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JP2023549592A - ５’－キャッピングされたｒｎａ合成用オリゴヌクレオチド - Google Patents

５’－キャッピングされたｒｎａ合成用オリゴヌクレオチド Download PDF

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JP2023549592A
JP2023549592A JP2023524107A JP2023524107A JP2023549592A JP 2023549592 A JP2023549592 A JP 2023549592A JP 2023524107 A JP2023524107 A JP 2023524107A JP 2023524107 A JP2023524107 A JP 2023524107A JP 2023549592 A JP2023549592 A JP 2023549592A
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Abstract

本発明は、５’－キャッピングされたＲＮＡの合成に用いられる新規オリゴヌクレオチドプライマーに関する。本発明ににおいて、化学式１で提供されるＲＮＡキャッピング用新規オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸治療薬またはワクチン分野に有用に活用され得る。

Description

技術分野
本発明は、５’－キャッピングされたＲＮＡの合成用オリゴヌクレオチドに関する。
背景技術
ｖＲＮＡの５’－キャッピングとは、真核細胞内でのｐｒｅ－ｍＲＮＡ加工過程の第一段階であって、転写されたＲＮＡの５’末端にキャップ（ｃａｐ）を被せる過程である。真核生物におけるｍＲＮＡ分子の５’末端には、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）が５’三リン酸結合を介して連結された５’キャップ（ｃａｐ－０）が生成され、これはｉｎ ｖｉｖｏでメチルトランスフェラーゼ酵素によって媒介される。真核生物におけるｍＲＮＡには、５’末端の最初のリボース糖の２’ヒドロキシ基のメチル化（ｃａｐ－１）および二番目のリボース糖の２’ヒドロキシ基のメチル化（ｃａｐ－２）を含むさらなる修飾が存在し得る。このようなｍＲＮＡの５’キャッピング過程を通じて、ｍＲＮＡが核から細胞質に出るとき、５’エキソヌクレアーゼなどの分解酵素に対する抵抗性を獲得する。
医療または研究目的で、特定の遺伝子をコードするキャッピングされたｍＲＮＡを真核生物にトランスフェクションしたり、細胞または胚に微小注入することによって、前記遺伝子を人工的に発現させたりすることができる。しかし、この過程でキャップされていないＲＮＡを使用する場合、ＲＮＡは急速に分解されるだけでなく、免疫原性を有し、タンパク質の翻訳効率が急激に低下する。 したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを合成するためには、５’キャッピングが適切に行われることが非常に重要である。
ｍＲＮＡを合成するための、５’－三リン酸基を有するＲＮＡを最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させた後、キャッピング酵素を用いて５’キャッピングを行うという過程は費用がかかり、非効率的であることが判明した。このことから、５’－キャッピング構造を有するオリゴヌクレオチドを製造し、これをプライマーとして用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を開始する合成方法が開発された。例えば、国際公開公報ＷＯ２００８／０１６４７３および国際公開公報ＷＯ２０１３／０５９４７５には、５’－キャッピングされたＲＮＡを合成するためのジヌクレオチドｍＲＮＡキャップ類似体が開示されており、国際公開公報ＷＯ２０１７／０５３２９７には、５’－キャッピングされたｍＲＮＡを合成するためのトリヌクレオチドｍＲＮＡキャップ類似体が開示されている。
キャッピングされたＲＮＡ転写体は、核酸治療薬、ワクチン分野などのタンパク質合成を必要とする治療および／または予防分野に適用できるため、これらを効率的に調製するための５’－キャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーの開発が必要である。例えば、従来の方法より製造工程が簡便で費用対効果が高く、所望の転写反応を効率的に進める、ＲＮＡ生成収率を向上させる、不要な異種生成物の生成を減少する、追加の酵素反応を必要としない、またはＲＮＡの大規模な合成を可能にするＲＮＡキャップ類似体の開発が切実であるのが実情である。さらに、実際のＲＮＡ治療薬またはワクチンとして適用されるとき、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡの安定性を維持する、翻訳効率を改善する、または免疫原性などの副作用を軽減することができるキャップ構造を提供すれば、ＲＮＡ治療薬またはワクチン分野での汎用的な有用性を達成できるはずである。
発明の概要
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、新規ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマー、その製造方法並びに用途を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、前記ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーを用いて製造されるＲＮＡ分子並びにその用途を提供するものである。
課題を解決するための手段
本発明者らは、前記目的を達成するために新規ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマー、その製造方法並びにその使用方法を提供する。特に断りがない限り、本願にて使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本願の開示内容全般に亘って言及されたあらゆる特許文献および非特許文献は、その全文が参照により組み込まれる。
新規ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマー
本発明は、下記化学式１で表される化合物、その立体異性体、またはその塩を提供する：

前記化学式中、
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、天然、非天然または修飾ヌクレオシド塩基であり；
Ｘ１は、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
Ｘ２は、－ＨまたはＸ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
Ｙ１は、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－ＣＨ２Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
Ｙ２は、－ＨまたはＹ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立して、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－ＣＨ２Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
Ｚ３は、－ＨまたはＺ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
ｎは、０～３の整数であり；
ｍは、１～１０の整数であり｛ここで、ｍが２以上である場合、それぞれのＢ２、Ｚ１およびＺ２は、互いに異なっていてもよい｝；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、－Ｈまたは－（Ｃ１－４アルキル）であり；
Ｒ３は、－（Ｃ１－４アルキル）である。
本発明において、前記ヌクレオシド塩基は、天然ヌクレオシド塩基だけでなく、非天然または修飾ヌクレオシド塩基も使用可能である。
本発明において、天然に生じるヌクレオシドにおいて最もよくみられる塩基環は、プリンおよびピリミジン環である。天然に生じるプリン環は、例えば、

を含む。天然に生じるピリミジン環は、例えば、

を含む。
本発明の具体例によれば、前記非天然または修飾ヌクレオシド塩基は、前記天然ヌクレオシド塩基の異性体であるまたは前記天然ヌクレオシド塩基の一つ以上の－Ｈが－（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）または－ハロで置換され、一つ以上の＝ＣＨ－が＝Ｎ－で置換され、および一つ以上の＝Ｏが＝Ｓで置換されてなる群から選択された１以上で置換されていてもよい。
また、本発明において、非天然または修飾ヌクレオシド塩基は、天然ＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ）のいずれかまたは他の特異的ＮＴＰの代替物としてＲＮＡポリメラーゼにより認識可能な人工塩基を伴うヌクレオシド類似体に由来する塩基であってもよい（文献［［Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２４３７－２４４７（２００１）；Ｃｒｅｙ－Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３：１５３２－１５４３（２００５）；Ｋｉｎｃａｉｄ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３：２６２０－２６２８（２００５）；Ｐｒｅｐａｒａｔａ，ＦＰ，Ｏｌｉｖｅｒ，ＪＳ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７５３－７６５（２００４）；およびＨｉｌｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：４２５８－４２６３（１９９８）］など）。
また、本発明において、前記非天然または修飾ヌクレオシド塩基は、ハロゲン－置換されたプリン（例えば、６－フルオロプリン）、ハロゲン－置換ピリミジン、Ｎ６－エチルアデニン、Ｎ４－（アルキル）－シトシン、５－エチルシトシンなどに由来する塩基であってもよいが、これらに制限されない。
また、本発明において、前記非天然または修飾ヌクレオシド塩基の他の一例として、８－アザグアノシン、シュードウリジン（ψ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）またはＮ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含むが、これらに制限されない。
この外にも、本発明で使用し得る天然、非天然または修飾ヌクレオシド塩基の例は、国際公開公報ＷＯ２０１８／１４４７７５または国際公開公報ＷＯ２０１８／１４４０８２などに記載された事項を参考することができる。
本発明の具体例によれば、Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、

であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、
Ｘ１は、－ＯＨであり；
Ｘ２は、－Ｈであってもよい。
また、本発明の具体例によれば、
Ｙ１は、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
Ｙ２は、－ＨまたはＹ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであってもよい ｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝。
また、本発明の具体例によれば、
Ｚ１は、－ＯＨまたは－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）であり；
Ｚ２は、－ＯＨであり；
Ｚ３は、－Ｈであってもよい。
また、本発明の具体例によれば、ｎは、０または１であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、ｍは、１であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、－Ｈであり；
Ｒ３は、－（Ｃ１－４アルキル）であってもよい。
具体的には、前記化学式１で表される化合物は、下記化合物からなる群から選択されるいずれかであってもよい：
Figure 2023549592000006
Figure 2023549592000007

Figure 2023549592000008

Figure 2023549592000009
本発明の具体例によれば、前記化学式１で表される化合物は、下記化合物からなる群から選択される１種以上であってもよい：
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホイル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホイル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホイル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホイル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド１）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（２－メトキシエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド２）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－６－メチル－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド３）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド４）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド５）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド６）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド７）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド８）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド９）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド１０）；
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド１１）；および
２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド１２）。
本発明の具体例によれば、前記化学式１で表される化合物は、ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）であってもよい。
本発明において、用語「立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ）」は、同様の化学式または分子式を有するが、立体的に異なる本発明の化合物またはその塩を意味する。このようなそれぞれの立体異性体およびそれらの混合物も同様に本発明の範囲に含まれる。また、特に断りがない限り、不斉炭素原子に結合する実線で表される結合（－）は、立体中心の絶対配置を表すくさび形

