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KR20240095306A - 5'-캡핑된 rna를 합성하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

5'-캡핑된 rna를 합성하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20240095306A
KR20240095306A KR1020247017688A KR20247017688A KR20240095306A KR 20240095306 A KR20240095306 A KR 20240095306A KR 1020247017688 A KR1020247017688 A KR 1020247017688A KR 20247017688 A KR20247017688 A KR 20247017688A KR 20240095306 A KR20240095306 A KR 20240095306A
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ome
rna
oligonucleotide primer
transcription
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KR1020247017688A
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리차드 아이. 호그리프
알렉산더 레베데브
앤톤 피. 맥카프리
동원 신
Original Assignee
트리링크 바이오테크놀로지스, 엘엘씨
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Publication date
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Abstract

본원에는 5' 캡핑된 RNA를 합성하기 위한 방법 및 조성물이 제공되며, 여기서 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반 형태 m7Gppp[N2'Ome]n[N]m을 가지며, 여기서 m7G은 N7-메틸화 구아노신 또는 임의의 구아노신 유사체이고, N은 임의의 천연, 변형된 또는 비천연 뉴클레오시드이고, "n"은 0 내지 4의 임의의 정수일 수 있고, "m"은 1 내지 9의 정수일 수 있다.

Description

5'-캡핑된 RNA를 합성하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR SYNTHESIZING 5'-CAPPED RNAS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 9월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 62/221,248을 우선권 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2016년 11월 16일에 생성된, 상기 ASCII 카피는 095109-000500PC-1022543_SL.txt로 명명되고 785 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 5'-캡핑된 RNA의 합성을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정한 측면에서, 본 발명은 천연 또는 변형된 5'-캡 0, 캡 1, 캡 2 또는 트리메틸구아노신-캡 (TMG-캡) 구조를 갖는 신규한 캡 함유 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다. 추가적인 측면에서, 본 발명은 이러한 캡 함유 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머를 효율적으로 생성하는 방법 및 5'-캡핑된 RNA를 제조하기 위해 상기 프라이머를 사용하는 방법에 관한 것이다.
하기 기재사항은 독자의 이해를 돕기 위해 제공된다. 제공된 정보 또는 인용된 참고문헌 중 어느 것도 본 발명의 선행 기술이라고 인정되지 않는다.
치료적 적용을 위한 생리학적으로 중요한 단백질을 코딩하는 메신저 RNA (mRNA)는 유전 물질을 전달하기 위해 DNA 기반 플라스미드 및 바이러스 벡터에 비해 상당한 이점을 제시한 바 있다. 이들 이점 중 가장 중요한 것은 하기와 같다:
(i) 높은 수준의 안전성을 나타내고 (바이러스 또는 플라스미드 통합으로 인한 잠재적 게놈 손상이 저하됨),
(ii) mRNA 전달은 즉각적인 단백질 발현을 초래하며 (일반적으로 플라스미드를 이용하는 경우에 발생하는 지연 반응과는 다름),
(iii) mRNA는 단백질의 발현 전반에 걸쳐 강력한 용량 의존적 제어를 가능하게 하고,
(iv) 플라스미드 및 바이러스 벡터의 제작과 비교해서 mRNA를 대규모로 합성하는 것이 간단하다.
메신저 RNA는 사실상 공지된 어떠한 단백질에 대해서도 코딩될 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 각종 방법에 의해 특이적 조직 및 기관에 전달될 수 있다. 일단 전달되면, 이들 mRNA는 표적화된 조직 내에서 리보솜 단백질 발현을 유도하여 mRNA 분자당 수백 개의 단백질이 생성된다.
각각의 활성 mRNA 분자에 존재하는 여러 가지 구조적 요소가 상기 코딩된 단백질을 효율적으로 번역하는데 활용된다. 이들 요소 중 하나가 mRNA의 5'-말단 상에 있는 캡 구조인데, 이는 모든 진핵 유기체 (및 일부 바이러스)에 존재한다. 천연적으로 발생하는 캡 구조는 구아닌 염기의 위치 N7에서 메틸화되는 리보-구아노신 잔기를 포함한다. 이러한 7-메틸구아노신 (7mG)은 5'- 내지 5'-트리포스페이트 쇄를 통하여 mRNA 분자의 5'-말단에 연결된다. 본 출원 전반에 걸쳐, 7m과 m7은 등가의 의미를 갖는 것으로 상호 교환적으로 사용된다. 5'-말단 상에 7mGppp 단편이 존재하는 것이 mRNA 성숙에 필수적인데, 이는:
mRNA가 엑소뉴클레아제에 의해 분해되지 못하게 해주고,
mRNA가 핵으로부터 세포질로 수송되는 것을 촉진시켜 주며,
번역 개시 복합체의 어셈블리에 있어 중요한 역할을 한다 (Cell 9:645-653, (1976); Nature 266:235, (1977); Federation of Experimental Biologists Society Letter 96:1-11, (1978); Cell 40:223-24, (1985); Prog. Nuc. Acid Res. 35:173-207, (1988); Ann. Rev. Biochem. 68:913-963, (1999); J. Biol. Chem. 274:30337-3040, (1999)).
상기 캡 구조를 수반하는 mRNA 만이 캡 의존적 번역에서 활성적이고; mRNA의 "캡 제거"는 단백질 합성에 대한 그의 주형 활성을 거의 완전히 상실하게 만든다 (Nature, 255:33-37, (1975); J. Biol. Chem., vol. 253:5228-5231, (1978); 및 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:1189-1193, (1975)).
진핵 mRNA의 또 다른 요소는 전사체 위치 1 (캡 1)에, 및 일부 경우에는 전사체 위치 1 및 2 (캡 2)에 2'-O-메틸 뉴클레오시드 잔기가 존재하는 것이다. 보다 높은 효능의 생체 내 mRNA 번역을 위해서는 mRNA의 2'-O-메틸화가 필요하고 ( 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3952-3956 (1980)]), 이는 5'-캡핑된 mRNA의 뉴클레아제 안정성을 추가로 개선시킨다. 캡 1 (및 캡 2)을 수반한 mRNA는 세포가 진실한 mRNA 5 '말단을 인식할 수 있게 해주는 특유의 마크이며, 일부 경우에는 감염성 유전 요소로부터 발산되는 전사체에 대항하여 구별할 수 있게 해준다 (Nucleic Acid Research 43: 482-492 (2015)).
1차 mRNA 전사체는 생체 내에서 NTP (전형적으로 GTP)로 출발하는 RNA 합성의 개시로부터 비롯되는 5'-트리포스페이트 기를 수반한다 (5'-pppmRNA). mRNA 전사체의 5'-삼인산화된 말단을 캡 구조 (캡 0)로 전환시키는 것은 몇 가지 효소적 단계를 통하여 이루어진다 (J. Biol. Chem. 250:9322, (1975); J. Biol. Chem. 271:11936, (1996); J. Biol. Chem. 267:16430, (1992)). 이들 효소적 반응 단계는 하기를 포함한다:
단계 1: RNA 트리포스파타제는 mRNA의 5'-트리포스페이트를 5'-디포스페이트로 전환시키고 [pppN1(pN)x→ppN1(pN)x + 무기 포스페이트];
단계 2: RNA 구아닐트랜스퍼라제는 GTP를 사용하여 GMP 잔기를 mRNA의 5'-디포스페이트로 전달하며 [ppN1(pN)x + GTP→G(5')ppp(5')N1(pN)x + 무기 피로포스페이트];
단계 3: 구아닌-7-메틸트랜스퍼라제는 S-아데노실-메티오닌 (AdoMet)을 보조인자로서 사용하여 AdoMet로부터의 메틸 기를 구아닌 염기의 7-질소로 전달한다 [G(5')ppp(5')N1(pN)x + AdoMet → 7mG(5')ppp(5')N1(pN)x + AdoHyc)].
이들 효소적 활성으로부터 비롯되는 RNA가 "5' 캡핑된 RNA" 또는 "캡핑된 RNA"로서 지칭되고, "캡핑된 RNA"의 형성을 초래하는 상기 공정에 관여한 효소의 조합물이 "캡핑 효소"로서 지칭된다. 이러한 효소의 클로닝된 형태를 포함한 캡핑 효소가 많은 공급원으로부터 확인 및 정제되었고, 이는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66:1-40, (2001); Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 50:101-129, (1995); 및 Microbiol. Rev. 44:175, (1980)). 캡 뉴클레오티드를 캡핑 효소에 의해 1차 RNA의 5'-말단에 부가함으로써 생성되는 캡핑된 RNA가 "캡 0 구조"를 갖는 캡핑된 RNA로서 지칭되어 왔다 (J. Biol. Chem. 269:14974-14981, (1994); J. Biol. Chem. 271:11936-11944, (1996)). 시험관 내에서 캡 0 구조를 갖는 캡핑된 RNA를 합성하기 위해 캡핑 효소를 사용하여 왔다 (J. Biol. Chem. 255:11588, (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:9573, (1997); J. Biol. Chem. 267:16430, (1992); J. Biol. Chem. 269:14974, (1994); 및 J. Biol. Chem. 271:11936, (1996)).
5'-캡 0 구조를 갖는 캡핑된 RNA는 (뉴클레오시드-2'-O-) 메틸트랜스퍼라제의 작용에 의해 생체 내에서 "캡 1" 구조로 추가로 변환될 수 있다 (J. Biol. Chem. 269:14974-14981, (1994); J. Biol. Chem. 271:11936-11944, (1996); 및 EMBO 21:2757-2768, (2002)). 예를 들어, 백시니아 mRNA (뉴클레오시드-2'-O) 메틸트랜스퍼라제는 하기 반응식에 의해 캡 0 구조를 갖는 5'-캡핑된 RNA의 5'-끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 2'-히드록실 기의 메틸화를 촉매할 수 있다:
7mG(5')ppp(5')N1pN2(pN)x + AdoMet → 7mG(5')ppp(5')N1 2'-OMepN2(pN)x + AdoHyc.
캡 1 구조를 갖는 디메틸화된 캡핑된 RNA가, 캡 0 구조를 갖는 캡핑된 RNA보다 더 효율적으로 번역되는 것으로 보고되었다 (Nucleic Acids Res. 26:3208, (1998)). 진핵 세포는 또 다른 (뉴클레오시드-2'-O) 메틸트랜스퍼라제 (예를 들어 인간 세포에서의 hMTR2 (Nucleic Acids Res. 39:4756 (2011)))를 활용하여 5'-캡핑된 RNA의 두 번째로 전사된 뉴클레오티드의 2'-히드록실 기의 메틸화를 촉매하여, 하기 반응식에 의해 캡 1 구조를 캡 2 구조로 전환시킨다:
7mG(5')ppp(5')N1 2'-OMe pN2(pN)x + AdoMet → 7mG(5')ppp(5')N1 2'-OMepN2 2'-OMe (pN)x + AdoHyc.
대략 50%의 진핵 mRNA가 캡 2 구조를 갖는다.
다양한 생물학적 연구를 위하여 긴 기능성 RNA를 생성하기 위해, 1차 RNA의 시험관내 효소적 합성 방법이 1980년대 중반에 개발되었다 (Methods Enzymol. 180:51-62, (1989); Nucl. Acids Res., 10:6353-6362, (1982); Meth. Enzymol., 180:42-50 (1989); Nucl. Acids Res., 12:7035-7056, (1984), 및 Nucleic Acid Research 15: 8783-8798, (1987)).
시험관내 전사 후, 5'-트리포스페이트 기를 수반하는 1차 mRNA 전사체를 캡핑 효소로 추가로 캡핑시킬 수 있다. 그러나, 시험관내 효소적 5'-캡핑은 비용이 많이 들고, 힘들며, 비효율적이고 제어하기 어렵다.
이러한 단점을 고려하여, 화학적으로 합성된 디뉴클레오티드 7mG(5')ppp(5')G (mCAP로서 지칭되기도 함)를 사용하여 전사를 개시하는, 캡핑된 mRNA의 시험관내 합성을 위한 또 다른 방법이 개발되었다 (RNA 1: 957-967, (1995)). 상기 mCAP 디뉴클레오티드는 성숙한 mRNA의 5'-캡 0 구조를 함유하지만, 캡 1 및 캡 2 구조에 대하여 특징적인 2'-O-메틸 뉴클레오시드는 갖지 않는다.
그러나, 합성 mCAP 디뉴클레오티드를 사용하여 시험관내 전사를 개시하는 것에 기인한 2가지 주요 단점이 있다. 첫 번째는 mRNA 합성의 개시를 놓고 mCAP와 pppG가 강력하게 경쟁하는 것이다. mRNA가 pppG로 개시되면, 이로써 생성된 ppp-mRNA는 번역에서 불활성이고 5'-트리포스페이트의 존재로 인해 면역원성이다. 그에 상응하여, mRNA가 mCAP로 개시되면, 생성된 5'-캡핑된-mRNA는 번역에서 활성이며 면역원성이 아니다.
5'-캡핑된 mRNA 대 5'-비캡핑된 (또는 5'-삼인산화된; pppmRNA) mRNA의 비를 개선시키기 위해서는, pppG에 비해 과량의 7mGpppG (4:1 내지 10:1)를 사용하여 5'-캡 구조 mRNA 전사체의 생성을 촉진시켜야 한다 (80 내지 90% 이하). 이러한 접근법의 부정적인 측면은 전사 동안 GTP 공급이 신속하게 고갈되고 비용이 많이 들 수 있는 합성 mCAP 이량체가 대량으로 필요하기 때문에 mRNA의 전체 수율이 상당히 감소한다는 것이다. 전사 후, 5'-캡핑된 mRNA와 5'-pppmRNA 둘 다를 함유하는 조질의 혼합물을 알칼리성 포스파타제로 추가적으로 처리하는 것이, 합성된 mRNA의 면역원성을 저하시키기 위해 pppmRNA로부터 비캡핑된 5'-트리포스페이트 기를 제거하는데 필요하다. 포스파타제 처리 후에 수득된 mRNA의 비캡핑된 5'-OH 형태는 불활성이고 번역 프로세스에 참여하지 않는다.
비대칭 mCAP 디뉴클레오티드를 사용할 때 또 다른 단점인 양방향 개시가 발생할 수 있다. 7mGpppG의 G 또는 7mG 모이어티 중 하나의 3'-히드록실 기가 거의 동일한 확률로 전사 신장을 위한 개시 지점으로서 작용하는 경향이 있다. 이는 전형적으로, 전사 반응의 조건에 따라서 7mG(5')pppG(pN)n 및 G(5')ppp7mG(pN)n 형태의 2개의 이성질체 RNA를 대략 동일한 비율로 합성시킨다 (RNA 1: 957-967, (1995)).
mCAP 디뉴클레오티드를 이용한 mRNA 합성의 양방향 개시를 없애기 위해, 7mG 잔기의 3'-OH 기를 OCH3 ("OMe")로 대체시킨 신규한 변형된 mCAP 유사체: 7mG(3'-O-Me)pppG (역 반전 캡 유사체 (ARCA)로서 공지되기도 함)가 개발되었다. ARCA는 정확한 정방향에서만 mRNA 합성을 개시한다 (RNA 7:1486-1495 (2001)). 몇 가지 유형의 ARCA 유사체가 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,074,596 참조). 그러나, 대부분의 mRNA 전사체 분자가 반드시 5'-캡 구조를 갖기 위해서는 pppG에 비해 큰 몰 과량의 ARCA가 여전히 필요하다. 추가의 단점은 7mGpppG2'-OMe 캡 이량체 (RNA 1: 957, (1995)) 또는 그의 ARCA 유사체를 사용해서는 캡 1 구조를 갖는 mRNA를 합성할 수 없다는 것이다.
현재에는, 캡 1 구조를 함유하는 활성 긴 mRNA의 생성에 대한 공지된 경로가 효소적 캡핑 및 5'-삼인산화된 mRNA 전사체의 효소적 2'-O-메틸화 또는 mCAP-캡핑된 또는 ARCA-캡핑된 mRNA 전구체의 효소적 2'-O-메틸화로 이루어진다 (Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 25:337-340, (2006) 및 Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids 25(3):307-14, (2006)). 접근법 둘 다가 상당히 힘들고, 제어하기 어려우며, 심지어 상당한 최적화가 이루어지더라도, 어떠한 접근법도 캡핑되고 메틸화된 mRNA 전구체의 높은 수율을 보장할 수 없다 (J. Gen. Virol., 91:112-121, (2010)). 추가로, 캡 2 구조를 갖는 mRNA를 제조하는 방법은 훨씬 더 어렵고 결과는 예측하기 힘들다. 캡 1을 캡 2로 전환시키기 위한 효소는 현재 상업적으로 이용가능하지 않다.
mRNA를 특히 대규모로 제작하는데 있어서의 시험관내 합성의 또 다른 중요한 문제는, 불활성이고 일부 경우에서는 면역원성인 비캡핑된 모든 mRNA 형태로부터 캡을 수반하는 활성 mRNA 분자를 단리하고 정제해야 하는 필요성이다. 불행하게도, 이들 방법은 사소한 것이 아니며, 종종 캡핑된 RNA 전사체를 더 용이하게 단리 및 정제할 수 있도록 해주는 접합된 친화성 태그 모이어티를 수반한 변형된 mCAP 유사체의 합성을 필요로 한다. 리포터/친화성 모이어티로서 친화성 태그를 갖는 mCAP 유사체를 합성하는 방법 및 전사 반응 혼합물로부터 캡핑된 RNA를 단리하기 위한 신규한 프로토콜이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,344,118 참조). 이러한 접근법은 효율적이긴 하지만, 더 비싼 mCAP 유사체의 사용이 필요하며 캡 0 구조만을 함유하는 mRNA의 제조 및 단리를 허용한다.
천연 및 변형된 RNA의 시험관내 합성은 리보자임, 안티센스, 생물 물리학적 및 생화학적 연구를 포함한 각종 적용 분야에 사용된다. 추가적으로, 캡핑된 mRNA 전사체는 단백질 합성을 필요로 하는 적용 분야, 예컨대 생체내 발현 실험 (미세 주사, 형질감염 및 감염을 이용함), 시험관내 번역 실험 및 검정뿐만 아니라 치료제, 진단제, 백신 개발, 표지화 및 검출에 있어서의 다양한 적용 분야에 사용된다.
