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KR20230010231A - 생체내 형질도입을 위한 벡터 및 방법 - Google Patents

생체내 형질도입을 위한 벡터 및 방법 Download PDF

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KR20230010231A
KR20230010231A KR1020227043191A KR20227043191A KR20230010231A KR 20230010231 A KR20230010231 A KR 20230010231A KR 1020227043191 A KR1020227043191 A KR 1020227043191A KR 20227043191 A KR20227043191 A KR 20227043191A KR 20230010231 A KR20230010231 A KR 20230010231A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mir
cells
cell
domain
receptor
Prior art date
Application number
KR1020227043191A
Other languages
English (en)
Inventor
더글라스 제이. 졸리
데렉 쥐. 오스터태그
노리유키 가사하라
카를로스 이바네츠
코넬리아 에이. 벤틀리
모흐드 무스타크 후사인
Original Assignee
아빈투스 바이오, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아빈투스 바이오, 인코포레이티드 filed Critical 아빈투스 바이오, 인코포레이티드
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Abstract

개시내용은 생체내에서 항원 수용체 결합 작제물의 세포 발현을 통해 면역을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

생체내 형질도입을 위한 벡터 및 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에서 2020년 5월 11일에 출원된 미국 가출원 일련번호 63/023,191 및 2020년 12월 31일에 출원된 미국 가출원 일련번호 63/133,224로부터의 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
개시내용은 암, 감염, 알레르기, 퇴행성 및 면역 장애의 세포 요법을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
이 출원에는 2021년 5월 11일에 생성되었으며 IBM-PC, MS-Windows 운영 체제에서 기계 포맷된 239,881 바이트의 데이터를 가지고 있는 "Sequence-Listing_ST25.txt"라는 제목의 서열 목록이 첨부되어 있다. 서열 목록은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
입양 면역요법은 암에 대한 치료 접근법의 가장 중요한 위치로 떠올랐다. T 세포는 종양 연관된 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. CAR은 조작된 면역-수용체로, T 세포를 선택적으로 종양 세포를 사멸하도록 재지향시킬 수 있다. 암 면역요법에서 그 사용을 위한 일반적인 전제는 종양-표적화된 T 세포를 신속하게 생성하는 것이다.
요약
이상적인 유전자 전달 시스템은 생산하기 쉽고 투여하기 쉽고 정상 세포에 대해 비-독성이며; 그것은 유전 정보를 혈류를 통해 표적 조직에 효율적이고 구체적으로 전달하고 유전 물질을 숙주 세포 안으로 통합하여 이식유전자가 안정적으로 발현되도록 할 것이다. 본 명세서에 기술된 신규한 시스템이 이 처방에 적합하다.
개시내용은 (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 적어도 하나의 miRNA 표적화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 여기서 (a) 및 (b)는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에 연결된다. 일 실시형태에서, 벡터는 (c) 전구약물을 세포독성 약물로 전환시키는 세포독성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, (a)는 하나 이상의 항원 결합 도메인(들)을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 도메인; 링커를 인코딩하는 선택적 폴리뉴클레오티드 도메인; 및 제1 폴리뉴클레오티드 도메인에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오티드 도메인으로, 여기서 제2 폴리뉴클레오티드 도메인은 막횡단을 인코딩하는, 도메인; 및 세포내 시그널링 도메인을 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 도메인을 포함한다. 추가 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 도메인은 항체 단편, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 가변 단편, 단일 도메인 항체, 낙타류 VHH 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체 또는 수용체 단편, 또는 이중특이적 항체를 인코딩한다. 또 다른 실시형태에서, 링커를 인코딩하는 선택적 폴리뉴클레오티드는 Gly3 서열을 인코딩한다. 또 다른 실시형태에서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD3γ, CD3ε, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및/또는 NKG2C로 구성된 군으로부터 선택된 구성원으로부터의 것이다. 또 다른 실시형태에서, 제3 폴리뉴클레오티드 도메인은 CD3 제타, 공통 FeR 감마(FCER1G), Fe 감마 RIIa, FeR 베타(Fe 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12로 구성된 군으로부터 선택된 세포내 시그널링 도메인을 인코딩한다. 일 실시형태에서, 전구약물을 세포독성 약물로 전환시키는 세포독성 폴리펩티드는 시토신 데아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드, 티미딘 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 실시형태에서, 벡터는 통합 벡터이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 또 다른 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 비-복제 감마레트로바이러스 벡터이다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 miRNA 표적화 서열은 hsa-miR-223-3p, hsa-miR143-3p, hsa-mir182-5p, hsa-miR-10bp, hsa-miR141-3p, has-miR486-5p 및 전술한 것의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 miRNA에 의해 결합된다.
개시내용은 또한 gag 폴리펩티드; pol 폴리펩티드; env 폴리펩티드; 및 레트로바이러스 벡터의 캡시드 내에 함유된 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자를 제공하며, 여기서 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로: (R-U5 도메인)-(임의의 신호 펩티드 코딩 서열 도메인)-(결합 도메인 코딩 서열 도메인)-(선택적 힌지/링커 코딩 서열 도메인)-(막횡단(TM) 코딩 서열 도메인)-(miRNA 표적 도메인(들))-(U3-R 도메인)을 포함한다. 일 실시형태에서, R-U5 도메인은 뉴클레오티드 1로부터 약 뉴클레오티드 145까지 서열번호: 25와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 결합 도메인 코딩 서열은 신호 서열이 선행된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 결합 도메인 코딩 서열은 선택적인 링커/스페이서 도메인 서열이 뒤따른다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 사멸 스위치 도메인 코딩 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시형태에서, 사멸 스위치 코딩 도메인은 전구약물을 세포독성 약물로 전환시키는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 IRES를 포함한다. 추가 실시형태에서, 폴리펩티드는 티미딘 키나제(TKO) 활성 또는 시토신 데아미나제(CD) 활성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 miRNA 표적화 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 적어도 하나의 miRNA 표적화 서열은 복수의 miRNA 표적화 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 복수의 miRNA 표적화 서열은 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 복수의 miRNA 표적화 서열 중 적어도 2개는 상이하다. 또 다른 실시형태에서, U3-R 도메인은 약 뉴클레오티드 5537로부터 약 6051까지 서열번호: 25와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
개시내용은 개시내용의 벡터를 사용하여 생체내 형질도입에 의해 생산된 유전자 형질도입된 줄기 세포를 담지하는 비-인간 동물을 추가로 제공한다.
도 1은 다양한 3' UTR 마이크로RNA 표적 서열을 갖거나 갖지 않는 CAR 또는 GFP 이식유전자를 전달하도록 조작된 RNV의 예시이다. 예는 miR233(단핵구에서 전사체 분해를 야기함); 또는 miRaBCT 및 miRaNKT(각각 B 및 NK 세포에서 전사체 분해를 야기함)를 포함한다. 이들 표적 서열은 단핵구, B 및 NK 세포에서 이식유전자 분해를 지시하기 위해 1-4의 배수 및 다양한 조합으로 추가된다.
도 2는 다양한 3' UTR 마이크로RNA 표적 서열을 갖거나 갖지 않는 CAR 또는 GFP 이식유전자를 전달하도록 조작된 RNV의 예시이다. 도 1에 부가하여, 추가 예는 간세포에서 이식유전자 전사체 분해를 지정하는 miR122a 및 miR199a를 포함한다. 이들 표적 서열은 이식유전자를 지시하기 위해 도 X1에 기술된 miRNA 표적 서열과 함께 1-4의 배수 및 다양한 조합으로 추가된다.
도 3은 혼합된 림프구(PBMC) 형질도입으로부터 말초 T-세포에서 예상되는 CD19 CAR 발현 프로파일을 제공한다. 시험관내 감염된 PBMC 세포를 CD3, CD20, CD4, CD8, CD45 및 CD19CAR-특이적 항체로 염색하고 유세포분석에 의해 분석한다. CD3, CD4 및 CD8 양성 세포는 RNV-GFP에 감염된 PBMC와 비교하여 CD19CAR 양성 염색(APC)을 나타낸다.
도 4a-c는 3개의 안전성-변형된 MLV-기반 레트로바이러스 성분 양쪽성 env(4070A-유도됨), gag/pol(MoMLV-유도됨) 및 벡터(MoMLV-유도됨)의 개략도를 제공한다. (a) pKT-1 레트로바이러스 벡터에서, 5' LTR의 업스트림, 3' LTR의 다운스트림 및 고유한 ClaI 부위와 TAG env 정지 코돈 사이의 외부 서열(검정색으로 표지됨)이 결실되었다. 부가하여, 2개의 정지 코돈을 확장된 패키징 신호 Ψ+에 도입하여 Gag/pol 단백질의 생성을 방지하였다. 제1 TAA 정지 코돈은 gag/pol의 ATG 시작 코돈을 대체하며, 제2 TGA 정지 코돈은 제1 TAA 정지 후 12nt를 도입했다. 이들 모든 변경은 안전성-변형된 벡터 pBA-5b에 통합되었다. 폴리링커는 이후 pBA5b 안으로 삽입되어 이 연구에 사용된 플라스미드 벡터인 pBA9Bb에 도달했다. (b) 원래의 gag/pol 작제물 pSCV10에서 모든 5' 및 3' 비번역된 서열이 제거되었고 Pol에서 인테그라제 유전자의 마지막 28개 아미노산을 코딩하는 서열이 절삭되었다(pSCV10/5',3'tr. 또는 pCI-GPM). 부가적으로, 축퇴 코드가 벡터(pCI-WGPM)의 확장된 패키징 신호에 중첩하는 것을 방지하기 위해 gag/pol의 처음 420nt에 통합되었다. (c) 원래의 양쪽성 엔벨롭 작제물 pCMVenvamDra는 3' 비번역된 서열(pCMVenvamDraLBGH) 또는 5' 및 3' 비번역된 서열(pCMV-β/envam)이 결실되도록 서열 중첩을 최소화하도록 변형되었다.
도 5는 상술한 바와 같이 다중 miR 서열을 사용함에 의해 골수, B 및 NK 세포에서 GFP 서열의 발현을 하향 조절하는데 사용되는 마이크로RNA 표적 서열을 포함하는 작제물을 도시한다.
도 6은 모 세포주로 시작하는 패키징 세포주(PCL) 및 고-역가 벡터-생산주(VPCL)를 생성하기 위한 프로세스를 개략적으로 설명하는 흐름도를 제공한다. 임상 제조를 위해 선별된 클론은 긍극적으로 확장되어 GMP 하에서 냉동보존되고 테스트되어 적격한 GMP 마스터 및 작업 세포 은행을 생성한다.
도 7a-e는 A20 B-세포 림프종 동물 모델에서의 실험 결과를 나타내며, 여기서 A20 이식 후 3일차에서 시작하여 연속 4일 동안 일당 1E7의 용량에서, (a) mCD19(1D3)-IRES YCD(V)의 벡터로 (b) 종양-담지 마우스에 IV 주사되었다. A20 B 세포 림프종 이식 후 12, 18 및 25일차에서 종양 부담을 비히클 대조군 및 RNV-1D3-처리된 동물에서 영상화(c) 및 발광 신호(d, 광도)에 의해 평가하였다. 발광 신호의 영상은 종양 부담에서 시각적 감소를 나타낸다(c). 양적 발광 신호는 복부 및 등쪽 투시도(상단 및 하단 이미지) 둘 모두에서 각 마우스에 대해 평가된다. (e) 처리 및 대조군 마우스에 대한 B 세포(CD19 양성) 카운트의 측정은 25일차까지 처리 마우스에서 B 세포 카운트의 유의한 저하를 나타냈다.
도 8은 웨스턴 블롯이 yCD2 이식유전자를 갖지 않는 작제물 14와 비교하여 작제물 8이 높은(MOI 10) 및 낮은 MOI(0.1)로 형질도입된 세포에서 yCD2의 발현을 확인할 수 있음을 나타낸다.
도 9는 CD 및 티미딘 키나제(TK) 인코딩 벡터: CD 인코딩 벡터 +/- 5-FC(플루시토신, D.Ostertag et al. Neuro-Oncology 2012), 및 TK 벡터 +/- 간시클로비르(GCV)에 대한 사멸-곡선을 나타낸다. 테스트 세포를 도말하고 24-48시간 후에 약물을 표시된 다양한 농도로 첨가한다; 생존력은 5-7일 후에 결정되었고 사멸 곡선 및 MTS 검정(Abcam ab197010)을 사용하여 IC50 결정을 생성했다. 결과는 사멸-스위치 유전자가 없는 벡터를 담지하는 세포에 대해 이것이 없는 세포에 비해 1 내지 3 로그 더 큰 IC50의 IC50을 나타낸다.
도 10a-b는 RNV 벡터에 miRNA 표적 서열을 포함하는 효과를 나타낸다. miR223-3p에 대한 표적 서열은 GFP 벡터 안으로 삽입되어 서열 pBA-9B-GFPmiR223-3pB-4TX(작제물 7)를 제공하고 감염성 벡터를 만드는데 사용되었다. miR223-3p는 단핵구 또는 골수 세포에서만 상당한 농도로 생산되는 마이크로RNA이다. (a) 원하는 결과의 개념적 도면. (b)는 U937 단핵구 세포주에서 원래의 GFP 벡터(왼쪽 열), GFP miR 223-3p 벡터(중앙 열) 및 miRaBC에 대한 관련이 없는 miRNA 표적을 갖는 GFP 벡터의 발현을 나타내어, 다른 두 벡터와 비교하여, GFPmiR223 감염된 세포주에서 GFP 발현에서의 190-100배수리딕티오를 나타낸다. 3가지 벡터 모두 HT1080 섬유육종 세포 또는 기타 비-단핵구 세포에서 동일한 양의 GFP를 생성했다.
도 11은 항-BCMA-CAR RNV 구조의 표현을 제공한다.
도 12는 miRNA 발현 식별의 박스-플롯 예를 나타낸다.
도 13은 miRNA 발현 탈-표적화 예를 나타낸다. 도면은 U937 단핵구 세포주에서 원래의 GFP 벡터(왼쪽 열), GFP miR 223-3p 벡터(중앙 열) 및 miRaBC에 대한 관련이 없는 miRNA 표적을 갖는 GFP 벡터의 발현을 나타내어, 다른 두 벡터와 비교하여, GFPmiR223 감염된 세포주에서 GFP 발현에서의 100 배수 감소를 나타낸다.
도 14는 env 서열의 프롤린 풍부 영역 안으로 삽입된 양 방향에서의 항-CD8 scFV 서열을 함유하도록 변형된 4070A 양쪽성 엔벨롭을 나타낸다. MuLV 및 렌티 유사형분석을 사용하여 CD34+ 조혈 줄기 세포에 대한 세포-특이적 표적화를 위한 대안적인 키메라 바이러스 엔벨롭의 사용. 표적 림프구에 대한 렌티바이러스 벡터의 유사형분석은 문헌에서 논의되었다(Frank et.al (2019) Surface-Engineered Lentiviral Vectors for Selective Gene Transfer into Subtypes of Lymphocytes, Mol. Ther. (Vol. 12). 대부분의 키메라 유사형분석은 홍역과 Nipah 바이러스 시스템의 이중 표적화 및 융합 기능을 이용하여 발생했다. 바이러스 세포 수용체 부착을 위해, 홍역 바이러스는 시알산 수용체에 부착하기 위해 헤마글루티닌-뉴라미다제(HN); 단백질성 수용체에 부착하기 위해 당단백질(G) 및 헤마글루티닌(H)을 인코딩한다.
도 15a-b는 (a) 힌지-TM 및 시그널링 도메인에 연결된 항-마우스 CD19-1D3 scFV 모노클로날 항체에 기반한 마우스 CD19CAR 작제물을 갖는 pBA-9b 벡터 또는 (b) 힌지-TM 및 시그널링 도메인에 연결된 항-인간 CD19-FMC63 scFV 모노클로날 항체에 기반한 인간 CD19CAR 작제물을 갖는 pBA-9b 벡터의 프로바이러스 통합된 형태를 나타낸다.
도 16은 골수, B 및 NK 세포에서 CAR 서열의 발현을 하향 조절하는데 사용되는 마이크로RNA 표적 서열을 제공한다.
도 17은 인간 항-CD19 CAR 서열의 발현을 보장하는 EF1a 인핸서를 갖는 구성적 CMV 프로모터를 사용하여 발현을 유도하는 SIN 벡터 디자인의 예를 제공한다. 벡터는 그의 상응하는 전구약물에 노출되었을 때 벡터 사멸 스위치로서 인간 코돈 최적화된 티미딘 키나제(TKO) 유전자 또는 효모 시토신 데아미나제 유전자(yCD2)의 발현을 위한 삽입 리보솜 진입 부위(IRES) 서열과, 이어지는 관심있는 유전자의 증강된 발현을 위한 우드척 간염 번역-후(WPRE) 요소를 포함한다.
도 18a-d는 내부 프로모터에 의해 구동된 CRISPR/CAS9를 갖는 (a) CCR5, (b) CCR2, (c) CCR5 및 CCR2, 및 (d) CCR5 및 CCR2에 대한 CRISPR/CAS9 시스템(들)을 포함하는 레트로바이러스 작제물을 나타낸다.
도 19a-d는 HIV 공동-수용체 CCR5 및 CCR2의 활성을 차단함에 의해 HIV 감염 또는 다발성 경화증을 치료하기 위한 레트로바이러스 작제물(a-d)을 나타낸다.
도 20a-d는 HIV 공동-수용체 CCR5 및 CCR2의 siRNA를 사용하여 HIV 감염 또는 다발성 경화증을 치료하기 위한 레트로바이러스 작제물(a-d)을 나타낸다.
도 21은 CCR5 및 CCR2에 대한 CRISPR/CAS 시스템을 사용하여 HIV 감염 또는 다발성 경화증을 치료하기 위한 레트로바이러스 작제물을 나타낸다.
도 22는 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)의 생체내 동원 및 형질도입을 위한 프로토콜에 사용된 타임 라인을 나타낸다.
도 23은 동원된 Balb/c 마우스에서 2시간 동안의 RNV-GFP 생체내 형질도입을 나타낸다. 비장세포를 FACS 분석 및 MethoCultassay에 의한 HSPC의 GFP 형질도입을 위한 배양 3일 후 수확하고 검사했다. FACS 분석 후 찍은 현미경사진(상단 패널은 UV 광 하에서 GFP+세포를 나타내고, 하단 패널은 위상차를 나타냄).
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "대상체"에 대한 언급은 복수의 그러한 대상체를 포함하고 "벡터"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 벡터 및 그의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다.
또한, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함하다", "포함한다", "포함하는" "포괄하다", "포괄한다" 및 "포괄하는"은 상호 교환가능하고 제한하려는 의도가 아니다.
다양한 실시형태의 설명이 용어 "포함하는"을 사용하는 경우, 당업자는 일부 특정 예에서, 실시형태가 "본질적으로 구성되는" 또는 " 구성되는"이라는 언어를 사용하여 대안적으로 기술될 수 있다는 것을 이해한다는 것이 추가로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22 nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012); Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3 rd ed., Wiley-Blackwell (November 28, 2012); 및 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)는 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 당업자에게 제공한다. 항체를 제조하는 방법에 대한 참조는 Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013); Kφhler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7):511-9; Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U. S. Patent No. 5,585,089 (1996 Dec); 및 Riechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323-7을 참고한다 본 명세서에 제공된 모든 표제 및 소표제는 단지 읽기 쉽도록 하기 위한 것이고 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 부가하여, 재료, 방법 및 특정 실시예는 예시에 불과하고 제한하려는 의도가 아니다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물은 본 명세서의 설명과 관련하여 사용될 수 있는 방법론을 기술하고 공개할 목적으로 완전히 참조로 포함된다. 더욱이, 본 개시내용에서 명시적으로 정의된 용어와 유사하거나 동일한 하나 이상의 간행물에 제시된 임의의 용어와 관련하여, 본 개시내용에서 명시적으로 제공된 용어의 정의는 모든 관점에서 우선할 것이다.
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되지 않고 그 자체가 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시형태 또는 양태를 설명하기 위한 것이고, 본 개시내용의 범주를 한정하려는 의도가 아니다.
작동 실시예에서 또는 달리 지시된 경우를 제외하고, 본 명세서에서 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 본 발명을 기술하는데 사용될 때 용어 "약"은 ±1%를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 해당 분야의 숙련가에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내를 의미할 수 있으며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 플러스 또는 마이너스 20%, 플러스 또는 마이너스 10%, 플러스 또는 마이너스 5%, 또는 플러스 또는 마이너스 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 5-배수 이내, 또는 2-배수 이내인 크기의 정도 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 가정될 수 있다. 또한, 값의 범위 및/또는 하위 범위가 제공되는 경우, 범위 및/또는 하위 범위는 범위 및/또는 하위 범위의 평가변수를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변동은 특정된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 양 또는 농도를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 수치 범위의 인용에 대해, 동일한 정밀도로 그 사이에 각각의 개재하는 숫자가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6-9 범위에 대해, 숫자 7 및 8이 6 및 9에 부가하여 고려되고, 6.0-7.0 범위에 대해 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 고려된다.
바이러스의 레트로바이러스과 패밀리는 그 숙주 게놈 안으로 통합되고 형질도입된 세포 및 그 후손에 장기간 유전자 발현을 제공하는 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 감마레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 거품형 바이러스 벡터는 동원된 줄기 세포를 포함하는 세포를 형질도입하는데 사용가능하고 유용하다. 개시내용은 감마레트로바이러스 벡터에 초점을 맞추지만, 당업자는 발명이 아데노바이러스-레트로바이러스 하이브리드, 피기-백 및 스리핑 뷰티 트랜스포존 등과 같은 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 포함하는 모든 유형의 통합 벡터를 사용할 수 있음을 빠르게 인식할 것이다. 개시내용은 유전 질환, 암, 감염성 질환 및 자가면역 질환을 포함한 많은 유형의 질환에서 치료적 효과를 달성하기 위해 벡터의 직접적 투여에 의해 생체내에서 세포(조혈 줄기 세포 포함)를 형질도입하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포는 생체내 감염 이전에 동원될 수 있다.
개시내용의 벡터 작제물은 하기에 기재된 도메인(때때로 카세트로 지칭됨)을 갖는 모듈식으로 간주될 수 있다. 일반적으로, 벡터는 긴 말단 반복, 결합 도메인, 힌지 또는 링커 도메인, 막횡단 도메인, 세포내 도메인, 하나 이상의 miRNA 표적 도메인, 선택적 사멸 스위치 도메인 및 선택적 세포-활성-조절 도메인을 포함한다. 결합 도메인, 힌지/링커, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인은 일반적으로 1세대, 2세대, 3세대 및 관련 작제물을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 다중 또는 단일 사슬, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다. 항체는 '인간화된', '키메라' 또는 비-인간일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화-연결된 Fv, VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체(sdAb) 예컨대 vL 또는 vH, 낙타류 vHH 도메인, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체, 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv 안으로 혼입될 수 있다(예를 들어, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 유형 III(Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드 안으로 그래프팅될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기술하는 미국 특허 번호: 6,703,199 참조).
용어 "항체 중쇄"는 항체 분자에 그의 자연적으로 발생하는 형태로 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭하고, 이는 일반적으로 항체가 속하는 부류를 결정한다.
용어 "항체 경쇄"는 항체 분자에 그의 자연적으로 발생하는 형태로 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄는 2가지 주요 항체 경쇄 이소타입을 지칭한다.
"항암제"는 비정상적인 세포 분열 및 성장을 억제하거나, 신생물 세포의 이동을 억제하거나, 침습성을 억제하거나, 암 성장 및 전이를 예방하는 제제를 지칭한다. 용어는 화학요법제, 생물학적 제제(예를 들어, siRNA, 바이러스 벡터 예컨대 조작된 MLV, 아데노바이러스, 세포독성 유전자를 전달하는 헤르페스 바이러스), 항체 등을 포함한다.
용어 "항암 효과"는 종양 부피에서 감소, 암세포의 수에서 감소, 전이의 수에서 감소, 기대 수명에서 증가, 암 세포 증식에서 감소, 암 세포 생존에서 감소, 또는 암성 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 처음 장소에 암의 발현의 예방에서 CAR의 능력에 의해 나타날 수 있다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산이나 특정 면역학적으로-적합한 세포의 활성화 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 숙련된 기술자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 따라서 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 인코딩될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 개시내용은 하나 초과의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용 및 이들 뉴클레오티드 서열이 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 인코딩하기 위해 다양한 조합으로 배열되는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 더욱이, 숙련된 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성되어 생성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
표적화될 수 있는 항원의 비-제한적인 예는 CD5; CD19; CD20; CD22; CD24; CD30; CD33, CD34; CD38, CD72; CD97; CD123; CD171; CS1(CD2 서브세트 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C-유형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRviii); 강글리오사이드 G2(GD2); 강글리오사이드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4 )bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양-연관된 당단백질 72(TAG72); CD44v6; 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터루킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(Testisin 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4); 엽산 수용체 알파(FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타(FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 연관(MUC1); 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제; 전립선산 포스파타제(PAP); 신장 인자 2 돌연변이(ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체); 탄산 탈수효소 IX(CAlX); 프로테아솜(프로솜, 마크로페인) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 중단점 클러스터 영역(BCR) 및 아벨슨 뮤어라인 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1(Abl)로 구성된 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2(EphA2); 시알릴 루이스 접착 분자(sLe); 강글리오사이드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDCalp(1- 4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량-흑색종 연관된 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드(OAcGD2); 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질 커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 개방 판독 프레임 61(CXORF61); CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1(PLAC1); globoH 글리코세라마이드의 육당 부분(GloboH); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3(ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TAP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종-연관된 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전좌-변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 중단점; 세포자멸사의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막횡단 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍을 이루는 상자 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수세포종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래된 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제-관련된 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B 1(CYP1B 1); CCCTC-결합 인자(징크 핑거 단백질)-유사(BORIS 또는 각인된 부위 조절기의 브라더), T 세포 3에 의해 인식된 편평 세포 암종 항원(SART3); 쌍을 이루는 상자 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2(SSX2); 진보된 당화 최종 생성물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1(RU1); 신장 유비쿼터스 2(RU2); 콩류; 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 열 충격 단백질 70-2 돌연변이(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; 백혈구-연관된 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체-유사 5(FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1(IGLL1); MPL; 비오틴; c-MYC 에피토프 태그; LAMP1 TROP2; GFR알파4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea(CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL11Ra; IL13Ra2; CD179b-IGL11; TCR감마-델타; NKG2D; CD32(FCGR2A) ; Tn Ag; Tim1-/HVCR1; CSF2RA(GM-CSFR-알파); TGF베타R2; 루이스 Ag; TCR-베타1 사슬; TCR-베타2 사슬; TCR-감마 사슬; TCR-델타 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체(LHR); 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR) ; 성선자극 호르몬 수용체(CGHR 또는 GR) ; CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 엔벨롭 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; KSHV K8.1; KSHV-gH; 인플루엔자 A 혈구응집소(HA); GAD; PDL1; 구아닐릴 사이클라제 C(GCC); 데스모글레인 3(Dsg3)에 대한 자가 항체; 데스모글레인 1(Dsg1)에 대한 자가 항체; HLA; HLA-A; HLA-A2; HLA-B; HLA-C; HLA-DP; HLA-DM; HLA-DOA; HLA-DOB; HLA-DQ; HLA-DR; HLA-G; IgE; CD99; Ras G12V; 조직 인자 1(TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2); P-당단백질; STEAP1; Liv1; 넥틴-4; 크립토; gpA33; BST1/CD157; 낮은 전도도 염화물 채널; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원을 포함한다.
"항원 결합 도메인"은 그의 1차, 2차 또는 3차 서열로 인해, 번역-후 변형 및/또는 전하가 고도의 특이성으로 항원에 결합하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 상이한 공급원, 예를 들어 항체(전장 중쇄, Fab 단편, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, 2가 단일 사슬 항체 또는 디아바디), 비-면역글로불린 결합 단백질, 리간드 또는 수용체로부터 유래될 수 있다. 그러나, 연결된 사이토카인(사이토카인 수용체를 담지하는 세포의 인식으로 이어짐), 어피바디, 자연적으로 발생하는 수용체로부터 리간드 결합 도메인, 수용체에 대한 가용성 단백질/펩티드 리간드(예를 들어 종양 세포 상), 펩티드, 및 면역 반응을 촉진하는 백신과 같은 수많은 대안이 있으며, 이는 개시내용의 다양한 실시형태에서 각각 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주어진 동족체 또는 항원에 높은 친화도로 결합하는 거의 모든 분자가 항원 결합 도메인으로서 사용될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 인식될 것이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 일부를 포함한다.
용어 "항감염 효과"는 예를 들어 감염성 제제의 역가에서 감소, 감염성 제제의 집락 수에서 감소, 감염성 병태와 연관된 다양한 생리적 증상의 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
용어 "항종양 효과" 또는 "항암 효과"는 예를 들어, 종양 부피에서 감소, 종양 세포의 수에서 감소, 종양 세포 증식에서 감소, 전이의 억제, 또는 종양 세포 생존에서 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "유익한 결과"는 질환 상태의 중증도 감소 또는 완화, 질환 상태 악화 예방, 질환 상태 치유, 질환 상태 발병 예방, 질환 상태를 발전시키는 환자 또는 대상체의 기회 감소 및 환자 또는 대상체의 수명 또는 기대 수명 연장을 포함하지만 이에 제한되지 않는닫. 비-제한적인 예로서, "유익한 결과"는 하나 이상의 증상(들)의 완화, 결핍 정도의 감소, 암 진행의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 전이 또는 침습성의 지연 또는 감속, 및 암과 연관된 증상의 개선 또는 완화일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "이의 생물학적 등가물"은 참조 단백질, 항체 또는 이의 단편, 폴리펩티드 또는 핵산을 언급할 때 "이의 등가물"과 동의어로 의도되며, 원하는 구조 및/또는 기능성을 여전히 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도한다. 예를 들어, 등가물은 적어도 약 70%의 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80%의 상동성 또는 동일성 및 대안적으로는, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안적으로는 적어도 약 90%, 또는 대안적으로는 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 적어도 98% 퍼센트 상동성 또는 동일성을 의도하고, 참조 단백질, 폴리펩티드, 항체 또는 이의 단편 또는 핵산과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드를 언급할 때, 이의 등가물은 엄격한 조건 하에서 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체에 혼성화하고 동일한 생물학적 기능을 갖는 (예를 들어 특정 miRNA에 결합하거나 또는 그것이 비교되는 폴리뉴클레오티드와 동일한 또는 유사한 생물학적 효과를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는) 폴리뉴클레오티드이다. 대안적으로, 폴리펩티드 또는 단백질을 언급할 때, 이의 등가물은 엄격한 조건 하에 참조 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 폴리펩티드 또는 단백질이다.
"암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 B-세포 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비-호지킨 림프종), T 세포 림프종, 골수종, 골수이형성 증후군, 골수증식성 장애(예를 들어, 진성 적혈구증가증, 골수섬유증, 본태성 혈소판증가증 등), 피부암, 뇌종양, 유방암, 결장암, 직장암, 식도암, 항문암, 원발성 불명의 암, 내분비암, 고환암, 폐암, 간세포암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 생식기관암 갑상선암, 신장암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암(예를 들어, 다형성 교모세포종), 전립선암(안드로겐-의존성 전립선암 및 안드로겐-독립성 전립선암을 포함하지만 제한되지 않음), 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 암 및 세포 증식성 장애는 당업계에서 쉽게 인식될 것이다. 용어 "종양" 및 "암"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어 두 용어 모두는 고체 및 액체, 예를 들어 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본 명세서에 사용된 용어 "암" 또는 "종양"은 전악성, 뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다. 용어 "암"은 조직병리학적 유형 또는 침습성의 단계에 관계없이 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것으로 의미된다.
용어 "세포-활성-조절 도메인"은 PDL1, PDL2, CD80, CD86, crmA, p35, NEMO-K277A(또는 이의 유도체), K13-opt, IKK2-SS/EE, IKK1-SS/EE, 41BBL, CD40L, vFLIP-K13, MC159 등 및 면역 세포(예를 들어, T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포 등)에서 발현되어 면역 세포의 활성을 감소, 조절 또는 변형시키는 이의 조합 중 임의의 하나 이상을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 액세서리 모듈은 CAR 또는 CAR-발현 세포의 발현 또는 활성을 증가, 감소, 조절 또는 변형하기 위해 CAR과 같은 면역 수용체와 공동-발현된다. 액세서리 모듈은 단일 벡터를 사용하거나 2개 이상의 상이한 벡터를 사용하여 CAR과 공동-발현될 수 있다.
"화학요법제"는 암에 대한 화학요법에 사용되는 것으로 공지된 화합물이다. 화학요법제의 비-제한적 예는 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴과 같은 니트로스우레아; 엔디인 항생제와 같은 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1(예를 들어, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186(1994) 참조)); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 발색단백 엔디인 항생물질 발색단), 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-부신; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 배당체; 아미노레불린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 안에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 아사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, 오리건주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 TAXOL® 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스턴 소재), 파클리탁셀의 ABRAXANE® 크레모포어-유리, 알부민-조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Ill. 샤움버그 소재) 및 TAXOTERE® 도세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로란부실; GEMZAR® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 네이블빈; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴, 라파티닙(Tykerb); 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR(예를 들어, 에를로티닙(Tarceva®)) 및 VEGF-A의 억제제 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
"키메라 항원 수용체"(CAR)는 입양 세포 전달이라고 불리는 기술을 사용하여 암, 자가면역 질환 및 감염성 질환에 대한 요법으로 사용하기 위해 고려되는 인공(비-자연적으로 발생하는) 면역 세포(예를 들어 T 세포) 수용체이다. CAR은 또한 인공 T-세포 수용체, 키메라 T-세포 수용체 또는 키메라 면역수용체로 알려져 있다. CAR은 CAR이 결합하는 특정 항원에 반응하여 T 세포 활성화 및 증식을 자극하도록 특이적으로 구성된다. 일반적으로, CAR은 면역 이펙터 세포에서 발현될 때 세포에 표적 항원 또는 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성과 세포내 신호 생성을 제공하는, 가장 단순한 실시형태에서 전형적으로 2개의 폴리펩티드의 세트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CAR은 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 시그널링 도메인을 포함하는 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 시그널링 도메인(본 명세서에서 "세포내 시그널링 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 세트는 서로 인접한다. 일 실시형태에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단(N-ter)에 선택적 리더 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하며, 여기서 리더 서열은 CAR의 세포 프로세싱 및 국지화 동안 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)으로부터 세포 막으로 선택적으로 절단된다. 다양한 실시형태에서, CAR은 항원 결합 도메인, 힌지 영역(HR), 막횡단 도메인(TMD), 선택적 공동-자극 도메인(CSD) 및 세포내 시그널링 도메인(ISD)을 포함하는 재조합 폴리펩티드이다. 선택적 공동자극 도메인은 일반적으로 1세대 CAR 작제물에 부재한다. 항원 결합 도메인(예를 들어, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 포함하는 2세대 CAR은 전형적으로 공동자극 도메인(예를 들어 41BB)을 합체한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 용어 "CAR" 또는 "CAR들"은 또한 항체-TCR 키메라 분자 또는 Ab-TCR(참고로 본 명세서에 포함된 WO2017/070608A1), TCR 수용체 융합 단백질 또는 TFP(본 명세서에 참고로 포함된 WO2016/187349A1), 삼-기능성 T 세포 항원 커플러(Tri-TAC 또는 TAC)(본 명세서에 참고로 포함된 WO2015/117229A1 참고)와 같은 세포 상에 항원 특이성을 부여하기 위한 보다 새로운 접근법을 포괄한다. 전형적으로, 용어 "CAR-T 세포"는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T-세포를 지칭하기 위해 사용된다. 따라서, 그러한 CAR을 담지하는 T 림프구는 일반적으로 CAR-T 림프구로 지칭된다. CAR은 조혈 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC), NK 세포 및 대식세포와 같은 T 세포 이외의 세포에서도 발현될 수 있다.
"코돈 최적화" 또는 "종 코돈 편향에 대한 제어"는 특정 숙주 세포의 바람직한 코돈 활용을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 숙주에서 그의 발현을 증강시키기 위해 코딩 서열을 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 유전 코드는 64개의 가능한 코돈으로 중복되지만 대부분의 유기체는 전형적으로 이들 코돈의 서브셋트를 사용한다. 한 종에서 가장 자주 이용되는 코돈을 최적 코돈이라고 하고, 매우 자주 이용되지 않는 코돈을 희귀 또는 낮은-활용 코돈으로 분류한다. 코돈 최적화의 일부로서, 개시내용의 벡터의 코딩 서열은 ApoBec 매개된 돌연변이를 제한하도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 개시내용의 벡터는 그의 안정성 및/또는 발현을 변형시키도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 발현에서의 변화는 세포에서 복제할 때 불활성화 또는 약화 돌연변이가 벡터에 축적되는 빈도로 인해 발생할 수 있다. 조사에 따르면 가장 빈번한 이벤트 중 하나는 제1 복제 단계에서 단일 가닥 DNA의 음성 가닥에서 G에서 A로의 돌연변이(C에서 T로의 돌연변이에 상응) 특징적인 ApoBec 매개된 돌연변이인 것으로 나타났다. 이것은 벡터-인코딩된 단백질의 아미노산 조성에서 변화 및 TGG(트립토판)에서 정지 코돈(TAG 또는 TGA)으로의 파괴적인 변화를 야기할 수 있다. 일 실시형태에서, 이 불활성화 변화는 ApoBec 변형의 위치에서 페닐알라닌 또는 티로신과 같은 유사한 화학적 또는 구조적 특성을 갖는 다른 아미노산의 치환 코돈에 의해 회피된다.
이러한 돌연변이는 트립토판 코돈을 인코딩된 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 허용가능한 코돈으로 변경하는 벡터 도메인의 코딩 서열에서 하나 이상의 코돈의 변형을 포함할 수 있다. 트립토판에 대한 코돈이 UGG(DNA에서 TGG)인 것은 당업계에 공지되어 있다. 더욱이, "정지 코돈"이 UAA, UAG 또는 UGA(DNA에서 TAA, TAG 또는 TGA)인 것은 당업계에 공지되어 있다. 트립토판 코돈에서 단일 점 돌연변이는 부자연스러운 정지 코돈을 유발할 수 있다(예를 들어, UGG -> UAG 또는 UGG -> UGA). 인간 APOBEC3GF(hA3G/F)는 G -> A 과돌연변이를 통해 레트로바이러스 복제를 억제하는 것이 또한 알려져 있다(Neogi et al., J. Int. AIDS Soc., 16(1):18472, Feb. 25, 2013). 따라서, 개시내용은 트립토판 코돈을 허용가능한 비-트립토판 코돈으로 변형함에 의해 ApoBec 과돌연변이를 감소시키기 위해 개시내용의 벡터의 코딩 서열에 대한 변형을 고려한다.
"보존적 치환" 또는 "보존적 서열 변형"은 인코딩된 단백질의 결합 특성 또는 기능에 유의하게 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 예를 들어, "보존적 서열 변형"은 개시내용의 CAR 작제물의 결합 특성 또는 기능에 유의하게 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형(예를 들어, 불변 사슬, 항체, 항체 단편, 또는 비-면역글로불린 결합 도메인에서 보존적 변경)을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 추가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 개시내용의 CAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 CAR은 본 명세서에 기재된 결합 및/또는 기능적 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "공동-자극 도메인"은 T 세포의 증식, 생존 및/또는 발달을 증강시키는 생물학적 제제를 지칭한다. 공동-자극 도메인은, 예를 들어, TNFR 슈퍼패밀리, CD28, CD137(4-1BB), CD134(OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이의 조합의 구성원 중 임의의 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. (예를 들어, 다른 단백질로부터의) 다른 공동-자극 도메인은 당업자에게 명백할 것이고, 개시내용의 대안적 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다.
사이토카인 방출 증후군(CRS)은 그 자체로 발열, 저혈압, 숨가쁨, 신 기능장애, 폐 기능장애 및/또는 모세관 누출 증후군과 같은 징후와 증상으로 나타나는 세포 요법(예를 들어, CAR-T, 이중특이성 T 세포 계합 항체 등)의 합병증이다. CRS는 일반적으로 IL6 및 IL1과 같은 사이토카인의 과도한 생산에 기인한 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "~로부터 유래된"은 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 그것은 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하고 제2 분자에서 유래된 제1 분자에 대한 프로세스 또는 공급원 제한을 포함하지 않는다. 예를 들어, 항체 분자로부터 유래된 항원 결합 도메인의 경우, 항원 결합 도메인은 필요한 기능, 즉 항원에 결합하는 능력을 갖도록 충분한 항체 구조를 보유한다. 여기에는 항체를 생산하는 특정 공정에 대한 임의의 제한이 포함되지 않는다.
