JP2023519776A - 多重特異性抗原結合分子を製造するための方法 - Google Patents
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Abstract
複数の異なる抗原に結合することができるが、2つ以上の免疫細胞、例えばT細胞を非特異的に架橋しない、多重特異性抗原結合分子が提供される。そのような多重特異性抗体タンパク質の好ましい構造形態を製造または濃縮するための方法、およびそのような多重特異性抗体タンパク質のジスルフィド不均一性を除去するための方法が提供される。加えて、好ましい形態の多重特異性抗体タンパク質を特異的に認識する立体構造特異的抗体および該立体構造特異的抗体の使用が提供される。
Description
本発明は、少なくとも1つのジスルフィド結合を介して相互に連結することができる2つ以上の抗原結合部分を含む多重特異性抗原結合分子、およびそのような多重特異性抗原結合分子を製造するための方法に関する。より詳細には、本発明は、好ましい形態の多重特異性抗体タンパク質を増加させるかまたは濃縮するための方法、およびそのような組換え抗体タンパク質のジスルフィド不均一性を除去するための方法に関する。
抗体は、血漿中で極めて安定でありかつ副作用がほとんどないことから、医薬として注目を集めている。多数の治療用抗体のうち、一部の種類の抗体は、抗腫瘍反応を発揮するためにエフェクター細胞を必要とする。抗体依存性細胞傷害（ADCC）は、NK細胞およびマクロファージ上に存在するFc受容体への抗体のFc領域の結合を介して、エフェクター細胞が抗体結合細胞に対して呈する細胞傷害である。がんを治療するための医薬として、これまで、ADCCを誘導して抗腫瘍効果を発揮できる複数の治療用抗体が開発されている（Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078）。
エフェクター細胞としてNK細胞またはマクロファージを動員することによってADCCを誘導する抗体に加えて、エフェクター細胞としてT細胞を動員することによって細胞傷害性を取り入れるT細胞動員抗体（TR抗体）が、1980年代から知られている（非特許文献2～4）。TR抗体は、T細胞上のT細胞受容体複合体を形成するサブユニットのいずれか1つ、特にCD3ε鎖と、がん細胞上の抗原とを認識し、かつそれらに結合する二重特異性抗体である。いくつかのTR抗体が現在開発されている。カツマキソマブ（Catumaxomab）は、EpCAMに対するTR抗体であり、悪性腹水症の治療に関して欧州で承認されている。さらに、「二重特異性T細胞誘導（BiTE）」と呼ばれる種類のTR抗体が、強力な抗腫瘍活性を示すことが近年見出されている（非特許文献5および6）。ブリナツモマブ（Blinatumomab）は、CD19に対するBiTE分子であり、2014年に最初にFDAの承認を受けた。ブリナツモマブは、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および補体依存性細胞傷害（CDC）を誘導するリツキシマブ（Rituximab）と比較して、CD19/CD20陽性がん細胞に対してはるかに強い細胞傷害活性をin vitroで示すことが証明されている（非特許文献7）。
しかしながら、三機能性抗体は、がん抗原非依存的に、T細胞とNK細胞またはマクロファージなどの細胞との両方に同時に結合し、結果として、これらの細胞上に発現している受容体が架橋され、種々のサイトカインの発現が抗原非依存的に誘導されることが公知である。三機能性抗体の全身投与は、そのようなサイトカイン発現の誘導の結果として、サイトカインストーム様の副作用を引き起こすと考えられる。実際、第I相臨床試験において、非小細胞肺がんを有する患者に対するカツマキソマブの全身投与での最大耐容量が5 μg/bodyという超低用量であったこと、およびより高用量の投与が、様々な重篤な副作用を引き起こすことが報告されている（非特許文献8）。そのような低用量で投与した場合、カツマキソマブは、有効血中レベルに到達することはできない。すなわち、そのような低用量でカツマキソマブを投与することによって、期待される抗腫瘍作用を達成することはできない。
近年、FcγRに対する結合活性を低下させたFc領域を用いることで、有害反応を回避しつつ、T細胞によって媒介される細胞傷害活性を引き起こす改良型抗体が提供されている（特許文献1）。しかしながら、このような抗体であっても、その分子構造を踏まえると、がん抗原に結合しつつ2つの免疫受容体、すなわち、CD3εおよびFcγRに作用することはできない。有害反応を回避しつつ、がん抗原特異的な様式で、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、T細胞以外の細胞によって媒介される細胞傷害活性との両方を発揮する抗体は、まだ知られていない。
一方で、カツマキソマブとは異なり、二重特異性sc（Fv）2フォーマット分子（BiTE）は、Fcγ受容体結合部位を有さないことから、T細胞上ならびにNK細胞およびマクロファージなどの細胞上に発現している受容体をがん抗原非依存的に架橋しない。しかしながら、二重特異性 sc（Fv）2は、Fc領域を有さない改変された低分子量抗体分子であることから、患者への投与後のその血中半減期が、治療用抗体として通常用いられるIgG型の抗体より著しく短いという問題がある。実際、in vivoで投与された二重特異性 sc（Fv）2の血中半減期は、およそ数時間であると報告されている（非特許文献9および10）。ブリナツモマブ、すなわち、CD19およびCD3に結合するsc（Fv）2分子は、急性リンパ性白血病の治療に関して承認されている。ブリナツモマブの血清半減期は、患者中で2時間未満であることが明らかになっている（非特許文献11）。ブリナツモマブの臨床試験では、ブリナツモマブは、ミニポンプを用いる持続点滴静注によって投与された。この投与方法は、患者にとって極めて不便であるだけでなく、デバイスの誤作動などによる医療事故の危険性の可能性もまた有する。したがって、そのような投与方法は望ましいものであるとは言えない。
T細胞は、腫瘍免疫において重要な役割を果たし、１）主要組織適合複合体（MHC）クラスI分子によって提示される抗原ペプチドに対するT細胞受容体（TCR）の結合およびTCRの活性化；ならびに２）抗原提示細胞上のリガンドに対するT細胞の表面上の共刺激分子の結合および共刺激分子の活性化、の2つのシグナルによって活性化されることが知られている。さらに、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーおよびTNF受容体スーパーファミリーに属する分子、例えばT細胞の表面上のCD137（4-1BB）の活性化は、T細胞活性化に重要であると説明されている（非特許文献12）。これに関連して、CD137アゴニスト抗体は、抗腫瘍効果を示すことが既に実証されており、これは、主にCD8陽性T細胞およびNK細胞の活性化により、実験的に示されている（非特許文献13）。細胞外ドメインとしての腫瘍抗原結合ドメイン、ならびに細胞内ドメインとしてのCD3およびCD137シグナル伝達ドメインからなるキメラ抗原受容体分子を有するように操作されたT細胞（CAR-T細胞）は、効力の持続性を増強することができる（Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733（非特許文献14））。しかし、そのようなCD137アゴニスト抗体のその非特異的肝毒性による副作用は、臨床上および非臨床上問題であり、薬剤の開発は前進していない（Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22（非特許文献15））。副作用の主な原因は、抗体定常領域を介したFcγ受容体に対する抗体の結合が関与していることが示唆されている（Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22（非特許文献16））。さらに、TNF受容体スーパーファミリーに属する受容体を標的とするアゴニスト抗体がin vivoでアゴニスト活性を発揮するためには、Fcγ受容体発現細胞（FcγRII発現細胞）による抗体架橋が必要であることが報告されている（Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6（非特許文献17））。WO2015/156268（特許文献2）は、CD137アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する二重特異性抗体が、腫瘍特異的抗原を発現する細胞の存在下でのみ、CD137アゴニスト活性を発揮し、かつ免疫細胞を活性化することができることを記載している。
腫瘍特異的抗原（EGFR）結合ドメイン、CD137結合ドメイン、およびCD3結合ドメインを含む三重特異性抗体は、既に報告されている（WO2014116846）。しかしながら、そのような分子フォーマットを有する抗体は、3種類の異なる抗原に同時に結合できることから、それらの三重特異性抗体は、CD3およびCD137に同時に結合することによって、CD3ε発現T細胞とCD137発現細胞（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞、DCなど）との間に架橋形成をもたらし得ることが推測された。この脈絡において、有害反応を回避しつつ、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、CD137を介するT細胞および他の免疫細胞の活性化活性との両方をがん抗原特異的に発揮する抗体は、まだ知られていない。
複数のジスルフィド結合を有する抗体では、抗体調製物間の構造不均一性が観察されているが、この不均一性の背景にある理由は依然解明されていない。例えば、米国特許出願公開第2005/0161399号、Dillon et al.は、抗体を含む高分子量タンパク質を分析する逆相LC/MS法について論じている。加えて、米国特許出願公開第2006/194280号、Dillon et al.は、組換えIgGタンパク質の調製物を還元/酸化カップリング試薬および任意でカオトロピック剤に供することによって、特定のIgGアイソフォームを一過性に濃縮する方法に関する。
Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
Nature. 1985 Apr 18-24;314(6012):628-31.
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Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22
Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22
Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6
有害反応を回避しつつ、免疫細胞（例えば、T細胞)によって媒介される細胞傷害活性と、共刺激分子（例えば、CD137)を介するT細胞および/または他の免疫細胞の活性化活性との両方を標的抗原特異的に発揮する抗体は、まだ知られていない。本発明の目的は、副作用を低下または最小化させつつ、免疫細胞（例えば、T細胞)によって媒介される効果的な標的特異的細胞殺傷効果を呈する抗原結合分子を提供することである。
本発明の別の目的は、多重特異性抗原結合分子を製造するための方法、好ましい形態の多重特異性抗体タンパク質を増加させるかまたは濃縮するための方法、およびそのような組換え抗体タンパク質のジスルフィド不均一性を除去するための方法を提供することである。
複数の異なる抗原（例えば、T細胞上のCD3、および/またはT細胞、NK細胞、DC細胞上のCD137等）に結合することができるが、2つ以上の免疫細胞、例えばT細胞を非特異的に架橋しない抗原結合分子が提供される。そのような多重特異性抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子を薬物として用いる際に有害反応を担うと考えられる、異なる細胞上に発現している抗原への従来型の多重特異性抗原結合分子の結合に起因する異なる細胞（例えば、異なるT細胞）間の架橋形成を回避しつつ、免疫反応を調節および/または活性化することができる。
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子の有効性を改善または増強する、非常に独特な構造形式を有する新たな抗原結合分子を提供する。独特な構造形式を有する新たな抗原結合分子は、増加した数の抗原結合ドメインを提供し、望ましくない有害作用の低下を伴って、エフェクター細胞および標的細胞上の各々の抗原に対する増加した結合価および/または特異性をもたらす。
さらなる局面において、本発明のそのような新たな独特な構造形式を有する抗原結合分子の1つは、（例えば、Fc、ジスルフィド結合、またはリンカー等を介して）相互に連結され、各々がエフェクター細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞等の免疫細胞）上の第1のおよび/または第2の抗原に結合する、少なくとも2つの第1のおよび第2の抗原結合部分（例えば、Fabドメイン）を含み、かつ、第1のまたは第2の抗原結合部分のいずれか一方に連結され、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の第3の抗原に結合する、第3の（および任意で第4の）抗原結合ドメインをさらに含む。
さらなる局面において、本発明のそのような新たな独特な構造形式を有する抗原結合分子の1つは、（例えば、Fc、ジスルフィド結合、またはリンカー等を介して）相互に連結され、各々がエフェクター細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞等の免疫細胞）上の第1のおよび/または第2の抗原に結合する、少なくとも第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分（例えば、Fabドメイン）を含み、かつ、第1のまたは第2の抗原結合部分のいずれか一方に連結され、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の第3の抗原に結合する、第3の（および任意で第4の）抗原結合部分をさらに含み、ここで、第1の抗原および/または第2の抗原に結合できる第1のおよび第2の抗原結合部分（例えば、Fabドメイン）はそれぞれ、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間にジスルフィド結合を作出し、それらを相互に近くに維持し、かつ、例えば、2つのDual-Fab間の立体障害または短い距離の結果として同じ単一のエフェクター細胞へのシス抗原結合を促進し、それによって、2つのDual-FabによってDLL3非依存的に媒介される2つのCD3/CD137発現免疫細胞の望ましくない架橋形成を妨げることにより三重特異性抗体（三重特異性Ab）の安全性プロファイルを改善する、少なくとも1つのアミノ酸変異を含む。1つの特定の局面において、該第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、Fabであり、かつCH1領域中に（変異、置換、または挿入を介して）少なくとも1つのシステイン残基を含み、該少なくとも1つのシステイン残基は、第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成することができる。別の特定の局面において、該第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成することができる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含む。
そのような独特な構造形式を有する抗原結合分子は驚くべきことに、異なる細胞（例えば、T細胞などのエフェクター細胞）の間での望ましくない架橋形成に起因するオフターゲット副作用の低減または最小化を示しつつ、他の多重特異性抗体フォーマット（例えば、BiTE）と比較して優れた有効性を示すことが見出された。1つの局面において、本発明は、各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない（すなわち、CD3およびCD137に結合できるが同時ではない）、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびにDLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、第3の抗原結合部分を含み、他の多重特異性抗原結合分子が有し得る有害な毒性の懸念または副作用を回避しつつ、より効率的にT細胞依存性細胞傷害を誘導する、多重特異性抗原結合分子に関する。本発明は、有効成分として抗原結合分子を含むことによって、種々のがん、特に、DLL3陽性腫瘍などのDLL3に関連するがんを治療することができる多重特異性抗原結合分子および医薬組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、（例えば、CH1領域中に）第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に1つまたは複数のジスルフィド結合を含む新規フォーマットの多重特異性抗原結合分子を製造する方法；該少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗体タンパク質の好ましい形態を増加させるかまたは濃縮するための方法、および（例えば、CH1領域中の）該少なくとも1つのジスルフィド結合を効率的かつ適切に形成させる条件下で抗体調製物を還元剤と接触させることによって、そのような組換え抗体タンパク質のジスルフィド不均一性を除去するための方法に関する。さらなる局面において、本発明は、多重特異性抗体タンパク質の好ましい形態を特異的に認識する立体構造特異的抗体、および抗体含有試料の精製、分析、または定量化における立体構造特異的抗体の使用に関する。
1つの特定の局面において、本開示は以下を提供する：
[1] 各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子。
[1A] 各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、第3の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子。
[2] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および 配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および 配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および 配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[1]～[1A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[3] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[1]または[2]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[4] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、Fab分子であり、かつ第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を含み、好ましくは、該少なくとも1つのジスルフィド結合が、ヒンジ領域内にはないアミノ酸残基（システイン）間に、好ましくは各抗原結合部分のCH1領域内のアミノ酸残基（システイン）間に形成される、[1]～[3]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[4A] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、Fab分子であり、かつ第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基（システイン）間に形成される1つのジスルフィド結合を含む、[4]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[5] 第3の抗原結合部分が、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方に融合されている、[1]～[4A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[5A] 第3の抗原結合部分がFabまたはscFvである、[5]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[6] 第1の、第2の、および第3の抗原結合部分のそれぞれがFab分子であり、第3の抗原結合部分が、Fab重鎖（CH1）のC末端で、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、[5]～[5A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[6A]前記ペプチドリンカーが、配列番号：248、配列番号：249、または配列番号：259のアミノ酸配列からなる群より選択される、[5]～[6]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[6B] 第1の抗原結合部分が第2の抗原結合部分と同一である、[1]～[6A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[7] 第3の抗原結合部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれが従来型のFab分子である、[1]～[6B]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[8] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および/または124位にあるアミノ酸が独立して、リジン（K）、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）によって置換され（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位にあるアミノ酸および/または213位にあるアミノ酸が独立して、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって置換されている（EUナンバリングによるナンバリング）、[7]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[9]第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および124位にあるアミノ酸がそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であり（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において147位および213位にあるアミノ酸が、グルタミン酸（E）である（EUナンバリングによるナンバリング）、[8] に記載の多重特異性抗原結合分子。
[10] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、以下の（a1）～（a5）：
（a1） 配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および 配列番号：239の軽鎖CDR 3；
（a2） 配列番号：276の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：277の重鎖CDR 2、配列番号：278の重鎖CDR 3、配列番号：279の軽鎖CDR 1、配列番号：280の軽鎖CDR 2、および 配列番号：281の軽鎖CDR 3；
（a3） 配列番号：285の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：286の重鎖CDR 2、配列番号：287の重鎖CDR 3、配列番号：288の軽鎖CDR 1、配列番号：289の軽鎖CDR 2、および 配列番号：290の軽鎖CDR 3；
（a4）（a1）～（a3）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a5）（a1）～（a3）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[1]～[9]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[11] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、以下の（a1）～（a6）：
（a1）配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：264のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：265のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：266のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：267のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：268のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：269のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）（a1）～（a4）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a6）（a1）～（a4）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[1]～[10]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12] Fcドメインをさらに含む、[1]～[11]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12A] Fcドメインが、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつFcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、[12]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[12C] Fcドメインが、天然型IgGのFc領域のものと比較して、酸性pH条件（例えば、pH 5.8）下で増強されたFcRn結合活性を示す、[12]～[12A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12D] Fcドメインが、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にGlu、Arg、Ser、またはLys；および440位にGlu、Asp、またはGlnを含む、[12C]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[12E] Fcドメインが、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にArgまたはLys；および440位にGluまたはAspを含む、[12D]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[12F] Fcドメインが、EUナンバリングによる、428位にIleもしくはLeu；および/または436位にIle、Leu、Val、Thr、もしくはPheをさらに含む、[12E]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[12G] Fcドメインが、EUナンバリングによる、以下：
（a）N434A/Q438R/S440E；
（b）N434A/Q438R/S440D；
（c）N434A/Q438K/S440E；
（d）N434A/Q438K/S440D；
（e）N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（f）N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（g）N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（h）N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（i）N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（j）N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（k）N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（l）N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（m）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；
（n）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；
（o）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；
（p）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；
（q）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；
（r）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；
（s）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；
（t）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；
（u）M428L/N434A/Q438R/S440E；
（v）M428L/N434A/Q438R/S440D；
（w）M428L/N434A/Q438K/S440E；
（x）M428L/N434A/Q438K/S440D；
（y）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（z）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（aa）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（ab）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（ac）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（ad）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（ae）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（af）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（ag）L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；および
（ah）L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、[12C]～[12F]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12H] Fcドメインが、M428L/N434A/Q438R/S440Eのアミノ酸置換の組み合わせを含む、[12C]～[12G]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12I] Fcドメインが、IgG Fcドメイン、好ましくはヒトIgG Fcドメイン、より好ましくはヒトIgG1 Fcドメインである、[12]～[12H]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12J] Fcドメインが、以下：
（a）配列番号：100に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニット、および配列番号：111に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット；または
（b）配列番号：99に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニット、および配列番号：109に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット
のいずれかを含む、[12]～[12I]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12K] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれがFabであり、第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端でFcドメインの第1のまたは第2のサブユニットのN末端に融合され、かつ第2の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端でFcドメインの残りのサブユニットのN末端に融合されている、[12]～[12J]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12L] 第3の抗原結合部分が、C末端で、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、[12K]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[13]以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；および
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、
好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している、[1]～[12L]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[1] 各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子。
[1A] 各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、第3の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子。
[2] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および 配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および 配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および 配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[1]～[1A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[3] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[1]または[2]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[4] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、Fab分子であり、かつ第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を含み、好ましくは、該少なくとも1つのジスルフィド結合が、ヒンジ領域内にはないアミノ酸残基（システイン）間に、好ましくは各抗原結合部分のCH1領域内のアミノ酸残基（システイン）間に形成される、[1]～[3]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[4A] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、Fab分子であり、かつ第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基（システイン）間に形成される1つのジスルフィド結合を含む、[4]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[5] 第3の抗原結合部分が、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方に融合されている、[1]～[4A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[5A] 第3の抗原結合部分がFabまたはscFvである、[5]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[6] 第1の、第2の、および第3の抗原結合部分のそれぞれがFab分子であり、第3の抗原結合部分が、Fab重鎖（CH1）のC末端で、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、[5]～[5A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[6A]前記ペプチドリンカーが、配列番号：248、配列番号：249、または配列番号：259のアミノ酸配列からなる群より選択される、[5]～[6]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[6B] 第1の抗原結合部分が第2の抗原結合部分と同一である、[1]～[6A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[7] 第3の抗原結合部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれが従来型のFab分子である、[1]～[6B]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[8] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および/または124位にあるアミノ酸が独立して、リジン（K）、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）によって置換され（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位にあるアミノ酸および/または213位にあるアミノ酸が独立して、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって置換されている（EUナンバリングによるナンバリング）、[7]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[9]第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および124位にあるアミノ酸がそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であり（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において147位および213位にあるアミノ酸が、グルタミン酸（E）である（EUナンバリングによるナンバリング）、[8] に記載の多重特異性抗原結合分子。
[10] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、以下の（a1）～（a5）：
（a1） 配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および 配列番号：239の軽鎖CDR 3；
（a2） 配列番号：276の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：277の重鎖CDR 2、配列番号：278の重鎖CDR 3、配列番号：279の軽鎖CDR 1、配列番号：280の軽鎖CDR 2、および 配列番号：281の軽鎖CDR 3；
（a3） 配列番号：285の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：286の重鎖CDR 2、配列番号：287の重鎖CDR 3、配列番号：288の軽鎖CDR 1、配列番号：289の軽鎖CDR 2、および 配列番号：290の軽鎖CDR 3；
（a4）（a1）～（a3）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a5）（a1）～（a3）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[1]～[9]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[11] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、以下の（a1）～（a6）：
（a1）配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：264のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：265のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：266のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：267のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：268のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：269のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）（a1）～（a4）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a6）（a1）～（a4）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[1]～[10]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12] Fcドメインをさらに含む、[1]～[11]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12A] Fcドメインが、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつFcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、[12]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[12C] Fcドメインが、天然型IgGのFc領域のものと比較して、酸性pH条件（例えば、pH 5.8）下で増強されたFcRn結合活性を示す、[12]～[12A]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12D] Fcドメインが、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にGlu、Arg、Ser、またはLys；および440位にGlu、Asp、またはGlnを含む、[12C]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[12E] Fcドメインが、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にArgまたはLys；および440位にGluまたはAspを含む、[12D]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[12F] Fcドメインが、EUナンバリングによる、428位にIleもしくはLeu；および/または436位にIle、Leu、Val、Thr、もしくはPheをさらに含む、[12E]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[12G] Fcドメインが、EUナンバリングによる、以下：
（a）N434A/Q438R/S440E；
（b）N434A/Q438R/S440D；
（c）N434A/Q438K/S440E；
（d）N434A/Q438K/S440D；
（e）N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（f）N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（g）N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（h）N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（i）N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（j）N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（k）N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（l）N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（m）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；
（n）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；
（o）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；
（p）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；
（q）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；
（r）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；
（s）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；
（t）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；
（u）M428L/N434A/Q438R/S440E；
（v）M428L/N434A/Q438R/S440D；
（w）M428L/N434A/Q438K/S440E；
（x）M428L/N434A/Q438K/S440D；
（y）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（z）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（aa）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（ab）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（ac）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（ad）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（ae）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（af）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（ag）L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；および
（ah）L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、[12C]～[12F]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12H] Fcドメインが、M428L/N434A/Q438R/S440Eのアミノ酸置換の組み合わせを含む、[12C]～[12G]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12I] Fcドメインが、IgG Fcドメイン、好ましくはヒトIgG Fcドメイン、より好ましくはヒトIgG1 Fcドメインである、[12]～[12H]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12J] Fcドメインが、以下：
（a）配列番号：100に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニット、および配列番号：111に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット；または
（b）配列番号：99に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニット、および配列番号：109に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット
のいずれかを含む、[12]～[12I]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12K] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれがFabであり、第1の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端でFcドメインの第1のまたは第2のサブユニットのN末端に融合され、かつ第2の抗原結合部分が、Fab重鎖のC末端でFcドメインの残りのサブユニットのN末端に融合されている、[12]～[12J]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
[12L] 第3の抗原結合部分が、C末端で、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、[12K]に記載の多重特異性抗原結合分子。
[13]以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；および
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、
好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1～鎖5）が、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している、[1]～[12L]のいずれか1つに記載の多重特異性抗原結合分子。
本発明の別の局面は、以下に関する：
[1]（i）（哺乳動物細胞によって組換え産生されている）多重特異性抗原結合分子の調製物を製造する、（ii）望ましい立体構造を有する多重特異性抗原結合分子を精製する、または（iii）多重特異性抗原結合分子の調製物の均一性を改善するための方法であって、
多重特異性抗原結合分子が、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含み、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、Fabであり、かつ第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合せず；
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み；好ましくは、該少なくとも1つのシステイン残基がCH1領域中に位置し；該少なくとも1つのシステイン残基が、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき；
調製物を還元試薬と接触させる段階を含む；
前記方法。
[2] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、
第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成できる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基
を（変異、置換、または挿入を介して）含む、[1] に記載の方法。
[3]前記調製物を還元試薬と接触させる段階が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合の形成を可能にするおよび/または促進する、[1]または[2] に記載の方法。
[4]前記多重特異性抗原結合分子調製物（還元剤と接触させる前）が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合だけ異なる2つ以上の構造アイソフォームを含み、かつ還元剤と接触させる段階が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する構造アイソフォームの集団を優先的に濃縮するかまたは増加させる、[3] に記載の方法。
[5] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3から約10である、[1]～[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約6、7または8である、[5] に記載の方法。
[7] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約7である、[6] に記載の方法。
[8] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3である、[5] に記載の方法。
[9] 還元剤が、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、およびNa2SO3からなる群より選択される、[1]～[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10] 還元剤がTCEP、好ましくは0.25 mM TCEPである、[9] に記載の方法。
[11] 還元剤の濃度が約0.01 mMから約100 mMである、[1]～[9]のいずれか1つに記載の方法。
[12] 還元剤の濃度が、約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mM、好ましくは約0.25 mMである、[11] に記載の方法。
[13] 接触させる段階が、少なくとも30分間にわたって実施される、[1]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[14] 接触させる段階が、約10分間から約48時間にわたって実施される、[1]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[15]接触させる段階が、約2時間または約18時間にわたって実施される、[1]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[16] 接触させる段階が、約4℃から37℃の温度で、好ましくは23℃から25℃で実施される、[1]～[15]のいずれか1つに記載の方法。
[17] 前記多重特異性抗原結合分子が、前記還元剤と接触させる段階の前に少なくとも部分的に精製される、[1]～[16]のいずれか1つに記載の方法。
[18] 前記多重特異性抗原結合分子が、前記接触させる段階の前にアフィニティクロマトグラフィー（好ましくはプロテインAクロマトグラフィー）によって部分的に精製される、[17] に記載の方法。
[19] 多重特異性抗原結合分子の濃度が、約0.1 mg/mlから約50 mg/mlまたはそれを上回る、[1]～[18]のいずれか1つに記載の方法。
[20] 多重特異性抗原結合分子の濃度が約10 mg/mlまたは約20 mg/mlである、[19] に記載の方法。
[21] 好ましくは透析またはバッファー交換によって好ましくは還元剤を除去することによって、システインジスルフィド結合の再酸化を促進する段階をさらに含む、[1]～[20]のいずれか1つに記載の方法。
[22] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々が、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137の両方に同時には結合しない、[1]～[21]のいずれか1つに記載の方法。
[23] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および 配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および 配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および 配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[22] に記載の方法。
[24] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域.
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[23] に記載の方法。
[25] 多重特異性抗原結合分子が、第1のおよび第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分をさらに含む、[1]～[24]のいずれか1つに記載の方法。
[26] 第3の抗原結合部分が、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方に融合されている、[25] に記載の多重特異性抗原結合分子。
[27] 第3の抗原結合部分がFabまたはscFvである、[25]～[26]のいずれか1つに記載の方法。
[28]第1の、第2の、および第3の抗原結合部分のそれぞれがFab分子であり、第3の抗原結合部分が、Fab重鎖（CH1）のC末端で、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、[25]～[27]のいずれか1つに記載の方法。
[29] 前記ペプチドリンカーが、配列番号：248、配列番号：249、または配列番号：259のアミノ酸配列からなる群より選択される、[28] に記載の方法。
[30] 第1の抗原結合部分が第2の抗原結合部分と同一である、[1]～[29]のいずれか1つに記載の方法。
[30A] 第3の抗原結合部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれが従来型のFab分子である、[25]～[30]のいずれか1つに記載の方法。
[30B] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および/または124位にあるアミノ酸が独立して、リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）によって置換され（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位にあるアミノ酸および/または213位にあるアミノ酸が独立して、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって置換されている（EUナンバリングによるナンバリング）、[25]～[30A]のいずれか1つに記載の方法。
[30C] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および124位にあるアミノ酸がそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であり（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位にあるアミノ酸がグルタミン酸（E）である（EUナンバリングによるナンバリング）、[30B] に記載の方法。
[31] 第3の抗原結合部分が、DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、[1]～[30]のいずれか1つに記載の方法。
[32] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および 配列番号：239の軽鎖CDR 3を含む抗体可変領域を含む、[31] に記載の方法。
[33] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体可変領域を含む、[32]に記載の方法。
[34] 多重特異性抗原結合分子がFcドメインをさらに含む、[1]～[33]のいずれか1つに記載の方法。
[35] Fcドメインが、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつFcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、[34] に記載の方法。
[36] 多重特異性抗原結合分子が、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、かつ好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）が、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している、[1]～[35]のいずれか1つに記載の方法。
[37] 第4のポリペプチド（鎖4）および第5のポリペプチド（鎖5）が同一である、[1]～[36]のいずれか1つに記載の方法。
[38] CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子の均一な集団を有する、[1]～[37]のいずれか1つに記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
[39] 少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、好ましくは少なくとも95％のモル比の、CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子を有する、[1]～[37]のいずれか1つに記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
[1]（i）（哺乳動物細胞によって組換え産生されている）多重特異性抗原結合分子の調製物を製造する、（ii）望ましい立体構造を有する多重特異性抗原結合分子を精製する、または（iii）多重特異性抗原結合分子の調製物の均一性を改善するための方法であって、
多重特異性抗原結合分子が、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含み、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、Fabであり、かつ第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合せず；
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み；好ましくは、該少なくとも1つのシステイン残基がCH1領域中に位置し；該少なくとも1つのシステイン残基が、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき；
調製物を還元試薬と接触させる段階を含む；
前記方法。
[2] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、
第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成できる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基
を（変異、置換、または挿入を介して）含む、[1] に記載の方法。
[3]前記調製物を還元試薬と接触させる段階が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合の形成を可能にするおよび/または促進する、[1]または[2] に記載の方法。
[4]前記多重特異性抗原結合分子調製物（還元剤と接触させる前）が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合だけ異なる2つ以上の構造アイソフォームを含み、かつ還元剤と接触させる段階が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する構造アイソフォームの集団を優先的に濃縮するかまたは増加させる、[3] に記載の方法。
[5] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3から約10である、[1]～[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約6、7または8である、[5] に記載の方法。
[7] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約7である、[6] に記載の方法。
[8] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3である、[5] に記載の方法。
[9] 還元剤が、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、およびNa2SO3からなる群より選択される、[1]～[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10] 還元剤がTCEP、好ましくは0.25 mM TCEPである、[9] に記載の方法。
[11] 還元剤の濃度が約0.01 mMから約100 mMである、[1]～[9]のいずれか1つに記載の方法。
[12] 還元剤の濃度が、約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mM、好ましくは約0.25 mMである、[11] に記載の方法。
[13] 接触させる段階が、少なくとも30分間にわたって実施される、[1]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[14] 接触させる段階が、約10分間から約48時間にわたって実施される、[1]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[15]接触させる段階が、約2時間または約18時間にわたって実施される、[1]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[16] 接触させる段階が、約4℃から37℃の温度で、好ましくは23℃から25℃で実施される、[1]～[15]のいずれか1つに記載の方法。
[17] 前記多重特異性抗原結合分子が、前記還元剤と接触させる段階の前に少なくとも部分的に精製される、[1]～[16]のいずれか1つに記載の方法。
[18] 前記多重特異性抗原結合分子が、前記接触させる段階の前にアフィニティクロマトグラフィー（好ましくはプロテインAクロマトグラフィー）によって部分的に精製される、[17] に記載の方法。
[19] 多重特異性抗原結合分子の濃度が、約0.1 mg/mlから約50 mg/mlまたはそれを上回る、[1]～[18]のいずれか1つに記載の方法。
[20] 多重特異性抗原結合分子の濃度が約10 mg/mlまたは約20 mg/mlである、[19] に記載の方法。
[21] 好ましくは透析またはバッファー交換によって好ましくは還元剤を除去することによって、システインジスルフィド結合の再酸化を促進する段階をさらに含む、[1]～[20]のいずれか1つに記載の方法。
[22] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々が、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137の両方に同時には結合しない、[1]～[21]のいずれか1つに記載の方法。
[23] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および 配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および 配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および 配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および 配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および 配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[22] に記載の方法。
[24] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域.
