KR20220161375A - 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하기 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
복수의 상이한 항원에 결합할 수 있지만, 2개 이상의 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 비특이적으로 가교하지 않는, 다중 특이성 항원 결합 분자가 제공된다. 그와 같은 다중 특이성 항체 단백질의 바람직한 구조 형태를 제조 또는 농축하기 위한 방법, 및 그와 같은 다중 특이성 항체 단백질의 다이설파이드 불균일성을 제거하기 위한 방법이 제공된다. 더하여, 바람직한 형태의 다중 특이성 항체 단백질을 특이적으로 인식하는 입체 구조 특이적 항체 및 해당 입체 구조 특이적 항체의 사용이 제공된다.
Description
본 발명은, 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 개재시켜 서로 연결할 수 있는 2개 이상의 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자, 및 그와 같은 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 바람직한 형태의 다중 특이성 항체 단백질을 증가시키거나 또는 농축하기 위한 방법, 및 그와 같은 재조합 항체 단백질의 다이설파이드 불균일성을 제거하기 위한 방법에 관한 것이다.
항체는, 혈장 중에서 극히 안정되고 또한 부작용이 거의 없으므로, 의약으로서 주목을 끌고 있다. 다수의 치료용 항체 중, 일부 종류의 항체는, 항종양 반응을 발휘하기 위해서 이펙터 세포를 필요로 한다. 항체 의존성 세포 상해(ADCC)는, NK 세포 및 매크로파지 상에 존재하는 Fc 수용체에의 항체의 Fc 영역의 결합을 개재시켜, 이펙터 세포가 항체 결합 세포에 대해서 나타내는 세포 상해이다. 암을 치료하기 위한 의약으로서, 지금까지, ADCC를 유도하여 항종양 효과를 발휘할 수 있는 복수의 치료용 항체가 개발되고 있다(Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078).
이펙터 세포로서 NK 세포 또는 매크로파지를 동원하는 것에 의해 ADCC를 유도하는 항체에 더하여, 이펙터 세포로서 T 세포를 동원하는 것에 의해 세포 상해성을 도입하는 T 세포 동원 항체(TR 항체)가, 1980년대부터 알려져 있다(비특허문헌 2 내지 4). TR 항체는, T 세포 상의 T 세포 수용체 복합체를 형성하는 서브유닛의 어느 하나, 특히 CD3ε쇄와, 암 세포 상의 항원을 인식하고, 또한 그들에 결합하는 이중 특이성 항체이다. 몇몇 TR 항체가 현재 개발되고 있다. 카투막소마브(Catumaxomab)는, EpCAM에 대한 TR 항체이고, 악성 복수증의 치료에 관해서 유럽에서 승인되어 있다. 더욱이, "이중 특이성 T 세포 유도(BiTE)"라고 불리는 종류의 TR 항체가, 강력한 항종양 활성을 나타냄이 근년 발견되었다(비특허문헌 5 및 6). 블리나투모마브(Blinatumomab)는, CD19에 대한 BiTE 분자이며, 2014년에 최초로 FDA의 승인을 받았다. 블리나투모마브는, 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 및 보체 의존성 세포 상해(CDC)를 유도하는 리툭시마브(Rituximab)와 비교하여, CD19/CD20 양성 암 세포에 대해 훨씬 강한 세포 상해 활성을 in vitro로 나타냄이 증명되어 있다(비특허문헌 7).
그렇지만, 삼기능성 항체는, 암 항원 비의존적으로, T 세포와 NK 세포 또는 매크로파지 등의 세포의 양쪽에 동시에 결합하고, 결과로서, 이들 세포 상에 발현하고 있는 수용체가 가교되어, 여러 가지 사이토카인의 발현이 항원 비의존적으로 유도됨이 공지이다. 삼기능성 항체의 전신 투여는, 그와 같은 사이토카인 발현의 유도의 결과로서, 사이토카인 스톰양(樣)의 부작용을 야기한다고 생각된다. 실제, 제I상 임상 시험에 있어서, 비소세포 폐암을 갖는 환자에 대한 카투막소마브의 전신 투여에서의 최대 내용량(耐容量)이 5μg/body라는 초저용량이었던 것, 및 보다 고용량의 투여가, 다양한 중독(重篤)한 부작용을 야기하는 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 8). 그와 같은 저용량으로 투여한 경우, 카투막소마브는, 유효 혈중 레벨에 도달할 수 없다. 즉, 그와 같은 저용량으로 카투막소마브를 투여하는 것에 의해서는, 기대되는 항종양 작용을 달성할 수는 없다.
근년, FcγR에 대한 결합 활성을 저하시킨 Fc 영역을 이용함으로써, 유해 반응을 회피하면서, T 세포에 의해 매개되는 세포 상해 활성을 야기하는 개량형 항체가 제공되고 있다(특허문헌 1). 그렇지만, 이와 같은 항체여도, 그 분자 구조에 비추어볼 때, 암 항원에 결합하면서 2개의 면역 수용체, 즉, CD3ε 및 FcγR에 작용할 수는 없다. 유해 반응을 회피하면서, 암 항원 특이적인 양식으로, T 세포에 의해 매개되는 세포 상해 활성과, T 세포 이외의 세포에 의해 매개되는 세포 상해 활성의 양쪽을 발휘하는 항체는, 아직 알려져 있지 않다.
한편으로, 카투막소마브와는 달리, 이중 특이성 sc(Fv)2 포맷 분자(BiTE)는, Fcγ 수용체 결합 부위를 갖지 않으므로, T 세포 상, 및 NK 세포 및 매크로파지 등의 세포 상에 발현하고 있는 수용체를 암 항원 비의존적으로 가교하지 않는다. 그렇지만, 이중 특이성 sc(Fv)2는, Fc 영역을 갖지 않는 개변된 저분자량 항체 분자이므로, 환자에의 투여 후의 그 혈중 반감기가, 치료용 항체로서 통상 이용되는 IgG형의 항체보다 현저히 짧다고 하는 문제가 있다. 실제, in vivo로 투여된 이중 특이성 sc(Fv)2의 혈중 반감기는, 대략 수 시간이라고 보고되어 있다(비특허문헌 9 및 10). 블리나투모마브, 즉, CD19 및 CD3에 결합하는 sc(Fv)2 분자는, 급성 림프성 백혈병의 치료에 관해서 승인되어 있다. 블리나투모마브의 혈청 반감기는, 환자 중에서 2시간 미만임이 밝혀져 있다(비특허문헌 11). 블리나투모마브의 임상 시험에서는, 블리나투모마브는, 미니 펌프를 이용하는 지속 점적 정주에 의해 투여되었다. 이 투여 방법은, 환자에게 있어 극히 불편할뿐만 아니라, 디바이스의 오작동 등에 의한 의료 사고의 위험성의 가능성도 또한 갖는다. 따라서, 그와 같은 투여 방법은 바람직한 것이라고는 말할 수 없다.
T 세포는, 종양 면역에 있어서 중요한 역할을 하고, 1) 주요 조직 적합 복합체(MHC) 클래스 I 분자에 의해 제시되는 항원 펩티드에 대한 T 세포 수용체(TCR)의 결합 및 TCR의 활성화; 및 2) 항원 제시 세포 상의 리간드에 대한 T 세포의 표면 상의 공자극 분자의 결합 및 공자극 분자의 활성화의 2개의 시그널에 의해 활성화됨이 알려져 있다. 더욱이, 종양괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리 및 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 분자, 예를 들어 T 세포의 표면 상의 CD137(4-1BB)의 활성화는, T 세포 활성화에 중요하다고 설명되어 있다(비특허문헌 12). 이와 관련하여, CD137 아고니스트 항체는, 항종양 효과를 나타냄이 이미 실증되어 있고, 이것은, 주로 CD8 양성 T 세포 및 NK 세포의 활성화에 의해, 실험적으로 나타나 있다(비특허문헌 13). 세포외 도메인으로서의 종양 항원 결합 도메인, 및 세포내 도메인으로서의 CD3 및 CD137 시그널 전달 도메인으로 이루어지는 키메라 항원 수용체 분자를 갖도록 조작된 T 세포(CAR-T 세포)는, 효력의 지속성을 증강시킬 수 있다(Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733(비특허문헌 14)). 그러나, 그와 같은 CD137 아고니스트 항체의 그 비특이적 간 독성에 의한 부작용은, 임상상 및 비임상상 문제이며, 약제의 개발은 진전되고 있지 않다(Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22(비특허문헌 15)). 부작용의 주된 원인은, 항체 정상 영역을 개재시킨 Fcγ 수용체에 대한 항체의 결합이 관여하고 있음이 시사되고 있다(Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22(비특허문헌 16)). 더욱이, TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 수용체를 표적으로 하는 아고니스트 항체가 in vivo로 아고니스트 활성을 발휘하기 위해서는, Fcγ 수용체 발현 세포(FcγRII 발현 세포)에 의한 항체 가교가 필요하다고 하는 것이 보고되어 있다(Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6(비특허문헌 17)). WO2015/156268(특허문헌 2)은, CD137 아고니스트 활성을 갖는 결합 도메인과 종양 특이적 항원에 대한 결합 도메인을 갖는 이중 특이성 항체가, 종양 특이적 항원을 발현하는 세포의 존재하에서만, CD137 아고니스트 활성을 발휘하고, 또한 면역 세포를 활성화할 수 있음을 기재하고 있다.
종양 특이적 항원(EGFR) 결합 도메인, CD137 결합 도메인, 및 CD3 결합 도메인을 포함하는 삼중 특이성 항체는, 이미 보고되어 있다(WO2014116846). 그렇지만, 그와 같은 분자 포맷을 갖는 항체는, 3종류의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있으므로, 그들 삼중 특이성 항체는, CD3 및 CD137에 동시에 결합하는 것에 의해, CD3ε 발현 T 세포와 CD137 발현 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, DC 등) 사이에 가교 형성을 가져올 수 있을 것이 추측되었다. 이 맥락에 있어서, 유해 반응을 회피하면서, T 세포에 의해 매개되는 세포 상해 활성과, CD137을 개재시키는 T 세포 및 다른 면역 세포의 활성화 활성의 양쪽을 암 항원 특이적으로 발휘하는 항체는, 아직 알려져 있지 않다.
복수의 다이설파이드 결합을 갖는 항체에서는, 항체 조제물 사이의 구조 불균일성이 관찰되고 있지만, 이 불균일성의 배경에 있는 이유는 여전히 해명되어 있지 않다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 제2005/0161399호, Dillon et al.은, 항체를 포함하는 고분자량 단백질을 분석하는 역상 LC/MS법에 대해 논하고 있다. 더하여, 미국 특허출원공개 제2006/194280호, Dillon et al.은, 재조합 IgG 단백질의 조제물을 환원/산화 커플링 시약 및 임의로 카오트로픽제에 제공하는 것에 의해, 특정의 IgG 아이소폼을 일과성으로 농축하는 방법에 관한 것이다.
Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
Nature. 1985 Apr 18-24;314(6012):628-31.
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Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733
Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22
Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22
Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6
유해 반응을 회피하면서, 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 의해 매개되는 세포 상해 활성과, 공자극 분자(예를 들어, CD137)를 개재시키는 T 세포 및/또는 다른 면역 세포의 활성화 활성의 양쪽을 표적 항원 특이적으로 발휘하는 항체는, 아직 알려져 있지 않다. 본 발명의 목적은, 부작용을 저하 또는 최소화시키면서, 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 의해 매개되는 효과적인 표적 특이적 세포 살상 효과를 나타내는 항원 결합 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하기 위한 방법, 바람직한 형태의 다중 특이성 항체 단백질을 증가시키거나 또는 농축하기 위한 방법, 및 그와 같은 재조합 항체 단백질의 다이설파이드 불균일성을 제거하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
복수의 상이한 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3, 및/또는 T 세포, NK 세포, DC 세포 상의 CD137 등)에 결합할 수 있지만, 2개 이상의 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 비특이적으로 가교하지 않는 항원 결합 분자가 제공된다. 그와 같은 다중 특이성 항원 결합 분자는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 약물로서 이용할 때에 유해 반응을 담당한다고 생각되는, 상이한 세포 상에 발현하고 있는 항원에의 종래형의 다중 특이성 항원 결합 분자의 결합에 기인하는 상이한 세포(예를 들어, 상이한 T 세포) 사이의 가교 형성을 회피하면서, 면역 반응을 조절 및/또는 활성화할 수 있다.
하나의 국면에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 다중 특이성 항원 결합 분자의 유효성을 개선 또는 증강하는, 매우 독특한 구조 형식을 갖는 새로운 항원 결합 분자를 제공한다. 독특한 구조 형식을 갖는 새로운 항원 결합 분자는, 증가한 수의 항원 결합 도메인을 제공하여, 바람직하지 않은 유해 작용의 저하를 수반하고, 이펙터 세포 및 표적 세포 상의 각각의 항원에 대한 증가한 결합가 및/또는 특이성을 가져온다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명의 그와 같은 새로운 독특한 구조 형식을 갖는 항원 결합 분자의 하나는, (예를 들어, Fc, 다이설파이드 결합, 또는 링커 등을 개재시켜) 서로 연결되고, 각각이 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 DC 세포 등의 면역 세포) 상의 제 1 및/또는 제 2 항원에 결합하는, 적어도 2개의 제 1 및 제 2 항원 결합 부분(예를 들어, Fab 도메인)을 포함하고, 또한, 제 1 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽에 연결되고, 표적 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 제 3 항원에 결합하는, 제 3(및 임의로 제 4) 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명의 그와 같은 새로운 독특한 구조 형식을 갖는 항원 결합 분자의 하나는, (예를 들어, Fc, 다이설파이드 결합, 또는 링커 등을 개재시켜) 서로 연결되고, 각각이 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 DC 세포 등의 면역 세포) 상의 제 1 및/또는 제 2 항원에 결합하는, 적어도 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분(예를 들어, Fab 도메인)을 포함하고, 또한, 제 1 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽에 연결되고, 표적 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 제 3 항원에 결합하는, 제 3(및 임의로 제 4) 항원 결합 부분을 추가로 포함하고, 여기에서, 제 1 항원 및/또는 제 2 항원에 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 항원 결합 부분(예를 들어, Fab 도메인)은 각각, 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 다이설파이드 결합을 만들어 내고, 그들을 상호 가깝게 유지하고, 또한, 예를 들어, 2개의 Dual-Fab 사이의 입체 장애 또는 짧은 거리의 결과로서 동일한 단일한 이펙터 세포에의 시스 항원 결합을 촉진하고, 그것에 의해, 2개의 Dual-Fab에 의해 DLL3 비의존적으로 매개되는 2개의 CD3/CD137 발현 면역 세포의 바람직하지 않은 가교 형성을 방해하는 것에 의해 삼중 특이성 항체(삼중 특이성 Ab)의 안전성 프로파일을 개선하는, 적어도 1개의 아미노산 변이를 포함한다. 하나의 특정의 국면에 있어서, 해당 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, Fab이며, 또한 CH1 영역 중에 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 적어도 1개의 시스테인 잔기를 포함하고, 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기는, 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 다른 특정의 국면에 있어서, 해당 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 1개의 시스테인 잔기를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함한다.
그와 같은 독특한 구조 형식을 갖는 항원 결합 분자는 놀랍게도, 상이한 세포(예를 들어, T 세포 등의 이펙터 세포) 사이에서의 바람직하지 않은 가교 형성에 기인하는 오프타겟 부작용의 저감 또는 최소화를 나타내면서, 다른 다중 특이성 항체 포맷(예를 들어, BiTE)과 비교하여 우수한 유효성을 나타냄이 발견되었다. 하나의 국면에 있어서, 본 발명은, 각각이 CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는(즉, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만 동시는 아닌), 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및 DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는, 제 3 항원 결합 부분을 포함하고, 다른 다중 특이성 항원 결합 분자가 가질 수 있는 유해한 독성의 염려 또는 부작용을 회피하면서, 보다 효율적으로 T 세포 의존성 세포 상해를 유도하는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은, 유효 성분으로서 항원 결합 분자를 포함하는 것에 의해, 여러 가지 암, 특히, DLL3 양성 종양 등의 DLL3에 관련된 암을 치료할 수 있는 다중 특이성 항원 결합 분자 및 의약 조성물을 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 발명은, (예를 들어, CH1 영역 중에) 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 1개 또는 복수의 다이설파이드 결합을 포함하는 신규 포맷의 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하는 방법; 해당 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항체 단백질의 바람직한 형태를 증가시키거나 또는 농축하기 위한 방법, 및 (예를 들어, CH1 영역 중의) 해당 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 효율적으로 또한 적절히 형성시키는 조건하에서 항체 조제물을 환원제와 접촉시키는 것에 의해, 그와 같은 재조합 항체 단백질의 다이설파이드 불균일성을 제거하기 위한 방법에 관한 것이다. 추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 다중 특이성 항체 단백질의 바람직한 형태를 특이적으로 인식하는 입체 구조 특이적 항체, 및 항체 함유 시료의 정제, 분석, 또는 정량화에 있어서의 입체 구조 특이적 항체의 사용에 관한 것이다.
하나의 특정의 국면에 있어서, 본 개시는 이하를 제공한다:
[1] 각각이 CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
제 3 항원, 바람직하게는 암 세포/조직 상에 발현하고 있는 항원에 결합할 수 있는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[1A] 각각이 CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 내지 [1A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 또는 [2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, Fab 분자이며, 또한 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 포함하고, 바람직하게는, 해당 적어도 1개의 다이설파이드 결합이, 힌지 영역 내에는 없는 아미노산 잔기(시스테인) 사이에, 바람직하게는 각 항원 결합 부분의 CH1 영역 내의 아미노산 잔기(시스테인) 사이에 형성되는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4A] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, Fab 분자이며, 또한 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 아미노산 잔기(시스테인) 사이에 형성되는 1개의 다이설파이드 결합을 포함하는, [4]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[5] 제 3 항원 결합 부분이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽에 융합되어 있는, [1] 내지 [4A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[5A] 제 3 항원 결합 부분이 Fab 또는 scFv인, [5]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[6] 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이 Fab 분자이며, 제 3 항원 결합 부분이, Fab 중쇄(CH1)의 C말단에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, [5] 내지 [5A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[6A] 상기 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [5] 내지 [6] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[6B] 제 1 항원 결합 부분이 제 2 항원 결합 부분과 동일한, [1] 내지 [6A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[7] 제 3 항원 결합 부분이, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이며, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 종래형의 Fab 분자인, [1] 내지 [6B] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[8] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및/또는 124위에 있는 아미노산이 독립적으로, 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 치환되고(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위에 있는 아미노산 및/또는 213위에 있는 아미노산이 독립적으로, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환되어 있는(EU 넘버링에 따른 넘버링), [7]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[9] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산이 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서 147위 및 213위에 있는 아미노산이, 글루탐산(E)인(EU 넘버링에 따른 넘버링), [8]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[10] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 이하의 (a1) 내지 (a5):
(a1) 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 276의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 277의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 278의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 279의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 280의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 281의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 285의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 286의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 287의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 288의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 289의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 290의 경쇄 CDR 3;
(a4) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a5) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[11] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 이하의 (a1) 내지 (a6):
(a1) 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 264의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 265의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) (a1) 내지 (a4)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a6) (a1) 내지 (a4)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [1] 내지 [10] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12] Fc 도메인을 추가로 포함하는, [1] 내지 [11] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12A] Fc 도메인이, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, 또한 Fc 도메인이, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타내는, [12]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12C] Fc 도메인이, 천연형 IgG의 Fc 영역의 것과 비교하여, 산성 pH 조건(예를 들어, pH 5.8) 하에서 증강된 FcRn 결합 활성을 나타내는, [12] 내지 [12A] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12D] Fc 도메인이, EU 넘버링에 따른, 434위에 Ala; 438위에 Glu, Arg, Ser, 또는 Lys; 및 440위에 Glu, Asp, 또는 Gln을 포함하는, [12C]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12E] Fc 도메인이, EU 넘버링에 따른, 434위에 Ala; 438위에 Arg 또는 Lys; 및 440위에 Glu 또는 Asp를 포함하는, [12D]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12F] Fc 도메인이, EU 넘버링에 따른, 428위에 Ile 혹은 Leu; 및/또는 436위에 Ile, Leu, Val, Thr, 혹은 Phe를 추가로 포함하는, [12E]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12G] Fc 도메인이, EU 넘버링에 따른, 이하:
(a) N434A/Q438R/S440E;
(b) N434A/Q438R/S440D;
(c) N434A/Q438K/S440E;
(d) N434A/Q438K/S440D;
(e) N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f) N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(g) N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(h) N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(i) N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(j) N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(k) N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(l) N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(m) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;
(n) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;
(o) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;
(p) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;
(q) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;
(r) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;
(s) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;
(t) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;
(u) M428L/N434A/Q438R/S440E;
(v) M428L/N434A/Q438R/S440D;
(w) M428L/N434A/Q438K/S440E;
(x) M428L/N434A/Q438K/S440D;
(y) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(z) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(aa) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(ab) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(ac) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(ad) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(ae) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(af) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(ag) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; 및
(ah) L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함하는, [12C] 내지 [12F] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12H] Fc 도메인이, M428L/N434A/Q438R/S440E의 아미노산 치환의 조합을 포함하는, [12C] 내지 [12G] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12I] Fc 도메인이, IgG Fc 도메인, 바람직하게는 인간 IgG Fc 도메인, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 도메인인, [12] 내지 [12H] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12J] Fc 도메인이, 이하:
(a) 서열 번호: 100에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 Fc 서브유닛, 및 서열 번호: 111에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 2 Fc 서브유닛; 또는
(b) 서열 번호: 99에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 Fc 서브유닛, 및 서열 번호: 109에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 2 Fc 서브유닛
의 어느 하나를 포함하는, [12] 내지 [12I] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12K] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 Fab이며, 제 1 항원 결합 부분이, Fab 중쇄의 C말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N말단에 융합되고, 또한 제 2 항원 결합 부분이, Fab 중쇄의 C말단에서 Fc 도메인의 나머지의 서브유닛의 N말단에 융합되어 있는, [12] 내지 [12J] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[12L] 제 3 항원 결합 부분이, C말단에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, [12K]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[13] 이하의 (a1) 내지 (a15):
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5)
로부터 선택되는 조합의 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하고,
바람직하게는, 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)가, 도 1(a)에 나타내는 배향에 따라 서로 접속 및/또는 회합하고 있는, [1] 내지 [12L] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
본 발명의 다른 국면은, 이하에 관한 것이다:
[1] (i) (포유동물 세포에 의해 재조합 산생되어 있는) 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물을 제조하는, (ii) 바람직한 입체 구조를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자를 정제하는, 또는 (iii) 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물의 균일성을 개선하기 위한 방법으로서,
다중 특이성 항원 결합 분자가, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하고, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, Fab이며, 또한 제 1 항원 및 제 1 항원과는 상이한 제 2 항원에 결합할 수 있지만, 양쪽 항원에 동시에는 결합하지 않고;
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 힌지 영역 내에는 없는 적어도 1개의 시스테인 잔기를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함하고; 바람직하게는, 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기가 CH1 영역 중에 위치하고; 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기가, 바람직하게는 CH1 영역에 있어서, 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있고;
조제물을 환원 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는;
상기 방법.
[2] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이,
제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 1개의 시스테인 잔기
를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함하는, [1]의 방법.
[3] 상기 조제물을 환원 시약과 접촉시키는 단계가, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 및/또는 촉진하는, [1] 또는 [2]의 방법.
[4] 상기 다중 특이성 항원 결합 분자 조제물(환원제와 접촉시키기 전)이, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합만 상이한 2개 이상의 구조 아이소폼을 포함하고, 또한 환원제와 접촉시키는 단계가, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 구조 아이소폼의 집단을 우선적으로 농축하거나 또는 증가시키는, [3]의 방법.
[5] 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 3 내지 약 10인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 방법.
[6] 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 6, 7 또는 8인, [5]의 방법.
[7] 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 7인, [6]의 방법.
[8] 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 3인, [5]의 방법.
[9] 환원제가, TCEP, 2-MEA, DTT, 시스테인, GSH, 및 Na2SO3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 방법.
[10] 환원제가 TCEP, 바람직하게는 0.25mM TCEP인, [9]의 방법.
[11] 환원제의 농도가 약 0.01mM 내지 약 100mM인, [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법.
[12] 환원제의 농도가, 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100mM, 바람직하게는 약 0.25mM인, [11]의 방법.
[13] 접촉시키는 단계가, 적어도 30분간에 걸쳐서 실시되는, [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 방법.
[14] 접촉시키는 단계가, 약 10분간 내지 약 48시간에 걸쳐서 실시되는, [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 방법.
[15] 접촉시키는 단계가, 약 2시간 또는 약 18시간에 걸쳐서 실시되는, [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 방법.
[16] 접촉시키는 단계가, 약 4℃ 내지 37℃의 온도에서, 바람직하게는 23℃ 내지 25℃에서 실시되는, [1] 내지 [15] 중 어느 하나의 방법.
[17] 상기 다중 특이성 항원 결합 분자가, 상기 환원제와 접촉시키는 단계 전에 적어도 부분적으로 정제되는, [1] 내지 [16] 중 어느 하나의 방법.
[18] 상기 다중 특이성 항원 결합 분자가, 상기 접촉시키는 단계 전에 어피니티 크로마토그래피(바람직하게는 프로틴 A 크로마토그래피)에 의해 부분적으로 정제되는, [17]의 방법.
[19] 다중 특이성 항원 결합 분자의 농도가, 약 0.1mg/ml 내지 약 50mg/ml 또는 그것을 상회하는, [1] 내지 [18] 중 어느 하나의 방법.
[20] 다중 특이성 항원 결합 분자의 농도가 약 10mg/ml 또는 약 20mg/ml인, [19]의 방법.
[21] 바람직하게는 투석 또는 버퍼 교환에 의해 바람직하게는 환원제를 제거하는 것에 의해, 시스테인 다이설파이드 결합의 재산화를 촉진하는 단계를 추가로 포함하는, [1] 내지 [20] 중 어느 하나의 방법.
[22] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137의 양쪽에 동시에는 결합하지 않는, [1] 내지 [21] 중 어느 하나의 방법.
[23] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [22]의 방법.
[24] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [23]의 방법.
[25] 다중 특이성 항원 결합 분자가, 제 1 및 제 2 항원과는 상이한 제 3 항원, 바람직하게는 암 세포/조직 상에 발현하고 있는 항원에 결합할 수 있는, 제 3 항원 결합 부분을 추가로 포함하는, [1] 내지 [24] 중 어느 하나의 방법.
[26] 제 3 항원 결합 부분이, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽에 융합되어 있는, [25]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[27] 제 3 항원 결합 부분이 Fab 또는 scFv인, [25] 내지 [26] 중 어느 하나의 방법.
[28] 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각이 Fab 분자이며, 제 3 항원 결합 부분이, Fab 중쇄(CH1)의 C말단에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있는, [25] 내지 [27] 중 어느 하나의 방법.
[29] 상기 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [28]의 방법.
[30] 제 1 항원 결합 부분이 제 2 항원 결합 부분과 동일한, [1] 내지 [29] 중 어느 하나의 방법.
[30A] 제 3 항원 결합 부분이, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이며, 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이 종래형의 Fab 분자인, [25] 내지 [30] 중 어느 하나의 방법.
[30B] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및/또는 124위에 있는 아미노산이 독립적으로, 리신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H)에 의해 치환되고(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위에 있는 아미노산 및/또는 213위에 있는 아미노산이 독립적으로, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환되어 있는(EU 넘버링에 따른 넘버링), [25] 내지 [30A] 중 어느 하나의 방법.
[30C] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산이 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및 213위에 있는 아미노산이 글루탐산(E)인(EU 넘버링에 따른 넘버링), [30B]의 방법.
[31] 제 3 항원 결합 부분이, DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는, [1] 내지 [30] 중 어느 하나의 방법.
[32] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [31]의 방법.
[33] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [32]의 방법.
[34] 다중 특이성 항원 결합 분자가 Fc 도메인을 추가로 포함하는, [1] 내지 [33] 중 어느 하나의 방법.
[35] Fc 도메인이, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, 또한 Fc 도메인이, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타내는, [34]의 방법.
[36] 다중 특이성 항원 결합 분자가, 이하의 (a1) 내지 (a15):
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5)
로부터 선택되는 조합의 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하고, 또한 바람직하게는, 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)가, 도 1(a)에 나타내는 배향에 따라 서로 접속 및/또는 회합하고 있는, [1] 내지 [35] 중 어느 하나의 방법.
[37] 제 4 폴리펩티드(쇄 4) 및 제 5 폴리펩티드(쇄 5)가 동일한, [1] 내지 [36] 중 어느 하나의 방법.
[38] CH1 영역(EU 넘버링에 따른 191위)에 있어서 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자의 균일한 집단을 갖는, [1] 내지 [37] 중 어느 하나의 방법에 따라 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물.
[39] 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 몰비의, CH1 영역(EU 넘버링에 따른 191위)에 있어서 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자를 갖는, [1] 내지 [37] 중 어느 하나의 방법에 따라 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물.
본 발명의 추가로 다른 국면은, 이하에 관한 것이다:
[1] 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하기 위한 방법으로서, 해당 다중 특이성 항원 결합 분자가 이하:
각각이 Fab이며, 또한 제 1 항원 및 제 1 항원과는 상이한 제 2 항원에 결합할 수 있지만, 양쪽 항원에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
제 1 및 제 2 항원과는 상이한 제 3 항원, 바람직하게는 암 세포/조직 상에 발현하고 있는 항원에 결합할 수 있는, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제 3 항원 결합 부분
을 포함하고, 해당 방법이,
(a) 이하를 코딩하는 1개 또는 복수의 핵산을 제공하는 단계:
i. (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 임의로 중쇄 정상 영역(CH1); 및 제 1 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하는, 제 1 폴리펩티드;
ii. (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 임의로 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하는, 제 2 폴리펩티드;
iii. (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하는, 제 3 폴리펩티드;
iv. (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 임의로 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하는, 제 4 폴리펩티드; 및
v. (N말단으로부터 C말단으로) 제 1 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 임의로 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하는, 제 5 폴리펩티드;
(b) (a)에서 제조한 1개 또는 복수의 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계;
(c) (i) 내지 (v)에 있어서의 폴리펩티드가 발현되도록 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(d) 단계(c)에서 배양한 세포의 배양액으로부터 (i) 내지 (v)에 있어서의 5개의 폴리펩티드를 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자를 수집하는 단계
를 포함하고; 또한
임의로, (iv) 내지 (v)에 있어서의 폴리펩티드가 동일하고; 또한
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 힌지 영역 내에는 없는 적어도 1개의 시스테인 잔기를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함하고, 바람직하게는, 해당 적어도 1개의 시스테인이 CH1 영역 내에 위치하고 있고; 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기가, 바람직하게는 CH1 영역에 있어서, 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에, 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있고;
해당 방법이, 조제물을 환원 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 방법.
[2] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이,
제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 1개의 시스테인 잔기
를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함하는, [1]의 방법.
[3] CH1 영역(EU 넘버링에 따른 191위)에 있어서의 시스테인에 1개 또는 복수의 다이설파이드 결합을 형성시키는 환원 조건하에서, 단계(d)로부터 수집한 다중 특이성 항원 결합 분자(다중 특이성 항원 결합 분자) 조제물을 환원 시약과 접촉시키는 단계(e)를 추가로 포함하는, [1] 내지 [2] 중 어느 하나의 방법.
[4] (환원제와 접촉시키기 전의) 단계(d)로부터 수집한 상기 다중 특이성 항원 결합 분자 조제물이, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합만 상이한 2개 이상의 구조 아이소폼을 포함하고, 또한 환원제와 접촉시키는 단계(e)가, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자 구조 아이소폼의 집단을 우선적으로 농축하거나 또는 증가시키는, [3]의 방법.
[5] 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 3 내지 약 10인, [3] 내지 [4] 중 어느 하나의 방법.
[6] 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 6, 7 또는 8인, [5]의 방법.
[7] 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 7인, [6]의 방법.
[8] 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 3인, [5]의 방법.
[9] 환원제가, TCEP, 2-MEA, DTT, 시스테인, GSH, 및 Na2SO3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [3] 내지 [8] 중 어느 하나의 방법.
[10] 환원제가 TCEP, 바람직하게는 0.25mM TCEP인, [9]의 방법.
[11] 환원제의 농도가 약 0.01mM 내지 약 100mM인, [3] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법.
[12] 환원제의 농도가, 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100mM, 바람직하게는 약 0.25mM인, [11]의 방법.
[13] 접촉시키는 단계가, 적어도 30분간에 걸쳐서 실시되는, [3] 내지 [12] 중 어느 하나의 방법.
[14] 접촉시키는 단계가, 약 10분간 내지 약 48시간에 걸쳐서 실시되는, [3] 내지 [12] 중 어느 하나의 방법.
[15] 접촉시키는 단계가, 약 2시간 또는 약 18시간에 걸쳐서 실시되는, [3] 내지 [12] 중 어느 하나의 방법.
[16] 접촉시키는 단계가, 약 4℃ 내지 37℃의 온도에서, 바람직하게는 23℃ 내지 25℃에서 실시되는, [3] 내지 [15] 중 어느 하나의 방법.
[17] 상기 다중 특이성 항원 결합 분자가, 상기 환원제와 접촉시키는 단계 전에 적어도 부분적으로 정제되는, [3] 내지 [16] 중 어느 하나의 방법.
[18] 상기 다중 특이성 항원 결합 분자가, 상기 접촉시키는 단계 전에 어피니티 크로마토그래피(바람직하게는 프로틴 A 크로마토그래피)에 의해 부분적으로 정제되는, [17]의 방법.
[19] 다중 특이성 항원 결합 분자의 농도가, 약 0.1mg/ml 내지 약 50mg/ml 또는 그것을 상회하는, [3] 내지 [18] 중 어느 하나의 방법.
[20] 다중 특이성 항원 결합 분자의 농도가 약 10mg/ml 또는 약 20mg/ml인, [19]의 방법.
[21] 바람직하게는 투석 또는 버퍼 교환에 의해 바람직하게는 환원제를 제거하는 것에 의해, 시스테인 다이설파이드 결합의 재산화를 촉진하는 단계를 추가로 포함하는, [3] 내지 [20] 중 어느 하나의 방법.
[22] CH1 영역(EU 넘버링에 따른 191위)에 있어서 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자의 균일한 집단을 갖는, [3] 내지 [21] 중 어느 하나의 방법에 따라 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물.
[23] 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 몰비의, CH1 영역(EU 넘버링에 따른 191위)에 있어서 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자를 갖는, [3] 내지 [21] 중 어느 하나의 방법에 따라 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물.
