KR20240133711A - 갈랙틴-10 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질 갈랙틴-10(galectin-10), 특히 인간 갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 갈랙틴-10 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 갈랙틴-10의 결정화(crystallization)를 방해하며 따라서 병리학적으로 샤르코-라이덴 결정(Charcot-Leyden crystals, CLCs)의 형성/존재와 연결된 질환 및 병태를 예방 및 치료하는 방법에 유용하다.
Description
본 발명은 단백질 갈랙틴-10(galectin-10), 특히 인간 갈랙틴-10에, 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 갈랙틴-10 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 갈랙틴-10의 결정화(crystallization)를 방해하며 및 그러므로 병리학적으로 샤르코-라이덴 결정(Charcot-Leyden crystals, CLCs)의 형성/존재와 연결된 질환 및 병태를 예방 및 치료하는 방법에 유용하다.
샤르코-라이덴 결정(Charcot-Leyden crystals, CLCs)은 1853년에 처음 서술되었으며 및 미세하고, 무색의 결정으로 알레르기성 천식(allergic asthma) 및 기생충 감염을 포함하는 특정 병태를 가진 환자에서 발견되었다. CLCs는 호산성 염증성 반응(eosinophilic inflammatory response)과 연관된 인간 조직 및 분비물에서 자주 관찰된다. 천식 및 기생충 감염 이외에, 이 결정들은, 예를 들어, 골수성 백혈병과 같은 암을 지닌 환자에서 발견되었다. 구조적으로, CLCs는 길이 20 내지 40 μm 및 넓이 2 내지 4μm를 가진 세포 외 6각 양추 결정(hexagonal bipyramidal crystals)으로서 축적된다. 이 결정을 형성하는 단백질이 갈랙틴-10(galectin-10)으로 동정되었다.
갈랙틴-10(또한 샤르코-라이덴 결정(Charcot-Leyden crystals) 이라고도 알려짐)은 작고(16.5kDa), 자동-결정화되는(auto-crystallizing), 소수성(hydrophobic), 글라이칸-결합 단백질(glycan-binding protein)로 골수에서, 주로 호산구(eosinophils)에 의해 풍부하게 발현된다(Chua et al.(2012) PLoS One. 7(8): e42549). 갈랙틴-10은 또한 호염구(basophils) 및 Foxp3-양성-트래그(Foxp3-positive Tregs)에 의해서도 좀 적은 정도로 생산된다(Kubach et al.(2007) Blood 110(5): 1550-8). 이 단백질은 호산구(eosinophil) 구성 성분 중에 가장 풍부하고, 총 세포 단백질의 7% 내지 10%를 나타낸다. 갈랙틴-10은 인간 및 비-인간 영장류에서만 만 발견되며, 이는 분비 펩티드 신호 및 막 통과 도메인이 결여되어 있으며, 및 어떤 특정 병태에서 비-전통적인 및 새로운 아포크린 기전(apocrine mechanisms)으로 분비된다.
호산구 질환을 지닌 환자로부터의 조직에 CLCs가 나타난다는 많은 보고서가 있음에도 불구하고, 공통적인 견해는 이들 결정은 단지 호산구 사망의 마커일 뿐이라는 것이었다. 이러한 견해는 CLCs가 집 먼지-진드기(house dust mite, HDM)-유도된 쥐의 천식 모델에서 타입 2 면역(type 2 immunity)을 부스트 함을 보여준 연구에 의해 궁극적으로 도전을 받았다(Persson et al., Science(2019)). 추가로, CLCs 는 아스페르질루스증(Aspergillosis) 및 CRSwNP를 지닌 환자의 끈적한 점액에 풍부하다는 것이 관찰되었으며, 이는 CLCs가 점액의 점탄성에 기여한다는 것을 제시한다(Su J., Molecules(2018).
발명의 요약
갈랙틴-10 및 CLC-형성이 질환에 관여한다는 최근의 발견은 이는 치료제 타겟이라는 것을 제시한다. 갈랙틴-10 결정은 갈랙틴-10 항체의 투여에 의해 용해될 수 있다는 것을 여기서 보고한다. 중요하게, 여기서 보고되는 갈랙틴-10 항체는 37°C와 같은 상승된 온도에서 4주 동안의 저장 후에도 활성을 유지하며 및 안정하게 남아있다고 보고한다. 종합하면, 이는 여기서 보고되는 갈랙틴-10 항체는 병리적 현상이 CLCs 존재와 연결된 병태나 질환을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
첫 번째 관점에서, 본 발명은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합하는 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 항원 결합하는 단편은 가변 중쇄 도메인(variable heavy chain, VH) domain) 및 가변 경쇄 도메인(variable light chain, VL) domain)을 포함하고 여기서 :
(I)VH 도메인은 서열번호 2를 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR3; 서열번호 3을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR2; 서열번호 1을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR1 서열의 CDR 서열을 포함하고; 및
(II)VL 도메인은 서열번호 8을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR3; 서열번호 9를 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR2; 서열번호 7을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR1 서열의 CDR 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및 VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서. VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; 및 VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 단편은: 단일 사슬 항체(single chain antibody, scFv); F(ab')2 단편; Fab 단편; Fd 단편; Fv 단편; 단일-팔(단가) 항체(one-armed(monovalent) antibody); 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 또는 그러한 항원 결합 단편의 조합, 집합 또는 접합에 의해 형성된 어느 항원 결합 분자로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 형태에서, 항원 결합 단편은 Fab단편이다.
추가의 관점에서, 본 발명은 여기서 서술된 항체 또는 항원 결합 단편의 VH 및/또는 VL 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는, 여기서 서술된 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 분리된 폴리뉴크레오타이드 또는 폴리뉴크레오타이드들을 포함한다.
다른 관점에서, 작동적으로 조절 서열에 연결되어 항체, 항원 결합 단편, 가변 중쇄 도메인 또는 가변 경쇄 도메인을 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템(cell-free expression system)에서 발현되게 하는 여기서 서술된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 발현 벡터를 여기서 제공한다.
추가의 관점에서, 여기서 서술된 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 제공한다.
또한 여기서 제공되는 것은 여기서 서술된 대로의 재조합 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법이고, 이 방법에는 여기서 서술된 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에서 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하게 하는 조건하에서 배양하고 및 발현된 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 관점은, 여기서 서술된 대로의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 여기서 제공한다.
여기서 서술된 대로의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 여기서 서술된 대로의 약제학적 조성물은 추가의 관점에서 의약품으로서 사용된다. 추가의 관점에서, 이를 필요로하는 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 이 방법은 치료적으로 유효한 양의 여기서 서술된 대로의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 여기서 서술된 대로의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
항체, 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물은 갈랙틴-10 결정의 존재 또는 형성과 연관된 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위하여 투여될 수 있다. 적절하게, 질환 또는 병태는: 천식(asthma); 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis); 소아지방변증(celiac disease); 기생충감염(helminth infection); 위장관 호산구 염증(gastrointestinal eosinophilic inflammation); 낭포성 섬유종(cystic fibrosis)(CF); 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증(allergic bronchopneumonia aspergilosis, ABPA); 척-스트라우스 맥관염(Churg-Straus vasculitis); 만성 호산구 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 및 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 천식(asthema)이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 질환 또는 병태는 낭포성 섬유종(cystic fibrosis)이다.
본 발명은 또한 여기서 서술된 항체 또는 항원 결합 단편을 환자로부터 얻은 샘플에서 갈랙틴-10을 검출하는데 사용을 제공한다. 적절하게, 환자의 샘플은 점액 샘플 또는 객담(sputum) 샘플일 수 있다.
본 발명은 또한 여기서 서술된 대로 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 이 키트는 추가로 사용 설명서를 포함할 수 있다.
도 1은 두 번의 이중 실험의 결과를 보여준다. 이는 인간화된 Fab 클론 g18C06, g18E04, g18G07, g18G12, g20H09 및 g23H09로 배양시켰을 때 시간의 변수에 따라 샤르코 라이덴 결정(Charcot Leyden Crystal, CLC) 면적의 평균 변화가 얼마인가를 보여준다. 시간에 따른 CLCs의 용해가 기록되었다. 클론은 두 개의 독립적인 실험에서 250 μg/mL(n=4) 의 농도에서 검사되었으며 및 항체 첨가 2, 5, 7, 및 16시간 후에 샘플에 있는 CLCs의 이미지가 포착되었다. 이미지는 개별 결정(individual crystals)을 검출하기 위하여 알고리즘(algorithm)을 사용하여 분획 되었으며 및 웰 당 총 결정 면적이 결정되었다. 이 어세이에서, 1 μL의 항체 샘플은 1.5 mg/mL로 희석시켰으며 및 그 후 1 μg 의 Gal10을 형성된 재조합 CLCs 과 배양시켰다. 사용된 Y-축은 각 항체 샘플과 배양된 후의 웰 당 용해된 결정 면적의 평균 퍼센트이다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플(분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플)에 해당한다. "T2W"로 표시된 샘플은 분석 전에 37°C 온도에서 2시간 동안 저장되었다.
도 2는 회전하는 디스크 공초점 현미경(spinning disc confocal microscopy)으로 결정된 g7B07 및 g24F02_N53A(hFab)에 의한 재조합 샤르코 라이덴 결정(Charcot Leyden Crystals, CLCs)의 용해 비율을 보여주는 그래프이다. PBS만을 함유하는 샘플은 음성 대조군으로서 사용되었다. 도 2A는 재조합 CLC 용해 어세이의 도식적 묘사를 보여준다. 도 2B는 어세이 결과를 보여준다. 실험 시작점에서 CLC에 의해 커버 되는 초기 면적은 1로서 정의되었으며 및 CLC에 의해 점령되는 표면은 소프트웨어를 사용하여 결정되었다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플을 표시한다(분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플). "T2W"로 표시된 샘플은 분석 전에 37°C 온도에서 2시간 동안 저장되었다.
도 3은 나노드롭(Nanodrop)을 사용하여 280nm 파장에서 흡광도(A)를 측정하여 결정된 클론 g18C06, g20H09, g23H09, g24F02_N53A 및 g7B07의 단백질 농도를 보여준다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플에 해당한다(분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플). "TxW+y°C" 로 표시된 샘플은 분석 전에 y°C 의 온도에서 x 주 동안 저장되었다, 예를 들어, "T1W+5°C"로 표시된 샘플은 분석 전에 +5°C 에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, "T1W+25°C"로 표시된 샘플은 분석 전에 +25°C 에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, 및 등등. "1F/FT"로 표시된 샘플은 분석 전에 한 번의 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycles)을 거쳤고; "10F/FT"로 표시된 샘플은 분석 전에 10번의 동결-해동 사이클을 거쳤으며; 및 "낮은 pH(low pH)"로 표시된 샘플은 분석 전에 pH 3.7에서 2시간 동안 있게 하였다.
도 4는 표면 플라스몬 참조(surface plasmon reference, SPR)로 결정된 클론 g18C06, g20H09, g23H09, g24F02_N53A 및 g7B07의 퍼센트 상대적 활성(relative activity)을 보여준다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플에 해당한다(SPR 분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플). "TxW+y°C"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 y°C 의 온도에서 x 주(들) 동안 저장되었다, 예를 들어, "T1W+5°C"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 +5°C 에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, "T1W+25°C"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 +25°C 에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, 및 등등. "1F/FT"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 한 번의 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycles)을 거쳤고; "10F/FT"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 10번의 동결-해동 사이클을 거쳤으며; 및 "낮은 pH(low pH)"로 표시된 샘플은 분석 전에 pH 3.7에서 2시간 동안 있게 하였다.
도 5는 SE-HPLC로 결정된 대로 클론 g18C06, g20H09, g23H09, g24F02_N53A 및 g7B07의 퍼센트 순도를 보여준다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다. 맨 위 그래프는 각 샘플의 단량체 퍼센트를 보여주고, 중간 그래프는 각 샘플에서 총 집합체의 퍼센트를 보여주고 및 아래 그래프는 각 샘플에서 총 단편의 퍼센트를 보여준다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플에 해당한다(SE-HPLC 분석 전에 -80°C에 저장되었던 샘플). "TxW+y°C"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 y°C의 온도에서 x 주(들) 동안 저장되었다, 예를 들어, "T1W+5°C"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 +5°C에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, "T1W+25°C"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 +25°C에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, 및 등등. "1F/FT"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 한 번의 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycles)을 거쳤고; "10F/FT"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 10번의 동결-해동 사이클을 거쳤으며; 및 "낮은 pH(low pH)"로 표시된 샘플은 분석 전에 pH 3.7에서 2시간 동안 있게 하였다.
도 6은 모세관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis)(cGE)으로 평가된 클론들의 퍼센트 순도를 보여준다. 클론 샘플들은 또한 샘플 순도에 대한 스트레스의 영향을 평가하기 위하여 순도 결정 전에 다양한 스트레스에 있게 하였다. 맨 위 그래프는 비-환원 조건하에서 온전한 Fab의 퍼센트 순도를 보여주고 및 아래 그래프는 환원 조건하에서 총 Fab의 퍼센트 순도를 보여준다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플에 해당한다(cGE 분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플); "T4W+5°C"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 +5°C 에서 4주일 동안 저장되었음을 표시하고; "T4W+25°C"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 +25°C 에서 4주일 동안 저장되었음을 표시하고; "T4W+37°C"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 +37°C 에서 4주일 동안 저장되었음을 표시하고; "1F/FT"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 한 번의 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycles)을 거쳤고; 및 "10F/FT"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 10번의 동결-해동 사이클을 거쳤다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다.
도 7은 클론 g18C06, g20H09, g23H09, g24F02_N53A가 클론 g7B07_N53A에 비교할 만한 비율로 GAL10 결정을 용해함을 보여준다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다.
도 8은 클론 g18C06, g20H09 및 g23H09 가 GAL10 결정을 용해할 수 있음을 보여준다. 이 클론들은 다른 조건하에서 4주 동안 저장 후에 및 분무 후에도 GAL10 결정을 용해할 수 있었다. 수행된 어세이의 추가적 세부사항은 "실시예 1 내지 4에서 사용된 재료 및 프로토콜" 제목의 실시예 부분에서 찾을 수 있다(여기 서술된 어세이 1 참조). 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다.
도 9는 클론 g23H09 및 g24F02_N53A 이 다른 크기의 GAL10 결정을 용해함을 보여준다. 이 클론들은 5 °C 에서 4주 동안 저장 후에 및 분무 후에 GAL10 결정을 용해할 수 있었다("solo 0125"로 주석이 달린 샘플). 수행된 어세이의 추가적 세부 사항은 "실시예 1 내지 4에서 사용된 재료 및 프로토콜" 제목의 실시예 부분에서 찾을 수 있다(여기 서술된 어세이 2 참조).
도 10은 44개의 상품화된 치료 항체의 국제 DR 베타 1 위험 점수(global DR beta 1(DRB1) risk scores)는 물론 클론 g20H09, g23H09, g18C06 및 g24F02_N53A의 위험 점수를 보여준다. 인간 항체는 중간-회색 바로 보여주고, 인간화된 항체는 회색 바로 및 키메릭 항체는 어두운 회색 바로 보여준다.
도 11은 클론 g20H09, g23H09, g18C06 및 g24F02_N53A에 대한 IFNγ(왼쪽 그래프) 및 IL-5(오른쪽 그래프) 반응을 가진 공여자의 퍼센트를 보여준다. DFReq는 물론 분포-없는 재샘플링(distribution-free resampling(DFR2x) 알고리즘이 통계 분석에 사용되었다(Moodie et al. Cancer Immunol Immunother 59, 1489-1501(2010). KLH 샘플이 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 12는 클론 g20H09, g23H09, g18C06 및 g24F02_N53A의 공여자 검사 집단(n = 31)에서 IFNγ(왼쪽 패널) 및 IL-5(오른쪽 패널) 반응을 보여준다(DFR2x 알고리즘이 통계 분석을 위해 사용되었다(Moodie et al. Cancer Immunol Immunother 59, 1489-1501(2010)).
도 2는 회전하는 디스크 공초점 현미경(spinning disc confocal microscopy)으로 결정된 g7B07 및 g24F02_N53A(hFab)에 의한 재조합 샤르코 라이덴 결정(Charcot Leyden Crystals, CLCs)의 용해 비율을 보여주는 그래프이다. PBS만을 함유하는 샘플은 음성 대조군으로서 사용되었다. 도 2A는 재조합 CLC 용해 어세이의 도식적 묘사를 보여준다. 도 2B는 어세이 결과를 보여준다. 실험 시작점에서 CLC에 의해 커버 되는 초기 면적은 1로서 정의되었으며 및 CLC에 의해 점령되는 표면은 소프트웨어를 사용하여 결정되었다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플을 표시한다(분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플). "T2W"로 표시된 샘플은 분석 전에 37°C 온도에서 2시간 동안 저장되었다.
도 3은 나노드롭(Nanodrop)을 사용하여 280nm 파장에서 흡광도(A)를 측정하여 결정된 클론 g18C06, g20H09, g23H09, g24F02_N53A 및 g7B07의 단백질 농도를 보여준다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플에 해당한다(분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플). "TxW+y°C" 로 표시된 샘플은 분석 전에 y°C 의 온도에서 x 주 동안 저장되었다, 예를 들어, "T1W+5°C"로 표시된 샘플은 분석 전에 +5°C 에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, "T1W+25°C"로 표시된 샘플은 분석 전에 +25°C 에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, 및 등등. "1F/FT"로 표시된 샘플은 분석 전에 한 번의 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycles)을 거쳤고; "10F/FT"로 표시된 샘플은 분석 전에 10번의 동결-해동 사이클을 거쳤으며; 및 "낮은 pH(low pH)"로 표시된 샘플은 분석 전에 pH 3.7에서 2시간 동안 있게 하였다.
도 4는 표면 플라스몬 참조(surface plasmon reference, SPR)로 결정된 클론 g18C06, g20H09, g23H09, g24F02_N53A 및 g7B07의 퍼센트 상대적 활성(relative activity)을 보여준다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플에 해당한다(SPR 분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플). "TxW+y°C"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 y°C 의 온도에서 x 주(들) 동안 저장되었다, 예를 들어, "T1W+5°C"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 +5°C 에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, "T1W+25°C"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 +25°C 에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, 및 등등. "1F/FT"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 한 번의 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycles)을 거쳤고; "10F/FT"로 표시된 샘플은 SPR 분석 전에 10번의 동결-해동 사이클을 거쳤으며; 및 "낮은 pH(low pH)"로 표시된 샘플은 분석 전에 pH 3.7에서 2시간 동안 있게 하였다.
도 5는 SE-HPLC로 결정된 대로 클론 g18C06, g20H09, g23H09, g24F02_N53A 및 g7B07의 퍼센트 순도를 보여준다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다. 맨 위 그래프는 각 샘플의 단량체 퍼센트를 보여주고, 중간 그래프는 각 샘플에서 총 집합체의 퍼센트를 보여주고 및 아래 그래프는 각 샘플에서 총 단편의 퍼센트를 보여준다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플에 해당한다(SE-HPLC 분석 전에 -80°C에 저장되었던 샘플). "TxW+y°C"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 y°C의 온도에서 x 주(들) 동안 저장되었다, 예를 들어, "T1W+5°C"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 +5°C에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, "T1W+25°C"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 +25°C에서 1주일 동안 저장되었음을 표시하고, 및 등등. "1F/FT"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 한 번의 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycles)을 거쳤고; "10F/FT"로 표시된 샘플은 SE-HPLC 분석 전에 10번의 동결-해동 사이클을 거쳤으며; 및 "낮은 pH(low pH)"로 표시된 샘플은 분석 전에 pH 3.7에서 2시간 동안 있게 하였다.
도 6은 모세관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis)(cGE)으로 평가된 클론들의 퍼센트 순도를 보여준다. 클론 샘플들은 또한 샘플 순도에 대한 스트레스의 영향을 평가하기 위하여 순도 결정 전에 다양한 스트레스에 있게 하였다. 맨 위 그래프는 비-환원 조건하에서 온전한 Fab의 퍼센트 순도를 보여주고 및 아래 그래프는 환원 조건하에서 총 Fab의 퍼센트 순도를 보여준다. "T0"로 표시된 샘플은 각 클론의 참조 샘플에 해당한다(cGE 분석 전에 -80°C 에 저장되었던 샘플); "T4W+5°C"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 +5°C 에서 4주일 동안 저장되었음을 표시하고; "T4W+25°C"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 +25°C 에서 4주일 동안 저장되었음을 표시하고; "T4W+37°C"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 +37°C 에서 4주일 동안 저장되었음을 표시하고; "1F/FT"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 한 번의 동결-해동 사이클(freeze-thaw cycles)을 거쳤고; 및 "10F/FT"로 표시된 샘플은 cGE 분석 전에 10번의 동결-해동 사이클을 거쳤다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다.
도 7은 클론 g18C06, g20H09, g23H09, g24F02_N53A가 클론 g7B07_N53A에 비교할 만한 비율로 GAL10 결정을 용해함을 보여준다. 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다.
도 8은 클론 g18C06, g20H09 및 g23H09 가 GAL10 결정을 용해할 수 있음을 보여준다. 이 클론들은 다른 조건하에서 4주 동안 저장 후에 및 분무 후에도 GAL10 결정을 용해할 수 있었다. 수행된 어세이의 추가적 세부사항은 "실시예 1 내지 4에서 사용된 재료 및 프로토콜" 제목의 실시예 부분에서 찾을 수 있다(여기 서술된 어세이 1 참조). 의심을 피하기 위하여, 도에 있는 샘플 이름은 "g"라는 접두어를 함유하지 않지만, 검사된 클론들은 모두 생식세포계열 클론들이다.
도 9는 클론 g23H09 및 g24F02_N53A 이 다른 크기의 GAL10 결정을 용해함을 보여준다. 이 클론들은 5 °C 에서 4주 동안 저장 후에 및 분무 후에 GAL10 결정을 용해할 수 있었다("solo 0125"로 주석이 달린 샘플). 수행된 어세이의 추가적 세부 사항은 "실시예 1 내지 4에서 사용된 재료 및 프로토콜" 제목의 실시예 부분에서 찾을 수 있다(여기 서술된 어세이 2 참조).
도 10은 44개의 상품화된 치료 항체의 국제 DR 베타 1 위험 점수(global DR beta 1(DRB1) risk scores)는 물론 클론 g20H09, g23H09, g18C06 및 g24F02_N53A의 위험 점수를 보여준다. 인간 항체는 중간-회색 바로 보여주고, 인간화된 항체는 회색 바로 및 키메릭 항체는 어두운 회색 바로 보여준다.
도 11은 클론 g20H09, g23H09, g18C06 및 g24F02_N53A에 대한 IFNγ(왼쪽 그래프) 및 IL-5(오른쪽 그래프) 반응을 가진 공여자의 퍼센트를 보여준다. DFReq는 물론 분포-없는 재샘플링(distribution-free resampling(DFR2x) 알고리즘이 통계 분석에 사용되었다(Moodie et al. Cancer Immunol Immunother 59, 1489-1501(2010). KLH 샘플이 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 12는 클론 g20H09, g23H09, g18C06 및 g24F02_N53A의 공여자 검사 집단(n = 31)에서 IFNγ(왼쪽 패널) 및 IL-5(오른쪽 패널) 반응을 보여준다(DFR2x 알고리즘이 통계 분석을 위해 사용되었다(Moodie et al. Cancer Immunol Immunother 59, 1489-1501(2010)).
A.정의
달리 정의되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명의 기술적 분야에서 이 분야 기술의 전문가에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 가진다.
"항체(Antibody)" 또는 " 면역글로블린 ( Immunoglobulin )"-여기서 사용된 대로, "면역글로블린(Immunoglobulin)" 이란 용어는 해당하는 어떤 특이적인 면역반응성을 소유하든 또는 아니든, 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄의 조합을 가진 폴리펩티드를 포함한다. "항체(Antibodies)"는 관심 있는 항원(여기서는 갈랙틴- 10)에 대한 의미 있는 알려진 특이적인 면역반응 적인 활성을 가진 그러한 집합을 의미한다. "갈랙틴-10 항체(galectin-10 antibodies)" 라는 용어는, 인간 갈랙틴-10, 및 어떤 경우에는 이의 종 유사체(species homologues)를 포함하는, 갈랙틴-10 단백질에 대한 면역적인 특이성을 보여주는 항체를 의미하기 위해서 여기서 사용된다. 항체(Antibody) 및 면역글로블린(immunoglobulins)은 이들 사이에 체인 간의 공유 연결이 있이 또는 없이 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 척추동물 시스템에서 기본적인 면역글로빈 구조는 상대적으로 잘 이해되고 있다.
포괄적인 용어 "면역글로블린(immunoglobulin)"은 생화학적으로 구별될 수 있는 5개의 뚜렷한 부류(class) 의 항체를 포함한다. 모든 5개 부류의 항체는 본 발명의 범위 내에 있다. 다음의 논의는 일반적으로 면역글로블린 분자의 IgG 부류로 향할 것이다. IgG에 관하여, 면역글로블린은 대략 23,000 달톤(Daltons) 분자량의 두 개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 53,000-70,000 분자량의 두 개의 동일한 중쇄를 포함한다. 이 4개의 체인들은 'Y" 모양으로 이황화 결합(disulfide bonds) 에 의해 연결되어 있으며 여기서 경쇄는 "Y"의 입 부분에서 시작되는 중쇄를 괄호로 묶고 및 가변 부위를 통해 계속된다.
항체의 경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda)(κ,λ)로서 분류된다. 각 중쇄 부류는 경쇄의 카파(kappa) 또는 람다(lambda)와 결합할 수 있다. 일반적으로, 면역글로블린이 하이브리도마(hybridomas), B 세포 또는 유전적으로 제작된 숙주 세포에 의해 만들어질 때, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유적으로 결합되며, 및 두 개의 중쇄 꼬리 부분("tail" portions)은 공유 이황화 결합 또는 비-공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서는, 아미노산 서열은 Y 모양의 포크 된 끝의 N-말단으로부터 각 체인의 밑 부분의 C-말단으로 흐른다. 이 분야 기술의 전문가는 중쇄는, 이들 중 서브클래스(subclasses)가 있으면서(예를 들어, γ1- γ 4), 감마(gamma), 뮤(mu), 알파(alpha), 델타(delta), 또는 입실론(epsilon),(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되는 것을 인지할 것이다. 항체의 "클래스(class)"를 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로 결정하는 것이 이 체인의 성질이다. 면역클로블린의 서브클래스(subclasses)(아이소타입, isotypes), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 등은 잘 규명이 되었으며 및 기능적인 특성화가 주어지는 것으로 알려졌다. 이 클래스들 및 아이소타입의 각 수정된 형태는 즉석 공개의 관점에서 전문가에게는 쉽게 구별될 수 있으며, 및 따라서 즉석 발명의 범위 내에 있다.
상기 제시된 대로, 항체의 가변 부위는 항체가 선택적으로 항원의 에피톱을 인식하고 및 특이적으로 항체의 에피톱에 결합하게 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인이 조합하여 3차원 항원 결합 부위를 결정하는 가변 부위를 형성한다. 이 4차 항체 구조는 Y의 각 팔의 끝에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더 구체적으로, 항원 결합 부위는 각 VH 및 VL 체인에 세 개의 보완성 결정 부위(complementary determining regions, CDRs)로 정의된다.
" 갈랙틴 -10( Galectin -10)"-여기서 사용된 대로, "갈랙틴-10(galectin-10)"(Gal10 또는 Gal-10, 이는 여기서 서로 교환되게 사용된다)은 자동결정화되어 샤르코-라이덴 결정(Charcot-Leyden crystals)을 형성하는 작은, 소수성 글라이칸(glycan) 결합 단백질이다. 갈랙틴-10은 또한 샤르코-라이덴 결정 단백질(Charcot-Leyden crystal protein, CLCP), 에오지노필 라이소포스포리파제(eosinophil lysophospholipase) 및 라이소레시틴 아실하이드로레이즈(lysolecithin acylhydrolase) 라고도 언급된다. "갈랙틴-10(galectin-10)" 이란 용어는 인간 단백질 및 어느 종의 호모로그(homologues)도 커버 하기에 충분하게 넓다. 전장 인간 갈랙틴-10의 아미노산 서열은 서열번호 25(하기 참조)로 표시된다. 이 서열은 유니프로트 데이터베이스(UniProt database) 에 인간 갈랙틴-10으로서, 접근 번호 Q05315로, 저장된 서열에 해당한다. 또한 "갈랙틴-10 이란 용어 내에 포함되는 것은, 자연적으로 일어나는 인간 서열의 변이체, 예를 들어 28번 위치에 Als→Val 변이체, 이다.
서열번호 25
갈랙틴 -10 결정( Galectin -10 crystals)" 또는 " 샤르코 - 라이덴 결정(Charcot-Leyden crystals)"-갈랙틴-10 결정(Galectin-10 crystals)", "샤르코-라이덴 결정(Charcot-Leyden crystals)" 및 "CLCs"이란 용어는 여기서 갈랙틴-10으로 형성된 결정을 의미하는데 서로 바꿔서 사용된다. 갈랙틴-10에 의해 형성된 결정은 전형적으로 쌍뿔형 육각(bi-pyramidal hexagonal) 결정이며 및 대략 길이가 20 내지 40μm 이고 및 넓이는 2 내지 4μm 이다. 이 결정은 호산성 염증성 장애(eosinophilic inflammatory disorders)와 관련이 있다.
에피톱 ( Epitope )"-여기서 사용된 대로, "에피톱(Epitope)" 이란 용어는 길항제가 결합하는 갈랙틴-10 단백질의 한 부분을 의미한다. 길항제는 전형적으로 길항제의 보완적 결합 부위를(complementary binding site) 통해 이의 해당하는 갈랙틴-10 에피톱에 결합할 것이다. 길항제가 결합하는 에피톱은 전형적으로 전장 갈랙틴-10 단백질로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 것이다. 에피톱은 갈랙틴-10 단백질에서 연속적인 아미노산, 즉 선상 에피톱(linear epitope)을 포함하거나 또는 갈랙틴-10 단백질에서 비-연속적인 아미노산, 즉 구조적 에피톱(conformational epitope) 인 아미노산을 포함할 수 있다.
"결합 부위(Binding Site)" - 여기서 사용된 대로, 결합 부위(Binding Site)" 는 관심 있는 타겟 항원에(예를 들어, 갈랙틴-10) 선택적으로 결합하는데 책임 있는 폴리펩티드의 부분을 포함한다. 결합 도메인은 적어도 하나의 결합부위를 포함한다. 예시적인 결합 도메인에는 항체 가변 도메인이 포함된다. 본 발명의 항체 분자는 단일 결합 부위 또는 다수(예를 들어, 두 개, 세 개 또는 네 개) 결합 부위를 포함할 수 있다.
"유래한(Derived From)" -여기서 사용된 대로, 지정한 단백질(예를 들어, 낙타류 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 로부터 "유래한(derived from)" 이란 용어는 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 기원을 의미한다. 한 실시형태에서, 특정한 시작 폴리펩티드로부터 유래한 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 CDR 서열 또는 이것과 관련 있는 서열이다. 한 실시형태에서, 특정한 시작 폴리펩티드로부터 유래한 아미노산 서열은 연속적이지 않다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 여섯 CDRs은 시작 항체로부터 유래한다. 한 실시형태에서, 특정한 시작 폴리펩티드 또는 아미노산 서열로부터 유래한 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 이의 시작하는 서열, 또는 이의 한 부분과 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며 여기서 한 부분은 적어도 3 내지 5 아미노산, 적어도 5 내지 10 아미노산, 적어도 10 내지 20 아미노산, 적어도 20 내지 30 아미노산, 또는 적어도 30 내지 50 아미노산, 또는 달리 이 분야 기술 통상 전문가가 시작 서열에 그 서열이 기원함을 동정할 수 있는 아미노산 서열로 구성된다. 한 실시형태에서, 시작 항체로부터 유래한 하나 또는 그 이상의 CDR 서열은 변이체 CDR 서열을, 예를 들어, 친화 변이체를, 생산하기 위하여 변경되며, 여기서 변이체 CDR 서열은 타겟 결합 활성은 유지한다.
낙타류-유래( Camelid -Derived)" -특정 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 낙타류 전통적인 항체 또는 낙타류의 활성적인 면역화로 길러진 VHH 항체로부터 유래한 프레임워크(framework) 아미노산 서열 및/또는 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 그러나 낙타류-유래 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 항체는 인간 아미노산 서열(즉, 인간 항체) 또는 다른 비-낙타류 포유류 종으로부터 유래한 프레임 워크 및/또는 고정 부위(constant region) 서열을 포함하도록 제작될 수 있다. 예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류 프레임워크 부위, 중쇄 부위, 및/또는 힌지 부위(hinge portion)가 갈랙틴-10 항체에 포함될 수 있다. 한 실시형태에서, 하나 또는 그 이상의 비-낙타류 아미노산이 "낙타류-유래" 항체의 프레임워크 부위에 존재할 수 있다, 예를 들어, 낙타류 프레임워크 아미노산 서열은 해당하는 인간 또는 비-인간 영장류의 아미노산 잔기가 존재하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 더욱이, 낙타류-유래 VH 또는 VL 도메인, 또는 이의 인간화된 변이체는, 여기 다른 곳에서 서술된 대로, 인간 항체의 고정 부위(constant region)에 연결될 수 있어, 키메릭 분자(chimeric molecule)를 생산한다.
