KR20240003755A - 인간 FcγRs 결합력이 제거된 당화 Fc 변이체들 - Google Patents
인간 FcγRs 결합력이 제거된 당화 Fc 변이체들 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240003755A KR20240003755A KR1020230077425A KR20230077425A KR20240003755A KR 20240003755 A KR20240003755 A KR 20240003755A KR 1020230077425 A KR1020230077425 A KR 1020230077425A KR 20230077425 A KR20230077425 A KR 20230077425A KR 20240003755 A KR20240003755 A KR 20240003755A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antibody
- human antibody
- agent
- variants
- domain variant
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 100
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 47
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 43
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 32
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 24
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 23
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 23
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 12
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 8
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 claims description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 7
- -1 CD73 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 4
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- UGJMXCAKCUNAIE-UHFFFAOYSA-N Gabapentin Chemical compound OC(=O)CC1(CN)CCCCC1 UGJMXCAKCUNAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 claims description 4
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 4
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims description 4
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 claims description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 claims description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 claims description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 2
- 229940127272 CD73 inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012275 CTLA-4 inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710083479 Hepatitis A virus cellular receptor 2 homolog Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 2
- 229940125563 LAG3 inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 2
- 229940126547 T-cell immunoglobulin mucin-3 Drugs 0.000 claims description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 claims description 2
- NAVMQTYZDKMPEU-UHFFFAOYSA-N Targretin Chemical compound CC1=CC(C(CCC2(C)C)(C)C)=C2C=C1C(=C)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 NAVMQTYZDKMPEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940070021 anabolic steroids Drugs 0.000 claims description 2
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 claims description 2
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940124675 anti-cancer drug Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003092 anti-cytokine Effects 0.000 claims description 2
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940005529 antipsychotics Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 claims description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 229940125388 beta agonist Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002938 bexarotene Drugs 0.000 claims description 2
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 claims description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002842 clobetasol Drugs 0.000 claims description 2
- CBGUOGMQLZIXBE-XGQKBEPLSA-N clobetasol propionate Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CCl)(OC(=O)CC)[C@@]1(C)C[C@@H]2O CBGUOGMQLZIXBE-XGQKBEPLSA-N 0.000 claims description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 claims description 2
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims description 2
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 2
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 2
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 claims description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002870 gabapentin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 claims description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 2
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 2
- 229940035363 muscle relaxants Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003158 myorelaxant agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000004081 narcotic agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000842 neuromuscular blocking agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 claims description 2
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 claims description 2
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 claims description 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003452 romidepsin Drugs 0.000 claims description 2
- OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N romidepsin Chemical compound O1C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H]2CSSCC\C=C\[C@@H]1CC(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N 0.000 claims description 2
- OHRURASPPZQGQM-UHFFFAOYSA-N romidepsin Natural products O1C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(=CC)NC(=O)C2CSSCCC=CC1CC(=O)NC(C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010091666 romidepsin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940125723 sedative agent Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims description 2
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 claims description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 claims description 2
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005294 triamcinolone Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000237 vorinostat Drugs 0.000 claims description 2
- WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N vorinostat Chemical compound ONC(=O)CCCCCCC(=O)NC1=CC=CC=C1 WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 abstract description 19
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 abstract description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 10
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 abstract description 3
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 abstract description 2
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 83
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 39
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 30
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 18
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 15
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 9
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 8
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 3
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 2
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical group N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 2
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical class C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VQHRZZISQVWPLK-UIRGBLDSSA-N (7s,9s)-7-[(2r,4s,5s,6s)-5-[(2s,4s,5s,6s)-4-amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6,9,11-trihydroxy-9-(2-hydroxyacetyl)-8,10-dihydro-7h-tetracene-5,12-dione Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)C[C@H](O[C@@H]2C3=C(O)C=4C(=O)C5=CC=CC=C5C(=O)C=4C(O)=C3C[C@](O)(C2)C(=O)CO)O[C@H]1C VQHRZZISQVWPLK-UIRGBLDSSA-N 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006143 Brain stem glioma Diseases 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023073 Calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010007953 Central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000180278 Copernicia prunifera Species 0.000 description 1
- 235000010919 Copernicia prunifera Nutrition 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000012624 DNA alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000001976 Endocrine Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000611643 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010092555 Large-Conductance Calcium-Activated Potassium Channels Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101000917859 Macaca fascicularis Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000005746 Pituitary adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061538 Pituitary tumour benign Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100040714 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A Human genes 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023915 Ureteral Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046392 Ureteric cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000003761 Vaginal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124691 antibody therapeutics Drugs 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 229940097217 cardiac glycoside Drugs 0.000 description 1
- 239000002368 cardiac glycoside Substances 0.000 description 1
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940121420 cemiplimab Drugs 0.000 description 1
- 201000007455 central nervous system cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000025997 central nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 201000001343 fallopian tube carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000010453 lymph node cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 208000029559 malignant endocrine neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 description 1
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N ouabain Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@]2(O)CC[C@H]3[C@@]4(O)CC[C@H](C=5COC(=O)C=5)[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@@H]3[C@@]2(CO)[C@H](O)C1 LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 208000021310 pituitary gland adenoma Diseases 0.000 description 1
- 229960004403 pixantrone Drugs 0.000 description 1
- PEZPMAYDXJQYRV-UHFFFAOYSA-N pixantrone Chemical compound O=C1C2=CN=CC=C2C(=O)C2=C1C(NCCN)=CC=C2NCCN PEZPMAYDXJQYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 235000019814 powdered cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003124 powdered cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 208000016800 primary central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 229950000615 sabarubicin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 206010062261 spinal cord neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 229930002534 steroid glycoside Natural products 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229960000653 valrubicin Drugs 0.000 description 1
- ZOCKGBMQLCSHFP-KQRAQHLDSA-N valrubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@](CC2=C(O)C=3C(=O)C4=CC=CC(OC)=C4C(=O)C=3C(O)=C21)(O)C(=O)COC(=O)CCCC)[C@H]1C[C@H](NC(=O)C(F)(F)F)[C@H](O)[C@H](C)O1 ZOCKGBMQLCSHFP-KQRAQHLDSA-N 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004916 vulva carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000013013 vulvar carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 표적 하는 항원에 대해 항체의 목표에서 벗어난 독성(off-target toxicity)을 최소화하기 위한, 인간 FcγRs에 대한 결합력이 제거된 당화 Fc 변이체들에 관한 것으로, 인간의 당 프로파일과 매우 유사한 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 이용하여 발굴한 본 발명의 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체들은 야생형 인간 항체 Fc 도메인 및 종래의 S228P 또는 S228P/L235E 변이체보다 Fc 감마 수용체들과의 결합이 현저히 감소하였으며, pH 의존적 FcRn 결합력 및 열 안정성은 유지하면서 모든 FcγRs에 대한 결합력이 완전히 제거된 변이체들이므로, 치료용 단백질 의약품의 독성을 줄이고 효능을 높이기 위한 용도 및 진단/연구용 물질의 반감기를 유지하고 표적 독성을 제거하기 위한 용도로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 표적 하는 항원에 대해 항체의 목표에서 벗어난 독성(off-target toxicity)을 최소화할 수 있는 기술에 관한 것으로, 인간 FcγRs에 대한 결합력이 제거된 당화 Fc 변이체들에 대한 것이다.