[24] 제 3 항원 결합 부분이 종래형의 Fab이며, 또한
(a) 제 1 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 제 1 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하고;
(b) 제 2 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하고;
(c) 제 3 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하고;
(d) 제 4 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL) 포함하고; 또한
(e) 제 5 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 1 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하는,
[1] 내지 [21] 중 어느 하나의 방법.
[25] 제 3 항원 결합 부분이, (Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는) VH/VL 크로스오버 Fab이며, 또한
(a) 제 1 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VL, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 제 1 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하고;
(b) 제 2 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VH, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하고;
(c) 제 3 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하고;
(d) 제 4 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하고; 또한
(e) 제 5 폴리펩티드가, (N말단으로부터 C말단으로) 제 1 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하는,
[1] 내지 [21] 중 어느 하나의 방법.
[26] 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산이 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및 213위에 있는 아미노산이 글루탐산(E)인(EU 넘버링에 따른 넘버링), [25]의 방법.
[26-2] 단계(a) (i)에 있어서, 제 1 폴리펩티드가, 제 3 항원 결합 부분과 제 1 항원 결합 부분의 VH 또는 VL 사이에, 펩티드 링커를 추가로 포함하는, [1] 내지 [21] 중 어느 하나의 방법.
[27] 상기 펩티드 링커가, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [26-2]의 방법.
[28] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137의 양쪽에 동시에는 결합하지 않는, [1] 내지 [27] 중 어느 하나의 방법.
[29] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [28]의 방법.
[30] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17)
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [29]의 방법.
[31] 제 3 항원 결합 부분이, DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는, [1] 내지 [30] 중 어느 하나의 방법.
[32] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [31]의 방법.
[33] DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, [32]의 방법.
[34] 다중 특이성 항원 결합 분자가 Fc 도메인을 추가로 포함하는, [1] 내지 [33] 중 어느 하나의 방법.
[35] Fc 도메인이, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, 또한 Fc 도메인이, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타내는, [34]의 방법.
[36] 다중 특이성 항원 결합 분자가, 이하의 (a1) 내지 (a15):
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5)
로부터 선택되는 조합의 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하고; 또한
바람직하게는, 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)가, 도 1(a)에 나타내는 배향에 따라 서로 접속 및/또는 회합하고 있는, [1] 내지 [35] 중 어느 하나의 방법.
[37] 제 4 폴리펩티드(쇄 4) 및 제 5 폴리펩티드(쇄 5)가 동일한, [1] 내지 [36] 중 어느 하나의 방법.
[38] 1개의 핵산만, 또는 2, 3, 4 혹은 5개의 상이한 핵산이, 제 1, 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 폴리펩티드를 코딩하고 또한 발현하는, [1] 또는 [37] 중 어느 하나의 방법.
추가로 다른 국면에 있어서, 본 발명은 이하에 관한 것이다:
[1] 항체 조제물로부터 표적 항체를 포착 및/또는 제거하기 위한 방법으로서, 이하의 단계:
a) 표적 항체를 포함하는 항체 조제물을, 지지체 상에 고정화된 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계; 및
b) 항원 결합 분자에의 특이적 결합에 의해 표적 항체를 포착시키는 단계
를 포함하고,
해당 항체가, IgG(바람직하게는 인간 IgG 또는 인간 IgG1) 유래의 적어도 2개의 Fab를 포함하고, 또한 해당 항체 조제물이, CH1 도메인에서 2개의 Fab 사이에 형성되는 다이설파이드 결합만 상이한, 2개의 항체 구조 아이소폼을 포함하고; 또한
해당 항원 결합 분자가, 다이설파이드 결합을 포함하지 않는 표적 항체에 특이적으로 결합하여, 그것을 포착하는, 상기 방법.
[2] 상기 항원 결합 분자가, 표적 항체가 다이설파이드 결합을 갖지 않을 때에만 항원 결합 분자에 액세스할 수 있는 에피토프로 표적 항체에 결합하는, [1]의 방법.
[3] 상기 다이설파이드 결합이, CH1 도메인에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에서 항체의 2개의 Fab 사이에 형성되는 다이설파이드 결합인, [1] 또는 [2]의 방법.
[4] 상기 항원 결합 분자가, 이하:
(a1) 서열 번호: 166의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 170의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 174의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 182의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 186의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 190의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 167의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 171의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 175의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 183의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 187의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 191의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 168의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 172의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 176의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 184의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 188의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 192의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 169의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 173의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 177의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 185의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 189의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 193의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 166의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 170의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 174의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 115의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 124의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 134의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 167의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 171의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 175의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 116의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 125의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 135의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 168의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 172의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 176의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 118의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 128의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 137의 경쇄 CDR 3;
(a8) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및
(a9) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 결합과 경합하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1개를 포함하는 항체인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 방법.
[5] 상기 항원 결합 분자가, 이하:
(a1) 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 180의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 181의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 197의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 198의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및
(a9) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 결합과 경합하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 항체인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 방법.
[5A] 표적 항체가, 이하의 (a1) 내지 (a15):
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5)
로부터 선택되는 조합의 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하고; 또한
바람직하게는, 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)가, 도 1(a)에 나타내는 배향에 따라 서로 접속 및/또는 회합하고 있는, [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 방법.
[6] 이하:
(a1) 서열 번호: 166의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 170의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 174의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 182의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 186의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 190의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 167의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 171의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 175의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 183의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 187의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 191의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 168의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 172의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 176의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 184의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 188의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 192의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 169의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 173의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 177의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 185의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 189의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 193의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 166의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 170의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 174의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 115의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 124의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 134의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 167의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 171의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 175의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 116의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 125의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 135의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 168의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 172의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 176의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 118의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 128의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 137의 경쇄 CDR 3;
(a8) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및
(a9) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 결합과 경합하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1개를 포함하는, 항원 결합 분자.
[7] 이하:
(a1) 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 180의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 181의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 197의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 198의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및
(a9) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 결합과 경합하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1개를 포함하는, 항원 결합 분자.
[8] 인간 IgG1의 CH1에 특이적으로 결합하는, [6] 또는 [7]의 항원 결합 분자.
[9] 다이설파이드 결합이 인간 IgG1의 2개의 Fab의 CH1 도메인 사이에 형성될 때에, 인간 IgG1의 CH1에 특이적으로 결합하지 않는, [8]의 항원 결합 분자.
[10] 상기 다이설파이드 결합이, CH1 도메인에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에서 IgG1의 2개의 Fab 사이에 형성되는 다이설파이드 결합인, [9]의 항원 결합 분자.
[11] 인간 IgG4의 CH1에 결합하지 않는, [8] 내지 [10] 중 어느 하나의 항원 결합 분자.
[12] 항체 시료의 정제, 분석, 또는 정량화에 있어서의, [6] 내지 [11] 중 어느 하나의 항원 결합 분자의 사용.
[도 1] 여러 가지의 항체 포맷을 도시한다. 표 2의 각 Fv 영역의 어노테이션. (a) LINC 기술을 적용한 (1+2) 3가 항체, 명칭 1+2 Dual/LINC("LINC"는, 예를 들어 CH1 영역에서의, 조작된 다이설파이드 결합을 의미한다); 및 (b) 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 (1+2) 포맷 3가 항체를 나타내는 약도.
[도 2a] 1+2 포맷에서의 LINC-Ig 기술이 독성을 저감시킬 수 있음을 나타내는 설명도이다. LINC-Ig("LINC", 즉, 예를 들어 CH1 영역에서의, 조작된 다이설파이드 결합을 포함한다)는, 도 1(a)에 나타나는 항체의 항원 결합을, 주로 시스 양식, 즉, 동일한 면역 세포 상에 존재하는 항원에의 결합으로 제한할 수 있다. 이에 반해서, 도 1(b)에 나타나는 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 (1+2) 3가 포맷은, 트랜스 항원 결합 양식, 즉, 2개의 상이한 면역 세포 상에 존재하는 항원에 대한 도 1(b)의 항체의 결합을 가져올 수 있다. 이것은, 독성을 증가시킬 가능성이 있는, 종양 항원 결합에 비의존적인 2개의 면역 세포의 가교 형성을 야기할 가능성이 있다.
[도 2b] 짝을 이루지 않는 표면 시스테인을 갖는, 도 1(b)에 있어서의, 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 (1+2) 3가 항체는, 항체 조제물 중에서 유리 싸이올기, 예를 들어, 유리 시스테인 또는 글루타티온을 포함하는 분자와 다이설파이드 결합을 형성할 가능성이 있고, 그것에 의해, LINC 형성을 방해하는 항체 상의 짝을 이루지 않는 시스테인의 캐핑이 초래됨을 나타내는 모식도이다(왼쪽). 그와 같은 캐핑된 항체를 환원제에 의해 처리하는 것은, 표면 시스테인의 탈캐핑을 도울 수 있고(중앙), 탈캐핑된 항체의 추가적인 재산화(예를 들어, 버퍼 교환에 의한 환원제의 제거)는, 탈캐핑된 시스테인 사이의 다이설파이드 결합 형성을 재촉하여, LINC 형성을 촉진한다(오른쪽)(단순화를 위해, 항체의 힌지 영역 사이 및 중쇄 CH1와 경쇄 CL 사이 등의 천연형 다이설파이드 결합은 나타내지 않는다).
[도 3] LINC 조작 있음 및 없음(조작된 다이설파이드 결합 형성을 위한 S191C 변이 있음 또는 없음)에서의 3가 (1+2) 항체의 비환원 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. S191C 변이의 도입 없음의 (1+2) 3가 포맷에서는 단일한 단백질 영동 밴드(레인 2 및 5)가 관찰되었다. 이에 반해서, 2개의 단백질 영동 밴드가, (1+2) Dual/LINC 항체 배리언트로 검출되고, 보다 느린 영동 밴드가, LINC 변이의 도입 없음의 (1+2) 3가 포맷과 마찬가지의 전기영동 이동도를 나타냈다. 이것은, 보다 빠른 영동 밴드가 Dual/LINC-Ig임을 시사한다. 항체 시료에 있어서의 짝을 이루지 않는 시스테인을 갖는 Dual-LINC-Ig(unLINC 포맷)의 퍼센티지는, "UnLINC" 포맷에 대응하는 느린 밴드/상측의 밴드의 강도를, "LINC" 및 "UnLINC" 구조에 대응하는 2개의 밴드의 강도의 합계로 나누는 것에 의해 산출할 수 있다.
[도 4] 다양한 환원제에 의한 처리 후의 Dual-LINC-Ig의 비환원 SDS-PAGE를 나타낸다. "-"는 "CuSO4 첨가 없음"을 나타낸다. "+"는, 오버나이트(O/N) 재산화 시의 25μM/50μM CuSO4의 첨가를 나타낸다.
[도 5] 다양한 농도의 Dual-LINC-Ig에서의, TCEP 처리 후의 Dual-LINC-Ig의 비환원 SDS-PAGE를 나타낸다.
[도 6] 다양한 인큐베이션 기간에서의, TCEP 처리 후의 Dual-LINC-Ig의 비환원 SDS-PAGE를 나타낸다. 항체 시료중의 짝을 이루지 않는 시스테인을 갖는 Dual-LINC-Ig(unLINC 포맷)의 퍼센티지는, "UnLINC" 포맷에 대응하는 느린 밴드/상측의 밴드의 강도를, "LINC" 및 "UnLINC" 구조에 대응하는 2개의 밴드의 합계로 나누는 것에 의해 산출할 수 있다.
[도 7] 조작된 다이설파이드 결합을, 항체가, 예를 들어 CH1 영역에 갖지 않을("짝을 이루지 않는 시스테인" 형태) 때에만 표적 항체(예를 들어, CH1 영역 내의 에피토프)에 결합하는, 입체 구조 특이적 항체(예를 들어, 입체 구조 특이적 항CH1 항체)로서, 예를 들어, 조작된 다이설파이드 결합에 의해 야기되는 2개의 Fab 사이의 입체 장애 또는 짧은 거리에 기인하여, 조작된 다이설파이드 결합을 표적 항체가 가질("짝을 이루는 시스테인" 형태) 때에는, 해당 에피토프가 입체 구조 특이적 항체에 액세스할 수 없는, 입체 구조 특이적 항체의 개념을 나타내는 모식도이다.
[도 8] 3개의 Fab를 포함하는 Dual/LINC(1+2) 항체 포맷으로서, Fab 중 2개(각각 쇄 1-쇄 5 및 쇄3-쇄 4로 구성되는, Fab B 및 Fab C)가 각각, (양 Fab를 연결하는 조작된 다이설파이드 결합을 형성할 수 있고, 따라서 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태 또는 "짝을 이루는 시스테인" 형태의 어느 것인가로 존재할 수 있는) 조작된 시스테인을 포함하고, 또한 1개의 Fab(쇄 1-쇄 2로 구성되는 Fab A)가, 조작된 시스테인을 포함하지 않는("짝을 이루는 시스테인" 형태로만 존재하는), Dual/LINC(1+2) 항체 포맷을 도시한다. (a) Fab A의 CH1은, "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태/입체 구조 상태이며, Fab B 및 Fab C의 CH1은, "짝을 이루는 시스테인" 또는 "LINC" 형태/입체 구조 상태이다. (b) 입체 구조 특이적 항IgG1 CH1 항체는, "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태/입체 구조 상태에서의 IgG1의 CH1에만 결합할 수 있다. Fab A의 CH1은, IgG4 CH1 서열을 갖도록 조작되었다. 결과로서, 입체 구조 특이적 항IgG1 CH1 항체는, "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태/입체 구조 상태에서의 Dual/LINC(1+2) 항체에만 결합하지만, "짝을 이루는 시스테인" 또는 "LINC" 형태/입체 구조를 갖는 항체종에는 결합하지 않는다.
[도 9a] 입체 구조 특이적 항CH1 항체의 스크리닝을 위한 다양한 항체 포맷을 갖는 여러 가지 툴 항체의 설명도.
[도 9b] 툴 항체의 폴리펩티드쇄의 각각에 대한 아미노산 서열의 서열 번호를 나타낸다.
[도 10a] 입체 구조 특이적 항CH1 항체 FAB0133Hh/FAB0133L0001 어피니티 컬럼을 이용하는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056의 어피니티 정제에서의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
[도 10b] 입체 구조 특이적 항CH1 항체 FAB0133Hh/FAB0133L0001 어피니티 컬럼을 이용하는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056의 어피니티 정제에 있어서 용출된 항체의 비환원 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 구체적으로는, 플로스루 획분은, 비환원 SDS-PAGE 분석에 있어서 보다 빨리 영동하는(레인 1 내지 13) 1개의 우세한 단백질 밴드에 의해 나타나는 "짝을 이루는 시스테인" 또는 "LINC" 형태인 DualAE05/DualAE05-FF056을 고순도로 포함하고(플로스루: 백색의 바); 세정 획분은, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태인 DualAE05/DualAE05-FF056과 "짝을 이루는 시스테인" 형태인 DualAE05/DualAE05-FF056의 혼합물을 포함하고(세정액: 회색의 바); 또한 용출 획분은, 비환원 SDS-PAGE 분석에 있어서 보다 느리게 영동하는(레인 20 내지 23) 1개의 우세한 단백질 밴드에 의해 나타나는 "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태인 DualAE05/DualAE05-FF056을 우세하게 포함한다(50mM HCl 산 용출액: 흑색 바). 항체 시료의 순도는, 비환원 SDS-PAGE의 밴드의 덴시토메트리에 의해 결정되었다. 본 명세서에 나타내는 미염색 겔의 화상은, ChemiDoc Imaging Systems(Bio-Rad)에 의해 포착되고, LINC-Ig 항체의 unLINC 및 LINC 형태의 단백질 밴드의 덴시토메트리 분석은, Image Lab Software(Bio-Rad)를 이용하여 실시되었다. unLINC 형태는, 입체 구조의 차이에 기인하여, LINC 형태보다 조금 느리게 영동했다. 보다 고순도의 항체를 얻기 위해서, 30-40%의 unLINC 형태를 함유하는 단백질 시료(인풋이라고 표시된다)가 항CH1 컬럼에 적용되었다.
[도 2a] 1+2 포맷에서의 LINC-Ig 기술이 독성을 저감시킬 수 있음을 나타내는 설명도이다. LINC-Ig("LINC", 즉, 예를 들어 CH1 영역에서의, 조작된 다이설파이드 결합을 포함한다)는, 도 1(a)에 나타나는 항체의 항원 결합을, 주로 시스 양식, 즉, 동일한 면역 세포 상에 존재하는 항원에의 결합으로 제한할 수 있다. 이에 반해서, 도 1(b)에 나타나는 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 (1+2) 3가 포맷은, 트랜스 항원 결합 양식, 즉, 2개의 상이한 면역 세포 상에 존재하는 항원에 대한 도 1(b)의 항체의 결합을 가져올 수 있다. 이것은, 독성을 증가시킬 가능성이 있는, 종양 항원 결합에 비의존적인 2개의 면역 세포의 가교 형성을 야기할 가능성이 있다.
[도 2b] 짝을 이루지 않는 표면 시스테인을 갖는, 도 1(b)에 있어서의, 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 (1+2) 3가 항체는, 항체 조제물 중에서 유리 싸이올기, 예를 들어, 유리 시스테인 또는 글루타티온을 포함하는 분자와 다이설파이드 결합을 형성할 가능성이 있고, 그것에 의해, LINC 형성을 방해하는 항체 상의 짝을 이루지 않는 시스테인의 캐핑이 초래됨을 나타내는 모식도이다(왼쪽). 그와 같은 캐핑된 항체를 환원제에 의해 처리하는 것은, 표면 시스테인의 탈캐핑을 도울 수 있고(중앙), 탈캐핑된 항체의 추가적인 재산화(예를 들어, 버퍼 교환에 의한 환원제의 제거)는, 탈캐핑된 시스테인 사이의 다이설파이드 결합 형성을 재촉하여, LINC 형성을 촉진한다(오른쪽)(단순화를 위해, 항체의 힌지 영역 사이 및 중쇄 CH1와 경쇄 CL 사이 등의 천연형 다이설파이드 결합은 나타내지 않는다).
[도 3] LINC 조작 있음 및 없음(조작된 다이설파이드 결합 형성을 위한 S191C 변이 있음 또는 없음)에서의 3가 (1+2) 항체의 비환원 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. S191C 변이의 도입 없음의 (1+2) 3가 포맷에서는 단일한 단백질 영동 밴드(레인 2 및 5)가 관찰되었다. 이에 반해서, 2개의 단백질 영동 밴드가, (1+2) Dual/LINC 항체 배리언트로 검출되고, 보다 느린 영동 밴드가, LINC 변이의 도입 없음의 (1+2) 3가 포맷과 마찬가지의 전기영동 이동도를 나타냈다. 이것은, 보다 빠른 영동 밴드가 Dual/LINC-Ig임을 시사한다. 항체 시료에 있어서의 짝을 이루지 않는 시스테인을 갖는 Dual-LINC-Ig(unLINC 포맷)의 퍼센티지는, "UnLINC" 포맷에 대응하는 느린 밴드/상측의 밴드의 강도를, "LINC" 및 "UnLINC" 구조에 대응하는 2개의 밴드의 강도의 합계로 나누는 것에 의해 산출할 수 있다.
[도 4] 다양한 환원제에 의한 처리 후의 Dual-LINC-Ig의 비환원 SDS-PAGE를 나타낸다. "-"는 "CuSO4 첨가 없음"을 나타낸다. "+"는, 오버나이트(O/N) 재산화 시의 25μM/50μM CuSO4의 첨가를 나타낸다.
[도 5] 다양한 농도의 Dual-LINC-Ig에서의, TCEP 처리 후의 Dual-LINC-Ig의 비환원 SDS-PAGE를 나타낸다.
[도 6] 다양한 인큐베이션 기간에서의, TCEP 처리 후의 Dual-LINC-Ig의 비환원 SDS-PAGE를 나타낸다. 항체 시료중의 짝을 이루지 않는 시스테인을 갖는 Dual-LINC-Ig(unLINC 포맷)의 퍼센티지는, "UnLINC" 포맷에 대응하는 느린 밴드/상측의 밴드의 강도를, "LINC" 및 "UnLINC" 구조에 대응하는 2개의 밴드의 합계로 나누는 것에 의해 산출할 수 있다.
[도 7] 조작된 다이설파이드 결합을, 항체가, 예를 들어 CH1 영역에 갖지 않을("짝을 이루지 않는 시스테인" 형태) 때에만 표적 항체(예를 들어, CH1 영역 내의 에피토프)에 결합하는, 입체 구조 특이적 항체(예를 들어, 입체 구조 특이적 항CH1 항체)로서, 예를 들어, 조작된 다이설파이드 결합에 의해 야기되는 2개의 Fab 사이의 입체 장애 또는 짧은 거리에 기인하여, 조작된 다이설파이드 결합을 표적 항체가 가질("짝을 이루는 시스테인" 형태) 때에는, 해당 에피토프가 입체 구조 특이적 항체에 액세스할 수 없는, 입체 구조 특이적 항체의 개념을 나타내는 모식도이다.
[도 8] 3개의 Fab를 포함하는 Dual/LINC(1+2) 항체 포맷으로서, Fab 중 2개(각각 쇄 1-쇄 5 및 쇄3-쇄 4로 구성되는, Fab B 및 Fab C)가 각각, (양 Fab를 연결하는 조작된 다이설파이드 결합을 형성할 수 있고, 따라서 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태 또는 "짝을 이루는 시스테인" 형태의 어느 것인가로 존재할 수 있는) 조작된 시스테인을 포함하고, 또한 1개의 Fab(쇄 1-쇄 2로 구성되는 Fab A)가, 조작된 시스테인을 포함하지 않는("짝을 이루는 시스테인" 형태로만 존재하는), Dual/LINC(1+2) 항체 포맷을 도시한다. (a) Fab A의 CH1은, "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태/입체 구조 상태이며, Fab B 및 Fab C의 CH1은, "짝을 이루는 시스테인" 또는 "LINC" 형태/입체 구조 상태이다. (b) 입체 구조 특이적 항IgG1 CH1 항체는, "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태/입체 구조 상태에서의 IgG1의 CH1에만 결합할 수 있다. Fab A의 CH1은, IgG4 CH1 서열을 갖도록 조작되었다. 결과로서, 입체 구조 특이적 항IgG1 CH1 항체는, "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태/입체 구조 상태에서의 Dual/LINC(1+2) 항체에만 결합하지만, "짝을 이루는 시스테인" 또는 "LINC" 형태/입체 구조를 갖는 항체종에는 결합하지 않는다.
[도 9a] 입체 구조 특이적 항CH1 항체의 스크리닝을 위한 다양한 항체 포맷을 갖는 여러 가지 툴 항체의 설명도.
[도 9b] 툴 항체의 폴리펩티드쇄의 각각에 대한 아미노산 서열의 서열 번호를 나타낸다.
[도 10a] 입체 구조 특이적 항CH1 항체 FAB0133Hh/FAB0133L0001 어피니티 컬럼을 이용하는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056의 어피니티 정제에서의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
[도 10b] 입체 구조 특이적 항CH1 항체 FAB0133Hh/FAB0133L0001 어피니티 컬럼을 이용하는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056의 어피니티 정제에 있어서 용출된 항체의 비환원 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 구체적으로는, 플로스루 획분은, 비환원 SDS-PAGE 분석에 있어서 보다 빨리 영동하는(레인 1 내지 13) 1개의 우세한 단백질 밴드에 의해 나타나는 "짝을 이루는 시스테인" 또는 "LINC" 형태인 DualAE05/DualAE05-FF056을 고순도로 포함하고(플로스루: 백색의 바); 세정 획분은, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태인 DualAE05/DualAE05-FF056과 "짝을 이루는 시스테인" 형태인 DualAE05/DualAE05-FF056의 혼합물을 포함하고(세정액: 회색의 바); 또한 용출 획분은, 비환원 SDS-PAGE 분석에 있어서 보다 느리게 영동하는(레인 20 내지 23) 1개의 우세한 단백질 밴드에 의해 나타나는 "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태인 DualAE05/DualAE05-FF056을 우세하게 포함한다(50mM HCl 산 용출액: 흑색 바). 항체 시료의 순도는, 비환원 SDS-PAGE의 밴드의 덴시토메트리에 의해 결정되었다. 본 명세서에 나타내는 미염색 겔의 화상은, ChemiDoc Imaging Systems(Bio-Rad)에 의해 포착되고, LINC-Ig 항체의 unLINC 및 LINC 형태의 단백질 밴드의 덴시토메트리 분석은, Image Lab Software(Bio-Rad)를 이용하여 실시되었다. unLINC 형태는, 입체 구조의 차이에 기인하여, LINC 형태보다 조금 느리게 영동했다. 보다 고순도의 항체를 얻기 위해서, 30-40%의 unLINC 형태를 함유하는 단백질 시료(인풋이라고 표시된다)가 항CH1 컬럼에 적용되었다.
본 명세서에 있어서 기재 또는 참조되는 기법 및 수순은, 대체로 충분히 이해되고 있고, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, 및 Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)에 기재되는 널리 이용되고 있는 방법론 등의 종래의 방법론을 사용하여 당업자에 의해 일반적으로 이용되는 것이다.
이하의 정의 및 상세한 설명은, 본 명세서에 있어서 설명하는 본 개시의 이해를 용이하게 하기 위해서 제공된다.
정의
아미노산
본 명세서에 있어서, 아미노산은, 1문자 코드 혹은 3문자 코드 또는 그 양쪽, 예를 들어, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, 또는 Val/V에 의해 기재된다.
아미노산의 개변
항원 결합 분자의 아미노산 서열 중의 아미노산 개변(본 명세서에 있어서 "아미노산 치환" 또는 "아미노산 변이"라고도 기재된다)을 위해서는, 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) 및 중복 신장 PCR 등의 공지된 방법이 적절히 채용될 수 있다. 더욱이, 비천연 아미노산으로 치환하기 위한 아미노산 개변 방법으로서 몇몇 공지된 방법도 또한 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; 및 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들어, 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합한 tRNA를 포함하는 무세포 번역계(Clover Direct (Protein Express))를 이용하는 것이 적절하다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 개변의 부위를 기재할 때의 용어 "및/또는"의 의미는, "및"과 "또는"이 적절히 조합된 모든 조합을 포함한다. 구체적으로는, 예를 들어, "33위, 55위, 및/또는 96위의 아미노산이 치환되어 있는"은, 아미노산 개변의 이하의 배리에이션을 포함한다: (a) 33위, (b) 55위, (c) 96위, (d) 33위 및 55위, (e) 33위 및 96위, (f) 55위 및 96위, 및 (g) 33위, 55위, 및 96위의 아미노산.
더욱이, 본 명세서에 있어서, 아미노산의 개변을 나타내는 표현으로서, 특정의 위치를 나타내는 숫자의 앞 및 뒤에, 각각 개변 전 및 개변 후의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드를 나타내는 표현이 적절히 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 가변 영역 중에 포함되는 아미노산을 치환할 때에 이용되는 N100bL 또는 Asn100bLeu라고 하는 개변은, 100b위(Kabat 넘버링에 의한다)에 있어서의 Asn의, Leu에 의한 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는 Kabat 넘버링에 따른 아미노산의 위치를 나타내고, 숫자 앞에 기재되는 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는 치환 전의 아미노산을 나타내고, 숫자 뒤에 기재되는 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는 치환 후의 아미노산을 나타낸다. 마찬가지로, 항체 정상 영역 중에 포함되는 Fc 영역의 아미노산을 치환할 때에 이용되는 P238D 또는 Pro238Asp라고 하는 개변은, 238위(EU 넘버링에 의한다)에 있어서의 Pro의, Asp에 의한 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는 EU 넘버링에 따른 아미노산의 위치를 나타내고, 숫자 앞에 기재되는 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는 치환 전의 아미노산을 나타내고, 숫자 뒤에 기재되는 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는 치환 후의 아미노산을 나타낸다.
폴리펩티드
본 명세서에서 이용되는 용어 "폴리펩티드"는, 아마이드 결합(펩티드 결합으로서도 알려짐)에 의해 직쇄상으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성되는 분자를 가리킨다. 용어 "폴리펩티드"는, 2아미노산 이상의 임의의 쇄를 가리키고, 특정의 길이의 산물을 가리키는 것은 아니다. 따라서, 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산쇄", 또는 2아미노산 이상의 쇄를 가리키기 위해서 이용되는 임의의 다른 용어는, "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는, 이들 용어의 어느 것 대신에 또는 서로 교환 가능하게 이용되어도 된다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 한정되지 않지만, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호기/블로킹기에 의한 유도체화, 단백질 절단, 또는 비천연 아미노산에 의한 수식을 포함하는, 폴리펩티드의 발현 후 수식의 산물을 가리키는 것도 의도한다. 폴리펩티드는, 천연의 생물학적 공급원에서 유래해도 되고, 또는 재조합 기술에 의해 산생되어도 되지만, 반드시 지정된 핵산으로부터 번역될 필요는 없다. 그것은, 화학 합성을 포함하는, 임의의 방법으로 생성되어도 된다. 본 명세서에 있어서 기재되는 폴리펩티드는, 약 3아미노산 이상, 5아미노산 이상, 10아미노산 이상, 20아미노산 이상, 25아미노산 이상, 50아미노산 이상, 75아미노산 이상, 100아미노산 이상, 200아미노산 이상, 500아미노산 이상, 1,000아미노산 이상, 또는 2,000아미노산 이상의 사이즈의 것이어도 된다. 폴리펩티드는 규정된 삼차원 구조를 가질 수 있지만, 그들은 반드시 그와 같은 구조를 가질 필요는 없다. 규정된 삼차원 구조를 갖는 폴리펩티드는, 절첩(folding)되었다고 칭해지고, 규정된 삼차원 구조를 갖지 않지만 다수의 상이한 입체 구조를 취할 수 있는 폴리펩티드는, 절첩되어 있지 않다고 칭해진다.
퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 얻도록 서열을 정렬시키고 또한 필요하면 갭을 도입한 후의, 또한, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부라고 생각하지 않는다고 했을 때의, 참조 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의, 백분율비로서 정의된다. %아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적의 얼라인먼트는, 당해 기술 분야에 있어서의 기술의 범위 내에 있는 여러 가지 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 등의, 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 당업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 얼라인먼트를 달성하기 위해서 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열의 얼라인먼트를 취하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그렇지만, 본 명세서에 있어서의 목적을 위해서, %아미노산 서열 동일성치는, 서열 비교 컴퓨터 프로그램인 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은, 제넨테크사의 저작이며, 그 원시 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559)에 사용자용 서류와 함께 제출되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은, 제넨테크사(Genentech, Inc., South San Francisco, California)로부터 공적으로 입수 가능하고, 원시 코드로부터 컴파일해도 된다. ALIGN-2 프로그램은, Digital UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX operating system 상에서의 사용을 위해서 컴파일된다. 모든 서열 비교 파라미터는, ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변동하지 않는다. 아미노산 서열 비교에 ALIGN-2가 이용되는 상황에서는, 소여의 아미노산 서열 A의, 소여의 아미노산 서열 B에의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한 %아미노산 서열 동일성(혹은, 소여의 아미노산 서열 B에의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한, 어느 %아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 소여의 아미노산 서열 A라고 할 수도 있다)은, 다음과 같이 계산된다:
분율 X/Y의 100배
여기에서, X는 서열 얼라인먼트 프로그램 ALIGN-2에 의해, 당해 프로그램의 A 및 B의 얼라인먼트에 있어서 동일한 일치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 전수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에의 %아미노산 서열 동일성은, B의 A에의 %아미노산 서열 동일성과 동일하지 않은 것이, 이해될 것이다. 특별히 별도로 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 %아미노산 서열 동일성치는, 직전의 단락에서 기술한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻어지는 것이다.
재조합의 방법 및 구성
예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재되는 대로, 항체 및 항원 결합 분자는 재조합의 방법이나 구성을 이용하여 제조할 수 있다. 하나의 태양에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체를 코딩하는, 단리된 핵산이 제공된다. 그와 같은 핵산은, 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩해도 된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 1개 또는 복수의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이와 같은 태양의 하나에서는, 숙주 세포는, (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는, (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터와 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다(예를 들어, 형질 전환되어 있다). 하나의 태양에 있어서, 숙주 세포는, 진핵성이다(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프계의 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포)). 하나의 태양에 있어서, 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 전술한 바와 같이 당해 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 및 임의로, 당해 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자를 제작하는 방법이 제공된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항체의 재조합 제조를 위해서, (예를 들어, 전술한 것 등의) 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가적인 클로닝 및/또는 숙주 세포 중에서의 발현을 위해서, 1개 또는 복수의 벡터에 삽입한다. 그와 같은 핵산은, 종래의 수순를 이용하여 용이하게 단리 및 서열 결정될 것이다(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써).
항체를 코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현에 호적한 숙주 세포는, 본 명세서에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요해지지 않는 경우는, 세균으로 제조해도 된다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 관해서, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참조할 것. (더하여, 대장균(E. coli)에 있어서의 항체 단편의 발현에 대해 기재한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254도 참조할 것.) 발현 후, 항체는 세균 세포 페이스트로부터 가용성 프랙션 중에 단리 되어도 되고, 또한 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 부분적인 또는 완전한 인간의 글리코실화 패턴을 수반하는 항체의 산생을 가져오는, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있는 균류 및 효모의 주를 포함하는, 사상균 또는 효모 등의 진핵성의 미생물은, 항체 코드 벡터의 호적한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)를 참조할 것.
다세포 생물(무척추 생물 및 척추 생물)에서 유래하는 것도 또한, 글리코실화된 항체의 발현을 위해서 호적한 숙주 세포이다. 무척추 생물 세포의 예는, 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와의 접합, 특히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질 전환에 이용되는, 수많은 바큘로바이러스주가 동정되어 있다.
식물세포 배양물도, 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호(트랜스제닉 식물로 항체를 산생하기 위한, PLANTIBODIES(상표) 기술을 기재)를 참조할 것.
척추동물 세포도 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 부유 상태에서 증식하도록 적응된 포유동물 세포주는, 유용할 것이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는, SV40으로 형질 전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7); 인간 태아성 신주(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) 등에 기재된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 서톨리 세포(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) 등에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카녹색원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁 경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); Buffalo계 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방암(MMT 060562); TRI 세포(예를 들어, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기재); MRC5 세포; 및, FS4 세포 등이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는, DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0, 및 Sp2/0 등의 골수종 세포주를 포함한다. 항체 산생에 호적한 특정의 포유동물 숙주 세포주의 총설로서, 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조할 것.
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자의 재조합 산생은, 항원 결합 분자 전체 또는 항원 결합 분자의 일부를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 1개 또는 복수의 벡터를 포함하는(예를 들어, 그에 의해 형질 전환되어 있는) 숙주 세포를 이용하는 것에 의해, 상기에 기재된 것과 마찬가지의 방법으로 행할 수 있다.
