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KR20220153578A - Her2에 대한 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Her2에 대한 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20220153578A
KR20220153578A KR1020227028048A KR20227028048A KR20220153578A KR 20220153578 A KR20220153578 A KR 20220153578A KR 1020227028048 A KR1020227028048 A KR 1020227028048A KR 20227028048 A KR20227028048 A KR 20227028048A KR 20220153578 A KR20220153578 A KR 20220153578A
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KR
South Korea
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cells
seq
car
sequence
nucleic acid
Prior art date
Application number
KR1020227028048A
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English (en)
Inventor
그레고리 이안 프로스트
주니어 제임스 조셉 오누퍼
아니르반 쿤두
제이 엠 쇼트
게르하르트 프레이
화이 웬 창
Original Assignee
엑수마 바이오테크, 코포레이션
바이오아트라, 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 개시내용은 HER2에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR), CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 및 HER2에 결합하는 조건부 활성 생물학적 (CAB) CAR을 제공한다. 본 개시내용은 CAR을 생산하도록 유전적으로 변형된 세포, 이들 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 전달 현탁액, 및 그러한 세포의 제조 방법을 제공한다. 본 개시내용의 CAR은, 특정 조건 하에서 면역 세포를 활성화시키는 방법, 및 입양 세포 요법 예컨대 CAR 요법, 예를 들어 암에 대해 CAR 요법을 수행하는 방법을 포함하여, 또한 제공되는, 다양한 방법에서 사용될 수 있다.

Description

HER2에 대한 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법
관련된 출원에 대한 상호-참조
본원은 2020년 1월 23일 출원된, 미국 가출원 번호 62/964,947의 우선권이다. 본원은 이 전체가 본원에 참고로 편입된다.
서열 목록
본원은 이로써 이와 동시에 출원된 전자적 시컨싱 목록의 자료를 참고로 편입한다. 전자적 서열 목록의 자료는, 354 KB의 파일 크기이고, 이 전체가 참고로 본원에 편입되는, 2021년 1월 22일 창작된 subs"F1_005_WO_01_Sequence_Listing.txt"라는 표제의 텍스트 (.txt) 파일로서 제출된다.
공동 연구 합의
F1 Oncology, Inc. (현재 Exuma Biotech Corp.라고 불림) 및 BioAtla, LLC는 본원에 개시된 주제에 관련하는 공동 연구 합의에 당사자이다.
발명의 분야
본 개시내용은 키메라 항원 수용체 그리고 진단적 및 치료적 방법에서 키메라 항원 수용체의 용도에 관한 것이다.
개시내용의 배경
세포-기반된 입양 면역요법에서, 환자로부터 단리된 면역 세포는 이들이 후속적으로 환자에 역으로 이동된 후 세포가 새로운 치료적 기능을 수행하게 할 수 있는 합성 단백질을 발현시키도록 변형될 수 있다. 그와 같은 합성 단백질의 예는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 현재 사용된 CAR의 예는 세포외 인식 도메인 (예를 들면, 항원-특이적 표적화 영역 또는 ASTR), 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 융합이다. 항원 개입시, CAR의 세포내 신호전달 부문은 면역 세포에서 활성화-관련된 반응, 예컨대 종양 세포사를 유도하기 위한 세포용해성 분자의 방출, 등을 개시할 수 있다. CAR 및 CAR-T 요법이 특정 유형의 혈액 암에 매우 효과적이었어도, 고형 종양에 대해 CAR 및 CAR-T 요법이 여전히 필요하고, 이는 그래서 훨씬 더 파악하기 어려운 것으로 크게 증명하였다.
CAR-T 요법이 다양한 질환, 특히 혈액 암을 치료하기 위한 유망한 방법을 나타내는 한편, CAR-T 요법의 안전성은 임상적 시험 동안 유해 이벤트를 통해서 최근에 문제가 되고 있다. 이들 유해 이벤트를 감소시키는 하나의 방법은 ASTR의 표적내 종양외 결합을 감소시킴에 의한 것이다. 종양 미세환경 (TME)은 바르부르크 효과(Warburg Effect)로서 알려진 암 세포의 변경된 대사로 인해 정상 생리학적 환경보다 더욱 산성이다. 조건부 활성 ASTR을 가진 CAR은 특정 조건 하에서 항원 (즉 조건부 활성 생물학적 CAR (CAB CAR), 예컨대 TME에서 실재하는 것들에 단지 결합하고, CAR이 정상 생리학적 조건에서 항원을 결합시키지 않도록 표적내 종양외 결합에서 감소를 제공한다. 그래서, 이들 CAR의 부작용은 감소되고 치료는 더욱 안전하게 진행할 수 있다. 그러한 CAB CAR의 특정 예의 개발에도 불구하고, 고도로 효과적, 더욱 안전한 CAB CAR이 여전히 필요하다. 더욱이, 효과적이고 안전한 치료, 예컨대 고형 종양에 대해 신규 CAB CAR이 여전히 필요한 것은, CAR-T 요법이 특정 혈액 암을 치료하는데 고도로 효과적인 것으로 나타난 반면, 고형 종양에 대해 효과적 CAR-T 요법을 개발하는 것이 훨씬 더 도전적이었기 때문이다.
수용체 티로신 키나제 (RTK)는 리간드-제어된 티로신 키나제 활성을 통해서 정상 세포성 공정의 범위를 규제하는 세포 표면 수용체의 한 패밀리이다. 과거 20 년 동안, RTK의 탈규제는 암 발병 및 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. RTK는 예후적 분자성 바이오마커로서 그리고 종양학 치료제의 표적으로서 이제 인식된다. 종양학에서 중요한 RTK는 HER2 (ERBB2)이다. HER2 수용체는 많은 조직에서 발현되는 1255 아미노산, 185 kD 막관통 당단백질 RTK이다 (Iqbal and Iqbal, Mol Biol Int. vol. 2014, 2014: 852748). HER2 과발현은, 예를 들어, 유방암, 위암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, 폐암 및 요로상피성 방광암을 포함하는 수많은 고형 암에서 발생한다 (Id.). HER2의 몇몇 항체 및 작은 분자 억제제가 특정 암, 특히 전이성 유방암을 치료하는데 승인되어도, 이들 치료제는 전형적으로 생존을 연장시키지만 치유적이지 않다 (Id.). 예를 들어, HER2를 표적하는 승인된 단클론성 항체로 치료된 HER2+ 유방암을 가진 환자의 상당한 부분이 결국 재발하거나 진행성 질환으로 발달한다. 그래서, HER2 암을 표적하는 효과적 치료제를 개발하는 것이 여전히 필요하다. 더욱이, HER2를 인식하는 CAR이 더욱 효과적 항-HER2 치료제를 제공하려고 하기 위해 만들어졌어도, 그러한 CAR은 안전성 쟁점 및 심지어 환자 사망을 초래하였고, 이는 사이토카인 폭풍을 촉발시켰던 정상 폐 세포에 표적외 결합으로 인한 것으로 믿어졌다 (Morgan 등, Mol. Ther. 2010; 18(4)843-851).
암과 싸우기 위한 면역계의 힘을 동력화하는, 그러나 감소된 또는 제거된 표적내 종양외 뿐만 아니라 표적외 효과를 갖는 효과적 치료가 여전히 필요하다. HER2에 대해 단클론성 항체가 상업적으로 이용가능하여도, 조건부 활성인 HER2를 표적하는 항체 단편을 포함하는, 특정 환경, 예컨대 암 미세환경에서만 HER2를 발현시키는 세포를 효과적으로 표적하는 CAR이 필요하다. 그러한 조건부 활성 CAR을 창출하는 것은 수많은 과제를 제시한다. 예를 들어, 이들이 CAR의 부분으로서 T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 발현되는 때 HER2를 결합시킬 뿐만 아니라, 암 세포에 노출되는 에피토프를 인식하는 능력을 추가적으로 갖는 항체 단편은 창출 및 식별되어야 한다. 더욱이, 그러한 CAR은 조건부 활성 방식에서, 특히 정상 생리학적 pH에 비교하여 종양의 산성 pH 하에서 그들의 표적에 이상적으로 결합한다. 추가적으로, 그러한 후보 CAR은, 그들의 표적에 결합된 때, CAR을 발현시키는 T 세포 또는 NK 세포를 활성화시켜 세포독성 기능을 발현시켜야 한다. 그래서, 현행 CAR-T 방법에 의해 제기된 문제 해결을 돕기 위해, 그와 같은 항체 단편을 함유하는 CAR에 대하여 많은 요구사항이 있다. 더욱이, HER2가 수많은 고형 종양에서 발현되므로, HER2에 대해 그와 같은 조건부 활성 CAR은 CAR-T 요법을 사용하여 고형 암을 치료할 가망이 있어서, 현행 CAR-T 요법의 주요 한계를 극복할 것이다.
개시내용의 개요
본 개시내용은 HER2에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR), 및 CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 그리고 HER2에 결합하는 조건부 활성 생물학적 (CAB) CAR을 제공한다. 본 개시내용은 CAR을 생산하기 위해 유전적으로 변형된 세포, 이들 CAB CAR-함유 세포, 특히 CAB CAR T 세포 및 NK 세포의 집단을 포함하는 전달 현탁액, 및 그러한 세포의 제조 방법을 제공한다. 본 개시내용의 CAR은 다양한 방법에서 사용될 수 있고, 특정 조건, 예컨대 TME의 pH 하에서 면역 세포를 활성화시키는 방법, 및 입양 세포 요법 예컨대 CAR 요법, 예를 들어 암에 대해 CAR 요법을 수행하는 방법을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 본원에 제공된 그러한 CAB CAR을 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포의 실례적 예를 사용하여, 본원에 개시된 개념증명 실험에서, 그러한 CAB CAR T 세포 및/또는 NK 세포가 특히 항-HER2 CAR에 대하여 표적내, 종양외 효과와 연관된 문제들을 극복할 수 있는 효과적 생물제인 것으로 나타난다.
본원에 제공된 양태 및 구현예의 상세는 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공된다. 명확성을 위하여, 본 개요 섹션은 본원에 제공된 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되기 위한 것이 아니고, 해석되지 않아야 한다.
도 1a 및 1b는 ELISA에 의해 측정된 경우에 상이한 pH 값에서 인간 HER2 단백질에 다양한 항체의 결합 활성을 도시한다. 조건부 활성 항체는 HER2 벤치마크 항체 (BM)로 도시된다.
도 2는 루시퍼라제 사멸 검정에서 CHO-S-HER2 표적 세포의 퍼센트 용해를 도시한다. CHO-S-HER2 세포 및 CAR-T 효과기 세포는 최대 6 시간 동안 낮은 pH 및 높은 pH에서 공배양되었다. ASTR을 포함하는 scFv의 중쇄 또는 경쇄 어느 한쪽에서 5개 상이한 단일 아미노산 치환에 의해 X4-04와 각각 상이하였던 벤치마크 CAR, X4-04, 및 5개 CAB-CAR에 대하여 데이터가 도시된다.
도 3은 루시퍼라제 사멸 검정에서 CHO-S-HER2 표적 세포의 퍼센트 용해를 도시한다. CHO-S-HER2 세포 및 CAR-T 효과기 세포는 최대 6 시간 동안 낮은 pH 및 높은 pH에서 공배양되었다. 각 배향에서 VH-1 및 VL-3을 포함하는 CAB CAR에 비교해서 각 배향에서 VH-1 및 VL-1을 포함하고, 어느 한쪽 링커 A (도 3a) 또는 링커 B (도 3b)에 의해 연결된 벤치마크 CAR에 대하여 데이터가 도시된다.
도 4는 실시간 사멸 검정에서 30 시간 동안 측정된 경우에 낮은 pH 및 높은 pH에서 CAR X4-03 및 X4-16에 의한 CHO-S-HER2 표적 세포의 퍼센트 특이적 용해를 도시한다.
도 5는 유세포 분석에 의해 측정된 경우에 1 일 동안 낮은 pH 및 높은 pH에서 MCF7 표적과 공배양후 CD3+eTAG+ CAR-T 세포에서 CD69의 MFI의 그래프를 도시한다.
도 6은 유세포 분석에 의해 측정된 경우에 1 일 동안 낮은 pH 및 높은 pH에서 MCF7 표적과 공배양후 세포내 IFNγ에 대하여 양성 염색하는 CD3+eTAG+ CAR-T 세포의 백분율의 그래프를 도시한다.
도 7은 유세포 분석에 의해 측정된 경우에 5 시간 동안 낮은 pH 및 높은 pH에서 MCF7 표적과 공배양후 CD107a+인 CD3+eTAG+ CAR-T 세포의 백분율의 그래프를 도시한다.
도 8은 살아있는 CD3+ 게이팅된 세포의 유세포 분석에 의해 측정된 경우에 5 일 동안 낮은 pH 및 높은 pH에서 MCF7 표적과 공배양후 WT1 및 후보 2 CAR-T 세포에서 셀트레이스 바이올렛의 양의 히스토그램을 도시한다.
도 9는 DPBS, CAB-CAR 세포, 또는 WT CAR 세포로 치료 이후 마우스의 평균 SK-OV-3 종양 부피를 도시한다.
도 10a 및 10b는 CAB-CAR 세포, WT CAR 세포, 또는 DPB로 치료 이후 SK-OV-3 종양을 보유하고 인간 HER2-루시퍼라제의 강제된 간 발현을 가진 마우스의 간의 생체발광을 관찰하기 위해 IVIS에 의한 마우스의 생체내 영상화의 결과를 도시한다. 도 10a는 마우스의 이미지를 도시한다. 도 10b는 평균 총 플럭스를 도시한다.
도 11은 DPBS, 트라스투주맙 (저 용량), 트라스투주맙 (고 용량) 이어서 42 일차에 용량화된 CAB-CAR 세포, CAB-CAR 세포, 또는 WT CAR 세포로 치료 이후 마우스의 평균 NCI-87 종양 부피를 도시한다.
정의
본원에 사용된 경우에, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR" 또는 "CAR들"은, 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, 대식세포, 및 줄기 세포에 항원 특이성을 이식하는, 조작된 수용체를 지칭한다. 본 발명의 CAR은 적어도 하나의 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인 (TM), 및 세포내 활성화 도메인 (IAD)을 포함하고 스토크, 및 하나 이상의 공-자극 도메인 (CSD)을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, CAR은 2개 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적인 이중특이적 CAR이다. ASTR이 표적 항원에 특이적으로 결합한 후, IAD는 세포내 신호전달을 활성화시킨다. 예를 들어, IAD는, 항체의 항원-결합 특성을 활용하여, 비-MHC-국한된 방식으로 선택된 표적을 향해 T 세포 특이성 및 반응성을 재지정할 수 있다. 비-MHC-국한된 항원 인식은 CAR을 발현시키는 T 세포에 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 제공하여서, 종양 탈출의 주요 기전을 우회한다. 게다가, T 세포에서 발현된 경우, CAR은 유리하게는 내인성 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 쇄와 이량체화하지 않는다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "구성적 T 세포 또는 NK 세포 프로모터"는, 유전자 산물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결된 경우, 유전자 산물이 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 생산되도록 하는 프로모터를 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "유도가능한 프로모터" 또는 "활성화가능한 프로모터"는 유전자 산물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결된 경우, 유전자 산물이 실질적으로 프로모터-특이적 유도제가 세포에서 존재하는 경우에만 세포에서 생산되도록 하는 프로모터를 지칭한다. 유도가능한 프로모터는 기저 전사 활성이 없거나 낮은 수준이지만 전사 활성이 유도하는 신호의 존재 하에서 때때로 크게 증가한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "미세환경"은 신체의 영역 또는 조직의 다른 영역으로부터 일정하거나 일시적, 물리적, 또는 화학적 차이가 있는 신체 또는 조직의 임의의 부문 또는 영역을 의미한다. 예를 들어, 본원에 사용된 경우에 "종양 미세환경" (TME)은 종양이 실재하는 환경을 지칭하고, 이는 종양 내에서 비-세포성 영역 및 직접적으로 종양성 조직 외부 영역이지만 암 세포 자체의 세포내 구획에 속하지 않는다. TME는 생존 및/또는 확장 및/또는 확산하는 악성 공정에 대하여 구조적 및 또는 기능적 환경을 창출하는 조건을 포함하는 종양 환경의 임의의 및 모든 조건을 지칭할 수 있다. 예를 들어, TME는 조건 예컨대, 비제한적으로, 압력, 온도, pH, 이온 강도, 삼투압, 오스몰 농도, 산화 스트레스, 하나 이상의 용질의 농도, 전해질의 농도, 글루코스의 농도, 히알루로난의 농도, 락트산 또는 락트산염의 농도, 알부민의 농도, 아데노신의 수준, R-2-하이드록시글루타레이트의 수준, 피루브산염의 농도, 산소의 농도, 및/또는 산화제, 환원제, 또는 보조인자의 존재, 뿐만 아니라 숙련된 기술자가 이해할 다른 조건에서 변경을 포함할 수 있다. pH와 관련하여, TME는 정상 생리학적 pH보다 더욱 산성 pH를 갖는 것으로 믿어진다.
본원에 교환가능하게 사용된 경우에, 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태, 어느 한쪽 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 지칭한다. 그래서, 본 용어는, 비제한적으로, 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈성 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-자연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "항체"는, 항원에 특이적 결합을 보유하는 온전한 항체 및 항체의 단편을 포함하는, 다클론성 및 단클론성 항체를 포함한다. 항체 단편은, 비제한적으로, 단편 항원 결합 (Fab) 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, Fab'-SH 단편, (Fab')2 Fv 단편, Fd 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 2가 scFv, 3가 scFv를 포함하는, 단일-쇄 항체 단편, 및 단일 도메인 항체 단편 (예를 들면, sdAb, sdFv, 나노바디)일 수 있다. 본 용어는 면역글로불린의 유전적으로 조작된 및/또는 달리 변형된 형태, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 단일-쇄 항체, 완전히 인간 항체, 인간화된 항체, 항체의 항원-특이적 표적화 영역 및 비-항체 단백질을 포함하는 융합 단백질, 헤테로컨쥬게이트 항체, 다중특이적, 예를 들면, 이중특이적, 항체, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디, 탠덤 디-scFv, 및 탠덤 트리-scFv를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 이의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 용어는 또한, IgG 및 이의 하위-부류, IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함하는, 임의의 부류 또는 하위-부류의 항체를 포함하는, 온전한 또는 전장 항체를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 한 부문, 예를 들어, 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata 등, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는, 용이하게 결정화하는 능력을 반영하는 칭호인, 잔여 "Fe" 단편 및, 단일 항원-결합 부위를 각각 가진, "Fab" 단편으로 불리는, 2개 동일한 항원-결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 2개 항원 조합 부위를 갖는 F(ab')2 단편을 산출하고 항원을 여전히 가교시킬 수 있다.
본원에 교환가능하게 사용된 경우에, 용어 "단일-쇄 Fv", "scFv", 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에서 존재한다. 일부 구현예에서, Fv 폴리펩타이드는 추가로, sFv가 항원 결합을 위하여 원하는 구조를 형성하도록 할 수 있는, VH와 VL 도메인 사이 폴리펩타이드 링커 또는 스페이서를 포함한다. sFv의 검토를 위하여, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참고.
본원에 사용된 경우에, "자연 발생" VH 및 VL 도메인은 특정 조건 하에 scFv 형식으로 생성된 경우 그들의 친화성을 변화시키기 위한 추가 분자성 진화 없이 숙주로부터 단리된 VH 및 VL 도메인을 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "친화성"은 2개 제제의 가역성 결합에 대하여 평형 상수를 지칭하고 해리 상수 (Kd)로서 표현된다. 친화성은 관련되지 않은 아미노산 서열을 위한 항체의 친화성보다 적어도 1-배 초과, 적어도 2-배 초과, 적어도 3-배 초과, 적어도 4-배 초과, 적어도 5-배 초과, 적어도 6-배 초과, 적어도 7-배 초과, 적어도 8-배 초과, 적어도 9-배 초과, 적어도 10-배 초과, 적어도 20-배 초과, 적어도 30-배 초과, 적어도 40-배 초과, 적어도 50-배 초과, 적어도 60-배 초과, 적어도 70-배 초과, 적어도 80-배 초과, 적어도 90-배 초과, 적어도 100-배 초과, 또는 적어도 1000-배 초과, 또는 그 이상일 수 있다. 항체의 표적 단백질에의 친화성은, 예를 들어, 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM) 또는 그 이상일 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "친화력"은 희석후 해리에 대한 둘 이상의 제제의 복합체의 내성을 지칭한다. 용어 "면역반응성" 및 "우선적으로 결합한다"는 항체 및/또는 항원-결합 단편과 관련하여 본원에 교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "결합하기"는, 예를 들어, 상호작용 예컨대 염 다리 및 물 다리를 포함하여, 공유, 정전기, 소수성, 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인한 2개 분자 사이의 직접 회합을 지칭한다. 비-특이적 결합은 약 10-7 M 미만의 친화성을 가진 결합, 예를 들면, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 등의 친화성을 가진 결합을 지칭할 것이다.
