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KR20240099441A - 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제 및 그 용도 - Google Patents

2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제 및 그 용도 Download PDF

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KR20240099441A
KR20240099441A KR1020247018911A KR20247018911A KR20240099441A KR 20240099441 A KR20240099441 A KR 20240099441A KR 1020247018911 A KR1020247018911 A KR 1020247018911A KR 20247018911 A KR20247018911 A KR 20247018911A KR 20240099441 A KR20240099441 A KR 20240099441A
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nucleic acid
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double
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melting temperature
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아미 다치바나
도모아키 우치키
미노루 다케우치
요코 데루우치
고지 와타나베
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니토 보세키 가부시기가이샤
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Abstract

종래 기술에 있어서의 문제에 대처할 수 있는, 신규한 이중 사슬 핵산의 융해 온도 (Tm) 의 상승화제, 이중 사슬 핵산의 미스매치 혹은 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하는 방법, 및 이들 방법을 실시하는 키트를 제공한다. 특정한 카티온성 구성 단위 (1) 과, 특정한 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는 양쪽성 공중합체를 포함하는, 이중 사슬 핵산의 융해 온도 상승화제, 이것을 사용하는 핵산 미스매치의 검출 방법 및 시료 핵산의 기준 핵산에 대한 변이의 검출 방법, 그리고 이것을 포함하는, 핵산 미스매치 검출 키트 및 변이 검출 키트.