またはくさび形の破線結合

を含むことができる。
本発明において、用語「塩（ｓａｌｔ）」は、医薬業界で通常使用される塩を意味する。具体的には、塩基（ｂａｓｅ）付加塩であってもよい。例えば、カルシウム、カリウム、ナトリウムまたはマグネシウムなどで製造された無機イオン塩；アルギニン、リジン、ヒスチジンなどで製造されたアミノ酸塩；およびトリメチルアミン、トリエチルアミン、アンモニア、ピリジン、ピコリンなどで製造されたアミン塩などがあるが、挙げられたこれら塩によって本発明にて意味する塩の種類が限定されるものではない。
新規オリゴヌクレオチドプライマーでキャッピングされたＲＮＡ
上述したＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーは、これを含むＲＮＡ分子を製造することに用いられることができる。したがって、本発明は、化学式１で表されるＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子を提供する。
本発明に係るＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーは、３’－末端でのＮＴＰの組み込みによってＲＮＡポリメラーゼにより伸長され得る。ＤＮＡ鋳型（例えば、ＤＮＡプラスミド）、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド５’－三リン酸および適切な緩衝剤のような必須構成要素を含有する転写系において、プロモーターの制御下でｉｎ ｖｉｔｒｏで転写を開始することができる。ここで、オリゴヌクレオチドプライマーは、開始部位においてＤＮＡ鋳型に対して相補的である。
本発明において、プロモーターとは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）の転写の開始を誘導および制御するｄｓＤＮＡ鋳型の特定領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡ上の同一鎖および上流（センス鎖の５’領域に向かう）に位置する。プロモーターは、通常、転写されるＤＮＡ配列のすぐ隣であるまたは部分的にこのような配列と重複する。プロモーター中のヌクレオチド位置は、ＤＮＡの転写が始まる転写出発部位を基準にして設計される（位置＋１）。開始オリゴヌクレオチドプライマーは、プロモーター配列の開始部位（これは、特定の実施態様において、位置＋１および＋２にあり、開始四量体の場合には、位置＋１、＋２および＋３にある）に対して相補的である。
一実施態様において、前記ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーは、５’－キャッピングされたＲＮＡを形成するため、ＲＮＡ分子の５’ 上端に付着する。このように形成されたＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ、小さい核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、小さい核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、小さいカハール体－特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）を含むが、これらに制限されない。
一実施態様において、前記ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり、１個以上のコーティング配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＣＤＳ）を含むことができる。さらに、前記ＲＮＡ分子は、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリＡ配列は、完全にまたは大部分アデニンヌクレオチド、その類似体、または誘導体から構成されることができる。ポリＡ配列は、核酸の３’未翻訳の領域に隣接して位置する尾であってもよい。
本発明は、また、（Ｓ－１）ＤＮＡ鋳型、上述した化学式１で表されるＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを混合する工程；および（Ｓ－２）前記混合物をインキュベーションし、前記ポリヌクレオチド鋳型の転写を行う工程を含む５’－キャッピングされたＲＮＡ分子の合成方法を提供する。
一方、オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオシド５’－三リン酸 （ＮＴＰ）を用いてＲＮＡのＤＮＡ－鋳型化したおよびプロモーター制御された合成方法は、本発明が属する技術分野に公知されている。したがって、本発明にて提供された化学式１で表されるＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーを活用し、これを含むＲＮＡ分子を合成することができる。
本発明の具体例によれば、ＤＮＡ鋳型は、二重鎖線形ＤＮＡ、部分的二重鎖線形ＤＮＡ、環状二重鎖ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、ＰＣＲアンプリコンであってもよく、その外にもＲＮＡポリメラーゼと適切に反応することができる修飾核酸であってもよい。
本発明の具体例によれば、前記ＲＮＡ分子の合成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで大規模な転写を行うため、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、Ｋ１－５、Ｋ１Ｅ、Ｋ１ＦまたはＫ１１バクテリオファージに由来するシングルサブユニットファージポリメラーゼが用いられることができる。このような系列のポリメラーゼは、補助タンパク質を必要とせず、開始ヌクレオチド配列に対する最小限の制約を有する～１７個のヌクレオチドの単純な最小プロモーター配列を有する。本発明にて使用できるＲＮＡポリメラーゼの一例としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）が挙げられるが、関連技術分野における通常の技術者は、本発明が他のＲＮＡポリメラーゼを用いても実施することができることが理解できるであろう。ＤＮＡポリメラーゼとは異なり、Ｔ７ ＲＮＡＰはプライマー不在にＲＮＡ合成を開始する。開始における第一工程は、新規なＲＮＡ合成と呼ばれ、ここでは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鋳型での特異的配列を認識し、位置＋１および＋２における鋳型残基に対して相補的なヌクレオチド三リン酸の第１対を選択し、ホスホジエステル結合の形成を触媒し、ジヌクレオチドを形成する。
キャッピングされたＲＮＡの医薬的用途
上述したような本発明に係る５’－キャッピングされたＲＮＡ分子は、医薬的目的のために有用に活用され得る。
本発明の具体例によれば、本発明に従って製造された５’－キャッピングされたＲＮＡ分子は、核酸治療薬またはワクチンとして活用され得る。例えば、前記核酸治療薬またはワクチンは、ＲＮＡワクチン（癌または感染症の疾患予防用ワクチン）として用いられることができる。前記核酸治療薬またはワクチンは、対象体に投与され、目的とするペプチドを産生するため、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されることができる。
本発明の具体例によれば、前記５’－キャッピングされたＲＮＡ分子は、細胞内に導入され、細胞の医薬的病態を治療するまたは細胞に対して治療的影響を及ぼすことができるタンパク質を生成させることができる。
本発明の具体例によれば、前記核酸治療薬またはワクチンは、ＲＮＡ分子と共に、前記ＲＮＡ分子を標的細胞に導入することができる伝達体をさらに含むことができる。
本発明の具体例によれば、本発明は、上述した５’－キャッピングされたＲＮＡ分子から翻訳されたペプチドを提供する。
本発明の具体例によれば、本発明は、上述した５’－キャッピングされたＲＮＡ分子が導入された細胞を提供する。前記細胞は、対象体の体細胞であってもよく、体外で培養可能な細胞株であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、本発明は、５’－キャッピングされたＲＮＡ分子が導入された細胞から産生されたペプチドを提供する。
本発明において、ＲＮＡ治療薬またはワクチンのための製薬組成物は、注射による投与、または特定の病態を治療するために、関連技術分野における通常の技術者に公知された他の適切な経路による投与用に剤形化することができる。非経口投与のための注射可能な組成物は、通常、適合する溶液および／または製薬担体、例えば、滅菌性生理学的食塩水中の活性化合物を含有する。前記組成物はまた、脂質またはリン脂質中の懸濁剤、リポソーム懸濁剤、または水性エマルジョンとして剤形化することができる。
ＲＮＡ治療薬またはワクチンのための組成物および／または剤形を製造する方法は、関連技術分野における通常の技術者に公知されている（文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）］参照）。投与される組成物は、標的細胞または組織における目的タンパク質の発現を増加させるため、製薬上、安全で有効な量で選択された化合物の特定の量を含有する。
一部の実施態様において、製薬組成物は、前記記載のような化合物を少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）含有し、一部の実施態様において、製薬組成物は、前記化合物を０．１％超含有し、一部の実施態様において、製薬組成物は、約１０％以下含有し、一部の実施態様において、製薬組成物は、約５％以下含有し、一部の実施態様において、製薬組成物は、約１％（ｗ／ｖ）以下含有する。適合する濃度の選択は、活性作用剤の目的とする用量、頻度および伝達方法のような要因によって左右される。
対象体、例えば、哺乳類またはヒトを治療する場合、その投与量は、対象体の体重および全般的な健康、治療を受ける病態、症状の重症度などのような要因に基づいて決定される。好ましくない如何なる副作用も避けながら、目的とする受益をもたらす投与量と濃度を決定する。対象化合物の典型的な投与量は、ヒトの患者の場合、約０．０００５～５００ｍｇ／日の範囲内であり、一部の実施態様において、約１～１００ｍｇ／日の範囲内である。例えば、より高い用量療法は、例えば、５０～１００、７５～１００、または５０～７５ｍｇ／日を含み、より低い用量療法としては、例えば、１～５０、２５～５０、または１～２５ｍｇ／日を含むことができる。
発明の効果
本発明に係る新規オリゴヌクレオチドは、５’－キャッピングされたＲＮＡの合成に活用され、ＲＮＡ生産工程（例えば、合成収率、合成規模、純度など）を改善するばかりでなく、それを活用した核酸治療薬またはワクチンの効能（例えば、ＲＮＡの安定性および／またはタンパク質発現効率）改善および副作用の減少（例えば、免疫原性の減少）効果を発揮することができる。したがって、本発明は、核酸治療薬またはワクチン分野に有用に活用し得る。
図１はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡに対する電気泳動の結果を示す。 図２は蛍光顕微鏡を通じたＧＦＰ ｍＲＮＡ発現の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例および実験例を通じて本発明の構成および効果をより詳しく説明する。これら実施例および実験例は、本発明を例示するためだけのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例および実験例により限定されるものではない。
製造例１：（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩の製造
工程１．（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロ－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（２－イソブチルアミド－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）ホスファートの製造
Ｎ－（９－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－２－イル）イソブチルアミド（４ｇ、１０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶かした。０～５℃まで冷却した後、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（８．９１ｇ、１０．１７ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（２．８５ｇ、４０．７ｍｍｏｌ）を順次入れた。１０分後、常温までゆっくりと昇温させ、１時間攪拌した。反応液を０～５℃まで冷却した後、Ｉ２（０．１Ｍ）（７．７４ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）ｉｎ ＴＨＦ／蒸留水／ピリジン（６６：３３：１）（１０１．６ｍＬ）を入れた。常温までゆっくりと昇温させ、１時間攪拌した。反応終了後、ＤＣＭで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム五水和物の溶液を入れ、有機層と水層を分離した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水させ、減圧濃縮した。
濃縮残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶かした。０～５℃まで冷却した後、ＴＦＡ １０．１７ｍＬをＤＣＭ ８１７ｍＬに希釈してゆっくりと入れ、１０分間攪拌した。反応液を常温までゆっくりと昇温させ、１０分間攪拌した。反応液を０～５℃まで冷却した後、飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ）溶液をゆっくりと入れながらｐＨを８～９の間に合わせた。有機層と水層を分離し、有機層を硫酸ナトリウムで水分を除去し、濾過した。減圧濃縮後、カラムクロマトグラフィーにより分離し、黄色の固形物として標題化合物（５．６２ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ ８８２．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
工程２．（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（２－イソブチルアミド－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）ホスファートの製造
前記工程１にて得られた（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロ－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（２－イソブチルアミド－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）ホスファート（５．６ｇ、６．３５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２１．２ｍＬ）に溶かした。０～５℃まで冷却した後、ビス（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（３．３２ｍＬ、１２．７０ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（０．８９０ｇ、１２．７０ｍｍｏｌ）を順次入れた。１０分後、常温までゆっくりと昇温させ、１時間攪拌した。反応液を０～５℃まで冷却した後、Ｉ２（０．１Ｍ）（４．８４ｇ、１９．０５ｍｍｏｌ）ｉｎ ＴＨＦ／蒸留水／ピリジン（６６：３３：１）（６３．６ｍＬ）を入れた。常温までゆっくりと昇温させ、１時間攪拌した。反応終了後、ＤＣＭで希釈し、１０％のチオ硫酸ナトリウム五水和物の溶液を入れ、有機層と水層を分離した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水させ、減圧濃縮後、カラムクロマトグラフィーにより分離し、黄色の固形物として標題化合物（５．７８ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １０８６．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
工程３．（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩の製造