본원에 사용된 경우에, "세포 표면 발현 시스템" 또는 "세포 표면 디스플레이 시스템" 지칭은 세포의 표면에서 단백질 또는 이의 부문의 디스플레이 또는 발현을 지칭한다. 전형적으로, 세포-표면 단백질에 융합된 관심의 단백질을 발현시키는 세포가 생성된다. 예를 들어, 단백질은 막관통 도메인을 가진 융합 단백질로서 발현된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "요소"는, 폴리펩타이드의 융합, 폴리펩타이드의 영역, 폴리뉴클레오타이드, 및 이들의 기능적 돌연변이체 또는 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "영역"은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 임의의 분절이다.
본원에 사용된 경우에, "도메인"은 기능적 및/또는 구조적 특성을 가진 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 영역이다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "스토크" 또는 "스토크 도메인"은 측접 폴리펩타이드 영역에 구조적 가요성 및 이격을 제공하는 가요성 폴리펩타이드 커넥터 영역을 지칭하고 자연 또는 합성 폴리펩타이드로 이루어질 수 있다. 스토크는 인간 IgGl의 Glu216부터 Pro230까지 스트레칭으로서 일반적으로 정의되는 면역글로불린 (예를 들면, IgGl)의 힌지 또는 힌지 영역에서 유래될 수 있다 (Burton (1985) Molec. Immunol., 22:161-206). 다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역은 동일한 위치에서 중쇄간 디술피드 (S-S) 결합을 형성하는 최초 및 최종 시스테인 잔기를 배치함으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다. 스토크는 비제한적으로 변경된 힌지 영역을 포함하는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 스토크는 임의의 부류 또는 하위부류의 항체에서 유래된 완전 힌지 영역을 포함할 수 있다. 스토크는 측접 영역에 가요성 및 이격을 제공하기에서 유사한 기능을 제공하는 CD8, CD28, 또는 다른 수용체에서 유래된 영역을 또한 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "단리된"은 재료가 이의 본래 환경 (예를 들면, 자연 발생이면 자연 환경)에서 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 존재하는 자연-발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 재료의 일부 또는 전부에서 분리된, 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된다. 그러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 부분일 수 있고/거나 그러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 부분일 수 있고, 여전히 그러한 벡터 또는 조성물이 이의 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 단리될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 단일 쇄이다. 폴리펩타이드는 고정된 구조로 폴딩하지 않거나 임의의 번역후 변형을 갖지 않는다. "단백질"은 고정된 구조로 폴딩하는 폴리펩타이드이다. "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에 교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 경우에, 폴리펩타이드는 "정제"되어 폴리펩타이드의 자연 환경의 오염 성분, 예를 들면 폴리펩타이드를 위한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 물질 예컨대, 예를 들어, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 제거할 수 있다. 폴리펩타이드는 (1) 로우리 방법에 의해 결정된 경우에 항체의 90중량% 초과, 95중량% 초과, 또는 98중량% 초과, 예를 들어, 99중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마씨 블루 또는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비환원 조건 하에서 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의한 균질성으로 정제될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "면역 세포"는 일반적으로 골수에서 생산된 조혈모 세포 (HSC)에서 유래되는 백색 혈액 세포 (백혈구)이다. "면역 세포"는, 예를 들면, 림프구 (T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포) 및 골수양-유래 세포 (호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, "T 세포"는 T-헬퍼 세포 (CD4+ 세포), 세포독성 T 세포 (CD8+ 세포), T-조절 세포 (Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하는 CD3을 발현시키는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다. NKT 세포는 CD3을 발현시키고 αβ T-세포 수용체를 전형적으로 공발현시키고, NK 세포 (예컨대 NK1.1 또는 CD56)와 전형적으로 회합되는 다양한 분자성 마커를 또한 발현시키는 T 세포의 서브세트이다.
본원에 사용된 경우에, "세포독성 세포"는 CD8+ T 세포, 자연-살해 (NK) 세포, NK-T 세포, γδ T 세포, CD4+ 세포의 하위집단, 및 세포독성 반응을 매개할 수 있는 세포인, 호중구를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "줄기 세포"는 일반적으로 만능 또는 다능 줄기 세포를 포함한다. "줄기 세포"는, 예를 들면, 배아 줄기 세포 (ESC); 중간엽 줄기 세포 (MSC); 유도-만능 줄기 세포 (iPSC); 및 수임 전구 세포 (조혈모 세포 (HSC); 골수 유래 세포, 등)를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "치료", "치료하기", 및 기타 등등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과 수득하기를 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/거나 질환 및/또는 질환에 기인할 수 있는 유해 효과에 대하여 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. "치료"는, 본원에 사용된 경우에, 포유동물에서, 예를 들면, 인간에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 그것을 갖는 것으로서 진단되지 않은 대상체에서 질병이 발생하는 것을 예방하기; (b) 질환을 억제하기, 즉, 이의 발병을 저지하기; 및 (c) 질환을 경감시키기, 즉, 질환의 퇴행을 야기시키기를 포함한다.
본원에 교환가능하게 사용된 경우에, 용어 "개체", "대상체", "숙주", 및 "환자"는, 비제한적으로, 인간, 쥣과 (예를 들면, 랫트, 마우스), 토끼목 (예를 들면, 토끼), 비-인간 영장류, 갯과, 고양잇과, 유제동물 (예를 들면, 말과, 솟과, 양과, 돼지과, 염소과), 등을 포함하는 포유동물을 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, 용어"치료적으로 유효량" 또는 "실효량"은, 질환을 치료하기 위하여 포유동물 또는 다른 대상체에 투여된 경우, 질환에 대하여 그러한 치료에 영향을 미치는데 충분한 한 제제의 양, 또는 2개 제제의 조합된 양을 지칭한다. "치료적으로 유효량"은 제제(들), 질환과 이의 중증도 및 치료될 대상체의 연령, 체중, 등에 의존하여 다양할 것이다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "진화" 또는 "진화하기"는, 자체 개선된 생물학적 분자이고/거나 또 다른 개선된 생물학적 분자의 생성에 기여하는, 상이한 폴리펩타이드를 인코딩하는 상이한 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 하나 이상의 돌연변이 방법을 사용하는 것을 지칭한다. "생리학적" 또는 "정상" 또는 "정상 생리학적" 조건은 조건 예컨대, 비제한적으로, 압력, 온도, pH, 이온 강도, 삼투압, 오스몰 농도, 산화 스트레스, 하나 이상의 용질의 농도, 전해질의 농도, 글루코스의 농도, 히알루로난의 농도, 락트산 또는 락트산염의 농도, 알부민의 농도, 아데노신의 수준, R-2-하이드록시글루타레이트의 수준, 피루브산염의 농도, 산소의 농도, 및/또는 산화제, 환원제, 또는 보조인자의 존재, 뿐만 아니라 대상체에 투여의 부위에, 또는 작용의 부위에 조직 또는 장기에 정상 범위 내인 것으로 간주될 다른 조건이다.
본원에 사용된 경우에, "형질도입된 세포" 또는 "안정적으로 형질감염된 세포"는 세포의 게놈으로 통합되는 외인성 핵산(들)을 함유하는 세포이다. 본원에 사용된 경우에, "유전적으로 변형된 세포"는 외인성 핵산(들)이 세포의 게놈으로 통합되는지 여부와 무관하게, 그리고 외인성 핵산(들)을 세포에 도입하는데 사용된 방법과 무관하게 외인성 핵산(들)을 함유하는 세포이다. 세포의 게놈으로 통합되지 않는 세포 내부의 외인성 핵산(들)은 본원에서 "염색체외"로서 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 경우에, "변형된 세포"는, 외인성 핵산을 함유하는, 실례적 구현예에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자인, 재조합 핵산 벡터와 회합되는 세포, 또는 외인성 핵산에 의해 유전적으로 변형된 세포이다. 전형적으로, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 포함하는 조성물 및 방법에서, 변형된 세포는, 슈도타이핑 요소 및/또는 T 세포 활성화 요소를 포함하여, 세포의 표면에서 단백질과 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 표면에서 단백질 사이 상호작용을 통해서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자와 회합한다. 지질-기반된 시약, 예컨대 리포좀 시약 내부에서 핵산의 형질감염을 포함하는 조성물 및 방법에서, 재조합 핵산 벡터의 한 유형인, 핵산을 함유하는 지질-기반된 시약은 변형된 세포에 의해 내재화되기 또는 융합하기 전에 변형된 세포의 지질 이중층과 회합한다. 비슷하게, 핵산의 화학적-기반된 형질감염, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI) 또는 인산칼슘-기반된 형질감염을 포함하는 조성물 및 방법에서, 핵산은 양으로 하전된 형질감염 시약과 전형적으로 회합되어 변형된 세포의 음으로 하전된 막과 회합하는 재조합 핵산 벡터를 형성한 다음 복합체는 변형된 세포에 의해 내재화된다. 세포를 안정적으로 형질감염시키기 또는 유전적으로 변형시키기의 다른 수단 또는 방법은 전기천공, 탄도 전달, 및 미세주사를 포함한다. 본원에 사용된 경우에 "폴리타이드"는 단백질 분자의 일부 또는 전체 뿐만 아니라 임의의 번역후 또는 다른 변형을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우에 슈도타이핑 요소는 표적 숙주 세포를 식별 및 결합시키는 하나 이상의 폴리펩타이드, 전형적으로 당단백질, 및 레트로바이러스성 및 표적 숙주 세포 막의 융합을 매개하는 하나 이상의 "융합성 폴리펩타이드"를 포함하고, 이에 의해 레트로바이러스성 게놈이 표적 숙주 세포에 진입하게 하는 "결합 폴리펩타이드"를 포함할 수 있다. "결합 폴리펩타이드"는 본원에 사용된 경우에, "T 세포 및/또는 NK 세포 결합 폴리펩타이드" 또는 "표적 개입 요소"로서 또한 지칭될 수 있고, "융합성 폴리펩타이드"는 "융합성 요소"로서 또한 지칭될 수 있다.
"휴지" 림프구, 예컨대 예를 들어, 휴지 T 세포는 활성화 마커 예컨대 Ki-67을 발현시키지 않는 세포 주기의 G0 기에서 림프구이다. 휴지 림프구는 특이적 항원을 결코 직면하지 않은 나이브 T 세포 및 항원과 이전의 직면에 의해 변경된 기억 T 세포를 포함할 수 있다. "휴지" 림프구는 "정지" 림프구로서 또한 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, "림프구제거"는, 예를 들어 림프구제거 제제의 투여에 의해, 대상체에서 림프구의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 림프구제거는 부분적 신체 또는 전신 분할 방사선 요법에 의해 또한 달성될 수 있다. 림프구제거 제제는 포유동물에 투여된 경우 포유동물에서 기능적 림프구의 수를 감소시킬 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물일 수 있다. 그와 같은 제제의 하나의 예는 하나 이상의 화학요법 제제이다. 그러한 제제 및 투약량은 알려지고, 치료될 대상체에 따라 치료 의사에 의해 선택될 수 있다. 림프구제거 제제의 예는, 비제한적으로, 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 클라드리빈, 데닐류킨 디프티톡스, 알렘티주맙 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 경우에, "재조합 레트로바이러스"는 복제가능한 레트로바이러스로서 명시적으로 언급되지 않는 한 비-복제가능한, 또는 "복제 불능" 레트로바이러스를 지칭한다. 용어 "재조합 레트로바이러스" 및 "재조합 레트로바이러스성 입자"는 본원에 교환가능하게 사용된다. 그러한 레트로바이러스/레트로바이러스성 입자는, 예를 들어, 감마 레트로바이러스를 포함하는 임의의 유형의 레트로바이러스성 입자, 및 실례적 구현예에서, 렌티바이러스일 수 있다. 알려진 대로, 그러한 레트로바이러스성 입자, 예를 들어 렌티바이러스성 입자는, 전형적으로 패킹 세포를 패키징 구성요소 예컨대 슈도타이핑 요소를 인코딩하는 Gag, Pol 및 Rev, 외피 또는 슈도타이핑 플라스미드를 포함하는 플라스미드, 및 관심의 유전자(들) 또는 다른 코딩 서열이 인코딩되는 전형적으로 플라스미드인, 전이성, 게놈성, 또는 레트로바이러스성 (예를 들면 렌티바이러스성) 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 패키징 세포에서 형성된다. 따라서, 레트로바이러스성 (예를 들면 렌티바이러스성) 발현 벡터는 세포에 형질감염후 발현 및 패키징을 촉진시키는 서열 (예를 들면 프시 패키징 요소 및 표적 이종 코딩 서열을 예를 들면 측접하는 5' LTR 및 3' LTR)을 포함한다. 용어 "렌티바이러스" 및 "렌티바이러스성 입자"는 본원에 교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "작제물"은 단리된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 숙련된 기술자는 작제물이 문맥에 따라 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 단리된 폴리펩타이드를 지칭하는 지를 이해할 것이다.
본원에 사용된 경우에, "MOI"는 MOI가 세포의 수당 감염에 사용된 바이러스 입자의 수의 비율과 똑같은 감염 다중도 비율을 지칭한다. 바이러스 입자의 수의 기능적 역가화는 비-제한 예로서 FACS 및 리포터 발현을 사용하여 수행될 수 있다.
"말초 혈액 단핵 세포" (PBMC)는 원형 핵을 갖는 말초 혈액 세포를 포함하고 림프구 (예를 들면 T 세포, NK 세포, 및 B 세포) 및 단핵구를 포함한다. PBMC가 아닌 일부 혈액 세포 유형은 적색 혈액 세포, 혈소판 및 과립구 (즉 호중구, 호산구, 및 호염기구)를 포함한다.
본 개시내용 및 본원에 제공된 양태 및 구현예가 개시된 특정한 실시예로 제한되지 않고, 그 자체로, 물론, 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이므로, 본원에 사용된 전문용어가 특정한 실시예 및 구현예만을 개시할 목적을 위한 것이고, 제한되기 위한 것이 아님이 또한 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한과 임의의 다른 명시된 또는 그 언급된 범위의 개재 값 사이, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 하한의 단위의 10분의 1까지, 각 개재 값이 본 개시내용 내에 포함되는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에서 포함될 수 있고, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계에 따라, 본 발명 내에 또한 포괄된다. 언급된 범위가 한계 중 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 경우, 포함된 한계 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 제외한 범위는 또한 본 발명에 포함된다. 중첩하는 범위에 대하여 여러 낮은 값 및 여러 높은 값이 주어지면, 숙련된 기술자는 선택된 범위가 높은 값 미만인 낮은 값을 포함할 것임을 인식할 것이다. 본 명세서에서 모든 제목은 독자의 편의를 위한 것이며 제한적이지 않다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 테스팅에 사용될 수 있어도, 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 간행물이 인용된 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 참고로 본원에 편입된다.
본원에 사용된 경우에 및 첨부된 청구항에서, 단수 형태 "한", "하나", 및 "상기"가 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조물을 포함하는 것이 유의되어야 한다. 그래서, 예를 들어, "한 키메라 항원 수용체" 지칭은 당업자에 알려진 복수의 그러한 키메라 항원 수용체 및 이의 등가물, 및 기타 등등을 포함한다. 청구항이 어느 임의적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음이 추가로 유의된다. 따라서, 본 진술은 청구항 요소의 인용, 또는 "음성" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 및 기타 등등으로서 그러한 배타적 전문용어의 사용에 대하여 선행 근거의 역할을 하기 위한 것이다.
명확성을 위하여, 별도 구현예의 맥락에서 기재되는 본 발명의 특정 속성이 단일 구현예에서 조합으로 또한 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간략성을 위하여, 단일 구현예의 맥락에서 기재되는 본 발명의 다양한 속성이 별도로 또는 임의의 적당한 하위-조합으로 또한 제공될 수 있다. 본 발명에 속하는 구현예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포용되고 각각의 및 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 이밖에도, 다양한 구현예 및 이의 요소의 모든 하위-조합은 본 발명에 의해 또한 구체적으로 포용되고 각각의 및 모든 그러한 하위-조합이 본원에 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 본원에 사용된 임의의 섹션 제목은 조직적 목적만을 위한 것이고 설명된 주제를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
상세한 설명
본원에 개시된 양태 및 구현예는, 특정 양태에서, HER2를 결합시키기 위한 새로운 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공함으로써, 현행 암 요법, 및 특히 HER2를 표적하는 암 요법의 표적내, 종양외 효과의 문제를 극복한다. 실례적 구현예에서, 본원에 제공된 HER2를 결합시키기 위한 CAR은, 종양 환경에서 활성이지만 정상 생리학적 조직/장기에서 더 적은 활성이거나 활성이 아닌, 본원에 제공된, CAB CAR-T 세포 및 NK 세포를 창출하는데 사용되는 조건부 활성 생물학적 CAR (즉 항-HER2 CAB CAR)이다. 그러한 CAB CAR, 및 특히 그러한 CAB CAR을 발현시키는 T 세포 및 NK 세포, 및 그러한 CAB CAR T 세포 및 NK 세포를 포함하는 본원에 제공된 전달 현탁액은 요법에서 사용을 위한, 그리고 치료제의 제조에서 사용을 위한, 특히 고형 종양, 특히 HER2를 발현시키고/거나 HER2+ 종양으로서 분류되는 고형 종양을 치료하기 위한 약속을 지킨다. 본원에 제공된 예시적 CAB CAR T 세포 및/또는 NK 세포가 정상 생리학적 pH에 비교하여 더 낮은 pH, 예컨대 TME의 것에서 HER2를 발현시키는 표적 세포를 더욱 효과적으로 사멸시킬 수 있음이, 그러한 CAB CAR을 발현시키는 그러한 T 세포 및/또는 NK 세포를 사용하여, 본원에 개시된 개념증명 실험에서 나타난다. 더욱이, 본원에 제공된 항-HER2 CAB CAR을 발현시키는 CAR-T 세포의 실례적 예가 생체내 마우스 모델에서 HER2를 발현시키는 종양 세포, 그러나 TME의 외부에서 HER2를 발현시키는 희박한 세포를 사멸시킬 수 있음이 그러한 개념증명 실험에서 본원에 나타난다.
HER2를 결합시키는 CAR의 다양한 구현예 외에, 본원에 제공된 CAR의 임의의 것을 인코딩하는, 또는 그러한 CAR에서 사용될 수 있는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구현예가 본원에 제공된다. 더욱이, 그러한 CAR을 발현시키기 위한 발현 벡터, 예컨대 CAR의 임의의 것을 발현시키기 위한 바이러스성 작제물 및 레트로바이러스성 입자가 본원에 제공된다. 본 개시내용의 CAR은 다양한 방법에서 사용될 수 있고, 본 개시내용의 CAR을 인코딩하는 발현 벡터, 예컨대 재조합 바이러스성 벡터로 T-세포 및 다른 세포독성 세포의 감염 방법과 함께, 또한 제공된다.
조건부 활성 생물학적 항-HER2 CAR (항-HER2 CAB-CAR)
본 개시내용은, 단순성을 위하여, "CAR"로서 본원에 지칭되는 키메라 항원 수용체를 제공한다. 실례적 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 HER2에 결합하는 폴리펩타이드이고 추가 실례적 구현예에서, CAR은 HER2에 조건부 활성 방식으로 결합한다. 본원에 제공된 실례적 항-HER2 CAR은 전형적으로 다른 CAR 도메인에 연결되고, 실례적 구현예에서, 상기에 공유적으로 부착되는 HER2에 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR)을 포함한다. 이들 다른 CAR 도메인은 전형적으로 세포내 신호전달 도메인에 연결되는 막관통 도메인에 항-HER2 ASTR을 연결시키는 스토크 도메인을 포함한다. 이들 다른 CAR 도메인은 하나 이상의 조절 도메인 뿐만 아니라 당업계에서 알려진 임의의 CAR 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이들 중 일부는 본원에 명시적으로 제공된다. ASTR은 전형적으로, 실례적 구현예에서 링커에 의해 분리된 동일한 폴리펩타이드 쇄에 있는, 분리된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 양태에서, a) 7.4의 pH에 비교하여 pH 6.7에서 HER2에 증가된 결합을 나타내는 적어도 하나의 조건부 활성 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR); b) 막관통 도메인; 및 c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CAR이 본원에 제공된다. 실례적 구현예에서, CAR의 항원-특이적 표적화 영역은 항-HER2 항체의 조건부 활성 scFv 부문이다. 더욱이, 실례적 구현예에서 ASTR은 정상 생리학적 환경에 비교하여 종양 환경에서 활성의 증가를 나타낸다.
