KR20240019216A - 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제를 포함하는 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 효과를 갖는 서열번호 1을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 또는 피부 외용제에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 8월 13일에 출원된 미국 가특허출원 일련번호 63/232,766의 혜택과 우선권을 주장하며, 그 전체가 여기에 참조로 포함된다.
본 발명은 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 효과를 갖는 서열번호 1을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 또는 피부 외용제에 관한 것이다.
피부는 신체 외부를 덮고 있는 하나의 막으로, 피부의 가장 중요한 역할은 외부의 세균 침입과 손상으로부터 피부를 보호하는 방어장벽(defense barrier)의 역할을 함과 동시에 내부로부터의 열과 수분 손실을 방지하는 것이다. 인간의 피부는 끊임없이 변화를 겪게 되며, 그 중 가장 대표적인 것이 노화에 의한 피부의 기능 저하 및 시각적인 아름다움의 감소이다. 피부의 노화는 크게 유전적 요소에 따른 내적 노화와 태양광선 등의 외부 환경적 요소에 따른 외적 노화로 구분된다. 이러한 외적 노화는 피부의 주름을 형성시키며, 대표적인 주름 형성의 인자로서 활성 산소, 자외선 및 콜라겐의 생합성 감소 등을 들 수 있다(Danielle, H. W., Ann Intern Med., 75(6), 873-880, 1971; Grove, G. L. et al., J Am Acad Dermatol., 21(3 Pt 2), 631-637, 1989). 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 피부 내 콜라겐의 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면 진피 매트릭스의 성분이 증가 되어 주름개선, 탄력증진, 피부강화 등의 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다. 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 종래에 사용한 물질로는, 레티노이드(retinoid), TGF-βgrowth factor), 베툴린산(betulic acid), 클로렐라 추출물 등이 알려졌으나, 레티노인산의 경우 불안정하고 피부적용시 자극 등에 의한 안정성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성 촉진으로 인한 피부 기능 개선효과를 기대할 수 없다. 최근 새롭게 등장한 주름치료 방법으로서 초음파 치료 및 피부 스케일링, 레이저 박피술, 보툴리눔 톡신 주사, 레스틸렌 주사 등이 있으나, 시술 비용 및 지속성 면에서 큰 효과를 발휘하지 못하고 있는 실정이다. 따라서 생체에서 콜라겐 합성 촉진 효과가 매우 우수한 촉진제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 위와 같은 배경 하에서 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 세포 투과성 핵 유입 억제제(CP-NI, cSN50.1 펩티드)에 TSDT(therapeuticmolecule systemic delivery technology)를 기반으로 하는 aMTD(advanced macromolecule transduction domain)을 도입하여 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 제조하였으며, 상기 iCP-NI 펩티드가 생체 적합성이 우수할 뿐만 아니라, 콜라겐 생성량 증가 효과, ROS 생성 억제 효과, 주름 개선 효과, 피부 수분함량 개선 효과, 표피 탄력 개선 효과 및 피부 치밀도 개선 효과를 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 노화는 UV 노출에 의한 광노화일 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 iCP-NI 펩티드는 화장료 조성물 내 0.001 내지 20 mM의 농도로 함유될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 군으로부터 하나 또는 그 이상 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주용 개선용 피부 외용제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 피부 외용제에 있어서, 상기 외용제의 제형은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 하나 또는 그 이상 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제에 있어서, 상기 피부 노화는 UV 노출에 의한 광노화일 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 개체에게 도포하는 단계를 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타내므로 화장료 조성물 또는 피부 외용제로 유효하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 생체적합성에 대한 in-vitro 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 콜라겐 생성에 대한 in-vitro 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 UVB 자극 후 콜라겐 생성에 대한 in-vitro 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 세포내 활성산소(ROS) 억제 정량 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 세포내 활성산소(ROS) 억제 이미지 측정 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 콜라겐 생성에 대한 in-vitro 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 UVB 자극 후 콜라겐 생성에 대한 in-vitro 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 세포내 활성산소(ROS) 억제 정량 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드의 세포내 활성산소(ROS) 억제 이미지 측정 결과를 나타낸다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 구체적인 실시예에 따른 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 포함하는 화장료 조성물을 자세히 설명한다. 다만, 이는 예시를 위한 실시예에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 범위 내에서 다양한 실시예에 대한 변형이 가능함은 당업자에게 자명하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포함하다(include)" 또는 "포함하다(comprise)" 는 본 명세서 전체에 걸쳐 달리 언급되지 않는 한 특별한 제한 없이 특정한 구성(또는 요소)를 포함하는 것을 의미하며, 다른 구성(또는 요소)의 추가를 배제하는 것으로 해석될 수 없다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미에서, 자연 발생한 L α-아미노산 또는 이의 잔기 뿐만 아니라 D-아미노산 및 화학적으로 변형된 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 아미노산은 전술한 아미노산의 모방체 및 유사체를 포함할 수 있다. 