前記工程２にて得られた（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（２－イソブチルアミド－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）ホスファート（２．８９ｇ、２．７１ｍｍｏｌ）を１Ｍ ＨＣｌ水溶液（１６２ｍＬ、１６２ｍｍｏｌ）に溶かし、常温で１６時間攪拌した。反応液を０～５℃まで冷却した後、アンモニア水（４２．２ｍＬ、１０８３ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。常温までゆっくりと昇温させた後、５０～５５℃で２３時間加熱した。反応液をＤＣＭ（１５０ｍＬで２回）で洗浄し、水層をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｒｅｓｉｎで精製し、白色の固形物として標題化合物（１．９８ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ,ｍ／ｚ）＝ ６９５．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
製造例２：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ホスホリル）オキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．ナトリウム塩の製造
工程１．２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．トリエチルアミン塩の製造
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）二りん酸塩三水素メチル．２トリエチルアミン塩（５ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）を精製水（１５５ｍＬ）に溶かし、酢酸で溶液のｐＨを４．５に調節した。硫酸ジメチル（５．１８ｍＬ、５４．２ｍｍｏｌ）を１分間ゆっくりと添加した後、常温で１時間攪拌した。このとき、溶液のｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて４～４．５に調節した。反応終了後、ＤＣＭ（２００ｍＬ×３回）で洗浄し、水層を１Ｍ ＴＥＡＢを用いてｐＨ５．５～６に調節した。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｒｅｓｉｎで精製し、白色の固形物として標題化合物（３．０３ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ ４５６．０（Ｍ－Ｈ＋）。
工程２．２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ホスホリル）オキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．ナトリウム塩の製造
前記工程１にて得られた２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．トリエチルアミン塩（３．０３ｇ、５．４２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（３．６９ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３８．７ｍＬ）に溶かした。２，２’－ジチオジピリジン（５．９７ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）を添加し、常温で１０時間攪拌した。反応終了後、反応液を－１０～－２０℃まで冷却し、アセトン中の０．１Ｍナトリウムパーコレート（１０８ｍＬ、１０．８３ｍｍｏｌ）を滴下した。生成された個体を濾過した後、乾燥し、白色の固形物として標題化合物（２．３３ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ ５０７．０（Ｍ－Ｈ＋）。
製造例３：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３－ヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ホスホリル）オキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．ナトリウム塩の製造
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．２トリエチルアミン塩（１９０ｍｇ、０．３３１ｍｍｏｌ）を用いて、前記製造例２と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（１５９ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ ５２２．０（Ｍ＋Ｈ＋）。
実施例１：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホイル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホイル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホイル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホイル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド１）の製造
製造例１にて得られた化合物（２０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（２３．１８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．２９ｍＬ）に溶かし、ＭｇＣｌ２（３．８４ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を添加した後、常温で７時間攪拌した。反応終了後、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｑ）１．４４ｍＬに希釈した。完全に溶解されたことを確認した後、精製水１４４ｍＬに希釈し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｒｅｓｉｎで精製し、白色の固形物として標題化合物（２２．４ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１３２．６（Ｍ－Ｈ＋）。
実施例２：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（２－メトキシエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド２）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（２－メトキシエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（９２ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（９１．３ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（７３ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１８７．７（Ｍ－３Ｈ＋）
実施例３：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－６－メチル－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド３）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－６－メチル－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（３０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（３５ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（６ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１５６．１（Ｍ－Ｈ＋）
実施例４：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド４）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（１７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（２４．４３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（３．８ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４５．８（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例５：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド５）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（５０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（１１２．０ｍｇ、０．２２１ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（８ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４３．０（Ｍ－Ｈ＋）
実施例６：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド６）の製造
製造例１にて得られた化合物（３０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）と製造例３にて得られた化合物（３２．７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（９ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４９．１（Ｍ＋Ｈ＋）
実施例７：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド７）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（２０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）と製造例３にて得られた化合物（３１．３ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（１６ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４７．１（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例８：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド８）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（２０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（３０．５ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（１４．５ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１３３．１（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例９：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド９）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（５０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（６１．８ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（３４．６ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １０９２．８（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例１０：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド１０）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（２０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）と製造例３にて得られた化合物（２１．４７ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（１５．２ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１６５．０（Ｍ＋Ｈ＋）
実施例１１：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド１１）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（５０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（５２．３ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（２６．３ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４７．９（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例１２：２－アミノ－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－５－（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド１２）の製造
製造例１にて得られた化合物（４０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）と製造例２と同様の方法で得られた２－９－（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－ピリン－７－イウム．ナトリウム塩（４２．６ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（６．５ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １０５２．１（Ｍ－２Ｈ＋）
実験例１：ＧＦＰ ＤＮＡ鋳型の製造
ｍＲＮＡ合成のためのＤＮＡ鋳型を得るため、バイオニクス（株）からＴ７ ＲＮＡプロモーター、５’ＵＴＲ、ＥＧＦＰ、３’ＵＴＲ、ｐｏｌｙ Ａ配列を有するプラスミド遺伝子の合成を行った。次いで、キャップ物質に応じてプロモーター配列を変更するために、プラスミド遺伝子とｐｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ｐｒｅｍｉｘ（タカラカタログ＃Ｒ０４０Ａ）、２μｍｏｌのフォワードプライマー（配列番号１）、２μｍｏｌのリバースプライマー（配列番号２）を混合し、ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）を行った後、従来のプラスミド遺伝子にＸｂａＩ（タカラカタログ＃１０９３Ａ）、ＢａｍＨＩ（タカラカタログ＃１０１０Ａ）制限酵素を用いたクローニングを通じてプラスミド遺伝子を作製した。作製したプラスミド遺伝子をＳａｍＩ（タカラカタログ＃１０８５Ａ）制限酵素で線形化した後、ＡｃｃｕＰｒｅｐ ＰＣＲ精製キット（バイオニアカタログ＃Ｋ－３０３７）を用いて、ＧＦＰ ＤＮＡ転写鋳型（配列番号３）を確保した。
実験例２：ＧＦＰ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ転写
２－１：キャップを有さない（Ｎｏｎ ｃａｐ）ＧＦＰ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ転写
５’末端にキャップ（ｃａｐ）構造を有さないｍＲＮＡ合成反応のため、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２５ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＵＴＰ、２ｍＭのＣＴＰ、２ｍＭのＧＴＰ、５％のＤＭＳＯ（シグマアルドリッチカタログ＃４７２３０１－５００ＭＬ）、５ｍｇ／ｍＬのＧＦＰ ＤＮＡ転写鋳型、８００Ｕ／ｍＬ組み換えＲＮａｓｅ阻害タンパク質（タカラカタログ＃２３１６Ａ）、２Ｕ／ｍＬ 酵母無機ピロホスファターゼ（サーモサイエンティフィックカタログ＃ＥＦ０２２１）、２５００Ｕ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（バイオダインカタログ＃ｄｙ１６７０）を混合した。