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[23] に記載の方法。
[25] 多重特異性抗原結合分子が、第1のおよび第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分をさらに含む、[1]～[24]のいずれか1つに記載の方法。
[26] 第3の抗原結合部分が、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方に融合されている、[25] に記載の多重特異性抗原結合分子。
[27] 第3の抗原結合部分がFabまたはscFvである、[25]～[26]のいずれか1つに記載の方法。
[28]第1の、第2の、および第3の抗原結合部分のそれぞれがFab分子であり、第3の抗原結合部分が、Fab重鎖（CH1）のC末端で、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている、[25]～[27]のいずれか1つに記載の方法。
[29] 前記ペプチドリンカーが、配列番号：248、配列番号：249、または配列番号：259のアミノ酸配列からなる群より選択される、[28] に記載の方法。
[30] 第1の抗原結合部分が第2の抗原結合部分と同一である、[1]～[29]のいずれか1つに記載の方法。
[30A] 第3の抗原結合部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子であり、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれが従来型のFab分子である、[25]～[30]のいずれか1つに記載の方法。
[30B] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および/または124位にあるアミノ酸が独立して、リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）によって置換され（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位にあるアミノ酸および/または213位にあるアミノ酸が独立して、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって置換されている（EUナンバリングによるナンバリング）、[25]～[30A]のいずれか1つに記載の方法。
[30C] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および124位にあるアミノ酸がそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であり（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位にあるアミノ酸がグルタミン酸（E）である（EUナンバリングによるナンバリング）、[30B] に記載の方法。
[31] 第3の抗原結合部分が、DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、[1]～[30]のいずれか1つに記載の方法。
[32] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および 配列番号：239の軽鎖CDR 3を含む抗体可変領域を含む、[31] に記載の方法。
[33] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体可変領域を含む、[32]に記載の方法。
[34] 多重特異性抗原結合分子がFcドメインをさらに含む、[1]～[33]のいずれか1つに記載の方法。
[35] Fcドメインが、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつFcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、[34] に記載の方法。
[36] 多重特異性抗原結合分子が、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、かつ好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）が、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している、[1]～[35]のいずれか1つに記載の方法。
[37] 第4のポリペプチド（鎖4）および第5のポリペプチド（鎖5）が同一である、[1]～[36]のいずれか1つに記載の方法。
[38] CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子の均一な集団を有する、[1]～[37]のいずれか1つに記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
[39] 少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、好ましくは少なくとも95％のモル比の、CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子を有する、[1]～[37]のいずれか1つに記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
本発明のさらに別の局面は、以下に関する：
[1] 多重特異性抗原結合分子を製造するための方法であって、該多重特異性抗原結合分子が以下：
それぞれがFabであり、かつ第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
第1のおよび第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む第3の抗原結合部分
を含み、該方法が、
（a）以下をコードする1つまたは複数の核酸を提供する段階：
i.（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVHまたはVL、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含む、第1のポリペプチド；
ii.（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第2のポリペプチド；
iii.（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVHまたはVL、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含む、第3のポリペプチド；
iv.（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第4のポリペプチド；ならびに
v.（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第5のポリペプチド；
（b）（a）で製造した1つまたは複数の核酸を宿主細胞に導入する段階；
（c）（i）～（v）におけるポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養する段階；ならびに
（d）段階（c）で培養した細胞の培養液から（i）～（v）における5つのポリペプチドを含む多重特異性抗原結合分子を収集する段階
を含み；かつ
任意で、（iv）～（v）におけるポリペプチドが同一であり；かつ
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み、好ましくは、該少なくとも1つのシステインがCH1領域内に位置しており；該少なくとも1つのシステイン残基が、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に、少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき；
該方法が、調製物を還元試薬と接触させる段階を含む、前記方法。
[2] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、
第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成できる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基
を（変異、置換、または挿入を介して）含む、[1] に記載の方法。
[3] CH1領域（EUナンバリングによる191位）におけるシステインに1つまたは複数のジスルフィド結合を形成させる還元条件下で、段階（d）から収集した多重特異性抗原結合分子（多重特異性抗原結合分子）調製物を還元試薬と接触させる段階（e）をさらに含む、[1]～[2]のいずれか1つに記載の方法。
[4] （還元剤と接触させる前の）段階（d）から収集した前記多重特異性抗原結合分子調製物が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合だけ異なっている2つ以上の構造アイソフォームを含み、かつ還元剤と接触させる段階（e）が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子構造アイソフォームの集団を優先的に濃縮するかまたは増加させる、[3] に記載の方法。
[5] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3から約10である、[3]～[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約6、7または8である、[5] に記載の方法。
[7] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約7である、[6] に記載の方法。
[8]多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3である、[5] に記載の方法。
[9] 還元剤が、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、およびNa2SO3からなる群より選択される、[3]～[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10] 還元剤がTCEP、好ましくは0.25 mM TCEPである、[9] に記載の方法。
[11] 還元剤の濃度が約0.01 mMから約100 mMである、[3]～[9]のいずれか1つに記載の方法。
[12] 還元剤の濃度が、約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mM、好ましくは約0.25 mMである、[11] に記載の方法。
[13]接触させる段階が、少なくとも30分間にわたって実施される、[3]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[14]接触させる段階が、約10分間から約48時間にわたって実施される、[3]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[15] 接触させる段階が、約2時間または約18時間にわたって実施される、[3]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[16] 接触させる段階が、約4℃から37℃の温度で、好ましくは23℃から25℃で実施される、[3]～[15]のいずれか1つに記載の方法。
[17]前記多重特異性抗原結合分子が、前記還元剤と接触させる段階の前に少なくとも部分的に精製される、[3]～[16]のいずれか1つに記載の方法。
[18] 前記多重特異性抗原結合分子が、前記接触させる段階の前にアフィニティクロマトグラフィー（好ましくはプロテインAクロマトグラフィー）によって部分的に精製される、[17] に記載の方法。
[19] 多重特異性抗原結合分子の濃度が、約0.1 mg/mlから約50 mg/mlまたはそれを上回る、[3]～[18]のいずれか1つに記載の方法。
[20] 多重特異性抗原結合分子の濃度が約10 mg/mlまたは約20 mg/mlである、[19] に記載の方法。
[21] 好ましくは透析またはバッファー交換によって好ましくは還元剤を除去することによって、システインジスルフィド結合の再酸化を促進する段階をさらに含む、[3]～[20]のいずれか1つに記載の方法。
[22] CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子の均一な集団を有する、[3]～[21]のいずれか1つに記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
[23]少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、好ましくは少なくとも95％のモル比の、CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子を有する、[3]～[21]のいずれか1つに記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
[24] 第3の抗原結合部分が従来型のFabであり、かつ
（a）第1のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（b）第2のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
（c）第3のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および 任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（d）第4のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）含み；かつ
（e）第5のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む、
[1]～[21]のいずれか1つに記載の方法。
[25] 第3の抗原結合部分が、（Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されている）VH/VLクロスオーバーFabであり、かつ
（a）第1のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVL、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および 任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（b）第2のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVH、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
（c）第3のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および 任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（d）第4のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；かつ
（e）第5のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む、
[1]～[21]のいずれか1つに記載の方法。
[26] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれのCLにおいて、123位および124位にあるアミノ酸がそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であり（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位にあるアミノ酸がグルタミン酸（E）である（EUナンバリングによるナンバリング）、[25] に記載の方法。
[26-2] 段階（a）（i）において、第1のポリペプチドが、第3の抗原結合部分と第1の抗原結合部分のVHまたはVLとの間に、ペプチドリンカーをさらに含む、[1]～[21]のいずれか1つに記載の方法。
[27] 前記ペプチドリンカーが、配列番号：248、配列番号：249、または配列番号：259のアミノ酸配列からなる群より選択される、[26-2] に記載の方法。
[28]第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々が、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137の両方に同時には結合しない、[1]～[27]のいずれか1つに記載の方法。
[29] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[28] に記載の方法。
[30] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[29] に記載の方法。
[31] 第3の抗原結合部分が、DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、[1]～[30]のいずれか1つに記載の方法。
[32] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および配列番号：239の軽鎖CDR 3を含む抗体可変領域を含む、[31] に記載の方法。
[33] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体可変領域を含む、[32] に記載の方法。
[34] 多重特異性抗原結合分子がFcドメインをさらに含む、[1]～[33]のいずれか1つに記載の方法。
[35] Fcドメインが、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつFcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、[34] に記載の方法。
[36] 多重特異性抗原結合分子が、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み；かつ
好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）が、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している、[1]～[35]のいずれか1つに記載の方法。
[37] 第4のポリペプチド（鎖4）および第5のポリペプチド（鎖5）が同一である、[1]～[36]のいずれか1つに記載の方法。
[38]1つの核酸のみ、または2、3、4もしくは5つの異なる核酸が、第1の、第2の、第3の、第4のおよび第5のポリペプチドをコードしかつ発現する、[1]または[37]のいずれか1つに記載の方法。
[1] 多重特異性抗原結合分子を製造するための方法であって、該多重特異性抗原結合分子が以下：
それぞれがFabであり、かつ第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
第1のおよび第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む第3の抗原結合部分
を含み、該方法が、
（a）以下をコードする1つまたは複数の核酸を提供する段階：
i.（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVHまたはVL、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含む、第1のポリペプチド；
ii.（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第2のポリペプチド；
iii.（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVHまたはVL、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含む、第3のポリペプチド；
iv.（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第4のポリペプチド；ならびに
v.（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第5のポリペプチド；
（b）（a）で製造した1つまたは複数の核酸を宿主細胞に導入する段階；
（c）（i）～（v）におけるポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養する段階；ならびに
（d）段階（c）で培養した細胞の培養液から（i）～（v）における5つのポリペプチドを含む多重特異性抗原結合分子を収集する段階
を含み；かつ
任意で、（iv）～（v）におけるポリペプチドが同一であり；かつ
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み、好ましくは、該少なくとも1つのシステインがCH1領域内に位置しており；該少なくとも1つのシステイン残基が、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に、少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき；
該方法が、調製物を還元試薬と接触させる段階を含む、前記方法。
[2] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、
第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成できる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基
を（変異、置換、または挿入を介して）含む、[1] に記載の方法。
[3] CH1領域（EUナンバリングによる191位）におけるシステインに1つまたは複数のジスルフィド結合を形成させる還元条件下で、段階（d）から収集した多重特異性抗原結合分子（多重特異性抗原結合分子）調製物を還元試薬と接触させる段階（e）をさらに含む、[1]～[2]のいずれか1つに記載の方法。
[4] （還元剤と接触させる前の）段階（d）から収集した前記多重特異性抗原結合分子調製物が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合だけ異なっている2つ以上の構造アイソフォームを含み、かつ還元剤と接触させる段階（e）が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子構造アイソフォームの集団を優先的に濃縮するかまたは増加させる、[3] に記載の方法。
[5] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3から約10である、[3]～[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約6、7または8である、[5] に記載の方法。
[7] 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約7である、[6] に記載の方法。
[8]多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3である、[5] に記載の方法。
[9] 還元剤が、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、およびNa2SO3からなる群より選択される、[3]～[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10] 還元剤がTCEP、好ましくは0.25 mM TCEPである、[9] に記載の方法。
[11] 還元剤の濃度が約0.01 mMから約100 mMである、[3]～[9]のいずれか1つに記載の方法。
[12] 還元剤の濃度が、約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mM、好ましくは約0.25 mMである、[11] に記載の方法。
[13]接触させる段階が、少なくとも30分間にわたって実施される、[3]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[14]接触させる段階が、約10分間から約48時間にわたって実施される、[3]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[15] 接触させる段階が、約2時間または約18時間にわたって実施される、[3]～[12]のいずれか1つに記載の方法。
[16] 接触させる段階が、約4℃から37℃の温度で、好ましくは23℃から25℃で実施される、[3]～[15]のいずれか1つに記載の方法。
[17]前記多重特異性抗原結合分子が、前記還元剤と接触させる段階の前に少なくとも部分的に精製される、[3]～[16]のいずれか1つに記載の方法。
[18] 前記多重特異性抗原結合分子が、前記接触させる段階の前にアフィニティクロマトグラフィー（好ましくはプロテインAクロマトグラフィー）によって部分的に精製される、[17] に記載の方法。
[19] 多重特異性抗原結合分子の濃度が、約0.1 mg/mlから約50 mg/mlまたはそれを上回る、[3]～[18]のいずれか1つに記載の方法。
[20] 多重特異性抗原結合分子の濃度が約10 mg/mlまたは約20 mg/mlである、[19] に記載の方法。
[21] 好ましくは透析またはバッファー交換によって好ましくは還元剤を除去することによって、システインジスルフィド結合の再酸化を促進する段階をさらに含む、[3]～[20]のいずれか1つに記載の方法。
[22] CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子の均一な集団を有する、[3]～[21]のいずれか1つに記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
[23]少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、好ましくは少なくとも95％のモル比の、CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子を有する、[3]～[21]のいずれか1つに記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
[24] 第3の抗原結合部分が従来型のFabであり、かつ
（a）第1のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（b）第2のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
（c）第3のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および 任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（d）第4のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）含み；かつ
（e）第5のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む、
[1]～[21]のいずれか1つに記載の方法。
[25] 第3の抗原結合部分が、（Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されている）VH/VLクロスオーバーFabであり、かつ
（a）第1のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVL、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および 任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（b）第2のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVH、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
（c）第3のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および 任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（d）第4のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；かつ
（e）第5のポリペプチドが、（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む、
[1]～[21]のいずれか1つに記載の方法。
[26] 第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれのCLにおいて、123位および124位にあるアミノ酸がそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であり（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位にあるアミノ酸がグルタミン酸（E）である（EUナンバリングによるナンバリング）、[25] に記載の方法。
[26-2] 段階（a）（i）において、第1のポリペプチドが、第3の抗原結合部分と第1の抗原結合部分のVHまたはVLとの間に、ペプチドリンカーをさらに含む、[1]～[21]のいずれか1つに記載の方法。
[27] 前記ペプチドリンカーが、配列番号：248、配列番号：249、または配列番号：259のアミノ酸配列からなる群より選択される、[26-2] に記載の方法。
[28]第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々が、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137の両方に同時には結合しない、[1]～[27]のいずれか1つに記載の方法。
[29] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[28] に記載の方法。
[30] 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、[29] に記載の方法。
[31] 第3の抗原結合部分が、DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、[1]～[30]のいずれか1つに記載の方法。
[32] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および配列番号：239の軽鎖CDR 3を含む抗体可変領域を含む、[31] に記載の方法。
[33] DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体可変領域を含む、[32] に記載の方法。
[34] 多重特異性抗原結合分子がFcドメインをさらに含む、[1]～[33]のいずれか1つに記載の方法。
[35] Fcドメインが、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつFcドメインが、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す、[34] に記載の方法。
[36] 多重特異性抗原結合分子が、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み；かつ
好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）が、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している、[1]～[35]のいずれか1つに記載の方法。
[37] 第4のポリペプチド（鎖4）および第5のポリペプチド（鎖5）が同一である、[1]～[36]のいずれか1つに記載の方法。
[38]1つの核酸のみ、または2、3、4もしくは5つの異なる核酸が、第1の、第2の、第3の、第4のおよび第5のポリペプチドをコードしかつ発現する、[1]または[37]のいずれか1つに記載の方法。
さらに別の局面において、本発明は以下に関する：
[1] 抗体調製物から標的抗体を捕捉および/または除去するための方法であって、以下の段階：
a）標的抗体を含む抗体調製物を、支持体上に固定化された抗原結合分子と接触させる段階；および
b）抗原結合分子への特異的結合によって標的抗体を捕捉させる段階
を含み、
該抗体が、IgG（好ましくはヒトIgGまたはヒトIgG1）由来の少なくとも 2つのFabを含み、かつ該抗体調製物が、CH1ドメインで2つのFab間に形成されるジスルフィド結合だけ異なっている、2つの抗体構造アイソフォームを含み；かつ
該抗原結合分子が、ジスルフィド結合を含まない標的抗体に特異的に結合し、それを捕捉する、前記方法。
[2]前記抗原結合分子が、標的抗体がジスルフィド結合を有さない時にだけ抗原結合分子にアクセスできるエピトープで標的抗体に結合する、[1] に記載の方法。
[3] 前記ジスルフィド結合が、CH1ドメインにおけるEUナンバリングによる191位で抗体の2つのFab間に形成されるジスルフィド結合である、[1]または[2] に記載の方法。
[4]前記抗原結合分子が、以下：
（a1）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：182の軽鎖CDR 1、配列番号：186の軽鎖CDR 2、および配列番号：190の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：183の軽鎖CDR 1、配列番号：187の軽鎖CDR 2、および配列番号：191の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：184の軽鎖CDR 1、配列番号：188の軽鎖CDR 2、および配列番号：192の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：169の重鎖CDR 1、配列番号：173の重鎖CDR 2、配列番号：177の重鎖CDR 3、配列番号：185の軽鎖CDR 1、配列番号：189の軽鎖CDR 2、および配列番号：193の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：115の軽鎖CDR 1、配列番号：124の軽鎖CDR 2、および配列番号：134の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：116の軽鎖CDR 1、配列番号：125の軽鎖CDR 2、および配列番号：135の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：118の軽鎖CDR 1、配列番号：128の軽鎖CDR 2、および配列番号：137の軽鎖CDR 3；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む抗体である、[1]～[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5]前記抗原結合分子が、以下：
（a1）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：178のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：179のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：180のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：181のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む抗体である、[1]～[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5A]標的抗体が、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み；かつ
好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）が、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している、[1]～[5]のいずれか1つに記載の方法。
[6]以下：
（a1）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：182の軽鎖CDR 1、配列番号：186の軽鎖CDR 2、および配列番号：190の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：183の軽鎖CDR 1、配列番号：187の軽鎖CDR 2、および配列番号：191の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：184の軽鎖CDR 1、配列番号：188の軽鎖CDR 2、および配列番号：192の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：169の重鎖CDR 1、配列番号：173の重鎖CDR 2、配列番号：177の重鎖CDR 3、配列番号：185の軽鎖CDR 1、配列番号：189の軽鎖CDR 2、および配列番号：193の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：115の軽鎖CDR 1、配列番号：124の軽鎖CDR 2、および配列番号：134の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：116の軽鎖CDR 1、配列番号：125の軽鎖CDR 2、および配列番号：135の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：118の軽鎖CDR 1、配列番号：128の軽鎖CDR 2、および配列番号：137の軽鎖CDR 3；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む、抗原結合分子。
[7]以下：
（a1）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：178のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：179のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：180のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：181のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む、抗原結合分子。
[8] ヒトIgG1のCH1に特異的に結合する、[6]または[7]の抗原結合分子。
[9] ジスルフィド結合がヒトIgG1の2つのFabのCH1ドメイン間に形成される時に、ヒトIgG1のCH1に特異的に結合しない、[8]に記載の抗原結合分子。
[10]前記ジスルフィド結合が、CH1ドメインにおけるEUナンバリングによる191位でIgG1の2つのFab間に形成されるジスルフィド結合である、[9]に記載の抗原結合分子。
[11] ヒトIgG4のCH1に結合しない、[8]～[10]のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[12] 抗体試料の精製、分析、または定量化における、[6]～[11]のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[1] 抗体調製物から標的抗体を捕捉および/または除去するための方法であって、以下の段階：
a）標的抗体を含む抗体調製物を、支持体上に固定化された抗原結合分子と接触させる段階；および
b）抗原結合分子への特異的結合によって標的抗体を捕捉させる段階
を含み、
該抗体が、IgG（好ましくはヒトIgGまたはヒトIgG1）由来の少なくとも 2つのFabを含み、かつ該抗体調製物が、CH1ドメインで2つのFab間に形成されるジスルフィド結合だけ異なっている、2つの抗体構造アイソフォームを含み；かつ
該抗原結合分子が、ジスルフィド結合を含まない標的抗体に特異的に結合し、それを捕捉する、前記方法。
[2]前記抗原結合分子が、標的抗体がジスルフィド結合を有さない時にだけ抗原結合分子にアクセスできるエピトープで標的抗体に結合する、[1] に記載の方法。
[3] 前記ジスルフィド結合が、CH1ドメインにおけるEUナンバリングによる191位で抗体の2つのFab間に形成されるジスルフィド結合である、[1]または[2] に記載の方法。
[4]前記抗原結合分子が、以下：
（a1）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：182の軽鎖CDR 1、配列番号：186の軽鎖CDR 2、および配列番号：190の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：183の軽鎖CDR 1、配列番号：187の軽鎖CDR 2、および配列番号：191の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：184の軽鎖CDR 1、配列番号：188の軽鎖CDR 2、および配列番号：192の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：169の重鎖CDR 1、配列番号：173の重鎖CDR 2、配列番号：177の重鎖CDR 3、配列番号：185の軽鎖CDR 1、配列番号：189の軽鎖CDR 2、および配列番号：193の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：115の軽鎖CDR 1、配列番号：124の軽鎖CDR 2、および配列番号：134の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：116の軽鎖CDR 1、配列番号：125の軽鎖CDR 2、および配列番号：135の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：118の軽鎖CDR 1、配列番号：128の軽鎖CDR 2、および配列番号：137の軽鎖CDR 3；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む抗体である、[1]～[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5]前記抗原結合分子が、以下：
（a1）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：178のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：179のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：180のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：181のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む抗体である、[1]～[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5A]標的抗体が、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み；かつ
好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）が、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している、[1]～[5]のいずれか1つに記載の方法。
[6]以下：
（a1）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：182の軽鎖CDR 1、配列番号：186の軽鎖CDR 2、および配列番号：190の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：183の軽鎖CDR 1、配列番号：187の軽鎖CDR 2、および配列番号：191の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：184の軽鎖CDR 1、配列番号：188の軽鎖CDR 2、および配列番号：192の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：169の重鎖CDR 1、配列番号：173の重鎖CDR 2、配列番号：177の重鎖CDR 3、配列番号：185の軽鎖CDR 1、配列番号：189の軽鎖CDR 2、および配列番号：193の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：115の軽鎖CDR 1、配列番号：124の軽鎖CDR 2、および配列番号：134の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：116の軽鎖CDR 1、配列番号：125の軽鎖CDR 2、および配列番号：135の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：118の軽鎖CDR 1、配列番号：128の軽鎖CDR 2、および配列番号：137の軽鎖CDR 3；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む、抗原結合分子。
[7]以下：
（a1）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：178のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：179のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：180のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：181のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む、抗原結合分子。
[8] ヒトIgG1のCH1に特異的に結合する、[6]または[7]の抗原結合分子。
[9] ジスルフィド結合がヒトIgG1の2つのFabのCH1ドメイン間に形成される時に、ヒトIgG1のCH1に特異的に結合しない、[8]に記載の抗原結合分子。
[10]前記ジスルフィド結合が、CH1ドメインにおけるEUナンバリングによる191位でIgG1の2つのFab間に形成されるジスルフィド結合である、[9]に記載の抗原結合分子。
[11] ヒトIgG4のCH1に結合しない、[8]～[10]のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[12] 抗体試料の精製、分析、または定量化における、[6]～[11]のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
態様の説明
本明細書において記載または参照される技法および手順は、概して十分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)：PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual、およびAnimal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；ならびにCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993) に記載される広く利用されている方法論などの従来の方法論を使用して当業者によって一般的に用いられるものである。
本明細書において記載または参照される技法および手順は、概して十分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)：PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual、およびAnimal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；ならびにCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993) に記載される広く利用されている方法論などの従来の方法論を使用して当業者によって一般的に用いられるものである。
以下の定義および詳細な説明は、本明細書において説明する本開示の理解を容易にするために提供される。
定義
アミノ酸
本明細書において、アミノ酸は、1文字コードもしくは3文字コードまたはその両方、例えば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、またはVal/Vによって記載される。
アミノ酸
本明細書において、アミノ酸は、1文字コードもしくは3文字コードまたはその両方、例えば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、またはVal/Vによって記載される。
アミノ酸の改変
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸改変（本明細書において「アミノ酸置換」または「アミノ酸変異」とも記載される）のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））および重複伸長PCRなどの公知の方法が適宜採用され得る。さらに、非天然アミノ酸に置換するためのアミノ酸改変方法として、いくつかの公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249；およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合したtRNAを含む無細胞翻訳系 (Clover Direct (Protein Express)) を用いることが適切である。
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸改変（本明細書において「アミノ酸置換」または「アミノ酸変異」とも記載される）のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））および重複伸長PCRなどの公知の方法が適宜採用され得る。さらに、非天然アミノ酸に置換するためのアミノ酸改変方法として、いくつかの公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249；およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合したtRNAを含む無細胞翻訳系 (Clover Direct (Protein Express)) を用いることが適切である。
本明細書において、アミノ酸改変の部位を記載する際の用語「および／または」の意味は、「および」と「または」が適切に組み合わされたあらゆる組み合わせを含む。具体的には、例えば、「33位、55位、および／または96位のアミノ酸が置換されている」は、アミノ酸改変の以下のバリエーションを含む：(a) 33位、(b) 55位、(c) 96位、(d) 33位および55位、(e) 33位および96位、(f) 55位および96位、ならびに (g) 33位、55位、および96位のアミノ酸。
さらに、本明細書において、アミノ酸の改変を示す表現として、特定の位置を表す数字の前および後に、それぞれ改変前および改変後のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードを示す表現が、適宜使用され得る。例えば、抗体可変領域中に含まれるアミノ酸を置換する際に用いられるN100bLまたはAsn100bLeuという改変は、100b位（Kabatナンバリングによる）におけるAsnの、Leuによる置換を表す。すなわち、数字はKabatナンバリングによるアミノ酸の位置を示し、数字の前に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換前のアミノ酸を示し、数字の後に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換後のアミノ酸を示す。同様に、抗体定常領域中に含まれるFc領域のアミノ酸を置換する際に用いられるP238DまたはPro238Aspという改変は、238位（EUナンバリングによる）におけるProの、Aspによる置換を表す。すなわち、数字はEUナンバリングによるアミノ酸の位置を示し、数字の前に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換前のアミノ酸を示し、数字の後に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換後のアミノ酸を示す。
ポリペプチド
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2アミノ酸以上の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。よって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2アミノ酸以上の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたは相互に交換可能に用いられてもよい。用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよく、または組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定の核酸から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含む、任意の方法で生成されてもよい。本明細書において記載されるポリペプチドは、約3アミノ酸以上、5アミノ酸以上、10アミノ酸以上、20アミノ酸以上、25アミノ酸以上、50アミノ酸以上、75アミノ酸以上、100アミノ酸以上、200アミノ酸以上、500アミノ酸以上、1,000アミノ酸以上、または2,000アミノ酸以上のサイズのものであってもよい。ポリペプチドは規定された三次元構造を有し得るが、それらは必ずしもそのような構造を有する必要はない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと称され、規定された三次元構造をもたないが多数の異なる立体構造をとり得るポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2アミノ酸以上の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。よって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2アミノ酸以上の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたは相互に交換可能に用いられてもよい。用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよく、または組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定の核酸から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含む、任意の方法で生成されてもよい。本明細書において記載されるポリペプチドは、約3アミノ酸以上、5アミノ酸以上、10アミノ酸以上、20アミノ酸以上、25アミノ酸以上、50アミノ酸以上、75アミノ酸以上、100アミノ酸以上、200アミノ酸以上、500アミノ酸以上、1,000アミノ酸以上、または2,000アミノ酸以上のサイズのものであってもよい。ポリペプチドは規定された三次元構造を有し得るが、それらは必ずしもそのような構造を有する必要はない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと称され、規定された三次元構造をもたないが多数の異なる立体構造をとり得るポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。
パーセント (％) アミノ酸配列同一性
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした時の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。％アミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign (DNASTAR) ソフトウェアなどの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムであるALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：
分率X／Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした時の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。％アミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign (DNASTAR) ソフトウェアなどの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムであるALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：
分率X／Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
組換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体および抗原結合分子は組換えの方法や構成を用いて製造することができる。1つの態様において、本明細書に記載の抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。1つの態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。1つの態様において、抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、本発明の多重特異性抗原結合分子を作製する方法が提供される。
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体および抗原結合分子は組換えの方法や構成を用いて製造することができる。1つの態様において、本明細書に記載の抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。1つの態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。1つの態様において、抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、本発明の多重特異性抗原結合分子を作製する方法が提供される。
本明細書において記載される抗体の組換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌 (E. coli) における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部がん細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳がん (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR- CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
本明細書において記載される抗原結合分子の組換え産生は、抗原結合分子全体または抗原結合分子の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む1つまたは複数のベクターを含む（例えば、それによって形質転換されている）宿主細胞を用いることによって、上記に記載されたものと同様の方法で行うことができる。
抗原結合分子および多重特異性抗原結合分子
本明細書で用いられる用語「抗原結合分子」は、抗原結合部位を含む任意の分子、または抗原に対する結合活性を有する任意の分子を指し、約5アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子をさらに指し得る。ペプチドおよびタンパク質は、生物に由来するものに限定されず、例えば、それらは、人工的に設計された配列から産生されたポリペプチドであってもよい。それらは、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれかであってもよい。スキャフォールドとしてα/βバレルなどの公知の安定な立体構造を含み、分子の一部が抗原結合部位になる、スキャフォールド分子もまた、本明細書において記載される抗原結合分子の一態様である。
本明細書で用いられる用語「抗原結合分子」は、抗原結合部位を含む任意の分子、または抗原に対する結合活性を有する任意の分子を指し、約5アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子をさらに指し得る。ペプチドおよびタンパク質は、生物に由来するものに限定されず、例えば、それらは、人工的に設計された配列から産生されたポリペプチドであってもよい。それらは、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれかであってもよい。スキャフォールドとしてα/βバレルなどの公知の安定な立体構造を含み、分子の一部が抗原結合部位になる、スキャフォールド分子もまた、本明細書において記載される抗原結合分子の一態様である。
「多重特異性抗原結合分子」は、2つ以上の抗原に特異的に結合する抗原結合分子を指す。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が、少なくとも2種類の異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。用語「三重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも3種類の異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。
特定の態様において、本出願の多重特異性抗原結合分子は、三重特異性抗原結合分子、すなわち、3種類の異なる抗原に特異的に結合することができる、つまり、CD3またはCD137のいずれか一方に結合することができるが、両方の抗原に同時には結合せず、かつDLL3に特異的に結合することができる、三重特異性抗原結合分子である。
特定の態様において、本出願の多重特異性抗原結合分子は、三重特異性抗原結合分子、すなわち、3種類の異なる抗原に特異的に結合することができる、つまり、CD3またはCD137のいずれか一方に結合することができるが、両方の抗原に同時には結合せず、かつDLL3に特異的に結合することができる、三重特異性抗原結合分子である。
ある局面において、本開示は、以下：
各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。
各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。
ある局面において、本開示は、以下：
各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、第3の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。
各々がCD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、第3の抗原結合部分
を含む、多重特異性抗原結合分子を提供する。
ある局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分はそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
ある局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分はそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域.
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域.