본 개시에서, 모방체 및 유사체는 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피부"는 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직 뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “피부 노화”는 피부의 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상이 나타나는 것으로, 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다. 상기 피부 노화는 광노화인 것일 수 있다. 상기 광노화는 태양광선의 자외선에 반복적이거나 장기간 노출 시 피부의 탄력 및 수분이 감소되고 주름이 형성되는 등 피부손상이 일어나는 현상을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피부 주름"은 피부상에 형성된 피부주름을 제한없이 나타내는 것으로서, 이는 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 피부주름, 예를 들어 자외선 자극 등에 의한 피부 광노화에 수반되는 피부주름을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개선" 또는 "치료"는 개체에서 피부염 질환의 (a) 발전의 억제 (b) 경감 및 (c) 제거를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "도포"는 어떠한 적절한 방법으로 개체의 피부에 본 발명에 따른 조성물을 접촉시키는 모든 방법을 의미하며, 이를 통해 해당 조성물을 피부 내부로 흡수시키는 것을 목적으로 한다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 피부 노화 방지는 광노화 또는 자연노화에 의한 피부노화 억제 작용을 의미하나, 상기 피부노화는 특히 UV 노출에 의한 광노화인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 피부주름은 광노화 또는 자연노화에 의한 것일 수 있고, 광노화에 의한 것이 보다 바람직하며, UV 노출에 의한 광노화인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드는 화장료 조성물 내 0.01 내지 10000 ppm의 농도로 함유되는 것이 바람직하고, 0.01 내지 1000 ppm의 농도로 함유되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 펩티드의 농도가 0.01 ppm 미만이면 원하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 효과를 얻기 어렵고10000 ppm을 초과하면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않아서 생산 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.
본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드는 일반적인 화학합성, 예를 들어 고체상 펩티드 합성기술(solid-phase peptide synthesis)에 의해 제조될 수 있고, 상기 펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 상기 펩티드를 발현시킨 다음, 통상의 방법으로 정제하여 제조할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 펩티드 외에 본 발명이 목적으로 하는 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 상기 펩티드의 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 효과가 알려져 있는 임의의 다른 물질들 뿐만 아니라, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않고, 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 다른 한편으로, 두피 트리트먼트제, 비누, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어팩, 헤어젤, 로션, 컨디셔너, 헤어오일, 무스, 크림, 고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀, 연고제, 화장수, 에센스, 패취 또는 분무제의 제형으로 제조될 수도 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으며, 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 iCP-NI 펩티드는 생체 적합성이 뛰어나며, ROS 생성 및 주름을 감소시키고, 콜라겐 생성, 피부 수분 함량, 표피 탄력 및 피부 치밀도 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 iCP-NI 펩티드는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선을 위한 화장료 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
제2구현예에 따르면,
본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 피부, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 투여가 포함되고, 경구 또는 비경구 투여가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 비경구 투여는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 병소내 주사 또는 주입기술을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제형화할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합 및 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물이 상기 iCP-NI 펩티드를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 상기 iCP-NI 펩티드를 약 0.01 내지 1,500 ㎎의 단위용량으로 함유되는 것이 바람직하고, 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1 내지 500 ㎎ 범위가 보통이나 이에 한정되지 않는다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일 회 투여량으로는 하루에 보통 약 5 내지 300 ㎎의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
제3구현예에 따르면,
본 발명은 화장품학적 또는 약제학적으로 유효한 양의 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 화장품학적 또는 약제학적으로 유효한 양이란 0.000001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 제한되는 것은 아니다. 처리 또는 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 조절될 수 있다. 처리 또는 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 실시할 수도 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 인간 또는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 인간일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 처리 또는 투여 방법은 도포, 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막 주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(iCP-NI)의 제조
본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 iCP-NI 펩티드는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 aMTD(advanced macromolecule transduction domain) 및 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 NF-κ핵 위치 서열(NLS)을 이용하여 제조하였다(표 1).