Description

2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제 및 그 용도
본 발명은, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 상승화제, 이것을 사용하여 2 본쇄 핵산에 있어서의 미스매치 혹은 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하는 방법 및 이것을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 특정한 구조를 갖는 양쪽성 공중합체를 포함하는 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 상승화제, 이것을 사용하여 2 본쇄 핵산에 있어서의 미스매치 혹은 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하는 방법 및 이것을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다.
특정한 세균이나 바이러스를 동정하거나, 인간의 질환 이환 용이성이나 약제 반응성 등을 판정하거나 하기 위해, 게놈 핵산 중의 변이를 검출하는 것이 널리 실시되고, 최근에는, 게놈 핵산의 1 염기의 변이를, 정확, 신속, 및 저비용으로 검출할 수 있을 것이 요구되게 되었다.
게놈 핵산의 변이를 검출하는 방법으로서, 다양한 방법이 개발되어 있으며, 예를 들어, 기준 핵산과 그 상보 사슬로 이루어지는 2 본쇄 핵산을 시료 핵산과 공존시키고, 상보 사슬이 시료 핵산과 치환되는 속도 또는 비율을 측정함으로써, 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 미스매치를 검출하는 방법이 제안되어 있다 (특허문헌 1 내지 3). 이 방법에서는, 폴리리신이나 폴리아르기닌 등의 카티온성 고분자를 주사슬로 하고, 덱스트란이나 폴리에틸렌글리콜 등을 측사슬로 하여 그래프트 중합시킨 폴리머를 첨가함으로써, 상보 사슬이 시료 핵산과 치환되는 속도를 촉진시켜 검출 감도를 높이고 있으며, 1 염기의 미스매치여도 검출할 수 있다고 되어 있다. 그러나, 이 방법은, 상보 사슬의 시료 핵산으로의 치환을 FRET 법으로 검출하는 것이며, 기준 핵산 및 상보 사슬을 형광 색소로 표지해 두는 것이 필요해지기 때문에, 이것을 불필요하게 할 수 있으면 보다 편리하다.
FRET 법 등과 같이 형광 색소로 표지한 핵산을 사용하지 않고 게놈 핵산의 변이를 검출 가능한 방법으로는, 융해 온도 (Tm) 를 이용하여 2 본쇄 핵산의 미스매치를 검출하는 방법이 있다.
융해 온도 (Tm) 는, 2 본쇄 핵산의 50 ％ 가 1 본쇄로 변성되는 온도를 말하며, 상보적인 관계에 있는 풀 매치 2 본쇄에 비해, 상보적인 관계에 없는 미스매치 2 본쇄에서는, 융해 온도 (Tm) 가 낮아진다. 이 때문에, 이 현상을 이용하여, 시료 핵산의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하거나, 이 현상에 의해 발생하는 핵산 증폭 효율의 차를 통하여 표적 서열을 검출하거나 할 수 있다. 단, 1 염기의 미스매치에 의해 발생하는 융해 온도 (Tm) 의 변화는 1 ∼ 3 ℃ 정도라고 되어 있어, 융해 온도 (Tm) 를 이용하여 게놈 핵산 중의 극히 근소한 변이를 검출하려면, 감도를 높이는 연구가 필요해진다.
이 점에 대해, 융해 곡선을 해석하여 근소한 변이를 검출 가능하게 하는 방법이 이루어지고 있다 (특허문헌 4 및 5). 그러나, 이들 방법에서는, 엄밀한 온도 제어가 필요하기 때문에 고정밀도의 항온 장치가 필요해져, 실용상 보다 간편한 방법이 요망된다.
또, 상기 서술한 특허문헌 1 에서는, 상기 카티온성 폴리머의 존재하 및 비존재하에서, 1 염기의 미스매치를 갖는 20 mer 2 본쇄 핵산, 및 풀 매치의 20 mer 2 본쇄 핵산의 Tm 값이 측정되고, 각각의 카티온성 고분자 폴리머의 존재에 따른 Tm 상승값이 개시되어 있다. 유감스럽게도, 미스매치의 2 본쇄 핵산과 풀 매치의 2 본쇄 핵산에서, 카티온성 폴리머의 존재에 따른 Tm 상승값은 모두 15 ℃ 정도로서, 양자에 유의한 차는 없다.
국제공개 제03/018841 A1호 팸플릿 일본 공개특허공보 2001-78769호 일본 공개특허공보 2008-278779호 일본 공개특허공보 2005-58107호 일본 공개특허공보 2003-528626호 국제공개 2016/167320 A1호 팸플릿 일본 특허 제6242336호 일본 특허 제5813263호 일본 특허 제4731324호 일본 특허 제4383178호 일본 특허 제5030998호 일본 특허 제4151751호 일본 공개특허공보 제2001-89496호 국제공개 제2003/068795호 팸플릿 국제공개 제2005/021570호 팸플릿 일본 특허 제3756313호
본 발명은, 이상과 같은 종래 기술에 있어서의 문제에 대처할 수 있는, 신규한 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 의 상승화제, 2 본쇄 핵산의 미스매치 혹은 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하는 방법, 및 이들 방법을 실시하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 특정한 카티온성 구성 단위 (1) 과, 특정한 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는 양쪽성 공중합체 (이하,「특정 양쪽성 공중합체」라고 약칭하는 경우가 있다) 를 핵산 용액에 첨가하면, 상보적인 관계에 있는 풀 매치의 2 본쇄 핵산에 있어서의 특정 양쪽성 공중합체의 존재에 따른 Tm 상승값과, 상보적인 관계에 없는 미스매치의 2 본쇄 핵산에 있어서의 특정 양쪽성 공중합체의 존재에 따른 Tm 상승값의 차가 확대되고, 이로써 1 염기 레벨에서도 미스매치를 검출 가능한 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 융해 온도 상승화제, 핵산 미스매치의 검출 방법, 시료 핵산의 기준 핵산에 대한 변이의 검출 방법, 핵산 미스매치 검출 키트 및 변이 검출 키트를 제공하는 것이다.
[1] 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제로서,
일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중, R1 은 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1),
일반식 (I-c) 혹은 일반식 (I-d)
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기이고, Xa- 는 카운터 이온을 나타내고, a 는 그 카운터 이온의 가수를 나타낸다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (1-2),
일반식 (1-e)
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기, 또는 탄소수 5 ∼ 6 의 시클로알킬기를 나타낸다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-3), 그리고
일반식 (1-f)
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중 R6 은 수소 원자 또는 메틸기, R7 및 R8 은 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 4 의 알킬기를 나타내고, n 은 2 ∼ 4 의 정수이다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 카티온성 구성 단위 (1) 과,
일반식 (II-a)
[화학식 5]
Figure pct00005
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-1),
일반식 (II-b)
[화학식 6]
Figure pct00006
(식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-2),
일반식 (II-c)
[화학식 7]
Figure pct00007
(식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-3), 그리고,
일반식 (II-d)
[화학식 8]
Figure pct00008
(식 중 R10 은, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는 양쪽성 공중합체를 포함하는, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제.
[2] 상기 카티온성 구성 단위 (1) 이, 구성 단위 (1-1) 및 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군에서 선택되고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 가, 구성 단위 (2-1) 및 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는, [1] 에 기재된 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제.
[3] 상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [1] 또는 [2] 에 기재된 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제.
[4] 시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치의 검출 방법으로서,
(1) [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재하는 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기 프로브 핵산과 상기 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 측정하고, 상기 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 프로브 핵산과, 상기 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 융해 온도의 상승값 (기준 ΔTm) 을 결정하는 공정과,
(2) [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기 시료 핵산과 상기 프로브 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 측정하고, 상기 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 시료 핵산과 상기 프로브 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도의 상승값 (시료 ΔTm) 을 결정하는 공정과,
(3) 상기 기준 ΔTm 에서 상기 시료 ΔTm 을 뺀 값 (ΔΔTm) 에 기초하여, 핵산 미스매치의 유무를 판정하는 공정을 포함하는, 핵산 미스매치의 검출 방법.
[5] 상기 ΔΔTm 이 5.0 ℃ 이상인 경우, 핵산 미스매치가 존재하는 것으로 판정하는, [4] 에 기재된 핵산 미스매치의 검출 방법.
[6] 시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치 검출 키트로서,
상기 프로브 핵산과,
상기 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산과,
[1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 포함하는, 핵산 미스매치 검출 키트.
[7] 시료 핵산과 기준 핵산 간의 변이의 검출 방법으로서,
(1) [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기 기준 핵산과 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 측정하고, 상기 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 기준 핵산과 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도의 상승값 (기준 ΔTm) 을 결정하는 공정과,
(2) [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기 시료 핵산과 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 측정하고, 상기 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 시료 핵산과 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도의 상승값 (시료 ΔTm) 을 측정하는 공정과,
(3) 상기 기준 ΔTm 에서 상기 시료 ΔTm 을 뺀 값 (ΔΔTm) 에 기초하여, 변이의 유무를 판정하는 공정을 포함하는, 변이의 검출 방법.
[8] 상기 ΔΔTm 이 5.0 ℃ 이상인 경우, 변이가 존재하는 것으로 판정하는, [7] 에 기재된 변이의 검출 방법.
[9] 시료 핵산과 기준 핵산 간의 변이 검출 키트로서,
상기 기준 핵산과,
상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산과,
[1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 포함하는, 변이 검출 키트.
[10]
2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제를 제조하기 위한,
일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중, R1 은 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1),
일반식 (I-c) 혹은 일반식 (I-d)
[화학식 10]
Figure pct00010
(식 중, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기이고, Xa- 는 카운터 이온을 나타내고, a 는 그 카운터 이온의 가수를 나타낸다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (1-2),
일반식 (1-e)
[화학식 11]
Figure pct00011
(식 중, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기, 또는 탄소수 5 ∼ 6 의 시클로알킬기를 나타낸다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-3), 그리고
일반식 (1-f)
[화학식 12]
Figure pct00012
(식 중 R6 은 수소 원자 또는 메틸기, R7 및 R8 은 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 4 의 알킬기를 나타내고, n 은 2 ∼ 4 의 정수이다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 카티온성 구성 단위 (1) 과,
일반식 (II-a)
[화학식 13]
Figure pct00013
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-1),
일반식 (II-b)
[화학식 14]
Figure pct00014
(식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-2),
일반식 (II-c)
[화학식 15]
Figure pct00015
(식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-3), 그리고,
일반식 (II-d)
[화학식 16]
Figure pct00016
(식 중 R10 은, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는, 양쪽성 공중합체의 사용.
[11]
