, CD34와 같은 동일한 세포 표면 마커의 존재를 특징으로 함)와 동일한 유형의 자연 발생 조혈 세포와 비교할 때 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현이 실질적으로 감소된 경우 조혈 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍된 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원의 검출 가능한 발현을 갖지 않는다(예를 들어, 세포-표면 계통-특이적 항원을 발현하지 않는다). 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현 수준은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현 수준은 항원-특이적 항체로 항원을 검출함으로써 평가될 수 있다(예를 들어, 유세포 분석법, 웨스턴 블로팅).
일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 세포 상의 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현은 자연 발생 조혈 세포(예를 들어, 야생형 대응물) 상의 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현과 비교된다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작은 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현 수준을, 자연 발생 조혈 세포 상의 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현과 비교할 때 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 감소시킨다. 즉, 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 세포는 자연 발생 조혈 세포(예를 들어, 야생형 대응물)와 비교할 때 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 세포-표면 계통-특이적 항원(예를 들어, CD33)을 발현한다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작은 야생형 세포-표면 계통-특이적 항원(예를 들어, CD33)의 발현 수준을, 자연 발생 조혈 세포 상의 야생형 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현 수준과 비교할 때 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 감소시킨다. 즉, 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 조혈 세포는 자연 발생 조혈 세포(예를 들어, 야생형 대응물)와 비교할 때 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 야생형 세포-표면 계통-특이적 항원(예를 들어, CD33)을 발현한다.
일부 실시형태에서, 조혈 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원을 암호화하는 전체 내인성 유전자가 결핍되어 있다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원을 암호화하는 전체 내인성 유전자가 결실되었다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원을 암호화하는 내인성 유전자의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원의 일부(예를 들어, 절두된 단백질)를 발현한다. 다른 실시형태에서, 세포 표면 계통-특이적 항원을 암호화하는 내인성 유전자의 일부는 결실되었다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원을 암호화하는 유전자의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상이 결실되었다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조혈 세포가 항원이 결핍되도록(예를 들어, 항원의 발현이 실질적으로 감소됨), 세포-표면 계통-특이적 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부가 결실되거나 하나 이상의 비-암호 서열이 결실될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원은 CD33이다. CD33의 예측된 구조는 2개의 면역글로불린 도메인, IgV 도메인 및 IgC2 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD33의 면역글로불린 C 도메인의 일부가 결실된다.
세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍된 HSC와 같은 임의의 유전자 조작 조혈 세포는 통상적인 방법 또는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 공학은 게놈 편집을 사용하여 수행된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "게놈 편집"은 표적 유전자의 발현을 넉아웃시키기 위해 유기체의 임의의 단백질-암호 또는 비-암호 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 게놈을 변형시키는 방법을 지칭한다. 일반적으로, 게놈 편집 방법은 예를 들어, 표적화 뉴클레오타이드 서열에서 게놈의 핵산을 절단할 수 있는 엔도뉴클레아제의 사용을 포함한다. 게놈에서의 이중 가닥 브레이크의 수선은 돌연변이를 도입하여 수선될 수 있고/있거나 외인성 핵산이 표적화 부위에 삽입될 수 있다.
게놈 편집 방법은 일반적으로 표적 핵산에서 이중 가닥 브레이크 생성에 관여하는 엔도뉴클레아제의 유형에 따라 분류된다. 이러한 방법은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기-기반 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 및 CRISPR/Cas 시스템의 사용을 포함한다.
본 개시내용의 일 양상에서, 정상 세포의 변형된 집단에 의한 종양 세포의 대체는 계통-특이적 항원이 변형된 정상 세포를 사용하여 수행된다. 이러한 변형은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하는 임의의 계통 특이적 항원의 고갈 또는 저해를 포함할 수 있으며, 여기서 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas9 시스템은 조작된 비-자연 발생 CRISPR-Cas9 시스템이다(도 4).
CRISPR-Cas 시스템은 박테리아, 인간, 초파리, 얼룩말 물고기 및 식물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 유기체의 게놈을 편집하는 데 성공적으로 이용되었다. 예를 들어, 문헌[Jiang et al., Nature Biotechnology (2013) 31(3):233; Qi et al, Cell (2013) 5:1173; DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. (2013) 7:4336; Hwang et al., Nat. Biotechnol (2013), 3:227); Gratz et al., Genetics (2013) 194:1029; Cong et al., Science (2013) 6121:819; Mali et al., Science (2013) 6121:823; Cho et al. Nat. Biotechnol (2013) 3: 230; 및 Jiang et al., Nucleic Acids Research (2013) 41(20):el88] 참고.
본 개시내용은 계통 특이적 항원 폴리뉴클레오타이드에서 표적 서열과 혼성화하는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하며, 여기서 CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 뉴클레아제 및 조작된 crRNA/tracrRNA(또는 단일 가이드 RNA)를 포함한다. CRISPR/Cas9 복합체는 계통 특이적 항원 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있고, 항원 폴리뉴클레오타이드의 절단을 허용하여, 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다.
본 개시내용의 CRISPR/Cas 시스템은 유전자 내 또는 이에 인접한 암호 또는 비-암호 영역, 예를 들어, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론, 또는 암호 영역의 상류 또는 하류에 있는 전사되지 않은 영역 내에서 세포-표면 계통-특이적 항원 내의 관심대상 영역에 결합하고/하거나 이를 절단할 수 있다. 본 개시내용에서 사용되는 가이드 RNA(gRNA)는 gRNA가 Cas9-gRNA 복합체의 게놈 내의 미리 결정된 절단 부위(표적 부위)에 대한 결합을 지시하도록 설계될 수 있다. 절단 부위는 서열이 알려지지 않은 영역 또는 SNP, 뉴클레오타이드 삽입, 뉴클레오타이드 결실, 재배열 등을 포함하는 영역을 함유하는 단편을 방출하도록 선택될 수 있다.
유전자 영역의 절단은 Cas 효소에 의해 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개의 가닥을 절단하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 절단은 표적 유전자의 감소된 전사를 초래할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 절단은 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드와의 상동성 재조합에 의해 절단된 표적 폴리뉴클레오타이드를 수선하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 수선은 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 초래한다.
용어 "gRNA", "가이드 RNA" 및 "CRISPR 가이드 서열"은 전체적으로 상호 교환적으로 사용될 수 있고, CRISPR/Cas 시스템의 Cas DNA 결합 단백질의 특이성을 결정하는 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. gRNA는 숙주 세포의 게놈에서 표적 핵산 서열에 (상보적, 부분적으로 또는 완전히) 혼성화한다. 표적 핵산에 혼성화하는 gRNA 또는 이의 부분은 길이가 15 내지 25개 뉴클레오타이드, 18 내지 22개 뉴클레오타이드 또는 19 내지 21개 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산에 혼성화하는 gRNA 서열은 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산에 혼성화하는 gRNA 서열은 길이가 10 내지 30개, 또는 15 내지 25개 뉴클레오타이드이다.
표적 핵산에 결합하는 서열에 더하여, 일부 실시형태에서, gRNA는 또한 스캐폴드 서열을 포함한다. 표적 핵산에 상보적인 서열과 스캐폴드 서열을 둘 다를 암호화하는 gRNA의 발현은 표적 핵산에 결합(혼성화)하고, 표적 핵산에 엔도뉴클레아제를 동원하는 이중 기능을 가지며, 이는 부위 특이적 CRISPR 활성을 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 키메라 gRNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA는 변형되고, 예를 들어 화학적으로 변형된다. 변형된 gRNA는 핵염기, 당, 및 포스포다이에스터 링키지 또는 골격 부분(예를 들어, 뉴클레오타이드 포스페이트) 중 적어도 하나의 화학 구조에 대한 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다. 예시적인 gRNA 변형은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌[Lee et al., Synthetically modified guide RNA and donor DNA are a versatile platform for CRISPR-Cas9 engineering. Elife. 2017 May 2;6. pii: e25312. doi:10.7554/eLife.25312] 및 미국 특허 공개 제2016/0289675호에서 찾아볼 수 있다. 추가의 적합한 변형은 포스포로티오에이트 골격 변형, 2'-O-Me-변형된 당, 2'F-변형된 당, 리보스 당을 이환식 뉴클레오타이드-cEt, 3'티오PACE(MSP) 또는 이들의 임의의 조합물로 대체하는 것을 포함한다. 적합한 gRNA 변형은 예를 들어, 문헌[Rahdar et al. PNAS December 22, 2015 112 (51) E7110-E7117 및 Hendel et al., Nat Biotechnol. 2015 Sep; 33(9): 985-989]에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 화학적으로 변형된다. 예를 들어, gRNA는 하나 이상의 2'-O 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에 2'-O 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 3' 단부에 2'-O 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부 및 3' 단부 둘 다에 2'-O-변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 화학적으로 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 화학적으로 변형된 당을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸-변형된다. 일부 실시형태에서, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드는 인접한 뉴클레오타이드에 대한 포스페이트 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드는 인접한 뉴클레오타이드에 대한 포스포로티오에이트 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드는 인접한 뉴클레오타이드에 대한 티오PACE 링키지를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 하나 이상의 2'-O-변형된 및 3'인-변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서 2'-O-변형된 및 3'인-변형된, 예를 들어, 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 3' 단부에서 2'-O-변형된 및 3'인-변형된, 예를 들어, 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부 및 3' 단부에서 2'-O-변형된 및 3'인-변형된, 예를 들어, 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는, 하나 이상의 비-브리징 산소 원자가 황 원자로 대체된 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 화학적으로 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 화학적으로 변형된 당을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트-변형된다.
일부 실시형태에서, gRNA는 하나 이상의 2'-O-변형된 및 3'-인-변형된, 예를 들어, 2'-O-메틸 3'티오PACE 뉴클레오타이드 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서 2'-O-변형된 및 3'인-변형된, 예를 들어, 2'-O-메틸 3'티오PACE 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 3' 단부에서 2'-O-변형된 및 3'인-변형된, 예를 들어, 2'-O-메틸 3'티오PACE 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부 및 3' 단부에서 2'-O-변형된 및 3'인-변형된, 예를 들어, 2'-O-메틸 3'티오PACE 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는, 하나 이상의 비-브리징 산소 원자가 황 원자로 대체되고, 하나 이상의 비-브리징 산소 원자가 아세테이트기로 대체된 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3' 티오PACE-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3' 티오PACE-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3'티오PACE-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3'티오PACE-변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 화학적으로 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 화학적으로 변형된 당을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드에서 2'-O-변형되고, 3'인-변형되고, 예를 들어 2'-O-메틸 3'티오PACE-변형된다.
일부 실시형태에서, gRNA는 화학적으로 변형된 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 포스포로티오에이트 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 비-브리징 산소 원자는 황 원자로 대체되었다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, 및 gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 각각은 포스포로티오에이트 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 각각은 포스포로티오에이트 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드는 각각 포스포로티오에이트 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드 각각은 포스포로티오에이트 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드는 각각 포스포로티오에이트 링키지를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 티오PACE 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는, 하나 이상의 비-브리징 산소 원자가 황 원자로 대체되고, 하나 이상의 비-브리징 산소 원자가 아세테이트기로 대체된 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, 및 gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 각각은 티오PACE 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 각각은 티오PACE 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드는 각각 티오PACE 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드 각각은 티오PACE 링키지를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부에서의 뉴클레오타이드, gRNA의 5' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, 5' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제2 뉴클레오타이드, gRNA의 3' 단부로부터의 제3 뉴클레오타이드 및 gRNA의 3' 단부로부터의 제4 뉴클레오타이드는 각각 티오PACE 링키지를 포함한다.
gRNA의 화학적 변형은 예를 들어 문헌[Hendel, A. et al., Nature Biotech., 2015, Vol 33, No. 9]에 기재되어 있고, 이것은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, tracrRNA라고도 지칭되는 "스캐폴드 서열"은 상보적 gRNA 서열에 결합된(혼성화된) 표적 핵산에 Cas 엔도뉴클레아제를 동원하는 핵산 서열을 지칭한다. 적어도 하나의 줄기 루프 구조를 포함하고, 엔도뉴클레아제를 동원하는 임의의 스캐폴드 서열이 본 명세서에 기재된 유전 요소 및 벡터에 사용될 수 있다. 예시적인 스캐폴드 서열은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌[Jinek, et al. Science (2012) 337(6096):816-821, Ran, et al. Nature Protocols (2013) 8:2281-2308], PCT 출원 제WO2014/093694호 및 PCT 출원 제WO2013/176772호에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA 서열은 스캐폴드 서열을 포함하지 않고, 스캐폴드 서열은 별개의 전사체로서 발현된다. 이러한 실시형태에서, gRNA 서열은 스캐폴드 서열의 일부에 상보적이고, 스캐폴드 서열에 결합(혼성화)하고, 엔도뉴클레아제를 표적 핵산에 동원하는 기능을 하는 추가 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA 서열은 표적 핵산에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 적어도 100% 상보적이다(또한 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 gRNA 서열의 상보성에 대한 교시를 위해 참조에 의해 포함된 미국 특허 제8,697,359호 참고). CRISPR 가이드 서열과 표적 핵산의 3' 단부 근처의 표적 핵산 사이의 미스매치가 뉴클레아제 절단 활성을 폐지할 수 있음이 입증되었다(문헌[Upadhyay, et al. Genes Genome Genetics (2013) 3(12):2233-2238] 참조). 일부 실시형태에서, gRNA 서열은 표적 핵산의 3' 단부(예를 들어, 표적 핵산의 3' 단부의 마지막 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드)와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 적어도 100% 상보적이다.
표적 핵산은 엔도뉴클레아제와 상호작용할 수 있고, 표적 핵산에 대한 엔도뉴클레아제 활성을 표적화하는 데 추가로 관여할 수 있는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 의해 3' 측면에 측접된다. 일반적으로 표적 핵산에 측접하는 PAM 서열은 엔도뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제가 유래되는 공급원에 의존한다고 생각된다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 Cas9 엔도뉴클레아제의 경우, PAM 서열은 NGG이다. 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 유래된 Cas9 엔도뉴클레아제의 경우, PAM 서열은 NNGRRT이다. 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)로부터 유래된 Cas9 엔도뉴클레아제의 경우, PAM 서열은 NNNNGATT이다. 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)로부터 유래된 Cas9 엔도뉴클레아제의 경우 PAM 서열은 NNAGAA이다. 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)로부터 유래된 Cas9 엔도뉴클레아제의 경우 PAM 서열은 NAAAAC이다. Cpf1 뉴클레아제의 경우, PAM 서열은 TTN이다.
일부 실시형태에서, 세포를 유전적으로 조작하는 것은 또한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 그 초과)의 Cas 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 암호화하는 핵산은 동일한 핵산(예를 들어, 벡터) 상에 제공된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 암호화하는 핵산은 상이한 핵산(예를 들어, 상이한 벡터) 상에 제공된다. 대안적으로 또는 추가로, Cas 엔도뉴클레아제는 단백질 형태로 세포 내로 제공되거나 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 효소 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스(SpCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스(SaCas9), 네이세리아 메닝기티디스(NmCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)(CjCas9) 또는 트레포네마 덴티콜라로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9 상동체 또는 오쏘로그이다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 단백질의 활성을 변경하도록 추가로 변형된다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 "닉카제" 또는 "Cas9n"으로 지칭되는 엔도뉴클레아제의 촉매 잔기 중 하나를 비활성화하도록 변형되었다. Cas9 닉카제 엔도뉴클레아제는 표적 핵산의 하나의 DNA 가닥을 절단한다. 예를 들어, 문헌[Dabrowska et al. Frontiers in Neuroscience (2018) 12(75)] 참고). 효소의 RuvC 및 HNH 촉매 도메인에서 하나 이상의 돌연변이가 Cas9 효율을 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌[Sarai et al. Currently Pharma. Biotechnol. (2017) 18(13)] 참고. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 촉매적으로 불활성인 Cas9이다. 예를 들어, dCas9는 촉매 활성 잔기(D10 및 H840)의 돌연변이를 포함하며 뉴클레아제 활성이 없다. 대안적으로 또는 추가로, Cas9 엔도뉴클레아제는 또 다른 단백질 또는 이의 일부에 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, dCas9는 KRAB 도메인과 같은 억제인자 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이러한 dCas9 융합 단백질은 멀티플렉싱된 유전자 억제(예를 들어, CRISPR 간섭(CRISPRi))를 위해 본 명세서에 기재된 작제물과 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, dCas9는 활성화제 도메인, 예컨대, VP64 또는 VPR에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이러한 dCas9 융합 단백질은 유전자 활성화(예를 들어, CRISPR 활성화(CRISPRa))를 위해 본 명세서에 기재된 작제물과 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, dCas9는 히스톤 데메틸라제 도메인 또는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 도메인과 같은 후성적 조절 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, dCas9는 LSD1 또는 p300, 또는 그의 일부에 융합된다. 일부 실시형태에서, dCas9 융합은 CRISPR 기반 후성적 조절에 사용된다. 일부 실시형태에서, dCas9 또는 Cas9는 Fok1 뉴클레아제 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, Fok1 뉴클레아제 도메인에 융합된 Cas9 또는 dCas9는 게놈 편집을 위해서 사용된다. 일부 실시형태에서, Cas9 또는 dCas9는 형광 단백질(예를 들어, GFP, RFP, mCherry 등)에 융합된다. 일부 실시형태에서, 형광 단백질에 융합된 Cas9/dCas9 단백질은 게놈 유전자좌의 표지화 및/또는 시각화 또는 Cas 엔도뉴클레아제를 발현하는 세포를 식별하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 효소의 특이성을 향상시키도록 변형된다(예를 들어, 표적외 효과를 감소시키고, 강력한 표적상 절단을 유지한다). 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 향상된 특이성 Cas9 변이체(예를 들어, eSPCas9)이다. 예를 들어, 문헌[Slaymaker et al. Science (2016) 351 (6268): 84-88] 참고. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 고 충실도 Cas9 변이체(예를 들어, SpCas9-HF1)이다. 예를 들어, 문헌[Kleinstiver et al. Nature (2016) 529: 490-495] 참고.
Cas 엔도뉴클레아제와 같은 Cas 효소는 당업계에 공지되어 있고, 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있고/있거나 효소의 하나 이상의 활성 또는 특이성을 조절하도록 조작/변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 효소는 하나 이상의 PAM 서열을 인식하도록 조작/변형되었다. 일부 실시형태에서, Cas 효소는 조작/변형 없이 Cas 효소가 인식하는 PAM 서열과 상이한 하나 이상의 PAM 서열을 인식하도록 조작/변형되었다. 일부 실시형태에서, Cas 효소는 효소의 표적외 활성을 감소시키도록 조작/변형되었다.
일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 엔도뉴클레아제 활성의 특이성을 추가로 변경(예를 들어, 표적 외 절단 감소, Cas 엔도뉴클레아제 활성 또는 세포 수명 감소, 상동성-유도 재조합(homology-directed recombination) 증가 및 비-상동성 단부 결합 감소)시키도록 변형된다. 예를 들어, 문헌[Komor et al. Cell (2017) 168: 20-36] 참고). 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 엔도뉴클레아제의 PAM 인식을 변경하도록 변형된다. 예를 들어, Cas 엔도뉴클레아제 SpCas9는 PAM 서열 NGG를 인식하는 반면, 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 변형을 포함하는 SpCas9의 완화된 변이체(예를 들어, VQR SpCas9, EQR SpCas9, VRER SpCas9)는 PAM 서열 NGA, NGAG, NGCG를 인식할 수 있다. 변형된 Cas 엔도뉴클레아제의 PAM 인식은, Cas 엔도뉴클레아제가 변형되지 않은 Cas 엔도뉴클레아제와 비교할 때 더 많은 잠재적인 PAM 서열을 인식하는 경우 "완화"된 것으로 간주된다. 예를 들어, Cas 엔도뉴클레아제 SaCas9는 PAM 서열 NNGRRT를 인식하는 반면, 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 변형을 포함하는 SaCas9의 완화된 변이체(예를 들어, KKH SaCas9)는 PAM 서열 NNNRRT를 인식할 수 있다. 일례에서, Cas 엔도뉴클레아제 FnCas9는 PAM 서열 NNG를 인식하는 반면, 엔도뉴클레아제(예를 들어, RHA FnCas9)의 하나 이상의 변형을 포함하는 FnCas9의 완화된 변이체는 PAM 서열 YG를 인식할 수 있다. 일례에서, Cas 엔도뉴클레아제는 치환 돌연변이 S542R 및 K607R을 포함하고, PAM 서열 TYCV를 인식하는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일례에서, Cas 엔도뉴클레아제는 치환 돌연변이 S542R, K607R 및 N552R을 포함하고, PAM 서열 TATV를 인식하는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 예를 들어, 문헌[Gao et al. Nat. Biotechnol. (2017) 35(8): 789-792] 참고.
일부 실시형태에서, 하나 초과(예를 들어, 2, 3개 또는 그 초과)의 Cas 엔도뉴클레아제가 사용된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제 중 적어도 하나는 Cas9 효소이다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제 중 적어도 하나는 Cpf1 효소이다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제 중 적어도 하나는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, Cas9 엔도뉴클레아제 중 적어도 하나는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 유래되고, Cas9 엔도뉴클레아제 중 적어도 하나는 스트렙토코쿠스 피오게네스가 아닌 유기체로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 염기 편집기이다. 염기 편집기 엔도뉴클레아제는 일반적으로 기능 도메인에 융합된 촉매적으로 불활성인 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Eid et al. Biochem. J. (2018) 475(11): 1955-1964; Rees et al. Nature Reviews Genetics (2018) 19:770-788] 참고. 일부 실시형태에서, 촉매적으로 불활성인 Cas 엔도뉴클레아제는 dCas9이다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 우라실 글리코실라제 저해제(UGI) 도메인에 융합된 dCas9를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 아데닌 염기 편집기(ABE), 예를 들어, RNA 아데닌 데아미나제 TadA로부터 진화된 ABE에 융합된 dCas9를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 시티딘 데아미나제 효소(예를 들어, APOBEC 데아미나제, pmCDA1, 활성화-유도 시티딘 데아미나제(AID))에 융합된 dCas9를 포함한다. 일부 실시형태에서, 촉매적으로 불활성인 Cas 엔도뉴클레아제는 감소된 활성을 가지며, nCas9이다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 우라실 글리코실라제 저해제(UGI) 도메인에 융합된 nCas9를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 아데닌 염기 편집기(ABE), 예를 들어, RNA 아데닌 데아미나제 TadA로부터 진화된 ABE에 융합된 nCas9를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 시티딘 데아미나제 효소(예를 들어, APOBEC 데아미나제, pmCDA1, 활성화-유도 시토딘 데아미나제(AID))에 융합된 nCas9를 포함한다.