결과적으로, (a) 통상적인 방법보다 힘들지 않고, (b) 전사 동안 양방향 개시를 제거하거나 또는 감소시켜 주며, (c) 보다 높은 수율의 mRNA를 생성시키고, (d) 현재의 방법과 비교해서 비용을 절감시켜 주며, (e) 상이한 5'-서열을 갖는 이종 생성물의 생성을 감소시켜 주고, (f) 캡 1 및 캡 2 구조를 상기 합성된 mRNA 내로 혼입하기 위해 추가적인 효소적 반응을 필요로 하지 않는, mRNA의 대규모 합성을 가능하게 하는 조성물 및 방법이 업계에 필요하다. 또한, 특이적 변형 및/또는 친화성 태그, 예컨대 형광 염료, 방사성 동위원소, 질량 태그 및/또는 분자의 5 '말단 또는 그 근처에서의 비오틴과 같은 분자 결합 쌍의 하나의 파트너를 수반하는, 변형된 및/또는 비천연 뉴클레오시드를 함유하는 다양한 mRNA의 합성이 필요하다.
본원에는 5'-캡핑된 RNA를 합성하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 본 발명의 한 측면에서, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 화학식 I의 일반 구조를 포함한다:
여기서
각각의 B1 내지 B10은 독립적으로 천연, 변형된 또는 비천연 뉴클레오시드 염기이고;
M은 0 또는 1이고;
L은 0 또는 1이고;
q1은 1이고;
각각의 q2 내지 q9는 독립적으로 0 또는 1이고;
R1은 H 또는 메틸이고;
R2 및 R3은 독립적으로 H, OH, 알킬, O-알킬, 할로겐, 아민, 아지드, 링커 또는 검출가능한 마커이고;
각각의 X1 내지 X13은 독립적으로 O 또는 S이고;
각각의 Y1 내지 Y13은 독립적으로 OH, SH, BH3, 아릴, 알킬, O-알킬 또는 O-아릴이고;
각각의 Z0 내지 Z22는 독립적으로 O, S, NH, CH2, C(할로겐)2 또는 CH(할로겐)이고;
각각의 R4 내지 R12는 독립적으로 H, OH, OMe, 링커 또는 검출가능한 마커이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 화학식 I의 캡 함유 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RNA 분자, 이러한 RNA를 포함하는 제약 조성물, 상기 RNA를 함유하는 세포 및 상기 RNA로부터 번역된 단백질 또는 펩티드를 함유하는 세포가 제공된다.
또한 본 발명의 또 다른 측면에서, 화학식 I의 캡 함유 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머를 폴리뉴클레오티드 주형의 RNA 폴리머라제에 의한 전사에 도움이 되는 조건 하에 폴리뉴클레오티드 주형 및 RNA 폴리머라제를 포함하는 혼합물 내로 도입하고, 그 후 생성된 혼합물을 상기 주형의 전사를 허용하는데 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, RNA 분자의 합성 방법이 제공된다.
도 1은 구아노신 5'-디포스페이트로부터 7-메틸구아노신 5-디포스페이트 (pp7mG)를 제조하는 예시적인 방법을 제시하고;
도 2는 pp7mG로부터 7-메틸구아노신 5'-디포스페이트 이미다졸리드 (Im-pp7mG)를 제조하는 예시적인 방법을 제시하고;
도 3은 3'-O-메틸구아노신으로부터 3'-O-메틸구아노신 5'-포스페이트 (pG3'Ome)를 제조하는 예시적인 방법을 제시하고;
도 4는 pG3'Ome로부터 3'-O-메틸구아노신 5'-포스포르이미다졸리드 (Im-pG3'Ome)를 제조하는 예시적인 방법을 제시하고;
도 5는 Im-pG3'Ome로부터 3'-O-메틸구아노신 5'-디포스페이트 (ppG3'Ome)를 제조하는 예시적인 방법을 제시하고;
도 6은 ppG3'Ome로부터 7-메틸-3'-O-메틸구아노신 5-디포스페이트 (pp7mG3'Ome)를 제조하는 예시적인 방법을 제시하고;
도 7은 pp7mG3'Ome로부터 7-메틸-3'-O-메틸구아노신 5-디포스페이트 이미다졸리드 (Im-pp7mG3'Ome)를 제조하는 예시적인 방법을 제시하고;
도 8은 pN2'-OR1pN 올리고뉴클레오티드 (R1 = H 또는 Me)의 제조를 위한 일반적 절차를 제시하고;
도 9는 캡 0, 캡 1 또는 캡 2 구조를 갖는 개시 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 일반적 절차를 나타내고;
도 10a는 B1이 구아닌이고; M이 0이고; L이 1이고; q1 내지 q9가 0이고; R1이 H이고; R2가 H이고; R3이 O-메틸이고; X1이 O이고; X2가 O이고; X13이 O이고; Y13이 OH이고; Z0이 O이고; Z1이 O이고; Z2가 O이고; Z22가 O인 화학식 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시하고;
도 10b는 B1이 구아닌이고; B10이 구아닌이고; M이 0이고; L이 1이고; q1이 1이고; q2 내지 q9가 0이고; R1이 H이고; R2가 H이고; R3이 H이고; X1이 O이고; X2가 O이고; X4가 O이고; X13이 O이고; Y1이 OH이고; Y2가 OH이고; Y4가 OH이고; Y13이 OH이고; Z0이 O이고; Z1이 O이고; Z2가 O이고; Z4가 O이고; Z5가 O이고; Z22가 O이고; R4가 O-메틸인 화학식 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시하고;
도 10c는 B1이 구아닌이고; B10이 구아닌이고; M이 0이고; L이 1이고; q1이 1이고; q2 내지 q9가 0이고; R1이 H이고; R2가 H이고; R3이 O-메틸이고; X1이 O이고; X2가 O이고; X4가 O이고; X13이 O이고; Y1이 OH이고; Y2가 OH이고; Y4가 OH이고; Y13이 OH이고; Z0이 O이고; Z1이 O이고; Z2가 O이고; Z4가 O이고; Z5가 O이고; Z22가 O이고; R4가 O-메틸인 화학식 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시하고;
도 10d는 B1이 아데닌이고; B10이 구아닌이고; M이 0이고; L이 1이고; q1이 1이고; q2 내지 q9가 0이고; R1이 H이고; R2가 H이고; R3이 H이고; X1이 O이고; X2가 O이고; X4가 O이고; X13이 O이고; Y1이 OH이고; Y2가 OH이고; Y4가 OH이고; Y13이 OH이고; Z0이 O이고; Z1이 O이고; Z2가 O이고; Z4가 O이고; Z5가 O이고; Z22가 O이고; R4가 O-메틸인 화학식 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시하고;
도 10e는 B1이 아데닌이고; B10이 구아닌이고; M이 0이고; L이 1이고; q1이 1이고; q2 내지 q9가 0이고; R1이 H이고; R2가 H이고; R3이 O-메틸이고; X1이 O이고; X2가 O이고; X4가 O이고; X13이 O이고; Y1이 OH이고; Y2가 OH이고; Y4가 OH이고; Y13이 OH이고; Z0이 O이고; Z1이 O이고; Z2가 O이고; Z4가 O이고; Z5가 O이고; Z22가 O이고; R4가 O-메틸인 화학식 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시하고;
도 10f는 B1이 시토신이고; B10이 구아닌이고; M이 0이고; L이 1이고; q1이 1이고; q2 내지 q9가 0이고; R1이 H이고; R2가 H이고; R3이 H이고; X1이 O이고; X2가 O이고; X4가 O이고; X13이 O이고; Y1이 OH이고; Y2가 OH이고; Y4가 OH이고; Y13이 OH이고; Z0이 O이고; Z1이 O이고; Z2가 O이고; Z4가 O이고; Z5가 O이고; Z22가 O이고; R4가 O-메틸인 화학식 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시하고;
도 10g는 B1이 시토신이고; B10이 구아닌이고; M이 0이고; L이 1이고; q1이 1이고; q2 내지 q9가 0이고; R1이 H이고; R2가 H이고; R3이 O-메틸이고; X1이 O이고; X2가 O이고; X4가 O이고; X13이 O이고; Y1이 OH이고; Y2가 OH이고; Y4가 OH이고; Y13이 OH이고; Z0이 O이고; Z1이 O이고; Z2가 O이고; Z4가 O이고; Z5가 O이고; Z22가 O이고; R4가 O-메틸인 화학식 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시하고;
도 10h는 B1이 아데닌이고; B2가 구아닌이고; B10이 구아닌이고; M이 0이고; L이 1이고; q1이 1이고; q2가 1이고; q3 내지 q9가 0이고; R1이 H이고; R2가 H이고; R3이 O-메틸이고; X1이 O이고; X2가 O이고; X4가 O이고; X5가 O이고; X13이 O이고; Y1이 OH이고; Y2가 OH이고; Y4가 OH이고; Y5가 OH이고; Y13이 OH이고; Z0이 O이고; Z1이 O이고; Z2가 O이고; Z4가 O이고; Z5가 O이고; Z6이 O이고; Z22가 O이고; R4가 O-메틸이고; R5가 O-메틸인 화학식 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시하고;
도 11은 공동-전사적으로 캡핑된 mRNA의 루시페라제 활성을 제시하고;
도 12a-12h는 집합적으로, 12a) ARCA, 12b) m7GpppG2'OmepG, 12c) m7G3'OmepppG2'OmepG, 12d) m7GpppA2'OmepG, 12e) m7G3'OmepppA2'-OMepG, 12f) m7GpppC2'OmepG, 12g) m7G3'OmepppC2'OmepG, 12h) m7G3'OmepppA2'OmepG2'OmepG로 공동-전사적으로 캡핑된 mRNA의 캡핑 효율을 제시한다. 도 12b-12g에서의 캡핑 효율은 도 12a에서 관찰된 것과 동일하거나 또는 상당히 초과한다;
도 13a-13d는 집합적으로, 전사 주형 상의 m7GpppA2'OmepG로 공동-전사적으로 캡핑된 mRNA의 개시의 충실도 및 캡핑 효율을 제시하며, 여기서 도 13a은 프라이머/NTP 제형 2를 사용하여 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘 잔기를 사용하는 것을 예시하고; 도 13b는 프라이머/NTP 제형 3을 사용하여 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘 잔기를 사용하는 것을 예시하며; 도 13c는 프라이머/NTP 제형 2를 사용하여 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시시티딘 잔기를 사용하는 것을 예시하고; 도 13d는 프라이머/NTP 제형 3을 사용하여 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시시티딘 잔기를 사용하는 것을 예시한다.
도 14a 및 14b는 집합적으로, 주형 위치 +1 및 +2에 시티딘 잔기를 갖는 전사 주형과 비교해서 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘 잔기를 갖는 전사 주형 상에서 m7GpppA2'OmepG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 만든 mRNA의 분화된 THP-1 세포에서의 번역을 비교한 것을 제시한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 개시내용 전반에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 전문이 참조로 포함된다. 본원에서의 특정 용어에 대한 복수 개의 정의가 존재하는 경우에는, 본 섹션에서의 정의가 우선한다.
수치와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대략" 또는 "약"은 명시된 값을 포함하여 정의된 범위 내의 모든 값을 포함하여 표시된 값의 ± 30%를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산", "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 단편, 임의의 리보 또는 데옥시리보 유도체, 및 천연 및/또는 변형된 뉴클레오티드 잔기 및 뉴클레오티드간 연쇄를 함유하는 천연적으로 발생하거나 또는 합성인 분자를 지칭한다. 상기 용어는 또한, 단일 가닥, 이중 가닥, 삼중 가닥 또는 사중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 천연 (예를 들어, 게놈) 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA; 또는 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질을 지칭한다. DNA 서열과 관련하여 "RNA 등가물"은 질소 함유 염기 티민의 전부 또는 대부분이 우라실로 대체되고 당 주쇄가 2'-데옥시리보스 대신 리보스로 구성된다는 것을 제외하고는 참조 DNA 서열과 동일한 뉴클레오티드의 선형 서열로 구성된다. 본원에 제공된 방법 및 조성물에 적합한 추가적인 대체 핵산 주쇄는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 알킬 포스포트리에스테르, 아릴 포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트, 아릴 포스포네이트, 포스포보로네이트, 모르폴리노 핵산 (MNA), 고정 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프라이머" 또는 "올리고뉴클레오티드 프라이머"는 단일 가닥이고, 천연적으로 발생하거나 또는 합성일 수 있으며, 통상적으로 약 2 내지 약 10개의 뉴클레오티드, 약 3 내지 약 8개의 뉴클레오티드 또는 약 3 내지 약 5개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 리보- 또는 데옥시리보- 또는 키메라 리보/데옥시리보-올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하나 이상의 변형 기를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 RNA, DNA, 및/또는 다른 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 DNA 주형 서열의 전사에 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계 및 제조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 유사체" 또는 "개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머"는 프라이머의 5'-말단 상에 캡 0, 캡 1, 캡 2 또는 TMG-캡 구조를 함유하는 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머를 지칭한다. 이와 같이 캡핑된 프라이머는 비변형되거나 또는 개방된 3'-OH 기를 가지며, 프라이머의 3'-말단 상으로의 NTP의 혼입을 통하여 RNA 폴리머라제에 의해 연장될 수 있다. 하기 필수 구성 요소를 함유하는 전사 시스템에서 프로모터의 제어 하에 시험관내 전사를 개시할 수 있다: DNA 주형 (예를 들어 DNA 플라스미드), RNA 폴리머라제, 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 및 적절한 완충제. 또한 본원에 사용된 "개시 프라이머" 또는 "개시 올리고뉴클레오티드 프라이머"는 RNA 폴리머라제에 대한 유효 기질인 말단 3'-OH 기를 수반하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머는 RNA 폴리머라제에 대한 기질이고 프라이머의 3'-말단 상으로의 NTP의 혼입에 의해 신장될 수 있다. 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머는 개시 부위에서 DNA 주형에 대해 상보적이다.
개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 NTP의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "비치환된" 또는 "비변형된"은 변형되지 않은 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 NTP를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머"는 하나 이상의 추가적인 변형 기를 함유하는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형 기"는 당, 뉴클레오시드 염기, 트리포스페이트 브릿지, 및/또는 뉴클레오티드간 포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 여러 위치에서 개시 프라이머에 부착될 수 있는 임의의 화학적 모이어티를 지칭한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 20070281308). 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 변형 기는 전사 프로세스와 임의의 천연적 화합성인 기일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드간 연쇄"는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 핵산의 2개의 뉴클레오시드를 연결시켜 주고 천연 포스포디에스테르 연쇄 또는 변형된 연쇄일 수 있는 결합(들)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표지" 또는 "검출가능한 표지"는 표지를 검출함으로써 특정 분자를 직접적으로 또는 간접적으로 검출할 수 있도록 이러한 분자에 부착될 수 있거나 또는 달리 연합될 수 있는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합물을 지칭한다. 검출가능한 표지는 방사성 동위원소 (예를 들어, 탄소, 인, 아이오딘, 인듐, 황, 삼중 수소 등), 질량 동위원소 (예를 들어, H2, C13 또는 N15), 염료 또는 형광단 (예를 들어, 시아닌, 플루오레세인 또는 쿠마린), 합텐 (예를 들어, 비오틴), 또는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 임의의 다른 작용제일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "혼성화한다" 또는 "특이적으로 혼성화한다"는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 전사 반응 동안 적절하게 엄격한 조건 하에 DNA 주형과 어닐링되는 프로세스를 지칭한다. DNA와의 혼성화는 특정 실시양태에서, 5'-5' 역전된 캡 구조를 포함하여 길이가 3 내지 10개의 뉴클레오티드인 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 시행된다. 핵산 혼성화 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.(1989); Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. (1994)]).
개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머와 DNA 주형의 복합체의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "보체", "상보적" 또는 "상보성"은 표준 왓슨/크릭(Watson/Crick) 염기 쌍 형성 규칙을 지칭한다. 예를 들어, 서열 "5'-A-G-T-C-3'"은 서열 "3'-T-C-A-G-5'"에 대해 상보적이다. 특정의 비-천연 또는 합성 뉴클레오티드는 본원에 기재된 핵산에 포함될 수 있으며; 이들은 염기 및 당 변형된 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 및 핵산, 예컨대 이노신, 7-데아자구아노신, 2'-O-메틸구아노신, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘, 슈도우리딘, 고정 핵산 (LNA), 및 펩티드 핵산 (PNA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상보성은 완벽할 필요가 없으며; 이중체는 미스매치된 염기 쌍, 변성, 또는 비매치된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 조성 및 서열, 미스매치된 염기 쌍의 발생률, 이온 강도, 혼성화 완충제의 성분, 및 반응 조건을 포함한 수많은 변수를 실험적으로 고려하여 이중체 안정성을 결정할 수 있다.