" VHH 항체" - 여기서 사용된 대로," VHH 항체(VHH antibody)" 또는 "중쇄만인 항체(Heavy-chain only antibodies)" 는 낙타(camels), 라마(llama), 알파카(alpaca)를 포함하는, 낙타류(Camelidae family) 종에 의해서만 생산되는 타입의 항체를 의미한다. "중쇄만인 항체(Heavy-chain only antibodies)" 또는 VHH 항체는 두 개의 중쇄를 포함하며 및 경쇄는 없다. 각 중쇄는 N-말단에 가변 도메인을 가지며, 및 이 가변 도메인들은 전통적인 헤테로테트라머 항체(heterotetrameric antibodies)의 중쇄의 가변 도메인, 즉, 상기 서술된 대로, VH 도메인과 구별하기 위하여, "VHH" 도메인으로서 언급된다.
보존적 아미노산 치환(Conservative amino acid substitution)"-"보존적 아미노산 치환(Conservative amino acid substitution)" 은 아미노산 잔기가 비슷한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 비슷한 측쇄를 지닌 아미노산 잔기 류(family)가 이 분야 기술에서 정의되었으며, 염기성 측 쇄(예를 들어, 리신(lysine), 아르기닌(Argentine), 히스티딘(histamine), 산성 측 쇄(예를 들어, 아스파르틱 에시드(aspartic acid), 글루타믹 에시드(glutamic acid)), 비 전하성 측쇄(uncharged polar side chains)(예를 들어, 글라이신(glycine), 아스파르긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 시스테인(cysteine)), 비극성 측쇄(nonpolar side chains)(예를 들어, 알라닌(alanine), 발린(valine), 루이신(leucine), 이소루이신(isoleucine), 프로린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine), 트립토판(tryptophan)), 베타-가지형 측쇄(beta-branched side chains)(예를 들어, 트레오닌(threonine), 발린(valine), 이소루이신(isoleucine)) 및 방향족 측쇄(aromatic side chains)(예를 들어, 타이로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 히스티딘(histidine))가 포함된다. 그러므로 면역글로불린 폴리펩티드에서 비 필수 아미노산 잔기는 같은 측쇄 류로부터 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 다른 실시형태에서, 한 줄의 아미노산들은 측쇄 류 멤버들의 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 비슷한 줄로 교체될 수 있다.
" 중쇄 부분(Heavy chain portion)" -여기서 사용된 대로, "중쇄 부분(heavy chain portion)"은 면역글로블린 중쇄의 고정 도메인으로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 적어도 다음 중 하나를 포함한다: CH1 도메인, 힌지(hinge)(예를 들어, 상부, 중부, 및/또는 하부 힌지 부위) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 변이체 또는 단편. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 면역글로블린 중쇄의 Fc 부분을 포함할 수 있다(예를 들어, 힌지 부분, CH2 도메인, 및 CH3 도메인). 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 적어도 고정 도메인의 한 부분(예를 들어, CH2 도메인 전부 또는 일부) 이 결여 될 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나, 및 바람직하게는 모두의 고정 도메인은 인간 면역글로블린 중쇄로부터 유래한다. 예를 들어, 한 바람직한 실시형태에서, 중쇄 부분은 전적으로 인간 힌지 도메인을 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 중쇄 부분은 전적으로 인간 Fc 부분(예를 들어, 인간 면역글로블린으로부터의 힌지, CH2 및 CH3 도메인 서열)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 중쇄 부분의 고정 도메인의 구성 성분은 다른 면역글로블린으로부터이다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유래한 CH2 도메인 및 IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유래한 힌지 부분을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 고정 도메인(constant domains) 은 다른 면역글로블린 분자의 부분을 포함하는 키메릭 도메인(chimeric domains)이다. 예를 들어, 힌지(hinge) 는 IgG1 분자로부터 첫 번째 부분 및 IgG3 또는 IgG4 분자로부터 두 번째 부분을 포함할 수 있다. 상기에 제시된 대로, 중쇄 부분의 고정 도메인은 자연적으로 일어나는(야생형) 면역글로블린 분자로부터 아미노산 서열이 다르도록 수정될 수 있다는 것이 이 분야 통상 전문가에 의해 이해될 것이다. 즉, 여기서 공개되는 본 발명의 폴리펩티드는 중쇄 고정 도메인(CH1, 힌지, CH2 또는 CH3) 및/또는 경쇄 고정 도메인(CL) 하나 또는 그 이상에 대하여 변경 또는 수정을 포함할 수 있다. 예시적인 수정에는 하나 또는 그 이상의 도메인에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 첨가(additions), 삭제(deletions) 또는 치환(substitutions)이 포함 된다.
" 키메릭 (chimeric)"- "키메릭(chimeric)" 단백질은 자연에서는 자연적으로 연결되어 있지 않은 두 번째 아미노산에 연결된 첫 번째 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드에서 합치게 되는 별도의 단백질에 정상적으로 존재할 수 있거나 또는 정상적으로는 같은 단백질에 존재하나 융합 폴리펩티드에서는 새로운 배열로 놓이게 될 수 있다. 키메릭 단백질은, 예를 들어, 화학적 합성으로, 또는 펩티드 부위가 바람직한 관계에서 암호화되는 폴리뉴클레오타이드를 만들고 및 번역하여 만들 수 있다. 본 발명의 예시적인 키메릭 항체에는 인간 항체, 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 고정 도메인에 융합된, 낙타류-유래 VH 및 VL 도메인, 또는 이의 인간화된 변이체를 포함하는 융합 단백질이 포함된다.
"가변 부위(Variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"-가변 부위(Variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)은 여기서 서로 바꾸어서 사용할 수 있으며 및 동등한 의미를 갖는 것으로 여긴다. "가변(variable)" 은 가변 도메인 VH 및 VL의 어떤 특정 부분이 항체들 사이에서 그 서열이 상당히 다르고 및 각 특정 항체의 그의 항원 타겟에 대한 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나 이 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 골고루 분포되는 것은 아니다. 이는 항원 결합 부위의 한 부분을 형성하는 각 VL 도메인 및 VH 도메인에 있는 "초 가변 루프(hypervariable loops)" 라고 불리는 세 부분에 몰려있다. VLambda 경쇄 도메인의 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 초 가변 루프는 여기서 L1(λ), L2(λ) 및 L3(λ)로 언급되며 및 VL 도메인에 잔기 24-33((L1(λ), 9, 10 또는 11 아미노산 서열로 구성)), 49-53(L2(λ), 3 잔기로 구성) 및 90-96((L3(λ), 5 잔기로 구성))를 포함하는 것으로서 정의될 수 있다(Morea et al., Methods 20:267-279(2000)). VKappa 경쇄 도메인의 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 초 가변 루프는 여기서 L1(κ), L2(κ) 및 L3(κ)로 언급되며 및 VL 도메인에 잔기 24-33(L1(κ), 6, 7, 8, 11, 12 또는 13 아미노산 서열로 구성), 49-53(L2(κ), 3 잔기로 구성) 및 90-97(L3(κ), 6 잔기로 구성)을 포함하는 것으로 정의될 수 있다(Morea et al., Methods 20:267-279(2000)). VH 도메인의 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 초 가변 루프는 여기서 H1, H2 및 H3로 언급되며 및 VH 도메인에 잔기 25-33(H1, 7, 8, 또는 9 잔기로 구성), 52-56(H2, 3 또는 4 잔기로 구성) 및 91-105(H3, 길이가 매우 다양하다)를 포함하는 것으로 정의될 수 있다(Morea et al., Methods 20:267-279(2000).
달리 제시되지 않는 한, L1, L2 및 L3란 용어는 각각 VL 도메인의 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 초 가변 루프를 의미하며, 및 Vkappa 및 Vlambda 동종체(isotype)둘 다로부터 얻은 초 가변 루프를 포함한다. H1, H2 및 H3란 용어는 각각 VH 도메인의 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 초 가변 루프를 의미하며, 및 γ, ε, δ, α 또는 μ를 포함하는 어느 알려진 중쇄 동종체(isotype)로부터 얻은 초 가변 루프를 포함한다.
초 가변 루프 L1, L2, L3, H1, H2 및 H3는 하기에 정의한 대로, 각각 "보완성 결정 부위(complementarity determining region)" 또는 "CDR"의 한 부분을 포함한다. "초 가변 루프(hypervariable loop)" 또는 "보완성 결정 부위(complementarity determining region)"란 용어는 엄밀하게 동의어는 아니다, 왜냐하면 초 가변 루프(hypervariable loops, HVs)는 구조에 근거하여 정의되고, 반면에 보완성 결정 부위(CDRs)는 서열 가변성에 근거하여 정의되기 때문이며(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983) 및 HVs 및 CDRs의 경계는 어떤 VH 및 VL 도메인에서 다를 수 있다.
VL 및 VH 도메인의 CDRs는 하기의 아미노산을 포함하는 것으로 전형적으로 정의할 수 있다: 경쇄 가변 도메인에서 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3) 잔기, 및 중쇄 가변 도메인에서 잔기 31-35 또는 31-35b(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3);(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)). 그러므로 HVs는 해당하는 CDRs 내에서 포함될 수 있고 및 여기서 VH 및 VL 도메인의 초 가변 루프에의 참조는 달리 제시하지 않는 한, 또한 해당하는 CDRs를, 및 그 반대를, 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
가변 도메인의 좀 더 높이 보존된 부분은 하기 서술된 대로, 프레임워크 부위(framework region, FRB), 이라고 불린다. 자연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각 네 개의 FRs(FR1, FR2, FR3 및 FR4, 각각)를 포함하며, 주로 β-시트 모양을 취하고 있으며, 세 개의 초 가변 루프로 연결된다. 각 체인의 초 가변 루프는 FRs에 의하여 인접하여 함께 붙어 있으며, 및 다른 체인으로부터의 초 가변 루프와 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는 데 기여한다. 항체의 구조적인 분석은 서열과 보완성 결정 부위에 의해서 형성되는 결합 부위의 모양 사이에 상호관계를 보여준다(Chothia et al., J. Mol. Bio. 227: 799-817(1992));Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215:175-182(1990)).
" CDR " -여기서 사용된 대로, "CDR" 또는 "보완성 결정부위(complementarity determining region)"는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 부위 내에서 발견되는 비-연속성 항원 결합부위를 의미한다. 이 특별한 부위들은 카벳 등(Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616(1977)) 및 카벳 등(Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest.(1991)), 및 코티아 등( Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)) 및 멕칼룸 등(MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745(1996))에 의해서 서술되었으며 여기에서의 정의에는 서로에 대해 비교될 때는 겹치거나 또는 서브세트 아미노산 잔기가 포함된다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 CDRs을 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해 제시된다. 바람직하게, "CDR"이란 용어는 서열 비교에 근거하여 카벳(Kabat)에 의해 정의된 대로의 CDR이다.
표 1:
CDR
정의
1잔기 수매김은 카벳 등(Kbatet al., supra)의 명명법에 따른다.
2잔기 수매김은 쵸티아(Chothia et al., supra)의 명명법에 따른다.
3잔기 수매김은 멕컬럼(MacCallum et al., supra)의 명명법에 따른다.
" 프레임워크 부위(Framework region)"-"프레임워크 부위(framework region)" 또는 "FR 부위(FR region)"는 여기서 사용된 대로, 가변 부위의 한 부분의 아미노산 잔기를 포함하나, 그러나 CDRs의 한 부분은 아니다(예를 들어, 카벳(Kabat) 정의의 CDRs을 사용). 그러므로, 프레임워크의 가변 부위는 길이로 약 100-120 아미노산 사이이나 단지 CDRs의 밖의 부분의 아미노산만을 포함한다. 중쇄 변이 도메인의 특별한 예 및 CDRs을 위하여 카벳(Kabat) 등에 의해 정의된 대로, 프레임워크 부위 1 은 아미노산 1-30을 포함하는 변이 부위의 도메인에 해당하며; 프레임워크 부위 2 는 아미노산 36-49를 포함하는 변이 부위의 도메인에 해당하며; 프레임워크 부위 3은 아미노산 66-94를 포함하는 변이 부위의 도메인에 해당하며, 및 프레임워크 부위 4는 아미노산 103에서부터 변이 부위 끝까지의 도메인에 해당한다. 경쇄의 프레임워크 부위는 비슷하게 각 경쇄 가변 부위 CDRs에 의해 분리된다. 비슷하게, 쵸티아 등(Chothia et al.) 또는 맥칼럼 등(McCallum et al.)에 의한 정의를 사용하여, 프레임워크 부위 경계가 상기 서술된 대로 각각의 CDR 말단에 의해 분리된다. 바람직한 실시 형태에서 CDRs는 카벳(Kabat)에 의해 정의된 대로이다.
자연적으로 일어나는 항체들에서, 각 단량체 항체(monomeric antibody)에 존재하는 6개 CDRs는 짧고, 비-연속적인 서열의 아미노산으로 항체가 수성 환경에서 3차원 모양을 가지는 것으로 가정되어 특별히 항원 결합 부위를 형성하도록 위치하여 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 나머지는 아미노산 서열에서 분자 간 변이성이 덜하며 및 프레임워크 부위라고 일컬어진다. 프레임워크 부위는 대개 β-시트(β-sheet) 구조를 수용하며 및 CDRs는 β-시트 구조를 연결하는, 및 어떤 경우에는 이의 한 부분을 형성하는, 루프를 형성한다. 그러므로 이 프레임워크 부위들은 체인-간, 비-공유적인 상호작용으로 이 6개 CDRs들이 올바른 방향으로 위치하도록 제공하는 스케폴드(scaffold)를 형성하도록 작용한다. 위치한 CDRs에 의하여 형성된 항원 결합 부위는 면역반응적인 항원의 에피톱에 대한 표면 보완성을 지정한다. 이 보완적인 표면은 항체가 면역반응적인 항원 에피톱에 비-공유적 결합하는 것을 촉진한다. CDRs의 위치는 이분야 기술 전문가에 의해 쉽게 동정 될 수 있다.
" 힌지 부위(Hinge region)" -여기서 사용된 대로, 힌지 부위(Hinge region) 라는 용어는 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결 시키는 중쇄 분자의 한 부분을 포함한다. 이 힌지 부위는 대략 25 잔기를 포함하며 및 유연하다, 그러므로 두 개의 N-말단 항원 결합 부위가 독립적으로 움직이도록 허락한다. 힌지 부위는 3개의 뚜렷한 도메인들로 다시 나누어질 수 있다: 상위, 중간, 및 하위 힌지 도메인(Roux K.H. et al. J. Immunol. 161:4083-90 1998). "전적으로 인간(fully human)" 힌지 부위를 포함하는 본 발명의 항체는 하기 표 2에 보여준 힌지 부위 서열 중 하나를 함유할 수 있다.
표 2: 인간 힌지 서열
"CH2 도메인(CH2 domain)"-여기서 사용된 대로, "CH2 도메인(CH2 domain)"은, 전통적인 수 매김 계획을 사용하여, 예를 들어, 항체의 약 잔기 244에서부터 잔기 360까지 확장되는 중쇄 분자의 한 부분을 포함한다(잔기 244에서 360, 카벳 수 매김 시스템; 및 잔기 231-340, EU 수 매김 시스템, Kabat EA et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH. 1991). CH2 도메인은 다른 도메인과 가깝게 쌍을 이루고 있지 않다는 면에서 유일하다. 오히려, 두 개의 N-연결된 가지형 카보하이드레이트 체인(branched carbohydrate chains) 이 온전한 자연 IgG 분자의 두 개의 CH2 도메인 사이에 삽입되어 있다. 또한, CH3 도메인이 CH2 도메인으로부터 IgG 분자의 C-말단까지 확장되어 있고 및 대략 108 잔기를 포함한다는 것이 잘 증명되어 있다.
"단편(Fragment)" - "단편(Fragment)" 이라는 용어는 본 발명의 항체의 맥락에서 사용된 대로, 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 체인보다 좀 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 체인의 한 부분 또는 몫을 의미한다. "항원 결합 단편(antigen binding fragment)" 이라는 용어는 항원에 결합하거나 또는 온전한 항체와 항원 결합에 대하여(즉, 갈랙틴-10 에 특이적 결합) 경쟁하는(즉, 이들의 유래된 온전한 항체와) 면역글로블린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 의미한다. 여기서 사용된 대로, 항체 분자의 "단편(fragment)"이란 용어는 항체의 항원 결합 단편, 예를 들어, 항체 경쇄 변이 도메인(antibody light chain variable domain)(VL), 항체 중쇄 변이 도메인(antibody heavy chain variable domain)(VH), 단일 체인 항체(single chain antibody, scFv), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일-팔(단일가) 항체(one-armed(monovalent) antibody), 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 또는 그러한 항원 결합 단편의 조합(combination), 집합(assembly) 또는 접합(conjugation)에 의해 형성되는 어느 항원 결합 분자를 포함한다. 항원 결합 단편(antigen binding fragment)" 이란 용어는 여기서 사용된 대로 더 나아가 유니바디(unibodies), 도메인 항체(domain antibodies) 및 나노바디(nanobodies)로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편을 포함하려는 의도가 있다. 단편은, 예를 들어, 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 체인의 화학적 또는 효소적 처리 또는 재조합 방법에 의하여 얻을 수 있다.
" Fab " -"Fab" 또는 "Fab 단편(Fab fragment)"은 중쇄 및 경쇄로 구성된 분자로서 여기서 경쇄는 VL 도메인과 하나의 고정 도메인(constant domain)(CL, Cκ, Cλ)으로 구성되고 및 중쇄는 VH 도메인 및 CH1 도메인만으로 구성된 분자를 의미한다. Fab 단편(Fab fragment)은 전형적으로 Y-모양 면역글로블린 분자의 단일-팔 이다. Fab 단편은 면역글로블린 분자로부터 효소 파파인(papain)의 작용으로 만들어질 수 있다. 파파인은 면역글로블린 분자의 힌지 부위를 쪼개서 두 개의 Fab 단편 및 별도의 Fc 부위를 생산한다.
" scFv " 또는 " scFv 단편( scFv fragment)"- "scFv" 또는 "scFv 단편(scFv fragment)" 은 단일 체인 가변 단편을 의미한다. scFv는 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인이 링커를 통해 연결된 융합 단백질이다.
" 결합가 (Valency)"- 여기서 사용된 대로 "결합가(Valency)" 라는 용어는 폴리펩티드에서 잠재적인 타겟 결합의 수를 의미한다. 각 타겟 결합 부위는 하나의 타겟 분자에 특이적으로 결합하거나 또는 타겟 분자의 특정한 부위에 결합한다. 폴리펩티드가 하나 이상의 타겟 결합 부위를 포함할 때, 각 타겟 결합 부위에 같은 또는 다른 분자에 특이적으로 결합할 수 있다.(예를 들어, 다른 리간드, 다른 항원, 또는 같은 항원의 다른 에피톱에 결합할 수 있다).
"특이성(Specificity)"- 특이성(Specificity)"이란 용어는 주어진 타겟, 예를 들어, 갈랙틴-10, 에 결합하는 능력을(예를 들어, 면역반응과) 의미한다. 폴리펩티드는 단일 특이성(monospecific) 일 수 있으며 및 하나의 타겟에 특이적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 결합 부위를 함유할 수 있거나 또는 폴리펩티드는 다수 특이성(multispecific) 일 수 있으며 및 같은 타겟 또는 다른 타겟에 특이적으로 결합하는 두 개 또는 그 이상의 결합부위를 함유할 수 있다.
"합성적(Synthetic)" -여기서 사용된 대로 "합성적(Synthetic)"이란 용어는 폴리펩티드에 관한 한 자연적으로는 존재하지 않은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 자연적으로 존재하는 폴리펩티드의 수정된 형태인(예를 들어, 첨가, 치환 또는 삭제와 같은 돌연변이를 포함하는) 자연적으로 존재하지 않은 폴리펩티드, 또는 선상의 아미노산 서열로 자연에서는 연결되지 않는 두 번째 아미노산 서열에 연결된 첫 번째 아미노산 서열(자연적으로 존재 또는 존재하지 않은)을 포함하는 폴리펩티드.
"제작된(Engineered)" - 여기서 사용된 대로, "제작된(Engineered)"이란 용어는 합성적인 방법으로 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 조작을 포함한다(예를 들어, 재조합 기술, 시험관 내 펩티드 합성, 효소적 또는 화학적인 펩티드 커플링 또는 이들 기술의 어떤 조합). 바람직하게는, 본 발명의 항체는 제작되며, 예를 들어, 인간화 및/또는 키메릭 항체, 및 항원 결합, 안정성/반감기, 면역성 또는 주효인자 기능과 같은, 하나 또는 그 이상의 성질을 개선하기 위하여 제작된 항체를 포함한다.
"수정된 항체(Modified antibody)"-여기서 사용된 대로, '수정된 항체(Modified antibody)" 라는 용어는 자연에 존재하지 않게 변경된 합성된 형태의 항체를 포함한다, 예를 들어, 적어도 두 개의 중쇄 부분을 포함하나 두 개의 완전한 중쇄가 아닌 항체(도메인 삭제된 또는 미니바디와 같은); 두 개 또는 그 이상 다른 항원 또는 단일 항원의 다른 에피톱에 결합하도록 변경된 다수 특이성 형태의 항체(예를 들어 두 개 특이적(bisect), 세 개 특이적(trispecific) 등); scFv 분자 및 이와 유사한 분자에 연결된 중쇄 분자. scFv 분자는 이 분야 기술에서 알려졌으며, 예를 들어, US 특허 5,892,019에 서술되어 있다. 추가로, "수정된 항체(modified antibody)" 라는 용어는 다수가 형태(multivalent forms)의 항체를 포함한다(예를 들어, 트리발란트(trivalent), 테트라발란트(tetravalent), 등, 세 개 또는 그 이상의 카피의 같은 항원에 결합하는 항체). 다른 실시형태에서, 본 발명의 수정된 항체는 적어도 CH2 도메인이 결여된 하나의 중쇄 부분을 포함하는 융합 단백질이며 및 하나의 수용체-리간드 쌍의 한 멤버의 폴리펩티드의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
"수정된 항체(Modified antibody)" 이란 용어는 또한 여기서 구조적으로 정의된 대로 본 발명의 항체의 아미노산 변이체를 의미하기 위하여 여기서 사용될 수 있다. 이 분야 기술 통상 전문가는 이가 유래 되는 항체와 비교하여 아미노산 서열이 다른 변이체 항체를 생산하기 위하여 항체가 수정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에 보존적인 치환 또 변경을 초래하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 치환이 만들어질 수 있다(예를 들어, CDR 및/또는 프레임워크 잔기에). 아미노산 치환은 하나 또는 그 이상의 아미노산을 자연에 존재하는 또는 비-자연적인 아미노산으로의 교체를 포함할 수 있다.
"인간화 치환( Humanising substitutions)"-여기서 사용된 대로, 인간화 치환(Humanising substitutions)" 이란 용어는 항체의 VH 또는 VL 도메인의 특정한 위치에 존재하는 아미노산 잔기가(예를 들어, 낙타류-유래된 갈랙틴-10 항체) 참조 인간 VH 또는 VL 도메인의 해당하는 위치에 일어나는 아미노산 잔기로 교체되는 아미노산 치환을 의미한다. 참조 인간 VH 또는 VL 도메인은 인간 생식라인에 의해 암호화되는 VH 또는 VL 도메인일 수 있다. 인간화 치환은 여기서 정의된 항체의 프레임워크 부위 및/또는 CDRs에 만들어 질 수 있다.
"인간화 변이체 ( Humanised variants)"--여기서 사용된 대로, "인간화 변이체(Humanised variants)"라는 용어는 참조 항체에 비교하여 하나 또는 그 이상의 "인간화 치환(humanising substitutions)"을 함유하는 변이된 항체를 의미하며, 여기서 참조 항체의 일부분은(예를 들어, VH 도메인 및/또는 VL 도메인 또는 적어도 하나의 CDR을 함유하는 이의 부분) 비-인간 종으로부터 유래한 아미노산을 가지고 있으며, 및 "인간화 치환"은 비-인간 종으로부터 유래한 아미노산 서열 내에서 일어난다.
"생식세포계열 변이체(Germlined variants)"-"생식세포계열 변이체(germlined variant)" 라는 용어는 특히 "인간화 변이체(humanised variants)"를 의미하며 여기서 "인간화 치환(humanising substitutions)"은 항체의(예를 들어 낙타류-유래 갈랙틴-10 항체) VH 또는 VL 도메인의 특정한 위치에 존재하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 인간 생식세포계열에 의해 암호화되는 참조 인간 VH 또는 VL 도메인에 있는 해당하는 위치의 아미노산 잔기로 교체되는 결과를 의미한다. 어느 주어진 "생식세포계열 변이체"에 있어서, 생식세포계열 변이체로 치환되는 교환 아미노산 잔기는 전적으로, 또는 우세하게, 단일 인간 생식세포-암호화된 VH 또는 VL 도메인으로부터 얻어진다. "인간화 변이체(humanised variant)" 및 "생식세포계열 변이체(germlined variant)"라는 용어는 여기서 가끔 서로 바꿔서 사용된다. 하나 또는 그 이상의 인간화 치환("humanising substitutions)을 낙타류-유래(예를 들어, 라마(llama) 유래) VH 또는 VL 도메인에의 도입은 낙타류(라마)-유래 VH 또는 VL 도메인의 "인간화 변이체(humanised variant)"의 생산의 결과에 이른다. 만약 치환되어 들어간 아미노산 잔기가 우세하게 또는 전적으로 단일 인간 생식세포-암호화된 VH 또는 VL 도메인 서열로부터라면, 그때는 결과는 낙타류(라마)-유래 VH 또는 VL 도메인의 "인간 생식세포계열 변이체(human germlined variant)" 일수 있다.
" % 동일성( % identity)"- 여기서 사용된 대로, 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열과 같은 두 서열 사이에 서열 유사성을 서술하는 것이다. 이는 최적의 방식으로 정렬된 두 서열을 비교하여 결정될 수 있으며 및 여기서 비교될 아미노산 서열은 이 두 서열 사이의 최적 정렬을 위한 참조 서열에 대비하여 첨가 또는 삭제를 포함할 수 있다. 동일성 %는 두 개의 서열 사이에 동일한 잔기에 대한 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 동일한 위치의 수를 비교 창에 있는 총 위치 수로 나누고 및 이 두 서열 사이의 퍼센트 동일성을 얻기 위하여 얻어진 결과를 100으로 곱하여 계산된다. 예를 들어, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html 사이트에서 얻을 수 있는 BLAST 프로그램, "BLAST 2 서열"(Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) 을 사용하는 것이 가능하며, 사용된 계수들(parameter) 은 디폴트로 주어진 것들이고(특히 "열린 갭 패널티(open gap penalty)" 계수: 5, 및 "연장 갭 패널티(extension gap penalty)" 계수: 2; 선택된 매트릭스는, 예를 들어, 프로그램에 의해 제안된 매트릭스 "BLOSUM 62"이다), 비교될 두 서열 사이에 퍼센트 동일성은 프로그램에 의해 직접적으로 계산된다.
"친화력 변이체 (Affinity variants)"-여기서 사용된 대로, "친화력 변이체(Affinity variants)" 란 용어는 참조 항체에 비교하여 아미노산 서열 하나 또는 그 이상의 변화를 보이는 변이된 항체를 의미하며, 여기서 친화력 변이체는 참조 항체에 비교하여 타겟 항원에 대한 변경된 친화력을 보인다. 예를 들어, 친화력 변이체는 참조 갈랙틴-10 항체에 비교하여, 갈랙틴-10에 대하여 변화된 친화력을 보일 것이다. 바람직하게는, 친화력 변이체는 참조 항체에 비교하여 타겟 항원에, 예를 들어, 갈랙틴-10에 대하여 개선된 친화력을 보일 것이다. 친화력 변이체는 전형적으로, 참조 항체에 비교하여, CDRs의 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 변화를 보인다. 그러한 치환은 CDRs의 주어진 위치에 존재하는 원래의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 교체하는 결과가 될 수 있으며, 이는 자연적으로 존재하는 아미노산 잔기 또는 비-자연적으로 존재하는 아미노산 잔기 일 수 있다. 아미노산 치환은 보존적이거나 또는 비-보존적일 수 있다.
"높은 인간 상동성 (High human homology)"- 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL) 을 포함하는 항체는 만약 이 VH 도메인 및 VL 도메인이, 함께, 가장 가깝게 일치되는 인간 생식계열 VH 및 VL 서열과 적어도 90% 아미노산 서열이 동일성을 보이면, 높은 인간 상동성을 가진 것으로 간주 된다. 높은 인간 상동성을 가진 항체는 인간 생식세포계열 서열에 충분히 높은 % 서열 동일성을 보이는 자연 비-인간 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함할 수 있으며, 예를 들어 낙타류 전통적인 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체는 물론, 그러한 항체의 제작된, 특별히 인간화 또는 생식세포 계열화된, 변이체 및 또한 "전적으로 인간(fully human)" 항체를 포함한다.
한 실시형태에서 인간과 높은 상동성을 가진 항체의 VH 도메인은 프레임워크 부위, FR1, FR2, FR3 및 FR4에 걸쳐서 하나 또는 그 이상의 인간 VH 도메인과 80% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성(sequence identity) 또는 서열 상동성(sequence homology)을 보일 수 있다. 다른 실시형태에서 본 발명의 폴리펩티드의 VH 도메인과 가장 가깝게 일치하는 인간 생식세포계열 VH 도메인 서열 사이에 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성은 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 97% 또는 그 이상, 또는 99%까지 또는 100%까지 일 수 있다.
한 실시형태에서 높은 인간 상동성을 가진 항체의 VH 도메인은 가장 가깝게 일치하는 인간 VH 서열에 비교하여, 프레임워크 부위, FR1, FR2, FR3 및 FR4에 걸쳐서 하나 또는 그 이상(예를 들어, 1 에서 10) 아미노산 서열 불일치(mis-match)를 함유할 수 있다.
다른 실시형태에서 높은 인간 상동성을 가진 항체의 VL 도메인은 프레임워크 부위, FR1, FR2, FR3 및 FR4에 걸쳐서 하나 또는 그 이상의 인간 VL 도메인과 80% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성(sequence identity) 또는 서열 상동성(sequence homology)을 보일 수 있다. 다른 실시형태에서 본 발명의 폴리펩티드의 VL 도메인과 가장 가깝게 일치하는 인간 생식세포계열 VL 도메인 서열 사이에 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성은 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 97% 또는 그 이상, 또는 99%까지 또는 100%까지 일수 있다.
한 실시형태에서 높은 인간 동일성을 가진 항체의 VL 도메인은 가장 가깝게 일치하는 인간 VL 서열에 비교하여, 프레임워크 부위, FR1, FR2, FR3 및 FR4에 걸쳐서 하나 또는 그 이상(예를 들어, 1 에서 10) 아미노산 서열 불일치(mis-match)를 함유할 수 있다.
B.
갈랙틴
-10에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편
상기 서술된 대로, 본 발명은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한다. "항체 antibody)" 란 용어는 여기서 가장 넓은 의미에서 사용되며 및, 이것에만 국한하지 않고, 갈랙틴-10 단백질에 대한 적절한 면역학적 특이성을 보이기만 하면, 단일 클론 항체(monoclonal antibodies)(전장 단일 클론 항체를 포함하는), 다클론 항체(polyclonal antibodies), 다수 특이적 항체(multispecific antibodies)(예를 들어, 이중 특이적 bispecific) 항체)를 포함한다. 여기서 서술된 갈랙틴-10 단백질에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편은 어느 갈랙틴-10 에피톱에 대한 면역학적 특이성을 보일 수 있다.
