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KR20240009061A - 혈청 내 다중 아포지단백질의 직접정량 방법 - Google Patents

혈청 내 다중 아포지단백질의 직접정량 방법 Download PDF

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KR20240009061A
KR20240009061A KR1020220086103A KR20220086103A KR20240009061A KR 20240009061 A KR20240009061 A KR 20240009061A KR 1020220086103 A KR1020220086103 A KR 1020220086103A KR 20220086103 A KR20220086103 A KR 20220086103A KR 20240009061 A KR20240009061 A KR 20240009061A
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KR
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serum
mass spectrometry
apolipoprotein
sample
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천종기
백제현
양원석
김효진
천동희
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(재)씨젠의료재단
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Publication date
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Abstract

본 발명은 유기용매를 전처리함으로써 생물학적 시료로부터 아포지단백질을 분리 및/또는 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 반추동물의 혈청을 포함하는 단백질의 질량 분석용 기질(matrix) 및 내부표준물질(internal standard) 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 효소를 이용한 절단 없이도 다양한 단백질형(Proteoform)을 직접 정량할 수 있을 뿐 아니라, 동물의 혈청을 기질로 이용함으로써 시료 내 목적 단백질을 제거하지 않고도 간단하게 검체 시료의 기질을 유지시킬 수 있으며, 내부표준물질로써 시간과 비용이 소요되는 기존의 합성 펩타이드 또는 합성 단백질 대신 동물의 혈청 내 단백질을 활용함으로써 최소 비용으로 정량 결과의 객관성과 정확성을 담보하였다. 이에, 본 발명은 간소화된 공정을 통해 시료로부터 높은 순도로 목적 단백질을 추출하고, 시료 내 모든 단백질형의 총량에 관한 정보 뿐 아니라 다양한 당화 패턴을 가지는 각 단백질형에 대한 개별적인 정량 정보를 높은 신뢰도로 제공할 수 있는 효율적인 분석 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

혈청 내 다중 아포지단백질의 직접정량 방법{A Method for Direct Quantification of Multiple Apolipoproteins in Serum}
본 발명은 특정 농도의 유기용매를 전처리하고 기질 및 내부표준물질로서 비-인간 동물 혈청을 이용함으로써 인간 혈청 내 목적 단백질, 구체적으로 아포지단백질을 직접 정량하는 방법에 관한 것이다.
질량분석-기반의 표적화 SRM/MRM는 임상적인 바이오마커의 절대적 정량화를 위한 가장 강력한 수단 중 하나이며, 수십년간 임상적 질량분석 분야에서 널리 이용되어 왔다. 정량적 프로테오믹스를 이용하면 신규 단백질 바이오마커 후보를 발굴 및 검증할 수 있을 뿐 아니라 질환 진행의 메카니즘을 조사할 수 있다. 민감성, 선택성 및 단순한 실험과정으로 인해 전통적인 항체-기반 방법이 단백질 정량을 위해 일상적으로 사용되어 왔으나, 이는 타겟 특이적인 항체를 필요로 하고 다른 유사 단백질과 교차반응성을 보인다는 한계가 있다. 또한, 전사후 변형(PTMs)이 일어난 이들의 단백질형(proteoform)과의 서열 차이를 구분하는 것은 어려운 문제이다. 단백질형은 단일 유전자 서열로부터 합성된 폴리펩타이드 변이체이나, 다양한 생물학적인 과정(예를 들어 RNA 스플라이싱, 단일염기다형성(SNP), 돌연변이 또는 다양한 PTM)에 의해서도 만들어지므로, 일반적인 에피토프 영역을 검출하는 이러한 어세이는 기능적 또는 임상적으로 중요한 특정 단백질형의 정량에 그칠 수 있다. 바텀-업(bottom-up) 방법에 의해 고속대량 스크리닝 및 글로벌 프로테옴 분석이 가능하므로, 액상 크로마토그래피와 탠덤 질량분석(펩타이드-MRM)의 조합이 다중 타겟의 정량 또는 대량 단백질 분석에 널리 사용되고 있다. 그러나, 이러한 방법은 서열 커버 범위가 제한되고 펩타이드의 높은 복잡성으로 인해 특정 서열 및/또는 변이 정보를 포함하는 특정 펩타이드를 누락하는 단점이 있다. 아울러, 펩타이드-MRM은 다중의 기질에서 분석물을 고속 검출할 수 있음에도 효소를 이용한 단백질 분해가 필수적이고 단백질 변성, 환원 또는 알킬화와 같이 복잡한 시료 제작과정이 요구된다는 점에서 시간이 소요된다. 이에, LC-MS/MS가 면역어세이 방법을 대체하기 시작하였음에도, LC-MS/MS에서 정량 정확도를 유지하면서도 보다 신속하고 간편한 시료 제작방법에 대한 요구가 커지고 있다.
구체적으로, 생물학적 활성 또는 임상적 유용성을 판단하기 위해서는 절단(digestion) 없이 전체 단백질(예를 들어 단백질형)을 분석하는 것이 필요하다. 일반적으로, 단백질의 완전성(intactness)에 대한 분석을 통해 고유의 단백질형과 각 단백질형 내의 PTM의 위치를 동정할 수 있다. 탑-다운(Top-down) 프로테오믹스는 온전한 단백질을 단백질형 수준에서 분석하며, 이는 질량분석기에서 직접적으로 이온화되어 절편화됨으로써 다양한 단백질형의 구분 및 특성 분석이 가능하다. 단백질형 수준에서의 온전한 단백질의 정량은 4중극 질량분석기를 이용하여 꾸준히 개발되어 오고 있으나, 단백질형 수준에서의 정량은 임상분야에서 실용화하기에 어려운 난점들이 산재해있다. 단백질 침전(PPT)은 혈청 알부민 및 면역글로불린과 같은 대부분의 고분자량 단백질을 혈청으로부터 효율적으로 제거하며, 유기 용매, 염 및 금속이온은 PPT 시약으로 널리 이용된다.
한편, 아포지단백질 C-Ⅲ(APOC-Ⅲ)는 다양한 질환에 대한 혈청 마커로 적용되고 있다. 이는 아포지단백질 B-함유 지단백질 입자 및 고밀도 지단백질 입자와 관련된 저분자량 당단백질(8.8 kDa)로서, 중성지방-풍부 지단백질의 대사에 중요한 역할을 하여 질환에 대한 바이오마커로서의 가능성이 연구되어오고 있다. 당화 APOC-Ⅲ 단백질형 간의 비율 변화 또는 과-시알산화된 APOC-Ⅲ는 요독증 및 고중성지방혈증의 원인이 된다. APOC-Ⅲ의 단백질형에 대한 탑-다운 질량분석과 상대적 정량 방법에 대한 연구들이 있어왔으나, LC-MS/MS를 이용한 유효하고 효율적인 절대정량 방법은 개발되지 못하고 있다.