단백질 치료제들은 질병 타깃들에 아주 높은 특이성과 낮은 부작용과 독성을 보이기 때문에 비특이적인 저분자 화합물 치료제들을 아주 빠른 속도로 대체하여 임상에서 널리 이용되고 있으며, 현재 임상에 이용되고 있는 단백질 치료제들 중 항체 치료제들과 항체 Fc 영역을 융합된 Fc-융합 단백질 치료제들이 주종을 이루고 있다. 치료용 항체는 기존의 저분자 약물에 비해 타깃에 매우 높은 특이성을 보이며, 생체 독성이 낮고 부작용이 적을 뿐만 아니라, 약 3주의 우수한 혈중 반감기를 가지기 때문에 가장 효과적인 암 치료방법 중의 하나로 여겨지고 있다. 실제로 전 세계의 거대 제약회사들과 연구소들에서 암 발병 원인인자를 비롯한 암세포에 특이적으로 결합하여 효과적으로 제거하는 치료용 항체의 연구 개발에 박차를 가하고 있다. 치료용 항체 의약품 개발 기업으로는 로슈, 암젠, 존슨앤존슨, 애보트, 비엠에스 등의 제약 기업이 주를 이루고 있으며, 특히 로슈는 항암 치료 목적의 허셉틴 (Herceptin), 아바스틴 (Avastin), 리툭산 (Rituxan) 등이 대표적 상품으로 이 세 가지 치료용 항체로 2012년 세계시장에서 약 195억 달러의 매출을 달성하는 등 큰 이윤을 창출하고 있을 뿐 아니라, 세계의 항체 의약품 시장을 이끌고 있다. 레미케이드(Remicade)를 개발한 존슨앤존슨 역시 매출의 증가로 세계 항체 시장에서 빠르게 성장해나가고 있으며, 애보트와 비엠에스 등의 제약 기업 역시 개발 막바지 단계의 치료용 항체를 다수 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따른 결과로 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약 시장에서 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 바이오 의약품이 빠르게 그 자리를 대체해 나가고 있다. 항체는 체액성 및 세포성 면역계 사이의 연결고리를 제공하며, 항체의 Fab 영역이 항원을 인식하는 반면, Fc 도메인 부분은 모든 면역 적격 세포에 의해 차별적으로 발현되는 세포 상의 항체(면역글로불린)에 대한 수용체 (Fc 수용체 또는 FcR)에 결합하며, 결합하는 면역세포 표면에 발현된 FcγR의 종류에 따라 다른 기작을 가진다. 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위가 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합함으로써 Fc 영역을 통해 항체가 세포 표면 상의 Fc 수용체에 결합하면 항체-코팅 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 살세포에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해 (항체-의존적 세포-매개 세포독성, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity 또는 ADCC), 염증 매개체의 방출, 태반 이동 및 면역글로불린 생성의 제어를 포함하여 중요하고도 다양한 여러 생물학적 반응을 촉발한다 (Deo, Y.M. et al., Immunol. Today 18(3):127-135 (1997)). 이와 같이, Fc 도메인은 면역세포의 모집과 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 및 ADCP(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)에 결정적인 역할을 하며, 특히, 항체의 작용기 기능(effector function)인 ADCC 및 ADCP 기능은 많은 세포의 표면에 존재하는 Fc 수용체와의 상호작용에 의존한다. 사람의 Fc 수용체는 5가지로 분류되며, 항체가 어떠한 Fc 수용체에 결합되는지에 따라 모집되는 면역세포의 종류가 결정된다. 예를 들어, 항체의 Fc 도메인이 FcγRⅢa와 결합하여 ADCC, FcγRI 또는 FcγRⅡa와 결합하여 ADCP, 그리고 C1q와 결합하여 CDC(complement dependent cytotoxicity)의 작용기 기능을 유발하여 Fab 영역에 결합한 표적 항원으로 독성을 가짐으로써 치료용 항체의 주요한 치료 효과를 담당한다.
그러나, 치료학적 맥락에서, 항체의 작용기 기능은 종종 바람직하지 않으며, 숙주 면역 방어를 활성화시킴으로써 안전성 문제 및 원치 않는 부작용을 일으킬 수 있다. 이의 예로, 면역세포와 결합하는 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitor), 면역세포 유도 이중 항체(Bispecific immune cell engager)와 같은 일부 치료용 항체들은 표적하고 있는 면역세포로 면역 작용기작이 나타나 면역세포가 파괴되는 부작용을 가지는 문제가 있어왔다. T-세포와 같이 면역세포 표면에 발현된 면역관문 단백질을 표적하는 면역관문억제제는 Fc 매개 면역 작용기작으로 인해 면역 반응 활성화로 암세포를 제거해야 할 면역세포가 파괴되는 부작용을 가져 항체의 본래 효과를 낮추는 단점이 있다. 또한, 한쪽에는 암세포 표면의 항원과 결합하고, 다른 한쪽은 면역세포와 결합하는 항체 치료제로 면역세포를 암세포로 이끌어서 보다 효과적으로 암세포가 제거할 수 있도록 작용하는 항체 치료제인 면역세포 유도 이중 항체는 해당 항체에 Fc 매개 면역 작용기작이 존재할 경우 면역세포가 파괴되어 암세포를 효과적으로 제거하지 못하여 부작용이 나타난다. 또한, 표적 세포에 결합하여 세포의 활성화를 유도하는 작용제 항체나 표적 항원과 리간드의 상호작용을 막는 길항제 항체도 Fc 매개 면역 작용기작으로 인해 표적 세포 및 항원에 독성을 가지게 되어 항체의 본래 효과를 낮추는 문제점이 있다. 아울러, 치료용 또는 진단, 연구용 목적에 따라 단백질이나 화학물과 같은 활성 물질의 반감기를 증가시키고자 Fc 영역을 융합한 Fc-융합 단백질을 개발할 때 Fc 매개 면역 작용기작으로 인한 독성이 나타나는 문제가 있다.
따라서, 항체의 면역 작용기작으로 인한 항체의 목표에서 벗어난 독성(off-target toxicity)을 막고 효과적인 항체 치료 효과를 가지기 위해서는 Fc 매개 면역 작용기작이 제거되는 것이 필수적이다. 이를 위해 항체를 개발할 때 인간 IgG 하위분류 중 FcγR와 가장 결합력이 낮아 매우 낮은 면역 작용기작을 가지는 IgG2 항체가 고려되나, IgG2 항체는 힌지(hinge) 영역의 이황화 결합 교환(exchange)으로 인해 여러 알로타입(allotype)들이 존재하고, 안정성 감소로 인한 응집(aggregation)이 발생하는 물성 문제가 존재하므로, 그 다음으로 결합력이 낮은 IgG4 항체가 고려되어 현재 임상 개발에 사용 중이다. 이와 관련하여, T-세포에 발현된 면역관문 단백질 PD-1(Programmed cell death-1)을 표적 하는 항-PD-1 항체 (Merck & Co.사의 pembrolizumab(Keytruda), Bristol-Myers Squibb사의 nivolumab(Opdivo), Regeneron사의 cemiplimab(Libtayo))는 모두 인간 IgG4 항체 형태로 FDA 승인을 받아 임상에서 많은 수요를 통해 사용되고 있으며, 펨브로리주맙(pembrolizumab)은 다양한 암 종류에 대해 임상 허가를 받아 2020년 기준 전 세계 의약품 매출 2위로 143억 달러의 매출을 냈고, 니볼루맙(nivolumab)은 8위로 79억 달러의 매출을 냈다. 하지만, IgG4 항체도 모든 FcγRs에 대해 결합력을 가지며, 특히 FcγRI에 대해 수 nM의 강한 결합력을 가지고 있어 다양한 면역 작용기작이 활성화되는 문제가 있어, 항체의 면역 작용기작으로 인해 표적 세포가 파괴되는 것을 방지하기 위해 FcγRs에 대한 결합력이 제거된 Fc가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 작용기 기능이 감소된 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 항체 치료제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 인간 항체 Fc 도메인 변이체의 제조방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 작용기 기능이 감소된 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 작용기 기능이 감소된 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 치료제에 접합된 항체 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 Fc 도메인 변이체, 상기항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편, 또는 상기 항체 치료제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체 Fc 도메인 변이체의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 작용기 기능이 감소된 항체의 제조방법을 제공한다.
인간의 당 프로파일과 매우 유사한 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 이용하여 발굴한 본 발명의 신규한 인간 항체 Fc 도메인 변이체들은 야생형 인간 항체 Fc 도메인 및 종래의 S228P 또는 S228P/L235E 변이체보다 Fc 감마 수용체들과의 결합이 현저히 감소하였으며, pH 의존적 FcRn 결합력 및 열 안정성은 유지하면서 모든 FcγRs에 대한 결합력이 완전히 제거된 변이체들이므로, 치료용 단백질 의약품의 독성을 줄이고 효능을 높이기 위한 용도 및 진단/연구용 물질의 반감기를 유지하고 표적 독성을 제거하기 위한 용도로 활용될 수 있다.
도 1은 당화 Fc의 포유류 세포 디스플레이 기술에 대한 개략도이다.
도 2는 정제된 사합체 FcγRI-스트렙타비딘, 사합체 FcγRⅢa-158V-스트렙타비딘, FcγRI-GST, FcγRⅡa-131H-GST, FcγRⅡa-131R-GST, FcγRⅡb-GST, FcγRⅢa-158V-GST, FcγRⅢa-158F-GST 및 FcRn-GST의 발현 및 정제 후 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 형광 표지된 사합체 FcγRI-Alexa647, 사합체 FcγRⅢa-Alexa647 및 Protein A-FITC의 CHO 세포 발현 야생형 Fc와의 결합 활성을 분석한 결과이다.
도 4는 당화 Fc 엔지니어링을 위한 site-directed mutation 라이브러리의 개략도이다.
도 5는 CHO 세포 디스플레이를 이용한 당화 Fc 엔지니어링 모식도 및 스크리닝 결과 확보한 당화 Fc 변이체의 돌연변이들의 빈도를 나타낸 결과이다.
도 6은 선별한 당화 Fc 변이체들 (SL001, SL002, SL003, SL004, SL005, SL006, SL007 및 SL008)을 정제한 후 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 선별한 당화 Fc 변이체들 (SL001, SL002, SL003, SL004, SL005, SL006, SL007 및 SL008)을 각각 도입한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 FcγRI 및 FcγRⅢa-158V에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 8은 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 Fc 변이체들을 각각 포함하는 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)을 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 9는 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 FcγRI, FcγRⅡa-131H, FcγRⅡa-131R, FcγRⅡb, FcγRⅢa-158V 및 FcγRⅢa-158F에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 10은 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 C1q와의 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 11은 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 FcRn에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 12는 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 열 안정성을 DSF로 분석한 결과이다.