"도메인" 또는 "모듈"은 작제물의 다른 도메인 또는 모듈의 기능에 영향을 미치지 않으면서 유사한 도메인으로 대체될 수 있는 더 큰 작제물의 분리된 섹션 또는 부분을 지칭한다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체에서 폴리펩티드 또는 코딩 핵산 서열은 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 갖는 것으로 기술될 수 있다. CAR의 각 "도메인"은 CAR의 다른 도메인에 영향을 미치지 않고 변형되거나 변경될 수 있다. 예를 들어, 결합 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 다수의 상이한 결합 도메인 중 하나일 수 있다. 결합 도메인은 CD19 항원에 결합하는 폴리펩티드 서열일 수 있다. 이 CD19 결합 도메인은 막관통 도메인을 변경해야 하는 것에 영향을 미침이 없이 CD20에 결합하는 결합 도메인으로 대체될 수 있다. 유사하게, 바이러스 캡시드에 함유된 개시내용의 레트로바이러스 벡터는 (5'에서 3'으로) 다음을 포함하는 다수의 도메인을 갖는 폴리뉴클레오티드 센스 RNA 가닥을 포함한다: 5' 반복(5'R) - U5 - 패키징 서열 - CAR 서열 -(예를 들어, 티미딘 키나제 코딩 서열에 연결된 IRES 도메인을 포함하는 선택적 사멸 스위치) - miRNA 표적화 서열(들) - U3 - 3' 반복(3'R). 바이러스 폴리뉴클레오티드의 각 도메인/모듈은 변경될 수 있어 상이한 CAR 서열, 상이한 사멸 스위치(예를 들어, TKO 또는 CD), 상이한 miRNA 표적화 서열 등이 제공될 수 있다. 개시내용의 작제물은 설계상 모듈식이다. 폴리뉴클레오티드 작제물이든 인코딩된 폴리펩티드 작제물이든, 작제물의 각 도메인/모듈은 변이가 도메인의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한 서열에서 사소한 변이를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 막횡단 도메인은 특정 막횡단 서열에 대해 80-100% 동일성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 "유전적으로 변형된 세포", "재지향된 세포", "유전적으로 조작된 세포" 또는 "변형된 세포"는 예를 들어 CAR을 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 벡터를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "힌지 영역"(HR)은 CAR의 항원 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 있는 친수성 영역을 지칭한다. 힌지 영역은 항체의 Fc 단편 또는 이의 단편 또는 유도체, 항체의 힌지 영역 또는 이의 단편 또는 유도체, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 힌지 영역의 예는 CD8a 힌지, 및 예를 들어 IgG(예컨대 인간 IgG4)의 Gly3 또는 CH1 및 CH3 도메인만큼 작을 수 있는 폴리펩티드로 만들어진 인공 스페이서를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 (i) IgG4의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (ii) IgG4의 힌지 영역, (iii) IgG4의 힌지 및 CH2, (iv) CD8a의 힌지 영역, (v) IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (vi) IgG1의 힌지 영역 또는 (vi) IgG1의 힌지 및 CH2 영역 중 임의의 하나 이상이다. 다른 힌지 영역은 당업자에게 명백할 것이고 개시내용의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "면역 세포"는 항원 제시 세포, B-세포, 호염기구, 세포독성 T-세포, 수지상 세포, 호산구, 과립구, 헬퍼 T-세포, 백혈구, 림프구, 대식세포, 비만 세포, 기억 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 호중구, 식세포, 형질 세포 및 T-세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 면역계의 세포를 지칭한다. "생체내 면역 세포"는 대상체로부터 단리되거나 제거되지 않은 대상체의 신체에 존재하는 면역 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어로 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어, 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수-유래된 식세포를 포함한다.
"세포내 시그널링 도메인"(ISD) 또는 "세포질 도메인"은 분자의 세포내 시그널링 부분을 지칭한다. 세포내 시그널링 도메인은 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 면역 이펙터 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함한 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다. 이펙터 기능 신호를 변환하는 도메인의 예는 T-세포 수용체 복합체의 z 사슬 또는 임의의 이의 동족체(예를 들어, h 사슬, FceR1g 및 b 사슬, MB1(Iga) 사슬, B29(Igb) 사슬 등), 인간 CD3 제타 사슬, CD3 폴리펩티드(D, d 및 e), syk 패밀리 티로신 키나제(Syk, ZAP 70 등), src 패밀리 티로신 키나아제(Lck, Fyn, Lyn 등) 및 CD2, CD5 및 CD28과 같은 T-세포 형질도입에 관여하는 기타 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 세포내 시그널링 도메인은 당업자에게 명백할 것이고 개시내용의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 세포내 시그널링 도메인은 일차 세포내 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 일차 세포내 시그널링 도메인은 일차 자극, 또는 항원 의존적 시뮬레이션을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포내 시그널링 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 시그널링 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 독립적인 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 일차 세포내 시그널링 도메인은 CD3z 또는 CD3z1xx의 세포질 서열을 포함할 수 있고(Feucht et al. Nt. Med 2019), 공동자극 세포내 시그널링 도메인은 공동-수용체 또는 공동자극 분자, 예컨대 CD28 또는 41BB로부터 세포질 서열을 포함할 수 있다.
일차 세포내 시그널링 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 시그널링 모티프를 포함할 수 있다. 일차 세포질 시그널링 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 공통 FeR 감마(FCER1G), Fe 감마 RIIa, FeR 베타(Fe 입실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12로부터 유해된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 또는 생물학적제제 또는 세포 물질을 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "단리된"은 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩티드, 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관으로부터 각각 분리된, DNA 또는 RNA와 같은 핵산; 단백질 또는 폴리펩티드; 세포 또는 세포 소기관(들); 또는 조직을 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 때 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않을 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용되고 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 모두를 포괄하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 조직을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용되고, 배양 및 조작된 세포 또는 조직 둘 모두를 포괄하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "링커"(또한 "링커 도메인" 또는 "링커 영역")는 각각 CAR 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 2개 이상의 도메인 또는 영역을 함께 연결하는 올리고 또는 펩티드를 지칭한다. 링커는 길이가 1 내지 500개 아미노산 또는 길이가 3 내지 1500개 뉴클레오티드의 임의의 곳일 수 있다. 일부 실시형태에서 "링커"는 절단가능하거나 비-절단가능하다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 용어 "링커"는 비-절단가능한 링커를 의미한다. 상기 비-절단가능한 링커는 서로에 대해 인접한 단백질 도메인의 자유로운 움직임을 허용하는 유연한 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 이러한 잔기의 비-제한적인 예는 글리신 및 세린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 유연하지 않은 아미노산 잔기를 포함한다. 절단가능한 링커의 예는 2A 링커(예를 들어, T2A), 2A-유사 링커 또는 이의 기능적 등가물 및 이의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 피코르나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스(P2A), 토세아 아시그나 바이러스(T2A) 또는 이의 조합, 변이체 및 기능적 등가물(예를 들어, GSG 변형된 변이체)의 CHYSEL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 2A 글리신과 2B 프롤린 사이의 절단을 초래하는 모티프를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 수 있는 다른 절단가능한 링커는 당업자에 의해 쉽게 이해된다.
본 명세서에 사용된 용어 "유연한 폴리펩티드 링커"는 폴리펩티드 사슬을 함께 (예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께) 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 구성된 펩티드 링커를 지칭한다. 일 실시형태에서, 유연한 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고 아미노산 서열 (Gly3-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 등)이다.
본 명세서에 사용된 "포유동물"은, 제한 없이, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 가축; 마우스, 랫트 및 기니 피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물 등을 포함하는 포유류 부류의 임의의 구성원을 지칭한다. 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성인 및 신생 대상체뿐만 아니라 남성이든 여성이든 태아는 이 용어의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 당업자는 CAR 작제물 및 관련된 서열이 특정 포유동물 종에서 사용하기 위해 최적화된다는 것을 인식할 것이다(예를 들어, 인코딩된 단백질/폴리펩티드는 치료되는 포유동물 종으로부터 유래됨).
본 명세서에 사용된 "표적-외 형질도입된 세포"는 개시내용의 바이러스 벡터에 의해 감염되지만 벡터의 유전자의 발현이 원치 않거나 바람직하지 않은 세포를 지칭한다. 바이러스 벡터는 바이러스 엔벨롭 상의 표적화 단백질의 혼입을 통해 "표적화"될 수 있다는 것이 당업계에서 인지될 것이다. 부가하여, 또는 대안적으로, 바이러스 유전자의 발현은 조직 특이적 프로모터의 사용을 통해 제어될 수 있다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 바이러스 유전자/작제물의 발현은 선천적 유전자 발현 조절을 조절하기 위해 존재하는 세포 기구의 사용을 통해 조절될 수 있다. 이 경우에 RNAi 표적 서열이 사용될 수 있으며, 이로써 표적 서열에 대한 타고난 miRNA의 결합은 표적-외 세포 유형에서의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 각 구성요소가 기능적일 수 있도록 제1 구성요소와 제2 구성요소 사이의 기능적 연결 또는 회합을 지칭한다. 예를 들어, 작동가능하게 연결된 것은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 연관을 포함하여 후자의 발현을 초래한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 상관관계에 위치할 때 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 2개의 폴리펩티드의 맥락에서, 제1 폴리펩티드는 임의의 연결과 독립적인 방식으로 기능하고, 제2 폴리펩티드는 둘 사이의 연결이 부재하는 것처럼 기능한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 "동일성 퍼센트"는 서열 동일성 퍼센트에 의해 관련된 2개 이상의 서열을 지칭한다. 2개 서열이 비교 윈도우, 또는 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 지정된 영역에 걸쳐서 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬될때, 동일한(예를 들어, 특정된 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 선택적으로 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 갖는 경우 2개 서열은 "실질적으로 동일"하다. 선택적으로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개 뉴클레오티드(또는 10개 아미노산)인 영역에 걸쳐, 또는 보다 전형적으로 길이가 100개 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드(또는 20, 50, 200개 이상의 아미노산)인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교의 경우, 일반적으로 하나의 서열이 테스트 서열이 비교되는 참조 서열로 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고 필요에 따라 하위 서열 좌표를 지정하며 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 기본 프로그램 매개변수를 사용하거나 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 그런 다음 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기반으로 참조 서열와 관련된 테스트 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 공개적으로 이용가능하다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어, Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c의 국지 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Bioi. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하기 위해 사용될 수 있는 알고리즘의 두 가지 예는 Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Bioi. 215:403-410에 각각 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터(NCBI)를 통해 공개적으로 이용가능하다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 부가하여, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Blossom 62 매트릭스 또는 P AM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Bioi. 48:444-453) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "RNAi 표적 서열", 또는 "miR 표적 서열" 또는 "miR 표적 카세트"는 RNA 간섭(간섭 RNA)을 유도하는 dsRNA에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 따라서, RNAi 표적 서열은 적어도 하나의 RNAi 유도 분자(간섭 RNA)에 본질적으로 상보적인 서열이다. RNAi 표적 서열은 miRNA 표적 서열 또는 siRNA 표적 서열이다. 전형적으로 RNAi 표적 서열은 miRNA 표적 서열이다. 아래에서 보다 완전하게 기재된 바와 같이, 개시내용은 CAR에 대한 코딩 서열, 하나 이상의 RNAi 표적화 서열 및 선택적 사멸 스위치 코딩 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 제공한다.
용어 "단일 사슬 가변 영역" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 합성 링커, 예를 들어 짧은 유연성 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고 단일 사슬 폴리펩티드로 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 보유한다. 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 scFv는 vL 및 vH 가변 영역을 어느 순서로든 가질 수 있으며, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 끝과 관련하여 scFv는 vL-링커-vH를 포함할 수 있거나 vH-링커-vL을 포함할 수 있다. 대안적으로, scFv는 또한 (vL+vH) 또는 (vH+vL)로 기술된다.
용어 "시그널링 도메인"은 2차 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능함에 의해 정의된 시그널링 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내 정보를 전달하는 단백질의 기능적 영역을 지칭한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 임의의 가축화된 포유동물 또는 인간)를 포함하도록 의도된다. 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자"는 개시내용의 조성물 또는 약학적 조성물의 투여가 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 포유동물 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함하며, 인간이 바람직하다.
용어 "T-세포" 및 "T-림프구"는 상호교환가능하고 본 명세서에서 동의어로 사용된다. 예에는 나이브 T 세포("림프구 전구세포"), 중추 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 줄기 기억 T 세포(Tscm), iPSC-유래된 T 세포, 합성 T 세포 또는 이의 조합이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "치료 효과"는 예를 들어, 종양 부피에서 감소, 암 세포의 수에서 감소, 전이의 수에서 감소, 기대 수명에서 증가, 암 세포 증식에서 감소, 암 세포 생존에서 감소, 감염제의 역가에서 감소, 감염제의 집락 수에서 감소, 질환 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "치료 효과"는 또한 먼저 질환의 발현의 예방 또는 질환의 재발의 예방에서 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료적으로 유효한 양"은 질환 또는 장애의 적어도 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 벡터 또는 생체내 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 약학적 조성물의 양을 지칭하고, 원하는 효과를 제공하기 위한 약리학적 조성물의 충분한 양에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 "치료적으로 유효한 양"이라는 문구는 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험 비율에서 장애를 치료하기에 충분한 양의 조성물을 의미한다.
증상에서의 치료적으로 또는 예방학적으로 유의한 감소는 예를 들어 대조군 또는 치료되지 않은 대상체 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 투여하기 이전의 대상체의 상태와 비교하여 측정된 매개변수에서 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150% 또는 그 초과이다. 측정되거나 측정가능한 매개변수는 임상적으로 검출가능한 질환의 표지, 예를 들어 생물학적 표지의 상승 또는 저하된 수준, 뿐만 아니라 암에 대한 임상적으로 허용되는 증상 또는 표지의 척도와 관련된 매개변수를 포함한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 및 제형의 총 일일 용법은 건전한 의학적 판단의 범주 내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다. 필요한 정확한 양은 치료 중인 질환의 유형, 대상체의 성별, 연령 및 체중과 같은 요인에 따라 다양할 것이다.
본 명세서에 사용된 "막횡단 도메인"(TMD)은 원형질막을 가로지르는 CAR의 영역을 지칭한다. 개시내용의 CAR의 막횡단 도메인은 막횡단 단백질(예를 들어, 유형 I 막횡단 단백질), 인공 소수성 서열 또는 이의 조합의 막횡단 영역이다. 다른 막횡단 도메인은 당업자에게 명백할 것이고 개시내용의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, TMD는 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD3γ, CD3ε, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CDl la, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 막횡단 도메인으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용된 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입되어 숙주를 형질전환하고 도입된 서열의 발현(예를 들어 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 등을 포함한다.
용어 "바이러스 벡터"는 바이러스로부터 수득되거나 유래된 벡터를 지칭한다. 전형적으로 바이러스는 렌티바이러스 및 감마 레트로바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 레트로바이러스이다. 개시내용의 바이러스 벡터는 감마-레트로바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스를 기반으로 할 수 있다. 개시내용의 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)와 같은 비-영장류 렌티바이러스를 기반으로 할 수 있다. 개시내용의 바이러스 벡터는 바이러스 엔벨롭에 유사분열 T-세포 활성화 막횡단 단백질 및/또는 사이토카인-기반 T-세포 활성화 막횡단 단백질을 포함한다. 유사분열 T-세포 활성화 막횡단 단백질 및/또는 사이토카인-기반 T-세포 활성화 막횡단 단백질은 상기 설명된 바와 같이 숙주 세포 막으로부터 유래된다.
본 명세서에 사용된 "바이러스 유사 입자" 또는 "VLP"는 바이러스 게놈이 결여된 바이러스 입자를 지칭한다. 어떤 경우에는 VLP에 env 단백질을 결한다. 완전한 바이러스 입자와 마찬가지로 이들은 숙주 세포 지질-이중층(막)으로 구성된 외부 바이러스 엔벨롭을 함유하므로 숙주 세포 막횡단 단백질을 함유한다. VLP는 개시내용의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
하기에 더 완전하게 기재된 바와 같이, 개시내용은 표적-외 형질도입된 세포에서 벡터에 함유된 코딩 서열(예를 들어, CAR 코딩 서열)의 발현을 제어하기 위해 벡터 안으로 삽입된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다. 특정 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 캡슐화된 바이러스 폴리뉴클레오티드 내로 삽입된 miRNA 표적 서열(들)을 포함할 수 있다. 표적-외 세포에서 발현된 miRNA는 이러한 miRNA 표적 서열(들)에 결합할 수 있고 miRNA 표적 서열을 함유하는 바이러스 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제함에 의해, 표적-외 형질도입된 세포에서 벡터-함유 코딩 서열(예를 들어, CAR)의 바이러스 복제 및/또는 발현을 제한한다. 이러한 재조합 바이러스 벡터는 miR을 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖는 세포와 비교하여 합체된 miR 표적 서열(들)에 결합할 수 있는 하나 이상의 miRNA를 발현하는 세포에서 벡터-함유 코딩 서열의 감소 또는 감쇠된 복제 및/또는 발현을 나타내기 때문에 본 명세서에서 "miR-감쇠된", "발현-제한된 벡터" 또는 "복제-제한된 벡터"로 지칭될 수 있다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열(들)은 CAR 코딩 서열의 3' 비번역된 영역(UTR) 및/또는 3' UTR 하류에 합체된다. 전사될 때, CAR 코딩 서열의 mRNA 전사체는 하나 이상의 miRNA 표적 서열(예를 들어, miRNA 표적 서열 카세트)을 포함하는 miR-표적 서열(TS)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다. miR-TS 카세트가 2개 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 이러한 실시형태에서, 2개 이상의 표적 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 복수의 miRNA 표적 서열 각각은 동일한 miRNA에 대한 표적 서열이다. 예를 들어, miR-TS 카세트는 뉴클레오티드 스페이서(예를 들어, 1-10 뉴클레오티드)에 의해 바로 인접하거나 분리된 동일한 miR 표적 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 2 내지 6개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 3개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 4개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 5개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 6개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 7개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 8개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 9개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 10개 카피를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 복수는 적어도 2개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피 및 제2 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피 및 제2 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피 및 제2 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 적어도 3개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 하나 이상의 카피, 제2 miR 표적 서열의 하나 이상의 카피, 및 제3 miR 표적 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피, 제2 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피, 및 제3 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피, 제2 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피, 및 제3 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 적어도 4개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 적어도 하나의 카피, 제2 miR 표적 서열의 적어도 하나의 카피, 제3 miR 표적 서열의 적어도 하나의 카피, 및 제4 miR 표적 서열의 적어도 하나의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피, 제2 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피, 제3 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피 및 제4 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피, 제2 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피, 제3 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피, 및 제4 miR 표적 서열의 3 또는 4개 카피를 포함한다.
miR-TS 카세트가 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 일부 실시형태에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 임의의 개재하는 핵산 서열 없이 나란히 배열될 수 있다. 일부 양태에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 링커 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 약 4 내지 약 20개의 뉴클레오티드를 포함한다. 추가 실시형태에서, 링커 서열은 약 4 내지 약 16개의 뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 실시형태로서, miR-TS 카세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 다음 서브유닛을 포함할 수 있다: 제1 miRNA 표적 서열-링커-제2 miRNA 표적 서열, 여기서 인접한 서브유닛은 추가 링커 서열에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 miRNA 표적 서열은 동일한 miRNA의 표적이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 miRNA 표적 서열은 상이한 miRNA의 표적이다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-1251-5p, miR-219a-5p, miR-219a-2-3p, miR-124-3p, miR-448, miR-138-2-3p, miR-490-5p, miR-129-1-3p, miR-1264, miR-3943, miR-490-3p, miR-383-5p, miR-133b, miR-129-2-3p, miR-128-2-5p, miR-133a-3p, miR-129-5p, miR-1-3p, miR-885-3p, miR-124-5p, miR-759, miR-7158-3p, miR-770-5p, miR-135a-5p, miR-885-5p, let-7g-5p, miR-100, miR-101, miR-106a, miR-124, miR-124a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-125b, miR-127-3p, miR-128, miR-129, miR-136, miR-137, miR-139-5p, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-146b-5p, miR-149, miR-152, miR-153, miR-195, miR-21, miR-212-3p, miR-219-5p, miR-222, miR-29b, miR-31, miR-3189-3p, miR-320, miR-320a, miR-326, miR-330, miR-331-3p, miR-340, miR-342, miR-34a, miR-376a, miR-449a, miR-483-5p, miR-503, miR-577, miR-663, miR-7, miR-7-5p, miR-873, let-7a, let-7f, miR-107, miR-122, miR-124-5p, miR-139, miR-146a, miR-146b, miR-15b, miR-16, miR-181a, miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c, miR-181d, miR-184, miR-185, miR-199a-3p, miR-200a, miR-200b, miR-203, miR-204, miR-205, miR-218, miR-23b, miR-26b, miR-27a, miR-29c, miR-328, miR-34c-3p, miR-34c-5p, miR-375, miR-383, miR-451, miR-452, miR-495, miR-584, miR-622, miR-656, miR-98, miR-124-3p, miR-181b-5p, miR-200b, 및/또는 miR-3189-3p에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 뇌암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-10b-5p, miR-126-3p, miR-145-3p, miR-451a, miR-199b-5p, miR-5683, miR-3195, miR-3182, miR-1271-5p, miR-204-5p, miR-409-5p, miR-136-5p, miR-514a-5p, miR-559, miR-483-3p, miR-1-3p, miR-6080, miR-144-3p, miR-10b-3p, miR-6130, miR-6089, miR-203b-5p, miR-4266, miR-4327, miR-5694, miR-193b, let-7a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-100, miR-107, miR-10a, miR-10b, miR-122, miR-124, miR-1258, miR-125a-5p, miR-125b, miR-126, miR-127, miR-129, miR-130a, miR-132, miR-133a, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-146b, miR-147, miR-148a, miR-149, miR-152, miR-153, miR-15a, miR-16, miR-17-5p, miR-181a, miR-1826, miR-183, miR-185, miR-191, miR-193a-3p, miR-195, miR-199b-5p, miR-19a-3p, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-205, miR-206, miR-211, miR-216b, miR-218, miR-22, miR-26a, miR-26b, miR-300, miR-30a, miR-31, miR-335, miR-339-5p, miR-33b, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-374a, miR-379, miR-381, miR-383, miR-425, miR-429, miR-450b-3p, miR-494, miR-495, miR-497, miR-502-5p, miR-517a, miR-574-3p, miR-638, miR-7, miR-720, miR-873, miR-874, miR-92a, miR-98, miR-99a, mmu-miR-290-3p, 및/또는 mmu-miR-290-5p에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 유방암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-143, miR-145, miR-17-5p, miR-203, miR-214, miR-218, miR-335, miR-342-3p, miR-372, miR-424, miR-491-5p, miR-497, miR-7, miR-99a, miR-99b, miR-100, miR-101, miR-15a, miR-16, miR-34a, miR-886-5p, miR-106a, miR-124, miR-148a, miR-29a, 및/또는 miR-375에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 자궁경부암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-133a-5p, miR-490-5p, miR-124-3p, miR-137, miR-655-3p, miR-376c-3p, miR-369-5p, miR-490-3p, miR-432-5p, miR-487b-3p, miR-342-3p, miR-223-3p, miR-136-3p, miR-136-3p, miR-143-5p, miR-1-3p, miR-214-3p, miR-143-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-451a, miR-127-3p, miR-133a-3p, miR-145-5p, miR-145-3p, miR-199a-5p, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-100, miR-101, miR-126, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-192, miR-200c, miR-21, miR-214, miR-215, miR-22, miR-25, miR-302a, miR-320, miR-320a, miR-34a, miR-34c, miR-365, miR-373, miR-424, miR-429, miR-455, miR-484, miR-502, miR-503, miR-93, miR-98, miR-186, miR-30a-5p, miR-627, let-7a, miR-1, miR-124, miR-125a, miR-129, miR-1295b-3p, miR-1307, miR-130b, miR-132, miR-133a, miR-133b, miR-137, miR-138, miR-139, miR-139-5p, miR-140-5p, miR-148a, miR-148b, miR-149, miR-150-5p, miR-154, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-18a, miR-191, miR-193a-5p, miR-194, miR-195, miR-196a, miR-198, miR-199a-5p, miR-203, miR-204-5p, miR-206, miR-212, miR-218, miR-224, miR-24-3p, miR-26b, miR-27a, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-29b, miR-30a-3p, miR-30b, miR-328, miR-338-3p, miR-342, miR-345, miR-34a-5p, miR-361-5p, miR-375, miR-378, miR-378a-3p, miR-378a-5p, miR-409-3p, miR-422a, miR-4487, miR-483, miR-497, miR-498, miR-518a-3p, miR-551a, miR-574-5p, miR-625, miR-638, miR-7, miR-96-5p, miR-202-3p, miR-30a, 및/또는 miR-451에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 결장 또는 결장직장암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-101, miR-130a, miR-130b, miR-134, miR-143, miR-145, miR-152, miR-205, miR-223, miR-301a, miR-301b, miR-30c, miR-34a, miR-34c, miR-424, miR-449a, miR-543, 및/또는 miR-34b에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 자궁내막암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-125b, miR-138, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-16-1, miR-16-1-3p, miR-16-2, miR-181a, miR-181b, miR-195, miR-223, miR-29b, miR-34b, miR-34c, miR-424, miR-10a, miR-146a, miR-150, miR-151, miR-155, miR-2278, miR-26a, miR-30e, miR-31, miR-326, miR-564, miR-27a, let-7b, miR-124a, miR-142-3p, let-7c, miR-17, miR-20a, miR-29a, miR-30c, miR-720, miR-107, miR-342, miR-34a, miR-202, miR-142-5p, miR-29c, miR-145, miR-193b, miR-199a, miR-214, miR-22, miR-137 및/또는 miR-197에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 혈액암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-1, miR-145, miR-1826, miR-199a, miR-199a-3p, miR-203, miR-205, miR-497, miR-508-3p, miR-509-3p, let-7a, let-7d, miR-106a*, miR-126, miR-1285, miR-129-3p, miR-1291, miR-133a, miR-135a, miR-138, miR-141, miR-143, miR-182-5p, miR-200a, miR-218, miR-28-5p, miR-30a, miR-30c, miR-30d, miR-34a, miR -378, miR-429, miR-509-5p, miR-646, miR-133b, let-7b, let-7c, miR-200c, miR-204, miR-335, miR-377 및/또는 miR- 506에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 신장암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-1, miR-100, miR-101, miR-105, miR-122, miR-122a, miR-1236, miR-124, miR-125b, miR-126, miR-127, miR-1271, miR-128-3p, miR-129-5p, miR-130a, miR-130b, miR-133a, miR-134, miR-137, miR-138, miR-139, miR-139-5p, miR-140-5p, miR-141, miR-142-3p, miR-143, miR-144, miR-145, miR-146a, miR-148a, miR-148b, miR-150-5p, miR-15b, miR-16, miR-181a-5p, miR-185, miR-188-5p, miR-193b, miR-195, miR-195-5p, miR-197, miR-198, miR-199a, miR-199a-5p, miR-199b, miR-199b-5p, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-202, miR-203, miR-204-3p, miR-205, miR-206, miR-20a, miR-21, miR-21-3p, miR-211, miR-212, miR-214, miR-217, miR-218, miR-219-5p, miR-22, miR-223, miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-29b-1, miR-29b-2, miR-29c, miR-302b, miR-302c, miR-30a, miR-30a-3p, miR-335, miR-338-3p, miR-33a, miR-34a, miR-34b, miR-365, miR-370, miR-372, miR-375, miR-376a, miR-377, miR-422a, miR-424, miR-424-5p, miR-433, miR-4458, miR-448, miR-450a, miR-451, miR-485-5p, miR-486-5p, miR-497, miR-503, miR-506, miR-519d, miR-520a, miR-520b, miR-520c-3p, miR-582-5p, miR-590-5p, miR-610, miR-612, miR-625, miR-637, miR-675, miR-7, miR-877, miR-940, miR-941, miR-98, miR-99a, miR-132, 및/또는 miR-31에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 간암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 간암은 간세포 암종이다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-143-3p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1266-3p, miR-6130, miR-6080, miR-511-5p, miR-143-5p, miR-223-5p, miR-199b-5p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-451a, miR-142-5p, miR-144, miR-150-5p, miR-142-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-199a-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-1297, miR-141, miR-145, miR-16, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-29b, miR-381, miR-409-3p, miR-429, miR-451, miR-511, miR-99a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-1, miR-101, miR-133b, miR-138, miR-142-5p, miR-144, miR-1469, miR-146a, miR-153, miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-182, miR-192, miR-193a-3p, miR-194, miR-195, miR-198, miR-203, miR-217, miR-218, miR-22, miR-223, miR-26a, miR-26b, miR-29c, miR-33a, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-365, miR-449a, miR-449b, miR-486-5p, miR-545, miR-610, miR-614, miR-630, miR-660, miR-7515, miR-9500, miR-98, miR-99b, miR-133a, let-7a, miR-100, miR-106a, miR-107, miR-124, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-126, miR-126*, miR-129, miR-137, miR-140, miR-143, miR-146b, miR-148a, miR-148b, miR-149, miR-152, miR-154, miR-155, miR-17-5p, miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c, miR-181d, miR-184, miR-186, miR-193b, miR-199a, miR-204, miR-212, miR-221, miR-224, miR-27a, miR-27b, miR-29a, miR-30a, miR-30b, miR-30c, miR-30d, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-32, miR-335, miR-338-3p, miR-340, miR-342-3p, miR-361-3p, miR-373, miR-375, miR-4500, miR-4782-3p, miR-497, miR-503, miR-512-3p, miR-520a-3p, miR-526b, miR-625*, 및/또는 miR-96에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 폐암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 let-7b, miR-101, miR-125b, miR-1280, miR-143, miR-146a, miR-146b, miR-155, miR-17, miR-184, miR-185, miR-18b, miR-193b, miR-200c, miR-203, miR-204, miR-205, miR-206, miR-20a, miR-211, miR-218, miR-26a, miR-31, miR-33a, miR-34a, miR-34c, miR-376a, miR-376c, miR-573, miR-7-5p, miR-9, 및/또는 miR-98에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 흑색종을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 let-7d, miR-218, miR-34a, miR-375, miR-494, miR-100, miR-124, miR-1250, miR-125b, miR-126, miR-1271, miR-136, miR-138, miR-145, miR-147, miR-148a, miR-181a, miR-206, miR-220a, miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-32, miR-323-5p, miR-329, miR-338, miR-370, miR-410, miR-429, miR-433, miR-499a-5p, miR-503, miR-506, miR-632, miR-646, miR-668, miR-877, 및/또는 miR-9에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 구강암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 let-7i, miR-100, miR-124, miR-125b, miR-129-5p, miR-130b, miR-133a, miR-137, miR-138, miR-141, miR-145, miR-148a, miR-152, miR-153, miR-155, miR-199a, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-212, miR-335, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-409-3p, miR-411, miR-429, miR-432, miR-449a, miR-494, miR-497, miR-498, miR-519d, miR-655, miR-9, miR-98, miR-101, miR-532-5p, miR-124a, miR-192, miR-193a, 및/또는 miR-7에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 난소암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR 안으로 삽입된, miR-216a-5p, miR-802, miR-217, miR-145-3p, miR-143-3p, miR-451a, miR-375, miR-214-3p, miR-216b-3p, miR-432-5p, miR-216a-3p, miR-199b-5p, miR-199a-5p, miR-136-3p, miR-216b-5p, miR-136-5p, miR-145-5p, miR-127-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-559, miR-129-2-3p, miR-4507, miR-1-3p, miR-148a-3p, miR-101, miR-1181, miR-124, miR-1247, miR-133a, miR-141, miR-145, miR-146a, miR-148a, miR-148b, miR-150*, miR-150-5p, miR-152, miR-15a, miR-198, miR-203, miR-214, miR-216a, miR-29c, miR-335, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-373, miR-375, miR-410, miR-497, miR-615-5p, miR-630, miR-96, miR-132, let-7a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-126, miR-135a, miR-143, miR-144, miR-150, miR-16, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-217, miR-218, miR-337, miR-494, 및/또는 miR-98에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 췌장암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 let-7a-3p, let-7c, miR-100, miR-101, miR-105, miR-124, miR-128, miR-1296, miR-130b, miR-133a-1, miR-133a-2, miR-133b, miR-135a, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-154, miR-15a, miR-187, miR-188-5p, miR-199b, miR-200b, miR-203, miR-205, miR-212, miR-218, miR-221, miR-224, miR-23a, miR-23b, miR-25, miR-26a, miR-26b, miR-29b, miR-302a, miR-30a, miR-30b, miR-30c-1, miR-30c-2, miR-30d, miR-30e, miR-31, miR-330, miR-331-3p, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-374b, miR-449a, miR-4723-5p, miR-497, miR-628-5p, miR-642a-5p, miR-765, 및/또는 miR-940에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 전립선암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-101, miR-183, miR-204, miR-34a, miR-365b-3p, miR-486-3p, 및/또는 miR-532-5p에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 망막아세포종을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-143-3p, miR-133b, miR-1264, miR-448, miR-1298-5p, miR-490-5p, miR-138-2-3p, miR-144-3p, miR-144-5p, miR-150-5p, miR-129-1-3p, miR-559, miR-1-3-p, miR-143-5p, miR-223-3p, miR-3943, miR-338-3p, miR-124-3p, miR-219a-5p, miR-219a-2-3p, miR-451a, miR-142-5p, miR-133a-3p, miR-145-5p, 및/또는 miR-145-3p에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 교아종을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-143-3p, miR-223-3p, miR-6080, miR-208b-3p, miR-206, miR-133a-5p, miR-133b, miR-199a-5p, miR-199b-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-150-5p, miR-142-3p, miR-144-3p, miR-144-5p, miR-338-3p, miR-214-3p, miR-559, miR-133a-3p, miR-1-3p, miR-126-3p, miR-142-5p, miR-451a, miR-199a-3p, 및/또는 miR-199b-3p에 대한 표적 서열이다. 추가 실시형태에서, 벡터는 두경부암을 치료하는데 사용되는 CAR 코딩 서열을 포함한다.
설계된 CAR 및 CAR 안으로/상으로 조작된 결합 도메인에 따라, 방법 및 조성물은 다수의 질환 및 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표 1에 나열된 "표적" 중 임의의 수를 표적화하는 결합 도메인은 표적과 연관된 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
표 1:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
개시내용은 대상체에게 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하여 CAR이 원하는 면역 세포 유형 또는 면역 세포 줄기 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포)에서 선택적으로 발현되도록 하는 개시내용의 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에게 입양 세포 면역을 제공하는 방법을 제공한다. 방법은 바이러스 게놈으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 엔벨롭 및 바이러스 캡시드를 포함하는 바이러스 작제물을 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 감마 레트로바이러스로부터 유래된다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 및 3' 말단에 긴 말단 반복을 포함한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 CAR에 대한 코딩 서열을 포함한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 여전히 또 다른 실시형태에서, miRNA 표적 서열은 표적-외 세포에 존재하는 miRNA에 대한 표적이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 전구약물을 독성 약물로 전환시키는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다.
개시내용은 바이러스 캡시드 내로 캡슐화되는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 서열을 포함하는 플라스미드를 제공한다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 감마 레트로바이러스로부터 유래된다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 및 3' 말단에 긴 말단 반복을 포함한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 CAR에 대한 코딩 서열을 포함한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 여전히 또 다른 실시형태에서, miRNA 표적 서열은 표적 세포에서도 아니고 감염성 벡터를 만드는데 사용되는 세포에서도 아닌 표적-외 세포에 존재하는 miRNA에 대한 표적이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 전구약물을 독성 약물로 전환시키는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다.
개시내용은 5'에서 3'으로 시그널링 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 막횡단 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 힌지/링커 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 결합 도메인에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 감마레트로바이러스로부터의 "R-U5" 도메인에 이어서 하나 이상의 miRNA 표적 서열(miR-TS; miR 표적 카세트)과 이어서 감마레트로바이러스로부터의 "U3-R" 도메인을 포함하는 바이러스 폴리뉴클레오티드 작제물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 RNA는 IRES에 작동가능하게 연결된 사멸 스위치에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IRES-사멸 스위치는 miRNA 카세트의 업스트림 또는 다운스트림(5' 또는 3')일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 도식적으로 다음과 같이 표시될 수 있다(또한 도 1 참조):
R-U5-결합 도메인-힌지/링커-TM 도메인-시그널링 도메인-miRNA표적-U3-R
일 실시형태에서, R-U5 도메인은 다음 서열과 적어도 80-100% 동일한 서열을 포함할 수 있다:
GCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCAUCCGACUUGUGGUCUCGCUGUUCCUUGGGAGGGUCUCCUCUGAGUGAUUGACUACCCGUCAGCGGGGGUCUUUCAUU(뉴클레오티드 1 내지 145의 서열번호:25)
일 실시형태에서, R-U5-패키징 도메인은 다음 서열과 적어도 80-100% 동일한 서열을 포함할 수 있다:
GCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCAUCCGACUUGUGGUCUCGCUGUUCCUUGGGAGGGUCUCCUCUGAGUGAUUGACUACCCGUCAGCGGGGGUCUUUCAUUUGGGGGCUCGUCCGGGAUCGGGAGACCCCUGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGUAAGCUGGCCAGCAACUUAUCUGUGUCUGUCCGAUUGUCUAGUGUCUAUGACUGAUUUUAUGCGCCUGCGUCGGUACUAGUUAGCUAACUAGCUCUGUAUCUGGCGGACCCGUGGUGGAACUGACGAGUUCGGAACACCCGGCCGCAACCCUGGGAGACGUCCCAGGGACUUCGGGGGCCGUUUUUGUGGCCCGACCUGAGUCCAAAAAUCCCGAUCGUUUUGGACUCUUUGGUGCACCCCCCUUAGAGGAGGGAUAUGUGGUUCUGGUAGGAGACGAGAACCUAAAACAGUUCCCGCCUCCGUCUGAAUUUUUGCUUUCGGUUUGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGUCUUGUCUGCUGCAGCAUCGUUCUGUGUUGUCUCUGUCUGACUGUGUUUCUGUAUUUGUCUGAGAAUUAAGGCCAGACUGUUACCACUCCCUGAAGUUUGACCUUAGGUCACUGGAAAGAUGUCGAGCGGAUCGCUCACAACCAGUCGGUAGAUGUCAAGAAGAGACGUUGGGUUACCUUCUGCUCUGCAGAAUGGCCAACCUUUAACGUCGGAUGGCCGCGAGACGGCACCUUUAACCGAGACCUCAUCACCCAGGUUAAGAUCAAGGUCUUUUCACCUGGCCCGCAUGGACACCCAGACCAGGUCCCCUACAUCGUGACCUGGGAAGCCUUGGCUUUUGACCCCCCUCCCUGGGUCAAGCCCUUUGUACACCCUAAGCCUCCGCCUCCUCUUCCUCCAUCCGCCCCGUCUCUCCCCCUUGAACCUCCUCGUUCGACCCCGCCUCGAUCCUCCCUUUAUCCAGCCCUCACUCCUUCUCUAGGCGCCGGAAUUAAUUCUCGA(서열번호:25 뉴클레오티드 1 내지 1055)
일 실시형태에서, U3-R 도메인은 다음 서열과 적어도 80-100% 동일한 서열을 포함할 수 있다:
UGAAAGACCCCACCUGUAGGUUUGGCAAGCUAGCUUAAGUAACGCCAUUUUGCAAGGCAUGGAAAAAUACAUAACUGAGAAUAGAGAAGUUCAGAUCAAGGUCAGGAACAGAUGGAACAGCUGAAUAUGGGCCAAACAGGAUAUCUGUGGUAAGCAGUUCCUGCCCCGGCUCAGGGCCAAGAACAGAUGGAACAGCUGAAUAUGGGCCAAACAGGAUAUCUGUGGUAAGCAGUUCCUGCCCCGGCUCAGGGCCAAGAACAGAUGGUCCCCAGAUGCGGUCCAGCCCUCAGCAGUUUCUAGAGAACCAUCAGAUGUUUCCAGGGUGCCCCAAGGACCUGAAAUGACCCUGUGCCUUAUUUGAACUAACCAAUCAGUUCGCUUCUCGCUUCUGUUCGCGCGCUUCUGCUCCCCGAGCUCAAUAAAAGAGCCCACAACCCCUCACUCGGCGCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCA(뉴클레오티드 5537 내지 6051의 서열번호:25)
R-U5 및 U3-R 서열의 DNA 플라스미드 서열은 "U"가 "T"로 대체됨을 당업자는 인식할 것이다.
"CAR"의 결합 도메인은 원하는 표적 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 서열일 수 있다. 예를 들어, 결합 도메인은 원하는 표적 항원에 지향된 scFv와 같은 항체 단편일 수 있다(예를 들어, 표 1 참조). 표 1에 제시된 표적에 대한 다양한 결합 도메인을 인코딩하는 서열은 당업계에 공지되어 있고 다수의 출원에 공개되어 있다. 개시내용의 CAR은 본질적으로 모듈식이므로 원하는 표적에 따라 상이한 "결합 도메인"이 부착될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, '힌지' 또는 링커 코딩 서열은 CAR의 결합 도메인에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 경우에 '힌지'는 선택적이고 결합 도메인은 막횡단 도메인 코딩 서열에 직접적으로 연결될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 결합 도메인 및 막횡단 도메인은 최소 펩티드 코딩 서열 또는 스페이서에 의해 분리된다. 다양한 힌지 도메인 및 스페이서가 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있다.
miR 표적화 서열 또는 카세트는 전형적으로 바이러스 작제물의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 miRNA 분자에 대한 표적을 포함할 것이다. 예를 들어, miR 표적 서열은 전형적으로 예를 들어 CAR의 발현이 바람직하지 않거나 원하지 않는 조직 또는 세포에서 발현되는 miRNA에 결합할 것이지만, miRNA는 표적 세포에서도 또는 바이러스 작제물로부터의 발현이 요망되는 벡터 생산자 세포에서도 발현되지 않는다. 이러한 서열 또는 miRNA가 아직 알려지지 않은 경우, 그것은 발현을 원하지 않는 표적 조직(예를 들어, 종양)의 여러 예 및 발현이 바람직하거나 필요한 세포(예를 들어, T 세포)의 여러 예로부터 전체 RNA를 만들고 이러한 샘플에 대한 심층 벌크 시퀀싱을 수행한 다음 당업자에게 공지된 생물정보학 기술을 사용함에 의해 쉽게 식별되고 특성화될 수 있으며, 추가 시험을 위한 후보 miRNA 및 상응하는 표적이 식별된다. 추가로, 개시내용을 사용하여 당업자는 특정 암 또는 질환을 치료하기 위한 결합 도메인 뿐만 아니라 바람직하지 않은 조직 및/또는 세포 및 적합한 '힌지', '막횡단 도메인' 및 세포내 도메인에서 CAR의 발현을 방지할 miRNA 표적화 서열을 용이하게 식별할 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 벡터 작제물은 벡터 작제물의 발현이 예를 들어 자살 유전자(예를 들어, 티미딘 키나제(TK) 또는 시토신 데아미나제(CD) 활성을 갖는 폴리펩티드)의 발현을 초래하도록 추가 안전 메커니즘으로서 사멸 스위치를 포함할 것이다. 대상체, 세포 또는 조직이 원치 않는 벡터 발현을 전개한 경우, 대상체, 조직 또는 세포는 예를 들어 시토신 데아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 세포가, 5-FC가 사멸-스위치의 발현의 부위에서 세포독성 5-FU로 전환되어 벡터-감염된 세포를 사멸시키는 5-FC에 의해 접촉되도록 전구-약물(예를 들어, 5-플루오로시토신)과 접촉된다.