이에, 본 발명자들은 인간 혈청 내 단백질의 분해(digestion) 없이 APOC-Ⅲ의 각 단백질형을 정량할 수 있는 단백질-MRM 방법을 개발하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허문헌 1. 공개특허공보 제10-2021-0111243호
본 발명자들은 혈청 단백질의 생물학적 활성 및 임상적 유용성에 대한 정확한 정보를 수득하기 위해 분해(digestion) 없이 전장 단백질을 높은 신뢰도로 정량 및 동정하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 목적 단백질을 포함하는 생물학적 시료, 구체적으로는 인간 혈청에 니트릴(nitrile) 유기용매를 전처리할 경우 목적 단백질, 구체적으로는 아포지단백질을 선택적으로 액상 추출할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 생물학적 시료로부터 아포지단백질을 분리 및/또는 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 반추동물의 혈청을 포함하는, 목적 단백질의 질량 분석을 위한 기질(matrix) 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 반추동물의 혈청을 포함하는, 목적 단백질의 질량 분석을 위한 내부표준물질(internal standard, IS) 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아포지단백질(apolipoprotein)을 포함하는 생물학적 시료에 R-CN(R은 직쇄 또는 분쇄의 C1-C3 알킬)으로 표시되는 유기용매를 첨가하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 아포지단백질의 분리 방법을 제공한다.
본 발명자들은 혈청 단백질의 생물학적 활성 및 임상적 유용성에 대한 정확한 정보를 수득하기 위해 분해(digestion) 없이 전장 단백질을 높은 신뢰도로 정량 및 동정하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 목적 단백질을 포함하는 생물학적 시료, 구체적으로는 인간 혈청에 니트릴(nitrile) 유기용매를 전처리할 경우 목적 단백질, 구체적으로는 아포지단백질을 선택적으로 액상 추출할 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“단백질의 분리”는 생물학적 시료에 포함된 분석 대상 단백질을 분석 대상 이외의 다른 단백질 기타 불순물로부터 선택적으로 분리시키는 과정을 의미한다. 따라서 용어 단백질의“분리”는 단백질의“추출(extract)”,“용출(elute)”,“정제(purify)”및“증폭(enrich)”과 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어“알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 포함한다. C1-C3 알킬은 탄소수 1 내지 3의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1-C3 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 발명에서 사용되는 유기용매는 구체적으로는 프로피오니트릴(R는 C2 알킬) 또는 아세토니트릴(R는 C1 알킬)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 아세토니트릴일 수 있다.
본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 아포지단백질 또는 이를 발현하는 세포, 이들의 배양액 등을 포함할 가능성이 있는 여하한 물질로서 생체로부터 분리된 시료(혈액, 혈장, 혈청, 타액, 조직, 기관 등), 환경(예를 들어, 물, 대기, 토양 등)으로부터 채취한 물질 또는 인위적으로 혼합된 시료 등을 총칭하는 의미로 사용된다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)으로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 구체적으로는 혈청이다.
본 발명에서 용어“아포지단백질”은 지방, 콜레스테롤, 지용성 비타민 등의 지질에 결합하여 지단백질(lipoprotein)을 형성함으로써 혈액, 뇌척수액 및 림프액에서 지질을 수송하는 기능을 가지는 단백질을 총칭하는 의미이다. 아포지단백질은 동맥경화를 비롯하여 지질-관련 심뇌혈관 질환의 중요 바이오마커이자 위험인자로 알려져 있어 이의 정확한 검출은 임상적으로 중요한데, 최근에는 혼탁도측정 면역어세이(TIA)와 같은 면역학적 방법으로 주로 측정되나 이는 교차반응성, 표준화, 민감도 및 다중화와 같은 한계점을 가진다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 분리 및 분석하고자 하는 아포지단백질은 ApoA-I, ApoA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoA-Ⅴ, ApoB, ApoC-I, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoC-Ⅳ, ApoD, ApoE, ApoF, ApoL1, ApoL2, ApoL3, ApoL4, ApoL5, ApoL6, Apo(a) 및 ApoM으로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 구체적으로는, 상기 아포지단백질은 ApoL1, ApoM, ApoE, ApoA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoD 및 ApoF로 구성된 군으로부터 선택된다.
가장 구체적으로는, 상기 아포지단백질은 ApoC-Ⅲ이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 유기용매는 40 - 80 v/v%의 아세토니트릴이다. 보다 구체적으로는 50 - 70 v/v%의 아세토니트릴이며, 보다 더 구체적으로는 55 - 65 v/v%의 아세토니트릴이고, 가장 구체적으로는 약 60 v/v%의 아세토니트릴이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 아포지단백질의 분리 방법을 수행함으로써 생물학적 시료로부터 아포지단백질을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 내 아포지단백질의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 생물학적 시료, 유기 용매 및 아포지단백질에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어“검출(detection)”은 시료 내 분석 대상 물질의 존재 여부를 판정하는 과정을 의미한다. 따라서,“아포지단백질의 검출”이란 아포지단백질을 코딩하는 핵산 분자의 검출 또는 증폭; 아포지단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원결합단편을 이용한 면역학적 분석; 및 아포지단백질의 전장 단백질 또는 이의 절편 펩타이드에 상응하는 질량값을 검출하는 질량 분석 등 목적 단백질의 존재여부를 확인할 수 있는 직접적 및/또는 간접적인 정보를 수득하는 과정을 모두 포괄한다.
본 발명의 방법은 시료 내 아포지단백질을 절대 정량할 수 있을 뿐 아니라 효소의 절단 없이도 다양한 당화패턴을 가지는 각종 단백질형(Proteoform)을 직접 동정 및 정량할 수 있다. 따라서, 용어“검출”은“정량(quantification)”또는“단백질형의 동정(identification)”과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의“검출”은 전술한 본 발명의 방법에 의해 분리된 아포지단백질에 대한 질량 분석(mass spectrometry)를 통해 수행된다.
본 명세서에서 용어“질량분석(mass spectrometry, MS)”은 질량값을 통해 분석 대상 물질을 동정하는 것을 의미하며, 구체적으로는 질량 대 이온 비율(m/z)을 기반으로 분석물의 구조를 예측하는 분석 기술을 의미한다. MS 분석은 일반적으로 분석 대상물이 전하를 띄도록 하는 이온화 단계; 및 하전된 물질의 질량값을 검출하여 m/z 값을 계산하는 단계를 통해 수행된다. 구체적으로는 상기 질량분석은 예를 들어 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight), SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight), ESI-TOF(Electrospray ionisation time-of-flight), 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 또는 LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아포지단백질은 ApoC-Ⅲ이며, 상기 방법은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring; MRM)을 통해 수행된다.
선택적 반응 모니터링(selective reaction monitoring, SRM)이라고도 불리우는 MRM은 삼중 사중극자(triple quadrupole)를 이용하는 MS 방법으로, 제1 질량필터(Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달하고, 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체에 의해 절편화됨으로써 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터(Q2)로 보내진 후, 타겟 단백질의 질량값에 상응하는 특정 어미이온과 특정 딸이온을 가지는 단백질만이 분리됨으로써 선택성과 민감도가 높은 분석이 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 아포지단백질의 분해(digestion) 단계를 포함하지 않는다. 본 발명의 방법은 종래에 고속대량 스크리닝 및 글로벌 프로테옴 분석에 적용되던 바텀-업(bottom-up) 질량분석 방법에 필연적으로 포함되던 효소 등에 의한 전장 단백질의 분해 과정이 포함되지 않아 서열 커버 범위가 제한되지 않고 타겟 펩타이드의 특정 변이 정보 등이 누락됨 없이 완전한 분석이 가능하다. 이에, 본 발명은 분해 및 절단 없이 아포지단백질의 각 단백질형을 동정 및 정량할 수 있는 단백질-MRM 방법으로 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 비-인간 동물의 혈청을 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료 내 목적 단백질의 질량 분석을 위한 기질(matrix) 조성물을 제공한다.