본 개시내용의 CAR은 실례적 구현예에서, 조건부 활성이다. 이 특성은 전형적으로 정상 조직에서 생리학적 pH에 비교하여 더 낮은 pH에서 HER2에 증가된 결합, 실례적 구현예에서 6.7의 pH 대 7.4의 pH에서 증가된 결합으로서 나타난, CAR의 항-HER2 ASTR 도메인의 조건부 활성 성격의 결과이다. 이론에 의해 제한됨 없이, 본원에 제공된 항-HER2 ASTR의 이 조건부의 결합은 그와 같은 조건부 활성 항-HER2 ASTR을 포함하는 CAR에 조건부 항-HER2 CAR 활성을 줄 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 CAR의 조건부 항-HER2 활성은 HER2-발현 표적 세포에 CAR을 발현시키는 세포의 노출시, 7.4의 pH에 비교하여, 6.5 내지 6.9, 실례적 구현예, 6.7의 pH에서 증가된 CAR 활성이다. 일부 구현예에서, 이 항-HER2 CAR 활성은 HER2-발현 표적 세포로 인큐베이션시 T 세포의 활성화이다. 일부 구현예에서, T 세포의 활성화는 T 세포에 의한 T 세포 활성화 바이오마커의 증가된 발현, T 세포에 의한 사이토카인 생산, T 세포의 증식, 및 T 세포에 의한 표적 세포 사멸 중 하나 이상을 분석함으로써 결정된다. 본원에 더욱 상세히 논의된, 그리고 본원에 실시예에서 실례된 대로, 항-HER2 CAR 활성은 HER2를 발현시키는 표적 세포 및 온-테스트 CAR을 인코딩하는 핵산으로 형질도입된 온-테스트 CAR-T 세포가 T 세포의 활성화 검출하기 및/또는 측정하기 전에 유효 시간 동안 검정 배지에서 함께 인큐베이션되는 시험관내 검정에서 측정될 수 있다.
특정 실례적 구현예에서, 본 개시내용의 CAB-CAR은 비-TME의 조건 하에서 보다 TME의 조건(들) 하에서 HER2에 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, TME에서의 조건 및 비-TME에서의 조건은 둘 다 pH이다. 그래서, CAB-CAR은 전형적으로 이들이 정상 생리학적 환경에서 직면되는 pH인, 7.2-7.8의 pH에 비교하여, TME에서 직면되는 pH인, 약 6.0-6.8의 pH에서 HER2에 대하여 더 높은 결합 친화성을 갖기 때문에 조건부 활성 방식으로 HER2에 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 실례적 CAB-CAR은 pH 7.4보다 pH 6.7에서 HER2에 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 본원에 제공된 실례적 CAB-CAR은 pH 7.4보다 pH 6.0에서 HER2에 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있다. 그러한 조건은 예를 들어, 정상 생리학적 조직에서 상응하는 조건(들)과 상이한, 아래 더욱 상세히 제시된 대로, 생체내 종양 환경에서 발견된 하나 이상의 조건 하에서 항원 결합 및/또는 CAR 활성 (예를 들면 세포 용해)에 대하여 테스트하는 시험관내 종양 대리 검정에서 테스트될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 종양 대리 검정 조건은 생리학적 pH (7.2-7.8)에 비교하여 낮은 pH (예를 들면, 6.0-6.8)일 수 있다. 실례적 예에서, 종양 대리 검정 조건은 6.7의 pH인 반면 상응하는 생리학적 pH는 7.4이다.
HER2를 표적하는 조건부 활성 ASTR
본원에 논의된 경우에, 본원에 제공된 실례적 CAR의 조건부 항-HER2 CAR 활성은 정상, 생리학적 pH에서 결합에 비교하여 정상 생리학적 pH 미만의 pH에서 HER2에 대한 그들 CAR의 ASTR의 증가된 결합의 결과인 것으로 믿어진다. 따라서, 본원에 제공된 다양한 양태의 임의의 것의 실례적 구현예는 7.4의 pH에 비교하여 5.0 내지 6.8의 pH, 또는 6.5 내지 6.8의 pH, 또는 6.7의 pH에서 HER2 단백질에 증가된 결합이 있는 조건부 활성 ASTR을 갖는 CAR을 포함한다. 그러한 ASTR 및 그러한 ASTR을 함유하는 CAR의 예는 본원에 실시예에서 제공된다. 이론에 의해 제한됨 없이, 항체에서 존재하는 때 pH 6.7 대 7.4에서 증가된 결합을 그 항체에 주는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 7.4에 비교하여 pH 6.7에서 증가된 활성과 항-HER2 CAB-CAR 활성을 가질, 본원에 개시된 ASTR의 임의의 것으로 CAR이 만들어질 수 있음을 본 발명자들이 믿는다는 것이 주목할만 하다. 항-HER2 CAB 사멸 활성, 또는 심지어 pH에 의해 영향받지 않은 사멸 활성이 테스트된 그러한 CAR 가변 경쇄 및/또는 중쇄를 포함한 본원에 실시예에서 테스트된 모든 CAR 작제물에서 검출되지 않았어도, 추가 테스팅이, 특히 CAB 항체에서 발견되지 않는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 만들어진 ASTR에 비교된 경우, 이들 CAR의 임의의 것의 항-HER2 CAB-CAR 성격을 드러낼 것으로 믿어진다.
일부 구현예에서, ASTR 또는 그와 같은 ASTR의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항체 단편은 TME에 한 pH, 예컨대 5.0 내지 6.8의 pH, 또는 6.0의 pH 또는 6.7의 pH에서 HER2 단백질에 대한 결합 친화성 대, 예를 들어, 비-TME에 상이한 pH, 예컨대 7.4의 pH에서 HER2 단백질에 대한 결합 친화성의 비 적어도 약 1.5:1, 적어도 약 2:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 8:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 70:1, 또는 적어도 약 100:1을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, ASTR은 서열번호:119의 중쇄 및 서열번호:122의 경쇄를 포함하는 항체와 동일한 HER2의 에피토프에 결합한다. 실례적 구현예에서, ASTR은, 링커에 의해 전형적으로 분리된, 서열번호:119의 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일-쇄 가변 항체 단편과 동일한 HER2의 에피토프에 결합한다. 실례적 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호:123-125 중 어느 하나일 수 있고 경쇄 가변 영역은 서열번호:122일 수 있다. 실례적 양태에서, 그러한 ASTR을 갖는 CAR은 조건부의 활성 항-HER2 CAR (즉 항-HER2 CAB CAR)이다. 그러한 항-HER2 CAB CAR의 비-제한 예는 본원에 실시예에서 제공된다. 일부 구현예에서, CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산은, 본원에 실시예에서 테스트되었고 대조군 CAR에 비해 증가된 사멸 활성을 보여주었던, 서열번호:153-236, 또는 서열번호:157-236)의 ASTR의 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산은 7.4에 비교하여 pH 6.7에서 HER2-발현 표적 세포의 존재 하에서 CAB 활성을 보여주었던, 본원에 실시예에서 식별된 ASTR의 임의의 것을 포함할 수 있다. 이들 ASTR 및 상응하는 CAR의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는 pH 7.4보다 pH 6.0에서 HER2에 더 높은 결합 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (예를 들면 (본원에 참고로 이 전체가 편입된 미국 가출원 번호 62/964,747의 도 4 및 8 참고).
실례적 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호:126-130 중 임의의 것일 수 있고 중쇄 가변 영역은 서열번호:119일 수 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 이들 조합은 본원에 실시예에서 CAB-CAR 활성을 보여주었다. 이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는, pH 7.4보다 pH 6.0에서 HER2에 더 높은 결합 친화성을 갖기 위해, 본 발명자들 중 적어도 한명에 의해 수행된 실험에서 밝혀졌다 (예를 들면 (본원에 참고로 이 전체가 편입된 미국 가출원 번호 62/964,747의 도 4 및 8 참고).
서열번호:119 및 122, 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합은 본원에 벤치마크로서 지칭된다. 벤치마크의 CDR은 서열번호:119의 아미노산 26 내지 35에 상응하는 HCDR1 GFNIKDTYIH (서열번호:131); 서열번호:119의 아미노산 50 내지 66에 상응하는 HCDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG (서열번호:132); 서열번호:119의 아미노산 99 내지 109에 상응하는 HCDR3 WGGDGFYAMDY (서열번호:133); 서열번호:122의 아미노산 24 내지 34에 상응하는 LCDR1 RASQDVNTAVA (서열번호:134); 서열번호:122의 아미노산 50 내지 56에 상응하는 LCDR2 SASFLYS (서열번호:135); 및 서열번호:122의 아미노산 89 내지 97에 상응하는 LCDR3 QQHYTTPPT (서열번호:136)이다. 이들 CDR은 CDR의 서열 정의 (Kabat 등. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest (Natl. Inst. Health, Bethesda, MD)에 기반된 아미노산 및 CDR의 구조적 정의 (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)에 기반된 아미노산을 포함한다. 본원에 제공된 CAR의 항-HER2 ASTR의 CDR은 비슷하게 정의된다. 예시적 링커에 의해 분리된 벤치마크 중쇄 및 경쇄를 포함하는 비-제한 예시적 ASTR은 서열번호:153-156에서 제공된다.
본원에 실례적 구현예에서, 본원에 제공된 항-HER2 ASTR은 7.4의 pH에 비교하여 6.7의 pH에 증가된 CAR 활성을, 이들을 함유하는 CAR에 준다. 이들 CARS에서 항-HER2 ASTR은, 실례적 구현예에서 서열번호:119의 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 단일-쇄 가변 항체 단편과 동일한 HER2의 에피토프에 결합한다. 실례적 구현예에서, 본원에 제공된 그러한 항-HER2 ASTR은 7.4에 비교하여 6.7의 pH에서 HER2에 더 큰 결합을 갖는다.
ASTR이 HER2에 결합하는, 그리고 실례적 구현예에서 서열번호:119의 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 단일-쇄 가변 항체 단편과 동일한 HER2의 에피토프에 결합하는 일부 구현예에서, ASTR은 전형적으로 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서
HCDR1 서열은 GFNIKDTYIH (서열번호:131)이고;
HCDR2 서열은 X1IYPTNGYTX2YADSVKG (서열번호:137)이고;
HCDR3 서열은 WGGDGFYAMDY (서열번호:133)이고;
ASTR은 전형적으로 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서
LCDR1 서열은 RASQDVNTX3VA (서열번호:142)이고;
LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고;
LCDR3 서열은 QQX4YTTPPT (서열번호:143)이고,
식중 X1은 R 또는 K이고, X2는 R 또는 E이고, X3은 A 또는 D이고, X4는 H, D 또는 E이다.
실례적 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합은 벤치마크의 중쇄 및 경쇄 CDR의 조합을 포함하지 않는다. 실례적 구현예에서, ASTR은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이 5 내지 50개 (예를 들면 10 내지 40, 15 내지 30개) 아미노산 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은 각각이 서열번호: 119 및 서열번호:122, 각각에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하고, K로서 X1, E로서 X2, D로서 X3, 또는 D 또는 E로서 X4의 1, 2, 3 또는 모두 4개를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, ASTR은 각각이 K로서 X1, E로서 X2, D로서 X3, 또는 D 또는 E로서 X4의 1, 2, 3 또는 모두 4개를 제외한, 서열번호:119 및 서열번호:122 각각에 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는다. 예시적 링커에 의해 분리된, 벤치마크 CDR을 포함하는, 벤치마크 중쇄 및 경쇄를 포함하는 예시적 ASTR은 서열번호:153-156에서 제공된다.
일부 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4는 R, R, A, 및 H, 각각이다. 하지만, 실례적 구현예에서, 상기 양태에서 CDR이 벤치마크의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하지 않는 경우, ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 각각 R, R, A, 및 H 이외이다. 그래서, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호:119 및 서열번호:122 이외이다. 실례적 구현예에서, ASTR은 서열번호:119 및 122의 양쪽 서열 (즉 조합)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, ASTR은 중쇄 가변 영역에서 X1이 R이고 X2가 R이고 경쇄 가변 영역에서 X3이 A이고 X4가 H인 CDR의 조합을 포함하지 않는다. 실례적 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 X1, X2, X3, 및 X4는 각각 R, R, D, 및 H (A032D); 각각 R, R, A, 및 D (H091D); 각각 R, R, A, 및 E (H091E); 각각 K, R, A, 및 H (R050K); 또는 각각 R, E, A, 및 H (R059E)일 수 있다. 벤치마크로부터 이들 돌연변이체의 각각은 본원에 실시예에서 실례된 대로 7.4 미만 pH에서 HER2에 증가된 결합을 제공하는 것으로 항체에서 식별되었다. 벤치마크로부터 이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역 단일 돌연변이체의 각각은 본원에 실시예에서 나타난 대로 항-HER2 CAR의 ASTR에서 포함된 때 CAB-CAR 활성을 제공하였다.
실시예 2 및 3에서, CDR로서 이들 서열을 함유하는 ASTR을 가진 CAR은 HER2-발현 세포를 용해시켰다 (표 2 내지 4). 6.7의 pH (전형적 TME) 대 7.4의 pH (전형적 비-TME) 사이 112 초과 활성의 비를 가진, 즉, 더 낮은 pH에 더 높은 활성을 보여주는 CAR은 CAB (표 3에서 "CAB"로서 카테고리화된 작제물)로서 식별되었다. CAR은 다른 쪽의 ASTR N-말단의 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄와 경쇄 사이 링커 어느 한쪽으로 테스트되었다. 이들 구현예 중 임의의 것에서, 경쇄는 중쇄에 N-말단일 수 있거나 중쇄는 경쇄에 N-말단일 수 있다. 실례적 구현예에서, CAR은 CDR을 포함할 수 있고 실례적 구현예에서 표 3 (서열번호:154, 156, 159-162, 172-173, 175-176, 199, 또는 224)에서 F1-4-37, F1-4-26, F1-4-27, F1-4-28, F1-4-74, F1-4-75, F1-4-77, F1-4-81, 및 F1-4-85 중 임의의 것의 ASTR, 이들 모두는 실시예 2에서 나타난 대로 CAB-CAR 활성을 가졌다. 표 3은 CDR에서의 돌연변이 그리고 중쇄 또는 경쇄가 다른 쪽의 N-말단인지를 나타낸다. CAR은 중쇄 및 경쇄에 대하여, 서열번호:119 및 122, 각각의 FR을 함유하였다. 이의 CAB 활성이 벤치마크의 것보다 더 크지 않기 때문에 F1-4-31이 실시예 2에서 야생형으로서 카테고리화되지 않아도, 1 초과의 퍼센트 용해 비율을 가졌고 그러므로 CAB 활성을 가질 수 있음이 주목할 만하다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 CAR의 임의의 것은 서열번호:119의 중쇄 및 서열번호:126-128의 경쇄 중 임의의 것을 포함하는 ASTR을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:123 또는 서열번호:124의 중쇄 및 서열번호:122의 경쇄를 포함할 수 있다.
ASTR이 HER2에 결합하는, 그리고 실례적 구현예에서 서열번호:119의 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일-쇄 가변 항체 단편과 동일한 HER2의 에피토프에 결합하는 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서
HCDR1 서열은 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고;
HCDR2 서열은 RIX2PTX3X4YX5RYADSVKG (서열번호:139)이고;
HCDR3 서열은 WGGDGFYX6MDY (서열번호:140)이고;
ASTR은 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서
LCDR1 서열은 RASQDVNTAVA (서열번호:134)이고;
LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고;
LCDR3 서열은 QQHYTTPPT (서열번호:136)이고,
식중 X1은 N 또는 W이고; X2는 Y, D, 또는 K이고; X3은 N 또는 A이고; X4는 G 또는 K이고; X5는 T 또는 D이고, X6은 A 또는 E이고;
중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합은 벤치마크의 중쇄 및 경쇄 CDR의 조합을 포함하지 않는다.
상기 양태에서 CDR이 벤치마크의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하지 않으므로, ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6의 조합은 각각 N, Y, N, G, T, 및 A 이외이다. 그래서, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호:119 및 서열번호:122 이외이다. 실례적 구현예에서, ASTR은 서열번호:119 및 122의 양쪽 서열 (즉 상기의 조합)을 포함하지 않는다. 실례적 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6은 각각 W, Y, N, G, T, 및 A (N028W); 각각 N, D, N, G, T, 및 A (Y052D); 각각 N, K, N, G, T, 및 A (Y052K); 각각 N, Y, A, G, T, 및 A (N055A); 각각 N, Y, N, K, T, 및 A (G056K); 각각 N, Y, N, G, D, 및 A (T058D); 또는 각각 N, Y, N, G, T, 및 E (A106E)일 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄는 돌연변이 S119E를 포함할 수 있다. 이들 돌연변이는 항-HER2 항체로서 테스트된 때 CAB 활성을 갖는 것으로 나타났다 (예를 들면, 실시예 1 및 (본원에 참고로 편입된) 미국 가출원 번호 62/964,747 참고).
ASTR이 HER2에 결합하는, 그리고 실례적 구현예에서 서열번호:119의 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일-쇄 가변 항체 단편과 동일한 HER2의 에피토프에 결합하는 일부 구현예에서 중쇄 가변 영역은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서
HCDR1 서열은 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고;
HCDR2 서열은 X2IX3PTX4X5YX6X7YADSVKG (서열번호:141)이고;
HCDR3 서열은 WGGDGFYX8MDY (서열번호:140)이고;
ASTR은 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서
LCDR1 서열은 RASQDVNTX9VA (서열번호:142)이고;
LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고;
LCDR3 서열은 QQX10YTTPPT (서열번호:143)이고,
식중 X1은 N 또는 W이고, X2는 R 또는 K이고, X3은 Y, D, 또는 K이고, X4는 N 또는 A이고, X5는 G 또는 K이고, X6은 T 또는 D이고, X7은 R 또는 E이고, X8은 A 또는 E이고, X9는 A 또는 D이고, X10은 H, D, 또는 E이고;
중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합은 벤치마크의 중쇄 및 경쇄 CDR의 조합을 포함하지 않는다.
상기 양태에서 CDR이 벤치마크의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하지 않으므로, 실례적 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 조합은 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A 및 H 이외이다. 그래서, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호:119 및 서열번호:122 이외이다. 실례적 구현예에서, ASTR은 서열번호:119 및 122의 양쪽 서열 (즉 상기의 조합)을 포함하지 않는다. 실례적 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10은 각각 W, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H (N028W); 각각 N, K, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H (R050K); 각각 N, R, D, N, G, T, R, A, A, 및 H (Y052D); 각각 N, R, K, N, G, T, R, A, A, 및 H (Y052K); 각각 N, R, Y, A, G, T, R, A, A, 및 H (N055A); 각각 N, R, Y, N, K, T, R, A, A, 및 H (G056K); 각각 N, R, Y, N, G, D, R, A, A, 및 H (T058D); 각각 N, R, Y, N, G, T, E, A, A, 및 H (R059E); 각각 N, R, Y, N, G, T, R, E, A, 및 H (A106E); 각각 N, R, Y, N, G, T, R, R, D, 및 H (A032D); 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 D (H091D); 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 E (H091E); 각각 N, R, K, N, G, T, R, R, D, 및 H (Y052K/A032D); 각각 N, R, Y, N, K, T, R, R, D, 및 H (G056K/A032D); 각각 N, R, Y, N, G, D, R, D, A, 및 H (T058D/A032D); 또는 각각 N, R, Y, N, G, T, R, E, D, 및 H (A106E/A032D)일 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄는 돌연변이 S119E를 포함할 수 있다. 이들 돌연변이는, 항-HER2 항체로서 테스트된 때 CAB 활성을 갖는 것으로, 본 발명자들 중 적어도 한 명에 의해 수행된 실험에서 나타났다 (예를 들면 (본원에 참고로 편입된) 미국 가출원 번호 62/964,747의 도 4 및 8 참고).
본원에 개시된 구현예 중 임의의 것에서, ASTR은 단일-쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편 (예를 들면 scFv 단편), 2가 단일-쇄 항체, 또는 디아바디일 수 있다. 실례적 구현예에서, HER2를 결합시키는 조건부 활성 ASTR은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단일-쇄 가변 단편이다.
pH 7.4에 비교하여 pH 6.7에서 HER2에 증가된 결합을 갖는 예시적 조건부 활성 CAR (CAB-CAR)은 본원에 실시예에서 찾아진다. 실례적 구현예에서, CAR 또는 ASTR은, 서열번호:119의 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 및/또는 단일-쇄 가변 항체 단편과 동일한 HER2의 에피토프에 결합할 수 있다. 그러한 실례적 구현예의 추가 구현예에서, 항-HER2 CAR 또는 ASTR은 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하거나 상기이다. 추가 실례적 예에서, 항-HER2 scFv는 경쇄에 N-말단인 중쇄 또는 중쇄에 N-말단인 경쇄 어느 한쪽을 포함한다. CAR을 포함하는 본원에 구현예들 중 임의의 것에서, 그리고 서열번호:119의 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 HER2의 에피토프에 결합하는 실례적 구현예에서, ASTR은 서열번호:119, 122-124, 또는 126-28 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 실례적 구현예에서 1개 중쇄 및 1개 경쇄를 포함하고 서열번호:119 및 서열번호:122의 조합 이외이다. 게다가, 본원에 구현예들 중 임의의 것의 항-HER2 CAR은 본원에 다른 곳에 제공된 CAR 구성요소들 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 실례적 구현예에서, 항-HER2 CAR, 및 특히 항-HER2 CAB-CAR을 포함하는 본원에 CAR은, 비-제한 실례적 구현예에서 표 3 내지 4에 조건부의 세포독성 활성 ("CAB")을 입증하였던 항-HER2 CAB-CAR들 중 임의의 것을 포함한다.
본원에 개시된 중쇄 가변 영역 폴리펩타이드 및 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드는 모체 항체 중쇄 가변 영역 (서열번호:119) 및 모체 항체 경쇄 가변 영역 (서열번호:122)으로부터 식별되었다.