상기 카티온성 구성 단위 (1) 이, 구성 단위 (1-1) 및 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군에서 선택되고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 가, 구성 단위 (2-1) 및 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, [10] 에 기재된 사용.
[12]
상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [10] 또는 [11] 에 기재된 사용.
[13]
2 본쇄 핵산의 융해 온도를 상승시키는 방법으로서,
일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 17]
Figure pct00017
(식 중, R1 은 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1),
일반식 (I-c) 혹은 일반식 (I-d)
[화학식 18]
Figure pct00018
(식 중, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기이고, Xa- 는 카운터 이온을 나타내고, a 는 그 카운터 이온의 가수를 나타낸다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (1-2),
일반식 (1-e)
[화학식 19]
Figure pct00019
(식 중, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기, 또는 탄소수 5 ∼ 6 의 시클로알킬기를 나타낸다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-3), 그리고
일반식 (1-f)
[화학식 20]
Figure pct00020
(식 중 R6 은 수소 원자 또는 메틸기, R7 및 R8 은 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 4 의 알킬기를 나타내고, n 은 2 ∼ 4 의 정수이다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 카티온성 구성 단위 (1) 과,
일반식 (II-a)
[화학식 21]
Figure pct00021
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-1),
일반식 (II-b)
[화학식 22]
Figure pct00022
(식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-2),
일반식 (II-c)
[화학식 23]
Figure pct00023
(식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-3), 그리고,
일반식 (II-d)
[화학식 24]
Figure pct00024
(식 중 R10 은, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는, 양쪽성 공중합체를, 2 본쇄 핵산과 용액 중에서 혼합하여, 상기 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 상승시키는 방법.
[14]
상기 카티온성 구성 단위 (1) 이, 구성 단위 (1-1) 및 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군에서 선택되고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 가, 구성 단위 (2-1) 및 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, [13] 에 기재된 방법.
[15]
상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [13] 또는 [14] 에 기재된 방법.
본 발명에 의하면, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 를 이용하여, 간이하게 또한 고감도로, 2 본쇄 핵산 미스매치를 검출할 수 있다. 따라서, 기준 핵산 (예를 들어, 야생형 게놈 핵산) 에 대한 시료 핵산의 변이 유무를 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 를 이용하여, 간이하게 또한 고감도로 검사할 수 있다.
도 1 은, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 2 는, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 3 은, 디알릴아민염산염·말레산 공중합체의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 4 는, 디알릴아민염산염·말레산 공중합체의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 5 는, 디알릴메틸아민·말레산 공중합체의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 6 은, 디알릴메틸아민·말레산 공중합체의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 7 은, 디알릴아민염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 8 은, 디알릴아민염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 9 는, 알릴아민 중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 3000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 10 은, 알릴아민 중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 3000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 11 은, 알릴아민 중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 8000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 12 는, 알릴아민 중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 8000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 13 은, 알릴아민 중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 15000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 14 는, 알릴아민 중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 15000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 15 는, 알릴아민염산염·디알릴아민염산염 공중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 100000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 16 은, 알릴아민염산염·디알릴아민염산염 공중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 100000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 17 은, 알릴아민염산염·디알릴아민염산염 공중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 20000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 18 은, 알릴아민염산염·디알릴아민염산염 공중합체 (중량 평균 분자량 (Mw) : 20000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 19 는, 50 몰％ 아세틸화폴리알릴아민 (중량 평균 분자량 (Mw) : 15000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 20 은, 50 몰％ 아세틸화폴리알릴아민 (중량 평균 분자량 (Mw) : 15000) 의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 21 은, 폴리아크릴아미드의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 22 는, 폴리아크릴아미드의 존재하 또는 비존재하, 혹은 당해 공중합체 대신에 MgCl2 의 존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 완전 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 23 은, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체의 존재하 또는 비존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 BNA 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 24 는, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체의 존재하 또는 비존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 BNA 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 25 는, 디알릴아민염산염·말레산 공중합체의 존재하 또는 비존재하에서의, 기준 핵산 올리고머와 BNA 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
도 26 은, 디알릴아민염산염·말레산 공중합체의 존재하 또는 비존재하에서의, 기준 핵산 올리고머에 대하여 1 염기의 변이를 갖는 핵산 올리고머와 기준 핵산 올리고머에 대한 BNA 상보 사슬 올리고머 간의 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다.
본 발명의 실시형태를 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정하여 이해되어야 하는 것은 아니다.
본 발명은, 특정한 구성 단위를 포함하는 양쪽성 공중합체를 포함하는 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 상승화제, 이것을 사용하여 2 본쇄 핵산에 있어서의 미스매치 또는 기준 핵산에 대한 시료 핵산 중의 변이를 검출하는 방법, 및 이들 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다. 이하, 이들 실시형태에 대해 상세하게 설명한다.
1. 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 상승화제
본 발명의 일 실시형태는, 특정 양쪽성 공중합체를 포함하는, 2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제에 관한 것이다. 이 2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제는, 특정 양쪽성 공중합체만으로 구성되어 있어도 되고, 특정 양쪽성 공중합체를 뉴클레아제 프리의 매체 (예를 들어, 물) 에 용해시킨 수용액과 같이, 그 이외의 성분을 포함하고 있어도 된다.
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제는, 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 16.0 ℃ 이상, 바람직하게는 20.0 ℃ 이상 상승시킨다. 특히 2 본쇄 핵산이 미스매치를 포함하지 않는 2 본쇄 핵산 (풀 매치 2 본쇄 핵산) 인 경우, 2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제는, 풀 매치 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 20.0 ℃ 이상, 바람직하게는 25.0 ℃ 이상, 특히 바람직하게는 30.0 ℃ 이상 상승시킨다.
특정 양쪽성 공중합체
특정 양쪽성 공중합체는, 특정한 구조를 갖는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 특정한 구조를 갖는 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는 것이며, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 만으로 구성되어 있어도 되고, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 에 추가하여, 그 이외의 구성 단위를 갖고 있어도 된다. 그 이외의 구성 단위로는, 후술하는 논이온성 구성 단위 (3) 이나, 특정한 구조를 갖는 카티온성 구성 단위 (1) 및 특정한 구조를 갖는 아니온성 구성 단위 (2) 의 어느 것에도 해당하지 않는 구조의 카티온성 또는 아니온성의 구성 단위를 들 수 있다.
카티온성 구성 단위 (1)
특정 양쪽성 공중합체를 구성하는 카티온성 구성 단위 (1) 은, 하기의 구성 단위 (1-1), 구성 단위 (1-2), 구성 단위 (1-3) 및 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 카티온성 구성 단위이다.
이하에 일반식 등을 사용하여 나타내는 바와 같이, 카티온성 구성 단위 (1) 은 그 구조 중에 카티온기로서 아미노기를 갖는 것인데, 양호한 Tm 값 상승 효과를 실현하는 등의 관점에서, 그 아미노기는 제 2 급 또는 제 3 급의 아미노기인 것이 바람직하다.
특정 양쪽성 공중합체는, 카티온성 구성 단위 (1) 1 종류만을 포함하고 있어도 되고, 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 을 포함하고 있어도 된다. 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 을 포함하는 경우의 당해 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 은, 모두 구성 단위 (1-1) 로 분류되는 구성 단위의 조합, 모두 구성 단위 (1-2) 로 분류되는 구성 단위의 조합, 모두 구성 단위 (1-3) 으로 분류되는 구성 단위의 조합, 또는 모두 구성 단위 (1-4) 로 분류되는 구성 단위의 조합이어도 되고, 구성 단위 (1-1) 내지 (1-4) 중 서로 상이한 것으로 분류되는 구성 단위끼리의 조합이어도 된다.
특정 양쪽성 공중합체에 있어서는, 2 본쇄 핵산의 미스매치 혹은 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 변이를 보다 확실하게 검출 가능한 점에서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 이 구성 단위 (1-1) 및 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 것이 특히 바람직하고, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 이 구성 단위 (1-1) 인 것이 가장 바람직하다.
구성 단위 (1-1)
구성 단위 (1-1) 은, 하기 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 25]
Figure pct00025
식 중, R1 은 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다. R1 은, 수소 원자, 메틸기, 에틸기, 또는 벤질기인 것이 바람직하고, 수소 원자, 또는 메틸기인 것이 특히 바람직하다.
구성 단위 (1-1) 은, 상기 구조식 (1-a), 또는 (1-b) 로 나타나는 구조의 무기산염, 혹은 유기산염 등인 구조, 즉 산 부가염인 구조를 갖고 있어도 된다.