도 13은 본 발명에서 선별한 당화 Fc 변이체들 (EC 및 FG), 이들의 조합 당화 Fc 변이체 (ECFG) 및 재조합 당화 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)을 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 다양한 인간 FcγR에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 C1q와의 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 16은 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 FcRn에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 17은 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 열 안정성을 DSF로 분석한 결과이다.
도 18은 정제된 뮤린(murine) FcγRI-GST, 뮤린 FcγRIIb-GST, 뮤린 FcγRIII-GST, 뮤린 FcγRIV-GST, 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey) FcγRI-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIa-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIb-GST 및 사이노몰거스 원숭이 FcγRIII-GST의 발현 및 정제 후 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 다양한 뮤린 FcγR에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 20은 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 다양한 사이노몰거스 원숭이 FcγR에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 2는 정제된 사합체 FcγRI-스트렙타비딘, 사합체 FcγRⅢa-158V-스트렙타비딘, FcγRI-GST, FcγRⅡa-131H-GST, FcγRⅡa-131R-GST, FcγRⅡb-GST, FcγRⅢa-158V-GST, FcγRⅢa-158F-GST 및 FcRn-GST의 발현 및 정제 후 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 형광 표지된 사합체 FcγRI-Alexa647, 사합체 FcγRⅢa-Alexa647 및 Protein A-FITC의 CHO 세포 발현 야생형 Fc와의 결합 활성을 분석한 결과이다.
도 4는 당화 Fc 엔지니어링을 위한 site-directed mutation 라이브러리의 개략도이다.
도 5는 CHO 세포 디스플레이를 이용한 당화 Fc 엔지니어링 모식도 및 스크리닝 결과 확보한 당화 Fc 변이체의 돌연변이들의 빈도를 나타낸 결과이다.
도 6은 선별한 당화 Fc 변이체들 (SL001, SL002, SL003, SL004, SL005, SL006, SL007 및 SL008)을 정제한 후 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 선별한 당화 Fc 변이체들 (SL001, SL002, SL003, SL004, SL005, SL006, SL007 및 SL008)을 각각 도입한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 FcγRI 및 FcγRⅢa-158V에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 8은 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 Fc 변이체들을 각각 포함하는 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)을 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 9는 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 FcγRI, FcγRⅡa-131H, FcγRⅡa-131R, FcγRⅡb, FcγRⅢa-158V 및 FcγRⅢa-158F에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 10은 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 C1q와의 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 11은 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 FcRn에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 12는 Fab-arm 교환 현상이 방지된 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 열 안정성을 DSF로 분석한 결과이다.
도 13은 본 발명에서 선별한 당화 Fc 변이체들 (EC 및 FG), 이들의 조합 당화 Fc 변이체 (ECFG) 및 재조합 당화 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)을 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 다양한 인간 FcγR에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 C1q와의 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 16은 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 FcRn에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 17은 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 열 안정성을 DSF로 분석한 결과이다.
도 18은 정제된 뮤린(murine) FcγRI-GST, 뮤린 FcγRIIb-GST, 뮤린 FcγRIII-GST, 뮤린 FcγRIV-GST, 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey) FcγRI-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIa-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIb-GST 및 사이노몰거스 원숭이 FcγRIII-GST의 발현 및 정제 후 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 다양한 뮤린 FcγR에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 20은 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)의 다양한 사이노몰거스 원숭이 FcγR에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:
알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.
일 측면에서, 본 발명은 야생형(Wild type) 인간 항체 Fc 도메인에서, 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따라 넘버링된 228, 233, 234, 309 및 402 위치의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 위치의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 S228P, E233C, E233P, E233G, F234G, F234T, F234R, L309P 및 G402D로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 E233C 및/또는 F234G의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 S228P 및 E233C의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SPEC일 수 있으며, 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SPEC은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 S228P 및 F234G의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SPFG일 수 있으며, 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SPFG은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 서열번호 4의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 E233C 및 F234G의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 ECFG일 수 있으며, 인간 항체 Fc 도메인 변이체 ECFG은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 S228P, E233C 및 F234G의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SPECFG일 수 있으며, 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SPECFG는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 서열번호 8의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 E233C의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL001일 수 있으며, 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL001는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 서열번호 10의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 E233P의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL002일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 E233G의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL003일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 E233G 및 L309P의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL004일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F234G 및 G402D의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL006일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F234T의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL007일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F234R의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL008일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 F234G의 아미노산 치환을 포함하는 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL005일 수 있으며, 인간 항체 Fc 도메인 변이체 SL005는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 서열번호 12의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 인간 항체 (면역글로불린)는 IgA, IgM, IgE, IgD 또는 IgG, 또는 이들의 변형일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있고, IgG4인 것이 더욱 바람직하고, 항-PD 항체인 것이 더욱 바람직하고, 펨브로리주맙일 수 있다.
일 구현예에서, 인간 항체 (면역글로불린)는 IgG4 또는 이의 변형일 수 있으며, hinge, CH2 및 CH3를 포함하는 야생형 IgG4의 Fc 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 서열번호 14의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 변이체들은 인간 항체 IgG4 Fc 도메인, 또는 종래의 S228P의 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 Fc 도메인 변이체에서, 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따라 넘버링된 233 및/또는 234 위치의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 추가로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, S228P의 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 Fc 도메인 변이체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 서열번호 16의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, S228P 및 L235E의 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 Fc 도메인 변이체는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 서열번호 18의 염기 서열을 포함하는 핵산분자로 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 항체 Fc 도메인에 비해 Fc 감마 수용체(FcγRs)와의 결합력이 감소될 수 있으며, Fc 감마 수용체는 FcγRI, FcγRⅡa, FcγRⅡb 또는 FcγRⅢa일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 항체 Fc 도메인에 비해 C1q와의 결합력이 감소될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 항체 Fc 도메인에 비해 작용기 기능(effector function)이 감소될 수 있다.
일 구현예에서, 작용기 기능은 C1q-결합, 보체 활성화, 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC), 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), Fc-감마 수용체 결합을 포함하는 Fc-수용체 결합, 단백질 A-결합, 단백질 G-결합, 항체-의존적 세포성 포식작용(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP), 보체-의존적 세포성 세포독성(complement dependent cell-mediated cytotoxicity, CDCC), 보체-증강 세포독성, 옵소닌화, Fc-함유 폴리펩티드 내재화, 표적 하향조정, ADC 흡수, 아폽토시스의 유도, 세포 사멸, 세포 주기 정지, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 Fc-매개된 작용기 기능일 수 있으며, ADCC 또는 CDC인 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체는 야생형 인간 항체 Fc 도메인과 유사한 정도의 pH-의존적 FcRn 결합 친화력을 가져 야생형 인간 항체 Fc 도메인과 유사한 정도의 생체 내 반감기(Half-life) 및 열 안정성을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인 변이체들은 결합하는 세포를 사멸시키지 않기 위한 목적에 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인 변이체들은 면역세포 혹은 정상세포를 표적화하는 항체에 적용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인 변이체들은 면역관문억제 항체(Immune checkpoint inhibitor antibody) 또는 면역세포 유도 이중 항체(Bispecific Immune cell engaging bispecific antibody)에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 인간 항체 Fc 영역에서 아미노산의 변이를 포함하는 변이체는 모 항체 Fc 영역을 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의되고, 통상의 항체 넘버링은 카밧에 의한 EU 인덱스에 따른다 (Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991).
본 발명에서 사용된, 용어 "Fc 도메인 변이체"는 "Fc 변이체"와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "야생형 (wild-type) 폴리펩타이드"는 후에 변형되어 유도체를 생산하는 비변형 폴리 펩타이드를 의미한다. 야생형 폴리펩타이드는 자연에서 발견되는 폴리펩타이드 또는 자연에서 발견되는 폴리펩타이드의 유도체 또는 조작된 것일 수 있다. 야생형 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 그 자체, 상기 야생형 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 이를 코딩하는 아미노산 서열을 언급하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 용어 "야생형 항체"는 아미노산 잔기가 변형되어 유도체를 생성하게 되는 비변형된 항체 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 용어와 호환적으로, 아미노산 변형이 도입되어 유도체를 생성하게 되는 비변형된 항체 폴리펩타이드를 의미하는 "모(parent) 항체"이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "아미노산 변형/변이"는 폴리펩타이드 서열의 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실, 바람직하게는 치환을 의미한다. 본 발명에서 사용된, 용어 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 야생형 인간 항체 Fc 도메인의 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서의 아미노산이 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 예를 들면, S228P 치환을 포함하는 Fc 변이체는 야생형 항체의 Fc 도메인의 아미노산 서열에서 228번째 아미노산 잔기인 세린이 프롤린으로 대체된 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "Fc 변이체"는 야생형 항체 Fc 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 Fc 변이체는 야생형 항체 Fc 도메인 (영역 또는 단편)과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하며, 그로 인해 아미노산 서열에 있어 차이를 갖는다. 본 발명에 따른 Fc 변이체의 아미노산 서열은 야생형 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열과 실질적으로 상동하다. 예를 들면, 본 발명에 따른 Fc 변이체의 아미노산 서열은 야생형 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열과 비교하여 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 가질 것이다. 아미노산 변형은 분자생물학적 방법을 사용하여 유전적으로 수행될 수 있거나, 또는 효소적 또는 화학적 방법을 이용하여 수행될 수도 있다.