질량 분석이 있어서 분석 시료에 대한 기질은 실제로 측정할 임상 검체를 혼합할 수도 있으나, 이 경우 측정 대상인 표적 물질이 포함되어 측정 결과가 왜곡되는 것을 막기 위해 측정 물질이 없는 기질을 사용하거나 또는 측정 물질을 인위적으로 제거하는 전처리를 거친 기질을 사용할 수 있다. 본 발명자들은 인간의 혈청 내에서 아포지단백질을 검출하고자 할 경우 질량 분석을 위한 기질로서 비-인간 동물의 혈청을 이용할 경우 타겟물질을 제거하지 않고도 손쉽게 검체의 기질을 유지시키면서 높은 검출 정확도를 유지할 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 비-인간 동물은 반추동물이다.
본 명세서에서 용어“반추동물(ruminant)”은 되새김위라고도 불리우는 반추위를 갖는 포유동물을 의미하며, 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과 및 소과의 동물을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 목적 단백질의 질량 분석은 펩타이드-MRM(multiple reaction monitoring)이며, 이 경우 상기 반추동물은 염소(goat)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 목적 단백질의 질량 분석은 단백질-MRM이며, 상기 반추동물은 소(bovine)이다.
본 발명자들은 펩타이드-MRM 방법에서는 염소의 혈청이 인간 혈청과 유사한 기질 성분을 가지면서도 특정 단백질, 구체적으로는 아포지단백질의 분자량 차이를 보여 적절한 기질 조성물로 사용될 수 있는 반면, 단백질-MRM에서는 소의 혈청이 표적 단백질을 액상 추출하는 과정에서 보다 적합한 기질로 적용될 수 있음을 발견하였다. 이에, 보정선(calibration curve) 검체 조제시 각각 이들 동물의 혈청을 기질로 유지함으로써 직선성(linearity)를 유지할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 비-인간 동물의 혈청 내 단백질을 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료 내 목적 단백질의 질량 분석을 위한 내부표준물질(internal standard, IS) 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어“내부표준물질”분석대상 시료에 일정한 농도로 첨가되어 분석물(analyte)에 대한 신호와 내부 신호 간의 비율을 통해 분석 기기의 오차를 보정(calibration)하기 위한 화합물을 의미하며, 주로 시료의 제작 또는 주입 단계에서 분석물의 소실을 교정하기 위해 사용된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 비-인간 동물은 반추동물이며, 보다 구체적으로는 염소(goat) 또는 소(bovine)이다.
보다 구체적으로는, 상기 비-인간 동물 혈청으로 소의 혈청이 이용되는 경우, 본 발명의 내부표준물질은 표 2에 기재된 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
보다 구체적으로는, 상기 비-인간 동물 혈청으로 염소의 혈청이 이용되는 경우, 본 발명의 내부표준물질은 표 3에 기재된 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 질량분석은 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight), SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight), ESI-TOF(Electrospray ionisation time-of-flight), MRM(Multiple Reaction Monitoring), QqQ MS(Triple Quadrupole Mass Spectrometry), 액상 크로마토그래피-질량분석(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 및 LC-MS/MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 질량분석 방법을 이용하여 이루어진다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생물학적 시료에 R-CN(R은 직쇄 또는 분쇄의 C1-C3 알킬)으로 표시되는 유기용매를 첨가하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 표 4에 나열된 하나 이상의 단백질의 분리 방법을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 유기용매 및 생물학적 시료에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 유기용매를 전처리함으로써 생물학적 시료로부터 아포지단백질을 분리 및/또는 검출하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 또한 반추동물의 혈청을 포함하는 단백질의 질량 분석용 기질(matrix) 및 내부표준물질(internal standard) 조성물을 각각 제공한다.
(c) 본 발명은 효소를 이용한 절단 없이도 다양한 단백질형(Proteoform)을 직접 정량할 수 있을 뿐 아니라, 동물의 혈청을 기질로 이용함으로써 시료 내 목적 단백질을 제거하지 않고도 간단하게 검체 시료의 기질을 유지시킬 수 있으며, 내부표준물질로써 시간과 비용이 소요되는 기존의 합성 펩타이드 또는 합성 단백질 대신 동물의 혈청 내 단백질을 활용함으로써 최소 비용으로 정량 결과의 객관성과 정확성을 담보하였다.
(d) 이에, 본 발명은 간소화된 공정을 통해 시료로부터 높은 순도로 목적 단백질을 추출하고, 시료 내 모든 단백질형의 총량에 관한 정보 뿐 아니라 다양한 당화 패턴을 가지는 각 단백질형에 대한 개별적인 정량 정보를 높은 신뢰도로 제공할 수 있는 효율적인 분석 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 시도한 다양한 시료 전처리 방법(ACN 액상추출법, MTBE 방법, TFA 방법, TCA 액상추출법, 여과, 인산 방법)에 의한 효과를 각각 SDS-PAGE 분석(상단) 및 웨스턴 블롯 분석(하단)을 통해 보여주는 그림이다. 각 방법의 효과를 판단하는 기준은 SDS-PAGE에서 단백질의 복잡성이 감소하는지 및 웨스턴 블롯에서 타겟 단백질(예를 들어 APOC-Ⅲ 단백질)의 양이 유지되는지를 복합적으로 판단하였다. 그 결과, 이러한 기준을 가장 잘 만족시키는 방법은 아세토니트릴(ACN)을 유기 용매로 이용한 방법임을 알 수 있었다.
도 2는 ACN을 이용한 시료 전처리법에 있어 ACN의 최적 농도를 탐색한 결과를 보여주는 SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여주는 그림이다. 최적 농도는 단백질의 복잡성 감소와 타겟 단백질이 일정하게 추출되는지 여부를 통해 결정하였으며, 이를 위해 타겟 단백질의 추출 정도는 밀도측정(densitometry) 방법으로 분석하였고, 전체 단백질 양을 nano-drop 방법으로 정량하였다. 보정 값은 타겟 단백질의 검출정도를 전체 단백질양으로 보정한 것이다. 측정 결과, ACN의 농도가 60 v/v%인 경우 가장 우수한 효과가 나타났다.
도 3은 ACN의 농도(40-80%)에 따라 액상 추출된 단백질들의 정량 결과를 그래프로 보여주는 그림이다. 아포지단백질에 속하는 다양한 단백질에 대한 3회 반복한 측정 값의 평균으로 나타내었으며, 도 2와 마찬가지로 전체 단백질의 정량값으로 해당 단백질의 정량값을 보정한 보정 값으로 표현되었다. 정량값은 크로마토그램의 면적 값으로 계산되었다. 대부분의 아포지단백질을 포함하여 42개 단백질이 60% ACN에서 가장 추출이 잘 되었다.
도 4는 효소의 절단 없이 단백질형을 동정한 MALDI-TOF와 Q-TOF 분석 결과를 보여주는 그림이다. APOC-Ⅲ에 대한 4가지 단백질형을 모이온 분석(MS1만 분석)과 텐덤 분석(MS1과 MS2 모두 분석)을 통해 동정하였다.
도 5는 기질 탐색을 위해 혈청에 60% ACN를 가하여 액상 추출을 수행한 결과를 SDS-PAGE 분석으로 보여주는 그림이다. 인간, 염소(goat), 소(bovine)의 혈청을 기질로서 각각 처리하였으며, 흰색 박스는 전처리를 하지 않은 전체 단백질을, 빨간색 박스는 전처리 후 액상 추출된 단백질을 나타낸다.