특정 양쪽성 공중합체가 구성 단위 (1-1) 을 갖는 경우, 특정 양쪽성 공중합체의 제조에 있어서는, 제조 비용 등의 관점에서는, 부가염을 갖는 디알릴아민 모노머를 사용하는 것이 바람직하다. 중합체로부터 HCl 등의 부가염을 제거하는 프로세스는 번잡하고, 비용 증대의 원인이 되기도 하는 점에서, 그러한 프로세스를 필요로 하지 않고 제조 가능한, 부가염형의 구성 단위 (1-1) 을 사용하는 것은, 비용 등의 관점에서도 바람직한 실시형태이다.
입수의 용이성이나 반응의 제어성 등의 관점에서, 이 실시형태의 구성 단위 (1-1) 에 있어서의 무기산염, 또는 유기산염은, 염산염, 카르복실산염, 술폰산염, 또는 알킬술페이트염인 것이 바람직하고, 염산염인 것이 특히 바람직하다.
구성 단위 (1-2)
구성 단위 (1-2) 는, 하기 일반식 (I-c) 혹은 일반식 (I-d) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 26]
Figure pct00026
식 중, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기이고, Xa- 는 카운터 이온을 나타내고, a 는 그 카운터 이온의 가수를 나타낸다.
R2 및 R3 은 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기, 또는 벤질기인 것이 바람직하고, 메틸기, 또는 에틸기인 것이 특히 바람직하다.
양호한 Tm 값 상승 효과를 실현하는 등의 관점에서는, R2 및 R3 중 적어도 일방이 수소 원자인 것이 바람직하다.
카운터 이온 Xa- 에는 특별히 한정은 없지만, 입수의 용이성이나 반응의 제어성 등의 관점에서, 염소 이온, 카르복실산 이온, 술폰산 이온, 또는 알킬술페이트 이온인 것이 바람직하고, 염소 이온, 또는 에틸술페이트 이온인 것이 특히 바람직하다.
특정 양쪽성 공중합체의 제조에 있어서는, 제조 비용 등의 관점에서는, 카운터 이온을 갖는 디알릴아민 모노머를 사용하는 것이 바람직하다. 중합체로부터 카운터 이온을 제거하는 프로세스는 번잡하고, 비용 증대의 원인이 되기도 하는 점에서, 그러한 프로세스를 필요로 하지 않고 제조 가능한, 카운터 이온형의 구성 단위 (1-2) 를 갖는 특정 양쪽성 공중합체를 사용하는 것은, 비용 등의 관점에서도 바람직한 실시형태이다.
구성 단위 (1-3)
구성 단위 (1-3) 은, 하기 일반식 (I-e) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 27]
Figure pct00027
식 중, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기, 또는 탄소수 5 ∼ 6 의 시클로알킬기를 나타낸다.
R4 및 R5 로서 바람직한 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기는, 직사슬형, 분지형 중 어느 것이어도 된다. 그 예로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 헥실기, 옥틸기, 데실기, 도데실기, 벤질기 등을 들 수 있다. 또, R4 및 R5 로서 바람직한 탄소수 5 ∼ 6 의 시클로알킬기로는, 시클로펜틸기 및 시클로헥실기 를 들 수 있지만, 이것들에는 한정되지 않는다.
R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기, 또는 벤질기인 것이 바람직하고, 수소 원자, 또는 메틸기인 것이 특히 바람직하다.
양호한 Tm 값 상승 효과를 실현하는 등의 관점에서는, R4 및 R5 의 양방이 동시에는 수소 원자가 되지 않는 것이 바람직하다.
구성 단위 (1-3) 이 일반식 (I-e) 로 나타내는 구조의 산 부가염인 경우의 부가염의 종류에는 특별히 제한은 없지만, 입수성이나 반응 제어의 용이성 등의 관점에서, 예를 들어 염산염, 황산염, 인산염, 질산염, 아황산염, 아인산염, 아질산염, 브롬화수소산염, 아세트산염, 아미드황산염, 메탄술폰산염, 트리플루오로아세트산염, p-톨루엔술폰산염 등을 사용할 수 있다.
그 중에서도, 염산염, 황산염, 인산염, 및 아미드황산염이 바람직하고, 모노알릴아민으로부터 유도되는 구조의 염산염, 황산염, 인산염, 및 아미드황산염이 특히 바람직하다.
구성 단위 (1-4)
구성 단위 (1-4) 는, 하기 일반식 (I-f) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 28]
Figure pct00028
식 중 R6 은 수소 원자 또는 메틸기, R7 및 R8 은 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 4 의 알킬기를 나타내고, n 은 2 ∼ 4 의 정수이다.
R6 은, 메틸기인 것이 바람직하고, n 은 2 ∼ 3 인 것이 바람직하고, R7 및 R8 은 각각 메틸기인 것이 바람직하다.
구성 단위 (1-4) 가 일반식 (I-f) 로 나타내는 구조의 산 부가염인 경우의 부가염의 종류에는 특별히 제한은 없지만, 입수성이나 반응 제어의 용이성 등의 관점에서, 예를 들어 염산염, 황산염, 인산염, 질산염, 아황산염, 아인산염, 아질산염, 브롬화수소산염, 아세트산염, 아미드황산염, 메탄술폰산염, 트리플루오로아세트산염, p-톨루엔술폰산염 등을 사용할 수 있다.
그 중에서도, 염산염, 황산염, 인산염, 및 아미드황산염이 바람직하고, 모노알릴아민으로부터 유도되는 구조의 염산염, 황산염, 인산염, 및 아미드황산염이 특히 바람직하다.
특정 양쪽성 공중합체의 전체 구성 단위에서 차지하는 카티온성 구성 단위 (1) 의 비율은, 통상적으로 10 ∼ 70 몰％ 이고, 바람직하게는 15 ∼ 60 몰％ 이고, 특히 바람직하게는 20 ∼ 55 몰％ 이다. 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 을 포함하는 경우의 상기 비율은, 당해 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 의 합계량에 기초하여 정의된다.
아니온성 구성 단위 (2)
본 발명에 있어서 사용되는 특정 양쪽성 공중합체를 구성하는 아니온성 구성 단위 (2) 는, 하기의 구성 단위 (2-1), 구성 단위 (2-2), 구성 단위 (2-3) 및 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 아니온성 구성 단위이다.
특성 양쪽성 공중합체는, 아니온성 구성 단위 (2) 1 종류만을 포함하고 있어도 되고, 2 종류 이상의 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하고 있어도 된다. 2 종류 이상의 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는 경우의 당해 2 종류 이상의 아니온성 구성 단위 (2) 는, 모두 구성 단위 (2-1) 로 분류되는 구성 단위의 조합, 모두 구성 단위 (2-2) 로 분류되는 구성 단위의 조합, 모두 구성 단위 (2-3) 으로 분류되는 구성 단위의 조합, 또는 모두 구성 단위 (2-4) 로 분류되는 구성 단위의 조합이어도 되고, 구성 단위 (2-1) 내지 (2-4) 중 서로 상이한 것으로 분류되는 구성 단위끼리의 조합이어도 된다.
특정 양쪽성 공중합체에 있어서는, 2 본쇄 핵산의 미스매치 혹은 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 변이를 보다 확실하게 검출 가능한 점에서, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 가 구성 단위 (2-1) 및 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 것이 특히 바람직하다.
구성 단위 (2-1)
구성 단위 (2-1) 은, 하기 일반식 (II-a) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 29]
Figure pct00029
식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 를 나타낸다.
R9 는, 수소인 것이 바람직하고, Y 는 수소 또는 Na 인 것이 바람직하다. 구성 단위 (2-1) 은, 말레산으로부터 유도되는 것인 것이 특히 바람직하다.
구성 단위 (2-2)
구성 단위 (2-2) 는, 하기 일반식 (II-b) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 30]
Figure pct00030
식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 를 나타낸다.
Y 는 수소 또는 Na 인 것이 바람직하다.
구성 단위 (2-3)
구성 단위 (2-3) 은, 하기 일반식 (II-c) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 31]
Figure pct00031
식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다.
Y 는 수소 또는 Na 인 것이 바람직하다.
구성 단위 (2-4)
구성 단위 (2-4) 는, 하기 일반식 (II-d) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 32]
Figure pct00032
식 중, R10 은, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다.
R10 은, 수소인 것이 바람직하고, Y 는 수소 또는 Na 인 것이 바람직하다.
구성 단위 (2-4) 는, (메트)아크릴산으로부터 유도되는 것인 것이 바람직하고, 아크릴산으로부터 유도되는 것인 것이 특히 바람직하다.
특정 양쪽성 공중합체에 있어서의 아니온성 구성 단위 (2) 로서, 1 종류만의 아니온성 구성 단위 (2) 를 단독으로 사용해도 되고, 복수 종류의 서로 상이한 구조의 아니온성 구성 단위 (2) 를 조합하여 사용해도 된다.
복수 종류의 서로 상이한 아니온성 구성 단위를 사용하는 경우, 각각의 아니온성 구성 단위는, 동일한 일반 구조식 (II-a), (II-b), (II-c) 또는 (II-d) 로 나타내는 범위 내에 있어서 서로 상이한 구조를 갖고 있어도 되고, 상이한 일반 구조식으로 나타내는 서로 상이한 구조를 갖고 있어도 된다. 전자의 경우, 예를 들어, 일반 구조식 (II-a) 로 나타내지만, Y 의 원소가 서로 상이함으로써 구조가 서로 상이한, 복수 종류의 아니온성 구성 단위 (2) 를 사용해도 된다. 후자의 경우, 예를 들어, 구조식 (II-a) 로 나타내는 구조를 갖는 1 의 아니온성 구성 단위 (2-1) 과, 구조식 (II-d) 로 나타내는 구조를 갖는 다른 아니온성 구성 단위 (2-4) 를 사용해도 된다.
특정 양쪽성 공중합체는, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하므로, 카티온성 및 아니온성을 갖는 양쪽성 공중합체가 된다.
특정한 구조를 갖는 카티온성 구성 단위 (1) 및 특정한 구조를 갖는 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는 특정 양쪽성 공중합체를 사용함으로써, 2 본쇄 핵산 미스매치가 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우의 2 본쇄 핵산 융해 온도의 차를 현저하게 확대시키는 메커니즘은 반드시 분명한 것은 아니지만, 카티온성 구성 단위의 카티온 밀도가 지나치게 높으면, 핵산 간의 결합을 지나치게 강화시켜, 2 본쇄 핵산 융해 온도의 측정 자체가 어려워지고, 카티온성 구성 단위의 카티온 밀도가 지나치게 낮으면, 2 본쇄 핵산 융해 온도의 상승이 작아져 미스매치의 검출 감도가 낮아지는 점에서, 특정한 구조를 갖는 카티온성 구성 단위 (1) 의 포지티브 차지와 특정한 구조를 갖는 아니온성 구성 단위 (2) 의 네거티브 차지가 적당히 간섭하여, 핵산 간의 결합을 적당히 강화시키고 있는 것으로 추정된다.
상기 서술한 바와 같이 2 본쇄 핵산의 미스매치 혹은 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 변이를 보다 확실하게 검출 가능한 점에서, 특정 양쪽성 공중합체에 있어서, 카티온성 구성 단위 (1) 이 구성 단위 (1-1) 및 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 것이 바람직하고, 아니온성 구성 단위 (2) 가 구성 단위 (2-1) 및 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 것이 바람직하므로, 카티온성 구성 단위 (1) 로서 구성 단위 (1-1) 및 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 갖고, 아니온성 구성 단위 (2) 로서 구성 단위 (2-1) 및 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 갖는 특정 양쪽성 공중합체를 특히 바람직하게 사용할 수 있다.
카티온성 구성 단위 (1) 과 아니온성 구성 단위 (2) 의 합계가 특정 양쪽성 공중합체의 전체 구성 단위에서 차지하는 비율에는 특별히 제한은 없지만, 통상적으로 25 몰％ 이상이고, 바람직하게는 30 ∼ 90 몰％ 이고, 보다 바람직하게는 35 ∼ 75 몰％ 이고, 특히 바람직하게는 40 ∼ 60 몰％ 이다.
카티온성 구성 단위 (1) 과 아니온성 구성 단위 (2) 의 비율에도 특별히 제한은 없지만, 몰비 (카티온 구성 단위 (1) : 아니온성 구성 단위 (2)) 로 통상적으로 0.1 : 1 ∼ 2 : 1 이고, 바람직하게는 0.3 : 1 ∼ 0.8 : 1 이고, 보다 바람직하게는 0.4 : 1 ∼ 1.2 : 1 이고, 특히 바람직하게는 0.5 : 1 ∼ 1 : 1 이다.
특정 양쪽성 공중합체에 있어서의, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비는, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 의 구조가 이미 알려진 경우, 특정 양쪽성 공중합체를 이소프로필알코올 또는 아세톤 등의 유기 용매로 재침전시키고, 재침전물에 대해, Perkin Elmer 2400II CHNS/O 전자동 원소 분석 장치 또는 동등한 성능의 장치를 사용하여, 상기 구성 단위의 구조에 따른 적절한 모드로 분석함으로써 특정할 수 있다. 또한, 측정은, 캐리어 가스로서 헬륨 가스를 사용하고, 주석 캡슐에 고체 시료를 칭량하여 넣고, 연소관 내에 낙하시켜 순산소 가스 중에서 연소 온도 1800 ℃ 이상에서 시료를 연소시키고, 분리 칼럼 및 열 전도 검출기에 의한 프론탈 크로마토그래피 방식으로 각 측정 성분을 검출하고, 교정 계수를 사용하여 각 원소의 함유율을 정량함으로써 실시할 수 있다. 여기서, 특정 양쪽성 공중합체에 있어서의 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 의 구조가 미지인 경우, 상기 원소 분석 장치에 의한 측정 전에, 1H-NMR 또는 13C-NMR 을 사용한 공지된 방법에 의해, 각각의 구성 단위의 구조를 특정한다. 또, 특정 양쪽성 공중합체의 제조 (공중합) 에 있어서 공급한 각 단량체의 양, 및 특정 양쪽성 공중합체에 도입되지 않고 잔류한 각 단량체의 양으로부터 계산할 수도 있다. 또한, 특정 양쪽성 공중합체에 있어서의 각 단량체로부터 유도되는 구성 단위의 비율 (몰비) 은, 각 구성 단위의 주입 조성 (몰비) 과 대략 일치하기 때문에, 본 명세서에서는 편의적으로 모노머의 배합비를 구성 단위의 비율 (몰비) 로서 취급하는 경우가 있다.
그 이외의 구성 단위
특정 양쪽성 공중합체는, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 에 추가하여, 그 이외의 구성 단위를 갖고 있어도 된다.
그 이외의 구성 단위로는, 논이온성 구성 단위 (3) 이나, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 의 어느 것에도 해당하지 않는 카티온성 또는 아니온성의 구성 단위를 들 수 있다.