転写反応混合物を３７℃で５時間インキュベーションした。反応物に４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのＤＴＴおよび５０００Ｕ／ｍＬの組み換えＤＮＡｓｅ Ｉ（タカラカタログ＃２２７０Ａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。生成されたｍＲＮＡをメーカーの取扱説明書に従って、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＲＮＡｃｌｅａｎ ＆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５キット（カタログ＃１０１７）を用いて精製した。
ｍＲＮＡの合成可否は、Ｌｏｎｚａ ＧｅｌＳｔａｒＴＭ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ＃５０５３５）を添加した１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行って確認した（図１）。合成されたｍＲＮＡのＵＶ解析は、サーモサイエンティフィックＮａｎｏｄｒｏｐ ｏｎｅ ＵＶ－ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。その結果、約１０６６ ｎｔのｐｏｌｙ Ａ（１２０）を含むＧＦＰ ｍＲＮＡが生成されることを確認した。
２－２：ＡＲＣＡキャップ類似体の共転写キャッピングを通じたＧＦＰ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ転写
ＡＲＣＡキャップを用いたｍＲＮＡ合成反応のため、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２５ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＵＴＰ、２ｍＭのＣＴＰ、０．４ｍＭのＧＴＰ、１．６ｍＭのＡＲＣＡ（トリリンク、カタログ＃Ｎ－７００３）、５％のＤＭＳＯ（シグマアルドリッチカタログ＃４７２３０１－５００ＭＬ）、５ｍｇ／ｍＬのＧＦＰ ＤＮＡ転写鋳型、８００Ｕ／ｍＬの組み換えＲＮａｓｅ阻害タンパク質（タカラカタログ＃２３１６Ａ）、２Ｕ／ｍＬの酵母無機ピロホスファターゼ（サーモサイエンティフィックカタログ＃ＥＦ０２２１）、２５００Ｕ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（バイオダインカタログ＃ｄｙ１６７０）を混合した。
転写反応混合物を３７℃で５時間インキュベーションした。反応物に４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのＤＴＴおよび５０００Ｕ／ｍＬの組み換えＤＮＡｓｅ Ｉ（タカラカタログ＃２２７０Ａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。生成されたｍＲＮＡをメーカーの取扱説明書に従って、Ｚｙｍｏ ＲｅｓｅａｒｃｈＲＮＡｃｌｅａｎ ＆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５キット（カタログ＃１０１７）を用いて精製した。
ｍＲＮＡの合成可否は、Ｌｏｎｚａ ＧｅｌＳｔａｒＴＭ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ＃５０５３５）を添加した１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行って確認した（図１）。合成されたｍＲＮＡのＵＶ解析は、サーモサイエンティフィックＮａｎｏｄｒｏｐ ｏｎｅ ＵＶ－ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。その結果、約１０６７ ｎｔのｐｏｌｙ Ａ（１２０）を含む二量体ＡＲＣＡ ｃａｐｐｉｎｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡが生成されることを確認した。
２－３：実施例の共転写キャッピングを通じたＧＦＰ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ転写
本発明の実施例化合物を用いたｍＲＮＡ合成反応のため、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２５ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＵＴＰ、２ｍＭのＣＴＰ、２ｍＭのＧＴＰ、３．２ｍＭの実施例化合物、５％のＤＭＳＯ（シグマアルドリッチカタログ＃４７２３０１－５００ＭＬ）、５ｍｇ／ｍＬのＧＦＰ ＤＮＡ転写鋳型、８００Ｕ／ｍＬの組み換えＲＮａｓｅ阻害タンパク質（タカラカタログ＃２３１６Ａ）、２Ｕ／ｍＬの酵母無機ピロホスファターゼ（サーモサイエンティフィックカタログ＃ＥＦ０２２１）、２５００Ｕ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（バイオダインカタログ＃ｄｙ１６７０）を混合した。
転写反応混合物を３７℃で５時間インキュベーションした。反応物に４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのＤＴＴおよび５０００Ｕ／ｍＬの組み換えＤＮＡｓｅ Ｉ（タカラカタログ＃２２７０Ａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。生成されたｍＲＮＡをメーカーの取扱説明書に従って、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＲＮＡｃｌｅａｎ ＆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５キット（カタログ＃１０１７）を用いて精製した。
ｍＲＮＡの合成可否は、Ｌｏｎｚａ ＧｅｌＳｔａｒＴＭ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ＃５０５３５）を添加した１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行って確認した（図１）。合成されたｍＲＮＡのＵＶ解析は、サーモサイエンティフィックＮａｎｏｄｒｏｐ ｏｎｅ ＵＶ－ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。その結果、約１０６７ ｎｔのｐｏｌｙ Ａ（１２０）を含む実施例ｃａｐｐｉｎｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡが生成されることを確認した。
実験例３：Ｈｅｌａ細胞におけるｍＲＮＡの翻訳
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成されたｍＲＮＡの翻訳活性をヒト子宮頸癌細胞株（Ｈｅｌａ；Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）で評価した。Ｈｅｌａ細胞を５％の二酸化炭素の雰囲気下で３７℃で１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭ中で培養した。１×１０６個／ウェルのＨｅｌａ細胞を６－ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞をトランスフェクション試薬（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；インビトロジェンカタログ＃ＬＭＲＮＡ００３）を用いてトランスフェクションさせた：トランスフェクション試薬メーカーの取扱説明書に従って、チューブＡに複合培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１２５μＬにトランスフェクション試薬７．５μＬを希釈し、室温で１０分間インキュベーションさせ、チューブＢには、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １２５μＬに製造されたｍＲＮＡ ５μｇを希釈し、準備した。チューブＡとチューブＢの溶液を混合した後、室温で５分間インキュベーションさせた。インキュベーション時間の間、細胞培養液は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに交換した。その後、インキュベーションされた混合溶液を用いて細胞をトランスフェクションさせた。５％の二酸化炭素の雰囲気下で３７℃で３～４時間インキュベーション後に細胞培養液は、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクション９６時間後に蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を確認した。
その結果、実施例化合物を用いて製造されたｍＲＮＡは、優れた蛍光活性を示した。その反面、対照群であるｃａｐを有さないｍＲＮＡは、蛍光活性が全く見られなかった。また、ＡＲＣＡキャップを用いて合成したｍＲＮＡと対比したとき、実施例化合物を用いて製造されたｍＲＮＡは、いずれも優れたタンパク質の発現率を示した（図２）。
実験例４：ウェスタンブロットの解析
トランスフェクションの実験後、培養液を除去し、ＰＢＳを用いて１回洗浄を行った。細胞溶解緩衝液（ＲＩＰＡ＋ホスファターゼ阻害剤＋ＰＭＳＦ）２００μＬを処理した後、４℃で１０分間溶解させた。細胞溶解物を回収した後、１２０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分離を行った。その後、上澄み液を回収した後、５×ＳＤＳ－サンプルローディングバッファーと混合した後、１００℃で５～１０分間沸かした。１０％のＳＤＳ ＰＡＧＥ－ゲルで１２０Ｖ、１０分、１７０Ｖ、１時間ランニングした。Ｘｃｅｌｌ ２ ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３０Ｖで１時間トランスファーした。５％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを用いて常温で１時間ブロッキングした。ラビット抗－ＧＦＰ抗体を５％のＢＳＡ－ＰＢＳＴに１：１０００で希釈した後、４℃で一晩反応させた。その後、ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。ＨＲＰ－結合されたラビット二次抗体を２．５％ＢＳＡ－ＰＢＳＴに１：１００００で希釈した後、室温で１時間処理した。次いで、ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。ＥＣＬ処理後、化学発光により確認し、β－ａｃｔｉｎ対比ＧＦＰ 発現レベルを解析した（表１）。
Figure 2023549592000012
実験例５：ＦＡＣＳ解析
トランスフェクションの実験後、培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。トリプシン－ＥＤＴＡ処理後、３７℃で細胞が脱落し始めるまで約２～３分間インキュベーションした。培養培地（ＨＧ ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１％のペニシリン／ストレプトマイシン）で中和した後、常温で１２００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄み液を掬い取った後、ＰＢＳ１ｍＬ分注した後、ピベッティングにより凝集した細胞を解放した。ＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ ８．０．３）でＧＦＰシグナル（ＦＩＴＣ）を測定した（ＦＳＣ、ＳＳＣ確認、表２）。
Figure 2023549592000013
以上、本発明の特定の部分を詳細に説明したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好ましい実施例及び実験例に過ぎず、これにより本発明の範囲が限定されるものでないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるものと言える。
技術分野
本発明は、５’－キャッピングされたＲＮＡの合成用オリゴヌクレオチドに関する。
背景技術
ｖＲＮＡの５’－キャッピングとは、真核細胞内でのｐｒｅ－ｍＲＮＡ加工過程の第一段階であって、転写されたＲＮＡの５’末端にキャップ（ｃａｐ）を被せる過程である。真核生物におけるｍＲＮＡ分子の５’末端には、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）が５’三リン酸結合を介して連結された５’キャップ（ｃａｐ－０）が生成され、これはｉｎ ｖｉｖｏでメチルトランスフェラーゼ酵素によって媒介される。真核生物におけるｍＲＮＡには、５’末端の最初のリボース糖の２’ヒドロキシ基のメチル化（ｃａｐ－１）および二番目のリボース糖の２’ヒドロキシ基のメチル化（ｃａｐ－２）を含むさらなる修飾が存在し得る。このようなｍＲＮＡの５’キャッピング過程を通じて、ｍＲＮＡが核から細胞質に出るとき、５’エキソヌクレアーゼなどの分解酵素に対する抵抗性を獲得する。
医療または研究目的で、特定の遺伝子をコードするキャッピングされたｍＲＮＡを真核生物にトランスフェクションしたり、細胞または胚に微小注入することによって、前記遺伝子を人工的に発現させたりすることができる。しかし、この過程でキャップされていないＲＮＡを使用する場合、ＲＮＡは急速に分解されるだけでなく、免疫原性を有し、タンパク質の翻訳効率が急激に低下する。 したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを合成するためには、５’キャッピングが適切に行われることが非常に重要である。
ｍＲＮＡを合成するための、５’－三リン酸基を有するＲＮＡを最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させた後、キャッピング酵素を用いて５’キャッピングを行うという過程は費用がかかり、非効率的であることが判明した。このことから、５’－キャッピング構造を有するオリゴヌクレオチドを製造し、これをプライマーとして用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を開始する合成方法が開発された。例えば、国際公開公報ＷＯ２００８／０１６４７３および国際公開公報ＷＯ２０１３／０５９４７５には、５’－キャッピングされたＲＮＡを合成するためのジヌクレオチドｍＲＮＡキャップ類似体が開示されており、国際公開公報ＷＯ２０１７／０５３２９７には、５’－キャッピングされたｍＲＮＡを合成するためのトリヌクレオチドｍＲＮＡキャップ類似体が開示されている。
キャッピングされたＲＮＡ転写体は、核酸治療薬、ワクチン分野などのタンパク質合成を必要とする治療および／または予防分野に適用できるため、これらを効率的に調製するための５’－キャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーの開発が必要である。例えば、従来の方法より製造工程が簡便で費用対効果が高く、所望の転写反応を効率的に進める、ＲＮＡ生成収率を向上させる、不要な異種生成物の生成を減少する、追加の酵素反応を必要としない、またはＲＮＡの大規模な合成を可能にするＲＮＡキャップ類似体の開発が切実であるのが実情である。さらに、実際のＲＮＡ治療薬またはワクチンとして適用されるとき、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡの安定性を維持する、翻訳効率を改善する、または免疫原性などの副作用を軽減することができるキャップ構造を提供すれば、ＲＮＡ治療薬またはワクチン分野での汎用的な有用性を達成できるはずである。
発明の概要
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、新規ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマー、その製造方法並びに用途を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、前記ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーを用いて製造されるＲＮＡ分子並びにその用途を提供するものである。
課題を解決するための手段
本発明者らは、前記目的を達成するために新規ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマー、その製造方法並びにその使用方法を提供する。特に断りがない限り、本願にて使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本願の開示内容全般に亘って言及されたあらゆる特許文献および非特許文献は、その全文が参照により組み込まれる。
新規ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマー
本発明は、下記化学式１で表される化合物、その立体異性体、またはその塩を提供する：