도 6은 기질이 있는 경우와 없는 경우 각각 단백질-MRM에서 조제 검체의 회귀곡선을 보여주는 그림으로, 기질이 없는 경우 X축으로 떨어지지만, 기질이 있을 경우 0점을 향할 뿐 아니라 회귀곡선의 결정계수도 1에 더 가까워짐을 알 수 있다.
도 7은 내부표준물질 탐색을 위해 동물의 혈청을 60% ACN 방법으로 액상추출한 후 검출된 단백질을 보여주는 그림이다. 도 5의 SDS-PAGE 분석에서 대표적인 단백질(알부민 및 아포지단백질)을 표시하였다.
도 8은 내부표준물질을 사용할 경우의 단백질 정량 효과를 보여주는 회귀곡선이다. 조제 검체에서 내부표준물질이 있을 때 보정한 값의 회귀곡선의 결정계수가 1에 더 가깝다는 것을 펩타이드-MRM(좌측)과 단백질-MRM(우측)에서 각각 보여준다. 내부표준물질로 펩타이드-MRM에서는 합성 펩타이드를 사용하였고, 단백질-MRM에서는 단일 단백질을 사용하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 시료 전처리법 최적화
전처리 방법의 선정
혈청으로부터 특정 단백질군을 액상 추출하기 위해 시료를 전처리하는 최적의 방법을 탐색하고자 유기용매(ACN, 메틸 tert-부틸 에테르) 처리 방법, 산(트리플루오로 아세트산, 트리클로로아세트산, 인산) 처리 방법 및 여과(30kD 필터 이용) 방법을 비교하였다. 각 전처리 방법의 구체적인 공정은 아래와 같다:
1) ACN 액상 추출법: 증류수 100μl에 100% ACN 300μl 넣고, 혈청 50μl를 넣어 최종 60% ACN 농도가 되도록 하였다. 4℃에서 30분간 반응 후 원심분리하고 (14,000g, 30분, 4℃) 상층액을 회수하였다.
2) MTBE 방법 1: MTBE(메틸 tert-부틸 에테르):메탄올:증류수 = 10: 3: 2.5 비율로 섞고 4℃에서 30분 반응 후 원심분리(21,000g, 30분, 4℃)한 뒤 하층액을 회수하였다.
3) MTBE 방법 2: MTBE:메탄올:증류수= 5: 3: 1 비율로 섞고 4℃에서 30분 반응 후 원심분리(21,000g, 30분, 4℃)한 뒤 상층액을 회수하였다. 상층액에 MTBE:메탄올:증류수 = 5:1:1 비율로 섞고 원심분리(1,000g, 10분, 4℃)하고 하층액을 회수하였다.
4) TFA 방법: 혈청 2μl에 0.1% TFA 50μl를 섞고 1,500rpm, 상온에서 15분 반응시킨 후 C18 필터를 이용하여 염을 제거하였다.
5) TCA 액상추출법 1: 혈청 100μl에 우레아 완충액(8M urea, 20mM DTT in HEPES, pH 8.0) 100μl를 섞고 5분간 단백질을 변성시켰다. 이후 20% TCA 200μl를 첨가하고 1시간 동안 4℃에서 반응시킨 뒤 원심분리(16,000g, 10분, 4℃) 후 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 HLB 필터를 이용하여 염을 제거하였다.
6) TCA 액상추출법 2: ACN 침전법과 동일한 방법으로 진행하되 ACN 대신 TCA를 사용하였다. 농도를 1-10% 구간에서 또는 ACN과 순차적으로 연결하여 전처리하였다.
7) 인산 방법: 혈청 2μl에 12% 인산을 최종 2%가 되도록 넣고 30분간 4℃에서 반응시킨 뒤 원심분리(21,000g, 30분, 4℃)하고 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 60% ACN 침전법으로 전처리하였다.
8) 여과 방법: 혈청 100μl에 2% ACN, 0.1% FA 용액 900μl를 섞고 30kD 필터에서 원심분리하였다(14,000g, 30분~1시간, 4℃). 이후 HLB 필터를 이용하여 염을 제거하였다.
상기 나열된 8가지 방법을 통해, 혈청의 액상 추출에서 가장 잘 검출되는 단백질인 APOC-Ⅲ을 대상으로 하여 SDS-PAGE를 통해 단백질 밴드의 패턴을 확인하고, 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 단백질의 추출 정도를 판단하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, SDS-PAGE에서 단백질의 복잡성을 가장 감소시키면서 웨스턴 블롯에서 타겟 단백질인 APOC-Ⅲ 단백질의 양이 일정하게 유지되는지를 평가한 결과, 유기 용매 중에서도 아세토니트릴(ACN)을 이용한 전처리를 수행할 경우, 즉 상기 방법 1)이 가장 효율적으로 혈청 단백질을 액상 추출할 수 있음을 확인하였다(도 1).
ACN 액상 추출법의 최적화
이어서, ACN을 이용한 시료 전처리법을 사용할 경우 ACN의 농도를 비롯한 최적의 전처리 조건을 탐색하고자 다양한 농도(40-80v/v%), 반응 시간, 반응 온도에서 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석을 통해 단백질의 추출 양상을 평가하였다:
1) ACN 농도: 혈청 20μl에 증류수와 100% ACN을 최종 40-80% ACN 농도가 되도록 섞었다. 4℃에서 30분간 반응 후 원심분리하고(14,000g, 30분, 4℃) 상층액을 회수하였다.
2) 반응 온도: 혈청 20μl에 증류수 40μl와 100% ACN 120μl를 섞고 상온, 4℃, -20℃ 및 -80℃에서 30분간 반응시킨 후 원심분리하고 (14,000g, 30분, 4℃) 상층액을 회수하였다.
3) 반응 시간: 혈청 20μl에 증류수 40μl와 100% ACN 120μl를 섞고 4℃에서 30분, 60분간 반응시킨 후 원심분리하고 (14,000g, 30분, 4℃) 상층액을 회수하였다.
4) 원심분리 조건: 위와 동일한 조건에서 원심분리의 속도 (14,000g, 21,000g, max)에 따라, 멈추는 속도에 따라 (normal, slow) 비교하였다.
상기와 같은 다양한 조건을 적용한 결과, 반응 시간과 반응 온도에 따른 변수는 유의하지 않았으나, ACN의 농도가 60 v/v%인 경우 가장 효율적으로 타겟 단백질이 추출됨을 알 수 있었다(도 2). 아울러, 40-80% ACN을 이용하여 수득한 단백질 분획은 액체크로마토그래피 및 의존성 질량분석법을 통해 검출한 후 단백질들을 동정하였고, 비의존성 질량분석 방법을 통해 상대적으로 정량하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, 아포지단백질에 속하는 다양한 단백질군이 50 내지 70% 농도 범위의 ACN에서 우수한 추출 효율을 보였으며, 특히 측정된 9개 단백질은 60% ACN에서 가장 추출이 잘 되었다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
전처리한 샘플을 5x 샘플버퍼(12.5% 2-머캅토에탄올 포함)에 섞어 95℃에 10분간 반응시켰다. 샘플은 4-15% Tris-glycine 겔에 30분간 200V에서 분자량에 따라 분리시켰다. SDS-PAGE 분석은 겔을 50% 메탄올, 7% 아세트산이 들어있는 단백질 고정용매에 10분 반응시키고 GelCode Blue 용액에 30분간 염색시켰다. 잔여의 염색액은 물로 충분히 세척하였다.