본 발명의 Fc 변이체는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 따른 인간 항체의 Fc 변이체는 특정 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩타이드 서열을 코딩한 후, 원하는 경우, 숙주세포 내로 클로닝되고, 발현 및 검정되는 핵산 형성에 이용된다. 이를 위한 다양한 방법이 문헌 (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed., Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons)에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 Fc 변이체를 코딩하는 핵산은 단백질 발현을 위해 발현벡터에 삽입될 수 있다. 발현벡터는, 통상 조절 또는 제어(regulatory) 서열, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소와 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 관계에 놓인 단백질을 포함한다. 적절한 상태에서, 핵산으로 형질전환된 숙주세포, 바람직하게는, 본 발명에 따른 Fc 변이체를 코딩하는 핵산 함유 발현벡터를 배양하여 단백질 발현을 유도하는 방법에 의해 본 발명에 따른 Fc 변이체가 생산될 수 있다. 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 및 효모를 포함하는 다양한 적절한 숙주세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 생산비가 저렴하여 산업적 이용가치가 높은 대장균을 숙주세포로 하여 본 발명에 따른 Fc 변이체를 생산한다.
따라서, 본 발명의 범위에는 Fc 변이체를 코딩하는 핵산이 도입된 숙주세포를 단백질 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 숙주세포로부터 발현된 Fc 변이체를 정제 또는 분리하는 단계를 포함하는 Fc 변이체의 제조방법이 포함된다.
본 발명에서 사용된, 용어 "FcRn" 또는 "신생아 Fc 수용체"는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질을 의미하며, 이는 적어도 부분적으로는 FcRn 유전자에 의해 코딩된다. 상기 FcRn은, 이로 제한하는 것은 아니나, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하는 임의의 유기체 유래일 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 기능적 FcRn 단백질은 종종 경쇄 및 중쇄로 불리는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린 (β-2-microglobulin)이며, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 코딩된다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, FcRn 또는 하나의 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 언급하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 FcγRs에 대한 결합력이 제거되어, 야생형 인간 항체에 비해 Fc 감마 수용체(FcγRs) 또는 C1q와의 결합력이 감소될 수 있다.
일 구현예에서, Fc 감마 수용체(FcγR)는 FcγRI, FcγRⅡa, FcγRⅡb 또는 FcγRⅢa일 수 있으며, 인간 FcγR, 뮤린(murine) FcγR 또는 원숭이 FcγR일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 인간 FcγR는 FcγRI, FcγRⅡa, FcγRⅡb 또는 FcγRⅢa일 수 있으며, 상기 FcγRⅢa는 FcγRⅢa-158V 또는 FcγRⅢa-158F일 수 있고; 뮤린 FcγR는 뮤린 FcγRI, 뮤린 FcγRⅡIb, 뮤린 FcγRⅢ 또는 뮤린 FcγⅣ일 수 있으며; 및 원숭이 FcγR는 사이노몰거스 원숭이 FcγRI, 원숭이 FcγRⅡa, 원숭이 FcγRⅡb 또는 원숭이 FcγRⅢ일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 야생형 인간 항체에 비해 작용기 기능이 감소될 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체일 수 있으며, 면역학적 활성을 가진 단편은 상기 항체의 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편 또는 디아바디(diabody)일 수 있다.
항체는 당해 기술분야에서 공지된 다양한 방법으로 분리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제방법은 크로마토그래피 기술, 전기영동, 면역, 침강, 투석, 여과, 농축, 및 크로마토포커싱 (chromatofocusing) 기술을 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어 박테리아 단백질 A, G, 및 L과 같은 다양한 천연 단백질이 항체와 결합하며, 상기 단백질은 정제에 이용될 수 있다. 종종, 특정 융합 파트너에 의한 정제가 가능할 수 있다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 이들의 면역학적 활성을 가진 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다.
상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 생체에서 분리된 (생체에 존재하지 않는) 것 또는 비자연적으로 생산(non-naturally occurring)된 것일 수 있으며, 예컨대, 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.
본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 자연적 또는 비자연적(예컨대, 합성적 또는 재조합적)으로 얻어질 수 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 발명에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1 , CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명에서 용어, "Fc 도메인", "Fc 단편" 또는 "Fc 영역"은 Fab 도메인/단편과 함께 항체를 이루며, Fab 도메인/단편은 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과, 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어지고, Fc 도메인/단편은 중쇄의 두 번째 불변 영역(CH2) 및 세 번째 불변 영역(CH3)로 이루어진다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. 단리된 핵산은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 이를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 핵산 분자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.
본 발명에 따른 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 단백질 발현을 위해 발현벡터에 삽입될 수 있다. 발현벡터는, 통상 조절 또는 제어 (regulatory) 서열, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소와 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 관계에 놓인 단백질을 포함한다. 적절한 상태에서, 핵산으로 형질전환된 숙주세포, 바람직하게는, 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자 함유 발현벡터를 배양하여 단백질 발현을 유도하는 방법에 의해 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 생산될 수 있다. 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 및 효모를 포함하는 다양한 적절한 숙주세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 생산비가 저렴하여 산업적 이용가치가 높은 대장균을 숙주세포로 생산할 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
일 구현예에서, 상기 벡터의 제작 시, 상기 Fc 도메인 변이체, 또는 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 박테리아 또는 동물세포일 수 있으며, 동물 세포주는 CHO 세포, HEK 세포 또는 NSO 세포일 수 있고, 박테리아는 대장균일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Fc 도메인 변이체, 또는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 화물 분자에 연결된 융합 단백질에 관한 것이다.
일 구현예에서, 화물 분자는 검출제, 치료제, 약물, 펩티드, 성장 인자, 시토카인, 수용체 트랩, 화학 화합물, 탄수화물 모이어티, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기재 분자, 바이러스 벡터, 또는 세포독성제; 검출제, 치료제, 약물, 펩티드, 효소, 항체 또는 그의 단편, DNA-기재 분자, 바이러스 벡터, 또는 세포독성제가 로딩된 1종 이상의 리포솜 또는 나노운반체; 또는 1종 이상의 나노입자, 나노와이어, 나노튜브, 또는 양자점일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 융합 단백질은 작용제(agonist) 항체, 길항제(antagonist) 항체 또는 항체 치료제일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 하나 이상의 치료제에 접합된 항체 치료제에 관한 것이다.
일 구현예에서, 항체 치료제는 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitor) 또는 면역세포 유도 이중 항체(Bispecific immune cell engager)일 수 있으며, 감소된 작용기 기능을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 치료제는 키메라 항원 수용체(CAR) 세포 치료제, 종양세포붕괴성 약물(oncolytic drug), 면역요법제, 세포 독성제, 혈관신생 억제제, 키나아제 억제제, 공자극 분자 차단제, 부착 분자 차단제, 항-사이토카인 제제, 항-CTLA-4 제제, 항-PD-1 제제, 항-PD-L1 제제, 항-PD-L2 제제, TNF-α 교차-결합 제제, TRAIL 교차-결합 제제, 항-CD27 제제, 항-CD30 제제, 항-CD40 제제, 항-4-1BB 제제, 항-GITR 제제, 항-OX40 제제, 항-TRAILR1 제제, 항-TRAILR2 제제, 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론, 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 가바펜틴, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출 가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID: non-steroid anti-inflammatory drug), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 단백 동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 정신병 치료제, 각성제, 천식약, 베타 아고니스트, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 이의 유사체, 사이토카인, 사이토카인 길항제, PD-1 길항제, 아데노신 A2AR 길항제, CD73 저해제, CTLA-4 저해제, TIM-3 저해제, LAG-3 저해제, 안트라사이클린 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체, 이를 포함하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편, 또는 이를 포함하는 항체 치료제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역원성 세포사멸 유도제를 추가로 포함할 수 있으며, 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycin), 미토잔트론(mitoxantrone) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin) 또는 발루비신(valrubicin)일 수 있고, 탁산계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 생물학적 요법, 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암을 치료할 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 화학적 항암 약물(항암제) 등과 함께 투여함으로써, 암세포의 사멸 효과를 통해 종래의 항암제의 암치료 효과를 증가시킬 수 있다. 병용 투여는 상기 항암제와 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 상기 항암제의 예시에는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 플리카마이신(plicamycin) 및 마이토마이신 C(mitomycin C); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan) 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 암세포의 사멸 또는 암의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 조성물의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 본 발명의 인간 항체 Fc 도메인 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 b) 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체의 제조방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 b) 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계를 포함하는 작용기 기능이 감소된 항체의 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 항체의 정제는 여과, HPLC, 음이온 교환 또는 양이온 교환, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화도 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 하는 것이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 Protein A를 사용하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 당화 Fc 변이체 스크리닝을 위한 포유류 세포 디스플레이 시스템 구축
면역 작용기작을 제거할 수 있는 새로운 당화 Fc 변이체를 발굴하기 위해 Fc 라이브러리를 제작하였다. 구체적으로, 당화 Fc 표유류 세포 표면에 디스플레이하고 안정적으로 스크리닝하기 위해 stable 세포주 제조에 활용되는 FLP-FRT 유전자 재조합(gene recombination) 시스템을 활용하였으며, 세포막에 디스플레이 하기 위해 Fc의 C-말단에 PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor) 막관통(transmembrane) 도메인을 융합하였다. Fc-PDGFR 유전자는 FRT 위치(site)가 삽입되어 있는 pcDNA5/FRT 플라스미드 (Invitrogen, V601020)에 클로닝하여 준비하였다. 해당 플라스미드는 유전자 재조합을 일으키는 효소인 FLP를 발현하는 pOG44플라스미드 (Invitrogen, V600520)와 함께 FRT 위치가 삽입된 CHO 세포 (Invitrogen, R75807)에 co-트랜스팩션(transfection)하여 유전자 재조합을 유도함으로써 CHO 세포의 염색체(chromosomal) DNA에 Fc-PDGFR DNA가 인테그레이션(integration)되어 당화 Fc를 안정적으로 발현하는 CHO 세포주를 제작하였다 (도 1). 이 때 트랜스팩션 후 유전자 인테그레이션이 일어난 CHO 세포들만 선별하기 위해 하이그로마이신(hygromycin)-B 저항성 유전자를 함께 인테그레이션되도록 하였으며, 500 μg/ml의 하이그로마이신-B (Invitrogen, 10687010)을 처리함으로써 당화 Fc 안정적 발현 CHO 세포주를 선별 및 제조하였다.