일 실시형태에서, 개시내용은 gag 폴리펩티드, pol 폴리펩티드 및 env 폴리펩티드와 레트로바이러스 벡터의 캡시드 내에 함유된 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 5'에서 3'으로 다음을 포함하는 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드: R-U5-결합 도메인-힌지/링커-TM 도메인-시그널링 도메인-miRNA표적-U3-R. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 1 내지 약 뉴클레오티드 145(예를 들어, 약 뉴클레오티드 140, 141, 142, 143, 144, 145, 126, 147, 148, 149 또는 150)의 서열 번호: 25와 적어도 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 R-U5 핵산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 R-U5 도메인에 대해 서열 3'을 코딩하는 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일 실시형태에서, CAR 코딩 서열은 항원 결합 도메인에 대한 코딩 서열을 포함한다(예를 들어, CD19에 대한 scFv). 일부 실시형태에서, 결합 도메인 코딩 서열은 신호 서열이 선행될 수 있다. 추가 실시형태에서, 결합 도메인 코딩 서열은 선택적 링커/스페이서 도메인 서열이 이어진다. 또 다른 실시형태에서, 결합 도메인 코딩 서열 선택적인 스페이서/링커 코딩 서열은 막횡단 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 이어진다. 추가 실시형태에서, 막횡단 코딩 서열은 세포질 시그널링 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 이어진다. 또 다른 실시형태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 선택적 사멸 스위치 도메인 코딩 서열을 포함할 수 있다. 선택적 사멸 스위치 코딩 도메인은 전구약물을 세포독성 약물로 전환시키는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 IRES를 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리펩티드는 티미딘 키나제(TKO) 또는 시토신 데아미나제(CD)이다. 추가 실시형태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 상이한 miRNA 표적화 서열의 적어도 하나, 전형적으로 복수의 이들을 포함한다. miRNA 표적화 서열은 CAR 도메인의 3'이다. 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 U3-R 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, U3-R 도메인은 약 뉴클레오티드 5537 내지 약 6051의 서열 번호: 25와 적어도 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성인 서열을 포함한다. 전술한 것 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 도메인은 의도적이거나 클로닝의 인공물일 수 있는 약 2-20개 뉴클레오티드의 작은 스페이서 서열에 의해 분리될 수 있다.
개시내용은 또한 적합한 숙주 세포에서 발현될 때 개시내용의 레트로바이러스 벡터를 생성하는 플라스미드 서열을 제공한다.
개시내용은 R-U5 도메인, 패키징 도메인, CAR 도메인 및 miRNA 탈표적화 도메인(예를 들어, miRNA 표적화 도메인)을 갖는 재조합 바이러스 게놈을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 재조합 바이러스 게놈은 자살 유전자(예를 들어, TKO 또는 CD 활성을 갖는 폴리펩티드를 생성한 유전자)에 대한 코딩 서열을 포함하는 사멸 스위치를 추가로 포함할 수 있다. CAR 도메인은 원하는 면역 세포에서 발현될 때 표적 항원에 결합할 수 있는 1세대, 2세대 또는 3세대 CAR 작제물(당업계에 공지된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 개시내용의 레트로바이러스 벡터는 포유동물 세포를 감염시키고 재조합 바이러스 게놈을 포유동물 세포 내로 전달할 수 있는 엔벨롭을 포함하는 레트로바이러스 캡시드를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 생체내에서 세포를 변형시키는 데 사용될 수 있으므로 현재 입양 세포 요법에서 수행되는 세포의 생체외 단리의 필요성을 제거한다. miRNA 탈표적화 도메인은 바이러스 게놈의 발현이 바람직하지 않은 세포에서 생성된 miRNA에 의해 결합될 수 있는 표적화 서열을 포함한다. 이들 세포에서 miRNA의 결합은 miRNA 표적화 서열에 결합하고 세포에서 바이러스 게놈의 발현을 방지한다.
개시내용은 또한 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 생체외 면역 세포 조작 없이 생체내 CAR의 발현을 유도하는 것을 포함한다. 방법은 치료되는 질환 또는 장애에 특이적인 표적 항원을 식별하는 것을 포함할 수 있다. 질환 또는 장애에 특이적인 항원을 표적화하는 결합 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체를 구축하는 것. CAR 코딩 서열을 개시내용의 벡터 내로 클로닝하는 것. CAR 작제물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 작제물을 생성하는 것 및 대상체의 면역 세포가 CAR을 발현하도록 생체내 형질도입되도록 바이러스 작제물을 투여하는 것.
개시내용의 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성되고, 정제되고 대상체에 투여하기 위한 약학적 제형으로 제조될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 개시내용은 개시내용의 벡터로 요법을 계획하거나, 진행 중이거나, 받은 대상체에서 줄기 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포)를 동원하는 방법을 제공한다.
개시내용은 조혈 줄기 세포를 동원하는 다수의 방법을 제공한다. 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)는 조골 세포, 망상/간엽 세포, 내피 세포, 대식세포 및 거핵구와 같은 여러 세포 유형에 의해 정주된 골수 환경 내의 독특한 틈새에 잔류한다. 이들 틈새 세포는 조절 기능을 수행하여 HSPC의 세포 주기 안으로의 도입을 제한하고 HSPC 풀을 유지 및 재생성할 수 있는 제한된 수의 HSPC에 의한 조혈 시스템의 평생 재군집화를 보장한다. HSPC는 이들 틈새에서 혈액 안으로 동원될 수 있고 이 동원은 성장 인자, 약물, 항체 등에 의해 유도될 수 있다. 일단 동원되면 HSPC는 혈류를 통해 이동하고 조혈의 부위로 돌아갈 수 있다. 개시내용은 상대적으로 접근불가능한 골수 틈새로 복귀하기 전에 혈액에서 조혈 줄기 세포(HSC)의 형질도입을 허용하기 위해 이를 효과적으로 수행하는 여러 상이한 방법을 제공한다.
개시내용은 또한 이들 세포의 표면 상에 디스플레이된 에피토프에 결합하도록 설계된 모이어티를 갖는 레트로바이러스 캡시드 상의 엔벨롭을 사용하여 HSC에 레트로바이러스 벡터를 표적화하는 방법을 제공한다.
조골세포는 가용성 및 막-국소화된 인자의 그 발현을 통해 HSPC의 정지 또는 증식을 조절한다. 예를 들어, 조골세포는 CD34+ HSPC와 접촉 또는 PTH/PTHrP 수용체(PPR)를 통해 부갑상선 호르몬(PTH) 또는 국부적으로 생성된 PTH-관련된 단백질(PTHrP)로 자극 시 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 및 간세포 성장 인자(HGF) 같은 조혈 성장 인자를 생성한다. 더욱이, PTH의 존재하에 배양된 골수 기질 세포는 장기간 골수-개시 세포(LTC-IC)를 유지하는 능력을 얻었고, PTH의 적용은 골수-재군집화 활성으로 HSPC를 증가시킨다. 따라서, PTH는 조골 기질 세포에서 HSPC에 대한 관련 성장 신호에 영향을 주어 HSPC 증식을 조절할 수 있다(Calvi et al., 2003).
HSPC를 지지하는 조골세포는 N-카드헤린+ CD45-의 뚜렷한 표현형을 추가로 갖고, 골 형태형성 단백질(BMP)에 의해 조절된다. 이들 조골세포는 케모카인 예컨대 C-X-C 모티브 케모카인-12(CXCL12; 간질-유래된 인자-1(SDF1)로도 알려짐), 뿐만 아니라 줄기 세포 인자(SCF), 인터루킨-6(IL-6) 및 Notch 리간드, 지그재그 1(Jag1)을 발현한다. 예를 들어, 조골세포에서 Jag1의 PRR의 PTH/PTHrP 활성화를 통해 HSPC에서 Notch 시그널링을 증가시키면 성숙한 조혈 세포에 영향을 미치지 않으면서 HSPC의 수를 증가시키는 반면 Notch 활성화의 감마-세크레타제 억제에 의한 Notch 시그널링을 차단하면 장기 재군집화 HSPC의 수를 감소시킨다(Calvi et al., 2003; Stier et al., 2002).
조골세포는 안지오포이에틴-1을 추가로 발현하며, 이는 HSPC 상의 Tie2 수용체에 결합하여 HSPC 정지, HSPC의 골 부위에 접착 및 HSPC의 유지를 지원한다(Arai et al., 2004). 조골세포는 또한 트롬보포이에틴(TPO)을 발현하며, 이는 골수에서 정지된 HSPC에서 발현되는 MPL 수용체를 활성화하하며; TPO/MPL 상호작용은 HSPC에서 베타1-인테그린 및 사이클린-의존성 키나제 억제제를 상향조절하여 HSPC의 정지를 유도하는 반면 항-MPL-중화 항체로 TPO/MPL 경로의 억제는 정지된 HSPC의 수를 감소시킨다(Yoshihara et al., 2007, Qian et al., 2007).
골아세포 틈새에서 원시 HSPC 증식의 조절에서 또 다른 인자는 골수 틈새에서 원시 세포 확장을 제한하는 오스테오폰틴이다. 오스테오폰틴은 조골세포에 의해 생산되고 원시 HSPC는 시험관내에서 베타1 인테그린을 통해 오스테오폰틴에 대한 특이적 접착을 나타낸다(Nilsson et al., 2005). 오스테오폰틴의 결핍 또는 억제는 인간 CD34+ HSPC에서 유의하게 증가된 기질 Jag1 및 Notch1 수용체 발현을 초래하여 장기간 재군집화 HSPC의 증가된 수를 초래한다(Stier et al., 2005; Iwata et al., 2004).
골수 기질은 골수 세포의 부착성 분획의 일부이고 골수가 장기간 배양 조건에 놓일 때 조혈-지지 부착성 층을 형성하는 섬유아세포-유사 세포를 추가로 함유한다. 이들 섬유아세포 간엽세포는 골아세포, 연골세포, 또는 지방세포와 같은 다양한 계통으로 분화할 수 있고, 골수 기질 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 외막 망상 세포(ARC), 및 STRO-1 세포로 다양하게 명명되어 왔다. 이들 세포는 STRO-1, SH2, SH3, SH4, Nestin, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체-a(PDGFra), CD51, CD146과 같은 세포 표면 마커를 인식하는 항체의 사용에 의해 식별되고 분리될 수 있고 CD45, CD31 및 Ter119에 대해 음성이다(Simmons et al., 1994; Sacchetti et al., 2007; Mendez-Ferrer et al., 2010; Pnho et al., 2013). 중간엽 세포 마커 NG-2(Cspg4)를 발현하는 세동맥 혈관주위 세포도 HSPC 정지를 유지한다(Kunisaki et al., 2013).
특히, Nestin은 HSPC 및 아드레날린성 신경 섬유와 공간적으로 연관된 비-조혈 MSC의 작은 하위모집단에 대한 마커이다(Mendez-Ferrer et al., 2010). 대부분의 HSPC는 'CXCL12-풍부 망상' 세포라고 하는 다량의 케모카인 CXCL12를 발현하는 기질 세포와 밀접하게 접촉하며, 이는 정현파 내피 세포를 둘러싸거나 내피 근처에 위치한다(Sugiyama et al., 2006). CXCL12 발현은 Nestin- 기질 세포에서보다 Nestin+에서 >50-배수 더 높고 일차 조골세포보다 10-배수 더 높다. Nestin+ MSC의 고갈은 미성숙 HSPC의 50% 감소 및 골수로 귀소하는 HSPC의 90% 감소를 초래한다. 더욱이, PTH의 투여는 Nestin+ MSC의 증식, 조골세포로의 그 분화 및 HSPC 풀의 증가를 유도했다(Mendez-Ferrer et al., 2010; Adams et al., 2007).
더욱이, Nestin-MSC에 비해 Nestin+ MSC는 HSPC 유지 유전자 SCF/c-키트 리간드, IL-7 및 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 및, HSPC 유지의 역-조절제로서, 오스테오폰틴을 고도로 발현한다. 또한, CXCL12-풍부 망상 세포는 교감 신경계에 의해 신경자극되며, 이는 Nestin+ MSC에서 콘넥신 43 및 45의 높은 발현에 의해 확인된 바와 같이 ?-아드레날린성 신경 말단과의 그 전기기계적 커플링을 나타내고, ?3 아드레날린성 수용체 작용제의 투여는 HSPC의 동원을 증강시킨다(Katayama et al., 2006).
내피 세포는 또한 HSPC 틈새 신호에 기여한다. 골수 혈관 구조의 영상화는 장기 재군집화 HSPC의 85%가 정현파 혈관의 10μm 이내에 있고 렙틴 수용체+ 및 CXCL12-높은 기질 틈새 세포와 접촉하고 있는 것을 나타냈다(Acar et al., 2015). 최근 연구는 또한 HoxB5의 발현에 의해 표시된 골수에서 HSPC의 94% 초과가 혈관의 압루미날 위치에서 발견되고 VE-카드헤린(Cdh5)-발현 내피 세포에 직접적으로 부착된다는 것을 입증했다(Chen et al., 2016).
인간 정현파 내피 세포와 HSPC의 직접적인 세포 접촉은 Notch 리간드 지그재그 1(Jag1), Jag2, 델타-유사 리간드 4(Dll4), Dll1 및 Dll1로부터 유래된 내피-표적화된 합성 융합 단백질을 통해 HSPC의 재군집 가능성 및 자가-재생을 증가시키고 기타 Notch 리간드는 HSPC 재생을 증강시킬 수 있다(Butler et al., 2010; Tian et al., 2013). 비록 Notch 시그널링이 성체 HSPC의 항상성에 필수적인 것은 아니지만, Notch-리간드 부착성 상호작용은 HSC 정지 및 틈새 보유를 유지하고, 최근에 Notch2 차단(Notch1 차단 아님)이 HSPC를 동원 자극에 민감하게 하고 골수에서 말초 혈액으로 증강된 퇴거를 야기한다는 것이 보고되었다(Wang et al., 2017).
한편, 내피 세포 생존에 중요한 VE-카드헤린 의존성 및 혈관-내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2)-의존성 혈관신생 시그널링 경로의, 3일 동안 모노클로날 항체에 의한 파괴가 또한 조혈 세포에서 Notch 시그널링을 파괴하여 HSPC의 감소된 빈도를 초래하고 분화를 유도하는 것으로 보고되었다(Butler et al., 2010). 화학요법 동안 세동맥 및 정현파 내피 세포를 포함한 정현파 혈관은 용량-의존적으로 손상되고 VEGFR2는 그 재생 및 HSPC 재구성에 필수적이다(Hooper et al., 2009).
HSPC 증식을 조절하는 다른 인자는 내피 세포 및 렙틴 수용체-발현 혈관주위 세포에서의 줄기 세포 인자(SCF)를 포함한다(Ding et al., 2012). 골수 정현파 내피 세포에 의해 발현되고 분비되는 헤파린-결합 성장 인자 플레오트로핀은 또한 조혈 줄기 세포 자가-재생 및 보유를 조절하는 것으로 나타났다(Himburg et al., 2012). 더욱이, 내피 세포-특이적 부착 분자인 E-셀렉틴의 결실은 증가된 HSPC 정지를 유도하여 내피 세포가 또한 HSPC 증식을 조절할 수 있음을 시사한다(Winkler et al., 2012).
HSPC는 또한 골수 대식세포와 접촉하여 발견되며, 이는 조골세포 생존과 그 틈새에서 HSPC의 보유를 지원한다(Chow et al. 2011; Christopher et al. 2011). CD169+(Siglec1) 대식세포의 고갈은 골수의 중간엽(ARC) 틈새에서 HSPC의 감소된 보유를 야기하고 결과적으로 HSPC가 혈류에 동원된다(Chow et al. 2011). 더욱이, G-CSF는 골내 대식세포의 고갈을 유도하여, 조골세포 기능과 HSPC 동원의 억제를 야기한다(Winkler et al. 2010).
HSPC는 또한 HSPC 틈새에 또한 기여하는 거핵구와 직접적 접촉에서 발견된다. 거핵구는 일반적으로 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 ?1(TGF-?1) 및 케모카인 C-X-C 모티브 리간드-4(CXCL4)와 같은 세포 주기 조절자를 분비하여, HSPC를 세포 주기의 G0 단계에 유지한다(Nakamura-Ishizu et al. 2014; Bruns et al. 2014; Zhao et al. 2014). 실제로 TGF-β1은 조골세포, 내피 세포, Nestin+ 혈관주위 세포, CXCL12-풍부 망상 세포를 포함한 골수에서 임의의 다른 기질 세포 유형보다 거핵구에서 더 높게 발현되는 것으로 보고되어 있다; 그러나, 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 화학요법 약물의 화학독성 스트레스 하에서 거핵구는 섬유아세포 성장 인자 1(FGF-1)을 분비하고 TGF-β1을 하향-조절하여, HSPC의 확장을 자극한다(Zhao et al. 2014 ).
HSPC의 동원은 다인자 과정이고 HSPC와 골수 기질 사이의 상호작용의 조절을 통해 골수 미세환경의 수준에서 조절된다. 부착 분자, 측분비 사이토카인 및 케모카인이 이 상호작용에 연루되어 있다. 틈새에 HSPC를 고정하고/하거나 그 정지를 유도하는 주요 요인은 혈관 세포 부착 분자(VCAM)-1, CD44, 조혈 성장 인자, 예를 들어, 줄기 세포 인자(SCF) 및 FLT3 리간드, CXCL12를 포함한 케모카인, 성장-조절된 단백질 베타 및 IL-8, 프로테아제, 펩티드 및 기타 화학적 전달물질 예컨대 뉴클레오티드이다. 동원은 기질 부착으로부터의 탈계합에 의해 시작되고, 골수 부비동으로의 지향된 이동, 및 기저막과 내피층을 통한 후속적 퇴거가 이어진다.
HSPC는 골수 기질 세포에서 발견되는 리간드를 갖는 광범위한 세포 부착 분자(CAM)를 나타낸다. 동원 및 귀소 과정에서 많은 CAM-리간드 쌍의 역할과 기여는 크게 알려져 있지 않다. 그러나, 인테그린 LFA-1(림프구 기능-연관된 항원 1) 및 VLA-4(Very Late Antigen-4 또는 인테그린 α4β1)를 포함한 여러 백혈구 부착 분자의 발현은 골수에 상주하는 전구 세포와 비교할 때 순환하는 전구에서 감소된다. 이들 부착 분자에 대한 각각의 리간드(세포간 부착 분자-1 또는 ICAM-1, 및 혈관 세포 부착 분자-1 또는 VCAM-1)는 골수 내피 및 기질 세포에서 발견된다. 주로 VCAM-1 단백질은 VLA-4(α4β1)에 대한 내피 리간드이고 LPAM(Lymphocyte Peyer 패치 부착 분자 또는 인테그린 α4β7)에 약하게 결합한다. 모든 정제된 말초 혈액 CD34+ 세포의 90 퍼센트 초과가 VLA-4(α4β1) 인테그린을 발현하는 반면, 10 내지 15 퍼센트만이 VLA-5(인테그린 α5β1 또는 피브로넥틴 수용체)를 발현한다. VLA-4(α4β1) 인테그린 단독은 부착에 영향을 미치는 반면 VLA-4(α4β1) 및 VLA-5(α5β1) 둘 모두는 재조합 피브로넥틴에서 클론생성 CD34+ 전구 세포의 화학주성을 매개한다(Carstanjen et al. 2005).
골수 내의 기질 세포로부터의 HSPC의 방출은 엘라스타제 및 카텝신 G에 의한 VCAM-1 및 호중구 프로테아제에 의한 CXCL12의 단백질분해적 분해에 의해 영향을 받는다(Levesque et al. 2002). 또한, 매트릭스 메탈로프로테이나제 9(MMP-9)에 의한 막-결합 SCF의 유출은 HSPC 동원에 기여하는 것으로 밝혀졌다(Heissig et al. 2002). 이들 발견은 G-SCF로 자극한 후 뿐만 아니라 케모카인 또는 화학요법과 같은 다른 자극으로 자극한 후에도 HSPC 동원에서 공통 '종료 경로'를 지적했다.
초기 연구에서, VLA-4 및 VCAM에 대한 항체는 비-인간 영장류에서 전구 세포를 동원하고/하거나 골수로의 귀소를 억제하는 것으로 나타났다(Papayannopoulou et al. 1995; Papayannopoulou and Nakamoto 1993). 이어서, HSPC와 골수 틈새에서 HSPC의 유지를 위한 기질 세포 간의 VLA-4/VCAM-1 상호작용 뿐만 아니라, VLA-5(?5?1; 피브로넥틴 수용체)/피브로넥틴 및 CD44/히알루로난/오스테오폰틴 상호작용의 유의성은 기능-차단 항-VLA-5 및 항-CD44 항체를 사용한 연구에 의해 표시되었으며, 모두 HSPC의 유리 및 혈액 내로 그의 동원을 초래한다(Vermeulen et al. 1998; van der Loo et al. 1998). 중요하게, VLA-4(α4β1) 및 VLA-5(α5β1)에 대한 항체는 인간 말초 혈액 CD34+ 세포의 이식 후 골수의 재군집을 독립적으로 감소시킨다(Carstanjen et al. 2005).
나탈리주맙은 다발성 경화증 및 크론병이 있는 환자의 치료를 위해 FDA 승인된 인간화된 모노클로날 항-VLA-4 항체이다. 다발성 경화증에 대해 그 나탈리주맙 주입 요법을 받은 환자에서 일련의 측정은 대략적으로 3-배수의 순환하는 CD34+ 세포에서 유의한 증가를 나타냈다(Zohren et al. 2008). 조혈 줄기 세포 이식 및 줄기 세포 질환의 맥락에서, 나탈리주맙 단독 또는 세포독성 약물 또는 기타 항체와 조합한 사용은 줄기 세포 동원을 위한 새로운 양식일 수 있다(Neumann, Zohren, and Haas 2009).
HSPC에 대한 부착 분자의 낮은 발현 또는 감소된 결합력은 또한 골수로부터의 이의 동원을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 인터루킨(IL)-3, 과립구-대식세포 CSF(GM-CSF) 및 KIT 리간드(KL)와 같은 특정 사이토카인은 CD34+ 세포 상에 발현된 VLA-4 및 VLA-5의 기능을 변형하고 이에 의해 피브로넥틴에 대한 부착을 조절할 수 있는 것으로 나타났다(Levesque et al. 1995). 반대로, 줄기 세포 인자(SCF) 자극 후, CD34+ HSPC 상에 VLA-4 및 VLA-5의 발현은 각각 대략적으로 2-배수 및 4- 내지 10-배수 증가하는 것으로 보고되었으며, SCF로 자극 후 피브로넥틴에 대한 증가된 부착을 초래했다(Hart et al. 2004).
부가하여, 골수 정현파에서 EPHB4 수용체 및 조혈 세포에서 에프린 B2 리간드의 상호적으로 배타적인 분포는 HSPC 동원에서 이들 분자의 상호작용의 역할을 나타낸다. 마우스에서 EPHB4/에프린 B2 시그널링 경로의 차단은 순환계로의 HSPC 및 기타 골수 세포의 동원을 감소시키는 것으로 나타났다(Kwak et al. 2016).
개시내용의 약학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 개시내용의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 2차 활성제(예를 들어, 항암제, 항바이러스제 또는 항생제)를 추가로 포함할 수 있다.
개시내용의 약학적 조성물은 치료(또는 예방)되는 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양과 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이다. "면역학적으로 유효한 양", "항-종양 유효량", "종양-억제 유효량" 또는 "치료량" 또는 "항-감염성"이 표시되는 경우, 투여되는 개시내용의 조성물의 양은 경우에 따라 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양의 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 상태에서 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 약학적 조성물은 질환 또는 장애를 치료하기에 충분한 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)의 형질도입을 야기하기에 충분한 양으로 투여된다고 언급될 수 있다. 일 실시형태에서, 개시내용의 약학적 조성물은 103 내지 1011 변환 단위/용량(예를 들어, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 또는 전기한 두 값 중 임의의 것 사이의 임의의 값)에서의 벡터를 포함한다. 용량은 1일 1회 내지 수회 투여될 수 있고, 생체내 면역 이펙터 세포를 유도하기 위해 필요에 따라 연속 일, 수주 또는 수개월 동안 투여될 수 있다. 개시내용의 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 면역요법에서 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참조).
개시내용은 다음 실험적 실시예를 참조하여 추가로 기술된다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 의도가 아니다. 따라서, 개시내용은 다음 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1
miRNA 표적 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스 벡터로부터의 선택적 이식유전자 발현의 시험관내 시험.
이 실험은 이식유전자에 대해 전사된 인코딩 RNA 내에 마이크로RNA 표적 서열을 포함하는 이식유전자를 함유하는 RNV로 수행된다. 감염 벡터는 실시예 2-6에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된다. 관례에 따라 플라스미드 명칭은 전체 명칭에 선행하는 작은 "p"를 갖고 상응하는 감염 벡터는 "p"가 없거나 선행하는 또는 뒤에 "v"가 있는 동일한 명칭을 갖는다. 따라서, pBA9-9b-hCD19-miRT223T4X는 항-인간 CD19CAR에 대한 코딩 서열 및 miR223에 대한 표적 서열의 4개 카피를 함유하는 pBA-9b(서열번호: 1 여가서 "U"는 "T"일 수 있음)로부터의 바이러스 백본을 담지하는 플라스미드(예를 들어, 작제물 7)를 의미하며; BA-9b-hCD19-miRT223T4X 또는 vBA-9b-hCD19-miRT223T4X 또는 BA-9b-hCD19-miRT223T4X(V)는 상응하는 감염 벡터를 나타낸다. 동족 마이크로RNA를 발현하는 세포는 miRNA 표적 서열을 포함하는 RNA를 분해하여 해당 세포 유형에서 이식유전자의 발현을 제한할 것이다. 이식유전자는 각각의 마이크로RNA 표적 서열의 1개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 이 실시예에서 이식유전자는 전사체의 3' 말단에서 각 miRNA 표적 서열의 4개 카피를 갖는 및 갖지 않는 CD19 키메라 항원 수용체를 인코딩한다. 일 실시형태에서, 마이크로RNA 표적 서열은 miR223 표적("miR223T(4X)")의 4개 반복을 코딩하여 형질도입된 단핵구에서 이식유전자 발현을 감소시킨다(도 1; 작제물 7; 서열번호: 2). 일 실시형태에서, 마이크로RNA 표적 서열은 B 세포(림프종) 특이적 miRaBCT(4X)를 코딩하여 형질도입된 B 세포에서 이식유전자 발현을 감소시킨다(도 1). 일 실시형태에서, 마이크로RNA 표적 서열은 miRaNKT(4X)를 코딩하여 형질도입된 NK 세포에서 이식유전자 발현을 감소시킨다(도 1). 일 실시형태에서, 마이크로RNA 표적 서열은 miRaBCT(4X) 및 miR223T(4X)를 코딩하여 형질도입된 B 세포 및 단핵구에서 이식유전자 발현을 감소시킨다(도 1; 작제물 5). 일 실시형태에서, 마이크로RNA 표적 서열은 miRaNKT(4X) 및 miR223T(4X)를 코딩하여 형질도입된 B 세포 및 단핵구에서 이식유전자 발현을 감소시킨다(도 1). 일 실시형태에서, 마이크로RNA 표적 서열은 miRaNKT(4X), miRaNKT(4X) 및 miR223T(4X)를 코딩하여 형질도입된 B 세포 및 단핵구에서 이식유전자 발현을 감소시킨다(도 1). 또 다른 실시형태에서, RNV는 또한 간세포에서 전사체 분해를 초래하는 이식유전자 UTR에 miRNA 표적 서열을 함유할 수 있다. 단일 표적으로 또는 UTR에 조합하여 miRNA122aT(4X) 및 miR199aT(4X) 서열의 추가는 간에서 이식유전자 발현을 감소시킨다(도 2; 작제물 36, 37, 38). 이들 간 탈표적화 miRNA는 모든 5개 miRNA 표적 서열이 RNV 이식유전자 UTR에 인코딩되는 조합을 포함하여 도 1로부터의 성분과 조합될 수 있다(도 2).
개시내용의 RNA 바이러스 폴리뉴클레오티드(vRNA 게놈)는 서열번호:1에 제공되며; 굵은/밑줄이 있는 부분은 다중 클로닝 사이트를 식별한다:
GCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCAUCCGACUUGUGGUCUCGCUGUUCCUUGGGAGGGUCUCCUCUGAGUGAUUGACUACCCGUCAGCGGGGGUCUUUCAUUUGGGGGCUCGUCCGGGAUCGGGAGACCCCUGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGUAAGCUGGCCAGCAACUUAUCUGUGUCUGUCCGAUUGUCUAGUGUCUAUGACUGAUUUUAUGCGCCUGCGUCGGUACUAGUUAGCUAACUAGCUCUGUAUCUGGCGGACCCGUGGUGGAACUGACGAGUUCGGAACACCCGGCCGCAACCCUGGGAGACGUCCCAGGGACUUCGGGGGCCGUUUUUGUGGCCCGACCUGAGUCCAAAAAUCCCGAUCGUUUUGGACUCUUUGGUGCACCCCCCUUAGAGGAGGGAUAUGUGGUUCUGGUAGGAGACGAGAACCUAAAACAGUUCCCGCCUCCGUCUGAAUUUUUGCUUUCGGUUUGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGUCUUGUCUGCUGCAGCAUCGUUCUGUGUUGUCUCUGUCUGACUGUGUUUCUGUAUUUGUCUGAGAAUUAAGGCCAGACUGUUACCACUCCCUGAAGUUUGACCUUAGGUCACUGGAAAGAUGUCGAGCGGAUCGCUCACAACCAGUCGGUAGAUGUCAAGAAGAGACGUUGGGUUACCUUCUGCUCUGCAGAAUGGCCAACCUUUAACGUCGGAUGGCCGCGAGACGGCACCUUUAACCGAGACCUCAUCACCCAGGUUAAGAUCAAGGUCUUUUCACCUGGCCCGCAUGGACACCCAGACCAGGUCCCCUACAUCGUGACCUGGGAAGCCUUGGCUUUUGACCCCCCUCCCUGGGUCAAGCCCUUUGUACACCCUAAGCCUCCGCCUCCUCUUCCUCCAUCCGCCCCGUCUCUCCCCCUUGAACCUCCUCGUUCGACCCCGCCUCGAUCCUCCCUUUAUCCAGCCCUCACUCCUUCUCUAGGCGCCGGAAUUAAUU CUCGAGGGGCCCAGAUCUGCGGCCGCUCGCGAGUCGACAAGCUUGGAUCC AUCGAUAAAAUAAAAGAUUUUAUUUAGUCUCCAGAAAAAGGGGGGAAUGAAAGACCCCACCUGUAGGUUUGGCAAGCUAGCUUAAGUAACGCCAUUUUGCAAGGCAUGGAAAAAUACAUAACUGAGAAUAGAGAAGUUCAGAUCAAGGUCAGGAACAGAUGGAACAGCUGAAUAUGGGCCAAACAGGAUAUCUGUGGUAAGCAGUUCCUGCCCCGGCUCAGGGCCAAGAACAGAUGGAACAGCUGAAUAUGGGCCAAACAGGAUAUCUGUGGUAAGCAGUUCCUGCCCCGGCUCAGGGCCAAGAACAGAUGGUCCCCAGAUGCGGUCCAGCCCUCAGCAGUUUCUAGAGAACCAUCAGAUGUUUCCAGGGUGCCCCAAGGACCUGAAAUGACCCUGUGCCUUAUUUGAACUAACCAAUCAGUUCGCUUCUCGCUUCUGUUCGCGCGCUUCUGCUCCCCGAGCUCAAUAAAAGAGCCCACAACCCCUCACUCGGCGCGCCAGUCCUCCGAUUGACUGAGUCGCCCGGGUACCCGUGUAUCCAAUAAACCCUCUUGCAGUUGCA
CAR 작제물 및 (추가 도메인, 예를 들어, miRNA 표적화 도메인, 사멸 스위치 도메인 등을 갖지 않는 또는 갖지 않는) 다중 클로닝 부위 안으로 클로닝될 수 있다.
다양한 세포 유형에서 miRNA 표적 서열 특이성 및 기능을 확인하기 위해, 에메랄드 GFP를 함유하는 RNV를 CD19CAR 대신 사용하여 PMBC 세포 유형 및 다양한 세포주에 걸쳐 이식유전자 발현을 관찰한다. 도 1에 기술된 벡터 BA9B-emdGFP-함유 miR 변이체를 사용하여 세포주: Jurkat(T 세포); TALL-104(T 세포); Raji(B); NALM-6(B); THP-1(단핵구); U937(단핵구) 및 NK-92(NK)를 형질도입했다. 양성 대조군으로서 HT1080 세포는 퓨로마이신과 함께 전구체 miRNA의 단일 또는 다양한 조합을 발현하는 3세대 SIN-렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 형질도입-후 HT1080은 UTR에서 miRNA 표적 서열로 원하는 이식유전자를 인코딩하는 RNV 형질도입 전에 2주 동안 퓨로마이신(6ug/mL)으로 선택된다. 이것은 형질도입된 적어도 하나의 세포주가 분해를 위해 RNV 이식유전자 UTR을 표적화하는 원하는 miRNA(들)를 발현할 것임을 보장한다. 예를 들어, 작제물 5로 형질도입된 세포에서 mRNA 표적 서열에 대한 동족 miRNA를 발현하지 않는 이들 세포주만이 표 2에 요약된 바와 같이 eGFP 발현을 나타낸다. 동일한 GFP 발현 벡터를 사용하여, GFP 이식유전자를 감지할 수 있는 수준과 빈도로 발현하는 것은 주로 단지 T 세포이다는 것을 나타내는 유사한 결과를 갖는 PBMC를 형질도입한다(도 3).
표 2. BA9B-CD19CAR-miRaBCT4X-miRaNKT4X-miR223T4X로 형질도입 후 GFP 발현(예측)
Figure pct00006
동시에, BA9B-CD19CAR-miRaBCT4X-miRaNKT4X-miR223T4X 벡터는 폴리브렌(4-8μg/ml)의 존재에서 혼합 림프구 반응에서 PBMC를 형질도입하기 위해 10 MOI에서 사용된다. 100만개 PBMC가 24 웰 조직 배양 플레이트의 단일 웰에 10% FBS가 보충된 RPMI1640 배지에 1e6/mL 밀도로 접종된다. 형질도입-후 24-48시간에 세포를 샘플링하고 세포측정기에서 실행하여 CD19CAR의 세포 유형 특이적 발현을 평가한다(도 3). CD4 또는 CD8 규범적 마커를 발현하는 T 세포만 유세포분석에 의해 CD19CAR 발현을 나타내는 반면 B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함한 다른 세포 유형은 CD19CAR 발현을 나타내지 않는다. 또한, 감소된 CD19+ B 세포 빈도는 T 세포로부터의 CD19CAR 활성으로 인해 PBMC의 배양에서 관찰될 수 있다. 추가로, T 세포를 발현하는 CD19CAR은 하기에 기술된 일부 시험관내 검정의 수행 동안 풍부화될 수 있다.
재프로그래밍된 T 세포의 CD19 CAR-특이적 활성의 경우, 다중 단기 및 장기 세포 검정을 수행하여 CAR-매개된 증식, 세포내 및 분비 둘 모두에서 사이토카인 생성 및 Nalm6-CD19WT 및 Nalm6-CD19KO 종양 세포주에 대한 세포독성을 측정한다. 종양주 Nalm6-CD19WT는 ATCC에서 구입하고 CD19 CAR 활성을 테스트하기 위해 재프로그래밍된 T 세포와의 공동-배양을 위해 10% 소 태아 혈청이 보충된 배지 RPMI-1640에서 유지된다. 재프로그래밍된 T 세포의 CD19 CAR-비-특이적 활성을 측정하기 위해, 원래의 Nalm6-CD19WT 모 종양주로부터의 CRISPR 기술을 사용하여 Nalm6의 CD19 항원 결핍 변이체(Nalm6-CD19KO)를 생성한다. 16:1, 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4 및 1:8의 다른 이펙터 대 표적(E:T) 비율에서 Nalm6과 함께 재프로그래밍된 CD19 CAR-T 세포의 공동-배양으로부터 상등액을 수집하여 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 분비된 사이토카인 수준을 측정하고 바이오레전드의 레전드플렉스 검정을 사용하여 유세포분석을 측정한다. 재프로그래밍된 CAR-T 세포는 CD19 CAR-특이적 방식에서 Nalm6-CD19KO가 아닌 Nalm6-CD19WT를 갖는 배양물로부터의 상등액에서만 IL2, IFNγ 및 TNF와 같은 사이토카인을 분비한다. 유세포분석-기반 방법은 또한 NALM6-CD19WT 및 Nalm6-CD19KO 세포주와 별도로 단기 공동-배양의 4시간 후 재프로그래밍된-CAR-발현 T 세포에서 탈과립화(CD107 동원) 및 세포내 사이토카인을 검출하는데 사용된다. 재프로그래밍된 CAR-T 세포는 탈과립화하고 CD19 CAR-특이적 방식으로 Nalm6-CD19KO가 아닌 Nalm6-CD19WT와의 공동-배양에서 세포내로 IL2, IFNγ 및 TNF와 같은 사이토카인을 보유한다. 유세포분석을 사용하여 재프로그래밍된 T 세포의 CAR-매개된 증식을 측정하기 위해, 세포 트레이스 바이올렛(CTV) 표지된 PBMC의 전체 풀을 RNV-hCD19로 처리한 다음 Nam16-CD19WT 및 Nalm6-CD19KO 세포주와 별도로 72시간 동안 공동-배양한다. 재프로그래밍된 T 세포만 CAR-특이적 방식으로 Nalm6-CD19KO가 아닌 Nalm6-CD19WT와의 배양에서 우선적으로 증식한다.
재프로그래밍된 T 세포는 또한 단기 및 장기 공동-배양 검정에서 측정된 바와 같이 Nalm6-CD19KO와의 공동-배양과 비교하여 Nalm6-CD19WT와 공동-배양될 때 CD19 CAR-특이적 종양 세포독성을 나타낸다. 발광 기반 방법은 루시페라제 발현-Naml6-CD19WT에 대한 단기 즉시 CAR-특이적 세포독성을 측정하는 데 사용된다. 애질런트의 xCELLigence 검정은 또한 Nalm6-CD19WT에 대한 단기 및 장기 CAR-특이적 종양 세포독성을 측정하는 데 사용된다. xCELLigence 검정은 배양 플레이트에 포매된 바이오센서를 사용하여 Nalm6 종양 라인의 수에서 임의의 변화에 대해 연속적인 실시간 세포 분석(RTCA)을 수행한다. 상이한 E:T 비에서 재프로그래밍된 T 세포의 추가는 Nalm6-CD19KO 세포와 비교하여 Nalm6-CD19WT의 CD19 CAR-특이적 사멸을 입증한다. 추가로, 72시간-길이의 xCELLigence 검정은 Nalm6-CD19WT 종양 세포주의 CAR-특이적 사멸 및 성장 억제를 나타낸다.
실시예 2
모 HT-1080 세포에서 MLV 유래된 Gag/Pol 및 Env의 조작된 버전을 발현하는 플라스미드 구성을 인코딩하는 HAL2 패키징 세포주
HAL2 패키징 세포주는 Sheridan et al., MOLECULAR THERAPY Vol. 2, No. 3, September 2000에 기술된 바와 같이 HA-LB 패키징 세포와 유사한 방식으로 개발되었다. 이 실시예의 경우, 또한 Sheridan et al. Mol. Ther. 2000에 기술된 HAII 패키징 세포주가 사용될 수 있다. HAL2 패키징 세포 플라스미드 작제물 뿐만 아니라 HAII 패키징 세포주에 대한 작제물이 본 명세서에 기재되어 있다. 플라스미드 작제물을 모 HT-1080 세포주(ATCC-CCL-121) 안으로 안정적으로 형질감염시켰다. 대안적으로, 당업자를 위해, gag/pol 및 env MLV 유래된 서열은 또한 유사한 HAL2 패키징 세포주를 얻기 위해 순차적 형질도입 이벤트에서 MLV 서열을 안정적으로 형질도입하기 위해 VSG-g로 위형화된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 삽입 및 발현될 수 있다. gag/pol 서열의 안정적인 형질감염 또는 형질도입 후, HT-1080 중간체를 발현하는 gag/pol은, 웨스턴 블롯 분석에 의해 높은 gag/pol p30 발현에 대해 스크리닝된 개별 클론으로 희석 클로닝된다. 클론은 또한 gag/pol 패키징 세포주 중간체가 높은 역가 MLV 바이러스 입자를 생산할 수 있다는 것을 확인하기 위해, 기능적 MLV env 서열을 또한 발현하는 패키징 신호, 선택 가능한 마커(예를 들어 네오마이신 내성) 또는 마커 유전자(예를 들어 에메랄드 GFP)를 측접하는 5' 및 3' LTR 둘 모두를 함유하는 MLV 벡터로 gag/pol 클론 중간체를 형질도입하여 기능적 역가 생산에 대해 스크리닝될 수 있다. 우수한 역가 벡터 생성 가능성의 확인 후, MLV env 서열은 MLV env 서열을 인코딩하는 렌티-바이러스 벡터를 사용하여 안정한 형질감염 또는 안정한 형질도입에 의해 선택된 gag/pol 중간체 안으로 삽입된다. MLV 서열이 전달된 후, gag/pol 및 env 둘 모두를 발현하는 패키징 세포주는 희석 클로닝되고 스크리닝되어 가장 높은 env 발현을 식별할 뿐만 아니라 개별 클론 패키징 세포주 성능을 평가하기 위해 바이러스 env 서열이 없는 경우를 제외하고 선택가능한 마커 또는 마커 유전자를 발현할 수 있는 유사한 MLV 테스트 벡터를 사용하여 기능적 역가 생산을 확인한다. HAL2 패키징 세포주를 생성하는데 사용되는 특정 MLV gag/pol 및 env 작제물은 아래에서 추가로 기술된다.