CAR은 HER2에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호:119 및 122의 서열의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 변이체인 ASTR을 또한 포함할 수 있고, 실례적 구현예에서 중쇄 가변 영역의 CDR (HCDR1-HCDR3) 및 경쇄 가변 영역의 CDR (LCDR1-LCDR3)을 포함한다. 이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 변이체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 변형 도입에 의해, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 결실(들), 삽입(들), 및 치환(들)의 임의의 조합은 최종 작제물에 도달하도록 만들어질 수 있고, 다만 최종 작제물은 원하는 특징들 중 적어도 하나, 예를 들면, 항원-결합을 소유한다.
조건부의 활성에 대한 테스트
지시된 대로, 본원에 제공된 항-HER2 CAR은, 7.4의 pH에 비교하여 5 내지 6.7 pH에서 증가된 CAR 활성 (예를 들면 pH 6.7 대 7.4에서 CAB-CAR 활성)을 갖는 전형적으로 CAB-CAR (즉 조건부 활성 CAR)이다, 이 CAR 활성은, HER2-발현 표적 세포와 인큐베이션시, 본원에 제공된 CAR을 발현시키는 T 세포의 활성화에 의해 검출 또는 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포의 활성화는 T 세포에 의한 T 세포 활성화 바이오마커의 증가된 발현, (세포내 또는 세포외) T 세포에 의한 사이토카인 생산, T 세포의 증식, 및/또는 T 세포에 의한 표적 세포 사멸 중 하나 이상을 분석함으로써 결정된다. 본원에 실시예에서 실례된 대로, CAR 활성은 HER2를 발현시키는 표적 세포 및 온-테스트 CAR을 인코딩하는 핵산으로 형질도입된 온-테스트 CAR-T 세포가 검정을 수행하기 위한 유효 시간 동안 검정 배지에서 함께 인큐베이션되는 시험관내 검정에서 측정될 수 있다. 하기 단락은 그러한 검정에 관하여 추가 개시내용을 제공한다. 게다가, 본원에 실시예는, 비-제한 CAR-활성 및 CAB-CAR 검정 예컨대 루시퍼라제 세포 사멸 검정 및 임피던스를 측정하는 실시간 세포 사멸 검정, 뿐만 아니라 다수의 시험관내 발현 검정, 및 생체내 검정을 입증한다. 표적 세포의 하나의 유형으로 초기 스크린에서 CAB 활성을 보여주거나 CAR 사멸을 촉진시키지 않는 HER2를 결합시키는 것으로 입증된 중 및 경 항체 쇄를 사용하여 설계된 CAR이 도메인의 상이한 조합을 가진 또는 테스트되었다면 다른 HER2-발현 표적 세포를 가진 CAB-CAR일 수 있음을 유의한다. 본원에 예시적 구현예에서 개시된 항-HER2 CAR이 5.0 내지 6.7 대 7.4의 pH에서 HER2에 증가된 결합을 갖는 것으로 실험적으로 결정된 항체로부터 CDR을 갖는 ASTR을 포함하므로, 본원에 예시적 구현예의 이들 항-HER2 CAR이 CAB-CAR인 것은 이들이 CAB CAR 활성을 적어도 특정 조건 하에서, 예컨대 본원에 개시된 테스트들의 임의의 것을 사용하여 CAB-CAR 활성을 위한 스크린에 사용된 특정한 세포주로 입증할 것이기 때문인 것으로 믿어진다.
전형적으로, pH 5.0 내지 6.7 대 7.4에서 CAB-CAR 활성은, 본 섹션에서, 비제한적으로, 포함하는 이의 예가 본원에 제공되는, 정량적 검정을 사용하여 결정된다. 특정한 CAB-CAR 활성은 일부 구현예에서, 통계적으로 유의미한 결과에 기반된다. 예를 들어, 그러한 검정은, 통계적 테스트를 사용하여, 대조군 CAR을 위한 반복실험의 결과를 온-테스트 CAR을 위한 것들과, 또는 pH 5.0 내지 6.7 대 7.5의 pH에서 온-테스트 CAR을 위한 것들과 비교하는 단계를 포함할 수 있고, 여기에서 상기 활성은 통계적 유의미성 (예를 들면 반복실험에 대한 평균 값이 6.7 대 7.4에서 적어도 1 표준 편차, 2 표준 편차, 또는 3 표준 편차 더 큰, 또는 pH 6.7/7.4 비율이 CAB 활성을 나타내지 않는 항체 도메인으로 만들어진 CAR을 갖는 대조군 CAR을 위하여 동일한 pH 6.7/7.4 비율에 대한 그러한 통계적 유의미성을 갖거나; 대조군 CAR 및 온-테스트 CAR의 활성의 범위 (평균 +/- 1, 2, 또는 3 표준 편차)가 중첩하지 않는 온-테스트), 전형적으로 온-테스트 샘플 대 대조군 샘플에 대하여 CAR 활성에서 유의미한 증가에 기반된다. 그러한 검정은, 예를 들어, T-테스트를 사용하여 대조군 CAR 및 온-테스트 CAR로부터 결과를 비교하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 추가적으로, 이들 테스트는 단지 온-테스트 CAR 그리고 더 낮은 pH 값 및 더 높은 pH 값에서 온-테스트 CAR 사이 비교된 결과로 수행되어 온-테스트 CAR이 CAB-CAR 활성을 갖는 지를 결정할 수 있다.
본 개시내용의 CAR은 진핵 세포, 예를 들면, 포유류 세포의 혈장 막에서 존재할 수 있고, 여기에서 적당한 포유류 세포는, 비제한적으로, 세포독성 세포, T 림프구, 줄기 세포, 줄기 세포의 자손, 전구 세포, 전구 세포의 자손, NK 세포, NK-T 세포, 및 대식세포를 포함한다. 실례적 구현예에서 CAR은 T 세포 및/또는 NK 세포의 하나 또는 집단의 혈장 막에서 존재한다. 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 경우, 본 개시내용의 CAR은, 특정 조건에서, ASTR을 결합시키는 HER2의 존재 하에서 활성이다. 항-HER2 ASTR은 특이적 결합 쌍의 제1 구성원이고. HER2는 특이적 결합 쌍의 제2 구성원이다. 특이적 결합 쌍의 HER2는 가용성일 (예를 들면, 세포에 결합되지 않을) 수 있지만; 실례적 구현예에서 세포 예컨대 표적 세포의 표면에서 존재하거나; 고체 표면에서 제시되거나; 지질 이중층; 및 기타 등등에서 존재한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, 세포에서 적어도 하나의 핵산의 발현을 증가시킨다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, HER2의 부재 하에서 핵산의 전사의 수준과 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 10-배 초과만큼 세포에서 적어도 하나의 핵산의 발현을 증가시킨다.
예로서, 본 개시내용의 CAR은 면역수용체 티로신-기반된 활성화 모티프 (ITAM)-함유 세포내 신호전달 폴리펩타이드를 포함할 수 있고; 그러한 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, 활성화된 T 세포 (NFAT)-의존적 전사의 핵 인자를 증가시킨다. NFAT-의존적 전사는, 예를 들면, NFATel, NFATc2, NFATc3, NFATc4, NFAT5; AP-1; Spl; NKKB; 및 기타 등등을 포함하는, NFAT 패밀리의 어느 구성원에 의해 유도된 전사를 포함한다.
본 개시내용의 CAR은, HER2에 CAR을 결합시킴으로써 활성화되는 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 일부 경우에, 세포에 의한 하나 이상의 사이토카인의 증가된 생산을 초래할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, HER2의 부재 하에서 세포에 의해 생산된 사이토카인의 양과 비교하여, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 또는 10-배 초과만큼 세포에 의해, 사이토카인 예컨대 IFN 감마 또는 IL-2, 또는 활성화와 연관된 세포 표면 마커, 예컨대 CD107a 및/또는 CD69의 생산을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, HER2의 부재 하에서 세포에 의해 분비된 사이토카인의 양과 비교하여, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 또는 10-배 초과만큼 세포에 의해 사이토카인의 분비를 증가시킬 수 있다. 생산이 증가될 수 있는 사이토카인은, 비제한적으로 인터페론 감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), IL-2, IL-15, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10; 케모카인; 성장 인자; 및 기타 등등을 포함한다. 그래서, 실시예 3에서 입증된 대로, CAB-CAR 활성은 상이한 pH 값, 예를 들면, pH 6.7 대 pH 7.4에서 CD69 또는 CD107a의 발현 수준을 비교함으로써 입증될 수 있다. 이들 검정을 위한 일반 방법은 다음과 같고; Her2-발현 포유류 표적 세포는 높은 및 낮은 pH에서 조직 배양 플레이트의 웰들에 씨딩되고, 밤새 37℃ 및 5% CO2에 인큐베이션된다. 다음 날, 따라서 pH 조정된 온-테스트 CAR 효과기 세포는 특이적 효과기 대 표적 (E:T) 세포 비율로 표적 세포를 함유하는 웰에 첨가되어 공-배양물을 형성한다. 이들 검정에서 사용된 전형적 E:T 비율은 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 또는 1:10이다. 실례적 구현예에서, E:T 비율은 3:1, 1:1, 또는 1:3이다. 공-배양물은 연구 중인 마커에 따라 가변하는 시간의 기간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션된다. 실시예 3에서, CAR 효과기 및 MCF-7 표적의 공-배양물은 1 일 동안 인큐베이션된 다음 세포는 수집되었고 유세포 분석에 의해 세포내 IFNg 및 CD69 표면 발현의 분석을 위하여 항체로 염색되었다. IFNg 염색을 위하여, 세포는 먼저 투과된다. CD107a의 발현을 위한 일반 방법은 브레펠딘(Brefeldin) A, 및 모넨신(Monensin)이 자극화의 시작에 (예를 들면 표적 세포 및 효과기 세포가 공-배양물에 배치되는 때) 첨가되고 공-배양물이 대략 5 시간 동안 인큐베이션된 다음 세포가 수확되고 CD107a에 대한 항체로 염색되는 것을 제외하고 유사하다. 구체적으로 CAR-T 세포에서 활성화 마커의 표면 발현을 검출하기 위해, 세포는 CD3, CD4, CD8에 대한 항체, 및 CAR 또는 세포 태그 (예컨대 eTag)에 대한 항체로 전형적으로 공-염색되고, 게이팅을 이용한 유세포 분석은, 예를 들어, 활성화 마커의 발현을 위하여 살아있는 CD3+eTag+ 세포를 연구하는데 사용된다.
실시예 3에서 입증된 대로, CAB-CAR 활성은 상이한 pH 값, 예를 들면, pH 6.7 대 pH 7.4에서 표적 세포를 이용한 자극화 후에 CAR-T 세포의 증식을 비교함으로써 또한 사정될 수 있다. 증식 검정을 위한 일반 방법은 다음과 같고; 표적 세포, 예컨대 Her2-발현 표적 세포는 미토마이신 C로 처리되고 대략 3 시간 동안 37℃ 및 5% CO2에 인큐베이션되어 그들의 추가 증식을 억제시킨다. 표적 세포는 PBS에서 세정되고 높은 및 낮은 pH에서 조직 배양 플레이트의 웰에 씨딩된다. 온-테스트 CAR 효과기 세포는 수확되고, 그러한 하나 이상의 세포 추적 염료 (예를 들면 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 및 셀트레이스 바이올렛)로 표지화되고, 상기 기재된 대로 정의된 E:T 비율로 상응하는 pH에서 표적 세포에 첨가되고 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션된다. 1 내지 14, 예를 들어 대략 5 일의 공-배양 후, 세포는 수확되고 7AAD, CD3, CD8, 및 세포 태그 예컨대 eTag에 대하여 염색된다. 효과기 세포가 증식함에 따라, 세포 추적 염료의 양은 감소하고 유세포 분석 히스토그램에서 뚜렷한 피크로서 검출가능하다. 게이팅은 살아있는 CD3+세포 태그+ 세포의 증식을 구체적으로 연구하는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, 세포에서 핵산의 전사의 증가, 사이토카인의 생산의 증가, 및 세포에 의한 사이토카인의 분비의 증가를 초래할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, CAR의 제1 폴리펩타이드의 항원-결합 도메인이 결합하는 항원을 이의 세포 표면에서 발현시키는 표적 세포를 향하여 세포에 의한 세포독성 활성을 초래한다. 예를 들어, 진핵 세포가 세포독성 세포 (예를 들면, NK 세포 또는 세포독성 T 림프구 (즉 세포독성 T 세포)인 경우, 본 개시내용의 CAR은, 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, HER2를 이의 세포 표면에서 발현시키는 표적 세포를 향하여 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 예를 들어, 진핵 세포가 NK 세포 또는 T 림프구인 경우, 본 개시내용의 CAR은, 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, HER2의 부재 하에서 세포의 세포독성 활성에 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 10-배 초과만큼 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, 다른 CAR 활성화 관련된 이벤트 예컨대 (어느 한쪽 증가된 세포성 분열 또는 항-세포사멸적 반응으로 인한) 증식 및 확장을 초래할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵 세포의 혈장 막에서 존재하는 때, 그리고 HER2에 의해 활성화된 때, 다른 CAR 활성화 관련된 이벤트 예컨대 세포내 신호전달 조절, 세포성 분화, 또는 세포사를 초래할 수 있다.
본 개시내용의 CAR은 진핵 세포 막에서 존재할 수 있고, 여기에서 CAR의 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서로에 공유적으로 연결되지 않는다. 본 개시내용의 CAR은 막에서 임의의 다른 폴리펩타이드에 공유적으로 연결되지 않는 단일 헤테로이량체로서 진핵 세포 막에서 존재할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 제1 CAR은 본 개시내용의 제2 CAR에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결되는 헤테로이량체로서 진핵 세포 막에서 존재할 수 있다. 일부 경우에, 제1 및 제2 CAR은 제1 CAR의 제1 폴리펩타이드 및 제2 CAR의 제1 폴리펩타이드 양쪽에서 존재하는 힌지 영역에서 존재하는 시스테인들 사이 형성된 디술피드 결합을 통해 공유적으로 연결된다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포 막에서 존재할 수 있고, 여기에서 CAR의 제1 폴리펩타이드는 항체 단편을 포함하고 CAR의 제2 폴리펩타이드는 사이토카인 수용체에서 유래된 신호 전달 도메인을 포함하여, 이로써, 이량체화시, CAR은 헤테로이량체성-시그날로바디 CAR, 예를 들면, 적어도 2개의 독립적 폴리펩타이드로 구성된 시그날로바디를 나타낼 수 있다. "시그날로바디"는, 당업계에서 알려지는 바와 같이, 사이토카인 수용체에서 유래된 신호 전달 도메인 및 항체 단편으로 구성된 단일 키메라 거대분자이다. 특정 경우에, 본 개시내용의 헤테로이량체성-시그날로바디 CAR은, 진핵 세포의 세포 막에서 존재하는, 이량체화제에 의해 이량체화된, 그리고 항원, 예를 들면, 올리고머화된 항원에 의해 활성화된 때, 헤테로이량체성-시그날로바디 CAR의 올리고머화를 유도할 수 있다. 헤테로이량체성-시그날로바디 CAR의 그러한 리간드-유도된 올리고머화는 신호 전달을 활성화, 예를 들면, 증가, 또는 영속화, 예를 들면, 유지시킬 수 있고, 예를 들면, 헤테로이량체성-시그날로바디 CAR의 리간드-유도된 올리고머화는 세포성 반응을 유인하는 신호를 전송할 수 있다. 일부 경우에, 복수의 헤테로이량체성-시그날로바디 CAR은 원하는 세포성 반응을 유인하기 위해 조합적으로 활용될 수 있다.
추가 ASTR 구조적 고려사항
본 개시내용의 CAR은, 전형적으로 항-HER2 ASTR인, HER2를 포함하는 (즉 적어도 특정 조건 하에서 HER2를 결합시킬 수 있는) 특이적 결합 쌍의 한 구성원을 포함한다. 본 개시내용의 CAR에서 사용에 적합한 항-HER2 ASTR은, 전형적으로 HER2를 결합시킬 수 있는, 결합시키기에 효과적일 수 있는, 또는 결합하는데 적응되는 임의의 항원-결합 폴리펩타이드일 수 있다. 특정 구현예에서, ASTR은 항체 예컨대 단일-쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편 (예를 들면 scFv), 2가 단일-쇄 항체 또는 디아바디, 또는 항원-결합 가변 영역 (VH 또는 VL) 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1을 포함하는 항체 (CH2 및 CH3이 생략된 "전장" 항체)이다. 본원에 제공된 항-HER2 ASTR은, 실례적 구현예에서 2개 항체 쇄, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)를 포함한다. VH 및 VL의 각각은 전형적으로 3개 가변 영역 및 4개 프레임워크 영역을 포함한다. 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 본원에 사용된 경우에 항원에 항체 결합시키기에서 관여되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 (VH 및 VL, 각각)의, 및 본원에 실례적 항-HER2 ASTR의 가변 도메인은, 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각 도메인은 4개 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개 초가변 상보성 결정 영역 (CDR) (VH 쇄에서 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 그리고 VL 쇄에서 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함한다, 예를 들면, Kindt 등. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91페이지 (2007), 참고. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 게다가, 특정한 항원을 결합시키는 항체는 항원을 결합시켜 상보적 VL 또는 VH 도메인, 각각의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다, 예를 들어, Portolano 등, J. Immunol., vol. 150, pp. 880-887, 1993; 또는 Clarkson 등, Nature, vol. 352, pp. 624-628, 1991, 참고. 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 본원에 사용된 경우에 전형적으로 CDR에서 잔기 이외 가변 도메인 잔기 (중쇄에서 HCDR1 내지 3 및 경쇄에서 LCDR1 내지 3)를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 따라서, CDR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)내 하기 서열: FR1-HCDR1/LCDR1-FR2-HCDR2/LCDR2-FR3-HCDR3/LCDR3-FR4로 나타난다. FR 및 CDR의 경계는 당업계에서 알려진 방법론을 사용하여, 예를 들어, Kabat 정의, Chothia 정의, AbM 정의, 및/또는 접촉 정의에 의해 정확히 식별될 수 있고, 이들의 모두는 당업계에서 잘 알려진다. 예를 들면, 그들 전체가 참고로 본원에 편입된, Kabat, E. A., 등. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Chothia 등, (1989) Nature 342:877; Chothia, C. 등 (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani 등 (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; 및 Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004), 참고.
본원에 제공된 항-HER2 ASTR은, 실례적 구현예에서, "인간화된"다. 용어 "인간화된 항체" 또는 "인간화된 ASTR"은 전형적으로 인간 항체에서 발견된 서열에 대하여 스와핑된 FR을 가졌던 비-인간 항체 또는 ASTR, 각각을 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체에서, CDR을 제외한, 전체 항체는 인간 기원의 폴리뉴클레오타이드 또는 단리된 핵산에 의해 인코딩되거나 이의 CDR 내에서 제외하고 그와 같은 항체와 동일하다. 인간화된 ASTR에서, ASTR은 이의 CDR 내에서 제외하고 인간 항체의 상응하는 부문에 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 단리된 핵산에 의해 인코딩된다. 바람직하게는, 인간화된 항체 또는 ASTR은 이것이 유래된 비-인간화된 마우스 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 항원에 대한 친화성을 갖는다. 일부 또는 전부가 비-인간 생물에서 기원하는 핵산에 의해 인코딩되는, CDR은 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 프레임워크에 이식되어 항체를 창출하고, 이의 특이성은 생착된 CDR에 의해 결정된다. 실례적 구현예에서, 본원에 CAR은 HER2를 인식하는 인간화된 ASTR을 포함하고, 추가 실례적 구현예에서, CAB-CAR 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 ASTR에서 중쇄 가변 영역은, 본원에 개시된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 (예를 들면, 서열번호:131-133 및 137-141)의 임의의 것과 조합으로, 서열번호:119의 FR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR에서 경쇄 가변 영역은 본원에 개시된 LCDR1, LCDR2s, 및 LCDR3 (예를 들면, 서열번호:134-136 및 142-143)의 임의의 것과 조합으로, 서열번호:122의 FR을 포함할 수 있다. 그러한 중쇄 및 경쇄 조합은 서열번호:119 및 서열번호:122의 조합 이외이다 (즉 포함하지 않는다).