상보성은 2개의 핵산 가닥의 뉴클레오티드 염기 모두가 공인된 염기 쌍 형성 규칙에 따라서 매칭되는 경우에 "완전" 또는 "전체"일 수 있고, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머와 DNA 표적의 뉴클레오티드 염기 중 일부만이 공인된 염기 쌍 형성 규칙에 따라서 매칭되는 경우에 "부분"일 수 있거나 또는 2개의 핵산 가닥의 뉴클레오티드 염기 중 어느 것도 공인된 염기 쌍 형성 규칙에 따라서 매칭되지 않는 경우에 "부재"일 수 있다. 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머와 DNA 주형 간의 상보성의 정도는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드와 DNA 주형 간의 혼성화의 강도 및 이에 상응하게 반응의 효율에 상당한 효과를 미칠 수 있다. 용어 상보성은 또한, 개별 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내의 특정한 뉴클레오티드는 나머지 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머와 DNA 가닥 간의 상보성과 대조적으로 또는 이와 비교해서, 또 다른 가닥 내의 뉴클레오티드에 대한 그의 상보성 또는 그의 결여로써 표시될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "완전", "전체" 또는 "완벽하게" 상보적이란 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머와 DNA 표적의 뉴클레오티드 염기 각각이 공인된 염기 쌍 형성 규칙에 따라서 정확하게 매칭된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 상보적"이란 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 2개의 서열을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 실질적으로 상보적인 서열이 그의 전체 길이를 따라 혼성화할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 특히, 실질적으로 상보적인 서열은 표적 서열과 혼성화되지 않는 염기의 연속되는 서열을 포함할 수 있고, 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열과 혼성화하는 염기의 연속되는 서열에 대해 3' 또는 5'에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열, 및 DNA 주형과 혼성화하는 그의 능력과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "특이적"은 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머와 DNA 가닥이 정렬될 때 DNA 주형의 특정 부분과 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 서열이다. 바람직할 수 있는 더 높은 수준의 서열 동일성은 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 및 가장 바람직한 100% 서열 동일성을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오시드"는 천연에서 발견되는 모든 형태의 뉴클레오시드 염기 및 푸라노시드를 포함한, 천연적으로 발생하는 모든 뉴클레오시드를 포함한다. 천연적으로 발생하는 뉴클레오시드에서 가장 흔히 발견되는 염기 고리는 푸린 및 피리미딘 고리이다. 천연적으로 발생하는 푸린 고리는, 예를 들어, 아데닌, 구아닌, 및 N6-메틸아데닌을 포함한다. 천연적으로 발생하는 피리미딘 고리는, 예를 들어, 시토신, 티민, 5-메틸시토신, 슈도우라실을 포함한다. 천연적으로 발생하는 뉴클레오시드는, 예를 들어, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 우리딘, 이노신, 7-메틸구아노신 또는 슈도우리딘의 리보, 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시리보 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오시드 유사체", "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 유도체"는 본원에 기재된 바와 같은 합성 뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오시드 유도체는 또한, 보호 기를 수반하거나 또는 수반하지 않는, 변형된 염기 또는/및 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드를 포함하고, 예를 들어, 2'-데옥시-2'-플루오로우리딘, 5-플루오로우리딘 등을 포함한다. 본원에 제공된 화합물 및 방법은 상기 염기 고리 및 그의 합성 유사체뿐만 아니라 비천연 헤테로사이클-치환된 염기 당, 및 아시클릭 치환된 염기 당을 포함한다. 본 발명으로 활용될 수 있는 다른 뉴클레오시드 유도체는, 예를 들어, LNA 뉴클레오시드, 할로겐-치환된 푸린 (예를 들어, 6-플루오로푸린), 할로겐-치환된 피리미딘, N6-에틸아데닌, N4-(알킬)-시토신, 5-에틸시토신 등을 포함한다 (미국 특허 번호 6,762,298).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "만능 염기", "변성 염기", "만능 염기 유사체" 및 "변성 염기 유사체"는, 예를 들어, 특정 실시양태에서, 천연 NTP (예를 들어, ATP, UTP, CTP 및 GTP) 중 하나 또는 다른 특이적 NTP에 대한 대체물로서 RNA 폴리머라제에 의해 인식가능한 인공 염기를 수반한 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 만능 염기 또는 변성 염기는 문헌 [Loakes, D., Nucleic Acids Res., 29:2437-2447 (2001); Crey-Desbiolles, C., et al., Nucleic Acids Res., 33:1532-1543 (2005); Kincaid, K., et al., Nucleic Acids Res., 33:2620-2628 (2005); Preparata, FP, Oliver, JS, J. Comput. Biol. 753-765 (2004); 및 Hill, F., et al., Proc Natl Acad. Sci. U S A, 95:4258-4263 (1998)]에 개시된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 NTP"는 당, 염기, 트리포스페이트 쇄, 또는 이들 3개 위치의 임의의 조합을 포함한 임의의 위치에서 결합된 화학적 모이어티 기를 갖는 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트를 지칭한다. 이러한 NTP의 예는, 예를 들어, 문헌 ["Nucleoside Triphosphates and Their Analogs: Chemistry, Biotechnology and Biological Applications," Vaghefi, M., ed., Taylor and Francis, Boca Raton (2005)]에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는, 예를 들어, 변형된 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오티드간 연쇄를 함유하거나 또는 변형된 뉴클레오시드와 뉴클레오티드간 연쇄의 임의의 조합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 뉴클레오티드간 연쇄 변형의 예는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르 및 메틸포스포네이트 유도체를 포함한다 (Stec, W.J., et al., Chem. Int. Ed. Engl., 33:709-722 (1994); Lebedev, A.V., et al., E., Perspect. Drug Discov. Des., 4:17-40 (1996); 및 Zon, et al., 미국 특허 출원 번호 20070281308). 뉴클레오티드간 연쇄 변형의 다른 예는 문헌 [Waldner, et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 6:2363-2366 (1996)]에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 특정한 DNA 서열 (예를 들어 유전자)의 전사의 개시를 유도 및 제어하는 dsDNA 주형의 특정 영역을 지칭한다. 프로모터는 DNA 상의 동일한 가닥 및 상류 (센스 가닥의 5' 영역을 향함)에 위치한다. 프로모터는 전형적으로, 전사될 DNA 서열에 바로 인접하거나 또는 부분적으로 이러한 서열과 중복된다. 프로모터 내의 뉴클레오티드 위치는 DNA의 전사가 시작되는 전사 출발 부위를 기준으로 하여 설계된다 (위치 +1). 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프로모터 서열의 개시 부위 (이는 특정 실시양태에서, 위치 +1 및 +2에 있고, 개시 사량체의 경우에는, 위치 +1, +2 및 +3에 있음)에 대해 상보적이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사" 또는 "전사 반응"은 DNA 주형에 대해 상보적인 RNA를 효소적으로 만듬으로써, DNA 서열의 수많은 RNA 카피를 생성하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 방법을 지칭한다. 전사 반응에서 합성된 RNA 분자가 "RNA 전사체", "1차 전사체" 또는 "전사체"로 지칭된다. 본원에 제공된 조성물 및 방법에 관여한 전사 반응은 "개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머"를 이용한다. DNA 주형의 전사는 지수적, 비선형 또는 선형일 수 있다. DNA 주형은 이중 가닥 선형 DNA, 부분적 이중 가닥 선형 DNA, 환형 이중 가닥 DNA, DNA 플라스미드, PCR 앰플리콘, RNA 폴리머라제와 화합성인 변형된 핵산 주형일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아실"은 기 -C(O)Ra (여기서 Ra는 수소, 저급 알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴 등임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 아실"은 기 -C(O)Ra' (여기서 Ra'는 치환된 저급 알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 헤테로시클릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 등임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아실옥시"는 기 -OC(O)Rb (여기서 Rb는 수소, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릴, 치환된 헤테로시클릴, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴 등임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬"은 일부 실시양태에서, 1-20개의 탄소 원자 범위이고, 일부 실시양태에서 1-8개의 탄소 원자 범위인 탄화수소의 단일 결합 쇄를 지칭하고; 그의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소아밀, 헥실, 옥틸, 도데카닐 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "저급 알킬"은 일부 실시양태에서, 1-6개의 탄소 원자 범위이고, 일부 실시양태에서 2-5개의 탄소 원자 범위인 탄화수소의 직쇄 또는 측쇄를 지칭한다. 그의 예는 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알케닐"은 1개 이상의 이중 결합을 가지며, 달리 명시되지 않는 한, 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자를 함유하고, 일부 실시양태에서 약 2 내지 약 10개의 탄소 원자 범위이고, 일부 실시양태에서 약 2 내지 약 8개의 탄소 원자 범위이며, 일부 실시양태에서 약 2 내지 약 6개의 탄소 원자 범위인 직쇄 또는 측쇄 히드로카르빌을 지칭한다. 알케닐 라디칼의 예는 비닐, 알릴, 1,4-부타디에닐, 이소프로페닐 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알케닐아릴"은 알케닐-치환된 아릴 기이고, "치환된 알케닐아릴"은 본원에 제시된 바와 같은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하고 있는 알케닐아릴 기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알케닐렌"은 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 가지며, 전형적으로 2-20개의 탄소 원자를 함유하고, 일부 실시양태에서 2-12개의 탄소 원자 범위이며, 일부 실시양태에서 2-8개의 탄소 원자 범위인 2가 직쇄 또는 측쇄 히드로카르빌 기를 지칭하고, "치환된 알케닐렌"은 본원에 제시된 바와 같은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하고 있는 알케닐렌 기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬렌"은 1-20개의 탄소 원자를 함유하고, 일부 실시양태에서 1-15개의 탄소 원자 범위인 직쇄 또는 측쇄의 2가 히드로카르빌 기를 지칭하며, 그로부터의 2개의 수소 원자는 동일한 탄소 원자로부터 취하거나 또는 상이한 탄소 원자로부터 취한다. 알킬렌의 예는 메틸렌 (-CH2-), 에틸렌 (-CH2CH2-) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알키닐"은 1개 이상의 삼중 결합을 가지며, 약 2-20개의 탄소 원자를 함유하고, 일부 실시양태에서 약 2-10개의 탄소 원자 범위이며, 일부 실시양태에서 약 2-8개의 탄소 원자 범위이고, 일부 실시양태에서 약 2-6개의 탄소 원자 범위인 직쇄 또는 측쇄 히드로카르빌을 지칭한다. 알키닐 라디칼의 예는 에티닐, 프로피닐 (프로파르길), 부티닐 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알키닐아릴"은 알키닐-치환된 아릴 기를 지칭하고, "치환된 알키닐아릴"은 본원에 제시된 바와 같은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하고 있는 알키닐아릴 기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알콕시"는 기 -ORc (여기서 Rc는 정의된 바와 같은 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로헤테로알킬, 또는 치환된 시클로헤테로알킬임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "저급 알콕시"는 기 -ORd (여기서 Rd는 저급 알킬임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬아릴"은 알킬-치환된 아릴 기이고, "치환된 알킬아릴"은 본원에 제시된 바와 같은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하고 있는 알킬아릴 기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬티오"는 기 -S-Rh (여기서 Rh는 알킬임)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 알킬티오"는 기 -S-Ri (여기서 Ri는 치환된 알킬임)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알키닐렌"은 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 가지며, 전형적으로 약 2-12개의 탄소 원자 범위를 가지고, 일부 실시양태에서 약 2-8개의 탄소 원자 범위를 가지는 2가 직쇄 또는 측쇄 히드로카르빌 기를 지칭하고, "치환된 알키닐렌"은 본원에 제시된 바와 같은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하고 있는 알키닐렌 기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미도"는 기 -C(O)NRjRj' (여기서 Rj 및 Rj'는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 또는 치환된 헤테로아릴일 수 있음)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 아미도"는 기 -C(O)NRkRk' (여기서 Rk 및 Rk'는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 또는 치환된 헤테로아릴이지만, 단 Rk 및 Rk' 중 적어도 하나는 수소가 아님)를 의미한다. RkRk'는 질소와 조합하여, 임의로 치환된 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노" 또는 "아민"은 기 -NRnRn' (여기서 Rn 및 Rn'는 독립적으로 수소이거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 또는 치환된 헤테로아릴일 수 있음)를 의미한다. "2가 아민"은 기 -NH-를 의미한다. "치환된 2가 아민"은 기 -NR- (여기서 R은 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 또는 치환된 헤테로아릴임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 아미노" 또는 "치환된 아민"은 기 -NRpRp' (여기서 Rp 및 Rp'는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴이지만, 단 Rp 및 Rp' 중 적어도 하나는 수소가 아님)를 의미한다. RpRp'는 질소와 조합하여, 임의로 치환된 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아로일"은 아릴-카르보닐 종, 예컨대 벤조일을 지칭하고, "치환된 아로일"은 본원에 제시된 바와 같은 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하고 있는 아로일 기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴"은 단독으로 또는 조합하여, 5-10개의 고리 구성원, 및 일부 실시양태에서 5-6개의 고리 구성원의 시클로알킬을 임의로 수반하고/하거나 할로, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 알킬술피닐, 알킬술포닐, 아실옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시; 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기로 임의로 일치환되거나 또는 이치환된 아미노; 아미디노; 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴 기로 임의로 치환된 우레아; 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기로 임의로 N-일치환되거나 또는 N,N-이치환된 아미노술포닐; 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 헤테로아릴술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 헤테로아릴카르보닐아미노 등 중 1 내지 3개의 기 또는 치환기로 임의로 치환된 융합된 방향족 헤테로시클릭, 페닐 또는 나프틸을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아릴옥시"는 기 -OAr (여기서 Ar은 아릴, 또는 치환된 아릴 기임)을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "카르보사이클"은 연결된 탄소 원자로 구성된 단일 고리 또는 다중 축합 고리를 갖는 포화, 불포화, 또는 방향족 기를 지칭한다. 이러한 고리(들)는 임의로, 비치환되거나 또는 예를 들어, 할로겐, 저급 알킬, 알콕시, 알킬티오, 아세틸렌 (-C≡CH), 아미노, 아미도, 아지도, 카르복실, 히드록실, 아릴, 아릴옥시, 헤테로사이클, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로 (-NO2), 시아노 (-CN), 티올 (-SH), 술파미도 (-S(O)2NH2) 등으로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "구아니디닐"은 기 -N=C(NH2)2를 의미하고, "치환된 구아니디닐"은 기 -N=C(NR2)2 (여기서 각각의 R은 독립적으로 H이거나, 또는 본원에 제시된 바와 같은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 또는 치환된 아릴임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 모든 할로겐, 즉 클로로 (Cl), 플루오로 (F), 브로모 (Br), 및 아이오도 (I)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로아릴"은 기 O, S, 및 N으로부터 독립적으로 선택된 1개 이상, 및 일부 실시양태에서 1-4개 및 일부 실시양태에서 1-3개 및 일부 실시양태에서 1-2개의 헤테로원자를 함유하고 할로, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 알킬술피닐, 알킬술포닐, 아실옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시; 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기로 임의로 일치환되거나 또는 이치환된 아미노; 아미디노; 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴 기로 임의로 치환된 우레아; 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기로 임의로 N-일치환되거나 또는 N,N-이치환된 아미노술포닐; 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 헤테로아릴술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 헤테로아릴카르보닐아미노 등 중 1-3개의 기 또는 치환기로 임의로 치환된, 5 또는 6개의 고리 원자를 함유하는 모노시클릭 방향족 고리 구조, 또는 8-10개의 원자를 갖는 비시클릭 방향족 기를 지칭한다. 헤테로아릴은 또한, 산화된 S 또는 N, 예컨대 술피닐, 술포닐, 및 3급 고리 질소의 N-옥시드를 포함하는 것으로 의도된다. 탄소 또는 질소 원자는 안정한 방향족 고리가 유지되도록 해주는 헤테로아릴 고리 구조의 부착점이다. 헤테로아릴 기의 예는 프탈이미드, 피리디닐, 피리다지닐, 피라지닐, 퀴나졸리닐, 푸리닐, 인돌릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 옥사티아디아졸릴, 이소티아졸릴, 테트라졸릴, 이미다졸릴, 트리아지닐, 푸라닐, 벤조푸릴, 인돌릴 등이다. 치환된 헤테로아릴은 안정한 화합물을 생성하기 위해 이용가능한 탄소 또는 질소에 부착된 치환기를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 헤테로아릴"은 1개 이상의 관능기, 예를 들어, 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 알킬티오, 아세틸렌, 아미노, 아미도, 카르복실, 히드록실, 아릴, 아릴옥시, 헤테로사이클, 치환된 헤테로사이클, 헤타릴, 치환된 헤타릴, 니트로, 시아노, 티올, 술파미도 등으로 임의로 일치환 또는 다치환된 헤테로사이클을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로사이클"은 임의로 비치환되거나 또는 예를 들어, 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 알킬티오, 아세틸렌, 아미노, 아미도, 카르복실, 히드록실, 아릴, 아릴옥시, 헤테로사이클, 헤타릴, 치환된 헤타릴, 니트로, 시아노, 티올, 술파미도 등으로 치환될 수 있는, 단일 고리 (예를 들어, 모르폴리노, 피리딜 또는 푸릴) 또는 다중 축합 고리 (예를 들어, 나프트피리딜, 퀴녹살릴, 퀴놀리닐, 인돌리지닐 또는 벤조[b]티에닐)를 가지며 고리 내에 탄소 원자 및 적어도 1개의 헤테로 원자, 예컨대 N, O 또는 S를 갖는 포화, 불포화, 또는 방향족 기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 헤테로사이클"은 안정한 화합물을 생성하기 위해 임의의 이용가능한 지점에 부착된, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 할로, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 알킬술피닐, 알킬술포닐, 아실옥시, 아릴, 치환된 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 아미노, 아미도, 아미디노; 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴 기로 임의로 치환된 우레아; 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기로 임의로 N-일치환되거나 또는 N,N-이치환된 아미노술포닐; 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 헤테로아릴술포닐아미노, 알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 헤테로아릴카르보닐아미노, 아실, 카르복실, 헤테로사이클, 치환된 헤테로사이클, 헤타릴, 치환된 헤타릴, 니트로, 시아노, 티올, 술폰아미도, 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 또는 3개의 치환기로 치환된 헤테로사이클을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "히드로카르빌"은 그의 주쇄가 탄소와 수소만을 포함하는 임의의 유기 라디칼을 지칭한다. 따라서, 히드로카르빌은 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐, 알케닐아릴, 아릴알키닐, 알키닐아릴 등을 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 히드로카르빌"은 히드록시, 히드로카르빌옥시, 치환된 히드로카르빌옥시, 알킬티오, 치환된 알킬티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 아미노, 알킬아미노, 치환된 알킬아미노, 카르복시, -C(S)SR, -C(O)SR, -C(S)NR2 (여기서 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬 또는 치환된 알킬임), 니트로, 시아노, 할로, -SO3M 또는 -OSO3M (여기서 M은 H, Na, K, Zn, Ca, 또는 메글루민임), 구아니디닐, 치환된 구아니디닐, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌, 히드로카르빌카르보닐, 치환된 히드로카르빌카르보닐, 히드로카르빌옥시카르보닐, 치환된 히드로카르빌옥시카르보닐, 히드로카르빌카르보닐옥시, 치환된 히드로카르빌카르보닐옥시, 아실, 아실옥시, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴카르보닐, 치환된 헤테로아릴카르보닐, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일, 아릴카르바모일, 카르바메이트 기, 디티오카르바메이트 기, 아로일, 치환된 아로일, 유기 술포닐, 치환된 유기 술포닐, 유기 술피닐, 치환된 알킬술피닐, 알킬술포닐아미노, 치환된 알킬술포닐아미노, 아릴술포닐아미노, 치환된 아릴술포닐아미노, 술폰아미드 기, 술푸릴 등으로부터 선택된 1개 이상의 치환기를 추가로 보유하고 있는 상기 언급된 히드로카르빌 기 중 임의의 것을 지칭하며, 이는 -O-, -S-, -NR- (여기서 R은 수소, 알킬 또는 치환된 알킬임), -C(O)-, -C(S)-, -C(=NR')-, -C(=CR'2)- (여기서 R'는 알킬 또는 치환된 알킬임), -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR- (또는 -NR-C(O)-O-), -NR-C(O)-, -NR-C(O)-NR-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -S-C(O)-NR-, -O-S(O)2-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR-, -O-NR-C(O)-, -O-NR-C(O)-O-, -O-NR-C(O)-NR-, -NR-O-C(O)-, -NR-O-C(O)-O-, -NR-O-C(O)-NR-, -O-NR-C(S)-, -O-NR-C(S)-O-, -O-NR-C(S)-NR-, -NR-O-C(S)-, -NR-O-C(S)-O-, -NR-O-C(S)-NR-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR- (또는 -NR-C(S)-O-), -NR-C(S)-, -NR-C(S)-NR-, -S-S(O)2-, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2-NR-, -NR-O-S(O)-, -NR-O-S(O)-O-, -NR-O-S(O)-NR-, -NR-O-S(O)2-, -NR-O-S(O)2-O-, -NR-O-S(O)2-NR-, -O-NR-S(O)-, -O-NR-S(O)-O-, -O-NR-S(O)-NR-, -O-NR-S(O)2-O-, -O-NR-S(O)2-NR-, -O-NR-S(O)2-, -O-P(O)R2-, -S-P(O)R2-, 또는 -NR-P(O)R2- (여기서 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬 또는 치환된 알킬임) 등과 같은 링커/스페이서 모이어티에 의해 히드로카르빌 모이어티에 부착된 상기 기재된 기 중 2개 이상을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "히드록실" 또는 "히드록시"는 기 -OH를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "옥소"는 부착된 탄소와 이중 결합된 산소 치환기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "술피닐"은 기 -S(O)-를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 술피닐"은 기 -S(O)Rt (여기서 Rt는 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 치환된 시클로알킬알킬, 헤테로시클릴, 치환된 헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 치환된 헤테로시클릴알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 치환된 헤테로아르알킬, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "술포닐"은 기 -S(O)2-를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된 술포닐"은 기 -S(O)2Rt (여기서 Rt는 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 치환된 시클로알킬알킬, 헤테로시클릴, 치환된 헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 치환된 헤테로시클릴알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 치환된 헤테로아르알킬, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬임)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "술푸릴"은 기 -S(O)2-를 의미한다.