항원 결합 분자 및 다중 특이성 항원 결합 분자
본 명세서에서 이용되는 용어 "항원 결합 분자"는, 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 분자, 또는 항원에 대한 결합 활성을 갖는 임의의 분자를 가리키고, 약 5아미노산 이상의 길이를 갖는 펩티드 또는 단백질 등의 분자를 추가로 가리킬 수 있다. 펩티드 및 단백질은, 생물에서 유래하는 것으로 한정되지 않고, 예를 들어, 그들은, 인공적으로 설계된 서열로부터 산생된 폴리펩티드여도 된다. 그들은, 천연 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등의 어느 것이어도 된다. 스캐폴드로서 α/β 배럴 등의 공지된 안정된 입체 구조를 포함하고, 분자의 일부가 항원 결합 부위가 되는, 스캐폴드 분자도 또한, 본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자의 일 태양이다.
"다중 특이성 항원 결합 분자"는, 2개 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 가리킨다. 용어 "이중 특이성"은, 항원 결합 분자가, 적어도 2종류의 상이한 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 용어 "삼중 특이성"은, 항원 결합 분자가 적어도 3종류의 상이한 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다.
특정의 태양에 있어서, 본 출원의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 삼중 특이성 항원 결합 분자, 즉, 3종류의 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 즉, CD3 또는 CD137의 어느 한쪽에 결합할 수 있지만, 양쪽 항원에 동시에는 결합하지 않고, 또한 DLL3에 특이적으로 결합할 수 있는, 삼중 특이성 항원 결합 분자이다.
어느 국면에 있어서, 본 개시는, 이하:
각각이 CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
제 3 항원, 바람직하게는 암 세포/조직 상에 발현하고 있는 항원에 결합할 수 있는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다.
어느 국면에 있어서, 본 개시는, 이하:
각각이 CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분은 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는, 항체 가변 영역을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분은 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는, 항체 가변 영역을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, Fab 분자이며, 또한 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 포함하고, 바람직하게는, 적어도 1개의 다이설파이드 결합은, 힌지 영역 내에는 없는 아미노산 잔기(시스테인) 사이에, 바람직하게는, 각 항원 결합 부분의 CH1 영역 내의 아미노산 잔기(시스테인) 사이에 형성된다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, Fab 분자이며, 또한 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 아미노산 잔기(시스테인) 사이에 형성되는 1개의 다이설파이드 결합을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽에 융합된다.
어느 국면에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은 Fab 또는 scFv이다.
어느 국면에 있어서, 제 1, 제 2, 및 제 3 항원 결합 부분의 각각은 Fab 분자이며, 제 3 항원 결합 부분은, Fab 중쇄(CH1)의 C말단에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합되어 있다.
어느 국면에 있어서, 펩티드 링커는, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분은 제 2 항원 결합 부분과 동일하다.
어느 국면에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이며, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 종래형의 Fab 분자이다.
어느 국면에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL에 있어서, 123위 및/또는 124위에 있는 아미노산은 독립적으로, 리신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H)에 의해 치환되고(Kabat에 의한 넘버링), 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위에 있는 아미노산 및/또는 213위에 있는 아미노산은 독립적으로, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 치환되어 있다(EU 넘버링에 따른 넘버링).
어느 국면에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 경쇄의 정상 도메인 CL, 123위 및 124위에 있는 아미노산은 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및 213위에 있는 아미노산은 글루탐산(E)이다(EU 넘버링에 따른 넘버링).
어느 국면에 있어서, DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은, 이하의 (a1) 내지 (a5):
(a1) 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 276의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 277의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 278의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 279의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 280의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 281의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 285의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 286의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 287의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 288의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 289의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 290의 경쇄 CDR 3;
(a4) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a5) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는, 항체 가변 영역을 포함한다.
어느 국면에 있어서, DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은, 이하(a1) 내지 (a6):
(a1) 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 264의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 265의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 266의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 267의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 268의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 269의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) (a1) 내지 (a4)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a6) (a1) 내지 (a4)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는, 항체 가변 영역을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, Fc 도메인은, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타낸다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, 천연형 IgG의 Fc 영역의 것과 비교하여, 산성 pH 조건(예를 들어, pH 5.8) 하에서 증강된 FcRn 결합 활성을 나타낸다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 434위에 Ala; 438위에 Glu, Arg, Ser, 또는 Lys; 및 440위에 Glu, Asp, 또는 Gln을 포함한다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 434위에 Ala; 438위에 Arg 또는 Lys; 및 440위에 Glu 또는 Asp를 포함한다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 428위에 Ile 혹은 Leu; 및/또는 436위에 Ile, Leu, Val, Thr, 혹은 Phe를 추가로 포함한다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 이하:
(a) N434A/Q438R/S440E;
(b) N434A/Q438R/S440D;
(c) N434A/Q438K/S440E;
(d) N434A/Q438K/S440D;
(e) N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f) N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(g) N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(h) N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(i) N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(j) N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(k) N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(l) N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(m) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;
(n) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;
(o) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;
(p) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;
(q) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;
(r) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;
(s) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;
(t) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;
(u) M428L/N434A/Q438R/S440E;
(v) M428L/N434A/Q438R/S440D;
(w) M428L/N434A/Q438K/S440E;
(x) M428L/N434A/Q438K/S440D;
(y) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(z) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(aa) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(ab) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(ac) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(ad) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(ae) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(af) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(ag) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; 및
(ah) L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, M428L/N434A/Q438R/S440E의 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, IgG Fc 도메인, 바람직하게는 인간 IgG Fc 도메인, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, 이하:
(a) 서열 번호: 100에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 Fc 서브유닛 및 서열 번호: 111에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 2 Fc 서브유닛; 또는
(b) 서열 번호: 99에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 Fc 서브유닛 및 서열 번호: 109에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 제 2 Fc 서브유닛
의 어느 하나를 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은 Fab이며, 제 1 항원 결합 부분은, Fab 중쇄의 C말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유닛의 N말단에 융합되고, 또한 제 2 항원 결합 부분은, Fab 중쇄의 C말단에서 Fc 도메인의 나머지의 서브유닛의 N말단에 융합되어 있다.
어느 국면에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은, C말단에서, 제 1 항원 결합 부분 또는 제 2 항원 결합 부분의 어느 한쪽의 Fab 중쇄의 N말단에, 임의로 펩티드 링커를 개재시켜, 융합된다.
어느 국면에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하의 (a1) 내지 (a15):
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5)
로부터 선택되는 조합의 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하고; 바람직하게는, 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)는, 도 1(a)에 나타내는 배향에 따라 서로 접속 및/또는 회합하고 있다.
본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자의 구성 성분은, 다양한 배치로 서로 융합시킬 수 있다. 예시적인 배치는, 표 2와 아울러 읽는 도 1(a)에 도시된다.
상기 태양의 어느 것에 따르면, 다중 특이성 항원 결합 분자의 구성 성분(예를 들어, 항원 결합 부분, Fc 도메인)은, 직접적으로, 또는 여러 가지 링커, 특히, 본 명세서에 있어서 기재되어 있거나 또는 당 기술 분야에 있어서 공지인 1개 혹은 복수의 아미노산, 전형적으로는 약 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해서, 융합시켜도 된다. 적절한 비면역원성 펩티드 링커에는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n, 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커가 포함되고, 여기에서, n은 대체로 1 내지 10, 전형적으로는 2 내지 4의 수이다.
파이로글루타밀화
항체가 세포에 있어서 발현되었을 경우, 항체는 번역 후에 수식됨이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄의 C말단에 있는 리신의, 카복시펩티다제에 의한 절단; 중쇄 및 경쇄의 N말단에 있는 글루타민 또는 글루탐산의, 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산에의 수식; 글리코실화; 산화; 탈아마이드; 및 당화를 들 수 있고, 그와 같은 번역 후 수식은 여러 가지 항체에서 생김이 공지되어 있다(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447).
몇몇 태양에서는, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자에는, 번역 후 수식도 포함된다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄 가변 영역의 N말단에서의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C말단에서의 리신의 결실을 받고 있는 것을 들 수 있다. 당 분야에 있어서, N말단에서의 파이로글루타밀화 및 C말단에서의 리신의 결실에 의한 그와 같은 번역 후 수식이, 항체의 활성에 어떤 영향을 갖지 않음은 공지되어 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
항원 결합 부분
본 명세서에서 이용되는 용어 "항원 결합 부분"은, 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 가리킨다. 하나의 태양에 있어서, 항원 결합 부분은, 그것이 결합하고 있는 실체를, 표적 부위, 예를 들어 암 항원(DLL3)을 발현하는 특정의 종류의 종양 세포로 방향지을 수 있다. 다른 태양에 있어서, 항원 결합 부분은, 그 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원(특히, CD3) 및/또는 공자극 수용체(CD137)를 통해서 시그널 전달을 활성화할 수 있다. 항원 결합 부분에는, 본 명세서에 있어서 추가로 정의되는 항체 및 그 단편이 포함된다. 구체적인 항원 결합 부분으로서는, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인 또는 항체 가변 영역을 들 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 항원 결합 부분은, 본 명세서에 있어서 추가로 정의되고 또한 당 기술 분야에 있어서 공지된 항체 정상 영역을 포함해도 된다. 유용한 중쇄 정상 영역에는, 5개의 아이소타입: α, δ, ε, γ, 또는 μ의 어느 것이 포함된다. 유용한 경쇄 정상 영역에는, 2개의 아이소타입: κ 및 λ의 어느 것이 포함된다.
항원 결합 부분 등에 관해서, 본 명세서에서 이용되는 용어 "제 1", "제 2", 및 "제 3"은, 2종류 이상의 종류별의 부분 등이 존재하는 경우에 구별한다고 하는 편리성을 위해서 이용된다. 이들 용어의 사용은, 특별히 명시하지 않는 한, 다중 특이성 항원 결합 분자의 특정의 순서 또는 방향을 부여하는 것을 의도하지 않는다.
CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만 CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는 항원 결합 부분
본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 적어도 1개의 항원 결합 부분(본 명세서에 있어서 "Dual 항원 결합 부분" 또는 "제 1 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab" 또는 "Dual-Ig"라고도 칭해진다)을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 2개의 Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 2개의 Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")의 각각은, CD3 또는 CD137에 대한 1가의 결합을 제공하지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는다. 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 2개 이내의 Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")을 포함한다.
특정의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은 일반적으로, Fab 분자, 특히 종래형의 Fab 분자이다. 특정의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분")은, 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역(VL 및 VH)을 포함하는 도메인이다. 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, 그와 같은 도메인의 적절한 예로서는, "단쇄 Fv(scFv)", "단쇄 항체", "Fv", "단쇄 Fv2(scFv2)", "Fab", "F(ab＇)2" 등을 들 수 있다.
특정의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, CD3의 전체 혹은 그 부분 펩티드의 일부분에 특이적으로 결합한다. 특정의 태양에 있어서, CD3은 인간 CD3 또는 필리핀원숭이 CD3, 특히 인간 CD3이다. 특정의 태양에 있어서, 제 1 항원 결합 부분은, 인간 및 필리핀원숭이 CD3에 대해 교차 반응성을 갖는다(즉, 그들에 특이적으로 결합한다). 몇몇 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, CD3의 ε 서브유닛, 특히, 서열 번호: 7(NP_000724.1)(괄호 내에 RefSeq 등록 번호를 나타낸다)에 나타나는 CD3의 인간 CD3ε 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 진핵세포의 표면 상에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 제 1 항원 결합 부분은, T 세포의 표면 상에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 결합한다.
특정의 태양에 있어서, CD137은 인간 CD137이다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 적합한 예에는, 이하:
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC 서열(서열 번호: 21)을 포함하는 영역을 인식하는 항체,
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC 서열(서열 번호: 35)을 포함하는 영역을 인식하는 항체,
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC 서열(서열 번호: 49)을 포함하는 영역을 인식하는 항체, 및
인간 CD137 단백질 중의 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC 서열(서열 번호: 105)을 포함하는 영역을 인식하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체에 의해 결합되는 인간 CD137 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")을 들 수 있다.
특정의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 이하의 표 1A에 나타나는 항체 가변 영역 서열 중 어느 1개를 포함한다. 특정의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 표 1A에 나타나는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합 중 어느 1개를 포함한다.
[표 1A]
하나의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 6에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 58에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 14에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 58에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 81에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 58에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정의 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은, 이하의 표 1B에 나타나는 HVR 서열의 조합 중 어느 1개를 포함한다.
[표 1B]
몇몇 태양에 있어서, Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")은 각각,
서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
을 포함하는, 항체 가변 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 Dual 항원 결합 부분("제 1 항원 결합 부분" 또는 "제 2 항원 결합 부분" 또는 "Dual-Fab")에는, 번역 후 수식도 포함된다. 번역 후의 예로서는, 중쇄 가변 영역의 N말단에서의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C말단에서의 리신의 결실을 받고 있는 것이 들 수 있다. 당 분야에 있어서, N말단에서의 파이로글루타밀화 및 C말단에서의 리신의 결실에 의한 그와 같은 번역 후 수식은, 항체의 활성에 대해서 어떠한 영향도 갖지 않음이 알려져 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분
본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 델타양 3(DLL3)에 결합할 수 있는 항원 결합 부분(본 명세서에 있어서 "DLL3 항원 결합 부분" 또는 "제 3 항원 결합 부분"이라고도 불린다)을 적어도 1개 포함한다. 어느 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, DLL3에 결합할 수 있는 1개의 항원 결합 부분을 포함한다. 어느 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분("DLL3 항원 결합 부분")을 2개 포함한다. 특정의 그와 같은 태양에 있어서, 이들 항원 결합 부분의 각각은, DLL3의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 보다 더 구체적인 태양에 있어서, 이들 "DLL3 항원 결합 부분"의 모두는 동일하다. 하나의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, DLL3에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자("DLL3 항원 결합 부분")를 포함한다. 하나의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, DLL3에 결합할 수 있는 항원 결합 부분("DLL3 항원 결합 부분")을 2개 이하 포함한다.
어느 특정의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 크로스오버 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 정상 영역 중 한쪽이 교환되어 있는 DLL3 분자이다. 어느 특정의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자이다.
몇몇 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, DLL3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, DLL3의 세포외 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 진핵세포의 표면 상에 발현하고 있는 DLL3 단백질에 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 암 세포의 표면 상에 발현하고 있는 DLL3 단백질에 결합한다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 세포외 도메인(ECD) 내, 즉, N말단으로부터 TM 영역의 직전까지이지만, TM 영역 또는 C말단 세포내 도메인까지가 아닌 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, ECD 내의 전술한 도메인/영역의 어느 것 중의 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역 내의 에피토프에 결합한다. 보다 구체적으로는, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3에 있어서 서열 번호: 89로 정의되는 영역 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, 혹은 EGF6 영역, 또는 EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역, 또는 인간 DLL3의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, 혹은 EGF6 영역, 또는 EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역 내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 결합되는 DLL3 에피토프가 특성 해석되어 있는, 지금까지 보고되어 있는 항DLL3 항체(예를 들어, WO2019131988 및 WO2011093097)에서 유래할 수 있다.
특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 이하의 표 1C에 나타나는 항체 가변 영역 서열 중 어느 1개를 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 표 1C에 나타나는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역과의 조합 중 어느 1개를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 표 1C에 나타나는 항체 가변 영역의 어느 1개와 DLL3에의 결합에 대해 경합하는 항체 가변 단편을 포함하는 도메인을 포함한다.
[표 1C]
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 232에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 236에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 300에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 236에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 300의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 301에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 236에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 301의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 274에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 275에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 274의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 275의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 264에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호: 265에 대해서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 264의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 265의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정의 태양에 있어서, DLL3 항원 결합 부분은, 이하의 표 1D에 나타나는 HVR 서열의 조합 중 어느 1개를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 표 1D에 나타나는 항체 가변 영역의 어느 1개와 DLL3에의 결합에 대해 경합하거나, 또는 표 1D에 나타나는 항체 가변 영역의 HVR 영역과 동일한 HVR 서열을 포함하는 어느 하나의 항체 가변 단편과 DLL3에의 결합에 대해 경합하는 항체 가변 단편을 포함하는 도메인이다.
[표 1D]
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 이하의 (a1) 내지 (a5):
(a1) 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 276의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 277의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 278의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 279의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 280의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 281의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 285의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 286의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 287의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 288의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 289의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 290의 경쇄 CDR 3;
(a4) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a5) (a1) 내지 (a3)으로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는, 항체 가변 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분에는, 번역 후 수식도 포함된다. 번역 후의 예로서는, 중쇄 가변 영역의 N말단에서의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C말단에서의 리신의 결실을 받고 있는 것을 들 수 있다. 당 분야에 있어서, N말단에서의 파이로글루타밀화 및 C말단에서의 리신의 결실에 의한 그와 같은 번역 후 수식은, 항체의 활성에 대해서 어떠한 영향도 갖지 않음이 알려져 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
다른 국면에 있어서, 본 발명의 DLL3 항원 결합 부분은, DLL3 결합 도메인을 짜넣고 있는 새로운 키메라 항원 수용체(CAR)(DLL3 CAR)에 있어서 이용할 수 있다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 발명의 DLL3 결합 도메인(및 DLL3 CAR)은, scFv 구축물을 포함한다고 생각되고, 바람직한 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 개시되는 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다고 생각되고 및 포함한다. 다른 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 DLL3 결합 도메인(및 DLL3 CAR)은, 본 명세서에 있어서 기재되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv 구축물 또는 그 단편을 포함한다고 생각된다. 바람직한 태양에 있어서, 개시되는 키메라 항원 수용체는, 증식성 장애 및 그 임의의 재발 또는 전이를 치료 또는 예방하는 데 유용하다.
어느 특정의 태양에 있어서, DLL3 단백질은, 종양 시원 세포 상에 발현하고 있다. DLL3 CAR은, 유전자 개변(예를 들어, 형질 도입)을 개재시켜 세포 상해성 림프구(바람직하게는 자기 세포 상해성 림프구) 상에 발현하여, DLL3 양성 종양 세포를 표적으로 하고 또한 그것을 살상하기 위해서 이용할 수 있는 DLL3 감수성 림프구를 가져온다. 본 명세서에 있어서 널리 논해지는 바와 같이, 본 발명의 CAR은 전형적으로는, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 어느 특정의 림프구를 활성화하여, DLL3 양성 종양 세포의 면역 반응을 생기게 하는 DLL3 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 선택되는 태양은, 개시된 CAR를 나타내는 면역학적으로 활성인 숙주 세포, 및 본 발명의 DLL3 CAR을 코딩하는 여러 가지 폴리뉴클레오티드 서열 및 벡터를 포함한다. 다른 국면에는, DLL3 CAR 분자를 발현하는 숙주 세포를 암으로 이환하고 있는 개체에게 도입하여, 개체를 처치하는 것에 의해, 개체에 있어서의 T 림프구 또는 NK 세포(NK) 세포의 활성을 증강하는 방법이 포함된다. 그와 같은 국면에는, 특히, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암) 및 흑색종이 포함된다.
다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하기 위한 방법
본 개시는, 본 명세서에 있어서 기재되는 몇개의 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
어느 국면에 있어서, 본 개시는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제조하기 위한 방법을 제공해, 해당 다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하:
각각이, Fab이며, 또한 제 1 항원 및 제 1 항원과는 상이한 제 2 항원에 결합할 수 있지만, 양쪽 항원에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
제 1 및 제 2 항원과는 상이한 제 3 항원, 바람직하게는 암 세포/조직 상에 발현하고 있는 항원에 결합할 수 있는, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제 3 항원 결합 부분
을 포함하고, 해당 방법은, 이하의 단계:
(a) 이하를 코딩하는 1개 또는 복수의 핵산을 제공하는 단계:
i. (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 임의로 중쇄 정상 영역(CH1); 및 제 1 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하는, 제 1 폴리펩티드;
ii. (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 임의로 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하는, 제 2 폴리펩티드;
iii. (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하는, 제 3 폴리펩티드;
iv. (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 임의로 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하는, 제 4 폴리펩티드; 및
v. (N말단으로부터 C말단으로) 제 1 항원 결합 부분의 VH 또는 VL, 임의로 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하는, 제 5 폴리펩티드;
(b) (a)에서 생성한 1개 또는 복수의 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계;
(c) (i) 내지 (v)에 있어서의 폴리펩티드가 발현되도록 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(d) 단계(c)에서 배양한 세포의 배양액으로부터 (i) 내지 (v)에 있어서의 5개의 폴리펩티드를 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자를 수집하는 단계
를 포함하고; 또한
임의로 (iv) 내지 (v)에 있어서의 폴리펩티드는 동일하고; 또한
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 힌지 영역 내에는 없는 적어도 1개의 시스테인 잔기를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함하고, 바람직하게는, 해당 적어도 1개의 시스테인은, CH1 영역 내에 위치하고 있고; 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기는, 바람직하게는 CH1 영역에 있어서, 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있고;
해당 방법은, 조제물을 환원 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 1개의 시스테인 잔기를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함한다.
어느 국면에 있어서, 방법은, CH1 영역(EU 넘버링에 따른 191위)에 있어서의 시스테인에 1개 또는 복수의 다이설파이드 결합을 형성시키는 환원 조건하에서, 단계(d)로부터 수집한 다중 특이성 항원 결합 분자(다중 특이성 항원 결합 분자) 조제물을 환원 시약과 접촉시키는 단계(e)를 추가로 포함한다.
어느 국면에 있어서, (환원제와 접촉시키기 전의) 단계(d)로부터 수집한 다중 특이성 항원 결합 분자 조제물은, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합만 상이한 2개 이상의 구조 아이소폼을 포함하고, 또한 환원제와 접촉시키는 단계(e)는, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자 구조 아이소폼의 집단을 우선적으로 농축하거나 또는 증가시킨다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 환원 시약의 pH는 약 3 내지 약 10이다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 환원 시약의 pH는 약 6, 7, 또는 8이다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 환원 시약의 pH는 약 7이다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 환원 시약의 pH는 약 3이다.
어느 국면에 있어서, 환원제는, TCEP, 2-MEA, DTT, 시스테인, GSH, 및 Na2SO3으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
어느 국면에 있어서, 환원제는 TCEP, 바람직하게는 0.25mM TCEP이다.
어느 국면에 있어서, 환원제의 농도는 약 0.01mM 내지 약 100mM이다.
어느 국면에 있어서, 환원제의 농도는, 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100mM, 바람직하게는 약 0.25mM이다.
어느 국면에 있어서, 접촉시키는 단계는, 적어도 30분간에 걸쳐서 실시된다.
어느 국면에 있어서, 접촉시키는 단계는, 약 10분간 내지 약 48시간에 걸쳐서 실시된다.
어느 국면에 있어서, 접촉시키는 단계는, 약 2시간 또는 약 18시간에 걸쳐서 실시된다.
어느 국면에 있어서, 접촉시키는 단계는, 약 4℃ 내지 37℃의 온도에서, 바람직하게는 23℃ 내지 25℃에서 실시된다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 환원제와 접촉시키는 단계 전에 적어도 부분적으로 정제된다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 접촉시키는 단계 전에 어피니티 크로마토그래피(바람직하게는 프로틴 A 크로마토그래피)에 의해 부분적으로 정제된다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 농도는, 약 0.1mg/ml 내지 약 50mg/ml 또는 그것을 상회한다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 농도는 약 10mg/ml 또는 약 20mg/ml이다.
어느 국면에 있어서, 방법은, 바람직하게는 투석 또는 버퍼 교환에 의해 바람직하게는 환원제를 제거하는 것에 의해, 시스테인 다이설파이드 결합의 재산화를 촉진하는 단계를 추가로 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은 종래형의 Fab이며, 또한
(a) 제 1 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 제 1 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하고;
(b) 제 2 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하고;
(c) 제 3 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하고;
(d) 제 4 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하고; 또한
(e) 제 5 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 1 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은, (Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는) VH/VL 크로스오버 Fab이며, 또한
(a) 제 1 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VL, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 제 1 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하고;
(b) 제 2 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 3 항원 결합 부분의 VH, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하고;
(c) 제 3 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VH, 중쇄 정상 영역(CH1); 및 임의로 힌지 영역 및/또는 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 포함하고;
(d) 제 4 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 2 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함하고; 또한
(e) 제 5 폴리펩티드는, (N말단으로부터 C말단으로) 제 1 항원 결합 부분의 VL, 및 경쇄 정상 영역(CL)을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 CL에 있어서, 123위 및 124위에 있는 아미노산은 각각, 아르기닌(R) 및 리신(K)이며(Kabat에 의한 넘버링), 또한 제 1 및 제 2 항원 결합 부분의 각각의 중쇄의 정상 도메인 CH1에 있어서, 147위 및 213위에 있는 아미노산은 글루탐산(E)이다(EU 넘버링에 따른 넘버링).
어느 국면에 있어서, 단계(a) (i)에 있어서, 제 1 폴리펩티드는, 제 3 항원 결합 부분과 제 1 항원 결합 부분의 VH 또는 VL의 사이에, 펩티드 링커를 추가로 포함한다.
어느 국면에 있어서, 펩티드 링커는, 서열 번호: 248, 서열 번호: 249, 또는 서열 번호: 259의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137의 양쪽에 동시에는 결합하지 않는다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분은 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는, 항체 가변 영역을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분은 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는, 항체 가변 영역을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 제 3 항원 결합 부분은, DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있다.
어느 국면에 있어서, DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함한다.
어느 국면에 있어서, DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분은, 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함한다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
어느 국면에 있어서, Fc 도메인은, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, 해당 Fc 도메인은, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타낸다.
어느 국면에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하의 (a1) 내지 (a15):
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
로부터 선택되는 조합의 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하고; 또한
바람직하게는, 해당 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)는, 도 1(a)에 나타내는 배향에 따라 서로 접속 및/또는 회합하고 있다.
어느 국면에 있어서, 제 4 폴리펩티드(쇄 4) 및 제 5 폴리펩티드(쇄 5)는 동일하다.
어느 국면에 있어서, 1개의 핵산만, 또는 2, 3, 4 혹은 5개의 상이한 핵산이, 제 1, 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 폴리펩티드를 코딩하고 또한 발현한다.
환원 시약과의 접촉
"접촉시키는"은, 용액 중에서 그것에 제공하는 것, 폭로하는 것을 의미한다. 항체, 단백질, 또는 폴리펩티드는, 고체 지지체(예를 들어, 어피니티 컬럼 또는 크로마토그래피 매트릭스)에 결합시킨 상태에서, 환원 시약을 접촉시킬 수 있다. 바람직하게는, 용액은 완충화된다. 바람직한 입체 구조를 갖는 항체/단백질의 수량을 최대화하기 위해서, 용액의 pH는, 항체/단백질의 안정성을 보호하고, 다이설파이드 교환을 최적화하도록 선택된다. 본 발명의 실시에 있어서, 용액의 pH는 바람직하게는 강산성은 아니다. 따라서, 일부의 pH 범위는 pH 5를 상회하고, 바람직하게는 약 pH 6 내지 약 pH 11, 보다 바람직하게는 약 pH 7 내지 약 pH 10, 보다 더 바람직하게는 약 pH 6 내지 약 pH 8이다. 본 발명의 하나의 비한정적인 태양에 있어서, 최적인 pH는 약 pH 7임이 발견되었다. 그렇지만, 본 발명의 특정의 태양에서의 최적 pH는, 당업자에 의해 실험적으로 용이하게 결정할 수 있다.
이하의 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, UnLINC 포맷(즉, 조작된 다이설파이드 결합 또는 "짝을 이루는 시스테인"을 갖지 않는 3가 1+2 항체)의 존재는, 짝을 이루지 않는 Cys 잔기를 "캐핑"하여 LINC 형성(조작된 다이설파이드 결합의 형성)을 방해하는 시스테인화(cysteinylation) 및 글루타티온화(glutathionylation) 등, 유리 싸이올기를 함유하는 분자와 다이설파이드 결합을 많은 경우 형성하는, 짝을 이루지 않는 Cys 잔기에 기인할 가능성이 있다고 생각된다. 도 2(b)에 나타나는 바와 같이, 짝을 이루지 않는 시스테인의 캐핑된 분자를 제거하기 위해서, 환원제는 표면 시스테인의 탈캐핑을 도울 수 있고, 탈캐핑된 항체의 추가적인 재산화(예를 들어, 버퍼 교환에 의한 환원 시약의 제거)는, LINC 형성을 위한 탈캐핑된 시스테인 사이의 다이설파이드 결합 형성을 촉진할 수 있다. 따라서, 환원 및 재산화에 의한 UnLINC 포맷에 있어서의 짝을 이루지 않는 설프하이드릴로부터의 시스테인화의 제거는, UnLINC 포맷을 제거하여, 항체의 균일성을 향상시킬 수 있다.
용어 "환원 시약"과 "환원제"는 호환적으로 이용된다. 몇몇 태양에 있어서, 상기 환원제는 유리 싸이올이다. 환원 시약은 바람직하게는, 글루타티온(GSH), 다이싸이오트레이톨(DTT), 2-머캅토에탄올, 2-아미노에테인싸이올(2-MEA), TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀), 다이싸이오나이트로벤조에이트, 시스테인, 및 Na2SO3으로 이루어지는 군으로부터의 화합물로 구성된다. 몇몇 태양에 있어서, TCEP, 2-MEA, DTT, 시스테인, GSH, 또는 Na2SO3을 이용할 수 있다. 몇몇 바람직한 태양에 있어서, 2-MEA를 이용할 수 있다. 몇몇 바람직한 태양에 있어서, TCEP를 이용할 수 있다.
환원제는, 재조합 단백질을 생성하는 세포를 증식시키는 발효 배지에 가해져도 된다. 추가의 태양에 있어서, 환원제는, 재조합 단백질을 분리하기 위한 LC 분리 단계 시에 LC 이동상에 가해져도 된다. 어느 특정의 태양에 있어서, 단백질은 LC 컬럼의 고정상에 고정화되고, 환원제는 이동상의 일부이다. 특정의 태양에 있어서, 미처리의 IgG 항체는, 피크의 수에 의해 나타나는 불균일한 혼합물로서 용출될 수 있다. 환원/산화 커플링 시약의 사용은, 보다 단순하고 또한 보다 균일한 피크 패턴을 생기게 한다. 관심 대상의 이러한 보다 균일한 피크는, IgG의 보다 균일한 조제물로서 단리될 수 있을 것이 기도된다.
환원제는, 바람직한 입체 구조(예를 들어, 항체의 2개의 Fab 사이, 예를 들어 힌지 영역 내에 없는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 1개 또는 복수의 조작된 다이설파이드 결합을 갖는 "짝을 이루는 시스테인" 형태의 항체)의 상대적 비율을 증가시키는 데 충분한 농도로 존재한다. 환원제의 최적 절대 농도 및 몰비는, 총IgG 및 일부의 상황에서는 특정의 IgG 서브클래스의 농도에 의해 정해진다. IgG1 분자를 조제하는 데 이용하는 경우, 그것은, 단백질 중의 짝을 이루지 않는 시스테인의 수 및 액세스 용이성에 의해서도 정해진다. 일반적으로, 환원제로부터의 유리 싸이올의 농도는, 약 0.05mM 내지 약 100mM, 보다 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 50mM, 보다 더 바람직하게는 약 0.2mM 내지 약 20mM일 수 있다. 몇몇 바람직한 태양에 있어서, 환원제의 농도는, 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100mM이다. 몇몇 바람직한 태양에 있어서, 0.05mM 내지 1mM의 2-MEA를 이용할 수 있다. 몇몇 바람직한 태양에 있어서, 0.01mM 내지 25mM TCEP를 이용할 수 있다.
재조합 단백질의 조제물과 환원제의 접촉은, 바람직한 입체 구조의 상대적 비율을 증가시키는 데 충분한 시간에 걸쳐서 실시된다. 비율의 임의의 상대적 증가가 바람직하고, 예를 들어, 바람직하지 않은 입체 구조를 갖는 단백질의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 더욱이 80%, 또는 90%가, 바람직한 입체 구조를 갖는 단백질로 변환되는 것이 포함된다. 접촉은, 단백질을 발생시키는 발효 배지에 환원제를 제공하는 것에 의해 실시되어도 된다. 혹은, 접촉은, 그것을 발생시키는 세포 배양물로부터의 단백질의 부분 정제 시에 행해진다. 추가로 다른 태양에 있어서, 접촉은, 단백질이 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출된 후이지만, 추가적인 처리 전에 실시된다. 본질적으로는, 접촉은, 항체의 조제, 정제, 보존, 또는 제제 시의 임의의 단계에서 실시될 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 어피니티 크로마토그래피(예를 들어, 프로틴 A 크로마토그래피)에 의한 부분 정제는, 접촉 전에 실행될 수 있다.
접촉은, 크로마토그래피 컬럼의 고정상에 부착시킨 항체에 의해 실시되어도 되고, 환원제는 이동상의 일부인; 이 경우, 접촉은, 크로마토그래피 정제 수법의 일부로서 실시될 수 있다. 대표적인 크로마토그래피 폴딩 프로세스의 예로서는, 사이즈 배제(SEC); 프로틴 A 컬럼 상에서의 가역적 흡착 시의 용매 교환; 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC); 고정화 금속 어피니티 크로마토그래피(IMAC); 역상 크로마토그래피(RPC); 고정화 폴딩 촉매, 예를 들어, GroE1, GroES, 또는 폴딩 특성을 갖는 다른 단백질의 사용을 들 수 있다. 온컬럼 리폴딩은, 시판되는 조제용 크로마토그래피 시스템을 이용하여 용이하게 자동화되므로, 매력적이다. 미생물 세포에서 생성되는 재조합 단백질의 컬럼 상에서의 리폴딩이 (Li et al., 2004)에 있어서 최근 개설되었다.
접촉시키는 단계가 재조합 단백질의 부분적으로 또는 고도로 정제된 조제물에 대해서 실시되는 경우, 접촉시키는 단계는, 짧게는 약 1시간 내지 약 4시간, 또한 길게는 약 6시간 내지 약 4일간에 걸쳐서 실시될 수 있다. 약 2 내지 약 48시간, 또는 약 16시간의 접촉시키는 단계가 잘 기능함이 발견되었다. 접촉시키는 단계는 또한, 다른 단계 시에, 예를 들어, 여과 또는 정제에 있어서의 임의의 다른 단계 시에 고상상에서 행해질 수 있다.
본 발명의 방법은, 넓은 온도 범위에 걸쳐서 실시할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은, 약 4℃ 내지 약 37℃의 온도에서 성공리에 행해지고 있지만, 최선의 결과는 보다 낮은 온도에서 달성되었다. 재조합 단백질의 부분적으로 또는 완전히 정제된 조제물을 접촉시키기 위한 전형적인 온도는 약 4℃ 내지 약 25℃(주위 온도), 또는 바람직하게는 23℃이지만, 보다 낮은 온도 및 보다 높은 온도에서도 실시할 수 있다.