비-인간 항체를 변형, 인간화 및 재형상화하기 위한 다양한 기법 및 방법은 당업계에서 잘 알려진다 (Lu, RM., Hwang, YC., Liu, IJ. 등 "Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases", J Biomed Sci 27, 1 (2020)Lu 등 참고 (이 전체가 참고로 본원에 편입됨). 비인간 항체 가변 영역의 면역원성을 감소시키는 다른 방법 또는 인간화는 당업계에서 알려진 대로 재표면화 방법을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 모체 항체는, 당업계에서 알려진 대로, 친화성 성숙되었다. 구조-기반된 방법은 당업계에서 알려진 대로 인간화 및 친화성 성숙화를 위하여 이용될 수 있다. 선택 기반된 방법은 당업계에서 알려진 대로 항체 가변 영역을 인간화 및/또는 친화성 성숙시키는데 이용될 수 있다. 다른 인간화 방법은 당업계에서 알려진 대로 CDR의 부분들만의 이식을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 항-HER2 ASTR의 인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로: "최적선" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들면, Sims 등 J. Immunol., vol. 151, p. 2296, 1993, 참고); 본원에 예시적 구현예 섹션에서 개시된 돌연변이와 사용될 수 있는, 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열, 예를 들어, Carter 등에서 개시된 4D5-1, 4D5-2, 4D5-3, 4D5-4, 4D5-5, 4D5-6, 4D5-7, 또는 4D5-8에서 발견된 서열의 임의의 것에서 유래된 프레임워크 영역 (예를 들면, Carter 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, p. 4285, 1992; 및 Presta 등 J. Immunol., vol. 151, p. 2623, 1993, 참고); 인간 성숙한 (체세포적으로 성숙된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci., vol. 13, pp. 1619-1633, 2008, 참고); 및 스크리닝 FR 라이브러리에서 유래된 프레임워크 영역 (예를 들면, Baca 등, J. Biol. Chem., vol. 272, pp. 10678-10684, 1997 및 Rosok 등, J. Biol. Chem., vol. 271, pp. 22611-22618, 1996, 참고)을 포함한다. 모체 비-인간 항체의 VH 및 VL의 가변 영역은 당업계에서 알려진 방법에 따라 3차원 분자성 모델링 분석에 적용될 수 있다. 다음으로, 올바른 CDR 구조들의 형성에 중요한 것으로 예측된 프레임워크 아미노산 잔기는 동일한 분자성 모델링 분석을 사용하여 식별될 수 있다. 병행하여, 모체 비-인간 항체의 것들과 상동인 아미노산 서열을 갖는 인간 VH 및 VL 쇄는 검색 쿼리로서 모체 VH 및 VL 서열을 사용하여 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 식별된다. 인간 VH 및 VL 억셉터 유전자는 그 다음 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-HER2 ASTR은 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본원에 제공된 구현예들 중 임의의 것에서, ASTR은, 예시적 구현예에서 더욱 상세히 개시된 대로, 항-HER2 ASTR에 대하여 본원에 제공된 서열 변동들의 임의의 것을 가질 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 스크린은 HER2에 항-HER2 항체의 결합을 개선시킬 수 있는 다양한 잔기에 4D5-8 배경에서 잠재적 돌연변이를 식별하였다 (Gerstner 등, 2002, J Mol Biol 321(5):851-862). 일부 구현예에서, 본원에 제공된 CAR 구현예의 임의의 것은 상이한 파지 디스플레이 스크린 돌연변이를 포함할 수 있다. 더 많은 구현예는 본원에 예시적 구현예 섹션에서 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-HER2 ASTR은 서열번호:119의 전체 가변 영역 또는 프레임워크 영역 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:122의 전체 가변 영역 또는 프레임워크 영역 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 인간 FR 또는 공통 인간 FR에 이식된다. 공통 인간 FR을 창출하기 위해, 몇몇 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터 FR은 공통 아미노산 서열을 식별하도록 정렬된다. CDR 이식은 미국 특허 번호 7,022,500 (Queen)에서, 예를 들어, 기재되고 당업계에서 알려진다. ASTR을 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예의 임의의 것에서, 본원에 제공된 항-HER2 ASTR은, 인간화된 항체를 형성하기 위해 공통 인간 아미노산으로 대체된 프레임워크 영역에서 아미노산이 있는 다양한 항원에 관한 중쇄 가변 영역인, 서열번호:252-254의 프레임워크 영역 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은, 인간화된 항체를 형성하기 위해 마우스 아미노산 또는 공통 인간 아미노산으로 대체된 프레임워크 영역에서 아미노산이 있는 다양한 항원에 관한 경쇄 가변 영역인, 서열번호:255-257의 프레임워크 영역 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 (FR)은, 본원에 개시된 돌연변이 중 임의의 것과, 본원에 제공된 항-HER2 ASTR에서 사용될 수 있다. 서열번호:119의 FR은 잔기 1-25, 잔기 36-49, 잔기 67-98, 및 잔기 110-120을 포함한다. 서열번호:122의 FR은 잔기 1-23, 잔기 35-49, 잔기 57-88, 및 잔기 98-107을 포함한다. 숙련된 기술자는 중쇄 및 경쇄의 FR을 식별할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, ASTR의 중쇄 가변 영역은 서열번호:119의 FR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR의 경쇄 가변 영역은 서열번호:122에서 FR을 포함할 수 있다.
조건부 활성 항-HER2 ASTR (즉 HER2를 표적하는 ASTR)은 HER2를 표적하는 것으로 알려진 항체 및 항체의 단편으로부터 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, ASTR은 쥣과 단클론성 항체 mumAb4D5의 인간화된 버전으로부터 서열을 포함할 수 있고 (Carter 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289), 여기서 ASTR은 HER2를 결합시키는 능력을 보유하고, 예를 들어 6.7의 pH 대 7.4의 pH에서 더 많은 결합으로, 조건부 활성이다. 일부 실례적 구현예에서, ASTR의 중쇄 가변 영역은 서열번호:119를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR의 경쇄 가변 영역은 서열번호:122를 포함할 수 있다.
면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열이 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역에서 아미노산 변경 (예를 들면, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10개 아미노산 치환, 결실, 또는 부가)을 함유할 수 있음이 본원에 고려된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 ASTR이 제공된다. 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것에서, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링에 기반된 중쇄의 위치 119에 S에서 E 돌연변이를 포함할 수 있다. 실례적 구현예에서, ASTR은 서열번호:122에서 넘버링에 기반된 경쇄의 위치 32에 A에서 D 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 돌연변이는 항-HER2 항체에서 존재하는 때 CAB 활성을 보여주었다. 이 돌연변이는 FR에서이고 이 돌연변이를 함유하는 항체는 항체로서 사용된 때 CAB 활성을 보여준다 (결과 나타나지 않음). 이 FR 돌연변이는 본원에 개시된 중쇄 또는 경쇄의 CDR에서 다른 돌연변이 중 임의의 것과 조합될 수 있다.
"SUPERHUMANIZATION™"으로 불리는 접근법에서, 인간 CDR 서열은, 당업계에서 알려진 대로 인간화될 마우스 항체의 것들에 대한 인간 CDR의 구조적 유사성에 기반하여, 인간 생식계열 유전자로부터 선정된다. 프레임워크 서열은 공공 DNA 데이터베이스 또는 간행된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다.
면역원성을 감소시키는 다른 방법은 "재형상화", "초키메라화", 및 "베니어링/재표면화"를 포함한다. 본원에 제공된 일부 구현예에서, 베니어링/재표면화 접근법은, 인간 항체에서 동일한 위치에 더욱 빈번하게 발견된 아미노산 잔기에 의해 본원에 ASTR에서 사용된, 쥣과 항-HER2 항체 또는 이의 단편에서 표면 접근가능한 아미노산 잔기를 대체하는데 사용된다. 이들 인간화된 항체 중 임의의 것은 인간화된 ASTR을 제조하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-HER2 CAR의 ASTR은 단일 쇄 Fv (scFv)이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-HER2 CAR의 ASTR에서, 중쇄는 본원에 제공된 CAR의 ASTR에서 경쇄의 N-말단 위치된다. 다른 구현예에서, 경쇄는 본원에 제공된 CAR의 ASTR에서 중쇄의 N-말단 위치된다. 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 중쇄 및 경쇄는 본원에 더욱 상세히 논의된 대로 링커에 의해 분리될 수 있다. 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 중쇄 또는 경쇄는 CAR의 N-말단에 있을 수 있고 또 다른 도메인, 예컨대 신호 서열 또는 펩타이드의 전형적으로 C-말단이다.
다른 항체-기반된 인식 도메인 (cAb VHH (낙타과 항체 가변 도메인) 및 인간화된 버전, IgNAR VH (상어 항체 가변 도메인) 및 인간화된 버전, sdAb VH (단일 도메인 항체 가변 도메인) 및 "낙타화된" 항체 가변 도메인은 본 개시내용의 CAR을 사용하는 방법 및 CAR을 이용한 용도에 적합하다. 일부 경우에, T-세포 수용체 (TCR) 기반된 인식 도메인 예컨대 단일 쇄 TCR (scTv, 단일 쇄 2-도메인 TCR 함유 VαVβ)는 용도에 또한 적합하다.
CAR을 포함하는 본원에 임의의 양태 또는 구현예를 위한 특정 구현예는 내인성 TCR 신호전달 복합체 및 CD3Z 신호전달 경로를 선출하도록 조작된 세포외 도메인을 갖는 CAR을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 항원 수용체 ASTR은 내인성 TCR 복합체 쇄들 (예를 들면 TCR 알파, CD3E 등) 중 하나에 융합되어 TCR 복합체로의 편입 그리고 내인성 CD3Z 쇄를 통해서 신호전달을 촉진시킨다. 다른 구현예에서, CAR은 TCR 복합체에 결합하는 제1 scFv 또는 단백질 그리고 표적 항원 (예를 들면 종양 항원)에 결합하는 제2 scFv 또는 단백질을 함유한다. 또 다른 구현예에서, TCR은 단일 쇄 TCR (scTv, 단일 쇄 2-도메인 TCR 함유 VαVβ)일 수 있다. 마지막으로, scFv들은 특이적 MHC/펩타이드 복합체를 인식하도록 또한 생성되어, 이에 의해 대리 TCR로서 작용할 수 있다. 그러한 펩타이드/MHC scFv-결합제는 CAR들과 많은 유사한 구성에서 사용될 수 있다.
ASTR을 포함하는 본원에 제공된 양태들 중 임의의 것의 특정 구현예에서, ASTR은 예시적 스플릿-CAR 작제물에서 HER-2 발현 세포에 발현된 HER2와 ASTR을 연결하는 중간체 단백질에 관한 것일 수 있다. 중간체 폴리펩타이드 또는 단백질은 내인성으로 발현될 수 있거나 외인성으로 도입될 수 있고 자연적이거나, 조작되거나, 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서 ASTR은 적어도 하나의 태깅된 중간체, 전형적으로 항체-태그 컨쥬게이트가 ASTR에 의해 인식된 태그와 HER2-발현 표적 세포에서 발현된 표적 분자, 전형적으로 HER2 단백질 표적 사이 포함되도록 항-태그 ASTR일 수 있다. 따라서, 그러한 구현예에서, ASTR은 태그를 결합시키고 태그는 표적 세포, 예컨대 암 세포에서 HER2에 관한 본원에 제공된 CAB 항체에 컨쥬게이션된다. 다른 스플릿-CAR 작제물은 본원에 제공된다. 태그의 비-제한 예는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 비오틴, 히스티딘, 디니트로페놀, 페리디닌 클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광성 단백질, 피코에리트린 (PE), 양고추냉이 퍼옥시다제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 및 말토스 결합 단백질을 포함한다. 이와 같이, ASTR은 태그를 결합시키는 분자를 포함한다.
치환, 삽입, 및 결실 변이체
일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 중 임의의 것의 ASTR은 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심의 부위는 CDR 및 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 보존적 치환은 "보전적 치환"의 표제 하에 표 1에서 나타난다. 더 많은 변화는 "예시적 치환"의 표제 하에 표 1에서 제공되고, 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 아래 추가로 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 관심의 ASTR 그리고 원하는 활성, 예를 들면, 보유된/개선된 항원 결합, 조건부의 활성 및/또는 감소된 면역원성에 대하여 스크리닝된 산물에 도입될 수 있다.
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아미노산은 공통 측-쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다: (1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 한 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반한다.
치환적 변이체의 하나의 유형은 모체 항체 (예를 들면 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 CDR 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 선택된 생성된 변이체(들)은 모체 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들면, 증가된 친화성, 개선된 조건부의 활성 또는 선택성, 감소된 면역원성)에서 변형 (예를 들면, 개선)을 가질 것이고/거나 모체 항체의 실질적으로 보유된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 실례적 구현예에서, 생성된 변이체는 개선된 조건부의 활성을 가질 것이다.
변경 (예를 들면, 치환)은 CDR에서, 예를 들면, 항체 친화성을 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 그러한 변경은 CDR "핫스팟", 즉, 체세포 성숙화 과정 도중 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (예를 들면, Chowdhury, Methods Mol. Biol., vol. 207, pp. 179-196, 2008, 참고), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대하여 테스트된다. 이차 라이브러리로부터 작제화 및 재선택화에 의한 친화성 성숙화는, 예를 들면, Methods in Molecular Biology, vol. 178, pp. 1-37, 2001)에서 Hoogenboom 등에 의해 기재되었다. 친화성 성숙화의 일부 구현예에서, 다양성은 다양한 방법 (예를 들면, 오류-경향 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-관련 돌연변이유발) 중 임의의 것에 의해 성숙화를 위하여 선정된 가변 유전자에 도입된다. 이차 라이브러리는 그 다음 창출된다. 라이브러리는 그 다음 스크리닝되어 원하는 친화성을 가진 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 CDR-관련 접근법을 포함하고, 여기에서 몇몇 CDR 잔기 (예를 들면, 한번에 4-6개 잔기)는 랜덤화된다. 항원 결합에 관여된 CDR 잔기는, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 식별될 수 있다. CDR-HCDR3 및 CDR-LCDR3은 종종 표적화된다.
일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 그러한 변경이 HER2 항원에 결합하는 ASTR의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들면, 본원에 제공된 경우에 보존적 치환)은 CDR에서 이루어질 수 있다. 그러한 변경은 CDR "핫스팟" 는 SDR의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각 CDR 어느 한쪽은 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
본원에 기재된 ASTR의 아미노산 서열 변형(들)은 고려된다. 예를 들어, ASTR의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 인간화된 항체가 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에서 비-인간 동물에서 유래된 항체의 VH 및 VL에서 CDR만을 단순히 이식함으로써 생산되는 때, 항원 결합 활성이 비-인간 동물에서 유래된 본래 항체의 것과 비교하면 감소되는 것이 알려진다. CDR에서 뿐만 아니라 FR에서, 비-인간 항체의 VH 및 VL의 몇몇 아미노산 잔기가 항원 결합 활성과 직접적으로 또는 간접적으로 연관되는 것이 고려된다. 그리하여, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에서 유래된 상이한 아미노산 잔기로 이들 아미노산 잔기의 치환은 결합 활성을 감소시킬 것이다. 문제를 해결하기 위해, 인간 CDR로 이식된 항체에서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 항체에 결합과 직접적으로 연관되거나, CDR의 아미노산 잔기와 상호작용하거나, 항체의 3차원 구조를 유지하고 항원에 결합과 직접적으로 연관되는 아미노산 잔기를 식별하려는 시도가 이루어져야 한다. 감소된 항원 결합 활성은 식별된 아미노산을 비인간 동물에서 유래된 본래 항체의 아미노산 잔기로 대체함으로써 증가될 수 있다.
변형 및 변화는 본 발명의 항체의 구조에서, 그리고 이들을 인코딩하는 DNA 서열에서 이루어질 수 있고, 바람직한 특징을 갖는 ASTR로 CAR을 인코딩하는 기능적 분자는 여전히 수득될 수 있다.
아미노 서열에서 변화시키기 위해, 아미노산의 소수친수성 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하기에서 소수친수성 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 일반적으로 이해된다. 아미노산의 상대적 소수친수성 특성이 생성하는 단백질의 이차 구조에 기여하는 것이 인정되고, 이는 차례로 단백질의 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원, 및 기타 등등과의 상호작용을 정의한다. 각 아미노산은 이들이 있는 그들의 소수친수성 및 전하 특징에 근거하여 소수친수성 지수로 지정되었다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 항체 단편의 기능-보존적 변이체를 포괄한다.
2개 아미노산 서열은 아미노산의 80% 초과, 또는 85% 초과, 또는 바람직하게는 90% 초과, 또는 더욱 바람직하게는 95% 초과, 또는 98% 초과가 동일한 때 "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"이다. 일부 구현예에서, 아미노산의 적어도 90% 또는 95% 초과는 서열의 전체 길이에 걸쳐 유사 (기능적으로 동일)하다. 바람직하게는, 유사한 또는 상동 서열은, 예를 들어, GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wis.) 파일업 프로그램, 또는 서열 비교 알고리즘 예컨대 BLAST, FASTA, 등의 임의의 것을 사용하는 정렬에 의해 식별된다.
예를 들어, 특정 아미노산은 인식가능한 활성의 손실 예측 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다 (예를 들면 상기 표 1 참고). 단백질의 상호작용적 성능 및 성질이 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정의하므로, 특정 아미노산 치환은 단백질 서열에서, 그리고, 물론, 이의 DNA 인코딩 서열에서 이루어질 수 있는 한편, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 가진 단백질을 수득한다. 그래서 다양한 변화가, 그들의 생물학적 활성의 인식가능한 손실 없이, 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 서열, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 상응하는 DNA 서열에서 이루어질 수 있음이 고려된다.
특정 아미노산이 유사한 소수친수성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 가진 단백질을 초래, 즉 여전히 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 수득할 수 있음이 당업계에서 알려진다.
상기 개괄된 대로, 아미노산 치환은 아미노산 측-쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 그들의 소수친수성, 친수성, 전하, 크기, 및 기타 등등에 기반될 수 있다. 다양한 전술한 특징을 고려하는 예시적 대체물은 당업자에게 잘 알려지고 하기 쌍을 사용하는 대체물을 포함한다: 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 그리고 발린, 류신 및 이소류신.
글리코실화 변이체
일부 구현예에서, 본원에 제공된 ASTR은 ASTR이 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소하도록 변경된다. 항체, 및 ASTR의 상응하는 scFv에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 창출되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 성취될 수 있다.
스토크
일부 구현예에서, CAR은 세포 외부에 있는 CAR의 부문에 위치하고 ASTR과 막관통 도메인 사이 개재되는 스토크를 포함한다. 일부 구현예에서, 스토크는 야생형 CD8 알파 스토크 영역 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (서열번호:16) )에 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 야생형 CD28 스토크 영역 (FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호:3))에 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 야생형 면역글로불린 중쇄 스토크 영역에 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일성을 갖는다. CAR에서, 이용된 스토크는 항원-특이적 표적화 영역, 및 전형적으로 전체 CAR이, 표적 항원에 증가된 결합을 보유하도록 허용한다.
스토크 영역은 약 4개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 예를 들면, 약 4개 aa 내지 약 10개 aa, 약 10개 aa 내지 약 15개 aa, 약 15개 aa 내지 약 20개 aa, 약 20개 aa 내지 약 25개 aa, 약 25개 aa 내지 약 30개 aa, 약 30개 aa 내지 약 40개 aa, 또는 약 40개 aa 내지 약 50개 aa의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, CAR의 스토크는 적어도 하나의 시스테인을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스토크는 서열 Cys-Pro-Pro-Cys (서열번호:4)를 포함할 수 있다. 존재한다면, 제1 CAR의 스토크에서 시스테인은 제2 CAR에서 스토크와 디술피드 결합을 형성하는데 이용할 수 있다.
스토크는 당업계에서 알려지는 면역글로불린 힌지 영역 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 예를 들면, Tan 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:162; 및 Huck 등 (1986) Nucl. Acids Res. 14:1779를 참고한다. 비-제한 예로서, 면역글로불린 힌지 영역은 하기 아미노산 서열: CPPC (서열번호:4); DKTHT (서열번호:5); CPEPKSCDTPPPCPR (서열번호:6) (예를 들면, Glaser 등 (2005) J. Biol. Chem. 280:41494, 참고); ELKTPLGDTTHT (서열번호:7); KSCDKTHTCP (서열번호:8); KCCVDCP (서열번호:9); KYGPPCP (서열번호:10); EPKSCDKTHTCPPCP (서열번호:11) (인간 IgGl 힌지); ERKCCVECPPCP (서열번호:12) (인간 IgG2 힌지); ELKTPLGDTTHTCPRCP (서열번호:13) (인간 IgG3 힌지); SPNMVPHAHHAQ (서열번호:14) (인간 IgG4 힌지); 및 기타 등등 중 임의의 것의 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 스토크는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 힌지 영역의 아미노산 서열을 가진 힌지 영역을 포함할 수 있다. 스토크는 야생형 (자연-발생) 힌지 영역에 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG 1 힌지의 His229는 Tyr로 치환될 수 있어서, 스토크는 서열 EPKSCDKTYTCPPCP (서열번호:15)를 포함한다, (예를 들면, Yan 등 (2012) J. Biol. Chem. 287:5891, 참고).
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 추가의 세포외 폴리펩타이드 도메인을 포함한다. 그러한 추가의 세포외 폴리펩타이드 도메인은, 비제한적으로, 친화성 도메인, 존재 또는 활성이, 예를 들어 항체 검정에 의해 또는 검출가능한 신호를 생산하는 폴리펩타이드이기 때문에 검출될 수 있는 폴리펩타이드 (검출가능한 마커)인, 그리고 인식 또는 제거 도메인을 포함하고, 각각은 본원에 다른 섹션에서 더욱 상세히 기재된다. 일부 구현예에서, 그러한 추가의 세포외 폴리펩타이드 도메인은 스토크에 N-말단이다. 일부 구현예에서, 그러한 추가의 세포외 폴리펩타이드 도메인은 스토크에 C-말단이다. 일부 구현예에서, 추가의 세포외 폴리펩타이드는 스토크에 직접적으로 융합된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 추가의 세포외 폴리펩타이드를 스토크에 연결시킨다.