실시예 2. FcγRs 발현 및 정제
상기 실시예 1에서 확립된 당화 Fc의 CHO 세포 디스플레이 시스템 및 Fc 라이브러리 안정적 발현 세포주(stable 세포주)를 FACS 스크리닝하기 위해 인간 FcγRs 중에서 가장 결합력이 높은 FcγRI 및 면역 작용기작 중 ADCC에 관여하는 FcγRⅢa에 대한 결합력을 제거하고자 FcγRI과 FcγRⅢa를 생산하였다. 구체적으로, Fc와의 가시적 결합 친화도를 향상시켜 효율적인 FACS 스크리닝이 가능하도록 각 수용체의 C-말단에 스트렙타비딘을 융합하여 사합체(tetrameric) FcγRI-스트렙타비딘-His 및 사합체 FcγRⅢa-158V-스트렙타비딘-His를 제조하였다. 또한, 발굴한 당화 Fc 변이체들의 FcγRs에 대한 결합력을 ELISA로 분석하기 위해 필요한 FcγRI-GST, FcγRⅡa-131H-GST, FcγRⅡa-131R-GST, FcγRⅡb-GST, FcγRⅢa-158V-GST 및 FcγRⅢa-158F-GST를 제조하여 생산하였다. 또한, 항체의 생체 내 반감기에 관여하는 FcRn 결합력을 분석하기 위해 필요한 FcRn-GST를 제조하여 생산하였다. 상기에서 생산한 각각의 단백질들을 동물세포 발현용 벡터에 클로닝한 후 PEI를 이용해 Expi293F 세포에 트랜스펙션하고, 37℃, 125 rpm 및 8% CO2 조건에서 7일간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 상등액을 회수하여 PBS로 평형을 맞추고 Ni-NTA(Anti-His) 또는 항-GST 친화도 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE 젤로 확인하였다. 그 결과, 고순도의 사합체 FcγRI-스트렙타비딘, 사합체 FcγRⅢa-158V-스트렙타비딘, FcγRI-GST, FcγRⅡa-131H-GST, FcγRⅡa-131R-GST, FcγRⅡb-GST, FcγRⅢa-158V-GST, FcγRⅢa-158F-GST 및 FcRn-GST가 정제되었음을 확인하였다 (도 2).
실시예 3. FcγRs의 표지 및 검증
생산한 단백질들 중 FACS 스크리닝을 위해 준비한 사합체 FcγRI-스트렙타비딘 및 사합체 FcγRⅢa-스트렙타비딘을 Alexa647 (Invitrogen, A20173) 형광 dye를 표지하여, 이에 결합하는 Fc 변이체들을 분리하기 위한 선별(sorting)이 가능하도록 준비하였으며, 디스플레이된 Fc 변이체들의 발현 여부 및 레벨을 확인하기 위해 FcγRs와 결합부위가 겹치지 않는 Protein A (Amicogen, 1070020)에 FITC(Invitrogen, F6434)를 컨쥬게이션(conjugation)하여 준비하였다. 형광 dye들 (Alexa647 및 FITC)의 컨쥬게이션은 각각의 제조사에서 제공한 메뉴얼에 따라 수행하였다. 이를 통해 형광 표지된 사합체 FcγRI-스트렙타비딘-Alexa647, 사합체 FcγRⅢa-스트렙타비딘-Alexa647 및 Protein A-FITC를 CHO 세포에 디스플레이된 야생형(wild-type) Fc에 결합을 유도한 뒤 활성을 확인하였다. 그 결과, Protein A-FITC 결합에 의한 형광 신호를 통해 Protein A-FITC가 정상적인 활성을 가지며, CHO 세포에 디스플레이된 야생형 Fc가 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다 (도 3). 또한, 사합체 FcγRI-스트렙타비딘-Alexa647 및 사합체 FcγRⅢa-스트렙타비딘-Alexa647 역시 야생형 Fc에 정상적으로 결합하는 것으로 나타나 (도 3), Alexa647 형광 표지된 FcγRI 및 FcγRⅢa 역시 우수한 활성을 가지며, CHO 세포에 디스플레이된 Fc들이 정상적으로 발현되고 각각의 기능을 수행한다는 것을 검증하였다.
실시예 4. CHO 세포 디스플레이를 이용한 FcγRs 결합력 제거 당화 Fc 변이체 라이브러리 구축
확립된 CHO 세포 Fc 디스플레이 시스템을 통해 당화 Fc를 엔지니어링 하고, FcγRs 결합력이 제거된 당화 Fc 변이체를 선별하기 위한 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리는 FcγRs 결합에 매우 중요한 영향을 미치는 Fc의 4가지 영역 (Lower hinge, B/C loop, C'/E loop 및 F/G loop)에서 FcγRs와 결합력이 가장 낮은 IgG2의 아미노산이 FcγRs와 결합하지 않는 것에 중요한 영향을 미칠 것으로 가정하여, IgG2 및 IgG4 서열을 기반으로 기존 돌연변이 위치는 제외하고, 6곳에 돌연변이를 도입하여 FcγRs 결합을 완전히 제거할 수 있는 신규 돌연변이를 발굴하기 위한 라이브러리를 제작하였다 (도 4). 라이브러리 유전자는 상기 실시예 2에서 확립한 Fc 안정적 발현 CHO 세포주 제조 방법과 동일한 방법으로 FLP 발현 플라스미드와 co-트랜스팩션 후 하이그로마이신-B 배지를 통한 선별 과정을 거쳐 당화 Fc 변이체 라이브러리 안정적 발현 CHO 세포주를 제작하였다.
실시예 5. CHO 세포 디스플레이를 이용한 FcγRs 결합력 제거 Fc 변이체 선별
확립된 CHO 세포 Fc 디스플레이 시스템 및 Fc 라이브러리 안정적 발현 CHO 세포주를 이용해 FcγRⅢa 결합력이 제거된 당화 Fc를 선별하기 위해, 라이브러리 안정적 발현 CHO 세포주에 FcγRⅢa-Alexa647 및 Protein A-FITC의 결합을 유도한 뒤, Protein A-FITC에 의한 발현 수준과 제거된 FcγRⅢa 결합을 동시에 모니터링하여 1R의 FACS 선별(sorting)을 수행하였다. 이 후 1R을 거친 라이브러리를 FcγRI 결합력이 제거된 당화 Fc를 선별하기 위해 같은 방법으로 2R의 FACS 선별을 수행하였고, 이와 같은 방법으로 FcγRⅢa-Alexa647 및 Protein A-FITC를 이용한 3R, FcγRI-Alexa647 및 Protein A-FITC를 이용한 4R의 FACS 선별을 수행하였다. 이로써 제거된 FcγRI 결합력 및 FcγRⅢa 결합력을 보일 것으로 예상되는 집단(population)을 선별하였고, 선별된 당화 Fc 변이체 발현 CHO 세포들을 genomic DNA prep을 통해 회수한 뒤, 염기서열을 확인하여 최종적으로 조작된(engineered) 당화 Fc 변이체들을 선별하였다 (도 5 및 표 1).