염기 편집기의 예는 비제한적으로 BE1, BE2, BE3, HF-BE3, BE4, BE4max, BE4-Gam, YE1-BE3, EE-BE3, YE2-BE3, YEE-CE3, VQR-BE3, VRER-BE3, SaBE3, SaBE4, SaBE4-Gam, Sa(KKH)-BE3, Target-AID, Target-AID-NG, xBE3, eA3A-BE3, BE-PLUS, TAM, CRISPR-X, ABE7.9, ABE7.10, ABE7.10*, xABE, ABESa, VQR-ABE, VRER-ABE, Sa(KKH)-ABE 및 CRISPR-SKIP를 포함한다. 염기 편집기의 추가 예는 예를 들어, 미국 공개 제2018/0312825A1호, 미국 공개 제2018/0312828A1호 및 PCT 공개 제WO 2018/165629A1호에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 실시형태에서, 염기 편집기는 표적 부위에서 염기 절단 수선을 저해하고, 세포 미스매치 수선을 유도하도록 추가로 변형되었다. 본 명세서에 기재된 임의의 Cas 엔도뉴클레아제는 분해 및 엑소뉴클레아제 활성으로부터 Cas 엔도뉴클레아제를 보호하기 위해 Gam 도메인(박테리오파지 Mu 단백질)에 융합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Eid et al. Biochem. J. (2018) 475(11): 1955-1964] 참고.
일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제의 클래스 2 유형 V에 속한다. 클래스 2 유형 V Cas 엔도뉴클레아제는 유형 V-A, 유형 V-B, 유형 V-C 및 유형 V-U로 추가 분류될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Stella et al. Nature Structural & Molecular Biology (2017)] 참고. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 유형 V-A Cas 엔도뉴클레아제, 예컨대, Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 유형 V-B Cas 엔도뉴클레아제, 예컨대, C2c1 엔도뉴클레아제이다. 예를 들어, 문헌[Shmakov et al. Mol Cell (2015) 60: 385-397] 참고. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 Mad7이다.
대안적으로 또는 추가로, Cas 엔도뉴클레아제는 Cpf1 뉴클레아제 또는 이의 변이체이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, Cas 엔도뉴클레아제 Cpf1 뉴클레아제는 또한 Cas12a로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Strohkendl et al. Mol. Cell (2018) 71: 1-9] 참고. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 프로베텔라 종(Provetella spp.) 또는 프란시셀라종(Francisella spp.), 아시다미노코쿠스종(Acidaminococcus sp.)(AsCpf1), 라크노스피라세아 박테리움(Lachnospiraceae bacterium)(LpCpf1), 또는 유박테리움 렉타클(Eubacterium rectale)로부터 유래된 Cpf1 뉴클레아제를 발현한다. 일부 실시형태에서, Cpf1 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cpf1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 단백질의 활성을 변경하도록 추가로 변형된다.
Cpf1(Cas12a)의 촉매적으로 불활성인 변이체는 dCas12a라고 지칭될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, Cpf1의 촉매적으로 불활성인 변이체는 기능 도메인에 융합되어 염기 편집기를 형성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Rees et al. Nature Reviews Genetics (2018) 19:770-788] 참고. 일부 실시형태에서, 촉매적으로 불활성인 Cas 엔도뉴클레아제는 dCas9이다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 우라실 글리코실라제 저해제(UGI) 도메인에 융합된 dCas12a를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 아데닌 염기 편집기(ABE), 예를 들어, RNA 아데닌 데아미나제 TadA로부터 진화된 ABE에 융합된 dCas12a를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 시티딘 데아미나제 효소(예를 들어, APOBEC 데아미나제, pmCDA1, 활성화-유도 시토딘 데아미나제(AID))에 융합된 dCas12a를 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, Cas 엔도뉴클레아제는 Cas14 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체일 수 있다. Cas9 엔도뉴클레아제와 달리, Cas14 엔도뉴클레아제는 아카에아(archaea)로부터 유래되고, 크기가 더 작은 경향이 있다(예를 들어, 400 내지 700개 아미노산). 추가로 Cas14 엔도뉴클레아제는 PAM 서열이 필요하지 않다. 예를 들어, 문헌[Harrington et al. Science (2018)] 참고.
본 명세서에 기재된 임의의 Cas 엔도뉴클레아제는 원하는 시간에 Cas 엔도뉴클레아제의 발현 및/또는 활성 수준을 조절하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 세포 주기의 특정 단계(들) 동안 Cas 엔도뉴클레아제의 발현 및/또는 활성 수준을 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 상동성-유도 수선(homology-directed repair)은 세포 주기의 G1기 동안 감소하므로, S기, G2기 및/또는 M기 동안 Cas 엔도뉴클레아제의 발현 및/또는 활성 수준의 증가가 Cas 엔도뉴클레아제 편집 후 상동성-유도 수선을 증가시킬 수 있음이 입증되어 있다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제의 발현 및/또는 활성 수준은 세포 주기의 S기, G2기, 및/또는 M기 동안 증가된다. 일례에서, Cas 엔도뉴클레아제는 인간 Geminin의 N-말단 영역에 융합된다. 예를 들어, 문헌[Gutschner et al. Cell Rep. (2016) 14(6): 1555-1566] 참고. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제의 발현 및/또는 활성 수준은 G1기 동안 감소된다. 일례에서, Cas 엔도뉴클레아제는 G1기 동안 감소된 활성을 갖도록 변형된다. 예를 들어, 문헌[Lomova et al. Stem Cells (2018)] 참고.
대안적으로 또는 추가로, 본 명세서에 기재된 임의의 Cas 엔도뉴클레아제는 후성적 변형제(예를 들어, 염색질-변형 효소, 예를 들어, DNA 메틸라제, 히스톤 데아세틸라제)에 융합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kungulovski et al. Trends Genet. (2016) 32(2):101-113] 참고. 후성적 변형제에 융합된 Cas 엔도뉴클레아제는 "에피이펙터(epieffector)"라고 지칭될 수 있고, 시간적 및/또는 일시적 엔도뉴클레아제 활성을 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 염색질-변형 효소에 융합된 dCas9이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 조혈 세포에서 세포-표면 계통-특이적 항원을 저해하기 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 가이드 RNA 서열은 세포-표면 계통-특이적 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 혼성화된다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원은 CD33이고, gRNA는 CD33을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부에 혼성화한다(도 5). CD33을 표적으로 하는 gRNA의 예를 표 4에 제공하지만, CD33에 혼성화되고, 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있는 추가 gRNA가 개발될 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호 50 또는 서열번호 51을 포함한다.
표 4는 CD33의 일부에 혼성화하거나 혼성화할 것으로 예측되는 예시적인 가이드 RNA 서열을 제공한다. 예시적인 가이드 RNA 서열의 RNA 및 DNA 서열 둘 다가 제공되지만, 당업자는 달리 언급되지 않는 한, 본 출원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열이 대표적인 DNA 서열에서 "T"를 인용하지만 그 서열이 RNA를 나타내는 경우 "T"는 "U"로 치환될 것이라는 것을 인식할 것이다.
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Figure pct00014
일부 경우에, 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 상기 표 4에서의 임의의 예시적인 가이드 RNA 서열, 예를 들어, 서열번호 67, 서열번호 68 또는 서열번호 70과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 동일한 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 포함할 수 있다.
두 핵산 서열의 "백분율 동일성"은 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된, 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수=100, 단어 길이-12로 수행되어 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻을 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, Gapped BLAST를 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이식편-대-숙주 효과를 감소시키기 위해서, HSC, 특히 동종이계 HSC를 추가로 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 재발성 AML에 대한 표준 요법은 조혈 줄기세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation: HSCT)이다. 그러나, 성공적인 HSCT를 위한 제한 요인 중 적어도 하나는 세포 표면 분자 CD45의 발현이 연루된 이식편대숙주병(graft-versus-host disease: GVHD)이다. 예를 들어, 문헌[Van Besie, Hematology Am. Soc. Hematol Educ Program (2013)56; Mawad Curr. Hematol. Malig. Rep. (2013) 8(2):132] 참고. CD45RA 및 CD45RO는 CD45의 아이소폼이다(적혈구를 제외한 모든 조혈 세포에서 발견됨). T 림프구에서, CD45RA는 미경험 세포에서 발현되는 반면, CD45RO는 기억 세포에서 발현된다. CD45RA T 세포는 HSCT 후 수용자-특이적 항원에 대한 반응성이 높아, GVHD를 유발할 가능성이 높다. 따라서, 이식 거부 또는 GVHD의 가능성을 감소시킬 효율적이고 안전한 AML 치료가 여전히 필요하다. CD45는, CD45 보유 세포가 생존에 필요하지만 CRISPR을 사용하여 줄기세포로부터 항원이 제거될 수 있기 때문에 유형 1 계통 항원이다.
HSCT 후 GvHD의 발달로 인해 발생하는 합병증을 고려하여, 본 개시내용은 또한 CD45RA를 표적으로 하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 조성물 및 방법은 GvHD의 발생 또는 정도를 예방 및/또는 감소시키는 것을 의미한다.
따라서, GVHD의 경우, 환자의 치료는 하기 단계를 포함할 수 있다: (1) 치료적 유효량의 T 세포를 환자에게 투여하는 단계(여기서 T 세포는 CD45RA 계통 특이적 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함함); 및 (2) 조혈 줄기세포를 환자에게 주입하는 단계(여기서 조혈 세포는 CD45RA 계통 특이적 항원의 발현이 감소됨.
추가로, 본 개시내용은 CD33 및 CD45RA 계통 특이적 항원 둘 다의 조합된 저해를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 치료 요법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (1) 치료적 유효량의 T 세포를 환자에게 투여하는 단계(여기서 T 세포는 CD33 및 CD45RA 계통 특이적 항원 둘 다를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열을 포함함); 및 (2) 자가 또는 동종이계의 조혈 줄기세포를 환자에게 주입 또는 재주입하는 단계(여기서 조혈 세포는 CD 33 및 CD45RA 계통 특이적 항원 둘 다의 발현이 감소됨).
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원 CD45RA는 또한 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 조혈 세포에서 결실되거나 저해된다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열은 CD45RA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부에 혼성화한다(도 6). CD45RA을 표적으로 하는 gRNA의 예를 표 5에 제공하지만, CD45RA에 혼성화되고, 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있는 추가 gRNA가 개발될 수 있다.
표 5는 인간 CD45의 엑손 4 또는 엑손 5에 혼성화하거나 혼성화할 것으로 예측되는 예시적인 가이드 RNA 서열을 제공한다.
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또한 본 명세서에는 세포를 제공하고, 게놈 편집을 위해 CRISPR Cas 시스템의 세포 성분에 도입하는 것을 포함하는 세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍된 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 계통-특이적 세포-표면 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부에 혼성화하거나 혼성화하는 것으로 예측되는 CRISPR-Cas 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 핵산이 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, gRNA가 벡터 상에서 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제가 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제가 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산으로서 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, gRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 동일한 핵산(예를 들어, 동일한 벡터) 상에서 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 단백질 형태로 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제 및 gRNA는 시험관내에서 사전 형성되고, 복합체로서 세포에 도입된다.
본 개시내용은 CRISPR/Cas9 복합체의 하나 이상의 성분을 암호화할 수 있는 조작된, 비-자연 발생 벡터 및 벡터 시스템을 추가로 제공하며, 여기서 벡터는 (i) 계통 특이적 항원 서열에 혼성화하는 (CRISPR)-Cas 시스템 가이드 RNA 및 (ii) Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 개시내용의 벡터는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 CDM8(Seed, Nature (1987) 329: 840) 및 pMT2PC(Kaufman, et al., EMBO J. (1987) 6: 187)를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 전형적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 유인원 바이러스 40, 및 본 명세서에 개시되고 당업계에 공지된 다른 것으로부터 유래된다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 챕터 16 및 17을 참조한다.
본 개시내용의 벡터는 특정 세포 유형에서 우선적으로 핵산의 발현을 지시할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 조절 요소는 핵산을 발현하는 데 사용된다). 이러한 조절 요소는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있는 프로모터를 포함한다. 프로모터에 적용되는 용어 "조직 특이적"은 상이한 유형의 조직에서 관심대상의 동일한 뉴클레오타이드 서열의 발현이 상대적으로 부재할 때 관심대상 뉴클레오타이드 서열을 특정 유형의 조직(예를 들어, 시드)으로 선택적으로 발현하도록 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 프로모터에 적용되는 용어 "세포 유형 특이적"은 동일한 조직 내의 상이한 유형의 세포에서 관심대상의 동일한 뉴클레오타이드 서열의 발현이 상대적으로 부재할 때 특정 유형의 세포에서 관심대상 뉴클레오타이드 서열의 선택적인 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 프로모터에 적용될 때 용어 "세포 유형 특이적"은 또한 단일 조직 내의 영역에서 관심대상 뉴클레오타이드 서열의 선택적 발현을 촉진할 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터의 세포 유형 특이성은 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어, 면역조직화학적 염색을 사용하여 평가될 수 있다.
기존의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 포유동물 세포 또는 표적 조직에서 CRISPR/Cas9를 암호화하는 핵산을 도입할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 CRISPR-Cas 시스템의 성분을 암호화하는 핵산을 배양물 또는 숙주 유기체 중의 세포에 투여할 수 있다.
비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA(예를 들어, 본 명세서에 기재된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 일 실시형태에서, 사용된 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 사전 형성된 리보핵단백질 복합체(예를 들어, 표적화 gRNA와 복합체로 Cas9 단백질을 포함하는 복합체)이다. 그 다음 사전 형성된 리보핵단백질 복합체는 전기천공법, 유전자 충격(biolistic bombardment) 또는 다른 물리적 전달 방법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 전기천공법을 사용하여 사전 형성된 리보핵단백질 복합체를 세포 내로 도입한다.
바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접(생체내) 투여될 수 있거나, 변형된 세포가 환자에게 투여될 수 있는 시험관내 또는 생체외에서 세포를 조작하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 바이러스 기반 시스템을 이용한다. 또한, 본 개시내용은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 숙주 게놈에 통합될 수 있는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 CRISPR-Cas 시스템의 발현에 사용되는 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 CRISPR-Cas를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 진핵 세포 내로 도입하는 것을 제공한다. 세포는 암 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포는 조혈 줄기세포와 같은 조혈 세포이다. 줄기세포의 예는 만능(pluripotent), 다능(multipotent) 및 단능(unipotent) 줄기세포를 포함한다. 만능 줄기세포의 예는 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 배아 암종 세포 및 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 CRISPR-Cas9를 조혈 줄기세포 내로 도입하는 것을 제공한다.
본 개시내용의 벡터는 대상체의 진핵 세포에 전달된다. CRISPR/Cas9 시스템을 통한 진핵 세포의 변형은 세포 배양물에서 일어날 수 있으며, 여기서 방법은 변형 전에 대상체로부터 진핵 세포를 단리시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 상기 진핵 세포 및/또는 이로부터 유래된 세포를 대상체에게 복귀시키는 단계를 추가로 포함한다.
병용 요법
본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포-표면 계통-특이적 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제는 세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍된 조혈 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 gRNA를 사용하여 생산된 조혈 줄기 또는 전구세포와 조합하여 대상체에게 투여될 수 있고, 여기서 예를 들어, gRNA는AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67) 또는 CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50) 또는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에서 유전자 돌연변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호 교환적으로 사용되며, 척추동물, 바람직하게는 인간과 같은 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 인간 영장류, 비인간 영장류 또는 뮤린, 소, 말, 개 또는 고양이과 종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자이다.
일부 실시형태에서, 작용제 및/또는 조혈 세포는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되어 약제학적 조성물을 형성할 수 있으며, 이는 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해, 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제의 유효량 및 유효량의 조혈 세포가 치료를 필요로 하는 대상체에게 공동-투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 "치료적 유효량"이라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 목적하는 활성을 초래하기에 충분한 작용제, 세포 집단 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 작용제 및/또는 조혈 세포를 포함하는 조성물)의 양을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락 내에서, 용어 "유효량"은 본 개시내용의 방법에 의해서 치료되는 장애의 징후를 지연시키고, 진행을 정지시키고, 적어도 하나의 증상을 경감 또는 완화시키기에 충분한 화합물, 세포 집단 또는 약제학적 조성물의 양을 지칭한다. 활성 성분의 조합물이 투여되는 경우, 조합물의 유효량은 개별적으로 투여되는 경우 효과적이었을 각각의 성분의 양을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음을 주목하기 바란다.
유효량은, 당업자에게 인식되는 바와 같이, 치료될 특정 상태, 병태의 중증도, 연령, 신체 상태, 체격, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 매개변수, 치료 기간, 동반 요법의 특성(존재하는 경우), 특정 투여 경로 및 의료 종사자의 지식 및 전문 지식 내에서 유사한 요소에 따라서 달라진다. 일부 실시형태에서, 유효량은 대상체에서 임의의 질환 또는 장애를 완화시키거나, 경감시키거나, 향상시키거나, 개선시키거나, 증상을 감소시키거나 또는 진행을 지연시킨다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 키메라 수용체를 발현하는 조혈 세포 및/또는 면역 세포는 대상체에 대해서 자가일 수 있으며, 즉, 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현 또는 키메라 수용체 작제물의 발현이 결핍되도록 유전자 조작된, 치료를 필요로 하는 대상체로부터 수득되고, 그 다음 동일한 대상체에게 투여된다. 대상체에 자가 세포를 투여하면 비-자가 세포를 투여하는 것과 비교할 때 숙주 세포에 대한 거부 반응이 감소될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 동종이계 세포이고, 즉, 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원의 발현 또는 키메라 수용체 작제물의 발현이 결핍되도록 유전자 조작된, 제1 대상체로부터 얻어지고, 제1 대상체와 상이하지만, 동일한 종인 제2 대상체에 투여된다. 예를 들어, 동종이계 면역 세포는 인간 공여자로부터 유래되어, 공여자와 상이한 인간 수용자에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 세포 및/또는 조혈 세포는 동종이계 세포이고, 이식편대숙주병을 감소시키도록 추가로 유전자 조작되었다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 조혈 줄기세포는 CD45RA의 감소된 발현을 갖도록 유전자 조작될 수 있다(예를 들어, 게놈 편집을 사용하여).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포는 표적 세포(예를 들어, 암 세포)의 수를 적어도 20%, 예를 들어, 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그 초과만큼 감소시키는 데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여되는 세포, 즉, 면역 세포 또는 조혈 세포의 전형적인 양은 예를 들어, 1백만개 내지 1000억개 세포의 범위일 수 있지만; 이러한 예시적인 범위 미만 또는 초과의 양이 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 예를 들어, 세포의 1일 용량은 약 100만 내지 약 500억개 세포(예를 들어, 약 5백만개 세포, 약 2천 5백만개 세포, 약 5만개 세포, 약 10억개 세포, 약 50억개 세포, 약 200억개 세포, 약 300억개 세포, 약 400억개 세포 또는 상기 값 중 임의의 둘에 의해서 정의된 범위), 바람직하게는 약 100억개 내지 약 1000억개 세포(예를 들어, 약 200억개 세포, 약 300억개 세포, 약 400억개 세포, 약 600억개 세포, 약 700억개 세포, 약 800억개 세포, 약 900억개 세포, 약 100억개 세포, 약 250억개 세포, 약 500억개 세포, 약 750억개 세포, 약 900억개 세포 또는 상기 값 중 임의의 둘에 의해서 정의된 범위), 보다 바람직하게는 약 1000억개 세포 내지 약 500억개 세포(예를 들어, 약 1억 2천만개 세포, 약 2억 5천만개 세포, 약 3억 5천만개 세포, 약 4억 5천만개 세포, 약 6억5천만개 세포, 약 8억개 세포, 약 9억개 세포, 약 30억개 세포, 약 300억개 세포, 약 450억개 세포 또는 상기 값 중 임의의 둘에 의해서 정의된 범위)일 수 있다.
일 실시형태에서, 키메라 수용체(예를 들어, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산)는 면역 세포 내로 도입되고, 대상체(예를 들어, 인간 환자)는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 초기 투여 또는 용량을 제공받는다. 작용제(예를 들어, 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포)의 1회 이상의 후속 투여는 이전 투여 후에 15일, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일의 간격으로 환자에게 제공될 수 있다. 1회 초과의 용량의 작용제, 예를 들어, 2, 3, 4회 또는 그 초과의 작용제가 주 단위로 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체는 주 1회 초과의 용량의 작용제(예를 들어, 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포)를 제공받고, 그 다음 1주 동안 작용제가 투여되지 않고, 마지막으로 1회 이상의 추가 용량의 작용제(예를 들어, 주당 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 1회 초과의 투여)를 제공받을 수 있다. 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포는 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주 또는 그 초과 동안 주 3회 투여를 위해 격일로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 본 명세서에 인용된 질환 상태 중 임의의 것과 관련된 한, 용어 "치료하다", "치료" 등은 그러한 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 경감 또는 완화시키거나 또는 그러한 상태의 진행을 둔화시키거나 역전시키는 것을 의미한다. 본 개시내용의 의미 내에서, 용어 "치료하다"는 또한 질환을 정지시키고/시키거나, 발병을 지연(즉, 질환의 임상적 징후 이전의 기간)시키고/시키거나 질환의 발병 또는 악화 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 암과 관련하여 용어 "치료하다"는 환자의 종양 부담을 제거 또는 감소시키거나, 전이를 예방하거나, 지연시키거나 또는 저해하는 등을 의미할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원 및 세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍된 조혈 세포의 집단에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제가 제공된다. 따라서, 이러한 치료 방법에서, 작용제는 표적 사멸을 위한 세포-표면 계통-특이적 항원을 발현하는 표적 세포를 인식(결합)한다. 항원이 결핍된 조혈 세포는 작용제에 의해서 표적화되는 세포 유형의 재증식을 허용한다. 일부 실시형태에서, 환자의 치료는 하기 단계를 포함할 수 있다: (1) 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적으로 하는 작용제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계 및 (2) 환자에게 자가 또는 동종이계의 조혈 줄기세포를 주입 또는 재주입하는 단계(여기서 조혈 세포는 계통 특이적 질환-연관 항원의 발현이 감소됨). 일부 실시형태에서, 환자의 치료는 하기 단계를 포함할 수 있다: (1) 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계(여기서 면역 세포는 세포-표면 계통-특이적 질환-연관 항원에 결합하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함함); 및 (2) 환자에게 자가 또는 동종이계의 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기세포)를 주입 또는 재주입하는 단계(여기서 조혈 세포는 계통 특이적 질환-연관 항원의 발현이 감소됨).