| 명칭 | 서열 | SEQ No. |
| iCP-NI | IAAVLAAPALVPCVQRKRQKLMPC | 서열번호 1 |
| aMTD | IAAVLAAPALVP | 서열번호 2 |
| NLS | CVQRKRQKLMPC | 서열번호 3 |
2. iCP-NI 펩티드의 생체적합성에 대한 in-vitro 효능 평가
NHDF 세포를 24-well plate에 2.0×104cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양한 뒤, iCP-NI 펩티드 시료(최종농도가 1, 5, 10, 30 및 50 μM이 되도록 배지로 희석됨)가 포함된 serum-free FBM로 교환한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 EZ-Cytox을 한 well당 50 μl씩 첨가하고 1시간 동안 더 배양하였다. 배양한 배지를 96well plate에 옮겨 담고 VERSA max microplate reader (Molecular devices, LCC., USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 생존율을 조사하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드는 1 ~ 50 μM 농도 범위에서 대조군 대비 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다(도 1).
3. iCP-NI 펩티드의 콜라겐 생성에 대한 in-vitro 효능 평가
(1) 콜라겐 생성량 평가
NHDF 세포를 24-well plate에 2.0×104cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양한 뒤, 각 농도별로 희석한 시료가 포함된 serum-free FBM로 교환한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 상층액을 취하여 배지 중 유리된 procollagen의 양을 Procollagen Type I C-peptide(PIP) EIA Kit를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 L-ascorbic acid(0.001 %)를 이용하여 비교하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드는 1 ~ 50 μM 농도 범위에서 대조군 대비 약 130 ~ 150% 세포내 콜라겐(PIP) 생성량을 농도의존적으로 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었다(도 2).
(2) UVB 자극 후 Collagen 생성량 정량
NHDF 세포를 24-well plate에 3.0×104cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양한 뒤, 배지를 버리고 인산완충생리식염수(PBS, phosphate buffered saline)로 세척한 다음 인산완충생리식염수 500 μl를 넣어주어 자외선(UVB) 40mJ을 조사한 다음 인산완충생리식염수를 제거한다. 이후 각 농도별로 희석한 시료가 포함된 serum-free FBM로 교환한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 상층액을 취하여 배지 중 유리된 procollagen의 양을 Procollagen Type I C-peptide(PIP) EIA Kit를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 L-ascorbic acid(0.001 %)를 이용하여 비교하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드는 UVB에 의하여 감소된 세포 내 콜라겐(PIP) 생성량을 약 110 ~ 175%까지 농도의존적으로 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었다(도 3)
4. iCP-NI 펩티드의 ROS 생성 억제에 대한 in-vitro 효능 평가
(1) iCP-NI 세포내 활성산소(ROS) 정량 분석
세포내 활성산소(ROS) 변화를 측정하기 위하여 DCF-DA assay를 이용하였다. HaCaT 세포를 24-well plate에 1.0×105cells/well로 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 시료를 농도 1, 5, 10 uM별로 24시간 전처리하고, PBS 세척 후 H2O2 150 uM의 농도로 30분 후 처리하여 추가 배양하였다. 세포내 ROS를 측정하기 위한 dye인 DCF-DA (dichlorofluorescein diacetate)를 20uM 첨가하여 30분동안 배양 후 OxiselectTM Intracellular ROS assay Kit(CELL BIOLABS, INC.)를 사용하여 세포내 ROS 생성 억제량을 Spectra Max i3X(480nm/530nm)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드는 H2O2에 의해 중가한 ROS를 약 10 ~ 20%까지 유의하게 억제하는 것으로 확인되었다(도 4).