MoMLV-유래된 gag/pol 작제물. HAL2 패키징 세포주는 상동 재조합 이벤트에 의해 복제 적격 바이러스를 감소시키도록 설계된 HA-LB MLV 패키징 세포주에 대해 사용된 바와 같이 원래의 MoMLV-유래된 gag/pol 플라스미드 pSCV10(예를 들어, WIPO 특허 공개 WO 91/06852 및 WO 92/05266 참조, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨)을 사용한다. 레트로바이러스 벡터 및 env 발현 작제물에 대한 서열 상동성이 감소된 HAII 패키징 세포주에서 gag/pol 작제물이 또한 사용될 수 있다. HAII에서, gag/pol 작제물 발현 카세트 pCI-WGPM은 gag에 대한 코딩 영역의 대략적으로 처음 400 nt에 축퇴 코드뿐만 아니라 모든 5' 및 3' 비번역된 서열의 결실을 함유한다. 부가하여, pol 유전자의 마지막 28개 아미노산을 코딩하는 서열이 결실되어, 절삭된 인테그라제 유전자를 초래한다. 플라스미드 pCI-GPM 및 pSCV10/5',3'tr은 gag의 5' 영역이 고유 서열을 함유한다는 점을 제외하고 pCI-WGPM과 동일한 gag/pol cDNA를 함유한다.
MoMLV 유래된 Ampho 엔벨롭 작제물. gag/pol 및 레트로바이러스 벡터 플라스미드에서 서열 중복을 줄이기 위해, 원래의 4070A-유래된 양쪽성 발현 플라스미드 pCMVenvamDra(특허 출원 WO 91/06852)를 사용하여 HA-LB 패키징 세포주에서 사용된 바와 같은 env 정지 코돈(pCMVenvamDraLBGH) 후에 결실된 모든 3' 비번역된 서열 또는 HAII 패키징 세포주에서 사용된 바와 같이 모든 3' 및 5' 비번역된 서열이 결실된 2개의 플라스미드를 생성했다.
pBA-9B-emdGFPmir233-3p4TXv2 MLV 플라스미드 벡터를 사용하여 표적-외 또는 비-의도된 특정 세포 유형에서 벡터 발현의 하향 조절을 위한 miRNA 서열 뿐만 아니라 에메랄드 GFP를 인코딩하는 MLV 바이러스 입자를 생성하기 위한 HAL2로부터 벡터 생성 세포주(VPCL)의 생성
플라스미드 작제물 pBA-9b-emdGFPmir233-3p4TXv2(작제물 7)는 세포-특이적 탈표적화를 위해 변형되었다. 염기성 pBA-9B-emdGFP 서열은 벡터의 안전성 프로파일을 증가시키고 비-의도된 세포 유형에서의 발현을 방지하기 위해 세포 유형 특이적 방식으로 벡터 발현을 하향 조절하는 효과적인 방법으로서 마이크로RNA(miR) 표적 서열을 또한 인코딩하도록 변형될 수 있다. 도 5는 골수성, B 및 NK 세포 유형에서 발현을 방해하는데 사용되는 miR 표적 서열의 예를 도시한다.
레트로바이러스 비-클론 벡터 생성 세포주뿐만 아니라 후속 생산 클론은 높은 다중도의 형질도입("m.o.t.")을 사용하여, VSV-G 위형화된 MLV 벡터 입자를 사용한 형질도입의 단일 또는 다중 백-투-백 라운드를 사용한 >20의 m.o.t.로 "높은 m.o.t." 접근인 선택된 HAL2 클론 패키징 세포주로부터 확립된다. 형질도입의 다중도는 VPCL 비-클론 세포주의 생산을 위해 PCL 세포당 사용되는 감염성 바이러스 입자의 수로 정의된다. 전형적으로 PCL 배양은 형질도입 하루 전에 6-웰 플레이트에 1 X 105 세포/웰로 접종된다. 그런 다음 적절한 부피의 벡터 상등액을 PCL에 추가한다(4, 5, 6, 7 또는 8μg/ml 폴리브렌의 존재에서; 각각 0.1, 0.5, 5, 25 및 125의 m.o.t.에 해당). 20-24시간 후 벡터 상등액을 2ml의 신선한 배지로 교체한다. m.o.t.를 증가시키기 위해, 동일한 부피의 벡터 상등액을 사용하여 형질도입 절차를 제2 일 동안 반복할 수 있다. 생산자 풀을 컨플루언스로 성장시키고 상등액을 컨플루언스-후 24, 48 및 72시간에 매일 수집하여 PCR 형질도입 역가를 결정하고 유전자 발현의 전달을 나타낸다. 선택된 비-클론 풀은 클론의 개별 그룹이 확장됨에 따라 여러 라운드의 역가 결정 및 발현의 전달 검정에서 분석되는 웰당 단일 세포를 초래하는 96 웰 플레이트 안으로 제한된 희석 접종을 사용하여 클로닝된다. 지속가능한 높은 역가 생산을 갖는 VPCL 클론은 냉동보관되어 안전성에 대해 시험된 작업 스톡을 동결하여 준비한다(FDA의 고려 사항 및 지침 간행물에 기술된 대로 멸균, 마이코플라스마, 복제 가능 레트로바이러스뿐만 아니라 기타 바이러스 외래성 제제). 개별 클론에서 유래하는 바이러스 입자의 게놈 바이러스 서열화도 적격의 세포 은행 스톡 특성화의 일부로 게놈 MLV 서열의 정확성을 보장하기 위해 수행된다. 일단 적격화되면 적격의 세포 은행 스톡으로부터 바이알을 추가로 확장하고 GMP 하에서 추가 테스트하여 GMP 마스터 및 작업 세포 은행 스톡을 생성할 수 있다. 패키징 세포주 또는 벡터 생산 세포주를 생성하기 위한 일련의 이벤트가 도 6에 요약되어 있다.
실시예 3
부착 배양을 위한 다중 Corning CellSTACKs ® 또는 파일럿 규모 관류 공급 세포 배양 시스템을 사용하는 실험실 규모로서 R&D 연구를 위한 바이러스 생산
다음 실시예는 소규모 R&D 연구를 위해 뮤어라인 백혈병 바이러스(MuLV)를 생산하기 위해 부착성 벡터 생산자 세포주(VPCL) 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 바이러스 생산 방법을 검토한다. pBA-9b-emdGFPmir233-3p4TXv2 작제물에 기반된 생산 MuLV 바이러스가 실시예로서 사용되지만, 이 과정은 또한 본 개시내용에 기재된 모든 MLV 바이러스 벡터에 대해서도 사용될 수 있다.
이 실시예에서 모 HT1080 세포(ATCC CCL-121)로부터 생성된 VPCL이 기재되어 있지만 본 방법은 또한 HEK 293T, D17 또는 CF2 유래된 세포(각각, CRL-1573, CCL-183 또는 CRL-1430)에서 생성된 VPCL에 대해, 5% CO2 조건 하에서 37℃의 조건 하에서 사용될 수 있다. 장기 보관을 위해, VPCL은 액체 질소 조건 하에서 동결보존되며, 세포 배양 성장 배지 용액에서 10% DMSO 및 50-90% 소 태아 혈청을 함유하는 동결보호 세포 배양 배지 용액에서 동결된 최대 1.0 x 107 세포를 함유하는 동결보호 플라스틱 바이알에 저장된다. 해동 시, 세포는 초기에 T-75 플라스크 안으로 접종함에 의해 확장되고 후속으로 2개의 T-175로 확장된 다음 이어서 다음 성장 배지를 갖는 다중 T-175 플라스크 안으로 배양된다:
Figure pct00007
컨플루언스에 도달한 후, 세포는 TrpZean®(Sigma)으로 수확되고 표준 세포 배양 방법을 사용하여 동일한 성장 배지로 중화된다. 세포를 완전한 DMEM 배지에서 약 3.1 x 104 생존가능 세포/㎠의 접종 밀도로 3개의 10-층 CellSTACKs®(Corning)에 접종하여 바이러스를 생산한다. 각 세포 스택은 1.1L의 성장 배지를 함유했다. CellSTACKs®는 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션된다.
접종 후 대략적으로 2일에 CellSTACKs® 배양물은 컨플루언스에 접근하거나 도달할 것이다. 컨플루언스에 도달한 후, 각 배양에서의 배지를 매일 기준으로, 생산된 바이러스를 함유한 소비된 세포 배양 배지를 신선한 배지로 교체하고, 신선한 배지 교체 후 수확한다. 대안적으로, 신선한 배지 공급 및 벡터 수확은 동일한 부피(1.1L)의 신선한 성장 배지로 10-12시간마다 발생할 수 있다. 원하는 부피가 수집된 후, 수확 수집물은 그 다음 정제를 위해 풀링된다. 3회 수확 및 풀에 대한 바이러스 역가는 다음 표에 나열되어 있다:
Figure pct00008
Corning CellCube® 관류 시스템을 사용한 부착성 VPCL의 대규모 벡터 생산
더 많은 양의 벡터가 필요한 경우, 부착성 세포 배양 확장 트레인을 사용한 대규모 레트로바이러스 벡터 생산은 섬유 디스크, 마이크로-캐리어 비드 또는 iCellis® 시스템(Pall Corporation, NY) 같은 고정 베드 유사 시스템과 같은 다중 단일 사용 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. VPCL의 확장은 CellCube® 시스템을 접종하기 위해 10% γ-조사된 정의된 소 태아 혈청으로 제형화된 DMEM을 사용하여 225-㎠ 조직 배양 플라스크에서 수행된다. 세포는 하위-컨플루언스까지 약 3-4일 동안 확장하도록 허용된다. 세포는 그런 다음 CellCube® 시스템을 접종하는데 필요한 세포의 수에 도달하도록 표면적을 4 X 10-층 Cell Factory(Nalge Nunc International, IL)로 증가시키면서 점진적으로 계대된다. 신선한 배지 관류 공급은 1일당 최대 4개의 시스템 부피의 배지 교환까지로 글루코스 소비에 기반하여 제어된다. 최대 약 13-16일의 기간에 걸쳐 200 내지 1000 리터까지 사용되는 Cell Cube 모듈의 수에 의존한 생산 부피. 대표적인 생물반응기 샘플은 대사 프로필 및 PCR 형질도입 역가 분석을 위해 채취된다.
실시예 4
혈청으로부터의 HT-1080 MuLV 바이러스 벡터 생산자 세포주의 적응 및 무혈청 현탁액 배양에 대한 부착 의존성.
요약하면, 무혈청 적응 과정은 HT-1080 벡터 생산 세포주의 적합한 희석 클론의 스크리닝 및 동정 후에 수행된다. 적응 과정은 대략적으로 2x107 세포를 조건 배지를 포함하는 5% 혈청 10mL 및 선택된 무혈청 선택 배지 10mL를 함유하는 125mL 셰이커 플라스크 안으로 접종함에 의해 시작되어, 2.5%의 감소된 혈청 농도를 초래한다. 이 실시예에서, 무혈청 배지는 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen Corp를 통해 유통되는 FreeStyle 293 발현 배지이지만, 당해 분야의 숙련가를 위해, 동등하거나 맞춤화된 무혈청 배지가 또한 사용될 수 있다. 배양물은 온도 및 CO2 가스 제어 둘 모두를 갖는 조직 배양 인큐베이터에 위치된 진탕 플랫폼에 배치된다. 진탕 플랫폼은 약 80RPM으로 설정되고 인큐베이터는 37℃ 및 선호되는 5% CO2 조건으로 설정된다. 매 3-7일마다, 배양물은 현탁액에 있는 세포를 수집함에 의해 재-공급되고 동일한 초기 조절 배지 10mL 및 대략적으로 2.5%의 혈청 수준을 유지하는 신선한 무혈청 배지 10mL를 함유하는 새로운 셰이커 플라스크 안으로 재접종된다. 배양물은 세포 증식을 확인하기 위해 필요에 따라 수행된 생존가능 세포 계수로 각 재-공급 이벤트에서 검사된다. 세포가 세포 2배 또는 글루코스 소비를 기반으로 한 성장의 증거를 보일 때, 1.67%의 혈청 농도가 그 다음 조건 배지 및 신선한 무혈청 배지의 부피량을 조정함에 의해 표적화된다. 배양물은 다시 검사되고 매 3-7일마다 재공급된다. 세포가 성장의 증거를 보일 때, 1.25%의 혈청 농도가 조절된 배지 및 신선한 무혈청 배지의 부피를 다시 조정함에 의해 표적화된다. 이 과정은 세포가 100% 무혈청 조건이 될 때까지 1.0%, 0.9%, 0.83% 혈청 조건의 후속 혈청 조건을 표적화하여 계속된다. 이 적응 과정 동안 세포 배양물은 대략적으로 0.5 내지 1.0 x106 세포/mL의 최소 생존가능 배양물을 표적화하는 1,000mL 진탕 플라스크에서 대략적으로 200mL 부피로 확장된다. 세포가 100% 무혈청 조건에 도달하면, 세포는 더 무거운 덩어리 세포가 교반 없이 짧은 기간 동안 침전되도록 함에 의해 단일 현탁된 세포를 단리하는 무혈청 조건 하에서 연속적으로 계대된다. 배양이 일관되게 단일 세포 현탁액의 대략적으로 95% 모집단으로 구성되면, 배양물은 표준 포유동물 세포 동결 조건을 사용하여 10% DMSO 및 90% 무혈청 배지로 구성된 동결보존 배지에서 동결될 수 있다.
필요한 재료:
· FreeStyle 293 발현 배지, Invitrogen Corp., 캘리포니아주 칼즈배드 소재
· 125mL 및 1000mL 통기식 쉐이크-플라스크
· DMSO, USP(Cryoserv, Bionche Pharma USA, 일리노이주 레이크 포레스트 소재
실시예 5
파일럿/전-임상 규모 생산을 위한 로킹 백 생물반응기 시스템에서 현탁 배양물 및 생성 바이러스에 대한 생산자 세포주의 적응. VPCL 부착 클론을 무혈청 현탁액 VPCL에 적용하기 위해 이전에 기술된 과정을 사용하여, 세포 확장은 플라스크당 표시된 양의 세포 배양 배지를 함유하는 일련의 진탕기 플라스크를 사용하여 개시된다: Corning으로부터의 125-mL(20mL 배양); 250-mL(40mL); 500-mL(100mL); 및 1-L(200mL) 모두. 세포 확장은 0.1% 인간 혈청 알부민(HSA, Octapharma USA 유래, NJ 소재)이 보충된 완전히 한정된 무-혈청 배지(FreeStyle 293 발현 배지, Gibco Cat# 12338)를 사용하여 수행된다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 약 80rpm의 진탕기 속도로 인큐베이션한다. 5개의 1-L 진탕 플라스크 배양물을 사용하여 10L 작업 부피의 20-L 셀백을 함유하는 WAVE 생물반응기(WAVE 20/50 EHT, Cytiva Healthcare Life Sciences/GE Healthcare, MA 소재)에 접종한다. 생물반응기에서의 초기 세포 밀도는 37℃에서 약 4 x 105 생존가능 세포/mL(생존율 91%)이다. 초기 작동 조건은 5% CO2, 로커 속도 15rpm, 각도 6°, 공기 유량 0.2L/분이다. pH 제어는 약 7.2로 설정되고 DO 제어는 약 40%로 설정된다. pH 및 DO 제어 둘 모두는 WAVE POD 콘솔 시스템에 의해 구현된다.
세포 밀도가 ~1 x 106 생존가능 세포/mL에 도달한 후, 중공 섬유(파트# CFP-6D-6A) 카트리지(Cytiva Healthcare Life Sciences/GE Healthcare, MA 소재)를 사용하여 세포 관류 과정이 시작된다. 공급 (및 투과) 속도는 처음에 ~0.25 부피/일로 설정되고 최대 ~3.8 부피/일에 대해 세포 밀도로 점진적으로 증가된다. 바이러스를 함유하는 총 180L의 투과물이 15일 기간 이내에 수확된다. 대략적으로 300L의 수확된 재료가 25L의 작업 부피를 사용한 50L WAVE 백을 사용하여 수집될 수 있다. 180L - 300L 수확물에서 바이러스 역가는 5-8 x 106 TU/mL일 수 있다.
일회용 생물반응기(SUB) 관류 시스템을 사용한 현탁액 적응된 VPCL의 대규모 벡터 생산. SUB 생물반응기 확장 예로서, 최소 52L 작업 부피를 갖는 100L SUB(Thermo Fisher Scientific) 시스템을 사용하여 대략적으로 900-1000L의 정화된 벡터를 생성한다. 세포는 WAVE 생물반응기 로킹 시스템의 접종에 대해 이전에 기술된 바와 같이 확장된다. SUB 접종 후 WAVE와 유사하게, 세포는 2-8℃로 냉각된 일회용 믹서(SUM)에서 지속적인 신선한 배지 공급 및 정화된 투과물 수확 수집(14 내지 21일의 기간에 걸침)과 함께 관류 공정을 사용함에 의해 더 높은 세포 밀도로 성장된다.
배양물의 관류 공급은 생물반응기가 접종된 후 대략적으로 3일 후에 시작된다. 세포 배양 배지는 사용 전에 안티-폼 B(Sigma-Aldrich)와 같은 폴리디메틸실록산 기반 소포제의 낮은 수준 농도의 첨가를 갖는 0.1% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 보충된 Gibco FreeStyle 293 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)이다.
SUB 생물반응기 시스템에서 관류 과정 동안, 현탁 세포는 세포 배양 순환에 유지되는 반면, 벡터 생성물을 함유하는 세포 배양 상등액은 0.45μm 공칭 기공을 갖는 중공사 카트리지를 통한 접선 유동 미세여과에 이어서 수확된다. "투과물" 또는 정화된 벡터 수확물은 2-8℃로 제어되는 재킷형 일회용 믹서(SUM) 내의 일회용 수확 백 안으로 수집된다. 수확물 수집은 세포 밀도가 3-5 x 106 생존가능 세포/mL에 도달할 때 5-9일차 사이에 시작한다. 수집 과정은 11일에서 17일 동안 지속된다. 생산 가동은 대략적으로 900-1000L의 정화된 벡터 수확물이 얻어지면 종료되며, 이는 생물반응기에 접종한 시점으로부터 약 14 내지 21일이 소요된다.
생산자 세포주 확장 및 벡터 생산 공정 전반에 걸쳐, 생물반응기의 온도는 37℃로 제어된다. pH는 중탄산나트륨의 컨트롤러-자동화된 첨가에 의해 7.20±0.15로 제어되고, 용존 산소는 생물반응기 안으로 O2를 살포하여 40% 포화 설정점에서 제어된다. CO2 가스 유량은 공기 유량의 것의 5%로 설정된다. 글루코스 수준은 공급 속도 증가에 대한 지표로 온-라인 모니터링된다. 생물반응기에서 세포의 밀도가 대략적으로 2.5 x 106 생존가능 세포/mL에 도달하거나 생물반응기에서 글루코스의 수준이 (초기 5g/L로부터) 0.5g/L로 감소하면, 신선한 배지의 관류가 개시된다. 세포 밀도는 시간이 지남에 따라 증가하므로 공급 속도가 증가한다. 공급 속도 증가는 BioXpert W7 소프트웨어(Applikon Biotechnology)를 기반으로 개발되고 사용자 특이적인 자동화 코드를 이용하는 Applikon 컨트롤러를 통해 자동화된다. 신선한 배지는 세포 밀도가 증가함에 따라 생물반응기에서 영양소의 증가된 소비에 기인한 글루코스 및 영양소 고갈을 보충하기 위해 생물 반응기에 공급된다. 접선-흐름 중공사 카트리지에서 제거된 정화된 벡터 수확의 속도는 배지 공급 속도가 증가함에 따라 증가된다. 공급 및 투과율 증가 둘 모두는 생물반응기로부터 온-라인 글루코스 측정을 기반으로 자동화된다. 생물반응기의 중량(부피)은 동일한 사용자 특이적 자동화 코드에 의해 공급 속도와 함께 그 동시적인 증가 후 투과율(생물반응기에서 회수된 부피)을 조정함에 의해 시스템을 사용하여 제어된다.
실시예 6
바이러스 정제 및 농축. 정제된 바이러스 제제는 임상용 의약품 제제로 사용될 뿐만 아니라 (1) 항바이러스 항체를 검출하기 위한 정제된 포획 항원으로 ELISA 플레이트의 코팅을 위해 요구되고, (2) ELISA 검정 또는 기타 면역원성 바이러스 검출 방법을 위한 양성 대조군 항-바이러스 항체를 생성하기 위해 동물에서 정제된 면역원성 항원으로 사용된다. 개시내용의 바이러스는 MLV gag-pol을 발현하는 293 세포주인, 293T(예를 들어, Burns et al. PNAS 90:8033-8037 1993 참조) 또는 HT1080 세포를 일시적 형질감염에 의해, 또는 벡터 생산 비-클론성 세포주 풀, 또는 클로닝된 벡터 생산자 세포주로부터 다양한 양식 하에서 제조된다. 세포주 적응에 따라, 배지는 혈청 또는 무혈청일 수 있으며, 세포는 부착성 세포 또는 현탁액으로 성장할 수 있어, 세포 배양 상등액에 회분식으로 수확물이 수집되거나 관류 모드 하에서 수집되고 냉장된 2-8℃ 조건 하에서 보관될 수 있다. 배양 상등액은 수확되고 4℃에서 최대 2주간 보관된다. 이 대량 수확물은 데드 엔드 0.45 마이크론 필터 카트리지를 통해 또는 중공 섬유 카트리지 또는 큰 세포 파편을 제거하는 데 사용되는 플레이트 및 프레임 여과 시스템을 사용하는 접선 흐름 미세여과를 통해 여과된다. 여과 후 벡터는 세포질 DNA를 분해하기 위해 최소 온도 4℃에서 15-30시간의 범위에서 밤새 인큐베이션된 2mM MgCl2의 존재에서 2-5 단위/mL Benzonase®(EMD Millipore, 독일 다름슈타트 소재)로 처리되고(Shastry et al., Hum Gene Ther., 15:221, 2004) 그 다음 농축 단계를 거친다.
농축 단계는 접선 흐름 한외-여과를 사용하거나 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 한외여과의 경우, 바이러스 벡터 물질의 농축은 재순환 루프 내에서 큰 바이러스 입자를 유지하도록 설계된 500MW 컷-오프 막을 사용하여 달성된다. 시스템의 살균 및 중화 후, 후처리된 벡터 물질은 농축 용기에서 시작하여 연동 펌프를 통해 500MW 중공사 카트리지를 통해 재-순환 루프에서 농축된 다음 농축 용기로 되돌아간다. 재순환 시스템에서 모든 공기가 제거되면, 투과물 배출구가 개방되어 농축 과정이 시작된다. 투과물의 흐름은 재순환 속도의 대략적으로 1/10 유량으로 설정된다. 재순환 속도는 중공사 카트리지의 크기에 따라 다르지만 전형적으로 펌프 속도와 전단 속도가 바이러스에 손상을 주지 않는 최대 속도의 대략적으로 75%로 설정된다. 투과 폐기물이 수집되면, 추가 벡터 재료는 재료가 일반적으로 역가에서 10 내지 50x 배수 증가와 부피에서 상응하는 감소인 원하는 농축된 범위에 도달할 때까지 루프에 추가된다. 목표 농축에 도달하면, 제형 완충액을 사용하여 정용여과하고 벡터를 원하는 pH 중성 등장성 트리스-완충된 수크로스 용액으로 완충액 교환한다. 그런 다음 이 물질을 필터 멸균하고 그대로 사용하거나 추가 크로마토그래피 정제를 수행할 수 있다. 연마 크로마토그래피는 (1) 저분자량 하전 단백질을 추가로 제거할 수 있는 Capto Core 400(Cytiva/GE Healthcare)과 같은 다중 모드 수지를 사용하거나 (2) 완충액 교환 역할을 할 뿐만 아니라 저분자량 단백질을 제거하는, S-500 수지(Cytiva/GE Healthcare)와 같은 표준 크기 배제 크로마토그래피의 사용에 의해 사용될 수 있다. 크로마토그래피 후, 벡터는 안정성을 제공하기 위해 필요한 부형제와 함께 제형화되고, 0.2μ 필터 멸균되고, 바이알에 넣고 영하 65℃ 이하에서 동결될 수 있다.
한외여과에 대한 대안으로서, 벡터 농축은 또한 AEX 크로마토그래피를 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,792,643; Rodriguez et al., J Gene Med., 9:233, 2007; Sheridan et al., Mol. Ther., 2:262-275, 2000 참조). 벤조나아제 처리된 바이러스 제제는 음이온 교환 컬럼 상에 장입되고 바이러스는 단계적 NaCl 구배로 용리된다. 바이러스를 함유하는 분획은 PCR 검정 또는 A215, A280 뿐만 아니라 A400에 의해 식별될 수 있다. 양성 분획이 수집되고 풀링된다. 풀링된 제제는 이후에 크기 배제 컬럼(SEC) 상에 장입되어 염 뿐만 아니라 기타 남아있는 저분자량 오염물질을 제거할 뿐만 아니라 바이러스를 SEC 제형 완충액(HCl로 pH 7.2로 조정된, 90mM NaCl; 1% 수크로스, 1% 만니톨로 구성된 20mM 트리스 기반 등장성 용액)으로 컨디셔닝한다. SEC는 제형 완충액을 갖는 등용매 조건 하에서 실행되고 SEC 컬럼으로부터 바이러스 분획은 공극 부피에서 수집된다. 양성으로 식별된 분획을 모아서 최종 1mg/mL 인간 혈청 알부민에 보충하고, 제형 사전-습윤된 멸균 0.2μm 필터를 통해 여과하고, 분취하고 영하 65℃ 이하에서 동결한다. 공정에 사용되는 모든 성분은 임상 사용을 위해 GMP 요구사항 하에서 수행될 수 있는 제조 공정을 갖는 USP 공정서 등급 재료이다. 바이러스 제제는 SDS PAGE 겔 분석에 의해 평가된 순도 및 일관성을 갖는 무균, 마이코플라즈마 및 내독소와 같은 표준 테스트를 기반으로 출시된다. 역가는 표적 세포에서 통합된 바이러스 DNA의 PCR 정량화에 의해 형질도입 단위(TU)로 결정된다. 최종 생성물은 1x108 내지 1x109 TU/ml의 역가 범위를 갖는 것을 목표로 한다.
실시예 7
홍역 H-CD8scFv 및 절삭된 홍역 F 단백질 분자의 구성 및 특성화.
다른 실시형태에서, MLV-홍역 하이브리드 벡터는 CD8 양성 T-세포를 표적화하기 위해 제공된다. 홍역 헤마글루틴 "H" 작제물은 CD8 발현 세포에 특이적인 단일 사슬 항체의 키메라 서열을 인코딩하도록 변형된다. 설계에서 H 단백질 세포질 꼬리는 키메라 단백질을 수용체 결합 서열로 바이러스에 고정시키는데 사용되고, 돌연변이되거나 결실되어 H 수용체 결합을 파괴한다. 발현 작제물 HstalkscFvhl에서 입증된 바와 같이, 수용체 결합은 링커 서열을 통해 scFv 서열을 표적화하는 융합된 CD8을 사용하여 오히려 달성된다. 발현 작제물에서 입증된 바와 같이 HstalkscFvlh 개선 또는 대안적 표적화는 이것 및 다른 수용체 특이적 scFv 결합 서열의 대안적인 중쇄 및 경쇄 서열의 배향을 식별함에 의해 달성된다. 설계에서 Edmonston B 균주 홍역 서열이 사용되지만, 다른 홍역 바이러스 균주가 동등한 변형을 위한 F 및 H 단백질을 공여하기 위해 사용될 수 있다. CD8 세포 결합 시 바이러스 융합을 달성하기 위해, Pit2 결합 인식 서열이 없는 별도의 키메라 MLV env 작제물이 작제물 EdB 융합 P DNA-4070A 꼬리에 대해 기술된 바와 같이 홍역 "F" 융합 단백질에 융합된다. 이 키메라 작제물은 양쪽성 엔벨롭의 세포질 꼬리를 사용하여 바이러스 입자에 결합된다. 대안적인 설계에서, 꼬리-없는 F 단백질이 또한 바이러스 입자 융합을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 8
CD8 양성 T-세포 표적화를 위해 변형된 홍역 "F" 융합 단백질 및 "H" 결합 단백질을 갖는 MoMLV 하이브리드 엔벨롭을 사용한 표적화된 CD 8 엔벨롭을 갖는 PCL/VPCL의 구축 및 시험.
CD8 양성 T-세포를 표적화할 수 있는 MoMLV 바이러스 입자를 생성할 수 있는 패키징 세포주를 생성하기 위해, 실시예 7에 기재된 홍역 H-CD8scFv 및 절삭된 홍역 F 단백질 작제물이 패키징 세포주를 생성하기 위해 실시예 2에 기재된 pCMVenvamDraLBGH 또는 pCMV-β/envam 엔벨롭 작제물 대신에 사용된다. 간단히 말해서, H-CD8scFv를 인코딩하는 플라스미드 작제물(작제물 52, pCMVenvMFhlCD8DraLBGH) 및 절삭된 홍역 F 단백질 발현 벡터(작제물 53, pCMVenvMtFDraLBGH)이 안정한 플라스미드 형질감염에 의해 특성화된 gag/pol 패키징 세포주 중간체 안으로 순차적으로 형질감염된다. 이전에 지적된 바와 같이, 당업자는 또한 조작된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 표적화 H-CD8scFV 및 절삭된 홍역 F(mF) 서열을 갖는 gag/pol 중간체 세포주를 안정적으로 형질도입할 수 있다. 일 실시형태에서, 홍역 F 단백질 벡터는 홍역 F 단백질을 또한 발현하는 gag/pol 중간체 세포주를 생성하기 위해 초기에 전달된다. 이는 대안적인 바이러스 표적화 가능성이 있는 패키징 세포주를 생성하기 위해 바이러스 하이브리드 엔벨롭 표적화 서열의 추가만을 요하는 대안적인 gag/pol-mF 중간체 세포주를 허용한다. 이 새로운 gag/pol-F 단백질 중간체는 웨스턴 블롯 분석에 의해 gag/pol 및 mF 단백질 서열 둘 모두의 가장 높은 공동-발현에 대해 스크리닝된 클론과 함께, 희석 클론을 생성하기 위해 연속적으로 희석된다. 안정적인 발현을 위해 여러 클론이 식별되면, 클론은 선택가능한 마커를 발현할 수 있는 유사한 MLV 테스트 벡터뿐만 아니라 바이러스 표적화 H-CD8scFV 서열을 세포주 안으로 도입함에 의해 기능적으로 시험되어 바이러스 패키징 세포주 성능을 평가할 수 있다. 역가 분석을 수행함에 있어 발현의 전달을 테스트하기 위한 나이브 테스트 세포는 CD8 양성 세포 예컨대 TALL-104(ATCC CRL-11386); Molt4(ATCC CRL-1582) 또는 CD8 수용체 예컨대 PC-3(ATCC CRL-1435) 또는 HT0180(ATCC CCL-121)을 안정적으로 발현하도록 변형된 부착 세포이여야 할 것이다. 일단 클론 gag/pol-mF 세포주 중간체가 식별되면, 세포는 그 다음 표적화 H-CD8scFV 발현 벡터로 안정적으로 형질감염되거나 형질도입될 수 있다. 표적화 H-CD8scFV 패키징 세포주는 후속적으로 모든 관련 바이러스 단백질 서열: gag/pol, mF 및 H-CD8scFV에 대해 스크리닝된 개별 클론으로 연속으로 희석된다. 가장 높은 발현을 갖는 클론은 바이러스 입자의 발현을 나이브 CD8 양성 역가화 세포 상으로 전달함에 의해 안정한 역가 생산을 평가하기 위해 형광 마커 및/또는 약물 선택가능한 내성 마커를 발현하는 MLV 테스트 벡터를 도입함에 의해 기능적 성능에 대해 다시 시험된다.
MLV 패키징 세포주를 표적화하는 CD8을 사용한 벡터 생성 세포주(VPCL)의 생성. 상기에 기술된 CD8 표적화 MLV 패키징 세포주를 사용하여 VPCL을 생성하기 위해, 실시예 2에서 입증된 것과 동일한 MLV 벡터 pBA-9b-emdGFPmir233-3p4TXv2 또는 대안적인 MLV 벡터 작제물을 사용하여 CD8 표적화 PCL을 안정적으로 형질감염시킨다. 대안적으로, MLV 벡터 작제물은 MLV 패키징 세포주를 표적화하는 CD8을 안정적으로 형질도입하기 위해 일시적으로 생성된 VSV-g 또는 암포-유래된 벡터 입자를 생성하는데 사용된다. 이전에 상기 기술된 바와 같이, 레트로바이러스 비-클론 벡터 생산 세포주 뿐만 아니라 후속 생산 클론은 도 6에 참조된 개요에 따라 설정된다. 그러나, 이 실시예에서는 PCL을 표적화하는 CD8이 gag/pol 중간체 세포주에서 생성된 VSV-G 위형화된 MLV를 사용하거나 MLV 벡터를 갖는 HAL2 세포 안으로 일시적으로 형질감염시킴에 의해 양쪽성 벡터 생성 입자를 사용하여 단일 또는 다중 백-투-백 형질도입 라운드에 사용된 >20의 m.o.t.를 갖는 형질도입 "높은 m.o.t." 어프로치의 동일한 높은 다중도를 사용한 HAL2 클론 패키징 세포주 대신에 사용된다. 전형적으로 PCL 배양물은 일시적 형질도입 하루 전에 6-웰 플레이트에 1 X 105 세포/웰로 접종된다. 적절한 부피의 벡터 상등액이 그런 다음 0.1, 0.5, 5, 25 및 125의 m.o.t.에 상응하는 PCL(4-8μg/ml 폴리브렌 존재 하에)에 첨가된다. 20-24시간 후 벡터 상등액은 신선한 배지 2ml로 교체된다. m.o.t.를 증가시키기 위해, 형질도입 절차는 동일한 부피의 벡터 상등액을 사용하여 제2 일 동안 반복될 수 있다. 생산자 풀은 컨플루언스까지 성장하고 상등액은 컨플루언스-후 24, 48 및 72시간에 매일 배지 재공급 일정을 사용하여 매일 수집되어 역가화 세포주로서 CD8 양성 세포주를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 PCR 형질도입 역가를 결정하고/하거나 유전자 발현의 전달을 평가한다. 선택된 비-클론 풀은 개별 클론이 확장됨에 따라 여러 라운드의 역가 측정 및 발현 검정의 전달을 사용하여 분석되는 웰당 단일 세포를 초래하는 96 웰 플레이트 안으로 접종하는 제한된 희석을 사용하여 클로닝된다. 지속가능한 높은 역가 생산을 갖는 VPCL 클론은 냉동보존되어 안전성에 대해 테스트되는 작업 스톡을 동결하여 준비한다(FDA의 고려 사항에 기술된 대로 멸균, 마이코플라스마, 복제 가능 레트로바이러스뿐만 아니라 기타 바이러스 외래성 제제). 개별 클론에서 유래하는 바이러스 입자의 게놈 바이러스 서열화도 적격의 세포 은행 스톡 특성화의 일부로 게놈 MLV 서열의 정확성을 보장하기 위해 수행된다. 일단 적격화되면 적격의 세포 은행 스톡으로부터 바이알을 추가로 확장하고 GMP 하에서 추가 테스트하여 궁극적 임상 생산을 위한 GMP 마스터 및 작업 세포 은행 스톡을 생성할 수 있다.
실시예 9
CD4 양성 T-세포 표적화를 위한 홍역 "F" 융합 단백질 및 "H" 결합 단백질을 갖는 MoMLV 하이브리드 엔벨롭을 사용한 표적화된 CD 4 엔벨롭을 갖는 PCL/VPCL의 구축 및 시험.
CD4 양성 T-세포를 표적화할 수 있는 MoMLV 바이러스 입자를 생성할 수 있는 패키징 세포주를 생성하기 위해, 실시예 7에 기재된 홍역 H-CD4scFv 및 절삭된 홍역 F 단백질 작제물이 패키징 세포주를 생성하기 위해 실시예 2에 기술된 pCMVenvamDraLBGH 또는 pCMV-β/envam 엔벨롭 작제물 대신 사용된다. 간단히 말해서, 플라스미드 작제물 H-CD4scFv 및 절삭된 홍역 F 단백질 발현 벡터는 안정한 플라스미드 형질감염에 의해 특성화된 gag/pol 패키징 세포주 중간체 안으로 순차적으로 형질감염된다. 이전에 지적된 바와 같이, 당업자는 또한 조작된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 표적화 H-CD8scFV 및 절삭된 홍역 F(mF) 서열을 갖는 gag/pol 중간체 세포주를 안정적으로 형질도입할 수 있다. 일 실시형태에서, 홍역 F 단백질 벡터는 홍역 F 단백질을 또한 발현하는 대안적인 gag/pol 중간체 세포주를 생성하기 위해 초기에 전달된다. 이는 대안적인 바이러스 표적화 가능성이 있는 패키징 세포주를 생성하기 위해 바이러스 표적화 서열의 추가만을 요하는 gag/pol-mF 중간체 세포주를 허용한다. 이 gag/pol-F 단백질 세포주 중간체는 웨스턴 블롯 분석에 의해 gag/pol 및 mF 단백질 서열 둘 모두의 가장 높은 공동-발현에 대해 스크리닝된 클론과 함께, 희석 클론을 생성하기 위해 연속적으로 희석된다. 안정적인 발현을 위해 여러 클론이 식별되면, 클론은 선택가능한 마커를 발현할 수 있는 유사한 MLV 테스트 벡터뿐만 아니라 바이러스 표적화 H-CD8scFV 서열을 세포주 안으로 도입함에 의해 기능적으로 시험되어 바이러스 패키징 세포주 성능을 평가할 수 있다. 역가 분석을 수행함에 있어 발현의 전달을 테스트하기 위한 나이브 테스트 세포는 CD4 양성 세포 예컨대 CCRF-CEM(ATCC CCL-119); A301 또는 CD4 수용체 예컨대 PC-3(ATCC CRL-1435) 또는 HT0180(ATCC CCL-121)을 안정적으로 발현하도록 변형된 부착 세포이여야 할 것이다. 일단 클론 gag/pol-mF 세포주 중간체가 식별되면, 세포는 그 다음 표적화 H-CD4scFV 발현 벡터로 안정적으로 형질감염되거나 형질도입될 수 있다. 표적화 H-CD4scFV 패키징 세포주는 후속적으로 모든 관련 바이러스 단백질 서열: gag/pol, mF 및 H-CD4scFV에 대해 스크리닝된 개별 클론으로 연속으로 희석된다. 모든 단백질의 가장 높은 발현을 갖는 클론은 바이러스 입자의 발현을 나이브 CD4 양성 테스트 세포 상으로 전달함에 의해 안정한 역가 생산을 평가하기 위해 형광 마커 및/또는 약물 선택가능한 서열을 발현하는 MLV 테스트 벡터를 도입함에 의해 기능적 성능에 대해 다시 시험된다.
MLV 패키징 세포주를 표적화하는 CD4를 사용한 벡터 생성 세포주(VPCL)의 생성. 상기에 기술된 CD4 표적화 MLV 패키징 세포주를 사용하여 VPCL을 생성하기 위해, 실시예 2에서 입증된 것과 동일한 MLV 벡터 pBA-9b-emdGFPmir233-3p4TXv2 또는 대안적인 MLV 벡터 작제물을 사용하여 CD4 표적화 PCL을 직접적으로 안정적으로 형질감염시킨다. 대안적으로, 그리고 또 다른 실시형태에서, MLV 벡터 작제물은 CD4 표적화 MLV 패키징 세포주를 안정적으로 형질도입하기 위해 일시적으로 생성된 VSV-g 또는 암포 유래된 벡터 입자를 생성하는데 사용된다. 이전에 상기 기술된 바와 같이, 레트로바이러스 비-클론 벡터 생산 세포주 뿐만 아니라 후속 생산 클론은 도 6에 참조된 개요에 따라 설정된다. 그러나, 이 실시예에서는 PCL을 표적화하는 CD8이 gag/pol 중간체 세포주에서 생성된 VSV-G 위형화된 MLV를 사용하거나 MLV 벡터를 갖는 HAL2 세포 안으로 일시적으로 형질감염시킴에 의해 양쪽성 벡터 생성 입자를 사용하여 단일 또는 다중 백-투-백 형질도입 라운드에 사용된 >20의 m.o.t.를 갖는 형질도입 "높은 m.o.t." 어프로치의 동일한 높은 다중도를 사용한 HAL2 클론 패키징 세포주 대신에 사용된다. 전형적으로 PCL 배양물은 일시적 형질도입 하루 전에 6-웰 플레이트에 1 X 105 세포/웰로 접종된다. 적절한 부피의 벡터 상등액이 그런 다음 0.1, 0.5, 5, 25 및 125의 m.o.t.에 상응하는 PCL(4-8μg/ml 폴리브렌 존재 하에)에 첨가된다. 20-24시간 후 벡터 상등액은 신선한 배지 2ml로 교체된다. m.o.t.를 증가시키기 위해, 형질도입 절차는 동일한 부피의 벡터 상등액을 사용하여 제2 일 동안 반복될 수 있다. 생산자 풀은 컨플루언스까지 성장하고 상등액은 컨플루언스-후 24, 48 및 72시간에 매일 배지 재공급 일정을 사용하여 매일 수집되어 CD4 양성 세포주를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 PCR 형질도입 역가를 결정하고/하거나 유전자 발현의 전달을 평가한다. 선택된 비-클론 풀은 개별 클론이 확장됨에 따라 여러 라운드의 역가 측정 및 발현 검정의 전달을 사용하여 분석되는 웰당 단일 세포를 초래하는 96 웰 플레이트 안으로 접종하는 제한된 희석을 사용하여 클로닝된다. 지속가능한 높은 역가 생산을 갖는 VPCL 클론은 냉동보존되어 안전성에 대해 테스트되는 작업 스톡을 동결하여 준비한다(FDA의 고려 사항에 기술된 대로 멸균, 마이코플라스마, 복제 가능 레트로바이러스뿐만 아니라 기타 바이러스 외래성 제제). 개별 클론에서 유래하는 바이러스 입자의 게놈 바이러스 서열화도 적격의 세포 은행 스톡 특성화의 일부로 게놈 MLV 서열의 정확성을 보장하기 위해 수행된다. 일단 적격화되면 적격한 세포 은행 스톡으로부터 바이알을 추가로 확장하고 GMP 하에서 추가 테스트하여 궁극적 임상 생산을 위한 GMP 마스터 및 작업 세포 은행 스톡을 생성할 수 있다.