세포-표면 계통-특이적 항원 및 세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍된 조혈 세포의 집단에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제를 사용하는 치료 방법의 효능은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고, 숙련된 의료 전문가에게 자명할 것이다. 예를 들어, 요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 이의 조직 또는 샘플에서의 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 요법의 효능은 특정 집단 또는 세포의 계통에 속하는 세포의 수를 정량함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 요법의 효능은 세포-표면 계통-특이적 항원을 제시하는 세포의 수를 정량함으로써 평가된다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원 및 조혈 세포의 집단에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제는 동반하여 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포)는 조혈 세포의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포)는 조혈 세포의 투여 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 초과 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포)는 조혈 세포의 투여 전에 대상체에게 수 회 투여된다.
일부 실시형태에서, 조혈 세포는 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포) 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포 집단은 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 작용제의 투여 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 초과 전에 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원 및 조혈 세포의 집단을 표적으로 하는 작용제는 실질적으로 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적으로 하는 작용제가 투여되고, 일정 기간 동안 환자가 평가되고, 그 후 조혈 세포의 집단이 투여된다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포의 집단이 투여되고, 일정 기간 동안 환자가 평가되고, 그 후 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적으로 하는 작용제가 투여된다.
또한 작용제 및/또는 조혈 세포의 집단의 다중 투여(예를 들어, 투약)가 본 개시내용의 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 작용제 및/또는 조혈 세포의 집단은 대상체에게 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 작용제 및/또는 조혈 세포의 집단은 1회 초과(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과)로 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 작용제 및/또는 조혈 세포의 집단은 규칙적인 간격, 예를 들어, 6개월마다 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 조혈 악성종양을 갖는 인간 대상체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 조혈 악성종양은 조혈 세포(예를 들어, 전구세포 및 줄기세포를 포함하는 혈액 세포)를 포함하는 악성 이상을 지칭한다. 조혈 악성종양의 예는 비제한적으로 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종을 포함한다. 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 또는 만성 림프모구성 백혈병, 및 만성 림프성 백혈병을 포함한다.
일부 실시형태에서, 백혈병은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. AML은 주요 분화 및 성장 조절 경로를 방해하는 중요한 유전적 변화를 점진적으로 획득한 형질전환된 세포에서 유래하는 이종 클론성 신생물성 질환으로서 특징규명된다(Dohner et al., NEJM, (2015) 373:1136). CD33 당단백질은 대부분의 골수성 백혈병 세포뿐만 아니라 정상 골수성 및 단핵구 전구체에서 발현되며, AML 요법에 대한 매력적인 표적으로 간주되어 왔다(Laszlo et al., Blood Rev. (2014) 28(4):143-53). 항 CD33 단클론성 항체 기반 요법을 사용한 임상 시험에서 표준 화학요법과 병용했을 때 AML 환자의 하위세트에서 생존율이 개선된 것으로 나타났지만, 이러한 효과에는 안전성 및 효능 문제도 동반되었다.
AML 세포를 표적으로 하는 다른 노력은 AML에서 CD33을 선택적으로 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포의 생성과 관련이 있다(Buckley et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. (2):65 (2015)). 그러나 데이터가 제한적이며, 이러한 접근법이 환자 치료에 얼마나 효과적인지(모든 표적 세포가 제거되었는지 여부)에 대한 불확실성이 있다. 또한 골수 계통 세포는 생명에 필수적이기 때문에 골수 계통 세포의 대상체를 고갈시키는 것은 환자의 생존에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 본 개시내용은 AML 치료와 연관된 이러한 문제를 적어도 부분적으로 해결하는 것을 목표로 한다.
대안적으로 또는 추가로, 본 명세서에 기재된 방법은 비제한적으로 폐암, 귀, 코 및 인후암, 결장암, 흑색종, 췌장암, 유선암, 전립선암, 유방암, 난소암, 기저 세포 암종, 담도암; 방광암; 골암; 유방암; 자궁 경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합 조직 암; 소화계의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암; 상피내 신생물; 신장암; 후두암; 간암; 섬유종, 신경모세포종; 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 신장암; 호흡기암; 육종; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁암; 비뇨기계의 암, 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종을 포함하는 비-조혈암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
암종은 상피 기원의 암이다. 본 개시내용의 방법으로 치료하고자 하는 암종은 세엽세포암종(acinar carcinoma), 선방상 암종(acinous carcinoma), 폐포성 선암종(또한, 샘낭암종, 샘근상피종(adenomyoepithelioma), cribriform carcinoma) 및 원주종(cylindroma)이라고도 함), 선암종, 선암, 부신피질 암종, 폐포성 암종, 폐포상피암(세기관지성 암종, 폐포세포 종양 및 폐선종증이라고도 함), 기저세포암종, 암종 기저세포(carcinoma basocellulare)(기저세포암(basaloma) 또는 바실로마(basiloma), 및 모기질 암종이라고도 함), 기저세포암종(basaloid carcinoma), 기저편평세포암, 유방암, 세기관지암, 세기관지성 암종, 기관지원성 암종, 대뇌모양 암종, 담관세포 암종(담관종 및 담관암종이라고도함), 융모막 암종, 콜로이드질 암종, 면포암종, 자궁체부암종, 사상형 암종, 흉부갑옷 암종(carcinoma en cuirasse), 피부 암종(carcinoma cutaneum), 원통형 암종, 원주세포 암종, 도관 암종, 경성 암종(carcinoma durum), 배아 암종, 뇌양 암종(encephaloid carcinoma), 안구상 암종(epibulbar carcinoma), 표피 암종, 상피 암종 아데노이드, 궤양 성 암종(carcinoma exulcere), 섬유성 암종(carcinoma fibrosum), 젤라틴형 암종(gelatiniform carcinoma), 교상 암종(gelatinous carcinoma), 거대세포 암종, 거대세포(gigantocellulare), 선 암종, 과립막 세포 암종, 모 기질 암종, 간세포양 암종(hepatoid carcinoma), 간세포 암종(간암, 악성 간암 및 헤파토카르시노마(hepatocarcinoma)라고도 함), 허들세포 암종, 유리질 암종, 고신장형 암종, 소아형 배아 암종, 상피내암종(carcinoma in situ), 표피내암, 상피내암(intraepithelial carcinoma), 크롬페쳐 암종(Krompecher's carcinoma), 쿨치즈키-세포 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 렌즈핵성 암종(lenticular carcinoma), 수정체 암종(carcinoma lenticulare), 지방성 암종, 림프상피 암종, 유선 암종(carcinoma mastitoides), 수양암(carcinoma medullare), 속질암종(medullary carcinoma), 흑피증 암종(carcinoma melanodes), 흑색 암종(melanotic carcinoma), 점액 암종, 점액분비 암종(carcinoma muciparum), 점액세포 암종(carcinoma mucocellulare), 점액표피양 암종, 점액암(carcinoma mucosum), 점액 암종(mucous carcinoma), 점액종중 암종(carcinoma myxomatodes), 비인두 암종, 흑색 암종(carcinoma nigrum), 귀리세포 암종, 골화성 암종(carcinoma ossificans), 유골 암종(osteoid carcinoma), 난소 암종, 유두상 암종, 문맥주위 암종(periportal carcinoma), 자궁경부 상피내암, 전립선 암종, 신장의 신세포 암종(또한, 신장의 선암 및 고신장형 암종이라고도 함), 예비 세포 암종, 육종양 암종(carcinoma sarcomatodes), 시나이더 암종, 섬유질 암종, 음낭 암종, 인환 세포 암종, 단순 암종, 소세포 암종, 솔레노이드 암종, 둥근 세포 암종, 방추 세포 암종, 해면양 암종, 편평 암종(squamous carcinoma), 편평세포 암종, 스트링 암종(string carcinoma), 모세혈관확장성 암종(carcinoma telangiectaticum), 모세혈관 확장성 암종(carcinoma telangiectodes), 이행세포 암종, 황색종 암종(carcinoma tuberosum), 관상 암종, 사마귀모양 암종, 및 유모 암종(carcinoma vilosum)을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 유방, 자궁경부, 난소, 전립선, 폐, 결장 및 직장, 췌장, 위 또는 신장의 암을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용된다.
육종은 뼈 및 연조직에서 발생하는 중간엽 신생물이다. 다양한 유형의 육종이 인식되며 이들은 다음을 포함한다: 지방육종(점액성 지방육종 및 다형성 지방 육종을 포함), 평활근육종, 횡문근육종, 악성 말초신경초 종양(악성 신경초종, 신경섬유육종, 또는 신경성 육종이라고도 함), 유잉 종양(Ewing's tumor)(뼈의 유잉 육종, 골외(즉, 뼈가 아닌) 유잉 육종 및 원시 신경외배엽성 종양[primitive neuroectodermal tumor: PNET] 포함), 활막 육종, 맥관 육종, 혈관 육종, 림프관 육종, 카포시 육종, 혈관내피종, 섬유 육종, 데스모이드 종양(desmoid tumor)(공격성 섬유종증이라고도 함), 융기성 피부 섬유육종(dermatofibrosarcoma protuberans: DFSP), 악성 섬유조직구종(malignant fibrous histiocytoma: MFH), 혈관주위세포종, 악성 간엽세포 종, 포상 연부 육종, 유상피 육종, 투명 세포 육종, 결합조직형성 소세포 종양, 위장관 간질성 종양(gastrointestinal stromal tumor: GIST)(GI 간질성 육종이라고도 알려짐), 골육종(골원성 육종이라고도 알려짐)-골격 및 골외, 및 연골육종.
일부 실시형태에서, 치료될 암은 난치성 암일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "난치성 암"은 처방된 치료 표준에 내성이 있는 암이다. 이러한 암은 초기에 치료에 반응하는 것처럼 보일 수 있거나(그 다음 재발), 치료에 완전히 반응하지 않을 수 있다. 일반적인 치료 표준은 암 유형 및 대상체의 진행 정도에 따라 달라질 것이다. 그것은 화학 요법, 수술, 방사선 또는 이들의 조합일 수 있다. 당업자는 이러한 치료 표준을 알고 있다. 따라서 난치성 암에 대해 본 개시내용에 따라 치료될 대상체는 암에 대한 또 다른 치료에 이미 노출되었을 수 있다. 대안적으로, 암이 난치성일 가능성이 있는 경우(예를 들어, 암 세포의 분석 또는 대상체의 병력이 주어진 경우), 대상체는 이미 또 다른 치료에 노출되지 않았을 수 있다. 난치성 암의 예는 백혈병, 흑색종, 신세포 암종, 결장암, 간(liver)(간(hepatic))암, 췌장암, 비호지킨 림프종 및 폐암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포 중 임의의 것은 약제학적 조성물로서 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 중에 투여될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및/또는 세포와 관련하여 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한"이라는 문구는 생리학적으로 용인되고, 포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여될 때 뜻밖의 반응을 전형적으로 생성하지 않는 분자 엔티티 및 이러한 조성물의 다른 성분을 지칭한다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 포유동물, 보다 특히 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거됨을 의미한다. "허용 가능한"은 담체가 조성물의 활성 성분(예를 들어, 핵산, 벡터, 세포 또는 치료용 항체)과 상용성이고, 조성물(들)이 투여되는 대상에 부정적인 영향을 미치지 않음을 의미한다. 본 방법에 사용될 임의의 약제학적 조성물 및/또는 세포는 동결건조된 형성물 또는 수용액의 형태로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다.
완충제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제; 저분자량 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 아미노산; 소수성 고분자; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물; 금속 착물; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover] 참고.
치료 용도를 위한 키트
또한 본 개시내용의 범주 내에는 세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍된 조혈 세포의 집단과 조합하여 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적으로 하는 작용제를 사용하기 위한 키트가 있다. 이러한 키트는 세포-표면 계통-특이적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 임의의 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포), 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제1 제약 조성물, 및 세포-표면 계통-특이적 항원이 결핍된 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기세포)의 집단 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제2 제약 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키트는 ATCCCTGGCACTCTAGAACC(서열번호 50) 또는 CCTCACTAGACTTGACCCAC(서열번호 58)의 서열을 갖는 부위에 결합하는 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70) 또는 AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 포함된 설명서는 대상체에서 의도된 활성을 달성하기 위해 대상체에 대한 제1 약제학적 조성물 및 제2 약제학적 조성물의 투여에 대한 설명을 포함할 수 있다. 키트는 대상체가 치료를 필요로 하는지 여부를 식별하는 것에 기초하여 치료에 적합한 대상체를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 설명서는 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1 약제학적 조성물 및 제2 약제학적 조성물을 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다.
세포-표면 계통-특이적 항원을 표적으로 하는 작용제 및 본 명세서에 기재된 제1 약제학적 조성물 및 제2 약제학적 조성물의 사용에 관한 설명은 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 용량 패키지) 또는 하위 단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 제공된 설명은 일반적으로 라벨 또는 패키지 삽입물에 기재된 설명이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 약제학적 조성물이 대상체의 질환 또는 장애를 치료하고/하거나, 발병을 지연시키고/시키거나 완화시키는 데 사용된다는 것을 기재한다.
본 명세서에 제공된 키트는 적절한 포장 내에 존재한다. 적합한 포장은 바이알, 병, 자(jar), 가요성 포장 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한 흡입기, 비강 투여 장치 또는 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 용기가 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 약제학적 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 수용체 변이체이다.
키트는 선택적으로 추가 성분, 예컨대, 완충액 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 일반적으로 키트는 용기 및 용기 위 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 상기에 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반적인 기술
본 개시내용의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985≫; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984≫; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986≫; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986≫; 및 B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)]에 완전히 설명되어 있다.
추가 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 하기 구체적인 실시형태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것이 아니다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 본 명세서에 참조된 목적 또는 발명 주제를 위해 참조에 의해 원용된다.
실시예 1: 인간 백혈병 세포주에서 CD33의 시험관내 결실
CRSPR-Cas9 시스템이 시험관 내에서 CD33을 표적화하는 능력을 시험하기 위해서, 인간 백혈병 세포 K-562를 Neon™(써모 피셔 사이언티픽사)을 사용하여 Cas9-GFP(PX458, 에스. 피오게네스) 및 NGG PAM 서열을 함유하는 가이드 RNA(도 4)로 공동 형질주입시켰고, 여기서 가이드 RNA는 표적 hCD33 게놈 서열을 표적으로 하도록 설계되었다. 형질주입 48시간 후, Cas9를 발현하는 세포를 식별하고, GFP에 대한 FACS 분류를 사용하여 단리시켰다. 그런 다음 세포를 96시간 동안 인큐베이션시키고, 유세포 분석법에 의해 CD33 발현을 시험하였다(도 5). 항-CD33 항체를 사용한 유세포 분석법 플롯은 Cas9 벡터 및 가이드 RNA의 전달 전(상단 플롯) 및 전달 후(하단 플롯) K-562 세포에 의한 CD33 발현을 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 세포의 98%는 형질주입 후 CD33 발현이 결여되었다.
본 실시예는 인간 백혈병 세포에서 CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 CD33의 효율적인 결실을 입증한다.
실시예 2: 인간 백혈병 세포주에서 CD45의 시험관내 결실
CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 시험관내에서 CD45RA를 표적화하였다. 간략하면, TIB-67 세망 세포 육종 마우스 대식세포-유사 세포를 Neon™ 시약(써모 피셔 사이언티픽사)을 사용하여 Cas9-GFP (PX458, 에스. 피오게네스) 및 CRISPR gRNA("NGG" PAM 서열 포함) 표적화 hCD45RA 게놈 서열로 공동 형질주입시켰다. 형질주입 48시간 후, CRISPR-Cas9 시스템을 발현하는 세포를 식별하고, GFP에 대한 FACS 분류를 사용하여 단리시켰다. 이어서 세포를 96시간 동안 인큐베이션시키고, CD45RA 발현에 대해서 시험하였다(도 6). CD45RA 항체를 사용한 유세포 분석법 플롯은 Cas9 벡터 및 가이드 RNA의 전달 전(상단 플롯) 및 전달 후(하단 플롯) CD45RA 발현을 나타낸다.
CD33 발현이 백혈병 세포에서 성공적으로 감소된 실시예 1과 유사하게, 본 실시예의 발견은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 CD45RA의 효율적인 표적화를 나타낸다.
실시예 3: 급성 골수성 백혈병(AML)에서 세포-표면 계통-특이적 CD33의 표적화
본 실시예에는 AML에서 CD33 항원의 표적화를 포함한다. 본 실시예의 구체적인 단계를 하기 표 6에 요약한다.
Figure pct00016
I. CD33-표적화 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 요법
A. 항-CD33 CAR 작제물의 생성
본 명세서에 기재된 CD33을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체는 5'에서부터 3'로 순서대로 다음 성분으로 이루어질 수 있다: pHIV-Zsgreen 렌티바이러스 골격(www.addgene.org/18121/), 펩타이드 신호, CD33 scFv, 힌지, CD28 분자의 막관통 영역, CD28의 세포내 도메인 및 TCR-ζ 분자의 신호전달 도메인.
먼저, 펩타이드 신호, 항-CD33 경쇄(서열번호 1), 가요성 링커 및 항-CD33 중쇄(서열번호 2)를 최적 코작 서열로 pHIV-Zsgreen의 EcoRI 부위에 클로닝한다.
경쇄-링커-중쇄-힌지-CD28/ICOS-CD3ζ의 기본 구조를 가진 CD33에 결합하는 예시적인 키메라 수용체의 핵산 서열을 하기에 제공한다.
부분 1: 경쇄- 링커-중쇄(서열번호 16): 코작 시작 부위를 볼드체로 나타낸다. 펩타이드 신호 L1을 이탤릭체로 나타낸다. 항-CD33 경쇄 및 중쇄를 링커에 의해서 분리된, 볼드체 및 이탤릭체로 나타낸다.
Figure pct00017
Figure pct00018
부분 2: 힌지-CD28/ICOS-CD3ζ NotI 제한 효소 인식 부위를 대문자로 나타낸다. 번역 중단 부위를 볼드체로 나타낸다. BamHI 제한 절단 부위를 밑줄로 나타낸다.
Figure pct00019
다음 단계에서, 힌지 영역, CD28 도메인(서열번호 3) 및 TCR-ζ의 세포질 성분을 pHIV-Zsgreen(이미 펩타이드 신호 및 CD33 scFv를 함유함)의 NotI 및 BamHI 부위에 클로닝한다. 대안적으로, CD28 도메인을 ICOS 도메인(서열번호 4)으로 치환시킬 수 있다.
CD28 및 ICOS 도메인에 추가하여, CD28 및 ICOS 세포내 신호전달 도메인의 단편을 포함하는 융합 도메인을 조작할 것이고(서열번호 5), 이를 사용하여 추가 키메라 수용체를 생성시킨다. 키메라 수용체가 항원 결합 단편, 항-CD33 경쇄 가변 영역, 링커, 항-CD33 중쇄 가변 영역, CD28/ICOS 혼성 영역(CD28의 TM 영역 포함) 및 TCR-ζ 분자의 신호전달 영역을 포함하는 이러한 구성.
키메라 수용체를 생성시키는 데 사용될 수 있는 성분의 예시적인 아미노산 서열, 예컨대, CD28 도메인(서열번호 6), ICOS 도메인(서열번호 7), CD28/ICOS 혼성 도메인(서열번호 8) 및 TCR-ζ를 본 명세서에 제공한다. 대안적으로, 키메라 수용체를 마찬가지로 생성시킬 수 있다(섹션 B.)
B. 항-CD33 CAR 작제물의 대안적인 생성 방법
예시적인 키메라 수용체의 개략도를 도 7의 패널 A 내지 D에 제공한다. 키메라 수용체는 세포외 CD8 힌지 영역, 막관통 및 세포질 신호전달 도메인, 및 CD3 ζ-신호전달 쇄에 연결된, CD33 항원을 인식하는 세포외 인간화 scFv를 사용하여 생성시킬 것이다(도 7, 패널 B). 항-CD33 키메라 수용체를 암호화하는 DNA는 인간화 scFv를 사용하여 생성시킬 것이다(Essand et al., J Intern Med. (2013) 273(2):166). 대안은 CD28 또는 CD28/OX1 또는 CD28/4-1-B-B 혼성 대신 OX-1 또는 41-BB를 함유하는 CAR T 세포를 포함한다(도 7, 패널 C 및 D).
항-CD33 scFV 서열을 생성시키기 위해, 상기에 기재된 항-CD33 항체의 가변 영역의 중쇄 및 경쇄의 암호 영역(서열번호 1 및 2)을 특정 프라이머로 증폭시키고, 세포에서의 발현을 위해서 pHIV-Zsgreen 벡터에 클로닝할 것이다. scFv(단일 쇄 가변 단편)의 표적 항원에 대한 결합 강도를 평가하기 위해서, scFv를 Hek293T 세포에서 발현시킬 것이다. 이를 위해, 벡터(암호 영역을 포함하는 pHIV-Zsgreen)를 이. 콜라이(E. coli) Top10F 박테리아 및 준비된 플라스미드에 형질전환시킬 것이다. scFv 항체를 암호화하는 얻어진 발현 벡터를 Hek293T 세포 내로 형질주입에 의해 도입할 것이다. 형질주입된 세포를 5일 동안 배양한 후, 상청액을 제거하고, 항체를 정제할 것이다.