막관통 도메인
본 개시내용의 CAR은 진핵 세포 막에 삽입을 위하여 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 ASTR과 공-자극 도메인 사이 개재될 수 있다. 막관통 도메인은 스토크와 공-자극 도메인 사이 개재되어서, 키메라 항원 수용체가, 아미노 말단 (N-말단)부터 카르복실 말단 (C-말단)까지 순서대로: ASTR; 스토크; 막관통 도메인; 및 활성화 도메인을 포함할 수 있다.
진핵 (예를 들면, 포유류) 세포의 세포 막에 폴리펩타이드의 삽입을 제공하는 임의의 막관통 (TM) 도메인은 본원에 개시된 양태 및 구현예에서 용도에 적합하다.
본원에 제공된 특정 구현예에서, CAR을 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태를 위한 TM 도메인은 CD8 알파 TM 도메인, CD8 베타 TM 도메인, CD4 TM 도메인, C3Z TM 도메인, C134 TM 도메인, CD7 TM 도메인, CD8 TM 도메인, CD28 TM 도메인, T-세포 수용체 TM 도메인의 알파 쇄, T-세포 수용체 CD3 TM 도메인의 베타 쇄, T-세포 수용체 TM 도메인의 제타 쇄, CD3 엡실론 TM 도메인, CD45 TM 도메인, CD5 TM 도메인, CD9 TM 도메인, CD16 TM 도메인, CD22 TM 도메인, CD33 TM 도메인, CD37 TM 도메인, CD64 TM 도메인, CD80 TM 도메인, CD86 TM 도메인, CD137 TM 도메인, CD154 TM 도메인, KIRDS2 TM 도메인, CD2 TM 도메인, CD27 TM 도메인, LFA-1 (CD11a, CD18) TM 도메인, ICOS (CD278) TM 도메인, GITR TM 도메인, CD40 TM 도메인, BAFFR TM 도메인, HVEM (LIGHTR) TM 도메인, SLAMF7 TM 도메인, NKp80 (KLRF1) TM 도메인, CD160 TM 도메인, CD19 TM 도메인, IL2R 베타 TM 도메인, IL2R 감마 TM 도메인, IL7Rα TM 도메인, VLA1 TM 도메인, CD49a TM 도메인, ITGA1 TM 도메인, ITGA4 TM 도메인, ITGA6 TM 도메인, ITGAD TM 도메인, ITGAE TM 도메인, ITGAL TM 도메인, ITGAM TM 도메인, ITGAX TM 도메인, ITGB2 TM 도메인, ITGB7 TM 도메인, IA4 TM 도메인, CD49D TM 도메인, VLA-6 TM 도메인, CD49f TM 도메인, CD11d TM 도메인, CD103 TM 도메인, CD11a TM 도메인, CD11b TM 도메인, CD11c TM 도메인, ITGB1, CD29 TM 도메인, CD18 TM 도메인, TNFR2 TM 도메인, DNAM1 (CD226) TM 도메인, SLAMF4 (CD244, 2B4) TM 도메인, CD84 TM 도메인, CD96 (Tactile) TM 도메인, TM 도메인 CEACAM1 TM 도메인, CRTAM TM 도메인, Ly9 (CD229) TM 도메인, CD160 (BY55) TM 도메인, PSGL1 TM 도메인, CD100 (SEMA4D) TM 도메인, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) TM 도메인, SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) TM 도메인, BLAME (SLAMF8) TM 도메인, SELPLG (CD162) TM 도메인, LTBR TM 도메인, 또는 PAG/Cbp TM 도메인이다. 본원에 제공된 CAR의 실례적 구현예는 CD8 알파 TM 도메인 또는 CD28 TM 도메인을 포함한다. 본원에 제공된 양태 또는 구현예 중 임의의 것에 적합한 TM 도메인의 비-제한 예는 하기 TM 도메인 또는 조합된 스토크 및 TM 도메인: a) CD8 알파 TM (서열번호:17); b) CD8 베타 TM (서열번호:18); c) CD4 TM (서열번호:19); d) CD3Z TM (서열번호:20); e) CD28 TM (서열번호:21); f) CD134 (OX40) TM: (서열번호:22); g) CD7 TM (서열번호:23); h) CD8 스토크 및 TM (서열번호:24); 및 i) CD28 스토크 및 TM (서열번호:25) 중 임의의 것의 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함한다.
비-제한 예로서, 본 발명의 양태의 막관통 도메인은 적어도 80%, 90%, 또는 95%를 가질 수 있거나 서열번호:17 막관통 도메인에 100% 서열 동일성을 가질 수 있거나, 하기 유전자 각각으로부터 막관통 도메인: CD8 알파 막관통 도메인, CD8 베타 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, CD3 제타 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD134 막관통 도메인, 또는 CD7 막관통 도메인 중 임의의 것에 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
세포내 활성화 도메인
활성화된 때 본 개시내용의 CAR에서 사용에 적합한 세포내 활성화 도메인은 전형적으로 하나 이상의 사이토카인의 생산을 유도하고/거나; 세포사를 증가시키고/거나; CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, NKT 세포, γδT 세포, 및/또는 호중구의 증식을 증가시킨다. 활성화 도메인은 본원에 활성화 도메인으로서 또한 지칭될 수 있다. 활성화 도메인은 본원에 제공된 CAR에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 하기 기재된 대로 적어도 하나의 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6개, 등) ITAM 모티프를 포함한다. CAR에서 사용을 위한 세포내 활성화 도메인은, T 세포 신호전달 단백질 예컨대 CD3, B7 패밀리 공-자극, 및 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 수퍼패밀리 수용체를 포함하는 면역 신호전달 수용체의 몇몇 유형의 세포내 신호전달 도메인; NK 및 NKT 세포에 의해 사용된 신호전달 도메인 예컨대 NKp30 (B7-H6), DAP12, NKG2D, NKp44, NKp46, DAP10, 및 CD3z; 및 면역수용체 티로신 기반된 활성화 모티프 (ITAM)를 함유하는 인간 면역글로불린 수용체의 신호전달 도메인 예컨대 FcR 감마 (FCER1G), FcR 베타 (FCER1B), Fc감마RI, Fc감마RIIA, Fc감마RIIC, Fc감마RIIIA, 및 FcRL5를 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 양태의 임의의 것을 위한 CAR의 특정 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 NKp30 (B7-H6), DAP12, NKG2D, NKp44, NKp46, DAP10, CD3z, Fc감마RI, Fc감마RIIA, Fc감마RIIC, Fc감마RIIIA, 또는 FcRL5로부터 신호전달 도메인이다. 이들은 본원에 NKp30 (B7-H6) 활성화 도메인, DAP12 활성화 도메인, NKG2D 활성화 도메인, NKp44 활성화 도메인, NKp46 활성화 도메인, DAP10 활성화 도메인, CD3z 활성화 도메인, Fc감마RI 활성화 도메인, Fc감마RIIA 활성화 도메인, Fc감마RIIC 활성화 도메인, Fc감마RIIIA 활성화 도메인, 또는 FcRL5 활성화 도메인, 각각으로서 지칭된다. 일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 DAP10/CD28 유형 신호전달 쇄를 포함한다. 비-제한 예로서, CAR을 포함하는 본 발명의 임의의 양태의 세포내 활성화 도메인은 CD3Z 활성화 도메인, CD3D 활성화 도메인, CD3E 활성화 도메인, CD3G 활성화 도메인, CD79A 활성화 도메인, DAP12 활성화 도메인, FCERlG 활성화 도메인, DAP10/CD28 활성화 도메인, 또는 ZAP70 활성화 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 양태의 세포내 활성화 도메인은 하기 기재된 대로 CD3Z, CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, DAP12, FCERlG, FCGR2A, FCGR2C, DAP10/CD28, 또는 ZAP70 도메인에 적어도 80%, 90%, 또는 95%를 가질 수 있거나 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 개시내용의 CAR에서 사용에 적합한 세포내 활성화 도메인은 면역수용체 티로신-기반된 활성화 모티프 (ITAM)-함유 세포내 신호전달 폴리펩타이드를 포함한다. ITAM 모티프는 YX1X2L/I이고, 식중 X1 및 X2는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 활성화 도메인은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM 모티프는 세포내 활성화 도메인에서 2회 반복되고, 여기에서 ITAM 모티프의 제1 및 제2 사례는 서로로부터 6 내지 8개 아미노산, 예를 들면, (YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I)만큼 분리되고, 식중 n은 6 내지 8의 정수이고, 6-8개 X3의 각각은 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 활성화 도메인은 3개 ITAM 모티프를 포함한다.
적합한 세포내 활성화 도메인은 ITAM 모티프를 함유하는 폴리펩타이드에서 유래되는 ITAM 모티프-함유 부문일 수 있다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 임의의 ITAM 모티프-함유 단백질로부터 ITAM 모티프-함유 도메인일 수 있다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 그것이 유래되는 전체 단백질의 전체 서열을 함유할 필요가 없다. 적합한 ITAM 모티프-함유 폴리펩타이드의 예는 비제한적으로: CD3Z (CD3 제타); CD3D (CD3 델타); CD3E (CD3 엡실론); CD3G (CD3 감마); CD79A (항원 수용체 복합체-연관된 단백질 알파 쇄); CD79B (항원 수용체 복합체-연관된 단백질 베타 쇄) DAP12; 및 FCERlG (Fc 엡실론 수용체 I 감마 쇄)를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 (CD3Z, T 세포 수용체 T3 제타 쇄, CD247, CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ, 등으로서 또한 알려진) T 세포 표면 당단백질 CD3 제타 쇄에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 하기 아미노산 서열 (2 아이소폼) 중 어느 한쪽의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 160개 aa의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다:
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (서열번호:26) 또는
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (서열번호:27), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD3 제타 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부문을 포함할 수 있다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 하기 아미노산 서열의 어느 한쪽의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 160개 aa의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (서열번호:28);
RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (서열번호:29);
NQL[YNELNLGRREEYDVL]DKR 서열번호:30);
EGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMK (서열번호:31); 또는
DGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQ (서열번호:32), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 (CD3D; CD3-DELTA; T3D; CD3 항원, 델타 서브유닛; CD3 델타; CD3d 항원, 델타 폴리펩타이드 (TiT3 복합체); OKT3, 델타 쇄; T 세포 수용체 T3 델타 쇄; T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 쇄; 등으로서 또한 알려진) T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 쇄에서 유래된다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 하기 아미노산 서열의 어느 한쪽의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 160개 aa의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다:
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK (서열번호:33) 또는
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK (서열번호:34), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD3 델타 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부문을 포함할 수 있다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다: DQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGN (서열번호:35), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 (CD3e, T 세포 표면 항원 T3/Leu-4 엡실론 쇄, T 세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 쇄, AI504783, CD3, CD3엡실론, T3e, 등으로서 또한 알려진) T 세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 쇄에서 유래된다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 하기 아미노산 서열의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 160개 aa의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다:
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQRRI (서열번호:36), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD3 엡실론 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부문을 포함할 수 있다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다: NPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQR (서열번호:37), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 (CD3G, T 세포 수용체 T3 감마 쇄, CD3-GAMMA, T3G, 감마 폴리펩타이드 (TiT3 복합체), 등으로서 또한 알려진) T 세포 표면 당단백질 CD3 감마 쇄에서 유래된다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 하기 아미노산 서열의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 160개 aa의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다:
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGNQLRRN (서열번호:38), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD3 감마 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부문을 포함할 수 있다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다: DQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGN (서열번호:39), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 (B-세포 항원 수용체 복합체-연관된 단백질 알파 쇄; CD79a 항원 (면역글로불린-연관된 알파); MB-1 막 당단백질; Ig-알파; 막-결합된 면역글로불린-연관된 단백질; 표면 IgM-연관된 단백질; 등으로서 또한 알려진) CD79A에서 유래된다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 하기 아미노산 서열의 어느 한쪽의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 160개 aa의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다:
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (서열번호:40) 또는
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (서열번호:41), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD79A 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부문을 포함할 수 있다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다: ENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRG (서열번호:42), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 (TYROBP; TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질; KARAP; PLOSL; DNAX-활성화 단백질 12; KAR-연관된 단백질; TYRO 단백질 티로신 키나제-결합 단백질; 살해 활성화 수용체 연관된 단백질; 살해-활성화 수용체-연관된 단백질; 등으로서 또한 알려진) DAP12에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 하기 아미노산 서열 (4개 아이소폼)의 어느 한쪽의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 160개 aa의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다:
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (서열번호:43),
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ (서열번호:44),
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (서열번호:45), 또는
MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (서열번호:46), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 DAP12 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부문을 포함할 수 있다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다: ESP[YQELQGQRSDVYSDL ] NTQ (서열번호:47), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 (FCRG; Fc 엡실론 수용체 I 감마 쇄; Fc 수용체 감마-쇄; fc-엡실론 RI-감마; fcR감마; fceRI 감마; 고 친화성 면역글로불린 엡실론 수용체 서브유닛 감마; 면역글로불린 E 수용체, 고 친화성, 감마 쇄; 등으로서 또한 알려진) FCERlG에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 하기 아미노산 서열의 약 50개 아미노산 내지 약 60개 아미노산 (aa), 약 60개 aa 내지 약 70개 aa, 약 70개 aa 내지 약 80개 aa, 또는 약 80개 aa 내지 약 88개 aa의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다: MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV[YTGLSTRNQETYETL]KHEKPPQ (서열번호:48), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 FCER1G 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부문을 포함할 수 있다. 그래서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다: DGV[YTGLSTRNQETYETL ] KHE (서열번호:49), 여기에서 ITAM 모티프는 각괄호로 제시됨.
본 개시내용의 CAR에서 사용에 적합한 세포내 활성화 도메인은 DAP10/CD28 유형 신호전달 쇄를 포함한다. DAP10 신호전달 쇄의 예는 아미노산 서열번호:50이다. 일부 구현예에서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 서열번호:50에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함한다.
CD28 신호전달 쇄의 예는 아미노산 서열이다 서열번호:51이다. 일부 구현예에서, 적합한 세포내 도메인은 서열번호:51의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 CAR에서 사용에 적합한 세포내 활성화 도메인은 ZAP70 폴리펩타이드를 포함한다, 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 스트레치에 또는 서열번호:52의 약 300개 아미노산 내지 약 400개 아미노산, 약 400개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 또는 약 500개 아미노산 내지 619개 아미노산의 연속 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다.
스플릿 CAR
실례적 구현예에서, CAR은 ASTR (즉 리간드-결합 도메인), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 단일 전장 융합 폴리펩타이드로서 발현된다. 다른 구현예에서, ASTR, 막관통, 및 활성화 도메인은 스플릿-CAR 설계에서 비-공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, CAR은 비-공유적으로 회합하는 2개 폴리펩타이드로서 발현된다. 일부 구현예에서, CAR은 비-공유적으로 회합하는 3개 이상 폴리펩타이드로서 발현된다.
일부 스플릿-CAR 구현예에서, HER2를 인식하는 ASTR은 막관통 도메인에 공유적으로 결합되지 않는다. 일부 구현예에서 HER2를 인식하는 ASTR은 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드의 세포외 도메인에서 동족 상호작용 도메인과 회합할 수 있는 폴리펩타이드 상호작용 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 이들 융합 폴리펩타이드 사이 상호작용은 직접적이다. 일부 구현예에서, 상호작용은 류신 지퍼 모티프에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 이들 2개 폴리펩타이드의 상호작용은 제3 폴리펩타이드 또는 작은 분자에 의해 매개된다.
일부 스플릿-CAR 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 ASTR 및 막관통 도메인을 포함하고 제2 폴리펩타이드는 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 공유적으로 부착된 세포내 활성화 도메인이 부족한 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 막-연관된다. 일부 구현예에서 제2 폴리펩타이드는 세포질에서 확산된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 그들의 막관통 도메인을 통해 비-공유적으로 회합한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 세포질에서 확산되고 제1 폴리펩타이드의 세포내 도메인과 회합한다.
조절 도메인
조절 도메인은, 활성화 도메인의 다운스트림 효과를 향상 또는 약화시킴 또는 반응의 성질을 변화시킴을 포함하는, CAR에서 세포내 활성화 도메인의 효과를 변화시킬 수 있다. 1, 2, 3, 4개, 또는 그 이상의 상이한 조절 도메인, 또는 동일한 조절 도메인의 1, 2, 3, 4개 이상의 카피가 본원에 제공된 CAR에 포함될 수 있다. 본 개시내용의 CAR에서 사용에 적합한 조절 도메인은 공-자극 도메인을 포함하고, 이는 본원에 제공된 특정 예시적 CAR 구현예에 포함되는 임의적 CAR 도메인이다. CAR에서 포함에 적합한 조절 도메인은 약 30개 아미노산 내지 약 70개 아미노산 (aa)의 길이를 가질 수 있고, 예를 들면, 조절 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 약 45개 aa 내지 약 50개 aa, 약 50개 aa 내지 약 55개 aa, 약 55개 aa 내지 약 60개 aa, 약 60개 aa 내지 약 65개 aa, 또는 약 65개 aa 내지 약 70개 aa의 길이를 가질 수 있다. 다른 경우에, 조절 도메인은 약 70개 aa 내지 약 100개 aa, 약 100개 aa 내지 약 200개 aa, 또는 200개 aa 초과의 길이를 가질 수 있다.
공-자극 도메인은 전형적으로 활성화 도메인에 대한 반응의 성격을 향상 및/또는 변화시킨다.　본 개시내용의 CAR에서 사용에 적합한 공-자극 도메인은 일반적으로 수용체에서 유래된 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 호모이량체화한다. 대상체 공-자극 도메인은 막관통 단백질의 세포내 부문일 수 있다 (즉, 공-자극 도메인은 막관통 단백질에서 유래될 수 있다). 일부 구현예에서, 본원에 제공된 CAR 중 임의의 것은 공자극 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인 또는 4-1BB (CD137), B7-HCDR3, CD2, CD7, CD27, CD28, Lck 결합 (IC△)이 결실된 CD28, CD30, CD40, ICOS, OX40, BTLA, GITR, HVEM, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, BAFFR, SLAMf7, NKP80 (KLRF1), CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Rα, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, IA4, VLA1, VLA-6, C49f, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD18, CD19, CD29, CD49a, CD49D, CD69, CD84, CD96 (Tactile), CD103, CD160 (BY55), CRLF2, CSF2RB, CSF2RA, CSF3R, EPOR, LFA-1, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), FCGRA2, GHR, SLAMF4 (C244, 2B4), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PD-1, PSGL1, C100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, PAG/Cbp, SLP-76, TILR2, TILR4, TILR7, TILR9, Fc 수용체 감마 쇄, Fc 수용체 ε 쇄, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR1, IFNGR2, IFNLR1, IL1R1, IL1RAP, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL6ST, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL18R1, IL18RAP, IL20RA, IL20RB, IL21R, IL22RA1, IL23R, IL27RA, IL31RA, LEPR, LIFR, LMP1, MPL, MYD88, OSMR, 또는 PRLR, 또는 이의 기능적 돌연변이체 및/또는 단편의 공자극 도메인을 포함할 수 있다.