웨스턴 블롯 분석은 겔의 단백질을 PVDF 막에 옮기고(20V, 1시간), 1 x TBS (150mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.6)에 5% 탈지유 또는 분유를 녹여 블로킹하였다. 1차 항체(래빗 항-인간 APOC-Ⅲ, 1:1,000)를 1시간 반응시키고, 1 X TBS-T (1 x TBS에 0.1% tween20 포함)로 세척하였다. 2차 항체(고트 항-래빗 IgG-HRP, 1:20,000)를 1시간 반응시키고, 1 X TBS-T로 세척하였다. ECL 용액에 막을 담궈 형광물질의 발광된 정도를 iBright CL 1000으로 측정하였다.
단백질 동정 및 정량을 위한 전처리 및 질량분석 방법
1) ACN 액상추출법: 혈청 10μl에 증류수와 100% ACN(chilled)을 최종 40-80% ACN농도가 되도록 섞었다. 상온에서 30분간 반응 후 원심분리하고 (21,000g, 30분, 4℃) 상층액을 회수하였다. C18 필터에 통과시켜 여과된 분획을 말렸다.
2) 용매 내 효소절단: 단백질 샘플에 최종 6-8M이 되도록 8M urea 용액을 섞어 주었다. 200mM DTT를 최종 10mM이 되도록 섞고 37℃, 30분, 600rpm에서 반응시켰다. 200mM IAA를 최종 15mM이 되도록 섞고 25℃, 1시간, 0rpm, 어두운 곳에서 반응시켰다. 50mM Tris-HCl, pH8.0로 urea 농도가 최종 1M 이하가 되도록 희석시켰다. 효소절단에서 사용하는 효소(Trypsin 또는 Trypsin/Lys-C)를 1:50 비율로 섞고 37℃, 16-24 시간, 900rpm에서 반응시켰다. 5% 포름산을 최종 0.5%가 되도록 섞고 C18 컬럼으로 염을 제거하였다.
3) Orbitrap MS: 전처리한 샘플 200ng 또는 혈청 부피로 보정한 양의 펩티드 (800ng이하)를 Ultimate 3000 nanoLC에 주입하였다 (용매A는 0.1% 포름산, 용매B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 75um x 2cm C18 trap 컬럼과 75um x 70 cm C18 분석컬럼). 펩티드를 분당 5μL 속도의 용매 A로 트랩 컬럼에 붙였고, 분당 0.35μL 속도로 용매 B 기준 10-40%까지 용매 비율에 변화를 주어 90분간 분석하였다. Orbitrap MS는 Q-Exactive HF-X를 사용하였으며 의존성 질량분석법(data dependent analysis, DDA)으로 단백질 동정 및 데이터베이스를 구축하고, m/z에 따라 구간을 나눈 비의존성 질량분석법(data independent analysis, DIA)으로 상대적 정량분석을 하였다. 질량분석 데이터는 사람의 Uniprot 단백질 데이터베이스(2022.03.22.에 다운로드한 단백질 서열로 42,290개 사용)에서 FDR 1% 이하로 분석하였다.
실시예 2. 직접 단백질 동정 및 절대정량을 위한 질량분석방법
본 발명자들은 효소의 절단 없이 각종 단백질형을 직접 정량할 수 있는 단백질-MRM 질량분석을 수행하고자 하였다. 전술한 실시예 1에서 확립된 방법에 따라 60% ACN 전처리로 혈청에서 단백질을 추출하였고, 대표 단백질로서 APOC-Ⅲ의 동형단백질 4가지를 MALDI-TOF와 LC-Q-TOF로 동정하였다(도 4).
MALDI-TOF (동정)
전처리한 샘플 1μl를 MSP 96 금속 플레이트에 스팟팅하고 건조시켰다. 그 위에 기질 용액(20mg/mL 시나프산, 0.1% TFA) 1μl를 스팟팅하고 건조시켰다. Microflex LT/SH MALDI-TOF에서 레이저 70, gain 7, 주파수 66.6Hz, 600샷 조건으로 분석하였다.
LC-Q-TOF (동정)
전처리한 샘플 5μl를 1260 HPLC에 주입하였다(용매 A는 0.1% 포름산, 용매B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 150 x 2.0 mm id, 5um Jupiter 300 C4, 컬럼온도 40℃). 분당 0.2mL의 속도로 용매 B 기준 5-60%까지 분당 4% 속도로 용매 비율에 변화를 주어 40분간 분석하였다. Q-TOF는 dual JetStreem ESI 소스가 달린 6545 X T Q-TOF를 사용하며 intact 단백질(MS 1만)이나 탑-다운 분석(MS1, MS2 사용)을 진행하였다. 데이터 처리는 MS1을 역합성곱 분석하여 intact 단백질을 동정하거나, TopPIC 프로그램을 사용하여 MS2까지 역합성곱 분석하여 조각이온까지 매칭 후 단백질을 동정하였다. 당 분석은 스펙트럼의 질량값과 동위원소 패턴 매칭으로 확인하였다.
LC-QQQ (정량, 단백질-MRM)
전처리한 샘플 5μl를 1290 UHPLC에 주입하였다(용매 A는 0.1% 포름산, 용매B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 150 x 2.0 mm id, 5um, Jupiter 300 C4, 컬럼온도 40℃). 분당 0.4mL의 속도로 용매 B 기준 5-60%까지 분당 4% 속도로 용매비율에 변화를 주어 30분간 분석하였다. QQQ는 JetStreem ESI 소스가 달린 6495 QQQ를 사용하며 아래의 설정된 이온소스 조건과 transition을 사용하여 정량 분석하였다.
1) 이온화 최적화: 아포지단백질의 이온화가 잘 되도록 조건을 최적화하였고, 검출되는 감도로 판단하였다(모세관 전압 (5500V), ion source 가스의 온도 (110℃)와 속도 (11L/분), sheath 가스의 온도(200℃)와 속도(11L/분), 네뷸라이저 (25psi), 노즐 전압 (500V)이 최적이었다).
2) Transition 설정: 고해상도 MS (Q-TOF)에서 탐색한 조건을 토대로 MRM에서 전구체 이온을 설정하고 절편 이온과 충돌 에너지(CE)를 설정하였다. 해상도는 wide(FWHM=1.2)를 사용하였다.
LC-QQQ (정량, 펩타이드-MRM)
전처리한 샘플 20μl를 1290 UHPLC에 주입하였다 (용매 A는 0.1% 포름산, 용매 B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 50 x 3.0mm id, 2.7um, Poroshell 20 EC-C18, 컬럼온도 40℃). 분당 0.4mL의 속도로 용매B 기준 5-31%까지 단계별 용매비율에 변화를 주어 10분간 분석하였다. QQQ는 JetStreem ESI 소스가 달린 6495 QQQ를 사용하며 최적화된 이온화 조건과 transition을 사용하여 정량 분석하였다. 해상도는 unit (FWHM=0.7)을 사용하였다.