더하여, 방법은 고압에서 실시할 수 있을 것이 기도된다. 지금까지, 1M을 하회하는 낮은 비변성 농도의 염산 구아니딘과 조합한, 높은 정수압(1000-2000바)이, 인간 성장 호르몬 및 리소자임, 및 b-락타마제를 포함하는 봉입체로서 대장균에 의해 생성된 복수의 변성 단백질을 탈응집(가용화) 및 리폴딩하기 위해서 이용되고 있다(St John et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:13029-13033(1999)). B-락타마제는, GdmHCl의 첨가가 없는 경우에도, 고수량의 활성 단백질로 리폴딩되었다. 다른 시험(Seefeldt et al., Protein Sci, 13:2639-2650 (2004))에서는, 2000바에서의 고압 조절 리폴딩으로 얻어진, 포유동물 세포에서 생성된 단백질 비쿠닌의 리폴딩 수량은, RP HPLC로 70%이며, 전형적인 염산 구아니딘 "희석 리폴딩"로 얻어진 55%의 값(RP-HPLC에 의한다)보다 유의하게 높았다. 이들 지견은, 높은 정수압은, 분자간 및 분자 내 상호작용의 파괴를 촉진하여, 단백질의 언폴딩 및 탈응집을 가져옴을 나타낸다. 단백질에 대한 고압의 상호작용은, 단백질과 카오트로픽제의 상호작용을 닮아 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 단백질 언폴딩을 위해서, 카오트로픽제를 이용하는 대신에 고압을 이용하는 것이 기도된다. 물론, 고압과 카오트로픽제의 조합도 또한, 일부의 예에 있어서 이용될 수 있다.
재조합 항체/단백질의 조제물은, 필요에 따라서, 여러 가지 양으로 환원제와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은, 분석적 실험 스케일(1-50mL), 조제 스케일(50mL-10L), 및 제조 스케일(10L 이상)로 성공리에 실시되고 있다. 본 발명의 방법은, 소규모 및 대규모의 양쪽에서 재현성을 가지고 실시할 수 있다. 따라서, 항체의 농도는, 공업량(그램의 무게 단위)(예를 들어, 공업량의 특정의 IgG)일 수 있거나, 혹은 밀리그램량일 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 반응 혼합물에 있어서의 재조합 항체의 농도는, 약 1mg/ml 내지 약 50mg/ml, 보다 구체적으로는, 10mg/ml, 15mg/ml, 또는 20mg/ml이다. 이들 농도에서의 재조합 IgG1 분자가 특히 기도된다.
어느 특정의 태양에 있어서, 환원제를 함유하는 배지를 이용하여 생성된 단백질은, 예를 들어, 도데실황산 나트륨(SDS), 요소, 또는 염산 구아니듐(GuHCl) 등의 카오트로픽 변성제를 이용하는 분리 처리 단계에서 추가로 처리된다. 검지할 수 있는 언폴딩을 관찰하기 위해서는, 상당양의 카오트로픽제가 필요해진다. 몇몇 태양에 있어서, 처리 단계는, 0.1M 내지 2M의 염산 구아니딘의 사용과 동등한 효과를 생기게 하는, 0.1M 내지 2M 사이의 카오트로프를 이용한다. 특정의 태양에 있어서, 산화적 리폴딩은, 대략 1.0M 염산 구아니딘, 또는 1M 염산 구아니딘과 동일한 또는 마찬가지의 양의 리폴딩을 생기게 하는 양의 다른 카오트로픽제의 존재하에서 달성된다. 몇몇 태양에 있어서, 방법은 약 1.5M 내지 0.5M 사이의 카오트로프를 이용한다. 이용되는 카오트로픽제의 양은, 해당 카오트로프의 존재하에서의 단백질의 구조적 안정성에 기초한다. 단백질의 도메인 상호작용의 국소적인 3차 구조 및/또는 4차 구조를 어지럽히는 데 충분하지만, 분자 및/또는 개개의 도메인의 2차 구조를 완전히 언폴드하는 데 필요해지는 것보다 적은, 카오트로프를 존재시킬 필요가 있다. 단백질이 평형 변성에 의해 언폴드하기 시작하는 포인트를 결정하기 위해서, 당업자는, 단백질을 함유하는 용액에 카오트로프를 적정하여, 원편광 2색성 또는 형광 등의 기술에 의해 구조를 모니터링할 수 있다. 카오트로프 대신에 이용될 수 있는, 단백질의 구조를 언폴드하거나 또는 약간 어지럽히기 위해서 이용할 수 있는 다른 파라미터가 존재한다. 온도 및 압력은, 단백질의 구조를 변화시키기 위해서 지금까지 이용되고 있는 2개의 기본적 파라미터이고, 산화 환원제와 접촉시키는 동안에 카오트로픽제 대신에 이용될 수 있다. 본 발명자들은, 단백질의 구조를 변성시키는 것 또는 어지럽히는 것이 나타나 있는 임의의 파라미터가, 카오트로픽제 대신에 당업자에 의해 이용될 수 있음을 기도한다.
다이설파이드 교환은, 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 ??칭할 수 있다. 예를 들어, 정제 단계를 통해서, 환원제를 제거해도 되고 혹은 그 농도를 저하시켜도 되고, 및/또는, 예를 들어 용액을 산성화하는 것에 의해, 그것을 화학적으로 불활성화해도 된다. 전형적으로는, 반응이 산성화에 의해 ??칭되는 경우, 환원제를 함유하는 용액의 pH는, pH 7 미만으로 인하된다. 몇몇 태양에 있어서, pH는 pH 6 미만으로 인하된다. 일반적으로, pH는, 약 pH 2 내지 약 pH 6 사이까지 낮출 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 환원제의 제거는, 투석, 버퍼 교환, 또는 본 명세서에 기재되는 임의의 크로마토그래피법에 의해 실행될 수 있다.
우선적 농축(또는 증가)
용어 "우선적으로 농축시키는(또는 증가시키는)"은, 바람직한 형태의 상대적 존재량의 증가, 또는 바람직한 형태의 상대적 비율의 증가, 또는 바람직한 형태(구조 아이소폼)의 집단의 증가를 의미한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 명세서에 기재되는 방법은, 항체의 구조 아이소폼, 예를 들어, 힌지 영역 외의 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 항체 등의 상대적 존재량을 증가시킨다. 하나의 태양에 있어서, 상기 적어도 1개의 다이설파이드 결합은, 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인의 각각의 CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성된다. 어느 특정의 태양에 있어서, 상기 방법은, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 몰비의, 힌지 영역 외에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 상기 항체를 갖는, 균일한 항체 조제물을 제조한다.
균일성
항체의 "균일한" 집단은, 주로 단일 형태의 항체를 포함하는 항체 집단을 의미하고, 예를 들어, 용액 또는 조성물 중의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그것을 상회하는, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 99%, 또는 100%의 항체가, 적정하게 폴딩된 형태를 취한다. 마찬가지로, 힌지 영역 외에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 항체의 "균일한" 집단은, 주로 단일한 적정하게 폴딩된 형태를 포함하는 상기 항체의 집단, 예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그것을 상회하는, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 99%, 또는 100%의 몰비의, 힌지 영역 외에 형성된 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 상기 항체를 의미한다. 하나의 바람직한 태양에 있어서, 항체의 상기 "균일한" 집단은, 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인의 각각의 CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 아미노산 잔기(즉, CH1 영역에 있어서의 EU넘버에 의한 191위에 있는 "짝을 이루는 시스테인") 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 포함한다.
바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 방법은, 본 명세서에 있어서 기재될 단계에 의해, 균일한 항체 집단 또는 균일한 항체 조제물을 산생한다.
항체 집단이 균일한지 여부, 및 혼합물 중의 단백질/항체의 입체 구조의 상대적인 존재량 또는 비율의 결정은, 여러 가지 분석 기술 및/또는 정성 기술의 어느 것인가를 이용하여 행할 수 있다. 2개의 입체 구조가 분리 기술, 예를 들어, 크로마토그래피, 전기영동, 여과, 또는 다른 정제 기술 사이에서 상이하여 분리되는 경우, 혼합물 중의 입체 구조의 상대적 비율은, 그와 같은 정제 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 재조합 IgG의 적어도 2개의 상이한 입체 구조는, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. 더욱이, 원자외역 원편광 2색성은 단백질의 2차 구조의 구성을 추정하기 위해서 이용되고 있으므로(Perczel et al., 1 991, Protein Engrg. 4:669-679), 그와 같은 기술은, 단백질의 대체 입체 구조가 존재할지 여부를 결정할 수 있다. 입체 구조를 결정하는 데 이용될 수 있는 추가의 다른 기술은, 트립토판 및 티로신 형광에 할당 가능한, 3차 구조에 있어서의 상보적인 차이를 확인하기 위해서 이용할 수 있는 형광 분광법이다. 입체 구조의 차이, 그 결과, 입체 구조의 상대적 비율을 결정하기 위해서 이용할 수 있는 다른 기술은, 응집 상태를 측정하기 위한 온라인 SEC, 융해 전이(Tm) 및 성분 엔탈피를 측정하기 위한 시차 주사 열량 측정, 및 카오트로프 언폴딩이다. 입체 구조의 차이, 그 결과, 입체 구조의 상대적 비율을 결정하기 위해서 이용할 수 있는 추가의 다른 기술은, 단백질의 불균일성을 결정하기 위한 LC/MS 검출이다.
혹은, 항체/단백질의 입체 구조 사이에 활성의 차이가 존재하는 경우, 혼합물 중의 입체 구조의 상대적 비율의 결정은, 활성 어세이(예를 들어, 리간드에의 결합, 효소 활성, 생물학적 활성 등)에 의해 행할 수 있다. 단백질의 생물학적 활성도 또한, 이용할 수 있다. 혹은, 활성 단위/mg 단백질로서 활성이 표시되는 결합 어세이를 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 하기에 상세히 기재되는 몇몇 태양에 있어서, 본 발명은, IEC 크로마토그래피를 이용하여, 항체/단백질의 불균일성을 결정한다. 그와 같은 경우에는, 항체는, 정제되거나, 또는 다른 폴리펩티드에 대응하는 폴리펩티드의 피크 또는 획분이 IEC 크로마토그래피에 의한 분석 시에 검출되지 않는 것을 의미하는, "균일"하다고 간주된다. 어느 특정의 태양에 있어서, 항체는, 정제되거나, 또는 "균일"하다고 간주될 경우, 다른 폴리펩티드에 대응하는 폴리펩티드의 밴드가 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분석 시에 검출되지 않는다. 관련되는 분야에 있어서의 당업자는, 축차적인 글리코실화 및 축차적인 번역 후 프로세싱 등에 기인하여, 폴리펩티드에 대응하는 복수의 밴드가 SDS-PAGE에 의해 가시화할 수 있음을 인식하고 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는, SDS-PAGE에 의한 분석 시에 단일한 폴리펩티드의 밴드에 의해 나타나는 바와 같이, 실질적으로 균일하게 정제된다. 폴리펩티드의 밴드는, 은 염색, 쿠마시 블루 염색, 및/또는 (폴리펩티드가 방사 표지되는 경우에는) 오토라디오그래피에 의해 가시화할 수 있다.
본 명세서에 있어서, SDS-PAGE 분석의 조건의 예는 이하와 같다. 비환원 SDS-PAGE를, 4-20% Mini-PROTEAN(등록상표) TGX Stain-FreeTM Precast Gels(Bio-Rad)를 1×Tris/글리신/SDS 러닝 버퍼(Bio-Rad)와 함께 이용하여 실시했다. 모노클로날 항체 시료를 70℃에서 10분간 가열했다. 0.2마이크로그램을 로드하고, 전기영동을 200V에서 90분간 실행했다. 단백질을 Chemidoc Imaging System(Bio-Rad)으로 가시화했다. 개개의 밴드의 퍼센티지를, Image Lab 소프트웨어 버전 6.0(Bio-Rad)에 의해 분석하고, 개개의 밴드(예를 들어, 빠른 영동(하측의 밴드) 및 느린 영동(상측의 밴드))의 %강도를, 밴드의 강도를 이들 2개의 밴드의 합계로 나누는 것에 의해 산출했다. 다음에, 겔을 CBB로 염색해도 되고, 겔 화상을 캡처해도 되고, 밴드를 화상화 디바이스를 이용하여 정량화해도 된다. 겔 화상에 있어서, 복수, 예를 들어 2개의 밴드, 즉, "상측의 밴드" 및 "하측의 밴드"가, 항체 배리언트 시료로 관찰되어도 된다. 이 경우에서는, 상측의 밴드의 분자량은, 친항체(개변 전)의 것에 대응할 수 있다. Fab의 다이설파이드 결합을 개재시키는 가교 형성 등의 구조 변화가 시스테인 치환에 의해 야기될 가능성이 있고, 이것은 전기영동 이동도의 변화를 가져올 수 있다. 이 경우에는, 하측의 밴드는, CH1 영역 사이에 형성되는 1개 또는 복수의 조작된 다이설파이드 결합을 갖는 항체에 대응한다고 간주될 수 있다. 추가의 시스테인 치환을 갖는 항체 배리언트 시료는, 대조 시료와 비교하여, 높은 상측의 밴드에 대한 하측 밴드의 비율을 나타낼 수 있다. 추가의 시스테인 잔기는, Fab의 다이설파이드 결합 가교 형성을 증강/촉진할 수 있고; 변이 위치에 형성되는 조작된 다이설파이드 결합을 갖는 항체 조제물의 퍼센티지 또는 구조 균일성을 증가시킬 수 있고; 변이 위치에 형성되는 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 항체 조제의 퍼센티지를 감소시킬 수 있다.
항체 조제물로부터 표적 항체를 포착 및/또는 제거하기 위한 방법
본 개시는, 항체 조제물로부터 표적 항체를 포착 및/또는 제거하기 위한 방법을 제공한다.
어느 국면에 있어서, 본 개시는, 이하의 단계:
a) 표적 항체를 포함하는 항체 조제물을, 지지체 상에 고정화된 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계; 및
b) 항원 결합 분자에의 특이적 결합에 의해 표적 항체를 포착시키는 단계
를 포함하는, 항체 조제물로부터 표적 항체를 포착 및/또는 제거하기 위한 방법으로서,
해당 항체가, IgG(바람직하게는 인간 IgG 또는 인간 IgG1) 유래의 적어도 2개의 Fab를 포함하고, 또한 해당 항체 조제물이, CH1 도메인에서 2개의 Fab 사이에 형성되는 다이설파이드 결합만 상이한, 2개의 항체 구조 아이소폼을 포함하고; 또한
해당 항원 결합 분자가, 다이설파이드 결합을 포함하지 않는 표적 항체에 특이적으로 결합하여, 그것을 포착하는,
상기 방법을 제공한다.
어느 국면에 있어서, 항원 결합 분자는, 표적 항체가 다이설파이드 결합을 갖지 않을 때에만 항원 결합 분자에 액세스할 수 있는 에피토프로 표적 항체에 결합한다.
어느 국면에 있어서, 다이설파이드 결합은, CH1 도메인에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에서 항체의 2개의 Fab 사이에 형성되는 다이설파이드 결합이다.
어느 국면에 있어서, 표적 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자는, 이하:
(a1) 서열 번호: 166의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 170의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 174의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 182의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 186의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 190의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 167의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 171의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 175의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 183의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 187의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 191의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 168의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 172의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 176의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 184의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 188의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 192의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 169의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 173의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 177의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 185의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 189의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 193의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 166의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 170의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 174의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 115의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 124의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 134의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 167의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 171의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 175의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 116의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 125의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 135의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 168의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 172의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 176의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 118의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 128의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 137의 경쇄 CDR 3;
(a8) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및
(a9) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 결합과 경합하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택시키는 어느 1개를 포함하는 항체이다.
어느 국면에 있어서, 표적 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자는, 이하:
(a1) 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 180의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 181의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 197의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 198의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및
(a9) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 결합과 경합하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1개를 포함하는 항체이다.
어느 국면에 있어서, 표적 항체는, 이하의 (a1) 내지 (a15):
(a1) 서열 번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 208의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a2) 서열 번호: 203의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a3) 서열 번호: 204의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a4) 서열 번호: 205의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 209의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a5) 서열 번호: 216의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 229의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a6) 서열 번호: 217의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 210의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a7) 서열 번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a8) 서열 번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a9) 서열 번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 211의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a10) 서열 번호: 222의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 230의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 214의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a11) 서열 번호: 223의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 212의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a12) 서열 번호: 225의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a13) 서열 번호: 226의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5);
(a14) 서열 번호: 227의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 213의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5); 및
(a15) 서열 번호: 228의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 1), 서열 번호: 206의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 2), 서열 번호: 231의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드쇄(쇄 3), 및 서열 번호: 215의 아미노산 서열을 각각이 포함하는 2개의 폴리펩티드쇄(쇄 4 & 쇄 5)
로부터 선택되는 조합의 어느 하나에 있어서의 5개의 폴리펩티드쇄를 포함하고,
바람직하게는, 5개의 폴리펩티드쇄(쇄 1 내지 쇄 5)는, 도 1(a)에 나타내는 배향에 따라 서로 접속 및/또는 회합하고 있다.
입체 구조 특이적 항체
본 개시는, 표적 항체가, 예를 들어 CH1 영역에, 2개의 Fab 사이에 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않을 때("짝을 이루지 않는 시스테인" 형태)에만 표적 항체에 특이적으로 결합하는 입체 구조 특이적 항체를 제공한다. 어느 국면에 있어서, 예를 들어, 조작된 다이설파이드 결합에 의해 야기되는 2개의 Fab 사이의 입체 장애 또는 짧은 거리에 기인하여, 표적 항체가, 조작된 다이설파이드 결합을 가질("짝을 이루는 시스테인" 형태) 때에는, 에피토프는 입체 구조 특이적 항체에 액세스할 수 없다.
어느 국면에 있어서, 입체 구조 특이적 항체(표적 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자)는, 이하:
(a1) 서열 번호: 166의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 170의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 174의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 182의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 186의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 190의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 167의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 171의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 175의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 183의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 187의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 191의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 168의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 172의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 176의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 184의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 188의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 192의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 169의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 173의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 177의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 185의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 189의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 193의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 166의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 170의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 174의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 115의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 124의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 134의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 167의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 171의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 175의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 116의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 125의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 135의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 168의 중쇄 CDR 1, 서열 번호: 172의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 176의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 118의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 128의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 137의 경쇄 CDR 3;
(a8) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및
(a9) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 결합과 경합하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1개를 포함한다.
어느 국면에 있어서, 입체 구조 특이적 항체(표적 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자)는, 이하:
(a1) 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 178의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 179의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 180의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 181의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 196의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 197의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 198의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및
(a9) (a1) 내지 (a7) 중 어느 1개를 포함하는 항체의 결합과 경합하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1개를 포함한다.
어느 국면에 있어서, 입체 구조 특이적 항체(표적 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자)는, 인간 IgG1의 CH1에 특이적으로 결합한다.
어느 국면에 있어서, 입체 구조 특이적 항체(표적 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자)는, 다이설파이드 결합이 인간 IgG1의 2개의 Fab의 CH1 도메인 사이에 형성될 때에, 인간 IgG1의 CH1에 특이적으로 결합하지 않는다. 추가적인 국면에 있어서, 다이설파이드 결합은, CH1 도메인에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 IgG1의 2개의 Fab 사이에 형성되는 다이설파이드 결합이다.
어느 국면에 있어서, 입체 구조 특이적 항체(표적 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자)는, 인간 IgG4의 CH1에 결합하지 않는다.
본 개시는, 항체 함유 시료의 정제, 분석, 또는 정량화에 있어서의 입체 구조 특이적 항체(표적 항체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자)의 사용을 제공한다.
항원
본 명세서에서 이용되는 용어 "항원"은, 항원 결합 부분이 결합하는 폴리펩티드 거대 분자 상의 부위(예를 들어, 연속한 일련의 아미노산, 또는 비연속 아미노산의 다른 영역으로부터 구성되는 입체 구조)를 가리키고, 항원 결합 부분-항원 복합체를 형성한다. 유용한 항원 결정기는, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에, 바이러스 감염 세포의 표면 상에, 다른 질환 세포의 표면 상에, 면역 세포의 표면 상에, 혈청 중에 유리된 상태로, 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에 발견할 수 있다.
제 1 항원 결합 부분 및/또는 제 2 항원 결합 부분이 결합하는 "제 1 항원" 또는 "제 2 항원"은 바람직하게는, 예를 들어, 면역 세포 표면 분자(예를 들어, T 세포 표면 분자, NK 세포 표면 분자, 수상 세포 표면 분자, B 세포 표면 분자, NKT 세포 표면 분자, MDSC 세포 표면 분자, 및 매크로파지 표면 분자), 또는 종양 세포, 종양 혈관, 및 간질 세포 등뿐만 아니라, 정상 조직 상에도 발현하고 있는 항원(인테그린, 조직 인자, VEGFR, PDGFR, EGFR, IGFR, MET 케모카인 수용체, 헤파란황산 프로테오글리칸, CD44, 피브로넥틴, DR5, TNFRSF 등)이다.
"제 1 항원" 및 "제 2 항원"의 조합으로서는, 바람직하게는, 제 1 항원 및 제 2 항원의 어느 한쪽은, 예를 들어, T 세포 상에 특이적으로 발현하고 있는 분자이며, 다른 한쪽의 항원은, T 세포 또는 임의의 다른 면역 세포의 표면 상에 발현하고 있는 분자이다. "제 1 항원" 및 "제 2 항원"의 조합의 다른 태양에 있어서, 바람직하게는, 제 1 항원 및 제 2 항원의 어느 한쪽은, 예를 들어, T 세포 상에 특이적으로 발현하고 있는 분자이며, 다른 한쪽의 항원은, 면역 세포 상에 발현하고 있는 분자이며, 또한 미리 선택된 항원과는 상이하다.
T 세포 상에 특이적으로 발현하고 있는 분자의 구체적인 예로서는, CD3 및 T 세포 수용체를 들 수 있다. 특히, CD3이 바람직하다. 예를 들어 인간 CD3의 경우에는, 본 발명의 항원 결합 분자가 결합하는 CD3의 부위는, 인간 CD3을 구성하는 γ쇄, δ쇄, 또는 ε쇄의 서열 중에 존재하는 임의의 에피토프일 수 있다. 특히, 인간 CD3 복합체 중의 ε쇄의 세포외 영역 중에 존재하는 에피토프가 바람직하다. CD3을 구성하는 γ쇄, δ쇄, 및 ε쇄 구조의 폴리뉴클레오티드 서열은, NM_000073.2, NM_000732.4, 및 NM_000733.3이며, 또한 그 폴리펩티드 서열은, NP_000064.1, NP_000723.1, 및 NP_000724.1(RefSeq 등록 번호)이다. 다른 항원의 예로서는, Fcγ 수용체, TLR, 렉틴, IgA, 면역 체크포인트 분자, TNF 슈퍼패밀리 분자, TNFR 슈퍼패밀리 분자, 및 NK 수용체 분자를 들 수 있다.
하나의 태양에 있어서, 제 1 항원은, T 세포 상에 특이적으로 발현하고 있는 분자, 바람직하게는 CD3 등의 T 세포 수용체 복합체 분자, 보다 바람직하게는 인간 CD3이다. 다른 태양에 있어서, 제 2 항원은, T 세포 또는 임의의 다른 면역 세포 상에 발현하고 있는 분자, 바람직하게는 면역 세포 상의 세포 표면 조절 인자, 보다 바람직하게는 T 세포 상에 발현하고 있는 공자극 분자, 보다 더 바람직하게는 인간 CD137(4-1BB), CD137L, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, RANK, RANKL, CD30, CD153, GITR, 및 GITRL을 포함하지만 이것으로 한정되지 않는 "TNF 슈퍼패밀리" 또는 "TNF 수용체 슈퍼패밀리"의 단백질이다. 하나의 바람직한 태양에 있어서, 제 1 항원은 CD3이며, 또한 제 2 항원은 CD137이다. 본 명세서에 있어서, 제 1 항원 및 제 2 항원은 호환적으로 정의된다.
본 명세서에 있어서 용어 "CD137"은, 4-1BB라고도 불리는, 종양괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리의 멤버이다. TNF 슈퍼패밀리 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 인자의 예로서는, CD137, CD137L, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, RANK, RANKL, CD30, CD153, GITR, 및 GITRL을 들 수 있다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 전술한 "제 1 항원" 및 "제 2 항원"과는 상이한 "제 3 항원"에 결합하는 제 3 항원 결합 부분을 추가로 포함한다. 본 발명의 제 3 항원에 결합하는 제 3 항원 결합 도메인은, 임의의 항원을 인식하는 항원 결합 부분일 수 있다. 본 발명의 제 3 항원에 결합하는 제 3 항원 결합 부분은, 암 조직에 있어서 특이적으로 발현하고 있는 분자를 인식하는 항원 결합 부분일 수 있다.
본 발명에서는, 본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 제 3 항원 결합 부분은, "제 1 항원" 및 "제 2 항원"과는 상이한 "제 3 항원"에 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, 제 3 항원은, 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 토끼, 또는 개에서 유래한다. 몇몇 태양에 있어서, 제 3 항원은, 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 토끼, 또는 개에서 유래하는 세포 또는 기관 상에 특이적으로 발현하고 있는 분자이다. 제 3 항원은 바람직하게는, 세포 또는 기관 상에 전신적으로 발현하고 있지 않는 분자이다. 제 3 항원은 바람직하게는, 예를 들어 종양 세포 특이적 항원이며, 이들에는, 세포의 악성화에 부수하여 발현하는 항원, 및 세포의 악성 형질 전환시에 세포 표면 또는 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄도 포함된다. 그 구체예로서는, ALK 수용체(플레이오트로핀 수용체), 플레이오트로핀, KS 1/4 췌장암 항원, 난소암 항원(CA125), 전립선 산성 인산(prostatic acid phosphate), 전립선 특이적 항원(PSA), 흑색종 관련 항원 p97, 흑색종 항원 gp75, 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA), 전립선 특이적 막 항원, 암 태아성 항원(CEA), 다형 상피 뮤신 항원, 인간 유지방구 항원, 결장 직장 종양 관련 항원(예를 들어, CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1, 및 LEA), 버킷 림프종 항원 38.13, CD19, 인간 B 림프종 항원 CD20, CD33, 흑색종 특이적 항원(예를 들어, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2, 및 강글리오시드 GM3), 종양 특이적 이식 항원(TSTA), T 항원, 바이러스에 의해 유도되는 종양 항원(예를 들어 DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 포락선 항원), 결장 CEA, 암 태아성 항원 α-페토프로틴(예를 들어, 암 태아성 영양막 당단백질 5T4 및 암 태아성 방광 종양 항원), 분화 항원(예를 들어, 인간 폐암 항원 L6 및 L20), 섬유육종 항원, 인간 T 세포 백혈병 관련 항원 Gp37, 신생 당단백질, 스핑고지질, 유방암 항원(예를 들어, EGFR(상피 성장 인자 수용체)), NY-BR-16, NY-BR-16 및 HER2 항원(p185HER2), 다형 상피 뮤신(PEM), 악성 인간 림프구 항원 APO-1, 분화 항원 예를 들어, 태아 적혈구에서 발견되는 I 항원, 성인 적혈구에서 발견되는 초기 내배엽 I 항원, 이식 전의 배 또는 위암에서 발견되는 I(Ma), 유선 상피에서 발견되는 M18, M39, 골수 세포에서 발견되는 SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, 결장 직장암에서 발견되는 D156-22, TRA-1-85(혈액형 H), 정소 및 난소암에서 발견되는 SCP-1, 결장암에서 발견되는 C14, 폐암에서 발견되는 F3, 위암에서 발견되는 AH6, Y 합텐, 배성 암 세포에서 발견되는 Ley, TL5(혈액형 A), A431 세포에서 발견되는 EGF 수용체, 췌장암에서 발견되는 E1 시리즈(혈액형 B), 배성 암 세포에서 발견되는 FC10.2, 위암 항원, 선암에서 발견되는 CO-514(혈액형 Lea), 선암에서 발견되는 NS-10, CO-43(혈액형 Leb), A431 세포의 EGF 수용체에서 발견되는 G49, 결장암에서 발견되는 MH2(혈액형 ALeb/Ley), 결장암에서 발견되는 19.9, 위암 뮤신, 골수 세포에서 발견되는 T5A7, 흑색종에서 발견되는 R24, 배성 암 세포에서 발견되는 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, 및 M1:22:25:8, 4세포기 내지 8세포기의 배에서 발견되는 SSEA-3 및 SSEA-4, 피부 T 세포 림프종 관련 항원, MART-1 항원, 사이알릴 Tn(STn) 항원, 결장암 항원 NY-CO-45, 폐암 항원 NY-LU-12 배리언트 A, 선암 항원 ART1, 종양 수반성 관련 뇌-정소 암 항원(종양 신경 항원 MA2 및 종양수반성 신경 항원), 신경종양학적 복측(neuro-oncological ventral) 항원 2(NOVA2), 혈액 세포 암 항원 유전자 520, 종양 관련 항원 CO-029, 종양 관련 항원 MAGE-C1(암/정소 항원 CT7), MAGE-B1(MAGE-XP 항원), MAGE-B2(DAM6), MAGE-2, MAGE-4a, MAGE-4b MAGE-X2, 암-정소 항원(NY-EOS-1), YKL-40, 및 이들 폴리펩티드의 임의의 단편, 및 그의 개변된 구조(전술한 개변된 인산기, 당쇄 등), EpCAM, EREG, CA19-9, CA15-3, 사이알릴 SSEA-1(SLX), HER2, PSMA, CEA, 및 CLEC12A를 들 수 있다.
하나의 바람직한 태양에 있어서, 제 3 항원은 글리피칸 3(GPC3)이다. 추가로 다른 태양에 있어서, 제 3 항원은 DLL3(델타양 3)이다.
용어 "DLL3"은, 본 명세서에 있어서 이용하는 경우, 특별한 지시가 없는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트) 등의 포유동물을 포함하는, 임의의 척추동물 공급원 유래의 임의의 천연형 DLL3(델타양 3)을 가리킨다. 해당 용어는, 프로세싱을 받고 있지 않은 "전장"의 DLL3 및 세포에서의 프로세싱에 의해 생기는 임의의 형태의 DLL3을 포함한다. 해당 용어는 또한, DLL3의 천연에 생기는 배리언트, 예를 들어, 스플라이스 배리언트 또는 대립 유전자 배리언트도 포함한다. 예시적인 인간 DLL3의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열(RefSeq) NM_016941.3으로서 공지이며, 예시적인 필리핀원숭이 DLL3의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열 XP_005589253.1로서 공지이며, 예시적인 마우스 DLL3의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열 NM_007866.2로서 공지이다.
인간 DLL3 단백질은, C말단측에 막관통(TM) 영역 및 세포내 도메인, 및 N말단측에 DSL(Notch) 도메인을 포함한다. 더하여, DLL3은, N말단측으로부터 C말단측으로 6개의 영역, EGF1 내지 EGF6을 포함하는 EGF 도메인을 갖는다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 세포외 도메인(ECD) 내, 즉, N말단으로부터 TM 영역의 직전까지이지만, TM 영역 또는 C말단 세포내 도메인까지가 아닌 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, ECD 내의 전술한 도메인/영역의 어느 것 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역 내의 에피토프에 결합한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3에 있어서의 서열 번호: 89로 정의되는 영역 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 분자/항체는, 인간 DLL3의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, 혹은 EGF6 영역, 또는 EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역, 또는 인간 DLL3의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, 혹은 EGF6 영역, 또는 EGF6으로부터 TM 영역의 직전까지의 영역 내의 에피토프에 결합한다.
인간 DLL3에서는, 전술한 도메인/영역은, 이하의 아미노산 잔기(예를 들어, http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NYJ7 또는 WO2013/126746을 참조):
세포외 도메인(ECD): 1위 내지 492위에 있는 아미노산 잔기;
DSL 도메인: 176위 내지 215위에 있는 아미노산 잔기;
EGF 도메인: 216위 내지 465위에 있는 아미노산 잔기;
EGF1 영역: 216위 내지 249위에 있는 아미노산 잔기;
EGF2 영역: 274위 내지 310위에 있는 아미노산 잔기;
EGF3 영역: 312위 내지 351위에 있는 아미노산 잔기;
EGF4 영역: 353위 내지 389위에 있는 아미노산 잔기;
EGF5 영역: 391위 내지 427위에 있는 아미노산 잔기;
EGF6 영역: 429위 내지 465위에 있는 아미노산 잔기;
EGF6로부터 TM 영역의 직전까지의 영역: 429위에서 492위에 있는 아미노산 잔기;
TM 영역: 493위 내지 513위에 있는 아미노산 잔기; 및
C말단 세포내 도메인: 516위 내지 618위(또는 일부의 아이소폼에서는 516위 내지 587위)에 있는 아미노산 잔기
를 갖는다. 상기에 기술되는 아미노산 위치는 또한, 서열 번호: 90에 나타나는 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 위치도 가리킨다.
따라서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3에 있어서의 전술한 위치에 있는 아미노산 잔기를 갖는 전술한 영역/도메인에 결합할 수 있다. 즉, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 DLL3 항원 결합 부분은, 인간 DLL3에 있어서의 전술한 위치에 있는 아미노산 잔기를 갖는 전술한 영역/도메인 내의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 DLL3 단백질은, 상기에 기재되는 서열을 갖는 DLL3 단백질이어도 되고, 또는 1개 또는 복수의 아미노산의 개변에 의해 상기에 기재되는 서열로부터 도출되는 서열을 갖는 개변 단백질이어도 된다. 1개 또는 복수의 아미노산의 개변에 의해 상기에 기재되는 서열로부터 도출되는 서열을 갖는 개변 단백질의 예로서는, 상기에 기재되는 아미노산 서열에 대해서, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 혹은, 이들 DLL3 단백질의 부분 펩티드가 이용되어도 된다.
본 발명에서 이용되는 DLL3 단백질은, 그 기원에 의해 한정되지 않고, 바람직하게는 인간 또는 필리핀원숭이 DLL3 단백질이다.
몇몇 태양에 있어서, DLL3 단백질로서, DLL3 ECD 단편 단백질(또는 ECD 배리언트)이 이용될 수 있다. 절단의 부위에 따라서, 단편/배리언트는, N말단측으로부터 C말단측으로, DSL 도메인으로부터 EGF6, EGF1로부터 EGF6, EGF2로부터 EGF6, EGF3로부터 EGF6, EGF4로부터 EGF6, EGF5 및 EGF6, 또는 EGF6을 포함해도 된다. 단편/배리언트는, EGF6 영역의 직후부터 TM 영역의 직전까지 미치는 영역을 추가로 포함해도 된다. Flag 태그를, 당 기술 분야에 있어서 주지된 기술을 이용하여 단편/배리언트의 C말단에 부착시켜도 된다.