여기서 사용된 대로 "단일 클론 항체" 란 용어는 상당히 균질한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 의미한다, 즉 아주 적은 양으로 존재할 수 있는 자연적으로 일어나는 돌연변이를 제외하고는 집단에 포함되는 개별 항체는 동일하다. 단일클론 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원성 부위에 대한 것이다. 더욱이, 항원의 다른 결정인자(에피톱)에 대한 다른 항체를 전형적으로 포함하는 전통적인 항체 제제(다클론)와는 달리, 각 단일 클론 항체는 항원의 단일 결정인자(single determinant) 또는 에피톱에 대한 것이다. "항체 단편(Antibody fragments)" 또는 "항원 결합 단편(antigen binding fragments)" 은 전장 항체의 한 부분을, 일반적으로 항원 결합 또는 이의 가변 도메인을 포함한다. 항체 단편은 여기 다른 곳에서 서술되며 및 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 이중-특이 Fab's(bi-specific Fab's), 및 Fv 단편, 디아바디(diabodies), 선상 항체(linear antibodies), 단일-체인 항체 분자(single-chain antibody molecules), 단일 체인 가변 단편(single chain variable fragment, scFv) 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중-특이 항체(multispecific antibodies)가 포함된다(Holliger and Hudson, Nature Biotechnol. 23:1126-36(2005), 참조, 이 내용이 참고문헌으로 여기에 병합됨).
여기서 서술된 갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편은 인간에 치료적으로 사용하려는 의도가 있으며 및 그러므로 전형적으로 면역글로블린 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 유형, 자주는 IgG 유형일 것이며, 이 경우 이들은 4개의 서브클래스(sub-classes) IgG1, IgG2a 및 b, IgG3 또는 IgG4 중 어느 것에 속할 수 있다. 바람직한 실시형태에서는, 항체는 IgG 항체이다. 단일클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위를 향한 것이므로 단일클론 항체가 바람직하다. 어떤 특정 바람직한 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항원 결합 단편은 Fab 단편 또는 "Fabs"이다.
갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편은 여기 다른 곳에서 정의한 대로 높은 인간 상동성(high human homology)을 보인다. 높은 인간 상동성을 가진 그러한 항체 분자는 인간 생식세포계열 서열에 충분히 높은 퍼센트 서열 동일성을 보이는 자연 비-인간 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비-인간 항체의 인간화 또는 생식세포 계열화된 변이체이다.
특정 실시형태에서, 여기서 서술된 대로 갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편은 낙타류-유래일 수 있다. 낙타류-유래 항체는 중-쇄 만인 항체, 즉, VHH 항체 일수 있거나 또는 전통적인 헤테로테트라메릭 항체(heterotetrameric antibodies) 일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 갈랙틴-10 항체 및 항원 결합 단편은 낙타류 헤테로테트라메릭 항체로부터 유래한다. 더 나아간 바람직한 실시 형태에서, 갈랙틴-10 항체는 VHH 항체로부터 유래된다.
예를 들어, 여기서 서술된 대로 항체 및 항원 결합 단편은 낙타류를 관심 있는 타겟으로, 즉, 갈랙틴-10으로, 면역화시키는 단계를 포함하는 방법으로 얻은 면역 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 낙타류는 타겟 단백질 또는 이의 폴리펩티드 단편, 또는 단백질 또는 이의 폴리펩티드 단편을 발현하는 mRNA 분자 또는 cDNA 분자로 면역화시킬 수 있다. 낙타류 종에서 항체를 생산하는 방법 및 낙타류 면역 라이브러리로부터 바람직한 타겟에 대한 항체를 선택하는 방법은, 예를 들어, 참고문헌으로 여기에 병합된 국제 특허 출원 번호(International patent application no.) WO2010/001251, 에 서술되어 있다.
특정 실시형태에서, 항체 및 항원 결합 단편은 이들이 낙타과에 있는 한 종의 VH 도메인 또는 VL 도메인으로부터 얻은 적어도 하나의 초 가변 루프(HV loop) 또는 보완성 결정 부위(complementarity determining region)를 포함한다는 점에서 낙타류-유래일 수 있다. 특히, 항체 및 항원 결합 단편은 낙타류의 아웃브레드(outbred), 예를 들어, 라마(llamas)를 갈랙틴-10으로 활성적으로 면역화시켜 얻은, VH 및/또는 VL 도메인, 또는 이의 CDRs를 포함할 수 있다.
이 문맥에서 "로부터 얻은(obtained from)" 이란 용어는, 항체의 HVs 또는 CDRs가 낙타과 면역글로블린 유전자에 의해 원래 암호화되는 아미노산 서열(또는 이의 약간의 변이)을 포함한다는 의미에서, 구조적인 상관관계를 내포한다. 그러나 이는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는데 사용된 생산 과정인 면에서 특별한 관계를 반드시 암시하는 것은 아니다.
낙타류-유래 항체 및 이의 항원 결합 단편은 어느 낙타류 종으로부터, 그중에서도(inter alia ), 라마(llama), 단봉낙타(dromedary), 알파카(alpaca), 비쿠나(vicuna), 구아나코(guanaco) 또는 낙타(camel)로부터 유래될 수 있다.
낙타류-유래 VH 및 VL 도메인, 또는 이의 CDRs을 포함하는 항체 분자들은, 전형적으로 재조합적으로 발현된 폴리펩티드이며, 및 키메릭 폴리펩티드일 수 있다. "키메릭 폴리펩티드(chimeric polypeptide)" 라는 용어는 그렇지 않으면 연속적으로 존재하지 않은 두 개 또는 그 이상의 펩티드 단편을 바로 옆에 위치하도록 창조한 인공적인(비-자연적으로 존재하는) 폴리펩티드를 의미한다. 이 정의 내에 포함되는 것은 둘 또는 그 이상의 종, 예를 들어, 낙타류 및 인간에 의해 암호화되는 펩티드 단편을 병렬로 놓아(juxtaposition) 창조한 "종(species)" 키메릭 폴리펩티드이다.
특정 실시형태에서, 전체 VH 도메인 및/또는 전체 VL 도메인은 낙타과 내 종으로부터 얻어질 수 있다. 낙타-유래 VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 그 후 단백질 제작(protein engineering)을 하게 할 수 있으며, 여기서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 삭제가 낙타류 아미노산 서열에 도입된다.
이러한 제작된 변경은 바람직하게는 낙타류 서열에 대비한 아미노산 치환을 포함한다. 그러한 변화에는 "인간화(humanisation)" 또는 "생식세포계열화(germlining)"를 포함하며 여기서 낙타류-암호화된 VH 또는 VL 도메인에 있는 아미노산 잔기 하나 또는 그 이상은 상응하는 인간-암호화된 VH 또는 VL 도메인으로부터의 해당 잔기로 교체된다.
갈랙틴-10으로 낙타류(예를 들어, 라마)를 활성적으로 면역화시켜 얻은 분리된 낙타류 VH 및 VL 도메인은 본 발명에 따라 갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편을 제작하는 근거로 사용될 수 있다. 온전한 낙타류 VH 및 VL 도메인(intact camelid VH and VL domains)으로부터 시작하여, 시작 낙타류 서열과는 다른 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 삭제를 제작하는 것이 가능하다. 특정 실시형태에서, 그러한 치환, 삽입 또는 삭제는 VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 프레임워크 부위에 존재할 수 있다.
다른 실시형태에서, 여기서 낙타류-유래한 VH 및 VL 도메인(또는 이의 제작된 변이체) 및 비-낙타류 항체로부터의 하나 또는 그 이상의 고정 도메인(constant domain), 예를 들어, 인간-암호화하는 고정 도메인(또는 이의 제작된 변이체)을 포함하는, "키메릭(chimeric)" 항체 분자가 제공된다. 그러한 실시형태에서, VH 도메인 및 VL 도메인 둘 다가 낙타류의 같은 종으로부터 얻어지는 것, 예를 들어, VH 및 VL 도메인 둘 다 라마 글라마(Lama glama) 로부터 얻어지거나 또는 VH 및 VL 도메인 둘 다 라마 파코스(Lama pacos) 로부터 얻어지는 것이(제작된 아미노산 서열 변이의 도입 전에) , 바람직하다. 그러한 실시형태에서, VH 및 VL 도메인 둘 다는 단일 동물, 특히 관심 있는 항원으로 활성적으로 면역화된 단일 동물, 로부터 유래될 수 있다.
낙타과 VH 및 VL 도메인의 일차 아미노산 서열에 변화를 제작하는 다른 방법으로서, 개별 낙타류-유래한 초 가변 루프(hypervariable loops) 또는 CDRs, 또는 이의 조합이 낙타류 VH/VL 도메인으로부터 분리될 수 있고 및 다른 프레임워크로,(즉, 비-낙타과), 예를 들어, 인간 VH/VL 프레임워크로, CDR 이식(CDR grafting) 에 의해 옮겨질 수 있다.
비-제한적인 실시예에서, 여기서 서술된 항체들은 CH1 도메인 및/또는 CL 도메인을(각각 중쇄 및 경쇄로부터) 포함할 수 있으며, 이의 아미노산 서열은 전적으로 또는 상당히 인간이다. 인간 치료에 사용하려는 항체 분자를 위해, 항체의 전체 고정 부위는, 또는 적어도 이의 한 부분은 전적으로 또는 상당히 인간의 아미노산 서열을 가지는 것이 전형적이다. 그러므로 CH1 도메인, 힌지 부위, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CL 도메인(및 CH4 도메인 만약 존재하면)의 하나 또는 그 이상의 또는 어느 조합은 이의 아미노산 서열에서 전적으로 또는 상당히 인간일 수 있다. CH1 도메인, 힌지 부위, CH2 도메인, CH3 도메인 및/또는 CL 도메인(및/또는 CH4 도메인 만약 존재하면)은 인간 항체로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 IgG 항체, 더 바람직하게는 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 IgG1 항체로부터 유래할 수 있다.
유리하게도, CH1 도메인, 힌지 부위, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CL 도메인(및 CH4 도메인 만약 존재하면)은 모두 전적으로 또는 상당히 인간 아미노산 서열을 가질 수 있다. 인간화된 또는 키메릭 항체 또는 항체 단편의 고정 부위 맥락에서, "상당히 인간(substantially human)" 이라는 용어는 아미노산 서열 동일성이 인간 고정 부위(human constant region) 와 적어도 90%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 99% 임을 의미한다. 이 맥락에서, "인간 아미노산 서열(human amino acid sequence)" 이란 용어는 인간 면역글로블린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 의미하며, 이는 생식세포계열, 재배열된 및 체세포적으로 돌연 변이된 유전자를 포함한다. 본 발명은 또한 "전적으로 인간(fully human)" 힌지 부위의 존재가 명백히 필요한 그러한 실시형태를 제외하고는, 인간 서열에 관한 한 하나 또는 그 이상의 아미노산의 첨가, 삭제 또는 치환에 의해 변경된 "인간" 서열의 고정 도메인을 포함하는 폴리펩티드도 고려한다.
갈랙틴-10에 결합하는 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 고정 부위 내, 특히 Fc 부위 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 삭제를 가질 수 있다. 아미노산 치환은 자연적으로 존재하는 다른 아미노산, 또는 비-자연적인 또는 수정된 아미노산으로 치환된 아미노산의 교체 결과가 될 수 있다. 다른 구조적인 수정도, 예를 들어 당화 패턴(glycosylation pattern)의 변화와 같은 것도(예를 들어, N- 또는 O-연결된 당화 부위(glycosylation sites)의 첨가 또는 삭제), 또한 허락된다.
항체는 신생아 수용체(neonatal receptor) FcRn에 결합 친화력을 증가시키기 위하여 Fc 부위 내에 수정될 수 있다. 증가 된 결합친화력은 산성 pH에서(예를 들어, 약 대략 pH 5.5로부터 대략 pH 6.0까지) 측정 가능하다. 증가 된 결합친화력은 또한 중성 pH(예를 들어, 약 대략 pH 6.9로부터 대략 pH 7.4까지)에서도 측정 가능하다. "증가 된 결합 친화력(increased binding affinity)"은 수정 되지 않은 Fc 부위에 대비하여 FcRn에 증가된 결합 친화력을 의미한다. 전형적으로 수정되지 않은 Fc 부위는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 야생형 아미노산 서열을 소유할 것이다. 그러한 실시형태에서, 수정된 Fc 부위를 가진 항체 분자의 증가된 FcRn 결합 친화력은 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 FcRn에 대한 결합 친화력에 대비하여 측정될 것이다.
특정 실시형태에서, Fc 부위 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 FcRn에 결합을 증가시키기 위하여 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. FcRn 결합을 증가시키고 및 이로써 항체 약동학을 개선 시키는 몇 가지 Fc 치환이 보고되었다. 그러한 치환은, 예를 들어, Zalevsky et al.(2010) Nat. Biotechnol . 28(2):157-9; Hinton et al.(2006) J Immunol . 176:346-356; Yeung et al.(2009) J Immunol . 182:7663-7671; Presta LG.(2008) Curr . Op. Immunol . 20:460-470; 및 Vaccaro et al.(2005) Nat. Biotechnol . 23(10):1283-88, 에 보고되었으며, 이들의 내용이 전문으로 여기에 병합되었다.
특정 실시형태에서, 항체는 아미노산 치환 H433K 및 N434F를 포함하거나 또는 이로 구성된 수정된 인간 IgG Fc 도메인을 포함하며, 여기서 Fc 도메인 수 매김(numbering)은 EU 수 매김(EU numbering)에 따른다(Edelman, G.M. et al., Proc . Natl. Acad . USA, 63, 78-85(1969) and Kabat, E.A.; National Institutes of Health(U.S.) Office of the Director. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed.; DIANE Publishing: Collingdale, PA, USA,(1991)). 더 나아간 실시형태에서, 여기서 서술된 항체는 아미노산 치환 M252Y, S254T, T256E, H433K 및 N434F를 포함하거나 또는 이로 구성된 수정된 인간 IgG Fc 도메인을 포함하며, 여기서 Fc 도메인 수 매김(numbering)은 EU 수 매김(EU numbering)에 따른다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 갈랙틴-10(즉, 항-갈랙틴-10 항체) 에 결합하는 항체를 제공하고 여기서 이 항체는 ABDEGTM 기술을 병합하는 적어도 하나의 변이체 Fc 도메인을 포함한다. ABDEGTM 항체 및 ABDEGTM 기술을 병합하는 FcRn 길항제가 자가면역 질환(autoimmune diseases)과 같은 항체-매개한 질환을 치료하기 위하여 서술되었다(WO2006/130834 및 WO2015/100299 참조, 여기 참고문헌으로 병합).
변이체 Fc 도메인 또는 FcRn 결합 단편에 병합될 수 있는 추가의 Fc 도메인 변경은 제한 없이, 그 내용이 여기 참고 문헌으로 병합된, Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15:637-40; Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol ., 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol . Immunol ., 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci USA, 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett ., 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J., 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett ., 54:101-104; Lund et al, 1996, J. Immunol ., 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol. 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J. Immunol., 164:4178-4184; Reddy et al, 2000, J. Immunol ., 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol ., 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J. Immunol ., 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol . Chem ., 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett ., 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans., 30:487-490); 미국 특허 번호 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; 미국특허 공고 번호(U.S. Patent Publication Nos) 2004/0002587 및PCT 공고(PCT Publications) WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351, 에 공개된 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 여기서 서술되는 항체는 해당하는 야생형 IgG 서열에 대비하여 2개까지로, 3개까지로, 4개까지로, 5개까지로, 6개까지로, 7개까지, 8개까지로, 9개까지로, 10개까지로, 12개까지로, 15개까지로, 또는 20개까지로의 치환으로 구성된 수정된 인간 IgG Fc 도메인을 포함한다.
여기서 서술된 갈랙틴-10 항체는 pH-의존적인 항원 결합, 즉 pH-의존적인 갈랙틴-10 결합을 보일 수 있다.
항원이 결합된 항체들이 세포로 흡수되고 및 엔도좀-라이소좀-분해 경로(endosomal-lysosomal degradation pathway)로 이동된다. 조기 엔도좀(early endosome) 내에서 항원으로부터 분리될 수 있는 항체들은 세포 표면으로 다시 리사이클 될 수 있다. 엔도좀 분획에서 이들의 항원과 높은 친화력으로 결합한 항체들은 전형적으로 라이소좀(lysosomes)으로 이동되어 분해된다. 만약 항체가, 혈장 pH와 비교하여 조기 엔도좀에서 pH 에서 이의 항원에 대해 더 낮은 결합력을 가지고 있는 것과 같은, pH-의존적인 항원 결합 활성을 가지면, 항체는 세포 표면으로 좀 더 효율적으로 리사이클 될 것이라는 것이 이전에 알려졌다. 이는 항체의 혈장 반감기를 연장할 수 있고 및 같은 항체가 다수의 항원에 결합하도록 한다. 이러한 이유로, 여기서 서술된 항-갈랙틴-10 항체가 pH-의존적인 항원 결합을 보이는 것은 유리하다. 본 발명에 따른 pH-의존적인 항-갈랙틴-10 항체는 이 단백질에 결합하여 갈랙틴-10을 제거하는 잠재력을 가졌다. 갈랙틴-10은 그 후 산성 엔도좀 분획에서 방출될 수 있고 및 라이소좀으로 이동되어 분해된다. 본 발명의 유리 항-갈랙틴-10 항체들은 그 후 세포 표면으로 리사이클 되어 추가의 갈랙틴-10에 결합하고 및 내부화될 수 있게 한다.
본 발명의 항-갈랙틴-10 항체들은 내부 유래 pH-의존적 항원 결합 활성을 소유할 수 있다, 즉 이들은 이 성질을 위해 선택되었을 수도 있다. 다른 한편으로 또는 추가로, 여기서 서술된 항-갈랙틴-10 항체들은 pH-의존적인 타겟 결합을 보여주도록 제작될 수 있다. 항체 분자에서 pH-의존적 항원 결합 활성을 제작하는 방법들이, 예를 들어, 여기 참고 문헌으로 병합된 EP2275443, 에 서술된다. 항체 분자에서 pH-의존적 항원 결합을 제작하는 방법들이, 예를 들어, 여기 참고 문헌으로 병합된, WO2018/206748, 에 또한 서술된다. 여기서 서술된 항체들은 어느 기술로도 수정되어 pH-의존적인 결합을 달성할 수 있다. 예를 들어, 항체들은 pH-의존적인 항원 결합을 보이도록 EP2275443 또는 WO2018/206748에 서술된 방법에 따라 수정될 수 있다.
여기서 서술된 항-갈랙틴-10 항체의 pH-의존적인 실시형태를 위하여, 항원-결합 활성은 혈장 pH에서의 항원-결합 활성에 비교하여 엔도좀 pH에서 더 낮다. 엔도좀 pH는 전형적으로 산성 pH 이고 반면에 혈장 pH는 전형적으로 중성 pH 이다. 따라서, 여기서 서술된 항체들은, 이들의 항원-결합 활성이 중성 pH에서의 항원-결합 활성에 비교하여 산성 pH에서 더 낮도록 pH-의존적 항체 결합을 보일 수 있다. 엔도좀 pH 또는 "산성 pH"는 약 pH 4.0 에서 약 pH 6.5 사이일 수 있다, 바람직하게는 약 pH 5.5에서 약 pH 6.5 사이, 바람직하게는 약 pH 5.5에서 약 pH 6.0 사이, 바람직하게는 pH 5.5, pH 5.6 또는 pH 5.8이다. 혈장 pH 또는 "중성 pH"는 약 pH 6.9 에서 약 pH 8.0 사이일 수 있다, 바람직하게는 약 pH 7.0에서 약 pH 8.0 사이, 바람직하게는 약 pH 7.0에서 약 pH 7.4 사이, 바람직하게는 pH 7.0 또는 7.4이다.
특정 실시형태에서, 항-갈랙틴-10 항체는 pH 7.4에서의 항원-결합 활성과 비교할 때 pH 5.8에서의 항원-결합 활성이 더 낮은 pH-의존적인 항원-결합 활성을 보인다. pH-의존적인 항-갈랙틴-10 항체는 산성 pH 또는 pH 5.8에서의 항체-항원 상호작용에 대한 해리 항수(dissociation constant, KD)가 중성 pH 또는 p H7.4에서의 항체-항원 상호작용에 대한 해리 항수보다 더 높다는 점에서 특성 지어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 항-갈랙틴-10 항체는 pH 5.8에서의 항원의 KD 및 pH 7.4에서의 KD의 비율(KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)) 이 2 또는 그 이상, 4 또는 그 이상, 6 또는 그 이상, 8 또는 그 이상, 10 또는 그 이상, 12 또는 그 이상인 것과 같은 pH-의존적인 결합을 보인다.
항체 분자의 pH-의존적인 항원-결합 활성은 산성 pH에서 항원-결합 활성 및/또는 중성 pH에서의 항원-결합 활성이 손상되도록 항체 분자를 수정하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 항체 분자의 적어도 하나의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나, 또는 적어도 하나의 히스티딘을 항체 분자에 삽입하여 수정시킬 수 있다. 그러한 히스티딘 돌연변이(치환 또는 삽입) 부위는 특별히 제한되지는 않으며, 및 돌연변이 또는 삽입 이전과 비교하였을 때 엔도좀 pH에서의 항원-결합 활성(예를 들어 pH 5.8) 이 혈장 pH(예를 들어 pH 7.4) 에서의 항원-결합 활성보다 더 낮은 한 어느 부위도 수용할 만하다.
특정 실시형태에서, 항-갈랙틴-10 항체는 가변 도메인에 하나 또는 그 이상의 치환을 도입하여 pH-의존적 항원 결합을 보이도록 제작될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 항-갈랙틴-10 항체는 항체의 하나 또는 그 이상의 CDRs에 하나 또는 그 이상의 치환을 도입하여 pH-의존적 항원 결합을 보이도록 제작된다. 치환은 pH-의존적 항원 결합이 되도록 하기 위하여 가변 도메인, 바람직하게는 중쇄 및/또는 경쇄 CDRs의 하나 또는 그 이상 부위에 하나 또는 그 이상의 His 잔기를 도입할 수 있다.
항체가 세 개의 중쇄 CDR 서열 및 세 개의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 본 발명의 실시형태를 위하여, 조합된 여섯 개의 CDRs은 총 1-10 His 치환, 선택적으로 1-5 His 치환, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 His 치환으로 구성될 수 있다. 항-갈랙틴-10 항체는, 여기에 참고문헌으로 병합된, WO2018/206748 에서 서술된 방법에 따라 제작될 수 있다. 비-히스티딘 치환은 여기서 서술된 pH-의존적 항체의 가변 도메인, 특히 CDR에 또한 병합될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 여기서 인용된 특정한 CDR, VH 및/또는 VL 도메인 서열을 가진 예시적인 항-갈랙틴-10 항체는 이들의 pH-의존적 항원 결합을 보이도록 제작된다. 예를 들어, 여기서 서술된 예시적인 항-갈랙틴-10 항체의 CDR 서열은 pH-의존적 항체 결합을 보이는 항체를 생산하도록 하나 또는 그 이상의 히스티딘 치환을 도입하여 수정될 수 있다.
여기서 서술된 항체는 또한, 화학요법치료제(chemotherapeutic agent), 톡신(toxin)(즉, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원, 또는 이의 단편의 효소적으로 활성화된 톡신), 또는 방사성 활성 동위원소(radioactive isotope)(즉, 방사성 접합(radioconjugate), 와 같은 세포독성 제제에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체(immunoconjugates)를 형성하도록 수정될 수 있다. Fc 부위는 또한, 여기 참고문헌으로 병합된 찬 및 카터(Chan and Carter(2010) Nature Reviews: Immunology 10:301-316)에 의해 서술된 대로, 반감기 확장을 위해 제작(engineered) 될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, Fc 부위는 하나 또는 그 이상의 아미노산 수정으로 항체가 항체 의존성 세포의 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity)(ADCC)을 매개하는 능력을 향상하고 및/또는 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화력을 증가하도록 수정된다.
특정한 실시형태에서, Fc 부위는 주효인자 기능(effector function)이 없도록 제작될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 감소한 주효인자 기능을 가진 자연적으로 존재하는 IgG 동종체(isotype), 예를 들어, IgG4, 로부터 유래한 Fc 부위를 가질 수 있다. IgG4로부터 유래한 Fc 부위는 더 나아가, 예를 들어, 생체 내에서 IgG4 분자 사이에 팔(arm)의 교환을 최소화하는 수정을 도입시켜, 치료적 유용성이 증가하도록 수정될 수 있다. IgG4로부터 유래한 Fc 부위는 S228P 치환을 포함하도록 수정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체 분자는 당화(glycosylation)에 관한 한 수정될 수 있다. 예를 들어, 당화 되지 않은 항체(aglycoslated antibody)가 만들어질 수 있다(즉, 당화가 결여된 항체). 당화는, 예를 들어, 타겟 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시키기 위하여 변경될 수 있다. 그러한 탄수화물 수정은; 예를 들어, 항체 서열 내에 당화 부위 하나 또는 그 이상을 변경하여 달성시킬 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 가변 부위 프레임워크 당화 부위를 제거하여 이로써 그 부위에서 당화를 제거하는 결과가 되는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 그러한 탈당화(aglycosylation)는 항체의 항원에 대한 친화력을 증가시킬 수 있다.
또한, 예견하는 것은, 감소한 양의 후코실 잔기(fucosyl residues)를 가진 저후코실화된 항체(hypofucosylated antibody) 또는 전적으로 또는 부분적으로 탈-후코실화된 항체(de-fucosylated antibody)(Natsume et al., Drug Design Development and Therapy, Vol.3, pp7-16, 2009에서 서술된 대로) 또는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 갖는 것과 같은, 변경된 유형의 당화를 가진 갈랙틴-10 결합하는 변이체 항체이다. 그러한 변경된 당화 패턴은 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 나타났으며, "자연의(native)" 인간 Fc 도메인을 포함하는 해당 항체에 비교하여 전형적으로 ADCC를 10배 강화한다. 그러한 탄수화물 수정은, 예를 들어, 숙주 세포에서 변경된 당화 효소 기구로(야만-오누크 및 사토(Yamane-Ohnuki and Satoh, mAbs 1:3, 230-236, 2009) 에서 서술한 대로)) 항체를 발현시켜 달성시킬 수 있다. 강화된 ADCC 기능을 가진 비-후코실화 된 항체의 예들은 바이오와 회사의(BioWa Inc) 포텔리젠트 기술(PotelligentTM technology)을 사용하여 생산된 그런 것이다.
C.
갈랙틴
-10에 결합하는 예시적 항체
본 발명은 갈랙틴-10에 결합하는 예시적인 항체 및 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은, 하기 서술된 대로, 이들의 구조적 특징에 관하여 독점적으로 정의 될 수 있다.
[클론
g24F02
_
N53A
]
여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편으로, 여기서 항체 및 이의 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 2를 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR3의 CDR 서열; 서열번호 3을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR2; 서열번호 1을 포함하거나 이로 구성된 HCDR1의 CDR 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 8을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR3의 CDR 서열; 서열번호 9를 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR2; 서열번호 7을 포함하거나 이로 구성된 LCDR1의 CDR 서열을 포함한다.
또한 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL)도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4와 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4와 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4와 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된다.
[클론
g24F02
]
추가로 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 2를 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR3; 서열번호 5를 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR2; 서열번호 1을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR1의 CDR 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 8을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR3; 서열번호 9를 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR2; 서열번호 7을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR1의 CDR 서열을 포함한다.
또한 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 6과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 6과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 6과 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 6과 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 6과 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된다.
[클론
g23H09
]
추가로 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 2를 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR3; 서열번호 13을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR2; 서열번호 11을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR1의 CDR 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 8을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR3; 서열번호 9를 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR2; 서열번호 7을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR1의 CDR 서열을 포함한다.
또한 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 14와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 14와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 14와 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 14와 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 14와 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된다.
[클론
g18C06
]
추가로 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 16을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR3; 서열번호 17을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR2; 서열번호 15를 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR1의 CDR 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 20을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR3; 서열번호 21을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR2; 서열번호 19를 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR1의 CDR 서열을 포함한다.
또한 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 18과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 18과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 18과 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 18과 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 18과 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 22와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 22와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 22와 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 22와 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 22와 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호18의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i) VH 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성되고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 22의 아미노산 서열로 구성된다.
[클론
g20H09
]
추가로 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 12를 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR3; 서열번호 23을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR2; 서열번호 11을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR1의 CDR 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 8을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR3; 서열번호 9를 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR2; 서열번호 7을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR1의 CDR 서열을 포함한다.
또한 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24와 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24와 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24와 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii) VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 갈랙틴-10에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10과 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호24의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하고 여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성되고; 및
(ii)VL 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된다.
항체 또는 항원 결합 단편의 도메인이 참조 서열에 대한 특정한 퍼센트 서열 동일성에 의해 정의된 실시형태에서는, VH 및/또는 VL 도메인은 참조 서열에 존재하는 CDR 서열과 동일한 CDR을 유지할 수 있어 변이는 단지 프레임워크(framwork) 부위 내에만 존재한다. 다른 한편의 실시형태에서, CDR 서열은 참조 서열에 비교하여 아미노산 치환(예를 들어, 보존적인 치환, 인간화 치환 또는 친화력 변이체)을 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 이는 여기서 예시된 갈랙틴-10 항체와 똑같은 에피톱에 결합한다.
특정 실시형태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 가진 것으로 정의되거나 또는 상기 인용된 특정한 VH/VL 도메인 아미노산 서열에 특정한 퍼센트 동일성을 가진 것으로 정의된 예시적인 항체 및 이의 항체 결합 단편은 CDR, VH, 및/또는 VL 서열들이 유래한 항체 및 이의 항체 결합 단편의 인간화되고(humanized), 생식세포 계열화되고(germlined) 또는 친화력 있는 변이체(affinity variants) 이다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 인용된 CDR 서열을 가진 예시적인 항체 분자는 높은 인간 상동성을 가진다, 예를 들어, CDR 서열들이 유래한 항체 및 이의 항체 결합 단편의 인간화된(humanized), 생식세포 계열화된(germlined) 또는 친화력 변이체(affinity variants) 이다.
인간 치료에 사용할 의도가 있는 항체 분자는, 항체의 전체 고정 부위(constant region), 또는 적어도 이의 일부분이, 전적으로 또는 상당히 인간 아미노산 서열을 가지는 것이 전형적이다. 그러므로, 한 실시형태에서, Fc 부위는 아미노산 서열에 관한 한 전적으로 또는 상당히 인간(human) 일 수 있다. 인간화된 또는 키메릭 항체, 또는 항체 단편의 고정 부위(constant region)의 문맥상, "상당히 인간(substantially human)"이란 용어는 아미노산 서열 동일성이 인간 고정 부위와 적어도 90%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 99%를 의미한다. "인간 아미노산 서열(human amino acid sequence)" 이란 용어는 이 문맥상 인간 면역글로블린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 의미하며, 이는 생식세포계열, 재배열된 및 체세포적으로 돌연변이 된 유전자들을 포함한다. 본 발명은 또한 "전적으로 인간(fully human)" 힌지 부위의 존재를 전적으로 필요로 하는 그런 실시형태를 제외하고는, 인간 서열에 관하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열이 첨가, 삭제, 또는 치환에 의하여 변경된 "인간(human)" 서열의 고정 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 고려한다. 여기서 서술된 예시적인 Fc 부위 수정 어느 것도 상기 인용된 CDR 및/또는 VH/VL 도메인 서열을 가진 항체에 병합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 인용된 CDR 및/또는 VH/VL 도메인 서열을 가진 항체는 아미노산 치환 H433K 및 N434F를 포함하거나 또는 이로 구성된 수정된 인간 IgG Fc 도메인을 포함하며, 여기서 Fc 도메인 수 매김(numbering)은 EU 수 매김에 따른다. 특정 실시형태에서, 상기 인용된 CDR 및/또는 VH/VL 도메인 서열을 가진 항체는 아미노산 치환 M252Y, S254T, T256E, H433K 및 N434F를 포함하거나 또는 이로 구성된 수정된 인간 IgG Fc 도메인을 포함한다.
D.
갈랙틴
-10에 결합하는 항체를 암호화하는
폴리뉴클레오타이드
본 발명은 또한 본 발명의 갈랙틴-10 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 예를 들어, 여기서 서술된 갈랙틴-10 항체의 VH, 및/또는 VL 도메인, 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자와 함께, 전장(full-length) 갈랙틴-10 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 또한, 제공되는 것은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열이 작동적으로 조절 서열에 연결되어 이 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템(cell-free expression system)에서 항체 또는 이의 단편을 발현하게 하는 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터이다.