(2) 세포내 활성산소(ROS) 이미지 측정
세포내 활성산소(ROS) 변화를 측정하기 위하여 DCF-DA assay를 이용하였다. HaCaT 세포를 24-well plate에 1.0×105cells/well로 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 시료를 농도 1, 5, 10 uM별로 24시간 전처리하고, PBS 세척 후 H2O2 150 uM의 농도로 30분 처리하여 추가 배양하였다. 세포내 ROS를 측정하기 위한 dye인 DCF-DA (dichlorofluorescein diacetate)를 50uM 첨가하여 30분동안 배양 후 PBS 세척 후 EVOS™FL Imaging System을 이용하여 형광 발현정도를 측정 및 이미지를 나타내었다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드는 농도 의존적으로 ROS의 생성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 6).
<제조예>
1. iCP-NI 펩티드를 포함하는 화장료 조성물의 제조
본 발명의 iCP-NI 펩티드를 유효성분으로 함유하는 크림을 하기 표 2와 같이 제조하였다(함량: 중량부).
| 구분 | 성분명 | 제형예 | 비교예 |
| 수상 | WATER | To. 100 | To. 100 |
| GLYCERIN | 5 | 5 | |
| 1,3-BUTYLENE GLYCOL | 8 | 8 | |
| 1,2-Hexanediol | 2 | 2 | |
| EDTA-2Na | 0.02 | 0.02 | |
| AMMONIUM ACRYLOYLDIMETHYLTAURATE/VP COPOLYMER | 0.5 | 0.5 | |
| 유상 | CETEARYL ALCOHOL | 2.0 | 2.0 |
| PEG-100 STEARATE | 1.5 | 1.5 | |
| GLYCERYL STEARATE | 0.7 | 0.7 | |
| BEESWAX | 1 | 1 | |
| CETYLETHYLHEXANOATE | 5 | 5 | |
| SQUALANE | 3 | 3 | |
| C14-22 ALCOHOL | 2.0 | 2.0 | |
| POLYSORBATE 20 | 0.5 | 0.5 | |
| SOLBITAN ISOSTEARATE | 1.2 | 1.2 | |
| C12-20 ALKYLGLUCOSIDE | 0.5 | 0.5 | |
| CYCLOMETHICONE | 2 | 2 | |
| DIMETHICONE | 1 | 1 | |
| DIMETHICONOL | 0.5 | 0.5 | |
| iCP-NI 상 | WATER | 1 | - |
| iCP-NI | 0.01 | - | |
| 첨가제상 | FRAGRANCE | 적량 | 적량 |
2. 본 발명에 따른 iCP-NI의 항노화 효능 평가
시험 대상자 20명을 대상으로 인체적용시험을 진행하였다. 얼굴 볼 부위를 세안 후 항온항습(22±2°C, 50±5%) 조건에서 30분 이상 대기하여 충분히 피부 안정을 취한 다음 시험에 참여하였다. 시험제품 사용 전 후에 따른 주름 개선 효과, 피부 수분함량 개선 효과, 표피 탄력 개선 효과 및 피부 치밀도 개선 효과를 하기의 방법에 따라 평가하였다.