이상과 같이 단백질-MRM 분석을 위해 LC-QQQ 장비에서 이온화 최적화 단계와 Transition 설정 단계를 거친 후, 동형단백질 4가지의 절대정량 분석을 시행하였다. 단백질-MRM 방법과 펩타이드-MRM 방법에서 최적화하여 사용되는 Transition을 하기 표 1에 요약하였으며, 가장 잘 검출되는 모이온과 조각이온, 조각을 내는 에너지에 대한 정보를 나타내었다.
동일한 LC-QQQ 장비에서 펩타이드-MRM, 단백질-MRM 분석을 APOC-Ⅲ에 대해 진행하였고, 기존에 사용되던 분석법인 항체기반 TIA 분석과 함께 3가지의 상관성이 좋음을 확인하였다.
실시예 3. 기질(matrix)의 탐색
본 발명자들은 질량 분석을 위한 기질로서 인간, 염소(goat) 및 소(bovine)의 혈청과 식염수를 시험하였으며, SDS-PAGE 분석과 질량분석방법을 통해 각 후보 물질들의 기질로서의 적절성을 다음과 같이 평가하였다:
기질 탐색을 위한 시료 전처리 방법
1) SDC(Sodium deoxycholate) 간소화 효소절단(펩타이드-MRM 분석용): 혈청은 1 x PBS로 20배 희석한 후 10μl를 내부표준물질(합성 펩타이드) 10μl와 섞어 주었다. 5% SDC 5μl와 trypsin/lys-C 25μl(1:3.6)를 섞어 37℃, 45분, 900rpm에서 반응시켰다. 5% 포름산 10μl를 섞고 원심분리하여(12,000g, 10분, 4℃) 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 C18 컬럼으로 염을 제거하였다.
2) 60% ACN 액상 추출(단백질-MRM 분석용): 혈청 10μl에 증류수 20μl를 넣고 100% ACN(chilled) 45μl를 첨가하여 60% ACN이 되도록 하였다. 상온에서 30분 반응 후 원심분리하고(21,000g, 30분, 4℃) 상층액을 회수한 뒤 C18 필터에 통과시켜 여과된 분획을 건조시켰다.
3) SDS-PAGE 분석: 전처리한 샘플을 5 x 샘플 버퍼(12.5% 2-머캅토에탄올 포함)에 섞어 95℃에 10분간 반응시켰다. 샘플은 4-15% Tris-glycine gel에 30분간 200V에서 분자량에 따라 분리시켰다. SDS-PAGE 분석은 겔을 50% 메탄올, 7% 아세트산이 들어있는 fix 용매에 10분 반응시키고 GelCode Blue 용액에 30분간 염색시켰다. 잔여의 염색액은 물로 충분히 세척하였다.
기질 탐색을 위한 정량용 질량분석 방법 (LC-QQQ)
1) 단백질-MRM 분석방법: 전처리한 샘플 5μl를 1290 UHPLC에 주입하였다 (용매 A는 0.1% 포름산, 용매B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 150 x 2.0 mm id, 5um, Jupiter 300 C4, 컬럼온도 40℃). 분당 0.4mL의 속도로 용매B 기준 5-60%까지 분당 4% 속도로 용매비율에 변화를 주어 30분간 분석하였다. QQQ는 JetStreem ESI 소스가 달린 6495 QQQ를 사용하며 아래의 설정된 이온소스 조건과 transition을 사용하여 정량 분석하였다. 해상도는 wide(FWHM=1.2)를 사용하였다.
2) 펩타이드-MRM 분석방법: 전처리한 샘플 20μl를 1290 UHPLC에 주입하였다(용매 A는 0.1% 포름산, 용매 B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 50 x 3.0mm id, 2.7um, Poroshell 20 EC-C18, 컬럼온도 40℃). 분당 0.4mL의 속도로 용매 B 기준 5-31%까지 단계별 용매비율에 변화를 주어 10분간 분석하였다. QQQ는 JetStreem ESI 소스가 달린 6495 QQQ를 사용하며 최적화된 이온화 조건과 transition을 사용하여 정량 분석하였다. 해상도는 unit (FWHM=0.7)을 사용하였다.
도 5에서 보는 바와 같이 (흰색 박스), 펩타이드-MRM 방법에서는 염소의 혈청이 사람과 유사한 기질을 가지면서 특정 단백질 분자량의 차이가 있어 적절한 기질로 확인되었다. 반면, 단백질-MRM에서는 염소의 혈청이 액상 추출되는 과정에서 기질을 유지하지 못하였고, 소의 혈청이 기질을 유지하면서 특정 단백질 분자량의 차이가 있어 적절한 기질로 확인되었다(도 5의 빨간색 박스). 이에, 보정선 검체 조제시 동물의 혈청을 기질로 사용함으로써 직선성(linearity)을 유지하는데 도움이 되었다 (도6).
실시예 4. 내부표준물질 탐색
염소와 소의 혈청을 사용하여 60% ACN으로 액상추출하고, 단백질 동정 분석으로 해당 동물에만 존재하는 단백질을 내부표준물질로 선정하고자 하였다:
내부표준물질 후보 탐색을 위한 시료 전처리 방법
1) 60% ACN 액상추출법: 혈청 10ul에 증류수 20μl를 넣고 100% ACN (chilled) 45μl를 섞어 60% ACN이 되도록 하였다. 상온에서 30분 반응 후 원심분리하고(21,000g, 30분, 4℃) 상층액을 회수하였다. C18 필터에 통과시켜 여과된 분획을 말렸다.
2) 용매 내 효소 절단: 단백질 샘플에 최종 6-8M이 되도록 8M urea 용액을 섞어 주었다. 200mM DTT를 최종 10mM이 되도록 섞고 37℃, 30분, 600rpm에서 반응시켰다. 200mM IAA를 최종 15mM이 되도록 섞고 25℃, 1시간, 0rpm, 어두운 곳에서 반응시켰다. 50mM Tris-HCl, pH8.0로 urea 농도가 최종 1M이하가 되도록 희석시켰다. 절단 효소(Trypsin 또는 Trypsin/Lys-C)를 1:20-1:50 비율로 섞고 37℃, 16- 24시간, 900rpm에서 반응시켰다. 5% 포름산을 최종 0.5%가 되도록 섞고 C18 컬럼으로 염을 제거하였다.
내부표준물질 탐색을 위한 단백질 동정 및 정량 효과 개선의 확인
1) Orbitrap MS: 전처리한 샘플 200ng 펩티드를 Ultimate 3000 nanoLC에 주입하였다(용매 A는 0.1% 포름산, 용매 B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 75um x 2cm C18 trap 컬럼과 75um x 70 cm C18 분석컬럼). 펩타이드를 분당 5μL 속도의 용매 A로 트랩 컬럼에 붙였고, 분당 0.35μL 속도로 용매 B 기준 10-40%까지 용매 비율에 변화를 주어 90분간 분석하였다. Orbitrap MS는 Q-Exactive HF-X를 사용하며 의존성 질량분석법(data dependent analysis, DDA)으로 분석하였다. 질량분석 데이터는 염소와 소의 Uniprot 단백질 데이터베이스 (2022.05.16.에 다운로드 한 단백질 서열로, 염소는 77,728개, 소는 47,030개 사용)에서 FDR 1% 이하로 분석하였고 펩타이드가 2개 이상 검출된 단백질만 리스트에 포함시켰다.