본 발명의 갈랙틴-10 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자는, 예를 들어, 재조합 DNA 분자를 포함한다. "핵산(nucleic acid)", " 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)" 또는 "폴리뉴클레오타이드 분자(polynucleotide molecule)" 란 용어는 여기서 사용된 대로, 서로 교환되게 사용되며 및 어느 DNA 또는 RNA 분자, 단일- 또는 이중-가닥 및 만약 단일-가닥이면, 이의 보완적 서열 의미한다. 핵산 분자의 논의에서, 특정한 핵산 분자의 서열 또는 구조는 정상 전통적 서열 제공에 따라 5'에서 3'의 방향으로 여기서 서술된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 "분리(isolated)" 된다. 이 용어는, 핵산 분자에 적용될 때는, 이것이 기원하는 대상체의 자연적으로 존재하는 유전체에 바로 인접한 서열로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 예를 들어, "분리된 핵산(isolated nucleic acid)"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나, 또는 원핵 또는 진핵 세포 또는 비-인간 숙주 대상체의 유전체 DNA로 통합되는 것과 같은, DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용될 때는, "분리된 핵산(isolated nucleic acid)"은 상기 정의된 대로 분리된 DNA 분자에 의해 암호화되는 RNA 분자를 주로 의미한다. 다른 한편으로, 이 용어는 이것이 자연 상태(즉, 세포 또는 조직) 에서 연관되어 있을 수 있는 다른 핵산으로부터 정제/분리된 것을 의미할 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)는 더 나아가 생물학적 또는 합성적 수단에 의해 직접적으로 생산되고 및 이의 생산 과정에서 존재하는 다른 성분으로부터 분리된 분자를 대표할 수 있다.
본 발명에 따른 갈랙틴-10 항체의 재조합적 생산을 위하여, 이를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 체인 또는 도메인을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 제조될 수 있고(표준 분자생물학 기술을 사용하여) 및 선택한 숙주 세포, 또는 무-세포 발현 시스템(cell-free expression system)에서 발현을 위한 복제 가능한 벡터에 삽입시킬 수 있다, 적절한 숙주 세포는, 원핵세포, 효모, 또는 고등 진핵세포, 특히 포유류 세포일 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예시에는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)로 형질 전환된 원숭이 신장 CV1(monkey kidney CV1 line); 인간 배아 신장 세포주(human embryonic kidney line)(293 또는 현탁 배양(suspension culture)에서 성장을 위해 서브 클론 된 293 세포, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59(1977)); 새끼 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney cells)(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(Chinese hamster ovary cells/-DHFR)(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980)); 생쥐 세르톨리 세포(mouse sertoli cells)(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980)); 생쥐 골수종 세포(mouse myeloma cells) SP2/0-AG14(ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) 또는 NS0((HPA(세포주 수집 번호) culture collections no. 85110503)); 원숭이 신장 세포(monkey kidney cells)(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(African green monkey kidney cells)(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 종양 세포(human cervical carcinoma cells)(HELA, ATCC CCL 2); 고양이 신장 세포(canine kidney cells)(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포(buffalo rat liver cells)(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(human lung cells)(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포(human liver cells)(Hep G2, HB8065); 생쥐 유방 종양(mouse mammary tumor)(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주(human hepatoma line)(Hep G2)는 물론 DSM's PERC-6 세포주이다. 이들 각 숙주 세포에서 사용에 적합한 발현 벡터들은 또한 이 분야 기술에서 일반적으로 알려졌다.
"숙주 세포(host cell)"는 일반적으로 배양된 세포 주를 의미한다는 것이 주지되어야 한다. 본 발명에 따른 항원 결합 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터가 도입되는 전 인간(whole human beings) 자체는 "숙주 세포" 정의에서 명백하게 제외된다.
E. 항체 생산
추가의 관점에서, 본 발명은 또한 항체의 발현이 허락되는 조건하에서 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 발현 벡터)를 함유하는 숙주 세포(또는 무-세포 발현 시스템)를 배양하고, 및 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 이 재조합 발현 과정은, 본 발명에 따른 갈랙틴-10 항체를 포함하는, 인간 치료적 사용을 의도한 단일 클론 항체를 포함하는 항체의 대규모 스케일 생산을 위하여 사용될 수 있다. 적절한 벡터, 세포 주 및 생체 내 치료적 사용에 적합한 재조합 항체의 대규모 스케일 제조를 위한 생산 과정은 일반적으로 이 분야 기술에서 가능하며 및 전문가에게는 잘 알려질 것이다.
F. 약제학적 조성물
본 발명은, 하나 또는 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 조합을 함유하고, 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 제형화된, 약제학적 조성물을 포함한다. 그러한 조성물은 하나 또는 갈랙틴-10 항체의 조합(예를 들어, 두 개 또는 세 개의 다른)을 포함할 수 있다. 인간 치료적 용도를 위한 단일 클론 항체의 제형화 기술은 이 분야 기술에서 잘 알려졌으며 및, 예를 들어, 그 전문이 여기에 병합된, 왕 등(Wang et al.), Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.96, pp1-26, 2007)의, 내용에서, 리뷰 되어 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나 또는 다른 치료들과, 동시에 또는 순차적으로, 조합으로 투여될 수 있다.
조성물을 제형화하는데 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 부형제에는, 이것에만 제한되지는 않으나: 이온 교환기(ion exchangers), 알루미나(alumina), 알루미늄 스테아레이트(aluminum stearate), 레시틴(lecithin), 인간 혈청 알부민(human serum albumin)과 같은 혈청 단백질(serum proteins), 인산염(phosphates)과 같은 버퍼 물질, 글라이신(glycine), 소르빅 에시드(sorbic acid), 포타슘 소르베이트(potassium sorbate), 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물(partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), 물(water), 염(salts) 또는 프로타민 설페이트(protamine sulfate)와 같은 전해액(electrolytes), 디소듐 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate), 포타슘 하이드로겐 포스페이트(potassium hydrogen phosphate), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 아연 염(zinc salts), 콜로이드 성 실리카(colloidal silica), 마그네슘 트리실리케이트(magnesium trisilicate), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 셀루로즈-근거한 물질(cellulose-based substances)(예를 들어, 소듐 카복시메틸셀루로즈(sodium carboxymethylcellulose), 폴리에틸렌 글리세롤(polyethylene glycol), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 왁스(waxes), 폴리에틸렌- 폴리옥시프로필렌- 블럭 폴리머(polyethylene-polyoxypropylene-block polymers), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 및 울 지방(wool fat)이 포함된다.
특정 실시형태에서, 조성물은 이것에만 국한하지 않으나 근육 내(intramuscular), 정맥 내(intravenous), 피부 내(intradermal), 복강 내(intr aperitoneal) 주사, 피하(subcutaneous), 경막 외(epidural), 코(nasal), 경구(oral), 직장(rectal), 국부(topical), 흡입(inhalational), 구강(buccal)((예를 들어, 설하(sublingual)), 및 경피(transdermal) 투여를 포함하는 어느 적절한 경로의 투여를 통해 대상체에게 투여하기 위하여 제형화 된다.
바람직한 실시 형태에서, 투여 경로는 흡입이다. 적절하게, 본 발명의 조성물은 흡입을 위하여 분말로서 제형화되거나 또는 흡입을 위하여 에어로졸화된 액체(aerosolised liquid)로서 제형화 될 수 있다. 적절하게, 본 발명에 따른 조성물은 건조 분말로서 제형화 될 수 있다. 다른 한편으로, 본 발명에 따른 조성물은 분무된 액체 에어로졸(nebulized liquid aerosol) 또는 액체 스프레이(liquid spray).로서 제형화 될 수 있다.
조성물의 흡입 투여의 방법 및 장치는 이 분야 기술에서 잘 알려졌다. 조성물의 흡입 투여는, 예를 들어, 분무기(nebulizer)를 통하여 달성될 수 있다. 분무기는 약물을 폐로 흡입되는 분무로서 투여하기 위하여 사용되는 약물 전달 장치이다. 다른 한편으로, 흡입기(inhaler) 가 본 발명의 조성물을 투여하기 위하여 사용될 수 있다. 흡입기는 흡입을 통하여 폐로 약물을 전달하는 약물 전달 장치이다. 예를 들어, 측량된-용량의 흡입기(metered-dose inhalers, MDIs), 건조 분말 흡입기(dry powder inhalers, DPIs) 및 연질 분무 흡입기(soft mist inhalers, SMIs)를 포함하는, 몇 가지 유형의 흡입기가 이 분야 기술에서 잘 알려져 있다.
G. 치료 방법
여기서 서술된 갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편은, 치료 방법에 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편을 의약품으로서 용도로서 제공한다. 다른 한편으로는, 여기서 제공되는 것은 갈랙틴-10에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편을 치료의 방법의 용도이다. 의약품으로서의 용도를 위한 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 전형적으로 약제학적 조성물로서 제형화 된다.
중요하게, 항체 및 항원 결합 단편과 관련된 상기 서술된 모든 실시형태는, 여기서 서술된 방법에 똑같이 적용할 만하다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 여기 다른 곳에서 서술된 대로 항체 또는 항원 결합 단편의 치료적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 그러한 치료 방법에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전형적으로 약제학적 조성물로서 제형화 된다. 여기서 사용된 대로, "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"이라는 용어는 치료적 효과를 생산하는데 충분한, 갈랙틴-10 항체의 양 또는 용량, 즉, 예를 들어, 질환 또는 병태과 연관된 증상을 근절하거나 또는 적어도 완화시키는데 요구되는 길항제의 양 또는 용량을 의미하려는 의도이다. 적절한 양 또는 용량은 의사에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 치료될 대상체의 크기 또는 무게, 치료될 대상체의 나이, 치료될 대상체의 일반적인 신체적 병태, 치료될 병태, 및 투여 경로와 같은 인자들에 근거하여 조정될 수 있다.
임상적 사용을 위하여, 특정 실시형태에서, 여기 다른 곳에서 서술된 대로 갈랙틴-10 항체 또는 항원 결합 단편은 대상체에게 약 0.1 mg/kg체중 에서 약 20mg/kg체중의 하나 또는 그 이상의 용량으로서 투여된다. 특정 실시형태에서, 여기 다른 곳에서 서술된 대로 항체 및 이의 항원 결합 단편은 대상체에게 약 0.1 mg/kg체중에서 약 10mg/kg체중의 용량에서 투여된다. 특정 실시형태에서, 여기 다른 곳에서 서술된 대로 항체 및 이의 항원 결합 단편은 대상체에게 약 0.5 mg/kg체중에서 약 10mg/kg체중의 용량에서 투여된다. 특정 실시형태에서, 여기 다른 곳에서 서술된 대로 항체 및 이의 항원 결합 단편은 대상체에게 약 1mg/kg체중에서 약 10mg/kg체중의 용량에서 투여된다.
갈랙틴-10 에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편은, 이들이 갈랙틴-10 결정화를 방해할 수 있다는 이유에서, 치료 방법에 유용하다. 여기 다른 곳에서 설명한 대로, 본 발명의 항체들은 갈랙틴-10의 에피톱에 결합하고 이로써 갈랙틴-10의 결정화(crystallization of galectin-10)를 방해한다. 특정 실시형태에서, 항체 및 항원 결합 단편은 갈랙틴-10의 결정화를 억제한다. 특정 실시형태에서, 항체 및 항원 결합 단편은 결정 갈랙틴-10(crystalline galectin-10) 의 용해를 촉진한다.
갈랙틴-10 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 갈랙틴-10의 결정 또는 CLCs의 존재 또는 형성과 연관된 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 여기서 제공되는 것은 여기서 서술된 갈랙틴-10 항체 및 이의 항원 결합 단편의 유효한 양을, 이를 필요로하는 환자 또는 대상체에게 투여하여 갈랙틴-10의 결정 또는 CLCs의 존재 또는 형성과 연관된 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하는 방법이다.
여기서 사용된 대로, 질환 또는 병태를 "예방(preventing)" 하는 방법은 질환의 발병을 예방, 증상의 악화를 예방, 질환 또는 병태의 진전을 예방하는 것 또는 대상체가 질환 또는 병태를 전개하는 위험인자를 감소시키는 것을 의미한다. 여기서 사용된 대로, 질환 또는 병태를 "치료(treating)" 하는 방법이란 질환 또는 병태를 치료하는 것 및/또는 질환 또는 병태와 연관된 증상을 경감 또는 근절하여 환자의 고통이 감소하는 것을 의미한다.
갈랙틴-10 결정의 존재가 특징인 질환 또는 병태를 가진 환자를 위하여, 치료 방법은, 전형적으로, 환자의 조직에 위치하여 있는 갈랙틴-10 결정을 녹일 수 있는, 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 관여될 것이다. 갈랙틴-10 결정의 형성이 특징인 질환 또는 병태를 전개할 "위험성이 있는(at risk)" 것으로 동정 된 환자를 위하여, 예방하는 방법에는 갈랙틴-10 결정화를 억제할 수 있는, 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여가 관여될 수 있다.
갈랙틴-10 결정 또는 CLCs은 일련의 질환 또는 병태의 범위에 있는 환자에서 관찰되었다. 여기서 서술된 갈랙틴-10 길항제는: 천식(asthma); 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis); 소아지방변증(celiac disease); 기생충감염(helminth infection); 위장관 호산구 염증(gastrointestinal eosinophilic inflammation); 낭포성 섬유종(cystic fibrosis, CF); 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA); 척-스트라우스 맥관염(Churg-Straus vasculitis); 만성 호산구 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 및 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다는 것이다. 바람직한 실시형태에서, 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 천식(asthma); 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis); 소아지방변증(celiac disease); 기생충감염(helminth infection); 위장관 호산구 염증(gastrointestinal eosinophilic inflammation); 낭포성 섬유종(cystic fibrosis, CF); 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA); 척-스트라우스 맥관염(Churg-Straus vasculitis); 만성 호산구 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 및 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 주목된 대로, 갈랙틴-10 결정 또는 CLCs는 호산구 염증(eosinophilic inflammation)으로 특징지어지는 질환 또는 병태와 특히 연관되어 있다. 바람직한 실시형태에서 그러므로, 여기서 서술된 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 호산구 염증과 연관된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용된다.
특히 바람직한 실시 형태에서, 여기서 서술된 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 천식(asthma)을 예방 또는 치료하는데 사용된다. 천식 환자의 기도(airway) 및 폐의 분석에서 CLCs의 존재를 보여주었다(Persson EK, Verstraete K, Heyndrickx I, et al. Protein crystallization promotes type 2 immunity and is reversible by antibody treatment. Science. 2019;364(6442)). 그러므로, 본 발명의 항체들은 갈랙틴-10의 에피톱에 결합하고 및 그로써 갈랙틴-10의 결정화를 방해한다. 이는 결국 천식 환자의 기도 및 폐에서 CLC 형성을 예방한다.
임상적으로, 천식은 가역적인 기도 폐색(airway obstruction) 및 과민성 반응으로 짧은 호흡 및 쌕쌕거림(wheezing) 을 초래하는 특징이 있다. 흡입된 스테로이드 및 기관지 확장제로 자주 치료 가능할지라도, 환자의 일부 그룹은 심각한 치료-저항적인 질환을 가지고 있어 자주 병원 입원을 필요로 하며, 이는 치명적인 공격(fatal attack) 을 초래할 수 있다(Braido F. Failure in asthma control: reasons and consequences. Scientifica(Cairo) 2013;2013:549252). 병리학적으로, 이 질환은 기도 호산구 증가(airway eosinophilia) 및 작은 기도의 비가역적인 폐색을 초래하는 두꺼워진 점액질의 과다의 생산으로 특징지어진다(Zhang L, He L, Gong J, Liu C. Risk Factors Associated with Irreversible Airway Obstruction in Asthma: A Systematic Review and Meta-Analysis. Biomed Res Int. 2016;2016:9868704). 대부분의 경우에 이 질환은 유형 2 면역 세포(type 2 immune cells)(CD4 Th2 림프구(lymphocytes) 및 유형 2 선천적인 림프계 세포(type 2 innate lymphoid cells(ILC2)) 면역 반응에 의해 유래되며, IL-4(배상 세포 변질(goblet cell metaplasia) 및 IgE 합성을 자극하는), IL-5(조직 호산구(tissue eosinophilia) 촉진), 및 IL-13(기관지 과활성(bronchial hyperreactivity) 및 배상세포 변질)의 생산을 초래한다(Lambrecht BN, Hammad H. The immunology of asthma. Nat Immunol. 2015;16(1):45-56).
특정 실시형태에서, 천식은 알레르기성 천식(allergic asthma)으로서 특징지어진다. 알레르기성 천식은 유럽에서 8-12%의 인구가 영향을 받는 전도성 기도(conducting airways)의 만성적인 염증성 질환이다(Selroos O, Kupczyk M, Kuna P, et al. National and regional asthma programmes in Europe. Eur Respir Rev. 2015;24(137):474-483).
다른 특정한 바람직한 실시 형태에서, 여기서 서술된 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 낭포성 섬유종(cystic fibrosis, CF)을 예방 또는 치료하기 위하여 사용된다.
본 발명은 또한 환자로부터 얻은 샘플에서 갈랙틴-10을 검출하기 위한 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 갈랙틴-10 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 환자로부터 얻은 샘플에서 갈랙틴-10을 검출하는데 사용된다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전형적으로 결정 갈랙틴-10을 검출하는데 사용된다. 상기 주목된 대로, 갈랙틴-10 결정 또는 CLC 결정은 여러 다른 질환 및 병태를 가진 환자에서 관찰되었다. 환자의 샘플은 다음의 질환 또는 병태 중 어느 하나를 가졌거나 또는 가진 것으로 의심되는 대상체로부터 분리될 수 있다는 것이다: 천식(asthma); 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis); 소아지방변증(celiac disease); 기생충감염(helminth infection); 위장관 호산구 염증(gastrointestinal eosinophilic inflammation); 낭포성 섬유종(cystic fibrosis, CF); 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA); 척-스트라우스 맥관염 Churg-Straus vasculitis); 만성 호산구 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 또는 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML). 환자 샘플에서 결정 갈랙틴-10의 검출은 샘플이 얻어진 대상체에서 질환 또는 병태를 진단하는데 사용될 수 있다. 샘플은 어떤 적절한 환자 샘플일 수 있다, 예를 들어, 질병 상태에서 CLCs가 관찰된 어느 체액 또는 조직. 특정 실시형태에서, 샘플은 폴립(polyp), 예를 들어, 코의 폴립(nasal polyp), 으로부터 얻은 조직 샘플이다. 특정 실시형태에서, 샘플은 점액(mucus) 샘플이다. 그러한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 점액 샘플에서 결정 갈랙틴-10의 검출은 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis)을 검출 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 환자의 샘플은 객담(sputum) 샘플이다. 그러한 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 객담 샘플에서 결정 갈랙틴-10의 검출은 천식(asthma) 을 검출 또는 진단하는데 사용될 수 있다.
H.
키트
여기서 서술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 어느 것도 키트(kit)로서 포장될 수 있으며 및 선택적으로 사용 설명서가 포함된다.
실시예
본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예를 참조하여 더 나아가 이해될 것이다.
배경 및 목적
클론 7B07은 WO 2019/197675에 서술되었다. 이 클론은 갈랙틴-10(Galectin-10)(GAL10)crystal)으로도 또한 언급되는 재조합 샤르코-라이덴 결정(Charcot-Leyden crystals, CLCs) 에 결합하고 용해하는 것이 관찰되었다. 보완성 결정 부위(complementarity determining region, CDR) 이식을 통한 생식계열화 과정은 이 클론의 결합 및 효능에 영향을 주지 않는다. 그러나, 안정성 연구에서 중쇄의 CDR2 에 있는 탈아미드화 부위(deamidation site)(N53G54)를 동정했으며, 이는 25°C 및 37°C의 배양 온도에서 결합 및 효능에서 감소의 원인이 되었다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 중쇄 CDR2에 있는 N53 및 G54에 돌연변이로 생식계열화된 7B07(g7B07) 클론의 변이체가 제조되었다. 재조합 CLC를 용해하는 이들 g7B07 돌연변이체의 효능은 보존되는 반면, 모든 돌연변이는 결합 특성을 떨어뜨리는 결과가 된다.
따라서, 클론 7B07에 비교하여 좀 더 바람직한 성질을 가진 추가의 항-갈랙틴-10(항-Gal10) 화합물을 동정하기 위하여 세 번의 발견 캠페인(discovery campaigns)이 시작되었다.
실시예 1.
Gal10에
결합하는 재조합 항체의 선택
1.1
7B07
에피톱
캠페인
파지 디스플레이(phage display)를 통한
Gal10에
7B07
에피톱에
결합하는 클론의 선택
인간 Gal10에 적절한 결합 능력을 가진 scFv 클론을 선택하기 위하여, 파지 패닝(phage panning) 방법이 사용되었다. 클론 7B07와 같이 Gal10의 비슷한 부위에 결합하는 클론을 선택하기 위하여 경쟁 셋-업(competition set-up)이 사용되었다.
이 셋-업에서, Gal10-His를 포획하기 위하여 타이로신 69(Tyrosine 69) 잔기를 타겟하는, 항-인간 특이 클론 1D11 이 맥시솝 플레이트(Maxisorp plate)에 코팅되었다. 1D11으로 Gal10을 포획하는 것은 7B07 에피톱에 결합하는 클론을 선택하는데 두 가지 장점이 있다. 첫 번째 장점은 1D11이 Gal10에서 7B07에 반대편 부위에 결합하기 때문에, 7B07 에피톱이 Gal10에 대한 scFv를 발현하는 파지에 접근이 가능하기 때문이다. 두 번째 장점은 타이로신 69(클론 1D11)에 결합하는 클론으로 Gal10-His를 포획함으로써 이 에피톱이 은폐되었다는 것이다. 이는 선택 캠페인 동안 대부분의 클론이 1D11 에피톱에 가깝게 결합하는 것으로 나타났으므로 상관성이 있다. 결합된 파지의 용출(elution)은 트립신(trypsin)(비-특이적인 용출)으로 또는 높은 농도의 7B07 IgG로 경쟁적 용출(클론 7B07에 비슷한 결합 부위에 결합하는 scFv 를 발현하는 파지의 특별한 용출)을 통해 이루어졌다.
두 개의 라마-유래한(llama-derived) scFv 라이브러리(람다 및 카파)가 Gal-10에 대한 결합 활성을 가진 scFv 클론을 선택하기 위하여 사용되었다. 두 번의 라운드의 선택 과정으로 인간 Gal10에 특이적인 scFv를 발현하는 파지가 뚜렷이 강화된 결과가 되었다. PBS 대조군에 대한 비슷한 강화(100-배까지)가 관찰되었다.
Gal10
특이적인 결합체의 스크리닝
트립신 및 7B07 로의 경쟁적 용출 둘 다 사용된 Gal10의 7B07 에피톱에 대한 두 번째 라운드(round) 선택 후에 두 개의 마스터 플레이트(master plates)가 생성되었다. 마스터 플레이트 18(MP18)은 첫 번째 라운드로부터 경쟁적 용출이 수행되었던 람다 라이브러리(Lambda library)의 두 번째 라운드 선택으로부터 생성되었다. 마스터 플레이트 19(MP19)는 용출이 트립신 또는 7B07을 사용하여 수행된 모든 다른 조건으로부터 생성되었다(표 3). 이 마스터 플레이트들로부터, 세포질 추출물이 생성되었으며(scFv) 및 이들의 Gal10에의 결합 능력이 ELISA 및 비아코아(Biacore)로 분석되었다.
표 3: Gal10에 7B07에피톱에 대한 선택 캠페인 후에 생성된 마스터 플레이트(master plates, MP)의 개요
scFv
세포질 추출물의 스크리닝
세포질 추출물의 결합 능력이 ELISA(결합 및 7B07로의 경쟁) 및 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)으로 분석되었다.
ELISA에 의한 결합 스크리닝
인간 Gal10에 대한 scFv(세포질 추출물)의 결합 능력이 ELISA로 분석되었다. 이 실험에서, OD 0.3 또는 그 이상을 가진 클론들은 Gal10 결합제로서 분류되었다. 총 48 Gal10-특이적인 클론들이 동정되었다.
ELISA에 의한 경쟁적 스크리닝
Gal10 에서 scFv의 타겟-결합 부위는 그 후 추가의 ELISA를 통해 분석되었으며 여기서 클론 7B07에 대항하는 클론들의 경쟁이 조사되었다. 이 셋-업에서, Gal10은 7B07로 코팅된 맥시솝 플레이트(Maxisorp plate)에 포획되었다. 그러므로, Gal10 에서 클론 7B07에 비슷한 결합 위치를 가진 클론들은 결합할 수 없으며 및 낮은 OD 값을 보여줄 것으로 기대되고, 반면에 다른 부위에 결합하는 클론들은 높은 OD 값을 보일 것으로 기대된다.
결합 및 경쟁적 ELISA 실험의 분석으로 25 클론들이 Gal10 결합에 대하여 클론 7 B07과 경쟁하는 것으로 나타났다. 이 클론들은 결합 ELISA(binding ELISA)에서 OD 값>0.3을 보였고 및 경쟁 ELISA(competition ELISA) 에서 <0.1 OD 값을 보였다.
SPR(비아코아
3000) 에서
어프
-
레이트
(off-rate) 스크리닝
ELISA 실험의 나머지 25 클론의 어프-레이트(off-rate)가 비아코아 3000(Biacore 3000) 기기에서 결정되었다. 세포질 추출물이 2500 RU Gal10-His로 코팅된 CM5 센서 칩(CD5 sensor chip)에 주사되었다. 11개 클론이 클론 7B07(2.18E-03 1/s) 에 비교하여 어프-레이트에서 적어도 2-배 개선됨을 보였으며 및 이 클론들이 추가의 성질 규명을 위해 선택되었다(표 4).
표 4: scFv 세포질 추출물의 어프-레이트(off-rate). 이 표는 대조군(g7B07)에 비교하여 각 클론의 결합((binding(Rmax)), 해리((dissociation)(off-rate))의 진폭을 제시함은 물론 어프-레이트의 변화 배수도 제시한다.
1.2
중쇄
셔플링
캠페인(shuffling campaign)
7B07 경쇄와 짝을 이루고 및 Gal10에 좋은 친화력을 갖도록 하고 및 개선된 안정성을 갖는 클론을 찾기 위하여 중쇄 셔프링 접근법(suffling approach)이 실시되었다.
라이브러리 구축(
Fab의
VH
-
셔플링
)
셔플된 중쇄 라이브러리를 구축하기 위하여, 두-단계 PCR이 사용되었다. 첫 번째, VH-CH1을 증폭하기 위하여 비-태그된 프라이머(non-tagged primers)가 두 마리의 면역화된 라마(이전 부분 캠페인에서 얻어짐)의 cDNA에 직접적으로 사용되었다. 얻어진 PCR 생산물은 그 후 정제되었고 및 VH를 증폭하기 위하여 태그된 프라이머(tagged primers)와 함께 두 번째 PCR에서 사용되었다. 클론 7B07이 라마 몬토요(llama Montoyo)로부터 분리되었으므로, 클론 7B07의 VL는 라마 몬토요로부터의 PCR-증폭된 VH 레파토아(VH repertoire)와 셔플되었다. 최종 Fab 라이브러리 크기는, 콜로니 PCR(colony PCR) 로 결정된 대로 VL 및 VH의 적절한 삽입 퍼센트는 94%로, 1.5E+07 VH/VL 조합이었다.
모체 g7B07 Fab 보다 인간 Gal1-에 결합하는 능력이 비교할만하거나 또는 더 좋은 새로운 Fab를 선택하기 위하여, 파지 패닝(phage panning) 접근법이 사용되었다. 이 목적을 위해, 첫 번째 라운드 및 두 번째 라운드 선택이 인간 Gal10-His 및 관계없는 His-태그된 단백질(대조군으로서) 에 대해 수행되었다. 세 번째 및 네 번째 라운드 선택이 용해성, 비 His-태그된 인간 Gal10에 대하여 수행되었다.
첫 번 두 라운드의 선택은 1 및 10 μg/mL의 코팅된 인간 Gal10-His 및 10 μg/mL의 관계없는 His-태그된 단백질에 대해 수행되었다. 첫 번째 및 두 번째 라운드 선택 둘 다를 위해, 조건(condition) 10 μg/mL Gal10-His로부터 용출된 파지가 이어지는 세 번째 및 네 번째 라운드의 선택에 사용되었다.
Gal10
특이적 결합제 스크리닝
세포질 추출물로서
Fabs의
생산
라운드 3 및 라운드 4의 트립신-용출된 파지로부터, 단일 클론이 생성되었으며 및 두 개의 마스터 플레이트가 만들어지는 결과가 되었다(표 5). 마스터 플레이트 24(MP24) 는 다른 조건((Gal10, 비-어프-레이트(non-off-rate) 세척 및 어프-레이트 세척)으로부터 선택된 콜로니를 가진 세 번째 라운드 선택으로부터 만들어졌다. 마스터 플레이트 26(MP26)은 비-어프-레이트(non-off-rate) 세척 및 어프-레이트 세척으로부터 선택된 콜로니를 가진 네 번째 라운드 센택으로부터 만들어졌다.
표 5: 인간 Gal10에 대한 선택 캠페인 후 생성된 마스터 플레이트의 개요.
서열 분석
마스터 플레이트 24(MP24)의 서열 분석 결과는, CDR3 서열에 근거하여, 7B07_VH 와는 구별되게 단지 4그룹의 VH 계가 존재하는 것으로 나타났다. 추가의 분석으로부터 이 4개의 VH 계 중 2개가 낙타류 단일-도메인 항체인 것으로 나타났다. 나머지 두 개의 VH 계로부터, 대표적인 클론이 추가의 분석을 위해 선택되었다-클론 24A04 및 클론 24F02.
BLI
기술을 사용한 선택된 두 개 클론의
Gal10
결합
선택된 두 개의 클론으로부터의 세포질 추출액의 포획된 Gal10-His에 대한 결합이 Octet RED96 기기(Bio-Layer Interferometry(BLI) technology)를 사용하여 검사되었다.
이 분석에서, 클론 7B07(g7B07)의 생식세포계열이 참조로서 포함되었다. 참조 클론에 비교하여 Gal10-His에 대한 낮은 반응이 측정되었다. 단지 클론 24F02 만이 클론 g7B07에 비교하여 더 좋은 어프-레이트(off-rate) 를 보였다(표 6).
표 6: 계산된 어프-레이트 kd(1/s).
7B07
에피톱에
대한 경쟁적 ELISA
선택된 클론이 클론 g7B07와 같이 Gal10이 같은 부위를 타겟하는지 확인하기 위하여 경쟁적 ELISA가 수행되었다. 간략하게, 96-웰 맥시솝 플레이트가 7B07_hIgG1로 코팅되었으며 및 Gal10-His가 포획되었다. 세포질 추출물을 함유하는 Fab-Myc가 그 후 배양되었고, 및 결합된 Fab가 항-Myc-HRP 항체로 검출되었다. OD 값 < 0.1을 갖는 클론들이 7B07 에피톱과 공유하는 것으로 정의되었다. 양성 대조군 샘플(클론 18C06)이 참조 샘플로서 사용되었다.
클론 24F02는 결합을 보이지 않았으며, 이는 24F02가 클론 7B07와 같은 에피톱에 결합함을 제시한다. 비슷한 데이터가, 7B07와 경쟁하는 것으로 알려진, 대조군 항체 18C06에 대하여도 얻어졌다. 클론 24A04는, 반대로, OD 값 > 0.1을 보였으며, 이는 이 클론은 7B07보다는 다른 에피톱에 결합함을 제시한다.
표 7: 평균 OD450mm 값
1.3
g7B07
_
CDR2
_
VH
무작위 캠페인
라이브러리 구축(
Fab
)
g7B07 CDR2 - N53G54 - 내에 탈아미드화 부위(deamidation site)의 무작위화(randomization)는 탈아미드화 부위 및 Gal10에의 좋은 결합 친화력이 없는 g7B07 변이체를 제공하는데 실패하였다. 탈아미드화 부위 및 좋은 결합 친화력이 없는 서열을 발견하기 위하여 CDR2 잔기가 무작위화 되었다. 7B07 Fab의 일부분을 Gal10과 복합체로 한 구조적 모델링이 추가의 조사를 위하여 무작위화된 CDR2 라이브러리 생성을 하게 하였다. 단지 CDR2 루프(loop)(잔기 52-57 - KNGGGI)(서열번호 74) 의 유연한 꼭지(flexible tip)만 무작위화 되었으며 및 역평행 베타-시트(antiparallel beta-sheet)는 그대로 두었다; 4개의 라이브러리가 구축되었다. X6로 라벨 된 라이브러리에서는 CDR2 루프의 유연한 꼭지의 6 잔기 모두가 무작위화 되었다((IXXXXXXT, 여기서 X는 무작위화 된 하나의 아미노산을 나타낸다). 이것은 원래의 7B07 VH-CDR2 서열로 되돌아감을 발견할 위험이 있기 때문에, 1 아미노산이 짧은 3개의 추가의 라이브러리 X3(IKXXXIT)(서열번호 75); X4(IXXXXT); 및 X5(IXXXXXT):가 구축되었으며; 여기서 'X'는 무작위화 된 위치를 나타낸다.
결정 구조에서, 잔기 54-56(GGG)은 Gal10 분자와 충돌하고 및 G55로 되돌아 굽어진다. 더 짧은 서열 1 아미노산을 만드는 것이 Gal10 에 결합하기에 더 잘 맞을 수 있다는 것이 고려되었다.