(1) Antera 3D를 이용한 주름 개선 효과 평가
시험 전, 시험 2주 후 및 시험 4주 후에 Antera 3D를 이용하여 눈가 주름 지수 (Indentation index, Wrinkles: small, A.U.)를 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드를 포함하는 화장료 조성물은 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 눈가 주름 지수를 감소시키는 것으로 확인되었다.
| 구분 | 평균 ± 표준편차 | 개선율 | p-value | |
| 시험 부위 | 시험전 | 12.12 ± 1.61 a | - | <0.0011) |
| 시험 2주 후 | 11.69 ± 2.04 a | 3.80% | ||
| 시험 4주 후 | 11.11 ± 1.89 b | 8.65% | ||
ab : 그룹 내에서 문자를 공유하지 않는 평균들은 통계적으로 유의한(p<0.05) 차이를 가짐. by LSD test1) by Repeated measures ANOVA. 측정 시점을 요인으로 분석
(2) Corneometer®를 이용한 피부 수분함량 개선 효과 평가
시험 전, 시험 2주 후 및 시험 4주 후에 Corneometre®를 이용하여 피부 수분함량(Corneometer value, A.U.)을 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드를 포함하는 화장료 조성물은 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부 수분 함량을 증가시키는 것으로 확인되었다.
| 구분 | 평균 ± 표준편차 | 개선율 | p-value | |
| 시험 부위 | 시험전 | 39.81 ± 9.24 a | - | <0.0011) |
| 시험 2주 후 | 44.12 ± 10.17 a | 11.08% | ||
| 시험 4주 후 | 47.31 ± 10.79 b | 19.55% | ||
(3) Cutometer®를 이용한 표피 탄력 개선 효과 평가
시험 전, 시험 2주 후 및 시험 4주 후에 Cutometer®MPA 580 2mm Probe를 이용하여 표피 탄력(R7 : Ur/Uf in cutometer, 2mm)을 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드를 포함하는 화장료 조성물은 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부 탄력을 증가시키는 것으로 확인되었다.
| 구분 | 평균 ± 표준편차 | 개선율 | p-value | |
| 시험 부위 | 시험전 | 0.2968 ± 0.0571 a | - | <0.0011) |
| 시험 2주 후 | 0.3316 ± 0.0449 a | 13.52% | ||
| 시험 4주 후 | 0.3744 ± 0.0540 b | 27.76% | ||
(4) Ultrasound를 이용한 피부 치밀도 개선 효과 평가
시험 전, 시험 2주 후, 시험 4주 후에 Ultrasound를 이용하여 피부 치밀도(Dermal density, %)를 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 iCP-NI 펩티드를 포함하는 화장료 조성물은 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부 치밀도 증가시키는 것으로 확인되었다.
| 구분 | 평균 ± 표준편차 | 개선율 | p-value | |
| 시험 부위 | 시험전 | 35.00 ± 9.49 a | - | <0.0011) |
| 시험 2주 후 | 39.03 ± 10.95 a | 11.67% | ||
| 시험 4주 후 | 41.85 ± 11.79 b | 19.18% | ||
본 발명에 따른 개선된 세포투과성 핵 수송 억제제(iCP-NI) 펩티드는 생체 적합성이 뛰어나며, ROS 생성 및 주름을 감소시키고, 콜라겐 생성, 피부 수분 함량, 표피 탄력 및 피부 치밀도 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 iCP-NI 펩티드는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선을 위한 화장료 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (7)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 노화는 UV 노출에 의한 광노화인 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 iCP-NI 펩티드는 화장료 조성물 내 0.01 내지 10000 ppm의 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물 - 제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물의 제형은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 군으로부터 하나 또는 그 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물. - 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선용 피부 외용제.
- 제5항에 있어서,
상기 외용제의 제형은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 하나 또는 그 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 피부 외용제. - 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제(improved cell-permeable nuclear import inhibitor, iCP-NI) 펩티드를 개체에게 도포하는 단계를 포함하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163232766P | 2021-08-13 | 2021-08-13 | |
| US63/232,766 | 2021-08-13 | ||
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| KR1020247000048A KR20240019216A (ko) | 2021-08-13 | 2022-08-16 | 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제를 포함하는 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 |
| KR1020247000047A KR20240019215A (ko) | 2021-08-13 | 2022-08-16 | 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제를 포함하는 피부 보습 및 피부 진정용 화장료 조성물 |
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| KR1020247000047A KR20240019215A (ko) | 2021-08-13 | 2022-08-16 | 개선된 세포 투과성 핵 수송 억제제를 포함하는 피부 보습 및 피부 진정용 화장료 조성물 |
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