실시예 6. 선별된 Fc 변이체가 도입된 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 발현 및 정제
선별한 당화 Fc 변이체들을 모델항체인 Fab-arm 교환 변이체를 가지지 않는 펨브로리주맙(pembrolizumab) 중쇄 유전자에 클로닝하여 발현 백터를 제조하였다. 그 후, Freestyle 293 expression 배양액 (Gibco, 12338-018) 3 ml에 변이체들의 중쇄유전자와 경쇄유전자를 1:1의 비율로 먼저 섞고 PEI:변이체유전자=4:1의 비율로 섞어 상온에서 20 분간 두었다가 전날 2x106cells/ml의 밀도로 계대배양해 놓은 Expi293F 세포에 트랜스펙션하였다. 그 후 CO2 진탕배양기에서 37 ℃, 125 rpm 및 8 % CO2의 조건으로 7일간 배양하고 원심분리하여 상등액만 취하였다. 상등액은 25X PBS로 평형을 맞춘 후 0.2 μm 시린지 필터로 여과하여 준비하였다. 이 후, 펨브로리주맙 Fc 변이체들이 포함된 배양액에 Protein A resin을 넣어 4℃에서 16시간 교반한 후 스핀 다운(spin down)하여 레진을 회수하고 2 ml PBS로 세척한 뒤 300 μl의 100 mM 글라이신(glycine) (pH 2.7) 버퍼로 용출하였다. 이 후 100 μl의 1 M Tris-HCl (pH 8.0)을 이용하여 중화하고 Amicon Ultra-4 centrifugal filter units 30K (Merck Millipore, UFC800324)을 사용하여 버퍼를 교환하였다. SDS-PAGE 젤 분석을 통해 당화 항체 펨브로리주맙 Fc 변이체들이 높은 순도로 정제되었음을 확인하였다 (도 6).
실시예 7. 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 FcγRs 결합력 확인
상기 실시예 6에서 정제한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 FcγRI 및 FcγRⅢa에 대한 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 FcγRs-GST (FcγRI-GST 및 FcγRⅢa-158V-GST)를 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate (Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크로 연속 희석된 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 HRP-Protein L (GenScript, M00098) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 상기 실시예들을 통해 발굴한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들은 다양한 암 치료제로 US FDA 승인을 받았으며 S228P의 돌연변이를 가지는 펨브로리주맙보다 FcγRI 및 FcγRⅢa-158V에 월등히 낮은 결합력을 가지는 것으로 나타났으며, 특히 SL001 변이체 (E233C) 및 SL005 변이체 (F234G)가 FcγRI에 대한 결합력이 제거된 것으로 나타났다 (도 7).
실시예 8. 선별한 펨브로리주맙 Fc 변이체와 Fab-arm 교환 방지 변이체의
재조합
야생형 인간 IgG4는 CH2 영역의 228번째 아미노산이 인간 IgG1과 다르게 세린(serine)으로 존재하고, 유연한 코어 힌지(core hinge)를 통해 쇄내(intrachain) 이황화 결합이 형성되어 비-공유(non-covalent) 연결로 half-항체가 생성된다. 이렇게 half-항체 형태로 존재하는 IgG4는 서로 다른 항원을 표적하는 2개의 IgG4의 half-항체 형태가 합쳐지는 Fab-arm 교환 현상이 나타난다. 이를 방지하기 위해 IgG4의 288번째 세린을 인간 IgG1의 228번째 아미노산인 프롤린(proline)으로 치환할 경우 힌지 영역이 안정화되어 Fab-arm 교환이 나타나지 않게되므로, IgG4 임상 항체에 범용적으로 적용되어 개발되고 있다. 이에, 상기 실시예들에서 발굴한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들에 S228P 변이를 도입하고, SL001(E233C) 및 SL005(F234G)의 조합 효과를 확인하고자 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (SPEC, SPFG 및 SPECFG)을 재조합하였다 (표 2).
실시예 9.
Fab-arm 교환 방지 당화 펨브로리주맙 Fc 재조합 변이체의 발현 및 정제
상기 표 2의 재조합 당화 Fc 변이체들을 모델 항체인 펨브로리주맙 중쇄 유전자에 클로닝하여 발현 백터를 제조하였다. 그 후, Freestyle 293 expression 배양액 (Gibco, 12338-018) 10 ml에 변이체들의 중쇄유전자와 경쇄유전자를 1:1의 비율로 먼저 섞고 PEI:변이체유전자=4:1의 비율로 섞어 상온에서 20 분간 두었다가 전날 2x106 cells/ml의 밀도로 계대배양해 놓은 Expi293F 세포에 트랜스펙션하였다. 그 후 CO2 진탕배양기에서 37 ℃, 125 rpm 및 8 % CO2의 조건으로 7일간 배양하고 원심분리하여 상등액만 취하였다. 상등액은 25X PBS로 평형을 맞춘 후 0.2 μm 시린지 필터로 여과하여 준비하였다. 이 후, 재조합 펨브로리주맙 Fc 변이체들이 포함된 배양액에 Protein A resin을 넣어 4℃에서 16시간 교반한 후 스핀 다운(spin down)하여 레진을 회수하고 10 ml ml PBS로 세척한 뒤 3 ml의 100 mM 글라이신(glycine) (pH 2.7) 버퍼로 용출하였다. 이 후 1 ml의 1 M Tris-HCl (pH 8.0)을 이용하여 중화하고 Amicon Ultra-4 centrifugal filter units 30K (Merck Millipore, UFC800324)을 사용하여 버퍼를 교환하였다. 이 후, SDS-PAGE 젤 분석을 통해 당화 항체 펨브로리주맙 Fc 변이체들이 높은 순도로 정제되었음을 확인하였고, 야생형 IgG4 및 모델항체 펨브로리주맙에 비해 발현 수준도 우수한 것을 확인하였다 (도 8).
실시예 10.
Fab-arm 교환 방지 당화 펨브로리주맙 Fc 재조합 변이체들의 FcγRs 결합력 확인
상기 실시예 9에서 정제한 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 FcγRs 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 FcγRs-GST (FcγRI-GST, FcγRⅡa-131H-GST, FcγRⅡa-131R-GST, FcγRⅡb-GST, FcγRⅢa-158V-GST 및 FcγRⅢa-158F-GST)를 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate (Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크로 연속 희석된 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 HRP-Protein L (GenScript, M00098) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들은 야생형 IgG4 및 다양한 암 치료제로 US FDA 승인을 받았으며 S228P 돌연변이를 가지는 펨브로리주맙보다 월등히 낮은 FcγRs 결합력을 가지는 것으로 나타났으며, 특히, 종래의 S228P 변이체 (펨브로리주맙)와 S228P/L235E 변이체는 FcγRs에 대한 결합력이 남아있는 것으로 나타났으나, SPECFG 변이체 (S228P/E233C/F234G)는 모든 FcγRs에 대한 결합력이 제거된 것으로 나타났다 (도 9).
실시예 11.
Fab-arm 교환 방지 당화 펨브로리주맙 Fc 재조합 변이체들의 C1q 결합력 확인
상기 실시예 9에서 정제한 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 C1q 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들을 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate(Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후, 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크로 연속 희석된 C1q(Quidel, A400) 단백질을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 항-C1q-HRP(Invitrogen, PA1-84324) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체는 C1q에 대한 결합력이 없는 것으로 나타났다 (도 10).
실시예 12.
Fab-arm 교환 방지 당화 펨브로리주맙 Fc 재조합 변이체들의 FcRn 결합력 확인
상기 실시예 9에서 정제한 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 생체 내 반감기에 관여하는 FcRn와의 결합력을 확인하기 위해 pH에 따른 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들을 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate(Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후, 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST (pH 6.0/pH 7.4) 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크 (pH 6.0/pH 7.4)로 각각 연속 희석된 FcRn-GST을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 anti-GST-HRP Conjugate (GE Healthcare, RPN1236V) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 야생형 IgG4의 FcRn 결합 특성을 유지하는 것으로 나타났다 (도 11).
실시예 13.
Fab-arm 교환 방지 당화 펨브로리주맙 Fc 재조합 변이체들의 열 안정성 분석
상기 실시예 9에서 정제한 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 온도에 따른 열 안정성을 확인하기 위해 DSF(differential scanning fluorimetry) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 1X PBS에 5 μM로 각각 희석한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체 45 μl 및 200X로 희석한 SYPRO Orange (Invitrogen, S6651) dye 5μl를 섞어 PCR plate (Thermo Scientific, AB0900W)에 각각 분주하고, 대조군으로 1X PBS도 같은 방법으로 준비하였다 (모든 시료는 triplicate으로 진행함). 시료가 담긴 플레이트에 optically clear sealing film (Thermo Scientific, AB1170)을 부착하고, QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, A28567)을 이용하여 25℃부터 99.9℃까지 초 당 0.03℃씩 증가시키며 발생하는 형광 세기를 측정하였다. 각 온도에 따른 형광 값은 OriginPro software를 이용하여 볼츠만 모델로 피팅(fitting)한 후 sigmoidal transition curve의 중간점을 구하였다.