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 다른 종의 CD3, CD137, 또는 DLL3의 사이에서 보존되어 있는 CD3, CD137, 또는 DLL3의 에피토프에 결합한다. 특정의 태양에 있어서, 본 출원의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 삼중 특이성 항원 결합 분자, 즉, 3종류의 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 즉, CD3 또는 CD137의 어느 한쪽에 결합할 수 있지만, 양쪽 항원에 동시에는 결합하지 않고, 또한 DLL3에 특이적으로 결합할 수 있는, 삼중 특이성 항원 결합 분자이다.
특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, CD3의 부분 펩티드의 전체 또는 일부에 특이적으로 결합한다. 특정의 태양에 있어서, CD3은 인간 CD3 또는 필리핀원숭이 CD3, 가장 전형적으로는 인간 CD3이다. 특정의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 인간 CD3 및 필리핀원숭이 CD3에 대해서 교차 반응성이다(즉, 그들에 특이적으로 결합한다). 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, CD3의 ε 서브유닛, 특히, 서열 번호: 7(NP_000724.1)(괄호 내에 RefSeq 등록 번호를 나타낸다)에 나타나는 CD3의 인간 CD3ε 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 진핵세포의 표면 상에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, T 세포의 표면 상에 발현하고 있는 CD3ε쇄에 결합한다.
특정의 태양에 있어서, CD137은 인간 CD137이다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 적합한 예에는, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체에 의해 결합되는 인간 CD137 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자가 포함된다:
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC 서열(서열 번호: 21)을 포함하는 영역을 인식하는 항체,
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC 서열(서열 번호: 35)을 포함하는 영역을 인식하는 항체,
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC 서열(서열 번호: 49)을 포함하는 영역을 인식하는 항체, 및
인간 CD137 단백질 중의 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC 서열(서열 번호: 105)을 포함하는 영역을 인식하는 항체.
적어도 1개의 다이설파이드 결합
본 발명의 하나의 국면에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 바람직하게는 CH1 영역에 있어서, 적어도 1개의 시스테인 잔기를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함하고, 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기는, 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 어느 특정의 태양에 있어서, 시스테인 잔기는, 항체 중쇄 정상 영역의 CH1 영역 내에 존재하고, 예를 들어, CH1 영역에 있어서 EU 넘버링에 따른 119위, 122위, 123위, 131위, 132위, 133위, 134위, 135위, 136위, 137위, 139위, 140위, 148위, 150위, 155위, 156위, 157위, 159위, 160위, 161위, 162위, 163위, 165위, 167위, 174위, 176위, 177위, 178위, 190위, 191위, 192위, 194위, 195위, 197위, 213위, 및 214위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에 존재한다. 하나의 태양에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각은, 제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 1개의 시스테인 잔기를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함한다.
상기 국면의 어느 태양에 있어서, 상기에 기재되는 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 연결하는, 형성되는 "적어도 1개의 결합"은, 2개의 항원 결합 부분(즉, 상기에 기재되는 바와 같은 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분)을 공간적으로 가까운 위치에 유지할 수 있다. 다이설파이드 결합을 개재시키는 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이의 연결을 위해서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 2개의 항원 결합 부분 사이에 도입된 추가의 결합을 갖지 않다고 하는 점에서만 본 발명의 항원 결합 분자와 상이한 대조 항원 결합 분자보다 가까운 위치에서, 2개의 항원 결합 분자를 유지할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 용어 "공간적으로 가까운 위치" 또는 "보다 가까운 위치"에는, 상기에 기재되는 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인이, 단축된 거리 및/또는 저하된 가동성으로 유지된다고 하는 의미가 포함된다.
결과로서, 본 발명의 항원 결합 분자의 2개의 항원 결합 부분(즉, 상기에 기재되어 있는 바와 같은 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분)은, 동일한 단일한 세포 상에 발현하고 있는 항원에 결합한다. 환언하면, 본 발명의 항원 결합 분자의 2개의 항원 결합 부분(즉, 상기에 기재되는 바와 같은 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분)의 각각은, 상이한 세포의 가교를 가져오도록, 상이한 세포 상에 발현하고 있는 항원에 결합하지 않는다. 본 출원에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 그와 같은 항원 결합 양식은 "시스 결합"이라고 부를 수 있고, 이에 대해서, 항원 결합 분자의 2개의 항원 결합 부분의 각각이, 상이한 세포 상에 발현하고 있는 항원에 결합하여, 상이한 세포의 가교를 가져오는, 항원 결합 분자의 항원 결합 양식은, "트랜스 결합"이라고 부를 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는 주로, "시스 결합" 양식으로 동일한 단일한 세포 상에 발현하고 있는 항원에 결합한다.
상기 국면의 어느 태양에 있어서, 상기에 기재되는 바와 같은 다이설파이드 결합을 개재시키는 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이의 다이설파이드 결합을 위해서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 DC 세포 등)의 바람직하지 않은 가교 형성 및 활성화를 저하시키고 및/또는 방해할 수 있다. 즉, 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 제 1 항원 결합 부분은, T 세포 등의 면역 세포 상에 발현하고 있는 임의 시그널 전달 분자(예를 들어, 제 1 항원)에 결합하여, 본 발명의 항원 결합 분자의 제 2 항원 결합 도메인도 또한, T 세포 등의 면역 세포 상에 발현하고 있는 임의의 시그널 전달 분자(예를 들어, 제 1 항원, 또는 제 1 항원과는 상이한 제 2 항원)에 결합한다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 분자의 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은, 동일한 단일한 면역 세포, 예를 들어 T 세포 상(즉, 시스 결합 양식) 또는 다른 면역 세포, 예를 들어 T 세포 상(즉, 트랜스 결합 양식)에 발현하고 있는 제 1 또는 제 2 시그널 전달 분자의 어느 것인가에 결합할 수 있다. 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인이, 트랜스 결합 양식으로 상이한 면역 세포, 예를 들어 T 세포 상에 발현하고 있는 시그널 전달 분자에 결합하는 경우, 그들 상이한 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 가교되고, 어느 특정의 상황에 있어서, T 세포 등의 면역 세포의 그와 같은 가교 형성은, T 세포 등의 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 야기할 수 있다.
한편, 본 발명의 항원 결합 분자, 즉, CH1 영역 중(EU 넘버링에 따른 191위)의 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 개재시켜 서로 연결되는 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 항원 결합 분자의 다른 태양의 경우에 있어서, 제 1 항원 결합 도메인 및 제 2 항원 결합 도메인은 어느 것도, "시스 결합" 양식으로 동일한 단일한 면역 세포, 예를 들어 T 세포 상에 발현하고 있는 시그널 전달 분자에 결합할 수 있고, 이것에 의해, 항원 결합 분자를 개재시키는 상이한 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 가교 형성이 저감되어, 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 회피할 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기의 특징, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 연결하는 CH1 영역 중(예를 들어, EU 넘버링에 따른 191위)의 적어도 1개의 다이설파이드 결합은, 약어 "LINC"로 기재되는 경우가 있다. 이 약어를 이용하면, 몇몇 태양에 있어서, 상기의 본 발명의 항원 결합 분자는, 예를 들어, "Dual/LINC", "DLL3-Dual/LINC", "짝을 이루는 시스테인 형태" 또는 "GPC3-Dual/Dual(linc)" 등으로서 표시될 수 있다. CH1 영역 중(예를 들어, EU 넘버링에 따른 191위)의 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 개재시켜 서로 연결되지 않은/아직 연결되어 있지 않은 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 항원 결합 분자는, 약어 "UnLINC" 또는 "짝을 이루지 않는 시스테인을 갖는 Dual-LINC-Ig" 등으로 기재될 수 있다.
힌지 영역
용어 "힌지 영역"은, CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결하는 야생형 항체 중쇄에 있어서의 항체 중쇄 폴리펩티드 부분, 예를 들어, EU 넘버링 시스템에 의한 약 216위 내지 약 230위, 또는 Kabat 넘버링 시스템에 의한 약 226위 내지 약 243위를 나타낸다. 천연형 IgG 항체에 있어서, 힌지 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 220위에 있는 시스테인 잔기는, 항체 경쇄에 있어서의 214위에 있는 시스테인 잔기와 다이설파이드 결합을 형성함이 알려져 있다. 더욱이, 2개의 항체 중쇄 사이에서, 다이설파이드 결합이, 힌지 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 226위에 있는 시스테인 잔기 사이 및 229위에 있는 시스테인 잔기 사이에 형성됨도 알려져 있다. 일반적으로, "힌지 영역"은, 인간 IgG1의 216으로부터 238까지(EU 넘버링) 또는 226으로부터 251까지(Kabat 넘버링)에 이른다고 하여 정의된다. 이 힌지는, 3개의 상이한 영역, 상측의 힌지, 중앙의 힌지 및 하측의 힌지로 추가로 분할할 수 있다. 인간 IgG1 항체에서는, 이들 영역은 대체로 이하와 같이 정의된다:
상측의 힌지: 216-225(EU 넘버링) 또는 226-238(Kabat 넘버링),
중앙의 힌지: 226-230(EU 넘버링) 또는 239-243(Kabat 넘버링),
하측의 힌지: 231-238(EU 넘버링) 또는 244-251(Kabat 넘버링).
다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역은, 중쇄간 SS 결합을 동일한 위치에 형성하는 제 1 시스테인 잔기 및 최후의 시스테인 잔기를 배치하는 것에 의해, IgG1 서열과 정렬시킬 수 있다(예를 들어, Brekke et al., 1995, Immunol (Table 1 of Today 16: 85-90를 참조)). 본 명세서에 있어서의 힌지 영역에는, 야생형 힌지 영역에 있어서의 아미노산 잔기가 치환, 부가, 또는 결실에 의해 변경되어 있는, 야생형 힌지 영역 및 배리언트가 포함된다.
용어 "힌지 영역 내에는 없는 아미노산 사이에 형성되는 다이설파이드 결합"(또는 "힌지 영역 외의 아미노산 사이에 형성되는 다이설파이드 결합")은, 상기에 정의되는 "힌지 영역" 외에 있는 임의의 항체 영역에 위치하는 아미노산에 의해 형성되거나, 접속되거나, 또는 연결되는 다이설파이드 결합을 의미한다. 예를 들어, 그와 같은 다이설파이드 결합은, 힌지 영역 이외의 항체 중의 임의의 위치(예를 들어, EU 넘버링 시스템에 의한 약 216위로부터 약 230위, 또는 Kabat 넘버링 시스템에 의한 약 226위로부터 약 243위)에 있어서의 아미노산에 의해 형성되거나, 접속되거나, 또는 연결된다. 몇몇 태양에 있어서, 그와 같은 다이설파이드 결합은, CH1 영역, CL 영역, VL 영역, VH 영역, 및/또는 VHH 영역에 위치하는 아미노산에 의해 형성되거나, 접속되거나, 또는 연결된다. 몇몇 태양에 있어서, 그와 같은 다이설파이드 결합은, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 119위 내지 123위, 131위 내지 140위, 148위 내지 150위, 155위 내지 167위, 174위 내지 178위, 188위 내지 197위, 201위 내지 214위에 위치하는 아미노산에 의해 형성되거나, 접속되거나, 또는 연결된다. 몇몇 태양에 있어서, 그와 같은 다이설파이드 결합은, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 119위, 122위, 123위, 131위, 132위, 133위, 134위, 135위, 136위, 137위, 138위, 139위, 140위, 148위, 150위, 155위, 156위, 157위, 159위, 160위, 161위, 162위, 163위, 164위, 165위, 167위, 174위, 176위, 177위, 178위, 188위, 189위, 190위, 191위, 192위, 193위, 194위, 195위, 196위, 197위, 201위, 203위, 205위, 206위, 207위, 208위, 211위, 212위, 213위, 214위에 위치하는 아미노산에 의해 형성되거나, 접속되거나, 또는 연결된다. 몇몇 태양에 있어서, 그와 같은 다이설파이드 결합은, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 188위, 189위, 190위, 191위, 192위, 193위, 194위, 195위, 196위, 및 197위에 위치하는 아미노산에 의해 형성되거나, 접속되거나, 또는 연결된다. 하나의 바람직한 태양에 있어서, 그와 같은 다이설파이드 결합은, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 위치하는 아미노산에 의해 형성되거나, 접속되거나, 또는 연결된다.
항원 결합 도메인
용어 "항원 결합 도메인"은, 항원의 일부 또는 모두에 특이적으로 결합하고 또한 그것에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 가리킨다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 1개 또는 복수의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역이라고도 불린다)에 의해 초래되어도 된다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은, 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 양쪽을 포함한다. 그와 같은 바람직한 항원 결합 도메인에는, 예를 들어, "단쇄 Fv(scFv)", "단쇄 항체", "Fv", "단쇄 Fv2(scFv2)", "Fab", 및 "F(ab')2"가 포함된다.
가변 영역
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은, 항체를 항원으로 결합시키는 것에 관여하는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 가리킨다. 천연형 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은, 통상, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함하는, 유사한 구조를 갖는다. (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조.) 1개의 VH 또는 VL 도메인으로, 항원 결합 특이성을 주기에 충분할 것이다. 더욱이, 어느 특정의 항원에 결합하는 항체는, 당해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 VL 또는 VH 도메인의 상보적 라이브러리를 스크리닝하여, 단리되어도 된다. 예를 들어 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조.
HVR 또는 CDR
본 명세서에서 이용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 서열에 있어서 초가변이며("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(complementarity determining region)), 및/또는 구조적으로 정해진 루프("초가변 루프")를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기("항원 접촉")를 포함하는, 항체의 가변 도메인의 각 영역을 가리킨다. 초가변 영역(HVR)은, "상보성 결정 영역"(CDR)이라고도 칭해지고, 이들 용어는, 본 명세서에서는, 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분에 관해서 서로 교환 가능하게 이용된다. 통상, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)이다. 본 명세서에서의 예시적인 HVR은, 이하의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)의 장소에서 생기는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)의 장소에서 생기는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)의 장소에서 생기는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및,
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56 (L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
특별히 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는, 본 명세서에서는 상기의 Kabat 등에 따라 넘버링된다.
HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3은, 각각, "H-CDR1", "H-CDR2", "H-CDR3", "L-CDR1", "L-CDR2", 및 "L-CDR3"이라고도 기재된다.
CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는다
본 발명의 항체 가변 영역이 "CD3 및 CD137에 결합할 수 있는"지 여부는, 당 기술 분야에 있어서 공지된 방법에 의해 판정할 수 있다.
이것은, 예를 들어, 전기 화학 발광법(ECL법)에 의해 판정할 수 있다(BMC Research Notes 2011, 4:281).
구체적으로는, 예를 들어, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자의, CD3 및 CD137에 결합할 수 있는 영역, 예를 들어, Fab 영역으로 구성되는 저분자 항체, 또는 그의 1가 항체(통상의 항체가 갖는 2개의 Fab 영역 중 1개가 결여되어 있는 항체)를, sulfo-tag(Ru 착체)로 표지된 CD3 또는 CD137과 혼합하고, 혼합물을 스트렙트아비딘 고정화 플레이트 상에 첨가한다. 이 조작에 있어서, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자는, 플레이트 상의 스트렙트아비딘에 결합한다. sulfo-tag로부터 광을 발생시키고, 그 발광 시그널을, Sector Imager 600 또는 2400(MSD K.K.) 등을 이용하여 검출하여, 그것에 의해, CD3 또는 CD137에 대한 피험 항원 결합 분자의 전술한 영역의 결합을 확인할 수 있다.
혹은, 이 어세이는, ELISA, FACS(형광 활성화 세포 선별), ALPHAScreen(증폭 발광 근접 호모지니어스 어세이 스크린), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상에 기초하는 BIACORE법 등에 의해 실시되어도 된다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
구체적으로는, 어세이는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상에 기초하는 상호작용 해석 기기인 Biacore(GE Healthcare Japan Corp.)를 이용하여 실시할 수 있다. Biacore 해석 기기에는, Biacore T100, T200, X100, A100, 4000, 3000, 2000, 1000, 8K, 또는 C 등의 임의의 기종이 포함된다. CM7, CM5, CM4, CM3, C1, SA, NTA, L1, HPA, 또는 Au 칩 등의 임의의 Biacore용 센서 칩을, 센서 칩으로서 이용할 수 있다. 프로틴 A, 프로틴 G, 프로틴 L, 항인간 IgG 항체, 항인간 IgG-Fab, 항인간 L쇄 항체, 항인간 Fc 항체, 항원 단백질, 또는 항원 펩티드 등의, 본 발명의 항원 결합 분자를 포착하기 위한 단백질을, 아민 커플링, 다이설파이드 커플링, 또는 알데하이드 커플링 등의 커플링법에 의해, 센서 칩 상에 고정화한다. 그 위에 CD3 또는 CD137을 애널라이트로서 인젝트하고, 상호작용을 측정하여 센서그램을 취득한다. 이 조작에 있어서, CD3 또는 CD137의 농도는, 어세이 샘플의 상호작용의 강도(예를 들어, KD)에 따라 수μM 내지 수pM의 범위 내에서 선택할 수 있다.
혹은, CD3 또는 CD137을, 항원 결합 분자 대신에 센서 칩 상에 고정화하고, 다음에, 평가하고 싶은 항체 샘플을 상호작용시켜도 된다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항체 가변 영역이 CD3 또는 CD137에 대한 결합 활성을 갖는지 여부를, 상호작용의 센서그램으로부터 산출된 해리 상수(KD)치에 기초하여, 또는 항원 결합 분자 샘플의 작용 전의 레벨을 상회하는, 작용 후의 센서그램의 증가의 정도에 기초하여, 확인할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 목적하는 항원(즉, CD3 또는 CD137)에 대한 본 발명의 항체 가변 영역의 결합 활성 또는 친화성을, 예를 들어, Biacore T200 기기(GE Healthcare) 또는 Biacore 8K 기기(GE Healthcare)를 이용하여, 섭씨 37도(℃)(CD137에 대해) 또는 25℃(CD3에 대해)에서 평가한다. 항인간 Fc(예를 들어, GE Healthcare)를, 아민 커플링 키트(예를 들어, GE Healthcare)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀 상에 고정화한다. 항원 결합 분자 또는 항체 가변 영역을, 항Fc 센서 표면 상에 포착하고, 그 다음에, 항원(CD3 또는 CD137)을 플로 셀 상에 인젝트한다. 항원 결합 분자 또는 항체 가변 영역의 포착 레벨은, 200레조넌스 유닛(RU)을 목표로 해도 된다. 재조합 인간 CD3 또는 CD137을, 2배 단계 희석에 의해 조제한 400 내지 25nM로 인젝트하고, 그 후 해리시켜도 된다. 모든 항원 결합 분자 또는 항체 가변 영역 및 애널라이트는, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4에 있어서 조제한다. 센서 표면은, 사이클마다 3M MgCl2로 재생시킨다. 결합 친화성은, 예를 들어, Biacore T200 Evaluation software, version 2.0(GE Healthcare) 또는 Biacore Insight Evaluation software(GE Healthcare)를 이용하여, 데이터를 프로세싱하고, 1:1 결합 모델에 피팅시키는 것에 의해 결정한다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 특이적 결합 활성 또는 친화성을 평가하기 위해서, KD치를 산출한다.
ALPHAScreen은, 2종류의 비즈(도너 및 억셉터)를 이용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해, 이하의 원리에 기초하여 실시된다: 도너 비즈에 결합한 분자와 억셉터 비즈에 결합한 분자 사이의 생물학적 상호작용에 의해 이들 2개의 비즈가 근접하여 위치할 때에만, 발광 시그널이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비즈 중의 포토센서타이저는, 주변의 산소를 여기 상태의 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소는, 도너 비즈 주변으로 확산하고, 그것에 근접하여 위치하는 억셉터 비즈에 액세스하면, 그것에 의해 비즈에 있어서의 화학 발광 반응을 야기하여, 최종적으로 광이 방출된다. 도너 비즈에 결합한 분자와 억셉터 비즈에 결합한 분자 사이의 상호작용이 없는 경우에는, 도너 비즈에 의해 산생되는 일중항 산소가 억셉터 비즈에 액세스하지 않는다. 따라서, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
그 사이의 상호작용을 관찰하는 물질 중 한쪽(리간드)을, 센서 칩의 금 박막 상에 고정한다. 금 박막과 유리의 경계면에서 전반사하도록, 센서 칩의 이측으로부터 광을 쬔다. 결과로서, 반사광의 일부에, 반사 강도가 저하된 부위(SPR 시그널)가 형성된다. 그 사이의 상호작용을 관찰하는 물질 중 다른 쪽(애널라이트)을, 센서 칩의 표면 상에 인젝트한다. 애널라이트가 리간드에 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여, 센서 칩 표면 상의 용매의 굴절률이 변화된다. 이 굴절률의 변화에 의해, SPR 시그널의 위치가 시프트한다(반대로, 결합한 분자가 해리되면, 시그널은 원래의 위치로 돌아간다). Biacore 시스템은, 시프트의 양, 즉, 센서 칩 표면 상의 질량 변화를 세로 좌표에 플롯하여, 질량의 시간 의존적 변화를 어세이 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서 칩 표면 상에 포착된 리간드에 결합한 애널라이트의 양(애널라이트를 상호작용시킨 전후에서의 센서그램 상에서의 리스폰스의 변화의 양)을, 센서그램으로부터 결정할 수 있다. 그러나, 결합량은 리간드의 양에도 의존하기 때문에, 비교는, 실질적으로 동일한 양의 리간드의 양을 이용하는 조건하에서 행하지 않으면 안 된다. 키네틱스, 즉, 회합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)는, 센서그램의 곡선으로부터 결정할 수 있고, 한편, 친화성(KD)은, 이들 상수의 비로부터 결정할 수 있다. 저해 어세이도 또한, BIACORE법에 있어서 호적하게 이용된다. 저해 어세이의 예는, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 기재되어 있다.
용어 "CD3과 CD137(4-1BB)에 동시(at the same time)에는 결합하지 않는" 또는 "CD3과 CD137(4-1BB)에 동시(simultaneously)에는 결합하지 않는"은, 본 발명의 항원 결합 부분 또는 항체 가변 영역이, CD3과 결합하고 있는 상태에서는 CD137에 결합할 수 없고, 반대로, 항원 결합 부분 또는 항체 가변 영역이, CD137과 결합하고 있는 상태에서는 CD3에 결합할 수 없음을 의미한다. 여기에서, "CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는"이라고 하는 어구에는, CD3을 발현하는 세포와 CD137을 발현하는 세포를 가교하지 않는 것, 또는, 각각이 상이한 세포 상에서 발현하고 있는 CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는 것도 포함된다. 이 어구에는 추가로, CD3 및 CD137이 가용성 단백질과 같이 세포막 상에 발현하고 있는지 여부, 또는 양쪽이 동일한 세포 상에 존재할 때에는, 가변 영역이, CD3과 CD137의 양쪽에 동시에 결합할 수 있지만, 각각이 상이한 세포 상에서 발현하고 있는 CD3과 CD137에는 동시에는 결합할 수 없는 경우도 포함된다. 그와 같은 항체 가변 영역은, 이들 기능을 갖고 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 그 예에는, 소망하는 항원에 결합하도록 그 아미노산의 일부를 개변한, IgG형의 항체 가변 영역에서 유래하는 가변 영역이 포함될 수 있다. 개변되는 아미노산은, 예를 들어, CD3 또는 CD137에 결합하는 항체 가변 영역에 있어서의, 그 개변이 항원에 대한 결합을 상실시키지 않는 아미노산으로부터 선택된다.
여기에서, "상이한 세포 상에서 발현하고 있는"이라고 하는 어구는, 단순히, 항원이 상이한 세포 상에서 발현하고 있음을 의미한다. 그와 같은 세포의 조합은, 예를 들어, T 세포와 다른 T 세포와 같이 동일한 종류의 세포여도 되고, 또는 T 세포와 NK 세포와 같이 상이한 종류의 세포여도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자가 "CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는"지 여부는, 항원 결합 분자가 CD3 및 CD137의 양쪽에 대한 결합 활성을 가짐을 확인하는 것; 그 다음에, 이 결합 활성을 갖는 가변 영역을 포함하는 항원 결합 분자에, CD3 또는 CD137의 어느 하나를 미리 결합시키는 것; 및 그 다음에, 전술한 방법에 의해 다른 하나의 것에 대한 그 결합 활성의 유무를 판정하는 것에 의해 확인할 수 있다. 혹은, 이것은 또한, ELISA 플레이트 상 또는 센서 칩 상에 고정화된 CD3 또는 CD137의 어느 하나에 대한 항원 결합 분자의 결합이, 용액 중으로의 다른 하나의 것의 첨가에 의해 저해되는지 여부를 판정하는 것에 의해, 확인할 수도 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의 CD3 또는 CD137의 어느 하나에 대한 결합은, 다른 하나에 대한 항원 결합 분자의 결합에 의해, 적어도 50%, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 또는 보다 한층 바람직하게는 95% 이상 저해된다.
하나의 국면에 있어서, 1개의 항원(예를 들어, CD3)을 고정화하고 있는 동안에, CD3에 대한 항원 결합 분자의 결합의 저해를, 선행 기술에 있어서 공지된 방법(즉, ELISA, BIACORE 등)에 의해, 다른 항원(예를 들어, CD137)의 존재하에서 결정할 수 있다. 다른 국면에 있어서, CD137을 고정화하고 있는 동안에, CD137에 대한 항원 결합 분자의 결합의 저해도 또한, CD3의 존재하에서 결정할 수 있다. 전술한 2개의 국면 중 어느 1개가 실시될 때에, 결합이, 적어도 50%, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 또는 보다 한층 바람직하게는 95% 이상 저해된다면, 본 발명의 항원 결합 분자는, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는다고 판정된다.
몇몇 태양에 있어서, 애널라이트로서 인젝트되는 항원의 농도는, 고정화되는 다른 항원의 농도보다도 적어도 1배, 2배, 5배, 10배, 30배, 50배, 또는 100배 높다.
바람직한 양식에 있어서, 애널라이트로서 인젝트되는 항원의 농도는, 고정화되는 다른 항원의 농도보다도 100배 높고, 결합은, 적어도 80% 저해된다.
하나의 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 CD137(고정화) 결합 활성에 대한 KD치에 대한 항원 결합 분자의 CD3(애널라이트) 결합 활성에 대한 KD치의 비(KD(CD3)/KD(CD137))를 산출하여, CD137(고정화) 농도보다도 KD치의 비(KD(CD3)/KD(CD137))의 10배, 50배, 100배, 또는 200배 높은, CD3(애널라이트) 농도를, 상기의 경합 측정을 위해서 이용할 수 있다. (예를 들어, KD치의 비가 0.1인 경우는, 1배, 5배, 10배, 또는 20배 높은 농도를 선택할 수 있다. 더욱이, KD치의 비가 10인 경우는, 100배, 500배, 1000배, 또는 2000배 높은 농도를 선택할 수 있다.)
하나의 국면에 있어서, 1개의 항원(예를 들어, CD3)을 고정화하고 있는 동안에, CD3에 대한 항원 결합 분자의 결합 시그널의 감약을, 선행 기술에 있어서 공지된 방법(즉, ELISA, ECL 등)에 의해, 다른 항원(예를 들어, CD137)의 존재하에서 결정할 수 있다. 다른 국면에 있어서, CD137을 고정화하고 있는 동안에, CD137에 대한 항원 결합 분자의 결합 시그널의 감약도 또한, CD3의 존재하에서 결정할 수 있다. 전술한 2개의 국면 중 어느 1개가 실시될 때에, 결합 시그널이, 적어도 50%, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 또는 보다 한층 바람직하게는 95% 이상 감약된다면, 본 발명의 항원 결합 분자는, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는다고 판정된다.
몇몇 태양에 있어서, 애널라이트로서 인젝트되는 항원의 농도는, 고정화되는 다른 항원의 농도보다도 적어도 1배, 2배, 5배, 10배, 30배, 50배, 또는 100배 높다.
바람직한 양식에 있어서, 애널라이트로서 인젝트되는 항원의 농도는, 고정화되는 다른 항원의 농도보다도 100배 높고, 결합은, 적어도 80% 저해된다.
하나의 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 CD137(고정화) 결합 활성에 대한 KD치에 대한 항원 결합 분자의 CD3(애널라이트) 결합 활성에 대한 KD치의 비(KD(CD3)/KD(CD137))를 산출하여, CD137(고정화) 농도보다도 KD치의 비(KD(CD3)/KD(CD137))의 10배, 50배, 100배, 또는 200배 높은, CD3(애널라이트) 농도를, 상기의 측정을 위해서 이용할 수 있다. (예를 들어, KD치의 비가 0.1인 경우는, 1배, 5배, 10배, 또는 20배 높은 농도를 선택할 수 있다. 더욱이, KD치의 비가 10인 경우는, 100배, 500배, 1000배, 또는 2000배 높은 농도를 선택할 수 있다.)
구체적으로는, 예를 들어, ECL법을 이용하는 경우, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자, sulfo-tag(Ru 착체)로 표지된 CD3, 및 표지되어 있지 않은 CD137을 준비한다. 피험 항원 결합 분자가, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는 경우, 피험 항원 결합 분자와 표지된 CD3의 혼합물을 스트렙트아비딘 고정화 플레이트 상에 첨가하는 것, 및 그 후의 발광에 의해, sulfo-tag의 발광 시그널이, 표지되어 있지 않은 CD137의 비존재하에서 검출된다. 대조적으로, 발광 시그널은, 표지되어 있지 않은 CD137의 존재하에서 감소한다. 이 발광 시그널의 감소를 정량하여, 상대적인 결합 활성을 결정할 수 있다. 이 해석은, 표지된 CD137 및 표지되어 있지 않은 CD3을 이용하여, 마찬가지로 실시될 수 있다.
ALPHAScreen의 경우, 피험 항원 결합 분자는, 경합하는 CD137의 비존재하에서 CD3과 상호작용하여, 520 내지 620nm의 시그널을 생성한다. 태그 붙여져 있지 않은 CD137은, 피험 항원 결합 분자와의 상호작용에 대해 CD3과 경합한다. 경합의 결과로서 야기되는 형광의 감소를 정량하고, 그것에 의해 상대적인 결합 활성을 결정할 수 있다. 설포-NHS-비오틴 등을 이용한 폴리펩티드의 비오틴화는, 당 기술 분야에 있어서 공지이다. 예를 들어, CD3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합하는 것; 및, 결과로서 생긴 융합 유전자를, 그 발현이 가능한 벡터를 보유하는 세포 등에 의해 발현시키고, 그 후 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 것을 포함하는, 적절히 채용되는 방법에 의해, CD3을 GST로 태그 붙이기할 수 있다. 얻어진 시그널은, 바람직하게는, 예를 들어, 비선형 회귀 해석에 기초하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합한 소프트웨어 GRAPHPAD PRISM(GraphPad Software, Inc., San Diego)을 이용하여 해석된다. 이 해석은, 태그 붙여진 CD137 및 태그 붙여져 있지 않은 CD3을 이용하여, 마찬가지로 해석될 수 있다.
혹은, 형광 공명 에너지 이동(FRET)을 이용한 방법이 이용되어도 된다. FRET란, 여기 에너지가, 근접하여 위치하는 2개의 형광 분자의 사이에 서로, 전자 공명에 의해 직접 이동하는 현상이다. FRET가 일어나면, 도너(여기 상태를 갖는 형광 분자)의 여기 에너지가 억셉터(도너의 근처에 위치하는 다른 하나의 형광 분자)로 이동하기 때문에, 도너로부터 방사되는 형광이 소실되고(정확하게는, 형광의 수명이 단축되고), 대신에 억셉터로부터 형광이 방사된다. 이 현상의 사용에 의해, CD3과 CD137에 동시에 결합하는지 여부를 해석할 수 있다. 예를 들어, 형광 도너를 갖는 CD3 및 형광 억셉터를 갖는 CD137이, 피험 항원 결합 분자에 동시에 결합하면, 도너의 형광은 소실되고, 한편, 억셉터로부터 형광이 방사된다. 그 때문에, 형광 파장의 변화가 관찰된다. 그와 같은 항체는, CD3과 CD137에 동시에 결합하는 것이라고 확인된다. 다른 한편으로, CD3, CD137, 및 피험 항원 결합 분자의 혼합이, CD3과 결합한 형광 도너의 형광 파장을 변화시키지 않는다면, 이 피험 항원 결합 분자는, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3과 CD137에 동시에는 결합하지 않는 항원 결합 도메인으로 간주할 수 있다.
예를 들어, 비오틴 표지된 피험 항원 결합 분자를, 도너 비즈 상의 스트렙트아비딘에 결합시키고, 한편, 글루타티온 S 트랜스페라제(GST)로 태그 붙여진 CD3을, 억셉터 비즈에 결합시킨다. 피험 항원 결합 분자는, 경합하는 제 2 항원의 비존재하에서 CD3과 상호작용하여, 520 내지 620nm의 시그널을 생성한다. 태그 붙여져 있지 않은 제 2 항원은, 피험 항원 결합 분자와의 상호작용에 대해 CD3과 경합한다. 경합의 결과로서 야기되는 형광의 감소를 정량하고, 그것에 의해 상대적인 결합 활성을 결정할 수 있다. 설포-NHS-비오틴 등을 이용한 폴리펩티드의 비오틴화는, 당 기술 분야에 있어서 공지이다. 예를 들어, CD3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합하는 것; 및, 결과로서 생긴 융합 유전자를, 그 발현이 가능한 벡터를 보유하는 세포 등에 의해 발현시키고, 그 후 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 것을 포함하는, 적절히 채용되는 방법에 의해, CD3을 GST로 태그 붙이기할 수 있다. 얻어진 시그널은, 바람직하게는, 예를 들어, 비선형 회귀 해석에 기초하는 일부위 경합 모델에 적합한 소프트웨어 GRAPHPAD PRISM(GraphPad Software, Inc., San Diego)을 이용하여 해석된다.
태그 붙이기는, GST 태그 붙이기로 한정되지 않고, 히스티딘 태그, MBP, CBP, Flag 태그, HA 태그, V5 태그, c-myc 태그 등이지만 그들로 한정되지 않는, 임의의 태그로 실시되어도 된다. 피험 항원 결합 분자의 도너 비즈에의 결합은, 비오틴-스트렙트아비딘 반응을 이용한 결합으로 한정되지 않는다. 특히, 피험 항원 결합 분자가 Fc를 포함하는 경우, 가능한 방법에는, 도너 비즈 상의 프로틴 A 또는 프로틴 G 등의 Fc 인식 단백질을 개재시켜 피험 항원 결합 분자를 결합시키는 것이 포함된다.