클론 g7B07의 중쇄 가변 도메인의 CDR2에 있는 6개 잔기를 무작위화 하기 위하여, 각 라이브러리를 위하여 특정한 세트의 프라이머가 생성되었다. 생식계열 클론 7B07의 중쇄의 DNA를 탬플레이트로 사용하여 두 단계의 인접한 PCR(nested PCR) 후에, g7B07 경쇄의 가변 도메인을 함유하는 PCB13 파지미드 벡터(phagemid vector)에 라이게이트 시키기 전에 앰플리콘(amplicons)을 제한효소로 소화시켰다.
라이브러리 구축은 4개의 라이브러리의 결과가 되었으며, 이는 이론적인 라이브러리 크기보다 5-1224-배 더 높은 라이브러리를 보여주었다.
표 8: 생성된 4개의 다른 라이브러리의 크기.
파지 디스플레이(Phage display)를 통한 선택
Gal10에 좋은 결합 친화력을 가진 안정적인 g7B07 변이체를 동정하기 위하여, 4개의 다른 파지 라이브러리(Input)를 10-배 과량의 Gal10-His로의 어프-레이트 세척 존재하에 또는 세척 없이 맥시솝 플레이트에 코팅된 Gal10-His에 24시간 기간 동안 결합하도록 하였다. His-태그가 아닌 Gal10 에 대한 특이적인 강화를 평가하기 위하여, 관계없는 His-태그된 단백질이 음성 대조군으로서 코팅되었다. 이 과정은 첫 번째 라운드 선택 후에 분명한 강화의 결과가 되었다. 관계없는 His-태그 된 단백질 패닝의 아웃풋 타이터(output titers)는 PBS 대조군에서보다 분명히 더 높다. 추가로, 10-배 과량의 Gal10으로 수행된 24시간 어프-레이트 세척은 0일째 날에 수행된 용출에 비교하여 더 낮은 강화(10-100-배)의 결과가 되었으나, 그러나 아마도 인간 Gal10에 대한 더 높은 친화력을 가진 Fab를 발현하는 파지로 24시간 후에 수행된 용출 대조군과(데이터 보이지 않음) 가장 비슷하다.
10 μg/mL 라운드 1 직접 트립신 용출 조건(condition)으로부터 용출된 파지는 추가로 두 개의 코팅된 Gal10-His 농도(10 및 1μg/mL)에 대해 선택되었다. 같은 과정에서, 두 번째 라운드의 선택 동안 어프-레이트 세척이 적용되었다.
두 번째 라운드의 선택으로부터의 결과는 첫 번째 라운드에 비교하여 비슷하거나 또는 10-배 더 낮은 강화를 보였다. 24시간 어프-레이트 세척은, X3 라이브러리의 경우를 제외하고, 어프-레이트 세척 없는 조건에 비교하여 10-배 더 낮은 아웃풋(output) 타이터의 결과가 되었다. 어프-레이트 선택 있이 또는 없이 첫 번째 및 두 번째 라운드 선택으로부터의 클론을 포함하여, 하나의 마스터 플레이트가 각 라이브러리에 대하여 제조되었다.
CDR2
무작위화
된 클론의 결합 스크리닝
Fab
세포질 추출물 생산
첫 번째 또는 두 번째 라운드 선택의 용출된 파지로부터(어프-레이트 세척 있게 또는 없게), 단일 클론이 생성되었으며 및 총 4개의 마스터 플레이트의 생성의 결과가 되었다(표 9에 표시된 것과 같이 다른 조건으로부터 선택된 콜로니를 가진, 라이브러리당 하나의 마스터).
표 9: 인간 Gal10-His에 대한 선택 캠페인(CDR2 무작위화 캠페인) 후 생성된 마스터 플레이트(MP)의 개요 표.
10-배 과량의 항원으로, 트립신 용출 방법으로 수행된 어프-레이트 세척 있이 또는 없이 10 μg/mL의 인간 Gal10에 대한 첫 번째 및 두 번째 라운드의 선택 후에 총 4개의 마스터 플레이트가 생성되었다.
이들 마스터 플레이트로부터, 세포질 추출물이 생성되었으며(Fab) 및 이들의 인간 Gal10에의 결합 능력이 SPR 로 분석되었다.
CDR2
무작위화
캠페인으로부터 생성된
Fab
세포질 추출물의 스크리닝
인간 Gal10-His에 대한 Fab(세포질 추출물)에의 결합 특성이 비아코아 3000(Biacore 3000) 기기로 SPR에 의해 분석되었다. 이 목적으로, 희석된 세포질 추출물이 인간 Gal10-His로 코팅된 CM5 칩(chip)에 적용되었다. 양성 대조군으로서, 인간 Fab 백본에 정제된 g7B07의 20 nM 주사가 운영(run) 시작 및 끝에 포함되었다. 스크리닝 동안에, Fab의 효과적인 농도가 알려지지 않았으므로 단지 Fab의 해리(어프-레이트) 만이 결정될 수 있으며 및 클론마다 상당히 다양할 수 있다.
SPR에서 스크린 된 376 클론 중에서, 스크린 된 세포질 추출물 대부분은 클론 g7B07 보다 더 높은 해리율을(어프-레이트 = 6.9E-03 1/s) 보였다.
표 10: SPR 기술을 사용한 CDR2 무작위화 캠페인으로부터 생성된 Fab 세포질 추출물의 스크리닝. 대조군 g7B07에 비교하여 비슷한 또는 더 좋은 어프-레이트를 가진 클론은 볼드체로(어프-레이트 배수 컬럼) 강조되었다. CDR2 서열의 무작위화 된 부분은 밑줄 쳐졌다.
Fab 세포질 추출물의 결합 능력이 비아코아 3000(Biacore 3000) 을 사용하여 SPR 기술로 분석되었다. 간략하게, 희석된 세포질 추출물이 2500 RU의 Gal10-His으로 코팅된 CM5 칩에 주사되었다. 대조군(g7B07 및 g7B07_N53A) 에 비교하여 각 클론의 결합의 증폭(Rmax), 해리(어프-레이트)는 물론, 어프-레이트 배수 변화가 제시된다. 클론 g20H09 및 g23H09는 대조군 g7B07에 비교하여 비슷한 또는 더 좋은 어프-레이트를 지녔다(표 10). CDR2 서열의 무작위화된 부분은 밑줄 쳐졌다(표 10).
4개의 다른 CDR2 무작위화된 라이브러리로부터 분리된, 제한적이 수의 클론들이 적절한 결합 성질을 보였다(표 10). 이 패널 중에, X6 라이브러리로부터 분리된, 클론 g23H09는 모체 클론 7B07보다 더 좋은 어프-레이트를 보여주는 유일한 클론이다(2.5-배 더 좋은 어프-레이트). X3 라이브러리로부터 분리된, 8.8E-03 1/s에 동등한 어프-레이트를 가진, 클론 20H09는 클론 g7B07와 비교하여 비슷한 어프-레이트를 보여주었다. 그러나, 클론 20H09(WHR) 및 g23H09(AQFQHW) 의 CDR2 무작위화된 부분은, 빛의 영향하에서 잠재적으로 산화될 수 있는, 하나의 트립토판 존재로 표시되는, 하나의 가능한 취약점을 보였다.
최종으로, g7B07에 비교하여 1.8-2.3-배 더 높은 어프-레이트를 가진, 클론 23E05(X6 라이브러리) 및 20F04(X3 라이브러리)는 모체 클론과 가까운 결합 특성을 보였다. X4 및 X5 라이브러리로부터 분리된 클론들 중 아무것도 적절한 결합 특성을 보이지 않았다.
실시예 1로부터의 결과의 요약
실시예 1로부터 7개 클론이 추가의 성질 규명을 위해 선택되었다(표 11). 이 클론들은 이들의 결합 능력(BLI 또는 SPR 결합), 에피톱 성질 규명(경쟁 ELISA) 및 VH 및 VL 서열에 기반을 두어 선택되었다(표 11).
표 11: 인간 Fab에서 생식계열화 및 리포메팅을 위하여 선택된 scFv /Fab 클론의 성질.
실시예 2: 인간
Fab
백본에서 선택된 클론들의 생식계열화(
germlining
), 리포메팅(reformatting) 및 생산
선택된 7개의 클론이 추가로 성질규명 되기 전에, 이 클론들은 인간화되고 및 인간 Fab 백본에 재-클론 되었다.
CDR
이식 접근법을 통한 선택된 클론의 생식계열화
선택된 항-Gal10 클론의 면역성을 감소하기 위하여, 가장 가까운 인간 생식계열 프레임워크(framework, FW)에 보완성 결정 부위(complementarity determining region, CDR) 이식을 통해 가변 부위(VH 및 VL)의 생식계열화가 시작되었다. 선택된 클론의 V-부위에 가장 높은 동일성을 가진 인간 생식계열 서열이 동정되었다.
변이체 24F02는 g7B07와 정확히 같은 부위에 위치하여 있는 잠재적인 탈아미드화 부위(pos53_CDR2_VH)를 제거하기 위하여 추가로 제작되었다. 이러한 이유로 위치 53의 N은 A로 돌연변이 되었다.
CDR2 무작위화 된 라이브러리가 생식계열화된 7B07 변이체의 중쇄의 가변 도메인 DNA를 사용하여 만들어졌기 때문에, 생성된 모든 클론들(g20H09 및 g23H09)은 이미 인간화되었다.
실시예 3: 인간
Fab
백본에 생식계열 클론 결합의 성질 규명
SPR로
3회 발견 캠페인(discovery campaigns)으로부터 선택된
Fab
클론의 결합 특성 성질 규명
선택된 Fab 클론의 인간 Gal10에 대한 결합 특성이 비아코아 3000 기기에 설정되어 있는 포획 방법을 통해 분석되었다. 두 개 농도의 선택된 Fab 클론들이 단일클론 항-His로 코팅된 CM5 칩에 고정시킨 인간 Gal10-His에 대하여 검사되었다. 대조군으로서, 클론 g7B07 및 g7B07_N53A가 운영(run) 시작 및 끝에 주사되었다. 간략하게, CM5 칩이 단일클론 항-His 항체(4000 RU)로 코팅되었으며, 그 후 인간 Fab 백본에 두 농도의 클론을 받기 전에 고정된 농도의 인간 Gal10-His(25 μg/mL)가 항-His 칩에 포획되었다.
표 11에서 동정된 클론의 생식계열 변이체는 클론 g7B07와 비슷하거나 또는 더 좋은 어프-레이트 및 친화력을 보였다(표 12 참조). 이 패널 중에, 7B07 에피톱 캠페인으로부터 분리된 클론들은 클론 g7B07 보다 6.2 내지 9.8-배 더 좋은 어프-레이트를 가진 최상의 어프-레이트를 보였다.
초기 클론 24F02의 생식계열화된(g24F02) 및 제작된 버전(g24F02_N53A)은 BLI에서 초기 스크리닝 캠페인 동안에 관찰된 초기 어프-레이트(5.86E-05 1/s)에 비교하여 좀 더 높은 어프-레이트를 보였다. 두 개의 Fabs는 아주 비슷한 결합 능력을 보였으며, 이는 위치 53에서 발견된 탈아미드화 부위의 제거는, 제작된 변이체 g7B07_N53A에서 결합 능력의 현저한 감소를 보이는 g7B07과는 달리, g24F02의 결합 능력에 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다.
언-레이트(on-rate) 7.1-8.3 E+05 사이, 및 어프-레이트(off-rate) 1.6E-03 1/s와 동등하고, 및 친화력 2.0-2.3 nM 사이를 가지면서, 이 클론들은 클론 g7B07보다 1.6 내지 1.9-배 더 좋은 언-레이트, 2.8-배 더 좋은 어프-레이트, 및 4.7-배 더 좋은 친화력을 보였다.
최종으로, CDR2 무작위화 캠페인으로부터 분리된 클론들은, 스크리닝 데이터와 동등하게, 분별력 있는 결합 특성을 보였다.
모든 클론들은 제작된 변이체 g7B07_N53A(kd 7.8E-02 1/s, KD 143.5 nM)에 비교하여 더 좋은 친화력 및 어프-레이트를 보였다.
표 12: 표 11로부터 선택된 생식계열화 된 클론들의 결합 특성.
실시예 4: 선택된 클론들의 안정성 연구
스트레스 테스트 후에, 중쇄 가변 도메인의 CDR2에 있는 탈아미드화 부위가 결합 및 강도(potency) 에 있어 분명한 하강을 유도한, 클론 g7B07의 그러한 문제와 비슷한 문제점을 조사하기 위하여, 선택된 클론들의 안정성이 분석되었다.
이러한 목적으로, 온도 스트레스 연구가 수행되었다. 이 셋-업에서, 결합, 강도(CLC 용해), 및 번역-후 수정(CDR2 서열에 초점)에 대해 비-스트레스화 된 샘플(T0)과 나란히 분석되기 전에, 스트레스 시킨 샘플들이 37°C에서 2주 동안 배양되었다. 이 테스트 클론들은 다른 시작 농도(3.2-7.3 mg/mL) 를 보였다.
SPR에서
온도 스트레스 된 샘플의 결합 능력 분석
온도 스트레스를 2주 받은 후에 선택된 7개 클론의 결합 특성이 비아코아 3000 기기에서 최적화된 포획 방법을 사용하여 분석되었다. 스트레스받은 샘플들의 결합 특성은, 검량 곡선에 비교하여, 결정되었으며, 및 상대적 활성(Relative Activity)의 퍼센트(% RA).로서 표현되었다.
간략하게, 포획 방법은 비아코아 3000 기기에서 셋-업 되었다. 이 목적으로, CM5 칩이 단일클론 항-His 항체(4000 RU)로 코팅되었으며, 그 후 검량기(calibrators), QC 샘플 및 각 클론의 온도 스트레스 된 샘플이 이중 주사(duplicate injection)를 받기 전에 고정된 농도의 인간 Gal10-His(25 μg/mL)가 항-His 칩에 포획되었다. 주사된 샘플의 각 기울기(slope) 가 그 후 BIA 평가 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. QC 샘플 및 온도 스트레스 된 샘플의 농도는 이 샘플들의 얻어진 기울기를 검량기 곡선에 보간하여(interpolating) 역-계산(back-calculated) 되었다. 얻어진 값은 테스트 된 샘플의 정상 농도의 +/-20% 내에 있으며 및 평균 상대적 정확도(average relative accuracy)(avg %RA)로서 표현된다(표 13).
표 13: 세 번의 발견 캠페인으로부터 분리된 선택된 클론들의 온도-스트레스 된 샘플의 결합 특성 분석
클론 g18G12, g18C06, 및 g24F02_N53A 는 비-온도 스트레스 된 샘플과 같이 37°C에서 두 주 후에 가장 좋은 안정성을 보였다(각각 95%, 106%, 및 99%)(표 13). 추가로, 제작되지 않은 변이체(non-engineered variant) g24F02 는 37°C에서 두 주 배양 후에 어느 결합의 손실도 보이지 않았으며, 이는 탈아미드화 위치 53은 이의 결합 특성에 영향을 주지 않음을 보여준다.
클론 g23H09 및 g20H09 는 37°C에서 배양 후에 감소 된 결합 능력을 보였으며, 이는 두 주 후에 각각 78% 및 86%의 결과가 되었다. 그러나, 결합에서 이 14% 및 22% 하강은 어세이 변이에 기인할 수도 있다.
g18G07 및 g18E04를 함유하는 온도 스트레스 된 샘플은 결합에서 분명한 하강을 보였으며(33% 및 74% RA), 37°C에서 두 주 후에 이들의 불안전성을 강조한다.
번역-후 수정의 분석(
CDR2
_
VH에
초점)
두 주의 온도 스트레스 후에, 생성된 샘플은, 이 클론들의 중쇄 CDR2 에 초점을 두어, 번역-후 수정에 대하여 분석되었다.
테스트 된 대부분의 클론은 37°C에서 두 주 배양 후에 상대적으로 낮은 퍼센트의 수정을 보였다. 클론 g18C06, g20H09 및 g23H09, 분석된 서열에서 각각 3.1%, 2.4%, 및 8.4%의 수정으로 가장 낮은 양의 수정을 보였다(표 14).
37°C에서 배양 후에 결합 활성의 감소에 따라, 클론 g18G07, 및 좀 덜한 정도의 클론 g18E04 는, 번역-후 수정을 보였다(표 14). 클론 g18E04는, 주로 52 위치에 Asn 의 탈아미드화 때문에, 37°C에서 두 주 배양 후에 11.7% 수정을 보였으며, 이는 이의 감소 된 결합 능력을 설명할 수 있다(표 13 및 14). 비-스트레스 된 클론 g18G07 샘플은 20.2% 수정을 보였으며, 이는 37°C에서 두 주 배양 후에 63%까지 증가하였으며, 이는 주로 위치 53의 Asn의 탈아미드화(58.8%) 때문이며, 온도 스트레스 된 샘플들의 결합 능력 손실을 설명한다.
비-스트레스 된 클론 g18G12 샘플은 30% 탈아미드화를 보였으며(54 위치에 Asn), 이는 37°C에서 두 주 배양 후에 영향을 받지 않았다. 이 클론의 탈아미드화는 생산 과정(37°C 6일) 에서 일어났을 가능성이 높다.
표 14: 선택된 항-Gal10 클론의 온도 스트레스 샘플의 번역-후 수정(CDR2_VH에 초점을 둔 PM). 번역-후 수정은, 대부분 위치 47에 W로, FW2에서 관찰되기 때문에, 선택된 클론들의 FW2의 일부 및 VH의 CDR2 서열만이 표에 표시된다. 밑줄 친 잔기들은 CDR2를 나타낸다(코벳 숫자 메김에 따라).
재조합
CLC를
용해하기 위한 온도 스트레스 된 샘플의 효능분석
인간 Fab 백본에서 선택된 클론들의 온도-스트레스 된 샘플의 재조합 CLC를 용해하기 위한 능력이 검사되었다.
클론 1D11(항-인간 특이적인)이 어세이-간 변이를 교정하기 위하여 참조로서 포함되었다. CLCs의 용해는 2, 5, 7, 및 16시간 배양 후에 인셀 2200(InCell 2200) 분석기를 사용하여 시간에 걸쳐 모니터 되었다(도 1). 간략하게, 항체는 두 번의 독립적인 실험에서 250 μg/mL(n=4) 에서 검사되었으며 및 항체 첨가 후 2, 5, 7, 및 16시간에 이미지가 얻어졌다. 이미지는 개별 결정 및 웰 당 총 결정 면적을 검출하기 위하여 개발된 알고리즘을 사용하여 분획 되었다. 이 셋-업에서, 1.5 mg/mL로 희석된 1 μL의 샘플(T0 및 T2W) 이 1μg의 Gal10으로 형성된 재조합 CLCs에 적용되었다.
표 15: 각 클론과 배양 후에 용해된 결정 면적 평균 %/웰
어세이는 다른 크기의 CLCs, 5-10 μm(런 2)부터 10-20 μm(런 1)까지 다양하게, 로 수행되었다. 결정 크기는 Fab 효능에 영향을 주는 것으로 관찰되었다. 특히, 크기 10-20μm 사이의 CLC는 클론들 사이에 가장 좋은 구별을 하도록 하였다.
클론 g20H09 및 g23H09는 패널 중에서 가장 강력한 클론이었다(도 1 및 표 15). 이 클론들은 2시간 이내에 59.6% 및 68.6%의 재조합 CLCs 를 용해시킬 수 있었다(런 1). 반면에, 다른 클론들은 2시간 후에 30.6%에서 37.9%의 용해를 보였다(런 1). 전체적으로, 배양 5시간 후에, 대부분의 클론은(g18G07 및 1D11) ~90%의 CLCs를 용해시킬 수 있었다.
양성 대조군, 클론 1D11, 은 배양 2시간 및 5시간 후에 각각 20% 및 36%의 CLC 용해로 결정을 용해하는 가장 낮은 강도를 보였다.
다른 안정성 결과와 맞게(결합 및 번역-후 수정), g18C06, g20H09, g23H09 및 g18G12 클론의 온도-스트레스 된 샘플은 비-스트레스 된 샘플과 비슷한 강도를 보였다. 클론 g18G07 및 g18E04의 온도-스트레스 된 샘플의 감소 된 결합 능력에 맞게, 이 샘플들은 재조합 CLCs을 용해하는데 감소 된 효능을 보였다.
재조합 CLCs를 용해하는 g24F02_N53A의 강도가 회전 디스크 공초점 현미경(spinning disk confocal microscope)으로 분석되었다. 간략하게, 인간화된 Fab 단편을 미리-형성된 CLC(pre-formed CLC)와 배양시켰으며 및 결정 용해가 시간에 따라 모니터되었다.
결합 데이터에 맞게, 온도 스트레스 된 샘플(37°C에서 2주)은 비-스트레스 된 샘플에 비교하였을 때 과 비슷한 효능을 보였다(도 2 및 표 16). 이는 이 클론의 37°C에서 2주 동안의 안정성을 강조한다. 실제로, 이 클론으로부터의 테스트 된 샘플은 43-46 분 내에 50% CLC 용해를 보였다(표 16). 클론 g24F02는 비-스트레스 된 및 온도 샘플 둘 다에서 g7B07에 비교하여, 비슷하나, 약간 더 낮은, 강도를 보였다.
표16: 온도-스트레스 된 샘플의 EC50 및 EC90 값(37°C에서 T0 및 T2W). 계산은 비-선형 회귀(non-linear regression)(log(agonist) 대비 반응 가변 기울기(response Variable slope)(4개 계수))를 사용하여 만들어졌으며 및 표에 보고되었다. 이 결과는 각 웰이 6개 복제에서 모니터 된 한 실험의 조합이다.
ELISA를 사용한
에피톱
비닝(epitope binning)을
통한 선택된 클론의 결합 부위 성질 규명
인간화된 Fab 의 에피톱 비닝(epitope binning) 분석이 g7B07의 인간화된 Fab와 비교하여 수행되었다.
이 실험을 위하여, 바이오티닐화된 클론 g7B07-인간화된 Fab의 최적이 아닌(sub-optimal) 농도가 Gal10 코팅된 플레이트에 첨가되었고 및 선택된 클론들과 사전-배양(pre-incubated) 되었다. g7B07와의 퍼센트 경쟁이 그 후 측정되었다(표 17). 인간 Fab 백본에 모타비쭈맵(Motavizumab)(Mota)이 음성 대조군으로서 사용되었다(0% 경쟁). 클론 g7B07이 경쟁의 양성 대조군으로서 사용되었고 및 그러므로 100% 경쟁값으로서 세트 되었다. 클론 1D11이 Gal10의 반대편(타이로신 69를 포함하는)에 결합하는 것으로 알려졌기 때문에 항-인간 특이적인 클론 1D11(타이로신 69 잔기에 결합)이 Gal10에 대한 7B07와의 경쟁을 위해 음성 대조군으로서 테스트 패널에 포함되었다.
표 17: ELISA에서 g7B07-인간 Fab-바이오티닐레이트(g7B07-human Fab-biotinylated)에 대항하는 선택된 항-Gal10 클론의 에피톱 비닝(epitope binning). g7B07-hFab-Biot에 대항하는 경쟁 퍼센트가 음성 대조군 모타비쭈맵(Motavizumab)의 OD 값을 0%로 및 비-바이오티닐화된 클론 g7B07의 OD 값을 100% 경쟁으로 사용하여 측정되었다.
결과는 선택된 클론들이 Gal10 결합에 대하여 g7B07과 경쟁함을 확인시켰다(표 17).
SPR에서
세 번의 발견 캠페인으로부터 선택된
Fab
클론의 결합 성질의 특성 규명
선택된 클론들의 인간 및 게먹이원숭이(cynomolgus) Gal10에의 결합 성질이 비아코아 3000 기기에서 확립된 포획 방법을 통해 분석되었다.
이 목적으로, 두 가지 접근 방법이 사용되었다. 첫 번째에서, 선택된 클론의 두 농도가 단일클론 항-His 항체로 코팅된 CM5 칩에 게먹이원숭이(WGS 동형단백질) Gal10-His 캡처에 적용되었다. 두 번째 접근 방법은 같은 셋-업에서 인간 또는 게먹이원숭이(WGS 동형단백질) Gal10-His에 적용된 시리즈 희석이 관여된다.
첫 번째 단계에서, 포획된 게먹이원숭이 Gal10((WGS 동형단배질(isoform))의 두 농도를 주사하여 패널의 게먹이원숭이 교차 반응성이 테스트되었다.
클론 g7B07 및 이의 제작된 변이체 g7B07_N53A는 게먹이원숭이 Gal10의 WAGS 동형단백질에 약한 결합을 보였다(g7B07-hFab는 KD 69 nM 대비 g7B07-mIgG1는 1.5 nM)(표 18).
클론 g20H09은 게먹이원숭이 항원에 좋지 않은 결합 능력을 보였으며, 반면에 클론 g18C06 는 결합을 보이지 않았다(표 18). 그러나, 클론 g23H09, g24F02 및 이의 제작된 변이체 g24F02_N53A는 좋은 게먹이원숭이 교차-반응성을 보였다(표 18).
이 클론들의 게먹이원숭이 교차-반응성의 추가 성질규명에서 g24F02_N53A 및 g23H0이 강조되었다. 정말로, 이 두 클론은 인간 Gal10에 대해 1.4 nM 및 5.34 nM 친화력 및 게먹이원숭이 Gal10에 대해 8.0 및 9.9 nM 친화력을 각각 보였다. 추가로, 이 두 클론은(g23H09 및 g24F02_N53A) 클론 g7B07 보다 1.7-배 및 6.3-배 더 좋은 친화력 및 1.9-배에서 3.5-배까지 더 좋은 어프-레이트를 보였다. g24F02_VH의 CDR2의 위치 53에 있는 Asn의 돌연변이는 인간 또는 게먹이원숭이 Gal10에 감소된 결합으로 나타나게 하지 않았으며, 및 비슷한 친화력 및 어프-레이트가 관찰되었다.
스크리닝 데이터와 맞게, 클론 g18C06는 인간 Gal10 에 대한 테스트 패널의 가장 좋은 친화력(1.27 nM) 및 어프-레이트(4.9E-04 1/s)를 보였으나, 그러나 게먹이원숭이의 상대(counterpart)에 대하여는 결합을 보이지 않았다.
g23H09의 생성의 결과가 된 g7B07_VH의 CDR2의 6 아미노산의 무작위화는 모체 클론에 비교하여 게먹이원숭이 교차-반응성의 증가를 보여준다. 그러나, CDR2의 3개 아미노산이 무작위화된 비슷한 발견 캠페인으로부터 분리된, 클론 g20H09는, 이 게먹이원숭이 교차-반응성의 증가를 보이지 않았으며, 이는 주요한(key) 아미노산이 클론 g23H09의 CDR2에 도입되었음을 보여주며, 이는 게먹이원숭이 Gal10에의 증가된 결합을 초래한다.
표 18: SPR로 측정된 대로 친화력 측정.
실시예 4 결과의 요약
분석된 계수들 모두를 보면서, 4개의 클론이 추가의 성질 규명을 위해 선택되었다.
g18C06: "7B07 에피톱 캠페인(7B07 epitope campaign)" 동안에 동정 되었으며, 인간 Gal10에 가장 좋은 어프-레이트(4.9E-04 1/s), 재조합 CLCs를 용해하는 좋은 강도(5시간 후에 76.8%) 및 적절한 안정성(번역-후 수정 3.1%, 결합 및 강도는 37°C에서 2주 후에 변화하지 않음)을 보였다. g7B07 처럼 Gal10에 비슷한 결합 부위이지만, 이 클론은 게먹이원숭이 Gal10에는 결합을 보이지 않았다.
g23H09: 중쇄의 CDR2에 있는 6개 잔기가 무작위화된, g7B07의 이변이체는 모체 클론과 비슷한 결합 성질을 보였다. 적절한 안정성(37°C에서 2주 배양 후에 결합 및 강도가 영향을 받지 않았음) 이외에, 이 클론은 재조합 CLC를 용해하는 데 두 번째로 좋은 효능을 보였다(5시간 후에 84.1%). 이는 또한, WGS 동종 단백질에 대한 친화도 9.9 nM를 가지고, 게먹이원숭이 교차-반응성을 분명히 보였으며, 이는 g7B07보다 7-배 더 좋고 및 g23H09를 게먹이원숭이 원숭이에서 독성 테스트에 사용하도록 할 것이다.
g24F02 _ N53A: g7B07의 "중쇄" 셔플링으로부터 동정된 유일한 클론은 모든 수용 기준(acceptance criteria) 을 충족시켰다. g7B07에서 발견된 것과 비슷하게, 가능한 탈아미드화 부위는 알라닌으로 돌연변이 시켰다. 강도 및 결합 능력은 37°C에서 2주 후에도 변화되지 않았다. 게먹이원숭이 Gal10에 8 nM 친화도를 가지고, 이 클론은 좋은 게먹이원숭이 교차-반응성을 보였으며, 이는 게먹이원숭이 원숭이에서 독성 테스트에 하도록 할 것이다.
g20H09: 중쇄의 CDR2 에 있는 3개 잔기가 무작위화된, g7B07의 이변이체는 모체 클론보다 더 낮은 결합 능력을 분명히 보였다. 적절한 안정성 및 Gal10 결정을 용해하는 가장 좋은 능력(5시간 후에 91.4%) 임에도 불구하고, 이 클론은 게먹이원숭이 Gal10에 약한 교차-반응성을 보였다.
표 19: 클론: g23H09, g24F02_N53A, g18C06 및 g20H09 의 특성 요약,
실시예
1-4에서 사용된 재료 및 프로토콜
샤르코 라이덴 결정(Charcot Leyden Crystal, CLC) 용해 어세이
어세이 1:
정제된 단일클론 Fab가 PBS로 공급되었으며 및 4°C에 저장되었다. 단백질 농도는 이론적 흡광 계수(extinction coefficients)를 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 결정되었다.
인간 CLC 결정은 페르손 등(Persson et al. 5 )에서 서술된 대로 생산되었다. 간략하게, 4 mg/mL의 농도로 PBS에 있는 5mL의 정제된 N-말단적으로 His-태그 된 인간 Gal10이 실온에서 TEV 프로테아제(protease)와 프로테아제: 타겟 비율 1%(g/g)로 하룻밤 동안 배양되었다. 다음날 용액을 볼텍싱 하여(vortexing)(15 s) 결정화가 유도되었다(15 s). CLC 결정은 30분 내지 1시간 내에 나타났으며 혼탁한 용액의 결과가 되었다. 이 결정 용액은 그 후 사용될 때까지 4°C에 저장된다.
어세이 2:
정제된 단일클론 Fabs는 PBS로 공급되고 및 4°C에서 저장되었다. 단백질 농도는 이론적 흡광 계수(extinction coefficients)를 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 결정되었다.
항체는 두 번의 독립적인 실험에서 250μg/mL(n=4) 에서 검사되었으며 및 항체 첨가 후 2, 5, 7, 및 16 시간에 이미지가 얻어졌다. 1D11 농도-반응 곡선(concentration-response curve, CRC)은 추가의 양성 대조군으로서 포함되었다(n=3).
개별 결정을 검출하기 위하여 이미지는 사내 알고리즘(in-house algorithm) 을 사용하여 분획 되었으며 및 웰 당 총 결정 면적이 계산되었다.
프로토콜(Protocols)
1.1 CDR2 무작위화 캠페인을 위한 라이브러리 구축
네스티드 PCRs(Nested PCRs)
CDR2 무작위화 캠페인의 라이브러리를 생성하기 위하여, 두 단계 네스티드 PCR(nested PCRs)이 수행 되어 클론 g7B07의 VH가 증폭되고 및 3-4-5 잔기(-1 잔기) 및 대조군 6잔기의 무작위화가 도입되었다. NcoI 및 NheI로 소화 후에, PCR 생산물은 TG1 ECC로 전기천공되기(electroporate) 전에 g7B07의 경쇄를 함유하는 PCB13((NheI/NcoI 및 BsteIII(자체 라이게이션을 피하기 위하여)) 벡터에 라이게이트 되었다.
두 단계
네스티드
(nested)
PCRs
:
첫 번째
PCR
:
g7B07_VH_PCB13가 템플레이트로 사용되었으며, 50 ng/μL의 용액이 2X MQ 물에서 제조되었다.
표 20: 프라이머(Primers)
첫 번째 샘플 반응의 제조(아래 cfr 표):
표 21: PCR 샘플의 구성성분
그 후 플레이트는 봉합되었고 및 PCR 기기에 넣어졌다.
표 22: PCR 사이클 조건
최종으로, 첫 번째 PCR로부터의 DNA 생산물은 아가로즈 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에서 분리되었다.