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
ある局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、Fab分子であり、かつ第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を含み、好ましくは、少なくとも1つのジスルフィド結合は、ヒンジ領域内にはないアミノ酸残基（システイン）間に、好ましくは、各抗原結合部分のCH1領域内のアミノ酸残基（システイン）間に形成される。
ある局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、Fab分子であり、かつ第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基（システイン）間に形成される1つのジスルフィド結合を含む。
ある局面において、第3の抗原結合部分は、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方に融合される。
ある局面において、第3の抗原結合部分はFabまたはscFvである。
ある局面において、第1の、第2の、および第3の抗原結合部分のそれぞれはFab分子であり、第3の抗原結合部分は、Fab重鎖（CH1）のC末端で、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されている。
ある局面において、ペプチドリンカーは、配列番号：248、配列番号：249、または配列番号：259のアミノ酸配列からなる群より選択される。
ある局面において、第1の抗原結合部分は第2の抗原結合部分と同一である。
ある局面において、第3の抗原結合部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子であり、第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれは、従来型のFab分子である。
ある局面において、第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCLにおいて、123位および/または124位にあるアミノ酸は独立して、リジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）によって置換され（Kabatによるナンバリング）、第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位にあるアミノ酸および/または213位にあるアミノ酸は独立して、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって置換されている（EUナンバリングによるナンバリング）。
ある局面において、第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの軽鎖の定常ドメインCL、123位および124位にあるアミノ酸はそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であり（Kabatによるナンバリング）、第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位にあるアミノ酸はグルタミン酸（E）である（EUナンバリングによるナンバリング）。
ある局面において、DLL3に結合できる第3の抗原結合部分は、以下の（a1）～（a5）：
（a1）配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および配列番号：239の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：276の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：277の重鎖CDR 2、配列番号：278の重鎖CDR 3、配列番号：279の軽鎖CDR 1、配列番号：280の軽鎖CDR 2、および配列番号：281の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：285の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：286の重鎖CDR 2、配列番号：287の重鎖CDR 3、配列番号：288の軽鎖CDR 1、配列番号：289の軽鎖CDR 2、および配列番号：290の軽鎖CDR 3；
（a4）（a1）～（a3）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a5）（a1）～（a3）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
（a1）配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および配列番号：239の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：276の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：277の重鎖CDR 2、配列番号：278の重鎖CDR 3、配列番号：279の軽鎖CDR 1、配列番号：280の軽鎖CDR 2、および配列番号：281の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：285の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：286の重鎖CDR 2、配列番号：287の重鎖CDR 3、配列番号：288の軽鎖CDR 1、配列番号：289の軽鎖CDR 2、および配列番号：290の軽鎖CDR 3；
（a4）（a1）～（a3）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a5）（a1）～（a3）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
ある局面において、DLL3に結合できる第3の抗原結合部分は、以下（a1）～（a6）：
（a1）配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：264のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：265のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：266のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：267のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：268のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：269のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）（a1）～（a4）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a6）（a1）～（a4）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
（a1）配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：264のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：265のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：266のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：267のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：268のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：269のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）（a1）～（a4）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a6）（a1）～（a4）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
ある局面において、本発明の多重特異性抗原結合分子はFcドメインをさらに含む。
ある局面において、Fcドメインは、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、Fcドメインは、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す。
ある局面において、Fcドメインは、天然型IgGのFc領域のものと比較して、酸性pH条件（例えば、pH 5.8）下で増強されたFcRn結合活性を示す。
ある局面において、Fcドメインは、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にGlu、Arg、Ser、またはLys；および440位にGlu、Asp、またはGlnを含む。
ある局面において、Fcドメインは、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にArgまたはLys；および440位にGluまたはAspを含む。
ある局面において、Fcドメインは、EUナンバリングによる、428位にIleもしくはLeu；および/または436位にIle、Leu、Val、Thr、もしくはPheをさらに含む。
ある局面において、Fcドメインは、EUナンバリングによる、以下：
（a）N434A/Q438R/S440E；
（b）N434A/Q438R/S440D；
（c）N434A/Q438K/S440E；
（d）N434A/Q438K/S440D；
（e）N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（f）N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（g）N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（h）N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（i）N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（j）N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（k）N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（l）N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（m）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；
（n）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；
（o）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；
（p）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；
（q）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；
（r）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；
（s）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；
（t）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；
（u）M428L/N434A/Q438R/S440E；
（v）M428L/N434A/Q438R/S440D；
（w）M428L/N434A/Q438K/S440E；
（x）M428L/N434A/Q438K/S440D；
（y）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（z）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（aa）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（ab）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（ac）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（ad）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（ae）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（af）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（ag）L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；および
（ah）L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。
（a）N434A/Q438R/S440E；
（b）N434A/Q438R/S440D；
（c）N434A/Q438K/S440E；
（d）N434A/Q438K/S440D；
（e）N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（f）N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（g）N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（h）N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（i）N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（j）N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（k）N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（l）N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（m）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；
（n）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；
（o）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；
（p）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；
（q）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；
（r）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；
（s）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；
（t）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；
（u）M428L/N434A/Q438R/S440E；
（v）M428L/N434A/Q438R/S440D；
（w）M428L/N434A/Q438K/S440E；
（x）M428L/N434A/Q438K/S440D；
（y）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（z）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（aa）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（ab）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（ac）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（ad）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（ae）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（af）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（ag）L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；および
（ah）L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。
ある局面において、Fcドメインは、M428L/N434A/Q438R/S440Eのアミノ酸置換の組み合わせを含む。
ある局面において、Fcドメインは、IgG Fcドメイン、好ましくはヒトIgG Fcドメイン、より好ましくはヒトIgG1 Fcドメインである。
ある局面において、Fcドメインは、以下：
（a）配列番号：100に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニットおよび配列番号：111に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット；または
（b）配列番号：99に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニットおよび配列番号：109に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット
のいずれかを含む。
（a）配列番号：100に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニットおよび配列番号：111に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット；または
（b）配列番号：99に示されるアミノ酸配列を含む第1のFcサブユニットおよび配列番号：109に示されるアミノ酸配列を含む第2のFcサブユニット
のいずれかを含む。
ある局面において、第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれはFabであり、第1の抗原結合部分は、Fab重鎖のC末端でFcドメインの第1のまたは第2のサブユニットのN末端に融合され、かつ第2の抗原結合部分は、Fab重鎖のC末端でFcドメインの残りのサブユニットのN末端に融合されている。
ある局面において、第3の抗原結合部分は、C末端で、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分のいずれか一方のFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合される。
ある局面において、本発明の多重特異性抗原結合分子は、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み；好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）は、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している。
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み；好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）は、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している。
本発明の多重特異性抗原結合分子の構成成分は、様々な配置で相互に融合させることができる。例示的な配置は、表2と合わせて読む図1（a）に図示される。
上記態様のいずれかによれば、多重特異性抗原結合分子の構成成分（例えば、 抗原結合部分、Fcドメイン）は、直接的に、または種々のリンカー、特に、本明細書において記載されているかまたは当技術分野において公知である1つもしくは複数のアミノ酸、典型的には約2～20個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを通じて、融合させてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n、またはG4(SG4)nペプチドリンカーが含まれ、ここで、nは概して1～10、典型的には2～4の数である。
ピログルタミル化
抗体が細胞において発現した場合、抗体は翻訳後に修飾されることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖のC末端にあるリジンの、カルボキシペプチダーゼによる切断；重鎖および軽鎖のN末端にあるグルタミンまたはグルタミン酸の、ピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾；グリコシル化；酸化；脱アミド；および糖化が挙げられ、そのような翻訳後修飾は種々の抗体で生じることが公知である（Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447）。
抗体が細胞において発現した場合、抗体は翻訳後に修飾されることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖のC末端にあるリジンの、カルボキシペプチダーゼによる切断；重鎖および軽鎖のN末端にあるグルタミンまたはグルタミン酸の、ピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾；グリコシル化；酸化；脱アミド；および糖化が挙げられ、そのような翻訳後修飾は種々の抗体で生じることが公知である（Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447）。
いくつかの態様では、本発明の多重特異性抗原結合分子には、翻訳後修飾も含まれる。翻訳後修飾の例としては、重鎖可変領域のN末端でのピログルタミル化および/または重鎖のC末端でのリジンの欠失を受けていることが挙げられる。当分野において、N末端でのピログルタミル化およびC末端でのリジンの欠失によるそのような翻訳後修飾が、抗体の活性に何ら影響を有さないことは公知である（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
抗原結合部分
本明細書で用いられる用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。1つの態様において、抗原結合部分は、それが結合している実体を、標的部位、例えばがん抗原（DLL3）を発現する特定の種類の腫瘍細胞へと方向付けることができる。別の態様において、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばT細胞受容体複合体抗原（特に、CD3）および/または共刺激受容体（CD137）を通じてシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、本明細書においてさらに定義される抗体およびその断片が含まれる。具体的な抗原結合部分としては、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインまたは抗体可変領域が挙げられる。特定の態様において、抗原結合部分は、本明細書においてさらに定義されかつ当技術分野において公知である抗体定常領域を含んでもよい。有用な重鎖定常領域には、5つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、またはμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、2つのアイソタイプ：κおよびλのいずれかが含まれる。
本明細書で用いられる用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。1つの態様において、抗原結合部分は、それが結合している実体を、標的部位、例えばがん抗原（DLL3）を発現する特定の種類の腫瘍細胞へと方向付けることができる。別の態様において、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばT細胞受容体複合体抗原（特に、CD3）および/または共刺激受容体（CD137）を通じてシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、本明細書においてさらに定義される抗体およびその断片が含まれる。具体的な抗原結合部分としては、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインまたは抗体可変領域が挙げられる。特定の態様において、抗原結合部分は、本明細書においてさらに定義されかつ当技術分野において公知である抗体定常領域を含んでもよい。有用な重鎖定常領域には、5つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、またはμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、2つのアイソタイプ：κおよびλのいずれかが含まれる。
抗原結合部分等に関して、本明細書で用いられる用語「第1の」、「第2の」、および「第3の」は、2種類以上の種類別の部分等が存在する場合に区別するという利便性のために用いられる。これらの用語の使用は、別段明示しない限り、多重特異性抗原結合分子の特定の順序または向きを付与することを意図しない。
CD3およびCD137に結合することができるがCD3とCD137に同時には結合しない抗原結合部分
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、少なくとも1つの抗原結合部分（本明細書において「Dual抗原結合部分」または「第1の抗原結合部分」または「Dual-Fab」または「Dual-Ig」とも称される）を含む。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、2つのDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）を含む。いくつかの態様において、2つのDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）のそれぞれは、CD3またはCD137に対する一価の結合を提供するが、CD3およびCD137に同時には結合しない。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、2つ以内のDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）を含む。
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない、少なくとも1つの抗原結合部分（本明細書において「Dual抗原結合部分」または「第1の抗原結合部分」または「Dual-Fab」または「Dual-Ig」とも称される）を含む。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、2つのDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）を含む。いくつかの態様において、2つのDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）のそれぞれは、CD3またはCD137に対する一価の結合を提供するが、CD3およびCD137に同時には結合しない。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、2つ以内のDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）を含む。
特定の態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は一般に、Fab分子、特に従来型のFab分子である。特定の態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」）は、抗体軽鎖および重鎖可変領域（VLおよびVH）を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含む、そのようなドメインの適切な例としては、「単鎖 Fv（scFv）」、「単鎖抗体」、「Fv」、「単鎖 Fv 2（scFv2）」、「Fab」、「F（ab’）2」等が挙げられる。
特定の態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、CD3の全体もしくはその部分ペプチドの一部分に特異的に結合する。特定の態様において、CD3はヒトCD3またはカニクイザルCD3、特にヒトCD3である。特定の態様において、第1の抗原結合部分は、ヒトおよびカニクイザルCD3に対し交差反応性を有する（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、CD3のεサブユニット、特に、配列番号：7（NP_000724.1）（括弧内にRefSeq登録番号を示す）に示されるCD3のヒトCD3εサブユニットに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、真核細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、第1の抗原結合部分は、T細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に結合する。
特定の態様において、CD137はヒトCD137である。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の好適な例には、以下：
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：21）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：35）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：49）を含む領域を認識する抗体、および
ヒトCD137タンパク質中のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：105）を含む領域を認識する抗体
からなる群より選択される抗体によって結合されるヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合するDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）が挙げられる。
特定の態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、CD3の全体もしくはその部分ペプチドの一部分に特異的に結合する。特定の態様において、CD3はヒトCD3またはカニクイザルCD3、特にヒトCD3である。特定の態様において、第1の抗原結合部分は、ヒトおよびカニクイザルCD3に対し交差反応性を有する（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、CD3のεサブユニット、特に、配列番号：7（NP_000724.1）（括弧内にRefSeq登録番号を示す）に示されるCD3のヒトCD3εサブユニットに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、真核細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、第1の抗原結合部分は、T細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に結合する。
特定の態様において、CD137はヒトCD137である。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の好適な例には、以下：
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：21）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：35）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：49）を含む領域を認識する抗体、および
ヒトCD137タンパク質中のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：105）を含む領域を認識する抗体
からなる群より選択される抗体によって結合されるヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合するDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）が挙げられる。
特定の態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、以下の表1Aに示される抗体可変領域配列のいずれか1つを含む。特定の態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、表1Aに示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせのいずれか1つを含む。
（表１Ａ）Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）の可変領域の配列番号
1つの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、配列番号：6に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：58に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
1つの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、配列番号：14に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：58に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
1つの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、配列番号：81に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：58に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
特定の態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）は、以下の表1Bに示されるHVR配列の組み合わせのいずれか1つを含む。
（表１Ｂ）Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）のHVR（CDR）配列の配列番号
いくつかの態様において、Dual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）はそれぞれ、
配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
を含む、抗体可変領域を含む。
配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
を含む、抗体可変領域を含む。
いくつかの態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子またはDual抗原結合部分（「第1の抗原結合部分」または「第2の抗原結合部分」または「Dual-Fab」）には、翻訳後修飾も含まれる。翻訳後の例としては、重鎖可変領域のN末端でのピログルタミル化および/または重鎖のC末端でのリジンの欠失を受けていることが挙げられる。当分野において、N末端でのピログルタミル化およびC末端でのリジンの欠失によるそのような翻訳後修飾は、抗体の活性に対していかなる影響も有さないことが知られている（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
DLL3に結合できる抗原結合部分
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、デルタ様3（DLL3）に結合できる抗原結合部分（本明細書において「DLL3抗原結合部分」または「第3の抗原結合部分」とも呼ばれる）を少なくとも1つ含む。ある特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、DLL3に結合できる1つの抗原結合部分を含む。ある特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、DLL3に結合できる抗原結合部分（「DLL3抗原結合部分」）を2つ含む。特定のそのような態様において、これらの抗原結合部分のそれぞれは、DLL3の同じエピトープに特異的に結合する。さらにより具体的な態様において、これらの「DLL3抗原結合部分」のすべては同一である。1つの態様において、多重特異性抗原結合分子は、DLL3に特異的に結合できる免疫グロブリン分子（「DLL3抗原結合部分」）を含む。1つの態様において、多重特異性抗原結合分子は、DLL3に結合できる抗原結合部分（「DLL3抗原結合部分」）を2つ以下含む。
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、デルタ様3（DLL3）に結合できる抗原結合部分（本明細書において「DLL3抗原結合部分」または「第3の抗原結合部分」とも呼ばれる）を少なくとも1つ含む。ある特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、DLL3に結合できる1つの抗原結合部分を含む。ある特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、DLL3に結合できる抗原結合部分（「DLL3抗原結合部分」）を2つ含む。特定のそのような態様において、これらの抗原結合部分のそれぞれは、DLL3の同じエピトープに特異的に結合する。さらにより具体的な態様において、これらの「DLL3抗原結合部分」のすべては同一である。1つの態様において、多重特異性抗原結合分子は、DLL3に特異的に結合できる免疫グロブリン分子（「DLL3抗原結合部分」）を含む。1つの態様において、多重特異性抗原結合分子は、DLL3に結合できる抗原結合部分（「DLL3抗原結合部分」）を2つ以下含む。
ある特定の態様において、DLL3抗原結合部分は、クロスオーバーFab分子、すなわち、Fab重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているDLL3分子である。ある特定の態様において、DLL3抗原結合部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子である。
いくつかの態様において、DLL3抗原結合部分は、DLL3の細胞外ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様において、DLL3抗原結合部分は、DLL3の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、DLL3抗原結合部分は、真核細胞の表面上に発現しているDLL3タンパク質に結合する。いくつかの態様において、DLL3抗原結合部分は、がん細胞の表面上に発現しているDLL3タンパク質に結合する。
いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、細胞外ドメイン（ECD）内、すなわち、N末端からTM領域の直前までだが、TM領域またはC末端細胞内ドメインまでではないドメイン内のエピトープに結合する。多重特異性抗原結合分子または DLL3抗原結合部分は、ECD内の上述のドメイン/領域のいずれか内のエピトープに結合し得る。好ましい態様において、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、EGF6からTM領域の直前までの領域内のエピトープに結合する。より具体的には、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、ヒトDLL3において配列番号：89で定義される領域内のエピトープに結合し得る。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、ヒトDLL3のEGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、もしくはEGF6領域、またはEGF6からTM領域の直前までの領域、またはヒトDLL3のEGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、もしくはEGF6領域、またはEGF6からTM領域の直前までの領域内のエピトープに結合する。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、結合されるDLL3エピトープが特性解析されている、これまでに報告されている抗DLL3抗体（例えば、WO2019131988およびWO2011093097）に由来し得る。
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、以下の表1Cに示される抗体可変領域配列のいずれか1つを含む。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、表1Cに示される重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせのいずれか1つを含む。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、表1Cに示される抗体可変領域のいずれか1つとDLL3への結合について競合する抗体可変断片を含むドメインを含む。
（表１Ｃ）例示的なDLL3抗原結合部位の可変領域の配列番号
1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：232に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：236に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：300に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：236に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：300のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：301に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：236に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：301のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：274に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：275に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：274のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：275のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：264に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である重鎖可変領域配列、および配列番号：265に対して少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である軽鎖可変領域配列を含む。1つの態様において、DLL3抗原結合部分は、配列番号：264のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：265のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
特定の態様において、DLL3抗原結合部分は、以下の表1Dに示されるHVR配列の組み合わせのいずれか1つを含む。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、表1Dに示される抗体可変領域のいずれか1つとDLL3への結合について競合するか、または表1Dに示される抗体可変領域のHVR領域と同一であるHVR配列を含むいずれかの抗体可変断片とDLL3への結合について競合する抗体可変断片を含むドメインである。
（表１Ｄ）例示的なDLL3抗原結合部位のHVR（CDR）配列の配列番号
いくつかの態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子または DLL3抗原結合部分は、以下の（a1）～（a5）：
（a1）配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および配列番号：239の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：276の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：277の重鎖CDR 2、配列番号：278の重鎖CDR 3、配列番号：279の軽鎖CDR 1、配列番号：280の軽鎖CDR 2、および配列番号：281の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：285の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：286の重鎖CDR 2、配列番号：287の重鎖CDR 3、配列番号：288の軽鎖CDR 1、配列番号：289の軽鎖CDR 2、および配列番号：290の軽鎖CDR 3；
（a4）（a1）～（a3）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a5）（a1）～（a3）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
（a1）配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および配列番号：239の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：276の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：277の重鎖CDR 2、配列番号：278の重鎖CDR 3、配列番号：279の軽鎖CDR 1、配列番号：280の軽鎖CDR 2、および配列番号：281の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：285の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：286の重鎖CDR 2、配列番号：287の重鎖CDR 3、配列番号：288の軽鎖CDR 1、配列番号：289の軽鎖CDR 2、および配列番号：290の軽鎖CDR 3；
（a4）（a1）～（a3）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a5）（a1）～（a3）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
いくつかの態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分には、翻訳後修飾も含まれる。翻訳後の例としては、重鎖可変領域のN末端でのピログルタミル化および/または重鎖のC末端でのリジンの欠失を受けていることが挙げられる。当分野において、N末端でのピログルタミル化およびC末端でのリジンの欠失によるそのような翻訳後修飾は、抗体の活性に対していかなる影響も有さないことが知られている（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
別の局面において、本発明のDLL3抗原結合部分は、DLL3結合ドメインを組み込んでいる新たなキメラ抗原受容体（CAR）（DLL3 CAR）において用いることができる。ある特定の態様において、本発明のDLL3結合ドメイン（およびDLL3 CAR）は、scFv構築物を含むと考えられ、好ましい態様において、本明細書において開示されるような重鎖および軽鎖可変領域を含むと考えられるおよび含む。他の好ましい態様において、本発明のDLL3結合ドメイン（およびDLL3 CAR）は、本明細書において記載される重鎖および軽鎖可変領域を含むscFv構築物またはその断片を含むと考えられる。好ましい態様において、開示されるキメラ抗原受容体は、増殖性障害およびその任意の再発または転移を治療または予防するのに有用である。
ある特定の態様において、DLL3タンパク質は、腫瘍始原細胞上に発現している。DLL3 CARは、遺伝子改変（例えば、形質導入）を介して細胞傷害性リンパ球（好ましくは自己細胞傷害性リンパ球）上に発現し、DLL3陽性腫瘍細胞を標的としかつそれを殺傷するために用いることができるDLL3感受性リンパ球をもたらす。本明細書において広く論じられるように、本発明のCARは典型的には、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ある特定のリンパ球を活性化し、DLL3陽性腫瘍細胞の免疫反応を生じさせるDLL3結合ドメインを含む。本発明の選択される態様は、開示されたCARを示す免疫学的に活性な宿主細胞、ならびに本発明のDLL3 CARをコードする種々のポリヌクレオチド配列およびベクターを含む。他の局面には、DLL3 CAR分子を発現する宿主細胞をがんに罹患している個体に導入し、個体を処置することによって、個体におけるTリンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の活性を増強する方法が含まれる。そのような局面には、特に、肺がん（例えば、小細胞肺がん）および黒色腫が含まれる。
別の局面において、本発明のDLL3抗原結合部分は、DLL3結合ドメインを組み込んでいる新たなキメラ抗原受容体（CAR）（DLL3 CAR）において用いることができる。ある特定の態様において、本発明のDLL3結合ドメイン（およびDLL3 CAR）は、scFv構築物を含むと考えられ、好ましい態様において、本明細書において開示されるような重鎖および軽鎖可変領域を含むと考えられるおよび含む。他の好ましい態様において、本発明のDLL3結合ドメイン（およびDLL3 CAR）は、本明細書において記載される重鎖および軽鎖可変領域を含むscFv構築物またはその断片を含むと考えられる。好ましい態様において、開示されるキメラ抗原受容体は、増殖性障害およびその任意の再発または転移を治療または予防するのに有用である。
ある特定の態様において、DLL3タンパク質は、腫瘍始原細胞上に発現している。DLL3 CARは、遺伝子改変（例えば、形質導入）を介して細胞傷害性リンパ球（好ましくは自己細胞傷害性リンパ球）上に発現し、DLL3陽性腫瘍細胞を標的としかつそれを殺傷するために用いることができるDLL3感受性リンパ球をもたらす。本明細書において広く論じられるように、本発明のCARは典型的には、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ある特定のリンパ球を活性化し、DLL3陽性腫瘍細胞の免疫反応を生じさせるDLL3結合ドメインを含む。本発明の選択される態様は、開示されたCARを示す免疫学的に活性な宿主細胞、ならびに本発明のDLL3 CARをコードする種々のポリヌクレオチド配列およびベクターを含む。他の局面には、DLL3 CAR分子を発現する宿主細胞をがんに罹患している個体に導入し、個体を処置することによって、個体におけるTリンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の活性を増強する方法が含まれる。そのような局面には、特に、肺がん（例えば、小細胞肺がん）および黒色腫が含まれる。
多重特異性抗原結合分子を製造するための方法
本開示は、本明細書において記載されるいずれかの多重特異性抗原結合分子を製造する方法を提供する。
ある局面において、本開示は、多重特異性抗原結合分子を製造するための方法を提供し、該多重特異性抗原結合分子は、以下：
それぞれが、Fabであり、かつ第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
第1のおよび第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む第3の抗原結合部分
を含み、該方法は、以下の段階：
（a）以下をコードする1つまたは複数の核酸を提供する段階：
i.（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVHまたはVL、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含む、第1のポリペプチド；
ii.（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第2のポリペプチド；
iii.（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVHまたはVL、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含む、第3のポリペプチド；
iv.（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第4のポリペプチド；ならびに
v.（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第5のポリペプチド；
（b）（a）で生成した1つまたは複数の核酸を宿主細胞に導入する段階；
（c）（i）～（v）におけるポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養する段階；ならびに
（d）段階（c）で培養した細胞の培養液から（i）～（v）における5つのポリペプチドを含む多重特異性抗原結合分子を収集する段階
を含み；かつ
任意で（iv）～（v）におけるポリペプチドは同一であり；かつ
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み、好ましくは、該少なくとも1つのシステインは、CH1領域内に位置しており；該少なくとも1つのシステイン残基は、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき；
該方法は、調製物を還元試薬と接触させる段階を含む。
本開示は、本明細書において記載されるいずれかの多重特異性抗原結合分子を製造する方法を提供する。
ある局面において、本開示は、多重特異性抗原結合分子を製造するための方法を提供し、該多重特異性抗原結合分子は、以下：
それぞれが、Fabであり、かつ第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
第1のおよび第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む第3の抗原結合部分
を含み、該方法は、以下の段階：
（a）以下をコードする1つまたは複数の核酸を提供する段階：
i.（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVHまたはVL、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含む、第1のポリペプチド；
ii.（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第2のポリペプチド；
iii.（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVHまたはVL、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含む、第3のポリペプチド；
iv.（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第4のポリペプチド；ならびに
v.（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVHまたはVL、任意で軽鎖定常領域（CL）を含む、第5のポリペプチド；
（b）（a）で生成した1つまたは複数の核酸を宿主細胞に導入する段階；
（c）（i）～（v）におけるポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養する段階；ならびに
（d）段階（c）で培養した細胞の培養液から（i）～（v）における5つのポリペプチドを含む多重特異性抗原結合分子を収集する段階
を含み；かつ
任意で（iv）～（v）におけるポリペプチドは同一であり；かつ
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み、好ましくは、該少なくとも1つのシステインは、CH1領域内に位置しており；該少なくとも1つのシステイン残基は、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき；
該方法は、調製物を還元試薬と接触させる段階を含む。
ある局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成できる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含む。
ある局面において、方法は、CH1領域（EUナンバリングによる191位）におけるシステインに1つまたは複数のジスルフィド結合を形成させる還元条件下で、段階（d）から収集した多重特異性抗原結合分子（多重特異性抗原結合分子）調製物を還元試薬と接触させる段階（e）をさらに含む。
ある局面において、（還元剤と接触させる前の）段階（d）から収集した多重特異性抗原結合分子調製物は、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合だけ異なっている2つ以上の構造アイソフォームを含み、かつ還元剤と接触させる段階（e）は、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子構造アイソフォームの集団を優先的に濃縮するかまたは増加させる。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子と接触させる還元試薬のpHは約3から約10である。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子と接触させる還元試薬のpHは約6、7、または8である。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子と接触させる還元試薬のpHは約7である。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子と接触させる還元試薬のpHは約3である。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子と接触させる還元試薬のpHは約6、7、または8である。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子と接触させる還元試薬のpHは約7である。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子と接触させる還元試薬のpHは約3である。
ある局面において、還元剤は、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、およびNa2SO3からなる群より選択される。
ある局面において、還元剤はTCEP、好ましくは0.25 mM TCEPである。
ある局面において、還元剤はTCEP、好ましくは0.25 mM TCEPである。
ある局面において、還元剤の濃度は約0.01 mMから約100 mMである。
ある局面において、還元剤の濃度は、約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mM、好ましくは約0.25 mMである。
ある局面において、還元剤の濃度は、約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mM、好ましくは約0.25 mMである。
ある局面において、接触させる段階は、少なくとも30分間にわたって実施される。
ある局面において、接触させる段階は、約10分間から約48時間にわたって実施される。
ある局面において、接触させる段階は、約2時間または約18時間にわたって実施される。
ある局面において、接触させる段階は、約4℃から37℃の温度で、好ましくは23℃から25℃で実施される。
ある局面において、接触させる段階は、約10分間から約48時間にわたって実施される。
ある局面において、接触させる段階は、約2時間または約18時間にわたって実施される。
ある局面において、接触させる段階は、約4℃から37℃の温度で、好ましくは23℃から25℃で実施される。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子は、還元剤と接触させる段階の前に少なくとも部分的に精製される。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子は、接触させる段階の前にアフィニティクロマトグラフィー（好ましくはプロテインAクロマトグラフィー）によって部分的に精製される。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子は、接触させる段階の前にアフィニティクロマトグラフィー（好ましくはプロテインAクロマトグラフィー）によって部分的に精製される。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子の濃度は、約0.1 mg/mlから約50 mg/mlまたはそれを上回る。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子の濃度は約10 mg/mlまたは約20 mg/mlである。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子の濃度は約10 mg/mlまたは約20 mg/mlである。
ある局面において、方法は、好ましくは透析またはバッファー交換によって好ましくは還元剤を除去することによって、システインジスルフィド結合の再酸化を促進する段階をさらに含む。
ある局面において、第3の抗原結合部分は従来型のFabであり、かつ
（a）第1のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（b）第2のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
（c）第3のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（d）第4のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；かつ
（e）第5のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む。
（a）第1のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（b）第2のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
（c）第3のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（d）第4のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；かつ
（e）第5のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む。
ある局面において、第3の抗原結合部分は、（Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されている）VH/VLクロスオーバーFabであり、かつ
（a）第1のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVL、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（b）第2のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVH、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
（c）第3のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（d）第4のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；かつ
（e）第5のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む。
（a）第1のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVL、重鎖定常領域（CH1）；および第1の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（b）第2のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第3の抗原結合部分のVH、および軽鎖定常領域（CL）を含み；
（c）第3のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVH、重鎖定常領域（CH1）；および任意でヒンジ領域および/またはFc領域（CH2およびCH3）を含み；
（d）第4のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第2の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含み；かつ
（e）第5のポリペプチドは、（N末端からC末端へ）第1の抗原結合部分のVL、および軽鎖定常領域（CL）を含む。
ある局面において、第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれのCLにおいて、123位および124位にあるアミノ酸はそれぞれ、アルギニン（R）およびリジン（K）であり（Kabatによるナンバリング）、かつ第1のおよび第2の抗原結合部分のそれぞれの重鎖の定常ドメインCH1において、147位および213位にあるアミノ酸はグルタミン酸（E）である（EUナンバリングによるナンバリング）。
ある局面において、段階（a）（i）において、第1のポリペプチドは、第3の抗原結合部分と第1の抗原結合部分のVHまたはVLとの間に、ペプチドリンカーをさらに含む。
ある局面において、ペプチドリンカーは、配列番号：248、配列番号：249、または配列番号：259のアミノ酸配列からなる群より選択される。
ある局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137の両方に同時には結合しない。
ある局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分はそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
ある局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分はそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域.
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域.