카티온성 구성 단위 (1) 과 아니온성 구성 단위 (2) 사이에 위치함으로써, 양자의 스페이서로서 기능하여, 각 구성 단위의 포지티브 차지와 네거티브 차지의 간섭을 조정하여, 2 본쇄 핵산의 미스매치 혹은 시료 핵산 중의 기준 핵산에 대한 변이를 보다 확실하게 검출 가능해지는 점에서, 특정 양쪽성 공중합체는 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는 것이 바람직하다. 또, 논이온성 구성 단위는, 카티온성 구성 단위 (1) 과 아니온성 구성 단위 (2) 사이에 위치하는 것이 바람직하다. 특히, 카티온성 구성 단위가, 상기 일반식 (I-f) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조인 경우에는, 논이온성 구성 단위가 스페이서로서 특히 유효하게 기능하는 점에서, 특정 양쪽성 공중합체는 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
논이온성 구성 단위 (3)
본 실시형태에 있어서의 논이온성 구성 단위 (3) 은, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 와 공중합 가능한 비이온성의 단량체로부터 유도되는 구성 단위이면 되고, 특별히 그 이외의 제한은 없지만, 메타크릴산에스테르계 단량체, 아크릴산에스테르계 단량체, 메타크릴아미드계 단량체, 아크릴아미드계 단량체, 이산화황 등으로부터 유도되는 구성 단위를 바람직하게 사용할 수 있다. 보다 구체적인 예로는, 메타크릴산메틸, 메타크릴산에틸, 메타크릴산부틸, 아크릴산메틸, 아크릴산에틸, 아크릴산부틸, 메타크릴아미드, N-메틸메타크릴아미드, 디메틸메타크릴아미드, N-(3-디메틸아미노프로필)메타크릴아미드, 아크릴아미드, 디메틸아크릴아미드, 하이드록시에틸아크릴아미드, 디메틸아미노프로필아크릴아미드, 디메틸아미노프로필아크릴아미드염화메틸 4 급 염, 아크릴로일모르폴린, 이소프로필아크릴아미드, 4-t-부틸시클로헥실아크릴레이트, 또는 이산화황으로부터 유도되는 구성 단위를 들 수 있다. 아크릴아미드로부터 유도되는 구성 단위를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
논이온성 구성 단위 (3) 은, 통상적으로, 단량체로서 비이온성의 단량체를 사용함으로써, 고분자 중에 도입할 수 있다.
특정 양쪽성 공중합체가 논이온성 구성 단위 (3) 을 갖는 경우의 논이온성 구성 단위 (3) 의 함유량에는 특별히 제한은 없고, 또 논이온성 구성 단위 (3) 의 종류에 따라서도 그 바람직한 양은 상이하지만, 아니온성 구성 단위 (2) 와의 몰비가, 논이온성 구성 단위 (3)/아니온성 구성 단위 (2) ＝ 0.1/1 ∼ 1/1 인 것이 바람직하고 0.2/1 ∼ 0.8/1 인 것이 보다 바람직하고, 0.3/1 ∼ 0.7/1 인 것이 더욱 바람직하고, 0.4/1 ∼ 0.6/1 인 것이 특히 바람직하다.
논이온성 구성 단위 (3) 이 메타크릴산에스테르계 단량체, 아크릴산에스테르계 단량체, 메타크릴아미드계 단량체, 또는 아크릴아미드계 단량체로부터 유도되는 경우에는, 상기 비율은 0.1/1 ∼ 1/1 인 것이 바람직하고 0.2/1 ∼ 0.8/1 인 것이 보다 바람직하고, 0.3/1 ∼ 0.7/1 인 것이 더욱 바람직하고, 0.4/1 ∼ 0.6/1 인 것이 특히 바람직하다.
논이온성 구성 단위 (3) 이 이산화황으로부터 유도되는 경우에는, 상기 비율은 0.1/1 ∼ 1/1 인 것이 바람직하고, 0.2/1 ∼ 1/1 인 것이 특히 바람직하다.
특정 양쪽성 공중합체의 제조 방법
특정 양쪽성 공중합체의 제조 방법에는 특별히 제한은 없고, 종래 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법으로 제조할 수 있지만, 예를 들어 카티온성 구성 단위 (1) 에 대응하는 구조의 카티온성 단량체, 및 아니온성 구성 단위 (2) 에 대응하는 구조의 아니온성 단량체, 그리고 원하는 바에 따라 논이온성 구성 단위 (3) 에 대응하는 구조의 논이온성 단량체 등의 그 이외의 단량체를 공중합시킴으로써 제조할 수 있다.
카티온성 구성 단위 (1) 에 대응하는 구조의 카티온성 단량체, 아니온성 구성 단위 (2) 에 대응하는 구조의 아니온성 단량체 등을 공중합시키는 경우의 용매는 특별히 한정되지 않으며, 수계의 용매여도 되고, 알코올, 에테르, 술폭시드, 아미드 등의 유기계의 용매여도 되지만, 수계의 용매인 것이 바람직하다.
카티온성 구성 단위 (1) 에 대응하는 구조의 카티온성 단량체, 아니온성 구성 단위 (2) 에 대응하는 구조의 아니온성 단량체 등을 공중합시키는 경우의 단량체 농도는, 단량체의 종류에 따라, 또 공중합을 실시하는 용매의 종류에 따라, 상이하지만, 수계의 용매의 경우 통상적으로 10 ∼ 75 질량％ 이다. 이 공중합 반응은, 통상적으로, 라디칼 중합 반응이고, 라디칼 중합 촉매의 존재하에 실시된다. 라디칼 중합 촉매의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니며, 그 바람직한 예로서, t-부틸하이드로퍼옥사이드 등의 과산화물, 과황산암모늄, 과황산나트륨, 과황산칼륨 등의 과황산염, 아조비스계, 디아조계 등의 수용성 아조 화합물을 들 수 있다.
라디칼 중합 촉매의 첨가량은, 일반적으로는 전체 단량체에 대하여 0.1 ∼ 20 몰％, 바람직하게는 1.0 ∼ 10 몰％ 이다. 중합 온도는 일반적으로는 0 ∼ 100 ℃, 바람직하게는 5 ∼ 80 ℃ 이고, 중합 시간은 일반적으로는 1 ∼ 150 시간, 바람직하게는 5 ∼ 100 시간이다. 중합 분위기는, 대기 중에서도 중합성에 큰 문제를 발생시키지 않지만, 질소 등의 불활성 가스의 분위기에서 실시할 수도 있다.
2. 시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치의 검출 방법
본 발명의 다른 실시형태는, 시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치의 검출 방법에 관한 것이며, 이 방법은,
(1) 상기 특정 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 프로브 핵산과, 상기 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산 융해 온도의 상승값 (기준 ΔTm) 을 결정하는 공정과,
(2) 상기 특정 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 시료 핵산과, 프로브 핵산의 2 본쇄 핵산 융해 온도의 상승값 (시료 ΔTm) 을 결정하는 공정과,
(3) 상기 기준 ΔTm 에서 상기 시료 ΔTm 을 뺀 값 (ΔΔTm) 에 기초하여, 핵산 미스매치의 유무를 판정하는 공정을 포함한다.
(1) 의 공정에 있어서, 융해 온도의 상승값 (기준 ΔTm) 은, 특정 양쪽성 공중합체의 존재하에 있어서의, 프로브 핵산과 그것에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 핵산 융해 온도 (Tm1), 그리고 특정 양쪽성 공중합체의 부재하에 있어서의, 프로브 핵산과 그것에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산 융해 온도 (Tm2) 를 각각 측정하고, Tm1 － Tm2 를 산출함으로써 결정한다.
동일하게, (2) 의 공정에 있어서, 융해 온도의 상승값 (시료 ΔTm) 은, 특정 양쪽성 공중합체의 존재하에 있어서의, 시료 핵산과 프로브 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm1), 그리고 특정 양쪽성 공중합체의 부재하에 있어서의, 시료 핵산과 프로브 핵산의 2 본쇄 핵산 융해 온도 (Tm2) 를 각각 측정하고, Tm1 － Tm2 를 산출함으로써 결정한다.
본원 명세서에 있어서,「핵산」은, DNA 및 RNA 모두 포함된다. 또, 비천연형 핵산도 포함한다. 시료 핵산 및 프로브 핵산에 상보적인 서열을 포함하는 핵산은, 게놈 DNA, cDNA, 게놈 RNA, mRNA, rRNA 등의 모든 핵산을 포함할 수 있다. 또, 프로브 핵산 및 프로브 핵산에 상보적인 서열을 포함하는 핵산은, 천연형 핵산이어도 되고 비천연형 핵산이어도 된다. 비천연형 핵산은, 인공 뉴클레오티드를 그 일부에 포함하는 DNA 또는 RNA 이고, 인공 뉴클레오티드로는, 예를 들어, BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid), 포스페이트기를 갖는 펩티드 핵산 (PHONA), 또는 모르폴리노 핵산을 적어도 일부에 포함하는 핵산 등을 들 수 있다 (이들 비천연형 핵산의 상세는, 예를 들어, 특허문헌 6 ∼ 16 등에 기재되어 있으며, 참조에 의해 그 내용을 본원 명세서에 편입한다).
시료 핵산 및 프로브 핵산의 중합도는, 특별히 한정되지 않지만, 검출 감도의 점에서, 통상적으로 4 ∼ 100 mer 이고, 바람직하게는 5 ∼ 50 mer 이고, 보다 바람직하게는 6 ∼ 30 mer 이고, 더욱 바람직하게는 7 ∼ 20 mer 이고, 특히 바람직하게는 8 ∼ 15 mer 이다.
시료 핵산 및 프로브 핵산의 GC 함량은, 특별히 한정되지 않지만, 검출 감도의 점에서, 통상적으로 30 ∼ 80 ％ 이고, 바람직하게는 50 ∼ 75 ％ 이다.
2 본쇄 핵산의 융해 온도의 측정은, 통상적으로 핵산 수용액을 사용하여 실시하지만, 용매는, 뉴클레아제 프리의 수성 매체이면 되며, 전형적으로는 뉴클레아제 프리의 물이다. 또, 핵산은, 완충액 중에 용해시켜도 되며, 예를 들어, 핵산 분석 시약에서 사용되는 핵산용 완충액을 사용할 수 있다. 또, 핵산 수용액은, 특정 양쪽성 공중합체에 의한 융해 온도 (Tm) 의 상승에 영향을 미치지 않는 범위에서, 계면 활성제를 포함해도 되고, 핵산 분석 시약에서 사용되는 계면 활성제를 들 수 있다.
2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 의 측정에 있어서, 특정 양쪽성 공중합체는, 통상적으로 0.03 ∼ 3.0 질량％ 의 농도로 용액 중에 함유시킬 수 있고, 0.2 ∼ 2.0 질량％ 의 농도로 용액 중에 함유시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에서는, 특정 양쪽성 공중합체에 추가하여, MgCl2 등의 이미 알려진 융해 온도 (Tm) 상승화제를 반응액에 포함해도 된다. 단, MgCl2 를 포함하는 경우, 그 농도는, 5 mM 이하로 하는 것이 바람직하다. 또, 융해 온도 (Tm) 의 상승에 영향을 미치지 않는 범위에서, NaCl 등의 염을 포함해도 된다. 이 경우, 염은, 300 mM 이하로 하는 것이 바람직하다.
2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 의 측정에 있어서, 시료 핵산 및 프로브 핵산은, 통상적으로 각각 10 ∼ 1000 μM 의 농도로 측정을 실시할 수 있고, 30 ∼ 300 μM 의 농도로 측정을 실시하는 것이 바람직하다.
용액 pH 는, 3.0 ∼ 11.0 으로 할 수 있고, 5.0 ∼ 9.0 으로 하는 것이 바람직하다.
2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 의 측정에 있어서의 온도 스케줄은, 2 본쇄 핵산의 변성을 검출하는 방법에 따라서도 상이하지만, 기본적으로는, 완전히 2 본쇄가 형성되는 온도로부터 서서히 온도를 상승시켜 2 본쇄 핵산의 변성을 발생시키면 된다.
2 본쇄 핵산의 변성을 검출하는 방법으로는, 핵산의 자외선 영역 (예를 들어, 260 ㎚) 에서의 흡광도가 2 본쇄 핵산의 변성에 수반하여 변화하는 것을 이용하는 방법, 형광 색소, 효소, 발광 색소 등으로 표지한, 프로브 핵산, 또는 프로브 핵산 및 그것에 상보적인 서열을 갖는 핵산을 이용하여, 2 본쇄 핵산의 형성 정도를 검출하는 방법 (예를 들어, FRET 법), 및 형광 색소 등을 2 본쇄 핵산 형성시에 핵산 간에 도입시키고, 2 본쇄 핵산의 변성에 수반되는 형광 강도의 감소를 이용하는 방법 (예를 들어, 인터칼레이터법) 이 있다.
형광 색소 등으로 표지한 프로브 핵산을 준비할 필요가 없고, 간단한 장치로 리얼타임의 분석이 가능한 점에서, 형광 색소 등을 2 본쇄 핵산 형성시에 핵산 간에 도입시키고, 2 본쇄 핵산의 변성에 수반되는 형광 강도의 감소를 이용하는 방법 (예를 들어, 인터칼레이터법) 이 바람직하다. 또한, 본원 명세서 중에서 Tm 의 구체적 수치를 언급하는 경우, 특별히 다른 방법을 특정하지 않는 한, 실시예 1 에 기재하는 방법으로 측정된 수치를 의미하며, 기준 ΔTm, 시료 ΔTm 및 ΔΔTm 의 구체적 수치는, 이와 같이 하여 얻어진 Tm 으로부터 계산으로 구해진 값을 의미한다.
시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치의 검출 감도는, 핵산의 길이, 핵산의 GC 함량, 염 농도 등의 조건으로 감도가 바뀔 수 있지만, 본 발명의 검출 방법에 있어서는, 핵산의 중합도가 20 이하이면, 1 염기의 미스매치여도, 통상적으로 상기 기준 ΔTm 이 상기 시료 ΔTm 보다 5.0 ℃ 이상 높아진다. 따라서, 상기 기준 ΔTm 이, 상기 시료 ΔTm 보다 5.0 ℃ 이상 높아진 경우, 2 본쇄 핵산 미스매치가 존재하는 것으로 판정하는 것이 바람직하고, 의양성을 저감시킨다는 관점에서는, 바람직하게는 7.5 ℃ 이상 높은 경우, 핵산 미스매치가 존재하는 것으로 판정하는 것이 보다 바람직하고, 10.0 ℃ 이상 높은 경우, 핵산 미스매치가 존재하는 것으로 판정하는 것이 특히 바람직하다.
3. 시료 핵산의 기준 핵산에 대한 변이의 검출 방법
상기 핵산 미스매치의 검출 방법의 일 양태로서, 기준 핵산 (예를 들어, 야생형 게놈 핵산) 에 대한 시료 핵산의 변이 유무를 검출할 수 있다. 구체적으로는, 상기 검출 방법에 있어서의 프로브 핵산으로서, 야생형 게놈 핵산의 안티센스 사슬을 사용하고, 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산으로서, 당해 야생형 게놈 핵산의 센스 사슬을 사용하고, 상기와 동일하게 하여, 프로브 핵산, 즉 야생형 게놈 핵산의 안티센스 사슬과 시료 핵산의 핵산 미스매치를 검출함으로써, 시료 핵산 중의 야생형 게놈 핵산 센스 사슬에 대한 변이를 검출할 수 있다. 바꿔 말하면, 본 발명의 다른 실시형태에 의해, 시료 핵산에 있어서의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하는 방법으로서,
(1) 특정 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 기준 핵산과, 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 융해 온도의 상승값 (기준 ΔTm) 을 측정하는 공정과,
(2) 특정 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 시료 핵산과, 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 융해 온도의 상승값 (시료 ΔTm) 을 측정하는 공정과,
(3) 상기 시료 ΔTm 과 상기 기준 ΔTm 의 차 (ΔΔTm) 에 기초하여, 변이의 유무를 판정하는 공정을 포함하는, 변이의 검출 방법이 제공된다.
4. 핵산 미스매치 검출 키트 및 변이 검출 키트
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 상기 서술한 시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치를 검출하는 방법, 그리고 시료 핵산에 있어서의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하는 방법을 실시하기 위한 키트가 제공된다. 구체적으로는, 일 실시형태에 있어서,
프로브 핵산과,
상기 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산과,
특정 양쪽성 공중합체를 포함하는, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 상승화제를 포함하는, 시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치를 검출하기 위한 키트가 제공된다.
또, 다른 실시형태에 있어서,
기준 핵산과,
상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산과,