생성된 항체를 당업계에 공지된 프로토콜에 의한 프레임워크 치환을 사용하여 인간화시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 하나의 프로토콜이 BioAtla(미국 샌디에이고 소재)에 의해 제공되며, 여기서 주형 항체로부터 유래된 합성 CDR 암호화 단편 라이브러리를 기능적으로 발현된 항체의 생식선 서열로 제한된 인간 프레임워크 풀로부터의 단편 라이브러리를 암호화하는 인간 프레임워크 영역에 결찰시킨다(bioatla.com/applications/express-humanization/).
항원 결합 친화도를 향상시키기 위해 친화도 성숙을 수행할 수 있다. 이는 파지 디스플레이와 같은 당업계에 공지된 일반적인 기술을 사용하여 달성할 수 있다(Schier R., J. Mol. Biol (1996), 263:551). 변이체를 예를 들어, Biacore 분석을 사용하여 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝할 수 있다. 변형을 위한 양호한 후보가 될 초가변 영역 잔기를 식별하기 위해서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 크게 기여하는 초가변 영역 잔기를 식별할 수 있다. 추가로, 기재된 조합 라이브러리를 또한 항체의 친화도를 개선하기 위해 사용할 수 있다(Rajpal et al., PNAS (2005) 102(24): 8466). 대안적으로, BioAtla는 항체의 신속하고, 효율적인 친화성 성숙을 위한 플랫폼을 개발하였으며, 이것을 또한 항체 최적화 목적으로도 사용할 수 있다(bioatla.com/applications/functional-maturation/).
(C) CAR 작제물의 조립
다음으로, 항-CD33 scFv를 세포외 CD8 힌지 영역, 막관통 및 세포질 CD28 신호전달 도메인, 및 CD3 ζ-신호전달 쇄에 연결할 것이다. 간략하면, 항-CD33 scFv 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 상기에 기재된 바와 같이 scFv를 증폭시킬 것이다. 완전한 인간 CD8 암호 서열을 보유하는 플라스미드(pUN1-CD8(www.invivogen.com/puno-cd8a) 를 사용하여 CD8 힌지 및 막관통 도메인(아미노산 135 내지 205)을 증폭시킬 것이다. CD3 ζ 단편을 완전한 인간 CD3ζ 암호 서열을 보유하는 Invivogen 플라스미드 pORF9-hCD247a(http://www.invivogen.com/PDF/pORF9-hCD247a_10E26v06.pdf)에서 증폭시킬 것이다. 마지막으로, CD28(아미노산 153-220, TM 및 CD28의 신호전달 도메인에 해당)을 Trizol 방법에 의해서 활성화된 T 세포로부터 수집된 RNA를 사용하여 생성된 cDNA에서 증폭시킬 것이다. 항-CD33-scFv-CD8-힌지+TM-CD28-CD3ζ를 함유하는 단편을 스플라이스 중첩 확장(splice overlap extension: SOE) PCR을 사용하여 조립할 것이다. 이어서 생성된 PCR 단편을 pELPS 렌티바이러스 벡터에 클로닝할 것이다. pELPS는 CMV 프로모터가 EF-1α 프로모터로 대체되고 HIV의 중심 폴리퓨린 관이 프로모터의 5'에 삽입된 3세대 렌티바이러스 벡터 pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPRE의 유도체이다(Milone et al., Mol Ther. (2009) (8): 1453, Porter et al., NEJM (2011) (8):725). 모든 작제물을 서열결정에 의해서 증명할 것이다.
대안적으로, CD28 도메인 대신 ICOS, CD27, 41BB 또는 OX-40 신호전달 도메인을 함유하는 CAR을 생성시키고, T-세포에 도입하여, CD33 양성 세포를 근절하는 능력에 대해 시험할 것이다(도 7, 패널 C). CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40과 같은 다중 신호전달 도메인을 조합하여 효력을 추가로 증가시키는 "3세대" 키메라 수용체의 생성이 또한 고려된다(도 7, 패널 D)(Sadelain et al., Cancer Discov.(2013) 4:388).
(D) 항-CD33 CAR T 세포 제조
1차 인간 CD8+ T 세포를 면역자기 분리(밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotec))에 의해 환자의 말초 혈액에서 단리시킬 것이다. T 세포를 완전 배지(10% 열-불활성화 FBS, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트, 10mM HEPES가 보충된 RPMI 1640)에서 배양하고, 이미 기재된 바와 같이 항-CD3 및 항-CD28 mAb 코팅 비드(인비트로젠사(Invitrogen)로 자극시킬 것이다(Levine et al., J. Immunol. (1997) 159(12):5921).
패키징 세포주를 사용하여 표적 세포를 형질도입할 수 있고, 항-CD33 키메라 수용체를 함유하는 바이러스 벡터를 생성시킬 것이다. 렌티바이러스 입자를 생성시키기 위해, 본 실시예의 섹션 (1)에서 생성된 CAR을 불멸화된 정상 태아 신장 293T 패키징 세포에 형질주입시킬 것이고, 세포와 함께 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 고글루코스 DMEM과 함께 배양할 것이다. 형질주입 후 48 내지 72시간에 상청액을 수집하고, FBS가 없는 DMEM에서 재조합 렌티바이러스를 농축시킬 것이다. 1차 CD8+ T 세포를 다음으로 폴리브렌의 존재 하에서 약 5 내지 10의 감염 다중도(MOI)에서 형질도입시킬 것이다. 인간 재조합 IL-2(알앤디 시스템즈사(R&D Systems))를 격일로 첨가할 것이다(50IU/㎖). T 세포를 자극 후 약 14일 동안 배양할 것이다. 인간 1차 T 세포의 형질도입 효율을 ZsGreen 리포터 유전자(클론테크사(Clontech), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)의 발현에 의해 평가할 것이다.
E. 환자 내로의 CAR T 세포의 주입
항-CD33 CAR T 세포의 환자 내로의 i.v. 주입 이전에, 세포를 인산염 완충 식염수로 세척하고, 농축할 것이다. 폐쇄 및 멸균 시스템을 제공하는 Haemonetics CellSaver(해모네틱스사(Haemonetics Corporation), 미국 매사추세츠주 브레인트리 소재)와 같은 세포 처리기를 제형 전에 세척 단계 및 농축 단계에 사용할 것이다. 항-CD33 키메라 수용체를 발현하는 최종 T 세포를 인간 혈청 알부민이 보충된 100㎖의 멸균 생리 식염수로 제형화할 것이다. 마지막으로, 환자에게 1 내지 3일의 기간에 걸쳐 1 내지 10×107개의 T 세포/㎏을 주입할 것이다(Maude et al., NEJM (2014) 371(16):1507). 주입된 항-CD33 키메라 수용체를 발현하는 T 세포의 수는 암 환자의 상태, 환자의 연령, 이전 치료 등과 같은 수 많은 요인에 따라 달라질 것이다.
또한, AML 환자에서 CD33을 표적으로 하는 키메라 수용체에 더하여, CD45RA를 표적으로 하는 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포가 또한 본 명세서에서 고려된다. 이것은 2가지 다른 접근법에 의해 달성될 수 있다: 1) 항-CD33 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포 및 항-CD47RA 키메라 수용체를 별도로 발현하는 면역 세포를 생성시키고, 환자에게 두 가지 유형의 면역 세포를 별도로 주입함, 또는 2) CD33 및 CD45RA 둘 다를 동시에 표적으로 하는 면역 세포를 생성시킴(Kakarla et al., Cancer (2):151 (2014)).
II. CD34 + CD33 - 세포를 사용한 자가 조혈 줄기세포 이식(HSCT)
환자로부터의 줄기세포 단리, 컨디셔닝 요법 및 줄기세포의 환자 주입에 관한 프로토콜은 환자의 연령, 병태, 치료 이력 및 치료가 수행되는 기관에 따라 크게 달라질 것이다. 따라서, 하기에 기재된 프로토콜은 단지 예일 뿐이며 당업자에 의한 일상적인 최적화의 대상이 된다.
A. 항-CD33 CAR T 세포의 입양 전달 후 말초 혈액 줄기세포(PBSC) 동원을 사용한 조혈 줄기세포의 단리
AML 환자를 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 10㎎/㎏/일 i.v. 투여로 자극할 것이다. CD34+ 세포 양성 선택을 면역자기 비드 및 면역자기 농축 장치를 사용하여 수행할 것이다. Fenwall CS 3000+ 세포 분리기를 사용하여 최소 2x106개 CD34+세포/㎏ 체중을 수집할 것으로 예상된다(Park et al., Bone Marrow Transplantation (2003) 32:889).
B. 환자의 컨디셔닝 요법
자가 말초 혈액 줄기세포 이식(PBSCT)을 위한 컨디셔닝 요법을 에토포사이드(VP-16) + 사이클로포스파마이드(CY) + 전신 방사선 조사(TBI)를 사용하여 수행할 것이다. 간략하면, 요법은 단일 용량으로서 26시간에 걸친 1.8g/㎡ i.v. 일정량 주입(c.i.v.)의 에토포사이드(VP-16), 그 다음 3일 동안 2시간에 걸쳐서 60㎎/㎏/일 i.v.의 사이클로포스파미드(CY), 그 후 다음 3일 동안 300cGy/일의 전신 방사선 조사(TBI)로 이루어질 것이다.
용량을 계산하기 위해, 이상적인 체중 또는 실제 체중 중 더 적은 것을 사용할 것이다. 이미 언급된 바와 같이, 암 환자의 상태, 환자의 연령, 이전 치료 및 절차가 수행되는 기관의 유형과 같은 요소를 정확한 컨디셔닝 요법을 결정할 때 모두 고려한다.
C. CD33을 표적으로 하는 CRISPR-Cas9 시스템의 플라스미드 작제
삽입물 Cas9 및 퓨로마이신 내성을 함유하는 lentiCRISPR v2를 애드젠사(Addgene)(플라스미드 #52961)에서 입수할 것이다(Sanjana et al., Nat Methods (2014) (8):783) 단일 가이드 RNA(sgRNA) CD33 가이드 서열을 클로닝하기 위해서, lentiCRISPR v2를 절단하고, FastDigest BsmBI 및 FastAP(퍼멘타스사(Fermentas))로 37℃에서 2시간 동안 탈인산화시킬 것이다. CD33을 표적으로 하는 gRNA를 crispr.mit.edu에서 온라인 최적화 설계 도구를 사용하여 설계할 것이다. 대안적으로, gRNA는 도 12(서열번호 11)에 도시된 서열을 가질 것이다. CD33 gRNA 올리고뉴클레오타이드를 Integrated DNA Technologies(IDT)로부터 입수할 것이고, 37℃에서 30분 동안 폴리뉴클레오타이드 키나제(퍼멘타스사)를 사용하여 인산화시키고, 5분 동안 95℃까지 가열하고, 1.5℃/분에서 25℃까지 냉각시킴으로써 어닐링하였다. T7 리가제를 사용하여 올리고를 어닐링하고, 그 후 어닐링된 올리고를 25℃에서 5분 동안 겔 정제된 벡터(퀴아젠사(Qiagen))에 결찰시킬 것이다. 이어서 생성된 플라스미드를 내독소가 없는 midi-prep 키트(퀴아젠사)를 사용하여 증폭시킬 수 있다(Sanjana et al., Nat Methods (2014)(8):783).
대안적으로, 2개의 벡터 시스템은 이미 기재된 프로토콜(Mandal et al., Cell Stem Cell (2014) 15(5):643)을 사용될 수 있다(gRNA 및 Cas가 별도의 벡터로부터 발현되는 경우). 여기에서 Mandal 등은 비-바이러스성 벡터로부터 발현된 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 인간 조혈 줄기세포에서 유전자의 효율적인 절제를 달성하였다.
간략하면, C-말단 SV40 핵 국소화 신호를 함유하는 인간-코돈-최적화 Cas9 유전자를 2A-GFP가 있는 CAG 발현 플라스미드에 클로닝할 것이다. 관심대상 CD33 서열을 절단하도록 Cas9를 지시하기 위해서, 가이드 RNA(gRNA(서열번호 11))를 인간 U6 폴리머라제 III 프로모터를 함유하는 플라스미드로부터 별도로 발현시킬 것이다. gRNA 서열 올리고뉴클레오타이드를 Integrated DNA Technologies(IDT)에서 얻고, 어닐링하고, BbsI 제한 부위를 사용하여 플라스미드에 도입할 것이다. 인간 U6 프로모터에 대한 'G' 염기의 전사 개시 요건뿐만 아니라 PAM(프로토스페이서-인접 모티프) 서열에 대한 요건으로 인해서, 게놈 표적은 GN20GG 뉴클레오타이드 서열을 포함할 것이다.
환자에게 CD33 결핍 조혈 줄기세포 HSC를 주입하는 것 외에도, 후속적으로 환자에게 CD45RA 고갈 HSC를 주입하는 프로토콜을 개발할 것이다. 대안적으로, 본 발명자들은 CD33 및 CD45RA 유전자 둘 다를 동시에 감소시키기 위해 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 CD34+CD33-CD45RA- 세포를 생성시킬 것이다. CD45RA 및 CD33에 대한 가이드 RNA 서열의 예를 하기 표 4 및 표 5에 나타낸다.
D. CD34 + CD33 - 세포를 생성시키기 위한 CD34 + 세포 HSC의 형질주입
새로 단리된 말초 혈액-유래 CD34+ 세포(4단계로부터)를 세포 배양 등급 줄기세포 인자(SCF) 300ng/㎖, FLT3-L 300 ng/㎖, 트롬보포이에틴(TPO) 100ng/㎖ 및 IL-3 60ng/㎖의 존재 하에서 무혈청 CellGro SCGM 배지에 1 Х 106개 세포/㎖로 시딩할 것이다. 사전 자극 24시간 후, CD34+ HSC를 Amaxa 인간 CD34 세포 Nucleofector 키트(U-008)(#VPA-1003)를 사용하여 Cas9 및 CD33 gRNA를 함유하는 LentiCRISPR v2로 형질주입시킬 것이다(Mandal et al., Cell Stem Cell (2014) 15(5):643)). 형질주입 후 24 내지 48시간에 CD34+ CD33- 세포를 1.2㎍/㎖ 퓨로마이신으로 선택한다. 퓨로마이신 선택 후, CD34+CD33- 세포를 퓨로마이신-무함유 배지에서 수 일 동안 유지시킬 것이다.
E. 환자로의 CD34 + CD33 - 세포의 재주입
CRISPR-Cas9-CD33으로 생체외 형질주입된 CD34+ 세포(CD34+CD33- 세포)를 필터가 없는 표준 혈액 투여 세트를 사용하여 Hickman 카테터를 통해 즉시 재주입한다(Hacein-Bey Abina et al. JAMA (2015) 313(15):1550).
일반적으로 위에 요약된 치료 프로토콜을 받은 환자를 순환 모세포 및 혈구감소증의 재발에 대해 모니터링할 것이다. 또한, 특정 환자에서 AML의 기본 기전에 따라, 유익한 분자 또는 세포유전학적 마커의 재출현 또는 유익한 유세포 분석법 패턴을 시험함으로써 시험에 의해서 치료의 성공을 모니터링할 것이다. 예를 들어, 필라델피아 염색체 양성 AML에서 BCR-ABL 신호의 재출현을 BCR(염색체 22) 및 ABL(9번 염색체)에 대한 프로브를 사용하여 형광 동소 교잡법(fluorescent in situ hybridization: FISH)을 사용하여 검출할 것이다.
CRISPR-Cas9 시스템을 통한 CD33 결실의 성공을 평가하기 위해, 말초 혈액 CD34+ 세포를 환자로부터 단리시키고(이식 후), 예를 들어 유세포 분석법, 웨스턴 블로팅 또는 면역조직화학을 사용하여 CD33 발현에 대해 평가할 것이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 실시예에 기재된 HSCT는 자가 또는 동종이계일 수 있고, 두 접근법 모두 적합하고 본 개시내용에 기재된 방법에 포함될 수 있다.
III. 선택적인 단계: 환자를 독소(면역독소)에 부착된 CD33 항체로 계속 치료함
A.CD33 면역독소 젬투주맙 오조가마이신(GO)으로의 환자의 치료
9㎎/㎡의 항-CD33 항체 젬투주맙 오조가마이신(GO)을 2주 간격으로 2회 용량으로 2시간 정맥내 주입하여 환자를 치료할 것이다(Larson et al., Cancer (2005), 104(7):1442-52). GO는 세포증식억제제인 칼리케아미신과 접합된 CD33에 대한 인간화된 단클론성 항체로 구성된다(도 8).
대안적으로, 항-CD33 항체를 상이한 독소, 예컨대, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 A(PE) 또는 리신 독소 A 쇄(RTA)에 접합시킬 수 있다(Wayne et al., Blood (2014) 123(16): 2470). 유사하게, 항-CD45RA 항체를 독소에 부착시켜, 치료 요법에 포함시킬 수 있다.
실시예 4: 항-CD33 키메라 수용체를 발현하는 T 세포 및 NK 세포주는 CD33을 발현하는 표적 세포의 세포 사멸을 유도한다.
CD33에 대한 키메라 수용체의 결합
CD33에 결합하는 키메라 수용체(예를 들어, CART1, CART2, CART3)를 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성시켰고, pHIV-Zsgreen 벡터(애드젠사; 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)에 삽입하였다. 키메라 수용체를 함유하는 벡터를 사용하여 렌티바이러스 입자를 생성시켰고, 이것을 사용하여 상이한 세포 유형, 예를 들어, T 세포주(예를 들어, 293 T 세포) 및 NK 세포주(예를 들어, NK92 세포)를 형질도입시켰다. 키메라 수용체의 발현은 웨스턴 블롯팅(도 9, 패널 A) 및 유세포 분석법(도 9, 패널 B)에 의해 검출하였다.
키메라 수용체를 발현하는 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 선택하고, CD33에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. 간략하면, 키메라 수용체를 발현하는 293T 세포의 용해물을 CD33 또는 CD33-알로피코시아닌(APC) 접합체와 함께 배양하였다. 샘플을 단백질 전기영동하고, Ponceau 단백질 염색으로 염색하거나(도 10, 패널 A), 막으로 옮기고, 항-CD3ζ 1차 항체로 프로빙하였다(도 10, 패널 B). 두 경우 모두, 키메라 수용체와 표적 CD33 사이의 결합이다.
키메라 수용체를 발현하는 K562 세포를 또한 프로브로서 CD33을 사용하여 유세포 분석법에 의해 CD33에 대한 결합에 대해 평가하였다(도 10, 패널 C). 빈 벡터 대조군을 함유하는 세포와 비교할 때 키메라 수용체(CART1, CART2 또는 CART3) 및 CD33 결합의 발현에 대해 양성인 세포의 수가 증가하였는데, 이는 키메라 수용체가 CD33에 결합한다는 것을 나타낸다.
키메라 수용체를 발현하는 세포에 의해서 유도된 세포독성
키메라 수용체를 발현하는 NK-92 세포를 세포 표면에 CD33을 제시하는 표적 세포의 세포독성을 유도하는 능력에 대해 기능적으로 특징규명하였다(예를 들어, K562는 CD33+인 인간 만성 골수성 백혈병 세포주임). 세포독성 검정을 수행하기 위해서, 효과기 세포(면역 세포, 예컨대, NK-92 세포)를 키메라 수용체를 암호화하는 렌티바이러스 입자로 감염시키고, 확장시켰다. 감염 7일 후, 키메라 수용체 암호화 벡터(예를 들어, GFP+ 또는 Red+)에 의해 또한 암호화된 형광 마커를 선택함으로써 키메라 수용체를 발현하는 세포를 FACS 분석에 의해 선택하였다. 키메라 수용체를 발현하는 선택된 세포를 1주일 동안 확장시켰다. 감염 14일 후, 표적 세포(표적 세포-표면 계통 특이적 항원, CD33을 발현하는 세포)를 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스터(CFSE)로 염색하고, 표적 세포 및 키메라 수용체를 발현하는 세포를 모두 계수하는 것을 포함하는 세포독성 검정을 수행하였다. 상이한 비율의 표적 세포 및 키메라 수용체를 발현하는 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 4.5시간 동안 공동 인큐베이션시킨 후, 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD)를 첨가하여 비-생존 세포를 염색하였다. 유세포 분석법을 수행하여 생존 및 비-생존 표적 세포의 집단을 열거하였다. 도 11, 패널 A 및 패널 B에 나타낸 바와 같이, 키메라 수용체 CART1, CART2 또는 CART3을 발현하는 NK92 세포는 평가된 각각의 세포 비에서 표적 K562 세포의 상당한 양의 세포 사멸을 유도하였다.
K562 세포의 세포 사멸이 CD33에 대한 키메라 수용체의 특이적 표적화에 의존하는 지를 결정하기 위해서, K562를 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 CD33이 결핍되도록 유전자 조작하였다. 간략하면, 인간 코돈-최적화된 Cas9 엔도뉴클레아제 및 CD33의 IgC 도메인의 일부를 표적으로 하는 gRNA를 K562 세포에서 발현시켜, CD33-결핍 K562 세포의 집단을 생성시켰다. 세포를 확장하고, 키메라 수용체를 발현하는 NK92 세포와 공동 인큐베이션시키고, 세포독성 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 12, 패널 A에 나타낸 바와 같이, 풀링된 CD33-결핍 K562 세포는 키메라 수용체를 발현하는 NK92 세포와의 공동 인큐베이션 시에 세포 사멸의 적당한 감소를 나타내었다. 그러나, CD33-결핍 K562 세포의 단일 클론을 단리시키고, 확장시키고, 이를 사용하여 세포독성 검정을 수행한 경우, 세포독성의 더 현저한 감소가 관찰되었다(도 12, 패널 B).
1차 T 세포에서 키메라 수용체의 발현
CD4+, CD8+ 또는 CD4+/CD8+ 세포를 양성으로 선택함으로써 FACS에 의해 공여자로부터 얻은 PMBC로부터 1차 T 세포 집단을 단리시켜, 고순도 집단을 생성시켰다(도 13, 패널 A 및 B). 1차 T 세포(CD4+, CD8+ 또는 CD4+/CD8+ 세포)의 각각의 집단을 키메라 수용체(예를 들어, CART1 및 CART8)를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였고, 키메라 수용체를 발현하는 생성된 1차 T 세포를 사용하여 상기에 기재된 바와 같이 세포독성 검정을 수행하였다. 키메라 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포의 집단과 K562(1000개의 표적 K562 세포)의 공동 인큐베이션은 K562 세포의 세포독성을 초래하지 않았다(도 14, 패널 A). 대조적으로, 키메라 수용체를 발현하는 CD8+ 또는 CD4+/CD8+ 세포 및 1000개의 표적 K562 세포를 사용한 세포독성 검정에서, CD8+ 또는 CD4+/CD8+ 세포는 낮은 세포 비율에서 K562 세포의 세포 사멸을 유도할 수 있었다(도 14, 패널 B).