그 결과, 본 발명의 재조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들은 야생형 IgG4의 분해 온도와 유사한 분해 온도를 가지고, 종래의 S228P/L235E 변이체는 분해 온도가 감소하는 것으로 나타났다 (도 12).
실시예 14.
FcγRI에 대한 결합력이 제거된 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 조합 변이체 제작
상기 실시예 7에서 FcγRI에 대한 결합력이 제거된 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체로 선별한 SL001 변이체 (E233C) 및 SL005 변이체 (F234G)의 조합 효과를 확인하기 위해 조합 펨브로리주맙 Fc 변이체 ECFG (E233C/F234G)를 제작하였다 (표 3).
실시예 15.
조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체의 발현 및 정제
상기 표 3의 조합 당화 Fc 변이체 ECFG와 표 2의 재조합 당화 Fc 변이체들 SPLE, SPEC, SPFG 및 SPECFG을 모델 항체인 펨브로리주맙 중쇄 유전자에 클로닝하여 발현 백터를 제조하였다. 그 후, Freestyle 293 expression 배양액 (Gibco, 12338-018) 10 ml에 변이체들의 중쇄유전자와 경쇄유전자를 1:1의 비율로 먼저 섞고 PEI:변이체유전자=4:1의 비율로 섞어 상온에서 20 분간 두었다가 전날 2x106 cells/ml의 밀도로 계대배양해 놓은 Expi293F 세포에 트랜스펙션하였다. 그 후 CO2 진탕배양기에서 37 ℃, 125 rpm 및 8 % CO2의 조건으로 7일간 배양하고 원심분리하여 상등액만 취하였다. 상등액은 25X PBS로 평형을 맞춘 후 0.2 μm 시린지 필터로 여과하여 준비하였다. 이 후, 펨브로리주맙 Fc 변이체들이 포함된 배양액에 Protein A resin을 넣어 4℃에서 16시간 교반한 후 스핀 다운하여 레진을 회수하고 10 ml ml PBS로 세척한 뒤 3 ml의 100 mM 글라이신 (pH 2.7) 버퍼로 용출하였다. 이 후 1 ml의 1 M Tris-HCl (pH 8.0)을 이용하여 중화하고 Amicon Ultra-4 centrifugal filter units 30K (Merck Millipore, UFC800324)을 사용하여 버퍼를 교환하였다. 이 후, SDS-PAGE 젤 분석을 통해 본 발명의 당화 항체 펨브로리주맙 Fc 변이체들이 높은 순도로 정제되었음을 확인하였으며, 야생형 IgG4 항체는 75 kDa의 half-항체가 형성되지만, Fab-arm 교환 방지 변이체 S228P가 도입된 모델 항체 펨브로리주맙(IgG4-SP), IgG4-SPLE (S228P/L235E), IgG4-SPEC (S228P/E233C), IgG4-SPFG (S228P/F234G) 및 IgG4-SPECFG (S228P/E233C/F234G)는 half-항체가 형성되지 않는 것을 확인하였다. 또한, IgG4-EC (표 1의 SL001, E233C) 및 IgG4-ECFG (E233C/F234G)는 Fab-arm 교환 방지 변이체 (S228P)가 도입되지 않았음에도 Fab-arm 교환 현상이 나타나지 않고, half-항체가 형성되지 않는 것을 확인하였다 (도 13).
실시예 16.
당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 인간 FcγRs 결합력 확인
상기 실시예 15에서 정제한 조합 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체와 재조합 당화 Fc 변이체들의 FcγRs 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 FcγRs-GST (FcγRI-GST, FcγRⅡa-131H-GST, FcγRⅡa-131R-GST, FcγRⅡb-GST, FcγRⅢa-158V-GST 및 FcγRⅢa-158F-GST)를 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate (Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크로 연속 희석된 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 HRP-Protein L (GenScript, M00098) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들은 야생형 IgG4 항체보다 현저히 낮은 FcγRs 결합력을 가지는 것으로 나타났으며 특히, ECFG 변이체 (E233C/F234G) 및 SPECFG 변이체 (S228P/E233C/F234G)는 모든 FcγRs에 대한 결합력이 제거된 것으로 나타났다 (도 14).
실시예 17.
당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 인간 C1q 결합력 확인
상기 실시예 15에서 정제한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 C1q 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들을 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate(Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후, 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크로 연속 희석된 C1q(Quidel, A400) 단백질을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 항-C1q-HRP(Invitrogen, PA1-84324) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)은 모두 C1q에 대한 결합력이 없는 것으로 나타났다 (도 15).
실시예 18.
당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 인간 FcRn 결합력 확인
상기 실시예 15에서 정제한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 생체 내 반감기에 관여하는 FcRn와의 결합력을 확인하기 위해 pH에 따른 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들을 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate(Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후, 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST (pH 6.0/pH 7.4) 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크 (pH 6.0/pH 7.4)로 각각 연속 희석된 FcRn-GST을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 anti-GST-HRP Conjugate (GE Healthcare, RPN1236V) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)은 모두 야생형 IgG4의 FcRn 결합 특성을 유지하는 것으로 나타났다 (도 16).
실시예 19.
당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 열 안정성 분석
상기 실시예 15에서 정제한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 온도에 따른 열 안정성을 확인하기 위해 DSF 분석을 수행하였다. 구체적으로, 1X PBS에 5 μM로 각각 희석한 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체 45 μl 및 200X로 희석한 SYPRO Orange (Invitrogen, S6651) dye 5μl를 섞어 PCR plate (Thermo Scientific, AB0900W)에 각각 분주하고, 대조군으로 1X PBS도 같은 방법으로 준비하였다 (모든 시료는 triplicate으로 진행함). 시료가 담긴 플레이트에 optically clear sealing film (Thermo Scientific, AB1170)을 부착하고, QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, A28567)을 이용하여 25℃부터 99.9℃까지 초 당 0.03℃씩 증가시키며 발생하는 형광 세기를 측정하였다. 각 온도에 따른 형광 값은 OriginPro software를 이용하여 볼츠만 모델로 피팅(fitting)한 후 sigmoidal transition curve의 중간점을 구하였다.
그 결과, 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)은 야생형 IgG4의 분해 온도보다 높은 분해 온도를 가지고, 종래의 S228P/L235E 변이체 (SPLE)는 분해 온도가 감소하는 것으로 나타났다 (도 17).
실시예 20. 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 동물 Fc 수용체들과의 결합력 분석
20-1. 뮤린 및 사이노몰거스 원숭이 FcγRs 발현 및 정제
전임상 동물 모델로 많이 사용되는 뮤린(murine)과 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey)의 FcγRs에 대한 본 발명의 당화 Fc 변이체들의 결합력 분석을 위해, 각 동물의 Fc 수용체 단백질로서 뮤린 FcγRI-GST, 뮤린 FcγRIIb-GST, 뮤린 FcγRIII-GST, 뮤린 FcγRIV-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRI-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIa-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIb-GST 및 사이노몰거스 원숭이 FcγRIII-GST를 생산하였다. 구체적으로, 상기 각각의 수용체 단백들을 동물세포 발현용 벡터에 클로닝하여 준비한 다음, PEI를 이용해 Expi293F 세포에 트랜스펙션한 뒤, 37℃, 125 rpm 및 8% CO2 조건에서 7일간 배양하여 얻었다. 배양 후, 상등액을 회수하여 PBS로 평형을 맞추고 anti-GST 친화도 크로마토그래피로 정제하였다.
그 결과, 고순도의 뮤린 FcγRI-GST, 뮤린 FcγRIIb-GST, 뮤린 FcγRIII-GST, 뮤린 FcγRIV-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRI-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIa-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIb-GST 및 사이노몰거스 원숭이 FcγRIII-GST가 정제되었음을 확인하였다 (도 18).
20-2. 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 뮤린 FcγRs과의 결합력 분석
상기 실시예 15에서 정제한 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 뮤린 FcγRs에 대한 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 뮤린 FcγRI-GST, 뮤린 FcγRIIb-GST, 뮤린 FcγRIII-GST 및 뮤린 FcγRIV-GST를 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate (Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크로 연속 희석된 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 HRP-Protein L (GenScript, M00098) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명에서 발굴한 모든 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들이 야생형 IgG4 항체보다 현저히 낮은 FcγRs 결합력을 가지며, 특히 뮤린 FcγRI, 뮤린 FcγRIIb 및 뮤린 FcγRIII에 대한 결합력이 완전히 제거된 것으로 나타났다 (도 19).