특정 양쪽성 공중합체를 포함하는, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 상승화제를 포함하는, 시료 핵산에 있어서의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하기 위한 키트가 제공된다.
이들 키트에 있어서의,「프로브 핵산」,「프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산」,「기준 핵산」,「기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산」및「특정 양쪽성 공중합체」의 상세 및 바람직한 형태는, 전술한 바와 같다.
또, 이것들에 추가하여, 수성 매체, 완충액, 계면 활성제, 염, 다른 융해 온도 (Tm) 상승화제, 2 본쇄 핵산을 검출하기 위한 시약 등의, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 (Tm) 의 측정에 사용할 수 있는 다른 성분을 포함할 수 있으며, 이것들에 대해서도 전술한 바와 같다. 특히, 핵산 미스매치 검출 및 변이 검출을 용이하게 한다는 점에서, 2 본쇄 핵산을 검출하기 위한 시약으로서, 인터칼레이터성 형광 색소를 포함하는 것이 바람직하다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체를 포함하는 폴리머 수용액을, 2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서 사용하여, 미스매치 2 본쇄와 풀 매치 2 본쇄에 있어서의 Tm 상승폭을 비교하고, 미스매치의 검출에 대해 당해 공중합체를 평가하였다.
1. 폴리머 수용액 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제)
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 (모노머 1) 과, 아크릴아미드 (모노머 2) 와, 아크릴산 (모노머 3) 을 이하의 중합 조건 1 에서 공중합시켜 이루어지고, 모노머 1 에서 유래하는 구성 단위 1 과 모노머 2 에서 유래하는 구성 단위 2 와 모노머 3 에서 유래하는 구성 단위 3 의 몰비가 1 : 1 : 2 인, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체를 10.0 질량％ 포함하고, pH 가 7.0 인, 폴리머 수용액을 조제하였다.
중합 조건 1 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 (고형분 농도 51.2 질량％) 을 16.15 g (0.04 몰 상당), 아크릴아미드 (고형분 농도 97 질량％) 를 2.93 g (0.04 몰 상당), 아크릴산 (고형분 농도 99 질량％) 을 5.82 g (0.08 몰 상당), 증류수를 143.86 g 주입하고, 60 ℃ 로 승온시켰다. 2 시간마다, 수용액 중의 과황산암모늄량이 모노머 전체량에 대하여 각각 0.25, 0.5, 0.5, 0.75 몰％ 가 되는 양만큼, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 하룻밤 반응을 계속하였다.
2. 기준 핵산, 상보적인 서열로 이루어지는 핵산 및 변이를 갖는 핵산
기준 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대하여 1 염기의 변이를 검출 가능한지 평가하기 위해, 이하의 올리고 DNA 를 사용하였다.
Figure pct00033
3. 반응액의 조제
이하의 반응액 1 내지 4 를 조제하였다. 또한, 형광 색소 용액 중의 형광 색소는, 인터칼레이터성 형광 색소에 해당한다.
Figure pct00034
4. 2 본쇄 융해 곡선의 작성
조제한 각 반응액을, StepOnePlus 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 에 세팅하고, 95 ℃ 에서 15 초간 가열한 후, 10 ℃ 에서 1 분간 보온하고, 이어서, 0.3 초마다 형광 계측을 실시하면서, 95 ℃ 까지 승온시켜 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그 후, 95 ℃ 에서 15 초간 유지하였다.
[참조예]
참고로서, 상기 폴리머 수용액 대신에, 종래부터 2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서 알려져 있는 염화마그네슘 용액을 사용하여 2 본쇄 융해 곡선을 얻었다.
구체적으로는, 상기 반응액 2 및 4 대신에, 이하의 반응액 5 및 6 을 조제하고, 실시예 1 과 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻었다.
Figure pct00035
[시험 결과]
도 1 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 2 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 1 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 37.0 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 67.30 ℃ 가 되어, 30.30 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
또, 도 2 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 34.25 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 53.35 ℃ 가 되어, 19.10 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
이 결과, 기준 핵산과 상보 사슬 간과, 변이 사슬과 상보 사슬 간에서는, 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서의 Tm 값의 상승에 대해, 11.20 ℃ 의 차가 확인되었다.
[실시예 2]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, 디알릴아민염산염 (모노머 1) 과, 말레산 (모노머 2) 을 이하의 중합 조건 2 에서 공중합시켜 이루어지고, 모노머 1 에서 유래하는 구성 단위 1 과 모노머 2 에서 유래하는 구성 단위 2 의 몰비가 1 : 1 인, 디알릴아민염산염·말레산 공중합체를 사용한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재에 따른, 기준 핵산 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (기준 ΔTm) 과, 변이 사슬 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (시료 ΔTm) 을 결정하고, 양자의 차 (ΔΔTm) 를 산출하였다.
중합 조건 2 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 500 mL 의 4 구 플라스크에 66.78 ％ 디알릴아민염산염 160.07 g (0.80 몰), 무수 말레산 78.45 g (0.80 몰), 증류수 91.86 g 을 주입하고, 내온을 50 ℃ 로 승온시켰다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을, 당해 수용액 중의 과황산암모늄량이 모노머의 전체량에 대하여 0.5 질량％ 가 되는 양만큼 첨가하고 중합을 개시하였다. 과황산암모늄의 양이 각각 4 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 0.5 질량％, 20, 26 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 1.0 질량％, 45, 51 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 1.5 질량％ 가 되는 양만큼, 상기 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 68 시간 반응시켰다.
도 3 에, 각각 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 4 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 3 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 37.00 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 69.85 ℃ 가 되어, 32.85 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
또, 도 4 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 34.25 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 56.05 ℃ 가 되어, 21.80 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
이 결과, 기준 핵산과 상보 사슬 간과, 변이 사슬과 상보 사슬 간에서는, 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서의 Tm 값의 상승에 대해, 11.05 ℃ 의 차가 확인되었다.
[실시예 3]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, 디알릴메틸아민 (모노머 1) 과, 말레산 (모노머 2) 을 이하의 중합 조건 3 에서 공중합시켜 이루어지고, 모노머 1 에서 유래하는 구성 단위 1 과 모노머 2 에서 유래하는 구성 단위 2 의 몰비가 1 : 1 인, 디알릴메틸아민·말레산 공중합체를 사용한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재에 따른, 기준 핵산 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (기준 ΔTm) 과, 변이 사슬 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (시료 ΔTm) 을 결정하고, 양자의 차 (ΔΔTm) 를 산출하였다.
중합 조건 3 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 20 L 의 4 구 플라스크에 무수 말레산 1.86 ㎏ (19.0 몰) 과 증류수 0.34 ㎏ 을 주입하고, 디알릴메틸아민 (DAMA) 2.11 ㎏ (19.0 몰) 을 냉각하에서 적하하였다. 그 후, 내온을 50 ℃ 로 승온시켰다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을, 당해 수용액 중의 과황산암모늄량이 모노머의 전체량에 대하여 0.5 질량％ 가 되는 양만큼 첨가하고 중합을 개시시켰다. 3, 21, 25 시간 후에 1.0 질량％ 첨가하고, 추가로 하룻밤 반응시켰다.
도 5 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 6 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 37.00 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 65.05 ℃ 가 되어, 28.05 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
또, 도 6 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 34.25 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 50.95 ℃ 가 되어, 16.70 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
이 결과, 기준 핵산과 상보 사슬 간과, 변이 사슬과 상보 사슬 간에서는, 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서의 Tm 값의 상승에 대해, 11.35 ℃ 의 차가 확인되었다.
[실시예 4]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, 디알릴아민염산염 (모노머 1) 과, 아크릴아미드 (모노머 2) 와, 아크릴산 (모노머 3) 을 이하의 중합 조건 4 에서 공중합시켜 이루어지고, 모노머 1 에서 유래하는 구성 단위 1 과 모노머 2 에서 유래하는 구성 단위 2 와 모노머 3 에서 유래하는 구성 단위 3 의 몰비가 1 : 1 : 2 인, 디알릴아민염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체를 사용한 것 이외에는, 올리고-올리고 2 본쇄 융해 시험을 실시하였다.
중합 조건 4 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디알릴아민염산염 (고형분 농도 65.40 질량％) 을 20.43 g (0.1 몰 상당), 증류수를 110.9 g 주입하고, 65 ℃ 로 승온시켰다. 수용액 중의 과황산암모늄의 양이 모노머 전체량에 대하여 2.0 몰％ 가 되는 양, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 첨가 후, 30 분 경과하고 나서 아크릴아미드 (고형분 농도 97 질량％) 를 7.11 g (0.1 몰 상당), 아크릴산 (고형분 농도 99 질량％) 을 14.56 g (0.2 몰 상당), 증류수를 21.15 g 혼합한 용액을 3 시간에 걸쳐서 적하하고, 하룻밤 반응을 계속하였다.
도 7 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 8 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 7 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 38.40 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 67.68 ℃ 가 되어, 29.28 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
또, 도 8 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 31.64 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 53.39 ℃ 가 되어, 21.75 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
이 결과, 기준 핵산과 상보 사슬 간과, 변이 사슬과 상보 사슬 간에서는, 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서의 Tm 값의 상승에 대해, 7.53 ℃ 의 차가 확인되었다.
[비교예 1]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, GPC 측정에 의해 얻어지는 중량 평균 분자량 (Mw) 이 3000 인, 알릴아민 중합체 (제품명 : PAA-03, 닛토보 메디컬 제조) 를 사용한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재에 따른, 기준 핵산 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (기준 ΔTm) 과, 변이 사슬 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (시료 ΔTm) 을 결정하고, 양자의 차 (ΔΔTm) 를 산출하였다.
도 9 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 10 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 9 및 10 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 명확한 피크가 검출되지 않아, Tm 값의 결정이 곤란하였다.