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む、抗体可変領域を含む。
ある局面において、第3の抗原結合部分は、DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる。
ある局面において、DLL3に結合できる第3の抗原結合部分は、配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および配列番号：239の軽鎖CDR 3を含む抗体可変領域を含む。
ある局面において、DLL3に結合できる第3の抗原結合部分は、配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体可変領域を含む。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子はFcドメインをさらに含む。
ある局面において、Fcドメインは、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、該Fcドメインは、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す。
ある局面において、多重特異性抗原結合分子は、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み；かつ
好ましくは、該5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）は、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している。
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み；かつ
好ましくは、該5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）は、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している。
ある局面において、第4のポリペプチド（鎖4）および第5のポリペプチド（鎖5）は同一である。
ある局面において、1つの核酸のみ、または2、3、4もしくは5つの異なる核酸が、第1の、第2の、第3の、第4のおよび第5のポリペプチドをコードしかつ発現する。
還元試薬との接触
「接触させる」は、溶液中でそれに供すること、曝露することを意味する。抗体、タンパク質、またはポリペプチドは、固体支持体（例えば、アフィニティカラムまたはクロマトグラフィーマトリックス）に結合させた状態で、還元試薬を接触させることができる。好ましくは、溶液は緩衝化される。望ましい立体構造を有する抗体/タンパク質の収量を最大化するために、溶液のpHは、抗体/タンパク質の安定性を保護し、ジスルフィド交換を最適化するように選択される。本発明の実施において、溶液のpHは好ましくは強酸性ではない。よって、一部のpH範囲はpH 5を上回り、好ましくは約pH 6から約pH 11、より好ましくは約pH 7から約pH 10、さらにより好ましくは約pH 6から約pH 8である。本発明の1つの非限定的な態様において、最適なpHは約pH 7であることが見出された。しかしながら、本発明の特定の態様での最適pHは、当業者によって実験的に容易に決定することができる。
以下の理論に拘束されることを望むものではないが、UnLINCフォーマット（すなわち、操作されたジスルフィド結合または「対をなすシステイン」を有さない三価 1＋2抗体）の存在は、対をなさないCys残基を「キャップ」してLINC形成（操作されたジスルフィド結合の形成）を妨げるシステイン化（cysteinylation）およびグルタチオン化（glutathionylation）など、遊離チオール基を含有する分子とジスルフィド結合を多くの場合形成する、対をなさないCys残基に起因する可能性があると考えられる。図2（b）に示されるように、対をなさないシステインのキャップされた分子を除去するために、還元剤は表面システインの脱キャップを助けることができ、脱キャップされた抗体のさらなる再酸化（例えば、バッファー交換による還元試薬の除去）は、LINC形成のための脱キャップされたシステイン間のジスルフィド結合形成を促進することができる。したがって、還元および再酸化によるUnLINCフォーマットにおける対をなさないスルフヒドリルからのシステイン化の除去は、UnLINCフォーマットを除去し、抗体の均一性を向上させることができる。
「接触させる」は、溶液中でそれに供すること、曝露することを意味する。抗体、タンパク質、またはポリペプチドは、固体支持体（例えば、アフィニティカラムまたはクロマトグラフィーマトリックス）に結合させた状態で、還元試薬を接触させることができる。好ましくは、溶液は緩衝化される。望ましい立体構造を有する抗体/タンパク質の収量を最大化するために、溶液のpHは、抗体/タンパク質の安定性を保護し、ジスルフィド交換を最適化するように選択される。本発明の実施において、溶液のpHは好ましくは強酸性ではない。よって、一部のpH範囲はpH 5を上回り、好ましくは約pH 6から約pH 11、より好ましくは約pH 7から約pH 10、さらにより好ましくは約pH 6から約pH 8である。本発明の1つの非限定的な態様において、最適なpHは約pH 7であることが見出された。しかしながら、本発明の特定の態様での最適pHは、当業者によって実験的に容易に決定することができる。
以下の理論に拘束されることを望むものではないが、UnLINCフォーマット（すなわち、操作されたジスルフィド結合または「対をなすシステイン」を有さない三価 1＋2抗体）の存在は、対をなさないCys残基を「キャップ」してLINC形成（操作されたジスルフィド結合の形成）を妨げるシステイン化（cysteinylation）およびグルタチオン化（glutathionylation）など、遊離チオール基を含有する分子とジスルフィド結合を多くの場合形成する、対をなさないCys残基に起因する可能性があると考えられる。図2（b）に示されるように、対をなさないシステインのキャップされた分子を除去するために、還元剤は表面システインの脱キャップを助けることができ、脱キャップされた抗体のさらなる再酸化（例えば、バッファー交換による還元試薬の除去）は、LINC形成のための脱キャップされたシステイン間のジスルフィド結合形成を促進することができる。したがって、還元および再酸化によるUnLINCフォーマットにおける対をなさないスルフヒドリルからのシステイン化の除去は、UnLINCフォーマットを除去し、抗体の均一性を向上させることができる。
用語「還元試薬」と「還元剤」は互換的に用いられる。いくつかの態様において、前記還元剤は遊離チオールである。還元試薬は好ましくは、グルタチオン（GSH）、ジチオスレイトール（DTT）、2-メルカプトエタノール、2-アミノエタンチオール（2-MEA）、TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）、ジチオニトロベンゾアート、システイン、およびNa2SO3からなる群からの化合物で構成される。いくつかの態様において、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、またはNa2SO3を用いることができる。いくつかの好ましい態様において、2-MEAを用いることができる。いくつかの好ましい態様において、TCEPを用いることができる。
還元剤は、組換えタンパク質を生成する細胞を増殖させる発酵培地に加えられてもよい。追加の態様において、還元剤は、組換えタンパク質を分離するためのLC分離段階時にLC移動相に加えられてもよい。ある特定の態様において、タンパク質はLCカラムの固定相に固定化され、還元剤は移動相の一部である。特定の態様において、未処理のIgG抗体は、ピークの数によって示される不均一な混合物として溶出され得る。還元/酸化カップリング試薬の使用は、より単純かつより均一なピークパターンを生じさせる。関心対象のこのより均一なピークは、IgGのより均一な調製物として単離され得ることが企図される。
還元剤は、望ましい立体構造（例えば、抗体の2つのFab間、例えばヒンジ領域内にないアミノ酸残基間に形成される1つまたは複数の操作されたジスルフィド結合を有する「対をなすシステイン」形態の抗体）の相対的割合を増加させるのに十分な濃度で存在する。還元剤の最適絶対濃度およびモル比は、総IgGおよび一部の状況では特定のIgGサブクラスの濃度によって決まる。IgG1分子を調製するのに用いる場合、それは、タンパク質中の対をなさないシステインの数およびアクセスし易さによっても決まる。一般に、還元剤からの遊離チオールの濃度は、約0.05 mMから約100 mM、より好ましくは約0.1 mMから約50 mM、さらにより好ましくは約0.2 mMから約20 mMであり得る。いくつかの好ましい態様において、還元剤の濃度は、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mMである。いくつかの好ましい態様において、0.05 mMから1 mMの2-MEAを用いることができる。いくつかの好ましい態様において、0.01 mMから25 mM TCEPを用いることができる。
組換えタンパク質の調製物と還元剤との接触は、望ましい立体構造の相対的割合を増加させるのに十分な時間にわたって実施される。割合の任意の相対的増加が望ましく、例えば、望ましくない立体構造を有するタンパク質の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、さらには80％、または90％が、望ましい立体構造を有するタンパク質に変換されることが含まれる。接触は、タンパク質を生じさせる発酵培地に還元剤を提供することによって実施されてもよい。あるいは、接触は、それを生じさせる細胞培養物からのタンパク質の部分精製時に行われる。さらに他の態様において、接触は、タンパク質がクロマトグラフィーカラムから溶出された後だが、さらなる処理の前に実施される。本質的には、接触は、抗体の調製、精製、保存、または製剤時の任意の段階で実施され得る。いくつかの態様において、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、プロテインAクロマトグラフィー）による部分精製は、接触の前に実行され得る。
接触は、クロマトグラフィーカラムの固定相に付着させた抗体により実施されてもよく、還元剤は移動相の一部である；この場合、接触は、クロマトグラフィー精製手法の一部として実施され得る。代表的なクロマトグラフィーリフォールディングプロセスの例としては、サイズ排除（SEC）；プロテインAカラム上での可逆的吸着時の溶媒交換；疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）；固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）；逆相クロマトグラフィー（RPC）；固定化フォールディング触媒、例えば、GroE1、GroES、またはフォールディング特性を有する他のタンパク質の使用が挙げられ得る。オンカラムリフォールディングは、市販の調製用クロマトグラフィーシステムを用いて容易に自動化されることから、魅力的である。微生物細胞で生成される組換えタンパク質のカラム上でのリフォールディングが（Li et al., 2004）において最近概説された。
接触させる段階が 組換えタンパク質の部分的にまたは高度に精製された調製物に対して実施される場合、接触させる段階は、短くて約1時間から約4時間、かつ長くて約6時間から約4日間にわたって実施され得る。約2から約48時間、または約16時間の接触させる段階がうまく機能することが見出された。接触させる段階はまた、別の段階時に、例えば、濾過または精製における任意の他の段階時に固相上で、行われ得る。
本発明の方法は、広い温度範囲にわたって実施することができる。例えば、本発明の方法は、約4℃から約37℃の温度で成功裏に行われているが、最良の結果はより低い温度で達成された。組換えタンパク質の部分的にまたは完全に精製された調製物を接触させるための典型的な温度は約4℃から約25℃（周囲温度）、または好ましくは23℃だが、より低い温度およびより高い温度でも実施することができる。
加えて、方法は高圧で実施され得ることが企図される。これまでに、1 Mを下回る低い非変性濃度の塩酸グアニジンと組み合わせた、高い静水圧（1000～2000バール）が、ヒト成長ホルモンおよびリゾチーム、ならびにb-ラクタマーゼを含んだ封入体として大腸菌によって生成された複数の変性タンパク質を脱凝集（可溶化）およびリフォールディングするために用いられている（St John et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:13029-13033（1999））。b-ラクタマーゼは、GdmHClの添加がない場合にも、高収量の活性タンパク質でリフォールディングされた。別の試験（Seefeldt et al., Protein Sci, 13:2639-2650 (2004)）では、2000バールでの高圧調節リフォールディングで得られた、哺乳動物細胞で生成したタンパク質ビクニンのリフォールディング収量は、RP HPLCで70％であり、典型的な塩酸グアニジン「希釈リフォールディング」で得られた55％の値（RP-HPLCによる）より有意に高かった。これらの知見は、高い静水圧は、分子間および分子内相互作用の破壊を促進し、タンパク質のアンフォールディングおよび脱凝集をもたらすことを示す。タンパク質に対する高圧の相互作用は、タンパク質とカオトロピック剤との相互作用に似ている。したがって、本発明の方法では、タンパク質アンフォールディングのために、カオトロピック剤を用いる代わりに高圧を用いることが企図される。もちろん、高圧とカオトロピック剤との組み合わせもまた、一部の例において用いられ得る。
組換え抗体/タンパク質の調製物は、必要に応じて、種々の量で還元剤と接触させることができる。例えば、本発明の方法は、分析的実験スケール（1～50 mL）、調製スケール（50 mL～10 L）、および製造スケール（10 L以上）で成功裏に実施されている。本発明の方法は、小規模および大規模の両方で再現性をもって実施することができる。したがって、抗体の濃度は、工業量（グラムの重さ単位）（例えば、工業量の特定のIgG）であり得るか、あるいはミリグラム量であり得る。特定の態様において、反応混合物における組換え抗体の濃度は、約1 mg/mlから約50 mg/ml、より具体的には、10 mg/ml、15 mg/ml、または20 mg/mlである。これらの濃度での組換えIgG1分子が特に企図される。
ある特定の態様において、還元剤を含有する培地を用いて生成されたタンパク質は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、尿素、または塩酸グアニジウム（GuHCl）などのカオトロピック変性剤を利用する分離処理段階でさらに処理される。検知できるアンフォールディングを観察するためには、相当量のカオトロピック剤が必要とされる。いくつかの態様において、処理段階は、0.1 Mから2 Mの塩酸グアニジンの使用と同等の効果を生じさせる、0.1 Mから2 Mの間のカオトロープを用いる。特定の態様において、酸化的リフォールディングは、およそ1.0 M塩酸グアニジン、または1 M塩酸グアニジンと同じまたは同様の量のリフォールディングを生じさせる量の他のカオトロピック剤の存在下で達成される。いくつかの態様において、方法は約1.5 Mから0.5 Mの間のカオトロープを用いる。用いられるカオトロピック剤の量は、該カオトロープの存在下でのタンパク質の構造的安定性に基づく。タンパク質のドメイン相互作用の局所的な三次構造および/または四次構造を乱すのに十分だが、分子および/または個々のドメインの二次構造を完全にアンフォールドするのに必要とされるものより少ない、カオトロープを存在させる必要がある。タンパク質が平衡変性によってアンフォールドし始めるポイントを決定するために、当業者は、タンパク質を含有する溶液にカオトロープを滴定し、円偏光二色性または蛍光などの技術によって構造をモニターし得る。カオトロープの代わりに用いられ得る、タンパク質の構造をアンフォールドするかまたはわずかに乱すために用いることができる他のパラメーターが存在する。温度および圧力は、タンパク質の構造を変化させるためにこれまでに用いられている2つの基本的パラメーターであり、酸化還元剤と接触させる間にカオトロピック剤の代わりに用いられ得る。本発明者らは、タンパク質の構造を変性させるまたは乱すことが示されている任意のパラメーターが、カオトロピック剤の代わりに当業者によって用いられ得ることを企図する。
ジスルフィド交換は、当業者に公知の任意の方法でクエンチすることができる。例えば、精製段階を通じて、還元剤を除去してもよくもしくはその濃度を低下させてもよい、および/または、例えば溶液を酸性化することによって、それを化学的に不活性化してもよい。典型的には、反応が酸性化によってクエンチされる場合、還元剤を含有する溶液のpHは、pH 7未満に引き下げられる。いくつかの態様において、pHはpH 6未満に引き下げられる。一般に、pHは、約pH 2から約pH 6の間にまで下げられる。
いくつかの態様において、還元剤の除去は、透析、バッファー交換、または本明細書に記載される任意のクロマトグラフィー法によって実行され得る。
優先的濃縮（または増加）
用語「優先的に濃縮させる（または増加させる）」は、望ましい形態の相対的存在量の増加、または望ましい形態の相対的割合の増加、または望ましい形態（構造アイソフォーム）の集団の増加を意味する。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、抗体の構造アイソフォーム、例えば、ヒンジ領域外のアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する抗体などの相対的存在量を増加させる。1つの態様において、前記少なくとも1つのジスルフィド結合は、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基間に形成される。ある特定の態様において、前記方法は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、好ましくは少なくとも95％のモル比の、ヒンジ領域外に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する前記抗体を有する、均一な抗体調製物を製造する。
用語「優先的に濃縮させる（または増加させる）」は、望ましい形態の相対的存在量の増加、または望ましい形態の相対的割合の増加、または望ましい形態（構造アイソフォーム）の集団の増加を意味する。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、抗体の構造アイソフォーム、例えば、ヒンジ領域外のアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する抗体などの相対的存在量を増加させる。1つの態様において、前記少なくとも1つのジスルフィド結合は、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基間に形成される。ある特定の態様において、前記方法は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、好ましくは少なくとも95％のモル比の、ヒンジ領域外に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する前記抗体を有する、均一な抗体調製物を製造する。
均一性
抗体の「均一な」集団は、主に単一形態の抗体を含む抗体集団を意味し、例えば、溶液または組成物中の少なくとも50％、60％、70％、80％またはそれを上回る、好ましくは少なくとも90％、95％、96％、97％、99％、または100％の抗体が、適正にフォールディングされた形態をとる。同様に、ヒンジ領域外に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する抗体の「均一な」集団は、主に単一の適正にフォールディングされた形態を含む前記抗体の集団、例えば、少なくとも50％、60％、70％、80％またはそれを上回る、好ましくは少なくとも90％、95％、96％、97％、99％、または100％のモル比の、ヒンジ領域外に形成された少なくとも1つのジスルフィド結合を有する前記抗体を意味する。1つの好ましい態様において、抗体の前記「均一な」集団は、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基（すなわち、CH1領域におけるEUナンバーによる191位にある「対をなすシステイン」）間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。
抗体の「均一な」集団は、主に単一形態の抗体を含む抗体集団を意味し、例えば、溶液または組成物中の少なくとも50％、60％、70％、80％またはそれを上回る、好ましくは少なくとも90％、95％、96％、97％、99％、または100％の抗体が、適正にフォールディングされた形態をとる。同様に、ヒンジ領域外に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する抗体の「均一な」集団は、主に単一の適正にフォールディングされた形態を含む前記抗体の集団、例えば、少なくとも50％、60％、70％、80％またはそれを上回る、好ましくは少なくとも90％、95％、96％、97％、99％、または100％のモル比の、ヒンジ領域外に形成された少なくとも1つのジスルフィド結合を有する前記抗体を意味する。1つの好ましい態様において、抗体の前記「均一な」集団は、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインの各々のCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基（すなわち、CH1領域におけるEUナンバーによる191位にある「対をなすシステイン」）間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。
好ましい態様において、本発明の方法は、本明細書において記載される段階によって、均一な抗体集団または均一な抗体調製物を産生する。
抗体集団が均一であるかどうか、および混合物中のタンパク質/抗体の立体構造の相対的な存在量または割合の決定は、種々の分析技術および/または定性技術のいずれかを用いて行うことができる。2つの立体構造が分離技術、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、または他の精製技術の間に異なって分離される場合、混合物中の立体構造の相対的割合は、そのような精製技術を用いて決定することができる。例えば、組換えIgGの少なくとも2つの異なる立体構造は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離することができる。さらに、遠紫外域円偏光二色性はタンパク質の二次構造の構成を推定するために用いられている（Perczel et al., 1 991, Protein Engrg. 4:669-679）ことから、そのような技術は、タンパク質の代替立体構造が存在するかどうかを決定することができる。立体構造を決定するのに用いられるさらに別の技術は、トリプトファンおよびチロシン蛍光に割り当て可能な、三次構造における相補的な相違を確認するために利用することができる蛍光分光法である。立体構造の相違、その結果、立体構造の相対的割合を決定するために用いることができる他の技術は、凝集状態を測定するためのオンラインSEC、融解転移（Tm）および成分エンタルピーを測定するための示差走査熱量測定、およびカオトロープアンフォールディングである。立体構造の相違、その結果、立体構造の相対的割合を決定するために用いることができるさらに別の技術は、タンパク質の不均一性を決定するためのLC/MS検出である。
あるいは、抗体/タンパク質の立体構造間で活性の相違が存在する場合、混合物中の立体構造の相対的割合の決定は、活性アッセイ（例えば、リガンドへの結合、酵素活性、生物学的活性等）によって行うことができる。タンパク質の生物学的活性もまた、用いることができる。あるいは、活性単位/ mgタンパク質として活性が表される結合アッセイを用いることができる。
本明細書において下記に詳細に記載されるいくつかの態様において、本発明は、IECクロマトグラフィーを用いて、抗体/タンパク質の不均一性を決定する。そのような場合では、抗体は、精製されるか、または他のポリペプチドに対応するポリペプチドのピークまたは画分がIECクロマトグラフィーによる分析時に検出されないことを意味する、「均一」であるとみなされる。ある特定の態様において、抗体は、精製されるか、または「均一」であるとみなされ、その場合、他のポリペプチドに対応するポリペプチドのバンドがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による分析時に検出されない。関連する分野にける当業者は、差次的なグリコシル化および差次的な翻訳後プロセシング等に起因して、ポリペプチドに対応する複数のバンドがSDS-PAGEによって可視化できることを認識している。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、SDS-PAGEによる分析時に単一のポリペプチドのバンドによって示されるように、実質的に均一に精製される。ポリペプチドのバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色、および/または（ポリペプチドが放射標識される場合には）オートラジオグラフィーによって可視化できる。
本明細書において、SDS-PAGE分析の条件の例は以下のとおりである。非還元SDS-PAGEを、4～20％ Mini-PROTEAN（登録商標）TGX Stain-Free(商標)Precast Gels（Bio-Rad）を1×Tris/グリシン/SDSランニングバッファー（Bio-Rad）と共に用いて実施した。モノクローナル抗体試料を70℃にて10分間加熱した。0.2マイクログラムをロードし、電気泳動を200 Vにて90分間実行した。タンパク質をChemidoc Imaging System（Bio-Rad）で可視化した。個々のバンドのパーセンテージを、Image Labソフトウェアバージョン6.0（Bio-Rad）によって分析し、個々のバンド（例えば、早い泳動（下側のバンド）および遅い泳動（上側のバンド））の％強度を、バンドの強度をこれら2つのバンドの合計で割ることによって算出した。次に、ゲルをCBBで染色してもよく、ゲル画像を取り込んでもよく、バンドを画像化デバイスを用いて定量化してもよい。ゲル画像において、複数、例えば2本のバンド、すなわち、「上側のバンド」および「下側のバンド」が、抗体バリアント試料で観察されてもよい。この場合では、上側のバンドの分子量は、親抗体（改変前）のものに対応し得る。Fabのジスルフィド結合を介する架橋形成などの構造変化がシステイン置換によって引き起こされる可能性があり、これは電気泳動移動度の変化をもたらし得る。この場合では、下側のバンドは、CH1領域間に形成される1つまたは複数の操作されたジスルフィド結合を有する抗体に対応するとみなされ得る。追加のシステイン置換を有する抗体バリアント試料は、対照試料と比較して、高い上側のバンドに対する下側バンドの比率を示し得る。追加のシステイン残基は、Fabのジスルフィド結合架橋形成を増強/促進し得；変異位置に形成される操作されたジスルフィド結合を有する抗体調製物のパーセンテージまたは構造均一性を増加させ得；変異位置に形成される操作されたジスルフィド結合を有さない抗体調製のパーセンテージを減少させ得る。
抗体調製物から標的抗体を捕捉および/または除去するための方法
本開示は、抗体調製物から標的抗体を捕捉および/または除去するための方法を提供する。
ある局面において、本開示は、以下の段階：
a）標的抗体を含む抗体調製物を、支持体上に固定化された抗原結合分子と接触させる段階；および
b）抗原結合分子への特異的結合によって標的抗体を捕捉させる段階
を含む、抗体調製物から標的抗体を捕捉および/または除去するための方法であって、
該抗体が、IgG（好ましくはヒトIgGまたはヒトIgG1）由来の少なくとも 2つのFabを含み、かつ該抗体調製物が、CH1ドメインで2つのFab間で形成されるジスルフィド結合だけ異なっている、2つの抗体構造アイソフォームを含み；かつ
該抗原結合分子が、ジスルフィド結合を含まない標的抗体に特異的に結合し、それを捕捉する、
前記方法を提供する。
本開示は、抗体調製物から標的抗体を捕捉および/または除去するための方法を提供する。
ある局面において、本開示は、以下の段階：
a）標的抗体を含む抗体調製物を、支持体上に固定化された抗原結合分子と接触させる段階；および
b）抗原結合分子への特異的結合によって標的抗体を捕捉させる段階
を含む、抗体調製物から標的抗体を捕捉および/または除去するための方法であって、
該抗体が、IgG（好ましくはヒトIgGまたはヒトIgG1）由来の少なくとも 2つのFabを含み、かつ該抗体調製物が、CH1ドメインで2つのFab間で形成されるジスルフィド結合だけ異なっている、2つの抗体構造アイソフォームを含み；かつ
該抗原結合分子が、ジスルフィド結合を含まない標的抗体に特異的に結合し、それを捕捉する、
前記方法を提供する。
ある局面において、抗原結合分子は、標的抗体がジスルフィド結合を有さない時にだけ抗原結合分子にアクセスできるエピトープで標的抗体に結合する。
ある局面において、ジスルフィド結合は、CH1ドメインにおけるEUナンバリングによる191位で抗体の2つのFab間に形成されるジスルフィド結合である。
ある局面において、標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子は、以下：
（a1）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：182の軽鎖CDR 1、配列番号：186の軽鎖CDR 2、および配列番号：190の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：183の軽鎖CDR 1、配列番号：187の軽鎖CDR 2、および配列番号：191の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：184の軽鎖CDR 1、配列番号：188の軽鎖CDR 2、および配列番号：192の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：169の重鎖CDR 1、配列番号：173の重鎖CDR 2、配列番号：177の重鎖CDR 3、配列番号：185の軽鎖CDR 1、配列番号：189の軽鎖CDR 2、および配列番号：193の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：115の軽鎖CDR 1、配列番号：124の軽鎖CDR 2、および配列番号：134の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：116の軽鎖CDR 1、配列番号：125の軽鎖CDR 2、および配列番号：135の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：118の軽鎖CDR 1、配列番号：128の軽鎖CDR 2、および配列番号：137の軽鎖CDR 3；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択させるいずれか1つを含む抗体である。
（a1）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：182の軽鎖CDR 1、配列番号：186の軽鎖CDR 2、および配列番号：190の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：183の軽鎖CDR 1、配列番号：187の軽鎖CDR 2、および配列番号：191の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：184の軽鎖CDR 1、配列番号：188の軽鎖CDR 2、および配列番号：192の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：169の重鎖CDR 1、配列番号：173の重鎖CDR 2、配列番号：177の重鎖CDR 3、配列番号：185の軽鎖CDR 1、配列番号：189の軽鎖CDR 2、および配列番号：193の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：115の軽鎖CDR 1、配列番号：124の軽鎖CDR 2、および配列番号：134の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：116の軽鎖CDR 1、配列番号：125の軽鎖CDR 2、および配列番号：135の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：118の軽鎖CDR 1、配列番号：128の軽鎖CDR 2、および配列番号：137の軽鎖CDR 3；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択させるいずれか1つを含む抗体である。
ある局面において、標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子は、以下：
（a1）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：178のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：179のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：180のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：181のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む抗体である。
（a1）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：178のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：179のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：180のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：181のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む抗体である。
ある局面において、標的抗体は、以下の（a1）～（a15）：
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、
好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）は、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している。
（a1）配列番号：201のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：208のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a2）配列番号：203のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a3）配列番号：204のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a4）配列番号：205のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：209のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a5）配列番号：216のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：229のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a6）配列番号：217のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：210のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a7）配列番号：219のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a8）配列番号：220のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a9）配列番号：221のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：211のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a10）配列番号：222のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：230のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：214のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a11）配列番号：223のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：212のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a12）配列番号：225のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a13）配列番号：226のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；
（a14）配列番号：227のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：213のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）；ならびに
（a15）配列番号：228のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖1）、配列番号：206のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖2）、配列番号：231のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖（鎖3）、および配列番号：215のアミノ酸配列をそれぞれが含む2本のポリペプチド鎖（鎖4＆鎖5）
から選択される組み合わせのいずれか1つにおける5本のポリペプチド鎖を含み、
好ましくは、5本のポリペプチド鎖（鎖1から鎖5）は、図1（a）に示す配向に従って相互に接続および/または会合している。
立体構造特異的抗体
本開示は、標的抗体が、例えばCH1領域に、2つのFab間に操作されたジスルフィド結合を有さない時（「対をなさないシステイン」形態）にのみ標的抗体に特異的に結合する立体構造特異的抗体を提供する。ある局面において、例えば、操作されたジスルフィド結合によって引き起こされる2つのFab間の立体障害または短い距離に起因して、標的抗体が、操作されたジスルフィド結合を有する（「対をなすシステイン」形態）時には、エピトープは立体構造特異的抗体にアクセスできない。
本開示は、標的抗体が、例えばCH1領域に、2つのFab間に操作されたジスルフィド結合を有さない時（「対をなさないシステイン」形態）にのみ標的抗体に特異的に結合する立体構造特異的抗体を提供する。ある局面において、例えば、操作されたジスルフィド結合によって引き起こされる2つのFab間の立体障害または短い距離に起因して、標的抗体が、操作されたジスルフィド結合を有する（「対をなすシステイン」形態）時には、エピトープは立体構造特異的抗体にアクセスできない。
ある局面において、立体構造特異的抗体（標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子）は、以下：
（a1）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：182の軽鎖CDR 1、配列番号：186の軽鎖CDR 2、および配列番号：190の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：183の軽鎖CDR 1、配列番号：187の軽鎖CDR 2、および配列番号：191の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：184の軽鎖CDR 1、配列番号：188の軽鎖CDR 2、および配列番号：192の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：169の重鎖CDR 1、配列番号：173の重鎖CDR 2、配列番号：177の重鎖CDR 3、配列番号：185の軽鎖CDR 1、配列番号：189の軽鎖CDR 2、および配列番号：193の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：115の軽鎖CDR 1、配列番号：124の軽鎖CDR 2、および配列番号：134の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：116の軽鎖CDR 1、配列番号：125の軽鎖CDR 2、および配列番号：135の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：118の軽鎖CDR 1、配列番号：128の軽鎖CDR 2、および配列番号：137の軽鎖CDR 3；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む。
（a1）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：182の軽鎖CDR 1、配列番号：186の軽鎖CDR 2、および配列番号：190の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：183の軽鎖CDR 1、配列番号：187の軽鎖CDR 2、および配列番号：191の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：184の軽鎖CDR 1、配列番号：188の軽鎖CDR 2、および配列番号：192の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：169の重鎖CDR 1、配列番号：173の重鎖CDR 2、配列番号：177の重鎖CDR 3、配列番号：185の軽鎖CDR 1、配列番号：189の軽鎖CDR 2、および配列番号：193の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：166の重鎖CDR 1、配列番号：170の重鎖CDR 2、配列番号：174の重鎖CDR 3、配列番号：115の軽鎖CDR 1、配列番号：124の軽鎖CDR 2、および配列番号：134の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：167の重鎖CDR 1、配列番号：171の重鎖CDR 2、配列番号：175の重鎖CDR 3、配列番号：116の軽鎖CDR 1、配列番号：125の軽鎖CDR 2、および配列番号：135の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：168の重鎖CDR 1、配列番号：172の重鎖CDR 2、配列番号：176の重鎖CDR 3、配列番号：118の軽鎖CDR 1、配列番号：128の軽鎖CDR 2、および配列番号：137の軽鎖CDR 3；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む。
ある局面において、立体構造特異的抗体（標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子）は、以下：
（a1）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：178のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：179のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：180のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：181のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む。
（a1）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：178のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：179のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：180のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：181のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の同じエピトープに結合する抗体；ならびに
（a9）（a1）～（a7）のいずれか1つを含む抗体の結合と競合する抗体
からなる群より選択されるいずれか1つを含む。
ある局面において、立体構造特異的抗体（標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子）は、ヒトIgG1のCH1に特異的に結合する。
ある局面において、立体構造特異的抗体（標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子）は、ジスルフィド結合がヒトIgG1の2つのFabのCH1ドメイン間に形成される時に、ヒトIgG1のCH1に特異的に結合しない。さらなる局面において、ジスルフィド結合は、CH1ドメインにおけるEUナンバリングによる191位にあるIgG1の2つのFab間に形成されるジスルフィド結合である。
ある局面において、立体構造特異的抗体（標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子）は、ヒトIgG4のCH1に結合しない。
ある局面において、立体構造特異的抗体（標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子）は、ジスルフィド結合がヒトIgG1の2つのFabのCH1ドメイン間に形成される時に、ヒトIgG1のCH1に特異的に結合しない。さらなる局面において、ジスルフィド結合は、CH1ドメインにおけるEUナンバリングによる191位にあるIgG1の2つのFab間に形成されるジスルフィド結合である。
ある局面において、立体構造特異的抗体（標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子）は、ヒトIgG4のCH1に結合しない。
本開示は、抗体含有試料の精製、分析、または定量化における立体構造特異的抗体（標的抗体に特異的に結合する抗原結合分子）の使用を提供する。
抗原
本明細書で用いられる用語「抗原」は、抗原結合部分が結合するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、連続した一続きのアミノ酸、または非連続アミノ酸の別々の領域から構成される立体構造）を指し、抗原結合部分-抗原複合体を形成する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離した状態で、および/または細胞外基質（ECM）中に見出すことができる。
本明細書で用いられる用語「抗原」は、抗原結合部分が結合するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、連続した一続きのアミノ酸、または非連続アミノ酸の別々の領域から構成される立体構造）を指し、抗原結合部分-抗原複合体を形成する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離した状態で、および/または細胞外基質（ECM）中に見出すことができる。
第1の抗原結合部分および/または第2の抗原結合部分が結合する「第1の抗原」または「第2の抗原」は好ましくは、例えば、免疫細胞表面分子（例えば、T細胞表面分子、NK細胞表面分子、樹状細胞表面分子、B細胞表面分子、NKT細胞表面分子、MDSC細胞表面分子、およびマクロファージ表面分子）、または腫瘍細胞、腫瘍血管、および間質細胞等だけでなく、正常組織の上にも発現している抗原（インテグリン、組織因子、VEGFR、PDGFR、EGFR、IGFR、METケモカイン受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、CD44、フィブロネクチン、DR5、TNFRSF等）である。
「第1の抗原」および「第2の抗原」の組み合わせとしては、好ましくは、第1の抗原および第2の抗原のいずれか一方は、例えば、T細胞上に特異的に発現している分子であり、もう一方の抗原は、T細胞または任意の他の免疫細胞の表面上に発現している分子である。「第1の抗原」および「第2の抗原」の組み合わせの別の態様において、好ましくは、第1の抗原および第2の抗原のいずれか一方は、例えば、T細胞上に特異的に発現している分子であり、もう一方の抗原は、免疫細胞上に発現している分子であり、かつ予め選択された抗原とは異なっている。
T細胞上に特異的に発現している分子の具体的な例としては、CD3およびT細胞受容体が挙げられる。特に、CD3が好ましい。例えばヒトCD3の場合には、本発明の抗原結合分子が結合するCD3の部位は、ヒトCD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖の配列中に存在する任意のエピトープであり得る。特に、ヒトCD3複合体中のε鎖の細胞外領域中に存在するエピトープが好ましい。CD3を構成するγ鎖、δ鎖、およびε鎖構造のポリヌクレオチド配列は、NM_000073.2、NM_000732.4、およびNM_000733.3であり、かつそのポリペプチド配列は、NP_000064.1、NP_000723.1、およびNP_000724.1（RefSeq登録番号）である。他の抗原の例としては、Fcγ受容体、TLR、レクチン、IgA、免疫チェックポイント分子、TNFスーパーファミリー分子、TNFRスーパーファミリー分子、およびNK受容体分子が挙げられる。
1つの態様において、第1の抗原は、T細胞上に特異的に発現している分子、好ましくはCD3などのT細胞受容体複合体分子、より好ましくはヒトCD3である。別の態様において、第2の抗原は、T細胞または任意の他の免疫細胞上に発現している分子、好ましくは免疫細胞上の細胞表面調節因子、より好ましくはT細胞上に発現している共刺激分子、さらにより好ましくはヒトCD137（4-1BB）、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、およびGITRLを含むがこれに限定されない「TNFスーパーファミリー」または「TNF受容体スーパーファミリー」のタンパク質である。1つの好ましい態様において、第1の抗原はCD3であり、かつ第2の抗原はCD137である。本明細書において、第1の抗原および第2の抗原は互換的に定義される。
本明細書において用語「CD137」は、4-1BBとも呼ばれ、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーである。TNFスーパーファミリーまたはTNF受容体スーパーファミリーに属する因子の例としては、CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、およびGITRLが挙げられる。