실시예 10
종양 세포에서 벡터 발현(GFP)을 방지하기 위해 miRNA를 갖는 B 림프종 세포의 탈표적화의 생체내 시험.
분화된 세포 유형은 그 표적 mRNA를 분해함에 의해 유전자 발현의 전사후 조절자로 역할을 하는 작은 비암호화 RNA인 miRNA의 독특한 세트를 발현한다. 비-복제 레트로바이러스의 전사 카고에 특정 miRNA 서열의 추가는 레트로바이러스의 세포 유형-특이적 분해를 초래하여 레트로바이러스가 레트로바이러스 형질도입 및 발현이 바람직하지 않은 세포에서 효과적으로 소멸될 수 있다. 이 어프로치의 효능을 입증하기 위해 HT1080 인간 섬유육종 세포를 렌트바이러스 벡터를 사용하여 정상적으로 발현하지 않는 miRNA R223-3p를 과발현하도록 조작했다. 그런 다음 이들 세포를 플라스미드 pBA-9b-GFP(c45) 및 pBA-9B-GFPmiR 223-3p4TX(c7)로 만든 GFP 벡터로 챌린지하여 결과를 얻었다. miR223-3p를 발현하는 HT1080세포에서 GFP-miRT223-3p 벡터로부터의 GFP 발현이 거의 완전히 차단되었지만 miR223-3p 발현이 있거나 없는 세포에서 비변형된 GFP를 사용하는 동등한 양호한 수준의 GFP 발현이 있었다. 덜 조작된 상황에서 이 효과를 보여주기 위해, 단핵구 세포주 U937은 비변형된 벡터 또는 관련없는 miRNA 표적(663A-T)을 갖는 벡터에서 GFP를 발현하고 miR223-3p를 갖는 벡터에서는 발현하지 않는 것으로 나타났다(도 10). 이들 실험은 일치하는 마이크로RNA를 발현하는 특정 세포 유형에서 miRT 변형된 벡터를 사용하여 유전자 발현을 차단하는 능력을 보여준다. 이 기능은 또한 IRES CD 모듈을 인코딩하는 벡터에 대해서 입증되었으며, 이는 사멸-스위치 유전자(IRES-Kill-Switch, 이 경우 시토신 데아미나제)에 대한 구성이 이 유형의 발현 제어에 동등하게 적용할 수 있음을 나타낸다. 함께, 이들 데이터는 형질도입된 세포에 의해 발현된 miRNA 서열이 RNV 페이로드의 발현을 소멸시키는데 활용될 수 있음을 확인한다.
실시예 11
림프종의 동계 마우스 모델에서 직접 투여에 의한 항-마우스 CD19 CAR을 인코딩하는 RNV의 생체내 치료 효과
플라스미드 pBA-9b-mCD19(1D3)-IRESyCD(c40)는 IRES-CD 카세트와 함께 WO2020/142780에 기재된 항-마우스 CD19(ID3) CAR 벡터를 인코딩하고, 실시예 2-6에 기재된 바와 같이 감염성 벡터를 제조하는데 사용된다.
Balb/c 마우스에서 A20 림프종 계통(루시퍼화됨)(Kueberuwa et al., J. Vis. Exp., (140), e58492, 2018)을 모델로 사용하여 마우스 항CD19 CAR RNV 작제물, (mCD19-RNVCAR, mCD19(1D3)-IRES yCD(v)), 마우스 항-CD19 scFv 1D3, 이어서 뮤어라인 CDS 막관통 도메인, 이어서 뮤어라인 4-1BB 세포내 도메인, 이어서 뮤어라인 CD3i(작제물 4) 세포내 도메인의 생체내 감염 효능을 평가했다. 간단히 말해서, A20 림프종 세포의 이식 하루 이전에, 6 내지 8-주령 BALB/c 마우스에 150mg/kg 시클로포스파미드를 복막(IP)으로 투여하였다. 시클로포스파미드 전처리는 A20 강력한 종양 생착을 허용한다. A20 B-세포 림프종 세포는 0일차에 IV(200μL 내 1E5 세포) 주사되었다. 벡터, mCD19(1D3)-IRES yCD(v)는 A20 이식 후 3일차에서 시작하여 연속 4일 동안 1일당 1E8 TU의 용량으로 주사되었다.
mCD19(1D3)-IRES yCD(v) 처리는 A20 림프종 세포로부터의 발광 신호에 의해 평가된 바와 같이 25일차까지 비히클 처리된 대조군과 비교하여 더 낮은 A20 종양 부담을 초래하였다(도 7 참조). 수치적 광도에서 현저한 감소는 시각적으로도 명백하다(도 7c 참조, 그리고 대조군에 대해 무 검출가능한 종양이 있는 무 동물, 4/10에 비해 무 검출가능한 종양 생존자를 갖는 2마리 동물을 갖는 6/10의 처리 그룹에 대해 명백한 생존 이점이 있음). A20 종양 부담에서 감소는 mCD19-RNVCAR 벡터의 IV 투여가 A20 종양 성장을 억제한다는 것을 나타낸다. mCD19(1D3)-IRES yCD(v)의 IV 투여 후 종양 성장 억제가 발생하기 위해, 벡터는 순환하는 T 세포에 들어가야 하고, mCD19-CAR은 이들 T 세포의 표면 상에서 발현되어야 하고 이들 T 세포는 그 다음 파종된 종양의 부위로 귀소해야 하고, 그리고 최종적으로 T 세포의 표면 상의 mCD19-CAR은 A20 종양 세포 상의 CD19와 계합하고 A20 종양 세포의 사멸을 활성화해야 한다.
실시예 12
전구약물 활성화 유전자의 사용에 의한 CAR-T 세포의 탈-활성화.
A. CD 유전자 플러스 5-FC 및 TK 유전자 플러스 간시클로비르로 감염된 세포의 시험관내 사멸 - 도 9 플러스 범례 참조.
B. 전구약물 플루시토신을 5-FU로 전환하고, 급성 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 완화하고 시험관내 장기간 B 세포 결실을 완화시키는 효모 시토신 데아미나제(CD) 사멸 스위치를 사용한 CAR-T 세포의 시험관내 탈활성화
시토신 데아미나제 활성 및 세포를 사멸시키는 능력을 측정하기 위한 시험관내 및 생체내 검정은 미국 특허 번호: US20140178340A1 및 US9732326B2에 기재되어 있다. 이 실시형태에서, CD는 RNV-형질도입된 CD19CAR 양성 세포를 제거하여 CD19 CAR 활성의 치료적 처리를 종료하기 위한 사멸 스위치로서 사용된다. 급성 CRS 및 장기 B 세포 무형성은 둘 모두 CD19 CAR 벡터 예를 들어 작제물 8 및 11 안으로 내장된 효모 CD 사멸 스위치를 전개함에 의해 완화할 수 있다 CD19CAR RNV에서 발현되도록 조작된 시토신 데아미나제를 갖는 폴리펩티드의 발현 및 활성은 미국 특허 번호 9,732,326B2에 기재된 시험관내 검정과 효모 CD+ 작제물 8) 및 CD-벡터(작제물 14)로 형질도입된 세포에 대한 비교된 5-FC 사멸 곡선을 통해 확인될 수 있다. 이들 데이터는 CD- 세포와 비교하여 CD+ 세포에 대한 5FC에 대해 민감도가 거의 100 배수 증가했음을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 시토신 데아미나제를 갖는 폴리펩티드는 사멸 스위치로서 최적화된 티미딘 키나제(TKO)로 대체된다. 티미딘 키나제 활성 및 세포를 사멸시키는 능력을 측정하기 위한, 시험관내 및 생체내 검정에서 TKO의 서열은 미국 특서 공개 번호 US20150273029A1에 기재되어 있다. 시토신 데아미나제와 유사하게, 추가적 치료 유전자를 함유하는 RNV에 추가될 때 TKO의 사용은 RNV-형질도입된 세포와 인접하는 세포의 세포 사멸을 유도하는 제자리 인산화에 의한 간시클로비르, 아시클로비르, 발라시클로비르(Valtrex™) 또는 다른 유사체와 같은 일반적인 항-헤르페스 약물의 활성화를 허용한다. 따라서 급성 CRS 및 장기 B 세포 무형성 둘 모두는 항-헤르페스 약물과 조합될 때 CD19 CAR 벡터 안에 내장된 TKO 사멸 스위치를 배치함에 의해 완화될 수 있다.
인간에서 CD19CAR 치료의 급성 부작용은 CAR-T 기능, 사이토카인 방출 증후군(CRS)에 의해 생성되는 특정 사이토카인의 더 높은 수준과 연관된다. 이 부작용은 연장된 입원기간을 초래할 수 있고 생명을 위협할 수 있다. 반응을 완전히 제거하지 않고 CAR-T 세포의 수를 감소시켜 CAR-T 세포 기능에 의해 매개되는 사이토카인 반응을 감소시키는 능력은 안전성을 증가시키고 전통적인 CAR-T와 연관된 부작용을 감소시킬 수 있다. CRS를 감소시키는 사멸 스위치의 능력을 평가하기 위해, CD34+ 이식된 마우스를 CD19CAR(v) 또는 CD19CAR-yCD(v)로 IV 처리하고 2일 후 50 내지 500mg/kg의 다양한 농도의 5-플루시토신을 투여하였다. 플루시토신이 없으면 대략적으로 30%의 마우스가 CRS-유사 증상을 전개하고 IL-6, IFN-g, GM-CSF 및 TNFa의 상승된 혈중 사이토카인 농도를 나타낸다. 상승된 사이토카인 수준을 나타내는 마우스는 또한 PCR 및 유세포분석에 의해 비장 및 골수에서 강한 CD19CAR 지속성을 나타낸다. 높은 용량의 플루시토신(500mg/kg)에서 CD19CAR-yCD(v)로 치료된 마우스는 비장과 골수에서 상승된 말초 혈액 사이토카인 또는 CD19CAR 지속성을 나타내지 않은 반면 CRS-유사 증상을 경험한 마우스의 백분율은 CD19CAR(v)로 처리된 마우스에서 변하지 않게 유지한다. 이것은 사이토카인 상승 및 CRS-유사 증상이 CD19CAR의 존재와 연관되어 있음을 입증한다. 그러나, 낮은 용량의 플루시토신(50 - 150mg/kg)에서, CD19CAR-yCD(v)로 처리된 마우스 중 어느 것도 상승된 사이토카인 또는 CRS-유사 증상을 보이지 않는 반면 CD19CAR(v)에서 CRS 영향은 30%로 유지된다. CD19CAR-γCD(v)로 처리된 동물에서, 여전히 검출가능한 CD19CAR 및 지속적인 B 세포 무형성이 존재하며 이는 전구약물의 낮은 용량이 CAR 및 CAR 기능을 제거하지 않고 CAR 기능과 연관된 사이토카인 수준을 감소시킬 수 있음을 시사한다. 낮은 용량 전구약물로 사이토카인 반응을 조정하거나 조절하는 능력은 CD19CAR-γCD(v)-형질도입된 T 세포의 기능을 불능화함이 없이 안전성을 개선할 가능성을 열어준다.
C. CAR-T의 생체내 탈활성화는 TKO 사멸 스위치를 사용하여 알려주고, 장기간 B 세포 무형성 효과 및 급성 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 완화시킨다.
또 다른 실시형태에서, 효모 시토신 데아미나제(yCD)는 CD19CAR-발현 RNV에서 TKO로 대체된다. 장기간 B 세포 무형성 효과와 CAR-T 활성과 연관된 급성 CRS 효과 둘 모두는 CD19 CAR 벡터 안으로 내장된 TKO 사멸 스위치를 활용함에 의해 완화될 수 있다. 유사한 생체내 연구가 상기에 기술된 대로 유사한 결과로 실행된다: 낮은 농도의 전구약물(예를 들어 5 - 20mg/kg 간시클로비르 IP, 1일당 2회)로 TKO 사멸 스위치의 활성화는 CRS와 연관된 말초 사이토카인이 감소하는 동시에 종양 세포를 사멸하기 위한 CD19CAR-형질도입된 T 세포의 지속성을 허용하고; 높은 용량의 전구약물(예를 들어 50mg/kg 간시클로비르 IP, 1일당 2회)로 TKO 사멸 스위치의 활성화는 CAR 형질도입된 세포 및 CAR-형질도입된 세포의 활성, 즉 B 세포 고갈을 효과적으로 제거한다.
실시예 13A
CD19에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 또한 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터에서 발현된 IL-12p70의 시험관내 시험
인간 CAR-발현 작제물에 대한 단일 사슬 작제물(작제물 16; 서열번호:3)로서 인간 IL-12p70의 첨가는 CAR의 지속되고 강력한 T 세포 활성을 지지하고 비-CAR 형질도입된 면역 세포의 항암 면역 활성을 촉진한다. 1차 말초 T 세포 또는 T 세포주(예를 들어 TALL-104; Jurkat)는 인간 CD19-표적화된 CAR을 인코딩하거나 IL-12p70 이식유전자(pBA9b-CD19CAR, 작제물 6 또는 8, 및 pBAb-CD19CAR-IL-12p70, 작제물 16)를 다양한 MOI(예를 들어 0.1, 1 및 10)에서 공동-발현하는 CD19-표적화된 CAR을 인코딩하는 RNV로 형질도입된다. 형질도입된 세포의 샘플에 대한 웨스턴 블롯을 실행하고 CD19 CAR의 용량-의존적 발현 및 작제물 16에 대해, 사용된 MOI 증가에 상응하는 증가하는 IL-12p70 단백질 수준을 확인한다. RNV-형질도입된 세포는 증식 모니터링 염료(예를 들어 세포 추적 보라색)로 표지된다. 그런 다음 세포는 시험관내 배양 실험에서 CD19-발현 세포(예를 들어 NALM-6 +/- CD19 발현; 일차 B 세포, 또는 CD19를 재조합적으로 발현하는 변형된 세포)와 혼합된다. 2, 6, 12, 24 및 48시간의 시간 경과의 배지 및 세포를 혼합된 세포 반응물로부터 취했다. 예를 들어, Nalm6-CD19WT 및 Nalm6-CD19KO 종양 세포주를 사용하여, 공동-배양 상등액을 수집하여 효소면역측정법(ELISA) 및 유세포분석-기반 Biolegend의 Legendplex™ 검정을 사용하여 분비된 사이토카인 수준을 측정한다. 재프로그래밍된 CAR-T 세포는 CAR-특이적 방식으로 Nalm6-CD19KO가 아닌 Nalm6-CD19WT를 갖는 배양물로부터 상등액에서만 IL2, IFNg 및 TNF와 같은 사이토카인을 분비한다. ELISA는 IL-12p70이 CD19CAR RNV에 의해 공동-발현될 때 MOI 전반에 걸쳐 인터페론 감마의 생산 증가를 확인한다. 인터페론 감마 생산에서 가장 큰 차이는 낮은 MOI에서 관찰되었다.
샘플의 유세포분석을 실행하여 T 세포 증식 뿐만 아니라 세포 사멸을 측정했다. 3가지 작제물 모두에 걸쳐 MOI가 증가함에 따라 증가된 세포 증식이 용량-의존적으로 관찰되었다. 부가하여, IL-12p70이 CD19CAR RNV에 의해 공동-발현될 때 형질도입된 세포는 CD19CAR 단독 발현과 비교하여 동일한 시간 프레임에서 발생한 세포 분열의 수에서 증가를 나타냈다. 유사한 효과가 GFPmiRT와 유사한 방법론을 사용하여 T 세포 분열에 해당하는 세포 사멸 및 증가된 세포 사멸에 대해 관찰되었다.
실시예 13B
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 RNV를 발현하는 CD19CAR에서 IL-2(작제물 14; 서열번호: 5)로 대체된다. 유사한 시험관내 연구가 유사한 결과로 상기에서 기술된 바와 같이 실행되었다. 웨스턴 블롯 및 ELISA는 IL-2가 형질도입된 세포에서 CD19 CAR과 함께 발현된다는 것을 확인한다. IL-2가 RNV-형질도입된 T 세포에서 CD19 CAR과 함께 공동-발현될 때, 이들 T 세포는 증가된 활성(증식), CD19(인터페론 감마)에 의한 활성화 시 사이토카인 분비 및 검정에서 형질도입된 T 세포에 의한 CD19-발현 세포의 사멸 증가를 나타낸다.
실시예 13C
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 RNV를 발현하는 IL-242A(IL-2supmut, 작제물 13; 서열번호: 6) CD19CAR로 대체된다. 유사한 시험관내 연구가 유사한 결과로 상기에서 기술된 바와 같이 실행되었다. 웨스턴 블롯 및 ELISA는 IL-2supmut이 형질도입된 세포에서 CD19 CAR과 함께 발현된다는 것을 확인한다. IL-2supmut이 RNV-형질도입된 T 세포에서 CD19 CAR과 함께 공동-발현될 때, 이들 T 세포는 증가된 활성(증식), CD19(인터페론 감마)에 의한 활성화 시 사이토카인 분비 및 형질도입된 T 세포에 의한 CD19-발현 세포의 사멸 증가를 나타낸다. 부가하여, 작제물 6, 8, 13 또는 14로 형질도입된 Treg 세포(일차 또는 MT-2 세포주)와 1:1 혼합된 T 세포주를 비교하는 시험관내 연구가 수행된다. 반면 작제물 6, 8, 14로 형질도입된 세포는 Treg의 활성화 및 IL-10의 발현을 보여주었으며, IL-2supmut로 형질도입된 것들은 기준선과 필적할만한 수준을 보여 IL-2supmut의 사용이 동일한 배양에서 Treg 모집단의 증강된 활성을 배제하면서 CD19CAR+ TH1 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성을 증가시킨다는 것을 확인한다.
실시예 13D
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 RNV를 발현하는 CD19CAR에서 IL-7R-CPT(작제물 15; 서열번호: 4)로 대체된다. 인터루킨-7 수용체 서브유닛 알파(IL7Ra)는 CD 항원 CD127로도 알려져 있으며, 이는 유형 I 사이토카인 수용체 패밀리 및 유형 4 서브패밀리에 속한다. IL7Ra/CD127은 나이브 및 기억 T 세포 및 기타 여러 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 발현된다. IL7Ra는 인터루킨-2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG)와 이종이량체를 형성하여 IL7 신호를 전달한다. 그러나, IL7Ra는 시스테인 및/또는 비시스테인 돌연변이를 획득하여 동종이량체를 형성하여, 리간드(IL7) 독립적인 시그널링 이벤트를 유발할 수 있다. 이 리간드 독립적인 IL7Ra 동종이량체(IL7-Ra-CPT)는 T 세포의 지속적인 증식과 장기간 지속을 지원한다. 유사한 시험관내 연구가 유사한 결과로 상기에서 기술된 바와 같이 실행되었다. 웨스턴 블롯 및 ELISA는 IL-7Ra-CPT가 형질도입된 세포에서 CD19 CAR과 함께 발현된다는 것을 확인한다. IL-7R-CPT가 RNV-형질도입된 T 세포에서 CD19 CAR과 함께 공동-발현될 때, 이들 T 세포는 증가된 활성(증식), CD19(인터페론 감마)에 의한 활성화 시 사이토카인 분비 및 상기에 실행한 검정과 유사한 형질도입된 T 세포에 의한 CD19-발현 세포의 증가된 사멸을 나타낸다.
실시예 13E
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 RNV를 발현하는 CD19CAR에서 IL-12p70과 관련되지 않은 IL-12(작제물 16) 또는 IL-12 유도체로 대체된다. 유사한 시험관내 연구가 유사한 결과로 상기에서 기술된 바와 같이 실행되었다. 웨스턴 블롯 및 ELISA는 IL-12가 형질도입된 세포에서 CD19 CAR과 함께 발현된다는 것을 확인한다. IL-12가 RNV-형질도입된 T 세포에서 CD19 CAR과 함께 공동-발현될 때, 이들 T 세포는 증가된 활성(증식), CD19(인터페론 감마)에 의한 활성화 시 사이토카인 분비 및 상기 검정과 유사한 형질도입된 T 세포에 의한 CD19-발현 세포의 증가된 사멸을 나타낸다.
실시예 13F
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 RNV를 발현하는 CD19CAR에서 cJun(작제물 12; 서열번호: 7)으로 대체된다. c-Jun의 발현은 세포 증식을 지원하는 반면 과발현은 촉진한다. T 세포의 기능 장애 또는 고갈은 감소된 c-Jun 수준과 연관되어 있고 그의 과발현은 T 이펙터 기능을 회복하는 동시에 지속적인 세포 주기 진행과 장기간 지속성을 지원한다. 웨스턴 블롯은 cJun이 형질도입된 세포에서 CD19 CAR과 함께 발현된다는 것을 확인한다. cJun이 RNV-형질도입된 T 세포에서 CD19 CAR과 함께 공동-발현될 때, 이들 T 세포는 증가된 활성(증식) 및 생존, CD19 결합(인터페론 감마)에 의한 활성화 시 사이토카인 분비 및 상기 검정과 유사한 형질도입된 T 세포에 의한 CD19-발현 세포의 증가된 사멸을 나타낸다. 생존 증가는 CD19 양성 세포와 공동-배양한 후 10일까지 시간 경과를 연장하고 작제물 6을 사용하여 cJun 발현이 없는 결과와 비교함에 의해 결정된다.
실시예 13G
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 RNV를 발현하는 CD19CAR에서 IL-15(작제물 9 또는 10)로 대체된다. IL-15는 CD8 T 세포와 자연 살해(NK) 세포 활성화, 증식 및 세포용해 활성을 자극하는 사이토카인이다. 항원의 부재에서 기억 T 세포를 유지하는 생존 신호는 IL-15에 의해 제공되고 지속적인 CAR T 반응을 생성하는데 도움이 될 수 있다. 유사한 시험관내 연구가 유사한 결과로 상기에서 기술된 바와 같이 실행되었다. IL-15가 RNV-형질도입된 T 세포에서 CD19 CAR과 함께 공동-발현될 때, 이들 T 세포는 증가된 활성(증식), CD19(IL2, IFNg 및 TNF)에 의한 활성화 시 사이토카인 분비 및 형질도입된 T 세포에 의한 CD19-발현 세포의 증가된 사멸을 나타낸다. 추가 시험관내 연구는 IL-15 발현이 배양에서 오래 지속되는 기억 T 세포 풀에 기여한다는 것을 입증한다.
실시예 13H
CD19에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 또한 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터에서 발현되는 역방향 전사된 IL-15의 시험관내 시험. RNV 백본(작제물 9; 서열번호:15)에서 CD19 CAR 유전자에 대해 반대 방향으로 전사되도록 조작된 IL-15 유전자의 추가는 IL-15 이식유전자에 비해 IL-15가 CD19 CAR(작제물 10; 서열번호: 8)과 동일한 방향으로 전사되는 경우 증가된 발현을 허용한다. CAR-발현 작제물은 CAR의 지속되고 강력한 T 세포 활성을 지원하고 비-CAR 형질도입된 면역 세포의 항암 면역 활성을 촉진한다. 일차 말초 T 세포 또는 T 세포주(예를 들어 TALL-104; Jurkat)는 CD19 표적 CAR(pBA9b-CD19CAR)을 인코딩하거나 다양한 MOI(예를 들어 0.1, 1 및 10)에서 어느 방향으로든 IL-15 이식유전자(pBAb-CD19CAR-IL-15, 작제물 9 또는 10)를 공동-발현하는 CD19-표적화된 CAR을 인코딩하는 RNV로 형질도입된다. 형질도입된 세포의 샘플에 대한 웨스턴 블롯을 실행하고 CD19 CAR의 용량-의존적 발현 및 작제물 9의 경우, 사용된 MOI 증가에 상응하는 증가하는 IL-15 단백질 수준뿐만 아니라 CD19CAR 이식유전자에 비해 역방향이 사용될 때 증가된 발현을 확인한다. RNV-형질도입된 세포는 증식 모니터링 염료(예를 들어, 세포 추적 보라색)로 표지된다. 그런 다음 세포는 시험관내 배양 실험에서 CD19-발현 세포(예를 들어 NALM-6; 일차 B 세포, 또는 CD19를 재조합적으로 발현하는 변형된 세포)와 혼합된다. 2, 6, 12, 24 및 48시간의 시간 경과의 배지 및 세포를 혼합된 세포 반응물로부터 취했다 ELISA는 IL-12p70이 상기에 기술된 검정과 유사한 CD19CAR RNV에 의해 공동-발현될 때 MOI에 걸쳐 인터페론 감마의 증가된 생산을 확인한다.
실시예 13I
다른 실시형태에서, 다른 면역 조절자는 증가된 이식유전자 발현을 위해 역방향으로 전사되도록 조작될 수 있다. 실시예 13a-f에 기재된 바와 같은 IL2, IL2supmut, IL12p70 사이토카인, IL-7Ra-CPT 및 cJun이 IL-15 대신 사용될 수 있다.
실시예 13J
다른 실시형태에서, pBA-9B RNV 백본은 자가-불활성화(SIN) LTR(작제물 27; 서열번호: 18)로 대체될 수 있다. RNV LTR 프로모터 활성의 파괴로 대체 프로모터가 사용된다. 인트론 없는 EF1a 또는 CMV 프로모터를 사용하여 pSIN-RNV로부터 이식유전자를 발현할 수 있다. 이 실시예에서, 인간 또는 마우스 CD19CAR은 사멸 스위치(예를 들어, 효모 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 이의 돌연변이체)(작제물 27)를 발현하기 위해 IRES 또는 2A 서열을 여전히 인코딩하면서 RNV 내에서 인코딩된 EF1a 프로모터로부터 발현된다. 더욱이, 추가적인 이식유전자가 사멸 스위치의 하류의 CMV 프로모터로부터 발현될 수 있다. 작제물 27 및 29에서; IL-15 사이토카인은 CMV 프로모터로부터 발현된다. CMV 프로모터 및 IL-15 유전자는 CD19CAR(작제물 9 및 10)의 전사 방향에 대해 두 방향으로 배치될 수 있다. 상기에 기술된 것과 유사한 연구를 사용하여 이들 작제물에서 모든 이식유전자의 발현 및 활성을 특성화한다.
실시예 13K
다른 실시예에서; pBA-9B RNV 백본은 자가-불활성화(SIN) 렌티바이러스 백본(작제물 28; 서열번호: 19)으로 대체될 수 있다. CAR, IRES-사멸 스위치, 면역 조절자, miRNA 표적 서열, shRNA 및 프로모터를 포함하여 설계된 모든 이식유전자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. RNV 서열(RNV LTR 및 패키징 서열 제외)에 부가하여, 우드척 전사-후 조절 요소는 이식유전자의 발현을 증강시키는 데 사용된다(Zufferey et al., "Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element Enhances Expression of Transgenes Delivered by Retroviral Vectors," Journal of Virology, 73(4):2886-2892, 1999). 이식유전자 발현 및 활성을 특성화하기 위해 본 명세서에 기재된 동일한 시험관내 및 생체내 검정이 이 비-복제 SIN 렌티바이러스 벡터(들)에 대해 사용된다.
실시예 13L
siRNA 작제물. 개시내용의 비-복제 레트로바이러스 벡터는 면역 세포를 포함하는 세포의 활성을 지배하는 주요 유전자의 발현을 차단하거나 낮추는 조작된 siRNA, shRNA 또는 miRNA의 발현으로 면역 세포의 활성을 조절하는 데 사용될 수 있다. 이러한 표적은 T 세포 활성을 조절하는 중심 체크포인트인 PD-1과 같은 유전자, 및 항암 활성을 예방하거나 감소시키는 핵심 단백질을 포함한다. shRNA-PD-1 발현 및 전사체 녹다운 능력을 측정하기 위한 시험관내 및 생체내 검정은 미국 특허 US20150273029A1에 기재되어 있다. 10의 MOI에서 작제물 19 벡터로 감염된 일차 T 세포에서 PD-1의 효율적인 녹다운을 입증하기 위해, 총 RNA는 감염 후 d3에 수확된 T 세포로부터 추출된다. PD-1의 유전자 발현은 정규화를 위한 내부 대조군으로서 RNA polIII 프로모터 전사체를 사용하여 qRT-PCR에 의해 측정된다. 나이브 일차 T 세포에 대한 PD-1의 상대적 발현 수준은 ΔΔC(t) 방법을 사용하여 계산된다. 데이터는 감염-후 3일차에 PD-1의 70% 초과가 하향조절된다는 것을 나타낸다. 감염된 세포는 최대 10일까지 IL-2의 존재에서 배양되고 PD-1의 지속적인 녹다운을 관찰한다. 동시에, 유사하게 형질도입된 일차 T 세포는 상기에 기술된 방법 및 실험을 사용하여 CD19CAR 활성에 대해 특성화된다. PD-1 shRNA가 CD19CAR과 조합하여 발현되는 경우, 72시간-길이의 xCELLigence 검정은 CD19CAR 단독에 비해 Nalm6-CD19WT 종양 세포주의 CAR-특이적 사멸 및 성장 억제의 2배화를 나타낸다.
실시예 14
CD19에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 또한 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터에서 발현된 IL-12p70의 생체내 시험
IL-12는 이종이량체 활성 사이토카인 IL-12p70을 만들기 위해 2개의 서브유닛인, IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)로 구성된다. IL-12p70은 항원 자극에 반응하여 수지상 세포 및 대식세포를 포함한 항원 제시 세포에 의해 자연적으로 생성된다. IL-12p70은 전염증성 사이토카인으로, NK 및 T 세포의 IFNg 생성 및 세포독성 이펙터 기능을 증강시키고 ADCC 활성 및 CD4 T 세포에서 Th1 표현형을 촉진하고 수지상 세포 및 대식세포에 대한 화학유인물질로 작용한다. 이들 IL-12 활성은 함께 숙주 항-종양 활성을 자극할 수 있다. CAR-발현 작제물에 단일 사슬 작제물(작제물 16)로 IL-12p70의 추가는 CAR의 지속적이고 강력한 T 세포 활성을 지원하고 비-CAR 형질도입된 면역 세포의 항암 면역 활성을 촉진한다.
CD19-표적화된 CAR을 발현하는 동일한 바이러스 벡터로부터 발현된 IL-12p70의 기능적 효과는 재조합 레트로바이러스 벡터(pBA9b-CD19CAR, 작제물 6 또는 8, 및 pBAb-CD19CAR-IL-12p70, 루시퍼화된 Nalm6 급성 림프모구성 백혈병 세포 및 인간 PBMC가 정맥내로 이식된 8-주령 NSG 마우스에서 작제물 16(인간 CAR, IL12)[작제물 41은 마우스 CD19CAR & IL12임]의 정맥 주사에 의해 생체내에서 테스트된다. 각 벡터 스톡의 1E6 내지 5E8 TU의 용량 또는 비히클 대조군은 효능 평가(종양 부담 및 생존)를 위한 군당 10마리 동물 및 면역 평가(유세포분석)를 위한 군당 5마리 동물로 구성된 각 처리 군에 정맥내 주사에 의해 투여된다. 종양 부담은 루시퍼라제 신호의 주기적인 영상화에 의해 연구의 기간에 걸쳐서 측정된다. 대조군 및 치료 동물의 생존이 평가된다. 결과는 CD19CAR(작제물 6)을 발현하는 바이러스 벡터로 치료가 루시페라제 신호에 의해 측정된 바와 같이 종양 부담을 감소시키고 대조군 처리된 동물과 비교하여 생존을 연장시킨다는 것을 나타낸다. CD19CAR-IL-12p70(작제물 16)은 루시페라제 신호에 의해 측정된 바와 같이 종양 부담을 감소시키고, 대조군 및 CD19CAR(작제물 6) 처리된 동물과 비교하여 생존을 연장하고, 일부 경우에 검출가능한 종양의 완전한 부재를 초래한다. 유세포분석은 치료의 개시 직후 Nalm6-영향받은 림프절에서 수행된다. 결과는 CD19CAR(작제물 6)과 비교하여 CD19CAR-IL-12p70(작제물 16)으로 처리된 동물에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화를 나타낸다.
CD19-표적화된 CAR을 발현하는 동일한 바이러스 벡터로부터 발현된 IL-12p70의 기능적 효과는 루시퍼화된 A20 B 세포 림프종 세포로 정맥내로 이식된 면역 적격, 8-주령 Balb/c 마우스에서 재조합 레트로바이러스 벡터(pBA9b-mCD19CAR, 작제물 40(서열번호: 16) 및 pBAb-mCD19CAR-IL-12p70, 작제물 41; 서열번호: 13)의 정맥내 주사에 의해 생체내에서 시험된다. 각 벡터 스톡 또는 비히클 대조군의 1E6 내지 5E8 TU의 용량은 효능 평가(종양 부담 및 생존)를 위한 군당 10마리 동물 및 면역 평가(유세포분석)를 위한 군당 5마리 동물로 구성된 각 처리 군에 정맥 주사에 투여된다. 종양 부담은 루시퍼라제 신호의 주기적인 영상화에 의해 연구의 기간에 걸쳐 측정된다. 대조군 및 처리 동물의 생존이 평가된다. 결과는 mCD19CAR(작제물 40)을 발현하는 바이러스 벡터로 처리가 루시퍼라제 신호에 의해 측정된 바와 같이 종양 부담을 감소시키고 대조군 처리된 동물과 비교하여 생존을 연장함을 나타낸다. mCD19CAR-IL-12p70(작제물 41; 서열번호: 13)은 루시페라제 신호에 의해 측정된 바와 같이 종양 부담을 감소시키고, 대조군 처리된 동물과 비교하여 생존을 연장하고, 일부 경우에 검출가능한 종양의 완전한 부재를 야기한다. 유세포분석은 치료의 개시 직후 A20-영향받은 림프절에서 수행된다. 결과는 mCD19CAR(작제물 40)과 비교하여 mCD19CAR-IL-12p70(작제물 41)으로 처리된 동물에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화를 나타낸다. 부가하여, 검출가능한 종양이 없는 mCD19CAR-IL-12p70-처리된 동물은 임의의 추가 처리 없이 A20 세포로의 재공격에 저항할 수 있다. 재공격에 대한 내성과 연관된 면역 기억은 부분적으로 mCD19CAR-IL-12p70-형질도입된 T 세포의 지속성과 연관되어 있을 뿐만 아니라 IL-12p70 발현에 의해 매개되는 항원 제시의 활성화 및 염증 증강과 연관된 면역 학습과도 연관된다. 면역 학습의 기여는 재공격 이전에 플루시토신과 함께 pBA9b-mCD19CAR 및 pBAb-CD19CAR-IL-12p70 바이러스 벡터 둘 모두에 존재하는 CD 사멸 스위치의 활성화에 의한 CAR-발현 세포의 사멸에 의해 확인된다. 플루시토신 IP 투여 및 CD19CAR-IL-12p70을 발현하는 세포의 완전한 부재의 확인에 이어서, 살아남은 A20 치유된 동물은 A20 재공격에 내성이 있었다.
실시예 15
CD19에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 또한 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터에서 발현된 IL-2F42A의 생체내 시험
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 인간 및 마우스 CD19CAR-발현 RNV 작제물 14 및 42에서 각각 IL-2(작제물 42; 서열번호: 14)로 대체된다). IL-2는 고도로 염증성이고 말초에서 작용하여 나이브 T 세포의 이펙터 및 기억 T 세포 안으로의 분화를 촉진한다. IL-2는 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 자연적으로 생성된다. IL-2는 여러 상황에서 항종양 활성이 있는 것으로 나타났지만 IL-2의 전신 투여는 심각한 부작용과 연관된다. IL-2 야생형은 또한 Treg 세포에 작용하여 면역 반응을 억제한다. CAR-발현 작제물에 대한, Treg 세포에 작용하지 않는 IL-2F42A의 추가는 CAR의 지속적이고 강력한 T 세포 활성을 지원하고 비-CAR 형질도입된 면역 세포의 항암 면역 활성을 촉진한다. 부가하여, 특정 CAR에 대한 높은 항원 밀도의 종양 부위에 T 세포를 발현하는 CAR의 자연 귀소 능력은 IL-2 발현을 주로 종양 내로 제한한다.
유사한 생체내 연구가 유사한 결과로 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과는 CD19CAR과 비교하여 CD19CAR-IL-2F42A(v)(작제물 42)로 처리된 Nalm6 종양-담지, PBMC-이식된 NSG 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화, 및 증가된 T 세포 수를 나타낸다. A20 종양을 담지하는 면역 적격 동물에서 결과는 mCD19CAR과 비교하여 mCD19CAR-IL-2F42A로 처리된 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화 및 증가된 T 세포를 나타낸다. mCD19CAR(v) 단독 또는 대조군 처리된 동물이 아닌 mCD19CAR-IL-2F42A(v)로 A20 종양-담지 면역 적격 마우스의 처리는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 학습과 함께 완전한 치유를 야기한다.
실시예 16
CD19에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 또한 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터에서 발현된 IL-15-IL-15Ra의 생체내 시험
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 IL-15-IL-15Ra(인간 및 마우스 CD19CAR-발현 RNV에서 작제물 49 및 54로 대체된다. IL-15는 주로 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포에 의해 발현되고 T 및 NK 세포의 활성화, 증식 및 생존을 지원한다. IL-15는 IL-15Ra 수용체와 복합체화된 막 결합 형태로 존재한다. 이 강력한 시그널링 복합체는 IL-15Ra의 스시 도메인(IL-15-IL15Ra)에 연결된 IL-15의 단일 사슬 발현에 의해 가용성 형태로 요약될 수 있다. CAR-발현 작제물에 단일 사슬 작제물로 분비된 IL-15-IL-15Ra의 추가는 CAR의 지속적이고 강력한 T 세포 활성, CAR 및 비-CAR T 세포의 수명이 긴 기억 T 세포로의 분화, 및 비-CAR 형질도입된 면역 세포의 항암 면역 활성을 지원한다.
유사한 생체내 연구가 유사한 결과로 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과는 CD19CAR과 비교하여 CD19CAR-IL-15-IL-15Ra(v)(작제물 49)로 처리된 Nalm6 종양-담지, PBMC-이식된 NSG 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화를 나타낸다. A20 종양을 담지하는 면역 적격 동물에서 결과는 mCD19CAR와 비교하여 mCD19CAR-IL-15-IL-15Ra(v)(작제물 49로 처리된 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화를 나타낸다 mCD19CAR(v) 단독 또는 대조군 처리된 동물이 아닌 mCD19CAR-IL-2F42A(v)로 A20 종양-담지 면역 적격 마우스의 처리는 또한 상기와 유사한 면역 학습과 함께 완전한 치유를 야기한다.
실시예 17
CD19에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 또한 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터에서 발현된 인터루킨-7 수용체-a 돌연변이체의 생체내 시험
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 CD19CAR-발현 RNV에서 IL-7Ra-CPT(작제물 15 & 55 - 인간 및 마우스 CD19CAR)로 대체된다. 인터루킨-7 수용체 서브유닛 알파(IL7Ra)는 CD 항원 CD127로도 알려져 있으며, 이는 유형 I 사이토카인 수용체 패밀리 및 유형 4 서브패밀리에 속한다. IL7Ra/CD127은 나이브 및 기억 T 세포 및 기타 여러 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 발현된다. IL7Ra는 인터루킨-2 수용체 서브유닛 감마(IL2RG)와 이종이량체를 형성하여 IL7 신호를 전달한다. 그러나, IL7Ra는 시스테인 및/또는 비시스테인 돌연변이를 획득하여 동종이량체를 형성하여 리간드(IL7) 독립적인 시그널링 이벤트를 야기할 수 있다. 이 리간드 독립적인 IL7Ra 동종이량체는 T 세포의 지속적인 증식과 장기간 지속을 지원한다. CAR-발현 작제물에 돌연변이체 IL7Ra 작제물(작제물 15)의 추가는 생체내에서 재프로그래밍된 T 세포의 항암 면역 활성을 촉진하면서 지속적인 증식, 지속성 및 효능을 지원한다.
유사한 생체내 연구가 유사한 결과로 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과는 CD19CAR과 비교하여 CD19CAR-IL-7Ra-CPT(작제물 15)로 처리된 Nalm6 종양-담지, PBMC-이식된 NSG 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화, 및 증가된 T 세포 수를 나타낸다. A20 종양을 담지하는 면역 적격 동물에서 결과는 mCD19CAR와 비교하여 mCD19CAR-IL-7Ra-CPT(작제물 55로 처리된 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화, 및 증가된 T 세포를 나타낸다 mCD19CAR(v) 단독 또는 대조군 처리된 동물이 아닌 mCD19CAR-IL-7Ra-CPT(v)로 A20 종양-담지 면역 적격 마우스의 처리는 또한 상기와 유사한 면역 학습과 함께 완전한 치유를 야기한다.
실시예 18
CD19에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 또한 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터에서 발현된 c-Jun의 생체내 시험
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 인간 및 마우스 CD19CAR-발현 RNV에서 c-Jun(작제물 12; 서열번호: 7)으로 대체된다. c-Jun은 JUN 유전자에 의해 인코딩된 단백질이다. c-Jun은 c-Fos와 조합하여 AP-1 초기 반응 전사 인자를 형성한다. c-jun 전사는 그 자체 생성물에 의해 자동조절되므로 세포외 자극으로부터 그 신호를 연장한다. c-Jun의 발현은 세포 증식을 지원하는 반면 과발현은 촉진한다. T 세포의 기능장애 또는 고갈은 감소된 c-Jun 수준과 연관되어 있고 그의 과발현은 T 이펙터 기능을 회복하는 동시에 지속적인 세포 주기 진행과 장기간 지속성을 지원한다. CAR-발현 작제물에 c-Jun 작제물(작제물 xx)의 추가는 이펙터 기능, 지속적인 증식, 지속성 및 효능을 지원하는 동시에 재프로그래밍된 T 세포 생체내 지속된 증식의 항암 면역 활성, 지속성 및 효력을 촉진하는 반면 생체내에서 재프로그래밍된 T 세포의 항암 면역 활성을 촉진한다.