[비교예 2]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, GPC 측정에 의해 얻어지는 중량 평균 분자량 Mw 가 8000 인, 알릴아민 중합체 (제품명 : PAA-08, 닛토보 메디컬 제조) 를 사용한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재에 따른, 기준 핵산 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (기준 ΔTm) 과, 변이 사슬 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (시료 ΔTm) 을 결정하고, 양자의 차 (ΔΔTm) 를 산출하였다.
도 11 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 12 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 11 및 12 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 명확한 피크가 검출되지 않아, Tm 값의 결정이 곤란하였다.
[비교예 3]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, GPC 측정에 의해 얻어지는 중량 평균 분자량 Mw 가 15000 인, 알릴아민 중합체 (제품명 : PAA-15C, 닛토보 메디컬 제조) 를 사용한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재에 따른, 기준 핵산 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (기준 ΔTm) 과, 변이 사슬 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (시료 ΔTm) 을 결정하고, 양자의 차 (ΔΔTm) 를 산출하였다.
도 13 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 14 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 13 및 14 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 명확한 피크가 검출되지 않아, Tm 값의 결정이 곤란하였다.
[비교예 4]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, 알릴아민염산염 (모노머 1) 과, 디알릴아민염산염 (모노머 2) 을 이하의 중합 조건 5 에서 공중합시켜 이루어지고, 모노머 1 에서 유래하는 구성 단위 1 과 모노머 2 에서 유래하는 구성 단위 2 의 몰비가 1 : 1 이고, GPC 측정에 의해 얻어지는 중량 평균 분자량 Mw 가 100000 인, 알릴아민염산염·디알릴아민염산염 공중합체를 사용한 것 이외에는, 올리고-올리고 2 본쇄 융해 시험을 실시하였다.
중합 조건 5 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 1 L 의 4 구 플라스크에 57.22 질량％ 의 알릴아민염산염 245.24 g (1.50 몰) 과 65.22 질량％ 의 디알릴아민염산염 307.31 g (1.50 몰) 을 주입하고, 60 ℃ 로 승온시켰다. 30 질량％ 의 V-50 (2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)이염산염) 현탁액을, 당해 현탁액 중의 V-50 의 양이 모노머 전체량에 대하여 0.50 질량％ 가 되는 양만큼 첨가하고 중합을 개시시켰다. 3 시간 후에 0.50 질량％, 24, 27, 48, 51, 54 시간 후에 0.25 질량％ 첨가하고, 추가로 하룻밤 반응시켰다.
도 15 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 16 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 15 및 16 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 명확한 피크가 검출되지 않아, Tm 값의 결정이 곤란하였다.
[비교예 5]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, 알릴아민염산염 (모노머 1) 과, 디알릴아민염산염 (모노머 2) 을 이하의 중합 조건 6 에서 공중합시켜 이루어지고, 모노머 1 에서 유래하는 구성 단위 1 과 모노머 2 에서 유래하는 구성 단위 2 의 몰비가 4 : 1 이고, GPC 측정에 의해 얻어지는 중량 평균 분자량 Mw 가 20000 인, 알릴아민염산염·디알릴아민염산염 공중합체를 사용한 것 이외에는, 올리고-올리고 2 본쇄 융해 시험을 실시하였다.
중합 조건 6 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 1 L 의 4 구 플라스크에 57.22 질량％ 의 알릴아민염산염 490.48 g (3.00 몰) 과 65.22 질량％ 의 디알릴아민염산염 153.66 g (0.75 몰) 을 주입하고, 60 ℃ 로 승온시켰다. 30 질량％ 의 V-50 (2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)이염산염) 현탁액을, 당해 현탁액 중의 V-50 량이 모노머 전체량에 대하여 1.00 질량％ 가 되는 양만큼 첨가하고, 중합을 개시시켰다. 24 시간 후에 1.00 질량％, 48 시간 후에 0.50 질량％ 첨가하고, 추가로 하룻밤 반응시켰다.
도 17 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 18 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 17 및 18 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 명확한 피크가 검출되지 않아, Tm 값의 결정이 곤란하였다.
[비교예 6]
이하의 반응 조건 1 에 의해 얻어진, GPC 측정에 의해 얻어지는 중량 평균 분자량 Mw 가 15000 인, 50 몰％ 아세틸화폴리알릴아민을 사용한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재에 따른, 기준 핵산 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (기준 ΔTm) 과, 변이 사슬 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (시료 ΔTm) 을 결정하고, 양자의 차 (ΔΔTm) 를 산출하였다.
도 19 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 20 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 19 및 20 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 명확한 피크가 검출되지 않아, Tm 값의 결정이 곤란하였다.
반응 조건 1 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 20 L 의 4 구 플라스크에 15.15 질량％ 의 알릴아민 중합체 (제품명 : PAA-15C, 닛토보 메디컬 제조) 17.00 ㎏ (45.11 몰) 을 주입하였다. 그 후, 냉각시키면서 무수 아세트산 2.37 ㎏ (22.55 몰) 을 적하하고, 실온에서 하룻밤 반응시켰다.
[비교예 7]
GPC 측정에 의해 얻어지는 중량 평균 분자량 Mw 가 20000 이고, 이하의 중합 조건 7 에서 중합시켜 이루어지는, 폴리아크릴아미드를 사용한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재에 따른, 기준 핵산 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (기준 ΔTm) 과, 변이 사슬 및 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (시료 ΔTm) 을 결정하고, 양자의 차 (ΔΔTm) 를 산출하였다.
중합 조건 7 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 증류수를 186.59 g 주입하고, 60 ℃ 로 승온시켰다. 과황산암모늄을 0.75 g 첨가한 후, 아크릴아미드 (고형분 농도 97 질량％) 를 25.65 g (0.35 몰 상당), 증류수를 36.55 g 혼합한 용액을 5 시간에 걸쳐서 적하하고, 하룻밤 반응을 계속하였다.
도 21 에, 반응액 1, 2 및 5 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 22 에, 반응액 3, 4 및 6 으로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 21 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 38.4 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 기준 핵산과 상보 사슬 간의 Tm 값은, 49.81 ℃ 가 되어, 11.41 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
또, 도 22 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 31.64 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 변이 사슬과 상기 상보 사슬 간의 Tm 값은, 42.14 ℃ 가 되어, 10.50 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
이 결과, 기준 핵산과 상보 사슬 간과, 변이 사슬과 상보 사슬 간에서는, 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서의 Tm 값의 상승에 대해, 불과 0.91 ℃ 의 차밖에 확인되지 않았다.
이하에 시험 결과를 정리하여 나타낸다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
[실시예 5]
기준 핵산에 대한 상보 사슬로서, 일부가 BNA 로 구성되어 있는 비천연 올리고 DNA 를 사용하고, 실시예 1 과 동일하게 하여, 미스매치의 검출에 대해 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체를 평가하였다.
1. 폴리머 수용액 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제)
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, 실시예 1 에서 사용한 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 공중합체를 10.0 질량％ 포함하고, pH 가 7.0 인, 폴리머 수용액을 조제하였다.
2. 기준 핵산, 상보적인 서열로 이루어지는 핵산 및 변이를 갖는 핵산
기준 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대하여 1 염기의 변이를 검출 가능한지 평가하기 위해, 이하의 올리고 DNA 를 사용하였다.
Figure pct00039
[화학식 33]
Figure pct00040
3. 반응액의 조제
이하의 반응액 1 내지 4 를 조제하였다.
Figure pct00041
4. 2 본쇄 융해 곡선의 작성
조제한 각 반응액을, StepOnePlus 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 에 세팅하고, 95 ℃ 에서 15 초간 가열한 후, 10 ℃ 에서 1 분간 보온하고, 이어서, 0.3 초마다 형광 계측을 실시하면서, 95 ℃ 까지 승온시켜 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그 후, 95 ℃ 에서 15 초간 유지하였다.
[시험 결과]
도 23 에, 반응액 1 및 2 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 24 에, 반응액 3 및 4 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 23 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 기준 핵산 및 BNA 상보 사슬 간의 Tm 값은, 63.74 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 기준 핵산 및 BNA 상보 사슬 간의 Tm 값은, 92.95 ℃ 가 되어, 29.21 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
또, 도 24 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 변이 사슬 및 상기 BNA 상보 사슬 간의 Tm 값은, 62.40 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 변이 사슬 및 상기 BNA 상보 사슬 간의 Tm 값은, 79.92 ℃ 가 되어, 17.52 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
이 결과, 기준 핵산 및 BNA 상보 사슬 간과, 변이 사슬 및 BNA 상보 사슬 간에서는, 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서의 Tm 값의 상승에 대해, 11.69 ℃ 의 차가 확인되었다.
[실시예 6]
2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제로서, 실시예 2 에서 사용한 디알릴아민염산염·말레산 공중합체를 10.0 질량％ 포함하고, pH 가 7.0 인, 폴리머 수용액을 사용한 것 이외에는, 실시예 5 와 동일하게 하여 각 반응액으로부터 2 본쇄 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재에 따른, 기준 핵산 및 BNA 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (기준 ΔTm) 과, 변이 사슬 및 BNA 상보 사슬 간의 Tm 상승폭 (시료 ΔTm) 을 결정하고, 양자의 차 (ΔΔTm) 를 산출하였다.
도 25 에, 각각 반응액 1 및 2 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타내고, 도 26 에, 반응액 3 및 4 로부터 얻어진 2 본쇄 융해 곡선을 나타낸다. 도 25 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 기준 핵산 및 BNA 상보 사슬 간의 Tm 값은, 63.74 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 기준 핵산 및 BNA 상보 사슬 간의 Tm 값은, 92.95 ℃ 가 되어, 29.21 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
또, 도 26 에 나타내는 바와 같이, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 비존재하에서는, 변이 사슬 및 상기 BNA 상보 사슬 간의 Tm 값은, 62.40 ℃ 가 되었다. 한편, 상기 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서는, 변이 사슬 및 상기 BNA 상보 사슬 간의 Tm 값은, 81.10 ℃ 가 되어, 18.70 ℃ 의 Tm 값의 상승이 확인되었다.
이 결과, 기준 핵산 및 BNA 상보 사슬 간과, 변이 사슬 및 BNA 상보 사슬 간에서는, 폴리머 (2 본쇄 핵산의 Tm 상승화제) 의 존재하에서의 Tm 값의 상승에 대해, 10.51 ℃ 의 차가 확인되었다.
실시예 5 및 6 의 시험의 결과를 정리하여 이하에 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제로서,
    일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
    Figure pct00043