본 발명은 5' 캡핑된 RNA를 합성하기 위한 방법 및 조성물을 제공하며, 여기서 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반 형태 m7Gppp[N2'Ome]n[N]m (여기서 m7G는 N7-메틸화 구아노신 또는 임의의 구아노신 유사체이고, N은 임의의 천연, 변형된 또는 비천연 뉴클레오시드이고, "n"은 1 내지 4의 임의의 정수일 수 있고, "m"은 1 내지 9의 정수일 수 있음)를 갖는다. 본 발명의 한 측면에서, 상기 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:
여기서:
각각의 B1 내지 B10은 독립적으로 천연, 변형된 또는 비천연 뉴클레오시드 염기이고;
M은 0 또는 1이고;
L은 0 또는 1이고;
q1은 1이고;
각각의 q2 내지 q9는 독립적으로 0 또는 1이고;
R1은 H 또는 메틸이고;
R2 및 R3은 독립적으로 H, OH, 알킬, O-알킬, 아민, 아지드, 할로겐, 링커 또는 검출가능한 마커이고;
각각의 X1 내지 X13은 독립적으로 O 또는 S이고;
각각의 Y1 내지 Y13은 독립적으로 OH, SH, BH3, 아릴, 알킬, O-알킬 또는 O-아릴이고;
각각의 Z0 내지 Z22는 독립적으로 O, S, NH, CH2, C(할로겐)2 또는 CH(할로겐)이고;
각각의 R4 내지 R12는 독립적으로 H, OH, OMe 또는 검출가능한 마커이다.
특정 실시양태에서 상기 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 삼량체 (q2-q9 = 0), 사량체 (q3-q9 = 0), 오량체 (q4-q9 = 0), 육량체 (q5-q9 = 0), 칠량체 (q6-q9 = 0), 팔량체 (q7-q9 = 0), 구량체 (q8-q9 = 0), 십량체 (q9 = 0) 또는 십일량체이다. 상기 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 삼량체 프라이머의 수많은 예가 하기 표 I에 제시된다:
표 I
Figure pat00003
Figure pat00004
본 발명에 의해 포괄된 다른 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 공지되거나 또는 신규한 염기 유사체를 갖는 프라이머를 포함한다. 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 합성 방법이 하기 실시예에 예시된다.
전사
진핵 생물에서는, 메신저 RNA (mRNA)의 전사가 RNA 폴리머라제 II에 의해 수행된다. 이는 복잡한 조절을 하는 복잡한 다중 서브유닛 효소이다. 시험관 내에서 대규모 전사를 수행하기 위해, 연구자는 T7, T3, SP6, K1-5, K1E, K1F 또는 K11 박테리오파지로부터 유래된 단일 서브유닛 파지 폴리머라제를 통상적으로 사용한다. 이러한 계열의 폴리머라제는 보조 단백질을 필요로 하지 않고 개시 뉴클레오티드 서열의 최소 제약 조건을 갖는 ~17개 뉴클레오티드의 단순한 최소 프로모터 서열을 갖는다. 본 출원이 T7 RNA 폴리머라제 (T7 RNAP)에 초점을 맞추고 있긴 하지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 다른 RNA 폴리머라제를 이용해서도 실시될 수 있었다는 것을 이해할 것이다.
T7 RNAP는 적어도 2가지 단백질 상태로 존재한다. 첫 번째는 "불완전한 복합체"로서 지칭되고, 이는 전사 개시와 연관이 있다. 두 번째는 "신장 복합체"라고 불리는 매우 진행적 입체 형태이다. 시험관내 전사는 6가지 단계로 나눌 수 있다: 1) RNA 폴리머라제와 프로모터 서열의 결합, 2) 전사의 개시, 3) 폴리머라제가 빈번하게 DNA 주형 및 짧은 불완전한 전사체를 방출하는 동안 불완전한 전사라고 불리는 비-진행성 신장, 4) 개방 복합체의 폐쇄된 복합체로의 전환, 5) 진행성 신장 및 6) 전사 종결. 전사 동안 생성된 상당한 양의 RNA는 길이가 ~2-8개의 뉴클레오티드인 짧은 불완전한 단편으로 이루어진다 (Biochemistry 19:3245-3253 (1980); Nucleic Acids Res. 9:31-45 (1981); Nucleic Acids Res. 15:8783-8798 (1987); Biochemistry 27:3966-3974 (1988)). 약 10-14개의 염기의 합성 후, RNA 폴리머라제는 불완전한 사이클링으로부터 빠져나오고, 이와 동시에 프로모터 DNA와의 서열-특이적 접촉을 상실하며, RNA 쇄가 서열-비의존적 방식으로 연장되는 진행성 신장 복합체를 형성한다 (J. Mol. Biol. 183:165-177(1985); Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83:3614-3618(1986); Mol. Cell Biol. 7:3371-3379 (1987)).
가장 활성적인 부류 III T7 프로모터에 대한 컨센서스 서열은 전사 출발 부위의 서열 상류 17 bp, 및 하류 6 bp를 포괄한다 (Cell 16:815-25. (1979)). 첫 번째로 전사된 뉴클레오티드의 위치는 통상적으로, RNA의 +1 전사체 뉴클레오티드로서 지칭되고, 두 번째로 전사된 뉴클레오티드는 +2 전사체 뉴클레오티드로서 지칭되는 등이다 (표 2). 전사 동안, 2개의 가닥이 용융되어 전사 버블을 형성하고 이중체의 하부 가닥 (표 2에서 3'에서 5'로 제시됨)이 전사를 위한 주형이다. 전사체 뉴클레오티드가 +3 이상인 경우, 주형 가닥은 주로 왓슨-크릭 염기 쌍 형성 상호작용을 통하여 상기 전사된 뉴클레오타이드의 실체를 규정한다. 여기서 제1 RNA 전사체 뉴클레오티드를 코딩하는 뉴클레오티드가 주형의 +1 뉴클레오티드로서 정의된다. 표 2에 제시된 예에서, +1 전사체 뉴클레오티드는 G이고 +1 주형 뉴클레오티드는 C이다. 마찬가지로 +4 전사체 뉴클레오티드는 A이고 +4 주형 뉴클레오티드는 T이다.
표 2
Figure pat00005
DNA 폴리머라제와는 달리, T7 RNAP는 프라이머의 부재 에 RNA 합성을 개시한다. 개시에 있어서의 첫 번째 단계는 새로운 RNA 합성으로 불리며, 여기서는 RNA 폴리머라제가 DNA 주형 상의 특이적 서열을 인식하고, 위치 +1 및 +2에서의 주형 잔기에 대해 상보적인 뉴클레오티드 트리포스페이트의 제1 쌍을 선택하며, 포스포디에스테르 결합의 형성을 촉매하여 디뉴클레오티드를 형성한다. 개시 뉴클레오티드는 신장 동안 사용된 것보다 더 낮은 폴리머라제에 대한 친화도를 갖는다. Kd 값은 제1 개시 NTP에 대하여 2 mM이고, 제2 개시 NTP에 대해서는 80 μM인 반면, Kd는 신장 동안 NTP에 대해서 대략 5 μM이다 (J. Mol. Biol. (2007) 370, 256-268). 새로운 합성이 전사 동안 속도 제한 단계인 것으로 밝혀졌다. T7 RNAP는 개시 뉴클레오티드로서 GTP에 대한 강력한 편재를 나타낸다 (J. Biol. Chem. 248: 2235-2244 (1973)). 게놈 내에서의 17개의 T7 프로모터 중에서, 15개가 GTP로 개시되고 13개가 pppGpG로 개시되는 반면, 전사 신장 동안 명백한 NTP 선호도는 없다 (J. Mol. Biol. 370:256-268 (2007)). T7 RNA 폴리머라제는 위치 +1에서 A를 코딩하는 프로모터 상에서는 거의 개시되지 않고; 그 대신 전사는 주로, 위치 +2에서 코딩된 G로 개시된다 (J. Biol. Chem. 278:2819-2823 (2003)).
새로운 RNA 합성 동안, 개시 뉴클레오티드의 결합은 주로, 염기 적층으로부터 창출된 자유 에너지, 폴리머라제 잔기들 간의 특이적 상호작용, 개시 뉴클레오티드의 구아닌 모이어티 및 염기 상보성 상호작용에 의해 달성된다 (J. Mol. Biol. 370:256-268 (2007)).
T7 RNAP가 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머로 개시될 수도 있는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, T7 게놈 내의 13개 프로모터가 pppGpG로 개시되는 것으로 공지되어 있다 (J. Mol. Biol. 370:256-268 (2007)). 몇 개의 그룹은 T7 RNAP가 디뉴클레오티드 프라이머로부터 개시될 수 있다는 것을 제시하였다 (Biochemistry 24:5716-5723 (1985)). 액설로드(Axelrod) 등은 각각 2'-데옥시시티딘 및 2'-데옥시티미딘인 +1 및 +2 주형 뉴클레오티드 ("CT" 주형)로부터 비캡핑된 GpA 디뉴클레오티드를 개시할 수 있었다는 것을 제시하였다. 그들의 반응 조건은 200 마이크로몰 (μM) 이량체 및 100 μM ATP, CTP, GTP 및 UTP였다. 그들의 반응 혼합물은 또한, 100 μM 3' dATP, 3' dCTP, 3' dUTP 또는 50 μM 3' dGTP를 함유하였다. 그들은 GpA 개시된 RNA 만을 관찰하고, GpA 개시된 RNA와 GTP 개시로부터의 5' 트리포스페이트 RNA의 혼합물은 그렇지 않다. 이는 이용된 반응 조건에 기인한 것으로 예상된다. 100 μM GTP는 첫 번째 개시 구아노신에 대한 T7 폴리머라제의 2 mM Kd보다 훨씬 아래이다 (J. Mol. Biol. (2007) 370, 256-268). GTP는 개시를 놓고 상기 개시 올리고뉴클레오티드와 경쟁하기 때문에, 낮은 GTP 농도를 사용하는 것이 GpA 개시를 촉진시키지만, 낮은 전사 수율이 초래된다 (계산된 최대 수율은 <150 ug / 반응물 1 mL인 것으로 추정됨). ApG, CpG, UpG 또는 GpG를 이용하여 "CT" 주형 상에서 전사를 개시할 때, 그들은 추가적인 비주형화된 5' 뉴클레오티드 (각각 A, C, U 또는 G)를 수반한 RNA 전사체의 형성을 관찰하였다.
액설로드 등은 또한, 주형 뉴클레오티드 +1 및 +2가 2'-데옥시시티딘 ("CC" 주형)인, 특정 프로모터 상에서 RNA 합성을 개시하기 위해 비캡핑된 GpG 디뉴클레오티드를 사용하였다. 그들은 개시의 낮은 충실도를 관찰하였고, 3가지 상이한 전사 생성물을 관찰하였다. 그들은 "오토라디오그래프의 검사 결과는 각각의 삼중체 중 하나의 구성원은 정상 (+1) 위치에서 GpG로의 개시로부터 비롯되었고, 각각의 삼중체의 두 번째 구성원은 비정상 (-1) 위치에서 GpG로의 개시로부터 비롯되었으며, 각각의 삼중체의 세 번째 구성원은 정상 위치에서 구아노신 트리포스페이트로의 개시로부터 비롯되었다. 따라서, GpG는 ø 10 프로모터 ("CC" 주형)뿐만 아니라 ø 1.1A 프로모터 ("CT" 주형)를 수반한 비교적 약한 개시인자이고, 사용되었던 농도에서 구아노신 트리포스페이트로의 정상적인 개시를 방지할 수 없다"라고 언급한다. 그들은 ø 10 프로모터 ("CC" 주형)를 수반한 GpA 디뉴클레오티드로의 개시는 관찰하지 못하였다. CpA, ApC 및 ApA는 상기 "TC" 및 "CC" 주형 중 어느 하나 상에서의 개시인자로서 제공되지 못하였으며, 이는 이들이 위치 +1 및 +2에서의 주형 뉴클레오티드와 혼성화할 수 없었기 때문인 것으로 추정된다. 액설로드 등의 문헌에 기재된 방법은 서열 분석을 위해 매우 적은 양의 방사성 전사체를 생성하도록 설계되었고, 유용한 제약 양의 RNA를 대규모로 생성하기에는 적합하지 않다. 보다 큰 농도 (~ 5 mM)의 개시 이량체 및 NTP (GTP 포함)를 사용하여 RNA의 수율을 증가시킨 경우, 예상되는 결과는 개시 이량체로 시작하여 낮은 비율의 RNA가 생성되며, 이는 pppG로 시작하여 높은 비율의 RNA를 생성시키는, Kd에 더 근접한 NTP 농도 (2 mM)에서 +1 뉴클레오티드로부터의 개시를 놓고 GTP가 이량체와 효율적으로 경쟁하기 때문이다.
피툴레(Pitulle) 등은 T7 RNAP를 이용한 전사가 비캡핑된 올리고뉴클레오티드 (2-량체 내지 6-량체)로 개시될 수 있었다는 것을 제시하였다 (Gene, 112:101-105 (1992)). 이들 올리고뉴클레오티드는 5'-OH 또는 5' 모노포스페이트 중 하나를 가졌다. 그들은 또한, 구조 비오틴-ApG의 올리고뉴클레오티드로 전사를 개시하였다. 이러한 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드 모두는 3' 말단 G를 함유하였다. 피툴레 등은 또한, RNA의 5'-말단에 또는 그 근처에 2'-O-메틸화 또는 2'-데옥시 잔기를 수반한 RNA 전사체를 생성하기 위해 2'-O-메틸 잔기 및 데옥시 잔기가 프라이머 서열 내에 포함될 수 있었다는 것을 제시하였다. 이 공보에서는 임의의 개시 올리고뉴클레오티드의 3 '말단 구아노신 잔기가 +1 주형 뉴클레오티드와 쌍을 형성한다는 것이 명백하다. 이로써, 전사된 RNA의 5 '말단에 비주형화된 뉴클레오티드가 부착된다. 구체적으로 언급하면, 상기 저자는 "또한, Y-말단 G와는 별도로 주형 DNA와의 염기 쌍 형성이 필요하지 않기 때문에, 상기 절편에서의 서열 변동이 용이하게 가능하다"라고 언급하고 있다. 따라서, 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 어느 것도 위치 +1에서의 주형 뉴클레오티드 "C"에 대해서만 완전하게 상보적이지 않고, 그 다음 위치 (+2, +3 등)에서의 임의의 뉴클레오티드에 대해서 상보적이지 않는 것은 없다. 이는 상기 그룹에 의한 후속 방법의 논문에서 확증된다 (Methods Mol Biol.74: 99-110 (1997), Methods Mol. Biol. 252:9-17, (2004)). 그들의 방법은 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 모든 뉴클레오티드가 위치 +1 및 그 다음 위치에서의 주형 뉴클레오티드에 대해 완전히 상보적인 본원에 기재된 방법과 상이하다. 클라이나이담(Kleineidam) 등은 2'-데옥시 또는 2'-O-메틸 당으로 변형시킨 이량체 또는 삼량체로 개시함으로써 5' 변형된 tRNA 전사체를 창출시켰다 (Nucleic Acids Research 21:1097-1101 (1993). 한번 더, 상기 저자들은 프라이머의 3'-말단 구아노신이 +1 주형 뉴클레오티드 "C"에서 개시된다고 언급하고 있다.