아가로즈
겔 전기영동을 통한 DNA 분리
1. 0.8% 아가로즈 겔이 제조되었다((10 웰 콤(comb)(웰 당 120 μL)).
2. 동일한 PCR 생산물을 합치고(8 복제, 총 부피 400 μL) 및 80 μL의 6x 오렌지 로딩 염색제(Orange loading dye)(Catalog R0631)가 혼합물에 첨가되었다.
3. 중합 후에, 겔은 전기영동 시스템으로 옮겨지고, 및 탱크(tank)는 신선한 1X TEA로 채워졌다.
4. 로더(Loader)(Gene Ruler Mix, 20 μL)가 한 웰에 로드(load) 되었다.
5. 그 후 120μL의 cDNA가 각 웰에 옮겨졌다(총 3웰)
6. 분리는 적어도 70분 동안 200볼트(volt) 에서 수행(run)되었다.
7. 예상되는 DNA 생산물의 추출로 계속되기 전에 생산물의 적절한 분리가 평가되었다(15ml 튜브).
PCR
정제(clean-up):
아가로즈 겔로부터 분리된 PCR 생산물의 정제는 뉴클레오스핀 겔(NucleoSpin Gel) 및 PCR 정제 키트(PCR Clean-up kit)에서 제공된 프로토콜에 따라 수행되었다:
1. NTI 버퍼(100mg 겔보다 2 번 이상, 20-30분, 65°C) 를 첨가하기 전에 PCR 생산물의 무게를 달았다. 용액은 PCR 정제 컬럼에 로딩하기 전에 벤치에 15분 동안(냉각) 놓아두었으며 및 11 000 g에서 1분 동안 원심분리시켰다.
2. 흘러나온 액(flow-through)은 버렸으며, 멤브레인을 씻기 위하여 700μL 의 NT3을 첨가하였으며 및 컬럼은 11 000 g에서 1분 동안 원심분리시켰다. 이 단계는 2번 수행되었다.
3. 흘러나온 액은 버렸으며 및 컬럼은 11 000 g에서 3분 동안 원심분리시켰다.
4. 최종으로, PCR 정제 컬럼은 1.5 mL 튜브에 옮겨졌으며 및 용출은 20μL의 따듯한 MQ 물(70°C)을 첨가하여 수행되었다.
5. 실온에서 배양 단계(1분) 후에, 컬럼은 11 000 g에서 1분 동안 원심분리시켰으며 및 용출된 DNA는 나노드롭(Nanodrop)(260 nm)으로 측정되었다.
두 번째
PCR
:
두 번째 네스티드 PCR을 위하여, DNA 생산물은 첫 번째 네스티드 PCR로부터10 ng/μL이 되도록 제조되었다.
표 23: 프라이머
1.두 번째 PCR의 제조
표 24: PCR 샘플 구성성분
2. 그 후 플레이트는 봉합되었고 및 PCR 기기에 올려졌다.
표 25: PCR 사이클 조건
3. PCR 프로그램이 운영되는 동안, 0.8% 아가로즈 겔이 제조되었다.
4. 프로그램 끝에, DNA 생산물의 정제는 전기영동(0.8% 아가로즈 겔)을 통해 수행되었으며 및 PCR 정제는 상기 서술된 대로 수행되었다.
최종으로, DNA 농도는 나노드롭(Nanodrop)에서 측정되었다.
PCR
생산물 및
g7B07
_
VL
L
을
함유하는 벡터의 소화(digestion)
1. 두 번째 네스티드 PCR로부터의 PCR 생산물은 10 ng/μL로 희석되었다.
표 26: PCR 생산물의 소화(digestion).
2. 용액은 PCR 튜브에 50μL(6 튜브 총(300μL)) 로 배분되었다.
3. 소화는 PCR 기기에서 37°C에서 4시간 동안 수행되었다.
4. 배양 시간 끝에, 각 라이브러리의 PCR 반응은 1.5mL 튜브에 모아졌다.
5. 정제는 뉴클레오스핀(Nucleospin) 컬럼으로 수행되었다(상기 cfr 프로토콜, 라이브러리 당 하나의 컬럼).
6. 용출은 컬럼 당 75μL 따듯한 2X MQ 물(10μg 에 총 150 μL)로 수행되었다.
7. 그 후 DNA 농도는 나노드롭(Nanodrop)으로 측정되었다.
VL을 함유하는 소화된 PCB13에 소화된 VH의 라이게이션(ligation)
NcoI/NheI 소화된 VH(N3-4-5 또는 6) 의 라이게이션은 Ncol/Nhel/Bstell 소화된 g7B07_VL PCB13 에로 수행되었다.
혼합물의 제조는 1.5 mL 튜브에서 수행되었다(라이브러리 당 1 튜브).
표 27: 라이게이션 반응 조건
1. 라이게이트된 생산물은 실온에서 2시간 또는 16°C에서 하룻밤 동안 배양되었다.
2. 이 배양시간 후에, 총 부피 250 μL가 되도록 여분의 DNA 리가제(ligase)(50 μL MQ물에, 2.5 μL T4 DNA 리가제, 5 μL 버퍼 T4 DNA 리가제)가 첨가되었다.
3. 최종으로, 라이게이션은 37°C(수조)에서 2시간 동안 계속되었다.
4. 그 후 DNA는 뉴클레오스핀 컬럼을 통하여 정제되었다. 이 목적을 위하여, 상기 설명된 세척 단계로 진행하기 전에, 500μL의 NTI 버퍼가 라이게이트된 용액에 첨가되었다. 종료하기 위하여, 용출이 컬럼 당 30 μL의 따듯한 MiliQ 물로 수행되었다.
최종 라이브러리의 전기천공
-1 일:
회복 배지(recovery medium) 가 -80°C로부터 4°C로 옮겨졌다.
0일:
실험 시작하기 4시간 전에, 회복 배지를 37°C(배양기)에서 따듯하게 하였으며 및 유전자 충격기/마이크로펄서 전기천공 큐벳(Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes)을 얼음에 놓아두었다.
1. 전기적 경쟁력 있는 세포(electrocompetent cells, ECC, TG1)가 얼음으로 15분 동안 옮겨졌다.
2. 그 후 50 μL의 ECC가 30μL의 정제된 라이게이트된 생산물(라이브러리)에 첨가되었다.
3.여분의 50μL의 ECC가 이전의 부피에 더하여 첨가되어 총 부피 127 μL에 도달했다.
4. 이 부피는 그 후 3 분획으로 나누어지고 및 42μL가 3개의 미리 냉각된 바이오레드(BioRad) 큐벳(cuvettes)으로 옮겨졌다.
5. 음성 대조군으로, 1/10 희석액이 제조되었다. 이 미리-희석된 용액으로부터, 10μL가 새로운 1.5 mL 튜브에 옮겨졌다. 그 후 20μL의 ECC가 이전의 부피 위에 첨가되어 총 부피 30μL에 도달되었다.
6. 전기천공이 EC1 프로그램((값은 4.6 이상이어야 하고, 바이오레드 마이크로펄서(BioRad Micropulser))을 사용하여 수행되었다.
7. ECC는 추가의 4mL 미리-따듯하게 한 회복 버퍼(큐벳 당 1mL + 3개 큐벳을 헹구기 위하여 사용된 1mL) 로 회복되었다. 이 용액은 그 후 15mL(라이브러리당 총 4mL) 튜브에 옮겨졌다.
8. 큐벳은 180 rpm at 37°C에서 180 rpm으로 30분 동안 배양되었다.
9. 배양 후에, 각 라이브러리를 위해 2TY 배지/ 앰피실린(Ampicillin) /글루코오즈(glucose)에서 1/1000 희석이 수행되었다(새로운 15mL 튜브). 1/10 시리즈 희석이 그 후 96 웰 플레이트(F 바닥)에서 수행되어 10-07 희석에 도달하였다.
10. 최종으로, 각 희석의 5 μL이 특정한 페트리 디쉬(Petri dishes)에 스폿 되었다(spotted). 플레이트는 37°C에서 하룻 밤 동안 배양되었다.
11. 나머지 회복된 배양액은(4mL이 있는 15mL 튜브) 300 mL의 2% 글루코오즈 및 앰피실린(Ampicillin) 이 있는 2TY 배지(미리-따듯하게 함)에 접종시켰다. 배양액은 그 후 37°C에서 흔들면서(110 rpm) 9시간 동안 배양시켰다.
파지(phage )제조
파지 감염
포화된 라이브러리 하룻밤 배양액으로부터:
1. 4mL이 400 mL의 2TY/앰피실린/글루코오즈(OD 값은 0.1 이하이어야 함)에 첨가되었으며 및 37°C 120 rpm에서 OD 값 0.5에 도달할 때까지(약 2시간) 배양되었다.
2. 이 배양액 100mL(라이브러리당 100mL) 이 새로운 500mL 에랜마이어(Erlenmeyer)로 옮겨졌다.
3. 20μL의 도움 파지(helper phages) VCSM(스톡 1x1013 파지/mL)이 첨가 되었으며 및 이 배양액은 37°C 에서 30분 동안 진탕 없이 배양되었으며 및 그 후 진탕 시키면서(110 rpm) 30분 동안 배양되었다.
4. 이 배양액 100mL은 실온 3500 g에서 10분 동안 원심분리 되기 전에 이 두 개의 50mL 활콘 튜브(falcon tubes)(라이브러리당 2개)로 옮겨졌다.
5. 각 박테리아 펠렛은(각 라이브러리당 2 펠렛)은 200 mL의 2TY/ 앰피실린/카나마이신(Kanamycin)(1/1000 희석) 에 재-현탁 되었다.
6. 이 배양액은 그 후 28°C에서 진탕 시키면서(110 rpm) 하룻밤 동안 배양되었다.
g7B07 에피톱에 대한 scFv 라이브러리((모토요(Montoyo) + 니고(Ynigo), 카파(kappa) +람다(lambda))의 파지 디스플레이 선택
1일:
코팅:
1. 맥시솝 플레이트는 웰당 100μL의 클론 1D11(g7B07 에피톱의 반대편 쪽에 Gal10 에 결합) 25 μg/mL로 코팅되었다. PBS 대조군이 음성 대조군으로서 포함되었다.
2. 플레이트는 봉인 테이프로 덮고 및 4°C에서 하룻밤 동안 배양되었다.
파지 제조
1. 라운드 1: 글리세롤 스톡(최종 라이브러리로 전기천공된 TG1 세포) 50 OD(1 OD = 2x108 세포/mL)를 포함하는 용액이 650 mL 2TY/2% 글루코오즈/앰피실린에 첨가되었다.
라운드 2: 하룻밤 감염(이전 라운드의 선택으로부터 구출된)은, A600 약 0.5(+/- 2 시간)에 도달될 때까지 37°C에서 진탕 시키면서(110 rpm) 배양하기 전까지, 15 mL의 LB/앰피실린/글루코오즈1/100로 희석되었다.
2. OD 값이 0.5-0.6 사이일 때, 도움 파지(helper phage) 단계가 시작되었다((이 단계에서, 박테리아의 표면에 가장 높은 필리(pili)의 발현은 파지에 의한 좋은 감염을 하게 한다)).
3. 10μL의 도움 파지((냉동고에 저장된 VCSM13(1013))가 각 활콘 튜브(10 mL R1-TG1)에 첨가되었다. 혼합할 필요가 없다(파지: 박테리아 비율은 10:1이어야 하고 및 스톡은 1x1013/mL이다).
4. 튜브는 실온에서 4800 g로 15분 동안 원심분리 되기 전에 진탕 없이(감염) 37°C에서 30분 동안 배양되었다(상등액 제거).
5. 펠렛은 28°C(110 rpm)에서 하룻밤 동안 배양되기 전에 250 mL 엘렌마이어(Erlenmeyer)에서 50 mL 2TY/앰피실린/카나마이신(1/1000 희석)(글루코오즈 없음)에 재현탁(50 mL 튜브) 되었다.
TG 1 접종(inoculation)
1. 50mL 엘렌마이어에서 10mL의 LB 배지에 최소 염 아가 플레이트(minimal salts agar plate)에서 자란 TG1의 단일 클론이 접종되었다.
2. 이 배양액은 37°C(100 rpm)에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
2일:
차단(
blockng
)
1. 하룻밤 배양 후에, 코팅된 플레이트는 웰 당 300 μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 다단식 파이펫(multistepper pipette)으로 세척시켰다.
2. 차단 단계는 일회용 저장고로부터 다채널 파이펫을 사용하여 웰 당 200 μL의 1X PBS 2% MARVEL의 첨가로 수행되었다.
3. 플레이트는 봉인시키고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 2시간 동안 배양시켰다.
파지 침전:
1. 하룻밤 성장으로부터(도움 파지로 감염된 TG1) 50mL을 새로운 50mL 튜브로 옮기고 및 4°C에서 15분 동안 원심분리(4800 g) 시켰다(라운드 1:2x 50 mL).
2. 상등액은 수집되고 및 40mL 이 10 mL의 차가운 20% PEG6000/2.5 M NaCl를 함유하는 새로운 50 mL 튜브로 옮겨졌다(파지의 침전).
3. 그 후 튜브는 얼음에서 30분 동안 배양되었다.
4. 파지의 침전은 4800 g에서 15분 동안 원심분리 단계로 수행되었다.
5. 상등액은 제거되고 및 펠렛은 1mL의 멸균 PBS에 재현탁 시켰으며 및 1.5 mL의 새로운 멸균 튜브로 옮겨졌다.
6. 튜브는 그 후 최대 속도로(테이블 원심분리기) 3분 동안 원심분리 되었다.
7. 상등액은 수집되었으며 및 얼음에서 15분 동안 배양되기 전에 250 μL의 20% PEG/2.5 M NaCl을 함유하는 새로운 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 첨가되었다.
8. 튜브는 최대 속도에서 3분 동안 원심분리 되었고 및 상등액은 제거되었다.
9. 펠렛은 PBS에 재현탁 되었다(라운드 1: 튜브 당 500μL 최종 합친 것; 라운드 2:1mL)
10. 추가 단계로서, 잔류 세포 부스러기를 침전시키기 위하여, 용액을 최대 속도에서, 3분 동안 원심분리시켰다. INPUT을 만들기 위하여 상등액은 새로운 1.5 mL 튜브에 수집되었다(파지).
11. 이 스톡 용액으로부터 글리세롤 스톡이 만들어졌다(400μL의 60% 글리세롤에 800μL의 파지).
클론
1D11로
코팅된
맥시솝
코팅된 플레이트에
GAl10
포획:
1. 코팅된 플레이트의 차단 버퍼는 플레이트를 거꾸로 하고 및 이를 종이 조각 위에서 두드려 제거되었다.
2. 웰 당 100 μL의 0.2% MARVEL 에 있는 5 μg/mL Gal10-His이 첨가되었다.
3. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 2시간 동안 배양시켰다.
파지 선택
1. 라운드 1:10μL의 파지/선택(90μL의 PBS 0.2% MARVEL + 10μL의 파지).
2. 라운드 2:1μL의 파지/선택(99μL의 PBS 0.2% MARVEL + 1μL의 파지).
3. 차단 버퍼는 플레이트를 거꾸로 하고 및 이를 종이조각 위에서 두드려 96웰 플레이트로부터 제거시켰고 및 100μL의 희석된 파지가 첨가되었다.
4. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 2시간 동안 배양시켰다.
5. 두 시간 배양 후에 상등액은 플레이트로부터 제거되었다(파이펫).
6. 웰은 철저히 세척시켰다(200 μL/웰)(총 25x).
a. 200μL의 PBS/Tween 0.05%로 5번.
봉인되기 전 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 5 분 동안 배양되기 전.
이 단계는 4번 수행되었다.
b. 그 후 웰은 용출 단계로 진행시키기 전에 200μL의 PBS로 3번 세척시 켰다.
용출: 트립신:
1. PBS는 제거되었고 및 용출은 웰 당 150 μL의 트립신(10 mg/mL)으로 수행되었다.
2. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 15분 동안 배양시켰다.
3.이 배양시간 후에, 150μL의 용출 용액이 각 웰에 7.5 μL 의 AEBSF(트립신 억제제)를 함유하는 96 웰 V 바닥 플레이트의 해당하는 웰로 옮겨졌다. 그 후 이 용액은 트립신이 적절히 중화되도록 5번 혼합되었다(파이펫으로 위 및 아래로 하여).
용출: 경쟁적 용출(Competitive elution):
1. 경쟁적 용출이 웰 당 100μL 의 0.2% MARVEL에 있는 2.5 mg/mL 7B07 또는 모타비쭈맵(Motavizumab)(동형 대조군)을 첨가하여 수행되었다.
2. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
3. 이 배양시간 후에, 용출 용액은 새로운 96웰 플레이트에 옮겨졌다.
감염(infection)/구출(Rescue):
구출(50mL 튜브):
1. 300 μL의 TG1 세포(OD 값 약 0.5) 가 625 μL 의 2TY 및 75 μL 의 용출된 파지(트립신 용출 또는 경쟁적 용출)를 함유하는 50mL튜브에 첨가되었다.
2. 이 튜브는 37°C에서 30분 동안, 진탕 없이 배양되었다.
3. 이 배양 시간 끝에 10 mL의 LB/앰피실린/2% 글루코오즈가 TG1/파지를 함유하는 각 50mL 튜브에 첨가되었다.
4.이 튜브는 그 후 37°C에서 진탕 시키면서(110 rpm) 하룻밤 동안 배양되었다.
스폿팅
(spotting)
1. 스폿팅을 위한 희석:
a. INPUT: 파지의 희석 시리즈가(INPUT) 스폿팅을 위하여 2TY에서 제조 되었다(LB 아가 플레이트).
12 포인트 희석 시리즈(1/10)가 2TY(45 μL 2TY에서 5μL 파지) (10-1 에서 10-12 까지)에서 제조되었다
b. OUTPUT: 파지의 희석 시리즈가(OUTPUT) 스폿팅을 위하여 2TY에서 제 조되었다(LB 아가 플레이트).
6 포인트 희석 시리즈(1/10)가 2TY(45 μL 2TY에서 5μL 파지)(10- 1 에서 10-6 까지)에서 제조되었다.
2. 그 후 50μL의 TG1 세포가(OD 값 약 0.5) 희석 플레이트(INPUT 및 OUTPUT) 에 있는 50μL의 파지에 첨가 되었다.
3. 이 플레이트는 봉인되었으며 및 37°C에서 30분 동안, 진탕 없이 배양되었다.
4. 5 μL의 각 희석액(INPUT: 10-6 에서 10- 12 까지; OUTPUT: 10-1 에서10-6까지) 이 건조된 페트리 디쉬(LB/앰피실린/글루코오즈) 에 스폿트 되었다.
3일:
1. 스폿팅 플레이트에서 단일 콜로니의 존재가 조절되었다.
2. 하룻밤 구출(overnight rescues)의 글리세롤 스톡이 만들어졌다((저온유리병(cryovials)에서 1mL 배양액 + 500 μL의 60% 글리세롤, -80°C에서 저장됨)).
마스터 플레이트 생성:
1. 적절한 구출(rescue)로부터 희석 시리즈가 2TY에서 제조되었다.
6 포인트 희석 시리즈(1/10)가 2TY(45 μL 2TY에서 5μL 파지)(10-1에서 10-6 까지)에서 제조되었다.
2. 50μL의 선택된 희석액(10-3/10- 4)이 2% 글루코오즈 및 앰피실린(Ampicillin)을 포함하는 고체 LB 아가(agar) 배지를 함유하는 페트리 디쉬에 옮겨졌다.
3. 유리 비드(glass beads)로 진탕하여 TG1 세포가 균질하게 분포되도록 하였다.
4. 비드는 제거되었으며, 및 페트리 디쉬는 37°C에서 하룻밤 동안 배양되었다.
4일:
1. 하룻밤 배양 후에 단일 클론이 p10 팁으로 뽑혔으며 및 2% 글루코오즈 및 앰피실린으로 보충된 100 μL LB 배지를 함유하는 평평한 바닥의 96 웰 플레이트로 옮겨졌다.
2. 플레이트는 숨 실수 있는 봉인 테이프로 봉인되었으며 및 37°C에서 120rpm으로 5시간 동안 배양되었다.
중쇄
셔플링
CDR2
무작위화
캠페인의 파지 디스플레이(phage display)
1일:
코팅(
중쇄
셔플링
)
1. 맥시솝 플레이트가 1X PBS에서 희석된 100μL의 인간 Gal10-His 또는 비-태그된 인간 Gal10으로 코팅되었다:
라운드 1 및 라운드 2: 10μg/mL 및 1μg/mL의 인간 Gal10-His.
라운드 3 및 라운드 4: 5μg/mL 및 0.5μg/mL의 인간 Gal10-His 및 Gal10.
대조군으로서, 비-코팅된 조건(PBS) 및 상관없는 His-테그된 단백질(mCD11c-His R&D Cat n° 7987-AX)이 포함되었다.
2. 플레이트는 봉인 테이프로 덮었으며 및 4°C에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
코팅(
CDR2
무작위화
)
1. 맥시솝 플레이트가 1X PBS에서 희석된 100μL의 인간 Gal10-His으로 코팅되었다:
라운드 1 및 라운드 2: 10μg/mL 및 1μg/mL의 인간 Gal10-His, 1X PBS에 희 석,
대조군으로서, 비 코팅된 조건(PBS) 및 상관없는 His-테그된 단백 질(mCD11c-His R&D Cat n° 7987-AX)이 포함되었다.
2. 플레이트는 봉인 테이프로 덮었으며 및 4°C에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
파지 제조
1. 하룻밤 감염(이전 라운드의 선택으로부터 구출된)은, A600 약 0.5(+/- 2 시간)에 도달될 때까지 37°C에서 진탕 시키면서(110 rpm) 배양하기 전까지, 15 mL의 LB/앰피실린/글루코오즈에1/100로 희석시켰다.
2. OD 값이 0.5-0.6 사이일 때, 도움 파지(helper phage) 단계가 시작되었다(이 단계에서, 박테리아의 표면에 가장 높은 필리(pili)의 발현은 파지에 의한 좋은 감염을 하게한다).
3. 10 μL의 도움 파지((냉동고에 저장된 VCSM13(1013))가 각 활콘 튜브(10 mL R1-TG1)에 첨가되었다. 혼합할 필요가 없다(파지: 박테리아 비율은 10:1이어야 하고 및 스톡은 1x1013/mL이다).
4. 튜브는 실온에서 4800 g로 15분 동안 원심분리 되기 전에 진탕 없이(감염) 37°C에서 30분 동안 배양되었다(상등액 제거).
5. 펠렛은 28°C(110 rpm)에서 하룻밤 동안 배양되기 전에 250 mL 엘렌마이어(Erlenmeyer)에서 50 mL 2TY/앰피실린/카나마이신(1/1000 희석)(글루코오즈 없음)에 재현탁(50 mL 튜브) 되었다.
TG1 접종
1. 50mL 엘렌마이어에서 10mL의 LB 배지에 최소 염 아가 플레이트(minimal salts agar plate)에서 자란 TG1의 단일 클론이 접종되었다.
2. 이 배양액은 37°C(100 rpm)에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
2일:
차단(Blocking)
1. 하룻밤 배양 후에, 코팅된 플레이트는 웰 당 300 μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 다단식 파이펫(multistepper pipette)으로 세척시켰다.
2. 차단 단계는 일회용 저장고로부터 다채널 파이펫을 사용하여 웰 당 200μL의 1X PBS 2% MARVEL의 첨가로 수행되었다.
3. 플레이트는 봉인시키고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 2시간 동안 배양시켰다.
파지 침전
1. 하룻밤 성장으로부터(도움 파지로 감염된 TG1) 50 mL을 새로운 50mL 튜브로 옮기고 및 4°C에서 15분 동안 원심분리(4800 g) 시켰다(라운드 1: 2x 50 mL).
2. 상등액은 수집되고 및 40mL 이 10 mL의 차가운 20% PEG6000/2.5 M NaCl을 함유하는 새로운 50 mL 튜브로 옮겨졌다(파지의 침전).
3. 그 후 튜브는 얼음에서 30분 동안 배양되었다.
4. 파지의 침전은 4800 g에서 15분 동안 원심분리 단계로 수행되었다.
5. 상등액은 제거되고 및 펠렛은 1mL의 멸균 PBS에 재현탁 시켰으며 및 1.5 mL의 새로운 멸균 튜브로 옮겨졌다.
6. 튜브는 그 후 최대 속도로(테이블 원심분리기) 3분 동안 원심분리 되었다.
7. 상등액은 수집되었으며 및 얼음에서 15분 동안 배양되기 전에 250μL의 20% PEG/2.5 M NaCl을 함유하는 새로운 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 첨가되었다.
8. 튜브는 최대 속도에서 3분 동안 원심분리 되었고 및 상등액은 제거되었다.
9. 펠렛은 PBS에 재현탁 되었다(라운드 1: 튜브 당 500μL 최종 합친 것; 라운드 2: 1mL))
10. 추가 단계로서, 잔류 세포 부스러기를 침전시키기 위하여, 용액을 최대 속도에서, 3분 동안 원심분리시켰다. INPUT을 만들기 위하여 상등액은 새로운 1.5 mL 튜브에 수집되었다(파지).
11. 이 스톡 용액으로부터 글리세롤 스톡이 만들어졌다(400μL의 60% 글리세롤에 800μL의 파지).
파지 선택
1. 2번째, 3번째, 및 4번째 라운드의 선택의 INPUT으로부터 MARVEL(495μL의 PBS 2% MARVEL + 5 μL의 파지)에 희석된 1μL의 파지가 사용되었다.
2. 차단 버퍼는 플레이트를 거꾸로 하고 및 이를 종이 조각 위에서 두드려 96웰 플레이트로부터 제거시켰고 및 100μL의 희석된 파지가 첨가되었다.
3. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 2시간 동안 배양시켰다.
4. 두 시간 배양 후에 상등액은 플레이트로부터 제거되었다(파이펫).
5. 웰은 철저히 세척시켰다(200μL/웰)(총 25x).
a. 200μL 의 PBS/Tween 0.05%로 5번.
봉인되기 전 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 5분 동안.
이 단계는 4번 수행되었다.
b. 그 후 웰은 용출 단계로 진행시키키 전에 200μL의 PBS로 3번 세척시켰 다.
어프
-
레이트
(off-rate) 세척 조건
1. 150μL의 50-100μg/mL Gal10-His 또는 용해성 Gal10이 각 선택된 웰에 첨가되었다.
2. 플레이트는 하룻밤 동안 또는 2일까지 37°C에서 플랫폼 진탕기에서 450 rpm 진탕 시키면서 배양되었다.
3. 배양 시간 후에, 웰들은 200μL의 PBS로 5번 세척시켰다.
용출(elution)
1. PBS는 제거되었고 및 용출은 웰 당 150μL의 트립신(10 mg/mL)으로 수행되었다.
2. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 15분 동안 배양시켰다.
3. 이 배양 시간 후에, 150μL의 용출 용액이 각 웰에 7.5μL 의 AEBSF(트립신 억제제)를 함유하는 96 웰 V 바닥 플레이트의 해당하는 웰로 옮겨졌다. 그 후 이 용액은 트립신이 적절히 중화되도록 5번 혼합되었다(파이펫으로 위 및 아래로 하여).
감염(infection)/구출(rescue)
1. 300μL의 TG1 세포(OD 값 약 0.5)가 625μL 의 2TY 및 75μL 의 용출된 파지(트립신 용출 또는 경쟁적 용출)를 함유하는 50mL 튜브에 첨가되었다.
2. 이 튜브는 37° C에서 30분 동안, 진탕 없이 배양되었다.
3.이 배양 시간 끝에 10 mL의 LB/앰피실린/2% 글루코오즈가 TG1/파지를 함유하는 각 50mL 튜브에 첨가되었다.
4. 이 튜브는 그 후 37°C에서 진탕 시키면서(110 rpm) 하룻밤 동안 배양되었다.
스폿팅
(spotting)
1. 스폿팅을 위한 희석:
a. INPUT: 파지의 희석 시리즈가(INPUT) 스폿팅을 위하여 2TY에서 제조 되었다(LB 아가 플레이트).
12 포인트 희석 시리즈(1/10) 가 2TY(45μL 2TY에서 5μL 파지) (10 -1 에서 10-12 까지) 에서 제조되었다.
b. OUTPUT: 파지의 희석 시리즈가(OUTPUT) 스폿팅을 위하여 2TY에서 제 조되었다(LB 아가 플레이트).
6 포인트 희석 시리즈(1/10) 가 2TY(45 μL 2TY에서 5μL 파지)(10- 1 에서 10- 6 까지) 에서 제조되었다.
2. 그 후 50μL의 TG1 세포가(OD 값 약 0.5) 희석 플레이트(INPUT 및 OUTPUT) 에 있는 50 μL의 파지에 첨가되었다.
3. 이 플레이트는 봉인되었으며 및 37°C에서 30분 동안, 진탕 없이 배양되었다.
4. 5μL의 각 희석액(INPUT: 10-6 에서 10- 12 까지; OUTPUT: 10-1 에서 10-6까지) 이 건조된 페트리 디쉬(LB/앰피실린/글루코오즈) 에 스폿트 되었다.
3일:
1. 스폿팅 플레이트에서 단일 콜로니의 존재가 조절되었다.
2. 하룻밤 구출(overnight rescues) 의 글리세롤 스톡이 만들어졌다((저온유리병(cryovials)에 1mL 배양액 + 500μL의 60% 글리세롤, -80°C에서 저장됨)).
마스터 플레이트 제조:
1. 적절한 구출(rescue)로부터 희석 시리즈가 2TY에서 제조되었다.
6 포인트 희석 시리즈(1/10) 가 2TY(45 μL 2TY에서 5μL 파지)(10-1에서 10-6 까지) 에서 제조되었다.
2. 50μL의 선택된 희석액(10-3/10-4) 이 2% 글루코오즈 및 앰피실린(Ampicillin)을 포함한 고체 LB 아가(agar) 배지를 함유하는 페트리 디쉬에 옮겨졌다.
3. 유리 비드(glass beads)로 진탕하여 TG1 세포가 균질하게 분포되도록 하였다.
4. 비드는 제거되었으며, 및 페트리 디쉬는 37°C에서 하룻밤 동안 배양되었다.
항-
Gal10
리드(leads)(
Fab
)의 생산 및 정제
세포질 추출물의 생산
1일:
접종:
1. 마스터 플레이트가 37°C에서 진탕 시키면서(110 rpm) 배양되었다.
2. 37°C 에서 진탕 시키면서(110 rpm) 배양되기 전에 1 mL의 2TY/앰피실린/0.1% 글루코오즈가 V-형 바닥 96 깊은 웰 플레이트(96 Deep well plate)의 각 웰에 첨가되었다.
3. 그 후 마스터 플레이트로부터 10 μL의 박테리아가 1mL의 딥 웰 플레이트(Deep well plate) 배지에 첨가되었다.
4. 플레이트는 그 후 37°C 에서 진탕 시키면서(110 rpm) OD600 값이 약 0.8-1.0에 도달될 때까지(6-7 시간) 배양되었다.
생산의 유도(Induction of production)
1. scFv 또는 Fab의 생산을 유도하기 위하여, 웰당 100 μL의 IPTG(2TY 에 10 mM IPTG + 앰피실린; 웰에 최종 농도 = +/- 1 mM IPTG)가 첨가되었다.
2. 플레이트는 26°C에서 진탕 시키면서(110 rpm) 하룻밤 동안 배양되었다.
2일:
1. 하루 후에, 96-딥 웰 플레이트는 4800 g에서 4°C로 차갑게 한 원심분리기에서 15 분 동안 원심 분리시켜 박테리아를 침전시켰다.
2. 배지는 제거되었다(쏟아 붓고 및 종이 위에서 건조시켰다).
3. 플레이트는 봉인시키고 및 -20°C에서 하룻밤 동안 저장하였다.
3일:
1. 플레이트는 -20°C 에서 -80°C로 적어도 1시간 동안 옮겨졌다.
2. 박테리아 펠렛은 실온에서 30분 동안 녹였다.
3. 펠렛은 1분 동안 볼텍스되기(vortexed) 전에 웰 당 110μL의 PBS로 재현탁시켰다.
4. 플레이트는 90분 동안 실온에서 진탕기(900 rpm) 위에서 배양시켰다.
5. 이 배양 시간 후, 박테리아는 그 후 원심분리 시켰다(4800 g, 15분, 4°C).
6. 상등액(scFv 또는 Fab peri) 은 새로운 V-바닥 96 웰 플레이트로 옮겨졌다.
7. scFv 또는 Fab 클론을 함유하는 세포질 분획의 저장은 -20°C에서 수행되었다.