CAR에서 포함에 적합한 공-자극 도메인은 약 30개 아미노산 내지 약 70개 아미노산 (aa)의 길이를 가질 수 있고, 예를 들면, 공-자극 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 약 45개 aa 내지 약 50개 aa, 약 50개 aa 내지 약 55개 aa, 약 55개 aa 내지 약 60개 aa, 약 60개 aa 내지 약 65개 aa, 또는 약 65개 aa 내지 약 70개 aa의 길이를 가질 수 있다. 다른 경우에, 공-자극 도메인은 약 70개 aa 내지 약 100개 aa, 약 100개 aa 내지 약 200개 aa, 또는 200개 aa 초과의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (TNFRSF9; CD137; 4-1BB; CDwLCDR37; ILA; 등으로서 또한 알려진) 막관통 단백질 CD137의 세포내 부문에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:53에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 공-자극 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 약 45개 aa 내지 약 50개 aa, 약 50개 aa 내지 약 55개 aa, 약 55개 aa 내지 약 60개 aa, 약 60개 aa 내지 약 65개 aa, 또는 약 65개 aa 내지 약 70개 aa의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (Tp44로서 또한 알려진) 막관통 단백질 CD28의 세포내 부문에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:54에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 공-자극 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 약 45개 aa 내지 약 50개 aa, 약 50개 aa 내지 약 55개 aa, 약 55개 aa 내지 약 60개 aa, 약 60개 aa 내지 약 65개 aa, 또는 약 65개 aa 내지 약 70개 aa의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 Lck 결합 (IC△)이 결실된 막관통 단백질 CD28의 세포내 부문에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:55에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 공-자극 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 약 45개 aa 내지 약 50개 aa, 약 50개 aa 내지 약 55개 aa, 약 55개 aa 내지 약 60개 aa, 약 60개 aa 내지 약 65개 aa, 또는 약 65개 aa 내지 약 70개 aa의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (AILIM, CD278, 및 CVIDl로서 또한 알려진) 막관통 단백질 ICOS의 세포내 부문에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:56에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 공-자극 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 약 45개 aa 내지 약 50개 aa, 약 50개 aa 내지 약 55개 aa, 약 55개 aa 내지 약 60개 aa, 약 60개 aa 내지 약 65개 aa, 또는 약 65개 aa 내지 약 70개 aa의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (TNFRSF4, RP5-902P8.3, ACT35, CD134, OX-40, TXGPlL로서 또한 알려진) 막관통 단백질 OX40의 세포내 부문에서 유래된다. OX40은, 각각 서열번호:84의 잔기 34-57에 p85 PI3K 결합 모티프 및 잔기 76-102에 TRAF 결합 모티프를 함유한다. 일부 구현예에서, 공자극 도메인은 OX40의 p85 PI3K 결합 모티프를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공자극 도메인은 OX40의 TRAF 결합 모티프를 포함할 수 있다. 서열번호:84의 아미노산 17 및 41에 상응하는 리신은 유비퀴틴 표적화 모티프의 부분으로서 기능하는 잠재적으로 음성 조절 부위이다. 일부 구현예에서, OX40의 공자극 도메인에서 이들 리신의 한쪽 또는 양쪽은 돌연변이된 아르기닌 또는 또 다른 아미노산이다. 일부 구현예에서, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:57에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 공-자극 도메인은 약 20개 aa 내지 약 25개 aa, 약 25개 aa 내지 약 30개 aa, 30개 aa 내지 약 35ㅍ aa, 약 35ㅍ aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 또는 약 45개 aa 내지 약 50개 aa의 길이를 갖는다. 실례적 구현예에서, 공-자극 도메인은 약 20개 aa 내지 약 50개 aa, 예를 들어 20개 aa 내지 45개 aa, 또는 20개 aa 내지 42개 aa의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (S 152, T 14, TNFRSF7, 및 Tp55로서 또한 알려진) 막관통 단백질 CD27의 세포내 부문에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:58에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 공-자극 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40ㅍ aa 내지 약 45ㅍ aa, 또는 약 45개 aa 내지 약 50개 aa의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (BTLAl 및 CD272로서 또한 알려진) 막관통 단백질 BTLA의 세포내 부문에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:59에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (TNFRSF8, DlS166E, 및 Ki-1로서 또한 알려진) 막관통 단백질 CD30의 세포내 부문에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:60의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 약 150개 aa 내지 약 160개 aa, 또는 약 160개 aa 내지 약 185개 aa의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (TNFRSF18, RP5-902P8.2, AITR, CD357, 및 GITR-D로서 또한 알려진) 막관통 단백질 GITR의 세포내 부문에서 유래된다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:61에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 공-자극 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 약 45개 aa 내지 약 50개 aa, 약 50개 aa 내지 약 55개 aa, 약 55개 aa 내지 약 60개 aa, 약 60개 aa 내지 약 65개 aa, 또는 약 65개 aa 내지 약 70개 aa의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 (TNFRSF14, RP3-395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR, 및 TR2로서 또한 알려진) 막관통 단백질 HVEM의 세포내 부문에서 유래하였다. 예를 들어, 적합한 공-자극 도메인은 서열번호:62에서 아미노산의 적어도 10, 15, 20, 또는 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예의 일부에서, 양쪽 제1 및 제2 폴리펩타이드의 공-자극 도메인은 약 30개 aa 내지 약 35개 aa, 약 35개 aa 내지 약 40개 aa, 약 40개 aa 내지 약 45개 aa, 약 45개 aa 내지 약 50개 aa, 약 50개 aa 내지 약 55개 aa, 약 55개 aa 내지 약 60개 aa, 약 60개 aa 내지 약 65개 aa, 또는 약 65개 aa 내지 약 70개 aa의 길이를 갖는다.
링커
일부 구현예에서, CAR은 임의의 2개 인접한 도메인 사이 링커를 포함한다. 예를 들어, 링커는 막관통 도메인과 제1 공-자극 도메인 사이일 수 있다. 또 다른 예로서, ASTR은 항체일 수 있고 링커는 중쇄와 경쇄 사이일 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 ASTR과 막관통 도메인 및 공-자극 도메인 사이일 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 공-자극 도메인과 제2 폴리펩타이드의 세포내 활성화 도메인 사이일 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 ASTR과 세포내 신호전달 도메인 사이일 수 있다.
링커 펩타이드는 다양한 아미노산 서열의 임의의 것을 가질 수 있다. 다른 화학적 연결기가 제외되지 않아도, 단백질은 일반적으로 가요성 성질의 스페이서 펩타이드에 의해 결합될 수 있다. 링커는 길이로 약 1개 내지 약 100개 아미노산, 또는 길이로 약 1개 내지 약 25개 아미노산의 펩타이드일 수 있다. 이들 링커는 합성, 링커-인코딩 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 생산되어 단백질을 커플링시킬 수 있다. 어느 정도의 가요성을 가진 펩타이드 링커는 사용될 수 있다. 연결 펩타이드는, 적합한 링커가 일반적으로 가요성 펩타이드를 초래하는 서열을 가질 것임을 염두에 두고, 사실상 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 작은 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌의 사용은 가요성 펩타이드 창출하기에 유용하다. 그러한 서열의 창출은 당업자에 일상적이다.
적당한 링커는 용이하게 선택될 수 있고 상이한 길이, 예컨대 4개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 9개 아미노산, 6개 아미노산 내지 8개 아미노산, 또는 7개 아미노산 내지 8개 아미노산을 포함하는, 1개 아미노산 (예를 들면, Gly) 내지 50개 아미노산, 2개 내지 35개 아미노산, 5개 내지 30개 아미노산, 15개 내지 30개 아미노산, 2개 아미노산 내지 15개 아미노산, 3개 아미노산 내지 12개 아미노산의 적합한 임의의 것일 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 아미노산일 수 있다.
예시적 가요성 링커는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체 (예를 들어, n이 적어도 1의 정수인 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, 및 (GGGGS)n 포함), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에서 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 이들 아미노산의 양쪽이 상대적으로 구조화되지 않고, 그러므로 구성요소들 사이 중성 테더의 역할을 할 수 있기 때문에 관심이다. 글리신 중합체는 글리신이 심지어 알라닌보다 상당히 더 많은 파이-프시 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 가진 잔기보다 훨씬 덜 국한되기 때문에 특히 관심이다 (Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992), 참고). 예시적 가요성 링커는, 비제한적으로 GSTSGSGKPGSGEGS (서열번호:1), RTGSTSGSGKPGSGEGS (서열번호:249), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호:144), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호:63), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호:64), GGGGSGGGSGGGGS (서열번호:65), GGSG (서열번호:66), GGSGG (서열번호:67), GSGSG (서열번호:68), GSGGG (서열번호:69), GGGSG (서열번호:70), GSSSG (서열번호:71), GS, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호:152), 및 기타 등등을 포함한다. 특정 실례적 구현예에서, ASTR의 중쇄 가변 영역과 경 항체 쇄 가변 영역 사이 링커는 5개 내지 50개, 5개 내지 30개, 5개 내지 20개, 10개 내지 20개, 10개 내지 30개, 15개 내지 30개, 또는 5개 내지 15개 아미노산이고 GGGS의 반복부를 포함한다. 보통 숙련된 기술자는 상기 기재된 임의의 요소에 컨쥬게이션된 펩타이드의 설계가 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있어서, 링커가 가요성 링커 뿐만 아니라 더 적은 가요성 구조를 부여하는 하나 이상의 부문을 포함할 수 있음을 인지할 것이다.
핵산
핵산은 본원에 다양한 방법에서 사용을 위하여 개시된다. 더욱이, 본원에 개시된 CAR 중 임의의 것을 인코딩하는 단리된 핵산은 본원에 제공된 별도 양태 및 구현예이다. 예를 들어, 일 양태에서 HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로,
a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인
을 포함하는 CAR를 인코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되고, 여기서 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 자리잡고, 여기서 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서 HCDR1 서열은 GFNIKDTYIH (서열번호:131)이고; HCDR2 서열은 X1IYPTNGYTX2YADSVKG (서열번호:137)이고; HCDR3 서열은 WGGDGFYAMDY (서열번호:133)이고; ASTR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 LCDR1 서열은 RASQDVNTX3VA (서열번호:142)이고; LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고; LCDR3 서열은 QQX4YTTPPT (서열번호:143)이고, 식중 X1은 R 또는 K이고, X2는 R 또는 E이고, X3은 A 또는 D이고, X4는 H, D 또는 E이다.
본원에 제공된 CAR 중 임의의 것을 인코딩하는 수많은 다른 핵산 양태 및 구현예가 고려된다. 추가 비-제한 예는, 예를 들어, 본원에 예시적 구현예 섹션에서 제공된다. 숙련된 기술자는 유전자 코드를 사용하여 본원에 제공된 임의의 CAR 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이 설계될 수 있음을 이해한다.
본원에 개시된 구현예 중 임의의 것에서, 비제한적으로 그러한 CAR의 ASTR을 포함하는, CAR을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화 그리고 스플라이스 공여자 및 수용자 부위의 제거를 포함하는 핵산 서열에 변형을 통해서 인간 세포에서 발현에 최적화될 수 있다. 본원에 실례적 구현예에서, 벤치마크 항체 중쇄 가변 영역 (서열번호:119)은 HCDR1이 뉴클레오타이드 76 내지 105에 의해 인코딩되고, HCDR2가 뉴클레오타이드 148 내지 198에 의해 인코딩되고, HCDR3이 뉴클레오타이드 295 내지 327에 의해 인코딩되는 핵산 서열 서열번호:145에 의해 인코딩된다. 본원에 실례적 구현예에서, 항체 중쇄 가변 영역은 돌연변이체 R050K (서열번호:124)이고 핵산 서열 서열번호:146에 의해 인코딩된다. 본원에 실례적 구현예에서, 항체 중쇄 가변 영역은 돌연변이체 R059E (서열번호:123)이고 핵산 서열 서열번호:147에 의해 인코딩된다. 본원에 실례적 구현예에서, 항체 중쇄 가변 영역은 돌연변이체 R050K/R059E (서열번호:125)를 갖는다. 본원에 실례적 구현예에서, 벤치마크 항체 경쇄 가변 영역 (서열번호:122)은 LCDR1이 뉴클레오타이드 70 내지 102에 의해 인코딩되고, LCDR2가 뉴클레오타이드 148 내지 168에 의해 인코딩되고, LCDR3이 뉴클레오타이드 265 내지 291에 의해 인코딩되는 핵산 서열 서열번호:148에 의해 인코딩된다. 본원에 실례적 구현예에서, 항체 경쇄 가변 영역은 돌연변이체 A032D (서열번호:128)이고 핵산 서열 서열번호:149에 의해 인코딩된다. 본원에 실례적 구현예에서, 항체 경쇄 가변 영역은 돌연변이체 H091D (서열번호:127)이고 핵산 서열 서열번호:150에 의해 인코딩된다. 본원에 실례적 구현예에서, 항체 경쇄 가변 영역은 돌연변이체 H091E (서열번호:126)이고 핵산 서열 서열번호:151에 의해 인코딩된다. 본원에 실례적 구현예에서, 항체 중쇄 가변 영역은 돌연변이체 A032/H091D (서열번호:129)를 갖는다. 본원에 실례적 구현예에서, 항체 중쇄 가변 영역은 돌연변이체 A032/H091E (서열번호:130)를 갖는다. 실례적 구현예에서, 상기본원에 제공된 중쇄 가변 영역 돌연변이체를 인코딩하는 핵산 경우에, 경쇄 가변 영역은 서열번호:148이다. 실례적 구현예에서, 상기본원에 제공된 경쇄 가변 영역 돌연변이체를 인코딩하는 핵산 경우에, 중쇄 가변 영역은 서열번호:145이다.
핵산은 일부 구현예에서 T 세포 또는 NK 세포의 게놈의 단리된 형태로 또는 이의 전부 또는 부분으로서, 예를 들어, 안티오-HER2 CAR, 및 실례적 구현예에서 본원에 제공된 CAB-CAR의 임의의 것을 인코딩하는 재조합 발현 벡터를, 예를 들면, 포함하여, DNA일 것이다. 핵산은 일부 구현예에서 패키징 세포주, T 세포 또는 NK 내에 단리된 형태로 또는 레트로바이러스성 게놈 또는 발현된 전사체로서, 예를 들어, 안티오-HER2 CAR, 및 실례적 구현예에서 본원에 제공된 CAB-CAR 중 임의의 것을 인코딩하는 RNA일 것이다. 일부 구현예에서, 핵산은 단리될 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "단리된"은 물질이 이의 본래 환경 (예를 들면, 자연 발생이면 자연 환경)에서 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 존재하는 자연-발생 폴리뉴클레오타이드, 또는 다른 구현예에서 폴리펩타이드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부에서 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된다. 그러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 부분일 수 있고/거나 그러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 부분일 수 있고, 그러한 벡터 또는 조성물이 이의 자연 환경의 부분이 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다. 예를 들어, 단리된 핵성은, 실례적 구현예에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자일 수 있는, 발현 벡터의 부분일 수 있다.
폴리펩타이드, 예를 들어 본 개시내용의 CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 전사적 제어 요소, 예를 들면, 프로모터, 및 인핸서, 등에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그와 같은 작제물에서, 전사적 제어 요소는 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드 (예를 들면 CAR)의 발현을 지시하고/거나 조절한다. 진핵 세포, 예컨대, 예를 들어, 재조합 레트로바이러스성 입자를 제조하기 위한 패키징 세포주에서 발현 경우에, 적합한 프로모터는, 비제한적으로, 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 사이토메갈로바이러스 최초기 프로모터; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 초기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 다양한 당업계 알려진 조직 특이적 프로모터를 포함한다 일부 구현예에서, 프로모터는 CD8 세포-특이적 프로모터, CD4 세포-특이적 프로모터, 호중구-특이적 프로모터, 또는 NK-특이적 프로모터이다. 프로모터는 표적 세포에서 구성적으로 활성 또는 유도가능성일 수 있다. 예를 들어, CD4 유전자 프로모터는 사용될 수 있고; 예를 들면, Salmon 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7739; 및 Marodon 등 (2003) Blood 101:3416을 참고한다. 또 다른 예로서, CD8 유전자 프로모터는 사용될 수 있다. 예를 들어 T 세포에서 발현을 위하여, 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 쥣과 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터일 수 있다 (Jones 등, Human Gene Therapy (2009) 20: 630-40). 실례적 구현예에서, 프로모터는 T 세포 특이적 CD3 제타 프로모터이다. NK 세포-특이적 발현은 Neri (p46) 프로모터의 사용에 의해 달성될 수 있고; 예를 들면, Eckelhart 등 (2011) Blood 117:1565를 참고한다. 가역성 유도가능한 프로모터를 포함하는 적합한 가역성 프로모터는 당업계에서 알려진다. 그러한 가역성 프로모터는 많은 생물, 예를 들면, 진핵생물 및 원핵생물에서 단리 및 유래될 수 있다. 제2 생물에서 사용을 위하여 제1 생물, 예를 들면, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물, 등에서 유래된 가역성 프로모터의 변형은 당업계에서 잘 알려진다. 그러한 가역성 프로모터, 및 그러한 가역성 프로모터에 기반된 그러나 또한 추가의 제어 단백질을 포함하는 시스템은, 비제한적으로, 알코올 조절된 프로모터 (예를 들면, 알코올 데하이드로게나제 I (alcA) 유전자 프로모터, 알코올 전사촉진제 단백질 (AlcR)에 반응하는 프로모터, 등), 테트라사이클린 조절된 프로모터, (예를 들면, TetActivators, TetON, TetOFF, 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드 조절된 프로모터 (예를 들면, 랫트 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템, 등), 금속 조절된 프로모터 (예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터 시스템, 등), 병인-관련 조절된 프로모터 (예를 들면, 살리실산 조절된 프로모터, 에틸렌 조절된 프로모터, 벤조티아디아졸 조절된 프로모터, 등), 온도 조절된 프로모터 (예를 들면, 열충격 유도가능한 프로모터 (예를 들면, HSP-70, HSP-90, 대두 열충격 프로모터, 등), 광 조절된 프로모터, 합성 유도가능한 프로모터, 및 기타 등등을 포함한다. 다양한 방법에서 그리고 별도 양태로서 사용에 적합한 프로모터의 추가 논의는 본원에 제공된다.
본 개시내용의 CAR을 인코딩하는 단리된 뉴클레오타이드 서열은 진핵 발현 벡터에서 존재할 수 있다. 발현 벡터는 선택가능한 마커, 복제의 기원, 그리고 벡터의 복제 및/또는 유지 및 이식유전자의 발현을 제공하는 다른 속성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 전형적으로 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 적합한 발현 벡터는 당업계에서 알려지고, 예를 들어, 플라스미드 및 바이러스성 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는, 본원에 상세히 개시된 대로, 재조합 레트로바이러스성 입자이다.
폴리뉴클레오타이드, 핵산 서열, 및/또는 전사 단위, 및/또는 동종을 포함하는 벡터를 포함하는 다양한 양태 및 구현예는 추가로 (본원에 코작(Kozak)-관련된 서열로 또한 불리는) 코작-유형 서열, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈 중 하나 이상의 정지 코돈은 하나 이상의 전사 단위 중 적어도 하나로부터 판독의 종결을 정의한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 서열, 및/또는 전사 단위, 및/또는 동종을 포함하는 벡터는 추가로 하나 이상의 전사 단위 중 적어도 하나의 시작 코돈의 상류 10개 뉴클레오타이드 내에서 5' 뉴클레오타이드를 갖는 코작-유형 서열을 포함한다. 코작은 699 척추동물 mRNA에 대하여 코작 공통 서열, (GCC)GCCRCCATG (서열번호:107)을 결정하였고, 여기에서 R은 퓨린 (A 또는 G)이다 (Kozak. Nucleic Acids Res. 1987 Oct 26;15(20):8125-48). 일 구현예에서 코작-유형 서열은 CCACCAT/UG(G) (서열번호:108), CCGCCAT/UG(G) (서열번호:109), GCCGCCGCCAT/UG(G) (서열번호:110), 또는 GCCGCCACCAT/UG(G) (서열번호:111)이거나 이를 포함한다 (임의적 뉴클레오타이드 및 그 위치에 슬래시 표시된 다른 가능한 뉴클레오타이드에 의해 분리된 뉴클레오타이드를 나타내는 괄호 안의 뉴클레오타이드는, 예를 들어 핵산이 DNA 또는 RNA인지 여부에 의존함. AU/TG 시작 코돈을 포함하는 이들 구현예에서, A는 위치 0으로 고려될 수 있다. 특정 실례적 구현예에서, -3 및 +4에 뉴클레오타이드는 동일하고, 예를 들어 -3 및 +4 뉴클레오타이드는 G일 수 있다. 또 다른 구현예에서 코작-유형 서열은 ATG가 시작 코돈인 ATG의 상류 세 번째 위치에서 A 또는 G를 포함한다. 또 다른 구현예에서 코작-유형 서열은 AUG가 시작 코돈인 AUG의 상류 세 번째 위치에서 A 또는 G를 포함한다. 실례적 구현예에서, 코작 서열은 (GCC)GCCRCCATG (서열번호:107)이고, 식중 R은 퓨린 (A 또는 G)이다. 실례적 구현예에서, 코작-유형 서열은 GCCGCCACCAUG (서열번호:112)이다. 코작-유형 서열을 포함하는 선행 구현예 및/또는 삼중 정지 코돈을 포함하는 하기 구현예와 조합될 수 있는, 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 WPRE 요소를 포함한다. WPRE는 당업계에서 (예를 들면, (Higashimoto 등, Gene Ther. 2007; 14: 1298) 참고) 그리고 WO2019/055946에서 실례된 대로 특성규명되었다. 일부 구현예에서, WPRE 요소는 하나 이상의 전사 단위의 정지 코돈의 3' 및 폴리뉴클레오타이드의 5'에서 3' LTR에 자리잡는다. 선행 구현예 (즉 폴리뉴클레오타이드가 코작-유형 서열을 포함하는 구현예 및/또는 폴리뉴클레오타이드가 WPRE를 포함하는 구현예)의 어느 한쪽 또는 양쪽과 조합될 수 있는, 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 전사 단위는 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈의 하나 이상의 정지 코돈으로 종결하고, 여기서 이중 정지 코돈은 제1 판독 프레임에서 제1 정지 코돈 및 제2 판독 프레임에서 제2 정지 코돈, 또는 제2 정지 코돈을 가진 프레임내 제1 정지 코돈을 포함하고, 여기서 삼중 정지 코돈은 제1 판독 프레임에서 제1 정지 코돈, 제2 판독 프레임에서 제2 정지 코돈, 및 제3 판독 프레임에서 제3 정지 코돈, 또는 제2 정지 코돈 및 제3 정지 코돈을 가진 프레임내 제1 정지 코돈을 포함한다.