이시카와(Ishikawa) 등에 의한 또 다른 연구는 구조 m7GpppApG, m7Gpppm6ApG, m7GpppA2'OmepG 또는 m7Gpppm6A2'OmepG의 캡핑된 개시 올리고뉴클레오티드 삼량체가 주형 위치 +1 및 +2에서의 2'-데옥시시티딘 잔기로 주형 상에서 전사를 개시할 수 있었다는 것을 제시하였다 ("CC" 주형; 문헌 [Nucleic Acids Symposium Series No. 53: 129 (2009)]). 상기 저자는 "m7G5'pppG를 사용한 경우와 상이한 결과는 m7G5'pppN1pG 내의 추가적인 아데노신 (N1)과 -1 위치에서의 T7 프로모터 내의 2'-데옥시티미딘 간의 염기 쌍 형성으로부터 야기될 수 있다"고 언급하고 있다. 이러한 방법은 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 삼량체의 +1 및 +2 뉴클레오티드가 주형 뉴클레오티드의 +1 및 +2와 쌍을 형성하는 본 발명에 기재된 방법과 명백하게 상이하다. 이시카와 등은 6 mM 개시 올리고뉴클레오티드 삼량체, 0.9 mM GTP 및 7.5 mM 각각의 ATP, CTP 및 UTP를 사용하였다. 상기 저자들은 합성된 RNA의 전체 비용을 증가시키는 pppRNA보다 캡핑된 RNA에 대한 전사 반응을 구동시키기 위해 경쟁하는 GTP에 비해, 전사 반응의 가장 비싼 뉴클레오티드 성분인 캡핑된 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머를 6배 초과하여 과량으로 사용하였다. 다른 한편으로는, 낮은 농도의 GTP (0.9 mM)는 전사 반응에서 RNA의 총 수율을 제한한다 (이론적으로 1.4 mg/mL 미만). 반대로, 본원에 기재된 방법은 효율적인 RNA 캡핑과 보다 높은 RNA 수율 (2 내지 6 mg/mL) 둘 다를 달성하기 위해 임의의 NTP의 농도를 제한할 필요가 없으므로, 고 품질의 mRNA를 상업적으로 유용한 비용으로 생성할 수 있게 해준다.
상기 논의된 공보 중 어느 것도 RNA 캡핑 효율을 직접적으로 측정하지 못하였으므로, 그러한 연구에서 캡핑 정도는 공지되어 있지 않다.
중요하게도, 상기 기재된 모든 연구에서, +1 주형 뉴클레오티드는 2'-데옥시시티딘이다 (Biochemistry 24:5716-5723 (1985), Gene, 112:101-105 (1992), Methods Mol. Biol.74: 99-110 (1997), Methods Mol. Biol. 252:9-17, (2004), Nucleic Acids Research 21:1097-1101 (1993), Nucleic Acids Symposium Series No. 53: 129 (2009)).
올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 전사 개시 연구를 발표한 이래 20년이 지난 지금, 문헌 [Nucleic Acids Symposium Series No. 53: 129 (2009)]으로 간략한 보고서가 출판될 때까지 5'- 내지 5' 역전된 캡 구조를 함유하는 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 전사 개시의 예가 발표되지 않았다.
5'-캡핑된 RNA를 제조하기 위한 본원에 제공된 방법 및 조성물은 mRNA, 작은 핵 RNA (snRNA), 작은 핵소체 RNA (snoRNA), 작은 카잘체-특이적 RNA (scaRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 방법은 RNA의 DNA-주형화된 및 프로모터 제어된 합성을 위한 RNA 폴리머라제, 캡 함유 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 (NTP)의 사용을 포함한다. 특정 측면에서, 상기 방법은 RNA 합성, 특히 캡핑된 mRNA의 합성에서 유용성을 제공하는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다. 이러한 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머는 천연 RNA 분자의 캡 0, 캡 1, 캡 2 또는 TMG-캡과 유사한 구조를 가지며, 이는 RNA의 5'-위치에서의 끝에서 두 번째 캡 1 및 그 다음의 끝에서 두 번째 캡 2에 2'-O-메틸화 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 천연 캡 0 구조는 2'-O-메틸화 뉴클레오시드 단위를 갖지 않는다.
RNA의 제조를 위한 방법 및 조성물은 분자의 5' 말단에 또는 그 근처에 변형을 수반하는 mRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, 전이 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 및 전이-메신저 RNA (tmRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 방법은 RNA의 DNA-주형화된 및 프로모터 제어된 합성을 위한 RNA 폴리머라제, 캡을 수반하거나 또는 수반하지 않는 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 (NTP)의 사용을 포함한다. 특정 측면에서, 상기 방법은 RNA 합성; 특히 5'-변형된 RNA의 합성에서 유용성을 제공하는 구조적 변형을 수반하는 변형된 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다.
개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 뉴클레오티드 단위를 프라이머의 3'-말단에 부가함으로써 DNA 주형 상에서 RNA의 RNA 폴리머라제 매개된 합성의 개시를 허용해 주는 개방된 3'-OH 기를 갖는다. 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전사 개시 부위에서 주형 DNA 서열과 실질적으로 상보적이다 (즉, 이러한 개시 부위는 프로모터 서열의 3'-말단에 더 근접하여 위치하고 프로모터 서열과 중복될 수 있음). 특정 실시양태에서, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이러한 프라이머의 3'-말단으로부터 출발하여 주로 한 방향 ("정방향)으로 RNA의 합성을 유도한다. 특정 측면 및 실시양태에서, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 RNA 합성의 개시를 놓고 어떠한 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트보다 훨씬 뛰어나기 때문에, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머로 시작하는 RNA의 생성이 최대화되고 5'-트리포스페이트-뉴클레오시드 (전형적으로 GTP)로 시작하는 RNA의 생성은 최소화된다.
시험관내 전사에 의해 mRNA를 제작하는 것은 고도로 활성인 파지 RNA 폴리머라제 (T3, T7, SP6 등)를 활용한다. RNA 폴리머라제는 주형 뉴클레오티드 서열의 앞에 있는 DNA 플라스미드 구축물에 혼입되는 특이적 프로모터의 제어 하에 작동된다. 전사 프로세스는 통상적으로, 푸린 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 (전형적으로 GTP)로 시작하고, RNA 폴리머라제가 종결 서열을 만나거나 또는 DNA 주형을 완성할 때까지 계속된다.
상기 논의된 바와 같이, 캡 0을 함유하는 mCAP 디뉴클레오티드 유사체인 7mG(5')ppp(5')N은 시험관내 전사를 개시하기 위해 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [RNA 1: 957-967 (1995)]). 이들 디뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 캡핑된 RNA 분자는 캡 0을 함유한다. 그러나, 합성된 캡핑된 RNA 분자의 약 50%만이 캡 0의 정확한 "정방향"을 가진다. 캡 0을 갖는 RNA를, 캡 1을 갖는 RNA로 전환시키기 위해, (뉴클레오시드-2'-O) 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 추가적인 효소적 반응을 수행해야만 한다. 그러나, 이러한 전환은 정량적이지 않을 수 있고; 이는 제어하기가 용이하지 않으며 나머지 캡 0 RNA를 캡 1 RNA로부터 분리시키는 것이 어렵다. 또한, 전사의 개시를 놓고 NTP (구체적으로는 GTP)와 경쟁하는 것은, 생성된 활성 캡핑된 RNA 분자의 양을 추가로 감소시킨다.
또한, 리보스 상의 차단된 3' 및/또는 2' 위치를 갖는 변형된 7mG 잔기를 수반하는 변형된 디뉴클레오티드 유사체, 예컨대 7mG3'Ome(5')ppp(5')N 및 다른 관련 ARCA 유사체가 시험관내 전사의 개시에 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [RNA 7:1486-1495 (2001)]). 이들 ARCA 캡 유사체는 "정방향"으로만 RNA 합성을 유도시키므로, 5'-말단 상에 (천연) 캡 0을 갖는 RNA 분자 (7mG 잔기에 대한 2' 및/또는 3' 변형을 가짐)가 생성된다. 이러한 RNA는 표준 디뉴클레오티드 유사체인 7mG(5')ppp(5')N을 사용하여 제조된 RNA와 비교해서 번역 시스템에서 더 활성이다. ARCA 캡 0을 갖는 RNA를, ARCA 캡 1을 갖는 RNA로 전환시키기 위해, 앞서 논의된 디뉴클레오티드 유사체에 대해 요구된 바와 유사한 (뉴클레오시드-2'-O) 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 추가적인 효소적 반응을 수행해야만 한다. 이러한 방법은 mCAP 디뉴클레오티드 유사체에 대해 상세히 설명된 것과 동일한 단점을 가지며; 캡 0을 갖는 RNA를 ARCA 캡 1을 갖는 RNA로 전환시키는 것은 정량적이지 않을 수 있고; 상기 반응은 제어하기가 용이하지 않으며, 나머지 캡 0 RNA를 캡 1 RNA로부터 분리시키는 것이 어려우며, 전사의 개시를 놓고 NTP (구체적으로는 GTP)와 경쟁하는 것은, 생성된 활성 캡핑된 RNA 분자의 양을 추가로 감소시킨다.
3'-말단 구아노신 잔기를 갖는 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머 (2 내지 6-량체)가 시험관내 전사의 개시를 위해 사용되어 왔다 (Pitulle, C. et al., Gene, 112:101-105(1992)). 이들 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 및 비변형된 리보뉴클레오시드 잔기를 함유하였다 (예를 들어, 변형된 리보뉴클레오시드 잔기는 2'-O-메틸화 뉴클레오시드 잔기 및 2'-데옥시리보뉴클레오시드 잔기를 포함하였음). 더 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머 (이량체 내지 사량체)는 실질적으로, 전사의 개시를 놓고 GTP보다 훨씬 뛰어난 반면, 더 긴 프라이머 (오량체 내지 육량체)는 GTP와 비교해서 전사의 개시에 있어서 훨씬 덜 효율적이다. 이러한 더 긴 프라이머 (설계된 바와 같음)는 개시 부위에서 DNA 주형과의 낮은 퍼센트의 상보성을 가지기 때문일 수 있다. 반대로, 이량체인 AG (설계된 바와 같음)는 개시 부위에서 DNA 주형에 대해 상보적이다. 본 섹션에서 논의된, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 생성된 RNA 분자는 내부 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 갖지만, 5'-캡 0, 캡 1, 캡 2 또는 TMG-캡은 함유하지 않았다. 캡 구조를 갖지 않은 RNA를, 캡 1, 캡 2 또는 TMG-캡 구조를 갖는 RNA로 전환시키기 위해, 캡핑 효소를 사용하는 추가적인 효소적 반응을 수행해야 할 것이다. 그러나, 이러한 전환은 상기 언급된 바와 동일한 단점을 갖는다.
캡 구조 및 내부 2'-O-메틸화 뉴클레오시드 잔기를 함유하는 다른 짧은 RNA 올리고뉴클레오티드가 화학적으로 제조되었다 (Ohkubo et al., Org. Letters 15:4386-4389 (2013)). 이러한 짧은 캡핑된 올리고뉴클레오티드는 T4 DNA 리가제 및 상보적 DNA 스플린터 올리고뉴클레오티드를 사용하여 긴 RNA의 "캡 제거된" (5'-캡 구조를 갖지 않음) 단편과 라이게이션되었다. 이러한 화학적-효소적 방법을 사용하여 합성된 최종 RNA는 내부 2'-O-메틸화 뉴클레오시드 잔기와 5'-TMG-캡 구조 둘 다를 가졌다. 그러나, 이러한 라이게이션 접근법을 이용해서는 짧은 캡핑된 RNA (<200-량체)만이 제조되었다. 더욱이, 그 수율은 낮았다 (15 내지 30%). T4 DNA 라이게이션 반응을 제어 및 최적화하는 것이 용이하지 않고; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하며 나머지 비캡핑된 RNA로부터 캡핑된 RNA를 단리하는 힘든 분리 과정이 요구된다. PAGE 방법에 의해 나머지 비캡핑된 mRNA로부터 긴 (500-10000개 염기) 캡핑된 mRNA를 분리하는 것은 실현가능하지 않다.
최종적으로, 5'-변형된 뉴클레오시드 또는 5'-변형된 모노뉴클레오티드 또는 5'-변형된 디뉴클레오티드, 전형적으로 구아노신의 유도체가 RNA의 시험관내 전사의 개시를 위해 사용되어 왔다 (Gene, 112:101-105 (1992), 및 Bioconjug. Chem., 10371-378 (1999)). 이러한 개시인자 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 표지 또는 친화성 기 (예를 들어 비오틴)를 수반할 수 있고, RNA의 5'-말단 상에 혼입될 때, 합성된 RNA의 용이한 검출, 단리 및 정제를 허용할 것이다. 이와 같이 5' 표지되거나 또는 태그부착된 RNA는 일부 적용에 필요할 수 있다. 그러나, 이러한 전략은 캡 0, 캡 1, 캡 2 또는 TMG-캡 구조를 갖는 mRNA의 제조에는 사용되지 않았다.
본 발명의 특정 측면에서, 화학식 I의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조성물이 제공된다. 관련 측면에서, 화학식 I의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 RNA를 합성하는 방법이 제공된다.
개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머
본 발명의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 개시 부위에서 DNA 주형 상의 서열에 대해 상보적일 수 있는 혼성화 서열을 갖는다. 본원에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 프라이머의 혼성화 서열의 길이는 주형 뉴클레오티드 서열의 실체, 및 이러한 프라이머가 DNA 주형과 혼성화되거나 또는 시험관내 전사 동안 사용되는 온도를 포함한 몇 가지 요인에 좌우된다. 전사에 사용하기 위한 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 특이적 뉴클레오티드 서열의 목적하는 길이의 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 또는 일상적인 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 핵산 또는 올리고뉴클레오티드의 길이는 목적하는 혼성화 특이성 또는 선택성에 근거하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 (역전된 5'-5' 캡 뉴클레오티드 포함)의 뉴클레오티드 길이는 3 내지 약 9개이고, 일부 실시양태에서 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 (캡 포함)의 뉴클레오티드 길이는 3 내지 약 7개이며, 일부 실시양태에서 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 (캡 포함)의 뉴클레오티드 길이는 3 내지 약 5개이고, 일부 실시양태에서 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 (캡 포함)의 뉴클레오티드 길이는 약 3개이다. 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 내의 혼성화 서열의 길이는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 전체 길이와 동일하거나 또는 그보다 더 짧을 수 있다.
혼성화 서열의 존재로 인해, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 목적하는 방향 (즉, "정방향")으로만 개시 부위에서 DNA 주형의 상보적 서열과 주로 정렬되어야 한다. 정방향에서는, RNA 전사체가 역전된 구아노신 잔기로 시작된다 (즉, 7mG(5')ppp(5')N…). 부정확한 "역방향"에 비해 DNA 주형 상의 프라이머 정렬의 정방향이 우위를 차지하는 것은 (도 1) 혼성화 복합체의 열역학에 의해 유지된다. 후자는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 혼성화 서열의 길이와, DNA 주형과의 혼성화에 관여한 염기의 실체에 의해 결정된다. 목적하는 정방향으로의 혼성화는 또한, DNA 주형과 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 혼성화되거나 또는 시험관내 전사 동안 사용되는 온도 및 반응 조건에 좌우될 수 있다.
본 발명의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표준 GTP, ATP, CTP 또는 UTP를 이용하는 개시의 효능과 비교해서 전사의 개시 효능을 증강시켜 준다. 일부 실시양태에서, RNA의 합성이 주로 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 출발하고 전사 혼합물 중의 임의의 NTP로부터는 그렇지 않는 경우에 전사의 개시가 증강된 것으로 간주된다. 이와 같이 전사의 개시 효율이 증강되면, RNA 전사체의 수율이 더 높아진다. 전사의 증강된 개시 효율은 개시 캡핑된 프라이머를 수반하지 않으면서 통상적인 방법으로 RNA를 합성하는 것에 비해 약 10%, 약 20%, 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 약 200% 또는 약 500%만큼 증가될 수 있다. 특정 실시양태에서 "개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머"는 전사의 개시를 놓고 어떠한 NTP (GTP 포함)보다도 훨씬 더 뛰어나다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 효능과 기질 활성의 수준을 용이하게 결정할 수 있다. 기질 효능을 결정하는 방법 중 한 가지 예가 실시예 13에 예시된다. 특정 실시양태에서, 개시는 NTP가 아니라 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 일어나서, 전사된 mRNA의 캡핑 수준이 더 높아지게 된다.
일부 측면에서, 치환 또는 변형을 갖는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 활용하여 RNA를 합성하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 치환 및 변형은 RNA의 합성을 실질적으로 손상시키지 않는다. 일상적인 시험 합성을 수행하여, 변형된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 바람직한 합성 결과를 수득할 수 있는지를 결정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 일상적인 실험을 수행하여, 바람직한 결과가 수득될 수 있는지를 결정할 수 있다. 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 치환 또는 변형은, 예를 들어, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 염기, 하나 이상의 변형된 당, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연쇄 및/또는 하나 이상의 변형된 트리포스페이트 브릿지를 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 1개 이상의 변형 기를 포함할 수 있는 변형된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 개방된 3'-OH 기 상으로의 NTP의 혼입에 의해 DNA 주형 상의 RNA 폴리머라제에 의해 신장될 수 있다. 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 천연 RNA 및 DNA 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 천연 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 연쇄 또는 그의 변형, 또는 그의 조합을 함유할 수 있다.
한 실시양태에서 상기 변형 기는 효소 반응 매질의 온도가 증가함에 따라 증가하는 속도로 변형된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 해리되는 열적으로 불안정한 기일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및 NTP에 대한 열적으로 불안정한 기의 예가 문헌 [Nucleic Acids Res., 36:e131 (2008), Collect. Symp. Ser., 10:259-263 (2008), 및 Analytical Chemistry, 81:4955-4962 (2009)]에 기재되어 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 바와 같은 변형을 가질 수 있는 적어도 하나 이상의 NTP를 전사 반응에 부가하는, RNA를 합성하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 NTP의 변형은 RNA의 RNA 폴리머라제 매개된 합성을 실질적으로 손상시키지 않는다. NTP의 변형은, 예를 들어, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 염기, 하나 이상의 변형된 당, 하나 이상의 변형된 5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 이와 같이 변형된 NTP는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단 상으로 혼입될 수 있고, 이는 전사를 차단하지 않고 프라이머의 추가의 신장을 지원해 준다.