本発明のいくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、上述の「第1の抗原」 および「第2の抗原」とは異なる「第3の抗原」に結合する第3の抗原結合部分をさらに含む。本発明の第3の抗原に結合する第3の抗原結合ドメインは、任意の抗原を認識する抗原結合部分であり得る。本発明の第3の抗原に結合する第3の抗原結合部分は、がん組織において特異的に発現している分子を認識する抗原結合部分であり得る。
本発明では、本発明の抗原結合分子における第3の抗原結合部分は、「第1の抗原」 および「第2の抗原」とは異なる「第3の抗原」に結合する。いくつかの態様において、第3の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する。いくつかの態様において、第3の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する細胞または器官上に特異的に発現している分子である。第3の抗原は好ましくは、細胞または器官上に全身的に発現していない分子である。第3の抗原は好ましくは、例えば腫瘍細胞特異的抗原であり、これらには、細胞の悪性化に付随して発現する抗原、ならびに細胞の悪性形質転換時に細胞表面またはタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も含まれる。その具体例としては、ALK受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、KS 1/4膵臓がん抗原、卵巣がん抗原（CA125）、前立腺酸性リン酸（prostatic acid phosphate）、前立腺特異的抗原（PSA）、黒色腫関連抗原p97、黒色腫抗原gp75、高分子量黒色腫抗原（HMW-MAA）、前立腺特異的膜抗原、がん胎児性抗原（CEA）、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原（例えば、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1、およびLEA）、バーキットリンパ腫抗原 38.13、CD19、ヒトBリンパ腫抗原 CD20、CD33、黒色腫特異的抗原（例えば、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、およびガングリオシドGM3）、腫瘍特異的移植抗原（TSTA）、T抗原、ウイルスにより誘導される腫瘍抗原（例えばDNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原）、結腸CEA、がん胎児性抗原α-フェトプロテイン（例えば、がん胎児性栄養膜糖タンパク質 5T4およびがん胎児性膀胱腫瘍抗原）、分化抗原（例えば、ヒト肺がん抗原L6およびL20）、線維肉腫抗原、ヒトT細胞白血病関連抗原 Gp37、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳がん抗原（例えば、EGFR（上皮成長因子受容体））、NY-BR-16、NY-BR-16およびHER2抗原（p185HER2）、多型上皮ムチン（PEM）、悪性ヒトリンパ球抗原 APO-1、分化抗原 例えば、胎児赤血球に認められるI抗原、成人赤血球に認められる初期内胚葉I抗原、移植の前の胚または胃がんに認められるI（Ma）、乳腺上皮に認められるM18、M39、骨髄細胞に認められるSSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸がんに認められるD156-22、TRA-1-85（血液型H）、精巣および卵巣がんに認められるSCP-1、結腸がんに認められるC14、肺がんに認められるF3、胃がんに認められるAH6、Yハプテン、胚性がん細胞に認められるLey、TL5（血液型A）、A431細胞に認められるEGF受容体、膵臓がんに認められるE1シリーズ（血液型B）、胚性がん細胞に認められるFC10.2、胃がん抗原、腺がんに認められるCO-514（血液型Lea）、腺がんに認められるNS-10、CO-43（血液型Leb）、A431細胞のEGF受容体に認められるG49、結腸がんに認められるMH2（血液型ALeb/Ley）、結腸がんに認められる19.9、胃がんムチン、骨髄細胞に認められるT5A7、黒色腫に認められるR24、胚性がん細胞に認められる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8、4細胞期～8細胞期の胚に認められるSSEA-3およびSSEA-4、皮膚T細胞リンパ腫関連抗原、MART-1抗原、シアリルTn（STn）抗原、結腸がん抗原NY-CO-45、肺がん抗原NY-LU-12バリアントA、腺がん抗原 ART1、腫瘍随伴性関連脳-精巣がん抗原（腫瘍神経抗原 MA2および腫瘍随伴性神経抗原）、神経腫瘍学的腹側（neuro-oncological ventral）抗原 2（NOVA2）、血液細胞がん抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原 CO-029、腫瘍関連抗原 MAGE-C1（がん/精巣抗原 CT7）、MAGE-B1（MAGE-XP抗原）、MAGE-B2（DAM6）、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b MAGE-X2、がん-精巣抗原（NY-EOS-1）、YKL-40、ならびにこれらのポリペプチドの任意の断片、ならびにその改変された構造（前述の改変されたリン酸基、糖鎖等）、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、シアリルSSEA-1（SLX）、HER2、PSMA、CEA、ならびにCLEC12Aが挙げられる。
1つの好ましい態様において、第3の抗原はグリピカン-3（GPC3）である。さらに別の態様において、第3の抗原はDLL3（デルタ様3）である。
用語「DLL3」は、本明細書において用いる場合、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然型 DLL3（デルタ様3）を指す。該用語は、プロセシングを受けていない「全長」のDLL3ならびに細胞でのプロセシングによって生じる任意の形態のDLL3を包含する。該用語はまた、DLL3の天然に生じるバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列（RefSeq）NM_016941.3として公知であり、例示的なカニクイザルDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列XP_005589253.1として公知であり、例示的なマウスDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列NM_007866.2として公知である。
用語「DLL3」は、本明細書において用いる場合、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然型 DLL3（デルタ様3）を指す。該用語は、プロセシングを受けていない「全長」のDLL3ならびに細胞でのプロセシングによって生じる任意の形態のDLL3を包含する。該用語はまた、DLL3の天然に生じるバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列（RefSeq）NM_016941.3として公知であり、例示的なカニクイザルDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列XP_005589253.1として公知であり、例示的なマウスDLL3のアミノ酸配列はNCBI参照配列NM_007866.2として公知である。
ヒトDLL3タンパク質は、C末端側に膜貫通（TM）領域および細胞内ドメイン、ならびにN末端側にDSL（Notch）ドメインを含む。加えて、DLL3は、N末端側からC末端側へ6つの領域、EGF1からEGF6を含むEGFドメインを有する。いくつかの態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、細胞外ドメイン（ECD）内、すなわち、N末端からTM領域の直前までだが、TM領域またはC末端細胞内ドメインまでではないドメイン内のエピトープに結合する。本発明の多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、ECD内の上述のドメイン/領域のいずれか内のエピトープに結合し得る。好ましい態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、EGF6からTM領域の直前までの領域内のエピトープに結合する。より具体的には、本発明の多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、ヒトDLL3における配列番号：89で定義される領域内のエピトープに結合し得る。いくつかの態様において、本発明の分子/抗体は、ヒトDLL3のEGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、もしくはEGF6領域、またはEGF6からTM領域の直前までの領域、またはヒトDLL3のEGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、もしくはEGF6領域、またはEGF6からTM領域の直前までの領域内のエピトープに結合する。
ヒトDLL3では、上述のドメイン/領域は、以下のアミノ酸残基（例えば、http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NYJ7またはWO2013/126746を参照）：
細胞外ドメイン（ECD）:1位から492位にあるアミノ酸残基；
DSLドメイン:176位から215位にあるアミノ酸残基；
EGFドメイン:216位から465位にあるアミノ酸残基；
EGF1領域:216位から249位にあるアミノ酸残基；
EGF2領域:274位から310位にあるアミノ酸残基；
EGF3領域:312位から351位にあるアミノ酸残基；
EGF4領域:353位から389位にあるアミノ酸残基；
EGF5領域:391位から427位にあるアミノ酸残基；
EGF6領域:429位から465位にあるアミノ酸残基；
EGF6からTM領域の直前までの領域: 429位から492位にあるアミノ酸残基；
TM領域:493位から513位にあるアミノ酸残基；および
C末端細胞内ドメイン: 516位から618位（または一部のアイソフォームでは516位から587位）にあるアミノ酸残基
を有する。上記に記述されるアミノ酸位置はまた、配列番号：90に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸位置も指す。
細胞外ドメイン（ECD）:1位から492位にあるアミノ酸残基；
DSLドメイン:176位から215位にあるアミノ酸残基；
EGFドメイン:216位から465位にあるアミノ酸残基；
EGF1領域:216位から249位にあるアミノ酸残基；
EGF2領域:274位から310位にあるアミノ酸残基；
EGF3領域:312位から351位にあるアミノ酸残基；
EGF4領域:353位から389位にあるアミノ酸残基；
EGF5領域:391位から427位にあるアミノ酸残基；
EGF6領域:429位から465位にあるアミノ酸残基；
EGF6からTM領域の直前までの領域: 429位から492位にあるアミノ酸残基；
TM領域:493位から513位にあるアミノ酸残基；および
C末端細胞内ドメイン: 516位から618位（または一部のアイソフォームでは516位から587位）にあるアミノ酸残基
を有する。上記に記述されるアミノ酸位置はまた、配列番号：90に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸位置も指す。
したがって、本発明の多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、ヒトDLL3における上述の位置にあるアミノ酸残基を有する上述の領域/ドメインに結合し得る。すなわち、本発明の多重特異性抗原結合分子またはDLL3抗原結合部分は、ヒトDLL3における上述の位置にあるアミノ酸残基を有する上述の領域/ドメイン内のエピトープに結合し得る。
本発明で用いられるDLL3タンパク質は、上記に記載される配列を有するDLL3タンパク質であってもよく、または1つまたは複数のアミノ酸の改変によって上記に記載される配列から導き出される配列を有する改変タンパク質であってもよい。1つまたは複数のアミノ酸の改変によって上記に記載される配列から導き出される配列を有する改変タンパク質の例としては、上記に記載されるアミノ酸配列に対して、70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上の同一性を有するポリペプチドを挙げることができる。あるいは、これらのDLL3タンパク質の部分ペプチドが用いられてもよい。
本発明で用いられるDLL3タンパク質は、その起源によって限定されず、好ましくはヒトまたはカニクイザルDLL3タンパク質である。
本発明で用いられるDLL3タンパク質は、その起源によって限定されず、好ましくはヒトまたはカニクイザルDLL3タンパク質である。
いくつかの態様において、DLL3タンパク質として、DLL3 ECD断片タンパク質（またはECDバリアント）が用いられ得る。切断の部位に応じて、断片/バリアントは、N末端側からC末端側へ、DSLドメインからEGF6、EGF1からEGF6、EGF2からEGF6、EGF3からEGF6、EGF4からEGF6、EGF5およびEGF6、またはEGF6を含んでもよい。断片/バリアントは、EGF6領域の直後からTM領域の直前までに及ぶ領域をさらに含んでもよい。Flagタグを、当技術分野において周知の技術を用いて断片/バリアントのC末端に付着させてもよい。
特定の態様において、本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、異なる種のCD3、CD137、またはDLL3の間で保存されているCD3、CD137、またはDLL3のエピトープに結合する。特定の態様において、本出願の多重特異性抗原結合分子は、三重特異性抗原結合分子、すなわち、3種類の異なる抗原に特異的に結合することができる、つまり、CD3またはCD137のいずれか一方に結合することができるが、両方の抗原に同時には結合せず、かつDLL3に特異的に結合することができる、三重特異性抗原結合分子である。
特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、CD3の部分ペプチドの全体または一部に特異的に結合する。特定の態様において、CD3はヒトCD3またはカニクイザルCD3、最も典型的にはヒトCD3である。特定の態様において、多重特異性抗原結合分子は、ヒトCD3およびカニクイザルCD3に対して交差反応性である（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子は、CD3のεサブユニット、特に、配列番号：7（NP_000724.1）（括弧内にRefSeq登録番号を示す）に示されるCD3のヒトCD3εサブユニットに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子は、真核細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子は、T細胞の表面上に発現しているCD3ε鎖に結合する。
特定の態様において、CD137はヒトCD137である。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の好適な例には、以下からなる群より選択される抗体によって結合されるヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合する抗原結合分子が含まれる：
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：21）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：35）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：49）を含む領域を認識する抗体、および
ヒトCD137タンパク質中のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：105）を含む領域を認識する抗体。
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：21）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：35）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：49）を含む領域を認識する抗体、および
ヒトCD137タンパク質中のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：105）を含む領域を認識する抗体。
少なくとも1つのジスルフィド結合
本発明の1つの局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、好ましくはCH1領域において、少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み、該少なくとも1つのシステイン残基は、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成することができる。ある特定の態様において、システイン残基は、抗体重鎖定常領域のCH1領域内に存在し、例えば、CH1領域においてEUナンバリングによる119位、122位、123位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、148位、150位、155位、156位、157位、159位、160位、161位、162位、163位、165位、167位、174位、176位、177位、178位、190位、191位、192位、194位、195位、197位、213位、および214位からなる群より選択される位置に存在する。1つの態様において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成することができる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含む。
本発明の1つの局面において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、好ましくはCH1領域において、少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み、該少なくとも1つのシステイン残基は、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成することができる。ある特定の態様において、システイン残基は、抗体重鎖定常領域のCH1領域内に存在し、例えば、CH1領域においてEUナンバリングによる119位、122位、123位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、148位、150位、155位、156位、157位、159位、160位、161位、162位、163位、165位、167位、174位、176位、177位、178位、190位、191位、192位、194位、195位、197位、213位、および214位からなる群より選択される位置に存在する。1つの態様において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれは、第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成することができる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含む。
上記局面のある態様において、上記に記載される第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を連結する、形成される「少なくとも1つの結合」は、2つの抗原結合部分（すなわち、上記に記載されるような第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分）を空間的に近い位置に保持することができる。ジスルフィド結合を介する第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間の連結のために、本発明の抗原結合分子は、2つの抗原結合部分間に導入された追加の結合を有さないという点でのみ本発明の抗原結合分子と相違する対照抗原結合分子より近い位置で、2つの抗原結合分子を保持することができる。いくつかの態様において、用語「空間的に近い位置」または「より近い位置」には、上記に記載される第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが、短縮された距離および/または低下した可動性で保持されるという意味が含まれる。
結果として、本発明の抗原結合分子の2つの抗原結合部分（すなわち、上記に記載されているような第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分）は、同じ単一の細胞上に発現している抗原に結合する。換言すると、本発明の抗原結合分子の2つの抗原結合部分（すなわち、上記に記載されるような第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分）の各々は、異なる細胞の架橋をもたらすように、異なる細胞上に発現している抗原に結合しない。本出願において、本発明の抗原結合分子のそのような抗原結合様式は「シス結合」と呼ぶことができ、これに対して、抗原結合分子の2つの抗原結合部分の各々が、異なる細胞上に発現している抗原に結合して、異なる細胞の架橋をもたらす、抗原結合分子の抗原結合様式は、「トランス結合」と呼ぶことができる。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は主に、「シス結合」様式で同じ単一の細胞上に発現している抗原に結合する。
上記局面のある態様において、上記に記載されるようなジスルフィド結合を介する第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間のジスルフィド結合のために、本発明の抗原結合分子は、免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞等）の望ましくない架橋形成および活性化を低下させるおよび/または妨げることができる。すなわち、本発明のいくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の第1の抗原結合部分は、T細胞などの免疫細胞上に発現している任意シグナル伝達分子（例えば、第1の抗原）に結合し、本発明の抗原結合分子の第2の抗原結合ドメインもまた、T細胞などの免疫細胞上に発現している任意のシグナル伝達分子（例えば、第1の抗原、または第1の抗原とは異なる第2の抗原）に結合する。したがって、本発明の抗原結合分子の第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、同じ単一の免疫細胞、例えばT細胞上（すなわち、シス結合様式）または異なる免疫細胞、例えばT細胞上（すなわち、トランス結合様式）に発現している第1のまたは第2のシグナル伝達分子のいずれかに結合できる。第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインが、トランス結合様式で異なる免疫細胞、例えばT細胞上に発現しているシグナル伝達分子に結合する場合、それらの異なる免疫細胞、例えばT細胞は架橋され、ある特定の状況において、T細胞などの免疫細胞のそのような架橋形成は、T細胞などの免疫細胞の望ましくない活性化を引き起こし得る。
一方、本発明の抗原結合分子、すなわち、CH1領域中（EUナンバリングによる191位）の少なくとも1つのジスルフィド結合を介して相互に連結される第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含む抗原結合分子の別の態様の場合において、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインはどちらも、「シス結合」様式で同じ単一の免疫細胞、例えばT細胞上に発現しているシグナル伝達分子に結合することができ、これにより、抗原結合分子を介する異なる免疫細胞、例えばT細胞の架橋形成が低減して、免疫細胞の望ましくない活性化を回避できる。
本出願において、上記の特徴、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を連結するCH1領域中（例えば、EUナンバリングによる191位）の少なくとも1つのジスルフィド結合は、略語「LINC」で記載される場合がある。この略語を用いると、いくつかの態様において、上記の本発明の抗原結合分子は、例えば、「Dual/LINC」、「DLL3-Dual/LINC」、「対をなすシステイン形態」または「GPC3-Dual/Dual（linc）」等として表示され得る。CH1領域中（例えば、EUナンバリングによる191位）の少なくとも1つのジスルフィド結合を介して相互に連結されない/まだ連結されていない第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の抗原結合分子は、略語「UnLINC」または「対をなさないシステインを有するDual-LINC-Ig」等で記載され得る。
ヒンジ領域
用語「ヒンジ領域」は、CH1ドメインとCH2ドメインとを連結する野生型抗体重鎖における抗体重鎖ポリペプチド部分、例えば、EUナンバリングシステムによる約216位から約230位、またはKabatナンバリングシステムによる約226位から約243位を表す。天然型IgG抗体において、ヒンジ領域におけるEUナンバリングによる220位にあるシステイン残基は、抗体軽鎖における214位にあるシステイン残基とジスルフィド結合を形成することが知られている。さらに、2つの抗体重鎖間で、ジスルフィド結合が、ヒンジ領域におけるEUナンバリングによる226位にあるシステイン残基間および229位にあるシステイン残基間で形成されることも知られている。一般に、「ヒンジ領域」は、ヒトIgG1の216から238まで（EUナンバリング）または226から251まで（Kabatナンバリング）に及ぶとして定義される。このヒンジは、3つの異なる領域、上側のヒンジ、中央のヒンジおよび下側のヒンジにさらに分割することができる。ヒトIgG1抗体では、これらの領域は概して以下のように定義される：
上側のヒンジ：216～225（EUナンバリング）または 226～238（Kabatナンバリング）、
中央のヒンジ：226～230（EUナンバリング）または 239～243（Kabatナンバリング）、
下側のヒンジ：231～238（EUナンバリング）または 244～251（Kabatナンバリング）。
用語「ヒンジ領域」は、CH1ドメインとCH2ドメインとを連結する野生型抗体重鎖における抗体重鎖ポリペプチド部分、例えば、EUナンバリングシステムによる約216位から約230位、またはKabatナンバリングシステムによる約226位から約243位を表す。天然型IgG抗体において、ヒンジ領域におけるEUナンバリングによる220位にあるシステイン残基は、抗体軽鎖における214位にあるシステイン残基とジスルフィド結合を形成することが知られている。さらに、2つの抗体重鎖間で、ジスルフィド結合が、ヒンジ領域におけるEUナンバリングによる226位にあるシステイン残基間および229位にあるシステイン残基間で形成されることも知られている。一般に、「ヒンジ領域」は、ヒトIgG1の216から238まで（EUナンバリング）または226から251まで（Kabatナンバリング）に及ぶとして定義される。このヒンジは、3つの異なる領域、上側のヒンジ、中央のヒンジおよび下側のヒンジにさらに分割することができる。ヒトIgG1抗体では、これらの領域は概して以下のように定義される：
上側のヒンジ：216～225（EUナンバリング）または 226～238（Kabatナンバリング）、
中央のヒンジ：226～230（EUナンバリング）または 239～243（Kabatナンバリング）、
下側のヒンジ：231～238（EUナンバリング）または 244～251（Kabatナンバリング）。
他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間SS結合を同じ位置に形成する第1のシステイン残基および最後のシステイン残基を配置することによって、IgG1配列と整列させることができる（例えば、Brekke et al., 1995, Immunol (Table 1 of Today 16: 85-90を参照)）。本明細書におけるヒンジ領域には、野生型ヒンジ領域におけるアミノ酸残基が置換、付加、または欠失によって変更されている、野生型ヒンジ領域ならびにバリアントが含まれる。
用語「ヒンジ領域内にはないアミノ酸間に形成されるジスルフィド結合」（または「ヒンジ領域外のアミノ酸間に形成されるジスルフィド結合」）は、上記に定義される「ヒンジ領域」外にある任意の抗体領域に位置するアミノ酸により形成されるか、接続されるか、または連結されるジスルフィド結合を意味する。例えば、そのようなジスルフィド結合は、ヒンジ領域以外の抗体中の任意の位置（例えば、EUナンバリングシステムによる約216位から約230位、またはKabatナンバリングシステムによる約226位から約243位）におけるアミノ酸により形成されるか、接続されるか、または連結される。いくつかの態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域、CL領域、VL領域、VH領域、および/またはVHH領域に位置するアミノ酸により形成されるか、接続されるか、または連結される。いくつかの態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域におけるEUナンバリングによる119位から123位、131位から140位、148位から150位、155位から167位、174位から178位、188位から197位、201位から214位に位置するアミノ酸により形成されるか、接続されるか、または連結される。いくつかの態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域におけるEUナンバリングによる119位、122位、123位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、148位、150位、155位、156位、157位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、167位、174位、176位、177位、178位、188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、197位、201位、203位、205位、206位、207位、208位、211位、212位、213位、214位に位置するアミノ酸により形成されるか、接続されるか、または連結される。いくつかの態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域におけるEUナンバリングによる188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、および197位に位置するアミノ酸により形成されるか、接続されるか、または連結される。1つの好ましい態様において、そのようなジスルフィド結合は、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位に位置するアミノ酸により形成されるか、接続されるか、または連結される。
抗原結合ドメイン
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部またはすべてに特異的に結合しかつそれに相補的である領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、1つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によってもたらされてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）および抗体重鎖可変領域（VH）の両方を含む。そのような好ましい抗原結合ドメインには、例えば、「単鎖Fv（scFv）」、「単鎖抗体」、「Fv」、「単鎖Fv2（scFv2）」、「Fab」、および「F(ab')2」が含まれる。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部またはすべてに特異的に結合しかつそれに相補的である領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、1つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によってもたらされてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）および抗体重鎖可変領域（VH）の両方を含む。そのような好ましい抗原結合ドメインには、例えば、「単鎖Fv（scFv）」、「単鎖抗体」、「Fv」、「単鎖Fv2（scFv2）」、「Fab」、および「F(ab')2」が含まれる。
可変領域
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに十分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに十分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
HVRまたはCDR
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域を指す。超可変領域（HVR）は、「相補性決定領域」（CDR）とも称され、これらの用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して相互に交換可能に用いられる。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組み合わせ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらに従ってナンバリングされる。
HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3は、それぞれ、「H-CDR1」、「H-CDR2」、「H-CDR3」、「L-CDR1」、「L-CDR2」、および「L-CDR3」とも記載される。
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域を指す。超可変領域（HVR）は、「相補性決定領域」（CDR）とも称され、これらの用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して相互に交換可能に用いられる。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組み合わせ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらに従ってナンバリングされる。
HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3は、それぞれ、「H-CDR1」、「H-CDR2」、「H-CDR3」、「L-CDR1」、「L-CDR2」、および「L-CDR3」とも記載される。
CD3およびCD137に結合することができるが、CD3およびCD137に同時には結合しない
本発明の抗体可変領域が「CD3およびCD137に結合することができる」かどうかは、当技術分野において公知の方法によって判定することができる。
これは、例えば、電気化学発光法（ECL法）によって判定することができる（BMC Research Notes 2011, 4:281）。
本発明の抗体可変領域が「CD3およびCD137に結合することができる」かどうかは、当技術分野において公知の方法によって判定することができる。
これは、例えば、電気化学発光法（ECL法）によって判定することができる（BMC Research Notes 2011, 4:281）。
具体的には、例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子の、CD3およびCD137に結合することができる領域、例えば、Fab領域から構成される低分子抗体、またはその一価抗体（通常の抗体が有する2つのFab領域のうち1つが欠けている抗体）を、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3またはCD137と混合し、混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加する。この操作において、ビオチン標識された被験抗原結合分子は、プレート上のストレプトアビジンに結合する。sulfo-tagから光を発生させ、その発光シグナルを、Sector Imager 600または2400（MSD K.K.）などを用いて検出し、それによって、CD3またはCD137に対する被験抗原結合分子の上述の領域の結合を確認することができる。
あるいは、このアッセイは、ELISA、FACS（蛍光活性化細胞選別）、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などによって実施されてもよい（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
具体的には、アッセイは、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づく相互作用解析機器であるBiacore（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて実施することができる。Biacore解析機器には、Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、8K、またはCなどの任意の機種が含まれる。CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA、またはAuチップなどの任意のBiacore用センサーチップを、センサーチップとして用いることができる。プロテインA、プロテインG、プロテインL、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgG-Fab、抗ヒトL鎖抗体、抗ヒトFc抗体、抗原タンパク質、または抗原ペプチドなどの、本発明の抗原結合分子を捕捉するためのタンパク質を、アミンカップリング、ジスルフィドカップリング、またはアルデヒドカップリングなどのカップリング法によって、センサーチップ上に固定化する。その上にCD3またはCD137をアナライトとしてインジェクトし、相互作用を測定してセンサーグラムを取得する。この操作において、CD3またはCD137の濃度は、アッセイサンプルの相互作用の強さ（例えば、KD）に従って数μMから数pMの範囲内で選択することができる。
あるいは、CD3またはCD137を、抗原結合分子の代わりにセンサーチップ上に固定化して、次に、評価したい抗体サンプルを相互作用させてもよい。本発明の抗原結合分子の抗体可変領域がCD3またはCD137に対する結合活性を有するかどうかを、相互作用のセンサーグラムから算出された解離定数（KD）値に基づいて、または抗原結合分子サンプルの作用前のレベルを上回る、作用後のセンサーグラムの増加の程度に基づいて、確認することができる。
いくつかの態様において、目的の抗原（すなわち、CD3またはCD137）に対する本発明の抗体可変領域の結合活性または親和性を、例えば、Biacore T200機器（GE Healthcare）またはBiacore 8K機器（GE Healthcare）を用いて、摂氏37度（℃）（CD137について）または25℃（CD3について）で評価する。抗ヒトFc（例えば、GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（例えば、GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化する。抗原結合分子または抗体可変領域を、抗Fcセンサー表面上に捕捉し、次いで、抗原（CD3またはCD137）をフローセル上にインジェクトする。抗原結合分子または抗体可変領域の捕捉レベルは、200レゾナンスユニット（RU）を目指してもよい。組換えヒトCD3またはCD137を、2倍段階希釈によって調製した400～25 nMでインジェクトし、その後解離させてもよい。すべての抗原結合分子または抗体可変領域およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製する。センサー表面は、サイクル毎に3M MgCl2で再生させる。結合親和性は、例えば、Biacore T200 Evaluation software, version 2.0（GE Healthcare）またはBiacore Insight Evaluation software（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定する。本発明の抗原結合ドメインの特異的結合活性または親和性を評価するために、KD値を算出する。
ALPHAScreenは、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズにアクセスすると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズにアクセスしない。したがって、化学発光反応は起きない。
その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。センサーチップ表面上に捕捉されたリガンドに結合したアナライトの量（アナライトを相互作用させた前後でのセンサーグラム上でのレスポンスの変化の量）を、センサーグラムから決定することができる。しかし、結合量はリガンドの量にも依存するため、比較は、実質的に同じ量のリガンドの量を用いる条件下で行わなければならない。キネティクス、すなわち、会合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムの曲線から決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。
用語「CD3とCD137（4-1BB）に同時（at the same time）には結合しない」または「CD3とCD137（4-1BB）に同時（simultaneously）には結合しない」は、本発明の抗原結合部分または抗体可変領域が、CD3と結合している状態ではCD137に結合できず、逆に、抗原結合部分または抗体可変領域が、CD137と結合している状態ではCD3に結合できないことを意味する。ここで、「CD3とCD137に同時には結合しない」という句には、CD3を発現する細胞とCD137を発現する細胞とを架橋しないこと、または、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しないことも含まれる。この句にはさらに、CD3およびCD137が可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していないか、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137には同時には結合することができない場合も含まれる。そのような抗体可変領域は、これらの機能を有している限り、特に限定されない。その例には、所望の抗原に結合するようにそのアミノ酸の一部を改変した、IgG型の抗体可変領域に由来する可変領域が含まれ得る。改変されるアミノ酸は、例えば、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域における、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸から選択される。
ここで、「異なる細胞上で発現している」という句は、単に、抗原が別々の細胞上で発現していることを意味する。そのような細胞の組み合わせは、例えば、T細胞と別のT細胞のように同じ種類の細胞であってもよいし、またはT細胞とNK細胞のように異なる種類の細胞であってもよい。
ここで、「異なる細胞上で発現している」という句は、単に、抗原が別々の細胞上で発現していることを意味する。そのような細胞の組み合わせは、例えば、T細胞と別のT細胞のように同じ種類の細胞であってもよいし、またはT細胞とNK細胞のように異なる種類の細胞であってもよい。
本発明の抗原結合分子が「CD3とCD137に同時には結合しない」かどうかは、抗原結合分子がCD3およびCD137の両方に対する結合活性を有することを確認すること；次いで、この結合活性を有する可変領域を含む抗原結合分子に、CD3またはCD137のいずれかを予め結合させること；および次いで、上述の方法によってもう1つのものに対するその結合活性の有無を判定すること、によって確認することができる。あるいは、これはまた、ELISAプレート上またはセンサーチップ上に固定化されたCD3またはCD137のいずれかに対する抗原結合分子の結合が、溶液中へのもう1つのものの添加によって阻害されるかどうかを判定することによって、確認することもできる。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子のCD3またはCD137のいずれかに対する結合は、もう1つに対する抗原結合分子の結合によって、少なくとも50％、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害される。
1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合の阻害を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、BIACOREなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合の阻害もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合が、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害されるならば、本発明の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の競合測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、ECLなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合シグナルが、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上減弱されるならば、本発明の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
具体的には、例えば、ECL法を用いる場合、ビオチン標識された被験抗原結合分子、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3、および標識されていないCD137を準備する。被験抗原結合分子が、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない場合、被験抗原結合分子と標識されたCD3との混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加すること、およびその後の発光によって、sulfo-tagの発光シグナルが、標識されていないCD137の非存在下で検出される。対照的に、発光シグナルは、標識されていないCD137の存在下で減少する。この発光シグナルの減少を定量して、相対的な結合活性を決定することができる。この解析は、標識されたCD137および標識されていないCD3を用いて、同様に実施され得る。
ALPHAScreenの場合、被験抗原結合分子は、競合するCD137の非存在下でCD3と相互作用して、520～620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていないCD137は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合（one-site competition）モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）用いて解析される。この解析は、タグ付けされたCD137およびタグ付けされていないCD3を用いて、同様に解析され得る。
あるいは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた方法が用いられてもよい。FRETとは、励起エネルギーが、近接して位置する2つの蛍光分子の間で互いに、電子共鳴によって直接移動する現象である。FRETが起こると、ドナー（励起状態を有する蛍光分子）の励起エネルギーがアクセプター（ドナーの近くに位置するもう1つの蛍光分子）に移動するため、ドナーから放射される蛍光が消失し（正確には、蛍光の寿命が短縮し）、代わりにアクセプターから蛍光が放射される。この現象の使用によって、CD3とCD137に同時に結合するか否かを解析することができる。例えば、蛍光ドナーを有するCD3および蛍光アクセプターを有するCD137が、被験抗原結合分子に同時に結合すると、ドナーの蛍光は消失し、一方、アクセプターから蛍光が放射される。そのため、蛍光波長の変化が観察される。そのような抗体は、CD3とCD137に同時に結合するものと確認される。他方で、CD3、CD137、および被験抗原結合分子の混合が、CD3と結合した蛍光ドナーの蛍光波長を変化させないならば、この被験抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗原結合ドメインとみなすことができる。
例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズ上のストレプトアビジンに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたCD3を、アクセプタービーズに結合させる。被験抗原結合分子は、競合する第2の抗原の非存在下でCD3と相互作用して、520～620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない第2の抗原は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。
タグ付けは、GSTタグ付けに限定されず、ヒスチジンタグ、MBP、CBP、Flagタグ、HAタグ、V5タグ、c-mycタグなどであるがそれらに限定されない、任意のタグで実施されてもよい。被験抗原結合分子のドナービーズへの結合は、ビオチン-ストレプトアビジン反応を用いた結合に限定されない。特に、被験抗原結合分子がFcを含む場合、可能な方法には、ドナービーズ上のプロテインAまたはプロテインGなどのFc認識タンパク質を介して被験抗原結合分子を結合させることが含まれる。
また、CD3およびCD137が、可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していない時、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができない場合もまた、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