인간 조혈 줄기세포의 유전자 조작
CD33의 IgC 도메인에 혼성화하도록 몇몇 gRNA를 설계하였다(예를 들어, 표 4, 서열번호 11 또는 28 내지 31 참고). 각각의 gRNA를 K562 세포에서 Cas9 엔도뉴클레아제와 함께 발현시켰다. CD33의 발현은 유세포 분석법에 의해 평가하였다(도 15). Crispr 3(서열번호 28) 및 Crispr5(서열번호 29)에 대해 나타낸 바와 같이, CD33을 발현하는 대조군 세포와 비교할 때 CD33-표적화 CRISPR/Cas 시스템을 발현하는 세포에서 CD33의 상당한 감소가 발견되었다.
CD33-결핍 조혈 줄기세포를 증식, 적혈구 분화 및 집락 형성을 포함한 다양한 특성에 대해서도 평가하였다. 간략하면, CD33-결핍 조혈 줄기세포 및 대조군 세포를 헤민 및 적혈구계 전구체의 마커인 CD71에 노출시켜 분화를 유도하였고, 상이한 시점에서 유세포 분석법에 의해 평가하였다(도 16, 패널 A 및 패널 B). CD33-결핍 조혈 줄기세포는 적혈구 분화를 겪었고, 유세포 분석법 프로파일은 대조군 세포(CD33+)와 유사하게 나타났다. 세포를 또한 CD33-결핍 조혈 줄기세포의 대사 활성을 측정하기 위해 MTT 검정하였다. 도 16, 패널 C에 나타낸 바와 같이, CD33-결핍 조혈 줄기세포는 대조군 세포와 대등한 성능을 나타내었다. 마지막으로, 현미경적 집락 형성 검정을 사용하여 세포의 증식 및 집락 형성 능력을 관찰하였다. 다시, CD33-결핍 조혈 줄기세포는 대조군 세포와 유사한 정도로 집락을 형성할 수 있었다(도 18). 이러한 결과는, CD33의 일부의 CRISPR/Cas 결실이 세포가 증식, 분화 또는 집락을 형성하는 능력에 유의한 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 유전자-편집된 줄기세포는 골수성 악성종양을 위한 CD33-유도 면역요법을 가능하게 한다.
키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 또는 항체-약물 접합체(ADC)와 같은 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 항원-유도 면역요법은 정상 골수 세포 또는 골수성 전구와 백혈병을 구별할 수 있는 고유한 표적화 가능한 항원이 없기 때문에 심각한 독성과 관련이 있다. 여기서는, 계통 특이적 골수 항원 CD33을 표적으로 하여 AML을 치료하기 위한 새로운 접근법이 제시된다. 본 발명의 접근법은 CD33-표적화 CAR-T 세포 및/또는 ADC, 젬투주맙 오조가마이신을, 게놈 조작 방법을 사용하여 CD33 발현을 제거하도록 조작된 조혈 줄기세포(HSC)의 이식과 조합한다. 인간 줄기/전구세포(HSPC)에서 CRISPR/Cas9 기술을 사용한 CD33 항원의 매우 효율적인 유전적 절제가 밝혀져 있고, HSPC에서 CD33의 결실이 생체내에서 다계통 조혈 시스템을 이식하고, 다시 생존하는 능력을 손상시키지 않는다는 증거가 제공되어 있다. 전체 게놈 서열결정 및 RNA 서열결정 분석은 검출 가능한 표적외 돌연변이유발 및 기능적 p53 경로의 손실을 나타내지 않았다. 인간 AML 세포주(HL-60)를 사용하여, 최소 잔류 질환이 있는 관해 후 골수를 모델링하였고, CD33-절제된 HSPC의 이식과 CD33-표적화 면역요법은 CD33-절제된 HSPC의 다계통 자손의 생착 및 회수에 의해서 입증되는 바와 같이, 골수 억제 없이 백혈병 제거로 이어지는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 연구는 표적화 면역요법의 발전에 기여하고, 다른 악성종양에서 쉽게 복제될 수 있다.
급성 골수성 백혈병은 특히 관해 후 환자에서 효과적인 치료법에 대한 충족되지 않은 요구가 있는 질환이다. CD33과 같은 계통-특이적 항원(LSA)에 대한 면역요법은 표적내 효과를 나타내지만, 정상 골수 세포 및 조혈 전구가 또한 CD33을 발현하기 때문에 독성에 의해 제한된다. 여기에서 CRISPR 방법을 사용하여, HSPC에서 CD33을 유전자 절제하면 항-CD33 CAR-T 또는 항체 요법을 사용하여 백혈병에 대한 면역요법이 가능하다는 것을 나타낸다. 마우스에서 최소 백혈병 질환이 있는 관해 후 인간 골수를 모델링하고, AML의 효과적인 제거 및 CD33 결실된 인간 이식편의 재구성을 나타낸다. 본 연구는, 골수성 백혈병을 치료하는 새로운 접근법을 제시하며, 다른 암 및 다른 항원으로 확장될 수 있다.
물질 및 방법
세포주 및 1차 인간 세포
불멸화된 인간 급성 골수성 세포주인 HL-60을 ATCC로부터 입수하고, 20% 소태아혈청 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 IMDMEM에서 배양하였다. 시간 경과에 따른 백혈병 생착 및 진행을 추적하기 위해서, HL-60 세포에 EF1α 프로모터 하에 dTomato 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스 입자를 형질도입하였다. 렌티바이러스 벡터 및 입자를 벡탈리스사(프랑스 톨루스 소재)에서 생산하였다.
인간 골수 또는 제대혈 CD34+ 줄기세포를 스템익스프레스사(StemExpress)(미국 캘리포니아주 폴솜 소재)에서 구입하였고, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 100ng/㎖ TPO, 100ng/㎖ SCF, 100ng/㎖ IL6 및 100ng/㎖ FLT3L 및 UM171 0.35nM(엑세스바이오사(Xcessbio), 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)을 함유하는 StemSpan SFEM II(스템셀 테크놀로지즈사(STEMCELL Technologies inc))에서 유지시켰다. 모든 인간 사이토카인은 바이오레전드사(Biolegend)(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)에서 구입하였다.
인간 T 세포는 뉴욕 혈액 센터(New York Blood Center)에서 구입한 신선한 말초 혈액 정상 기증자 류코펙(leukopak)에서 정제하였다. 간략하면, 류코팩을 2mM EDTA가 보충된 인산염 완충 식염수(1×)로 2 내지 4부피로 희석시키고, 4℃에서 저장하였다. 그런 다음 35㎖의 희석된 류코팩을 15㎖의 Ficoll-PaqueTM Premium(GE)에 조심스럽게 쌓고, 스윙 로터 버킷에서 25℃에서 30분 동안 400g로 원심분리시켰다. 그런 다음 단핵 세포 층을 새로운 튜브로 옮기고, 2mM EDTA를 함유하는 PBS(1×)로 1:1로 희석시키고, 25℃에서 15분 동안 400g로 원심분리시켰다. 그런 다음 펠릿의 적혈구를 1× ACK 용해 완충액(깁코사(Gibco))으로 제거하고, 실온에서 5 내지 8분 동안 인큐베이션시키고, 2mM EDTA를 함유하는 PBS(1×)로 세척하고, 다시 400g, 25℃에서 10분 원심분리시켰다. 그런 다음 제조사 프로토콜에 따라 밀테니이 바이오테크사 CD4+ 및 CD8+ 마이크로비드가 있는 단일 핵 세포 펠릿에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 양성으로 선택하였다. 그런 다음 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 같은 날 CD3/CD28 dynabeads 1:1 비드 대 세포 비율(깁코사)을 사용하여 활성화시키고, IL7 10ng/㎖ 및 IL15 5ng/㎖를 함유하는 Gibco OpTmizer™ CTS™ T-Cell Expansion SFM 배지에서 별도로 확장시켰다.
CAR 작제물, 렌티바이러스 생산 및 형질도입
프레임 내 융합된 인간화 항-인간 CD33 scFv(클론 My96)의 경쇄 및 중쇄를, Bryan Welm 및 Zena Werb의 선물인 렌티바이러스 플라스미드 pHIV-Zsgreen(애드젠사 플라스미드 # 18121) 내의 CD8 알파 힌지 도메인, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 신호전달 도메인 및 CD3제타 세포내 도메인에 클로닝함으로써 항-CD33 키메라 항원 수용체를 생성시켰다(Welm et al. Cell Stem Cell. 2008;2(1):90-102). 모든 cDNA 단편을 코돈 최적화하였고, 진아트사(GeneArt)(독일 레젠버그 소재)에 의해서 합성하였다. 렌티바이러스 입자를 벡탈리스사(프랑스 톨루스 소재)에서 생산하였다. 활성화 24시간 후, CD4+ T 세포에 MOI=30에서 렌티바이러스 입자를 형질도입하였고, 이와 병행하여 MOI=40에서 CD8+ T 세포에 형질도입하였다.
CRISPR/Cas9 매개된 CD33 게놈 표적화
인간 골수 또는 제대혈 CD34+ 줄기세포를 1% 페니실린 스트렙토마이신, 다음 인간 사이토카인 100ng/㎖ TPO, 100ng/㎖ SCF, 100ng/㎖ IL6 및 100ng/㎖ FLT3L 및 UM171 0.35nM(엑세스바이오사, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)을 함유하는 StemSpan SFEM II(스템셀 테크놀로지즈사)에서 유지시켰다. 모든 인간 사이토카인은 바이오레전드사(Biolegend)(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)에서 구입하였다.
TrueCut Cas9 단백질 V2는 인비트로젠사에서 구입하였다. CD33을 표적으로 하는 화학적으로 변형된 sgRNA를 Synthego CRISPR Gene KO 디자인 도구를 사용하여 설계하였고, Synthego에서 구입하였다. 3㎍의 TrueCut Cas9 단백질과 200,000개의 CD34+ 세포용 1.5㎍ sgRNA를 P3 완충액(론자사, Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector Kit)에서 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고, P3 완충액에 재현탁시키고, Cas9/sgRNA RNP 복합체와 혼합한 다음, 4D-뉴클레오펙터로 전기천공하였다. 전기천공 후, 세포를 분석할 때까지 37℃에서 배양하였다.
결실 효율은 바이오레전드사의 다음 항체를 사용하여 전기천공 7일 후에 평가하였다: hCD34-PerCp/Cy5.5 및 hCD33-FITC.
전체 게놈 및 RNA 서열결정
Cas9 단독 또는 RNP 복합체 Cas9/sgRNA로 전기천공한 후, CD34+ 세포를 시험관내에서 10일 동안 유지하고, DNA 또는 RNA를 다음과 같이 단리시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 QIAAmp DNA 미니 키트로 DNA를 정제한 다음 30ul로 용출하고, Nanodrop 및 Qubit dsDNA BR 검정을 사용하여 DNA 농도를 측정하였다. RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 miRNeasy 마이크로 키트로 정제시킨 후 18ul로 용출시켰다. 농도 및 품질을 측정하기 위해 Nanodrop 및 Bioanalyzer Pico chip 검정을 수행하였다.
전체 게놈 서열결정의 경우 NEBNext® Ultra™ II DNA 라이브러리 Prep Kit를 Illumina, 클러스터링 및 서열결정 시약에 사용하였다. 간략하면, 게놈 DNA를 음향 전단에 의해 단편화하고, 세정하고, 단부 수리하였다. 어댑터를 결찰시키고, DNA 라이브러리를 만들었다. DNA 라이브러리를 또한 실시간 PCR(어플라이드 바이오시스템즈사, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 의해 정량하고, 플로우 셀의 2개 레인에 클러스터링하고, 제조사의 설명에 따라 Illumina HiSeq 기기에 로딩하였다. 샘플을 2x 150 페어드 엔드(PE) 구성을 사용하여 서열결정하였다. 이미지 분석 및 베이스 콜링(base calling)은 HiSeq 기기에서 HiSeq 제어 소프트웨어(HCS)로 수행하였다. DNA 서열을 기본 매개변수를 사용하여 Illumina HiSeq 분석 소프트웨어 v2.1(HAS 2.1)을 사용하여 처리하였다.
RNA 서열결정을 위해서, SMART-Seq v4 Ultra Low Input Kit for Sequencing(클론테크사(Clontech), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 사용하여 cDNA 합성 및 증폭을 수행하였다. Nextera XT(일루미나사)를 사용하여 서열결정 라이브러리를 준비하였다. 샘플을 2x150 페어드 엔드(PE) 구성을 사용하여 서열결정하였다. 원시 데이터의 품질을 조사한 후, 트리밍된 판독값을 STAR 정렬기 v.2.5.2b를 사용하여 ENSEMBL에서 사용 가능한 호모 사피엔스(Homo sapiens) 참조 게놈에 매핑하였다. 이 단계의 결과로 BAM 파일이 생성시켰다. 고유 유전자 히트 수를 Subread 패키지 v.1.5.2의 기능 수를 사용하여 계산하였다. 엑손 영역에 속하는 고유한 판독치만 계수하였다. 유전자 히트 계수치의 추출 후, 유전자 히트 계수치 표를 SARTools 패키지 내의 edgeR 패키지를 사용하여 하류 차등 발현 분석에 사용하였다(Varet et al. PLoS One. 2016;11(6):e0157022). 유전자는 p-값이 0.05 초과인 경우 유의하게 차등적으로 발현된 것으로 간주되었다
유세포 분석법 및 분류
시험관내
형질도입 후 CAR-T 세포를 최대 15일까지 확장시킨 다음 Biorad S3e 분류기를 사용하여 GFP+에 대해 분류하고(사멸 세포는 프로피듐 아이오다이드를 사용하여 제외시킴), 시험관내 및 생체내 실험을 위해 1:1로 혼합하였다. CAR 발현 및 CD33을 인식하고 이에 결합하는 능력은 CAR-T 세포를 바이오티닐화된 인간 CD33 단백질(ACRO 바이오시스템즈사)과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션시킨 다음 형광색소 접합된 스트렙타비딘으로 염색하여 평가하였다.
바이오레전드사의 다음 항체를 사용하여 전기천공 후 5 내지 7일에 인간 CD34+ 줄기세포를 분석하였다: hCD34-PerCp/Cy5.5 및 hCD33-FITC.
생체내
바이오레전드사(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 또는 비디 바이오사이언시스사(BD Biosciences)(미국 캘리포니아주 산호세 소재)의 결과 항체를 사용하여 말초 혈액, 골수 흡인, 전체 골수(새킹된(sacked) 마우스로부터)의 분석에 의해서 시간 경과에 따른 조혈 시스템의 생착 및 재증식을 평가하였다: Ter119-PeCy5, Ly5-BV711, H2kd-BV711, hCD45-BV510, hCD3-Pacific Blue, hCD123-BV605, hCD33-APC, hCD14-APC/Cy7, hCD10-BUV395, hCD19-BV650, CD34-BV421, CD90-PeCy7, hCD38-BUV661 및 hCD45RA-BUV737. CAR-T 세포는 형광 단백질 zsGreen을 안정적으로 발현하고, 백혈병 세포는 dTomato를 안정적으로 발현하며, 죽은 세포는 프로피디움 아이오다이드를 사용하여 제외되었다. 백혈병 세포를 Ter119-dtomato+에서 게이팅하였다. CD34+ 주사 유래된 인간 세포를 Ter119-dtomato-, Ly5-/H2kd-인간 CD45+CART-에 게이팅하였다. 모든 데이터를 고속대량처리(high-throughput) 모드에서 BioRad ZE5 유세포 분석기로 수집하였고, 분석을 FlowJo 10.4.2를 사용하여 수행하였다. 이와 동시에 PerkinElmer IVIS Spectrum Optical Imaging System을 사용한 형광 영상화로 백혈병 진행을 평가하였다. Living Image 4.4 Optical Imaging Analysis Software로 영상을 수집하고 분석하였다.
시험관내 세포독성 검정
zsGreen을 안정적으로 발현하는 효과기 분류된 CAR-T 세포를 dTomato를 안정적으로 발현하는 다음 표적 세포 HL-60 및/또는 Celltrace blue로 염색된 CD34+CD33WT 세포 및/또는 Celltrace Violet(인비트로젠사)으로 염색된 CD34+CD33Del과 다른 비율로 혼합하였다. 인큐베이션 후 16 내지 24시간 후에, 7AAD 또는 Sytox Red를 생존성 염료로 사용하고, 세포 독성을 평가하기 위해 고속대량처리 모드에서 BioRad ZE5 유세포 분석기로 데이터를 획득하였다. 음성 대조군에서 자발적 용해를 차감한 후, CART33 세포 특이적 세포독성(%)을 CFSE 및 7-AAD 또는 Sytox Red 모두에 대해 양성인 세포로서 다음 수학식으로 계산하였다: ((CART33을 갖는 양성 세포 %)- (대조군 T 세포를 갖는 양성 세포 %))/(100 - ((대조군 T 세포를 갖는 양성 세포 %))×100.
생체내 실험
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ (NSG-SGM3) 마우스(잭슨 연구소, 미국 메인주 바 하버 소재)를 준치사량(sublethal(1.2Gy) 전신 방사선 조사(TBI)로 컨디셔닝시켰다. 인간 CD34+CD33Del 골수 또는 제대혈 줄기세포(5*105 내지 1*106개)와 5*105개 dTomato-HL-60 세포를 TBI 후 8 내지 24시간 이내에 마우스에 정맥 주사하였다. 1 내지 2주 후, 마우스에게 2 내지 3*106개의 항-CD33 또는 대조군 CAR-T 세포(미리 혼합된 CD4:CD8=1:1), 또는 6㎍의 GO(젬투주맙 오자가마이신) 또는 PBS를 정맥내 주사하여 처리하였다.
바이오레전드사(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 또는 비디 바이오사이언시스사(미국 캘리포니아주 산호세 소재)의 결과 항체를 사용하여 말초 혈액, 골수 흡인, 전체 골수(새킹된 마우스로부터)의 분석에 의해서 시간 경과에 따른 조혈 시스템의 생착 및 재증식을 평가하였다: Ter119-PeCy5, Ly5-BV711, H2kd-BV711, hCD45-BV510, hCD3-Pacific Blue, hCD123-BV605, hCD33-APC, hCD14-APC/Cy7, hCD10-BUV395, hCD19-BV650, CD34-BV421, CD90-PeCy7, hCD38-BUV661 및 hCD45RA-BUV737. 죽은 세포를 프로피디움 아이오다이드를 사용하여 제외시켰다. CD34+ 주사 유래된 인간 세포를 Ter119 - , Ly5 - /H2kd - 인간 CD45+에 게이팅하였다.
모든 실험은 콜롬비아 대학교(Columbia University)의 동물 실험 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다.
통계학
모든 통계는 Graphpad Prism 7을 사용하여 수행하였다. 연속 변수의 경우, 언페이드 양측 t-검정을 수행하였다. 평균 간의 차이는 p 값이 0.05 미만인 경우 유의미한 것으로 간주되고, 그렇지 않으면 유의하지 않은 것으로 간주되었다(ns; p>0.05).
결과
CD33 항원의 CRISPR/Cas9 매개된 유전자 절제
HL-60을 발현하는 CD33을 사용하여 골수성 백혈병 및 제대혈(CB) 또는 성인 골수(BM)로부터의 1차 CD34+ 세포를 기증자 조혈 줄기 전구세포(HSPC)로서 모델링하였다. CD33의 표면 발현을 이전에 기술된 바와 같이(문헌[Taussig et al. Blood. 2005;106(13):4086-4092; Haubner et al. Leukemia. 2018;33(1):64-74; Wisniewski et al. Blood Cancer J. 2011;1(9):e36; Krupka et al. Blood. 2014;123(3):356-365])) 유세포 분석법을 사용하여 HL-60 세포 및 CD34+ 세포 모두에서 확인하였다(도 19B). 최근 개발된 다용도 RNA 유도 DNA 편집 기술인 CRISPR/Cas9(Haubner et al. Leukemia. 2018;33(1):64-74)을 사용하여 CD33의 게놈 유전자좌를 유전자 편집하여 발현을 제거하였다. 엑손 3 게놈 유전자좌를 표적으로 하도록 가이드를 설계하였는데(도 19C는 서열번호 58의 sgRNA 811 스페이서 서열을 나타내고, 도 25A는 서열번호 29의 스페이서 서열을 나타내고, 도 25B는 서열번호 50의 sgRNA 846 스페이서 서열을 나타냄) 그 이유는 엑손 3이 모든 CD33 전사체에 공통이고, CD33이 구성원인 Siglec 패밀리 슈도진(pseudogene)과 유사성이 거의 또는 전혀 없기 때문이다. 플라스미드, 렌티바이러스 및 리보핵단백질(RNP) 기반 전달 시스템을 시험하여 세포주 및 1차 세포에서 여러 가이드의 효율성을 확인했으며, 화학적으로 변형된 가이드와 조합된 RNP 시스템이 1차 세포에서 가장 효율적인 것을 발견하였다(도 19B 및 도 19D). 최적의 조건에서, CD33 발현의 손실은 CD34+ HSPC(이후 CD33Del로 지칭됨)의 80% 초과에서 발견되었으며, 모든 CD33 아이소폼에 공통인 C2 도메인에 위치된 에피토프를 인식하는 항-CD33 클론 HIM34를 사용하여 유세포 분석기에서 측정되었다(도 19B 및 도 19D). CD33 발현의 이러한 감소는 DNA의 Sanger 서열결정에 의해 측정된 바와 같이 DNA 상의 Cas9의 예상 절단 부위에서 삽입/결실(인델)의 존재를 동반하였다(도 19E, 하단 크로마토그램). 또한 엑손 3을 표적으로 하는 2개의 다른 sgRNA를 시험하였고, 동일한 효율을 나타내었다(도 25A 및 25b). 예상된 바와 같이, sgRNA의 부재 하에 Cas9 단독의 전기천공은 표적 부위에서 어떠한 인델도 유도하지 않았다(도 19E, 상단 크로마토그램). CD33Del 세포는 CD34 및 CD90의 높은 발현을 유지하였다(도 19D, 하단 패널). RNP 전기천공 5 내지 7일 후, 몇몇 독립적인 실험에서 일관되게 높은 결실 효율이 관찰되었으며(도 19F), CD33WT 세포에서 평균 85% CD33 발현이 10% 미만의 CD33 발현으로 낮아졌다. 또한, CD33 발현이 결여된 B-세포를 음성 대조군으로 사용하여 Cas9 매개 결실 후 발현 손실을 확인하였다. 관찰된 나머지 10% CD33 발현은 편집되지 않았거나(두 대립유전자 모두에 대한 야생형), 부분적으로 편집된(인델이 있는 하나의 대립유전자만) 세포로부터 유래될 가능성이 있다.