前記化学式中、
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、天然、非天然または修飾ヌクレオシド塩基であり；
Ｘ１は、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
Ｘ２は、－ＨまたはＸ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
Ｙ１は、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－ＣＨ２Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
Ｙ２は、－ＨまたはＹ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立して、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－ＣＨ２Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
Ｚ３は、－ＨまたはＺ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
ｎは、０～３の整数であり；
ｍは、１～１０の整数であり｛ここで、ｍが２以上である場合、それぞれのＢ２、Ｚ１およびＺ２は、互いに異なっていてもよい｝；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、－Ｈまたは－（Ｃ１－４アルキル）であり；
Ｒ３は、－（Ｃ１－４アルキル）である。
本発明において、前記ヌクレオシド塩基は、天然ヌクレオシド塩基だけでなく、非天然または修飾ヌクレオシド塩基も使用可能である。
本発明において、天然に生じるヌクレオシドにおいて最もよくみられる塩基環は、プリンおよびピリミジン環である。天然に生じるプリン環は、例えば、

を含む。天然に生じるピリミジン環は、例えば、

を含む。
本発明の具体例によれば、前記非天然または修飾ヌクレオシド塩基は、前記天然ヌクレオシド塩基の異性体であるまたは前記天然ヌクレオシド塩基の一つ以上の－Ｈが－（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）または－ハロで置換され、一つ以上の＝ＣＨ－が＝Ｎ－で置換され、および一つ以上の＝Ｏが＝Ｓで置換されてなる群から選択された１以上で置換されていてもよい。
また、本発明において、非天然または修飾ヌクレオシド塩基は、天然ＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ）のいずれかまたは他の特異的ＮＴＰの代替物としてＲＮＡポリメラーゼにより認識可能な人工塩基を伴うヌクレオシド類似体に由来する塩基であってもよい（文献［［Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２４３７－２４４７（２００１）；Ｃｒｅｙ－Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３：１５３２－１５４３（２００５）；Ｋｉｎｃａｉｄ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３：２６２０－２６２８（２００５）；Ｐｒｅｐａｒａｔａ，ＦＰ，Ｏｌｉｖｅｒ，ＪＳ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７５３－７６５（２００４）；およびＨｉｌｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：４２５８－４２６３（１９９８）］など）。
また、本発明において、前記非天然または修飾ヌクレオシド塩基は、ハロゲン－置換されたプリン（例えば、６－フルオロプリン）、ハロゲン－置換ピリミジン、Ｎ６－エチルアデニン、Ｎ４－（アルキル）－シトシン、５－エチルシトシンなどに由来する塩基であってもよいが、これらに制限されない。
また、本発明において、前記非天然または修飾ヌクレオシド塩基の他の一例として、８－アザグアノシン、シュードウリジン（ψ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）またはＮ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含むが、これらに制限されない。
この外にも、本発明で使用し得る天然、非天然または修飾ヌクレオシド塩基の例は、国際公開公報ＷＯ２０１８／１４４７７５または国際公開公報ＷＯ２０１８／１４４０８２などに記載された事項を参考することができる。
本発明の具体例によれば、Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、

であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、
Ｘ１は、－ＯＨであり；
Ｘ２は、－Ｈであってもよい。
また、本発明の具体例によれば、
Ｙ１は、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
Ｙ２は、－ＨまたはＹ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであってもよい ｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝。
また、本発明の具体例によれば、
Ｚ１は、－ＯＨまたは－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）であり；
Ｚ２は、－ＯＨであり；
Ｚ３は、－Ｈであってもよい。
また、本発明の具体例によれば、ｎは、０または１であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、ｍは、１であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、－Ｈであり；
Ｒ３は、－（Ｃ１－４アルキル）であってもよい。
具体的には、前記化学式１で表される化合物は、下記化合物からなる群から選択されるいずれかであってもよい：



本発明の具体例によれば、前記化学式１で表される化合物は、下記化合物からなる群から選択される１種以上であってもよい：
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド１）
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（２－メトキシエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド２）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－６－メチル－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド３）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド４）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド５）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド６）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド７）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド８）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド９）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド１０）；
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド１１）；および
２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム（オリゴヌクレオチド１２）。
本発明の具体例によれば、前記化学式１で表される化合物は、ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）であってもよい。
本発明において、用語「立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ）」は、同様の化学式または分子式を有するが、立体的に異なる本発明の化合物またはその塩を意味する。このようなそれぞれの立体異性体およびそれらの混合物も同様に本発明の範囲に含まれる。また、特に断りがない限り、不斉炭素原子に結合する実線で表される結合（－）は、立体中心の絶対配置を表すくさび形