具体的には、CD3およびCD137に対する同時の結合を検出するためのECL-ELISAにおいて陽性であると確認されている被験抗原結合分子をまた、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞と混合する。被験抗原結合分子は、抗原結合分子およびこれらの細胞が互いに同時に結合しない限り、異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができないことが示され得る。このアッセイは、例えば、細胞ベースのECL-ELISAによって実施することができる。CD3を発現する細胞を、予めプレート上に固定化する。被験抗原結合分子をそれに結合させた後に、CD137を発現する細胞をプレートに添加する。CD137を発現する細胞上でのみ発現している異なる抗原は、この抗原に対するsulfo-tagで標識された抗体を用いて検出される。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、いかなるシグナルも観察されない。
あるいは、このアッセイは、ALPHAScreen法によって実施されてもよい。被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合したCD3を発現する細胞およびアクセプタービーズに結合したCD137を発現する細胞と混合する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、シグナルは観察されない。
あるいは、このアッセイは、Octet相互作用解析法によって実施されてもよい。最初に、ペプチドタグを付加したCD3を発現する細胞を、ペプチドタグを認識するバイオセンサーに結合させる。CD137を発現する細胞および被験抗原結合分子を、ウェルに入れて、相互作用について解析する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子およびCD137を発現する細胞のバイオセンサーへの結合によって引き起こされる大きな波長シフトが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、被験抗原結合分子のみのバイオセンサーへの結合によって引き起こされる小さな波長シフトが観察される。
結合活性に基づくこれらの方法の代わりに、生物活性に基づくアッセイが実施されてもよい。例えば、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞を、被験抗原結合分子と混合して培養する。それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原は、抗原結合分子がこれらの2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子を介して相互に活性化される。そのため、抗原のそれぞれの下流のリン酸化レベルの増加などの活性化シグナルの変化を、検出することができる。あるいは、サイトカインの産生が、活性化の結果として誘導される。そのため、産生されるサイトカインの量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。あるいは、CD137を発現する細胞に対する細胞傷害活性が、活性化の結果として誘導される。あるいは、レポーター遺伝子の発現が、活性化の結果として、CD137またはCD3のシグナル伝達経路の下流で活性化されるプロモーターによって誘導される。そのため、細胞傷害活性または産生されるレポータータンパク質の量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。
Fab分子
「Fab分子」は、免疫グロブリンの重鎖のVHおよびCH1ドメイン（「Fab重鎖」）ならびに軽鎖のVLおよびCLドメイン（「Fab軽鎖」）からなるタンパク質を指す。
「Fab分子」は、免疫グロブリンの重鎖のVHおよびCH1ドメイン（「Fab重鎖」）ならびに軽鎖のVLおよびCLドメイン（「Fab軽鎖」）からなるタンパク質を指す。
融合される
「融合される」は、構成成分（例えば、Fab分子およびFcドメインサブユニット）が、直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されることを意味する。
「融合される」は、構成成分（例えば、Fab分子およびFcドメインサブユニット）が、直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されることを意味する。
「クロスオーバー」Fab
「クロスオーバー」Fab分子（「Crossfab」とも呼ばれる）は、Fab重鎖およびFab軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されている、Fab分子を意味し、すなわち、クロスオーバーFab分子は、軽鎖可変領域および重鎖定常領域で構成されたペプチド鎖と、重鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成されたペプチド鎖とを含む。明確にするために記すと、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子では、重鎖定常領域を含むペプチド鎖が、本明細書において、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と称される。反対に、Fab軽鎖およびFab重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーFab分子では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖が、本明細書において、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と称される。
「クロスオーバー」Fab分子（「Crossfab」とも呼ばれる）は、Fab重鎖およびFab軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されている、Fab分子を意味し、すなわち、クロスオーバーFab分子は、軽鎖可変領域および重鎖定常領域で構成されたペプチド鎖と、重鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成されたペプチド鎖とを含む。明確にするために記すと、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーFab分子では、重鎖定常領域を含むペプチド鎖が、本明細書において、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と称される。反対に、Fab軽鎖およびFab重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーFab分子では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖が、本明細書において、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と称される。
「従来の」Fab
それに対して、「従来の」Fab分子は、その天然のフォーマットでのFab分子、すなわち、重鎖の可変領域および定常領域で構成された重鎖（VH-CH1）、ならびに軽鎖の可変領域および定常領域で構成された軽鎖（VL-CL）を含むFab分子を意味する。用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合で結合された2つの軽鎖および2つの重鎖で構成された、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端へ、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）と、その後に続く重鎖定常領域とも呼ばれる3種類の定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）とを有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端へ、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）と、その後に続く軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、またはμ（IgM）と呼ばれる5つのタイプのうちの1つに割り当てられてもよく、それらの一部は、サブタイプ、例えば、γ1（IgG1）、γ2（IgG2）、γ3（IgG3）、γ4（IgG4）、α1（IgA1）、およびα2（IgA2）にさらに分類されてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てられもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された、2つのFab分子およびFcドメインから本質的になる。
それに対して、「従来の」Fab分子は、その天然のフォーマットでのFab分子、すなわち、重鎖の可変領域および定常領域で構成された重鎖（VH-CH1）、ならびに軽鎖の可変領域および定常領域で構成された軽鎖（VL-CL）を含むFab分子を意味する。用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合で結合された2つの軽鎖および2つの重鎖で構成された、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端へ、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）と、その後に続く重鎖定常領域とも呼ばれる3種類の定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）とを有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端へ、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）と、その後に続く軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、またはμ（IgM）と呼ばれる5つのタイプのうちの1つに割り当てられてもよく、それらの一部は、サブタイプ、例えば、γ1（IgG1）、γ2（IgG2）、γ3（IgG3）、γ4（IgG4）、α1（IgA1）、およびα2（IgA2）にさらに分類されてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てられもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された、2つのFab分子およびFcドメインから本質的になる。
親和性
「親和性」は、分子（例えば、抗原結合分子または抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度を指す。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合親和性」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYに対する親和性は、一般的に、解離速度定数と会合速度定数（それぞれkoffおよびkon）との比である、解離定数（KD）により表すことができる。したがって、速度定数の比が同じままである限り、等価の親和性は異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野において公知の確立した方法によって測定することができる。親和性を測定するための具体的な方法は、表面プラズモン共鳴（SPR）である。
「親和性」は、分子（例えば、抗原結合分子または抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度を指す。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合親和性」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYに対する親和性は、一般的に、解離速度定数と会合速度定数（それぞれkoffおよびkon）との比である、解離定数（KD）により表すことができる。したがって、速度定数の比が同じままである限り、等価の親和性は異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野において公知の確立した方法によって測定することができる。親和性を測定するための具体的な方法は、表面プラズモン共鳴（SPR）である。
親和性を決定する方法
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体は、その抗原に対して、≦1μM、≦120nM、≦100nM、≦80nM、≦70nM、≦50nM、≦40nM、≦30nM、≦20nM、≦10nM、≦2nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、10-8M～10-13M、10-9M～10-13M）の解離定数 (KD) を有する。特定の態様において、CD3、CD137、またはDLL3に対する、抗体／抗原結合分子のKD値は、1～40、1～50、1～70、1～80、30～50、30～70、30～80、40～70、40～80、または60～80nMの範囲内に入る。
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体は、その抗原に対して、≦1μM、≦120nM、≦100nM、≦80nM、≦70nM、≦50nM、≦40nM、≦30nM、≦20nM、≦10nM、≦2nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、10-8M～10-13M、10-9M～10-13M）の解離定数 (KD) を有する。特定の態様において、CD3、CD137、またはDLL3に対する、抗体／抗原結合分子のKD値は、1～40、1～50、1～70、1～80、30～50、30～70、30～80、40～70、40～80、または60～80nMの範囲内に入る。
1つの態様において、KDは、放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA) によって測定される。1つの態様において、RIAは、目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するFabの溶液中結合親和性は、非標識抗原の漸増量系列の存在下で最小濃度の (125I) 標識抗原によりFabを平衡化させ、次いで結合した抗原を抗Fab抗体でコーティングされたプレートにより捕捉することによって測定される。（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) を参照のこと）。測定条件を構築するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート (Thermo Scientific) を50mM炭酸ナトリウム (pH9.6) 中5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体 (Cappel Labs) で一晩コーティングし、その後に室温（およそ23℃）で2～5時間、PBS中2％ (w/v) ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート (Nunc #269620) において、100 pMまたは26 pMの [125I]-抗原を、（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) における抗VEGF抗体、Fab-12の評価と同じように）目的のFabの段階希釈物と混合する。次いで、目的のFabを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が確実に達成されるよう、より長時間（例えば、約65時間）継続され得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、1時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをPBS中0.1％のポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μL/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）、Packard）を添加し、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター (Packard) においてプレートを10分間カウントする。最大結合の20％以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
別の態様によれば、Kdは、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) を用いる測定法が、およそ10反応単位 (response unit: RU) の抗原が固定されたCM5チップを用いて25℃で実施される。1つの態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ (CM5、BIACORE, Inc.) は、供給元の指示に従いN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド (EDC) およびN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) を用いて活性化される。抗原は、およそ10反応単位 (RU) のタンパク質の結合を達成するよう、5μL/分の流速で注入される前に、10mM酢酸ナトリウム、pH4.8を用いて5μg/ml（およそ0.2μM）に希釈される。抗原の注入後、未反応基をブロックするために1Mエタノールアミンが注入される。キネティクスの測定のために、25℃、およそ25μL/分の流速で、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤含有PBS (PBST) 中のFabの2倍段階希釈物 (0.78nM～500nM) が注入される。会合速度 (kon) および解離速度 (koff) は、単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）評価ソフトウェアバージョン3.2）を用いて、会合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算される。平衡解離定数 (Kd) は、koff/kon比として計算される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオン速度が106M-1s-1を超える場合、オン速度は、分光計（例えばストップフロー式分光光度計 (Aviv Instruments) または撹拌キュベットを用いる8000シリーズのSLM-AMINCO（商標）分光光度計 (ThermoSpectronic)）において測定される、漸増濃度の抗原の存在下でのPBS、pH7.2中20nMの抗抗原抗体（Fab形態）の25℃での蛍光発光強度（励起=295nm；発光=340nm、バンドパス16nm）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって決定され得る。
抗原結合分子または抗体の親和性を測定する上記の方法に従って、当業者は、様々な抗原に対する他の抗原結合分子または抗体の親和性測定を行うことができる。
抗体
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
抗体断片
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、scFv）、およびシングルドメイン抗体を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みin vivoにおける半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003) に記載されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、scFv）、およびシングルドメイン抗体を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みin vivoにおける半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003) に記載されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。
抗体のクラス
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
別段示さない限り、軽鎖定常領域中のアミノ酸残基は、本明細書ではKabatらに従ってナンバリングされ、重鎖定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているような、EUインデックスとも呼ばれる、EUナンバリングシステムに従う。
フレームワーク
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
ヒトコンセンサスフレームワーク
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。1つの態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。1つの態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。1つの態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。1つの態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
キメラ抗体
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体を指す。同様に、用語「キメラ抗体可変ドメイン」は、重鎖および／または軽鎖可変領域の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖可変領域の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体可変領域を指す。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体を指す。同様に、用語「キメラ抗体可変ドメイン」は、重鎖および／または軽鎖可変領域の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖可変領域の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体可変領域を指す。
ヒト化抗体
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。「ヒト化抗体可変領域」は、ヒト化抗体の可変領域を指す。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。「ヒト化抗体可変領域」は、ヒト化抗体の可変領域を指す。
ヒト抗体
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。「ヒト抗体可変領域」は、ヒト抗体の可変領域を指す。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。「ヒト抗体可変領域」は、ヒト抗体の可変領域を指す。
ポリヌクレオチド（核酸）
本明細書で相互に交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾を含み得る。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート等）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を伴うもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）などのペンダント部分を含むもの、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）を伴うもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸等）や非修飾形態のポリヌクレオチドを伴うものを含む。さらに、通常糖に存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられ得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を生成するよう活性化され得、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされ得る。5’および3’末端のOHは、リン酸化またはアミンもしくは1～20炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば以下のものを含む、当技術分野で一般に公知となっているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含み得る：2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、または2'-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、α-アノマー糖、アラビノースまたはキシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログ。1つまたは複数のホスホジエステル結合は、代替の連結基によって置き換えられ得る。これらの代替の連結基は、これらに限定されるものではないが、ホスフェートが以下のものによって置き換えられている態様を含む：P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）、ここで、各RまたはR'は独立してH、または、任意でエーテル（-O-）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル（1～20C）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。上記の説明は、RNAおよびDNAを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
本明細書で相互に交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾を含み得る。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート等）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を伴うもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）などのペンダント部分を含むもの、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）を伴うもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸等）や非修飾形態のポリヌクレオチドを伴うものを含む。さらに、通常糖に存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられ得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を生成するよう活性化され得、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされ得る。5’および3’末端のOHは、リン酸化またはアミンもしくは1～20炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば以下のものを含む、当技術分野で一般に公知となっているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含み得る：2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、または2'-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、α-アノマー糖、アラビノースまたはキシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログ。1つまたは複数のホスホジエステル結合は、代替の連結基によって置き換えられ得る。これらの代替の連結基は、これらに限定されるものではないが、ホスフェートが以下のものによって置き換えられている態様を含む：P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）、ここで、各RまたはR'は独立してH、または、任意でエーテル（-O-）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル（1～20C）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。上記の説明は、RNAおよびDNAを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
単離された（核酸）
「単離された」核酸分子は、そのもともとの環境の成分から分離されたものを指す。単離された核酸分子はさらに、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。
「単離された」核酸分子は、そのもともとの環境の成分から分離されたものを指す。単離された核酸分子はさらに、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。
ベクター
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。ベクターは、ウイルスまたはエレクトロポレーションを用いて宿主細胞に導入することができる。しかしながら、ベクターの導入は、in vitroでの方法に限定されない。例えば、ベクターは、in vivoでの方法を用いて対象に直接導入することもできる。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。ベクターは、ウイルスまたはエレクトロポレーションを用いて宿主細胞に導入することができる。しかしながら、ベクターの導入は、in vitroでの方法に限定されない。例えば、ベクターは、in vivoでの方法を用いて対象に直接導入することもできる。
宿主細胞
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
特異性
「特異的」とは、1つまたは複数の結合パートナーに特異的に結合する分子が、該パートナー以外の分子に対して何ら有意な結合を示さないことを意味する。さらに、「特異的」はまた、抗原結合部位が、抗原中に含まれる複数のエピトープのうちの特定のエピトープに特異的である場合にも用いられる。抗原結合分子が抗原に特異的に結合する場合、それは「抗原結合分子が、抗原に／抗原に対して特異性を有する／示す」とも記載される。抗原結合部位が結合するエピトープが複数の異なる抗原中に含まれる場合、該抗原結合部位を含む抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
「特異的」とは、1つまたは複数の結合パートナーに特異的に結合する分子が、該パートナー以外の分子に対して何ら有意な結合を示さないことを意味する。さらに、「特異的」はまた、抗原結合部位が、抗原中に含まれる複数のエピトープのうちの特定のエピトープに特異的である場合にも用いられる。抗原結合分子が抗原に特異的に結合する場合、それは「抗原結合分子が、抗原に／抗原に対して特異性を有する／示す」とも記載される。抗原結合部位が結合するエピトープが複数の異なる抗原中に含まれる場合、該抗原結合部位を含む抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
抗体断片
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F（ab'）2；ダイアボディ；線状抗体（linear antibody）；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F（ab'）2；ダイアボディ；線状抗体（linear antibody）；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体（whole antibody）」は、天然型の抗体構造に実質的に類似している構造を有するか、または本明細書において定義されるようなFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために、本明細書において互換的に用いられる。
可変断片（Fv）
本明細書において、用語「可変断片（Fv）」は、抗体の軽鎖可変領域（VL）と抗体の重鎖可変領域（VH）とのペアから構成される抗体由来の抗原結合部位の最小単位を指す。1988年にSkerraとPluckthunは、細菌のシグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性な抗体が大腸菌のペリプラズム画分から調製され得ることを見出した（Science (1988) 240 (4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvにおいては、抗原に結合するような様式でVHとVLが会合している。
本明細書において、用語「可変断片（Fv）」は、抗体の軽鎖可変領域（VL）と抗体の重鎖可変領域（VH）とのペアから構成される抗体由来の抗原結合部位の最小単位を指す。1988年にSkerraとPluckthunは、細菌のシグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性な抗体が大腸菌のペリプラズム画分から調製され得ることを見出した（Science (1988) 240 (4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvにおいては、抗原に結合するような様式でVHとVLが会合している。
scFv、単鎖抗体、およびsc(Fv) 2
本明細書において、用語「scFv」、「単鎖抗体」、および「sc(Fv)2」はいずれも、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むが、定常領域を含まない、単一ポリペプチド鎖の抗体断片を指す。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造の形成を可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際公開公報WO1988/001649、米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照のこと。特定の態様において、単鎖抗体は、二重特異性でありかつ／またはヒト化され得る。
本明細書において、用語「scFv」、「単鎖抗体」、および「sc(Fv)2」はいずれも、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むが、定常領域を含まない、単一ポリペプチド鎖の抗体断片を指す。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造の形成を可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際公開公報WO1988/001649、米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照のこと。特定の態様において、単鎖抗体は、二重特異性でありかつ／またはヒト化され得る。
scFvはFvを形成するVHとVLとがペプチドリンカーによって共に連結された単鎖低分子量抗体である（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883）。当該ペプチドリンカーによってVHとVLとが近接した状態に保持され得る。
sc(Fv)2は、2つのVLと2つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカー等のリンカーによって連結され一本鎖を形成する単鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189）。この2つのVHと2つのVLは異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。そのようなsc(Fv)2としては、例えば、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374に開示されるような、単一抗原中に存在する2つのエピトープを認識する二重特異性sc(Fv)2が好適に挙げられる。sc(Fv)2は、当業者に公知の方法によって製造され得る。例えば、sc(Fv)2は、scFvをペプチドリンカー等のリンカーで連結することによって製造され得る。
本明細書において、sc(Fv)2は、一本鎖ポリペプチドのN末端を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］）の順に並んでいる2つのVH単位および2つのVL単位を含む。2つのVH単位と2つのVL単位の順序は上記の構成に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。構成の例を以下に列挙する。
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］
［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］
［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］
［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］
［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
sc(Fv)2の分子形態についてはWO2006/132352においても詳細に記載されている。当業者であればこれらの記載に従って、本明細書で開示されるポリペプチド複合体を製造するために所望のsc(Fv)2を適宜調製することが可能である。
さらに本開示の抗原結合分子または抗体に、PEG等の担体高分子や抗がん剤等の有機化合物をコンジュゲートしてもよい。あるいは、糖鎖が所望の効果をもたらすように、糖鎖付加配列が抗原結合分子または抗体に好適に挿入される。
抗体の可変領域の連結に使用するリンカーは、遺伝子工学により導入され得る任意のペプチドリンカー、合成リンカー、および例えばProtein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを含む。しかしながら、本開示においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。長さは、好ましくは5アミノ酸以上（特に限定されないが、上限は通常、30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下）であり、特に好ましくは15アミノ酸である。sc(Fv)2に3つのペプチドリンカーが含まれる場合には、それらの長さはすべて同じであってもよいし異なってもよい。
例えば、そのようなペプチドリンカーには以下のものが含まれる：
Ser、
Gly-Ser、
Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly、
Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：91）、
Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号：92）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：93）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：94）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：95）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：96）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：97）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：98）、
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：93）)n、および
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：94）)n。
ここでnは1以上の整数である。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
Ser、
Gly-Ser、
Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly、
Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：91）、
Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号：92）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：93）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：94）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：95）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：96）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：97）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：98）、
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：93）)n、および
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：94）)n。
ここでnは1以上の整数である。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
合成リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられており、例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、およびビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）が挙げられる。これらの架橋剤は市販されている。
4つの抗体可変領域を連結するには、通常、3つのリンカーが必要となる。用いられるリンカーは、同じ種類のものであっても異なる種類のものであってもよい。
Fab、F(ab') 2 、およびFab'
「Fab」は、1本の軽鎖、ならびに1本の重鎖のCH1ドメインおよび可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
「Fab」は、1本の軽鎖、ならびに1本の重鎖のCH1ドメインおよび可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
「F(ab')2」または「Fab」は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）をペプシンおよびパパイン等のプロテアーゼで処理することにより製造され、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を2本の各H鎖のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近くで消化することによって生成される抗体断片を指す。例えばパパインは、IgGを、2本の各H鎖のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流で切断し、VL（L鎖可変領域）およびCL（L鎖定常領域）を含むL鎖がVH（H鎖可変領域）およびCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）を含むH鎖断片とそれらのC末端領域でジスルフィド結合により連結されている、相同な2つの抗体断片を生成する。これら2つの相同な抗体断片はそれぞれFab'と呼ばれる。
「F(ab')2」は、2本の軽鎖、ならびにジスルフィド結合が2本の重鎖間で形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む2本の重鎖からなる。本明細書において開示されるF(ab')2は、次のように好適に製造され得る。所望の抗原結合部位を含むモノクローナル全部抗体等を、ペプシン等のプロテアーゼで部分消化し、Fc断片をプロテインAカラムに吸着させることにより除去する。プロテアーゼは、pH等の適切な設定酵素反応条件下で選択的にF(ab')2をもたらすように全部抗体を切断し得るものである限り、特に限定はされない。例えば、そのようなプロテアーゼにはペプシンおよびフィシンが含まれる。
Fc領域
本発明において、用語「Fc領域」または「Fcドメイン」は、抗体分子中の、ヒンジまたはその一部、ならびにCH2およびCH3ドメインからなる断片を含む領域を指す。IgGクラスのFc領域は、例えば、システイン226（EU ナンバリング（本明細書においてEUインデックスとも称される））からC末端まで、またはプロリン230（EUナンバリング）からC末端までの領域を意味するが、それに限定されない。Fc領域は、好ましくは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にFabまたはF(ab')2を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびパパインが含まれ得る。
本発明において、用語「Fc領域」または「Fcドメイン」は、抗体分子中の、ヒンジまたはその一部、ならびにCH2およびCH3ドメインからなる断片を含む領域を指す。IgGクラスのFc領域は、例えば、システイン226（EU ナンバリング（本明細書においてEUインデックスとも称される））からC末端まで、またはプロリン230（EUナンバリング）からC末端までの領域を意味するが、それに限定されない。Fc領域は、好ましくは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にFabまたはF(ab')2を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびパパインが含まれ得る。
本発明において、例えば、天然型IgGに由来するFc領域を、本発明の「Fc領域」として用いることができる。ここで、天然型IgGとは、天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を含有し、免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。天然型ヒトIgGとは、例えば、天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、または天然型ヒトIgG4を意味する。天然型IgGにはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。遺伝子多型に基づく複数のアロタイプ配列が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4抗体の定常領域としてSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されており、それらはいずれも、本発明において用いることができる。特に、ヒトIgG1の配列は、EUナンバリング356～358位のアミノ酸配列として、DELまたはEEMを有してもよい。
いくつかの態様において、多重特異性抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンG（IgG）分子のFcドメインは、その各サブユニットがCH2およびCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む、二量体である。Fcドメインの2つのサブユニットは、相互に安定的に会合することができる。1つの態様において、本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、1つ以下のFcドメインを含む。
本明細書において記載される1つの態様において、多重特異性抗原結合分子のFcドメインはIgG Fcドメインである。特定の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。別の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。さらなる特定の態様において、FcドメインはヒトIgG1 Fc領域である。
ある態様において、多重特異性抗原結合分子はFcドメインを含む。
ある態様において、Fcドメインは、安定な会合が可能な第1のおよび第2のFc領域サブユニットで構成され、かつFcドメインは、天然型ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、ヒトFcγ受容体に対して低下した結合アフィニティを示す。
ある態様において、Fcドメインは、天然型IgGのFc領域のものと比較して、酸性pH条件（例えば、pH 5.8）下で増強されたFcRn結合活性を示す。
ある態様において、Fcドメインは、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にGlu、Arg、Ser、またはLys；および440位にGlu、Asp、またはGlnを含む。
ある態様において、Fcドメインは、EUナンバリングによる、434位にAla；438位にArgまたはLys；および440位にGluまたはAspを含む。
ある態様において、Fcドメインは、EUナンバリングによる、428位にIleもしくはLeu；および/または436位にIle、Leu、Val、Thr、もしくはPheをさらに含む。
ある態様において、Fcドメインは、EUナンバリングによる、以下：
（a）N434A/Q438R/S440E；
（b）N434A/Q438R/S440D；
（c）N434A/Q438K/S440E；
（d）N434A/Q438K/S440D；
（e）N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（f）N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（g）N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（h）N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（i）N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（j）N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（k）N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（l）N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（m）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；