유사한 생체내 연구가 유사한 결과로 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과는 CD19CAR과 비교하여 CD19CAR-c-Jun으로 처리된 Nalm6 종양-담지, PBMC-이식된 NSG 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화, 및 증가된 T 세포 수를 나타낸다. A20 종양을 담지하는 면역 적격 동물에서 결과는 mCD19CAR와 비교하여 mCD19CAR-c-Jun으로 처리된 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화, 및 증가된 T 세포를 나타낸다. mCD19CAR(v) 단독 또는 대조군 처리된 동물이 아닌 mCD19CAR-c-Jun(v)으로 A20 종양-담지 면역 적격 마우스의 처리는 또한 상기와 유사한 면역 학습과 함께 완전한 치유를 야기한다.
실시예 19
CD19에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 또한 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터에서 발현된 체크포인트 억제제 PD-1(shPD-1)에 대한 짧은 헤어핀 RNA의 생체내 시험
또 다른 실시형태에서, IL12p70은 CD19CAR-발현 RNV에서 체크포인트 억제제 PD-1(작제물 19; 서열번호: 9)에 대한 짧은 헤어핀 RNA로 대체된다. PD-1은 활성화 후 T 세포에 의해 발현되고 T 세포 고갈의 지표이다. PD-1은 T 세포 염증성 활성을 억제하고 T 세포 세포자멸사를 촉진한다. T 세포의 기능 장애 또는 고갈은 PD-1 활성을 차단함에 의해 되돌릴 수 있다. 치료 항체로 PD-1 체크포인트 차단은 암 세포의 T 세포 사멸을 지원함에 의해 특정 암 적응증에서 임상적으로 효능이 입증되었다. CAR-발현 작제물에 대한 shPD-1(작제물 19)의 추가는 생존, 증식 및 암 세포 사멸을 포함하여 CAR-발현 T 세포의 지속적인 활성을 지원한다.
유사한 생체내 연구가 유사한 결과로 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과는 CD19CAR과 비교하여 CD19CAR-shPD-1(작제물 19)로 처리된 Nalm6 종양-담지, PBMC-이식된 NSG 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화, 및 증가된 T 세포 수를 나타낸다. A20 종양을 담지하는 면역 적격 동물에서 결과는 mCD19CAR(작제물 40; 서열번호: 16)와 비교하여 mCD19CAR-shPD-1(작제물 m-shPD-1)로 처리된 마우스에서 증강된 T 세포 활성화 및 탈과립화, 및 증가된 T 세포를 나타낸다. mCD19CAR(v) 단독 또는 대조군 처리된 동물이 아닌 mCD19CAR-shPD-1(v)로 A20 종양-담지 면역 적격 마우스의 처리는 또한 상기와 유사한 면역 학습과 함께 완전한 치유를 야기한다.
실시예 20
BCMA는 다른 곳에서 최소한으로 발현되는 성숙한 형질 세포 마커이고, 다발성 골수종의 치료에서 CAR 인식 표적으로 성공적으로 사용되었다(Kochenderfer JN. et al. N Engl J Med., 380(18):1726-1732, May 2, 2019). 항-BCMA CARS는 CD19 이외의 항원에 대한 생체내 CAR 전달 시스템의 효능을 나타내는데 사용된다.
B 세포 및 단핵구에 대한 자살 유전자 및 탈-표적화 miRNA 표적을 갖는 a-BCMA CAR 벡터의 구축 및 시험관내 시험.
벡터의 구조는 pBA-9b-BCMACAR1.FHVH33-CD8BBZ.miRT663A-223을 만들기 위해 인간화된 Vh 단독 FHVH33-CD8BBZ(Lam et al., Nature Communic., 2020)와 같은 공지된 항-BCMA CAR 서열의 치환을 갖는 항-CD19 CAR에 대한 것과 같다.
상응하는 코돈 최적화된 DNA 핵산 서열은 다음과 같다:
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCGGCAGCGGCGACTACATCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACATCAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGAGGGCACCGGCGCCAACAGCAGCCTGGCCGACTACAGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCTTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCGCCAAGCCCACCACCACCCCCGCCCCCAGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGGAACAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG; 또는
(SID50) pBA-9b-BCMACAR2.SID50.miRT663A-223을 만들기 위한 WO 2015/158671에서의 CAR 펩티드에 상응하는 코돈 최적화된 DNA 핵산 서열
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCCCCGACTACTACATCAACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCTACTTCGCCAGCGGCAACAGCGAGTACAACCAGAAGTTCACCGGCAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCATCAACACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGCCTGTACGACTACGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCAGCATCAGCTGCTGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCAGCCAGAGCAGCATCTACCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGACCACCACCCCCGCCCCCAGACCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA; 또는
(SID56) pBA-9b-BCMACAR3.SID 56.miRT663A-223을 만들기 위한 WO 2015/158671에서의 CAR 펩티드에 상응하는 코돈 최적화된 DNA 핵산 서열
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGACCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCCCCGACTACTACATCAACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCTACTTCGCCAGCGGCAACAGCGAGTACAACCAGAAGTTCACCGGCAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCATCAACACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGCCTGTACGACTACGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACCCCCGGCCAGCCCGCCAGCATCAGCTGCTGGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGCAGCCAGAGCAGCATCTACCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGACCACCACCCCCGCCCCCAGACCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA.
생성된 플라스미드는 상응하는 감염성 RNV 제제를 생성하는데 사용된다. 감염성 벡터는 하기에 기술된 바와 같이 시험관내 및 생체내에서 CAR의 활성을 시험하는데 사용된다.
시험관내 시험
제1 CAR T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적절한 T 세포 자극을 갖는 PBMC의 형질도입에 의해 시험관내에서 생성된다. 형질도입된 세포는 특성화되고 20-80% T 세포 형질도입을 초래한다. 이들 세포는 그 다음 시험관내 시험에 사용된다.
탈과립화 검정(CD107a 동원)
T-세포는 BCMA 단백질을 발현하거나 발현하지 않는 동일한 양의 세포와 함께 96-웰 플레이트(40,000개 형질도입된 세포/웰)에서 인큐베이션된다. 공동-배양은 5% CO2를 갖는 37℃에서 6시간 동안 100μl의 X-Vivo™-15 배지(Lonza)의 최종 부피에서 유지된다. CD107a 염색은 세포 자극 동안, 1μg/ml의 항-CD49d(BD Pharmingen), 1μg/ml의 항-CD28(Miltenyi Biotec) 및 1x 모넨신 용액(eBioscience)과 함께 공동-배양의 시작 시 형광 항-CD107a 항체(APC 접합됨, Miltenyi Biotec 제품)의 추가에 의해 수행된다. 6시간 인큐베이션 기간 후, 세포를 고정가능한 생존성 염료(eBioscience로부터 eFluor 780) 및 형광색소-접합된 항-CD8(PE 접합됨 Miltenyi Biotec)로 염색하고 유세포분석에 의해 분석한다. 탈과립화 활성은 CD8+/CD107a+ 세포의 %로서, 그리고 CD8+ 세포 중 CD107a 염색에 대한 평균 형광 강도 신호(MFI)를 결정함에 의해 결정된다. 탈과립화 검정은 PBMC/T 세포 형질도입 후 동쪽 24시간에 수행된다.
항-BCMA CAR T 세포는 BCMA 발현 암 세포 발현 BCMA(RPMI8226 및 NCI-H929)에 대해 활성인 반면, CAR T 세포로 상기 CAR이 관련없는 표적(예를 들어, 마우스 CD19)에 대한 것인 세포에서 또는 GFP로 형질도입된 T 세포에서 활성이 검출되지 않는다. 표적이 BCMA 음성일 때(K562 세포) 어느 하나의 유형의 형질도입된 T 세포에서 무/배경 활성이 관찰된다.
실시예 21
BCMA CAR의 생체내 시험.
암컷 NOD-Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG; Jackson Laboratories) 마우스는 s.c. 이종이식을 확립하기 위해 E7 BCMA+ RPMI-8226 MM 종양 세포를 함유하는 5E7 세포/mL 현탁액 0.2mL의 피하(s.c.) 주사를 받는다. 종양 이식 후 대략적으로 10-15일에, 이종이식을 갖는 마우스는 인간 T 세포의 E5 내지 E8을 함유하는 세포 현탁액 0.2mL의 단일 정맥내(i.v.) 주사를 받는다. 대략적으로 18일차에, 마우스는 96 +/- 16㎣의 평균 종양 부피일 때 및 인간 T 세포의 생착을 확인한 후 10마리 마우스의 군으로 무작위화된다. 군은 벡터의 E3, E4, E5, E6, E7, E8 또는 E9 TU의 용량에서 CAR 인코딩 벡터 또는 대조군 벡터의 iv 투여를 받는다. 선택적 추가 양성 대조군은 4주 동안 주 2회로 1mg/kg의 보르테조밉(Velcade) i.v. 받는다. 종양 성장에 대해 대략적으로 100일차까지 마우스를 모니터링한다. 대조군과 비교하여 종양 성장 억제는 사용된 용량 및 벡터 제제에 따라 일부 마우스 군에서 관찰되고 다른 군에서는 관찰되지 않았고 가장 효과적인 용량 및 벡터가 식별된다.
실시예 22
BCMA에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 발현하고 IL-12p70을 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터를 함유하는 CD8-표적화된/위형화된 입자의 생체내 시험
aBCMA-CAR 및 단일 사슬 IL12p70을 인코딩하는 비-복제 레트로바이러스 입자는 바이러스가 "H" 단백질 하이브리드를 통해 "도킹"되면 융합을 야기하는 홍역 엔벨롭 단백질(작제물 52; 서열번호: 20) 및 절삭된 홍역 F 단백질 안으로 항-CD8a scFv의 혼입을 통해 CD8+ T 세포의 생체내 형질도입을 위해 위형화된다. 이것은 주로 CD8+ T 세포의 절묘한 형질도입을 허용한다. 이것은 종양 세포, 비-CD8+ 면역 세포, 증식하는 간 및 내피 세포를 포함하는 다른 증식하는 세포 유형의 잠재적인 형질도입을 회피한다. CD8+ 세포의 효율적인 표적화는 또한 비표적화된 세포가 더 이상 벡터 침착을 위한 싱크 역할을 하지 않기 때문에 형질도입된 CD8+ 세포의 상대적인 수를 증가시킨다.
BCMA에 대해 표적화된 키메라 항원 수용체를 발현하고 IL-12p70을 발현하는 비-복제 레트로바이러스 벡터를 함유하는 CD8-표적화된/위형화된 입자의 기능적 효과는 BCMA 양성 종양 세포주가 피하로 및 인간 PBMC가 정맥내로 이식된 8-주령 NSG 마우스에서 하이브리드 엔벨롭을 갖는 생산자 계통과 양쪽성 생산자 계통으로 만들어진, 재조합 레트로바이러스 벡터 BCMA-CAR-IL-12p70의 정맥내 주사에 의해 생체내에서 시험된다. 각 벡터 스톡 또는 비히클 대조군의 1E6 내지 5E8 TU의 용량을 효능 평가(종양 부피)를 위해 군당 10마리 동물로 구성된 각 처리 군에 정맥내 주사로 투여한다. 종양 부피는 연구의 기간에 걸쳐 측정된다. 결과는 BCMA-CAR-IL-12p70을 발현하는 바이러스 벡터로의 처리가 대조군 처리된 동물과 비교하여 종양 부피를 감소시킨다는 것을 나타낸다. CD8-PSMA-CAR-IL-12p70은 대조군 및 비-표적화된 PSMA-CAR-IL-12p70 처리된 동물과 비교하여 종양 부피를 감소시키고 일부 경우에 측정가능한 종양의 완전한 부재를 야기한다. 재조합 레트로바이러스 벡터의 정맥 주사 2일 후 말초 혈액의 유세포분석은 -CAR-IL-12p70 형질도입이 CD8+ 세포로 제한되는 반면 비-표적화된 BCMA-CAR-IL-12p70 형질도입은 CD8+, CD4+, B 세포 및 단핵구를 포함한 광범위한 면역 세포 모집단에 걸쳐서 검출가능함을 확인한다. 부가하여, 형질도입된 CD8+ 세포의 백분율은 비-표적화된 벡터에 비해 표적화된 벡터에서 더 높다.
실시예 23
miRNA 발현 수준은 건강한 공여자로부터 CD4+ 및 CD8+ 말초 혈액 단핵 세포에 부가하여 비-호지킨 림프종(DLBCL에 의해 표시됨) 및 다발성 골수종 환자의 일차 생검으로부터 정량화되었다. 샘플은 전체 RNA에 대해 추출되었고 그 다음 Illumina Small RNA-Seq 라이브러리 구성을 사용하여 miRNA 단리를 위해 처리되었다. 라이브러리는 단일 말단 판독, 최소 판독 길이 1x75 bp를 사용하여 샘플당 대략적으로 10,000,000 판독에서 Illumina NextSeq 서열화를 통해 서열화되었다. 서열화 결과를 처리하고 R에서 분석하여 샘플 전반에 걸친 miRNA 발현을 결정했다. 표적 miRNA 및 그 상응하는 표적 서열은 서열화로부터 생성된 miRNA 발현 프로파일의 차등 및 순위 분석 두 방법에 의해 식별되었다.
비-호지킨 림프종(NHL) miRNA 후보 분석
표 2 및 3은 T 세포에서 잘 발현되지 않는 DLBCL에서 발현되는 miRNA를 계산하고 식별하기 위한 2가지 상이한 방법(차등 또는 순위)의 결과를 나타낸다. 두 표 모두에서 상위 후보가 강조표시된다. 표 5는 양 방법에 의해 식별되는 공통 표적을 나타낸다.
표 3 차등 발현 방법(R isoMirs 패키지를 사용하여 카운트 데이터에 대한 차등 발현 분석을 수행함)
Figure pct00009
표 4: 순위 백분위수 비교 방법(RPKM 매트릭스 표를 기반으로, 세포 유형별로 그룹화된 모든 miRNA 발현이 순위 지정됨); 각 miRNA에 대한 중앙값 RPKM 발현 값은 이들 값의 log2FC와 함께 두 군에 대해 아래 표에 표시된다.
상위 90% DLBCL 발현자 대 가장 낮은 백분율의 T-세포
Figure pct00010
표 5: 차등 발현 및 순위 비교 방법으로부터 일반적인 miRNA 표적
Figure pct00011
다발성 골수종(MM) miRNA 후보 분석.
표 6 및 7은 T 세포에서 잘 발현되지 않는 MM에서 발현되는 상위 miRNA를 계산하고 식별하기 위한 2가지 상이한 방법(차등 또는 순위)의 결과를 나타낸다. 두 표 모두에서 상위 후보가 강조표시된다. 표 6은 양 방법에 의해 식별되는 공통 표적을 나타낸다.
표 6 차등 발현 방법(R isoMirs 패키지를 사용하여 카운트 데이터에 대한 차등 발현 분석을 수행함)
Figure pct00012
표 7 순위 백분위수 비교 방법(RPKM 매트릭스 표를 기반으로, 세포 유형별로 그룹화된 모든 miRNA 발현이 순위 지정됨); 각 miRNA에 대한 중앙값 RPKM 발현 값은 이들 값의 log2FC와 함께 두 군에 대해 아래 표에 표시된다.
Figure pct00013
표 8 차등 발현 및 순위 비교 방법으로부터 일반적인 miRNA 표적
Figure pct00014
도 12는 상응하는 표적 서열이 유전자 치료 작제물에서 사용되어 이에 의해 작제물이 이식유전자의 표적 외 발현을 감소시킬 수 있는 이상적인 miRNA 특성의 상자 플롯 실시예를 나타낸다. 이들 암에서 표적 발현을 감소시키는 것으로 식별된 miRNA hsa-miR-223-3p 및 hsa-miR-143-3p를 갖는 MM과 NHL에서 강력한 miRNA 후보 사이에 중복이 있다. RNV에 인코딩된 후보 miRNA 및 miRNA 표적 서열은 시험관내에서 생물학적 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 도 13은 RNV 벡터에 miRNA 표적 서열을 포함하는 효과를 나타낸다. miR223-3p에 대한 표적 서열을 GFP 벡터 안으로 삽입하여 서열 pBA-9B-GFPmiR223-3pB-4TX(작제물 7; 서열번호:2)를 제공하고 감염성 벡터를 만드는데 사용하였다. miR223-3p는 단핵구 또는 골수 세포에서만 상당한 농도로 생산되는 마이크로RNA이다. 도 13은 U937 단핵구 세포주에서 GFPmiR223 감염된 세포주에서 GFP 발현이 2개의 다른 벡터와 비교하여 100 배수 감소되었음을 나타낸다. 3가지 벡터 모두 HT1080 섬유육종 세포 또는 기타 비-단핵구 세포에서 동일한 양의 GFP를 생성했다.
실시예 24
인간 아데노신 데아미나제(ADA)를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터의 대규모 벡터 생산을 위한 양쪽성 패키징 및 생산자 세포주의 생성 또는 개선된 안전성 및 높은 역가를 고려한 벡터 및 임상 적용
플라스미드 구성.
레트로바이러스 벡터 작제물. 원래의 N2-유도된 레트로바이러스 벡터 pKT-1(특허 출원 WO 91/06852 및 WO 92/05266), 및 이의 모든 안전성 변형은 도 4a-c에 요약되어 있다. 레트로바이러스 벡터 pCBβ-gal은 pKT-1로부터 유래되고 β 갈락토시다제 및 neor 유전자를 코딩한다. 감소된 상동성 벡터인 pBA-5b는 pKT-1 안으로 통합된 여러 안전 변형의 결과이다. gag의 정상적인 ATG 시작 부위 대신에 이미 변형 ATT를 함유하고 있는 벡터 pKT-1은 확장된 패키징 신호(Ψ+)에서 2개의 정지 코돈을 함유하도록 변형되고; ATT 변형된 시작 부위는 정지 코돈 TAA로 변경되었고 추가 TGA 정지 코돈은 21 nt 하류에 삽입되었다. 5' LTR의 상류, 3' LTR의 하류, 폴리퓨린 관과 env의 정지 코돈 사이의 모든 외래성 MLV-유래된 레트로바이러스 서열이 제거되어, 벡터 pBA-9b를 생성한다.
MoMLV-유래된 gag/pol 작제물. 원래의 MoMLV-유래된 gag/pol 플라스미드 pSCV10(특허 출원 WO 91/06852, WO 92/05266)에 대한 안전성-변형을 수행하여 레트로바이러스 벡터 및 env 발현 작제물에 대한 서열 상동성을 감소시켰다(도 4b). 발현 카세트 pCI-WGPM은 gag에 대한 코딩 영역의 대략적으로 처음 400 nt에 축퇴 코드뿐만 아니라 모든 5' 및 3' 비번역된 서열의 결실을 함유한다. 부가하여, pol 유전자의 마지막 28개 아미노산을 코딩하는 서열이 결실되어, 절삭된 인테그라제 유전자를 초래한다. 플라스미드 pCI-GPM 및 pSCV10/5',3'tr.은 gag의 5' 영역이 천연 서열을 함유한다는 점을 제외하고 pCI-WGPM과 동일한 gag/pol cDNA를 함유한다.
엔벨롭 작제물. gag/pol 및 레트로바이러스 벡터 플라스미드에서 서열 중복을 줄이기 위해, 원래의 4070A-유래된 양쪽성 발현 플라스미드 pCMVenvamDra(특허 출원 WO 91/06852)를 사용하여 env 정지 코돈 후 결실된 모든 3' 비번역된 서열(pCMVenvamDraLBGH), 또는 결실된 모든 3' 및 5' 비번역된 서열(pCMV-β/envam)을 갖는 2개의 플라스미드(도 4c)를 생성했다. 이종성 레트로바이러스 엔벨롭 발현 카세트 pCMVxeno는 NZB9-1에서 유래되었고 양쪽성 엔벨롭 발현 카세트 pMLPenvam은 4070A에서 유래되었다.
모 세포. 인간 신장 293 세포(ATCC CRL 1573), 인간 섬유육종 HT-1080 세포(ATCC CCL 121), 송곳니 육종 D-17 세포(ATCC CRL 8468) 및 이들 모 세포로부터 유래된 레트로바이러스 패키징 및 생산자 세포주는 10% γ-조사된 정의된 소 태아 혈청(FBS, Hyclone Laboratories Inc., UT), 20mM Hepes(Irvine Scientific, CA), 1X 비-필수 아미노산 및 1mM 피루브산나트륨으로 보충된 DMEM(Irvine Scientific, CA)에 유지된다. 임상 벡터 생성 세포주를 생성하는데 사용된 모 세포주는 기원(즉, 동종효소 분석 및 핵형분석), 발현된 레트로바이러스 서열의 부재 및 마이코플라스마, 박테리아, 진균 및 바이러스를 포함한 외래성 제제에 대한 FDA 지침에 따라 보관 및 테스트된다.
VSV-G 위형화된 상등액의 생산. 농축된 VSV-G(수포성 구내염 바이러스 당단백질) 위형화된 벡터 상등액(G-상등액)의 대규모 생산은 일부 약간의 변형으로, Yee et al.에 의해 설명된 바와 같이 수행된다. 간단히 말해서, HA-LB 패키징 세포(표 9)는 1 x 107 세포/플라스크에서 T225 플라스크 안으로 도말된다. 12 내지 20시간 후, 세포는 ProFection 키트(Promega Corp., WI)를 사용하여 VSV-G 코딩 플라스미드 pMLP-G 및 각각의 레트로바이러스 벡터로 CaPO4-형질감염된다. 6-8시간 동안 DNA 침전물과 함께 인큐베이션에 이어, DNA 현탁액을 제거하고 신선한 배지를 추가한다. 12 내지 20시간 후, 상등액을 수집하고 신선한 배지를 적용한다. 4 내지 5회 반복 수집하고 G-상등액을 모으고 여과(0.45μm)하고 9000g 및 8℃에서 8-18시간 동안 원심분리에 의해 농축한다. 펠렛을 소량의 신선한 배지에 재현탁하고, 분취하고, 액체 질소 하에서 동결하고, -70℃에 보관한다. 이 농축된 바이러스 상등액은 그 다음 생산자 풀 및 클론 생성의 높은 m.o.t. 생성을 수행하기 전에 발현의 전달(TOE, 아래 참조)에 의한 역가 및 PCR 역가 분석에 대해 평가된다.
실시예 25
MLV-기반 패키징 및 생산자 세포주의 생성 및 분석
패키징 세포주. PCL DA, 2A, HX 및 2X의 생성이 자세히 기술되어 있고(특허 번호 WO 91/06852 및 WO92/05266) 절차는 PCL 2A-LB, HA-LB, HAII, DAII 및 DAwob의 생성을 위해 더욱 정제하였다. 일반적으로, 레트로바이러스 gag/pol 및 env 발현 플라스미드는 2주 동안 적절한 선택이 뒤따르는 플레오마이신 또는 메토트렉세이트 마커 플라스미드로 CaPO4-매개된 공동-형질감염에 의해 세포 안으로 순차적으로 도입된다. 선택된 gag/pol 중간체 풀은 p30 발현에 대해 분석되고 후속적으로 희석물은 표준 프로토콜에 따라 96-웰 플레이트 안으로 클로닝된다. Gag/pol 중간체 클론은 웨스턴 블롯(폴리클로날 염소 항-p30 항체, J. Elder에 의해 친절하게 제공됨)에서 p30 발현뿐만 아니라 양쪽성 env를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터 플러스 선택가능한 마커로 형질도입 및 생성된 벡터를 역가측정하는 것에 의한 역가 잠재력에 대해 분석된다. 가장 높은 역가 잠재력을 갖는 클론은 레트로바이러스 env 발현 플라스미드 및 마커로 공동-형질감염되고, 형질감염된 세포가 선택되고, 희석물이 클로닝되고 PCL 클론은 웨스턴 블롯(폴리클로날 염소 항-gp70 항체; Quality Biotech, MD)에서 gp70 발현 및 역가 잠재력에 대해 분석된다. 역가 잠재력은 패키징 용량의 한계를 테스트하기 위해 PCL에 대한 벡터의 높은 비율에서 PCL 안으로 여러 레트로바이러스 벡터 작제물을 사용한 여러 라운드의 형질도입에 의해 테스트된다.
표 9
MLV-기반 패키징 세포주의 특징적 특색의 요약
Figure pct00015
주, n.d., 결정되지 않음.
a 역가 값은 이 공보에 기술되거나 도시되지 않은 데이터로터 VPCL 풀 및 클론 역가를 나타냄.
b PCL은 참고 26, 28 및 36에 이미 기술됨.
c 총 5개 별도의 DA-기반 레트로바이러스 벡터 생성물이 임상 시험에 사용되었음.
d HAll-기반 인간 인자 VIII VPCL은 에 의해 후원된 혈우병 A 시험에 사용되었음.
실시예 26
세포-특이적 표적화를 위해 조작된 양쪽성 Env.
양쪽성 env는 4070A env 서열의 프롤린 풍부 영역의 변형에 의해 조작될 수 있다. 도 14에서, 어느 하나의 GFP(env 발현을 따라 추적하기 위한 보고 마커로서) 또는 CD8+ 세포에 우선적으로 바이러스 형질도입을 표적화하는데 사용되는 scFV 항 CD8 서열(두 방향 모두에서 제시됨))은 4070A 엔벨롭 서열의 프롤린 풍부 영역의 L(류신)코돈 서열 안으로 클로닝된 것으로 나타난다.
실시예 27
CD34 표적화.
A. CD34+ 세포에 대한 표적화를 달성하기 위해, 홍역 H 단백질이 다양한 표적화 단백질 스캐폴드 모이어티와 연계하여 단일 변화 단편 가변(scFv) 모노클로날 항체, 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin) 및 2개 별도의 수용체 에피토프를 인식하는 이중특이성 항체를 사용하여 표적화를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 홍역 바이러스에 대한 개체의 기존 면역을 최소화하기 위해, 표적화 모이어티를 조작하는 H 단백질의 전형적인 위치는 에드먼스턴 홍역 균주의 H-Noose-Epitope이다. H 단백질이 그 천연 수용체를 인식하지 못하도록 하기 위해, 점 돌연변이를 조작하여 인식 서열을 파괴한다. CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC)를 표적화하는 경우, 항-HPCA-1 모노클로날 항체를 표적화하는 CD34는 홍역 H 단백질 서열을 사용하고 그 안으로 조작하는데 선호되는 scFV 모이어티이며 이는 수용체-매개된 엔도사이토시스가 항-HPCA-1 항체로 자극 후 CD34+ 조혈 세포 상에서 촉발되기 때문이다. 홍역 융합(F) 단백질의 사용과 함께 항-HPCA-1 scFV를 갖는 키메라 홍역 H 단백질의 사용은 CD34+ 세포에 대한 MuLV 위형화된 바이러스 벡터를 표적화하고 융합을 허용할 것이다.
B. Sindbis 바이러스 엔벨롭 단백질은 또한 세포 진입의 수준에서 CD34+ 특이성을 부여함에 의해 CD34+ 세포에 렌티바이러스 및 MuLV 벡터를 위형화하고 표적화하는데 사용될 수 있다. 단백질 A의 ZZ 도메인은 Sindbis 엔벨롭 안으로 통합되었고, 벡터 형질도입은 표적화된 세포의 표면 상의 특정 항원에 대한 항체 결합을 통해 달성된다. E3 단백질에서 아미노산 61-64의 결실 및 E2 단백질에서 아미노산 K159A, E160A 및 SLKQ68-71AAAA의 돌연변이를 포함한 여러 돌연변이가 Sindbis 엔벨롭 당단백질에서 생성되어 Sindbis의 자연 친화성을 감소시켰으며, 결과적으로 높은 벡터 역가를 유지하면서 그 배경 감염성을 감소시켰다. E1 단백질에서 아미노산 226 및 227의 S 및 G로의 돌연변이는 E1이 표적 막에서 콜레스테롤의 부재에서 융합을 매개하여 엔벨롭 2.2로 지정된 Sindbis 위형화된 벡터의 친화성과 감염성 둘 모두를 증가시키도록 한다. 2.2 벡터는 인간 조혈 전구 세포를 표적화하기 위해 사용된 CD34, CD133 및 C-키트와 함께 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I, CD4, CD19, CD20, CD45, CD146, 흑색종 세포의 P-당단백질 및 전립선 줄기 세포 항원을 성공적으로 표적화했다. 다시 CD34+ 세포를 표적화하기 위한 바람직한 항체는 항-HPCA1, 클론 My10이다. 그러나 표적화 증가를 위해 항 C-키트+ 모이어티와 함께 양 항-HPCA1의 사용을 허용하는 이중-특이성 항체의 사용은 표적화를 증강할 것이다.
C. Nipah 키메라 엔벨롭 막 결합 G 단백질 및 F 단백질 변이체는 (1) 모집단에서 기존 면역성을 갖지 않는 것으로 나타났고, (2) 더 높은 바이러스 위형화된 역가를 가지고, (3) 더 높은 표면 밀도를 갖는 것과 같은 여러 이점을 갖는 세포 특이적 표적화에 사용되었다.
실시예 28
마우스 또는 인간 CD19 CAR 레트로바이러스 벡터를 인코딩하는 생산자 세포주.
안전성-변형된 pBA-9b 레트로바이러스 벡터는 또한 항-CD3z 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 시그널링 도메인에 연결된 scFV mAB-힌지-TM 도메인 영역으로 구성된 그 염기성 작제물형태로 마우스 또는 인간 항 CD19CAR 벡터 작제물을 인코딩하도록 유사하게 조작된다(도 15a-b).
레트로바이러스 비-클론 생성자 풀 뿐만 아니라 클론은 단일 또는 다중 백-투-백 형질도입 라운드를 사용한 >20의 m.o.t.를 갖는 형질도입 "높은 m.o.t." 어프로치의 높은 다중도를 사용한 클론 PCL로부터 (도 6에서 참조된 바와 같이) 확립된다. 형질도입의 다중도는 VPCL 비-클론 풀의 생성을 위해 PCL 세포당 사용된 감염성 바이러스 입자의 수로 정의된다. 전형적으로 PCL 배양은 형질도입 하루 이전에 6-웰 플레이트에 1 X 105 세포/웰로 접종된다. 적절한 부피의 벡터 상등액이 그 다음 0.1, 0.5, 5, 25 및 125의 m.o.t.에 상응하는 PCL(8μg/ml 폴리브렌의 존재 내)에 첨가된다. 20-24시간 후 벡터 상등액은 신선한 배지 2ml로 대체된다. m.o.t.를 증가시키기 위해, 형질도입 절차가 동일한 부피의 벡터 상등액을 사용하여 제2 일 동안 반복될 수 있다. 생산자 풀은 컨플루언스로 성장하고 컨플루언스-후 24, 48 및 72시간에 매일 상등액을 수집하여 PCR 역가를 결정하고 발현을 전달한다. 선택된 비-클론 풀은 클론의 개별 군이 확장됨에 따라 여러 라운드의 역가 결정 및 발현 검정 전달에서 분석되는 웰당 단일 세포를 생성하는 96 웰 플레이트 안으로 제한된 희석 접종을 사용하여 클로닝된다.
실시예 29
세포-특이적 탈표적화를 위한 pBA-9b-CD19CAR 서열에 대한 변형.
염기성 pBA-9B-CD19 CAR 서열은 벡터의 안전성 프로파일을 증가시키고 비-의도된 세포 유형에서 발현을 방지하기 위해 세포 유형 특이적 방식으로 벡터 발현을 하향 조절하는 효과적인 방법으로서 마이크로RNA(miR) 표적 서열을 또한 인코딩하도록 변형될 수 있다. 도 16은 골수성, B 및 NK 세포 유형에서 발현을 방해하는데 사용되는 예시적인 miR 표적 서열을 나타낸다.
실시예 30
자가-불활성화(SIN) 벡터 pSIN-BA9b를 생성하기 위한 pBA-9b에 대한 변형.
레트로바이러스 벡터의 안전성을 증가시키기 위해, pBA-9b의 SIN 버전은 LTR 삽입 돌연변이유발로 인한 종양유전자의 활성화를 제거하도록 조작될 수 있다. 도 17은 다중 클로닝 부위 내로 클로닝된 hCD19 CAR 유전자를 갖는 pSIN-BA-9B의 예시적인 디자인을 나타낸다.
실시예 31
레트로바이러스 벡터 제제의 핵심 특성의 결정
A. PCR에 의한 카피 수 정량화에 의한 역가의 측정. 벡터 샘플의 PCR 역가 분석이 수행된다. MLV-특이적 프라이머(5'-GCG-CCT-GCG-TCGGTA-CTA-G-3'(서열번호: 26), 5'-GAC-TCA-GGT-CGG-GCC-ACA-A-3'(서열번호:27)) 및 프로브(5'-AGT-TCG-GAA-CAC-CCG-GCC-GC-3'(서열번호:28))를 사용하여 80-bp 생성물을 증폭시킨다. 증폭 반응은 200-400μM dNTP, 900nM 프라이머 및 100nM 프로브 올리고뉴클레오티드로 50μl에서 수행된다. 생성된 형광을 검출하고 역가는 형질도입 단위/ml(TU/ml)로 표현된 프로벡터 카피 수를 기준으로 한다. 형질도입 단위는 알려진 카피 수 표준과 관련된 게놈 당량당 프로벡터 카피 수로 정의되고 벡터 통합 단위의 진정한 반영을 나타낸다.
B. 발현 검정 및 역가 결정의 전달. 이 일반적인 역가화 검정은 6-웰 플레이트(Corning Costar, NY)에서 웰당 3 X 105 세포로 형질도입 하루 이전에 접종된 HT-1080 표적 세포를 이용한다. 폴리브렌(8μg/ml)은 벡터 상등액의 일련의 희석으로 형질도입 2시간 전에 첨가된다. 20-24시간 후, 상등액을 1-2ml의 신선한 배지로 교체한다. 세포는 상등액 또는 게놈 DNA가 유전자 산물의 발현의 전달(TOE 역가) 또는 존재하는 프로벡터 카피의 수(PCR 역가)에 대해 검정되기 전 추가 24-48시간 동안 성장할 수 있다.
C. 발현 역가 결정의 β-갈락토시다아제 전달. β-gal TOE 역가는 2가지 독립적인 방법으로 결정된다. 제1 방법은 표준 프로토콜에 따라 X-gal 염색을 사용하는 생화학적 염색 절차이다. 제2 절차는 Galacto-light Plus Kit(Tropix, Inc., MA)를 이용하는 화학발광 검출 방법이다.
D. 복제-적격 레트로바이러스(RCR)의 검출. VPCL 또는 벡터 생성물에서 각각 RCR의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 2가지 절차가 사용된다. i) 제1 절차는 생산-후 VPCL을 테스트했다. 이들 세포는 동일한 수의 복제 허용 세포주 M. 둔니와 배양물 안으로 접종한다. VPCL은 소규모(1 X 107 세포)의 플라스크 또는 대규모(1 X 108 세포)의 롤러 병 안으로 접종된다. 세포는 여러 계대 동안 공동-배양되고 최종적으로 수확된다. 무세포 배양 상등액은 마커 구제 또는 PG4S + L- 검정을 사용하여 테스트된다. 하이브리드 뮤어라인 백혈병 바이러스로 M. 둔니 세포의 감염에 의해 생성된 RCR 생산 세포주는 공동배양 절차에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 나이브 M. 둔니 세포가 음성 대조군으로 사용되었다. ii) 제2 절차는 벡터 제제를 직접적으로 테스트한다. 비처리된 생산 수확물 또는 정제된 벌크 생성물은 롤러 병당 100ml 접종 부피를 사용하여 M. 둔니 세포에 적용된다. 짧은 접종 기간 후, 150ml의 추가 배지가 배양물에 첨가되고 세포는 배양 상등액의 일부가 수확되고, 여과되고, 마커 구제 또는 PG4S+ L- 테스트에 의해 RCR에 대해 검정되기 전에 4 내지 5회 계대된다. 최근 FDA 지침 문서([www.]FDA.gov)에 따라 임상 생산 로트로부터 조 벡터 300ml가 RCR에 대해 검정된다. 생성물 방출을 위해 사용된 M. 둔니 증폭(대규모) 및 PG4S + L- 검출 방법은 단일 단위 RCR 검출에 대해 검증되었다.
실시예 32
다중 세포 공장을 사용한 바이러스 생산.
다음 실시예는 바이러스 생산을 위한 뮤어라인 백혈병 바이러스(MuLV)를 생산하는 부착성 VPCL 세포를 성장시키는데 필요한 세포 배양 방법을 검토한다. MuLV 바이러스의 생산이 실시예로 사용되지만 이 과정은 또한 본 개시내용에 기술된 모든 바이러스에 대해 사용될 수 있다.
이 실시예에서, 모 HT1080 세포(ATCC CCL-121)로부터 생성된 VPCL이 기재되지만, 방법은 또한 5% CO2 조건 하에서 37℃의 바람직한 조건 하에서 HEK 293T 세포(CRL-1573), D-17(ATCC CCL-183) 및 Cf2Th(ATCC CRL-1430)로부터 생성된 VPCL에 대해 사용될 수 있다. 장기 보관을 위해, VPCL은 액체 질소 조건 하에서 동결보존되고, 세포 배양 성장 배지 용액에 10% DMSO, 50-90% 태아 소 혈청을 함유하는 동결보호 세포 배양 배지 용액에서 동결된 1 X 107 세포를 함유하는 동결보호 플라스틱 바이알에 저장된다. 해동 시, 세포는 2개 T-175의 것 안으로 후속한 확장을 갖는 T-75 플라스크 안으로 초기에 접종에 의해 확장되고 그 다음 후속적으로 다음 성장 배지를 갖는 10개의 T-175 플라스크로 배양된다:
Figure pct00016
컨플루언스에 도달한 후, 세포는 TrpZean®(Sigma)으로 수확되고 표준 세포 배양 방법을 사용하여 동일한 성장 배지로 중화된다. 세포는 이전에 상기 기술된 동일한 배지에서 3.1 x 10^4 생존가능 세포/㎠의 바람직한 접종 밀도로 3개의 10-층 세포 스택(Corning)에 접종하여 바이러스를 생산한다. 각 세포 스택은 1.1L의 성장 배지를 함유했다. 세포 스택은 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션된다.
접종 2일 후, 세포 스택 배양물은 컨플루언스에 접근하거나 도달할 것이다. 각 배양물에서 배지는 신선한 배지로 대체된다. 2일 후, 생산된 바이러스를 함유하는 배지를 수확하고(수확 #1), 동일한 부피(1.1L)의 신선한 배지로 배양물을 다시-공급했다. 10시간 후, 제2 수확(수확 #2)이 수행되고 동일한 부피(1.1L)의 신선한 성장 배지로 세포 배양물을 다시-공급했다. 2차 수확에 이어 16시간에 3차 수확(수확 #3)이 수행된다. 그런 다음 3 수확을 정제를 위해 모았다. 3 수확 및 풀에 대한 바이러스 역가는 다음 표에 나열되어 있다.
Figure pct00017
실시예 33
동일한 기술로 다른 세포주에 의한 바이러스 생산. 실시예 32에 기재된 것과 동일한 배양 기술을 사용하여 인간 세포주 HEK 293 세포(ATTC# CRL-1573) 및 개 세포주 Cf2TH(ATCC# CRL-1430) 또는 D-17(ATCC # CCL-183)에서 임의의 개시된 바이러스를 생산할 수 있다. 실시예 32에 기술된 바와 같이 3개 수확을 수집하고 모을 수 있다. Cf2TH 세포를 사용한 수확 풀에서 바이러스 역가는 4.9 x 10^6 TU/mL일 수 있다.
실시예 34
동원을 유도하는 HSPC-틈새 상호작용의 약리학적 억제
골수 내피를 가로지르는 이동, 즉, 경내피 이동은 전구 세포 동원의 조절에서 핵심 단계이다. 혈액에서 골수로의 HSPC-지시된 이동 및 골수 틈새에서의 체류를 조절하는 중심 메커니즘은 망상 Nestin+ 중간엽 줄기 및 전구 세포(MSPC)(Mendez-Ferrer et al. 2010), 인간 망상 CD146+ MSPC(Sacchetti et al. 2007) 및 혈관주위 망상 렙틴 수용체+ 세포(Ding et al. 2012)를 포함한 기질 세포의 다른 세브셋트 상에 발현된 케모카인 CXCL12(기질 세포-유래 인자-1(SDF-1)로도 알려짐)에 의한 HSPC에 대한 CXCR4 수용체의 활성화를 포함한다(Nagasawa et al. 1996; Oberlin et al. 1996).
CXCL12 구배 및 골수 틈새에 대한 HSPC 부착의 유도를 유도하는 세포외 기질에 흡착되고 이들 세포에 의해 분비된 CXCL12(Sugiyama et al. 2006). 마우스에서 CXCR4 또는 CXCL12의 조건부 결실에 의한 것과 같은 CXCL12/CXCR4 상호작용으로의 간섭은 골수에서 HSPC의 유지를 감소시키고 말초 혈액 및 비장 안으로의 HSPC 이동 수를 극적으로 증가시켰다(Tzeng et al. 2011). CXCL12(SDF-1) 자체는 세포-표면 인테그린 VLA-4, VLA-5 및 LFA-1을 활성화한다(Peled et al. 2000). CXCL12(SDF-1)로 CD34(+) 세포의 활성화는 견고한 접착 및 경내피 이동을 유도하고, 이는 LFA-1/ICAM-1 및 VLA-4/VCAM-1 상호작용에 의존적이고, 더욱이 내피에 밑줄을 긋는 세포외 기질을 통한 CD34(+) / CXCR4(+) HSPC의 CXCL12(SDF-1)-유도된 분극 및 혈관외유출은 VLA-4 및 VLA-5 둘 모두에 의존적이었다(Peled et al. 2000). CXCL12(SDF-1)는 또한 접착 분자 CD44를 활성화하고 이에 의해 고정된 히알루론산에 대한 HSPC 접착 및 골수로 HSPC의 귀소를 빠르고 강력하게 자극하는 것이 추가로 보고되었으며, 이는 항-CD44 모노클로날 항체 또는 가용성 히알루론산에 의해 차단될 수 있고, 히알루로니다제의 정맥 주사 후 현저하게 손상될 수 있다(Avigdor et al. 2004). 따라서, CXCL12(SDF-1)/CXCR4 상호작용의 억제는 다중 HSPC-기질 접착 상호작용에 대한 다운스트림 효과를 갖는다.