또한, CD3 및 CD137이, 가용성 단백질과 같이 세포막 상에 발현하고 있지 않을 때, 또는 양쪽이 동일한 세포 상에 존재할 때에는, 가변 영역이, CD3과 CD137에 동시에 결합할 수 있지만, 각각이 상이한 세포 상에서 발현하고 있는 CD3과 CD137에 동시에는 결합할 수가 없는 경우도 또한, 당 기술 분야에 있어서 공지된 방법에 의해 어세이할 수 있다.
구체적으로는, CD3 및 CD137에 대한 동시의 결합을 검출하기 위한 ECL-ELISA에 있어서 양성이라고 확인되어 있는 피험 항원 결합 분자를 또한, CD3을 발현하는 세포 및 CD137을 발현하는 세포와 혼합한다. 피험 항원 결합 분자는, 항원 결합 분자 및 이들 세포가 서로 동시에 결합하지 않는 한, 상이한 세포 상에서 발현하고 있는 CD3과 CD137에 동시에는 결합할 수 없음이 나타날 수 있다. 이 어세이는, 예를 들어, 세포 베이스의 ECL-ELISA에 의해 실시할 수 있다. CD3을 발현하는 세포를, 미리 플레이트 상에 고정화한다. 피험 항원 결합 분자를 그것에 결합시킨 후에, CD137을 발현하는 세포를 플레이트에 첨가한다. CD137을 발현하는 세포 상에서만 발현하고 있는 다른 항원은, 이 항원에 대한 sulfo-tag로 표지된 항체를 이용하여 검출된다. 항원 결합 분자가, 각각 2개의 세포 상에서 발현하고 있는 2개의 항원에 동시에 결합하는 경우는, 시그널이 관찰된다. 항원 결합 분자가 이들 항원에 동시에는 결합하지 않는 경우는, 어떠한 시그널도 관찰되지 않는다.
혹은, 이 어세이는, ALPHAScreen법에 의해 실시되어도 된다. 피험 항원 결합 분자를, 도너 비즈에 결합한 CD3을 발현하는 세포 및 억셉터 비즈에 결합한 CD137을 발현하는 세포와 혼합한다. 항원 결합 분자가, 각각 2개의 세포 상에서 발현하고 있는 2개의 항원에 동시에 결합하는 경우는, 시그널이 관찰된다. 항원 결합 분자가 이들 항원에 동시에는 결합하지 않는 경우는, 시그널은 관찰되지 않는다.
혹은, 이 어세이는, Octet 상호작용 해석법에 의해 실시되어도 된다. 최초에, 펩티드 태그를 부가한 CD3을 발현하는 세포를, 펩티드 태그를 인식하는 바이오센서에 결합시킨다. CD137을 발현하는 세포 및 피험 항원 결합 분자를, 웰에 넣고, 상호작용에 대해 해석한다. 항원 결합 분자가, 각각 2개의 세포 상에서 발현하고 있는 2개의 항원에 동시에 결합하는 경우는, 피험 항원 결합 분자 및 CD137을 발현하는 세포의 바이오센서에의 결합에 의해 야기되는 큰 파장 시프트가 관찰된다. 항원 결합 분자가 이들 항원에 동시에는 결합하지 않는 경우는, 피험 항원 결합 분자만의 바이오센서에의 결합에 의해 야기되는 작은 파장 시프트가 관찰된다.
결합 활성에 기초하는 이들 방법 대신에, 생물 활성에 기초하는 어세이가 실시되어도 된다. 예를 들어, CD3을 발현하는 세포 및 CD137을 발현하는 세포를, 피험 항원 결합 분자와 혼합하고 배양한다. 각각 2개의 세포 상에서 발현하고 있는 2개의 항원은, 항원 결합 분자가 이들 2개의 항원에 동시에 결합하는 경우는, 피험 항원 결합 분자를 개재시켜 서로 활성화된다. 그 때문에, 항원의 각각의 하류의 인산화 레벨의 증가 등의 활성화 시그널의 변화를, 검출할 수 있다. 혹은, 사이토카인의 산생이, 활성화의 결과로서 유도된다. 그 때문에, 산생되는 사이토카인의 양을 측정하고, 그것에 의해, 2개의 세포에 동시에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다. 혹은, CD137을 발현하는 세포에 대한 세포 상해 활성이, 활성화의 결과로서 유도된다. 혹은, 리포터 유전자의 발현이, 활성화의 결과로서, CD137 또는 CD3의 시그널 전달 경로의 하류에서 활성화되는 프로모터에 의해 유도된다. 그 때문에, 세포 상해 활성 또는 산생되는 리포터 단백질의 양을 측정하고, 그것에 의해, 2개의 세포에 동시에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다.
Fab 분자
"Fab 분자"는, 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인("Fab 중쇄"), 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 이루어지는 단백질을 가리킨다.
융합되는
"융합되는"은, 구성 성분(예를 들어, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이, 직접적으로, 또는 1개 혹은 복수의 펩티드 링커를 개재시켜, 펩티드 결합에 의해 연결되는 것을 의미한다.
"크로스오버" Fab
"크로스오버"Fab 분자("Crossfab"라고도 불린다)는, Fab 중쇄 및 Fab 경쇄의 가변 영역 또는 정상 영역의 어느 하나가 교환되어 있는, Fab 분자를 의미하고, 즉, 크로스오버 Fab 분자는, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 정상 영역으로 구성된 펩티드쇄와, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역으로 구성된 펩티드쇄를 포함한다. 명확하게 하기 위해서 기재하면, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자에서는, 중쇄 정상 영역을 포함하는 펩티드쇄가, 본 명세서에 있어서, 크로스오버 Fab 분자의 "중쇄"라고 칭해진다. 반대로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 정상 영역이 교환되어 있는 크로스오버 Fab 분자에서는, 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드쇄가, 본 명세서에 있어서, 크로스오버 Fab 분자의 "중쇄"라고 칭해진다.
"종래의" Fab
그에 대해, "종래의" Fab 분자는, 그 천연의 포맷에서의 Fab 분자, 즉, 중쇄의 가변 영역 및 정상 영역으로 구성된 중쇄(VH-CH1), 및 경쇄의 가변 영역 및 정상 영역으로 구성된 경쇄(VL-CL)를 포함하는 Fab 분자를 의미한다. 용어 "면역글로불린 분자"는, 천연에 존재하는 항체의 구조를 갖는 단백질을 가리킨다. 예를 들어, IgG 클래스의 면역글로불린은, 다이설파이드 결합으로 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 150,000돌턴의 헤테로4량체 당단백질이다. 각 중쇄는, N말단으로부터 C말단으로, 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)과, 그 후에 계속되는 중쇄 정상 영역이라고도 불리는 3종류의 정상 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 마찬가지로, 각 경쇄는, N말단으로부터 C말단으로, 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)과, 그 후에 계속되는 경쇄 정상 영역이라고도 불리는 정상 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는, α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)라고 불리는 5개의 타입 중 하나에 할당되어 있어도 되고, 그들의 일부는, 서브타입, 예를 들어, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1), 및 α2(IgA2)로 추가로 분류되어도 된다. 면역글로불린의 경쇄는, 그 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 및 람다로 불리는 2개의 타입 중 하나에 할당되어도 된다. 면역글로불린은, 면역글로불린 힌지 영역을 개재시켜 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 본질적으로 이루어진다.
친화성
"친화성"은, 분자(예를 들어, 항원 결합 분자 또는 항체)의 결합 부위 1개와, 분자의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의, 비공유 결합적인 상호작용의 합계의 강도를 가리킨다. 특별히 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 "결합 친화성"은, 어느 결합쌍의 멤버(예를 들어, 항원 결합 분자와 항원, 또는 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는, 고유의 결합 친화성을 가리킨다. 분자 X의, 그 파트너 Y에 대한 친화성은, 일반적으로, 해리 속도 상수와 회합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인, 해리 상수(KD)에 의해 나타낼 수 있다. 따라서, 속도 상수의 비가 동일한 그대로인 한, 등가의 친화성은 상이한 속도 상수를 포함해도 된다. 친화성은, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는, 당 기술 분야에 있어서 공지된 확립한 방법에 의해 측정할 수 있다. 친화성을 측정하기 위한 구체적인 방법은, 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
친화성을 결정하는 방법
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 분자 또는 항체는, 그 항원에 대해서, ≤1μM, ≤120nM, ≤100nM, ≤80nM, ≤70nM, ≤50nM, ≤40nM, ≤30nM, ≤20nM, ≤10nM, ≤2nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM 또는 ≤0.001nM(예를 들어, 10-8M 이하, 10-8M 내지 10-13M, 10-9M 내지 10-13M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 특정의 태양에 있어서, CD3, CD137, 또는 DLL3에 대한, 항체/항원 결합 분자의 KD치는, 1-40, 1-50, 1-70, 1-80, 30-50, 30-70, 30-80, 40-70, 40-80, 또는 60-80nM의 범위 내에 들어간다.
하나의 태양에 있어서, KD는, 방사성 표지 항원 결합 측정법(radiolabeled antigen binding assay: RIA)에 의해 측정된다. 하나의 태양에 있어서, RIA는, 목적하는 항체의 Fab 버전 및 그 항원을 이용하여 실시된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 중 결합 친화성은, 비표지 항원의 점증량 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I) 표지 항원에 의해 Fab를 평형화시키고, 그 다음에 결합한 항원을 항Fab 항체로 코팅된 플레이트에 의해 포착하는 것에 의해 측정된다. (예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)을 참조할 것). 측정 조건을 구축하기 위해서, MICROTITER(등록상표) 멀티웰 플레이트(Thermo Scientific)를 50mM 탄산 나트륨(pH 9.6) 중 5μg/ml의 포착용 항Fab 항체(Cappel Labs)로 하룻밤 코팅하고, 그 후에 실온(대략 23℃)에서 2 내지 5시간, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 블록한다. 비흡착 플레이트(Nunc #269620)에 있어서, 100pM 또는 26pM의 [125I]-항원을, (예를 들어, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에 있어서의 항VEGF 항체, Fab-12의 평가와 동일하게) 목적하는 Fab의 단계 희석물과 혼합한다. 그 다음에, 목적하는 Fab를 하룻밤 인큐베이트하지만, 이 인큐베이션은, 평형이 확실히 달성되도록, 보다 장시간(예를 들어, 약 65시간) 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을, 실온에서의 인큐베이션(예를 들어, 1시간)을 위해서 포착 플레이트로 옮긴다. 그 다음에 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1%의 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(등록상표))으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조되면, 150μL/웰의 신틸런트(MICROSCINT-20(상표), Packard)를 첨가하고, TOPCOUNT(상표) 감마 카운터(Packard)에 있어서 플레이트를 10분간 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 주는 각 Fab의 농도를, 경합 결합 어세이에 있어서 사용하기 위해서 선택한다.
다른 태양에 의하면, Kd는, BIACORE(등록상표) 표면 플라즈몬 공명 어세이를 이용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE(등록상표)-2000 또는 BIACORE(등록상표)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하는 측정법이, 대략 10반응 단위(response unit: RU)의 항원이 고정된 CM5 칩을 이용하여 25℃에서 실시된다. 하나의 태양에 있어서, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은, 공급원의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하여 활성화된다. 항원은, 대략 10반응 단위(RU)의 단백질의 결합을 달성하도록, 5μL/분의 유속으로 주입되기 전에, 10mM 아세트산 나트륨, pH 4.8을 이용하여 5μg/ml(대략 0.2μM)로 희석된다. 항원의 주입 후, 미반응기를 블록하기 위해서 1M 에탄올 아민이 주입된다. 키네틱스의 측정을 위해서, 25℃, 대략 25μL/분의 유속으로, 0.05% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(상표)) 계면활성제 함유 PBS(PBST) 중의 Fab의 2배 단계 희석물(0.78nM 내지 500nM)이 주입된다. 회합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 단순한 1대1 랭뮤어 결합 모델(BIACORE(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여, 회합 및 해리의 센서그램을 동시에 피팅하는 것에 의해 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는, koff/kon비로서 계산된다. 예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)을 참조할 것. 상기의 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의한 온 속도가 106M-1 s-1을 초과하는 경우, 온 속도는, 분광계(예를 들어 스톱플로식 분광 광도계(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 이용하는 8000 시리즈의 SLM-AMINCO(상표) 분광 광도계(ThermoSpectronic))에 있어서 측정되는, 점증 농도의 항원의 존재하에서의 PBS, pH 7.2 중 20nM의 항항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 발광 강도(여기=295nm; 발광=340nm, 밴드 패스 16nm)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하는 것에 의해 결정될 수 있다.
항원 결합 분자 또는 항체의 친화성을 측정하는 상기의 방법에 의해, 당업자는, 다양한 항원에 대한 다른 항원 결합 분자 또는 항체의 친화성 측정을 실시할 수 있다.
항체
본 명세서에서 용어 "항체"는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 소망의 항원 결합 활성을 나타내는 한은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하는, 여러 가지 항체 구조를 포함한다.
항체 단편
"항체 단편"은, 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 당해 완전 항체의 일부분을 포함하는, 당해 완전 항체 이외의 분자를 가리킨다. 항체 단편의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab＇-SH, F(ab')2, 다이아보디, 선상 항체, 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv), 및 싱글 도메인 항체를 포함한다. 특정의 항체 단편에 대한 총설로서, Hudson et al., Nat Med 9, 129-134(2003)를 참조할 것. scFv 단편의 총설로서, 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); 더하여, WO93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조할 것. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 in vivo에 있어서의 반감기가 길어진 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논설로서, 미국 특허 제5,869,046호를 참조할 것. 다이아보디는, 2가 또는 이중 특이적이어도 되는, 항원 결합 부위를 2개 가지는 항체 단편이다. 예를 들어, EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993) 참조. 트라이아보디 (triabody)나 테트라보디(tetrabody)도, Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)에 기재되어 있다. 싱글 도메인 항체는, 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 혹은 일부분, 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 혹은 일부분을 포함하는, 항체 단편이다. 특정의 태양에 있어서, 싱글 도메인 항체는, 인간 싱글 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 B1 참조). 항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된, 완전 항체의 단백질 분해적 소화, 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균 또는 파지)에 의한 산생을 포함하는, 여러 가지의 수법에 의해 만들 수 있다.
항체의 클래스
항체의 "클래스"는, 항체의 중쇄에 구비되는 정상 도메인 또는 정상 영역의 타입을 가리킨다. 항체에는 5개의 주요한 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이다. 그리고, 이 중 몇몇은 추가로 서브클래스(아이소타입)로 나눠져도 된다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 다른 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 정상 도메인을, 각각, α, δ, ε, γ, 및 μ라고 부른다.
특별히 나타내지 않는 한, 경쇄 정상 영역 중의 아미노산 잔기는, 본 명세서에서는 Kabat 등에 따라 넘버링되고, 중쇄 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재되어 있는 바와 같은, EU 인덱스라고도 불리는, EU 넘버링 시스템에 따른다.
프레임워크
"프레임워크" 또는 "FR"은, 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의, 가변 도메인 잔기를 가리킨다. 가변 도메인의 FR은, 통상 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 그에 따라서, HVR 및 FR의 서열은, 통상 다음의 순서로 VH(또는 VL)에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
인간 컨센서스 프레임워크
"인간 컨센서스 프레임워크"는, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택군에 있어서 가장 공통되게 생기는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 통상, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은, 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 통상, 서열의 서브그룹은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 있어서의 서브그룹이다. 하나의 태양에 있어서, VL에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 κI이다. 하나의 태양에 있어서, VH에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 III이다.
키메라 항체
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정의 공급원 또는 종에서 유래하는 한편으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지의 부분이 다른 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 가리킨다. 마찬가지로, 용어 "키메라 항체 가변 도메인"은, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 일부분이 특정의 공급원 또는 종에서 유래하는 한편으로, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 나머지의 부분이 다른 공급원 또는 종에서 유래하는 항체 가변 영역을 가리킨다.
인간화 항체
"인간화" 항체는, 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는, 키메라 항체를 가리킨다. 어느 태양에서는, 인간화 항체는, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함하고, 당해 가변 영역에 있어서는, 모든 혹은 실질적으로 모든 HVR(예를 들어 CDR)은 비인간 항체의 것에 대응하고, 또한, 모든 혹은 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 항체에서 유래하는 항체 정상 영역의 적어도 일부분을 포함해도 된다. 항체(예를 들어, 비인간 항체)의 "인간화된 형태"는, 인간화를 거친 항체를 가리킨다. "인간화 항체 가변 영역"은, 인간화 항체의 가변 영역을 가리킨다.
인간 항체
"인간 항체"는, 인간 혹은 인간 세포에 의해 산생된 항체 또는 인간 항체 레퍼터리 혹은 다른 인간 항체 코드 서열을 이용하는 비인간 공급원에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 구비하는 항체이다. 이 인간 항체의 정의는, 비인간의 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를, 명확하게 제외하는 것이다. "인간 항체 가변 영역"은, 인간 항체의 가변 영역을 가리킨다.
폴리뉴클레오티드(핵산)
본 명세서에서 서로 교환 가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 가리키고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 수식 뉴클레오티드 혹은 염기, 및/또는 그들의 아날로그, 또는 DNA 혹은 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 폴리머에 짜넣어질 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 메틸화 뉴클레오티드 및 그들의 아날로그 등의 수식 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에, 비뉴클레오티드 성분이 끼어 들어가 있어도 된다. 폴리뉴클레오티드는, 표지에의 컨주게이션 등의, 합성 후에 이루어지는 수식을 포함할 수 있다. 다른 타입의 수식은, 예를 들어, "캐핑", 1개 또는 복수의 천연에 존재하는 뉴클레오티드와 아날로그의 치환, 뉴클레오티드간 수식, 예를 들어, 비하전 연결(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포로아마이드산, 카바메이트 등) 및 하전 연결(예를 들어, 포스포로싸이오에이트, 포스포로다이싸이오에이트 등)을 수반하는 것, 예를 들어 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드, 폴리-L-리신 등) 등의 팬던트 부분을 포함하는 것, 인터캘레이트제(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)를 수반하는 것, 킬레이트제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 포함하는 것, 알킬화제를 포함하는 것, 수식 연결(예를 들어, 알파-아노머 핵산 등)이나 비수식 형태의 폴리뉴클레오티드를 수반하는 것을 포함한다. 더욱이, 통상 당에 존재하는 임의의 하이드록실기는, 예를 들어, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 치환될 수 있고, 표준적인 보호기에 의해 보호될 수 있고, 혹은 새로운 뉴클레오티드에의 새로운 연결을 생성하도록 활성화될 수 있고, 또는 고체 혹은 반고체 지지체에 컨주게이트될 수 있다. 5＇ 및 3＇ 말단의 OH는, 인산화 또는 아민 혹은 1 내지 20탄소 원자의 유기 캐핑기 부분으로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실도 또한, 표준적인 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어 이하의 것을 포함하는, 당 기술 분야에서 일반적으로 공지가 되어 있는 리보스 또는 데옥시리보스당의 유사 형태를 포함할 수 있다: 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴-, 2'-플루오로-, 또는 2'-아자이도-리보스, 탄소환식 당 아날로그, α-아노머당, 아라비노스 또는 자일로스 또는 릭소스 등의 에피머당, 피라노스당, 푸라노스당, 세도헵툴로스, 비환식 아날로그, 및 메틸 리보사이드 등의 염기성 뉴클레오티드 아날로그. 1개 또는 복수의 포스포다이에스터 결합은, 대체의 연결기에 의해 치환될 수 있다. 이들 대체의 연결기는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 포스페이트가 이하의 것에 의해 치환되어 있는 태양을 포함한다: P(O)S("싸이오에이트"), P(S)S("다이싸이오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO, 또는 CH2("폼아세탈"), 여기에서, 각 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는, 임의로 에터(-O-) 연결, 아릴, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 혹은 아르알딜을 포함하는 치환 혹은 비치환 알킬(1-20C)이다. 폴리뉴클레오티드 중의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기의 설명은, RNA 및 DNA를 포함하는 본 명세서에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
단리된 (핵산)
"단리된" 핵산 분자는, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 것을 가리킨다. 단리된 핵산 분자는 추가로, 그 핵산 분자를 통상 포함하는 세포 중에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 그 핵산 분자는 염색체 외에 존재하고 있거나 또는 본래의 염색체 상의 위치와는 상이한 염색체 상의 위치에 존재하고 있다.
벡터
본 명세서에서 이용되는 용어 "벡터"는, 그것이 연결된 다른 1개의 핵산을 늘릴 수 있는, 핵산 분자를 가리킨다. 이 용어는, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣어진 벡터를 포함한다. 어느 벡터는, 자신이 동작적으로 연결된 핵산의, 발현을 가져올 수 있다. 그와 같은 벡터는, 본 명세서에서는 "발현 벡터"라고도 칭해진다. 벡터는, 바이러스 또는 일렉트로포레이션을 이용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 그렇지만, 벡터의 도입은, in vitro로의 방법으로 한정되지 않는다. 예를 들어, 벡터는, in vivo로의 방법을 이용하여 대상에게 직접 도입할 수도 있다.
숙주 세포
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은, 서로 교환 가능하게 이용되고, 외래 핵산이 도입된 세포(그와 같은 세포의 자손을 포함한다)를 가리킨다. 숙주 세포는 "형질 전환체" 및 "형질 전환 세포"를 포함하고, 이것에는 초대의 형질 전환 세포 및 계대수에 상관 없이 그 세포에서 유래하는 자손을 포함한다. 자손은, 친세포와 핵산의 내용에 있어서 완전히 동일하지 않아도 되고, 변이를 포함하고 있어도 된다. 오리지널의 형질 전환 세포가 스크리닝되었을 또는 선택되었을 때에 이용된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도, 본 명세서에서는 포함된다.
특이성
"특이적"이란, 1개 또는 복수의 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 분자가, 해당 파트너 이외의 분자에 대해서 조금도 유의한 결합을 나타내지 않는 것을 의미한다. 더욱이, "특이적"은 또한, 항원 결합 부위가, 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정의 에피토프에 특이적인 경우에도 이용된다. 항원 결합 분자가 항원에 특이적으로 결합하는 경우, 그것은 "항원 결합 분자가, 항원에/항원에 대해서 특이성을 갖는/나타내는"이라고도 기재된다. 항원 결합 부위가 결합하는 에피토프가 복수의 다른 항원 중에 포함되는 경우, 해당 항원 결합 부위를 포함하는 항원 결합 분자는, 해당 에피토프를 갖는 다양한 항원에 결합할 수 있다.
항체 단편
"항체 단편"은, 인택트(intact)한 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 인택트한 항체의 일부를 포함하는, 인택트한 항체 이외의 분자를 가리킨다. 항체 단편의 예로서는, 이들로 한정되지 않지만, Fv, Fab, Fab', Fab＇-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선상 항체(linear antibody); 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 들 수 있다.
용어 "전장 항체", "인택트한 항체", 및 "전항체(whole antibody)"는, 천연형의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나, 또는 본 명세서에 있어서 정의되는 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 가리키기 위해서, 본 명세서에 있어서 호환적으로 이용된다.
가변 단편(Fv)
본 명세서에 있어서, 용어 "가변 단편(Fv)"은, 항체의 경쇄 가변 영역(VL)과 항체의 중쇄 가변 영역(VH)의 페어로 구성되는 항체 유래의 항원 결합 부위의 최소 단위를 가리킨다. 1988년에 Skerra와 Pluckthun은, 세균의 시그널 서열의 하류에 항체 유전자를 삽입하여 대장균 중에서 당해 유전자의 발현을 유도하는 것에 의해, 균일하고 또한 활성인 항체가 대장균의 페리플라즘 획분으로부터 조제될 수 있음을 발견했다(Science (1988) 240 (4855), 1038-1041). 페리플라즘 획분으로부터 조제된 Fv에 있어서는, 항원에 결합하는 것과 같은 양식으로 VH와 VL이 회합하고 있다.
scFv, 단쇄 항체, 및 sc(Fv)
2
본 명세서에 있어서, 용어 "scFv", "단쇄 항체", 및 "sc(Fv)2"는 모두, 중쇄 및 경쇄에서 유래하는 가변 영역을 포함하지만, 정상 영역을 포함하지 않는, 단일 폴리펩티드쇄의 항체 단편을 가리킨다. 일반적으로, 단쇄 항체는, 항원 결합을 가능하게 한다고 생각되는 소망의 구조의 형성을 가능하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인의 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 단쇄 항체는, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)"에 있어서 Pluckthun에 의해 상세하게 고찰되어 있다. 마찬가지로, 국제 공개 공보 WO1988/001649, 미국 특허 제4,946,778호 및 동 제5,260,203호를 참조할 것. 특정의 태양에 있어서, 단쇄 항체는, 이중 특이성이고 또한/또는 인간화될 수 있다.
scFv는 Fv를 형성하는 VH와 VL이 펩티드 링커에 의해 함께 연결된 단쇄 저분자량 항체이다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883). 당해 펩티드 링커에 의해 VH와 VL이 근접한 상태로 유지될 수 있다.
sc(Fv)2는, 2개의 VL와 2개의 VH의 4개의 가변 영역이 펩티드 링커 등의 링커에 의해 연결되어 1본쇄를 형성하는 단쇄 항체이다(J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189). 이 2개의 VH와 2개의 VL은 상이한 모노클로날 항체에서 유래해도 된다. 그와 같은 sc(Fv)2로서는, 예를 들어, Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374에 개시되는 바와 같은, 단일 항원 중에 존재하는 2개의 에피토프를 인식하는 이중 특이성 sc(Fv)2를 호적하게 들 수 있다. sc(Fv)2는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, sc(Fv)2는, scFv를 펩티드 링커 등의 링커로 연결하는 것에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 있어서, sc(Fv)2는, 1본쇄 폴리펩티드의 N말단을 기점으로 하여 VH, VL, VH, VL(［VH］-링커-［VL］-링커-［VH］-링커-［VL］)의 순서로 늘어서 있는 2개의 VH 단위 및 2개의 VL 단위를 포함한다. 2개의 VH 단위와 2개의 VL 단위의 순서는 상기의 구성으로 한정되지 않고, 어떠한 순서로 늘어 세워져 있어도 된다. 구성의 예를 이하에 열거한다.
［VL］-링커-［VH］-링커-［VH］-링커-［VL］
［VH］-링커-［VL］-링커-［VL］-링커-［VH］
［VH］-링커-［VH］-링커-［VL］-링커-［VL］
［VL］-링커-［VL］-링커-［VH］-링커-［VH］
［VL］-링커-［VH］-링커-［VL］-링커-［VH］
sc(Fv)2의 분자 형태에 대해서는 WO2006/132352에 있어서도 상세히 기재되어 있다. 당업자이면 이들 기재에 따라, 본 명세서에서 개시되는 폴리펩티드 복합체를 제조하기 위해서 소망의 sc(Fv)2를 적절히 조제하는 것이 가능하다.
더욱이 본 개시의 항원 결합 분자 또는 항체에, PEG 등의 담체 고분자나 항암제 등의 유기 화합물을 컨주게이트해도 된다. 혹은, 당쇄가 소망의 효과를 가져오도록, 당쇄 부가 서열이 항원 결합 분자 또는 항체에 호적하게 삽입된다.
항체의 가변 영역의 연결에 사용하는 링커는, 유전자 공학에 의해 도입될 수 있는 임의의 펩티드 링커, 합성 링커, 및 예를 들어 Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996에 개시되는 링커를 포함한다. 그렇지만, 본 개시에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다. 길이는, 바람직하게는 5아미노산 이상(특별히 한정되지 않지만, 상한은 통상, 30아미노산 이하, 바람직하게는 20아미노산 이하)이며, 특히 바람직하게는 15아미노산이다. sc(Fv)2에 3개의 펩티드 링커가 포함되는 경우에는, 그들의 길이는 모두 동일해도 되고 상이해도 된다.
예를 들어, 그와 같은 펩티드 링커에는 이하의 것이 포함된다:
Ser,
Gly-Ser,
Gly-Gly-Ser,
Ser-Gly-Gly,
Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 91),
Ser-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 92),
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 93),
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 94),
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 95),
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 96),
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 97),
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 98),
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호: 93))n, 및
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호: 94))n.
여기에서 n은 1 이상의 정수이다. 펩티드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성 링커(화학 가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 이용되고 있고, 예로서는, N-하이드록시석신이미드(NHS), 다이석신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포석신이미딜)수베레이트(BS3), 다이싸이오비스(석신이미딜프로피오네이트)(DSP), 다이싸이오비스(설포석신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌 글라이콜 비스(석신이미딜석시네이트)(EGS), 에틸렌 글라이콜 비스(설포석신이미딜석시네이트)(설포-EGS), 다이석신이미딜 타르타르산염(DST), 다이설포석신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스[2-(석신이미드옥시카보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 및 비스[2-(설포석신이미드옥시카보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES)을 들 수 있다. 이들 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변 영역을 연결하려면, 통상, 3개의 링커가 필요하다. 이용되는 링커는, 동일한 종류의 것이어도 상이한 종류의 것이어도 된다.
Fab, F(ab')
2
, 및 Fab'
"Fab"는, 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 도메인 및 가변 영역으로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는, 다른 중쇄 분자와 다이설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"F(ab')2" 또는 "Fab"는, 면역글로불린(모노클로날 항체)을 펩신 및 파파인 등의 프로테아제로 처리하는 것에 의해 제조되고, 면역글로불린(모노클로날 항체)을 2개의 각 H쇄의 힌지 영역 사이에 존재하는 다이설파이드 결합의 근처에서 소화하는 것에 의해 생성되는 항체 단편을 가리킨다. 예를 들어 파파인은, IgG를, 2개의 각 H쇄의 힌지 영역 사이에 존재하는 다이설파이드 결합의 상류에서 절단하여, VL(L쇄 가변 영역) 및 CL(L쇄 정상 영역)을 포함하는 L쇄가 VH(H쇄 가변 영역) 및 CHγ1(H쇄 정상 영역 중의 γ1 영역)을 포함하는 H쇄 단편과 그들의 C말단 영역에서 다이설파이드 결합에 의해 연결되어 있는, 상동인 2개의 항체 단편을 생성한다. 이들 2개의 상동인 항체 단편은 각각 Fab'로 불린다.
"F(ab')2"는, 2개의 경쇄, 및 다이설파이드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인의 일부분의 정상 영역을 포함하는 2개의 중쇄 로 이루어진다. 본 명세서에 있어서 개시되는 F(ab')2는, 다음과 같이 호적하게 제조될 수 있다. 소망의 항원 결합 부위를 포함하는 모노클로날 전부 항체 등을, 펩신 등의 프로테아제로 부분 소화하고, Fc 단편을 프로틴 A 컬럼에 흡착시키는 것에 의해 제거한다. 프로테아제는, pH 등의 적절한 설정 효소 반응 조건하에서 선택적으로 F(ab')2를 가져오도록 전부 항체를 절단할 수 있는 것인 한, 특별히 한정은 되지 않는다. 예를 들어, 그와 같은 프로테아제에는 펩신 및 피신이 포함된다.
Fc 영역
본 발명에 있어서, 용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은, 항체 분자 중의, 힌지 또는 그 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어지는 단편을 포함하는 영역을 가리킨다. IgG 클래스의 Fc 영역은, 예를 들어, 시스테인 226(EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU 인덱스라고도 칭해진다))으로부터 C말단까지, 또는 프롤린 230(EU 넘버링)으로부터 C말단까지의 영역을 의미하지만, 그것에 한정되지 않는다. Fc 영역은, 바람직하게는, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 모노클로날 항체를, 펩신 등의 단백질 분해 효소로 부분 소화한 후에, 프로틴 A 컬럼 또는 프로틴 G 컬럼에 흡착된 획분을 재용출하는 것에 의해 취득할 수 있다. 그와 같은 단백질 분해 효소는, 적절히 설정되는 효소의 반응 조건(예를 들어, pH)하에서 제한적으로 Fab 또는 F(ab')2를 형성하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 그 예에는, 펩신 및 파파인이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 천연형 IgG에서 유래하는 Fc 영역을, 본 발명의 "Fc 영역"으로서 이용할 수 있다. 여기에서, 천연형 IgG란, 천연에서 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 함유하고, 면역글로불린 γ 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 천연형 인간 IgG란, 예를 들어, 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 또는 천연형 인간 IgG4를 의미한다. 천연형 IgG에는 또한, 자연 발생적으로 그것에서 유래하는 배리언트 등도 포함된다. 유전자다형에 기초하는 복수의 알로타입 서열이, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 및 인간 IgG4 항체의 정상 영역으로서 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242에 기재되어 있고, 그들은 모두, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다. 특히, 인간 IgG1의 서열은, EU 넘버링 356 내지 358위의 아미노산 서열로서, DEL 또는 EEM을 가져도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄의 쌍으로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은, 그 각 서브유닛이 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 정상 도메인을 포함하는, 2량체이다. Fc 도메인의 2개의 서브유닛은, 서로 안정적으로 회합할 수 있다. 하나의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 명세서에 있어서 기재되는 하나의 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정의 태양에 있어서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 태양에 있어서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 추가적인 특정의 태양에 있어서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 영역이다.
어느 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함한다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, 안정된 회합이 가능한 제 1 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되고, 또한 Fc 도메인은, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타낸다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, 천연형 IgG의 Fc 영역의 것과 비교하여, 산성 pH 조건(예를 들어, pH 5.8)하에서 증강된 FcRn 결합 활성을 나타낸다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 434위에 Ala; 438위에 Glu, Arg, Ser, 또는 Lys; 및 440위에 Glu, Asp, 또는 Gln을 포함한다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 434위에 Ala; 438위에 Arg 또는 Lys; 및 440위에 Glu 또는 Asp를 포함한다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 428위에 Ile 혹은 Leu; 및/또는 436위에 Ile, Leu, Val, Thr, 혹은 Phe를 추가로 포함한다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, EU 넘버링에 따른, 이하:
(a) N434A/Q438R/S440E;
(b) N434A/Q438R/S440D;
(c) N434A/Q438K/S440E;
(d) N434A/Q438K/S440D;
(e) N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f) N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(g) N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(h) N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(i) N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(j) N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(k) N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(l) N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(m) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;
(n) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;
(o) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;
(p) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;
(q) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;
(r) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;
(s) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;
(t) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;
(u) M428L/N434A/Q438R/S440E;
(v) M428L/N434A/Q438R/S440D;
(w) M428L/N434A/Q438K/S440E;
(x) M428L/N434A/Q438K/S440D;
(y) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(z) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(aa) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(ab) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(ac) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(ad) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(ae) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(af) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(ag) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; 및
(ah) L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, M428L/N434A/Q438R/S440E의 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, IgG Fc 도메인, 바람직하게는 인간 IgG Fc 도메인, 보다 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
어느 태양에 있어서, Fc 도메인은, 이하:
(a) 제 1 Fc 서브유닛이, 서열 번호: 100에 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 제 2 Fc 서브유닛이, 서열 번호: 111에 나타나는 아미노산 서열을 포함한다; 또는
(b) 제 1 Fc 서브유닛이, 서열 번호: 99에 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 제 2 Fc 서브유닛이, 서열 번호: 109에 나타나는 아미노산 서열을 포함한다
의 어느 하나를 포함한다.