2) LC-QQQ (단백질-MRM 분석방법): 전처리한 샘플 5μl를 1290 UHPLC에 주입하였다(용매 A는 0.1% 포름산, 용매 B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 150 x 2.0 mm id, 5um, Jupiter 300 C4, 컬럼온도 40℃). 분당 0.4mL의 속도로 용매 B 기준 5-60%까지 분당 4% 속도로 용매비율에 변화를 주어 30분간 분석하였다. QQQ는 JetStreem ESI 소스가 달린 6495 QQQ를 사용하며 아래의 설정된 이온소스 조건과 transition을 사용하여 정량 분석하였다. 해상도는 wide(FWHM=1.2)을 사용하였다.
3) LC-QQQ (펩타이드-MRM 분석방법): 전처리한 샘플 20μl를 1290 UHPLC에 주입하였다(용매 A는 0.1% 포름산, 용매 B는 ACN, 0.1% 포름산, 컬럼은 50 x 3.0mm id, 2.7um, Poroshell 20 EC-C18, 컬럼온도 40℃). 분당 0.4mL의 속도로 용매 B 기준 5-31%까지 단계별 용매비율에 변화를 주어 10분간 분석하였다. QQQ는 JetStreem ESI 소스가 달린 6495 QQQ를 사용하며 최적화된 이온화 조건과 transition을 사용하여 정량 분석하였다. 해상도는 unit(FWHM=0.7)을 사용하였다.
소의 혈청에서 검출된 단백질 리스트 (총 52개)
Accession Description
P12763 Alpha-2-HS-glycoprotein OS=Bos taurus OX=9913 GN=AHSG PE=1 SV=2
P34955 Alpha-1-antiproteinase OS=Bos taurus OX=9913 GN=SERPINA1 PE=1 SV=1
Q5GN72 Alpha-1-acid glycoprotein OS=Bos taurus OX=9913 GN=agp PE=2 SV=2
P01966 Hemoglobin subunit alpha OS=Bos taurus OX=9913 GN=HBA PE=1 SV=2
I7CT57 Gc-globulin OS=Bos taurus OX=9913 PE=2 SV=1
Q3MHN5 Vitamin D-binding protein OS=Bos taurus OX=9913 GN=GC PE=2 SV=1
P81644 Apolipoprotein A-II OS=Bos taurus OX=9913 GN=APOA2 PE=1 SV=2
O46375 Transthyretin OS=Bos taurus OX=9913 GN=TTR PE=1 SV=1
P02769 Albumin OS=Bos taurus OX=9913 GN=ALB PE=1 SV=4
A0A3Q1MJT2 Alpha-1B-glycoprotein OS=Bos taurus OX=9913 GN=A1BG PE=1 SV=1
B0JYQ0 ALB protein OS=Bos taurus OX=9913 GN=ALB PE=2 SV=1
P02081 Hemoglobin fetal subunit beta OS=Bos taurus OX=9913 PE=1 SV=1
G1K122 Retinol-binding protein OS=Bos taurus OX=9913 GN=RBP4 PE=3 SV=1
A0A3Q1LVV7 Fibrinogen alpha chain OS=Bos taurus OX=9913 GN=FGA PE=4 SV=1
A0A452DI66 Prothrombin OS=Bos taurus OX=9913 GN=F2 PE=3 SV=1
P02453 Collagen alpha-1(I) chain OS=Bos taurus OX=9913 GN=COL1A1 PE=1 SV=3
F1MMK9 Protein AMBP OS=Bos taurus OX=9913 GN=KIF12 PE=3 SV=3
A0A3Q1MGB8 Protein AMBP OS=Bos taurus OX=9913 GN=KIF12 PE=3 SV=1
V6F9A3 Apolipoprotein C-III OS=Bos taurus OX=9913 GN=ApoC3 PE=3 SV=1
A0A3Q1M2B2 Complement C3 OS=Bos taurus OX=9913 GN=C3 PE=1 SV=1
Q58D62 Fetuin-B OS=Bos taurus OX=9913 GN=FETUB PE=1 SV=1
F1MS32 Apolipoprotein D OS=Bos taurus OX=9913 GN=APOD PE=3 SV=3
P01045 Kininogen-2 OS=Bos taurus OX=9913 GN=KNG2 PE=1 SV=1
G3N0V2 Cytokeratin-1 OS=Bos taurus OX=9913 GN=KRT1 PE=1 SV=2
P01044 Kininogen-1 OS=Bos taurus OX=9913 GN=KNG1 PE=1 SV=1
A0A0A0MP92 Serpin A3-7 OS=Bos taurus OX=9913 GN=SERPINA3-7 PE=1 SV=1
A6QNZ7 Keratin 10 (Epidermolytic hyperkeratosis; keratosis palmaris et plantaris) OS=Bos taurus OX=9913 GN=KRT10 PE=2 SV=1
Q68RU0 Ovarian and testicular apolipoprotein N OS=Bos taurus OX=9913 GN=ApoN PE=2 SV=1
P28800 Alpha-2-antiplasmin OS=Bos taurus OX=9913 GN=SERPINF2 PE=1 SV=2
A0A3Q1LRP5 C3/C5 convertase OS=Bos taurus OX=9913 GN=CFB PE=1 SV=1
Q5DPW9 Cystatin E/M OS=Bos taurus OX=9913 GN=CST6 PE=4 SV=1
A5D7S8 Fibulin-1 OS=Bos taurus OX=9913 GN=FBLN1 PE=2 SV=1
Q3T0E0 Copper transport protein ATOX1 OS=Bos taurus OX=9913 GN=ATOX1 PE=3 SV=1
I3PGL3 Insulin-like growth factor II (Fragment) OS=Bos taurus OX=9913 GN=IGF2 PE=2 SV=1
Q2KIS7 Tetranectin OS=Bos taurus OX=9913 GN=CLEC3B PE=2 SV=1
F1MYX2 Apolipoprotein M OS=Bos taurus OX=9913 GN=APOM PE=3 SV=1
E1B726 Plasminogen OS=Bos taurus OX=9913 GN=PLG PE=3 SV=2
D4QBB4 Globin A1 OS=Bos taurus OX=9913 GN=HBB PE=3 SV=1
A0A0A0MPA0 SERPIN domain-containing protein OS=Bos taurus OX=9913 GN=LOC784932 PE=1 SV=1
F1N5T0 Protein CutA OS=Bos taurus OX=9913 GN=CUTA PE=3 SV=1
P15497 Apolipoprotein A-I OS=Bos taurus OX=9913 GN=APOA1 PE=1 SV=3
A4IFP2 KRT4 protein OS=Bos taurus OX=9913 GN=KRT4 PE=2 SV=1
F1MLH6 Calmodulin OS=Bos taurus OX=9913 GN=CALM PE=4 SV=3
P13213 SPARC OS=Bos taurus OX=9913 GN=SPARC PE=1 SV=2
A0A3Q1LMK6 Cell growth regulator with EF-hand domain 1 OS=Bos taurus OX=9913 GN=CGREF1 PE=4 SV=1
G3X6N3 Beta-1 metal-binding globulin OS=Bos taurus OX=9913 GN=TF PE=1 SV=2
Q3B7N0 Cadherin-13 OS=Bos taurus OX=9913 GN=CDH13 PE=2 SV=1
F1N362 Keratin 84 OS=Bos taurus OX=9913 GN=KRT84 PE=3 SV=2
P13384 Insulin-like growth factor-binding protein 2 OS=Bos taurus OX=9913 GN=IGFBP2 PE=1 SV=2
A0A3Q1N2U0 Latent transforming growth factor beta binding protein 1 OS=Bos taurus OX=9913 GN=LTBP1 PE=4 SV=1
F1N0I3 Coagulation factor V OS=Bos taurus OX=9913 GN=F5 PE=3 SV=3
A0A3Q1M083 Protein CutA OS=Bos taurus OX=9913 GN=CUTA PE=3 SV=1
염소의 혈청에서 검출된 단백질 리스트 (총 9개)
Accession Description
P85295 Albumin (Fragments) OS=Capra hircus OX=9925 GN=ALB PE=1 SV=2
A0A8C2NVN1 Complement C3 OS=Capra hircus OX=9925 PE=4 SV=1
A0A452E2C8 Transthyretin OS=Capra hircus OX=9925 GN=TTR PE=3 SV=1
V5KXW5 Retinol-binding protein OS=Capra hircus OX=9925 PE=2 SV=1
A0A452FX21 Prothrombin OS=Capra hircus OX=9925 GN=F2 PE=3 SV=1
B3VHM9 Albumin (Fragment) OS=Capra hircus OX=9925 PE=1 SV=1
A0A452DY37 Beta-2-microglobulin OS=Capra hircus OX=9925 GN=B2M PE=3 SV=1
A0A452FVB9 BPI1 domain-containing protein OS=Capra hircus OX=9925 PE=4 SV=1
A0A452GA47 Cytokeratin-1 OS=Capra hircus OX=9925 GN=KRT1 PE=3 SV=1
상기 나열된 합성 펩타이드 또는 단일 단백질 중 myoglobin, cytochromeC 등을 비롯한 다수의 단백질을 내부표준물질로 이용하였을 때 보정선의 직선성이 좋아졌다.