AMD3100(플레릭사포)은 원래 항-HIV 약물로 개발된 바이시클람 부류의 합성 유기 분자이다(De Clercq 2019). CXCR4 수용체를 길항하고, 따라서 줄기 세포를 골수 기질에 묶는 CXCR4/CXCL12(SDF-1) 상호작용을 방해함에 의해, AMD3100은 다양한 동물 모델에서 HSPC를 빠르게 동원하는 것으로 밝혀졌다(Broxmeyer et al. 2005). 2008년에 AMD3100/플레릭사포(상표명 Mozobil)는 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종이 있는 환자에서 수집 및 후속 자가 이식을 위해 말초 혈액에 HSPC를 동원하기 위해 G-CSF와 조합하여 사용하도록 승인되었고, G-CSF-매개된 HSPC 동원이 충분한 수의 HSPC를 유도하지 못하는 경우 지지적 수단으로 사용된다(De Clercq 2019). AMD3100에 의한 신속한 동원은 CXCL12 수준을 조절할 뿐만 아니라 기질 메탈로프로테아제-9(MMP-9) 및 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제(uPA)와 같은 프로테아제의 활성화를 유도한다(Dar et al. 2011). 활성화된 골수 기질 및 내피 세포는 또한 AMD3100으로 자극 시 순환계 안으로 CXCL12(SDF-1)를 분비하는 역할을 수행한다(Dar et al. 2011).
더욱이, AMD3100은 유사하게 CXCR4 수용체를 표적화하는 다른 약물 화합물의 조사를 위한 모델 역할을 했고 KRH-1636 및 CX0714(De Clercq 2019)와 같은 줄기 세포-동원 제제로 잠재적으로 유용할 수 있다. T-140(4F-벤조일-TN14003)은 뮤어라인 모델에서 HSPC 및 또한 적혈구를 동원하고 G-CSF와 시너지 효과를 나타내는 또 다른 CXCR4 억제제이다(Abraham et al. 2007).
α4β1 및 α4β7 인테그린 억제제인, 피라테그라스트는 출생후 조혈 틈새에서 HSPC 체류를 방해하고 CXCR4 억제제 AMD3100과 상승적으로 상호작용하는 것으로 나타났다(Kim et al. 2016).
α4β7 인테그린에 대한 인간화된 모노클로날 항체인 베돌리주맙은 이용가능하고 크론병 및 궤양성 대장염에 대한 임상 시험에서 테스트되었고, 보다 최근에는 동종 HSPC 이식 후 이식편 대 숙주 질환의 예방을 위해 테스트되었다(Chen et al. 2019). HSPC 배출 감소와 함께 혈장 CXCL12 수준에서 감소가 베돌리주맙으로 처리된 마우스에서 관찰되었다.
BOP(N-(벤젠설포닐)-L-프롤릴-L-O-(1-피롤리디닐카르보닐)티로신)는 또한 인테그린 α9β1/α4β1과 표적화된 간섭을 일으키는 화학적 화합물이다. 이 소분자 길항제의 단일 용량은 HSPC를 재구성하는 장기간 다중-계통을 신속하게 동원하고 AMD3100-유도된 HSPC 동원을 또한 향상시키는 것으로 보고되었다(Cao et al. 2016).
Rac 억제제: 조혈 전구체 및 HSPC에서 발현되는 Rac 소형 GTPase는 HSPC 동원에 복잡하게 관여하는 것으로 밝혀졌고, Rac 활성(그러나 Cdc42 또는 RhoA 활성은 아님)의 특정 억제제의 적용은 신속한 HSPC 동원에 대해 사용될 수 있다(Cancelas et al. 2005). 최근에, Rac1 활성화는 CXCL12/CXCR4 시그널링을 강화하는 인간 CXCR4에서의 가역적 형태의 변화를 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 이들 시그널링 경로 간의 상호 누화를 의미한다(Zoughlami et al. 2012).
조혈 성장 인자에 의한 동원
조혈 성장 인자, 특히 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF, 필그라스팀, 레노그라스팀) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 몰그라모팀, 사그라모팀)는 조혈 성장 인자 단독으로 동원을 사용하는 기준선보다 60-배수까지 수준을 증가하도록 HSPC를 말초 혈액 안으로 동원하는데 효과적인 것으로 나타났다(Peters et al. 1993; Gazitt 2002).
이 접근법은 동원이 전향적으로 계획될 수 있고 화학요법의 연관된 이환율 없이 수행될 수 있을 때 유리하다. 부가하여, 환자가 집에서 동원을 위한 조혈 성장 인자의 투여를 받은 다음 외래환자로서 추가 유전자 전달 절차를 받는 것이 가능하다.
G-CSF: 내피 세포는 골수에서 G-CSF의 감염-유도된 발현의 주요 구성적 공급원인 것으로 나타났다(Boettcher et al. 2014). 따라서 이들 신호는 HSPC의 동원과 관련되거나 그의 일부일 가능성이 있다. 참고로 호중구는 투과 전자 현미경 연구(Lee et al. 2009)에서 볼 수 있듯이 골수에서 정현파 내피 장벽을 투과한다. 그러나, 골수 내피 장벽의 파괴는 반복적인 G-CSF 자극 동안 두드러지며, 이는 내피 세포가 HSPC 동원 동안 G-CSF의 표적으로 기능함을 나타낸다(Szumilas et al. 2005).
조골세포에서, SCF/c-키트 리간드, IL-7, VCAM-1 및 HSPC 유지의 역-조절자로서 오스테오폰틴은 모두 G-CSF 치료에 의한 동원 동안 또는 β3 아드레날린수용체 활성화 후에 선택적으로 하향-조절된다(Mendez-Ferrer, Battista and Frenette 2010). G-SCF는 β-아데네르기성 교감 신경 활성을 자극하기 때문에, 이것은 HSPC 동원을 유도하는 시그널링 사슬에 대한 증거를 제공한다.
더욱이, G-CSF 처리는 골수 내 호중구의 강력한 확장을 유도하는 것으로 나타났고, 이들은 G-CSF 투여 후 동원 동안 골수로부터 빠져나가는 제1 세포이다(Day and Link 2012). G-CSF 수용체가 호중구 과립구에 부재하는 경우 외부 자극, 즉 G-CSF, 화학요법 및 케모카인에 의한 HSPC 동원의 3가지 고전적 유형 모두가 파괴되지만 정상적인 조혈에도 불구하고 HSPC에서 부재하는 경우에는 파괴되지 않는다(Liu, Poursine-Laurent, Link 2000). 특히, G-CSF 수용체는 시클로포스파미드- 또는 IL-8-유도되지만 FLT3L-유도되지 않은 동원에 필요한 것으로 나타났다(Liu, Poursine-Laurent, and Link 2000). 호중구 과립구에 의해 방출된 세린 프로테아제 및 메탈로프로테이나제는 기질 틈새 세포 또는 HSPC로부터 VCAM-1, c-키트, SCF 및 CXCL12(SDF-1)를 절단하는 것으로 나타났고 호중구 엘라스타제, 카텝신 G 및 MMP-9를 포함한다(Levesque et al. 2002; Heissig et al. 2002). 이들 프로테아제는 G-CSF 후 동원 과정 동안, 및 케모카인 또는 화학요법으로 동원 동안 마지막 단계로 호중구에 의해 방출되어, 순환계 안으로 HSPC 및 전구세포의 빠른 배출로 이어진다. 과립구 집락-자극 인자 수용체(G-CSFR)는 조골세포의 지지적 역할을 억제하고 CXCL12/CXCR4 축을 파괴함에 의해 단핵구에서 HSPC를 혈류 안으로 동원하도록 신호하는 것이 또한 보고되었다(Christopher et al. 2011).
당뇨병 마우스는 골수에서 증가된 HSPC 체류 및 G-CSF에 의한 불량한 HSPC 동원을 나타낸다는 점에 유의해야 한다(Ferraro et al. 2011). 이들 동물에서는 G-SCF로 CXCL12(SDF-1)의 하향-조절이 없다. 결함은 AMD-3100의 적용에 의해 구제될 수 있고 HSPC의 동원이 조혈 시스템 외부의 질환에 의해 영향을 받을 수 있음을 나타낸다. HSPC에서 c-Met 시그널링의 부재는 골수에서 혈액으로의 HSPC 배출의 강력한 손상을 초래하여, 이에 의해 CXCR4의 차단이 G-CSF-유도된 c-Met 활성화 및 HSPC 동원을 방지했다(Tesio et al. 2011; Petit et al. 2002). 표피 성장 인자는 또한 G-CSF-유도된 HSPC 동원을 억제하는 것으로 나타났다(Ryan et al. 2010).
골수생성인자: 인터류킨-3(IL-3) 및 G-CSF 수용체의 다기능 작용제인 골수생성인자(MPO)는 또한 정상 비인간 영장류에서 대조군 사이토카인에 비해 조혈 집락-형성 세포(CFC) 및 CD34+ HSPC의 효과적이고 효율적인 동원자인 것으로 보고되었다(MacVittie et al. 1999).
VEGF: 성장 인자-자극된 전구 세포는 내피 세포에 작용하여 그의 성장, 운동성, 투과성 및 천공을 변형시킬 수 있는 다량의 사이토카인(예를 들어, 혈관 내피 성장 인자, VEGF)을 생성한다. rhVEGF164 또는 히스타민의 정맥내 투여의 15분 이내에 혈액 내 HSC 수에서 2- 내지 3-배수 증가뿐만 아니라 혈관 누출 증가가 발생했다(Smith-Berdan et al. 2015). VEGF는 또한 VEGF 또는 VEGF-수용체의 부재에서 조혈이 발달하지 않은 뮤어라인 모델에 의해 나타난 바와 같이 조혈 전구 세포의 동원 및 귀소에 특이적으로 관련될 수 있다(Shalaby et al. 1995). 그러나, 현저하게는 AMD3100으로 마우스의 처리에 이은 VEGF의 투여는 내피 전구 세포와 기질 전구 세포 둘 모두의 동원을 초래했지만 HSPC 동원은 억제했다(Pitchford et al. 2009).
SCF: 사이토카인 키트-리간드(줄기 세포 인자, SCF)에 대한 수용체인 c-키트와 같은 사이토카인 수용체는 또한 순환하는 HSPC 상에서 하향조절된다. 막-결합 사이토카인 예컨대 키트-리간드(SCF)는 골수 기질 및 내피 세포 상에 발현되기 때문에, c-키트는 또한 부착 분자로 작용할 수 있고 전구 세포 동원 및 귀소에 역할을 수행할 수 있다. 골수에서 CXCL12(SDF-1)의 하향조절은 또한 SCF 및 FLT3-L의 투여 시에 관찰되었다(Christopher et al. 2009). 외막 세망 세포와 마찬가지로, 조골 세포는 β-AR 작용제를 분비하여 CXCL12, VCAM-1 및 SCF의 발현을 하향-조절한다(Katayama et al. 2006; Mendez-Ferrer, Battista, and Frenette 2010).
보체 인자: 단핵구 세포는 방사선- 및 화학요법에 의해 활성화되고, 이에 의해 아나필라톡신으로 작용하는 보체 인자 C3(C3a, desArgC3a) 및 C5(C5a 및 desArgC5a) 절단 단편을 유리시키는 보체 캐스케이드를 통해 관련된다(Ratajczak et al. 2013). 보체 인자 3(C3) 녹아웃 마우스는 정상-상태 조건 하에서 혈액학적으로 정상이지만 야생형 HSPC의 조사 또는 이식에 이은 조혈 회복에 상당한 지연을 나타내고, C3 보체 인자는 CXCR4/CXCL12 축에 대한 HSPC의 반응성을 증가시키며(Ratajczak et al. 2013), 또한 HSPC 동원에서 고전적 보체 활성화 경로의 관여를 제안한다. 더욱이, 보체 인자 5(C5)-결핍 마우스는 HSPC의 손상된 동원을 보여주었다(Ratajczak et al. 2013).
스핑고지질 및 뉴클레오티드: CXCL12(SDF-1) 및 이의 수용체 CXCR4에 부가하여 HSPC의 이동을 유도하는 다수의 다른 화학유인물질이 알려져 있다. 이들은 G 단백질-커플링된 스핑고신 1-인산 수용체 1(S1P1) 및 세라마이드-1-인산(C1P)에 연결되는 스핑고지질 스핑고신-1-인산(S1P)(Golan et al. 2012; Ratajczak et al. 2014)을 포함한다(Ratajczak et al. 2014). 더욱이, 아데노신 삼인산(ATP) 또는 우리딘 삼인산(UTP)(Rossi et al. 2007) 및 2가 양이온 Ca2+ 및 그 수용체(CaR)(Adams et al. 2006) 및 H+(Krewson et al. 2020)와 같은 세포외 뉴클레오티드는 HSPC의 표면뿐만 아니라 내피 세포와 같은 줄기 세포 틈새의 특정 세포 상에서 부착 분자를 조절한다. 이들 분자의 기원 세포는 아직 명확하지 않은 경우가 많지만, 그 작용에는 생착(이식 후), 부착(정상 상태 하) 및 동원(그 유도 후)의 매개가 포함된다.
S1P: S1P 및 수용체 S1P1은 HSPC 정상-상태 배출 및 골수로부터의 동원을 조절하는 것으로 제안된다. S1P는 성숙한 적혈구와 활성화된 혈소판에 의해 생성되어, 혈액에서 마이크로몰 S1P 농도를 야기하며 대부분 알부민 및 높은-밀도 지단백질(HDL)에 결합된다(Pappu et al. 2007; Liu et al. 2011). 고형 조직에서는 낮은 농도의 S1P만이 검출가능하기 때문에 HSPC의 일정한 정상-상태 방출에 중요한 골수와 혈액 사이의 일정한 S1P 농도 구배가 제안되었다. 이 아이디어는 특정 억제제 FTY720으로 S1P1 수용체의 억제가 HSPC의 혈류 안로의 정상-상태 동원을 감소시킨다는 발견에 의해 뒷받침된다(Golan et al. 2012; Liu et al. 2011). 이와 일치하여, HSPC에서 S1P1 수용체의 과-발현은 S1P-매개된 이동을 증가시켰고, 시험관내 CXCL12(SDF-1)의 유의한 억제로 CXCR4 표면 발현의 감소는 이동을 유도하고 골수로의 HSPC 귀소 가능성을 감소시켰다(Ryser et al. 2008). 또한, 일시적으로 증가된 S1P 혈장 농도는 G-CSF 또는 AMD3100로 동원 동안 관찰되었으며(Golan et al. 2012), 아마도 보체 캐스케이드 및 막 공격 복합체를 활성화함에 의한 용혈이 증가했기 때문일 수 있으며(Ratajczak et al. 2013; Ratajczak et al. 2014), 이는 S1P가 동원 동안 HSPC의 방출에 관여됨을 시사한다(Golan et al. 2012). S1P의 증가된 골수 농도는 또한 골수 Nestin+ MSC로부터 CXCL12(SDF-1) 분비와 혈액 안으로 HSPC의 감소된 방출을 유도한다(Golan et al. 2012).
HSPC에서 발현되는 제2 S1P 수용체인 S1PR3은 골수 틈새에서 HSPC의 체류에 관여되는 것으로 제안된다. S1PR3의 억제 또는 녹아웃은 혈액 순환 안으로 HSPC의 동원을 초래하며, 이에 의해 S1PR3 길항작용이 골수 및 혈장 CXCL12(SDF-1) 농도를 억제한다(Ogle et al. 2017). 한편, S1PR3 길항작용은, S1PR3과 CXCR4 경로 사이의 시너지를 나타내는, AMD3100 유도된 동원을 증가시킨다.
C1P: 치명적인 방사선조사 후, S1P 및 C1P의 수준이 골수 미세환경에서 증가하는 것으로 나타났다; 게다가, 말초 순환 HSPC는 순환에 존재하는 비교적 높은 수준의 S1P 및 C1P에 노출된다. 이들 메커니즘 둘 모두는 이들 생체활성 지질의 잠재적 귀소 기울기에 대한 반응을 둔감화할 수 있다(Ratajczak et al. 2014).
ATP 및 UTP: 5-뉴클레오티드 삼인산, 특히 ATP 및 UTP는 HSPC를 포함하는 조혈 세포에 대한 증식, 분화, 세포 사멸 및 화학주성의 P2 뉴클레오티드 수용체-매개된 조절에 관여한다(Lemoli et al. 2004). UTP는 조직 손상 및 세포 사멸로 인해 세포외 환경 안으로 빠르게 방출되는 내인성 위험 신호를 나타내는 것으로 생각된다. UTP 및 기타 뉴클레오티드는 백혈구의 손상된 조직 안으로의 이동을 유도하고, 세포 증식의 유도에 의한 조직 회복을 자극하고, 항-염증 경로를 활성화함에 의해 면역 반응의 해소를 촉진한다(Di Virgilio, Boeynaems, and Robson 2009). UTP와 HSPC의 사전 인큐베이션은 시험관내에서 HSPC의 CXCR4-유도된 이동을 상당하게 개선한 반면, UTP 자체는 HSPC의 한계 화학주성 이동만을 유도한다(Rossi et al. 2007). 부가하여, UTP 단독 또는 CXCL12/SDF-1과 조합한 사전-처리는 피브로넥틴에 대한 세포 부착이 상당하게 증가시키고 UTP 사전-처리는 인간 HSPC의 골수로의 귀소를 개선한다(Rossi et al. 2007). PBSC 동원에서 UTP 시그널링의 관여는 아직 밝혀지지 않았다. 백일해 독소에 의한 CXCL12- 및 UTP-의존성 화학주성의 억제는 Rho 구아노신 5'-트리포스파타제(GTPase) Rac2 및 이의 이펙터 Rho GTPase-활성화된 키나제 1 및 2(ROCK1/2)가 UTP-조절/CXCL12-의존성 HSPC 이동에 관여된다는 것을 제안한다(Rossi et al. 2007).
우리딘 이인산-글루코스: 우리딘 이인산-글루코스(UDP-glc)는 스트레스에 반응하여 세포외액 안으로 방출된다. UDP-glc는 장기간 재증식 HSPC를 동원하는 것으로 나타났고 UDP-glc와 G-CSF의 공동-투여는 G-CSF 단독보다 더 큰 HSPC 동원을 유도했다(Kook et al. 2013). 경쟁적 재증식 실험에서, UDP-glc 플러스 G-CSF로 동원된 HSPC는 G-CSF 단독으로 동원된 HSPC보다 더 잘 재증식되었다. G-CSF와 비교하여, UDP-glc-동원된 HSPC는 보다 림프구-편향된 분화 능력을 보여, UDP-glc가 HSPC의 기능적으로 구별되는 서브셋트를 동원함을 나타낸다(Kook et al. 2013). 대조적으로, 억제 실험은 반응성 산소 종(ROS)이 UDP-glc-매개된 HSPC 동원의 매개체임을 보여주었다. ROS 억제제 N-아세틸-L-시스테인(NAC)의 적용은 UDP-glc-유도된 HSPC 동원을 상당하게 폐지할 수 있었다. Kooket et al.은 ROS가 핵 인자 카파-B 리간드(RANKL) 발현의 수용체 활성화제 및 RANKL-유도된 파골세포 분화에서 증강을 유도하여 HSPC 동원을 야기한다고 제안한다(Kook et al. 2013).
Ca2+ 및 CaR: HSPC는 줄기 세포 틈새 내/이로부터 HSPC의 체류 및 유리에 강하게 관여하는 7-막횡단-전범위 CaR을 발현한다. CaR이 결핍된 신생 마우스는 골수에서 감소된 세포질과 원시 HSPC의 결핍을 밝히는 반면 순환계와 비장에서 증가된 수의 HSPC가 발견되었다. CaR-/- 마우스의 태아 간은 정상적인 증식, 분화 및 이동 능력을 갖는 정상적인 수의 HSPC를 가졌다. 그러나 이들 HSPC는 콜라겐 I에 대한 부착 결함을 나타내어 골내 틈새에 결함있는 침적을 초래한다(Adams et al. 2006). 다른 한편으로, CaR의 양성 알로스테릭 조절제인 신나칼세트로 CaR의 약리학적 활성화는 콜라겐 I 및 피브로넥틴에 대한 HSPC의 증가된 부착, CXCL12(SDF-1)로의 시험관내 증가된 이동 및 증가된 생체내 귀소 및 골내막 틈새로의 침적을 초래했다. (Lam, Cunningham, and Adams 2011). Ca2+ 처리는 골수 세포의 CXCR4의 전사 및 발현과 SDF-1-매개된 CXCR4 내재화를 증가시켰고, 반면 Ca2+ 유입 억제제 또는 항체로 CaR의 차단은 Ca2+-유도된 CXCR4 발현을 억제하여 HSPC에서 Ca2+-유도된 변화가 CXCR4의 증가된 발현에 의해 부분적으로 조절됨을 나타낸다(Wu et al. 2009).
막 지질 래프트 안으로 CXCR4의 혼입을 촉진하는 분자: 양이온성 항균 펩티드(CAMP), 카텔리시딘 LL-37, β2-데펜신, 및 C3a는 CXCL12(SDF-1)의 피코몰 수준(1-2ng/ml)에 대한 HSPC의 반응성을 고도로 개선시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 조직의 생리학적 CXCL12(SDF-1) 농도를 반영하여 HSPC에서 이 부류의 분자의 생물학적 중요성을 뒷받침한다(Wu et al. 2012). 이들 분자는 막 지질 래프트 안으로 CXCR4 수용체의 혼입을 개선한다(Ratajczak et al. 2013). 막 지질 래프트 내에서 작은 구아닌 뉴클레오티드 삼인산효소(GTPase) Rac-1 및 Rac-2와 같은 여러 세포 시그널링 분자가 조립되며, 이는 틈새 안으로 HSPC의 침적, 또는 차단된 경우 동원을 위해 중요한 것으로 알려져 있다(Cancelas et al. 2005). 지질 래프트에서 CXCR4와 Rac-1의 공동-국지화는 GTP 결합 및 Rac-1의 활성화를 개선할 수 있다.
카텔리시딘 LL-37은 골수 기질 세포에 의해 발현되는 항균성 펩티드이고 골수 조사 후에 상향조절된다. LL-37은 HSPC의 화학주성 이동 및 부착성을 향상시키고 이식 이전에 LL-37과 함께 HSPC의 단시간 사전-인큐베이션은 마우스에서 혈소판 및 호중구 수의 회복을 가속화하는 것으로 나타났다(Wu et al. 2012). 동원에 대한 그 영향은 아직 결정되지 않았다.
프로스타글란딘 E2: 뮤어라인 및 인간 HSPC는 프로스타글란딘 E2(PGE2) 수용체를 발현한다. 뮤어라인 이식 실험에서 PGE2에 대한 단기 생체외 노출은 HSPC의 귀소 및 증식을 증강하고 원시의 장기적 재증식 세포의 수를 증가시켜, PGE2가 HSPC의 자가-재생을 지원함을 나타낸다(North et al. 2007; Hoggatt et al. 2009). 대조적으로, 콜로니-형성 단위-과립구 대식세포(CFU-GM) 및 대식세포(CFU-M)로 이어지는 미성숙 골수 전구 세포의 분화는 PGE2에 의해 억제되어(Pelus et al. 1979), PGE2에 의한 조혈의 차등 조절을 시사한다. 인도메타신, 아스피린, 이부프로펜 및 멜록시캄과 같은 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)에 의한 PGE2 생성의 차단은 G-CSF-유도된 HSPC 동원을 배가시켰다. G-CSF + NSAID-동원된 이식편의 이식은 이식후 조혈의 더 빠른 재생과 연관되었다(Hoggatt et al. 2013). 골수 틈새에서 PEG2의 중요성은 i) 조사된 골수 기질 세포에 의한 증가된 PGE2 생성, 및 ii) 기질 세포에서 시클로옥시게나제 2의 C1P- 및 S1P-유도된, 증가된 발현의 발견에 의해 뒷받침되며, 이에 의해 C1P 및 S1P는 치명적으로 조사된 손상된 골수 세포에서 방출되어, 치명적인 조사에 의한 HSPC 이식을 위한 조건화가 골수에서 PGE2 생산을 유도함을 시사한다(Ratajczak et al. 2014).
PGE2 처리는 세포내 CXCR4 mRNA 농도와 HSPC 표면 상에 CXCR4의 발현을 증가시켜 시험관내 SDF-1/CXCL12로의 증강된 이동 및 생체내 골수로의 귀소를 유도한다. 더욱이, PGE2는 서바이빈의 증가된 발현과 세포내 활성 카스파제-3의 감소로 인해 HSPC 생존을 증강시킨다(Hoggatt et al. 2009). HSPC 체류 및 혈액 안으로 HSPC의 배출의 PGE2-매개된 조절에 중요한 또 다른 메커니즘은 오스테오폰틴 발현의 조절이다. NSAID에 의한 PGE2 합성의 차단은 줄기 세포 틈새에 HSPC의 체류를 담당하는 오스테오폰틴 발현에서 감소로 이어진다는 것이 제안된다(Hoggatt et al. 2013). 또한 오스테오폰틴은 줄기 세포 풀의 크기의 음성 조절자이고 오스테오폰틴의 하향-조절 또는 부재는 원시 HSPC의 증가된 수와 연관되어 있다(Stier et al. 2005). 따라서, 기질 세포에 의해 발현된 오스테오폰틴은 G-CSF 단독으로 동원된 이식편과 비교하여 G-CSF 플러스 NSAID 동원된 줄기 세포 이식편의 우수한 재증식 능력 및 장기 생착과 연관될 수 있다(Hoggatt et al. 2013).
EPI-X4, 내인성 인간 CXCR4 길항제: EPI-X4는 인간 혈액 여액 및 혈장으로부터 단리되고 염증 과정 동안 면역 세포로부터 방출되는 아스파르트산 프로테아제 카텝신 D 및 E에 의해 산성 조건 하에 알부민으로부터 생성되는 16개 아미노산 펩티드이다(Zirafi et al. 2015). 호중구는 알부민으로부터 EPI-X4를 생산하는 것으로 나타났다(Zirafi et al. 2015). 골수에서 호중구 과립구가 G-CSF로 HSPC 동원 동안 강력하게 활성화되어, 고도로 단백질분해 환경을 유도하고(Levesque et al. 2002), 알부민이 골수의 세포외 공간 전반에 걸쳐서 분포되기 때문에, 골수에서 EPI-X4 생성에 의한 CXCR4/CXCL12(SDF-1) 축의 조절이 가능하며, 이는 마우스 안으로 EPI-X4의 단일 복강내 주사가 치명적으로 조사된 숙주를 이식한 HSPC의 현저한 동원을 초래했다는 아이디어와 일치한다(Zirafi et al. 2015).
CXCR2 효능제의 절삭된 형태인 GROβ: CXCR4 길항제 AMD3100과 조합된 인간 CXCR2 케모카인 효능제 GROβ의 N-말단 4-아미노산 절삭된 형태를 이용하는 신속한 줄기 세포 동원 요법이 최근에 보고되었다( Hoggatt et al. 2018). 마우스 안으로 두 제제의 단일 주입은 G-CSF의 표준 다중-일 요법과 동등한 규모인 15분 이내에 정점인 줄기 세포 동원을 초래했다. 이 신속한 동원은 호중구에 대한 상승적 시그널링으로 인한 것으로 증강된 MMP-9 방출을 초래했고, MMP-9에서 유전적 다형성이 이 요법의 활성을 변경할 수 있다는 것이 발견되었다(Hoggatt et al. 2018). 유사한 결과가 N-말단 절삭된 GROβ(SB-251353(King et al. 2001) 또는 SK&F 107647(King et al. 2000)로 다양하게 지정됨)를 단독으로 또는 비-인간 영장류에서 G-CSF와 조합하여(King et al. 2001) 사용하여 이전에 보고되었다.
실데나필: 단핵구에 의존할 가능성이 있고 HSPC 동원을 조절하는 인자는 산화질소이다. 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) -/- 마우스에서 동원 연구는 iNOS가 조혈 세포 이동의 음성 조절자이고 동원 동안 HSPC의 말초 혈액 안으로의 배출을 방지하는 것으로 나타났다(Adamiak et al. 2017). 포스포디에스테라제 유형 5(PDE5) 억제제인 실데나필 시트레이트(비아그라)는 혈관을 둘러싸고 있는 평활근 세포에서 순환 GMP의 분해를 차단하여 혈관 확장을 초래한다. 이 억제는 약물의 경구 투여 2시간 후 피크 활성으로 즉각적이다(Andersson 2018). 최근 연구는 CXCR4 길항제 AMD3100의 단일 주사와 조합된 실데나필 시트레이트의 단일 경구 용량의 신속한 2-시간 요법이 G-CSF(필그라스팀/뉴포젠)의 표준 치료 5-일 요법에 필적하는 수준에서 효율적인 HSC 동원을 유도하는 것을 밝혔다(Smith-Berdan et al. 2019).
동원 요법의 선택은 HSPC 표현형에 영향을 미칠 수 있다
항원 발현의 분석은 동원된 CD34+ 세포와 정상-상태 CD34+ 세포 사이에 표현형 변이가 있고 화학요법의 유무에 관계없이 동원하는 조혈 성장 인자의 선택이 CD34+ 세포의 수확 하위모집단에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 따라서 동원 요법의 선택은 동원된 HSPC에서 특정 세포 계통의 조혈 재구성에 영향을 미칠 수 있다.
시클로포스파미드-동원화된 CD34+ 세포는 낮은 CD71 발현과 함께 낮은 CD19 발현에 의해 결정된 바와 같이 소수의 사전-B 림프구를 가지며, 이는 활성 증식의 결여 및 상이한 환자 사이의 하위모집단의 발생률에서 변동을 시사한다.
역으로, 화학요법 및 G-CSF 둘 모두로의 동원은 상이한 환자에서 CD33 및 CD71 공동-발현의 이질성, 및 높은 수준의 CD71 발현을 나타낸다.
장기 혈소판 회복은 그것이 유래된 이종 CD34+ 세포 모집단보다는 이식된 원시 CD34+ CD33- 세포의 수에 의해 더 정확하게 예측된다는 것을 시사하는 증거가 축적되기 시작하고 있다.
초기 인간 전구 세포의 특징인 CD38 항원의 발현의 부족(CD38-)은 이용된 동원 요법에 의해 영향을 받을 수 있다. G-CSF-동원된 PBPC는 화학요법 플러스 G-CSF(97%가 CD38을 발현함), 화학요법 플러스 GM-CSF(96.4%가 CD38을 발현함) 또는 높은-용량 화학요법 단독(99.1%가 CD38을 발현함)에 의해 동원된 것보다 훨씬 더 큰 비율의 원시 전구체(CD38을 발현하는 세포의 단지 88%)를 함유한다.
유사하게, 장기 배양-개시 세포(LTCIC)의 증가된 수확 수율을 예측할 수 있는 특정 동원 요법이 기술되었다.
실시예 35
동원을 위한 화학요법 약물 요법
순환하는 HSPC의 수는 정상-상태 수준과 비교하여 골수억제 화학요법 후 회복 기간 동안 유의하게 증가될 수 있다.
예를 들어, 4g/㎡ 시클로포스파미드의 단일 용량은 CFU-GM의 수에서 최대 25-배수 증가를 초래할 수 있다.
유사하게, 3.62 × 106 세포/kg 정도의 CD34+ 세포 수율은 4-7g/㎡의 시클로포스파미드 용량에 이어서 달성될 수 있다).
높은-용량 에토포사이드(2g/㎡)도 HSPC를 동원하는 안전하고 효과적인 방법으로 사용될 수 있다.
높은-용량 시클로포스파미드와 에토포사이드(600mg/㎡)의 조합은 개별 화학요법 제제로 달성된 것보다 CFU-GM 및 CD34+ 세포 함량이 우수한 HSPC의 동원을 야기한다.
동원된 집락-형성 세포의 수는 유도 화학요법 요법의 제1 주기에 이어 가장 높은 것으로 보이며, 각 후속 주기 후에 숫자가 감소한다.
그러나, 이들 동원된 세포의 분석은 제1 주기에 이어서 보다 제4 화학요법 주기에 이어서 더 큰 비율의 CD34+ 세포를 나타낸다.
화학요법-유도된 동원은 효과적인 항-암 치료의 투여에서 지연을 피할 수 있고 HSPC 동원에 부가하여 생체내 퍼징을 가능하게 한다.
실시예 36
동원을 위한 조혈 성장 인자 요법.
G-CSF: G-CSF 단독은 골수에서 말초 혈액 안으로 HSPC를 효과적으로 동원할 수 있다.
필그라스팀 10μg/kg/일의 용량이 일반적으로 적절하지만 일부 연구에서는 16μg/kg/일을 사용했다.
순환하는 전구 세포의 수를 증가시키는 G-CSF의 능력은 D
Figure pct00018
hsen et al34에 의해 처음으로 언급되었고, 추가 연구는 G-CSF가 다양한 악성 질환이 있는 환자에서 골수로부터 말초 혈액 안으로 전구 세포를 동원한다는 것을 나타냈다.
Sheridan 등은 예후가 불량한 비-골수성 악성 질환이 있는 17명의 환자에서 PBPC를 동원하기 위해 G-CSF(6일 동안 12μg/kg/일) 단독의 사용을 조사했다. 평균 총 33 × 104 CFU-GM/kg이 수확되었다. 유사하게, G-CSF(10μg/kg/일)는 호지킨병 또는 NHL이 있는 34명 환자에서 PBPC를 적절하게 동원하여, 중앙값 32.6 × 104 CFU-GM 세포/kg 및 2.8 × 106 CD34+ 세포/kg의 수확을 허용했다. De Arriba 등은 10명 유방암 환자에서 G-CSF 단독(0.84 ± 0.1μg/kg/일)으로 동원에 이어서, 각각 제1 및 제2 백혈구성분채집술 후 0.77 × 106 CD34+ 세포/kg 및 1.42 × 106 CD34+ 세포/kg의 평균 수율을 보고했다.
G-CSF 용량-반응 효과. 동원 용량-반응 효과는 건강한 성인 및 환자에서 분명하다. G-CSF 용량을 5μg/kg/일에서 10μg/kg/일로 증가시키면 말초 혈액의 CD34+ 함량이 기준선에 비해 7배수에서 28-배수로 증가했다.
유사하게, G-CSF의 용량을 10μg/kg/일에서 24μg/kg/일로 증가시키면 CD34+ HSPC 수율이 유의하게 개선된다(11.32 × 107/kg 세포 대 48.25 × 107/kg 세포).
동원된 PBPC의 특성화는 또한 투여된 G-CSF 용량의 크기에 의해 영향을 받을 수 있다. G-CSF의 용량이 100에서 200μg/㎡로 증가될 때 덜 성숙한 전구체의 순환으로의 증가된 동원(즉, 혼합된 집락-형성 세포, CD34+ CD33- 세포 및 CD34+ HLA-DR- 세포)이 발생할 수 있다.
실제 실시예(G-CSF): HSPC 동원에 대한 현행 복용량 권장에 기반하여, 필그라스팀 또는 레노그라스팀 10μg/kg/일을 새로운 동원으로 투여하거나 화학 요법(Amgen; Chugai Pharma UK Ltd/Rh
Figure pct00019
ne-Poulenc Rorer)과 병용하여 제공하는 경우 필그라스팀 또는 레노그라스팀에 대한 5g/kg/일을 적어도 4일 동안 투여한다. 바이러스 벡터 주입은 5일차에 개시하고 3 연속 일 동안 계속할 수 있다.
GM-CSF: GM-CSF는 또한 암 환자에서 최대 7일 동안 연속 정맥내 주입에 의해 4-64μg/kg/일의 용량으로 HSPC를 동원하는데 효과적이어서 말초 혈액에서 4- 내지 18-배수 증가된 HSPC를 초래한다.
HSPC 동원은 GM-CSF 단독을 사용하여 달성될 수 있지만, 전구 세포 동원을 위해 GM-CSF를 사용하는 가능성이 확인되었지만 G-CSF 단독을 사용한 동원보다 우월하다는 증거는 없다는 점에 유의해야 한다.
Hohaus 등에 의한 이중-맹검 연구에서, 재발된 호지킨병이 있는 26명 환자가 화학요법을 받았고 화학요법에 이어서 첫째날에 시작하는 G-CSF(5μg/kg/일, N = 12) 또는 GM-CSF(5μg/kg/일, N = 14)를 받도록 무작위화되었다. CD34+ 세포의 중앙값 수율에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(G-CSF 및 GM-CSF에 대해 각각 7.6 × 106 대 5.6 × 106 CD34+ 세포/kg).
Villeval 등은 37명 환자를 0.3-30μg/kg/일 피하주사 또는 0.3-20μg/kg/일 짧은 정맥내 주입으로 치료하였고 혈액 GM-CFC의 수준이 4-5일 치료 후 유의하게 상승했고 추가로 명확한 용량-반응 효과가 있었음을 발견하였다.
GM-CSF에 의해 동원된 HSPC 모집단의 CFU-GM 함량은 125μg/m2에 이르는 우수한 수율을 생성하는 250μg/m2 용량으로 용량 반응성인 것으로 나타난다.
그러나, 4일 동안 G-CSF(5μg/kg/일) 또는 GM-CSF(5μg/kg/일) 단독의 투여는 기준선에 비해 CFU-GM의 수확에서 극적인 증가(각각 35.6 및 33.7-배수)를 생성한 반면, 이미 7일의 GM-CSF(5μg/kg/일)를 투여받은 환자에게 추가 5일 동안 G-CSF(5μg/kg/일)의 투여는 기준선에 비해 HSPC에서 80-배수 증가를 초래했다는 것을 인지해야 한다.
그러나, 건강한 대상체에서, G-CSF(5μg/kg/일) 플러스 GM-CSF(5μg/kg/일)의 조합으로 동원은 G-CSF(10μg/kg/일) 단독으로 동원과 비교할 때 수확 수율에서 유의한 증가를 생성하지 않았다(각각 평균, 101 × 106 CD34+ 세포/kg 대 119 × 106 CD34+ 세포/kg).
실시예 37
동원을 위한 화학요법 플러스 조혈 성장 인자 요법.
화학요법-기반 동원 요법 안으로 조혈 성장 인자의 도입의 목적은 조기 항암 치료를 지원하면서 HSPC 수율을 증강시키는 것이다. 화학요법 후 조혈 성장 인자의 추가는 화학요법 단독과 비교하여 동원되는 HSPC의 수를 유의하게 증가시킨다.
언급된 바와 같이, 동원 요법에 화학요법의 함입은 일부 종양의 치료의 신속한 개시를 위해 중요할 수 있다. 그러나, 이것이 필요하지 않은 경우 화학요법의 부작용을 신중하게 고려해야하고 조혈 성장 인자-단독 동원 요법이 더 적절할 수 있다. 또한, 반복된 화학요법 플러스 G-CSF는 G-CSF 단독으로 동원 후보다 더 적은 장기 배양 개시 세포(LTC-IC)의 유도로 이어질 수 있다.
다양한 조합 요법이 사용되었고, 최적의 투여량 또는 일정에 관한 합의된 권장사항은 없지만, 4-7g/㎡에서 시클로포스파미드 플러스 5μg/kg/일에서 G-CSF의 조합이 일반적으로 사용된다.
클리닉에서의 요법
G-CSF 플러스 시클로포스파미드: G-CSF와 높은-용량 시클로포스파미드(4-7g/㎡)의 조합은 혈액에서 CD34+ HSPC 수준의 수율을 향상시키는 것으로 나타났다.
HSPC의 수율을 개선하기 위해 더 높은 용량의 시클로포스파미드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 다발성 골수종이 있는 환자는 높은-용량 시클로포스파미드 7g/㎡ 플러스 G-CSF(300μg/일)로 동원될 수 있어, 시클로포스파미드 4g/㎡ 플러스 G-CSF로 얻을 수 있는 것보다 >2.5 × 106 CD34+ 세포/kg의 훨씬 더 높은 수율을 초래할 수 있다.
G-CSF 플러스 에토포사이드: 에토포사이드는 NHL, 호지킨병 및 덜한 정도로 유방암의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 그러한 악성종양이 있는 환자의 동원 요법에 포함시키는 것은 동원 단계 동안 치료를 제공하는데 논리적이다.
예를 들어, 유방암, NHL 또는 호지킨병이 있는 환자는 24시간에 걸쳐 지속적인 정맥내 주입에 더하여 에토포사이드 주입의 완료 후 48시간에 시작하는 G-CSF(5μg/kg/일)에 의해 높은-용량 에토포사이드(2g/㎡)로 동원된 HSPC를 가졌다.
동원 요법은 백혈구 수가 1 × 109/L(에토포사이드-후 중앙값 10일, 범위 7-16일)로 회복된 첫째날부터 시작하여 측정된, 각각 호지킨병, NHL 및 유방암이 있는 환자에서 동원된 24 × 106 CD34+ 세포/kg(범위: 9.5-27.7 × 106/kg), 28.0 × 106 CD34+ 세포/kg(범위: 1.7-81.8 × 106/kg), 22.7 × 106 CD34+ 세포/kg(범위: 2.7-79.3 × 106/kg)의 중앙값 수율에 의해 입증된 바와 같이 유효하였다.
G-CSF 플러스 시클로포스파미드 플러스 에토포사이드: HSPC 동원은 또한 유방암, 골수종 및 기타 악성종양이 있는 환자에서 G-CSF가 있거나 없는 높은-용량 시클로포스파미드(4g/㎡) 플러스 에토포사이드(600mg/㎡)에 이어서 달성될 수 있다. 동원 요법에 G-CSF의 함입은 시클로포스파미드 및 에토포사이드 단독으로의 동원에 이어서보다 거의 5-배수 더 많은 CD34+ 세포를 갖는 수율을 야기했다.