저하된 Fcγ 수용체 결합 활성을 갖는 Fc 영역
본 명세서에 있어서, "저하된 Fcγ 수용체 결합 활성"은, 예를 들어, 상기에 기재되는 분석 방법에 기초하여, 시험 항원 결합 분자 또는 항체의 경합 활성이, 대조 항원 결합 분자 또는 항체의 경합 활성의, 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 또는 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하인 것을 의미한다.
모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체는, 대조 항원 결합 분자 또는 항체로서 적절히 이용할 수 있다. Fc 도메인 구조는, 서열 번호: 85(RefSeq 액세션 번호 AAC82527.1의 N말단에 A가 부가된다), 서열 번호: 86(RefSeq 액세션 번호 AAB59393.1의 N말단에 A가 부가된다), 서열 번호: 87(RefSeq 액세션 번호 CAA27268.1의 N말단에 A가 부가된다), 및 서열 번호: 88(RefSeq 액세션 번호 AAB59394.1의 N말단에 A가 부가된다)에 나타난다. 더욱이, 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가 시험 물질로서 이용되는 경우, Fcγ 수용체 결합 활성에 대한 변이체의 변이의 작용은, 동일한 아이소타입의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체를 대조로서 이용하여 평가된다. 상기에 기재되는 바와 같이, 그 Fcγ 수용체 결합 활성이 저하되고 있다고 판단되고 있는 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가, 적절히 조제된다.
그와 같은 공지된 변이체로서는, 예를 들어, 아미노산 231A-238S(EU 넘버링)의 결실을 갖는 변이체(WO 2009/011941), 및 변이체 C226S, C229S, P238S, (C220S)(J. Rheumatol (2007) 34, 11); C226S 및 C229S((Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54); C226S, C229S, E233P, L234V, 및 L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192)를 들 수 있다.
구체적으로는, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서, 이하의 아미노산 위치: 220위, 226위, 229위, 231위, 232위, 233위, 234위, 235위, 236위, 237위, 238위, 239위, 240위, 264위, 265위, 266위, 267위, 269위, 270위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 300위, 325위, 327위, 328위, 329위, 330위, 331위, 또는 332위(EU 넘버링)로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산의 변이(예를 들어, 치환)를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것이 포함된다. Fc 도메인의 기원인 항체의 아이소타입은 특별히 한정되지 않고, 모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체에서 유래하는 적절한 Fc 도메인을 이용하는 것이 가능하다. IgG1 항체에서 유래하는 Fc 도메인을 이용하는 것이 바람직하다.
바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 예를 들어, 그 위치가, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 EU 넘버링에 의해 지정되어 있는(각 숫자가 EU 넘버링에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고; 또한 숫자 앞에 있는 1문자 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내고, 숫자 뒤에 있는 1문자 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 나타낸다), 이하에 나타나는 치환:
(a) L234F, L235E, P331S;
(b) C226S, C229S, P238S;
(c) C226S, C229S; 또는
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A
의 어느 1개를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것, 및 231위 내지 238위에 있는 아미노산 서열의 결실을 갖는 Fc 도메인을 갖는 것이 포함된다.
더욱이, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는 또한, 그 위치가, IgG2 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 EU 넘버링에 의해 지정되어 있는, 이하에 나타나는 치환:
(e) H268Q, V309L, A330S, 및 P331S;
(f) V234A;
(g) G237A;
(h) V234A 및 G237A;
(i) A235E 및 G237A; 또는
(j) V234A, A235E, 및 G237A
의 어느 1개를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 각 숫자는 EU 넘버링에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고; 또한 숫자 앞에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내고, 숫자 뒤에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 후의 아미노산 잔기를 나타낸다.
더욱이, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는 또한, 그 위치가, IgG3 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 EU 넘버링에 의해 지정되어 있는, 이하에 나타나는 치환:
(k) F241A;
(l) D265A; 또는
(m) V264A
의 어느 1개를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 각 숫자는 EU 넘버링에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고; 또한 숫자 앞에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내고, 숫자 뒤에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 후의 아미노산 잔기를 나타낸다.
더욱이, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는 또한, 그 위치가, IgG4 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 EU 넘버링에 의해 지정되어 있는, 이하에 나타나는 치환:
(n) L235A, G237A, 및 E318A;
(o) L235E; 또는
(p) F234A 및 L235A
의 어느 1개를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 각 숫자는 EU 넘버링에서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내고; 또한 숫자 앞에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 전의 아미노산 잔기를 나타내고, 숫자 뒤에 있는 1문자 아미노산 기호는 치환 후의 아미노산 잔기를 나타낸다.
다른 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 233위, 234위, 235위, 236위, 237위, 327위, 330위, 또는 331위(EU 넘버링)에 있는 어느 아미노산이, 대응하는 IgG2 또는 IgG4에 있어서의 대응하는 EU 넘버링에서의 위치의 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 것이 포함된다.
바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는 또한, 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 234위, 235위, 및 297위(EU 넘버링)에 있는 아미노산의 어느 1개 또는 복수가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 치환 후의 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않는다; 그렇지만, 234위, 235위, 및 297위에 있는 아미노산의 어느 1개 또는 복수가 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가 특히 바람직하다.
바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는 또한, 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 265위(EU 넘버링)에 있는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 것도 포함된다. 치환 후의 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않는다; 그렇지만, 265위에 있는 아미노산이 알라닌에 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가 특히 바람직하다.
Fc 수용체
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 가리킨다. 몇몇 태양에 있어서, FcR는, 천연형 인간 FcR이다. 몇몇 태양에 있어서, FcR는, IgG 항체에 결합하는 것(감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를, 이들 수용체의 대립 유전자 배리언트 및 선택적 스플라이싱에 의한 형태를 포함시켜, 포함한다. FcγRII 수용체는, FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그 세포질 도메인에 있어서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는, 그 세포질 도메인에 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는, 그 세포질 도메인에 면역 수용체 티로신 저해 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM)를 포함한다. (예를 들어, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)를 참조.) FcR은, 예를 들어, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)에 있어서 총설되어 있다. 장래 동정될 것을 포함하는 다른 FcR도, 본 명세서의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한, 모체의 IgG의 태아에의 이동(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성의 조절을 담당하는, 신생아형 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에의 결합을 측정하는 방법은 공지이다(예를 들어, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)를 참조).
in vivo로의 인간 FcRn에의 결합 및 인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩티드의 혈장 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 혹은 트랜스펙트된 인간 세포주에 있어서 또는 배리언트 Fc 영역을 수반하는 폴리펩티드가 투여되는 영장류에 있어서 측정될 수 있다. WO2000/42072(Presta)는, FcR에 대한 결합이 증가한 또는 감소한 항체 배리언트를 기재하고 있다. 예를 들어, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)도 참조할 것.
Fcγ 수용체
Fcγ 수용체는, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 모노클로날 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 수용체를 가리키고, 이것에는 Fcγ 수용체 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 단백질의 패밀리에 속하는 모든 멤버가 포함된다. 인간에 있어서, 이 패밀리에게는, 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다), 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16); 및 미동정의 인간 Fcγ 수용체, Fcγ 수용체 아이소폼, 및 그들의 알로타입의 모두가 포함된다. 그렇지만, Fcγ 수용체는 이들 예로 한정되지 않는다. Fcγ 수용체에는, 이들로 한정되지 않지만, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이에서 유래하는 것이 포함된다. Fcγ 수용체는 임의의 생물에서 유래해도 된다. 마우스 Fcγ 수용체에는, 이들로 한정되지 않지만, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 미동정의 마우스 Fcγ 수용체, Fcγ 수용체 아이소폼, 및 그들의 알로타입의 모두가 포함된다. 그와 같은 바람직한 Fcγ 수용체에는, 예를 들어, 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16), 및/또는 FcγRIIIB(CD16)가 포함된다. FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 RefSeq 등록 번호 NM_000566.3 및 RefSeq 등록 번호 NP_000557.1에 나타나고; FcγRIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 RefSeq 등록 번호 BC020823.1 및 RefSeq 등록 번호 AAH20823.1에 나타나고; FcγRIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 RefSeq 등록 번호 BC146678.1 및 RefSeq 등록 번호 AAI46679.1에 나타나고; FcγRIIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 RefSeq 등록 번호 BC033678.1 및 RefSeq 등록 번호 AAH33678.1에 나타나고; 및 FcγRIIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 RefSeq 등록 번호 BC128562.1 및 RefSeq 등록 번호 AAI28563.1에 나타난다. Fcγ 수용체가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 모노클로날 항체의 Fc 도메인에 대한 결합 활성을 가질지 여부는, 상기의 FACS 및 ELISA 포맷에 더하여, ALPHA 스크린(증폭 발광 근접 호모지니어스 어세이), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 베이스의 BIACORE법, 및 그 외에 의해 평가할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
그 한편으로, "Fc 리간드" 또는 "이펙터 리간드"는, 항체 Fc 도메인에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 분자, 및 바람직하게는 폴리펩티드를 가리킨다. 해당 분자는 임의의 생물에서 유래해도 된다. Fc 리간드의 Fc에의 결합은, 바람직하게는 1개 또는 복수의 이펙터 기능을 유도한다. 그와 같은 Fc 리간드에는, Fc 수용체, Fcγ 수용체, Fcα 수용체, Fcβ 수용체, FcRn, C1q, 및 C3, 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 스타필로코커스(Staphylococcus) 프로틴 A, 스타필로코커스 프로틴 G, 및 바이러스 Fcγ 수용체가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. Fc 리간드에는, Fcγ 수용체와 상동인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)(Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136)도 또한 포함된다. Fc 리간드에는, Fc에 결합하는 미동정의 분자도 또한 포함된다.
Fcγ 수용체 결합 활성
FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, 및/또는 FcγRIIIB의 어느 하나의 Fcγ 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 활성이 손상되고 있는 것은, 상기의 FACS 및 ELISA 포맷, 및 ALPHA 스크린(증폭 발광 근접 호모지니어스 어세이) 및 표면 플라즈몬 공명(SPR) 베이스의 BIACORE법을 이용하는 것에 의해 평가할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은, 2종류의 비즈: 도너 비즈 및 억셉터 비즈를 이용하는, 하기의 원리에 기초한 ALPHA 기술에 의해 실시된다. 도너 비즈에 연결된 분자가 억셉터 비즈에 연결된 분자와 생물학적으로 상호작용하고, 또한 2개의 비즈가 근접하여 위치하는 경우에만, 발광 시그널이 검출된다. 도너 비즈 내의 광증감제는, 레이저광에 의해 여기되어, 비즈 주변의 산소를 여기 상태의 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소가 도너 비즈 주변으로 확산하여, 근접하여 위치하는 억셉터 비즈에 액세스하면, 억셉터 비즈 내의 화학 발광 반응이 유도된다. 이 반응에 의해 최종적으로 광이 방출된다. 도너 비즈에 연결된 분자가 억셉터 비즈에 연결된 분자와 상호작용하지 않는 것이면, 도너 비즈에 의해 생성되는 일중항 산소는 억셉터 비즈에 액세스하지 않고, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들어, 비오틴 표지된 항원 결합 분자 또는 항체를 도너 비즈에 고정화하고, 글루타티온 S 트랜스페라제(GST)로 태그 붙여진 Fcγ 수용체를 억셉터 비즈에 고정화한다. 경합적 변이 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체의 비존재하에서는, Fcγ 수용체는, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체와 상호작용하여, 결과로서 520 내지 620nm의 시그널을 유도한다. 태그 붙여져 있지 않은 변이 Fc 도메인을 갖는 항원 결합 분자 또는 항체는, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체와 Fcγ 수용체와의 상호작용에 관해서 경합한다. 경합의 결과로서의 형광의 감소를 정량화하는 것에 의해, 상대적 결합 친화성을 결정할 수 있다. Sulfo-NHS-비오틴 등을 이용하여 항체 등의 항원 결합 분자 또는 항체를 비오틴화하는 방법은 공지이다. GST 태그를 Fcγ 수용체에 부가하기 위한 적절한 방법에는, Fcγ 수용체를 코딩하는 폴리펩티드와 GST를 코딩하는 폴리펩티드를 인프레임으로 융합하고, 해당 융합 유전자를 보유하는 벡터가 도입된 세포를 이용하여 해당 유전자를 발현시키고, 그 다음에 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 것을 수반하는 방법이 포함된다. 유도된 시그널은 바람직하게는, 예를 들어, GRAPHPAD PRISM(GraphPad; San Diego) 등의 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀 분석에 기초하는 일부위 경합 모델에 적합시키는 것에 의해, 해석할 수 있다.
상호작용을 관찰하기 위한 물질 중 한쪽을, 리간드로서 센서 칩의 금 박막 상에 고정화한다. 금 박막과 유리의 경계면에서 전반사가 일어나도록 센서 칩의 이면으로부터 광을 쬐면, 어느 특정의 부위에 있어서 반사광의 강도가 부분적으로 저하된다(SPR 시그널). 상호작용을 관찰하기 위한 다른 쪽 물질을, 분석물로서 센서 칩의 표면 상에 주입한다. 분석물이 리간드에 결합하면, 고정화 리간드 분자의 질량이 증가한다. 이것에 의해, 센서 칩의 표면 상의 용매의 굴절률이 변화한다. 굴절률의 변화는, SPR 시그널의 위치의 시프트를 일으킨다(반대로, 해리되면 시그널은 원래의 위치에 시프트하여 되돌아온다). Biacore 시스템에서는, 상기의 시프트의 양(즉, 센서 칩 표면 상에서의 질량의 변화)을 세로축에 플롯하고, 그와 같이 하여 경시적인 질량의 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 곡선으로부터 동태 파라미터(회합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd))가 결정되고, 이들 2개의 상수의 비율로부터 친화성(KD)이 결정된다. BIACORE법에서는, 저해 어세이가 바람직하게 이용된다. 그와 같은 저해 어세이의 예는, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010에 기재되어 있다.
다중 특이성 항체의 산생 및 정제
본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자는, Fc 도메인의 2개의 서브유닛의 한쪽 또는 다른 한쪽에 융합된, 2종류의 상이한 항원 결합 부분(예를 들어, "제 1 항원 결합 부분" 및 "제 2 항원 결합 부분")을 포함하고, 따라서, Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 전형적으로는, 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드쇄에 포함된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 동시 발현 및 계속된 2량체화는, 2개의 폴리펩티드의 복수의 조합의 가능성을 가져온다. 따라서, 재조합 산생에 있어서의 다중 특이성 항원 결합 분자의 수량 및 순도를 개선하기 위해서, 소망의 폴리펩티드의 회합을 촉진하는 개변을 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인 중에 도입하는 것은 유리해진다.
따라서, 특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서 기재되는 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, Fc 도메인의 제 1 서브유닛과 제 2 서브유닛의 회합을 촉진하는 개변을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이에서의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는, Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다. 따라서, 하나의 태양에 있어서, 해당 개변은 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다.
특정의 태양에 있어서, 해당 개변은, Fc 도메인의 2개 서브유닛의 한쪽에 있어서의 "노브(knob)" 개변과 Fc 도메인의 2개의 서브유닛의 다른 한쪽에 있어서의 "홀(hole)" 개변을 포함하는, 이른바 "knob-into-hole" 개변이다.
knob-into-hole 테크놀로지는, 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제7,695,936호; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996); 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에 기재되어 있다. 일반적으로, 방법은, 돌기("knob")가 공극("hole") 중에 위치하여, 헤테로2량체의 형성을 촉진하고 또한 호모2량체의 형성을 방해할 수 있도록, 돌기를 제 1 폴리펩티드의 계면에, 및 대응하는 공극을 제 2 폴리펩티드의 계면에 도입하는 단계를 수반한다. 돌기는, 제 1 폴리펩티드의 계면의 작은 아미노산 측쇄를, 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 치환하는 것에 의해 구축된다. 돌기와 동일한 또는 마찬가지의 사이즈의 보상적인 공극은, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환하는 것에 의해 제 2 폴리펩티드의 계면에 만들어진다.
따라서, 특정의 태양에 있어서는, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에 있어서, 아미노산 잔기는, 보다 큰 측쇄 체적을 갖는 아미노산 잔기로 치환되고, 그것에 의해, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인내의 공극 중에 위치할 수 있는 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌기가 생성되고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에 있어서, 아미노산 잔기는, 보다 작은 측쇄 체적을 갖는 아미노산 잔기로 치환되고, 그것에 의해, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌기가 위치할 수 있는 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 공극이 생성된다.
돌기 및 공극은, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 예를 들어 부위 특이적 변이 유발에 의해 변경하는 것에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해, 만들 수 있다.
특정의 태양에 있어서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에 있어서, 366위의 트레오닌 잔기는, 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에 있어서, 407위의 티로신 잔기는, 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 하나의 태양에 있어서, Fc 도메인의 제 2 서브유닛에 있어서, 추가로, 366위의 트레오닌 잔기는, 세린 잔기로 치환되고(T366S), 368위의 류신 잔기는, 알라닌 잔기로 치환된다(L368A).
더 추가적인 태양에 있어서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛에 있어서, 추가로, 354위의 세린 잔기는, 시스테인 잔기로 치환되고(S354C), Fc 도메인의 제 2 서브유닛에 있어서, 추가로, 349위의 티로신 잔기는, 시스테인 잔기에 의해 치환된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은, Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 가져와, 2량체를 더 안정화한다(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
다른 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자에는, 소망의 조합을 갖는 H쇄 사이 및 L쇄 H쇄 사이의 회합을 촉진하기 위한 다른 기술을 적용할 수 있다.
예를 들어, 다중 특이성 항체의 회합에는, 항체 H쇄의 제 2 정상 영역 또는 제 3 정상 영역(CH2 또는 CH3)의 계면에 정전기적 반발을 도입하는 것에 의해 바람직하지 않은 H쇄 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 정전기적 반발을 도입하는 것에 의해 의도하지 않는 H쇄 회합을 억제하는 기술에 있어서, H쇄의 다른 쪽의 정상 영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기의 예에는, CH3 영역에 있어서의 EU 넘버링 위치 356위, 439위, 357위, 370위, 399위, 및 409위의 잔기에 대응하는 영역이 포함된다.
보다 구체적으로는, 2종의 H쇄 CH3 영역을 포함하는 항체로서, 제 1 H쇄 CH3 영역에 있어서의, 이하의 (1) 내지 (3)에 나타내는 아미노산 잔기의 쌍으로부터 선택되는 1 내지 3쌍의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체를, 예로서 들 수 있다: (1) H쇄 CH3 영역에 포함되는, EU 넘버링 위치 356위 및 439위의 아미노산 잔기, (2) H쇄 CH3 영역에 포함되는, EU 넘버링 위치 357위 및 370위의 아미노산 잔기, 및 (3) H쇄 CH3 영역에 포함되는, EU 넘버링 위치 399위 및 409위의 아미노산 잔기.
더욱이, 해당 항체는, 상기 제 1 H쇄 CH3 영역과는 상이한 제 2 H쇄 CH3 영역에 있어서의 아미노산 잔기의 쌍이, 상기 (1) 내지 (3)의 아미노산 잔기의 쌍으로부터 선택되고, 상기 제 1 H쇄 CH3 영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1) 내지 (3)의 아미노산 잔기의 쌍에 대응하는 1 내지 3쌍의 아미노산 잔기가, 상기 제 1 H쇄 CH3 영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체여도 된다.
상기 (1) 내지 (3)에 나타나는 각각의 아미노산 잔기는, 회합했을 때에 서로 접근하고 있다. 당업자이면, 소망의 H쇄 CH3 영역 또는 H쇄 정상 영역에 있어서, 시판되는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 상기 (1) 내지 (3)의 아미노산 잔기에 대응하는 위치를 발견할 수 있고, 적절히, 이들 위치의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서, "전하를 갖는 아미노산 잔기"는, 예를 들어, 이하의 군의 어느 하나에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다:
(a) 글루탐산(E) 및 아스파르트산(D), 및
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서, 어구 "동일한 전하를 갖는"이란, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 잔기의 모두가, 상기의 군(a) 및 (b) 중 어느 하나에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것을 의미한다. 어구 "반대의 전하를 갖는"이란, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 잔기 중 적어도 1개의 아미노산 잔기가, 상기의 군(a) 및 (b) 중 어느 하나에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 경우에, 나머지의 아미노산 잔기가 다른 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는, 그 제 1 H쇄 CH3 영역과 제 2 H쇄 CH3 영역이 다이설파이드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 개변에 제공하는 아미노산 잔기는, 전술한 항체 가변 영역 또는 항체 정상 영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자이면, 변이 폴리펩티드 또는 이종 다량체에 있어서, 시판되는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 동정할 수 있고, 그 다음에 이들 위치의 아미노산 잔기를, 회합을 제어하도록 개변에 제공하는 것이 가능하다.
더하여, 본 발명의 다중 특이성 항체의 형성에는 다른 공지 기술을 이용할 수도 있다. 항체의 한쪽의 H쇄 CH3의 일부를 대응하는 IgA 유래의 서열로 바꾸고, 대응하는 IgA 유래의 서열을 다른 쪽의 H쇄 CH3의 상보적인 부분에 도입하는 것에 의해 생성된 쇄교환 조작 도메인 CH3(strand-exchange engineered domain CH3)을 이용하여, 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합을 CH3의 상보적인 회합에 의해 효율적으로 유도할 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지 기술을 이용하여 효율적으로 목적하는 다중 특이성 항체를 형성시킬 수도 있다.
더하여, 다중 특이성 항원 결합 분자의 형성에는, WO2011/028952, WO2014/018572 및 Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8에 기재되는 바와 같은 항체의 CH1과 CL의 회합 및 VH와 VL의 회합을 이용한 항체 제조 기술, WO2008/119353 및 WO2011/131746에 기재되는 바와 같은 따로따로 조제한 모노클로날 항체를 조합하여 사용하여 이중 특이성 항체를 제조하는 기술(Fab Arm Exchange), WO2012/058768 및 WO2013/063702에 기재되는 바와 같은 항체 중쇄 CH3 사이의 회합을 제어하는 기술, WO2012/023053에 기재되는 바와 같은 2종류의 경쇄와 1종류의 중쇄로 구성되는 다중 특이성 항체를 제조하는 기술, Christoph 등(Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))에 의해 기재되는 바와 같은 1개의 H쇄와 1개의 L쇄를 포함하는 항체의 편쇄를 각각 발현하는 2개의 세균 세포주를 이용한 다중 특이성 항체를 제조하는 기술 등을 이용해도 된다.
혹은, 목적의 다중 특이성 항체를 효율적으로 형성시킬 수 없는 경우에도, 산생된 항체로부터 목적하는 다중 특이성 항체를 분리하고 정제하는 것에 의해, 본 발명의 다중 특이성 항체를 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 2종류의 H쇄의 가변 영역에 아미노산 치환을 도입하는 것에 의해 등전점의 차를 부여함으로써, 2종류의 호모체와 목적하는 헤테로항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 것을 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325). 헤테로항체를 정제하는 방법으로서 지금까지, 프로틴 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로틴 A에 결합하지 않는 래트 IgG2b의 H쇄를 포함하는 헤테로2량화 항체를, 프로틴 A를 이용하여 정제 하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431 및 WO95033844). 더욱이, IgG와 프로틴 A의 결합 부위인 EU 넘버링 위치 435위 및 436위의 아미노산 잔기를, 상이한 프로틴 A 친화성을 가져오는 아미노산인 Tyr, His 등으로 치환한 H쇄를 이용하여, 혹은, 상이한 프로틴 A 친화성을 갖는 H쇄를 이용하여, 각 H쇄와 프로틴 A의 상호작용을 변화시키고, 그 다음에 프로틴 A 컬럼을 이용하는 것에 의해, 헤테로2량화 항체만을 효율적으로 정제할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 Fc 영역으로서, Fc 영역의 C말단의 헤테로제니티가 개선된 Fc 영역이 적절히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래의 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 의해 특정되는 446위의 글리신 및 447위의 리신을 결실시키는 것에 의해 생성된 Fc 영역을 제공한다.
본 명세서에 있어서 기재되는 바와 같이 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자는, 예를 들어, 고속 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 어피니티 크로마토그래피, 및 사이즈 배제 크로마토그래피 등의 당 기술 분야에 있어서 공지된 기술에 의해 정제되어도 된다. 특정의 단백질을 정제하기 위해서 이용되는 실제의 조건은, 알짜 전하, 소수성, 친수성 등의 인자에 일부 의존하고, 당업자에게 분명하다. 어피니티 크로마토그래피 정제에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자가 결합하는, 항체, 리간드, 수용체, 또는 항원을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자의 어피니티 크로마토그래피 정제에서는, 프로틴 A 또는 프로틴 G를 갖는 매트릭스가 이용되어도 된다. 다중 특이성 항원 결합 분자를 단리하기 위해서, 연속한 프로틴 A 또는 G 어피니티 크로마토그래피 및 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 다중 특이성 항원 결합 분자의 순도는, 겔 전기영동 및 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는, 다양한 주지된 분석 방법의 어느 것인가에 의해 결정할 수 있다.
본 명세서에 있어서 인용한 모든 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
이하는, 본 개시의 방법 및 조성물의 실시예이다. 전술한 일반적인 기재에 비추어, 여러 가지 다른 태양이 실시될 수 있음이, 이해될 것이다.
실시예
[실시예 1] (1+2) 3가 포맷 및 (1+2) Dual/LINC3가 포맷의 항체 제작
1.1. 3가 (1+2) 포맷 및 3가 (1+2) Dual/LINC 포맷의 제작 및 서열
CD137 수용체 클러스터 형성은 효과적인 아고니스트 활성에 있어 중요한 의미를 가진다. 세포 상해성을 개선하기 위해서, DUAL/LINC, 1+2라고 명명된 새로운 3가 항체 포맷을 설계하는 것에 의해, CD137 분자에의 결합수를 증가시켰다(도 1(a), 표 2). 구체적으로는, 새로운 항체 포맷은, 각각이 1개의 CD3 또는 CD137에 결합할 수 있지만 동시는 아닌 2개의 1가 Dual-Fab(도 1의 FvB 및 FvC, 참고 실시예 3에서 조제된다)와, 1개의 1가 종양 항원 결합 암(arm)(도 1의 FvA)을 포함하는, "1+2" 포맷을 갖는 3가 삼중 특이성 항체이며, 여기에서, 1개의 다이설파이드 결합("LINC")이, 예를 들어, 2개의 Dual-Fab의 각각의 CH1 도메인의 191위에, 시스테인 치환(Kabat 넘버링으로 S191C)을 도입하는 것에 의해, 2개의 Dual-Fab 사이에 도입/설계되고 있다(도 1a). 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 본 발명자들은, 그와 같이 설계된 다이설파이드 결합("LINC")은, 2개의 Dual-Fab 사이의 입체 장애 또는 짧은 거리의 결과로서, 2개의 Dual-Fab의 항원(CD3 또는 CD137) 결합 배향성을 시스 항원 결합(즉, 동일한 세포 상의 2개의 항원에의 결합)으로 제한하고, 그것에 의해, 종양 항원 비의존적으로 2개의 Dual-Fab에 의해 매개되는 2개의 CD3/CD137 발현 면역 세포의 바람직하지 않은 가교 형성을 방해하는 것에 의해 삼중 특이성 항체의 안전성 프로파일을 개선하는 것을 기도했다(도 2a). Fc 영역은 FcγR 사일런트이며, 또한 탈글리코실화되었다. 삼중 특이성 항체에 있어서의 각 Fv 영역의 표적 항원 및 각 결합 도메인의 명명 규칙을 표 2(a)에 나타내고, 서열 번호를 표 2(b) 및 (c)에 나타낸다.
[표 2]
모든 항체를 Expi293 세포(Invitrogen)에서의 일과성 발현에 의해 3가 형태로서 발현시키고, 참고 실시예 1에 따라 정제했다. 항체의 순도를, 도 3에 나타내는 바와 같이 비환원 SDS-PAGE(참고 실시예 2)에 의해 분석하고, (1+2) Dual/LINC3가 항체 시료로 이중의 밴드를 관찰했다. 단백질의 삼차 구조는 폴리펩티드의 SDS-PAGE 영동 속도에 영향을 줄 가능성이 있음이 나타나 있고, 다이설파이드로 연결된 입체 구조는 비환원 조건에서 SDS-PAGE 영동 속도를 증가시켰다(Therien AG, Grant FE, Deber CM (2001) Interhelical hydrogen bonds in the CFTR membrane domain. Nat Struct Biol 8:597-601). 도 3에 있어서, S191C 변이의 도입을 갖지 않는 (1+2) 3가 포맷(도 3, 레인 2, 5 및 7)에서 단일의 단백질 영동 밴드가 확인되었다. 이에 반해서, S191C 변이를 갖는 (1+2) Dual/LINC 항체 배리언트 시료에서는 2개의 단백질 영동 밴드가 검출되고, 보다 느린 영동 밴드(또는 상측의 밴드)는, S191C 변이의 도입을 갖지 않는 (1+2) 3가 포맷과 마찬가지의 전기영동 이동도를 나타냈다. 이것은, 보다 빠른 영동 밴드(또는 하측의 밴드)가, 조작된 다이설파이드 결합을 갖는 3가 1+2 항체(Dual/LINC, 도 1a)인 것을 시사한다. UnLINC 포맷(즉, 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 3가 1+2 항체, 도 1b)은, 종양 항원에의 결합의 비존재하에서 CD137 및/또는 CD3 발현 면역 세포의 가교 형성을 가져올 우려가 있으므로(도 2a에 도시하는 바와 같이), 최종 포맷 산물에 있어서, UnLINC 포맷을 저하시키는 추가적인 정제가 필요해진다.
[실시예 2] 환원 시약 처리에 의한 Dual/LINC 순도의 향상
실시예 2.1 환원제를 이용하는, Dual/LINC 항체에 있어서의 "짝을 이루는 시스테인"(조작된 다이설파이드 결합) 형성의 촉진
이하의 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, UnLINC 포맷(즉, 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 3가 1+2 항체, 또는 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태)의 존재는, 짝을 이루지 않는 Cys 잔기를 "캐핑"하여 LINC 형성(조작된 다이설파이드 결합의 형성)을 방해하는 시스테인화 및 글루타티온화 등, 유리 싸이올기를 함유하는 분자와 다이설파이드 결합을 때때로 형성하는 짝을 이루지 않는 Cys 잔기를 원인으로 할 가능성이 있다고 생각된다. 도 2(b)에 나타나는 바와 같이, 짝을 이루지 않는 시스테인의 캐핑된 분자를 제거하기 위해서, 환원제는, 표면 시스테인의 탈캐핑을 도울 수 있고, 탈캐핑된 항체의 추가적인 재산화(예를 들어, 버퍼 교환에 의한 환원 시약의 제거)는, LINC 형성을 위한 탈캐핑된 시스테인 사이의 다이설파이드 결합 형성을 촉진할 수 있다. 따라서, 환원 및 재산화에 의한 UnLINC 포맷에 있어서의 짝을 이루지 않는 설프하이드릴로부터의 시스테인화의 제거는, UnLINC 포맷을 제거하여, 항체의 균일성을 개선할 가능성이 있다.
균일한 Dual-LINC 항체 조제물을 얻기 위해서, 시스테인으로 캐핑된 짝을 이루지 않는 시스테인을, 탈캐핑하여, "짝을 이루는 시스테인"(조작된 다이설파이드 결합) 형성을 촉진할 필요가 있었다. 짝을 이루지 않는 시스테인을 탈캐핑하기 위해서, 여러 가지 환원제를 이용했다. 짝을 이루는 시스테인 형태와 짝을 이루지 않는 시스테인 형태를 포함하는 불균일한 Dual-LINC 항체 조제물을, 시스테인 또는 TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀) 또는 2MEA(2-머캅토에틸아민) 등의 환원제의 첨가에 의해, 탈캐핑에 제공했다. 탈캐핑에 이어, 버퍼 교환에 의해 환원제를 제거하여, Dual-LINC 항체 조제물에 있어서의 "짝을 이루는 시스테인"(조작된 다이설파이드 결합) 형성을 촉진했다. 버퍼 교환 외에, 시스테인 결합의 형성을 촉진함이 공지된 CuSO4를, "짝을 이루는 시스테인"(조작된 다이설파이드 결합) 형성을 증강하기 위해서 이용했다. 0.5mg/ml(2.5μM)의 Dual-LINC 항체 조제물을, 2mM 시스테인, 5mM 시스테인, 50μM TCEP, 100μM TCEP, 및 25mM 2MEA로 37℃에서 2시간 처리하고, 계속해서 CuSO4 없음 또는 25μM/50μM CuSO4 있음의 어느 것인가에서 1×TBS에 의해 버퍼 교환했다. 모든 조건 중, TCEP 처리는, Dual-LINC 항체 조제물에 있어서의 "짝을 이루는 시스테인"(조작된 다이설파이드 결합) 형성의 유의한 증가를 나타냈음이 관찰되었다. 시스테인, 2MEA, 및 CuSO4의 첨가는, TCEP 같이는 "짝을 이루는 시스테인" 형성(조작된 다이설파이드 결합)을 증가시키지 않았다(도 4).
TCEP 처리를 더 최적화하기 위해서, 여러 가지 농도의 Dual-LINC-Ig를 다양한 몰비의 TCEP와 실온에서 2시간 인큐베이트하고, 계속해서 1×PBS로 버퍼 교환하여(TCEP를 제거하기 위해), "짝을 이루는 시스테인" 형성을 촉진했다. 0.5mg/ml(2.5μM), 1mg/ml(5μM), 5mg/ml(25μM) 및 10mg/ml(50μM)의 다양한 농도의 Dual-LINC-Ig에 있어서, Dual-LINC 항체 조제물 및 TCEP를 1:10, 1:20 및 1:30 몰비로 첨가했다. 고농도, 예를 들어, 5mg/ml 및 10mg/ml도 또한, SDS-PAGE 분석에 기초하는 "짝을 이루는 시스테인"(조작된 다이설파이드 결합) 형성의 유의한 증가를 나타냈다(도 5).
TCEP 처리에서의 인큐베이션 기간을 더 최적화하기 위해서, 반응을, 1:2, 1:5 및 1:10의 몰비의 Dual-LINC-Ig(50μM) 및 TCEP로 2시간 또는 18시간의 상이한 인큐베이션 기간에 실시했다. 모든 조건에 있어서, 짝을 이루지 않는 시스테인(조작된 다이설파이드 결합)을 갖는 Dual-LINC-Ig는, SDS-PAGE 분석(도 6에서의 "LINC" 및 "UnLINC" 구조에 대응하는 2개의 밴드의 강도의 합계로 나눈, "UnLINC" 포맷에 대응하는 느린 밴드/상측의 밴드의 강도)에 기초하여 ＜10%까지 저하되어, Dual-LINC-Ig의 균일성을 더 증가시켰다(도 6). 모든 조건 중, 실온에서 18시간의 인큐베이션 기간, 계속해서 오버나이트(O/N) 재산화를 위한 1×PBS로의 버퍼 교환을 행한 1:5의 비의 Dual-LINC 항체 조제물 및 TCEP가, 짝을 이루는 시스테인 형성을 갖는 Dual-LINC를 가장 많이 나타냈다.