CD34 + CD33 Del HSPC는 생체내에서 생착 및 다계통 분화를 나타낸다.
본 발명의 접근법은 CD33 항원(CART33) 및 ADC 전달(GO)을 표적으로 하는 CAR-T를 위한 플랫폼으로서 CD33 유전자-편집 줄기세포(CD33Del)를 이식하는 것을 포함할 수 있기 때문에, CD33Del 세포가 골수생성 및 림프 생성에 대한 생착 및 기여하는 능력을 시험하는 것이 중요하다. 골수 및 제대혈 유래 CD34+ 세포를 모두 시험하였다(도 20). CD33Del HSPC를 꼬리 정맥 주사를 통해 준치사량으로(sublethally) 조사된 NSG-SGM3 마우스에게 주사하고, 골수 및 혈액을 분석하였다(도 20A). 골수-유래 세포가 주사된 마우스에서, 이식 후 제7주의 말초 혈액 분석은 인간 CD45+ 세포 및 골수성(CD14+ 세포) 및 림프성(CD19+ 세포) 기원의 성숙한 세포의 존재를 드러내었다(도 20B). 도 26B에 요약된, 제15주의 골수 흡인물의 분석(도 26A) 및 제21주의 새킹된 마우스로부터의 전체 골수의 분석(도 20C)은 시간 경과에 따라 인간 CD45+ 세포의 지속적인 기여와 함께 키메라 현상을 나타내었다. 조사된 모든 조직에서, 골수성(단핵구) 및 림프성(B-세포) 기원의 전구 및 성숙한 세포의 존재와 함께 다중-계통 생착이 존재하였다. 모든 세포는 CD33-음성으로 유지되었다(도 26A 및 26c). 야생형 세포와 비교할 때 CD33Del 세포의 다계통 생착에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
동시에, 제대혈 유래 CD34+ 세포에 대해서도 유사한 전략을 따랐고 유사한 결과를 얻었다. 다계통 생착은 제9주에 말초 혈액에서(도 20D), 제16주에 골수 흡인물에서(도 26C), 이식 후 제21주에 전체 골수에서(도 20E) 관찰되었다. 상기 결과는, CD33이 제대혈(CB) 또는 골수(BM) CD34+ 세포의 생착 또는 동물 모델에서 완전한 인간 조혈 시스템의 지속적인 재증식에 필요하지 않음을 시사한다.
CD33 Del 세포는 골수성 증식 및 기능에 능숙하다.
이 접근법의 목표는, 이의 임상으로의 번역이기 때문에, 골수성 CD33Del 세포의 기능적 능력을 시험관내 및 생체내에서 평가하였다. 첫째, 골수 계통의 다양성을 CD34+CD33WT 인간화 마우스와 비교하여 CD34+CD33del에서 분석하였고, 골수 하위세트 간에 눈에 띄는 차이가 발견되지 않았다. 시험관내에서 이 콜라이 바이오입자를 식균하는 단핵구 분화 CD34+CD33WT 및 CD34+CD33WT의 능력을 시험하였다. 유의미한 차이는 발견되지 않았다. CD34+CD33WT 또는 CD34+CD33del 세포가 이식된 NSGS 마우스에서 단핵구/대식세포에 의한 LPS 유도 사이토카인 생산을 또한 분석하였고, 유도 후 TNFα, IL6 및 IL8의 혈장 수준은 대등함을 관찰하였다. 마지막으로, 생체내에서 CD33 결실된 세포의 식세포 기능을 평가하기 위해 이 콜라이 바이오입자의 i.p. 주사 2시간 후 인간화 마우스의 복강을 분석하였다. 유세포 분석은 CD34+CD33WT 또는 CD34+CD33del 인간화 마우스 둘 다에서 hCD45+hCD11b+hCD14-hCD16- 하위세트에 의한 유사한 식세포 흡수를 나타내었다. 이러한 모든 발견은 CD33Del 골수 세포의 온전한 기능을 나타낸다.
검출 가능한 표적외 돌연변이유발 또는 기능성 p53 경로의 손실이 유전-편집된 세포에서 관찰되지 않았다.
본 연구에 사용된 두 가이드가 HSP 세포의 표적외 부위에 인델을 도입하는지 여부를 평가하기 위해, Cas9 단백질만으로 전기천공된 세포(CD33WT)와 비교하여 Cas9/sgRNA RNP 복합체로 전기천공된 인간 제대혈 CD34+ HSP 세포(CD33Del)의 전체 게놈 서열결정 데이터에서 인델을 평가하였다. 6억 2,900만 개 초과의 통과된 필터 판독이 판독의 93% 이상에서 Q30 이상의 기본 품질로 획득되었다(도 28). 평균 커버리지 깊이는 26X 초과였다. 단일-뉴클레오타이드 변이체(SNV) 및 작은 인델을 식별하기 위해 판독값을 인간 hg38 참조 게놈에 정렬하였다.
두 샘플에서 검출된 변이체의 요약을 도 28에 제공한다. 예상 절단 부위, chr19:51225811 및 chr19:51225846(도 21A)에 정렬된 90% 초과의 판독에서 인델이 있는 강력한 표적내 활성이 관찰되었다. 중요하게, 모든 인델은 사용된 2개의 sgRNA의 예상 절단 부위 내에 위치하였다. 전체 CD33 유전자좌에서 표적 영역 외부에서 관찰된 소수의 작은 인델은 CD33Del 전기천공된 세포에 고유하지 않았으며, Cas9만으로 전기천공된 세포에도 존재하였다. 다음으로 사용된 sgRNA와 최대 4개의 미스매치가 있는 높은 수준의 유사성을 나타내는 예측된 표적외 부위의 인델에 대해 데이터를 조사하였다(도 21B, 도 29 및 도 30). 다시 말하면, 조사된 표적외 유전자좌에서는 인델이 발견되지 않았다(도 29 및 도 30). 또한 TP53 유전자좌에서 인델을 조사하였으며, CD33Del 세포에 고유한 것은 발견되지 않았다.
CD33 발현의 손실이 다른 유전자의 발현 변화를 유발하는지 여부를 평가하기 위해, 4개의 다른 기증자로부터 얻은 CD33 결실(n=5) 및 대조군(n=5) CD34+ 세포의 유전자 발현 프로파일을 비교하였다. RNA 서열결정을 사용하여 각각의 샘플에 대한 유전자 발현 프로파일을 얻었고, edgeR을 사용하여 군 간의 비교를 수행하였다. Pearson 상관 계수가 0.9948인 두 군 사이에서 유사한 유전자 발현 프로파일이 관찰되었으며(도 21C), p-조정된 값에 기초하여 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 31). 14개의 유전자는 p-값에 기초하여 유의하게 상이한 것을 발견하였고, 가장 유의한 차이점은 대조군과 비교하여 CD33Del 샘플에서 CD33의 하향조절이었다(도 21D 및 도 31). 이러한 결과는, 시험관내 CD34+ 세포에서 CD33의 부재가 하류 유전자 발현에 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 확인시켜준다. p-값에 기초하여 변화된 발현을 나타낸 13개의 유전자 중에서, 어느 하나의 경로 또는 세포 과정에 대한 농축이 존재하지 않았다. 참고로, 유전자 발현 시그니처는 HSC 기능을 손상시키거나 장기적 잠재력을 감소시킬 수 있는 TP53 경로 또는 기타 DNA 손상 경로가 활성화되었음을 시사하지 않았다. 따라서 본 명세서에 기재된 유전자 편집 기술을 사용한 제대혈 세포 및 성체 HSC에서의 CD33 절제는 이들의 미래 기능을 손상시키지 않는 것으로 결론지어졌다.
통합 게놈 뷰어(integrated genomic viewer: IGV)를 사용하여 RNAseq 데이터에서 CD33의 엑손 3 및 TP53 전사체의 모든 암호 엑손에 대한 판독 매핑에서 인델에 대해 데이터를 수동으로 검사하였다. 예상된 바와 같이, CD33 엑손 3에서 95% 초과의 판독에 인델이 존재하였다(도 27). 인델이 있는 몇몇 판독물이 TP53에서 발견되었지만, 그것은 반복 서열 내에 존재하였고, 대조군 샘플에도 존재하였는데, 이는 서열결정 아티팩트(artifact)를 시사하였다. 종합하면, 이러한 데이터는 본 연구에서 사용된 가이드를 사용한 CD33 유전자좌에서의 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집이 줄기세포 시스템에서 검출 가능한 표적외 인델을 초래하지 않음을 시사한다.
T- 세포에서 CD33 특이적 CAR의 발현
CAR은 공자극성 도메인의 수에 따라 상이한 세대로 분류된다. CD28 막관통 도메인, 4-1BB(CD137) 공자극성 도메인 및 세포내 도메인으로서 CD3 TCR로부터의 CD3 제타 쇄와 쌍을 이루는 항-CD33(클론 My96)의 단일 쇄 가변 영역을 포함하는 2세대 CAR을 설계하였다(도 22A). CAR cDNA를 EF1-α 프로모터의 제어 하에 pHIV-zsGreen 렌티바이러스 벡터에 클로닝하여 ZS-green 바이시스트론 발현을 가능하게 하였다. 정상 공여자로부터 얻은 말초 혈액을 분획화하여 PBMC를 얻고, 벡터 단독 또는 CAR 작제물을 보유하는 렌티바이러스 입자를 형질도입하였다(도 22B). PBMC 내의 CD4 및 CD8 세포의 형질도입 효율은 동일하지 않았는데, 그 이유는 CD8 세포에 비해 더 높은 CD4 형질도입이 관찰되었기 때문이며, 다른 연구에서도 유사한 관찰이 이루어졌다(Blaeschke et al. Cancer Immunol Immunother. 2018;67(7):1053-1066). PBMC에서 CD4 및 CD8 세포의 불균등한 형질도입을 고려할 때, CD4 및 CD8 세포의 보다 정의된 조성을 얻기 위해, 정제된 CD4 및 CD8 세포를 별도로 형질도입하고, 하류 IRES 요소로부터의 GFP 발현에 기초하여 분류하고, 동일몰 비로 혼합하였다. CAR 발현을 스트렙타비딘 형광색소에 접합된 정제된 바이오티닐화된 CD33 단백질에 대한 CAR의 표면 발현 및 결합을 측정함으로써 확인하였다. CAR의 강력한 발현 및 CD33 분자와의 이의 결합이 관찰되었다(도 22B).
CAR 발현 T-세포는 시험관내에서 CD33-의존적 세포독성을 나타낸다.
CART33 세포의 세포독성을 먼저 가변 CD33 발현을 갖는 표적에 대해 평가하였다. CD33 골수성 백혈병 세포 HL-60의 높은 사멸이 확인되었고, 감소된 수준으로 CD33을 발현하는 CD33WT 줄기세포의 더 낮은 사멸이 관찰되었다. 특히, (Cas9/sgRNA 매개된 결실로 인한) CD33 발현의 부재는 CD33Del CD34+ 세포와 함께 인큐베이션시킬 때 CART33의 세포독성이 관찰되지 않았기 때문에 CD34+ 세포가 사멸되는 것을 보호하였다. 이러한 첫 번째 실험(도 22C)은 또한 표적 세포에 대한 CART33 세포독성 수준과 CD33 발현 수준 사이의 상관관계, 즉, CART33 세포독성이 표적 세포 상의 CD33의 발현 수준에 비례한다는 것을 확인해 주었다.
그런 다음 가변 CD33 발현의 표적과 공동 인큐베이션시킬 때 CART33 세포 사멸을 평가하기 위한 삼중 배양 검정을 설계하였다. CD33WT HL-60 세포 및 CD34+CD33WT 세포를 CART33과 공동 인큐베이션시키는 경우, CART33 세포의 상관된 세포독성 수준이 두 세포 유형에 걸쳐 관찰되었지만(도 22D), CD33WT HL-60 세포 및 CD34+CD33Del 세포를 CART33 세포와 함께 공동 인큐베이션시킨 경우, HL-60 세포만이 사멸되었다(도 22E). 유사하게, 모든 세 가지 세포 유형, CCD34+CD33WT, CD34+CD33Del, 및 CART33 세포(도 22F)의 공동 인큐베이션은 CD33 발현에 비례하는 수준에서 CD33WT CD34+의 사멸만을 나타내었다. 또한, CART33 세포독성을 또 다른 급성 골수 세포주인 KG1에 대해 시험하였고, CART33의 유사한 CD33-의존적 세포독성을 시험관내에서 발견하였다.
항-CD33 면역요법은 세포주 유래된 이종이식(CDX) 마우스 모델에서 CD33-의존적 백혈병 제거를 나타내다.
생체내 실험을 위해, 최소 잔류 질환의 맥락에서 인간 치료 설정을 나타내는 전략을 설계하였다(도 23A). 이 모델에서, 백혈병은 준치사량으로 조사된 마우스에 500,000개의 HL-60 세포를 주사하여 처음 시작되었다. AML 재발 모델을 모방하기 위해서 마우스에게 500,000개의 CD33Del CD34+ 세포를 동시에 주사하였다. 예비 실험은, 추가 2주 후에 마우스의 100%가 백혈병이 되기 때문에, AML 세포의 귀소 및 생착을 가능하게 하는 데 1주의 기간이 충분하다는 것을 시사하였다. 이것은 AML 세포가 임상적으로 검출할 수는 없지만 여전히 남아 있을 수 있는 관해 후 골수를 요약한다. 백혈병 및 CD34+ 줄기세포의 공동 주사 1주 후에, 마우스를 다양한 군으로 나누고, 기재된 바와 같은 작용제로 처리하였다(도 23A). 백혈병 부담 및 CD34+ 세포 생착을 영상화 및 유세포 분석법을 사용하여 시간 경과에 따라 모니터링하였다(도 23B 내지 도 23F). 3주까지, PBS 및 대조군 CAR-T 세포-처리된 마우스(즉, 벡터만으로 형질도입된 T 세포, CAR-T 작제물 결여)의 골수 흡인물에서 높은 종양 부담이 관찰되었고, 3주 및 4주까지 모두 이 두 군의 마우스는 질환으로 사망하였다(도 23A). 2개의 대조군 T 처리된 마우스는 3주에 비교적 낮은 백혈병 부담을 가졌으나, 사망 시 BM에서 매우 높은 백혈병 부담으로 진행했다. 이에 반해서, 12주의 기간에 걸쳐서, CART33 세포, 항-CD33 ADC GO, 또는 GO와 CART33의 조합물로 처리된 마우스의 골수 흡인물(도 23B) 또는 3.5주 또는 8주(도 23C 내지 도 23E 참고)에서의 영상화에서 CD33WT 백혈병 세포가 발견되지 않았다. 이러한 결과는 CART33과 GO 둘 다가 본 모델에서 CD33-발현 백혈병에 대한 강력한 작용제임을 시사한다.
CD34+CD33 Del HSPC가 요법 모델에서 다계통 생착 및 분화를 나타낸다.
동시에, 상기에 기재된 요법 모델에서 CD34+CD33Del 세포의 다계통 생착에 대해 마우스를 모니터링하였다. 모든 군의 골수 흡인물에서 CAR-T 및 CD33 음성인 인간 CD45+ 세포의 존재에 의해 입증된 바와 같이 생착이 관찰되었는데(도 23F), 이는 CD34+CD33Del 세포가 또한 본 요법 모델에서 생착될 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, CART33-처리군(CART33+PBS 및 CART33+GO)에서 제3주의 초기 시점에 비해 제6주 시점에서 CD33Del 인간 CD45+ 세포의 백분율의 감소가 관찰되었지만, 이러한 수준은 제9주까지 초기 수준으로 회복되고, 제12주의 마지막까지 유지되었다. 상대적으로 낮은 생착 및 두 군의 마우스에서의 후속 감소는 치료 관련 스트레스(골수에서 CAR-T 세포에 의한 항백혈병 반응 포함)를 반영할 수 있는데, 이것은 CAR-T 군에서 더 뚜렷했고 GO 군보다 오래 지속되었다. 대안적으로, 상이한 CD34+ 및 T 세포 공여자의 사용이 CART33 세포가 주입된 마우스에서 관찰된 재증식 지연을 설명할 수 있는 동종 반응을 촉발했을 수 있다. 특히, 이 현상은 생착 수준이 8주에 걸쳐 회복됨에 따라 가역적이었다.
다음으로 생착된 세포의 다능적 성질을 골수생성 및 림프생성을 분석함으로써 조사하였다(도 24A). CD33 음성 골수성 및 림프성 전구체뿐만 아니라 분석된 모든 시점에서 성숙한 골수성 및 림프성 세포가 발견되었다(도 24A). 모든 처리된 마우스에서 시간이 지남에 따라 완전한 조혈 시스템 재증식이 관찰되었지만 CAR-T 세포가 주사된 마우스에서는 림프구 재증식 지연이 관찰되었다. 이것은 림프구 전구세포가 동종-특이적 효과에 더 민감한 것으로 알려져 있기 때문에 동종 반응의 결과일 수 있다.
동시에, CD34+CD33WT 1차 HSPC에 대한 CART33 및 GO의 특이성을 입증하기 위해서, 준치사량으로 조사된 NSG-SGM3 마우스에게 500,000개의 HL-60 세포 및 500,000개의 CD34+CD33WT 세포를 공동 주사하였다(도 24B). 1주 후, 마우스 군을 CART33 세포로 처리하고, 제3주에 BM을 흡인하였고, 같은 날 또 다른 군에 GO를 주사하고, 4일 후에 BM 흡인물을 분석하였다. 치료 모델에서 관찰된 바와 같이, 치료 후에 완전한 백혈병 제거가 확인되었다(도 24C). 추가로, CD33WT 세포의 완전한 절제가 관찰되었다(도 24D). 따라서, CD33WT 세포는 GO 및 CART33 요법에 민감하게 유지되는 반면, CD33 제거된 세포는 둔감하다.
논의
CAR-T 또는 mAb와 같은 작용제를 사용하는 항원-의존적 면역 요법의 성공은 정상 세포 또는 신체 내의 다른 세포가 아니라 암세포 표면에 있는 고유한 항원의 존재에 좌우된다. 불행하게도, 그러한 항원은 암에서 드물다. 한 가지 가능한 결과는, 줄기세포에서 게놈 공학 방법을 사용하여 LSA를 절제함으로써 항원-의존적 면역요법에 내성인 줄기세포/전구세포를 생성시킬 수 있어 최대 면역 요법이 가능하다는 것이었다. 이러한 항원-고갈된 세포가 야생형 세포와 기능적으로 유사하다는 것을 입증한 후, 이들을 병이 있는 세포를 대체하는 데 사용할 수 있다. 그 계통의 정상적인 기능에 필수적인 혈통 특이적 항원을 신중하게 선택하는 것이 이 접근법에 중요하다. 대안적 접근에서, LSA가 필수인 경우, LSA의 발현을 완전히 절제하는 대신, 유전자 편집 기술을 사용하여 LSA 기능을 유지하면서 LSA에 대한 항원-의존적 면역 요법제가 인식하는 에피토프를 변형시킬 수 있다("기능적으로 중복된 에피토프 전환" 또는 FRES).
본 연구에서는, 계통 항원 CD33이 결여된 줄기세포를 동종이계 조작된 T 세포 또는 ADC와 함께 조합하면 백혈병 절제 및 완전한 조혈 재증식을 가능하게 할 수 있음을 발견하였다. 요법 영역에서 충족되지 않은 요구가 있는 질환인 급성 골수성 백혈병이 사용되었으며, 이러한 접근법이 실현 가능하다는 것이 입증되었다. CD33은 LSA이고, CAR-T 또는 CD33 mAb를 사용한 AML에서의 CD33의 표적화는 줄기/전구세포 및 골수 계통의 세포의 제거로 인해, 심각한 골수억제 및 림프 고갈을 초래하기 때문에, AML을 치료하기 위한 제안된 접근법은 CD33이 결핍된 세포로 조혈 시스템을 재건하는 것이다. CRISPR 기반 접근법은 제대혈 또는 골수 CD34+ 세포인 기증자 줄기세포에서 CD33 발현을 방해하여 그것이 CAR-T 세포 공격에 "저항성"이 되도록 하는 데 사용하였다.