またはくさび形の破線結合

を含むことができる。
本発明において、用語「塩（ｓａｌｔ）」は、医薬業界で通常使用される塩を意味する。具体的には、塩基（ｂａｓｅ）付加塩であってもよい。例えば、カルシウム、カリウム、ナトリウムまたはマグネシウムなどで製造された無機イオン塩；アルギニン、リジン、ヒスチジンなどで製造されたアミノ酸塩；およびトリメチルアミン、トリエチルアミン、アンモニア、ピリジン、ピコリンなどで製造されたアミン塩などがあるが、挙げられたこれら塩によって本発明にて意味する塩の種類が限定されるものではない。
新規オリゴヌクレオチドプライマーでキャッピングされたＲＮＡ
上述したＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーは、これを含むＲＮＡ分子を製造することに用いられることができる。したがって、本発明は、化学式１で表されるＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子を提供する。
本発明に係るＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーは、３’－末端でのＮＴＰの組み込みによってＲＮＡポリメラーゼにより伸長され得る。ＤＮＡ鋳型（例えば、ＤＮＡプラスミド）、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド５’－三リン酸および適切な緩衝剤のような必須構成要素を含有する転写系において、プロモーターの制御下でｉｎ ｖｉｔｒｏで転写を開始することができる。ここで、オリゴヌクレオチドプライマーは、開始部位においてＤＮＡ鋳型に対して相補的である。
本発明において、プロモーターとは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）の転写の開始を誘導および制御するｄｓＤＮＡ鋳型の特定領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡ上の同一鎖および上流（センス鎖の５’領域に向かう）に位置する。プロモーターは、通常、転写されるＤＮＡ配列のすぐ隣であるまたは部分的にこのような配列と重複する。プロモーター中のヌクレオチド位置は、ＤＮＡの転写が始まる転写出発部位を基準にして設計される（位置＋１）。開始オリゴヌクレオチドプライマーは、プロモーター配列の開始部位（これは、特定の実施態様において、位置＋１および＋２にあり、開始四量体の場合には、位置＋１、＋２および＋３にある）に対して相補的である。
一実施態様において、前記ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーは、５’－キャッピングされたＲＮＡを形成するため、ＲＮＡ分子の５’ 上端に付着する。このように形成されたＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ、小さい核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、小さい核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、小さいカハール体－特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）を含むが、これらに制限されない。
一実施態様において、前記ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり、１個以上のコーティング配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＣＤＳ）を含むことができる。さらに、前記ＲＮＡ分子は、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリＡ配列は、完全にまたは大部分アデニンヌクレオチド、その類似体、または誘導体から構成されることができる。ポリＡ配列は、核酸の３’未翻訳の領域に隣接して位置する尾であってもよい。
本発明は、また、（Ｓ－１）ＤＮＡ鋳型、上述した化学式１で表されるＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを混合する工程；および（Ｓ－２）前記混合物をインキュベーションし、前記ポリヌクレオチド鋳型の転写を行う工程を含む５’－キャッピングされたＲＮＡ分子の合成方法を提供する。
一方、オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオシド５’－三リン酸 （ＮＴＰ）を用いてＲＮＡのＤＮＡ－鋳型化したおよびプロモーター制御された合成方法は、本発明が属する技術分野に公知されている。したがって、本発明にて提供された化学式１で表されるＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーを活用し、これを含むＲＮＡ分子を合成することができる。
本発明の具体例によれば、ＤＮＡ鋳型は、二重鎖線形ＤＮＡ、部分的二重鎖線形ＤＮＡ、環状二重鎖ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、ＰＣＲアンプリコンであってもよく、その外にもＲＮＡポリメラーゼと適切に反応することができる修飾核酸であってもよい。
本発明の具体例によれば、前記ＲＮＡ分子の合成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで大規模な転写を行うため、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、Ｋ１－５、Ｋ１Ｅ、Ｋ１ＦまたはＫ１１バクテリオファージに由来するシングルサブユニットファージポリメラーゼが用いられることができる。このような系列のポリメラーゼは、補助タンパク質を必要とせず、開始ヌクレオチド配列に対する最小限の制約を有する～１７個のヌクレオチドの単純な最小プロモーター配列を有する。本発明にて使用できるＲＮＡポリメラーゼの一例としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）が挙げられるが、関連技術分野における通常の技術者は、本発明が他のＲＮＡポリメラーゼを用いても実施することができることが理解できるであろう。ＤＮＡポリメラーゼとは異なり、Ｔ７ ＲＮＡＰはプライマー不在にＲＮＡ合成を開始する。開始における第一工程は、新規なＲＮＡ合成と呼ばれ、ここでは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鋳型での特異的配列を認識し、位置＋１および＋２における鋳型残基に対して相補的なヌクレオチド三リン酸の第１対を選択し、ホスホジエステル結合の形成を触媒し、ジヌクレオチドを形成する。
キャッピングされたＲＮＡの医薬的用途
上述したような本発明に係る５’－キャッピングされたＲＮＡ分子は、医薬的目的のために有用に活用され得る。
本発明の具体例によれば、本発明に従って製造された５’－キャッピングされたＲＮＡ分子は、核酸治療薬またはワクチンとして活用され得る。例えば、前記核酸治療薬またはワクチンは、ＲＮＡワクチン（癌または感染症の疾患予防用ワクチン）として用いられることができる。前記核酸治療薬またはワクチンは、対象体に投与され、目的とするペプチドを産生するため、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されることができる。
本発明の具体例によれば、前記５’－キャッピングされたＲＮＡ分子は、細胞内に導入され、細胞の医薬的病態を治療するまたは細胞に対して治療的影響を及ぼすことができるタンパク質を生成させることができる。
本発明の具体例によれば、前記核酸治療薬またはワクチンは、ＲＮＡ分子と共に、前記ＲＮＡ分子を標的細胞に導入することができる伝達体をさらに含むことができる。
本発明の具体例によれば、本発明は、上述した５’－キャッピングされたＲＮＡ分子から翻訳されたペプチドを提供する。
本発明の具体例によれば、本発明は、上述した５’－キャッピングされたＲＮＡ分子が導入された細胞を提供する。前記細胞は、対象体の体細胞であってもよく、体外で培養可能な細胞株であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、本発明は、５’－キャッピングされたＲＮＡ分子が導入された細胞から産生されたペプチドを提供する。
本発明において、ＲＮＡ治療薬またはワクチンのための製薬組成物は、注射による投与、または特定の病態を治療するために、関連技術分野における通常の技術者に公知された他の適切な経路による投与用に剤形化することができる。非経口投与のための注射可能な組成物は、通常、適合する溶液および／または製薬担体、例えば、滅菌性生理学的食塩水中の活性化合物を含有する。前記組成物はまた、脂質またはリン脂質中の懸濁剤、リポソーム懸濁剤、または水性エマルジョンとして剤形化することができる。
ＲＮＡ治療薬またはワクチンのための組成物および／または剤形を製造する方法は、関連技術分野における通常の技術者に公知されている（文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）］参照）。投与される組成物は、標的細胞または組織における目的タンパク質の発現を増加させるため、製薬上、安全で有効な量で選択された化合物の特定の量を含有する。
一部の実施態様において、製薬組成物は、前記記載のような化合物を少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）含有し、一部の実施態様において、製薬組成物は、前記化合物を０．１％超含有し、一部の実施態様において、製薬組成物は、約１０％以下含有し、一部の実施態様において、製薬組成物は、約５％以下含有し、一部の実施態様において、製薬組成物は、約１％（ｗ／ｖ）以下含有する。適合する濃度の選択は、活性作用剤の目的とする用量、頻度および伝達方法のような要因によって左右される。
対象体、例えば、哺乳類またはヒトを治療する場合、その投与量は、対象体の体重および全般的な健康、治療を受ける病態、症状の重症度などのような要因に基づいて決定される。好ましくない如何なる副作用も避けながら、目的とする受益をもたらす投与量と濃度を決定する。対象化合物の典型的な投与量は、ヒトの患者の場合、約０．０００５～５００ｍｇ／日の範囲内であり、一部の実施態様において、約１～１００ｍｇ／日の範囲内である。例えば、より高い用量療法は、例えば、５０～１００、７５～１００、または５０～７５ｍｇ／日を含み、より低い用量療法としては、例えば、１～５０、２５～５０、または１～２５ｍｇ／日を含むことができる。
発明の効果
本発明に係る新規オリゴヌクレオチドは、５’－キャッピングされたＲＮＡの合成に活用され、ＲＮＡ生産工程（例えば、合成収率、合成規模、純度など）を改善するばかりでなく、それを活用した核酸治療薬またはワクチンの効能（例えば、ＲＮＡの安定性および／またはタンパク質発現効率）改善および副作用の減少（例えば、免疫原性の減少）効果を発揮することができる。したがって、本発明は、核酸治療薬またはワクチン分野に有用に活用し得る。
図１はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡに対する電気泳動の結果を示す。 図２は蛍光顕微鏡を通じたＧＦＰ ｍＲＮＡ発現の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例および実験例を通じて本発明の構成および効果をより詳しく説明する。これら実施例および実験例は、本発明を例示するためだけのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例および実験例により限定されるものではない。
製造例１：（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩の製造
工程１．（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロ－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（２－イソブチルアミド－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）ホスファートの製造
Ｎ－（９－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－２－イル）イソブチルアミド（４ｇ、１０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶かした。０～５℃まで冷却した後、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（８．９１ｇ、１０．１７ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（２．８５ｇ、４０．７ｍｍｏｌ）を順次入れた。１０分後、常温までゆっくりと昇温させ、１時間攪拌した。反応液を０～５℃まで冷却した後、Ｉ２（０．１Ｍ）（７．７４ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）ｉｎ ＴＨＦ／蒸留水／ピリジン（６６：３３：１）（１０１．６ｍＬ）を入れた。常温までゆっくりと昇温させ、１時間攪拌した。反応終了後、ＤＣＭで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム五水和物の溶液を入れ、有機層と水層を分離した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水させ、減圧濃縮した。
濃縮残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶かした。０～５℃まで冷却した後、ＴＦＡ １０．１７ｍＬをＤＣＭ ８１７ｍＬに希釈してゆっくりと入れ、１０分間攪拌した。反応液を常温までゆっくりと昇温させ、１０分間攪拌した。反応液を０～５℃まで冷却した後、飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ）溶液をゆっくりと入れながらｐＨを８～９の間に合わせた。有機層と水層を分離し、有機層を硫酸ナトリウムで水分を除去し、濾過した。減圧濃縮後、カラムクロマトグラフィーにより分離し、黄色の固形物として標題化合物（５．６２ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ ８８２．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
工程２．（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（２－イソブチルアミド－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）ホスファートの製造
前記工程１にて得られた（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロ－２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（２－イソブチルアミド－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）ホスファート（５．６ｇ、６．３５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２１．２ｍＬ）に溶かした。０～５℃まで冷却した後、ビス（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（３．３２ｍＬ、１２．７０ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（０．８９０ｇ、１２．７０ｍｍｏｌ）を順次入れた。１０分後、常温までゆっくりと昇温させ、１時間攪拌した。反応液を０～５℃まで冷却した後、Ｉ２（０．１Ｍ）（４．８４ｇ、１９．０５ｍｍｏｌ）ｉｎ ＴＨＦ／蒸留水／ピリジン（６６：３３：１）（６３．６ｍＬ）を入れた。常温までゆっくりと昇温させ、１時間攪拌した。反応終了後、ＤＣＭで希釈し、１０％のチオ硫酸ナトリウム五水和物の溶液を入れ、有機層と水層を分離した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水させ、減圧濃縮後、カラムクロマトグラフィーにより分離し、黄色の固形物として標題化合物（５．７８ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １０８６．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
工程３．（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩の製造
前記工程２にて得られた（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（２－イソブチルアミド－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）ホスファート（２．８９ｇ、２．７１ｍｍｏｌ）を１Ｍ ＨＣｌ水溶液（１６２ｍＬ、１６２ｍｍｏｌ）に溶かし、常温で１６時間攪拌した。反応液を０～５℃まで冷却した後、アンモニア水（４２．２ｍＬ、１０８３ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。常温までゆっくりと昇温させた後、５０～５５℃で２３時間加熱した。反応液をＤＣＭ（１５０ｍＬで２回）で洗浄し、水層をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｒｅｓｉｎで精製し、白色の固形物として標題化合物（１．９８ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ,ｍ／ｚ）＝ ６９５．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
製造例２：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ホスホリル）オキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．ナトリウム塩の製造
工程１．２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．トリエチルアミン塩の製造
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）二りん酸塩三水素メチル．２トリエチルアミン塩（５ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）を精製水（１５５ｍＬ）に溶かし、酢酸で溶液のｐＨを４．５に調節した。硫酸ジメチル（５．１８ｍＬ、５４．２ｍｍｏｌ）を１分間ゆっくりと添加した後、常温で１時間攪拌した。このとき、溶液のｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて４～４．５に調節した。反応終了後、ＤＣＭ（２００ｍＬ×３回）で洗浄し、水層を１Ｍ ＴＥＡＢを用いてｐＨ５．５～６に調節した。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｒｅｓｉｎで精製し、白色の固形物として標題化合物（３．０３ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ ４５６．０（Ｍ－Ｈ＋）。
工程２．２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ホスホリル）オキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．ナトリウム塩の製造
前記工程１にて得られた２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．トリエチルアミン塩（３．０３ｇ、５．４２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（３．６９ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３８．７ｍＬ）に溶かした。２，２’－ジチオジピリジン（５．９７ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）を添加し、常温で１０時間攪拌した。反応終了後、反応液を－１０～－２０℃まで冷却し、アセトン中の０．１Ｍナトリウムパーコレート（１０８ｍＬ、１０．８３ｍｍｏｌ）を滴下した。生成された個体を濾過した後、乾燥し、白色の固形物として標題化合物（２．３３ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ ５０７．０（Ｍ－Ｈ＋）。
製造例３：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３－ヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（（ヒドロキシ（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ホスホリル）オキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．ナトリウム塩の製造
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－(２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシ－３－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）二りん酸塩三水素メチル．２トリエチルアミン塩（１９０ｍｇ、０．３３１ｍｍｏｌ）を用いて、前記製造例２と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（１５９ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ ５２２．０（Ｍ＋Ｈ＋）。
実施例１：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド１）の製造
製造例１にて得られた化合物（２０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（２３．１８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．２９ｍＬ）に溶かし、ＭｇＣｌ２（３．８４ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を添加した後、常温で７時間攪拌した。反応終了後、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｑ）１．４４ｍＬに希釈した。完全に溶解されたことを確認した後、精製水１４４ｍＬに希釈し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ｒｅｓｉｎで精製し、白色の固形物として標題化合物（２２．４ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１３２．６（Ｍ－Ｈ＋）。
実施例２：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（２－メトキシエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド２）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－（２－メトキシエトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（９２ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（９１．３ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（７３ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１８７．７（Ｍ－３Ｈ＋）