20-2. 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 원숭이
FcγRs과의 결합력
분석
상기 실시예에서 정제한 본 발명의 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들의 사이노몰거스 원숭이 FcγRs에 대한 결합력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 0.05 M Na2CO3 (pH 9.6)에 4 μg/ml로 희석한 사이노몰거스 원숭이 FcγRI-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIa-GST, 사이노몰거스 원숭이 FcγRIIb-GST 및 사이노몰거스 원숭이 FcγRIII-GST를 각각 50 μl씩 flat bottom polystyrene high bind 96 well microplate (Costar, 3590)에 4℃에서 16시간 동안 고정화한 후 100 μl의 4% 스킴 밀크(skim milk) (GenomicBase, SKI400)로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST 180 μl로 4 회 세척한 뒤 1% 스킴 밀크로 연속 희석된 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들 (EC, FG, ECFG, SPEC, SPFG 및 SPECFG)을 50 μl씩 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 HRP-Protein L (GenScript, M00098) 50 μl을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 다시 세척하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA substrate solution (Thermo Fisher Scientific, 34028)을 50 μl씩 첨가해 발색한 뒤 2 M H2SO4를 50 μl씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek)을 이용해 흡광도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명에서 발굴한 모든 당화 펨브로리주맙 Fc 변이체들이 야생형 IgG4 항체보다 현저히 낮은 FcγRs 결합력을 가지는 것으로 나타났다 (도 20).
Claims (23)
- 야생형(Wild type) 인간 항체 Fc 도메인에서, 카밧 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따라 넘버링된 228, 233, 234, 309 및 402 위치의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 위치의 아미노산이 야생형의 아미노산과 다른 서열로 치환된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, S228P, E233C, E233P, E233G, F234G, F234T, F234R, L309P 및 G402D로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, E233C 또는 F234G의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, S228P 및 E233C의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, S228P 및 F234G의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, E233C 및 F234G의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, E233G 및 L309P의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, F234G 및 G402D의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, S228P, E233C 및 F234G의 아미노산 치환을 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, 인간 항체는 IgG4인, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, 야생형 인간 항체 Fc 도메인에 비해 Fc 감마 수용체(FcγRs) 또는 C1q와의 결합력이 감소된, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항에 있어서, 야생형 인간 항체 Fc 도메인에 비해 작용기 기능(effector function)을 감소시키는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 12항에 있어서, 작용기 기능은 C1q-결합, 보체 활성화, 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC), 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), Fc-감마 수용체 결합을 포함하는 Fc-수용체 결합, 단백질 A-결합, 단백질 G-결합, 항체-의존적 세포성 포식작용(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP), 보체-의존적 세포성 세포독성(complement dependent cell-mediated cytotoxicity, CDCC), 보체-증강 세포독성, 옵소닌화, Fc-함유 폴리펩티드 내재화, 표적 하향조정, ADC 흡수, 아폽토시스의 유도, 세포 사멸, 세포 주기 정지, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 Fc-매개된 작용기 기능인, 인간 항체 Fc 도메인 변이체.
- 제 1항의 Fc 도메인 변이체를 포함하는, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
- 제 14항에 있어서, 야생형 인간 항체에 비해 Fc 감마 수용체(FcγRs) 또는 C1q와의 결합력이 감소된, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
- 제 14항에 있어서, 야생형 인간 항체에 비해 작용기 기능이 감소된, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편.
- 제 1항의 인간 항체 Fc 도메인 변이체, 제 14항의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자.
- 제 14항의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 하나 이상의 치료제에 접합된 항체 치료제.
- 제 18항에 있어서, 감소된 작용기 기능을 갖는 항체 치료제.
- 제 18항에 있어서, 치료제는 키메라 항원 수용체(CAR) 세포 치료제, 종양세포붕괴성 약물(oncolytic drug), 면역요법제, 세포 독성제, 혈관신생 억제제, 키나아제 억제제, 공자극 분자 차단제, 부착 분자 차단제, 항-사이토카인 제제, 항-CTLA-4 제제, 항-PD-1 제제, 항-PD-L1 제제, 항-PD-L2 제제, TNF-α 교차-결합 제제, TRAIL 교차-결합 제제, 항-CD27 제제, 항-CD30 제제, 항-CD40 제제, 항-4-1BB 제제, 항-GITR 제제, 항-OX40 제제, 항-TRAILR1 제제, 항-TRAILR2 제제, 타그레틴, 인터페론-알파, 클로베타솔, 페그 인터페론, 프레드니손, 로미뎁신, 벡사로텐, 메토트렉세이트, 트리암시놀론 크림, 항-케모카인, 보리노스타트, 가바펜틴, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출 가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID: non-steroid anti-inflammatory drug), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 건선 치료제, 코르티코스테로이드, 단백 동화 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 정신병 치료제, 각성제, 천식약, 베타 아고니스트, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 이의 유사체, 사이토카인, 사이토카인 길항제, PD-1 길항제, 아데노신 A2AR 길항제, CD73 저해제, CTLA-4 저해제, TIM-3 저해제, LAG-3 저해제, 안트라사이클린 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 항체 치료제.
- 제 1항의 인간 항체 Fc 도메인 변이체, 제 14항의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편, 또는 제 18항의 항체 치료제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- a) 제 1항의 인간 항체 Fc 도메인 변이체를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 항체 Fc 도메인 변이체의 제조방법. - a) 제 14항의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계를 포함하는 작용기 기능이 감소된 항체의 제조방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20220079825 | 2022-06-29 | ||
| KR1020220079825 | 2022-06-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240003755A true KR20240003755A (ko) | 2024-01-09 |
Family
ID=89380831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230077425A KR20240003755A (ko) | 2022-06-29 | 2023-06-16 | 인간 FcγRs 결합력이 제거된 당화 Fc 변이체들 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240003755A (ko) |
| WO (1) | WO2024005423A1 (ko) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9775881B2 (en) * | 2013-05-23 | 2017-10-03 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Methods of treating mesothelioma by administration of compounds comprising FGFR1 ECD |
| MX2017008819A (es) * | 2014-12-30 | 2018-03-14 | Celgene Corp | Anticuerpos anti-cd47 y usos de los mismos. |
| KR101792205B1 (ko) * | 2017-04-13 | 2017-10-31 | 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단 | 혈중 지속성 연장을 위한 항체 Fc 변이체들 |
| WO2019057792A1 (en) * | 2017-09-19 | 2019-03-28 | Mab Discovery Gmbh | CD40 ANTIBODY AGONISTS |
| KR102382593B1 (ko) * | 2020-01-29 | 2022-04-05 | 고려대학교 산학협력단 | pH-감응성 Fc 변이체 |
-
2023
- 2023-06-16 WO PCT/KR2023/008394 patent/WO2024005423A1/ko unknown
- 2023-06-16 KR KR1020230077425A patent/KR20240003755A/ko unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024005423A1 (ko) | 2024-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7104000B2 (ja) | ヒト化またはキメラｃｄ３抗体 | |
| RU2693661C2 (ru) | Антитело против pdl-1, его фармацевтическая композиция и применение | |
| JP5398703B2 (ja) | 一本鎖ＦＣ（ＳｃＦｃ）領域、それを含む結合ポリペプチド、およびそれに関連する方法 | |
| CN110770255A (zh) | 具有受限cd3结合的多特异性多肽构建体及其使用方法 | |
| RU2762704C2 (ru) | Новое psma-связывающее антитело и его применения | |
| CN115536750A (zh) | 结合cd3和肿瘤抗原的异二聚体抗体 | |
| EP4155318A1 (en) | Bispecific antibody and use thereof | |
| WO2023068718A1 (ko) | FCγRIIA 결합 선택성이 향상된 인간 FC 변이체 | |
| EP4403576A1 (en) | Glycosylated fc variants with improved selective binding affinity to fc gamma riiia | |
| KR20240003755A (ko) | 인간 FcγRs 결합력이 제거된 당화 Fc 변이체들 | |
| WO2022116079A1 (zh) | 一种抗ceacam5的人源化抗体及其制备方法和用途 | |
| CN115698066A (zh) | 抗cd47抗体及其用途 | |
| WO2023068710A1 (ko) | PH-의존 FCRN 결합력과 FCγRⅢA 결합 선택성이 향상된 FC 변이체들 | |
| KR20240003757A (ko) | FcγRIIa 결합 선택성이 향상된 인간 Fc 변이체 | |
| KR20240054902A (ko) | 인간 항체 Fc 도메인 변이체 및 그 용도 | |
| WO2023043124A1 (ko) | Fcγrⅲa 결합력이 향상된 당화 fc 변이체들 | |
| KR20230055971A (ko) | pH-의존 FcRn 결합력과 FcγRⅢa 결합력이 향상된 Fc 변이체 | |
| KR102730638B1 (ko) | pH-감응성 Fc 변이체 | |
| KR20230055973A (ko) | pH-의존 FcRn 결합력과 FcγRⅢa 결합 선택성이 향상된 Fc 변이체들 | |
| US12030951B2 (en) | Anti-OX40 antibody and uses thereof | |
| WO2023043125A1 (ko) | 다양한 fc 감마 수용체들과의 결합력이 증대된 fc 변이체 | |
| KR20230055972A (ko) | pH-의존 FcRn 결합력과 FcγRⅡa 결합력이 향상된 인간 IgG1 Fc 변이체들 | |
| WO2023043127A9 (ko) | Fc 감마 수용체와의 결합력이 증대된 fc 변이체 | |
| KR20240150713A (ko) | 인간 C1q 결합력이 향상된 Fc 변이체들 | |
| WO2021197393A1 (zh) | 一种抗人cd47抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用 |