최근, 두 그룹이 유사한 관찰을 하고 이 연구에 설명된 접근법을 독립적으로 보고하였다(문헌[Kim et al. Cell. 2018;173(6):1439-1453 e1419; Humbert et al. Leukemia. 2019;33(3):762-808]). 본 데이터는 이러한 연구에서 얻은 관찰을 강화하고 보완적인 접근법을 사용하여 신규한 통찰력을 추가한다. 백혈병 도입 및 치료 전에 완전한 생착을 허용하기 위해 마우스에 먼저 CD33 유전자-편집 CD34+ 세포를 주입한 Kim 등의 연구와 달리, 본 발명의 접근법은 백혈병 세포와 유전자 편집 줄기세포를 공동 주입한 후 CAR-T 또는 ADC 요법이 수반되기 때문에 최소의 잔류 질환으로 AML 재발 상황을 보다 밀접하게 모방한다. 또한, 높은 표적내 및 낮은 표적외 활성을 갖는 CD33 가이드 RNA를 엄격하게 선택함으로써, 다른 유전자에서 관찰된 표적외 인델이 없이, HSC에서 CD33 발현의 매우 효율적인 절제가 관찰되었으며, 따라서 인간 연구에서 이 접근법의 안전성에 대한 확신을 가능하게 하였다(Kim et al. Cell. 2018;173(6):1439-1453 e1419). 실제로, 조사된 유전자 및 슈도진의 임의의 Siglec 패밀리 내에서 인델이 발견되지 않았다. Kim 등은 가장 가능하게는 CD33용으로 설계된 sgRNA의 SIGLEC22P와의 100% 상동성으로 인해서, 14kb 단편의 결실을 포함하여, SIGLEC22P에서 표적외 활성을 관찰하였다(Kim et al. Cell. 2018;173(6):1439-1453 e1419). 엑손 3 내의 위치 선택 및 다른 유전자와 선택된 sgRNA의 상동성 부재의 확인은 CD33 단독 절제의 특이성을 가능하게 했을 수 있다. TP53 유전자 내의 인델 또는 다른 게놈 재배열의 부재(전체 게놈 서열결정을 사용하여 분석됨) 및 p53 경로 또는 p53 자체와 관련된 조절되지 않는 임의의 유전자의 부재는 본 명세서에서 개발된 접근법이 HSC 기능을 손상시키지 않으면서 높은 특이성을 갖는 높은 수준의 효율적인 게놈 편집을 제공할 수 있음을 시사한다. 마지막으로, 생체내에서 HSC에서 구성적이고, 계속되는 Cas9의 바이러스-매개 발현과 대조적으로 Cas9 RNP(이것은 생체외 조작 동안 HSC에서 단지 일시적으로 존재함)를 사용하면 집단의 50% 초과에 존재하는 것으로 밝혀진 Cas9에 대한 기존의 면역원을 갖는 미래의 문제를 회피한다(Charlesworth et al. Nat Med. 2019;25(2):249-254; Crudele et al. Nat Commun 2018;9(1):3497).
더욱이, Kim 등과 달리, 본 발명의 접근법은 CD33 편집된 HSC(제대혈 또는 성인 골수에서 유래)를 사용한 allo-BMT, 그 다음 동종이계 공여자로부터 유래된 T 세포로의 ADC 처리 또는 CAR-T 처리를 포함한다. 이러한 접근법은 임상 환경에서 더 실용적이다. 세포독성 화학요법으로 사전 치료를 많이 받은 혈액 악성종양 환자는 종종 자가 T 세포 수율이 좋지 않아, 자가 CAR-T의 효율성 및 효과가 제한적이다. 수율과 품질이 문제가 되지 않는 allo-BMT 및 allo-T 세포를 사용함으로써 이 문제를 피할 수 있다. 더 중요한 것은, 질환을 표적으로 하기 위해 ADC(CAR-T가 아닌)를 사용함으로써, 체액 요법이 CAR-T 세포와 함께 또는 CAR-T 세포의 대안으로 작용할 수 있다는 것을 보여줌으로써, 체액 접근법을 사용하여 항백혈병 요법에 대한 접근법을 더 확장시킬 수 있다는 것이다.
GO 약물(항-CD33 항체 클론 P67.6으로 구성됨)이 엑손 2에 위치한 에피토프를 인식한다는 점이 또한 주목된다. CD33의 두 가지 아이소폼이 인간에서 발견된다. 더 일반적인 아이소폼은 GO에 민감한 엑손 2를 포함한 전장 단백질이고; 덜 일반적인 것은 엑손 2가 결여된 아이소폼이다. 집단의 대략 30%가 동형접합체 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP, T/T)을 보유하여, 엑손 2가 결여된 덜 일반적인 CD33 변이체의 독점적인 발현을 초래한다. 이러한 집단은 또한 본 연구에 설명된 표적화된 CD33 면역요법과 조합하여 HSCT 공여자의 잠재적 풀로 간주되어 Cas-9 유도 절제의 필요성을 제거할 수 있다. 그러나 이것은 공여자 풀을 극적으로 제한하여 인간 연구에서 접근법을 실질적으로 실행 불가능하게 만들 수 있다. 이와 관련하여 Humbert 등(Humbert et al. Leukemia. 2019;33(3):762-808)은, CRISPR/Cas9 접근법을 사용하여 두 개의 서로 다른 sgRNA를 사용하여 측접 인트론을 표적화하여 엑손 2를 결실시켰다. V-도메인을 선택적으로 제거하는 것이 전체 CD33의 파괴보다 이점이 있는지 여부는 불분명한데, 그 이유는 전체 CD33을 제거함으로써 생착 또는 기능적 결함이 마우스 또는 원숭이(레서스 마카크(Rhesus macaque))에서 관찰되지 않았기 때문이다(Kim et al. Cell. 2018;173(6):1439-1453 e1419). 또한 여러 가이드를 사용하면 잠재적인 표적외가 증가하고, 가이드의 효율성이 풀에서 가장 효율적인 가이드에 의해 제한될 수 있다.
본 발명의 연구에서 인간 CD34+ BM 및 CB에서 CD33의 결실은 눈에 띄는 부작용을 일으키지 않았다. 이식 후 21주를 초과하게, NSG-SGM3 마우스는 비정상적인 표현형을 나타내지 않았다. 관찰 가능한 CD33 결실 연결 표현형의 부재는 기능적 중복성 또는 Siglecs 구성원 간의 보상으로 설명될 수 있다.
변형된 면역 세포와 관련된 임상 시험의 수가 증가함에도 불구하고, 주로 정상 조직에 대한 표적내/조직외 독성으로 인해 환자에게 개선된 결과를 가져온 사례는 거의 없다. CAR-T는 장기적인 효과가 덜 확립된 최근 접근법이지만, mAb 및 ADC의 사용은 암 치료에서 일상적이며 일반적으로 안전하다. CART 세포 및/또는 ADC, 예컨대, GO를 조작된 줄기세포와 조합하면 정상 조직을 표적내/조직외 독성으로부터 보호하고, 동물 모델에서 완전한 관해 및 완전한 조혈 재구성으로 이어질 수 있는 것으로 나타났다. 입증된 이점에도 불구하고, 사실상 모든 GO 치료 환자는 정상 골수 계통 세포의 상당한 고갈을 경험하며, 이는 잠재적으로 치명적인 열성 호중구 감소증 및 GO 유도 골수억제로 인한 비정상적인 출혈 문제로 이어질 수 있다(문헌[Amadori et al. J Clin Oncol. 2016;34(9):972-979] 참조). 이러한 심각한 부작용은 GO의 사용을 유도 화학요법 동안 짧은 노출로 제한하고 본질적으로 만성 사용을 금지한다. 본 연구는 또한 CART33 주입 여부에 관계없이 더 낮은 GO 용량의 조합물이 AML 환자를 치료하는 근본적으로 새로운 접근법이 될 수 있음을 시사한다. 마지막으로, 최근 GO의 재승인 및 신규한 CD33 유도 시약(새로운 항-CD33 CAR-T, 항-CD33 ADC 및 CD33 이중특이적 T 세포 관여자 또는 BiTE 포함)의 현재 임상 시험의 부활은 이러한 접근법을 가까운 장래에 클리닉으로 이전할 수 있게 한다.
쉽게 사용할 수 있는 파이프라인을 또한 CD33을 매력적인 표적으로 만드는 특성을 공유하는 새로운 잠재적 표적, 즉, 조혈 세포에 의해 엄격하게 발현되고, 암세포에 의해 발현되는 또한 발현되는 기능적으로 중복되는 계통 마커(예를 들어, CD123, CLL-1 또는 CD244)를 시험하도록 설계하였다. 이 항원은 HSC로부터의 항원의 CRISPR 매개 절제에 의해 "암 특이적"이 된다(문헌[Haubner et al. Leukemia. 2018;33(1):64-74] 참조). 이러한 전략은 또한 기능적 오르가노이드가 발현을 제거하도록 편집된 배아 또는 유도 만능 줄기세포로부터 생성될 수 있거나 1차 기관이 이미 제거된(즉, 근치적 전립선 절제술 후 환자에서 정상 전립선 계통 항원을 표적으로 하기 위해) 고형 종양에서 복제될 수 있다. 마지막으로, DNA 염기 편집 방법을 사용한 조직 특이적 항원의 "에피토프 변형" 가능성이 제안되었다. "에피토프 변형"은 단백질이 기능을 유지하지만 작은 항원 결정기를 전환하도록 할 수 있다. 이 전략에서, 줄기세포는 기능적 단백질을 보유하지만, 더 이상 면역 요법을 위한 결합 부위를 보유하지 않는 반면, 변형되지 않은 단백질을 보유하는 암세포는 면역 요법에 고유하게 민감하게 남아 있다.
실시예 6: 젬투주맙 오조가마이신(GO)-표적화 면역요법은 1차 급성 골수성 백혈병(AML)을 제거하고, CD33Del 세포를 구제하였다.
CD34+ 세포의 집단을 gRNAs sgRNA 811(5' CCUCACUAGACUUGACCCAC 3'의 가이드 영역을 가짐; 서열번호 70) 및 sgRNA 846(5' AUCCCUGGCACUCUAGAACC 3'의 가이드 영역을 가짐; 서열번호 67)과 접촉시킴으로써 CD34+CD33Del 세포를 생성시켰다. GO 처리 시CD34+CD33De 세포 생착 및 조혈 재증식을 평가하기 위해서, 0.5×106개의 1차 인간 AML 세포를 첫째 날 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 NSG-SGM3(NSGS) 마우스에 주사하였다. AML 세포 주사 2개월 후, 골수(BM) 흡인물의 유세포 분석에 의해 AML 부담(최소 잔류 질환)을 평가하였다. 이어서, 코호트를 2개의 대등한 군(도 32A 그래프: 치료 전)으로 나누었다: 마우스가 치료를 제공받지 않을 대조군(원) 및 마우스가 만성 용량의 GO를 제공받을 처리군(삼각형). 백혈병 세포를 다음 항체를 사용하여 Ter119- H2kd/Ly5- hCD45+hCD33+cKit에 게이팅하였다: Ter119 Pecy5, Ly5/H2kd BV711, hCD45 BV510, hCD33 APC, cKit BV650. 최소 잔류 질환이 평가되면, 처리군의 마우스에 GO 1㎍을 첫 번째 주사하였다. 첫 번째 GO 주사 10일 후, 두 마우스 군(미처리 및 처리)에 0.5×106개 CD34+CD33Del 세포를 이식하였다. CD34+CD33Del 세포 이식 10일 후, 처리군에게 만성 용량의 GO(10일마다 1μgr GO 주입)를 제공하기 시작하였다. CD34+CD33Del 이식 3주 후, 두 마우스 군의 BM 흡인물을 AML 부담 및 CD34+CD33Del 세포 생착 평가에 대해서 유세포 분석법으로 분석하였다. 대조군 마우스에서 AML 수준은 70% 초과인 반면, 처리된 마우스에서는 AML 수준이 5% 미만이었다. 대조군 마우스에서 hCD33Del 세포의 백분율은 20% 미만인 반면, 처리된 마우스에서는 hCD33Del 세포의 백분율이 70% 초과하였는데, 이는 성공적인 생착을 나타낸다. (도 32B, 상단 그래프). 다음으로, 주입된 CD34+CD33 세포의 조혈 재증식 능력을 도 32B에 도시된 바와 같이 유세포 분석에 의해 골수/림프 전구체 및 성숙 세포를 분석함으로써 평가하였다. hCD45+CD33Del 집단 내 CD123+ 세포, CD14+ 세포, CD10+ 세포 및 CD19+ 세포의 수준(세포는 Ter119-, Ly5-/H2kd-, hCD45+, hCD33-에 게이팅됨)은 대조군과 처리된 코호트 간에 크게 다르지 않았다. 도 32C의 좌측 상단 패널에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스는 150일 동안 생존하지 못한 반면, 처리된 모든 마우스는 적어도 150일 동안 생존하였다. AML 부담은 사망 당시 대조군 마우스의 BM, 비장 및 말초 혈액에서 대등하였다(좌측 하단 패널). 더욱이, CD33 발현은 각각의 기관 또는 조직(우측 패널)에서 게이팅된 CD33+ 세포에 의해 나타난 바와 같이 BM 및 비장에서 가장 두드러졌다.
실시예 7: CD34 + CD33 Del CLL1 Del 세포의 생성
CD34+ 세포에, sgRNA 811(CD33에 대한 5' CCUCACUAGACUUGACCCAC 3'의 스페이서 서열을 가짐; 서열번호 70), sgRNA 846(CD33에 대한 스페이서 서열 5' AUCCCUGGCACUCUAGAACC 3'; 서열번호 67), 5' GUUGUAGAGAAAUAUUUCUC 3'의 스페이서 서열을 갖는 CLL-1 gRNA(서열번호 115) 및 가이드 영역 5' GGAGAGGUUCCUGAUCUUGU 3'를 갖는 제2 CLL-1 gRNA(서열번호 116)를 포함하는 gRNA의 상이한 조합물을 형질주입함으로써 CD34+CD33DelCLL1Del 이중 결실 세포를 생성시켰다. 제1일에 CRISPR/Cas9 매개-절제 후의 표적 유전자를 얻기 위해서 뉴클레오펙션을 사용하여 세포에 sgRNA를 형질주입하였다. 형질주입 4일 후, CD33 및 CLL1의 발현을 유세포 분석법에 의해 평가하였다. 제5일에, CD34+WT, CD34+CD33Del, CD34+CLL1Del 또는 CD34+CD33DelCLL1Del 세포를 NSGS 마우스에 정맥내 주사하였다. 도 33A에 나타낸 바와 같이, CD33 및/또는 CLL1 수준은 이러한 gRNA를 사용하여 개별적으로 및 조합하여 성공적으로 고갈되었다. 원하는 유전자좌의 돌연변이를 Sanger 서열결정에 의해 확인하였다(데이터 표시되지 않음).
주사 4주 후, 주사된 마우스의 골수(BM) 흡인물을 유세포 분석법에 의해 분석하여 Ter119-, Ly5-/H2kd-, hCD45+에 게이팅된 CD34+ 세포에서 CD33 및/또는 CLL1의 존재를 결정하였다(도 33B). 골수 샘플에서 단일 및 이중 결실 세포가 성공적으로 검출되었다. 또한, CD123+, CD14+, CD10+ 및 CD19+ 세포는 전체 골수 샘플(도 33C) 및 비장 샘플(도 33D) 모두에서 hCD45+ 집단에서 검출되었다. 이러한 분석은, CD33 및/또는 CLL1의 고갈이 조혈 다계통 생착을 손상시키지 않았음을 나타낸다.
Figure pct00020
다른 실시형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 대안적인 특징에 의해 대체되어 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공할 수 있다. 따라서, 달리 명확히 기재되지 않은 한, 개시된 각각의 특징은 오직 동등한 또는 유사한 특징의 총체적 시리즈의 예이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 개시내용의 필수적인 특징을 쉽게 확신할 수 있고, 이의 사상 및 범주를 벗어남이 없이, 본 개시내용의 다양한 변화 및 변형을 다양한 용법 및 조건에 적응시키도록 이것을 만들 수 있다. 따라서, 다른 실시형태가 또한 청구범위 내에 있다.
등가물
본 명세서에 본 발명의 몇 가지 실시형태가 기재되고 예시되었으나, 당업자는 기능을 수행하고/하거나 본 명세서에 기재된 하나 이상의 이점 및/또는 결과를 얻기 위한 다른 각종 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이며, 그러한 변동 및/또는 변형은 각각 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태의 범주 속하는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 당업자는 본 명세서에 기재된 모든 매개변수, 차원, 물질 및 구성이 예시적인 것을 의미하고, 실측 매개변수, 차원, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 용도 또는 용도들에 의존할 것임을 용이하게 인식할 것이다. 당업자는 일상적인 수준 이하의 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시형태는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 이에 대한 등가물의 범주 내에서 본 발명의 실시형태가 구체적으로 기재되고 청구된 것과는 다른 방식으로 수행될 수도 있음을 이해해야 한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 각각의 개별적 특성, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2종 이상의 그러한 특성, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은, 그러한 특성, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는다면, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 명세서에 정의되고 사용된 바와 같은 모든 정의는 사전적 정의, 참조에 의해 원용된 문헌의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미에 대해 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 참조문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참조에 의해 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 단수 표현은, 명확히 반대로 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "및/또는"이라는 문구는 연접한 요소, 즉 몇몇 경우에는 결합되어 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 열거된 다수의 요소는 동일한 방식으로, 즉 연접된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. "및/또는" 문구에 의해 구체적으로 식별된 이러한 요소와 관련이 있든 없든 간에, 이러한 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, 일 실시형태에서, A만(B 외의 요소를 선택적으로 포함함); 다른 실시형태에서, B만(A 외의 요소를 선택적으로 포함함); 또 다른 실시형태에서, A와 B 둘 다(다른 요소를 선택적으로 포함함); 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "또는"은 상기에 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록 내에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉, 다수의 요들 또는 하나의 목록의 요소 및 선택적으로 추가적인 미열거 항목 중 적어도 하나를 포함하지만, 1개 초과도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "중 단 하나" 또는 "중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용되는 경우 "로 이루어진"과 같은 명확히 반대로 나타낸 용어만 다수의의 또는 목록의 요소 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "또는"이라는 용어는 "어느 하나", " 중 하나", "중 단 하나" 또는 "중 정확히 하나"와 같은 배타적 용어가 선행될 때에만, 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 하나이지만 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로 해석될 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록의 언급에서 "적어도 하나"라는 문구는, 요소의 목록 내의 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택되지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하지는 않으며, 요소의 목록 내의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이 정의는 또한, "적어도 하나"라는 문구가 언급하는 요소의 목록 내에, 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든 간에, 구체적으로 식별된 요소 외의 요소가 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로, "A와 B 중 적어도 하나"(또는 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 실시형태에서 B가 존재하지 않는 경우, 적어도 하나, 예컨대, 선택적으로 2개 초과의 A(그리고 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 다른 실시형태에서는, A가 존재하지 않는 경우, 적어도 하나, 예컨대, 선택적으로 2개 초과의 B(그리고 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나, 예컨대, 선택적으로 1개 초과의 A 및 적어도 하나, 예컨대, 선택적으로 1개 초과의 B(그리고 선택적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
또한 명확하게 반대로 제시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 언급된 단계 또는 행위의 순서로 반드시 제한되는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITION OF LINEAGE SPECIFIC ANTIGENS <130> WO/2020/150478 <140> PCT/US2020/013887 <141> 2020-01-16 <150> US 62/852,573 <151> 2019-05-24 <150> US 62/793,210 <151> 2019-01-16 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 gagatcgtgc tgacccagag ccccggcagc ctggccgtga gccccggcga gagggtgacc 60 atgagctgca agagcagcca gagcgtgttc ttcagcagca gccagaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agatccccgg ccagagcccc aggctgctga tctactgggc cagcaccagg 180 gagagcggcg tgcccgacag gttcaccggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240 atcagcagcg tgcagcccga ggacctggcc atctactact gccaccagta cctgagcagc 300 aggaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagagg 339 <210> 2 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 caggtgcagc tgcagcagcc cggcgccgag gtggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactaca tccactggat caagcagacc 120 cccggccagg gcctggagtg ggtgggcgtg atctaccccg gcaacgacga catcagctac 180 aaccagaagt tccagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcac caccgcctac 240 atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagggaggtg 300 aggctgaggt acttcgacgt gtggggccag ggcaccaccg tgaccgtgag cagc 354 <210> 3 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60 catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120 tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180 tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240 atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300 gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 360 cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 420 gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 480 cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 540 attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 600 agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 657 <210> 4 <211> 603 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 ctatcaattt ttgatcctcc tccttttaaa gtaactctta caggaggata tttgcatatt 60 tatgaatcac aactttgttg ccagctgaag ttctggttac ccataggatg tgcagccttt 120 gttgtagtct gcattttggg atgcatactt atttgttggc ttacaaaaaa gaagtattca 180 tccagtgtgc acgaccctaa cggtgaatac atgttcatga gagcagtgaa cacagccaaa 240 aaatctagac tcacagatgt gaccctaaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 300 gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 360 tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 420 aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 480 agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 540 ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 600 cgc 603 <210> 5 <211> 627 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60 catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120 tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180 tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgttc 240 atgagagcag tgaacacagc caaaaaatct agactcacag atgtgaccct aagagtgaag 300 ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 360 ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 420 gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 480 aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 540 aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 600 cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 627 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn 65 70 75 80 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 85 90 95 Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 100 105 <210> 7 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Leu His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp 20 25 30 Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 gttgagtttt gcattggcgg cgg 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 acctgtcagg tgaagttcgc tgg 23 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser 20 25 30 Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Gly Ser Thr Ser Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 Thr Lys Gly <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 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agcagtgaac 240 acagccaaaa aatctagact cacagatgtg accctaagag tgaagttcag caggagcgca 300 gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 360 agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 420 ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 480 gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 540 ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 600 ctgccccctc gctaacgccc ctctccctcc ccccccccta a 641 <210> 19 <211> 665 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 gcggccgcaa ttgaagttat gtatcctcct ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga 60 accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct 120 aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 180 acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac 240 tacatgttca tgagagcagt gaacacagcc aaaaaatcta gactcacaga tgtgacccta 300 agagtgaagt tcagcaggag 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gatgtgtggg gccagggaac caccgtgacc gtgtctagcg ccctgagcaa 840 cagcatcatg tacttcagcc acttcgtgcc cgtgtttctg cccgccaagc ctaccacaac 900 ccctgcccct agacctccta ccccagcccc tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag 960 gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg agccgtgcac accagaggcc tggatatcta 1020 catctgggcc ccactggccg gcacctgtgg cgtgctgctg ctgtctctcg tgatcaccaa 1080 gagaggccgg aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgcggc ccgtgcagac 1140 cacccaggaa gaggacggct gtagctgccg gttccccgag gaagaagaag ggggctgcga 1200 gctgagagtg aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc tatcagcagg gccagaacca 1260 gctgtacaac gagctgaacc tgggcagacg ggaagagtac gacgtgctgg acaagcggag 1320 aggcagggac cctgagatgg gcggcaagcc cagacggaag aaccctcagg aaggcctgta 1380 taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctactcc gagatcggaa tgaagggcga 1440 gcggagaaga ggcaagggcc acgatggact gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga 1500 cacctatgac gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga tgaaattcat cgacgttaac 1560 tattctag 1568 <210> 39 <211> 1586 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60 caccgtggcc tgtagcatca gcgagatcgt gctgacccag agccctggct ctctggctgt 120 gtctcctggc gagcgcgtga ccatgagctg caagagcagc cagagcgtgt tcttcagcag 180 ctcccagaag aactacctgg cctggtatca gcagatcccc ggccagagcc ccagactgct 240 gatctactgg gccagcacca gagaaagcgg cgtgcccgat agattcaccg gcagcggctc 300 tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cgtgcagccc gaggacctgg ccatctacta 360 ctgccaccag tacctgagca gccggacctt tggccagggc accaagctgg aaatcaagcg 420 gggcagcaca agcggcagcg gaaagcctgg atctggcgag ggctctacca agggccaggt 480 gcagctgcag cagcctggcg ccgaagtcgt gaaacctggc gcctccgtga agatgtcctg 540 caaggccagc ggctacacct tcaccagcta ctacatccac tggatcaagc agacccctgg 600 acagggcctg gaatgggtgg gagtgatcta ccccggcaac gacgacatca gctacaacca 660 gaagttccag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacaagtct agcaccaccg cctacatgca 720 gctgtccagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac tgcgccagag aagtgcggct 780 gcggtacttc gatgtgtggg gccagggaac caccgtgacc gtgtctgccc tgagcaacag 840 catcatgtac ttcagccact tcgtgcccgt gtttctgccc gccaagccta ccacaacccc 900 tgcccctaga cctcctaccc cagcccctac aatcgccagc cagcctctgt ctctgaggcc 960 cgaggcttct agaccagctg ctggcggagc cgtgcacacc agaggactgg acaagccctt 1020 ctgggtgctg gtggtcgtgg gcggagtgct ggcctgttac agcctgctcg tgacagtggc 1080 cttcatcatc ttttgggtgc gcagcaagcg gtctagactg ctgcacagcg actacatgaa 1140 catgaccccc agaaggccag gccccacccg gaagcactat cagccttacg cccctcccag 1200 agacttcgcc gcctaccggt ccagagtgaa gttcagcaga agcgccgacg cccctgccta 1260 tcagcagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggcagacggg aagagtacga 1320 cgtgctggac aagagaagag gccgggaccc tgagatgggc ggcaagccca gacggaagaa 1380 ccctcaggaa ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag atggccgagg cctactccga 1440 gatcggcatg aagggcgaac ggcggagagg caagggacac gatggactgt accagggcct 1500 gagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc cctgcacatg caggccctgc cccccagatg 1560 aaattcatcg acgttaacta ttctag 1586 <210> 40 <211> 1715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 40 ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60 caccgtggcc tgtagcatca gcgagatcgt gctgacccag agccctggct ctctggctgt 120 gtctcctggc gagcgcgtga ccatgagctg caagagcagc cagagcgtgt tcttcagcag 180 ctcccagaag aactacctgg cctggtatca gcagatcccc ggccagagcc ccagactgct 240 gatctactgg gccagcacca gagaaagcgg cgtgcccgat agattcaccg gcagcggctc 300 tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cgtgcagccc gaggacctgg ccatctacta 360 ctgccaccag tacctgagca gccggacctt tggccagggc accaagctgg aaatcaagcg 420 gggcagcaca agcggcagcg gaaagcctgg atctggcgag ggctctacca agggccaggt 480 gcagctgcag cagcctggcg ccgaagtcgt gaaacctggc gcctccgtga agatgtcctg 540 caaggccagc ggctacacct tcaccagcta ctacatccac tggatcaagc agacccctgg 600 acagggcctg gaatgggtgg gagtgatcta ccccggcaac gacgacatca gctacaacca 660 gaagttccag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacaagtct agcaccaccg cctacatgca 720 gctgtccagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac tgcgccagag aagtgcggct 780 gcggtacttc gatgtgtggg gccagggaac caccgtgacc gtgtctagcg ccctgagcaa 840 cagcatcatg tacttcagcc acttcgtgcc cgtgtttctg cccgccaagc ctaccacaac 900 ccctgcccct agacctccta ccccagcccc tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag 960 gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg agccgtgcac accagaggac tggacaagcc 1020 cttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt gctggcctgt tacagcctgc tcgtgacagt 1080 ggccttcatc atcttttggg tgcgcagcaa gcggtctaga ctgctgcaca gcgactacat 1140 gaacatgacc cccagaaggc caggccccac ccggaagcac tatcagcctt acgcccctcc 1200 cagagacttc gccgcctaca gatccaagag aggccggaag aagctgctgt acatcttcaa 1260 gcagcccttc atgcggcccg tgcagaccac ccaggaagag gacggctgta gctgccggtt 1320 ccccgaggaa gaagaagggg gctgcgagct gagagtgaag ttcagcagaa gcgccgacgc 1380 ccctgcctat cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gcagacggga 1440 agagtacgac gtgctggaca agagaagagg ccgggaccct gagatgggcg gcaagcccag 1500 acggaagaac cctcaggaag gcctgtataa cgaactgcag aaagacaaga tggccgaggc 1560 ctactccgag atcggaatga agggcgagcg gcggagaggc aagggacacg atggactgta 1620 ccagggcctg agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgcc ctgcacatgc aggccctgcc 1680 ccccagatga aattcatcga cgttaactat tctag 1715 <210> 41 <211> 1436 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 41 ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60 caccgtggcc tgcagcatca gcatccagat gacccagacc accagcagcc tgagcgccag 120 cctgggcgat agagtgacca tcagctgcag agccagccag gacatcagca agtacctgaa 180 ctggtatcag cagaaacccg acggcaccgt gaagctgctg atctaccaca ccagcagact 240 gcacagcggc gtgccctcta gattttccgg cagcggctcc ggcaccgact acagcctgac 300 catctccaac ctggaacagg aagatatcgc tacctacttc tgtcagcaag gcaacaccct 360 gccctacacc ttcggcggag gcaccaagct ggaaatcggc agcacaagcg gctctggcaa 420 gcctggatct ggcgagggct ctaccaaggg cctgcaggaa tctggccctg gactggtggc 480 ccctagccag agcctgtctg tgacctgtac cgtgtccggc gtgtccctgc ctgactatgg 540 cgtgtcctgg atcagacagc cccccagaaa gggcctggaa tggctgggag tgatctgggg 600 cagcgagaca acctactaca acagcgccct gaagtcccgg ctgaccatca tcaaggacaa 660 ctccaagagc caggtgttcc tgaagatgaa cagcctgcag accgacgaca ccgccatcta 720 ctactgcgcc aagcactact actacggcgg cagctacgcc atggactact ggggccaggg 780 cacaagcgtg accgtgtctg ccctgagcaa cagcatcatg tacttcagcc acttcgtgcc 840 cgtgtttctg cccgccaagc ctaccacaac ccctgcccct agacctccta ccccagcccc 900 tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg 960 agccgtgcac accagaggac tggacaagcc cttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt 1020 gctggcctgt tatagcctgc tcgtgacagt ggccttcatc atcttttggg tgcgcgtgaa 1080 gttcagccgc agcgccgatg cccctgccta tcagcaggga cagaaccagc tgtacaacga 1140 gctgaacctg ggcagacggg aagagtacga cgtgctggac aagagaagag gccgggaccc 1200 tgagatgggc ggcaagccca gaagaaagaa cccccaggaa ggcctgtata acgaactgca 1260 gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgaac ggcggagagg 1320 caagggccac gatggactgt atcagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc 1380 cctgcacatg caggctctgc cccctcgctg aaattcatcg acgttaacta ttctag 1436 <210> 42 <211> 1253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 42 ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60 caccgtggcc tgtagcatca gcgagatcgt gctgacccag agccctggct ctctggctgt 120 gtctcctggc gagcgcgtga ccatgagctg caagagcagc cagagcgtgt tcttcagcag 180 ctcccagaag aactacctgg cctggtatca gcagatcccc ggccagagcc ccagactgct 240 gatctactgg gccagcacca gagaaagcgg cgtgcccgat agattcaccg gcagcggctc 300 tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cgtgcagccc gaggacctgg ccatctacta 360 ctgccaccag tacctgagca gccggacctt tggccagggc accaagctgg aaatcaagcg 420 gggcagcaca agcggcagcg gaaagcctgg atctggcgag ggctctacca agggccaggt 480 gcagctgcag cagcctggcg ccgaagtcgt gaaacctggc gcctccgtga agatgtcctg 540 caaggccagc ggctacacct tcaccagcta ctacatccac tggatcaagc agacccctgg 600 acagggcctg gaatgggtgg gagtgatcta ccccggcaac gacgacatca gctacaacca 660 gaagttccag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacaagtct agcaccaccg cctacatgca 720 gctgtccagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac tgcgccagag aagtgcggct 780 gcggtacttc gatgtgtggg gccagggaac caccgtgacc gtgtctagcg ccctgagcaa 840 cagcatcatg tacttcagcc acttcgtgcc cgtgtttctg cccgccaagc ctaccacaac 900 ccctgcccct agacctccta ccccagcccc tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag 960 gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg agccgtgcac accagaggac tggacaagcc 1020 cttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt gctggcctgt tacagcctgc tcgtgacagt 1080 ggccttcatc atcttttggg tgcgcagcaa gcggtctaga ctgctgcaca gcgactacat 1140 gaacatgacc cccagaaggc caggccccac ccggaagcac tatcagcctt acgcccctcc 1200 cagagacttc gccgcctaca gaagctgaaa ttcatcgacg ttaactattc tag 1253 <210> 43 <211> 1559 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60 caccgtggcc tgcagcatca gcatccagat gacccagacc accagcagcc tgagcgccag 120 cctgggcgat agagtgacca tcagctgcag agccagccag gacatcagca agtacctgaa 180 ctggtatcag cagaaacccg acggcaccgt gaagctgctg atctaccaca ccagcagact 240 gcacagcggc gtgccctcta gattttccgg cagcggctcc ggcaccgact acagcctgac 300 catctccaac ctggaacagg aagatatcgc tacctacttc tgtcagcaag gcaacaccct 360 gccctacacc ttcggcggag gcaccaagct ggaaatcggc agcacaagcg gctctggcaa 420 gcctggatct ggcgagggct ctaccaaggg cctgcaggaa tctggccctg gactggtggc 480 ccctagccag agcctgtctg tgacctgtac cgtgtccggc gtgtccctgc ctgactatgg 540 cgtgtcctgg atcagacagc cccccagaaa gggcctggaa tggctgggag tgatctgggg 600 cagcgagaca acctactaca acagcgccct gaagtcccgg ctgaccatca tcaaggacaa 660 ctccaagagc caggtgttcc tgaagatgaa cagcctgcag accgacgaca ccgccatcta 720 ctactgcgcc aagcactact actacggcgg cagctacgcc atggactact ggggccaggg 780 cacaagcgtg accgtgtctg ccctgagcaa cagcatcatg tacttcagcc acttcgtgcc 840 cgtgtttctg cccgccaagc ctaccacaac ccctgcccct agacctccta ccccagcccc 900 tacaatcgcc agccagcctc tgtctctgag gcccgaggct tctagaccag ctgctggcgg 960 agccgtgcac accagaggac tggacaagcc cttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt 1020 gctggcctgt tatagcctgc tcgtgacagt ggccttcatc atcttttggg tgcgcagcaa 1080 gcggagccgg ctgctgcact ccgactacat gaacatgacc cccagacggc caggccccac 1140 ccggaaacac tatcagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctacc ggtccagagt 1200 gaagttcagc agatccgccg acgcccctgc ctatcagcag ggacagaacc agctgtacaa 1260 cgagctgaac ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg gacaagagaa gaggccggga 1320 ccctgagatg ggcggcaagc ccagaagaaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact 1380 gcagaaagac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg aacggcggag 1440 aggcaagggc cacgatggac tgtatcaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctatga 1500 cgccctgcac atgcaggctc tgccccctcg ctgaaattca tcgacgttaa ctattctag 1559 <210> 44 <211> 1514 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 44 ggtgtcgtga gcggccgctg aactggccac catgtggctg cagtctctgc tgctgctggg 60 caccgtggcc tgtagcatca gcgagatcgt gctgacccag agccctggct ctctggctgt 120 gtctcctggc gagcgcgtga ccatgagctg caagagcagc cagagcgtgt tcttcagcag 180 ctcccagaag aactacctgg cctggtatca gcagatcccc ggccagagcc ccagactgct 240 gatctactgg gccagcacca gagaaagcgg cgtgcccgat agattcaccg gcagcggctc 300 tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cgtgcagccc gaggacctgg ccatctacta 360 ctgccaccag tacctgagca gccggacctt tggccagggc accaagctgg aaatcaagcg 420 gggcagcaca agcggcagcg gaaagcctgg atctggcgag ggctctacca agggccaggt 480 gcagctgcag cagcctggcg ccgaagtcgt gaaacctggc gcctccgtga agatgtcctg 540 caaggccagc ggctacacct tcaccagcta ctacatccac tggatcaagc agacccctgg 600 acagggcctg gaatgggtgg gagtgatcta ccccggcaac gacgacatca gctacaacca 660 gaagttccag ggcaaggcca ccctgaccgc cgacaagtct agcaccaccg cctacatgca 720 gctgtccagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac tgcgccagag aagtgcggct 780 gcggtacttc gatgtgtggg gccagggaac caccgtgacc gtgtccagca tcgaagtgat 840 gtacccccct ccctacctgg acaacgagaa gtccaacggc accatcatcc acgtgaaggg 900 caagcacctg tgccccagcc ctctgtttcc tggccctagc aagcccttct gggtgctggt 960 ggtcgtgggc ggagtgctgg cctgttacag cctgctcgtg acagtggcct tcatcatctt 1020 ttgggtgcgc agcaagcggt ctagactgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag 1080 aaggccaggc cccacccgga agcactatca gccttacgcc cctcccagag acttcgccgc 1140 ctaccggtcc agagtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctatc agcagggcca 1200 gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa 1260 gcggagaggc agggaccctg agatgggcgg caagcccaga cggaagaacc ctcaggaagg 1320 cctgtataac gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tactccgaga tcggcatgaa 1380 gggcgagcgg agaagaggca agggccacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac 1440 caaggacacc tatgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagatgaa attcatcgac 1500 gttaactatt ctag 1514 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cell-surface antigen sequence <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 45 atcgatcgat cgtacgcgng g 21 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cell-surface antigen sequence <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 46 atgcatcgta catcgatcgn gg 22 <210> 47 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 47 Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn 1 5 10 15 Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg 20 25 30 Leu Thr Asp Val Thr Leu 35 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 cctcactaga cttgacccac agg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 atccctggca ctctagaacc cgg 23 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 atccctggca ctctagaacc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 ggccgggttc tagagtgcca 20 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 ttctcctcac tagacttgac ccacaggccc a 31 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 tgggcctgtg 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 uggccggguu cuagagugcc agg 23 <210> 62 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 ggccggguuc uagagugcca ggg 23 <210> 63 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 caccgaggag ugaguagucc ugg 23 <210> 64 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 uccagcgaac uucaccugac agg 23 <210> 65 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 ccucacuaga cuugacccac agg 23 <210> 66 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 aucccuggca cucuagaacc cgg 23 <210> 67 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 aucccuggca cucuagaacc 20 <210> 68 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 ggccggguuc uagagugcca 20 <210> 69 <400> 69 000 <210> 70 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 ccucacuaga cuugacccac 20 <210> 71 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 ccucaucccu ggcacucuag aacccggc 28 <210> 72 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 gaguggccgg guucuagagu gccaggga 28 <210> 73 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 uucuccucac uagacuugac ccacaggc 28 <210> 74 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(25) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(38) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(51) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(64) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(77) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(90) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(103) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(116) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (118)..(129) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (131)..(142) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (144)..(155) <223> This region may encompass 3-12 residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(156) <223> This sequence may encompass 3-12 "GlyxSer" repeating units, wherein x = 3-12 <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 74 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 <210> 75 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 agtggccggg ttctagagtg ccagggatga ggattttggg 40 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 agtggccggg ttctagagtg ccggggatga ggattttggg 40 <210> 77 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 ctcatccctg gcactctaga acccggccac tccaaaaacc tg 42 <210> 78 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 ctcatccctg gcactctaga acccggccac tccaaaaacc tg 42 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 atccctggca ctcaggagcc 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 aaccctggct ctctaaaacc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 atccctggca ccctggcacc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 atccctggca ctccagggcc 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 agccctggca gtctggaacc 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 atcccaggcc ctctataacc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 atccatggta ctctggaacc 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 aacccaggca ctctagcacc 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 acccctagca ctctagagcc 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 acccctggca gtctagagcc 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 atccctgaca ctctgggacc 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 agccctcgca ctctggaacc 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 atctctggca gactagaacc 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 acccctgaca ctctagaaag 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 atccctggca cactgggccc 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 atcactgtct ccctagaacc 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 atccctgacc ctccagaaca 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 acccctggct ccctagagcc 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 ctgcctggct ctctagcacc 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 gtctctggca ctctaggccc 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 cctcacaaga ttagacccac 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 tctcactggc cttgacccac 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 cctcactgga cttgactcag 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 cctcactgga caagacccac 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 cctcactaga ctagatccat 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 cctcgctagc ctttacccac 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 cctcacaaga caagacccac 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 cttcaccagc cttgacccac 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 cctcaccagc cctgacccac 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 tcacactggc cttgacccac 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 ccttactagc ctccacccac 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 cctcacaaga taagacccac 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 cctaactaga attgccacac 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 cctctatata cttgtcccac 20 <210> 113 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 cctcatccct ggcactctag aacccggcca c 31 <210> 114 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 actagacttg acccacaggc ccaaaatcct catccctggc actctagaac ccggcca 57 <210> 115 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 115 guuguagaga aauauuucuc 20 <210> 116 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 116 ggagagguuc cugaucuugu 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gttgtagaga aatatttctc 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 ggagaggttc ctgatcttgt 20 <210> 119 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 119 ugaauaucuc caacaagauc 20

Claims (40)

  1. 유전자 조작된 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell) 또는 전구세포(progenitor cell)로서,
    내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 상기 유전자 돌연변이는 CCUCACUAGACUUGACCCAC(서열번호 70)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 gRNA에 의해서 표적화되는 부위에 존재하고, 상기 유전자 돌연변이는 야생형 대응물 세포와 비교할 때 CD33의 감소된 발현 수준을 유발하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 야생형 대응물에 의해서 발현되는 CD33의 20% 미만을 발현하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  3. 제2항에 있어서, CD33을 발현하지 않는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CD34+인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골수 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래되는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 대상체는 조혈 악성종양을 갖는 인간 환자인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  7. 제5항에 있어서, 상기 대상체는 건강한 인간 공여자인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 어떠한 예측된 표적외 부위, 예를 들어, 도 30에 열거된 어떠한 부위에도 돌연변이를 포함하지 않는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 복수의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는, 세포 집단.
  10. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법으로서,
    (i) 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 제공하는 단계, 및
    (ii) 상기 세포에 (a) 서열번호 70과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA); 및 (b) Cas9 엔도뉴클레아제를 도입하여, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 생산하는 단계
    를 포함하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포는 상기 야생형 대응물에 의해서 발현되는 CD33의 20% 미만을 발현하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포는 CD33을 발현하지 않는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 및 (b)는 상기 세포에 도입되는 하나의 벡터 상에 암호화된, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  15. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 및 (b)는 사전 형성된 리보핵단백질 복합체로서 상기 세포에 도입되는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 리보핵단백질 복합체는 전기천공을 통해서 상기 세포에 도입되는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  17. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 엔도뉴클레아제는 상기 세포에 상기 Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 분자를 전달함으로써 상기 세포에 도입되는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 단일-분자 가이드 RNA(single-molecule guide RNA: sgRNA)인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 gRNA는 화학적으로 변형된 sgRNA인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기세포 또는 전구세포는 CD34+인, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기세포 또는 전구세포는 대상체의 골수 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)로부터 유래되는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 대상체는 조혈 장애를 갖는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포의 생산 방법.
  23. 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  24. 조혈 장애의 치료 방법으로서,
    조혈 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제8항 및 제23항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 제9항의 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 조혈 장애의 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조혈 장애는 조혈 악성종양인, 조혈 장애의 치료 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 대상체에게 유효량의 CD33을 표적으로 하는 작용제를 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는, 조혈 장애의 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서, CD33을 표적으로 하는 작용제는 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역세포인, 조혈 장애의 치료 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포인, 조혈 장애의 치료 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역세포, 상기 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 둘 다는 동종이계(allogeneic)인, 조혈 장애의 치료 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역세포, 상기 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포 또는 둘 다는 자가(autologous)인, 조혈 장애의 치료 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 수용체 내의 상기 항원-결합 단편은 인간 CD33에 특이적으로 결합하는 단일-쇄 항체 단편(scFv)인, 조혈 장애의 치료 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종을 갖는 인간 환자인, 조혈 장애의 치료 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 대상체는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 또는 만성 림프모구성 백혈병인 백혈병을 갖는 인간 환자인, 조혈 장애의 치료 방법.
  34. 서열번호 70과 적어도 90% 동일한 스페이서 서열을 포함하는, 가이드 리보핵산(gRNA).
  35. 제34항에 있어서, 상기 gRNA는 단일-분자 gRNA(sgRNA)인, gRNA.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 gRNA는 화학적으로 변형된, gRNA.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 서열번호 70인, gRNA.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에서 어느 예측된 표적외 부위에 대해서도 유전자 편집을 유도하지 않고, 예를 들어, 표적 세포에서 도 30에 열거된 어느 부위에 대해서도 유전자 편집을 유도하지 않는, gRNA.
  39. 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포로서,
    내인성 CD33 유전자의 엑손 3에 유전자 돌연변이를 포함하되, 상기 유전자 돌연변이는 AUCCCUGGCACUCUAGAACC(서열번호 67)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 gRNA에 의해서 표적화되는 부위에 존재하는, 유전자 조작된 조혈 줄기세포 또는 전구세포.
  40. 서열번호 67과 적어도 90% 동일한 스페이서 서열을 포함하는, 가이드 리보핵산(gRNA).
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Patent event date: 20210810

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