実施例３：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－６－メチル－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド３）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｓ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－６－メチル－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（３０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（３５ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（６ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１５６．１（Ｍ－Ｈ＋）
実施例４：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド４）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（１７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（２４．４３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（３．８ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４５．８（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例５：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド５）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）－７－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－３－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，５－ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン－１－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（５０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（１１２．０ｍｇ、０．２２１ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（８ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４３．０（Ｍ－Ｈ＋）
実施例６：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド６）の製造
製造例１にて得られた化合物（３０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）と製造例３にて得られた化合物（３２．７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（９ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４９．１（Ｍ＋Ｈ＋）
実施例７：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド７）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（２０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）と製造例３にて得られた化合物（３１．３ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（１６ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４７．１（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例８：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド８）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－７－オキソ－６，７－ジヒドロ－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（２０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（３０．５ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（１４．５ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１３３．１（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例９：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド９）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（５０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（６１．８ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（３４．６ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １０９２．８（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例１０：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－ヒドロキシ－４－メトキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド１０）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（２０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）と製造例３にて得られた化合物（２１．４７ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（１５．２ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１６５．０（Ｍ＋Ｈ＋）
実施例１１：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）(ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド１１）の製造
製造例１と同様の方法で合成して得られた（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）りん酸二水素メチル．２トリエチルアミン塩（５０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）と製造例２にて得られた化合物（５２．３ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（２６．３ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １１４７．９（Ｍ－２Ｈ＋）
実施例１２：２－アミノ－９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．３トリエチルアミン塩（オリゴヌクレオチド１２）の製造
製造例１にて得られた化合物（４０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）と製造例２と同様の方法で得られた２－アミノ９－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（（ヒドロキシ（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ホスホリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７－メチル－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－７－イウム．ナトリウム塩（４２．６ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を実施例１と同様の方法で反応させ、白色の固形物として標題化合物（６．５ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝ １０５２．１（Ｍ－２Ｈ＋）
実験例１：ＧＦＰ ＤＮＡ鋳型の製造
ｍＲＮＡ合成のためのＤＮＡ鋳型を得るため、バイオニクス（株）からＴ７ ＲＮＡプロモーター、５’ＵＴＲ、ＥＧＦＰ、３’ＵＴＲ、ｐｏｌｙ Ａ配列を有するプラスミド遺伝子の合成を行った。次いで、キャップ物質に応じてプロモーター配列を変更するために、プラスミド遺伝子とｐｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ｐｒｅｍｉｘ（タカラカタログ＃Ｒ０４０Ａ）、２μｍｏｌのフォワードプライマー（配列番号１）、２μｍｏｌのリバースプライマー（配列番号２）を混合し、ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）を行った後、従来のプラスミド遺伝子にＸｂａＩ（タカラカタログ＃１０９３Ａ）、ＢａｍＨＩ（タカラカタログ＃１０１０Ａ）制限酵素を用いたクローニングを通じてプラスミド遺伝子を作製した。作製したプラスミド遺伝子をＳａｍＩ（タカラカタログ＃１０８５Ａ）制限酵素で線形化した後、ＡｃｃｕＰｒｅｐ ＰＣＲ精製キット（バイオニアカタログ＃Ｋ－３０３７）を用いて、ＧＦＰ ＤＮＡ転写鋳型（配列番号３）を確保した。
実験例２：ＧＦＰ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ転写
２－１：キャップを有さない（Ｎｏｎ ｃａｐ）ＧＦＰ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ転写
５’末端にキャップ（ｃａｐ）構造を有さないｍＲＮＡ合成反応のため、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２５ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＵＴＰ、２ｍＭのＣＴＰ、２ｍＭのＧＴＰ、５％のＤＭＳＯ（シグマアルドリッチカタログ＃４７２３０１－５００ＭＬ）、５ｍｇ／ｍＬのＧＦＰ ＤＮＡ転写鋳型、８００Ｕ／ｍＬ組み換えＲＮａｓｅ阻害タンパク質（タカラカタログ＃２３１６Ａ）、２Ｕ／ｍＬ 酵母無機ピロホスファターゼ（サーモサイエンティフィックカタログ＃ＥＦ０２２１）、２５００Ｕ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（バイオダインカタログ＃ｄｙ１６７０）を混合した。
転写反応混合物を３７℃で５時間インキュベーションした。反応物に４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのＤＴＴおよび５０００Ｕ／ｍＬの組み換えＤＮＡｓｅ Ｉ（タカラカタログ＃２２７０Ａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。生成されたｍＲＮＡをメーカーの取扱説明書に従って、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＲＮＡｃｌｅａｎ ＆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５キット（カタログ＃１０１７）を用いて精製した。
ｍＲＮＡの合成可否は、Ｌｏｎｚａ ＧｅｌＳｔａｒＴＭ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ＃５０５３５）を添加した１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行って確認した（図１）。合成されたｍＲＮＡのＵＶ解析は、サーモサイエンティフィックＮａｎｏｄｒｏｐ ｏｎｅ ＵＶ－ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。その結果、約１０６６ ｎｔのｐｏｌｙ Ａ（１２０）を含むＧＦＰ ｍＲＮＡが生成されることを確認した。
２－２：ＡＲＣＡキャップ類似体の共転写キャッピングを通じたＧＦＰ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ転写
ＡＲＣＡキャップを用いたｍＲＮＡ合成反応のため、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２５ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＵＴＰ、２ｍＭのＣＴＰ、０．４ｍＭのＧＴＰ、１．６ｍＭのＡＲＣＡ（トリリンク、カタログ＃Ｎ－７００３）、５％のＤＭＳＯ（シグマアルドリッチカタログ＃４７２３０１－５００ＭＬ）、５ｍｇ／ｍＬのＧＦＰ ＤＮＡ転写鋳型、８００Ｕ／ｍＬの組み換えＲＮａｓｅ阻害タンパク質（タカラカタログ＃２３１６Ａ）、２Ｕ／ｍＬの酵母無機ピロホスファターゼ（サーモサイエンティフィックカタログ＃ＥＦ０２２１）、２５００Ｕ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（バイオダインカタログ＃ｄｙ１６７０）を混合した。
転写反応混合物を３７℃で５時間インキュベーションした。反応物に４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのＤＴＴおよび５０００Ｕ／ｍＬの組み換えＤＮＡｓｅ Ｉ（タカラカタログ＃２２７０Ａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。生成されたｍＲＮＡをメーカーの取扱説明書に従って、Ｚｙｍｏ ＲｅｓｅａｒｃｈＲＮＡｃｌｅａｎ ＆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５キット（カタログ＃１０１７）を用いて精製した。
ｍＲＮＡの合成可否は、Ｌｏｎｚａ ＧｅｌＳｔａｒＴＭ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ＃５０５３５）を添加した１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行って確認した（図１）。合成されたｍＲＮＡのＵＶ解析は、サーモサイエンティフィックＮａｎｏｄｒｏｐ ｏｎｅ ＵＶ－ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。その結果、約１０６７ ｎｔのｐｏｌｙ Ａ（１２０）を含む二量体ＡＲＣＡ ｃａｐｐｉｎｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡが生成されることを確認した。
２－３：実施例の共転写キャッピングを通じたＧＦＰ ｍＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ転写
本発明の実施例化合物を用いたｍＲＮＡ合成反応のため、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２５ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのスペルミジン、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＵＴＰ、２ｍＭのＣＴＰ、２ｍＭのＧＴＰ、３．２ｍＭの実施例化合物、５％のＤＭＳＯ（シグマアルドリッチカタログ＃４７２３０１－５００ＭＬ）、５ｍｇ／ｍＬのＧＦＰ ＤＮＡ転写鋳型、８００Ｕ／ｍＬの組み換えＲＮａｓｅ阻害タンパク質（タカラカタログ＃２３１６Ａ）、２Ｕ／ｍＬの酵母無機ピロホスファターゼ（サーモサイエンティフィックカタログ＃ＥＦ０２２１）、２５００Ｕ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（バイオダインカタログ＃ｄｙ１６７０）を混合した。
転写反応混合物を３７℃で５時間インキュベーションした。反応物に４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのＤＴＴおよび５０００Ｕ／ｍＬの組み換えＤＮＡｓｅ Ｉ（タカラカタログ＃２２７０Ａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。生成されたｍＲＮＡをメーカーの取扱説明書に従って、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＲＮＡｃｌｅａｎ ＆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５キット（カタログ＃１０１７）を用いて精製した。
ｍＲＮＡの合成可否は、Ｌｏｎｚａ ＧｅｌＳｔａｒＴＭ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ＃５０５３５）を添加した１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行って確認した（図１）。合成されたｍＲＮＡのＵＶ解析は、サーモサイエンティフィックＮａｎｏｄｒｏｐ ｏｎｅ ＵＶ－ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。その結果、約１０６７ ｎｔのｐｏｌｙ Ａ（１２０）を含む実施例ｃａｐｐｉｎｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡが生成されることを確認した。
実験例３：Ｈｅｌａ細胞におけるｍＲＮＡの翻訳
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成されたｍＲＮＡの翻訳活性をヒト子宮頸癌細胞株（Ｈｅｌａ；Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）で評価した。Ｈｅｌａ細胞を５％の二酸化炭素の雰囲気下で３７℃で１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭ中で培養した。１×１０６個／ウェルのＨｅｌａ細胞を６－ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞をトランスフェクション試薬（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；インビトロジェンカタログ＃ＬＭＲＮＡ００３）を用いてトランスフェクションさせた：トランスフェクション試薬メーカーの取扱説明書に従って、チューブＡに複合培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１２５μＬにトランスフェクション試薬７．５μＬを希釈し、室温で１０分間インキュベーションさせ、チューブＢには、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １２５μＬに製造されたｍＲＮＡ ５μｇを希釈し、準備した。チューブＡとチューブＢの溶液を混合した後、室温で５分間インキュベーションさせた。インキュベーション時間の間、細胞培養液は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに交換した。その後、インキュベーションされた混合溶液を用いて細胞をトランスフェクションさせた。５％の二酸化炭素の雰囲気下で３７℃で３～４時間インキュベーション後に細胞培養液は、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＤＭＥＭに交換した。トランスフェクション９６時間後に蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を確認した。
その結果、実施例化合物を用いて製造されたｍＲＮＡは、優れた蛍光活性を示した。その反面、対照群であるｃａｐを有さないｍＲＮＡは、蛍光活性が全く見られなかった。また、ＡＲＣＡキャップを用いて合成したｍＲＮＡと対比したとき、実施例化合物を用いて製造されたｍＲＮＡは、いずれも優れたタンパク質の発現率を示した（図２）。
実験例４：ウェスタンブロットの解析
トランスフェクションの実験後、培養液を除去し、ＰＢＳを用いて１回洗浄を行った。細胞溶解緩衝液（ＲＩＰＡ＋ホスファターゼ阻害剤＋ＰＭＳＦ）２００μＬを処理した後、４℃で１０分間溶解させた。細胞溶解物を回収した後、１２０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分離を行った。その後、上澄み液を回収した後、５×ＳＤＳ－サンプルローディングバッファーと混合した後、１００℃で５～１０分間沸かした。１０％のＳＤＳ ＰＡＧＥ－ゲルで１２０Ｖ、１０分、１７０Ｖ、１時間ランニングした。Ｘｃｅｌｌ ２ ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３０Ｖで１時間トランスファーした。５％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを用いて常温で１時間ブロッキングした。ラビット抗－ＧＦＰ抗体を５％のＢＳＡ－ＰＢＳＴに１：１０００で希釈した後、４℃で一晩反応させた。その後、ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。ＨＲＰ－結合されたラビット二次抗体を２．５％ＢＳＡ－ＰＢＳＴに１：１００００で希釈した後、室温で１時間処理した。次いで、ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。ＥＣＬ処理後、化学発光により確認し、β－ａｃｔｉｎ対比ＧＦＰ 発現レベルを解析した（表１）。
Figure 2023549592000032
実験例５：ＦＡＣＳ解析
トランスフェクションの実験後、培養液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。トリプシン－ＥＤＴＡ処理後、３７℃で細胞が脱落し始めるまで約２～３分間インキュベーションした。培養培地（ＨＧ ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１％のペニシリン／ストレプトマイシン）で中和した後、常温で１２００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄み液を掬い取った後、ＰＢＳ１ｍＬ分注した後、ピベッティングにより凝集した細胞を解放した。ＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ ８．０．３）でＧＦＰシグナル（ＦＩＴＣ）を測定した（ＦＳＣ、ＳＳＣ確認、表２）。
Figure 2023549592000033
以上、本発明の特定の部分を詳細に説明したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好ましい実施例及び実験例に過ぎず、これにより本発明の範囲が限定されるものでないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるものと言える。