VH
및
VL
서열의 인간
Fab
백본에의
재클로닝
(
recloning
)
DNA 줄기(string) 디자인
1. Ab어라이너(AbAligner) 소프트웨어를 사용하여(버전 넘버 없이), VH 및 VL가 정렬 되었으며 및 가장 가까운 인간 생식계열 변이체외 비교되었다.
2. CDR 부위는(CDR1 전 +1 잔기 및 3) 이 생식계열 변이체의 FW 부위로 이식되었다.
3. 인간에서 생산을 위한 뉴클레오타이드 서열의 최적화는 진아트 툴(GeneArt® tools)(Life TechnologiesTM)로 수행되었다.
4. BsmBI 제한 효소 부위는 그 후 pUPEX 벡터에 재클로닝을 위하여 최적화된 아미노산 서열의 5' 및 3'에 첨가되었다.
5. 최종으로, DNA 줄기(DNA string)는 라이프 테크놀로지(Life TechnologiesTM)(Thermo Fisher ScientificTM) 에서 주문되었다.
DNA 줄기의 BsmBI으로 소화
1. 각 클론을 위하여, 200 ng의 VH 및 VL 가 BsmBI으로 탱고 버퍼(Tango Buffer) 10x에서 최종 부피 20μL에서 소화되었다.
2. 이 혼합물은 아래 표에 따라 제조되었으며 및 웰 당 10μL 이 PCR 플레이트에서 플레이트 레이아웃에 따라 배분되었다.
3. 그 후 PCR 플레이트는 37°C에서 2시간 동안 배양되었다((터머사이클러(Thermocycler)에서)).
표 28: PCR 사이클 조건
소화된 DNA의
PCR
정제(
PCR
clean-up)
소화된 줄기(string)의 정제는 뉴클레오스핀 겔(NucleoSpin Gel) 및 PCR-정제 키트(PCR Clean-up kit)에서 제공된 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 37°C에서 2시간 배양 후에, 80μL의 MQ 물이 각 소화된 DNA 줄기(string)에 첨가되었으며 및 200 μL의 NTI 버퍼가 PCR-정제 컬럼으로 옮겨지기 전에 첨가되었으며 및 11 000 g에서 1분 동안 원심분리 되었다.
2. 흘러나온 액(flow-through)은 버렸으며, 멤브레인을 씻기 위하여 700 μL의 NT3를 첨가하였으며 및 컬럼은 11 000 g에서 1분 동안 원심분리시켰다. 이 단계는 2번 수행되었다.
3. 흘러나온 액은 버렸으며 및 컬럼은 11 000 g에서 3분 동안 원심분리시켰다.
4. 최종으로,PCR 정제 컬럼은 1.5 mL 튜브에 옮겨졌으며 및 용출은 25μL의 따듯한 MQ 물(70°C)을 첨가하여 수행되었다.
5. 실온에서 배양 단계(1분) 후에, 컬럼은 11 000 g에서 1분 동안 원심분리시켰으며 및 용출된 DNA는 나노드롭(Nanodrop)(260 nm)으로 측정되었다.
소화된 DNA의 중쇄 및 경쇄 벡터와의 라이게이션
1. 소화된 VH/VL(BsmBI)는 다음에 삽입되었다:
a. VH에는 인간 CH1 도메인 BsmBI 소화된 벡터(pUPEX86).
b. VL에는 인간 람다 BsmBI 소화된 벡터(pUPEX116.9)
2. 라이게이션 혼합물(ligation mixture)은 하기의 표에 따라 1.5 mL 튜브에 1:5(벡터: 삽입)의 비율로 제조되었다.
표 29: 라이게이션(ligation) 조건
3. 라이게이션 혼합물은 실온에서 1시간 동안 배양되었다.
상위 10(Top 10) 경쟁력 있는 세포에의 형질전환
각 라이게이트 된 생산물의 상위 10 경쟁력 있는 세포에의 형질 전환은 열 충격(heat shock)을 통해 수행되었다.
1. 1시간 배양 후에, 라이게이션 혼합물은 얼음에 5분 동안 옮겨졌다.
2. 상위 10 경쟁력 있는 세포를 얼음 위에서 녹이고 및 40μL의 상위 10 세포가 15μL의 각 라이게이트된 생산물에 첨가되었다.
3. 이 튜브들은 얼음에 5분 동안 옮겨졌다.
4. 경쟁력 있는 상위 10 세포의 형질전환은 열 충격으로 수행되었다: 따듯한 수조에서 42°C로 90 초.
5. 튜브들은 그 후 1-2 분 동안 얼음 위에서 배양되었다.
6. 최종으로, 형질전환된 상위 10 세포는 2% 글루코오즈 및 앰피실린(벡터의 저항성 유전자)이 있는 고체 LB 배지를 함유하는 페트리 디쉬로 옮겨졌다.
7. 유리 비드로 진탕하여 균질한 세포 분배가 수행되었다.
8. 비드는 제거되었고, 및 페트리 디쉬는 37°C에서 하룻밤 동안 배양되었다.
콜로니
선택 및 서열분석
1. 하룻밤 배양 후에, 라이게이트된 생산물은 높은 수의 단일 박테리아 콜로니를 보였으며 반면에 대조군(빈 벡터)에서는 콜로니가 관찰되지 않거나/거의 없게 관찰되었다.
2. VH 또는 VL 당, 8개 단일 콜로니를 p10 팁(tip)으로 골랐으며 및 2% 글루코오즈 및 1/1000 앰피실린으로 보충된 LB 배지를 함유하는 평평한 바닥의 96 웰 플레이트로 옮겼다.
3. 플레이트는 숨 쉴 수 있는 봉인 테이프로 봉인되었으며 및 37°C 에서 120 rpm으로 5시간 동안 배양되었다.
4. 최종으로, 10 μL의 각 클론이 서열 분석 플레이트에 옮겨졌다(고체 LB배지 + 2% 글루코오즈 및 1/1000 앰피실린을 함유하는 96 웰 평평한 바닥 플레이트).
5. 서열 분석 플레이트는 LGC 지노믹스(LGC genomic)(프라이머 p90)로 보내졌다.
6. LGC 지노믹스로부터 얻어진 DNA 서열은 소프트웨어 클론 메너지 버전 n° 9(Clone Manager version n°9)로 분석되었다. 각 클론의 서열은 정렬되었으며 및 주문된 서열(ordered sequence)에 비교되었다.
7. 모체 서열(DNA string)과 비슷한 DNA 서열을 보이는 클론들이 선택되었다.
증폭 및
미디프랩
(
MidiPrep
):
1. 구조체(construct) 당, 20μL 배양액을 2% 글루코오즈 및 1/1000 앰피실린을 함유하는 10 mL LB배지에 정오 되기 전에 접종시켰다.
2. 이 배양액은 37°C, 120 rpm에서 배양되었다.
3. 저녁에, 이 배양액은 100 mL + 1/1000((글루코오즈는 미디프랩(Midiprep) DNA의 서열 분석을 방해할 수 있으므로, 글루코오즈 없이, 및 pUPEX 벡터는 글루코오즈를 필요로하지 않는다))로 옮겨졌다.
4.이 배양액은 37°C, 120 rpm에서 하룻밤 동안 배양되었다.
미디프랩(MidiPrep)은 키트에 제공된 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 110 mL 배양액이 원심분리로 펠렛화 되었다(4800 g, 4°C 에서 15분)
2. 상등액은 제거되었고, 펠렛은 RNAse 가 있는 8 mL의 RES 버퍼에 재현탁(볼텍스 및 파이펫팅).
3. 8mL의 LYS 버퍼가 첨가되었으며, 각 튜브는 용액이 완전히 파랗게 될 때까지 5번 꺼꾸로 하였고 및 실온에서 5분 동안 배양시켰다.
4. 8mL의 NEU 버퍼가 첨가되었으며 및 용액이 하얗게 될 때까지 혼합하였다.
5. 뉴클레온본드 엑스트라 미디(NucleonBond Xtra Midi) 컬럼 및 필터를 12 mL의 EQU 버퍼로 평형시켰다.
6. 박테리아 용액을 부드럽게 및 천천히 평형된 컬럼의 경계로 옮겼다.
7. 첫 번째 세척은 5 mL의 EQU 버퍼로 수행되었으며 및 전부 용출 후, 뉴클레온본드 엑스트라 컬럼 필터는 제거되었으며 및 두 번째 세척이 8mL의 WASH 버퍼로 수행되었다.
8. 컬럼은 그 후 50 mL 튜브로 옮겨졌으며 및 용출은 5 mL의 ELU 버퍼로 수행되었다.
9. DNA의 침전은 3.5 mL의 이소프로파놀(isopropanol)의 첨가로 수행되었다. 튜브는 볼텍스되었고(vortexed) 및 4800 g, 4°C에서 30분 동안 원심분리되었다.
10. 상등액은 제거되었고 및 2 mL의 70% 에탄올이 첨가되었다.
11. 튜브는 4800 g, 4°C에서 30분 동안 원심분리 되었다.
12. 상등액은 제거되었고, 및 펠렛은 상온에서 1시간 동안 건조되었다.
13. 최종으로, 100 μL 의 2XMQ 물이 재현탁된 펠렛에 첨가되었으며, 및 진탕 시키면서(900 rpm) 실온에서 30분 동안 배양시킨 후, DNA 농도는 나노드롭(Nanodrop)에서 측정되었다.
항-
갈랙틴
-10 클론의 생산
HEK293E
세포의 형질 감염
1일:
HEK293E 세포가 0.3E+06 세포 /mL로 심어졌다.
2일:
항-Gal10 클론 당, +/- 7.6 mL의 미리-따듯하게 한(37°C) 옵티맴(Optimem) 배지를 함유하는, 15mL 튜브가 제조되었다.
표 30: 형질 전환 조건
1. VH 및 VL의 미디프랩(MidiPrep) DNA가 1:3의 비율로 최종 100μg(25 μg VH + 75 μg VL)의 양으로 첨가되었다.
2. 최종으로, 300μg 의 PEI가 한 방울씩 튜브에 첨가되었으며 및 짧게 볼텍스되었다.
3. 배지/ DNA/PEI 혼합물이 200 mL HEK293E 배양액에 첨가되기 전에 실온에서 10분 동안 배양되었다.
4. 세포는 최종으로 배양기(37°C, 5% CO2, 120 rpm)에 다시 넣어졌다.
5. 형질 감염 후 4시간에, 미리-따듯하게 한(37°C) 1/20 Hypep 1510가 각 배양액에 첨가되었다.
6. 생산 후 6일에, 각 항-Gal10 클론의 모든 배지가 50mL 튜브에 모아졌다.
7. 이 튜브들은 1000 g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리 되었으며 및 상등액은 새로운 50mL 튜브에 옮겨졌다.
캡쳐
-
셀렉트
IgG
-CH1
비드
(Capture Select
IgG
-CH1 bead)를 사용한 생산된 항-Gal10
Fabs의
정제
생산된 Fabs의 정제는 캡쳐 셀렉트 IgG-CH1 비드(Capture Select IgG-CH1 bead)를 사용하여 수행되었다.
1일:
1. 캡쳐 설렉트 IgG-CH1 비드는 50 mL 튜브에서 PBS로 3번 세척하여 평형 시켰으며 및 50% 슬러리(slurry)가 PBS에서 만들어졌다.
2. 500 μL의 평형된 50% 슬러리 비드가 HEK 배양 상등액을 함유하는 50mL 튜브 당 첨가되었다.
3. 이 튜브들은 4°C 로터(rotor)(19 rpm)에서 하룻밤 동안 배양되었다.
2일:
1. 비드는 스핀다운(spun down) 시켰다(630 g, 2 분, 4°C, 가속=9, 감속=7)
2. 상등액은 새로운 50mL 튜브에 수집되었다.
3. 1 mL 1X PBS가 비드에 첨가되었고(활콘의 옆을 따라); 재-현탁되었고; 및 컬럼(100 mL 의 HEK 배양액 당 1 컬럼) 에 옮겨졌다.
4. 컬럼으로 옮겨지기 전에, 4mL의 1X PBS가 튜브를 세척하기 위하여 사용되었다.
5. 세척 단계는 두 번 반복되었다.
6. 컬럼은 5 mL의 1X PBS로 5번 세척되었다.
7. 세척 단계 동안에, 클론 당 세 개의 2mL 튜브가 준비되었으며 및 100 μL의 중화용액(neutralization solution)(1 M Tris pH 8)이 각 튜브에 첨가되었다.
8. 용출을 위하여, 컬럼은 2mL 튜브(중화 용액을 함유하는) 에 옮겨졌으며, 및 1mL의 용출 용액(0.1 M 글라이신 pH 3) 이 첨가 되었다. 용출이 완전히 된 후에, 컬럼은 다른 2mL 튜브로 옮겨졌으며 및 용출은 2번 반복되었다. 튜브는 적절히 혼합시켜 용출 용액이 잘 중화되도록 하였다.
9. 그 후 각 용출 분획의 단백질 농도는 나노드롭(280nm)을 사용하여 측정되었다.
10. 4mL을 아미콘 울트라-4 원심분리 필터(Amicon Ultra-4 centrifugal filter)에 로딩하여 버퍼 교환이 수행되었다. 그 후 컬럼은 4000 g, 4°C에서 15분 동안 원심분리 되었으며, 흘러-내린 액(flow-through) 은 버렸으며 및 위쪽 챔버에 5 mL의 1X PBS가 첨가되었다. 컬럼은 다시 원심분리 되었으며 및 5 mL 1X PBS로 총 5 번 세척되었다.
11. 단백질 농도는 그 후 나노드롭에서 측정되었으며 및 각 클론의 흡광 계수(extinction coefficient)로 보정하였다.
ELISA에 의한 항-
Gal10
분자의 스크리닝 및 결합의 성질규명 및
에피톱
비닝(
binning)
세포질 추출물의 결합성질의 스크리닝
결합 ELISA
1일
1. 맥시솝 플레이트가 웰당 100μL의 인간 Gal10-His(0.5 μg/mL, 1X PBS에 희석)로 코팅되었다.
2. 이 플레이트는 봉인 테이프로 봉인되었으며 및 4°C에서 하룻밤 동안 배양되었다.
2일:
1.다음날, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
2. 그 후 웰 당 300μL의 차단 버퍼((1X PBS 1% 카제인(Casein))가 첨가되었다.
3. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 2 시간 동안 배양되었다.
4. 이 배양 시간 동안, 세포질 마스터 플레이트(Periplasmic Master Plate, PMP) 플레이트로부터의 세포질 추출물이 마이크로플레이트 96 웰 U-바닥 플레이트에서 1X PBS-0.1% 카제인(Casein)으로 5에 1로 희석되었다.
5. 차단 용액으로 2시간 동안 배양 후에, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
6. 200μL 다채널 파이펫(multichannel pipett)으로, 웰 당 100μL 의 각 희석된 scFv-세포질 추출물이 희석 플레이트로부터 코팅된 플레이트로 옮겨졌다.
7. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 1시간 동안 배양되었다.
8. 이 배양 시간 동안 검출 항체가 충분한 부피의 1X PBS-0.1% 카제인(Casein)에서 검출 항체가 준비되었다(토끼 항-Myc HRP 접합된, 1/2000).
9. 1시간 배양 후에, 플레이트는 웰 당 300 μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
10. 200μL 다채널 파이펫(multichannel pipett)으로, 웰 당 100μL의 검출 항체가 코팅된 플레이트로 옮겨졌다.
11. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 1시간 동안 배양되었다.
12. 배양 시간 종료 15분 전에, TMB 용액이 실온에서 옮겨졌다.
13. 배양 후에, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
14. 200μL 다채널 파이펫(multichannel pipett)으로, 웰 당 100μL의 TMB가 첨가되었으며 및 웰 당 100μL 의 0.5M H2SO4 첨가로 반응이 멈춰지기 전에 450 rpm으로 진탕시키면서 15분 동안 배양시켰다.
15. 그 후 흡광도는 450 nm(참조는 620 nm)에서 테칸(Tecan) 기기 및 마게란 소프트웨어 버전 n° 7.2(Magellan software version n°7.2)로 측정되었다.
경쟁적 ELISA(
7B07에피톱에의
결합)
먼저, 맥시솝 플레이트가 7B07 hIG1로 코팅되었으며, 여기서 hGal10-His 가 포획되었다. 그 후, 1/5 희석으로 희석된 세포질 추출물이 첨가되었다. 검출은 토끼 항-Myc-HRP 항체로 수행되었다.
1일:
1. 맥시솝 플레이트가 웰 당 100μL의 7B07_hlgG1(3μg/mL, 1X PBS에 희석)로 코팅되었다.
2. 플레이트는 봉인되었으며 및 4°C에서 하룻밤 동안 배양되었다.
2일:
1. 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
2. 차단 단계는 웰 당 300μL의 1X PBS 1% 카제인(Casein)의 첨가로 수행되었다.
3. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 2시간 동안 배양되었다.
4. 이 배양시간 후에, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
5. 다음에는, 1 μg/mL의 인간 Gal10-His가 첨가되었다((웰 당 100μL, 1X PBS-0.1% 카제인(Casein)으로 희석)).
6. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 1시간 동안 배양되었다.
7. 이 배양 시간 동안, scFv / Fab 의 선택된 세포질 추출물이 마이크로플레이트 96 웰 U-바닥 플레이트에서 1X PBS-0.1% 카제인(Casein)으로 5에 1 희석으로 준비되었다
8. Gal10-His로 1시간 배양 후에, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
9. 그 후 200μL 다채널 파이펫(multichannel pipett)으로, 100μL의 각 세포질 추출물이 코팅된 플레이트에 첨가되었다.
10. 레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 1 시간 동안 배양되었다.
11. 이 배양 시간 후에, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5 번 세척시켰다.
12. 검출은 웰 당 1X PBS-0.1% 카제인에 희석된 100μL의 토끼 항-Myc HRP 접합체의 첨가를 통해 수행되었다.
13. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 1시간 동안 배양되었다.
14. 배양 시간 종료 15분 전에, TMB가 실온에서 옮겨졌다.
15. 그 후 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
16. 최종으로, 200μL 다채널 파이펫(multichannel pipett)으로, 웰 당 100μL의 TMB가 플레이트에 첨가되었다. 이 반응은 450 rpm으로 진탕 시키면서 5분 동안 진행되도록 하였으며, 및 웰 당 100μL 의 0.5M H2SO4 첨가로 반응이 멈춰 지기게 하였다.
17. 흡광도는 450 nm(참조는 620 nm)에서 테칸(Tecan) 기기로 측정되었다.
Fabs의
결합 특성의 스크리닝
에피톱 비닝(binning)
1 일:
1. 맥시솝 플레이트가 100μL의 인간 Gal10-His(1.25 μg/mL, 1X PBS에 희석)로 코팅되었다.
2. 이 플레이트는 봉인되었으며 및 4°C에서 하룻밤 동안 배양되었다.
2일:
1. 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
2. 차단 단계는 웰 당 300μL의 1X PBS 1% 카제인의 첨가로 수행되었다.
3. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 2시간 동안 배양되었다.
4. 이 배양 시간 동안, 선택된 Fabs의 희석은 마이크로플레이트 96 웰 U-바닥 플레이트에서 50μL의 1X PBS-0.1% 카제인으로 40μg/mL으로 준비되었다. 희석된 Fabs의 최종 농도는 20μg/mL일 것이다.
5. 차단 용액으로 2시간 배양 후에, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 3번 세척시켰다.
6. 200 μL 다채널 파이펫(multichannel pipett)으로, 50μL의 각 Fab 희석액이 희석 플레이트로부터 코팅된 플레이트로 옮겨졌다.
7. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 30분 동안 배양되었다.
8. 30분 후에, 400 ng/mL의 바이오티닐화된 클론(biotinylated clone) 7B07(hFab) 50μL이 각 웰에서 최종 농도200 ng/mL에 도달하도록 첨가되었다.
9. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 1시간 동안 배양되었다.
10. 이 배양 시간 후에, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
11. 그 후 검출은 100μL의 퍼옥시다제 스트렙타비딘(Peroxidase Streptavidin)(1X PBS-0.1% 카제인에 1/5000으로 희석된)으로 수행되었다.
12. 플레이트는 봉인되었고 및 플랫폼 진탕기에서 450 rpm으로 진탕 시키면서 실온에서 1시간 동안 배양되었다.
13. 배양 시간 종료 15분 전에, TMB가 실온에서 옮겨졌다.
14. 이 배양 시간 후에, 플레이트는 웰 당 300μL의 1X PBS-0.05% 투윈(Tween)으로 5번 세척시켰다.
15. 최종으로, 웰 당 100μL 의 TMB가 첨가되었다. 이 반응은, 웰 당 100μL의 0.5M H2SO4 첨가로 멈춰지기 전에, 450 rpm으로 진탕 시키면서 10분 동안 수행되었다.
16. 흡광도는 450 nm(참조는 620 nm)에서 테칸(Tecan) 기기 및 마게란 소프트웨어 버전 n°7.2(Magellan software version n°7.2)로 측정되었다.
OctetRed96을
통한
Fab
세포질 추출물의 결합 스크리닝
BLI 는 생물 분자의 상호작용을 측정하는 라벨-없는 기술이다. 이는 두 표면: 바이오센서 팁(biosensor tip)에 고정시킨 단백질 층, 및 내부 참조 층으로부터 반사되는 백색 광의 간섭 패턴(interference pattern)을 분석하는 광학적 분석기술이다. 바이오센서 팁에 결합한 분자 수의 어느 변화는 실시간으로 측정될 수 있는 간섭 패턴의 이동의 원인이 된다.
BLI Octet 스크리닝 어세이는 선택 단계 후에 세포질 추출물로서 생산된 Fabs의 결합 능력을 검사하는데 사용되었다.
1. 인간 Gal10-His 태그는 키네틱 버퍼(Kinetic Buffer)(200 μg/mL)에서 희석되었으며 및 포획 수준이 1nm에 도달될 때까지(로딩 단계, 30초) 항-펜타 His 1K 팁(Anti-Penta His 1K tips)에 포획되었다.
2. 세포질 추출물이 키네틱 버퍼에 1:5로 희석되었으며 및 120초 동안 적용되었으며(연합) 이어서 120초 동안 해리되었다.
3. 팁의 재생성은 글라이신 pH 1.5에서 10초의 세척 단계 2번으로 이루어졌다.
4. 센서 팁에 비-특이적인 세포질 추출물 결합을 평가하기 위하여, 참조 항-펜타 His 1K 팁(Anti-Penta His-1K tips)이 사용 되었다. 이 팁들은 상관없는 His 태그된 단백질((a-CD70 107B8-소르타제(sortase)-His D3 대조군))로 1nm 수준으로 코팅되었으며 및 세포질 추출물과 함께 배양시켰다.
5. Gal10-His에 대한 BLI 결합 분석은 25°C에서 옥테트레드 96(OctetRed 96)(ForteBio)을 사용하여 수행되었다.
6. 이중 참조 분석(Double Reference analysis)이 수행되었으며, 참조 팁 및 버퍼(Gal10-His 코팅된 팁에)에의 결합은 코팅된 팁으로 검출된 신호로부터 제거되었다.
7. 역학 계수(Kinetic parameters)들은 포르테바이오 데이터 분석(ForteBio Data analysis 9.0) 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델로((Y-축을 베이스라인에 정렬, 해리에 대하여 단계-간 교정(Inter-step correction), 사비트즈키-고레이 필터링(Savitzky-Golay Filtering), 커브 맞춤 국소/부분(Curve fitting Local/ Partial)) Fabs의 포획된 Gal10-His에의 결합에 맞추어 측정되었다. 1개 컬럼의 항-펜타 His-1K(Anti-Penta His-1K)이 PMP 당 사용되었으며 및 10번의 재생 사이클 후에 버려졌다는 것에 유의하여야 한다.
비아코아
3000에서 분자 항-
Gal10의
결합 성질규명
Gal10-His로 CM5 칩 코팅
세포질 추출물의 결합 성질을 결정하기 위하여, CM5 센서 칩이 2500-3000 RU 의 Gal10-His로 코팅되었다.
1. 코팅 재료는 아세테이트 pH 5.5에서 20μg/mL의 농도에서 버퍼 되었다.
2. Gal10-His는 그 후 EDC 및 NHS의 반응에 의해 CM5 칩 표면에 활성화된 NHS 에스터에 고정시켰다.
3. 타겟을 고정시킨 후에, 유리 NHS 에스터(free NHS esters)의 세척 및 탈활성화는 에탄올아민(ethanolamine)으로 수행되었다.
항- His 태그 항체로 CM5 칩의 코팅
비아코아 3000(Biacore 3000)에서 항-Gal10 구조물의 결합능력을 결정하기 위하여, 포획 접근 방법이 사용되었다. 이 목적으로 바이오레드(BioRad) 단일클론 생쥐 항-히스티딘 태그, 클론 AD1.1.1(Mouse Anti-Histidine Tag, Clone AD1.1.10), 가 CM5 칩의 4채널에 4000 RU의 최종 반응으로 아민 커플링을 통해 코팅되었다.
1. 코팅 재료는 아세테이트 pH 4.5에서 20μg/mL의 농도에서 버퍼 되었다.
2. 단일클론 mAb는 그 후 EDC 및 NHS의 반응에 의해 CM5 칩 표면에 활성화된 NHS 에스터에 고정시켰다.
3. 타겟을 고정시킨 후에, 유리 NHS 에스터의 세척 및 탈활성화는 에탄올아민(ethanolamine)으로 수행되었다.
scFv 세포질 추출물의 결합 성질의 스크리닝(어프-레이트 스크리닝)
세포질 추출물의 결합 성질 스크리닝을 위하여, 2600 RU Gal10-His로 코팅된 칩이 사용되었다.
1. -20°C에서 96 웰 플레이트에서 저장된 페리(peris)를 녹히고 및 새로운 둥근 바닥 96 웰 비아코아 플레이트에서 10μL의 페리(peri)를 40μL의 HBS-EP 러닝 버퍼(running buffer)에 첨가하여 1:5로 희석시켰다.
2. 프라이밍(priming), 정상화(normalization), 및 프라이밍(priming) 후에, 코팅된 CM5은 10μL HBS-EP 버퍼 pH 7.4의 4회 사이클로 러닝 버퍼에 평형 시켰다.
3. 5μL/분의 흐름 속도를 사용하여, 25μL의 희석된 세포질 추출물이 주사되었다.
4. 15분 후에, 새로운 샘플을 주사하기 전에, 6μL의 8 mM NaOH((흐름 속도 100 μL/분으로 빠른주사(Quickinject))를 주사하여 칩의 재생이 수행되었다.
5. 데이터 분석은 "BIA 평가(BIAevaluation)" 소프트웨어 버젼 n°4.1.1을 사용하여 2-1 및 4-3 공제로 수행되었다. 센서그램(sensorgram) 버퍼만이 참조로서 사용되었으며, 및 시그날이 제거되었다(Y-형질전환된). 최종으로, Gal10-His에 대한 클론의 친화력 및 어프-레이트(off-rate)를 결정하기 위하여 적응 모델(fitting model)이 사용되었다((Fit 역학 분리/ka/kd /해리/ 랑무어(Langmuir) 해리)).
Fabs의 결합 성질의 스크리닝(어프-레이트 스크리닝)
세포질 추출물 및 정제된 항-Gal10 분자의 결합 성질의 스크리닝을 위하여, 4000 RU 항-His 태그 항체로 코팅된 칩이 사용되었다.
1. 정제된 Fabs 가 다수의 농도로 희석되었다. 교정기(Calibrator) 및 QC 샘플(70%, 100%, 및 130%의 테스트 농도)이 포함 되었다.
2. 프라이밍(priming), 정상화(normalization), 및 프라이밍(priming)의 사이클 후에, 코팅된 CM5은 60 μL HBS-EP 버퍼 pH 7.4의 2회 사이클로 러닝 버퍼에 평형시켰다.
3. 첫 번째 단계로, Gal10-His 는 최종 포획 수준이 약 500 RU에 도달될 때까지 희석된 Gal10-His 20 μL의 주사("빠른 주사(Quick inject)", 흐름 속도는 30 μL/분으로 세트 되었다)를 통해 코팅된 CM5 칩의1 채널에 포획되었다.
4. 두 번째 단계로서, 인간 Fab 백본에서의 클론의 한 희석이 포획된 Gal10-His에 주사되었다((2 채널, 60 μL, "킨젝트(Kinject)")).
5. 100초의 해리 시간 후에, 8μL 의 10 mM Glycine-HCl pH 2.4의 한번 주사("Quickinject")로 칩의 재생이 수행되었다.
6. 데이터 분석은 "BIA 평가(BIAevaluation)" 소프트웨어 버젼 n° 4.1.1을 사용하여 Fc4-Fc3 또 Fc2-Fc12-1의 공제로 수행되었다. 센서그램의 정상화는 Gal10-His의 수준을 포획한 후에 수행되었다(약 20초). 센서그램(sensorgram) 버퍼만이 참조로서 사용되었으며, 및 시그날이 제거되었다((Y-형질전환된/커브-커브 2). 최종으로, Gal10-His 에 대한 클론의 친화력 및 어프-레이트(off-rate)를 결정하기 위하여 적응 모델(fitting model)이 사용되었다((Fit 역학 분리/ka/kd /해리/ 랑무어(Langmuir) 해리)). 최종으로, Gal10-His 에 대한 클론의 친화력 및 어프-레이트(off-rate)를 결정하기 위하여 질량 수송 효과(mass transport effect)를 가진 적응 모델(fitting model)이 사용되었다((Fit 역학 동시 ka/kd /질량 수송으로 결합/국소 Rmax(Local Rmax)).
인간 CLC 용해(저속 촬영)
1. 96-웰 플레이트의 외부 웰이 300μL PBS 버퍼로 채워졌다.
2. 증발을 피하기 위하여 플레이트의 가장자리에 충분한 진공 기름(vacuum grease)이 적용되었다.
3. 2μL 방울의 희석된 CLC 용액(PBS에 0.7 mg/mL)이 96-웰 플레이트에 스폿 되었다.
4. 다음에는, 투명한 플라스틱 커버 뚜껑이 플레이트 위에 놓여졌다.
5. 플레이트는 그 후 회전 디스크 공 초점 현미경(spinning disk confocal microscope)의 96 웰 플레이트 홀더(holder)에 놓였으며 및 웰 당 두 위치가 측정되었다.
6. 모든 위치가 선택된 후에, 플레이트는 홀더로부터 제거되었고, 뚜껑은 제거되었으며, 및 2 μL의 항체 용액이 웰에 있는 2μL 방울의 CLC에 첨가되었다. 대조군 병태으로서, 2μL 의 PBS 버퍼가 첨가되었다.
7. 각 Fab 병태는 재현을 확실히 하기 위하여 여러 번 이미지화 되었다.
8. 플레이트는 그 후 봉인되었고 및 현미경의 홀더에 다시 놓였다. 추가로, 플레이트는 스테이지에서 이동되지 않게 추가로 확실히 하기 위하여 접착테이프로 고정되었다. 그 후, 모든 위치는 다시 체크 되었고 및 개선되었다. 위치들은 소프트웨어로 메타데이터 출력으로 모아졌다.
9. 샘플들은 그 후 매 3-5 분마다 CSU-X1 요코가와 회전-디스크 헤드(CSU-X1 Yokogawa spinning-disk head)(Yokogawa Corporation) 및 플랜-아포크로메 10x 건조 대물렌즈(Plan-ApoChromat 10Х dry objective)(NA 0.30, DIC)가 있는, 자이스 엣시오캡 Mrm(Zeiss AxioCam Mrm)(Zeiss)으로 장치되어 있는 엑시오 옵져버 Z1(Axio Observer.Z1)(Zeiss)에서 이미지화되었다. 이미지는 3시간까지 동안 연속적으로 얻어졌다(전체 사이클은 대략 72초 걸린다).
10. 이미지 재현 및 데이터 분석은 이미지J(ImageJ)(NIH)로 수행되었다. 짧게는, 총 투사는 각 무더기에 대하여 만들어졌으며, 그 후 가장자리 여과가 한계점이 적용될 수 있는 포인트에 이미지에 적용되었다. 측정은 결정에 의해 점령되고 있는 전체적인 면적으로 계산하기 위하여 각 이미지에 대해 얻어졌으며, 및 데이터는 그 후 엑셀 파일(Excel file)에 보내졌으며 여기서 시간 포인트 0으로 정상화되었으며 및 시간의 함수로서 플럿트 되었다. 반복 샘플의 데이터는 통계분석을 위하여 함께 모아졌다. 전반적인 CLC의 크기는 시간에 따라 측정되었으며 및 그래파드 프리즘 7.01(GraphPad Prism 7.01)에 플롯트 되었다. 각 항체에 대한 EC50(50% 용해) 및 EC10(90% 용해) 값은, 비-선상 회귀((log(agonist) 대비 반응 변이 기울기(response Variable slope))(4개 계수))로 계산되었다.