（n）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；
（o）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；
（p）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；
（q）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；
（r）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；
（s）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；
（t）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；
（u）M428L/N434A/Q438R/S440E；
（v）M428L/N434A/Q438R/S440D；
（w）M428L/N434A/Q438K/S440E；
（x）M428L/N434A/Q438K/S440D；
（y）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（z）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（aa）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（ab）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（ac）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（ad）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（ae）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（af）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（ag）L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；および
（ah）L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。
（a）N434A/Q438R/S440E；
（b）N434A/Q438R/S440D；
（c）N434A/Q438K/S440E；
（d）N434A/Q438K/S440D；
（e）N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（f）N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（g）N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（h）N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（i）N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（j）N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（k）N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（l）N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（m）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；
（n）N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；
（o）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；
（p）N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；
（q）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；
（r）N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；
（s）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；
（t）N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；
（u）M428L/N434A/Q438R/S440E；
（v）M428L/N434A/Q438R/S440D；
（w）M428L/N434A/Q438K/S440E；
（x）M428L/N434A/Q438K/S440D；
（y）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；
（z）M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；
（aa）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；
（ab）M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；
（ac）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；
（ad）M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；
（ae）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；
（af）M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；
（ag）L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；および
（ah）L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。
ある態様において、Fcドメインは、M428L/N434A/Q438R/S440Eのアミノ酸置換の組み合わせを含む。
ある態様において、Fcドメインは、IgG Fcドメイン、好ましくはヒトIgG Fcドメイン、より好ましくはヒトIgG1 Fcドメインである。
ある態様において、Fcドメインは、以下：
（a）第1のFcサブユニットが、配列番号：100に示されるアミノ酸配列を含み、かつ第2のFcサブユニットが、配列番号：111に示されるアミノ酸配列を含む；または
（b）第1のFcサブユニットが、配列番号：99に示されるアミノ酸配列を含み、かつ第2のFcサブユニットが、配列番号：109に示されるアミノ酸配列を含む
のいずれかを含む。
（a）第1のFcサブユニットが、配列番号：100に示されるアミノ酸配列を含み、かつ第2のFcサブユニットが、配列番号：111に示されるアミノ酸配列を含む；または
（b）第1のFcサブユニットが、配列番号：99に示されるアミノ酸配列を含み、かつ第2のFcサブユニットが、配列番号：109に示されるアミノ酸配列を含む
のいずれかを含む。
低下したFcγ受容体結合活性を有するFc領域
本明細書において、「低下したFcγ受容体結合活性」は、例えば、上記に記載される分析方法に基づき、試験抗原結合分子または抗体の競合活性が、対照抗原結合分子または抗体の競合活性の、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、または15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下であることを意味する。
本明細書において、「低下したFcγ受容体結合活性」は、例えば、上記に記載される分析方法に基づき、試験抗原結合分子または抗体の競合活性が、対照抗原結合分子または抗体の競合活性の、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、または15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下であることを意味する。
モノクローナルIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体のFcドメインを含む抗原結合分子または抗体は、対照抗原結合分子または抗体として適宜用いることができる。Fcドメイン構造は、配列番号：85（RefSeqアクセッション番号AAC82527.1のN末端にAが付加される）、配列番号：86（RefSeqアクセッション番号AAB59393.1のN末端にAが付加される）、配列番号：87（RefSeqアクセッション番号CAA27268.1のN末端にAが付加される）、および配列番号：88（RefSeqアクセッション番号AAB59394.1のN末端にAが付加される）に示される。さらに、特定のアイソタイプの抗体のFcドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が試験物質として用いられる場合、Fcγ受容体結合活性に対する変異体の変異の作用は、同じアイソタイプのFcドメインを含む抗原結合分子または抗体を対照として用いて評価される。上記に記載されるように、そのFcγ受容体結合活性が低下していると判断されているFcドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が、適切に調製される。
そのような公知の変異体としては、例えば、アミノ酸231A～238S（EUナンバリング）の欠失を有する変異体（WO 2009/011941）、ならびに変異体 C226S、C229S、P238S、（C220S）（J. Rheumatol (2007) 34, 11）；C226SおよびC229S（(Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54）；C226S、C229S、E233P、L234V、およびL235A（Blood (2007) 109, 1185-1192）が挙げられる。
具体的には、好ましい抗原結合分子または抗体には、特定のアイソタイプの抗体のFcドメインを形成するアミノ酸において、以下のアミノ酸位置：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、または332位（EUナンバリング）から選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異（例えば、置換）を有するFcドメインを含むものが含まれる。Fcドメインの起源である抗体のアイソタイプは特に限定されず、モノクローナルIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体に由来する適切なFcドメインを用いることが可能である。IgG1抗体に由来するFcドメインを用いることが好ましい。
好ましい抗原結合分子または抗体には、例えば、その位置が、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンバリングにより指定されている（各数字がEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号が置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号が置換後のアミノ酸残基を表す）、以下に示される置換：
（a）L234F、L235E、P331S；
（b）C226S、C229S、P238S；
（c）C226S、C229S；または
（d）C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むもの、ならびに231位から238位にあるアミノ酸配列の欠失を有するFcドメインを有するものが含まれる。
（a）L234F、L235E、P331S；
（b）C226S、C229S、P238S；
（c）C226S、C229S；または
（d）C226S、C229S、E233P、L234V、L235A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むもの、ならびに231位から238位にあるアミノ酸配列の欠失を有するFcドメインを有するものが含まれる。
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、その位置が、IgG2抗体のFcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンバリングにより指定されている、以下に示される置換：
（e）H268Q、V309L、A330S、およびP331S；
（f）V234A；
（g）G237A；
（h）V234AおよびG237A；
（i）A235EおよびG237A；または
（j）V234A、A235E、およびG237A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
（e）H268Q、V309L、A330S、およびP331S；
（f）V234A；
（g）G237A；
（h）V234AおよびG237A；
（i）A235EおよびG237A；または
（j）V234A、A235E、およびG237A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、その位置が、IgG3抗体のFcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンバリングにより指定されている、以下に示される置換：
（k）F241A；
（l）D265A；または
（m）V264A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
（k）F241A；
（l）D265A；または
（m）V264A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、その位置が、IgG4抗体のFcドメインを形成するアミノ酸におけるEUナンバリングにより指定されている、以下に示される置換：
（n）L235A、G237A、およびE318A；
（o）L235E；または
（p）F234AおよびL235A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
（n）L235A、G237A、およびE318A；
（o）L235E；または
（p）F234AおよびL235A
のいずれか1つを有するFcドメインを含むものも含まれる。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前にある1文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後にある1文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
他の好ましい抗原結合分子または抗体には、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、または331位（EUナンバリング）にあるいずれかのアミノ酸が、対応するIgG2またはIgG4における対応するEUナンバリングでの位置のアミノ酸に置換されているFcドメインを含むものが含まれる。
好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における234位、235位、および297位（EUナンバリング）にあるアミノ酸のいずれか1つまたは複数が他のアミノ酸に置換されているFcドメインを含むものも含まれる。置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない；しかしながら、234位、235位、および297位にあるアミノ酸のいずれか1つまたは複数がアラニンに置換されているFcドメインを含む抗原結合分子または抗体が特に好ましい。
好ましい抗原結合分子または抗体にはまた、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における265位（EUナンバリング）にあるアミノ酸が別のアミノ酸に置換されているFcドメインを含むものも含まれる。置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない；しかしながら、265位にあるアミノ酸がアラニンに置換されているFcドメインを含む抗原結合分子または抗体が特に好ましい。
Fc受容体
用語「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を指す。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。）FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
用語「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を指す。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。）FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
用語「Fc受容体」または「FcR」はまた、母体のIgGの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）ならびに免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う、新生児型受容体FcRnを含む。FcRnへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)を参照のこと）。
in vivoでのヒトFcRnへの結合およびヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血漿半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株においてまたはバリアントFc領域を伴うポリペプチドが投与される霊長類において測定され得る。WO2000/42072 (Presta) は、FcRに対する結合が増加したまたは減少した抗体バリアントを記載している。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照のこと。
Fcγ受容体
Fcγ受容体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに結合し得る受容体を指し、これにはFcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質のファミリーに属するすべてのメンバーが含まれる。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI (CD64)；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII (CD32)；ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII (CD16)；ならびに未同定のヒトFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。しかしながら、Fcγ受容体はこれらの例に限定されない。Fcγ受容体には、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。Fcγ受容体は任意の生物に由来してよい。マウスFcγ受容体には、これらに限定されないが、FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)、およびFcγRIII-2 (CD16-2)、ならびに未同定のマウスFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。そのような好ましいFcγ受容体には、例えば、ヒトFcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16)、および／またはFcγRIIIB (CD16) が含まれる。FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号NM_000566.3およびRefSeq登録番号NP_000557.1に示され；FcγRIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC020823.1およびRefSeq登録番号AAH20823.1に示され；FcγRIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC146678.1およびRefSeq登録番号AAI46679.1に示され；FcγRIIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC033678.1およびRefSeq登録番号AAH33678.1に示され；ならびにFcγRIIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC128562.1およびRefSeq登録番号AAI28563.1に示される。Fcγ受容体がIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに対する結合活性を有するかどうかは、上記のFACSおよびELISAフォーマットに加えて、ALPHAスクリーン（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）、表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法、およびその他によって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
Fcγ受容体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに結合し得る受容体を指し、これにはFcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質のファミリーに属するすべてのメンバーが含まれる。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI (CD64)；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII (CD32)；ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII (CD16)；ならびに未同定のヒトFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。しかしながら、Fcγ受容体はこれらの例に限定されない。Fcγ受容体には、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。Fcγ受容体は任意の生物に由来してよい。マウスFcγ受容体には、これらに限定されないが、FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)、およびFcγRIII-2 (CD16-2)、ならびに未同定のマウスFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。そのような好ましいFcγ受容体には、例えば、ヒトFcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16)、および／またはFcγRIIIB (CD16) が含まれる。FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号NM_000566.3およびRefSeq登録番号NP_000557.1に示され；FcγRIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC020823.1およびRefSeq登録番号AAH20823.1に示され；FcγRIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC146678.1およびRefSeq登録番号AAI46679.1に示され；FcγRIIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC033678.1およびRefSeq登録番号AAH33678.1に示され；ならびにFcγRIIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC128562.1およびRefSeq登録番号AAI28563.1に示される。Fcγ受容体がIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに対する結合活性を有するかどうかは、上記のFACSおよびELISAフォーマットに加えて、ALPHAスクリーン（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）、表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法、およびその他によって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
その一方で、「Fcリガンド」または「エフェクターリガンド」は、抗体Fcドメインに結合してFc/Fcリガンド複合体を形成する分子、および好ましくはポリペプチドを指す。該分子は任意の生物に由来してよい。FcリガンドのFcへの結合は、好ましくは1つまたは複数のエフェクター機能を誘導する。そのようなFcリガンドには、Fc受容体、Fcγ受容体、Fcα受容体、Fcβ受容体、FcRn、C1q、およびC3、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA、スタフィロコッカスプロテインG、ならびにウイルスFcγ受容体が含まれるが、これらに限定されない。Fcリガンドには、Fcγ受容体と相同なFc受容体のファミリーであるFc受容体相同体 (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136) もまた含まれる。Fcリガンドには、Fcに結合する未同定の分子もまた含まれる。
Fcγ受容体結合活性
FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、および／またはFcγRIIIBのいずれかのFcγ受容体に対するFcドメインの結合活性が損なわれていることは、上記のFACSおよびELISAフォーマット、ならびにALPHAスクリーン（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）および表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法を用いることによって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、および／またはFcγRIIIBのいずれかのFcγ受容体に対するFcドメインの結合活性が損なわれていることは、上記のFACSおよびELISAフォーマット、ならびにALPHAスクリーン（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）および表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法を用いることによって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
ALPHAスクリーンは、2種類のビーズ：ドナービーズおよびアクセプタービーズを用いる、下記の原理に基づいたALPHA技術によって実施される。ドナービーズに連結された分子がアクセプタービーズに連結された分子と生物学的に相互作用し、かつ2つのビーズが近接して位置する場合にのみ、発光シグナルが検出される。ドナービーズ内の光増感剤は、レーザー光によって励起されて、ビーズ周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素がドナービーズ周辺に拡散し、近接して位置するアクセプタービーズにアクセスすると、アクセプタービーズ内の化学発光反応が誘導される。この反応によって最終的に光が放出される。ドナービーズに連結された分子がアクセプタービーズに連結された分子と相互作用しないのであれば、ドナービーズによって生成される一重項酸素はアクセプタービーズにアクセスせず、化学発光反応は起こらない。
例えば、ビオチン標識された抗原結合分子または抗体をドナービーズに固定化し、グルタチオンSトランスフェラーゼ (GST) でタグ付けされたFcγ受容体をアクセプタービーズに固定化する。競合的変異Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体の非存在下では、Fcγ受容体は、野生型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体と相互作用し、結果として520～620 nmのシグナルを誘導する。タグ付けされていない変異Fcドメインを有する抗原結合分子または抗体は、野生型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体と、Fcγ受容体との相互作用に関して競合する。競合の結果としての蛍光の減少を定量化することによって、相対的結合親和性を決定することができる。Sulfo-NHS-ビオチンなどを用いて抗体などの抗原結合分子または抗体をビオチン化する方法は公知である。GSTタグをFcγ受容体に付加するための適切な方法には、Fcγ受容体をコードするポリペプチドとGSTをコードするポリペプチドをインフレームで融合し、該融合遺伝子を保有するベクターが導入された細胞を用いて該遺伝子を発現させ、次いでグルタチオンカラムを用いて精製することを伴う方法が含まれる。誘導されたシグナルは好ましくは、例えば、GRAPHPAD PRISM（GraphPad；San Diego）などのソフトウェアを用いて非線形回帰分析に基づく一部位競合モデルに適合させることにより、解析することができる。
相互作用を観察するための物質の一方を、リガンドとしてセンサーチップの金薄膜上に固定化する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射が起こるようにセンサーチップの裏面から光を当てると、ある特定の部位において反射光の強度が部分的に低下する（SPRシグナル）。相互作用を観察するための他方の物質を、分析物としてセンサーチップの表面上に注入する。分析物がリガンドに結合すると、固定化リガンド分子の質量が増加する。これにより、センサーチップの表面上の溶媒の屈折率が変化する。屈折率の変化は、SPRシグナルの位置のシフトを引き起こす（逆に、解離するとシグナルは元の位置にシフトして戻る）。Biacoreシステムでは、上記のシフトの量（すなわち、センサーチップ表面上での質量の変化）を縦軸にプロットし、そのようにして経時的な質量の変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムの曲線から動態パラメーター（会合速度定数 (ka) および解離速度定数 (kd)）が決定され、これら2つの定数の比率から親和性 (KD) が決定される。BIACORE法では、阻害アッセイが好ましく用いられる。そのような阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010に記載されている。
多重特異性抗体の産生および精製
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方またはもう一方に融合された、2種類の異なる抗原結合部分（例えば、「第1の抗原結合部分」および「第2の抗原結合部分」）を含み、よって、Fcドメインの2つのサブユニットは典型的には、2本の同一でないポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現および続いての二量体化は、2つのポリペプチドの複数の組み合わせの可能性をもたらす。よって、組換え産生における多重特異性抗原結合分子の収量および純度を改善するために、所望のポリペプチドの会合を促進する改変を多重特異性抗原結合分子のFcドメイン中に導入することは有利となる。
本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方またはもう一方に融合された、2種類の異なる抗原結合部分（例えば、「第1の抗原結合部分」および「第2の抗原結合部分」）を含み、よって、Fcドメインの2つのサブユニットは典型的には、2本の同一でないポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現および続いての二量体化は、2つのポリペプチドの複数の組み合わせの可能性をもたらす。よって、組換え産生における多重特異性抗原結合分子の収量および純度を改善するために、所望のポリペプチドの会合を促進する改変を多重特異性抗原結合分子のFcドメイン中に導入することは有利となる。
したがって、特定の態様において、本明細書において記載される多重特異性抗原結合分子のFcドメインは、Fcドメインの第1のサブユニットと第2のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトIgG Fcドメインの2つのサブユニット間での最も広範囲のタンパク質-タンパク質相互作用の部位は、FcドメインのCH3ドメイン中にある。したがって、1つの態様において、該改変はFcドメインのCH3ドメイン中にある。
特定の態様において、該改変は、Fcドメインの2つサブユニットの一方における「ノブ(knob)」改変と、Fcドメインの2つのサブユニットのもう一方における「ホール(hole)」改変とを含む、いわゆる「knob-into-hole」改変である。
knob-into-holeテクノロジーは、例えば、米国特許第5,731,168号；米国特許第7,695,936号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)；およびCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、方法は、突起（「knob」）が空隙（「hole」）中に位置し、ヘテロ二量体の形成を促進しかつホモ二量体の形成を妨げることができるように、突起を第1のポリペプチドの界面に、および対応する空隙を第2のポリペプチドの界面に導入する段階を伴う。突起は、第1のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同じまたは同様のサイズの補償的な空隙は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって第2のポリペプチドの界面に作出される。
したがって、特定の態様においては、多重特異性抗原結合分子のFcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空隙中に位置することができる第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が位置することができる第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空隙が生成される。
突起および空隙は、ポリペプチドをコードする核酸を例えば部位特異的変異誘発によって変更することによって、またはペプチド合成によって、作ることができる。
特定の態様において、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、366位のスレオニン残基は、トリプトファン残基で置き換えられ（T366W）、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、407位のチロシン残基は、バリン残基で置き換えられる（Y407V）。1つの態様において、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、さらに、366位のスレオニン残基は、セリン残基で置き換えられ（T366S）、368位のロイシン残基は、アラニン残基で置き換えられる（L368A）。
なおさらなる態様において、Fcドメインの第1のサブユニットにおいて、さらに、354位のセリン残基は、システイン残基で置き換えられ（S354C）、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、さらに、349位のチロシン残基は、システイン残基によって置き換えられる（Y349C）。これらの2つのシステイン残基の導入は、Fcドメインの2つのサブユニット間にジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
他の態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子には、所望の組み合わせを有するH鎖間およびL鎖H鎖間の会合を促進するための他の技術を適用することができる。
例えば、多重特異性抗体の会合には、抗体H鎖の第2の定常領域または第3の定常領域（CH2またはCH3）の界面に静電気的反発を導入することにより望ましくないH鎖会合を抑制する技術を適用することができる（WO2006/106905）。
CH2またはCH3の界面に静電気的反発を導入することにより意図しないH鎖会合を抑制する技術において、H鎖の他方の定常領域の界面で接触するアミノ酸残基の例には、CH3領域におけるEUナンバリング位置356位、439位、357位、370位、399位、および409位の残基に対応する領域が含まれる。
より具体的には、2種のH鎖CH3領域を含む抗体であって、第1のH鎖CH3領域における、以下の（1）～（3）に示すアミノ酸残基の対から選択される1～3対のアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体が、例として挙げられる：（1）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置356位および439位のアミノ酸残基、（2）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置357位および370位のアミノ酸残基、ならびに（3）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置399位および409位のアミノ酸残基。
さらに、該抗体は、上記第1のH鎖CH3領域とは異なる第2のH鎖CH3領域におけるアミノ酸残基の対が、前記（1）～（3）のアミノ酸残基の対から選択され、前記第1のH鎖CH3領域において同種の電荷を有する前記（1）～（3）のアミノ酸残基の対に対応する1～3対のアミノ酸残基が、前記第1のH鎖CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する抗体であってもよい。
上記（1）～（3）に示されるそれぞれのアミノ酸残基は、会合した際に互いに接近している。当業者であれば、所望のH鎖CH3領域またはH鎖定常領域において、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、上記（1）～（3）のアミノ酸残基に対応する位置を見出すことができ、適宜、これらの位置のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の群のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい：
(a) グルタミン酸（E）およびアスパラギン酸（D）、ならびに
(b) リジン（K）、アルギニン（R）、およびヒスチジン（H）。
(a) グルタミン酸（E）およびアスパラギン酸（D）、ならびに
(b) リジン（K）、アルギニン（R）、およびヒスチジン（H）。
上記抗体において、語句「同じ電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記の群(a)および(b)のうちいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。語句「反対の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のうちの少なくとも1つのアミノ酸残基が、上記の群(a)および(b)のうちいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択される場合に、残りのアミノ酸残基が他の群に含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。
好ましい態様において上記抗体は、その第1のH鎖CH3領域と第2のH鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明において、改変に供するアミノ酸残基は、上述した抗体可変領域または抗体定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、変異ポリペプチドまたは異種多量体において、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基を同定することができ、次いでこれらの位置のアミノ酸残基を、会合を制御するように改変に供することが可能である。
加えて、本発明の多重特異性抗体の形成には他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖CH3の一部を対応するIgA由来の配列に変え、対応するIgA由来の配列を他方のH鎖CH3の相補的な部分に導入することにより生成された鎖交換操作ドメインCH3（strand-exchange engineered domain CH3）を用いて、異なる配列を有するポリペプチドの会合をCH3の相補的な会合によって効率的に誘導することができる (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。この公知技術を用いて効率的に目的の多重特異性抗体を形成させることもできる。
加えて、多重特異性抗原結合分子の形成には、WO2011/028952、WO2014/018572およびNat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8に記載されるような抗体のCH1とCLの会合およびVHとVLの会合を利用した抗体製造技術、WO2008/119353およびWO2011/131746に記載されるような別々に調製したモノクローナル抗体を組み合わせて使用して二重特異性抗体を製造する技術(Fab Arm Exchange)、WO2012/058768およびWO2013/063702に記載されるような抗体重鎖CH3間の会合を制御する技術、WO2012/023053に記載されるような2種類の軽鎖と1種類の重鎖とから構成される多重特異性抗体を製造する技術、Christophら（Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013)）によって記載されるような1本のH鎖と1本のL鎖を含む抗体の片鎖をそれぞれ発現する2つの細菌細胞株を利用した多重特異性抗体を製造する技術等を用いてもよい。
あるいは、目的の多重特異性抗体を効率的に形成させることができない場合であっても、産生された抗体から目的の多重特異性抗体を分離し精製することによって、本発明の多重特異性抗体を得ることが可能である。例えば、2種類のH鎖の可変領域にアミノ酸置換を導入することにより等電点の差を付与することで、2種類のホモ体と目的のヘテロ抗体をイオン交換クロマトグラフィーで精製することを可能にする方法が報告されている（WO2007114325）。ヘテロ抗体を精製する方法として、これまでに、プロテインAに結合するマウスIgG2aのH鎖とプロテインAに結合しないラットIgG2bのH鎖とを含むヘテロ二量化抗体を、プロテインAを用いて精製する方法が報告されている（WO98050431およびWO95033844）。さらに、IgGとプロテインAの結合部位であるEUナンバリング位置435位および436位のアミノ酸残基を、異なるプロテインA親和性をもたらすアミノ酸であるTyr、Hisなどに置換したH鎖を用いて、あるいは、異なるプロテインA親和性を有するH鎖を用いて、各H鎖とプロテインAとの相互作用を変化させ、次いでプロテインAカラムを用いることにより、ヘテロ二量化抗体のみを効率的に精製することができる。
さらに、本発明のFc領域として、Fc領域のC末端のヘテロジェニティーが改善されたFc領域が適宜使用され得る。より具体的には、本発明は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4由来のFc領域を構成する2つのポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングによって特定される446位のグリシンおよび447位のリジンを欠失させることにより生成されたFc領域を提供する。
本明細書において記載されるように調製された多重特異性抗原結合分子は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー等の当技術分野において公知の技術によって精製されてもよい。特定のタンパク質を精製するために用いられる実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性等の因子に一部依存し、当業者に明らかである。アフィニティクロマトグラフィー精製では、多重特異性抗原結合分子が結合する、抗体、リガンド、受容体、または抗原を用いることができる。例えば、本発明の多重特異性抗原結合分子のアフィニティクロマトグラフィー精製では、プロテインAまたはプロテインGを有するマトリックスが用いられてもよい。多重特異性抗原結合分子を単離するために、連続したプロテインAまたはGアフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いることができる。多重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動および高圧液体クロマトグラフィー等を含む、様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
本明細書において引用したすべての文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
[実施例１]（1＋2）三価フォーマットおよび（1＋2）Dual/LINC三価フォーマットの抗体作製
１．１．三価（1＋2）フォーマットおよび三価（1＋2）Dual/LINCフォーマットの作製および配列
１．１．三価（1＋2）フォーマットおよび三価（1＋2）Dual/LINCフォーマットの作製および配列
CD137受容体クラスター形成は効果的なアゴニスト活性にとって重要な意味をもつ。細胞傷害性を改善するために、DUAL/LINC、1＋2と名付けられた新たな三価抗体フォーマットを設計することによって、CD137分子への結合数を増加させた（図1（a）、表2）。具体的には、新たな抗体フォーマットは、それぞれが1つのCD3またはCD137に結合できるが同時ではない2つの一価Dual-Fab（図1のFvBおよびFvC、参考実施例3で調製される）と、1つの一価腫瘍抗原結合アーム（図1のFvA）とを含む、「1＋2」フォーマットを有する三価三重特異性抗体であり、ここで、1つのジスルフィド結合（「LINC」）が、例えば、2つのDual-FabのそれぞれのCH1ドメインの191位に、システイン置換（KabatナンバリングでS191C）を導入することによって、2つのDual-Fab間に導入/設計されている（図1a）。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、そのように設計されたジスルフィド結合（「LINC」）は、2つのDual-Fab間の立体障害または短い距離の結果として、2つのDual-Fabの抗原（CD3またはCD137）結合配向性をシス抗原結合（すなわち、同じ細胞上の2つの抗原への結合）に制限し、それによって、腫瘍抗原非依存的に2つのDual-Fabによって媒介される2つのCD3/CD137発現免疫細胞の望ましくない架橋形成を妨げることによって三重特異性抗体の安全性プロファイルを改善することを企図した（図2a）。Fc領域はFcγRサイレントであり、かつ脱グリコシル化された。三重特異性抗体における各Fv領域の標的抗原および各結合ドメインの命名規則を表2（a）に示し、配列番号を表2（b）および（c）に示す。
（表２）
（a）抗体名および標的アーム
（b）抗体鎖番号および配列ID
（c）可変領域およびそのCDR1～CDR3の配列ID
（a）抗体名および標的アーム
すべての抗体をExpi293細胞（Invitrogen）での一過性発現によって三価形態として発現させ、参考実施例1に従って精製した。抗体の純度を、図3に示すように非還元SDS-PAGE（参考実施例2）によって分析し、（1＋2）Dual/LINC三価抗体試料で二重のバンドを観察した。タンパク質の三次構造はポリペプチドのSDS-PAGE泳動速度に影響を与える可能性があることが示されており、ジスルフィドで連結された立体構造は非還元条件でSDS-PAGE泳動速度を増加させた（Therien AG, Grant FE, Deber CM (2001) Interhelical hydrogen bonds in the CFTR membrane domain. Nat Struct Biol 8:597-601）。図3において、S191C変異の導入を有さない（1＋2）三価フォーマット（図3、レーン2、5および7）で単一のタンパク質泳動バンドが確認された。これに対して、S191C変異を有する（1＋2）Dual/LINC抗体バリアント試料では2本のタンパク質泳動バンドが検出され、より遅い泳動バンド（または上側のバンド）は、S191C変異の導入を有さない（1＋2）三価フォーマットと同様の電気泳動移動度を示した。これは、より速い泳動バンド（または下側のバンド）が、操作されたジスルフィド結合を有する三価 1＋2抗体（Dual/LINC、図1a）であったことを示唆する。UnLINCフォーマット（すなわち、操作されたジスルフィド結合を有さない三価 1＋2抗体、図1b）は、腫瘍抗原への結合の非存在下でCD137および/またはCD3発現免疫細胞の架橋形成をもたらすおそれがある（図2aに図示するように）ことから、最終フォーマット産物において、UnLINCフォーマットを低下させるさらなる精製が必要とされる。
[実施例２] 還元試薬処理によるDual/LINC純度の向上
実施例２．１ 還元剤を用いる、Dual/LINC抗体における「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成の促進
以下の理論に拘束されることを望むものではないが、UnLINCフォーマット（すなわち、操作されたジスルフィド結合を有さない三価 1＋2抗体、または「対をなさないシステイン」形態）の存在は、対をなさないCys残基を「キャップ」してLINC形成（操作されたジスルフィド結合の形成）を妨げるシステイン化およびグルタチオン化など、遊離チオール基を含有する分子とジスルフィド結合を往々にして形成する対をなさないCys残基を原因とする可能性があると考えられる。図2（b）に示されるように、対をなさないシステインのキャップされた分子を除去するために、還元剤は、表面システインの脱キャップを助けることができ、脱キャップされた抗体のさらなる再酸化（例えば、バッファー交換による還元試薬の除去）は、LINC形成のための脱キャップされたシステイン間のジスルフィド結合形成を促進することができる。したがって、還元および再酸化によるUnLINCフォーマットにおける対をなさないスルフヒドリルからのシステイン化の除去は、UnLINCフォーマットを除去し、抗体の均一性を改善する可能性がある。