Claims (24)

  1. 下記化学式１で表される化合物、その立体異性体、またはその塩：

    前記化学式中、
    Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、天然、非天然または修飾ヌクレオシド塩基であり；
    Ｘ１は、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
    Ｘ２は、－ＨまたはＸ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
    Ｙ１は、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－ＣＨ２Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
    Ｙ２は、－ＨまたはＹ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
    Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立して、－ＯＨ、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、－ＣＨ２Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
    Ｚ３は、－ＨまたはＺ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものであり｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）、－ＯＨ、または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
    ｎは、０～３の整数であり；
    ｍは、１～１０の整数であり｛ここで、ｍが２以上である場合、それぞれのＢ２、Ｚ１およびＺ２は、互いに異なっていてもよい｝；
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、－Ｈまたは－（Ｃ１－４アルキル）であり；
    Ｒ３は、－（Ｃ１－４アルキル）である。
  2. 前記非天然または修飾ヌクレオシド塩基は、前記天然ヌクレオシド塩基の異性体であるまたは前記天然ヌクレオシド塩基の一つ以上の－Ｈが－（Ｃ１－４アルキル）、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）または－ハロで置換され、一つ以上の＝ＣＨ－が＝Ｎ－で置換され、および一つ以上の＝Ｏが＝Ｓで置換されてなる群から選択された１つ以上で置換されたものである；
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  3. Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、

    である；
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  4. Ｘ１は、－ＯＨであり；
    Ｘ２は、－Ｈである；
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  5. Ｙ１は、－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）または－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）Ｏ（Ｃ１－４アルキル）、または－ハロであり；
    Ｙ２は、－ＨまたはＹ１と結合し、ＬＮＡ環を形成するものである｛ここで、前記ＬＮＡ環の一つ以上のＨは、－（Ｃ１－４アルキル）で置換されていてもよい｝；
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  6. Ｚ１は、－ＯＨまたは－Ｏ（Ｃ１－４アルキル）であり；
    Ｚ２は、－ＯＨであり；
    Ｚ３は、－Ｈである；
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  7. ｎは、０または１である；
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  8. ｍは、１である；
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  9. Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、－Ｈであり；
    Ｒ３は、－（Ｃ１－４アルキル）である；
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  10. 下記化合物から構成された群から選択された、請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩：
    Figure 2023549592000016
    Figure 2023549592000017

    Figure 2023549592000018

    Figure 2023549592000019
  11. 前記化合物、その立体異性体、またはその塩は、ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーである、
    請求項１に記載の化合物、その立体異性体、またはその塩。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーを含むＲＮＡ分子。
  13. ＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーは、ＲＮＡ分子の５’上端に付着されたものである、請求項１２に記載のＲＮＡ分子。
  14. ＲＮＡ分子は、１個以上のコーティング配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＣＤＳ）を含むｍＲＮＡである、請求項１２に記載のＲＮＡ分子。
  15. （Ｓ－１）ＤＮＡ鋳型、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＲＮＡキャッピング用オリゴヌクレオチドプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを混合する工程；および
    （Ｓ－２）前記混合物をインキュベーションし、前記ポリヌクレオチド鋳型の転写を行う工程；
    を含む請求項１２に記載のＲＮＡ分子の合成方法。
  16. ＲＮＡ分子の合成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるものである、請求項１５に記載の合成方法。
  17. 請求項１２に記載のＲＮＡ分子から翻訳されたペプチド。
  18. 請求項１２に記載のＲＮＡ分子が導入された細胞。
  19. 請求項１８に記載の細胞から産生されたペプチド。
  20. 請求項１２に記載のＲＮＡ分子を含む核酸治療薬。
  21. ＲＮＡ分子を標的細胞に導入することができる伝達体を含む、請求項２０に記載の核酸治療薬。
  22. 請求項１２に記載のＲＮＡ分子を含むワクチン。
  23. ＲＮＡ分子を標的細胞に導入することができる伝達体を含む、請求項２２に記載のワクチン。
  24. 癌または感染症の疾患を予防するための、請求項２２に記載のワクチン。
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