ACN 60%에서 최대로 추출되는 아포지단백질 외 기타 혈청 단백질
단백질 유전자
Immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein ISLR UNQ189/PRO215
Coagulation factor XIII A chain (Coagulation factor XIIIa) (EC 2.3.2.13) F13A1 F13A
Prothrombin (EC 3.4.21.5) (Coagulation factor II) F2
Angiotensinogen (Serpin A8) AGT SERPINA8
Complement C3 (C3 and PZP-like alpha-2-macroglobulin domain-containing protein 1) C3 CPAMD1
Cystatin-C (Cystatin-3) (Gamma-trace) CST3
Insulin-like growth factor II (IGF-II) (Somatomedin-A) IGF2 PP1446
Fibrinogen alpha chain FGA
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein (LRG) LRG1 LRG
Retinol-binding protein 4 (Plasma retinol-binding protein) (PRBP) (RBP) RBP4 PRO2222
Alpha-1-acid glycoprotein 1 (AGP 1) (Orosomucoid-1) (OMD 1) ORM1 AGP1
Alpha-2-HS-glycoprotein (Alpha-2-Z-globulin) (Ba-alpha-2-glycoprotein) AHSG FETUA PRO2743
Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase (EC 2.3.1.43) LCAT
Serine protease 1 (EC 3.4.21.4) (Anionic trypsin I) PRSS1 TRP1 TRY1 TRYP1
Serum amyloid A-1 protein (SAA) SAA1
Coagulation factor V (Activated protein C cofactor) F5
Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IBP-2) IGFBP2 BP2 IBP2
Insulin-like growth factor-binding protein 4 (IBP-4) IGFBP4 IBP4
Serum paraoxonase/arylesterase 1 (PON 1) (EC 3.1.1.2) (EC 3.1.1.81) (EC 3.1.8.1) PON1 PON
Peroxiredoxin-2 (EC 1.11.1.24) (Natural killer cell-enhancing factor B) (NKEF-B) (PRP) PRDX2 NKEFB TDPX1
Trypsin-3 (EC 3.4.21.4) (Brain trypsinogen) (Mesotrypsin) (Mesotrypsinogen) (Serine protease 3) PRSS3 PRSS4 TRY3 TRY4
Beta-2-microglobulin B2M CDABP0092 HDCMA22P
Thymosin beta-4 (T beta-4) (Fx) TMSB4X TB4X THYB4 TMSB4
Galectin-3-binding protein (Basement membrane autoantigen p105) (Lectin galactoside-binding soluble 3-binding protein) LGALS3BP M2BP
EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (Extracellular protein S1-5) (Fibrillin-like protein) (Fibulin-3) (FIBL-3) EFEMP1 FBLN3 FBNL
Multimerin-1 (EMILIN-4) (Elastin microfibril interface located protein 4) (Elastin microfibril interfacer 4) (Endothelial cell multimerin) MMRN1 ECM EMILIN4 GPIA* MMRN
Trem-like transcript 1 protein (TLT-1) TREML1 TLT1 UNQ1825/PRO3438
Aprataxin and PNK-like factor (EC 3.1.-.-) (Apurinic-apyrimidinic endonuclease APLF) APLF C2orf13 PALF XIP1
ATP-dependent RNA helicase TDRD9 (EC 3.6.4.13) (Tudor domain-containing protein 9) TDRD9 C14orf75
Progesterone-induced-blocking factor 1 (PIBF) (Centrosomal protein of 90 kDa) (CEP90) PIBF1 C13orf24 PIBF
SPRY domain-containing SOCS box protein 2 (SSB-2) (Gene-rich cluster protein C9) SPSB2 GRCC9 SSB2
Keratin, type I cytoskeletal 23 (Cytokeratin-23) (CK-23) (Keratin-23) KRT23
Unconventional myosin-Va (Dilute myosin heavy chain, non-muscle) (Myosin heavy chain 12) MYO5A MYH12
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 아포지단백질(apolipoprotein)을 포함하는 생물학적 시료에 R-CN(R은 직쇄 또는 분쇄의 C1-C3 알킬)으로 표시되는 유기용매를 첨가하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 아포지단백질의 분리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 아포지단백질은 ApoA-I, ApoA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoA-Ⅴ, ApoB, ApoC-I, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoC-Ⅳ, ApoD, ApoE, ApoF, ApoL1, ApoL2, ApoL3, ApoL4, ApoL5, ApoL6, Apo(a) 및 ApoM으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 유기용매는 40 - 80 v/v%의 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하여 생물학적 시료로부터 아포지단백질을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 내 아포지단백질의 검출 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 아포지단백질은 ApoC-Ⅲ이며, 상기 방법은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring; MRM)을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 아포지단백질의 분해(digestion) 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 비-인간 동물의 혈청을 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료 내 목적 단백질의 질량 분석을 위한 기질(matrix) 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 반추동물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 목적 단백질의 질량 분석은 펩타이드-MRM(multiple reaction monitoring)이며, 상기 반추동물은 염소(goat)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 목적 단백질의 질량 분석은 단백질-MRM이며, 상기 반추동물은 소(bovine)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 비-인간 동물의 혈청 내 단백질을 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료 내 목적 단백질의 질량 분석을 위한 내부표준물질(internal standard, IS) 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 비-인간 동물은 반추동물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 반추동물은 염소(goat) 또는 소(bovine)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 질량분석은 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight), SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight), ESI-TOF(Electrospray ionisation time-of-flight), MRM(Multiple Reaction Monitoring), QqQ MS(Triple Quadrupole Mass Spectrometry), 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 및 LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 질량분석 방법을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
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