均一なDual-LINC抗体調製物を得るために、システインでキャップされた対をなさないシステインを、脱キャップし、「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成を促進する必要があった。対をなさないシステインを脱キャップするために、種々の還元剤を用いた。対をなすシステイン形態と対をなさないシステイン形態とを含む不均一なDual-LINC抗体調製物を、システインまたはTCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）または2MEA（2-メルカプトエチルアミン）などの還元剤の添加によって、脱キャップに供した。脱キャップに続いて、バッファー交換により還元剤を除去し、Dual-LINC抗体調製物における「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成を促進した。バッファー交換の他に、システイン結合の形成を促進することが公知のCuSO4を、「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成を増強するために用いた。0.5 mg/ml（2.5 μM）のDual-LINC抗体調製物を、2mMシステイン、5 mMシステイン、50 μM TCEP、100 μM TCEP、および25 mM 2MEAで37℃にて2時間処理し、続いてCuSO4なしまたは25 μM/50 μM CuSO4ありのいずれかで1×TBSによってバッファー交換した。すべての条件のうち、TCEP処理は、Dual-LINC抗体調製物における「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成の有意な増加を示したことが観察された。システイン、2MEA、およびCuSO4の添加は、TCEPのようには「対をなすシステイン」形成（操作されたジスルフィド結合）を増加させなかった（図4）。
実施例２．１ 還元剤を用いる、Dual/LINC抗体における「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成の促進
以下の理論に拘束されることを望むものではないが、UnLINCフォーマット（すなわち、操作されたジスルフィド結合を有さない三価 1＋2抗体、または「対をなさないシステイン」形態）の存在は、対をなさないCys残基を「キャップ」してLINC形成（操作されたジスルフィド結合の形成）を妨げるシステイン化およびグルタチオン化など、遊離チオール基を含有する分子とジスルフィド結合を往々にして形成する対をなさないCys残基を原因とする可能性があると考えられる。図2（b）に示されるように、対をなさないシステインのキャップされた分子を除去するために、還元剤は、表面システインの脱キャップを助けることができ、脱キャップされた抗体のさらなる再酸化（例えば、バッファー交換による還元試薬の除去）は、LINC形成のための脱キャップされたシステイン間のジスルフィド結合形成を促進することができる。したがって、還元および再酸化によるUnLINCフォーマットにおける対をなさないスルフヒドリルからのシステイン化の除去は、UnLINCフォーマットを除去し、抗体の均一性を改善する可能性がある。
均一なDual-LINC抗体調製物を得るために、システインでキャップされた対をなさないシステインを、脱キャップし、「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成を促進する必要があった。対をなさないシステインを脱キャップするために、種々の還元剤を用いた。対をなすシステイン形態と対をなさないシステイン形態とを含む不均一なDual-LINC抗体調製物を、システインまたはTCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）または2MEA（2-メルカプトエチルアミン）などの還元剤の添加によって、脱キャップに供した。脱キャップに続いて、バッファー交換により還元剤を除去し、Dual-LINC抗体調製物における「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成を促進した。バッファー交換の他に、システイン結合の形成を促進することが公知のCuSO4を、「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成を増強するために用いた。0.5 mg/ml（2.5 μM）のDual-LINC抗体調製物を、2mMシステイン、5 mMシステイン、50 μM TCEP、100 μM TCEP、および25 mM 2MEAで37℃にて2時間処理し、続いてCuSO4なしまたは25 μM/50 μM CuSO4ありのいずれかで1×TBSによってバッファー交換した。すべての条件のうち、TCEP処理は、Dual-LINC抗体調製物における「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成の有意な増加を示したことが観察された。システイン、2MEA、およびCuSO4の添加は、TCEPのようには「対をなすシステイン」形成（操作されたジスルフィド結合）を増加させなかった（図4）。
TCEP処理をさらに最適化するために、種々の濃度のDual-LINC-Igを様々なモル比のTCEPと室温にて2時間インキュベートし、続いて1×PBSへとバッファー交換し（TCEPを除去するため）、「対をなすシステイン」形成を促進した。0.5 mg/ml（2.5 μM）、1 mg/ml（5 μM）、5 mg/ml（25 μM）および10 mg/ml（50 μM）の様々な濃度のDual-LINC-Igにおいて、Dual-LINC抗体調製物およびTCEPを1:10、1:20および1:30モル比で添加した。高濃度、例えば、5 mg/mlおよび10 mg/mlもまた、SDS-PAGE分析に基づく「対をなすシステイン」（操作されたジスルフィド結合）形成の有意な増加を示した（図5）。
TCEP処理でのインキュベーション期間をさらに最適化するために、反応を、1:2、1:5および1:10のモル比のDual-LINC-Ig（50 μM）およびTCEPで2時間または18時間の異なるインキュベーション期間で実施した。すべての条件において、対をなさないシステイン（操作されたジスルフィド結合）を有するDual-LINC-Igは、SDS-PAGE分析（図6での「LINC」および「UnLINC」構造に対応する2本のバンドの強度の合計で割った、「UnLINC」フォーマットに対応する遅いバンド/上側のバンドの強度）に基づき＜10％まで低下し、Dual-LINC-Igの均一性をさらに増加させた（図6）。すべての条件のうち、室温にて18時間のインキュベーション期間、続いてオーバーナイト（O/N）再酸化のための1×PBS へのバッファー交換を行った1:5の比のDual-LINC抗体調製物およびTCEPが、対をなすシステイン形成を有するDual-LINCを最も多く示した。
以下は本発明のアミノ酸配列の例を示す。
（表３）
[実施例３] 抗体調製物から「対をなすシステイン」形成を有さないDual/LINCを分離するためのアフィニティクロマトグラフィーアプローチ
実施例３．１ 「対をなさないシステイン」形態を有する（操作されたジスルフィド結合を有さない）抗体だけに特異的に結合する立体構造特異的抗体の概念
実施例３．１ 「対をなさないシステイン」形態を有する（操作されたジスルフィド結合を有さない）抗体だけに特異的に結合する立体構造特異的抗体の概念
実施例2に記載されるように、操作されたシステインを有する抗体調製物（例えば、図1、表2に示される三価1＋2抗体）は、操作されたジスルフィド結合を有する抗体アイソフォーム（「対をなすシステイン」または「LINC」形態）および操作されたジスルフィド結合を有さない抗体アイソフォーム（「対をなさないシステイン」または「unLINC」形態）の不均一な集団を含む。操作されたジスルフィド結合を有さないこれらの抗体（「対をなさないシステイン」または「unLINC」形態）を抗体調製物から分離または除去するために、「対をなさないシステイン」形態の抗体に特異的に結合するおよび/またはそれを捕捉することができるが、「対をなすシステイン」形態の抗体には結合しない立体構造特異的抗体を、アフィニティクロマトグラフィー精製、分析および/または定量化適用での使用のためのツール抗体として作製することができる。
1つの態様において、標的抗体は、2つのFabのそれぞれに操作されたシステインを含むIgG（1＋1）フォーマットであり、そのような立体構造特異的抗体は、操作されたジスルフィド結合を標的抗体が有さない（「対をなさないシステイン」形態）時にだけ立体構造特異的抗体にアクセス可能であるエピトープに特異的に結合/認識する抗体であり、そのようなエピトープは、例えば、2つのFab間の立体障害または短い距離に起因して、操作されたジスルフィド結合を標的抗体が有する（「対をなすシステイン」形態）時には、立体構造特異的抗体にアクセスできない（図7）。1つの好ましい態様において、操作されたシステインは、2つのFabのそれぞれのCH1領域に位置し、そのようなエピトープは、標的抗体が「対をなさないシステイン」形態を有する時にのみ立体構造特異的抗体にアクセス可能であるCH1領域内に位置し、そのようなエピトープは、2つのFab間の立体障害または短い距離に起因して、標的抗体が「対をなすシステイン」形態を有する時には立体構造特異的抗体はアクセスできない（図7）。
さらに別の態様において、標的抗体は、3つのFab部分を含む図8に示されるDual/LINC、1＋2と呼ばれる三価1＋2抗体であり、Fabのうち2つ（すなわち、それぞれ鎖1-鎖5および鎖3-鎖4で構成されるFab BおよびFab C）はそれぞれ、両方のFabを連結する操作されたジスルフィド結合を形成できる操作されたシステインを含み、したがって「対をなさないシステイン」 もしくは「unLINC」形態、または「対をなすシステイン」もしくは「LINC」形態のいずれかで存在することができ；1つのFab（鎖1-鎖2で構成されるFab A）は、操作されたシステインを含まず、「対をなさないシステイン」または「unLINC」形態でのみ存在することができる。抗体調製物から「対をなさないシステイン」または「unLINC」形態を有するDual/LINC、1＋2フォーマットを有する抗体を分離するために、立体構造特異的抗体を、「対をなさないシステイン」形態または「対をなすシステイン」形態のいずれかで存在することができる2つのFab（それぞれ鎖1-鎖5および鎖3-鎖4で構成されるFab BおよびFab C）に特有であり、かつ操作されたシステインを含まない（「対をなすシステイン」形態でのみ存在する）他のFab（鎖1-鎖2で構成されるFab A）には存在しないエピトープに特異的に結合するようにさらに選択した。1つの好ましい態様において、「対をなさないシステイン」形態または「対をなすシステイン」形態のいずれかで存在することができる2つのFab（それぞれ鎖1-鎖5および鎖3-鎖4で構成されるFab BおよびFab C）はそれぞれ、第1のヒトIgGサブクラスのCH1ドメイン（例えば、ヒトIgG1 CH1）を含むのに対して、他のFab（鎖1-鎖2で構成されるFab A）は、第1のヒトIgGサブクラスとは異なる他のIgGサブクラスのCH1ドメイン（例えば、ヒトIgG4 CH1）を含む。そのような好ましい態様において、立体構造特異的抗体は、「対をなさないシステイン」形態にある第1のヒトIgGサブクラスのCH1ドメイン（例えば、ヒトIgG1 CH1）にだけ特異的に結合する（図8b）が、「対をなすシステイン」形態にある第1のヒトIgGサブクラスのCH1ドメイン（例えば、ヒトIgG1 CH1）または第1のヒトIgGサブクラスとは異なる他のIgGサブクラスのCH1ドメイン（例えば、ヒトIgG4 CH1）に結合しない（図8c）ように、作製され、選択された。
実施例３．２ 「対をなさないシステイン」形態にあるDual/LINC 1＋2抗体のCH1に特異的に結合する立体構造特異的抗CH1抗体の作製
抗CH1抗体を、以下のように調製し、選択し、発現させた：6匹のNZWウサギを、操作されたヒトIgG1 Fabで皮内免疫した。4回の反復投与を2ヶ月の期間にわたって与え、続いて、血液および脾臓を収集した。操作されたヒトIgGに結合できるB細胞をセルソーターを用いて選別し、次いで、プレーティングし、WO2016098356A1に記載される手法に従って培養した。培養後、B細胞培養上清をさらなる分析のために収集し、B細胞ペレットを凍結保存した。κ軽鎖を有する組換えIgG1およびλ軽鎖を有する組換えIgGへの結合を、B細胞培養上清を用いてELISAによって評価した。κ軽鎖を有する組換えIgG1およびλ軽鎖を有する組換えIgGの両方に結合できるB細胞が、遺伝子クローニングにとって好ましく、そして選択された。
抗CH1抗体を、以下のように調製し、選択し、発現させた：6匹のNZWウサギを、操作されたヒトIgG1 Fabで皮内免疫した。4回の反復投与を2ヶ月の期間にわたって与え、続いて、血液および脾臓を収集した。操作されたヒトIgGに結合できるB細胞をセルソーターを用いて選別し、次いで、プレーティングし、WO2016098356A1に記載される手法に従って培養した。培養後、B細胞培養上清をさらなる分析のために収集し、B細胞ペレットを凍結保存した。κ軽鎖を有する組換えIgG1およびλ軽鎖を有する組換えIgGへの結合を、B細胞培養上清を用いてELISAによって評価した。κ軽鎖を有する組換えIgG1およびλ軽鎖を有する組換えIgGの両方に結合できるB細胞が、遺伝子クローニングにとって好ましく、そして選択された。
望ましい結合特性を有する選択されたB細胞株のRNAを、ZR-96 Quick-RNAキット（ZYMO RESEARCH, Cat No. R1053）を用いてその凍結保存細胞ペレットから精製した。選択された株での抗体重鎖可変領域をコードするDNAを、逆転写PCRによって増幅し、ウサギIgG重鎖定常領域をコードするDNAで組換えた。抗体軽鎖可変領域をコードするDNAもまた、逆転写PCRによって増幅し、ウサギκ軽鎖定常領域をコードするDNAで組換えた。上記に記載した手法に従って、クローニングした抗体を発現させ、培養上清から精製した。
実施例３．３ 「対をなさないシステイン」形態にあるDual/LINC 1＋2抗体のCH1に特異的に結合する立体構造特異的抗CH1抗体の特定
立体構造特異的抗CH1抗体をスクリーニングしかつ特定するために、以下の5つの抗体をスクリーニングツールとして作製した。5つの抗体の抗体フォーマットを（図9a）に図示し、抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を（図9b）に示す：
（1）および（2）IgG1_001およびDualAE05-SG1201のそれぞれは、S191Cシステイン置換を有さないヒトIgG1 CH1を有する二価抗体である（図9a左パネル）。この抗体を用いて、（EUナンバリングの191位に操作されたジスルフィド結合を有さない）ヒトIgG1のCH1ドメインに特異的に結合するが、（EUナンバリングの191位に操作されたジスルフィド結合を有さない）ヒトIgG4のCH1ドメインに結合しない、抗CH1抗体をスクリーニングおよび特定した。
（3）DualAE05-SG1202は、S191Cシステイン置換を有するDualAE05-SG1201に対応する（図9a中央のパネル）。それは、S191Cを介して両方のFabを連結する操作されたジスルフィド結合を形成でき、したがって、「対をなさないシステイン」形態または「対をなすシステイン」形態のいずれかで存在することができる抗体に対応する。
（4）DualAE05-SG1202k/SG1201hV11は、Fabアームの一方がS191C変異を含み、もう一方のFabアームがS191C変異を含まない、ヒトIgG1 CH1を有する二重特異性抗体に対応する（図9a右パネル）。DualAE05-SG1202k/SG1201hV11重鎖のヘテロ二量体化を、knob into Holeエンジニアリングにより制御した。それは、S191C変異を含むが、S191Cを介して両方のFabを連結する操作されたジスルフィド結合を形成することができず、したがって、「対をなさないシステイン」形態でのみ存在することができる抗体である。
（5）IgG4_001は、S191Cシステイン置換を有さないヒトIgG4 CH1を有する二価抗体である（図9a左パネル）。この抗体を用いて、（操作されたジスルフィド結合を有さない）ヒトIgG1のCH1ドメインに特異的に結合するが、（操作されたジスルフィド結合を有さない）ヒトIgG4のCH1ドメインに結合しない、抗CH1抗体をスクリーニングおよび特定した。
立体構造特異的抗CH1抗体をスクリーニングしかつ特定するために、以下の5つの抗体をスクリーニングツールとして作製した。5つの抗体の抗体フォーマットを（図9a）に図示し、抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を（図9b）に示す：
（1）および（2）IgG1_001およびDualAE05-SG1201のそれぞれは、S191Cシステイン置換を有さないヒトIgG1 CH1を有する二価抗体である（図9a左パネル）。この抗体を用いて、（EUナンバリングの191位に操作されたジスルフィド結合を有さない）ヒトIgG1のCH1ドメインに特異的に結合するが、（EUナンバリングの191位に操作されたジスルフィド結合を有さない）ヒトIgG4のCH1ドメインに結合しない、抗CH1抗体をスクリーニングおよび特定した。
（3）DualAE05-SG1202は、S191Cシステイン置換を有するDualAE05-SG1201に対応する（図9a中央のパネル）。それは、S191Cを介して両方のFabを連結する操作されたジスルフィド結合を形成でき、したがって、「対をなさないシステイン」形態または「対をなすシステイン」形態のいずれかで存在することができる抗体に対応する。
（4）DualAE05-SG1202k/SG1201hV11は、Fabアームの一方がS191C変異を含み、もう一方のFabアームがS191C変異を含まない、ヒトIgG1 CH1を有する二重特異性抗体に対応する（図9a右パネル）。DualAE05-SG1202k/SG1201hV11重鎖のヘテロ二量体化を、knob into Holeエンジニアリングにより制御した。それは、S191C変異を含むが、S191Cを介して両方のFabを連結する操作されたジスルフィド結合を形成することができず、したがって、「対をなさないシステイン」形態でのみ存在することができる抗体である。
（5）IgG4_001は、S191Cシステイン置換を有さないヒトIgG4 CH1を有する二価抗体である（図9a左パネル）。この抗体を用いて、（操作されたジスルフィド結合を有さない）ヒトIgG1のCH1ドメインに特異的に結合するが、（操作されたジスルフィド結合を有さない）ヒトIgG4のCH1ドメインに結合しない、抗CH1抗体をスクリーニングおよび特定した。
DualAE05-SG1201、DualAE05-SG1202、DualAE05-SG1202k/SG1201hV11、IgG1_001、およびIgG4_001抗体をExpi293（Invitrogen）で発現し、プロテインA精製、続いてゲル濾過によって精製した。
Biacore結合実験をBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて37℃にて実施し、DualAE05-SG1201、DualAE05-SG1202、DualAE05-SG1202k/SG1201hV11、IgG1_001、およびIgG4_001に対する実施例3.2で調製した抗CH1抗体の結合活性を特徴づけた。具体的には、マウス抗ヒトFc（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセルの上に固定化した。ツール抗体DualAE05-SG1201、DualAE05-SG1202、DualAE05-SG1202k/SG1201hV11、IgG1_001、およびIgG4_001をフローセルの上に捕捉し、次いで、実施例3.2から得られた抗CH1抗体をすべてのフローセルの上にインジェクトした。すべての抗体を、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。センサー表面を3M MgCl2でサイクル毎に再生させた。
IgG1_001、DualAE05-SG1201、およびDualAE05-SG1202k/SG1201hV11に実質的に結合するが、IgG4_001およびDualAE05-SG1202のそれぞれに実質的に結合しない抗CH1抗体が、「対をなさないシステイン」形態にあるヒトIgG1のCH1ドメインに特異的に結合するが、「対をなすシステイン」形態にあるヒトIgG1のCH1ドメインまたはヒトIgG4 CH1のCH1ドメインに結合しない立体構造特異的抗体を得るためのスクリーニング基準を満たし得ることが決定された。スクリーニングの結果として、4つの抗体、すなわち、FAB0059ff、FAB0060hh、FAB0133hh、およびFAB0135hhが、「対をなさないシステイン」形態にあるDual/LINC 1＋2抗体に特異的に結合する立体構造特異的抗CH1抗体として見出されかつ選択された（表5）。表4に示されるように、これらの立体構造特異的抗CH1抗体は、IgG1_001、DualAE05-SG1201、およびDualAE05-SG1202k/SG1201hV11のそれぞれに対して相対的に強い結合活性（相対的結合活性＞0.8）を示し、一方、IgG4_001（相対的結合活性＜0.1）およびDualAE05-SG1202（相対的結合活性＜0.5）に対して結合活性を示さないかまたは相対的に弱い結合活性を示す。
表4は、ツール抗体DualAE05-SG1201、DualAE05-SG1202、DualAE05-SG1202k/SG1201hV11、IgG1_001、および IgG4_001のそれぞれに対する抗CH1抗体の相対的結合活性を示す。（IgG1_001のRU結合値に対して正規化される）ツール抗体に対する相対的結合活性の値は、ツール抗体に対する抗CH1抗体のBiacore結合反応（RU）をIgG1_001に対する抗CH1抗体のRU結合値で割ることによって得られる。
（表４）
立体構造特異的抗CH1抗体の物理化学特性を改善するために、CDR領域にあるシスチン残基を、FAB0059ff、FAB0060hh、およびFAB0133hhから取り除き、その後、それぞれFAB0059Hf/FAB0059L0001、FAB0060Hh/FAB0060L0001、およびFAB0133Hh/FAB0133L0001と名付けた。立体構造特異的抗CH1抗体のアミノ酸配列の配列番号を表５に示した。
（表５）
実施例３．４ 抗体調製物から「対をなさないシステイン」形態を有するDual/LINC 1＋2抗体を取り除くための立体構造特異的抗CH1抗体の使用
実施例3.3に記載される立体構造特異的抗CH1抗体は、例えば細胞培養上清から回収した、抗体調製物から、「対をなさないシステイン」形態にあるDual/LINC 1＋2抗体を選択的に捕捉または除去するためのリガンドまたはバインダーとして用いることができる。例えば、立体構造特異的抗CH1抗体は、アフィニティ精製を用いて抗体調製物から「対をなさないシステイン」形態にあるDual/LINC 1＋2抗体を取り除くためのカラムに固定化することができる。
実施例3.3に記載される立体構造特異的抗CH1抗体は、例えば細胞培養上清から回収した、抗体調製物から、「対をなさないシステイン」形態にあるDual/LINC 1＋2抗体を選択的に捕捉または除去するためのリガンドまたはバインダーとして用いることができる。例えば、立体構造特異的抗CH1抗体は、アフィニティ精製を用いて抗体調製物から「対をなさないシステイン」形態にあるDual/LINC 1＋2抗体を取り除くためのカラムに固定化することができる。
立体構造特異的抗CH1抗体、FAB0133Hh/FAB0133L0001；およびDual/LINC 1＋2抗体、DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056を、Expi293発現系（Thermo Fisher Scientific）を用いて、一過性にトランスフェクトおよび発現させた。DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056のフォーマットは、図8aに示される分子フォーマットを有し、かつ配列番号：142（鎖1）、配列番号：147（鎖2）、配列番号：148（鎖3）、および配列番号：157（鎖4＆5）のアミノ酸配列によって表される5本のポリペプチド鎖を含む。細胞培養上清を回収し、MabSelect SuReアフィニティクロマトグラフィー（GE Healthcare）、続いてSuperdex200（GE Healthcare）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、抗体を上清から精製した。
アフィニティ精製では、精製されたFAB0133Hh/FAB0133L0001とコンジュゲートしたNHSセファロース樹脂をXK 16/20カラム（GE Healthcare）に充填した。プロテインAクロマトグラフィー処理後、DLL3-DualAE05/DualAE05-FF056の抗体調製物をXK 16/20カラムにアプライし、カラム上での「対をなさないシステイン」形態にあるDLL3-DualAE05/DualAE05-FF056の特異的捕捉/結合を可能にした。ここで、「対をなすシステイン」形態にあるDLL3-DualAE05/DualAE05-FF056抗体は、カラムによって捕捉または結合されず、主にフロースルー画分中に出現する。その後、アフィニティ捕捉された、「対をなさないシステイン」形態にあるDLL3-DualAE05/DualAE05-FF056を、50mM HClでの処理によって溶出した。図10は、立体構造特異的抗CH1抗体FAB0133Hh/FAB0133L0001カラムを用いるDLL3-DualAE05/DualAE05-FF056のアフィニティ精製で溶出された抗体のクロマトグラフィープロファイル（図10a）および非還元SDS-PAGE分析（図10b）を示す。具体的には、フロースルー画分は、非還元SDS-PAGE分析においてより早く泳動する1本の優勢なタンパク質バンドによって示される「対をなすシステイン」または「LINC」形態にあるDualAE05/DualAE05-FF056（フロースルー：白色バー）を高い純度で含み（レーン1から13）；洗浄画分は、「対をなさないシステイン」形態にあるDualAE05/DualAE05-FF056と「対をなすシステイン」形態にあるDualAE05/DualAE05-FF056との混合物を含み（洗浄液：灰色バー、レーン14から19）；溶出画分は、非還元SDS-PAGE分析でより遅く泳動する1本の優勢なタンパク質バンドによって示される「対をなさないシステイン」形態にあるDualAE05/DualAE05-FF056（酸溶出液：黒色バー）を主に含む（レーン20から23）。
実施例４「対をなさないシステイン」形態を有するDual/LINC 1＋2抗体の定量分析での立体構造特異的抗CH1抗体の使用
実施例3で特定された立体構造特異的抗CH1抗体、例えばFAB0133Hh/FAB0133L0001をツールとして用いて、定量分析を実施し、SPR測定などの当技術分野において公知の分析方法を用いて「対をなさないシステイン」形態にある抗体の純度または比率を測定した。
実施例3で特定された立体構造特異的抗CH1抗体、例えばFAB0133Hh/FAB0133L0001をツールとして用いて、定量分析を実施し、SPR測定などの当技術分野において公知の分析方法を用いて「対をなさないシステイン」形態にある抗体の純度または比率を測定した。
具体的には、DLL3-DualAE05/DualAE05-FF110を細胞回収物から調製し、最初にPro Aカラムで処理し、続いて、実施例3.4に記載される抗CH1抗体カラムでアフィニティ精製した。
Pro Aカラムから溶出したDLL3-DualAE05/DualAE05-FF110試料および抗CH1抗体カラムからのDLL3-DualAE05/DualAE05-FF110試料フロースルーを、Biacore 8K機器を用いるBiacore結合分析のために収集した。0.9987のR2での線形相関関係が、SPR結合分析を用いることにより、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、40％、60％、80％、100％での種々の濃度比率で「対をなさないシステイン」形態を含有する抗体試料に対するFAB0133Hh/FAB0133L0001の結合反応間で観察された（データを示さず）。したがって、抗体試料における「対をなさないシステイン」形態にあるDLL3-DualAE05/DualAE05-FF110のパーセンテージ（％）量または比率は、抗体試料に対するFAB0133Hh/FAB0133L0001の％結合を測定することによって算出できる。抗体試料を、ラマ抗体断片の抗ヒトFcでコーティングしたCM5センサーチップ上に捕捉した。1 μM濃度のFAB0133Hh/FAB0133L0001をインジェクトし、相互作用の結合反応を測定した。アッセイ温度を25℃に設定した。すべての抗体およびアナライトを、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。
Pro Aカラムから溶出したDLL3-DualAE05/DualAE05-FF110試料および抗CH1抗体カラムからのDLL3-DualAE05/DualAE05-FF110試料フロースルーを、Biacore 8K機器を用いるBiacore結合分析のために収集した。0.9987のR2での線形相関関係が、SPR結合分析を用いることにより、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、40％、60％、80％、100％での種々の濃度比率で「対をなさないシステイン」形態を含有する抗体試料に対するFAB0133Hh/FAB0133L0001の結合反応間で観察された（データを示さず）。したがって、抗体試料における「対をなさないシステイン」形態にあるDLL3-DualAE05/DualAE05-FF110のパーセンテージ（％）量または比率は、抗体試料に対するFAB0133Hh/FAB0133L0001の％結合を測定することによって算出できる。抗体試料を、ラマ抗体断片の抗ヒトFcでコーティングしたCM5センサーチップ上に捕捉した。1 μM濃度のFAB0133Hh/FAB0133L0001をインジェクトし、相互作用の結合反応を測定した。アッセイ温度を25℃に設定した。すべての抗体およびアナライトを、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。
表6に示されるように、FAB0133Hh/FAB0133L0001は、抗CH1抗体カラムからのDLL3-DualAE05/DualAE05-FF110フロースルー試料に対する低下した結合反応を示し、抗CH1抗体カラムによる精製プロセス後に「対をなさないシステイン」形態の量の低下（＜2％）を示す。
（表６）
参考実施例１．抗体発現ベクターの調製ならびに抗体の発現および精製
アミノ酸置換またはIgG変換を、PCRまたはIn-fusion Advantage PCRクローニングキット（Takara Bio Inc.）等を用いて当業者に一般に公知の方法によって行い、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、当業者に一般に公知の方法によって配列決定した。調製したプラスミドをFreeStyle 293細胞（ThermoFisher Scientific）またはExpi293F細胞（ThermoFisher Scientific）に一過性に移入し、抗体を発現させた。rProtein A Sepharose（商標）Fast Flow（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて当業者に一般に公知の方法によって、得られた培養上清から各抗体を精製した。精製された抗体の濃度について、分光光度計を用いて吸光度を280 nmで測定し、PACEによって得られた値から算出された吸光係数の使用によって、抗体濃度を算出した（Protein Science 1995; 4: 2411-2423）。
アミノ酸置換またはIgG変換を、PCRまたはIn-fusion Advantage PCRクローニングキット（Takara Bio Inc.）等を用いて当業者に一般に公知の方法によって行い、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、当業者に一般に公知の方法によって配列決定した。調製したプラスミドをFreeStyle 293細胞（ThermoFisher Scientific）またはExpi293F細胞（ThermoFisher Scientific）に一過性に移入し、抗体を発現させた。rProtein A Sepharose（商標）Fast Flow（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて当業者に一般に公知の方法によって、得られた培養上清から各抗体を精製した。精製された抗体の濃度について、分光光度計を用いて吸光度を280 nmで測定し、PACEによって得られた値から算出された吸光係数の使用によって、抗体濃度を算出した（Protein Science 1995; 4: 2411-2423）。
参考実施例２．抗体の純度を特徴づけるための非還元SDS-PAGE
4～20％ Mini-PROTEAN（登録商標）TGX Stain-Free(商標)Precast Gels（Bio-Rad）を1×Tris/グリシン/SDSランニングバッファー（Bio-Rad）と共に用いて、非還元SDS-PAGEを実施した。モノクローナル抗体試料を70℃にて10分間加熱した。0.2マイクログラムをロードし、電気泳動を200 Vで90分間行った。タンパク質をChemidoc Imaging System（Bio-Rad）で可視化した。個々のバンドのパーセンテージをImage Labソフトウェアバージョン6.0（Bio-Rad）によって分析し、ここで、個々のバンド、例えば、早い泳動（下側のバンド）および遅い泳動（上側のバンド）の％強度は、バンドの強度をこれら2つのバンドの合計で割ることによって算出した。
4～20％ Mini-PROTEAN（登録商標）TGX Stain-Free(商標)Precast Gels（Bio-Rad）を1×Tris/グリシン/SDSランニングバッファー（Bio-Rad）と共に用いて、非還元SDS-PAGEを実施した。モノクローナル抗体試料を70℃にて10分間加熱した。0.2マイクログラムをロードし、電気泳動を200 Vで90分間行った。タンパク質をChemidoc Imaging System（Bio-Rad）で可視化した。個々のバンドのパーセンテージをImage Labソフトウェアバージョン6.0（Bio-Rad）によって分析し、ここで、個々のバンド、例えば、早い泳動（下側のバンド）および遅い泳動（上側のバンド）の％強度は、バンドの強度をこれら2つのバンドの合計で割ることによって算出した。
参考実施例３
腫瘍細胞に対するin vitro細胞傷害活性の改善に関する、親Dual-Fab H183L072の親和性成熟バリアントのスクリーニング
腫瘍細胞に対するin vitro細胞傷害活性の改善に関する、親Dual-Fab H183L072の親和性成熟バリアントのスクリーニング
１．１ 親和性成熟バリアントの配列
CD3およびCD137に結合するが、CD3およびCD137に同時には結合しない、免疫グロブリン可変（Fab）領域（Dual-Fab）を提供するという概念は、WO2019111871（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。WO2019111871に開示されている親Dual-Fab H183L072（重鎖：配列番号：1；軽鎖：配列番号：57）の結合アフィニティを増加させるために、H183L072を鋳型として用いて、可変領域に単一のまたは複数の変異を導入することにより、1,000個を上回るDual-Fabバリアントを作製した。抗体を、Expi293（Invitrogen）で発現させ、プロテインA精製、続いて、ゲル濾過が必要な場合にはゲル濾過によって精製した。複数の変異を有する22個の示されたDual-Fabバリアントの配列を、表7および表8-1～8-6に列記し、CD3およびCD137に対する結合アフィニティおよび動態を、参考実施例3の1.2.2において、下記に記載されるBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃および/または37℃で評価した（表11-1および11-2）。
CD3およびCD137に結合するが、CD3およびCD137に同時には結合しない、免疫グロブリン可変（Fab）領域（Dual-Fab）を提供するという概念は、WO2019111871（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。WO2019111871に開示されている親Dual-Fab H183L072（重鎖：配列番号：1；軽鎖：配列番号：57）の結合アフィニティを増加させるために、H183L072を鋳型として用いて、可変領域に単一のまたは複数の変異を導入することにより、1,000個を上回るDual-Fabバリアントを作製した。抗体を、Expi293（Invitrogen）で発現させ、プロテインA精製、続いて、ゲル濾過が必要な場合にはゲル濾過によって精製した。複数の変異を有する22個の示されたDual-Fabバリアントの配列を、表7および表8-1～8-6に列記し、CD3およびCD137に対する結合アフィニティおよび動態を、参考実施例3の1.2.2において、下記に記載されるBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃および/または37℃で評価した（表11-1および11-2）。
（表７）
（表８－１）
（表８－２）
（表８－３）
（表８－４）
（表８－５）
（表８－６）
１．２ 親和性成熟バリアントの結合動態情報
１．２．１ ヒトCD3およびCD137の発現および精製
ヒトCD3複合体（ヒトCD3egリンカー）のγサブユニットおよびεサブユニットを29-merリンカーによって連結し、Flag-タグをγサブユニットのC末端に融合させた（配列番号：１０２、表9および10）。この構築物を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD3egリンカーを発現する培養上清を、Q HP樹脂（GE healthcare）を充填したカラムを用いて濃縮し、次いで、FLAG-タグ親和性クロマトグラフィーに適用した。ヒトCD3egリンカーを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD3egリンカーを含有する画分をプールした。C末端にヘキサヒスチジン（His-タグ）およびビオチンアクセプターペプチド（BAP）を有するヒトCD137細胞外ドメイン（ECD）（配列番号：１０３、表9および10）を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD137 ECDを発現する培養上清をHisTrap HPカラム（GE healthcare）に適用し、イミダゾール（Nacalai）を含有する緩衝液で溶出した。ヒトCD137 ECDを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD137 ECDを含有する画分をプールし、-80℃で保管した。
ヒトCD3複合体（ヒトCD3egリンカー）のγサブユニットおよびεサブユニットを29-merリンカーによって連結し、Flag-タグをγサブユニットのC末端に融合させた（配列番号：１０２、表9および10）。この構築物を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD3egリンカーを発現する培養上清を、Q HP樹脂（GE healthcare）を充填したカラムを用いて濃縮し、次いで、FLAG-タグ親和性クロマトグラフィーに適用した。ヒトCD3egリンカーを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD3egリンカーを含有する画分をプールした。C末端にヘキサヒスチジン（His-タグ）およびビオチンアクセプターペプチド（BAP）を有するヒトCD137細胞外ドメイン（ECD）（配列番号：１０３、表9および10）を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD137 ECDを発現する培養上清をHisTrap HPカラム（GE healthcare）に適用し、イミダゾール（Nacalai）を含有する緩衝液で溶出した。ヒトCD137 ECDを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD137 ECDを含有する画分をプールし、-80℃で保管した。
（表９）
（表１０）
１．２．２ ヒトCD3およびCD137に対する親和性測定
ヒトCD3に対するDual-Fab抗体（Dual-Ig）の結合親和性を、Biacore 8K機器（GE Healthcare）を用いて25℃で評価した。抗ヒトFc（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセルの上に固定化した。抗体を抗Fcセンサー表面の上に捕捉し、次いで、組換えヒトCD3またはCD137をフローセルの上にインジェクトした。すべての抗体およびアナライトを、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。センサー表面は、3M MgCl2でサイクル毎に再生させた。結合親和性は、Biacore Insight Evaluation software（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定した。CD137結合親和性アッセイを、アッセイ温度を37℃に設定したことを除いて、同じ条件で行った。組換えヒトCD3およびCD137に対するDual-Fab抗体の結合親和性を表11-1および11-2に示す。表11-1および11-2に示すように、DUAL Fabバリアントは、CD3およびCD137に対し、H183/L072と比較して異なる結合動態を示した。
ヒトCD3に対するDual-Fab抗体（Dual-Ig）の結合親和性を、Biacore 8K機器（GE Healthcare）を用いて25℃で評価した。抗ヒトFc（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセルの上に固定化した。抗体を抗Fcセンサー表面の上に捕捉し、次いで、組換えヒトCD3またはCD137をフローセルの上にインジェクトした。すべての抗体およびアナライトを、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。センサー表面は、3M MgCl2でサイクル毎に再生させた。結合親和性は、Biacore Insight Evaluation software（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定した。CD137結合親和性アッセイを、アッセイ温度を37℃に設定したことを除いて、同じ条件で行った。組換えヒトCD3およびCD137に対するDual-Fab抗体の結合親和性を表11-1および11-2に示す。表11-1および11-2に示すように、DUAL Fabバリアントは、CD3およびCD137に対し、H183/L072と比較して異なる結合動態を示した。
（表１１－１）
（表１１－２）
本発明の多重特異性抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子を薬物として用いる際に有害反応を担うと考えられる、異なる細胞上に発現している抗原への従来型の多重特異性抗原結合分子の結合に起因する異なる細胞（例えば、異なるT細胞）間の架橋形成を回避しつつ、免疫反応を調節および/または活性化することができる。
Claims (17)
- 多重特異性抗原結合分子の調製物を製造するための方法であって、該多重特異性抗原結合分子が、以下：
（a）それぞれが第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
（b）第1のおよび第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分
を含み、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み、好ましくは、該少なくとも1つのシステインがCH1領域内に位置しており；該少なくとも1つのシステイン残基が、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき；
該方法が、該調製物を還元試薬と接触させる段階を含む、前記方法。 - 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、
第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成できる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基
を（変異、置換、または挿入を介して）含む、請求項1記載の方法。 - 前記多重特異性抗原結合分子調製物（還元剤と接触させる前）が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合だけ異なっている2つ以上の構造アイソフォームを含み、かつ還元剤と接触させる段階が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する構造アイソフォームの集団を優先的に濃縮するかまたは増加させる、請求項2記載の方法。
- 多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3から約10、好ましくはpH 6～8である、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
- 還元剤が、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、およびNa2SO3、好ましくは TCEPからなる群より選択される、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
- 還元剤の濃度が約0.01 mMから約100 mMである、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
- 多重特異性抗原結合分子の濃度が約0.1 mg/mlから約50 mg/ml、好ましくは約10 mg/mlである、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
- 好ましくは透析またはバッファー交換によって好ましくは還元剤を除去することによって、システインジスルフィド結合の再酸化を促進する段階
をさらに含む、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。 - 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々が、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137の両方に同時には結合しない、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
- 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、請求項9記載の方法。 - 第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a2）配列番号：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a3）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a4）配列番号：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a5）配列番号：6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a6）配列番号：8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a7）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a8）配列番号：9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a9）配列番号：10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a10）配列番号：11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a11）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a12）配列番号：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a13）配列番号：13のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（a14）配列番号：14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに
（a15）配列番号：81のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号：60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、請求項10記載の方法。 - 第3の抗原結合部分が、DLL3、好ましくはヒトDLL3に結合できる、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
- DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：233の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：234の重鎖CDR 2、配列番号：235の重鎖CDR 3、配列番号：237の軽鎖CDR 1、配列番号：238の軽鎖CDR 2、および配列番号：239の軽鎖CDR 3を含む抗体可変領域を含む、請求項12記載の方法。
- DLL3に結合できる第3の抗原結合部分が、配列番号：232のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体可変領域を含む、請求項13記載の方法。
- 多重特異性抗原結合分子がFcドメインをさらに含む、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
- CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子の均一な集団を有する、請求項1～15のいずれか一項記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
- 少なくとも80％、90％、好ましくは少なくとも95％のモル比の、CH1領域（EUナンバリングによる191位）において少なくとも1つのジスルフィド結合を有する多重特異性抗原結合分子を有する、請求項1～15のいずれか一項記載の方法に従って調製された多重特異性抗原結合分子の調製物。
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