인간 CLC 용해(저속 촬영)
1. 목적은 웰 당 1μg Gal10 존재하에서 1536-웰 고 함량 어세이(1536-well High Content assay)에서 14 항체 단편의 활성을 측정하는 것이었다.
2. 3.8 mg/mL Gal10을 20°C 에서 하룻밤 동안(16시간) 1.5 mL 튜브에서 38 μg/mL TEV 프로테아제와 배양시켰다.
3. 4 mg/mL Gal10이 30초 동안 볼텍스 되었고 및 PBS에 0.2 mg/mL로 희석시켜 30분 동안 포스트-볼텍스 되었다..
4. 어세이 대조군이 1536 플레이트에 첨가되었다: 1D11의 10포인트 시리즈 희석이 제조되었으며 및 1μL가 수동으로 1536-웰 플레이트에 첨가되었다(n=3). 1 μL 의 PBS 및 1D11(3 mg/mL)이 첨가되었다(n=64).
5. 항체들은 1.5 mg/mL로 희석되었으며 및 1μL가 1536-웰 플레이트로 옮겨졌다(n=4).
6. 5μL의 Gal10(총 1μg)이 대량 분배기(bulk dispenser)(BioTek MultiFlo)를 사용하여 플레이트에 있는 항체에 배포되었다.
7. 플레이트는 항체 첨가 후 2, 5, 7, 및 16시간에 이미지화되었다(InCell 2200).
이미지는 개별 결정을 검출하기 위하여 사내(in-house)에서 개발된 알고리즘을 사용하여 분획 되었으며 및 웰 당 총 결정이 계산되었다.
실시예 5: 추가의 온도 스트레스 안정성 연구 결과
모든 클론들은 2-8°C에서 48시간 동안까지 저장되었으며 및 샘플의 단백질 농도는 무균 조건하에서 원래의 제형 버퍼에서 10 mg/mL로 조정되었다. 클론들은 그 후 다른 온도 조건(+5°C, +25°C 및 +37°C)에서 4주 동안 저장되었으며 및 일주일 간격으로 안정성이 검사 되었다. 안정성은 몇 번의 동결 해동 사이클(1x, 5x 및 10x 사이클) 후 및 55°C 에서 80°C의 범위에 걸쳐 변성 온도 범위 내에서 열 스트레스(열 인내) 후에 검사되었다.
2.1 온도 스트레스 안정성 연구 결과
모습 및 육안 검사
두 명의 개인이 모든 시간-포인트 및 모든 온도 스트레스 조건에서 샘플의 안정성의 육안 검사를 진행하였다(1.5mL 투명한 유리 바이알에 채운 0.5mL). 전반적으로, 샘플들은 같은 육안 모습을 가졌다(표 31).
A: 가시적 입자 없음; B: 몇 가시적 입자(<5); F: 섬유
표 31: 온도 스트레스 검사시 클론들의 육안 검사 결과 개요.
탁도(Turbidity)
산란 및 응집의 정성적인 검출을 위하여, 입자는 두 개의 파장에서 스펙트로포토메터에서 흡광 스펙트라 획득에 의해 평가되었다. 결과는 모든 샘플에 대하여340nm 및 500nm에서 응집 지표(aggregation index)(A.I.)로서 표현되었다. A.I. 는 다음의 수식에 따라 측정되었다: A.I.340nm = A340nm /(A280nm - A340nm) 및 A.I.500nm = A500nm /(A280nm - A500nm).
각 샘플을 위해, 해당하는 버퍼, 음성 대조군(멸균, 여과된 mQ 물), 및 양성 대조군(상승된 응집체를 함유하는 것으로 알려진 단백질 샘플)이 또한 같은 스펙트로포토메트리적 분석이 되게 하였다. 제형 버퍼에 또는 적용된 어느 온도-스트레스 조건의 클론들 중과 비교하여 클론들 사이에 응집 지표에 관한 한 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다(표 32).
ND =측정되지 않았음
표 32. 다른 온도 스트레스 조건의 연구를 통한 클론들에서 얻어진 탁도 및 응집 지표 A.I.340 및 A.I. 500nm.
다이나믹
광 산란(dynamic light scattering)(DLS)에 의한 서브마이크론(submicron) 입자 검출
모든 클론 및 제형 샘플에 대하여 모든 저장 조건에 대하여 4-주 타임 포인트에서 DLS 분석이 수행되었다. 측정은 다이나프로 나노스타트(DynaPro Nanostart) 기기로 삼중 제제(triplicate preparations)에서 일어났다. 어느 스트레스도 적용되지 않은 대조군 샘플, 다른 스트레스 조건 하(T0에서 및 T4W에서)에서 4W 동안 유지된 샘플들이 나란히 분석되었다. 용액에서 서브마이크론 입자의 분포 프로파일을 모니터하기 위하여 퍼센트 질량, 분자의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius), 퍼센트 다분산성(polydispersity)(% PD) 및 다중분산 지표(polydispersion index)(PDI) 가 사용되었다.
제형 버퍼(formulation buffers)는 적용되는 저장 조건에, 여과 전 및 후(0.2μm), 적절하지 않았다. +25°C 및 +37°C에서 4W(T4W) 동안 저장된 앨리쿼트(aliquots)는 어느 후보로 적절하지 않았다. 추가로, 클론 20H09 및 23H09의 용액은 연구 시작(study start)(T0)에서 비-스트레스 샘플에서 적절하지 않았다. 모든 4 후보의 모든 샘플은 그러므로 여과되었고 및 재-분석되었다(삼중 측정). T4W에서 샘플의 DLS 프로파일은 상대적으로 비슷하고 및 강도에서 몇 가지 피크를 가졌으나 비-모노머적 종(non-monomeric species)은 퍼센트 질량 수가 제시하는 대로 일반적으로 무시할 만하다(표 33). 모든 후보자의 주된 피크의 반경은 그 단백질의 예상되는 크기와 일치한다. 샘플의 다분산성은 균질성의 표시이다. 다분산성은 각 클론의 복제 사이에 가변적인 동안, 전반적인 다분산성 스코어는 모든 샘플에서 입자의 좁은 크기 분포가 있음을 제시한다. 검사된 다른 저장 조건에서 여과-후 샘플의 대부분은 다양한 양태임이 발견되었으며, 이는 샘플에서 다양한 크기를 가진 입자의 존재를 제시한다. 클론 24F02-N53A로부터의 샘플은 가장 적은 다양한 양태의 산란인 경향이 있으며 이는 이들 샘플들은 좀 더 좁은 입자 크기 분포를 가졌음을 제시한다.
표 33: DLS 데이터 요약.
단백질 농도
단백질 농도는 온도-스트레스 된 샘플은 물론 동결-해동 스트레스 된 샘플에 대하여 280nm(나노드롭)에서 평가되었다(도 3). 널리는, 어느 저장 온도에서 검사된 어느 클론들 전체는 단백질 손실이 관찰되지 않았다.
+37°C 에서 4W 동안 저장된 클론 18C06에 대하여, 결과는 비전형적이다. 그러나, 비축 샘플로서 유지된(같은 시험적 조건하에서), 독립적인 앨리쿼트의 분석은, 그럼에도 불구하고 예상된 범위 내에서 측정되었다.
SPR에
의한 결합 활성
후보의 기능적 활성 농도는 그 후 비아코아 3000 기기에서 SPR에 의해 평가되었다(도 4). 모든 샘플들은 표준 자격 기준을 충족하는 방법 내에서 평가되었다. 앨리쿼트는 참조 샘플(T0, -80°C 저장)로부터의 적정 곡선(titration curves)에 대항하여 미리 정의된 검사 농도에서 및 참조 재료에 대한 70-130% 상대적 활성(relative activity)(% RA)의 범위를 커버하는 품질 관리(quality control)(QC) 샘플 존재하에서 검사되었다.
4개 후보자로부터의 대부분의 모든 온도-스트레스 된 샘플들은 이들의 저장되었던 조건에 관계없이 90% 이상의 상대적 활성을 유지하였다(도 4). 동결-해동 사이클 및 낮은 pH 에 있도록 한 샘플에서도 비슷한 관찰이 이루어졌다(도 4). 같은 조건하에서 취급되었던 같은 샘플의 독립적인 앨리쿼트의 검사가 90% RA 이상 유지하는 것으로 관찰되었더라도, 기록된 단지 비전형적인 결과는 +37°C 에서 4W 동안 저장된 클론 18C06 에서였다(도 4).
SE-
HPLC에
의한 크기 순도
SE-HPLC에 의한 순도가, 4차 펌프(quaternary pump), 자동 주입기(automatic injector), 언-라인 탈가스기(on-line degasser) 및 DAD 검출기(DAD detector), 컬럼 온도조절장치 부분(column thermo-stated compartment)(21°C), 및 6°C 로 세트 된 자동-샘플기(auto-sampler) 로 장치되어 있는 아질런트1260 인피니티II 크로마토그래픽 시스템(Agilent 1260 Infinity II chromatographic system)으로 평가되었다. 검출기는 크기 변이체를 모니터하기 위하여 파장 280nm 및 214nm로 동시에 세트 되었다. 샘플은 모든 저장 조건으로부터 및 모든 시간-포인트에서 분석되었다.
4개 클론으로부터의 모든 온도-스트레스 된, 동결-해동 및 낮은 pH 샘플들은 95% 보다 더 큰 순도를 가진 것으로 관찰되었다(도 5). 응집 및 분절 퍼센트는 온도-스트레스된 샘플 대부분이 1% 이하로 남아 있었다(도 5). 단지 예외는 클론 23H09 샘플이었으며, 이는 응집 형성에서 온도-유도된 증가를 보였다(도 5).
10회까지 동결-해동 사이클을 거치게 한 샘플들은, 모든 클론에서 참조 재료와 비교될만한 순도를 보였다(도 5). 낮은 pH 스트레스를 거친 샘플들에서는, 클론 23H09 샘플에서 미약한 응집이 검출되었다(도 5). 검사된 모든 다른 클론들은 낮은 pH 스트레스의 적용 후에 일부 분절을 보였다(도 5). 그러나, 모든 경우에서, 불순물의 퍼센트는 5% 미만으로 남아있었다(도 5).
모세관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis)(
cGE
)에 의한 순도
cGE에 의한 순도가 엑스퍼트 2100 바이오어날라이져 장치(Expert 2100 Bioanalyzer device)(Agilent)를 사용하여 랩-언-어-칩(lab-on-a-chip) 분석을 사용하여 평가되었다. 샘플들은 각 연구의 최종 시간-포인트에서 환원 및 비-환원 조건하에서 분석되었다.
다른 저장 조건들은, 클론 18C06을 제외하고, 클론들의 순도에 아무런 영향을 주지 않았다(도 6). 이 클론을 함유하는 샘플들은 비-환원 조건하에서 90% 이상의 주요 순도 피크를 보이지 않았다.(도 6). 이는 또한 클론 18C06를 함유하는 스트레스 없는 참조 샘플의 경우에서도 그렇다. 다른 세 개의 클론을 함유하는 나머지 샘플에서, 순도는, 이들이 거치는 저장 온도, 분석 시간-포인트 또는 동결-해동 사이클의 수(10회까지)와 무관하게 비-환원 조건에서 90%를 초과하였다(도 6). 환원 조건하에서, 검사된 모든 샘플들은 95% 이상의 순도를 보였다(도 6).
열 내성(
Thermotolerance
)
후보자들의 열 안정성을 평가하기 위하여, 클론들은 온도 범위 55-85°C에 걸쳐서 점차적 온도 분해 검사가 되도록 하였다. 이 스트레스를 적용한 후에, 몇 가지 변성 온도를 적용하도록 프로그램되어 있는 바이오메트라 서머사이클러(Biometra Thermocycler)에서, Gal10에 대한 50% 결합 활성이 없어지는 온도를 동정하기 위하여 스트레스 된 샘플들의 결합 활성이 비아코아(Biacore) 3000에서 평가되었다. 100% 결합 활성은 SPR에 의해 그 후 나란히 분석된 각 클론들의 비-스트레스 된 샘플에 기인한다. 모든 클론들의 샘플들은 상승 된 온도에서 50% 활성 손실을 보였다(표 34). 이 분석적 접근방법에 따라 동정 된 가장 안정적인 클론은 후보 24F02_N53A 이었으며, 이는 참조 클론 7B07_N53A와 함께, 융점 온도가 70°C 이상을 보였다.
표34: 선도 후보자(lead candidate) 들의 열 안정성 개요.
요약표
선택된 Fabs의 몇 가지 핵심 특징을 보여주는 표로 된 요약이 표 35에서 제공된다. 7B07_N53A Fab이 비교 및 참고 목적으로 포함된다.
선택된 Fabs의 다른 조건 하에서의 특성이 표로 된 요약이 표 36에서 제공된다. 동결 해동, 낮은 pH 및 열 스트레스 후 각 후보자들의 물리화학적 특성을 보여주는 표로된 요약이 표 37-40에서 제공된다.
NT: 검사되지 않은; L: 낮은 면역성 스코어
표 35: 선도 Fab 후보자의 특성
표36: 몇 가지 스트레스 후 4개 Fab 클론들의 특성 개요 : 결합 활성, CLCs에서의 생물학적 활성, CE-SDS(환원된 및 비-환원된) 및 SE-HPLC에 의한 순도, 번역 후 수정 및 DLS 및 FCM에 의한 입자평가
비교/참조를 위하여
1 샘플은 +37°C에서 4주 동안 유지되었던 앨리쿼트에 해당한다.
2샘플은 네블라이제이션 전에 +5°C 에서 4주 동안 유지되었던 앨리쿼트에 해당한다. 간략하게, 샘플들은 약물 용액을 흡입 가능한 에어로졸로 전환하는 에어로젠 솔로 액티브 바이브레이팅 메쉬 네블라이져(Aerogen Solo active vibrating mesh nebulizer)로 네블라이즈 되었다. 각 시간-포인트에 대하여 세 개의 다른 장치가 클론 당 사용되었으며 및 결과는 장치(네블라이져) 시리얼 번호(serial number)에 의해 보고되었다. 주어진 크기의 앨리쿼트에 대한 일상적인 네블라이제이션시간 보다 더 긴 것으로 제시되는, 장치 오염인 경우에는, 같은 유형의 여분의 장치가 세 개의 장치로 네블라이제이션을 완성하기 위하여 사용가능하다.
3 +37°C에서 4주 동안 저장 후에 이 샘플의 % RA는 두 개의 독립적인 샘플에서 82%(에팬도르프) 및 93%(유리 바이알)에서 측정되었다.
420H09 및 23H09에 대한 샘플들은 비-스트레스 된 앨리쿼트에 대해서도 필터 없이는 적절하지 않았다; 이 열에서의 정보는 모든 클론의 모든 유형의 샘플에서 필터 후에 결과를 보여준다.
(1) 낮은 pH 스트레스 검사는 0.1M 글라이신 pH 3.0으로 pH 3.7에 도달시켜 달성했으며 및 주위 온도 조건에서 2시간 유지된 단계 후에, 앨리쿼트는 1M Tris pH 8.0으로 중성으로 되돌려졌다.( 2) 하나의 앨리쿼트는 5회의 동결 해동 사이클을 거쳤으나 프로토콜 당으로서, 10회 동결 해동 앨리퉈트에 대해 비전형적인 결과가 얻어지지 않았으므로 이는 분석되지 않았다.
NT: 검사 되지 않았음; NA: 적용 가능하지 않음; ND: 검출되지 않았음.
표 37: Fab 클론 18C06에 대한 몇 가지 물리화학적 특성의 개요.
( 1) 낮은 pH 스트레스 검사는 0.1M 글라이신 pH 3.0으로 pH 3.7에 도달시켜 달성했으며 및 주위 온도 조건에서 2시간 유지된 단계 후에, 앨리쿼트는 1M Tris pH 8.0으로 중성으로 되돌려졌다.( 2) 하나의 앨리쿼트는 5회의 동결 해동 사이클을 거쳤으나 프로토콜 당으로서, 10회 동결 해동 앨리퉈트에 대해 비전형적인 결과가 얻어지지 않았으므로 이는 분석되지 않았다.
NT: 검사 되지 않았음; NA: 적용 가능하지 않음; ND: 검출되지 않았음.
표 38: Fab 클론 20H09 에 대한 몇 가지 물리화학적 특성의 개요.
(1) 낮은 pH 스트레스 검사는 0.1M 글라이신 pH 3.0으로 pH 3.7에 도달시켜 달성했으며 및 주위 온도 조건에서 2시간 유지된 단계 후에, 앨리쿼트는 1M Tris pH 8.0으로 중성으로 되돌려졌다.
(2) 하나의 앨리쿼트는 5회의 동결 해동 사이클을 거쳤으나 프로토콜 당으로서, 10회 동결 해동 앨리퉈트에 대해 비전형적인 결과가 얻어지지 않았으므로 이는 분석되지 않았다.
NT: 검사 되지 않았음; NA: 적용 가능하지 않음; ND: 검출되지 않았음.
표39: Fab 클론 23H09 에 대한 몇 가지 물리화학적 특성의 개요.
(1) 낮은 pH 스트레스 검사는 0.1M 글라이신 pH 3.0 로 pH 3.7에 도달시켜 달성했으며 및 주위 온도 조건에서 2시간 유지된 단계 후에, 앨리쿼트는 1M Tris pH 8.0으로 중성으로 되돌려졌다.
( 2) 하나의 앨리쿼트는 5회의 동결 해동 사이클을 거쳤으나 프로토콜 당으로서, 10회 동결 해동 앨리퉈트에 대해 비전형적인 결과가 얻어지지 않았으므로 이는 분석되지 않았다.
NT: 검사 되지 않았음; NA: 적용 가능하지 않음; ND: 검출되지 않았음.
표 40: Fab 클론 24F02_N53A에 대한 몇 가지 물리화학적 특성의 개요.
실시예 6: 번역 후 수정(Post Translational Modification)(
PTM
) 분석
클론의 구조적 성질 규명은 몇 가지 분석적인 기술을 사용하여((icIEF, 온라인-제염 MS(online-desalting MS), 환원된 단백질에 대한 RPLC-UV-MS, 트립틱 소화(tryptic digestion)후에 RPLC-MS를 사용한 펩티드 맵)) 단백질 및 펩티드 수준에서 수행되었다. 클론들은 이들이 다른 온도(+5°C, +25°C, +37°C) 에서 4W 동안 저장, +5°C 에서 사전(T0) 및 4W 후 네블리제이션, 및 낮은 pH 단계에 유지(2h/pH 3.7)를 포함하는 몇 가지 스트레스 조건에 있도록 한 후에 PTMs에 대해 분석되었다. 모든 경우에서, 분석은 각 클론에 대하여 대조군 비스트레스 된 참조 재료와 나란히 수행되었다.
결과는 다음과 같이 요약될 수 있다.
1. 4개의 클론의 아미노산 서열은, 각 온전한 Fab(LC 및 VH+CH1)의 분자량에 기반을 두어, 단백질 수준에서 확인되었으며 반면에 펩티드 서열 커버리지는 100%이었다.
2. Fabs의 스트레스 전 및 후에 구조적 온전성은 변하지 않고 유지되었으며 및 예상되는 이황화 브리지(disulfide bridge)의 존재((인터- 및 인트라-체인(inter- and intra-chain))를 보여주고 및 확인한 온전한 단백질 및 펩티드 맵핑 분석으로 확인되었다. 단지 18C06(참조를 포함한 모든 샘플)만이 VH+CH1 부분과의 예상되는 브리지 대신에 LC에 유리 시스테인을 가진 것으로 검출되었으며 및 대신, LC에서 가깝게 위치한 두 개의 시스테인 사이에 대안적인 이황화 브리지의 형성이 검출되었다.
3. +37°C 저장 후 파이로글루타믹 에시드(pyroglutamic acid)의 총 증가(8.5-10.5%)와 함께 및 +25°C 저장 후에 존재하나 덜 확연한(2.0-3.5%) 분명히 온도-유도되는 스트레스된 클론의 공통 VH+CH1 부분에서 N-말단 고리화가 검출되었으며; VH+CH1에서 이 수정은 낮은 pH 또는 네불라이즈된 샘플에서는 동정 되지 않았다. 추가로, g18C06에서는, 네블라이제이션 후에 LC는 전적으로 사이클화된 것으로 발견되었다.
4. 모든 다른 스트레스 조건에서 산화는 모든 클론에 대하여 <1%로 남아있었다.
5. 이성질화(isomerization) 및 탈아미드화(deamidation)와 같은 위치-특이적인 사건은 모든 클론에서 낮은 pH 스트레스 또는 네블라이제이션(nebulization) 후에 일반적으로 영향을 받지 않게 남아있었다.
6. 온도-스트레스 된 샘플에서, 클론 18C06은 LC 체인의 한 가변 부위에서 온도-민감한 탈아미드화를 보였다(+37°C에서 4주 후 14.7%). 상승된 온도에서 모든 전-선도 후보자(pre-lead candidate) 사이에 공유되는 VH+CH1 펩티드에서 두 개의 중간 정도의 탈아미드화 스폿이 검출되었다(각 5%까지). 이성질화에서는 g20H09, g23H09에서 제한적인 이성질화 증가가지고 및 g24F02에서 덜한 증가를 가진 LC 체인의 한 스폿이 검출되었다. 구조체 사이에서 공유하는, LC의 두 번째 펩티드는 또한 이성질화에서 작은 증가와 연관되었다(1.3%까지).
1 볼드체 글자는 CDR 부위를 제시한다.
2 클론 18C06는 공통의 LC를 공유하는 클론 20H09, 23H09 및 24F2_N53A 보다 다른 LC 를 가져온다.
표 41: +37°C 에서 4주 동안 저장 후 클론에서 관찰된 주요 번역 후 수정
실시예 7: 결정 용해 어세이 결과
모든 클론들은 시험관에서 GAL10 결정을 용해하는 이들의 능력에 대해 평가되었다.
간략하게, 결정 용해 어세이(crystal dissolution assay)(CDA)가 개발되었으며 및 네블라이제이션을 포함하는 몇 가지 스트레스 조건의 적용 전 및 후에 클론들의 생물학적 활성을 평가하기 위하여 표준화되었다. 이 연구의 목적은 만약 저장 전/후 네블라이제이션이 클론의(바이오) 활성에 영향을 줄 수 있어 Gal10 결정을 용해하는 이들의 능력의 손실을 초래하는지를 평가하는 것이다.
모든 클론에 대하여, 분석은 적절한 어세이 대조군의 존재와 함께 두 개의 독립적인 실험에서 수행되었다. 간략하게, 샘플들은 약물 용액을 흡입 가능한 에어로졸로 전환하는 에어로젠 솔로 액티브 바이브레이팅 메쉬 네블라이져(Aerogen Solo active vibrating mesh nebulizer)로 네블라이즈 되었다. 한 클론 당 각 시간-포인트에 대해 세 개의 다른 장치가 사용되었으며 및 결과는 장치(네블라이져) 시리얼 번호로 보고되었다. 각 주어진 크기의 앨리쿼트에 대해 일상적인 네블라이제이션 시간보다 더 긴 것으로 제시되는, 장치 오염인 경우에는, 같은 유형의 여분의 장치가 세 개의 반복 장치로 네블라이제이션을 완성하기 위하여 사용 가능하다. 세 개의 반복 장치를 가진 네블라이즈된 후보자에 대해, 하나의 공통 장치로부터의 에어로졸화된 단백질은 8-농도 포인트 곡선(Solo #0125)으로서 분석되었으며 및 나머지 두 개는 사전 선택된. 고정된 농도에서, 항상 두 독립적인 어세이로 분석되었다. +5°C, +25°C 및 +37°C에서 4주 저장 후의 샘플들은 모든 클론에 대하여 8-농도 포인트 커브로서 분석되었다. 여기에 보여준 결과들은 GAL10 결정의 크기 분포가 10μm보다 더 큰(10-15 μm) 어세이로부터 취했다.
도 7은 GAL10 결정을 용해하기 위한 4개 클론 중 하나를 함유하는 스트레스 되지 않은 샘플의 강도를 보여준다. 모든 클론들은 그 후 이들이 저장 후 및/또는 네블라이제이션 후, 저장-전 및 후에 이 강도를 보존할 수 있는지 아닌지를 평가하기 위하여 이들이 상기 서술된 스트레스 조건을 지난 후의 강도에 대해 검사되었다(도 8). 클론들 18C06, 20H09 및 23H09는 첫 번째 세트의 어세이에서 동시에 검사되었으며(도 8) 및 클론 24F02_N53A는 두 번째 세트의 어세이에서 클론 23H09과 나란히 검사되었다(도 9). 클론 7B07_N53A는 첫 번째 세트의 어세이에서 비교측정기로서 검사되었다.
모든 클론들은 샘플에 적용된 스트레스 요인(stressor)과는 상관없이 분석하는 동안 내내 GAL10 결정을 전부 용해 시킬 수 있었다(도 7-9). 따라서, 클론들의 추가 분석은 클론들 사이에 강도의 차이가 관찰 가능한 5시간까지의 가장 초기의 시간-포인트에 주로 초점을 두었다.
어세이에 따라, 23H09 및 24F02_N53A가 4개 클론 중에서 가장 강력한 분자이었다(도 9). 모든 독립적인 런(runs)에서, 및 검사된 GAL10 결정의 크기 분포와 상관없이, 클론 24F02_N53A는 시험관에서 GAL10 결정을 용해하는 이의 능력 면에서 좀 더 강력하였다. 트레스되지 않은 재료에 비교하였을 때 온도 또는 네블리제이션 스트레스는 용해하는 이의 능력에 영향을 끼치지 않았다(도 9). 상기 어세이에 기반하여, 후보자는 가장 큰 강도에서 가장 낮은 강도로 순위가 매겨졌다.
ㆍg24F02_N53 ~g23H09 > g20C06 > g18C06
실시예 8: 후보 클론의 면역성
인 실리코(in silico ) 평가 및 세포에 기반을 둔 시험관 내 평가를 포함하는, 론자 에피베이스(Lonza Epibase®)를 사용하여 모든 클론의 엔도톡신-없는(Endotoxin-free) 재료의 면역원성 위험도에 대해 평가되었다. 간략하게, 인 실리코 평가는, 영향을 받을 수 있는 동종이형인자(allotype) 및 HLA-DRB1 스코어 측정에 의한 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)를 포함하는, 잠재적인 면역원성 에피톱에 대한 클론의 아미노산 서열을 스크린 하기 위한 알고리즘을 사용하였다. 어세이는 세계 인구집단 빈도 다음으로 이들 동종이형인자(allotypes)를 스크린 하였다(도 10). 면역원성 스코어에 기반을 두어, 클론들은 가장 적은 면역원성으로부터 가장 큰 면역원성으로 순위가 매겨졌다.
ㆍg24F02_N53 < [g23H09, g18C06] < g20H09
이 결과들은 론자 에피베이스(Lonza Epibase®) 시험관 내 어세이로 확인되었다. 간략하게, 후보들은 31명의 건강한 공여자로부터의 PBMCs 에서 유도된 T-세포 반응에 대해 평가되었다. 스크리닝은 원하지 않는 면역 반응 위험으로서 T-세포 반응을 일으키는 공여자의 수(도 11), 및 검사 인구 집단에 대비 크기(도 12) 를 결정하기 위하여, 자극된 IFNγ 및 IL-5 세포의 검출시 및 계산시 평가되었다. 이 연구에서 사용된 양성 대조군은 클론 KLH 이었다(도 11).
모든 검사된 클론들은 면역 반응을 유도하는데 낮은 능력을 보였다. 4 클론들 중에서, IFNγ 반응 면에서, 클론 23H09 및 18C06이 가장 높은 빈도를 보였으며 반면에 IL-5 반응 면에서는, 클론 18C06 및 20H09가 가장 높은 빈도를 보였다. 모든 경우 및 모든 통계학적 접근 방법에서, 클론 g24F02_N53A는 원하지 않는 T-세포 반응을 유도하기가 가장 낮을 것으로 간주 되었고 및 그러므로, 이 클론은 가장 낮은 면역원성의 위험도를 가진 것으로 간주 된다.
실시예들로부터의 결론
상세히 연구된 클론들 중에서, 생식세포계열 Fab 클론 24F02_N53A는 가장 전망이 좋은 클론으로 간주 된다. 그 이유는:
·샘플이 상승된 저장 온도, 다수 사이클의 동결-해동을 거치고, 낮은 pH 조건을 거친 후에도 안정하게 남아있고;
·갈랙틴-10에 강한 결합을 보였고
·시험관 내에서 재조합 Gal10 결정을 빨리 용해할 수 있었고;
·게먹이원숭이(cynomolgus monkey) Gal10과 교차-반응하였고;
·인간에서 낮은 면역원성 위험성을 가진 것으로 예측되었고; 및
·이 클론의 안정성 및 결합 특성은 네블리제이션에 의해 영향을 받지 않았기 때문이다.
표 42:
갈랙틴
-10에 결합하는
Fab
항체의
VH
및
VL
서열
표 43:
갈랙틴
-10에 결합하는
Fab
항체의
중쇄
CDR
서열
표 44:
갈랙틴
-10에 결합하는
Fab
항체의
경쇄
CDR
서열
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Claims (23)
- 갈랙틴-10 에 결합하는 항체 또는 항원 결합하는 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합하는 단편은 가변 중쇄 도메인(VH domain) 및 가변 경쇄 도메인(VL domain)을 포함하고,
여기서:
(i)VH 도메인은 서열번호 2를 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR3; 서열번호 3을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR2; 서열번호 1을 포함하거나 또는 이로 구성된 HCDR1 서열의 CDR 서열을 포함하고;
(ii)VL 도메인은 서열번호 8을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR3; 서열번호 9를 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR2; 서열번호 7을 포함하거나 또는 이로 구성된 LCDR1 서열의 CDR 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서,
(i)VH 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 및
(ii)VL 도메인이 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 이것과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
(i)VH 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고;
(ii)VL 도메인이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항원 결합 단편이 단일 사슬 항체(scFv); F(ab')2 단편; Fab 단편; Fd 단편; Fv 단편; 단일-팔(단가) 항체; 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 그러한 항원 결합 단편의 조합, 집합 또는 접합에 의해 형성된 임의의 항원 결합 분자로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 항원 결합 단편.
- 제4항에 있어서,
상기 항원 결합 단편이 Fab 단편인, 항체 또는 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이의 VH 및/또는 VL 도메인을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들.
- 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템(cell-free expression system)에서 항체, 항원 결합 단편, 가변 중쇄 도메인 또는 가변 경쇄 도메인의 발현을 가능하게 하는 조절 서열에 작동가능 하게 연결된 제6항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 벡터.
- 제7항의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템.
- 제1항 내지 제5항의 재조합 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서,
상기 방법은 제8항의 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계 및 발현된 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 약제(medicament)로 사용을 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 제10항에 따른 약제학적 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 약제학적 조성물이 갈랙틴-10 결정의 존재 또는 형성과 연관된 질환 또는 병태(condition)를 예방 또는 치료하기 위하여 투여되는, 항체 또는 항원 결합 단편.
- 제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 항체, 항원 결합 단편, 또는 약제학적 조성물이: 천식(asthma); 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis); 소아지방변증(celiac disease); 기생충감염(helminth infection); 위장관 호산구 염증(gastrointestinal eosinophilic inflammation); 낭포성 섬유종(cystic fibrosis, CF); 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA); 척-스트라우스 맥관염(Churg-Straus vasculitis); 만성 호산구 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 및 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위하여 투여되는, 용도.
- 제13항에 있어서,
싱기 질환 또는 병태가 천식(asthma)인, 항체 또는 항원 결합 단편.
- 제13항에 있어서,
상기 질환 또는 병태가 낭포성 섬유종(cystic fibrosis) 인, 항체 또는 항원 결합 단편.
- 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 제10항에 따른 약제학적 조성물의 치료적으로 유효한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 항체, 항원 결합 단편, 또는 약제학적 조성물이 갈랙틴-10 결정의 존재 또는 형성과 연관된 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위해 투여되는, 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서,
상기 항체, 항원 결합 단편, 또는 약제학적 조성물이 천식(asthma); 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis); 소아지방변증(celiac disease); 기생충감염(helminth infection); 위장관 호산구 염증(gastrointestinal eosinophilic inflammation); 낭포성 섬유종(cystic fibrosis, CF); 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA); 척-스트라우스 맥관염(Churg-Straus vasculitis); 만성 호산구 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 및 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위하여 투여되는, 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 질환 또는 병태가 천식(asthma) 인, 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 질환 또는 병태가 낭포성 섬유종(cystic fibrosis) 인, 방법.
- 환자로부터 얻은 샘플에서 갈랙틴-10의 검출을 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의, 용도.
- 제21항에 있어서,
상기 환자 샘플이 점액(mucus) 샘플 또는 객담(sputum) 샘플인, 용도.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 키트.
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