또 다른 실시양태에서, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 변형 기는 검출가능한 표지 또는 검출가능한 마커일 수 있다. 따라서, 전사 후, 검출가능한 표지 또는 마커를 함유하는 표적 RNA는 크기, 질량, 색상 및/또는 친화성 포획에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지 또는 마커는 형광 염료이고; 친화성 포획 표지는 비오틴이다. 특정 실시양태에서, 전사 반응의 하나 이상의 구성 요소 (개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 NTP)는 검출가능한 표지 또는 마커로 표지시킬 수 있다. 따라서, 전사 후, RNA 분자는, 예를 들어, 크기, 질량, 친화성 포획 또는 색상에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 형광 염료이고; 친화성 포획 표지는 비오틴이다.
표준 화학적 및 효소적 합성 방법을 활용하여 본 발명의 "개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머"를 합성할 수 있고, 이는 본원의 실시예 섹션에 개시된다.
키트
전사를 수행하기 위한 "개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머"를 포함한 키트가 또한 고려된다. 예를 들어, 키트는 통상의 RNA의 합성을 위한 모든 전사 시약 (예를 들어, FLuc mRNA)을 함유할 수 있다. 보다 구체적으로, 키트는 "개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머"; 전사용으로 표시된 용기; RNA 합성을 수행하기 위한 설명서; 및 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머, 하나 이상의 비변형된 NTP, 하나 이상의 변형된 NTP (예를 들어, 슈도우리딘 5'-트리포스페이트), RNA 폴리머라제, 다른 효소, 반응 완충제, 마그네슘 및 DNA 주형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약을 함유할 수 있다.
본 발명의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다양한 개시 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함하거나 또는 캡 0 구조를 함유하는 폴리포스페이트 디뉴클레오티드 유도체, 예컨대 mCAP 및 ARCA의 사용을 포함하는 현재의 방법 및 조성물에 비해 상당한 이점을 가지고 있다. 상기 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 기존의 전사 시스템 및 시약과 화합성이고 추가적인 효소 또는 시약을 필요로 하지 않는다. 또한, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하면, 여러 가지의 비-효소적 및 효소적 단계 (예컨대 캡핑 및 2'-O-메틸화)가 불필요해지므로, 프로세스의 복잡성과 RNA 합성 비용이 감소된다.
본원에 기재된 예시적인 방법이 T7 RNA 폴리머라제 매개된 전사 반응에 관한 것이긴 하지만, 전사 반응에 사용하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 수많은 다른 RNA 폴리머라제가 본 발명의 조성물 및 방법으로 활용될 수 있다. 활용될 수 있는 천연 또는 돌연변이된 변이체를 포함한 다른 효소는, 예를 들어, SP6 및 T3 RNA 폴리머라제, 및 다른 공급원으로부터의 RNA 폴리머라제 (열안정한 RNA 폴리머라제 포함)를 포함한다.
일부 핵산 복제 및 증폭 방법은 프로세스의 일부로서 전사를 포함할 수 있다. 이러한 방법 중에서, 전사 매개된 증폭 (TMA) 및 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), DNA 및 RNA 서열 분석, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 핵산 연장 반응이 있다. 통상의 기술자는 앞으로 개발될 전사 반응의 변이체를 포함하여, 다른 방법이 전사 방법 대신에 사용될 수 있거나 또는 전사 방법과 함께 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
치료적 용도
본 발명은 또한, 제약 조성물에서 치료제로서 사용하기 위해 상기 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는 mRNA를 생성하고; 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는 RNA를 세포 내로 도입하여 이러한 세포의 의학적 병태를 치료하거나; 또는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는 RNA를, 이러한 RNA를 활용하는 세포 내로 도입하여 숙주 세포에 대하여 치료적 영향을 미칠 수 있는 단백질을 생성시키는 것을 고려한다.
개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는 RNA를 활용하여 특정 병태를 치료하는 한 가지 방법은 화학식 I의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는 RNA 또는 이러한 RNA를 포함하는 조성물을, 그의 증상/징후가 중증도 면에서 저하되거나 또는 제거될 수 있는 특정 병태가 있거나 또는 이러한 병태가 있는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
4 mg/ml 이하의 농도로 제약상 허용되는 담체 및/또는 제약상 허용되는 염에서 제형화되는 경우, 화학식 I "화합물"의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는 RNA는 제약상 허용되는 담체 단독을 수반하는 비처리된 개체보다 그 증상 및/또는 징후를 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과만큼 감소시키기에 유효하다.
제약 조성물은 주사에 의한 투여, 또는 특정한 병태를 치료하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 적절한 경로에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여하기 위한 주사가능한 조성물은 전형적으로, 적합한 용액 및/또는 제약 담체, 예컨대 멸균성 생리학적 식염수 중의 활성 화합물을 함유한다. 상기 조성물은 또한, 지질 또는 인지질 중의 현탁제, 리포솜 현탁제, 또는 수성 에멀션으로서 제형화될 수 있다.
각종 조성물 및/또는 제형을 제조하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (19th Ed., Williams & Wilkins, 1995) 참조). 투여될 조성물은 표적 세포 또는 조직에서의 목적 단백질의 발현을 증가시키기 위해 제약상 안전하고 유효한 양으로 선택된 화합물의 특정 양을 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 상기 기재된 바와 같은 화합물을 적어도 0.1% (w/v) 함유하고, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 상기 화합물을 0.1% 초과 함유하며, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 10% 이하 함유하고, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 5% 이하 함유하며, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1% (w/v) 이하 함유한다. 적합한 농도의 선택은 활성 작용제의 목적하는 용량, 빈도 및 전달 방법과 같은 요인에 좌우된다.
대상체, 예컨대 포유류 또는 인간을 치료하는 경우, 그 투여량은 대상체의 체중 및 전반적인 건강, 치료받는 병태, 증상의 중증도 등과 같은 요인에 근거하여 결정된다. 바람직하지 못한 어떠한 부작용도 피하면서, 목적하는 혜택을 가져다 주는 투여량과 농도를 결정한다. 대상 화합물의 전형적인 투여량은 인간 환자의 경우 약 0.0005 to 500 mg/일의 범위 내이고, 일부 실시양태에서 약 1 내지 100 mg/일의 범위 내이다. 예를 들어, 더 높은 용량 요법은, 예를 들어 50 내지 100, 75 내지 100, 또는 50 내지 75 mg/일을 포함하고, 더 낮은 용량 요법은, 예를 들어 1 내지 50, 25 내지 50, 또는 1 내지 25 mg/일을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면이 하기 비-제한 실시예에 의해 예시된다. 본 실시예는 예시 목적이며, 본 발명의 어떠한 실시에 대해서도 제한되지 않는다. 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 변이 및 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 시약 및 구성 요소를 합성하는 방법 또는 상업적으로 수득하는 방법을 용이하고 알고 있다.
실시예 1
구아노신 5'-디포스페이트로부터 7-메틸구아노신 5-디포스페이트 (pp 7m G)의 제조 (도 1)
40.0 mL의 물 중의 구아노신 5'-디포스페이트 (2.5 mmol)의 교반 용액에 아세트산을 부가하여 상기 용액의 pH를 4.0이 되도록 조정한다. 이 혼합물에 디메틸 술페이트 (4.0 mL)를 30분의 기간에 걸쳐 적가하고; 0.1 M NaOH 용액을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 약 4.0으로 유지시켜면서 반응 혼합물을 4시간 동안 실온 하에 교반시킨다. 4시간 후, 반응 혼합물을 CH2Cl2 (3 x 50 mL)로 추출하여 반응되지 않은 디메틸 술페이트를 제거한다. 수성 층을 물로 희석시켜 500 mL가 되도록 하고, 1 M TEAB로 pH 6.5가 되도록 조정하며 DEAE 세파덱스 칼럼 (3 x 50 cm) 상에 부하한다. 이 생성물을 0 내지 1 M TEAB, pH 7.5 (3 L)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨다. 순수한 pp7mG (트리에틸암모늄 염)를 함유하는 분획을 풀링하고, 증발시키며 고 진공 하에 건조시켜 미세한 백색 분말을 수득한다 (수율: 80%). 유사한 절차가 문헌 [Bioorgan. Med. Chem. Letters 17:5295-5299 (2007)]에 개시된다.
실시예 2
pp 7m G로부터 7-메틸구아노신 5'-디포스페이트 이미다졸리드 (Im-pp 7m G)의 제조
(도 2)
pp7mG의 트리에틸암모늄 염 (0.4 mmol)을 건조 DMF (20 mL) 중의 이미다졸 (4 mmol), 트리페닐포스핀 (2 mmol) 및 2,2'-디피리딜 디술피드 (2 mmol)와 8시간 동안 반응시킨다. 이러한 반응 혼합물을 250 mL의 0.2 M 과염소산 나트륨 용액 내로 따라 부음으로써 조질의 Im-pp7mG를 침전시킨다. 혼합물을 -20℃로 냉각시키고, 이로써 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하며, 아세톤 (3 x 50 mL)으로 세척하고, 고 진공 하에 건조시킨다. Im-pp7mG의 단리된 수율은 대략 100%이다. 유사한 절차가 문헌 [Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids 24:1131-1134 (2005), 및 J. Org. Chem. 64:5836-5840 (1999)]에 개시된다.
실시예 3
3'-O-메틸구아노신으로부터 3'-O-메틸구아노신 5'-포스페이트 (pG( 3'Ome ))의 제조
(도 3)
3'-O-메틸구아노신 (10 mmol)을 60 내지 70℃ 하에 트리에틸포스페이트 (40 mL)에 용해시킨다. 이 혼합물을 빙수 욕에서 0℃로 냉각시키고, 옥시염화인 (30 mmol)을 부가하며, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 아르곤 하에 교반시킨다. 교반시키면서 1 M TEAB (100 mL; pH 8.5)를 서서히 부가함으로써 상기 반응을 켄칭한다. 혼합물을 8시간 동안 교반시키고, 1 L의 물로 희석시킨다. 이로써 생성된 용액을 DEAE 세파덱스 칼럼 (3 x 40 cm) 상으로 부하하고, 생성물을 선형 구배 0.05 내지 1.0 M (3 L)의 TEAB (pH 7.5)로 용출시킨다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 증발시켜 고체 잔사가 되도록 하며, 메탄올 (4 x 50 mL)로 공동 증발시켜 pG(3'Ome) (트리에틸암모늄 염)를 백색 고체로서 수득한다 (수율 60%). 유사한 절차가 미국 특허 출원 번호 2012/0156751에 개시된다.
실시예 4
pG( 3'Ome )로부터 3'-O-메틸구아노신 5'-포스포르이미다졸리드 (Im-pG( 3'Ome ))의 제조
(도 4)
pG(3'Ome)의 트리에틸암모늄 염 (0.5 mmol)을 건조 DMF (25 mL) 중의 이미다졸 (5 mmol), 트리페닐포스핀 (2.5 mmol) 및 2,2'-디피리딜 디술피드 (2.5 mmol)와 5시간 동안 반응시킨다. 이러한 반응 혼합물을 400 mL의 아세톤 용액 중 0.2 M 과염소산 나트륨 내로 따라 부음으로써 조질의 Im-pG(3'Ome)를 침전시킨다. 혼합물을 -20℃로 냉각시키고, 이로써 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하며, 아세톤 (3 x 60 mL)으로 세척하고, 고 진공 하에 건조시킨다 (수율: 100%). 유사한 절차가 미국 특허 출원 번호 2012/0156751에 개시된다.
실시예 5
Im-pG( 3'Ome )로부터 3'-O-메틸구아노신 5'-디포스페이트 (ppG( 3'Ome ))의 제조
(도 5)
고체 염화아연 (14.0 mmol)을 작은 부분으로 나누어 건조 DMF (40 mL) 중의 Im-pG(3'Ome) (7.0 mmol)의 용액에 부가한다. 모든 고형물이 용해될 때까지 상기 혼합물을 아르곤 하에 15분 동안 교반시킨다. DMF (40 mL) 중의 1 M 트리부틸암모늄 포스페이트의 용액을 부가하고, 혼합물을 실온에서 교반시킨다. 5시간 후, 이 혼합물을 200 mL의 물로 희석시키고, 디클로로메탄 (2 x 200 mL)으로 추출한다. 수성 층을 물 (1 L)로 희석시키고, DEAE 세파덱스 칼럼 (5 x 40 cm) 상으로 부하하며, 0.05 내지 1.0 M (6 L) TEAB (pH 7.5)의 선형 구배로 용출시킨다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 증발시키며, 메탄올 (4 x 50 mL)로 공동 증발시켜 ppG(3'Ome) (트리에틸암모늄 염)를 백색 고체로서 수득한다 (수율 60%). 유사한 절차가 미국 특허 출원 번호 2012/0156751에 개시된다.
실시예 6
ppG( 3'Ome )로부터 7-메틸-3'-O-메틸구아노신 5-디포스페이트 (pp 7m G( 3'Ome ))의 제조
(도 6)
50 mL의 물 중의 ppG(3'Ome) (트리에틸암모늄 염; 3.0 mmol)의 용액을 준비하고, 빙초산을 부가하여 상기 용액의 pH를 4.0이 되도록 조정한다. 디메틸 술페이트 (10.0 mL)를 이러한 혼합물에 30분의 기간에 걸쳐 적가하고, 0.1 M NaOH 용액을 사용하여 4.0±0.5의 pH를 유지시키면서 상기 반응 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반시킨다. 4시간 후, 반응 혼합물을 CH2Cl2 (3 x 150 mL)로 추출하여 반응되지 않은 디메틸 술페이트를 제거한다. 수성 층을 pH 5.5가 되도록 조정하고, 물 (500 mL)로 희석시키며, DEAE 세파덱스 칼럼 (3 x 50 cm) 상으로 부하한다. 0-1.0M TEAB, pH 7.5 (3 L)의 선형 구배를 이용하여 상기 생성물을 용출시킨다. 순수한 pp7mG3'Ome (트리에틸암모늄 염)를 함유하는 분획을 풀링하고, 증발시키며 고 진공 하에 건조시켜 미세한 백색 분말을 수득한다 (수율: 80%). 유사한 절차가 문헌 [RNA 9:1108-1122 (2003); Nucleoside Nucleotides & Nucleic acids 25:337-340 (2006)]; 및 미국 특허 출원 번호 2012/0156751]에 개시된다.
실시예 7
pp 7m G( 3'Ome )로부터 7-메틸-3'-O-메틸구아노신 5-디포스페이트 이미다졸리드 (Im-pp 7m G( 3'Ome ))의 제조
(도 7)
실시예 1에 기재된 프로토콜을 Im-pp7mG(3'Ome)의 제조에 활용한다. 유사한 절차가 문헌 [RNA 14:1119-1131 (2008)]에 개시된다.
실시예 8
pN( 2'-OR1 )pN 디뉴클레오티드 (R 1 = H 또는 Me)의 제조를 위한 일반적인 절차
(도 8)
포스포르아미다이트 단량체 (i) (1.0 mmol) 및 2',3', N-보호된 뉴클레오시드 (ii) (1.0 mmol)를, 2.5 몰 당량의 활성화제 (테트라졸)를 함유하는 10 mL의 아세토니트릴에서 반응시킨다. 실온에서 교반시킨지 60분 후에, 중간 생성물을 아이오딘으로 P(III)에서 P(V) 상태로 산화시키고, 디클로로메탄 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 추출시킨다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 증발시켜 고체 포말 (중간체 (iii))을 수득한다.
DMT-보호 기를 제거하기 위해, 중간체 (iii)를 10 mL의 80% 아세트산에 용해시키고, 반응을 완료한 후 (약 1 내지 2시간), 혼합물을 증발시키고 메탄올 (5 x 30 mL)로 공동 증발시켜 아세트산을 제거한다. 조질의 5'-OH 이량체 (iv)를 단리하고, 용출제로서 디클로로메탄 중의 5% 메탄올을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피함으로써 정제한다.
5'-OH 이량체 (iv) (1.0 mmol)를 10 mL의 아세토니트릴 중의 2 당량의 비스-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포르아미다이트 및 2 당량의 활성화제 (테트라졸)로 포스피틸화한다. 실온에서 교반시킨지 30분 후에, 5'-포스피틸화 이량체를 아이오딘으로 P(III)에서 P(V) 상태로 산화시키고, 디클로로메탄 (150 mL) 및 염수 (150 mL)로 추출한다. 유기 층을 증발시켜 오일성 잔사가 되도록 하고, 메탄올 (2 x 30 mL)로 공동 증발시키며, 12 mL의 메탄올에 용해시키고, 농축된 암모니아 (12 mL)를 부가한다. 이 혼합물을 pN2'OR1pN 이량체 (v)의 탈보호가 완료될 때까지 48시간에 걸쳐 실온에서 유지시킨다. 혼합물을 증발시키고 메탄올 (2 x 30 mL)로 공동 증발시킨다.
R = 메틸인 경우, 상기 조질의 이량체 (v)를 음이온 교환 및 역상 크로마토그래피에 의해 직접적으로 정제한다 (단계 5). 분획을 증발시켜 최종 pN2'OR1pN 이량체 (v) (v; R1 = 메틸; 트리에틸암모늄 염)를 백색 고체로서 수득한다 (35% 전체 수율).
R = TBDMS인 경우, 상기 조질의 이량체 (v)를 HF-3TEA 혼합물로 처리하여 (단계 4B) 2'-OTBDMS 보호 기를 제거한다 (Org. Biomol. Chem. 3:3851-3868 (2005), 및 Nucl. Acids Res. 22:2430-2431 (1994)). 반응이 완료되면, 상기 혼합물을 0.05 M TEAB로 희석시키고, 음이온 교환 및 역상 크로마토그래피에 의해 정제한다 (단계 5). 분획을 증발시켜 최종 pN2'OR1pN 이량체 (v) (R1 = H; 트리에틸암모늄 염)를 백색 고체로서 수득한다 (30% 전체 수율).
실시예 9
캡 0, 캡 1 또는 캡 2 구조를 갖는 개시 올리고뉴클레오티드 (5'-인산화된 디뉴클레오티드가 본 실시예에 사용됨)의 합성을 위한 일반적인 절차
(도 9)
A. 접근법 1:
DMF (50 mL) 중의 Im-pp7mG(3'Ome) 또는 Im-pp7mG (2 mmol; 나트륨 염 형태) 및 5'-인산화 디뉴클레오티드 (1 mmol; 트리에틸암모늄 염)의 현탁액에 무수 ZnCl2 (1 g)을 서서히 부가하는데 이 동안에 상기 혼합물을 35℃에서 교반시킨다. 24시간 후, 물 (500 mL) 중의 EDTA의 25 mM 용액을 부가함으로써 반응을 중지시키고 중탄산나트륨 1 M 용액에 의해 중화시킨다. 이 혼합물을 물로 1 L가 되도록 희석시키고, DEAE 세파덱스 칼럼 (3 x 50 cm) 상에 부하한다. 0-1 M 중탄산암모늄, pH 7.2 (2 L)의 선형 구배를 사용하여 상기 생성물을 용출시킨다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 풀링하고, 증발시키며 고 진공 하에 건조시켜 미세한 백색 분말을 수득한다 (수율: 60%). 유사한 접근법이 미국 특허 출원 번호 2012/0156751; 문헌 [Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:5295-5299 (2007), 및 RNA 14:1119-1131 (2008)]에 개시된다.