    (식 중, R1 은 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1),
    일반식 (I-c) 혹은 일반식 (I-d)
    Figure pct00044

    (식 중, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기이고, Xa- 는 카운터 이온을 나타내고, a 는 그 카운터 이온의 가수를 나타낸다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (1-2),
    일반식 (1-e)
    Figure pct00045

    (식 중, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기, 또는 탄소수 5 ∼ 6 의 시클로알킬기를 나타낸다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-3), 그리고
    일반식 (1-f)
    Figure pct00046

    (식 중 R6 은 수소 원자 또는 메틸기, R7 및 R8 은 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 4 의 알킬기를 나타내고, n 은 2 ∼ 4 의 정수이다) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 카티온성 구성 단위 (1) 과,
    일반식 (II-a)
    Figure pct00047

    (식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-1),
    일반식 (II-b)
    Figure pct00048

    (식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-2),
    일반식 (II-c)
    Figure pct00049

    (식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-3), 그리고,
    일반식 (II-d)
    Figure pct00050

    (식 중 R10 은, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1 종의 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는 양쪽성 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 카티온성 구성 단위 (1) 이, 구성 단위 (1-1) 및 구성 단위 (1-4) 로 이루어지는 군에서 선택되고,
    상기 아니온성 구성 단위 (2) 가, 구성 단위 (2-1) 및 구성 단위 (2-4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제.
  4. 시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치의 검출 방법으로서,
    (1) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재하는 2 본쇄 핵산의 융해 온도 상승화제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기 프로브 핵산과 상기 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 측정하고, 상기 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 프로브 핵산과, 상기 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 융해 온도의 상승값 (기준 ΔTm) 을 결정하는 공정과,
    (2) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기 시료 핵산과 상기 프로브 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 측정하고, 상기 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 시료 핵산과 상기 프로브 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도의 상승값 (시료 ΔTm) 을 결정하는 공정과,
    (3) 상기 기준 ΔTm 에서 상기 시료 ΔTm 을 뺀 값 (ΔΔTm) 에 기초하여, 핵산 미스매치의 유무를 판정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 미스매치의 검출 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 ΔΔTm 이 5.0 ℃ 이상인 경우, 핵산 미스매치가 존재하는 것으로 판정하는, 핵산 미스매치의 검출 방법.
  6. 시료 핵산과 프로브 핵산 간의 핵산 미스매치 검출 키트로서,
    상기 프로브 핵산과,
    상기 프로브 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산과,
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 포함하는, 핵산 미스매치 검출 키트.
  7. 시료 핵산의 기준 핵산에 대한 변이를 검출하는 방법으로서,
    (1) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기 기준 핵산과 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 측정하고, 상기 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 기준 핵산과 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도의 상승값 (기준 ΔTm) 을 결정하는 공정과,
    (2) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기 시료 핵산과 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도를 측정하고, 상기 양쪽성 공중합체의 존재에 따른, 상기 시료 핵산과 상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산의 2 본쇄 핵산의 융해 온도의 상승값 (시료 ΔTm) 을 측정하는 공정과,
    (3) 상기 기준 ΔTm 에서 상기 시료 ΔTm 을 뺀 값 (ΔΔTm) 에 기초하여, 변이의 유무를 판정하는 공정을 포함하는, 변이의 검출 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 ΔΔTm 이 5.0 ℃ 이상인 경우, 변이가 존재하는 것으로 판정하는, 변이의 검출 방법.
  9. 시료 핵산과 기준 핵산 간의 변이 검출 키트로서,
    상기 기준 핵산과,
    상기 기준 핵산에 상보적인 염기 서열을 구비하는 핵산과,
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재하는 융해 온도 상승화제를 포함하는, 변이 검출 키트.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4151696A4 (en) * 2020-05-14 2024-05-29 National Institute Of Advanced Industrial Science and Technology SOLID HEAT ACCUMULATOR MATERIAL WITH REGULATED THERMAL CONDUCTIVITY AND COMPOSITE
US20250075035A1 (en) * 2021-12-10 2025-03-06 Nitto Boseki Co., Ltd. Agent for raising melting temperature (tm value) of nucleic acid

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4731324U (ko) 1971-05-06 1972-12-08
JPS5030998B1 (ko) 1970-03-11 1975-10-06
JPS5813263U (ja) 1981-07-20 1983-01-27 タカタ株式会社 シ−トベルト装置における緩衝装置
JPS6242336U (ko) 1985-08-30 1987-03-13
JPH0375631U (ko) 1989-11-21 1991-07-30
JPH0415175U (ko) 1990-05-30 1992-02-06
JP2001078769A (ja) 1999-09-16 2001-03-27 Atsushi Maruyama ヌクレオチド配列の間の交換を促進するためのカチオン性高分子調製物
JP2001089496A (ja) 1999-07-22 2001-04-03 Sankyo Co Ltd 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
WO2003018841A1 (fr) 2001-08-24 2003-03-06 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering Procede de determination d'un mesappariement entre des molecules d'acide nucleique monobrin
WO2003068795A1 (fr) 2002-02-13 2003-08-21 Takeshi Imanishi Analogues de nucleoside et derive d'oligonucleotide comprenant un analogue nucleotidique de ces composes
JP2003528626A (ja) 2000-03-29 2003-09-30 エルジーシー・リミテッド ハイブリダイゼーション・ビーコン、並びに迅速に配列を検出および判別する方法
WO2005021570A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Gene Design, Inc. Ｎ−０結合性架橋構造型新規人工核酸
JP2005058107A (ja) 2003-08-13 2005-03-10 Arkray Inc 融解曲線解析法
JP2008278779A (ja) 2007-05-09 2008-11-20 Asahi Kasei Corp 核酸ハイブリダイゼーション用溶液
JP2016167320A (ja) 2016-06-20 2016-09-15 日本電信電話株式会社 入力装置、入力支援方法および入力支援プログラム

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10031236A1 (de) * 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
EP1377679B1 (en) * 2000-12-14 2009-10-28 Gen-Probe Incorporated Method and kit for enhancing the association rates of polynucleotides
EP2554680B1 (en) * 2010-03-29 2016-10-12 Toppan Printing Co., Ltd. Method for distinguishing target base sequence
JP6972546B2 (ja) 2016-12-27 2021-11-24 日東紡績株式会社 セルロース系繊維用染料固着剤
US20250075035A1 (en) * 2021-12-10 2025-03-06 Nitto Boseki Co., Ltd. Agent for raising melting temperature (tm value) of nucleic acid

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5030998B1 (ko) 1970-03-11 1975-10-06
JPS4731324U (ko) 1971-05-06 1972-12-08
JPS5813263U (ja) 1981-07-20 1983-01-27 タカタ株式会社 シ−トベルト装置における緩衝装置
JPS6242336U (ko) 1985-08-30 1987-03-13
JPH0375631U (ko) 1989-11-21 1991-07-30
JPH0415175U (ko) 1990-05-30 1992-02-06
JP2001089496A (ja) 1999-07-22 2001-04-03 Sankyo Co Ltd 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
JP2001078769A (ja) 1999-09-16 2001-03-27 Atsushi Maruyama ヌクレオチド配列の間の交換を促進するためのカチオン性高分子調製物
JP2003528626A (ja) 2000-03-29 2003-09-30 エルジーシー・リミテッド ハイブリダイゼーション・ビーコン、並びに迅速に配列を検出および判別する方法
WO2003018841A1 (fr) 2001-08-24 2003-03-06 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering Procede de determination d'un mesappariement entre des molecules d'acide nucleique monobrin
WO2003068795A1 (fr) 2002-02-13 2003-08-21 Takeshi Imanishi Analogues de nucleoside et derive d'oligonucleotide comprenant un analogue nucleotidique de ces composes
JP2005058107A (ja) 2003-08-13 2005-03-10 Arkray Inc 融解曲線解析法
WO2005021570A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Gene Design, Inc. Ｎ−０結合性架橋構造型新規人工核酸
JP2008278779A (ja) 2007-05-09 2008-11-20 Asahi Kasei Corp 核酸ハイブリダイゼーション用溶液
JP2016167320A (ja) 2016-06-20 2016-09-15 日本電信電話株式会社 入力装置、入力支援方法および入力支援プログラム

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