이하는 본 발명의 아미노산 서열의 예를 나타낸다.
[표 3]
[실시예 3] 항체 조제물로부터 "짝을 이루는 시스테인" 형성을 갖지 않는 Dual/LINC를 분리하기 위한 어피니티 크로마토그래피 어프로치
실시예 3.1 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태를 갖는(조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는) 항체에만 특이적으로 결합하는 입체 구조 특이적 항체의 개념
실시예 2에 기재되는 바와 같이, 조작된 시스테인을 갖는 항체 조제물(예를 들어, 도 1, 표 2에 나타나는 3가 1+2 항체)은, 조작된 다이설파이드 결합을 갖는 항체 아이소폼("짝을 이루는 시스테인" 또는 "LINC" 형태) 및 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 항체 아이소폼("짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태)의 불균일한 집단을 포함한다. 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는 이들 항체("짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태)를 항체 조제물로부터 분리 또는 제거하기 위해서, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태의 항체에 특이적으로 결합하는 및/또는 그것을 포착할 수 있지만, "짝을 이루는 시스테인" 형태의 항체에는 결합하지 않는 입체 구조 특이적 항체를, 어피니티 크로마토그래피 정제, 분석 및/또는 정량화 적용에서의 사용을 위한 툴 항체로서 제작할 수 있다.
하나의 태양에 있어서, 표적 항체는, 2개의 Fab의 각각 조작된 시스테인을 포함하는 IgG(1+1) 포맷이고, 그와 같은 입체 구조 특이적 항체는, 조작된 다이설파이드 결합을 표적 항체가 갖지 않을("짝을 이루지 않는 시스테인" 형태) 때에만 입체 구조 특이적 항체에 액세스 가능한 에피토프에 특이적으로 결합/인식하는 항체이며, 그와 같은 에피토프는, 예를 들어, 2개의 Fab 사이의 입체 장애 또는 짧은 거리에 기인하여, 조작된 다이설파이드 결합을 표적 항체가 가질("짝을 이루는 시스테인" 형태) 때에는, 입체 구조 특이적 항체에 액세스할 수 없다(도 7). 하나의 바람직한 태양에 있어서, 조작된 시스테인은, 2개의 Fab의 각각의 CH1 영역에 위치하고, 그와 같은 에피토프는, 표적 항체가 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태를 가질 때에만 입체 구조 특이적 항체에 액세스 가능한 CH1 영역 내에 위치하고, 그와 같은 에피토프는, 2개의 Fab 사이의 입체 장애 또는 짧은 거리에 기인하여, 표적 항체가 "짝을 이루는 시스테인" 형태를 가질 때에는 입체 구조 특이적 항체는 액세스할 수 없다(도 7).
추가로 다른 태양에 있어서, 표적 항체는, 3개의 Fab 부분을 포함하는 도 8에 나타나는 Dual/LINC, 1+2로 불리는 3가 1+2 항체이고, Fab 중 2개(즉, 각각 쇄 1-쇄 5 및 쇄3-쇄 4로 구성되는 Fab B 및 Fab C)는 각각, 양쪽의 Fab를 연결하는 조작된 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는 조작된 시스테인을 포함하고, 따라서 "짝을 이루지 않는 시스테인" 혹은 "unLINC" 형태, 또는 "짝을 이루는 시스테인" 혹은 "LINC" 형태의 어느 것인가로 존재할 수 있고; 1개의 Fab(쇄 1-쇄 2로 구성되는 Fab A)는, 조작된 시스테인을 포함하지 않고, "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태로만 존재할 수 있다. 항체 조제물로부터 "짝을 이루지 않는 시스테인" 또는 "unLINC" 형태를 갖는 Dual/LINC, 1+2 포맷을 갖는 항체를 분리하기 위해서, 입체 구조 특이적 항체를, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태 또는 "짝을 이루는 시스테인" 형태의 어느 것인가로 존재할 수 있는 2개의 Fab(각각 쇄 1-쇄 5 및 쇄3-쇄 4로 구성되는 Fab B 및 Fab C)에 특유이며, 또한 조작된 시스테인을 포함하지 않는("짝을 이루는 시스테인" 형태로만 존재한다) 다른 Fab(쇄 1-쇄 2로 구성되는 Fab A)에는 존재하지 않는 에피토프에 특이적으로 결합하도록 추가로 선택했다. 하나의 바람직한 태양에 있어서, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태 또는 "짝을 이루는 시스테인" 형태의 어느 것인가로 존재할 수 있는 2개의 Fab(각각 쇄 1-쇄 5 및 쇄3-쇄 4로 구성되는 Fab B 및 Fab C)는 각각, 제 1 인간 IgG 서브클래스의 CH1 도메인(예를 들어, 인간 IgG1 CH1)을 포함하는 데 반해, 다른 Fab(쇄 1-쇄 2로 구성되는 Fab A)는, 제 1 인간 IgG 서브클래스와는 상이한 다른 IgG 서브클래스의 CH1 도메인(예를 들어, 인간 IgG4 CH1)을 포함한다. 그와 같은 바람직한 태양에 있어서, 입체 구조 특이적 항체는, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 제 1 인간 IgG 서브클래스의 CH1 도메인(예를 들어, 인간 IgG1 CH1)에만 특이적으로 결합하지만(도 8b), "짝을 이루는 시스테인" 형태에 있는 제 1 인간 IgG 서브클래스의 CH1 도메인(예를 들어, 인간 IgG1 CH1) 또는 제 1 인간 IgG 서브클래스와는 상이한 다른 IgG 서브클래스의 CH1 도메인(예를 들어, 인간 IgG4 CH1)에 결합하지 않도록(도 8c), 제작되고, 선택되었다.
실시예 3.2 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 Dual/LINC 1+2 항체의 CH1에 특이적으로 결합하는 입체 구조 특이적 항CH1 항체의 제작
항CH1 항체를, 이하와 같이 조제하고, 선택하고, 발현시켰다: 6마리의 NZW 토끼를, 조작된 인간 IgG1 Fab로 피내 면역했다. 4회의 반복 투여를 2개월의 기간에 걸쳐서 주고, 계속해서, 혈액 및 비장을 수집했다. 조작된 인간 IgG에 결합할 수 있는 B 세포를 셀 소터를 이용하여 선별하고, 그 다음에, 플레이팅하여, WO2016098356A1에 기재되는 수법에 따라 배양했다. 배양 후, B 세포 배양 상청을 추가적인 분석을 위해서 수집하고, B 세포 펠릿을 동결 보존했다. κ 경쇄를 갖는 재조합 IgG1 및 λ 경쇄를 갖는 재조합 IgG에의 결합을, B 세포 배양 상청을 이용하여 ELISA에 의해 평가했다. κ 경쇄를 갖는 재조합 IgG1 및 λ 경쇄를 갖는 재조합 IgG의 양쪽에 결합할 수 있는 B 세포가, 유전자 클로닝에 있어 바람직하고, 그리고 선택되었다.
바람직한 결합 특성을 갖는 선택된 B 세포주의 RNA를, ZR-96 Quick-RNA 키트(ZYMO RESEARCH, Cat No. R1053)를 이용하여 그 동결 보존 세포 펠릿으로부터 정제했다. 선택된 주에서의 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를, 역전사 PCR에 의해 증폭하고, 토끼 IgG 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA로 재조합했다. 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA도 또한, 역전사 PCR에 의해 증폭하고, 토끼 κ 경쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA로 재조합했다. 상기에 기재한 수법에 따라, 클로닝한 항체를 발현시키고, 배양 상청으로부터 정제했다.
실시예 3.3 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 Dual/LINC 1+2 항체의 CH1에 특이적으로 결합하는 입체 구조 특이적 항CH1 항체의 특정
입체 구조 특이적 항CH1 항체를 스크리닝하고 또한 특정하기 위해서, 이하의 5개의 항체를 스크리닝 툴로서 제작했다. 5개의 항체의 항체 포맷을 (도 9a)에 도시하고, 항체의 폴리펩티드쇄의 아미노산 서열을 (도 9b)에 나타낸다:
(1) 및 (2) IgG1_001 및 DualAE05-SG1201의 각각은, S191C 시스테인 치환을 갖지 않는 인간 IgG1 CH1을 갖는 2가 항체이다(도 9a 왼쪽 패널). 이 항체를 이용하여, (EU 넘버링의 191위에 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는) 인간 IgG1의 CH1 도메인에 특이적으로 결합하지만, (EU 넘버링의 191위에 조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는) 인간 IgG4의 CH1 도메인에 결합하지 않는, 항CH1 항체를 스크리닝 및 특정했다.
(3) DualAE05-SG1202는, S191C 시스테인 치환을 갖는 DualAE05-SG1201에 대응한다(도 9a 중앙의 패널). 그것은, S191C를 개재시켜 양쪽의 Fab를 연결하는 조작된 다이설파이드 결합을 형성할 수 있고, 따라서, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태 또는 "짝을 이루는 시스테인" 형태의 어느 것인가로 존재할 수 있는 항체에 대응한다.
(4) DualAE05-SG1202k/SG1201hV11은, Fab 암의 한쪽이 S191C 변이를 포함하고, 다른 한쪽의 Fab 암이 S191C 변이를 포함하지 않는, 인간 IgG1 CH1을 갖는 이중 특이성 항체에 대응한다(도 9a 오른쪽 패널). DualAE05-SG1202k/SG1201hV11 중쇄의 헤테로2량체화를, knob into Hole 엔지니어링에 의해 제어했다. 그것은, S191C 변이를 포함하지만, S191C를 개재시켜 양쪽의 Fab를 연결하는 조작된 다이설파이드 결합을 형성할 수 없고, 따라서, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태로만 존재할 수 있는 항체이다.
(5) IgG4_001은, S191C 시스테인 치환을 갖지 않는 인간 IgG4 CH1을 갖는 2가 항체이다(도 9a 왼쪽 패널). 이 항체를 이용하여, (조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는) 인간 IgG1의 CH1 도메인에 특이적으로 결합하지만, (조작된 다이설파이드 결합을 갖지 않는) 인간 IgG4의 CH1 도메인에 결합하지 않는, 항CH1 항체를 스크리닝 및 특정했다.
DualAE05-SG1201, DualAE05-SG1202, DualAE05-SG1202k/SG1201hV11, IgG1_001, 및 IgG4_001 항체를 Expi293(Invitrogen)에서 발현하고, 프로틴 A 정제, 계속해서 겔 여과에 의해 정제했다.
Biacore 결합 실험을 Biacore T200 기기(GE Healthcare)를 이용하여 37℃에서 실시하여, DualAE05-SG1201, DualAE05-SG1202, DualAE05-SG1202k/SG1201hV11, IgG1_001, 및 IgG4_001에 대한 실시예 3.2에서 조제한 항CH1 항체의 결합 활성을 특징지었다. 구체적으로는, 마우스 항인간 Fc(GE Healthcare)를, 아민 커플링 키트(GE Healthcare)을 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀 상에 고정화했다. 툴 항체 DualAE05-SG1201, DualAE05-SG1202, DualAE05-SG1202k/SG1201hV11, IgG1_001, 및 IgG4_001을 플로 셀 상에 포착하고, 그 다음에, 실시예 3.2로부터 얻어진 항CH1 항체를 모든 플로 셀 상에 인젝트했다. 모든 항체를, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4에 있어서 조제했다. 센서 표면을 3M MgCl2로 사이클마다 재생시켰다.
IgG1_001, DualAE05-SG1201, 및 DualAE05-SG1202k/SG1201hV11에 실질적으로 결합하지만, IgG4_001 및 DualAE05-SG1202의 각각 실질적으로 결합하지 않는 항CH1 항체가, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 인간 IgG1의 CH1 도메인에 특이적으로 결합하지만, "짝을 이루는 시스테인" 형태에 있는 인간 IgG1의 CH1 도메인 또는 인간 IgG4 CH1의 CH1 도메인에 결합하지 않는 입체 구조 특이적 항체를 얻기 위한 스크리닝 기준을 만족시킬 수 있는 것이 결정되었다. 스크리닝의 결과로서, 4개의 항체, 즉, FAB0059ff, FAB0060hh, FAB0133hh, 및 FAB0135hh가, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 Dual/LINC 1+2 항체에 특이적으로 결합하는 입체 구조 특이적 항CH1 항체로서 발견되고 또한 선택되었다(표 5). 표 4에 나타나는 바와 같이, 이들 입체 구조 특이적 항CH1 항체는, IgG1_001, DualAE05-SG1201, 및 DualAE05-SG1202k/SG1201hV11의 각각에 대해 상대적으로 강한 결합 활성(상대적 결합 활성＞0.8)을 나타내고, 또한, IgG4_001(상대적 결합 활성＜0.1) 및 DualAE05-SG1202(상대적 결합 활성＜0.5)에 대해서 결합 활성을 나타내지 않거나 또는 상대적으로 약한 결합 활성을 나타낸다.
표 4는, 툴 항체 DualAE05-SG1201, DualAE05-SG1202, DualAE05-SG1202k/SG1201hV11, IgG1_001, 및 IgG4_001의 각각에 대한 항CH1 항체의 상대적 결합 활성을 나타낸다. (IgG1_001의 RU 결합치에 대해서 정규화되는) 툴 항체에 대한 상대적 결합 활성의 값은, 툴 항체에 대한 항CH1 항체의 Biacore 결합 반응(RU)을 IgG1_001에 대한 항CH1 항체의 RU 결합치로 나누는 것에 의해 얻어진다.
[표 4]
입체 구조 특이적 항CH1 항체의 물리화학 특성을 개선하기 위해서, CDR 영역에 있는 cystin 잔기를, FAB0059ff, FAB0060hh, 및 FAB0133hh로부터 제거하고, 그 후, 각각 FAB0059Hf/FAB0059L0001, FAB0060Hh/FAB0060L0001, 및 FAB0133Hh/FAB0133L0001라고 이름 붙였다. 입체 구조 특이적 항CH1 항체의 아미노산 서열의 서열 번호를 표 5에 나타냈다.
[표 5]
실시예 3.4 항체 조제물로부터 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태를 갖는 Dual/LINC 1+2 항체를 제거하기 위한 입체 구조 특이적 항CH1 항체의 사용
실시예 3.3에 기재되는 입체 구조 특이적 항CH1 항체는, 예를 들어 세포 배양 상청으로부터 회수한, 항체 조제물로부터, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 Dual/LINC 1+2 항체를 선택적으로 포착 또는 제거하기 위한 리간드 또는 바인더로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 입체 구조 특이적 항CH1 항체는, 어피니티 정제를 이용하여 항체 조제물로부터 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 Dual/LINC 1+2 항체를 제거하기 위한 컬럼에 고정화할 수 있다.
입체 구조 특이적 항CH1 항체, FAB0133Hh/FAB0133L0001; 및 Dual/LINC 1+2 항체, DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056을, Expi293 발현계(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여, 일과성으로 트랜스펙트 및 발현시켰다. DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056의 포맷은, 도 8a에 나타나는 분자 포맷을 갖고, 또한 서열 번호: 142(쇄 1), 서열 번호: 147(쇄 2), 서열 번호: 148(쇄 3), 및 서열 번호: 157(쇄 4&5)의 아미노산 서열에 의해 나타내지는 5개의 폴리펩티드쇄를 포함한다. 세포 배양 상청을 회수하고, MabSelect SuRe 어피니티 크로마토그래피(GE Healthcare), 계속해서 Superdex200(GE Healthcare)을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여, 항체를 상청으로부터 정제했다.
어피니티 정제에서는, 정제된 FAB0133Hh/FAB0133L0001과 컨주게이트한 NHS 세파로스 수지를 XK 16/20컬럼(GE Healthcare)에 충전했다. 프로틴 A 크로마토그래피 처리 후, DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056의 항체 조제물을 XK 16/20컬럼에 아프라이 해, 컬럼 상에서의 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056의 특이적 포착/결합을 가능하게 했다. 여기에서, "짝을 이루는 시스테인" 형태에 있는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056 항체는, 컬럼에 의해 포착 또는 결합되지 않고, 주로 플로스루 획분 중에 출현한다. 그 후, 어피니티 포착된, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056을, 50mM HCl로의 처리에 의해 용출했다. 도 10은, 입체 구조 특이적 항CH1 항체 FAB0133Hh/FAB0133L0001 컬럼을 이용하는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056의 어피니티 정제로 용출된 항체의 크로마토그래피 프로파일(도 10a) 및 비환원 SDS-PAGE 분석(도 10b)을 나타낸다. 구체적으로는, 플로스루 획분은, 비환원 SDS-PAGE 분석에 있어서 보다 빨리 영동하는 1개의 우세한 단백질 밴드에 의해 나타나는 "짝을 이루는 시스테인" 또는 "LINC" 형태에 있는 DualAE05/DualAE05-FF056(플로스루: 백색 바)을 높은 순도로 포함하고(레인 1 내지 13); 세정 획분은, "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 DualAE05/DualAE05-FF056과 "짝을 이루는 시스테인" 형태에 있는 DualAE05/DualAE05-FF056의 혼합물을 포함하고(세정액: 회색 바, 레인 14 내지 19); 용출 획분은, 비환원 SDS-PAGE 분석에서 보다 느리게 영동하는 1개의 우세한 단백질 밴드에 의해 나타나는 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 DualAE05/DualAE05-FF056(산 용출액: 흑색 바)을 주로 포함한다(레인 20 내지 23).
실시예 4 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태를 갖는 Dual/LINC 1+2 항체의 정량 분석에서의 입체 구조 특이적 항CH1 항체의 사용
실시예 3에서 특정된 입체 구조 특이적 항CH1 항체, 예를 들어 FAB0133Hh/FAB0133L0001을 툴로서 이용하여, 정량 분석을 실시하고, SPR 측정 등의 당 기술 분야에 있어서 공지된 분석 방법을 이용하여 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 항체의 순도 또는 비율을 측정했다.
구체적으로는, DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110을 세포 회수물로부터 조제하고, 최초에 Pro A 컬럼으로 처리하고, 계속해서, 실시예 3.4에 기재되는 항CH1 항체 컬럼으로 어피니티 정제했다.
Pro A 컬럼으로부터 용출된 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110 시료 및 항CH1 항체 컬럼으로부터의 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110 시료 플로스루를, Biacore 8K 기기를 이용하는 Biacore 결합 분석을 위해서 수집했다. 0.9987의 R2에서의 선형 상관 관계가, SPR 결합 분석을 이용하는 것에 의해, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%로의 여러 가지의 농도 비율로 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태를 함유하는 항체 시료에 대한 FAB0133Hh/FAB0133L0001의 결합 반응 사이에서 관찰되었다(데이터를 나타내지 않음). 따라서, 항체 시료에 있어서의 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태에 있는 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110의 퍼센티지(%)양 또는 비율은, 항체 시료에 대한 FAB0133Hh/FAB0133L0001의 %결합을 측정하는 것에 의해 산출할 수 있다. 항체 시료를, 라마 항체 단편의 항인간 Fc로 코팅한 CM5 센서 칩 상에 포착했다. 1μM 농도의 FAB0133Hh/FAB0133L0001을 인젝트하고, 상호작용의 결합 반응을 측정했다. 어세이 온도를 25℃로 설정했다. 모든 항체 및 애널라이트를, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4에 있어서 조제했다.
표 6에 나타나는 바와 같이, FAB0133Hh/FAB0133L0001은, 항CH1 항체 컬럼으로부터의 DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110 플로스루 시료에 대한 저하된 결합 반응을 나타내고, 항CH1 항체 컬럼에 의한 정제 프로세스 후에 "짝을 이루지 않는 시스테인" 형태의 양의 저하(＜2%)를 나타낸다.
[표 6]
참고 실시예 1. 항체 발현 벡터의 조제 및 항체의 발현 및 정제
아미노산 치환 또는 IgG 변환을, PCR 또는 In-fusion Advantage PCR 클로닝 키트(Takara Bio Inc.) 등을 이용하여 당업자에게 일반적으로 공지된 방법에 의해 행하여, 발현 벡터를 구축했다. 얻어진 발현 벡터를, 당업자에게 일반적으로 공지된 방법에 의해 서열 결정했다. 조제한 플라스미드를 FreeStyle 293 세포(ThermoFisher Scientific) 또는 Expi293F 세포(ThermoFisher Scientific)에 일과성으로 이입하여, 항체를 발현시켰다. rProtein A Sepharose(상표) Fast Flow(GE Healthcare Japan Corp.)를 이용하여 당업자에게 일반적으로 공지된 방법에 의해, 얻어진 배양 상청으로부터 각 항체를 정제했다. 정제된 항체의 농도에 대해, 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 280nm에서 측정하고, PACE에 의해 얻어진 값으로부터 산출된 흡광 계수의 사용에 의해, 항체 농도를 산출했다(Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
참고 실시예 2. 항체의 순도를 특징짓기 위한 비환원 SDS-PAGE
4-20% Mini-PROTEAN(등록상표) TGX Stain-Free(상표) Precast Gels(Bio-Rad)를 1×Tris/글리신/SDS 러닝 버퍼(Bio-Rad)와 함께 이용하여, 비환원 SDS-PAGE를 실시했다. 모노클로날 항체 시료를 70℃에서 10분간 가열했다. 0.2마이크로그램을 로드하고, 전기영동을 200V에서 90분간 행했다. 단백질을 Chemidoc Imaging System(Bio-Rad)으로 가시화했다. 개개의 밴드의 퍼센티지를 Image Lab 소프트웨어 버전 6.0(Bio-Rad)에 의해 분석하고, 여기에서, 개개의 밴드, 예를 들어, 빠른 영동(하측의 밴드) 및 느린 영동(상측의 밴드)의 %강도는, 밴드의 강도를 이들 2개의 밴드의 합계로 나누는 것에 의해 산출했다.
참고 실시예 3
종양 세포에 대한 in vitro 세포 상해 활성의 개선에 관한, 친Dual-Fab H183L072의 친화성 성숙 배리언트의 스크리닝
1.1 친화성 성숙 배리언트의 서열
CD3 및 CD137에 결합하지만, CD3 및 CD137에 동시에는 결합하지 않는, 면역글로불린 가변(Fab) 영역(Dual-Fab)을 제공한다고 하는 개념은, WO2019111871(참조에 의해 본 명세서에 원용된다)에 개시되어 있다. WO2019111871에 개시되어 있는 친Dual-Fab H183L072(중쇄: 서열 번호: 1; 경쇄: 서열 번호: 57)의 결합 어피니티를 증가시키기 위해서, H183L072를 주형으로서 이용하여, 가변 영역에 단일의 또는 복수의 변이를 도입하는 것에 의해, 1,000개를 상회하는 Dual-Fab 배리언트를 제작했다. 항체를, Expi293(Invitrogen)에서 발현시키고, 프로틴 A 정제, 계속해서, 겔 여과가 필요한 경우에는 겔 여과에 의해 정제했다. 복수의 변이를 갖는 22개의 나타난 Dual-Fab 배리언트의 서열을, 표 7 및 표 8-1 내지 8-6에 열기하고, CD3 및 CD137에 대한 결합 어피니티 및 동태를, 참고 실시예 3의 1.2.2에 있어서, 하기에 기재되는 Biacore T200 기기(GE Healthcare)를 이용하여 25℃ 및/또는 37℃에서 평가했다(표 11-1 및 11-2).
[표 7]
[표 8-1]
[표 8-2]
[표 8-3]
[표 8-4]
[표 8-5]
[표 8-6]
1.2 친화성 성숙 배리언트의 결합 동태 정보
1.2.1 인간 CD3 및 CD137의 발현 및 정제
인간 CD3 복합체(인간 CD3eg 링커)의 γ 서브유닛 및 ε 서브유닛을 29-mer 링커에 의해 연결하고, Flag-태그를 γ 서브유닛의 C말단에 융합시켰다(서열 번호: 102, 표 9 및 10). 이 구축물을, FreeStyle293F 세포주(Thermo Fisher)를 이용하여 일과성으로 발현시켰다. 인간 CD3eg 링커를 발현하는 배양 상청을, Q HP 수지(GE healthcare)를 충전한 컬럼을 이용하여 농축하고, 그 다음에, FLAG-태그 친화성 크로마토그래피에 적용했다. 인간 CD3eg 링커를 함유하는 획분을 수집하고, 계속해서, 1×D-PBS로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼(GE healthcare)에 제공했다. 그 다음에, 인간 CD3eg 링커를 함유하는 획분을 풀링했다. C말단에 헥사히스티딘(His-태그) 및 비오틴 억셉터 펩티드(BAP)를 갖는 인간 CD137 세포외 도메인(ECD)(서열 번호: 103, 표 9 및 10)을, FreeStyle293F 세포주(Thermo Fisher)를 이용하여 일과성으로 발현시켰다. 인간 CD137 ECD를 발현하는 배양 상청을 HisTrap HP 컬럼(GE healthcare)에 적용하고, 이미다졸(Nacalai)을 함유하는 완충액으로 용출했다. 인간 CD137 ECD를 함유하는 획분을 수집하고, 계속해서, 1×D-PBS로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼(GE healthcare)에 제공했다. 그 다음에, 인간 CD137 ECD를 함유하는 획분을 풀링하고, -80℃에서 보관했다.
[표 9]
[표 10]
1.2.2 인간 CD3 및 CD137에 대한 친화성 측정
인간 CD3에 대한 Dual-Fab 항체(Dual-Ig)의 결합 친화성을, Biacore 8K 기기(GE Healthcare)를 이용하여 25℃에서 평가했다. 항인간 Fc(GE Healthcare)를, 아민 커플링 키트(GE Healthcare)을 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀 상에 고정화했다. 항체를 항Fc 센서 표면 상에 포착하고, 그 다음에, 재조합 인간 CD3 또는 CD137을 플로 셀 상에 인젝트했다. 모든 항체 및 애널라이트를, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4에 있어서 조제했다. 센서 표면은, 3M MgCl2로 사이클마다 재생시켰다. 결합 친화성은, Biacore Insight Evaluation software(GE Healthcare)를 이용하여, 데이터를 프로세싱하고, 1:1 결합 모델에 피팅시키는 것에 의해 결정했다. CD137 결합 친화성 어세이를, 어세이 온도를 37℃로 설정한 것을 제외하고, 동일한 조건에서 행했다. 재조합 인간 CD3 및 CD137에 대한 Dual-Fab 항체의 결합 친화성을 표 11-1 및 11-2에 나타낸다. 표 11-1 및 11-2에 나타내는 바와 같이, DUAL Fab 배리언트는, CD3 및 CD137에 대해, H183/L072와 비교하여 상이한 결합 동태를 나타냈다.
[표 11-1]
[표 11-2]
본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 약물로서 이용할 때에 유해 반응을 담당한다고 생각되는, 상이한 세포 상에 발현하고 있는 항원에의 종래형의 다중 특이성 항원 결합 분자의 결합에 기인하는 상이한 세포(예를 들어, 상이한 T 세포) 사이의 가교 형성을 회피하면서, 면역 반응을 조절 및/또는 활성화할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> METHOD FOR PRODUCING MULTISPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULES
<130> C1-A2007P
<150> JP 2020-062601
<151> 2020-03-31
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
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Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Asn Val
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50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
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Ala
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35 40 45
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65 70 75 80
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275 280 285
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Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
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340 345 350
Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
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Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
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Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
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Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
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Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
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Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
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Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Cys His Tyr Ile His Tyr Ala Ser Ala Ser Thr Leu Leu Pro Ala
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Ala
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Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Asn
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Val Trp Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Val Ala Gln Ile Lys Asp Tyr Tyr Asn Ala Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ala
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Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn
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<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 201
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Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Glu Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe
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<223> an artificially synthesized sequence
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<223> an artificially synthesized sequence
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<223> an artificially synthesized sequence
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<400> 206
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala
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Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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420 425 430
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<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 322
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325 330 335
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
355 360 365
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455
<210> 329
<211> 456
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 329
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Asn Val
20 25 30
Trp Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Lys Asp Tyr Tyr Asn Ala Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ala Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Tyr Val His Tyr Ala Ser Ala Ser Thr Leu Leu Pro Ala
100 105 110
Glu Gly Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
165 170 175
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu
210 215 220
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
355 360 365
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455
<210> 330
<211> 456
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 330
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Asn Val
20 25 30
Trp Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Lys Asp Tyr Tyr Asn Ala Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ala Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Tyr Val His Tyr Ala Ser Ala Ser Thr Leu Leu Pro Ala
100 105 110
Glu Gly Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr
145 150 155 160
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
165 170 175
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu
210 215 220
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
435 440 445
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
450 455
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Gly Pro Thr Pro Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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Asp Tyr Glu Met His
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 333
Ala Ile Asp Gly Pro Thr Pro Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
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Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
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<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 335
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 16
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 336
Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 337
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 338
Gly Gln Gly Thr Gln Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 339
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> an artificially synthesized sequence
<400> 339
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly
85 90 95
Thr Gln Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
225 230 235 240
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe
245 250 255
Ser Asn Val Trp Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
260 265 270
Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Tyr Tyr Asn Ala Tyr Ala Ala Tyr
275 280 285
Tyr Ala Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
290 295 300
Lys Asn Ser Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys His Tyr Val His Tyr Ala Ser Ala Ser Thr Leu
325 330 335
Leu Pro Ala Glu Gly Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
340 345 350
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
355 360 365
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
370 375 380
Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
385 390 395 400
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
405 410 415
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu
465 470 475 480
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485 490 495
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595 600 605
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
610 615 620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
625 630 635 640
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
645 650 655
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
660 665 670
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
675 680
Claims (17)
- 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물을 제조하기 위한 방법으로서, 해당 다중 특이성 항원 결합 분자가, 이하:
(a) 각각이 제 1 항원 및 제 1 항원과는 상이한 제 2 항원에 결합할 수 있지만, 양쪽 항원에 동시에는 결합하지 않는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분; 및
(b) 제 1 및 제 2 항원과는 상이한 제 3 항원, 바람직하게는 암 세포/조직 상에 발현하고 있는 항원에 결합할 수 있는, 제 3 항원 결합 부분
을 포함하고, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, 힌지 영역 내에는 없는 적어도 1개의 시스테인 잔기를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함하고, 바람직하게는, 해당 적어도 1개의 시스테인이 CH1 영역 내에 위치하고 있고; 해당 적어도 1개의 시스테인 잔기가, 바람직하게는 CH1 영역에 있어서, 제 1 항원 결합 부분과 제 2 항원 결합 부분 사이에 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있고;
해당 방법이, 해당 조제물을 환원 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 방법. - 제 1 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이,
제 1 항원 결합 부분의 CH1 영역과 제 2 항원 결합 부분의 CH1 영역 사이에 1개의 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는, CH1 영역에 있어서의 EU 넘버링에 따른 191위에 있는 1개의 시스테인 잔기
를 (변이, 치환, 또는 삽입을 개재시켜) 포함하는, 방법. - 제 2 항에 있어서,
상기 다중 특이성 항원 결합 분자 조제물(환원제와 접촉시키기 전)이, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합만 상이한 2개 이상의 구조 아이소폼을 포함하고, 또한 환원제와 접촉시키는 단계가, CH1 영역에 위치하고 있거나 또는 CH1 영역에 있어서의 191위(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기 사이에 형성되는 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 구조 아이소폼의 집단을 우선적으로 농축하거나 또는 증가시키는, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
다중 특이성 항원 결합 분자와 접촉시키는 상기 환원 시약의 pH가 약 3 내지 약 10, 바람직하게는 pH 6-8인, 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
환원제가, TCEP, 2-MEA, DTT, 시스테인, GSH, 및 Na2SO3으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 TCEP인, 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
환원제의 농도가 약 0.01mM 내지 약 100mM인, 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
다중 특이성 항원 결합 분자의 농도가 약 0.1mg/ml 내지 약 50mg/ml, 바람직하게는 약 10mg/ml인, 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
바람직하게는 투석 또는 버퍼 교환에 의해 바람직하게는 환원제를 제거하는 것에 의해, 시스테인 다이설파이드 결합의 재산화를 촉진하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분의 각각이, CD3 및 CD137에 결합할 수 있지만, CD3 및 CD137의 양쪽에 동시에는 결합하지 않는, 방법. - 제 9 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 17의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 31의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 45의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 64의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 69의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 74의 경쇄 CDR 3;
(a2) 서열 번호: 18의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 32의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 46의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a3) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a4) 서열 번호: 19의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 33의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 47의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a5) 서열 번호: 20의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 34의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 48의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a6) 서열 번호: 22의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 36의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 50의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a7) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a8) 서열 번호: 23의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 37의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 51의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a9) 서열 번호: 24의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 38의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 52의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a10) 서열 번호: 25의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 39의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 53의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a11) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 66의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 71의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 76의 경쇄 CDR 3;
(a12) 서열 번호: 26의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 40의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 54의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a13) 서열 번호: 27의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 41의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 55의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a14) 서열 번호: 28의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 42의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 56의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 63의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 68의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 73의 경쇄 CDR 3;
(a15) 서열 번호: 82의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 83의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 84의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 65의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 70의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 75의 경쇄 CDR 3;
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 방법. - 제 10 항에 있어서,
제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분이 각각, 이하의 (a1) 내지 (a17):
(a1) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a3) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a4) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a5) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a6) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a7) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a8) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a9) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a10) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a11) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a12) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a13) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a14) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(a15) 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
(a16) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 영역 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역; 및
(a17) (a1) 내지 (a15)로부터 선택되는 항체 가변 단편 중 어느 것의 결합과 경합하는 항체 가변 단편
중 어느 1개를 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 3 항원 결합 부분이, DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3에 결합할 수 있는, 방법. - 제 12 항에 있어서,
DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 서열 번호: 233의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 234의 중쇄 CDR 2, 서열 번호: 235의 중쇄 CDR 3, 서열 번호: 237의 경쇄 CDR 1, 서열 번호: 238의 경쇄 CDR 2, 및 서열 번호: 239의 경쇄 CDR 3을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 방법. - 제 13 항에 있어서,
DLL3에 결합할 수 있는 제 3 항원 결합 부분이, 서열 번호: 232의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 236의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
다중 특이성 항원 결합 분자가 Fc 도메인을 추가로 포함하는, 방법. - CH1 영역(EU 넘버링에 따른 191위)에 있어서 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자의 균일한 집단을 갖는, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물.
- 적어도 80%, 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 몰비의, CH1 영역(EU 넘버링에 따른 191위)에 있어서 적어도 1개의 다이설파이드 결합을 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자를 갖는, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자의 조제물.
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