B. 접근법 2:
Im-pp7mG(3'Ome) 또는 Im-pp7mG (2 mmol)를, MnCl2 (2 mmol)을 함유하는 N-메틸 모르폴린 완충제 (0.2 M, pH 7.0, 10 mL)에 용해시키고, 고체 5'-인산화 디뉴클레오티드 (1 mmol; 트리에틸암모늄 염)에 부가한다. 이 반응물을 실온에서 교반시킨다. 24 내지 40시간 후, 10 mL의 EDTA의 0.25 M 용액을 이용하여 상기 반응을 중지시킨다. 이 혼합물을 DEAE 세파덱스 칼럼 (3 x 50 cm) 상으로 부가한다. 0-1.0M 중탄산암모늄, pH 7.2 (2 L)의 선형 구배를 이용하여 상기 생성물을 용출시킨다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 풀링하고, 증발시키며 고 진공 하에 건조시켜 미세한 백색 분말을 수득한다 (수율: 50%). 유사한 접근법이 문헌 [Bioorganic & Medicinal Chemistry 21:7921-7928 (2013), Nucleic Acids Research 37:1925-1935 (2009); J. Org. Chem. 64:5836-5840 (1999)]에 개시된다. (주: 1. 5'-인산화 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체 올리고뉴클레오티드를 실시예 9에 예시된 바와 같이 5'-인산화 디뉴클레오티드 대신 사용할 수 있다. 2. 캡 0을 갖는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해, 5'-인산화 올리고뉴클레오티드는 첫 번째 5'-뉴클레오시드 잔기 상의 2'-O-메틸 기, 예를 들어 예를 들어 pApG를 갖지 않는다. 3. 캡 1을 갖는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해, 5'-인산화 올리고뉴클레오티드는 첫 번째 5'-뉴클레오시드 잔기 상에 1개의 2'-O-메틸 기, 예를 들어, pA(2'Ome)pG를 수반한다. 4. 캡 2를 갖는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해, 5'-인산화 올리고뉴클레오티드는 첫 번째 및 두 번째 5'-뉴클레오시드 잔기 상의 2개의 2'-O-메틸 기, 예를 들어 pA(2'Ome)pG(2'Ome)pG를 수반한다).
실시예 10
화학식 I에 따른 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조
도 10은 구조 I에 따른 실시예에 사용된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조를 제시한다. a) m7G3'OmepppG, b) m7GpppG2'OmepG, c) m7G3'OmepppG2'OmepG, d) m7GpppA2'OmepG, e) m7G3'OmepppA2'OmepG, f) m7GpppC2'OmepG, g) m7G3'OmepppC2'OmepG, h) m7GpppA2'OmepG2'OmepG.
실시예 11
ARCA 프라이머를 이용한 시험관내 전사
반딧불이 루시페라제를 코딩하는 이중 가닥 DNA 전사 주형을, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 생성시켰다. +1 주형 뉴클레오티드는 2'-데옥시시티딘이었다. 전사 반응물을 25 ug/mL 전사 주형, 40 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 27 mM MgCl2, 2 mM 스페르미딘, 10 mM DTT, 0.002% 트리톤 X-100, 1000 단위/mL 뮤린 RNase 억제제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 카탈로그 #M0314), 2 단위/mL 무기 피로포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 # M2403), 4000 단위/mL T7 RNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0251), 6 mM ARCA (m7G3'OmepppGG), 1.5 mM GTP, 7.5 mM ATP, 7.5 mM CTP 및 7.5 mM UTP와 어셈블리하였다. 전사물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 10 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2 및 100 단위/mL DNase I (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0303)로 보충시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠(Qiagen) 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제하였다. mRNA를 물에서 용출시키고, 이 용액을 50 mM 비스-트리스-프로판 HCl (pH 6.0), 1 mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2 및 250 단위/mg 안타르크틱 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0289)로 조정함으로써 탈인산화시켰다. 이 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제하였다. mRNA를 물에서 용출시켰다.
실시예 12
삼량체성 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 시험관내 전사
전사에 활용되는 일부 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 표 1에 표시된다. 각각의 삼량체에 대해 특이적인 이중 가닥 반딧불이 루시페라제 DNA 전사 주형을 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 생성시킨다. 이들 주형은 주형 뉴클레오티드 +1 및 +2에 있어서 상이하였다. 소정의 삼량체의 경우, 주형 뉴클레오티드 +1은 B1 (이 뉴클레오티드는 전사체 뉴클레오티드 +1이 되도록 예정되어 있음)에 대해 상보적이었다. 마찬가지로 주형 뉴클레오티드 +2는 B10 (이 뉴클레오티드는 전사체 뉴클레오티드 +2가 되도록 예정되어 있다; 실시예 10 참조)에 대해 상보적이었다. 전사 반응물을 25 ug/mL 전사 주형, 40 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 27 mM MgCl2, 2 mM 스페르미딘, 10 mM DTT, 0.002% 트리톤 X-100, 1000 단위/mL 뮤린 RNase 억제제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0314), 2 단위/mL 무기 피로포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 # M2403), 4000 단위/mL T7 RNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0251) 및 6 mM의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머, 1.5 mM GTP 및 7.5 mM 각각의 ATP, CTP 및 UTP와 어셈블리하였다. 후속 실시예에서는, 이러한 프라이머/NTP 제형이 프라이머/NTP 제형 1로서 지칭될 것이다. 그의 각각의 프로모터를 사용함으로써 동일한 기능을 수행하기 위해 T7 RNA 폴리머라제 대신 다른 폴리머라제, 예컨대 T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제를 사용할 수 있었다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다. 전사 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 반응물을 10 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2 및 100 단위/mL DNase I (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0303)로 보충시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제한다. mRNA를 물에서 용출시키고, 이 용액을 50 mM 비스-트리스-프로판 HCl (pH 6.0), 1 mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2 및 250 단위/mg 안타르크틱 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0289)로 조정함으로써 탈인산화시킨다. 이 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제한다. mRNA를 물에서 용출시킨다.
실시예 13
사량체성 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 7m G 3'Ome pppA 2'Ome pG 2'Ome pG를 이용한 시험관내 전사
개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 7mG3'OMepppA2'OMepG2'OMepG를 전사에 사용하였다. 전사는 하기 변형을 수반하여 실시예 11에서와 같이 수행하였다. 사량체에 대해 특이적인 이중 가닥 DNA 전사 주형을 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 생성시켰다. 주형 뉴클레오티드 +1 (2'-데옥시티미딘)은 아데노신 (프라이머의 첫 번째 뉴클레오티드는 전사체 뉴클레오티드 +1이 되도록 예정되어 있음)에 대해 상보적이었다. 마찬가지로 주형 뉴클레오티드 +2 (2'-데옥시시티딘)는 구아노신 (프라이머의 두 번째 뉴클레오티드는 전사체 뉴클레오티드 +2가 되도록 예정되어 있음)에 대해 상보적이었다. 마찬가지로 주형 뉴클레오티드 +3 (2'-데옥시시티딘)은 구아노신 (프라이머의 세 번째 뉴클레오티드는 전사체 뉴클레오티드 +3이 되도록 예정되어 있음)에 대해 상보적이었다. 전사 반응물을 25 ug/mL 전사 주형, 40 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 27 mM MgCl2, 2 mM 스페르미딘, 10 mM DTT, 0.002% 트리톤 X-100, 1000 단위/mL 뮤린 RNase 억제제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0314), 2 단위/mL 무기 피로포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 # M2403), 4000 단위/mL T7 RNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0251), 6 mM의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 7mG3'OMepppA2'OMepG2'OMepG, 1.5 mM의 GTP, 7.5 mM의 ATP, 7.5 mM의 UTP 및 7.5 mM의 CTP와 어셈블리하였다. 그의 각각의 프로모터를 사용함으로써 동일한 기능을 수행하기 위해 T7 RNA 폴리머라제 대신 다른 폴리머라제, 예컨대 T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제를 사용할 수 있었다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다. 전사 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 10 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2 및 100 단위/mL DNase I (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0303)로 보충시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제하였다. mRNA를 물에서 용출시키고, 이 용액을 50 mM 비스-트리스-프로판 HCl (pH 6.0), 1 mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2 및 250 단위/mg 안타르크틱 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0289)로 조정함으로써 탈인산화시켰다. 이 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제하였다. mRNA를 물에서 용출시켰다.
실시예 14
주형 위치 +1 및 +2 각각에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘 잔기를 갖는 전사 주형 상에서 m7 GpppA 2'Ome pG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 시험관내 전사
주형 위치 +1 및 +2 각각에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘 잔기를 갖는 이중 가닥 반딧불이 루시페라제 DNA 전사 주형을 사용하였다. 2가지 전사 반응물을 25 ug/mL 전사 주형, 40 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 27 mM MgCl2, 2 mM 스페르미딘, 10 mM DTT, 0.002% 트리톤 X-100, 1000 단위/mL 뮤린 RNase 억제제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0314), 2 단위/mL 무기 피로포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 # M2403), 4000 단위/mL T7 RNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0251)와 어셈블리하였다. 2가지 전사는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드의 양, NTP의 양 및 NTP의 실체에 있어서 상이하였다. 첫 번째 전사는 이시카와 등의 전사 조건을 모방하도록 예정되어 있었다 (Nucleic Acids Symposium Series No. 53:129 (2009)). 이러한 전사 반응은 6 mM의 m7GpppA2'OmepG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머, 0.9 mM GTP 및 7.5 mM의 ATP, CTP 및 UTP를 함유하였다. 후속 실시예에서는, 이러한 프라이머/NTP 제형이 프라이머/NTP 제형 2로서 지칭될 것이다. 이 제형에서는, 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머가 GTP에 비해 6배 초과하여 과량이었다. 두 번째 전사는 5 mM의 m7GpppA2'OmepG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머, 5 mM GTP, ATP, CTP 및 슈도우리딘 트리포스페이트 (ΨTP)를 사용하였다. 후속 실시예에서는, 이러한 프라이머/NTP 제형이 프라이머/NTP 제형 3으로서 지칭될 것이다. 프라이머/NTP 제형 3에서는, 상업적으로 유용한 양의 RNA를 생성하기 위해 GTP 농도가 증가되었다. 그의 각각의 프로모터를 사용함으로써 동일한 기능을 수행하기 위해 T7 RNA 폴리머라제 대신 다른 폴리머라제, 예컨대 T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제를 사용할 수 있었다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다. 전사 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 반응물을 10 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2 및 100 단위/mL DNase I (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0303)로 보충시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제하였다. mRNA를 물에서 용출시키고, 이 용액을 50 mM 비스-트리스-프로판 HCl (pH 6.0), 1 mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2 및 250 단위/mg 안타르크틱 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0289)로 조정함으로써 탈인산화시켰다. 이 반응물을 프라이머/NTP 제형 2의 경우에는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 프라이머/NTP 제형 3의 경우에는 3시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제하였다. mRNA를 물에서 용출시켰다. 프라이머/NTP 제형 2 및 3을 이용한 경우의 정제된 전사 수율은 각각 0.7 밀리그램/밀리리터 전사 반응물 (mg/mL) 및 3.9 mg/mL 전사 반응물이었다. 프라이머/NTP 제형 3을 이용한 경우의 수율이 프라이머/NTP 제형 2를 이용한 경우에 수득된 수율에 비해 상당히 우수하였다.
실시예 15
주형 위치 +1 및 +2에 시티딘 잔기를 갖는 전사 주형 상에서 m7 GpppA 2'Ome pG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 시험관내 전사
+1 및 +2 주형 뉴클레오티드가 시티딘이므로, m7GpppA2'OmepG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대해 완전히 상보적이지 않는 이중 가닥 반딧불이 루시페라제 DNA 전사 주형을 사용하였다. 2가지 전사 반응물을 25 ug/mL 전사 주형, 40 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 27 mM MgCl2, 2 mM 스페르미딘, 10 mM DTT, 0.002% 트리톤 X-100, 1000 단위/mL 뮤린 RNase 억제제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0314), 2 단위/mL 무기 피로포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 # M2403), 4000 단위/mL T7 RNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0251)와 어셈블리하였다. 2가지 전사는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 및 NTP의 양에 있어서 상이하였다. 첫 번째 전사는 이시카와 등의 전사 조건을 모방하도록 예정되어 있었다 (Nucleic Acids Symposium Series No. 53:129 (2009)). 이러한 전사 반응은 프라이머/NTP 제형 2를 함유하였다. 두 번째 전사는 프라이머/NTP 제형 3을 사용하였다. 그의 각각의 프로모터를 사용함으로써 동일한 기능을 수행하기 위해 T7 RNA 폴리머라제 대신 다른 폴리머라제, 예컨대 T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제를 사용할 수 있었다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다. 전사 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 10 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2 및 100 단위/mL DNase I (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0303)로 보충시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하거나 또는 역상 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상기 용액을 50 mM 비스-트리스-프로판 HCl (pH 6.0), 1 mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2 및 250 단위/mg 안타르크틱 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 #M0289)로 조정함으로써 mRNA를 탈인산화시켰다. 이 반응물을 프라이머/NTP 제형 2의 경우에는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 프라이머/NTP 제형 3의 경우에는 3시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 mRNA를 제조업체의 지시에 따라서 RNeasy 맥시 키트 (퀴아젠 카탈로그 # 75162)를 사용하여 정제하였다. mRNA를 물에서 용출시켰다. 프라이머/NTP 제형 2 및 3을 이용한 경우의 정제된 전사 수율은 각각 0.6 밀리그램/밀리리터 전사 반응물 (mg/mL) 및 3.9 mg/mL 전사 반응물이었다. 프라이머/NTP 제형 3을 이용한 경우의 수율이 프라이머/NTP 제형 2를 이용한 경우에 수득된 수율에 비해 상당히 우수하였다.
실시예 16
Huh-7 세포에서의 mRNA의 번역
(도 11)
개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 생성된 루시페라제 mRNA의 번역 활성을 배양된 간세포에서 삼중으로 평가하였다. Huh-7 세포를 5% CO2의 대기 하에 37℃에서 10% FBS, L-글루타민, 비-필수 아미노산 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충시킨 DMEM에서 배양하였다. 세포를 400 ng의 mRNA로 형질감염시켰다. 비교를 위해, 세포를 또한, ARCA로 개시함으로써 생성된 캡0 루시페라제 mRNA로 형질감염시켰다. 20시간에 세포를 수거하고, 제조업체의 권장 사항에 따라서 ONE-Glo 루시페라제 검정 시스템 키트 (프로메가(Promega) 카탈로그 #E6120)를 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라서 글로맥스-멀티+ 검출 시스템 기기를 사용하여 발광을 측정하였다. 시험된 모든 mRNA에 대한 루시페라제 활성을 검출하였다 (도 11). 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 3'-O-메틸 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 생성된 mRNA가 ARCA 캡핑된 RNA와 유사한 효율로 번역된다는 사실은 이들이 공동-전사적으로 효율적으로 캡핑된다는 것을 표시한다.
실시예 17
프라이머/NTP 제형 1을 사용하는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 ARCA로의 공동-전사적 캡핑에 의해 생성된 mRNA의 캡핑 효율을 결정하기 위한 검정
(도 12a-12h)
시험된 각각의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대하여, 액체 크로마토그래피 질량 분광법 (LC-MS)에 의해 검출될 충분한 양의 mRNA를 대상으로 하여 캡핑 검정을 수행하였다. 이러한 검정에서는, 작은 단편을 완전한 길이의 mRNA의 5' 말단으로부터 절단하고 LC-MS에 의해 분석하였다. 상기 mRNA를 절단하기 이전에, 이를 안타르크틱 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 # M0289)로 처리하여 비캡핑된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트를 5' OH로 전환시켜 분석을 촉진시켰다. 이어서, 상기 포스파타제 처리된 mRNA를 절단하고 정제하였다. 이와 같이 정제된 RNA를 대상으로 하여 LC-MS 분석을 수행하였다. 도 12는 LC 트레이스를 제시한다. 비캡핑된 (포스파타제 처리 후의 5' OH) 및 캡 1에 상응하는 LC 피크는 관찰된 질량으로 표시된다. 삽입된 개략도는 전사 주형 상의 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머의 정렬을 나타낸다. 주: "|"은 개략도에서 주형 뉴클레오티드를 수반한 캡핑된 개시 뉴클레오티드의 염기 쌍을 표시한다. 아래 첨자 "m"은 2'-O-메틸 기를 표시하고, 위 첨자 "m7"은 염기 메틸화를 표시한다. 비교를 위해, ARCA로 공동-전사적으로 캡핑된 mRNA를 대상으로 하여 캡핑 검정을 수행하였다. 캡핑 효율은 하기 공식을 사용하여 추정되었다: (캡핑된 피크의 세기)/[(캡핑된 피크의 세기) + (5' OH 피크의 세기)]. 도 12에서 관찰된 % 캡핑은 하기와 같았다: a) m7G3'OmepppG = 79%, b) m7GpppG2'OmepG = 89%, c) m7G3'OmepppG2'OmepG = 87%, d) m7GpppA2'OmepG = 99%, e) m7G3'OmepppA2'OmepG = 99%, f) m7GpppC2'OmepG = 98%, g) m7G3'OmepppC2'OmepG = 97%, h) m7GpppA2'OmepG2'OmepG = 50%. 각각의 경우에, 개시 삼량체성 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머로 공동-전사적으로 캡핑된 전사체의 캡핑 효율은 m7G3'OmepppG (ARCA)를 사용하여 관찰된 것보다 더 컸다.