G-CSF 플러스 조합 화학요법: 1일차에 5-플루오로우라실(500mg/㎡), 에피루비신(120mg/㎡) 및 시클로포스파미드(500mg/㎡)로 조합 화학요법에 이어서 2일차부터 G-CSF(10μg/kg/일)는 유방암이 있는 환자에서 중앙값 17.7 × 106(범위: 9.4-50.6 × 106)의 CD34+ 세포/kg을 초래했다.
유사하게, 예를 들어 파클리탁셀을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 화학요법 약물의, 시클로포스파미드 플러스 G-CSF를 조합하는 요법에 추가 첨가는 동원에서 추가 개선을 생성할 수 있다.
실시예 38
임상 HIV 예방
이전에, HIV-양성이고 CCR5Δ32 동형접합 공여자로부터 동종이계 골수 이식을 받은 2명 환자("베를린" 및 "런던" 환자로 지칭됨(R.K. Gupta et al. Nature 2015)가 검출가능한 바이러스 혈증 포스트-HSC 이식의 완전한 부재 및 관해를 나타내었다. 따라서, HSC로부터 CCR2 및/또는 CCR5를 녹아웃하는 것은 HIV 감염을 예방하거나 이미 HIV에 바이러스 감염된 환자에서 관해를 도입하는 실행가능한 방법이다. 비-복제 레트로바이러스 벡터(pBA-9b)는 HSC로부터 CCR5 또는 CCR2 유전자 발현을 감소시키거나 녹아웃시키는 여러 메카니즘 중 하나를 함유하도록 조작된다. 일 실시예에서, 벡터는 CCR5를 녹아웃하도록 CRISPR/CAS9 및 가이드 RNA를 인코딩한다(도 18a). 또 다른 실시예에서, 벡터는 CCR2를 녹아웃하도록 CRISPR/CAS9 및 가이드 RNA를 인코딩한다(도 18b). 추가의 실시예에서, 벡터는 CCR5 및 CCR2 둘 모두를 녹아웃하도록 CRISPR/CAS9 및 가이드 RNA를 인코딩한다(도 18c). 추가의 실시예에서, 벡터는 낙타류 및 상어 항체 또는 다른 단백질 결합 분자 예컨대 다르핀, 아피머, 하이카머 등을 포함하는 단일 사슬 항체를 인코딩하며 U.H.Wiedle et al. Cancer Genomics & Proteomics 10: 155-168, 2013; K.Skrlec et al. Trends inBiotechnology,33:408-418, 2015), 이는 표적 세포 내에서 생성되고 CCR5 단백질의 활성을 차단한다.
추가 실시형태는 CCR5 및 CCR2가 원하는 T 세포 모집단에서 녹아웃되도록 계통 특이적 프로모터의 첨가를 포함한다. 이 실시예에서, CRISPR/CAS9는 CD3 프로모터에 의해 구동되어 CRISPR/CAS9의 발현이 벡터에 의한 포스트-HSC 형질도입 및 후속 HSC 성숙으로부터 T 세포 계통에서 발생한다(도 18d). CD4 및 CD8 프로모터를 포함하는 추가의 T 세포 프로모터가 치환될 수 있다.
추가 실시형태에서 벡터는 낙타류 및 상어 항체 또는 다른 단백질 결합 분자 예컨대 다르핀, 아피머, 하이카머 등을 포함하는 단일 사슬 항체를 인코딩하며(U.H. Wiedle et al. Cancer Genomics & Proteomics 10: 155-168, 2013; K.Skrlec et al. Trends in Biotechnology, 33:408-418, 2015), 이는 표적 세포 내에서 생성되고 CCR5 및/또는 CCR2 단백질의 활성을 차단한다(도 19a-d).
또 다른 실시형태에서, CRISP/CAS 9는 CRISPR/CAS9 시스템에서와 동일한 구성을 사용하여 CCR5 및/또는 CCR2의 발현을 녹다운시키는 shRNA 또는 마이크로RNA 또는 사일런싱 RNA(모두 siRNA로 지칭됨)로 대체된다(도 20a-d).
HIV 감염된 환자의 예방 및 관해를 유도하는 것에 부가하여, 도 21에 기재된 벡터는 다발성 경화증으로 진단된 환자를 치료하는데 사용된다. 이 실시형태에서, CRISPR/CAS9 또는 siRNA는 HSC 계통 특이적 CD3 프로모터를 사용하여 T 세포로부터 CCR5 및 CCR2 발현을 제거하거나 감소시키는데 사용된다. 부가하여, 벡터는 치료의 종료 또는 급성 염증 에피소드를 중단시켜 TK 발현 세포를 사멸시키는 독성 화학물질로 전환되는 TK 전구약물을 환자에게 제공하도록 하는 세포 사멸 스위치인 티미딘 키나제(TK)를 함유한다(도 21).
인간 예:
1. HIV로 바이러스 감염된 환자에게 레트로바이러스 벡터를 억제하는 것으로 알려졌거나 의심되는 항바이러스제를 2-10일 동안 제거한 다음, CCR5를 녹아웃시키기 위해 CRISPR/CAS9 및 가이드 RNA에 대한 이식유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 임상적으로 허용가능한(GMP) 제제의 E6, E7, E8 E9, E10, E11 또는 E12의 용량을 투여한다. 벡터 주입은 본 명세서의 실시예에 기술된 바와 같이, 상대적으로 접근불가능한 골수로부터 접근가능한 말초로 HSC를 동원하는 적절한 어쥬번트로 보완된다. 생착-후 환자의 T 세포는 시간이 지남에 따라 CCR5 발현이 소실되고 혈액 내 양성 세포에서 HIV DNA 양성 T 세포의 수준이 감소되고 형질도입된 HIV-유리 T 세포의 수준이 증가된다. 환자 HSC에서 녹아웃된 CCR5의 생산적 생착 및 후속 T 세포 재생 후, 환자 T 세포의 대부분은 CCR5 음성으로 전환되고 1-3개월 이내에 HIV 감염에 내성이 있다. 시간이 지남에 따라, HIV는 환자의 신체에서 제거되고 환자는 HIV에 대한 장기 내성과 함께 장기 관해에 들어간다.
2. 질환의 초기 염증 단계에서 다발성 경화증 환자는 HSC 및 후손 T 세포 포스트-벡터 형질도입에서 CCR2/5를 침묵시키도록 설계된 PC3 세포에서 역가가 E8 TU/ml 이상인 레트로바이러스 벡터의 GMP 제제로의 투여를 겪는다. 투여 매개변수는 적절한 동원화 제제에 의한 전처리로 HIV 환자에게 사용되는 것과 동일하거나 유사하다. CCR2 및 CCR5의 손실은 T 세포가 MS-관련된 염증으로 이동하는 것을 예방하고 조직 손상을 예방한다. 부가하여, 간시클로비르는 MS의 급성기 동안 MS 환자에게 제공되어 현저한 T 세포의 고갈 및 환자에서 MRI-측정된 병변의 감소로 이어진다. 그런 다음 환자는 HSC 모집단을 회복하기 위해 반복적인 벡터/동원화 제제 요법을 겪는다. MRI-검출가능한 병변에서 감소는 환자의 T 세포에서 CCR2/5의 손실과 연관된다.
3. 소아 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍 중증 복합 면역-결핍(SCID) 환자에게 형질도입된 세포에서 인간 ADA의 발현을 야기하는 PC3 세포에 역가 E8 TU/ml 이상을 갖는 레트로바이러스 벡터의 GMP 제제가 투여된다. 용량은 E6 내지 E12 총 TU 사이이고 HSC 동원화 제제로 적절한 복용이 선행된다. 소아 ADA SCID 환자 안으로 생체외 형질도입된 자가 줄기 세포의 통상적인 이식 후 정상 또는 유사-정상 면역 기능으로의 회복은 A.Aiuti et al. NEJM 2009에 의해 기술된 바와 같다.
실시예 40
G-CSF가 없거나 또는 있는 플레릭사포를 사용한 효율적인 HSC 동원을 위한 상세한 인간 복용 프로토콜.
플레릭사포는 단독으로 사용되거나 G-CSF에 대한 부가물로 사용되는 CD34+ HSPC를 특이적으로 동원하는데 사용될 수 있다. 사용된 용량은 플레릭사포의 경우 5일차에 160μg/kg x 1이고, G-CSF의 경우 0, 1, 2, 3 및 4일차에 10μg/kg이거나, 단독으로 사용하는 경우 플레릭사포의 경우 240μg/kg이다. 240μg/kg(피하)에서 단일 용량의 플레릭사포는 전통적인 G-CSF 기반 동원에 대해 더 빠르고 가능하기로는 덜 독성이고 번거로운 대안을 제공할 수 있다. 그러나, G-CSF의 조합(플레릭사포와 함께, 4일차 저녁에 시작하여 최대 4일 동안 매일 지속하는, 최대 8일 동안 매일 피하로 10μg/kg, 피하로 240μg/kg의 (매일) 용량이 FDA의 승인을 받았고 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종이 있는 환자의 자가 줄기 세포 동원 및 이식에 권장된다.
플레릭사포의 통상적인 용량은 240μg/kg이지만 이 용량은 (건강한 개인의 경우) 480μg/kg까지 안전하게 증가될 수 있다. 240μg/kg 플레릭사포의 피하 주사 후, 혈액 내 CD34+ HSPC 수는 1-2 세포/μL에서 8-10시간 내에 대략적으로 25 세포/μL의 피크로 상승하고 점차 감소하지만 여전히 주입-후 24시간까지 대략적으로 10 세포/μL이다. 480μg/kg 플레릭사포의 피하 주사가 투여되면, 혈액 내 CD34+ HSPC 수는 1-2 세포/μL에서 8-10시간 내에 대략적으로 30 세포/μL의 피크로 증가하고 점차 감소하지만 여전히 주입-후 24시간까지 대략적으로 20 세포/μL이다.
실시예 41
실데나필(비아그라) 플러스 플레릭사포를 사용한 HSC의 동원을 위한 상세한 마우스 프로토콜.
비아그라는 AMD3100(2.5mg/kg)의 단일 피하(SQ) 주사 1시간 전에 경구 위관영양법(OG)(3mg/kg)을 통해 마우스에게 1회 투여되었다. 대조군 마우스는 매일 1회(250mg/kg) 투여된 5-일 G-CSF 처리를 받았다. AMD3100 1시간 후 또는 G-CSF 24시간 후 관류에 의해 혈액을 수집하고 유세포분석 및 치명적으로 조사된 수령체의 다중계통 재구성으로 분석했다.
5일, 다중용량 G-CSF 동원은 2-시간 비아그라 + AMD3100 동원 프로토콜보다 유의하게 더 양호하지 않았다. 더 높은 용량의 비아그라(10 및 30mg/kg)가 또한 AMD3100-매개된 HSC 동원을 개선했지만 3mg/kg보다 더 효과적이지 않았다. 더욱이, 단일 AMD3100 주사와 조결된 3-일 경구 비아그라 요법은 AMD3100 단독보다 혈류에서 유의하게 더 많은 HSC를 유도했다. 대조군 마우스와 비교하여, 표현형 HSC의 수는 AMD3100 단독, AMD3100 플러스 단일 비아그라 용량 및 AMD3100 플러스 3일의 비아그라로 각각 3-, 7.5- 및 8.5-배수 증가했다. 신속한 2-시간(2,500 HSC/마우스) 및 3-일(2,800 HSC/마우스) 비아그라/AMD3100 조합에서 혈류 내 HSC의 수는 4 연속 일의 G-CSF 주사 후 1일에 존재하는 수와 유사했다(3,400 HSC/마우스).
실시예 42
RNV로 생체내 조혈 줄기/전구 세포(HSPC) 형질도입.
마우스 HSPC의 프로파일은 Lin-, Sca1+, Kit1HI(LSK)였다.
HSPC는 GFP를 인코딩하는 높은 역가(>E8 TU/ml) 정제된 RNV로 생체내 형질도입 후 말초 혈액(PB), 비장(S) 및 골수(BM)로부터 수확되었고, 2가지 상이한 검정인: 콜로니 형성; 및 FACS 분석을 특징으로 하였다.
동원 프로토콜은 표적 동물(Balb/c 마우스)에서 작동하는 것으로 나타났다. HSPC를 동원하기 위해 Balb/c 마우스가 사용되었다. 제1 그룹(그룹 1)은 다음과 같이 시클로포스파미드 + GCSF + AMD3100을 사용하여 동원되었다:
o 시클로포스파미드 + G-CSF + AMD3100 동원 요법
o 0일차: 시클로포스파미드(CY)(ip) 20g 마우스당 4mg/100μL(200mg/kg/일)
o 1일차: G-CSF(sc) 일당 20g 마우스당 5μg/μL(250μg/kg/일)
o 2일차: G-CSF(sc) 일당 20g 마우스당 5μg/μL(250μg/kg/일)
o 3일차: G-CSF(sc) 일당 20g 마우스당 5μg/μL(250μg/kg/일)
o 4일차: AMD3100(sc) G-CSF의 마지막 용량 후 12-14시간 이내에 20g 마우스당 100μg/μL(5mg/kg) 주사
AMD3100 투여 1시간 후 말초 혈액(PB), 비장(S) 및 골수(BM)를 수확하고 PB, S 및 BM에서 HSPC(마우스 lin-, c-kit+, Sca-1+)의 존재에 대해 FACS로 분석했다.
제2 그룹(그룹 2)은 동원되지 않았다.
FACS 분석의 결과는 표 10에 요약되어 있다.
표 10: PB, 비장 및 골수에서 HSPC(Lin-, Sca1+, Kit1+)의 동원의 FACS 분석으로부터 결과의 요약. 개별 숫자는 개별 마우스로부터의 값을 나타낸다.
Figure pct00020
이들 실험은 말초 안으로 HSPC의 동원을 보여주었다.
생체내 조혈 줄기/전구 세포(HSPC) 형질도입.
다음으로, (A2 실험) 실험이 상기와 같이 수행되었지만 2시간 동안 생체내 레트로바이러스(RV) 형질도입이 따랐다. Balb/c 마우스의 3개 그룹이 사용되었다: 그룹 1-동원화, RV 없음(n=3 마우스 #1,2,3); 그룹 2 - 동원화 + RV(n=6 마우스 #4, 5, 6, 7, 8, 9); 및 그룹 3-동원화되지 않음, RV 없음(대조군)(n=1 마우스 #10).
말초 혈액(PB), 비장(S) 및 골수(BM)를 RV 형질도입 2시간 후에 수확하였다. PB, S 및 BM 세포를 3일 동안 배양하고 GFP+ HSPC(Sca+ Kit+인 LIN- 세포)에 대해 FACS에 의해 분석했다. GFP+ HSPC의 다중계통 재구성은 5일 동안 메틸셀룰로오스에서 PB, S 및 BM 세포를 배양하여 HSPC 콜로니가 GFP+인지 확인함에 의해 수행되었다.
다음으로, (A3 실험) 실험이 상기와 같이 수행되었지만 2일 동안 생체내 레트로바이러스(RV) 형질도입이 따랐다. Balb/c 마우스의 3개 그룹이 사용되었다: 그룹 1-동원화, RV 없음(n=3 마우스 #1,2,3); 그룹 2 - 동원화 + RV(n=6 마우스 #4, 5, 6, 7, 8, 9); 및 그룹 3-동원화되지 않음, RV 없음(대조군)(n=1 마우스 #10).
말초 혈액(PB), 비장(S) 및 골수(BM)를 RV 형질도입 2일 후에 수확하였다. PB, S 및 BM 세포를 3일 동안 배양하고 GFP+ HSPC(Sca+ Kit+인 LIN- 세포)에 대해 FACS에 의해 분석했다. GFP+ HSPC의 다중계통 재구성은 10일 동안 메틸셀룰로오스에서 PB, S 및 BM 세포를 배양하여 HSPC 콜로니가 GFP+인지 확인함에 의해 수행되었다.
비장에서 GFP+ 세포의 사진에 대해 도 23을 참조한다. 표 11은 실험 A2의 결과를 나타낸다.
표 11: PB S, & BM으로부터 HSPC의 RNV-GFP로 동원 및 형질도입; 0.1% 미만 숫자는 FACS 기계의 신뢰할 수 있는 검출의 한계이므로 0으로 계산되었다
Figure pct00021
표 12: (실험 A2) 2시간 동안 생체내 RNV 형질도입에 이은 HPSC 동원: 말초 혈액(PB); CFU: 콜로니 형성 단위, M: 단핵구/대식세포, G: 과립구, GM: 과립구/대식세포, GEMM: 과립구/적혈구/대식세포/거핵구. 1+2+3: 동원화되었지만 형질도입되지 않은 음성 대조군으로부터 풀링된 말초 혈액, 4부터 9: 개별 동원화된 마우스 및 RNV-형질도입된 마우스로부터 말초 혈액, 10: 비-동원화된 형질도입되지 않은 대조군의 말초 혈액:
Figure pct00022
표 12는 MethoCult GFM3434(Stem Cell Technologies)에서 5일 동안 12-웰 플레이트에서 웰당 4x104 말초 혈액(PB) 세포를 배양한 후 얻은 GFP+ 조혈 줄기/전구 세포(HSPC) 유래된 콜로니의 수를 나타낸다.
표 13: (실험 A2) 2시간 동안 생체내 RV 형질도입에 이은 HPSC 동원: 비장(S); CFU: 콜로니 형성 단위, M: 단핵구/대식세포, G: 과립구, GM: 과립구/대식세포, GEMM: 과립구/적혈구/대식세포/거핵구. 1+2+3: 동원화되었지만 형질도입되지 않은 음성 대조군으로부터 풀링된 비장세포, 4부터 9: 개별 동원화된 마우스 및 RNV-형질도입된 마우스로부터 비장세포(주: 기술적인 어려움으로 인해 #7, #8에서 콜로니가 형성되지 않음), 10: 비-동원화된 형질도입되지 않은 대조군으로부터 비장세포:
Figure pct00023
표 13은 MethoCult GFM3434(Stem Cell Technologies)에서 5일 동안 12-웰 플레이트에서 웰당 2x105 비장(S) 세포를 배양한 후 얻은 GFP+ 조혈 줄기/전구 세포(HSPC) 유래된 콜로니의 수를 나타낸다.
표 14: (실험 A2) 2시간 동안 생체내 RV 형질도입에 이은 HPSC 동원: 골수(BM); CFU: 콜로니 형성 단위, M: 단핵구/대식세포, G: 과립구, GM: 과립구/대식세포, GEMM: 과립구/적혈구/대식세포/거핵구. 1+2+3: 동원화되었지만 형질도입되지 않은 음성 대조군으로부터 풀링된 골수, 4부터 9: 개별 동원화된 마우스 및 RNV-형질도입된 마우스로부터 골수, 10: 비-동원화된 형질도입되지 않은 대조군으로부터 골수:
Figure pct00024
표 14는 MethoCult GF M3434(StemCell Technologies)에서 5일 동안 12-웰 플레이트에서 웰당 3x104 골수(BM) 세포를 배양한 후 얻은 GFP+ 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)-유래된 콜로니의 수를 나타낸다.
표 15. (실험 A3) 2일 동안 생체내 RNV 형질도입에 이은 HPSC 동원: CFU: 콜로니 형성 단위, M: 단핵구/대식세포, G: 과립구, GM: 과립구/대식세포, GEMM: 과립구/적혈구/대식세포/거핵구. 1+2+3: 동원화되었지만 형질도입되지 않은 음성 대조군으로부터 풀링된 말초 혈액, 4부터 9: 개별 동원화된 마우스 및 RV-형질도입된 마우스로부터 말초 혈액(주: #5는 RNV 주사 후 사망하고 분석에서 제거됨), 10: 비-동원화된 형질도입되지 않은 대조군으로부터 말초 혈액:
Figure pct00025
표 15는 MethoCult GF M3434(StemCell Technologies)에서 7일 동안 12-웰 플레이트에서 웰당 4x104 말초 혈액(PB) 세포를 배양한 후 얻은 GFP+ 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)-유래된 콜로니의 수를 나타낸다.
표 16: (실험 A3) 2일 동안 생체내 RV 형질도입에 이은 HPSC 동원: 비장(S); CFU: 콜로니 형성 단위, M: 단핵구/대식세포, G: 과립구, GM: 과립구/대식세포, GEMM: 과립구/적혈구/대식세포/거핵구. 1+2+3: 동원화되었지만 형질도입되지 않은 음성 대조군으로부터 풀링된 비장세포, 4부터 9: 개별 동원화된 마우스 및 RNV-형질도입된 마우스로부터 비장세포(주: #5는 RV 주사 후 사망하고 분석에서 제거됨; #8에서는 콜로니가 형성되지 않음), 10: 비-동원화된 형질도입되지 않은 대조군으로부터 비장세포(또한 콜로니가 관찰되지 않음):
Figure pct00026
표 16은 MethoCult GF M3434(StemCell Technologies에서 7일 동안 12-웰 플레이트에서 웰당 2x105 비장(S) 세포를 배양한 후 얻은 GFP+ 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)-유래된 콜로니의 수를 나타낸다.
표 17: (실험 A3) 2일 동안 생체내 RNV 형질도입에 이은 HPSC 동원: 골수(BM); CFU: 콜로니 형성 단위, M: 단핵구/대식세포, G: 과립구, GM: 과립구/대식세포, GEMM: 과립구/적혈구/대식세포/거핵구. 1+2+3: 동원화되었지만 형질도입되지 않은 음성 대조군으로부터 풀링된 골수, 4부터 9: 개별 동원화된 마우스 및 RNV-형질도입된 마우스로부터 골수(주: #5는 RNV 주사 후 사망하고 분석에서 제거됨), 10: 비-동원화된 형질도입되지 않은 대조군으로부터 골수.
Figure pct00027
표 17은 MethoCult GF M3434(StemCell Technologies)에서 7일 동안 12-웰 플레이트에서 웰당 3x104 골수(BM) 세포를 배양한 후 얻은 GFP+ 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)-유래된 콜로니의 수를 나타낸다.
이들 실험(A2 및 A3)은 100-200μL에서 RNV의 약 2E7 TU의 생체내(IV) 전달이 형질도입되는 HSPC 유래된 CFU의 최대 ~7%를 산출할 수 있음을 나타낸다.
추가 실험(실험 B1)이 CD34+ 세포 형질도입을 분석하기 위해 수행되었다. 두 그룹의 CD34+ 세포가 사용되었다: 그룹 1 - CD34+, RV 없음(234 웰-플레이트에서 1 웰); 그룹 2 - CD34+ 플러스 RV(24 웰-플레이스에서 2 웰). 세포를 해동하고 배양하고 무혈청 SFEMII+CC100 사이토카인 칵테일(StemCell)에서 확장했다. 세포를 100μl의 CD34+ 세포(3x105)로 도말하고(24-웰 플레이트에서 3 웰), 100μl의 RNV-GFP 바이러스를 총 부피 2ml로 그룹 2 웰에 첨가하였다.
세포를 15ml 튜브에 수집하고 PBS로 세정하고 24 웰 플레이트에서 새로운 웰 안으로 재도말했다. 세포를 BBMM_CC100 사이토카인 확장 인자에서 추가로 2일 동안 배양하고 GFP-양성 CD34+ 세포의 존재에 대해 FACS로 분석하였다. 부가하여. 15일 동안 메틸셀룰로오스에서 CD34+ 세포를 배양함에 의해 GFP+ HSPC의 다중계통 재구성을 수행하여 HSPC 콜로니가 GPF+인지 확인했다.
표 18: (실험 B1) 2시간 동안의 인간 CD34+ HSPC 시험관내 RNV 형질도입: 형질도입 대조군 연구; CFU: 콜로니 형성 단위, M: 단핵구/대식세포, G: 과립구, GM: 과립구/대식세포, GEMM: 과립구/적혈구/대식세포/거핵구. (형질도입되지 않음: 형질도입되지 않은 대조군 CD34+ 세포; RV TD 1, 2: RV 형질도입 복제):
Figure pct00028
표 18은 MethoCult Classic(GF H4434, StemCell Technologies)에서 15일 동안 35mm 접시당 5x102 인간 CD34+ 세포를 배양한 후 얻은 GFP+ 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)-유래된 콜로니의 수를 나타낸다.
이 실험(B1)은 마우스 줄기 세포의 생체내 형질도입을 제공하는 RNV의 제제가 또한 인간 CD34+ HSPC를 형질도입할 수 있음을 나타낸다.
다수의 실시형태가 개시내용을 예시하기 위해 상기에 제시되었다. 다음 청구범위는 출원인이 그들의 발명으로 간주하는 것을 추가로 제시한다.
<110> Abintus Bio, Inc. <120> VECTORS AND METHODS FOR IN VIVO TRANSDUCTION <130> 00156-002WO1 <140> Not yet assigned <141> 2021-05-11 <150> US 63/023,191 <151> 2020-05-11 <150> US 63/133,224 <151> 2020-12-31 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1662 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBA-9b vRNA genome with multiple cloning site <400> 1 gcgccagucc uccgauugac ugagucgccc ggguacccgu guauccaaua aacccucuug 60 caguugcauc cgacuugugg ucucgcuguu ccuugggagg gucuccucug agugauugac 120 uacccgucag cgggggucuu ucauuugggg gcucguccgg gaucgggaga ccccugccca 180 gggaccaccg acccaccacc gggagguaag cuggccagca acuuaucugu gucuguccga 240 uugucuagug ucuaugacug auuuuaugcg ccugcgucgg uacuaguuag cuaacuagcu 300 cuguaucugg cggacccgug guggaacuga cgaguucgga acacccggcc gcaacccugg 360 gagacguccc agggacuucg ggggccguuu uuguggcccg accugagucc aaaaaucccg 420 aucguuuugg acucuuuggu gcaccccccu uagaggaggg auaugugguu cugguaggag 480 acgagaaccu aaaacaguuc ccgccuccgu cugaauuuuu gcuuucgguu ugggaccgaa 540 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ccacaucggc gauacucucu 3960 uuacacuguu ccgggcacca gagcugcucg caccuaaugg agaucuguac aauguuuucg 4020 cuugggcccu cgauguccug gcuaagcggc uccggccuau gcacguguuc auccucgacu 4080 acgaccagag cccagcuggu ugucgggaug cucuccugca acugaccagc gggauggugc 4140 agacacacgu uacuacuccc ggcuccaucc ccacuaucug ugaccucgcc cggacauuug 4200 cccgggaaau gggcgaagcc aacugaucgu gcggucccgc ggcgccccgc cucgaugcgg 4260 ucccgcggcg ccccgccugc augcgguccc gcggcgcccc gccucuacgc ggucccgcgg 4320 cgccccgccu auuauggggu auuugacaaa cugacacgua ugggguauuu gacaaacuga 4380 caucgauggg guauuugaca aacugacauc acugggguau uugacaaacu gacagucgac 4440 cuaugcacug ucuuagacau ugauuauuga cuaguuauua auaguaauca auuacggggu 4500 cauuaguuca uagcccauau auggaguucc gcguuacaua acuuacggua aauggcccgc 4560 cuggcugacc gcccaacgac ccccgcccau ugacgucaau aaugacguau guucccauag 4620 uaacgccaau agggacuuuc cauugacguc aaugggugga guauuuacgg uaaacugccc 4680 acuuggcagu acaucaagug uaucauaugc caaguacgcc cccuauugac gucaaugacg 4740 guaaauggcc cgccuggcau uaugcccagu acaugaccuu augggacuuu ccuacuuggc 4800 aguacaucua cguauuaguc aucgcuauua ccauggugau gcgguuuugg caguacauca 4860 augggcgugg auagcgguuu gacucacggg gauuuccaag ucuccacccc auugacguca 4920 augggaguuu guuuuggcac caaaaucaac gggacuuucc aaaaugucgu aacaacuccg 4980 ccccauugac gcaaaugggc gguaggcgug uacgguggga ggucuauaua agcagagcug 5040 ccaccauggc ccccagaaga gccagaggcu gcagaacccu gggccugccc gcccugcugc 5100 ugcugcugcu gcugagaccc cccgccacca gaggcaacug ggugaacgug aucagcgacc 5160 ugaagaagau cgaggaccug auccagagca ugcacaucga cgccacccug uacaccgaga 5220 gcgacgugca ccccagcugc aaggugaccg ccaugaagug cuuccugcug gagcugcagg 5280 ugaucagccu ggagagcggc gacgccagca uccacgacac cguggaggac cugaucaucc 5340 uggccaacaa cagccugagc agcaacggca acgugaccga gagcggcugc aaggagugcg 5400 aggagcugga ggagaagaac aucaaggagu uccugcagag cuucgugcac aucgugcaga 5460 uguucaucaa caccagcaag cuuggaucca ucgauaaaau aaaagauuuu auuuagucuc 5520 cagaaaaagg ggggaaugaa agaccccacc uguagguuug gcaagcuagc uuaaguaacg 5580 ccauuuugca aggcauggaa aaauacauaa cugagaauag agaaguucag aucaagguca 5640 ggaacagaug gaacagcuga auaugggcca aacaggauau cugugguaag caguuccugc 5700 cccggcucag ggccaagaac agauggaaca gcugaauaug ggccaaacag gauaucugug 5760 guaagcaguu ccugccccgg cucagggcca agaacagaug guccccagau gcgguccagc 5820 ccucagcagu uucuagagaa ccaucagaug uuuccagggu gccccaagga ccugaaauga 5880 cccugugccu uauuugaacu aaccaaucag uucgcuucuc gcuucuguuc gcgcgcuucu 5940 gcuccccgag cucaauaaaa gagcccacaa ccccucacuc ggcgcgccag uccuccgauu 6000 gacugagucg cccggguacc cguguaucca auaaacccuc uugcaguugc a 6051 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLV specific forward primer <400> 26 gcgcctgcgt cggtactag 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLV specific reverse primer <400> 27 gactcaggtc gggccacaa 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MLV Probe sequence <400> 28 agttcggaac acccggccgc 20

Claims (55)

  1. (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) 적어도 하나의 miRNA 표적화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로서,
    여기서 (a) 및 (b)는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에 연결되는, 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, (c) 전구약물을 세포독성 약물로 전환시키는 세포독성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, (a)는 하나 이상의 항원 결합 도메인(들)을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 도메인;
    링커를 인코딩하는 선택적 폴리뉴클레오티드 도메인; 및
    제1 폴리뉴클레오티드 도메인에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오티드 도메인으로서, 여기서 제2 폴리뉴클레오티드 도메인은 막횡단을 인코딩하는, 제2 폴리뉴클레오티드 도메인; 및
    세포내 시그널링 도메인을 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 도메인을 포함하는, 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 도메인은 항체 단편, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 가변 단편, 단일 도메인 항체, 낙타류 VHH 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체 또는 수용체 단편, 또는 이중특이성 항체를 인코딩하는, 재조합 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 링커를 인코딩하는 선택적 폴리뉴클레오티드는 Gly3 서열을 인코딩하는, 재조합 벡터.
  6. 제3항에 있어서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD3γ, CD3ε, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C로 구성된 군으로부터 선택된 구성원으로부터 유래하는, 재조합 벡터.
  7. 제3항에 있어서, 제3 폴리뉴클레오티드 도메인은 CD3 제타, 공통 FeR 감마(FCER1G), Fe 감마 RIIa, FeR 베타(Fe 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12로 구성된 군으로부터 선택된 세포내 시그널링 도메인을 인코딩하는, 재조합 벡터.
  8. 제2항에 있어서, 전구약물을 세포독성 약물로 전환시키는 세포독성 폴리펩티드는 시토신 데아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드, 티미딘 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 통합 벡터인, 재조합 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 재조합 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 비-복제 감마레트로바이러스 벡터인, 재조합 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 miRNA 표적화 서열은 hsa-miR-223-3p, hsa-miR143-3p, hsa-mir182-5p, hsa-miR-10bp, hsa-miR141-3p, has-miR486-5p 및 전기한 것의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 miRNA에 의해 결합되는, 재조합 벡터.
  13. gag 폴리펩티드;
    pol 폴리펩티드;
    env 폴리펩티드; 및
    레트로바이러스 벡터의 캡시드 내에 함유된 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자로서,
    여기서 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로: (R-U5 도메인)-(선택적 신호 펩티드 코딩 서열 도메인)-(결합 도메인 코딩 서열 도메인)-(선택적 힌지/링커 코딩 서열 도메인)-(막횡단(TM) 코딩 서열 도메인)-(miRNA 표적 도메인(들))-(U3-R 도메인)을 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  14. 제13항에 있어서, R-U5 도메인은 뉴클레오티드 1 내지 약 뉴클레오티드 145의 서열번호: 25와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  15. 제13항에 있어서, 결합 도메인 코딩 서열은 신호 서열이 선행되는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  16. 제13항에 있어서, 결합 도메인 코딩 서열은 선택적인 링커/스페이서 도메인 서열이 뒤따르는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  17. 제13항에 있어서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 사멸 스위치 도메인 코딩 서열을 추가로 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  18. 제17항에 있어서, 사멸 스위치 코딩 도메인은 전구약물을 세포독성 약물로 전환시키는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 IRES를 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  19. 제18항에 있어서, 폴리펩티드는 티미딘 키나제(TKO) 활성 또는 시토신 데아미나제(CD) 활성을 갖는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  20. 제13항에 있어서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 miRNA 표적화 서열을 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  21. 제20항에 있어서, 적어도 하나의 miRNA 표적화 서열은 복수의 miRNA 표적화 서열을 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  22. 제21항에 있어서, 복수의 miRNA 표적화 서열은 동일한, 재조합 레트로바이러스 입자.
  23. 제21항에 있어서, 복수의 miRNA 표적화 서열 중 적어도 2개는 상이한, 재조합 레트로바이러스 입자.
  24. 제13항에 있어서, U3-R 도메인은 약 뉴클레오티드 5537 내지 약 6051의 서열번호: 25와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  25. 제13항에 있어서, 각각의 도메인은 약 1-20 뉴클레오티드의 작은 스페이서 서열에 의해 다른 도메인으로부터 분리될 수 있는, 재조합 레트로바이러스 입자.
  26. 약학적으로 허용가능한 담체에 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항의 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 약학적 조성물.
  27. (i) 항원을 표적화하는 항원 결합 수용체 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터; 및
    (ii) miR-표적화 서열 또는 miR-표적화 카세트;
    (iii) 선택적 사멸 스위치 코딩 도메인; 및
    (iv) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 항원 결합 수용체 작제물은 결합 도메인, 선택적 힌지/링커 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 시그널링 도메인을 포함하는, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 결합 도메인은 질환 또는 장애와 연관된 항원에 대한 특이성을 갖는, 항체, Fv, Fab, (Fab')2, 항체의 중쇄 가변 영역(vH 도메인), 항체의 경쇄 가변 영역(vL 도메인), 단일 도메인 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 항체의 단량체 가변 영역, 낙타류 vHH 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인(예를 들어, DARPIN, 아피바디, 아필린, 애드넥틴, 아피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질), 이의 리간드 또는 단편을 포함하는, 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 지질 엔벨롭을 포함하는, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 엔벨롭은 양쪽성인, 조성물.
  32. 제27항에 있어서, 항원 결합 수용체 작제물은 키메라 항원 수용체를 포함하는, 조성물.
  33. 제27항에 있어서, miR-표적화 서열 또는 miR-표적화 카세트는 표적-외 세포에서 발현되는 miRNA에 대한 하나 이상의 표적화 서열을 포함하는, 조성물.
  34. 제27항에 있어서, 선택적 사멸 스위치는 자살 유전자로부터 코딩 서열을 포함하는, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 자살 유전자는 시토신 데아미나제 활성 또는 티미딘 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물.
  36. 제27항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로: R-U5-(항원 결합 수용체 코딩 서열)-(miR 표적화 서열 또는 카세트)-(선택적 자살 유전자)-U3-R을 포함하는, 조성물.
  37. 제27항 또는 제36항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 감마레트로바이러스 R, U3 및 U5 서열을 포함하는, 조성물.
  38. 제29항에 있어서, 항원은 CD5; CD19; CD123; CD20; CD22; CD24; CD30; CD33, CD34; CD38, CD72; CD97; CD171; CS1(CD2 서브세트 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C-유형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRviii); 강글리오사이드 G2(GD2); 강글리오사이드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4 )bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1(ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양-연관된 당단백질 72(TAG72); CD44v6; 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터루킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(Testisin 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4); 엽산 수용체 알파(FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타(FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 연관(MUC1); 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제; 전립선산 포스파타제(PAP); 신장 인자 2 돌연변이(ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체); 탄산 탈수효소 IX(CAlX); 프로테아솜(프로솜, 마크로페인) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 중단점 클러스터 영역(BCR) 및 아벨슨 뮤어라인 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1(Abl)로 구성된 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2(EphA2); 시알릴 루이스 접착 분자(sLe); 강글리오사이드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDCalp(1- 4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량-흑색종 연관된 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드(OAcGD2); 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질 커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 개방 판독 프레임 61(CXORF61); CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1(PLAC1); globoH 글리코세라마이드의 육당 부분(GloboH); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3(ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TAP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종-연관된 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전좌-변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 중단점; 세포자멸사의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막횡단 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍을 이루는 상자 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수세포종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래된 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제-관련된 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B 1(CYP1B 1); CCCTC-결합 인자(징크 핑거 단백질)-유사(BORIS 또는 각인된 부위 조절기의 브라더), T 세포 3에 의해 인식된 편평 세포 암종 항원(SART3); 쌍을 이루는 상자 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2(SSX2); 진보된 당화 최종 생성물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1(RU1); 신장 유비쿼터스 2(RU2); 콩류; 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 열 충격 단백질 70-2 돌연변이(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; 백혈구-연관된 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체-유사 5(FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1(IGLL1); MPL; 비오틴; c-MYC 에피토프 태그; LAMP1 TROP2; GFR알파4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea(CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL11Ra; IL13Ra2; CD179b-IGL11; TCR감마-델타; NKG2D; CD32(FCGR2A) ; Tn Ag; Tim1-/HVCR1; CSF2RA(GM-CSFR-알파); TGF베타R2; 루이스 Ag; TCR-베타1 사슬; TCR-베타2 사슬; TCR-감마 사슬; TCR-델타 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체(LHR); 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR) ; 성선자극 호르몬 수용체(CGHR 또는 GR) ; CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 엔벨롭 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; KSHV K8.1; KSHV-gH; 인플루엔자 A 혈구응집소(HA); GAD; PDL1; 구아닐릴 사이클라제 C(GCC); 데스모글레인 3(Dsg3)에 대한 자가 항체; 데스모글레인 1(Dsg1)에 대한 자가 항체; HLA; HLA-A; HLA-A2; HLA-B; HLA-C; HLA-DP; HLA-DM; HLA-DOA; HLA-DOB; HLA-DQ; HLA-DR; HLA-G; IgE; CD99; Ras G12V; 조직 인자 1(TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2); P-당단백질; STEAP1; Liv1; 넥틴-4; 크립토; gpA33; BST1/CD157; 낮은 전도도 염화물 채널; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  39. 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 대상체에게 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
  40. 제26항의 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 항-질환 면역을 제공하는 방법으로서, 여기서 조성물은 항원 수용체 결합 작제물을 발현하는 면역 이펙터 세포를 발생시키기 위해 생체내에서 세포를 형질도입하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 조성물은 용량당 103 내지 1011 벡터 변환 단위(TU)를 포함하는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 항원 수용체 결합 작제물은 폴리뉴클레오티드의 miRNA 표적 서열에 결합하는 miRNA를 발현하는 세포에서 발현되지 않는, 방법.
  43. 제40항 또는 제41항에 있어서, 항-질환 면역은 증식성 질환, 전암성 병태, 암, 및 항원 수용체 결합 작제물이 결합하는 질환-연관된 항원의 발현과 연관된 비-암 관련된 적응증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환을 치료하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 암은 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(ALL), B-세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 아세포 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 여포성 림프종, 털이 많은 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 또는 전백혈병 중 하나 이상으로부터 선택된 혈액암인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 암은 결장암, 직장암, 신세포암종, 간암, 폐의 비-소세포암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암 샘, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우암, 중추신경계의 신생물(CNS), 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 메르켈 세포암, 표피양암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 환경적으로 유발된 암, 상기 암의 조합, 및 상기 암의 전이성 병변으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  46. 제40항에 있어서, 벡터는 T-림프구(T-세포), 나이브 T-세포, 기억 T-세포, Treg, NK 세포, 조혈 줄기 세포, 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 세포를 형질도입하는, 방법.
  47. 제26항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 서열번호: 25의 서열을 포함하는, 조성물.
  48. 뮤어라인 백혈병 바이러스(MLV) gag-pol 유전자를 발현하는 세포주를 제1항의 벡터로 형질전환시키는 것을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 생산하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 벡터는 서열번호:1-23 또는 24에 제시된 서열을 포함하는, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항의 방법에 의해 생산된 레트로바이러스.
  51. 세포 또는 조직으로부터 전체 RNA를 단리하는 단계;
    단리물 RNA로부터 서열 라이브러리를 생성하는 단계;
    서열 라이브러리를 서열화하는 단계;
    miRNA 서열을 식별하기 위해 서열 판독을 처리하는 단계;
    차등 및 순위 분석을 사용하여 miRNA 서열을 순서 순위화하는 단계; 및
    차등 및 순위 분석 둘 모두에 존재하는 상위 1 내지 5개 miRNA 서열을 식별하는 단계를 포함하는, 표적-외 miRNA 발현 프로파일을 식별하는 방법.
  52. 골수로부터 조혈 줄기 세포를 동원하는 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 생체내 유전자 전달 요법을 위해 줄기 세포를 동원하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 작용제는 조혈 줄기 세포의 생체내 형질도입을 위한 이식유전자를 포함하는 벡터를 투여하기 이전에 투여되는, 방법.
  54. 제52항에 있어서, 작용제는 플레릭사포, G-CSF, 실데나필, 필그라스팀, 레노그라스팀, GM-CSF, 몰그라모스팀, 사그라모스팀 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 벡터를 포함하는 제27항의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
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