실시예 18
주형 위치 +1 및 +2에 시티딘 잔기를 갖는 전사 주형과 비교해서 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘 잔기를 갖는 전사 주형 상에서 m7 GpppA 2'Ome pG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드로의 캡핑의 비교
(도 13a-13d)
실시예 14 및 15에서 만들어진 mRNA를 대상으로 하여 캡핑 검정을 수행하여, 주형 위치 +1 및 +2에 시티딘 잔기를 갖는 전사 주형과 비교해서 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘 잔기를 갖는 전사체의 캡핑의 특이성과 상대적 효율을 결정하였다. 액체 크로마토그래피 질량 분광법 (LC-MS)에 의해 검출될 충분한 양의 mRNA를 대상으로 하여 캡핑 검정을 수행하였다. 이러한 검정에서는, 작은 단편을 완전한 길이의 mRNA의 5' 말단으로부터 절단하고 LC-MS에 의해 분석하였다. 상기 mRNA를 절단하기 이전에, 이를 안타르크틱 포스파타제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그 # M0289)로 처리하여 비캡핑된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트를 5' OH로 전환시켜 분석을 촉진시켰다. 이어서, 상기 포스파타제 처리된 mRNA를 절단하고 정제하였다. 이와 같이 정제된 RNA를 대상으로 하여 LC-MS 분석을 수행하였다. 도 13은 LC 트레이스를 제시한다. 비캡핑된 및 캡 1에 상응하는 LC 피크는 관찰된 질량으로 표시된다. 삽입된 개략도는 전사 주형 상의 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머의 정렬을 제시한다. 아래 첨자 "m"은 2'-O-메틸 기를 표시하고, 위 첨자 "m7"은 염기 메틸화를 표시한다. 도 13a 및 13b 전사체는 프라이머/NTP 제형 2 및 3을 각각 사용하여 주형 뉴클레오티드 +1 및 +2 각각에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘을 갖는 주형으로부터 전사되었다. 도 13c 및 13d는 프라이머/NTP 제형 2 및 3을 각각 사용하여 주형 뉴클레오티드 +1 및 +2에 2'-데옥시시티딘을 갖는 주형으로부터 전사된 전사체였다. m7GpppA2'OmepG 개시 올리고뉴클레오티드가 +1 및 +2 뉴클레오티드에 대해 완전히 상보적인 경우, 관찰된 주요 생성물은 m7GpppA2'OmepG...로 개시된 목적하는 주형화된 캡 1 전사체였다 (도 13a 및 13b). 도 13a 및 13b의 경우, 캡핑 효율은 하기 공식: (캡핑된 피크의 세기)/[(캡핑된 피크의 세기) + (5' OH 피크의 세기)]을 사용하여 추정되었고, 프라이머/NTP 제형 2 및 프라이머/NTP 제형 3을 이용한 경우의 캡핑 효율은 각각 99% 및 96%였다. 사소한 비정상적인 개시 생성물 만이 검출되었다. 반대로, 주형 뉴클레오티드 +1 및 +2가 시티딘인 경우, m7GpppA2'OmepG 개시 올리고뉴클레오티드와 이들 주형 뉴클레오티드 간에 완벽한 상보성은 없다. 도 13c 및 13d는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드가 2개의 레지스터에서 개시되었다는 것을 제시한다. 첫 번째 레지스터에서는, 3' 구아노신 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 잔기가 +1 주형 시티딘과 쌍을 형성하여 추가적인 비주형화된 5' 아데노신 (캡 1 + A)을 갖는 전사체가 생성되었다. 주: "|"은 개략도에서 주형 뉴클레오티드를 수반한 캡핑된 개시 뉴클레오티드의 염기 쌍을 표시한다. 설계된 주형 뉴클레오티드 위치가 표시된다. 두 번째 레지스터에서는, 3' 구아노신 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 잔기가 +2 주형 시티딘과 쌍을 형성하였고, +1 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 아데노신은 +1 주형 뉴클레오티드와 완전하게 혼성체를 형성하지 않는다. 이로써, 주형화된 5' 구아노신을 비주형화된 아데노신으로 대체시킨 전사체가 생성된다 (캡 1 G투A). 캡핑 효율은 하기 공식을 사용하여 추정되었다: (캡핑된 피크 "캡 1 + A" + "캡 1 G투A"의 세기)/[(캡핑된 피크 "캡 1 + A" + "캡 1 G투A"의 세기) + (5' OH 피크의 세기)]. 도 13c 및 13d에서 계산된 캡핑 효율은 97 및 77%였다. 본 발명자들은 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 상응하는 주형 +1 및 +2 뉴클레오티드에 대해 완전히 상보적인 경우에, 캡핑 효율과 주형화된 전사 개시 충실도가 훨씬 더 높았다는 놀라운 발견에 주목한다. 또한, 본 발명자들의 방법을 사용하면, 캡핑을 구동시키기 위해 NTP의 농도를 낮추지 않고서도 효율적인 캡핑을 달성하여, 전사 수율을 훨씬 더 높일 수 있게 된다. 따라서, 본 발명자들이 기재하는 캡핑 방법은 이시카와 등의 방법과 완전히 다르고 그보다 더 탁월하다.
실시예 19
(도 14a-14b)
주형 위치 +1 및 +2에 시티딘 잔기를 갖는 전사 주형과 비교해서 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘 잔기를 갖는 전사 주형 상에서 m7 GpppA 2'Ome pG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 만든 mRNA의 분화된 THP-1 세포 내에서의 번역의 비교
실시예 14 및 15에서 생성된 루시페라제 mRNA의 발현을 평가하기 위해, mRNA를 6개의 복제물을 수반한 THP-1 세포 (ATCC, 카탈로그# TIB-202) 내로 형질감염시켰다. THP-1 세포를 5% CO2의 대기 하에 37℃에서 10% FBS, 소듐 피루베이트 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충시킨 ATCC 공식화된 RPMI-1640 (ATCC, 카탈로그# 30-2001)에서 배양하였다. 세포를 포르볼 에스테르 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트 (TPA; 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies), 카탈로그# 4174)의 존재 하에 24-웰 플레이트 포맷으로 웰당 2E+05개 세포로 시딩하여 분화를 유도시켰다. 세포를 시딩 후 72시간에 웰당 100 ng의 mRNA로 형질감염시켰다. 비교를 위해, 세포를 또한, ARCA로의 개시에 의해 생성된 캡0 루시페라제 mRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 20시간에, 세포를 수거하고, 제조업체의 권장 사항에 따라서 ONE-Glo 루시페라제 검정 시스템 키트 (프로메가 카탈로그# E6120)를 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 제조업체의 권장 사항에 따라서 글로맥스-멀티+ 검출 시스템 기기를 사용하여 발광을 측정하였다. 데이터는 6개 복제물의 평균 +/- 평균으로부터의 표준 편차로서 그래프로 나타냈다. 비-대응표본 t-시험을 사용하여 데이터를 분석하여 유의성 측정치로서 p 값을 생성하였다. 쌍 사이의 p-값이 표시된다. 주형 위치 +1 및 +2에 시티딘 잔기를 갖는 전사 주형 ("CC" 주형)과 비교해서 주형 위치 +1 및 +2에 2'-데옥시티미딘 및 2'-데옥시시티딘을 포함하는 주형 ("TC" 주형) 및 m7GpppA2'OmepG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 생성시킨 전사체에 대한 THP-1 세포에서의 번역을 비교하였다. a) 전사를 프라이머/NTP 제형 2로 시행하였거나 또는 b) 프라이머/NTP 제형 3으로 시행하였다. 상기 제형 둘 다를 이용하면, m7GpppA2'OmepG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 본 발명에 기재된 바와 같이 주형 뉴클레오티드 +1 및 +2 ("TC" 주형)에 대해 완전히 상보적인 경우에, 배양된 THP-1 세포에서의 번역은 상당히 탁월하였다. 도 14b에서, 본 발명자들은 또한, "TC" 주형을 이용하여 만들었고 ARCA (캡 0)로 캡핑시킨 mRNA의 활성을 평가하였다. 이것은 공동-전사적으로 캡핑된 mRNA를 생성하는 현재 업계 표준이다. ARCA 캡핑된 RNA는 m7GpppA2'OmepG 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 주형 뉴클레오티드 +1 및 +2 ("TC" 주형)에 대해 완전히 상보적인 경우에 만들어진 전사체보다 상당히 덜한 활성을 갖는다.
요약하면, 본원에 제시된 실시예는 기존에 공개된 방법과 비교해서, 본원에 기재된 방법이 1) 높은 수율, 2) 높은 정도의 캡핑, 3) 주형화된 전사의 높은 충실도 및 4) 세포에서의 탁월한 활성의 조합으로 RNA를 생성시킨다는 것을 입증해 준다.
본원에 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한(들)의 부재 하에서도 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명을 기재하는 맥락에서 (특히 하기 청구범위의 문맥에서) 단수 형태 및 유사한 지시대상은 본원에서 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수와 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함한", "함유하는" 등은 광범위하게 제한 없이 판독되어야 한다 (예를 들어, "포함하나 이에 제한되지는 않는"것을 의미함). 본원에서 값의 범위를 열거한 것은 단지, 본원에서 달리 표시되지 않는 한 그 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로서 제공하기 위한 것이며, 각각의 별도의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서 내로 혼입된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 달리 청구되지 않는 한 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서 내에서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 청구되지 않은 임의의 요소를 표시하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 추가적으로, 본원에 이용된 용어 및 표현은 기재사항의 용어로서 사용된 것이지 제한을 위한 것이 아니며, 제시되고 기재된 특징 또는 그의 일부의 임의의 등가물을 배제하는 상기 용어 및 표현의 사용에 대한 의도는 없지만, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 특정 실시양태 및 임의적 특징을 참조하여 구체적으로 개시되긴 하였지만, 본원에 개시되고 구체화된 본 발명의 변형 및 변이가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 가능할 수 있으며, 이러한 변형 및 변이가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명이 특정 실시양태 및 임의적 특징을 참조하여 구체적으로 개시되긴 하였지만, 본원에 개시되고 구체화된 본 발명의 변형, 개선 및 변이가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 가능할 수 있으며, 이러한 변형, 개선 및 변이가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다. 본원에 제공된 물질, 방법 및 실시예는 특정 실시양태를 대표하고, 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본 발명은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기재되었다. 일반적인 개시내용 내에 속하는 더 좁은 종 및 하위 속 부류 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 절제된 물질이 본원에서 구체적으로 인용되는 지의 여부와 상관없이 속으로부터 임의의 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 일반적인 기재사항을 포함한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 군으로 기재되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 군의 구성원의 하위군 또는 임의의 개별 구성원의 관점에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 각각이 개별적으로 참조로 포함되는 것처럼 동일한 정도까지 그 전문이 명확히 참조로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
출원인은 상기 임의의 문헌, 특허, 특허 출원 또는 다른 물리적 및 전자적 문서로부터의 임의의 및 모든 물질 및 정보를 본 출원 내로 물리적으로 포함시킬 권리를 보유하고 있다.
다른 실시양태가 하기 청구범위 내에 제시된다.
SEQUENCE LISTING <110> TRILINK BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SYNTHESIZING 5'-CAPPED RNAS <130> 095109-000500PC-1022543 <140> PCT/US2016/052670 <141> 2016-09-20 <150> 62/221,248 <151> 2015-09-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 taatacgact cactataggg aga 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 tctccctata gtgagtcgta tta 23

Claims (47)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 이의 입체이성질체의 염:

    여기서
    B1은 아데닌 또는 N6-메틸아데닌이고;
    B10은 구아닌이고;
    R1은 H 또는 메틸이고;
    R2는 H, OH, 알킬, O-알킬, 할로겐, 링커 또는 검출가능한 마커이고;
    R3은 O-알킬이고;
    R4는 H, OH, O-메틸 또는 검출가능한 마커이다.
  2. 제1항에 있어서, B1이 아데닌인 염.
  3. 제1항에 있어서, B1이 N6-메틸아데닌인 염.
  4. 제1항에 있어서, B10이 구아닌인 염.
  5. 제1항에 있어서, R1이 H인 염.
  6. 제1항에 있어서, R2가 OH 또는 O-메틸인 염.
  7. 제1항에 있어서, R3이 O-메틸인 염.
  8. 제1항에 있어서, R4가 O-메틸인 염.
  9. 하기 구조의 화합물 또는 이의 입체 이성질체의 염:
    .
  10. 하기 구조의 화합물 또는 이의 입체 이성질체의 염:
    .
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 나트륨 염, 리튬 염 또는 칼륨 염인 염.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 입체이성질체를 포함하는 RNA 분자.
  13. 제12항에 따른 RNA 분자를 포함하는 단리된 세포.
  14. 제12항에 따른 RNA 분자로부터 번역된 단백질 또는 펩티드를 포함하는 변형된 세포.
  15. 제12항에 따른 RNA 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  16. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머:
    m7G3'OmepppA2'OmepG의 염;
    m7G3'Omeppp(N6-메틸아데닌)2'OmepG의 염;
    m7G3'OmepppApG의 염; 및
    m7G3'Omeppp(N6-메틸아데닌)pG의 염.
  17. 제16항에 있어서, m7G3'OmepppA2'OmepG의 염을 포함하는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  18. 제16항에 있어서, m7G3'Omeppp(N6-메틸아데닌)2'OmepG의 염을 포함하는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RNA 분자.
  20. 제19항에 따른 RNA 분자를 포함하는 단리된 세포.
  21. 제19항에 따른 RNA 분자로부터 번역된 단백질 또는 펩티드를 포함하는 변형된 세포.
  22. 제19항에 따른 RNA 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  23. 하기 구조의 화합물 또는 이의 입체이성질체:

    여기서
    B1, B2 및 B10은 독립적으로 천연, 변형된 또는 비천연 뉴클레오시드 염기이고;
    R1은 H 또는 메틸이고;
    R2 및 R3은 독립적으로 H, OH, 알킬, O-알킬, 할로겐, 링커 또는 검출가능한 마커이고;
    R4 및 R5는 독립적으로 H, OH, OMe 또는 검출가능한 마커이다.
  24. 제23항에 있어서, B1, B2 및 B10이 독립적으로 천연 뉴클레오시드 염기인 화합물.
  25. 제23항에 있어서, B1이 아데닌, 구아닌, N6-메틸아데닌, 시토신 또는 우라실인 화합물.
  26. 제23항에 있어서, B2가 아데닌, 구아닌, N6-메틸아데닌, 시토신 또는 우라실인 화합물.
  27. 제23항에 있어서, B10이 아데닌, 구아닌, N6-메틸아데닌, 시토신 또는 우라실인 화합물.
  28. 제23항에 있어서, R2 또는 R3이 알킬이고, 여기서 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소아밀, 헥실, 옥틸 및 도데카닐로부터 선택되는 것인 화합물.
  29. 제23항에 있어서, R2 또는 R3이 O-알킬이고, 여기서 O-알킬은 O-메틸, O-에틸, O-프로필, O-이소프로필, O-n-부틸, O-sec-부틸, O-이소부틸, O-tert-부틸, O-펜틸, O-이소아밀, O-헥실, O-옥틸 및 O-도데카닐로부터 선택되는 것인 화합물.
  30. 제23항에 있어서, R4가 OH이고, R5가 OH인 화합물.
  31. 제23항에 있어서, R4가 OMe이고, R5가 OH인 화합물.
  32. 제23항에 있어서, R4가 OH이고, R5가 OMe인 화합물.
  33. 제23항에 있어서, R4가 OMe이고, R5가 OMe인 화합물.
  34. 하기 구조를 갖는 화합물 또는 이의 입체이성질체:
    .
  35. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  36. 제35항의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RNA 분자.
  37. 제36항의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RNA 분자를 함유하는 세포.
  38. 제36항의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RNA 분자로부터 번역된 단백질을 함유하는 세포를 생산하는 방법으로서,
    상기 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함유하는 RNA 분자를, 상기 단백질을 생산하기 위하여 상기 RNA 분자를 활용하는 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  39. 제36항의 RNA 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  40. RNA 분자를 합성하는 방법으로서,
    (a) 제35항의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 폴리뉴클레오티드 주형의 RNA 폴리머라제에 의한 전사에 도움이 되는 조건 하에 폴리뉴클레오티드 주형 및 RNA 폴리머라제를 포함하는 혼합물 내로 도입하는 단계로서,
    여기서 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 내의 B1은 폴리뉴클레오티드 주형의 프로모터 서열 내의 위치 +1의 염기에 상보적인 단계; 및
    (b) 생성된 혼합물을 상기 주형의 전사를 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 내의 B2가 폴리뉴클레오티드 주형의 프로모터 서열 내의 위치 +2의 염기에 상보적인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 내의 B10이 폴리뉴클레오티드 주형의 프로모터 서열 내의 위치 +3의 염기에 상보적인 방법.
  43. 제40항에 있어서, RNA 폴리머라제가 T7 폴리머라제인 방법.
  44. 제40항에 있어서, 혼합물이 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트를 포함하고, 임의로 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트가 GTP, ATP, CTP 및 UTP이고, 추가로 임의로 UTP가 슈도우리딘 트리포스페이트인 방법.
  45. 제40항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형이 DNA 주형이며, 임의로 상기 DNA 주형은 이중 가닥 선형 DNA, 부분 이중 가닥 선형 DNA, 원형 이중 가닥 DNA, DNA 플라스미드 또는 PCR 앰플리콘으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제40항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형이 주형 위치 +1에 2'-데옥시티미딘, 주형 위치 +2에 2'-데옥시시티딘, 및/또는 주형 위치 +3에 2'-데옥시시티딘을 포함하는 것인 방법.
  47. 제35항의 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 DNA 주형을 포함하는 복합체로서,
    여기서
    DNA 주형은 주형 위치 +1에 첫 번째 뉴클레오티드, 주형 위치 +2에 두 번째 뉴클레오티드 및 주형 위치 +3에 세 번째 뉴클레오티드를 갖는 전사 출발 부위를 포함하는 프로모터 영역을 포함하고;
    개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 내의 B1은 주형 위치 +1에서 DNA 주형 상의 뉴클레오시드 염기에 상보적이고, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 내의 B2는 주형 위치 +2에서 DNA 주형 상의 뉴클레오시드 염기에 상보적이고, 개시 캡핑된 올리고뉴클레오티드 프라이머 내의 B10은 주형 위치 +3에서 DNA 주형 상의 뉴클레오시드 염기에 상보적인,
    복합체.
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