본원에 삼중 정지 코돈은, 서로의 10개 뉴클레오타이드 내에서, 그리고 바람직하게는 중첩 서열을 갖는, 각 판독 프레임내 하나인, 3개 정지 코돈, 또는 동일한 판독 프레임에서, 바람직하게는 연속 코돈에 3개 정지 코돈을 포함한다. 이중 정지 코돈은, 서로의 10개 뉴클레오타이드 내에서, 그리고 바람직하게는 중첩 서열을 갖는, 상이한 판독 프레임에서 각각인, 2개 정지 코돈, 또는 동일한 판독 프레임에서, 바람직하게는 연속 코돈에 2개 정지 코돈을 의미한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부에서, PBMC, B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포에 DNA의 도입 그리고 임의로 숙주 세포 게놈에 DNA의 편입은 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 활용하지 않는 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 다른 바이러스성 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 또는 단순 포진 바이러스-1에서 유래된 것들은, 비-제한 예로서 활용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 표적 세포를 비-바이러스성 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서 비-바이러스성 벡터를 활용하여 표적 세포를 형질감염시킬 수 있고, 네이키드 DNA를 포함하는, 비-바이러스성 벡터는 전기천공, 뉴클레오펙션, 리포솜 제형, 지질, 덴드리머, 양이온성 중합체 예컨대 폴리(에틸렌이민) (PEI) 및 폴리(l-리신) (PLL), 나노입자, 세포-투과성 펩타이드, 미세주사, 및 /또는 비-통합 렌티바이러스성 벡터를 포함하는 방법을 사용하여 표적 세포, 예컨대 예를 들어, PBMC, B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA는 리포솜 및 프로타민을 가진 복합체에서 표적 세포, 예컨대 PBMC, B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포에 도입될 수 있다. 본원에 제공된 방법의 구현예에서 사용될 수 있는 생체외 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질감염시키는 다른 방법은 당업계에서 알려진다 (예를 들면, 이 전체가 본원에 참고로 편입된, Morgan and Boyerinas, Biomedicines. 2016 Apr 20;4(2). pii: E9, 참고).
본원에 제공된 방법의 일부 구현예에서, DNA는 관심의 유전자의 5' 및 3' 단부에서 트랜스포존 ITR 단편을 함유하는 플라스미드로서 표적 DNA의 공-형질감염, 공-뉴클레오펙션 또는 공-전기천공에 의한 트랜스포존-기반된 담체 시스템 그리고 인간 게놈내 슈도 attP 부위에서 관심의 유전자를 통합하는 DNA 또는 mRNA 또는 단백질 또는 부위 특이적 세린 리콤비나제 예컨대 phiC31로서 트랜스포사제 담체 시스템을 사용하여 게놈으로 통합될 수 있고, 이 경우에 DNA 벡터는 리콤비나제 효소에 대하여 인식 서열이고 (Bhaskar Thyagarajan 등 Site-Specific Genomic Integration in Mammalian Cells Mediated by Phage φC31 Integrase, Mol Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-3934) 리콤비나제로 공 형질감염되는 34 내지 40 bp attB 부위를 함유한다. T 세포 및/또는 NK 세포 경우에, 본원에 제공된 특정 방법에서 사용될 수 있는 트랜스포존-기반된 시스템은 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) DNA 담체 시스템 (예를 들면, 그들 전체가 본원에 참고로 편입된, 미국 특허 번호 6,489,458 및 미국 특허 출원 번호15/434,595, 참고), 피기백(PiggyBac) DNA 담체 시스템 (예를 들면, 이 전체가 본원에 참고로 편입된, Manuri 등, Hum Gene Ther. 2010 Apr;21(4):427-37 참고), 또는 ToLCDR2 트랜스포존 시스템 (예를 들면, 이 전체가 본원에 참고로 편입된, Tsukahara 등, Gene Ther. 2015 Feb; 22(2): 209-215 참고)을 DNA, mRNA, 또는 단백질 형태로 활용한다. 일부 구현예에서, 트랜스포존-기반된 벡터 시스템의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제는 T 세포 및/또는 NK 세포에 도입 전에 미니서클 DNA 벡터로서 생산될 수 있다 (예를 들면, 그들 전체가 본원에 참고로 편입된, Hudecek 등, Recent Results Cancer Res. 2016;209:37-50 및 Monjezi 등, Leukemia. 2017 Jan;31(1):186-194 참고). 하지만, 일부 상황에서, 트랜스포사제-기반된 담체 시스템은 외인성 핵산의 바람직한 도입 방법이 아니다. 그래서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 폴리뉴클레오타이드는 트랜스포존 ITR 단편을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 변형된, 유전적으로 변형된, 및/또는 형질도입된 세포는 DNA 또는 mRNA 또는 단백질로서 트랜스포사제 담체 시스템을 포함하지 않는다. CAR은, 표적 부위의 통합 5' 및 3'에 상동인 50-1000 bp 상동성 아암을 부가함으로써, CRISPR 또는 TALEN 매개된 통합을 사용하여 게놈에서 정의된 및 특이적 부위로 또한 통합될 수 있다 (Jae Seong Lee 등 Scientific Reports 5, Article number: 8572 (2015), CRISPR/Cas9 및 상동성-관련 DNA 복구 경로에 의해 매개된 CHO 세포에서 부위-특이적 통합). CRISPR 또는 TALEN은 특이성 및 게놈성-표적화된 절단을 제공하고 작제물은 상동성-매개된 단부 결합을 통해 통합될 것이다 (Yao X 등 Cell Res. 2017 Jun;27(6):801-814. doi: 10.1038/cr.2017.76. Epub 2017 May 19). CRISPR 또는 TALEN은 DNA, mRNA, 또는 단백질로서 표적 플라스미드로 공-형질감염될 수 있다.
n 일부 구현예, 본원에 단리된 핵산은 합성 RNA, 예컨대 하나 또는 CAR을 인코딩하는 합성 mRNA이다. CAR은 본원에 개시된 임의의 CAR 조성물일 수 있다.
재조합 레트로바이러스성 입자
재조합 레트로바이러스성 입자는, 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하여 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 그리고 단리된 발현 벡터로서 제조하기 위해, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 개시된다. 재조합 레트로바이러스성 입자는 본 발명의 자체 양태이다. 전형적으로, 본원에 제공된 양태에서 포함된 재조합 레트로바이러스성 입자는, 재조합 레트로바이러스성 입자가 일단 패키징 세포를 떠나가면 복제할 수 없음을 의미하는, 복제 불능이다. 실례적 구현예에서, 재조합 레트로바이러스성 입자는 렌티바이러스성 입자이다.
일부 양태에서 세포, 전형적으로 림프구 및 실례적 구현예 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는데 사용을 위한 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자가 본원에 제공된다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 본원에 다른 곳에 논의된 슈도타이핑 요소 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일 양태에서, A. 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위; 및 B. 슈도타이핑 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자가 본원에 제공된다. 또 다른 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자가 본원에 제공되고, 여기서 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 인코딩한다.
일부 양태에서, (i) T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 거기에 재조합 레트로바이러스성 입자의 막 융합을 용이하게 할 수 있는 슈도타이핑 요소; 및 (ii) T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 레트로바이러스성 입자가 본원에 제공되고, 여기서 하나 이상의 전사 단위는 항원-특이적 표적화 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 갖는 제1 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터는 패키징 세포주에서 활성이 아니거나 유도가능한 방식으로 패키징 세포주에서 겨우 활성이다.
복제 불능, 재조합 레트로바이러스성 입자에서 포함되는 다양한 요소 및 요소의 조합, 예컨대, 예를 들어, 슈도타이핑 요소, 뿐만 아니라 복제 불능, 재조합 레트로바이러스성 입자의 게놈에서 포함되는 핵산 서열 예컨대, 비제한적으로, CAR을 인코딩하는 핵산; 제어 요소를 인코딩하는 핵산; 및 프로모터, 특히 T 세포 및/또는 NK 세포에서 구성적으로 활성 또는 유도가능한 프로모터가 본 개시내용 내내 제공된다. 더욱이, 본원에 제공된 다양한 양태, 예컨대 재조합 레트로바이러스성 입자의 제조 방법, 입양 세포 요법을 수행하는 방법, 및 T 세포를 형질도입하는 방법은 복제 불능, 재조합 레트로바이러스성 입자를 생산하고/거나 포함한다. 그러한 방법 자체에서 생산되고/거나 포함되는 복제 불능 재조합 레트로바이러스는, 단리된 형태일 수 있는, 복제 불능, 재조합 레트로바이러스성 입자 조성물로서 본 발명의 별도 양태를 형성한다. 그러한 조성물은 건조된 (예를 들면 동결건조된) 형태일 수 있거나 레트로바이러스성 입자의 저장 및 사용을 위하여 당업계에서 알려진 적합한 용액 또는 배지일 수 있다.
재조합 레트로바이러스성 벡터, 예컨대 렌티바이러스성 벡터의 필요한 요소는 당업계에서 알려진다. 이들 요소는 실시예에서 제공된 복제 불능, 재조합 레트로바이러스성 입자를 제조하기 위하여 상세히 그리고 패키징 세포주 섹션에서 포함된다. 예를 들어, 렌티바이러스성 입자는 전형적으로, 하나 이상의 패키징 플라스미드를 통해 패키징 세포주에 전달될 수 있는 패키징 요소 REV, GAG 및 POL, 슈도타이핑 플라스미드를 통해 패키징 세포주에 전달될 수 있는, 다양한 이의 예가 본원에 제공되는 슈도타이핑 요소, 및 전달 플라스미드를 통해 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 생산되는 게놈을 포함한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 바이러스성 LTR 및 프시 패키징 신호를 포함한다. 5' LTR은, Tat 전사촉진에 의존적이지 않은 5' LTR을 포함하는, 이종 프로모터에 융합된 키메라 5' LTR일 수 있다. 전달 플라스미드는, 예를 들어, 3' LTR의 U3 영역을 제거함으로써 자가-비활성화될 수 있다.
본 발명의 다양한 양태에서 포함된 레트로바이러스성 입자 (예를 들면 렌티바이러스성 입자)는 실례적 구현예에서, 특히 대상체에 그러한 레트로바이러스성 입자로 형질도입된 형질도입 세포를 포함하는 구현예에 대하여 안전성 이유로 복제 불능이다. 복제 불능 레트로바이러스성 입자가 세포를 형질도입하는데 사용되는 때, 레트로바이러스성 입자는 형질도입된 세포로부터 생산되지 않는다. 레트로바이러스성 게놈에 대한 변형은 게놈을 포함하는 레트로바이러스성 입자가 복제 불능임을 보장하기 위해 당업계에서 알려진다. 하지만, 본원에 제공된 양태 중 임의의 것에 대하여 일부 구현예에서, 복제 가능 재조합 레트로바이러스성 입자가 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
숙련된 기술자는 본원에 논의된 기능적 요소가 상이한 유형의 벡터, 예컨대 발현 벡터를 사용하여 패키징 세포에 및/또는 T 세포에 전달될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 실례적 양태는 레트로바이러스성 벡터, 및 일부 특히 실례적 구현예에서 렌티바이러스성 벡터를 활용한다. 다른 적합한 발현 벡터는 본원에 특정 구현예를 달성하는데 사용될 수 있다. 그러한 발현 벡터는, 비제한적으로, 바이러스성 벡터 (예를 들면 백시니아 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스 (예를 들면, Li 등, Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras 등, Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto 등, H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655, 참고); 아데노-연관된 바이러스 (예를 들면, Ali 등, Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery 등, PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett 등, Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary 등, Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling 등, Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali 등, Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; WO 93/09239에서 Srivastava, Samulski 등, J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson 등, Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte 등, PNAS (1993) 90: 10613-10617, 참고); SV40; 단순 포진 바이러스에 기반된 바이러스성 벡터; 또는 레트로바이러스성 벡터 (예를 들면, 쥣과 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스에서 유래된 벡터 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스), 예를 들어 감마 레트로바이러스; 또는 인간 면역 결핍 바이러스 (예를 들면, Miyoshi 등, PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi 등, J Virol 73:7812 7816, 1999); 및 기타 등등을 포함한다.
본원에 개시된 경우에, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 유전자 전달을 위한 공통 도구이다 (Miller, Nature (1992) 357:455-460). 넓은 범위의 설치류, 영장류 및 인간 체세포에 재배열되지 않은 핵산 서열을 전달하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 능력은 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 세포에 유전자를 전달하는데 잘 적합화되게 만든다. 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 알파레트로바이러스 속, 베타레트로바이러스 속, 감마레트로바이러스 속, 델타레트로바이러스 속, 엡실론레트로바이러스 속, 렌티바이러스 속, 또는 스푸마바이러스 속에서 유래될 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용에 적합한 많은 레트로바이러스가 있다. 예를 들어, 쥣과 백혈병 바이러스 (MLV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 말과 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 라우스 육종 바이러스 (RSV), 후지나미 육종 바이러스 (FuSV), 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스 (Mo-MLV), FBR 쥣과 골육종 바이러스 (FBR MSV), 몰로니 쥣과 육종 바이러스 (Mo-MSV), 아벨손 쥣과 백혈병 바이러스 (A-MLV), 조류 골수세포종증 바이러스-29 (MC29), 및 조류 적혈구모세포증 바이러스 (AEV)가 사용될 수 있다. 레트로바이러스의 상세된 목록은 Coffin 등 ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763)에서 찾아질 수 있다. 일부 레트로바이러스의 게놈성 구조에 관한 상세는 당업계에서 찾아질 수 있다. 예로써, HIV에 관한 상세는 NCBI Genbank (즉 게놈 등록 번호 AF033819)로부터 찾아질 수 있다.
실례적 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 렌티바이러스 속에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 HIV, SIV, 또는 FIV에서 유래될 수 있다. 추가 실례적 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 렌티바이러스 속에서 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에서 유래될 수 있다. 렌티바이러스는, 공통 레트로바이러스성 유전자 gag, pol 및 env 이외에, 조절 또는 구조적 기능을 가진 다른 유전자를 함유하는 복잡한 레트로바이러스이다. 더 높은 복잡성은 렌티바이러스가 이의 수명 주기를, 잠복 감염의 과정에서 처럼, 조절하게 한다. 전형적 렌티바이러스는 AIDS의 병인체인, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)이다. 생체내, HIV는 거의 분열하지 않는 말단으로 분화된 세포, 예컨대 림프구 및 대식세포를 감염시킬 수 있다.
일부 구현예에서, DNA-함유 바이러스성 입자는 재조합 레트로바이러스성 입자 대신에 활용된다. 그러한 바이러스성 입자는 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 헤르페스바이러스, 사이토메갈로바이러스, 폭스바이러스, 아비폭스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 또는 신드비스 바이러스일 수 있다. 숙련된 기술자는 상이한 바이러스 및 레트로바이러스, 또는 레트로바이러스성 입자로 사용을 위하여 본원에 개시된 방법을 변형시키는 방법을 이해할 것이다. DNA 게놈을 포함하는 바이러스성 입자가 사용되는 경우, 숙련된 기술자는 기능적 단위가 그러한 게놈에 포함되어 바이러스성 입자의 DNA 게놈의 전부 또는 한 부문의 그러한 바이러스로 형질도입된 T 세포의 게놈으로의 통합을 유도할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역은 N-말단 RGG 박스 RNA 결합 모티프 및 ICP27을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV Rev를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역은 아데노바이러스 E1B 55-kDa 및 E4 Orf6을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역으로 대체될 수 있다.
일 양태에서 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 양태 중 임의의 것에 따라 단리된 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 포함하는 컨테이너, 예컨대 상업적 컨테이너 또는 패키지, 또는 동종을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 더욱이, 또 다른 양태에서 본원에 제공된 패키징 세포 및/또는 패키징 세포주 양태 중 임의의 것에 따라, 단리된 패키징 세포, 실례적 구현예에서 패키징 세포주로부터 단리된 패키징 세포를 포함하는 컨테이너, 예컨대 상업적 컨테이너 또는 패키지, 또는 동종을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 추가의 시약 예컨대 본원에 제공된 방법에서 사용된 시약 또는 완충액을 포함하는 추가의 컨테이너를 포함한다. 더욱이, 특정 양태에서 본원에 제공된 임의의 양태에 따라 T 세포 또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 키트의 제조에서, 임의의 양태에서 본원에 제공된 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도가 본원에 제공된다. 더욱이, 특정 양태에서 본원에 제공된 임의의 양태에 따라 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 생산하귀 위한 키트의 제조에서, 임의의 양태에서 본원에 제공된 임의의 패키징 세포 또는 패키징 세포주의 용도가 본원에 제공된다.
일 양태에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 및 대상체에서 종양 성장을 치료하기 위한 이의 용도에 대한 지침이 들어있는 상업적 컨테이너가 본원에 제공되고, 여기서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 본원에 제공된 항-HER2 CAR 중 임의의 것을 인코딩하는 게놈을 갖는다. 따라서, 재조합 레트로바이러스성 입자는, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된, 본원에 제공된 항-HER2 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에서 포함할 수 있다. 전형적으로, 하나 이상의 핵산 서열들 중 한 핵산 서열은 HER2를 결합시킬 수 있는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 본원에 제공된 항-HER2 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩한다.
재조합 레트로바이러스성 입자가 들어있는 컨테이너는 재조합 레트로바이러스성 입자의 튜브, 바이알, 플레이트의 웰, 또는 저장을 위한 다른 용기일 수 있다. 키트는 제2 또는 다른 컨테이너가, 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 위한 용액 또는 배지를 포함할 수 있고/거나, 제2 또는 다른 컨테이너가 pH-조절 약리학적 제제를 포함할 수 있는 둘 이상의 컨테이너를 포함할 수 있다. 이들 컨테이너들 중 임의의 것은 산업적 위력 및 등급일 수 있다.
또 다른 양태에서, 활성 성분으로서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 포함하는, 암 또는 종양 성장을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 또 다른 양태에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 포함하는 암 또는 종양 성장을 치료 또는 예방하기 위한 주입 조성물 또는 다른 전달 용액이 본원에 제공된다. 약학적 조성물 또는 주입 조성물의 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 상기 또는 본원에 다른 곳에 논의된 양태, 구현예, 또는 하위구현예 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
일 양태에서 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 양태 및 구현예 중 임의의 것에 따라, 단리된 핵산, 실례적 구현예에서 레트로바이러스성 입자를 포함하는 컨테이너, 예컨대 상업적 컨테이너 또는 패키지, 또는 동종을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 레트로바이러스성 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 그들의 게놈에서 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 서열들 중 한 핵산 서열은 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 본원에 제공된 항-HER2 CAB CAR을 인코딩할 수 있다.
단리된 핵산, 실례적 구현예에서 재조합 레트로바이러스성 입자가 임의의 양태 또는 구현예에서 들어있는 컨테이너는 키트의 구성요소일 수 있는 상업적 컨테이너를 포함하고, 튜브, 바이알, 플레이트의 웰, 또는 핵산 예컨대, 비제한적으로, 레트로바이러스성 입자의 저장을 위한 다른 용기일 수 있다. 사실, 본원에 제공된 일부 양태는 레트로바이러스성 입자를 포함하는 컨테이너를 포함하고, 여기서 그러한 레트로바이러스성 입자는 본원에 개시된 임의의 핵산(들) 또는 다른 구성요소(들)를 포함한다. 그러한 컨테이너는 실례적 구현예에서, 실질적으로 순수한 레트로바이러스성 입자로서, 약칭으로 본원에 때때로 지칭된, 실질적으로 순수한 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 포함한다. 전형적으로, 실질적으로 순수한 레트로바이러스성 입자의 제조물 및/또는 컨테이너는 멸균성이고, 표준 프로토콜에 따른 마이코플라즈마, 동일한 유형의 복제 가능 레트로바이러스, 및 외래성 바이러스에 대하여 음성이다 (예를 들면, "Viral Vector Characterization: A Look at Analytical Tools"; 2018년 10월 10일 (https://cellculturedish.com/viral-vector-characterization-analytical-tools/)에서 이용가능). 실질적으로 순수한 레트로바이러스성 입자를 생성하는 예시적 방법은 심층 여과, TFF, 벤조나제 처리, 정용여과, 및 제형화 중 하나 이상, 또는 모두의 조합에 의해 정제될 수 있다. 그러한 예시적 방법은 비-인간 동물 단백질이 없는 실질적으로 순수한 바이러스성 입자를 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 실례적 구현예에서, 실질적으로 순수한 레트로바이러스성 입자는 품질 관리 테스팅 결과에 기반하여 하기 특징들의 모두를 충족시킨다:
a. 마이코플라스마에 대하여 음성;
b. 25 EU/ml 미만, 및 특정 추가 실례적 구현예에서, 10 EU/ml 미만에서 내독소;
c. 의도적으로 컨테이너에서 검출된 것과 동일한 유형의 검출된 복제 가능 레트로바이러스 (예를 들면 렌티바이러스)의 부재;
d. 검출된 외래성 바이러스의 부재;
e. 1 pg 미만 숙주 세포 DNA/ 바이러스성 TU, 및 특정 추가 실례적 구현예에서, 0.3 pg / TU 미만;
f. 100개 미만 잔여 플라스미드 카피/ 바이러스성 TU, 및 특정 추가 실례적 구현예에서, 재조합 레트로바이러스성 입자를 제조하는데 사용된 임의의 플라스미드의 10개 미만 카피/바이러스성 TU.
g. 1 ng 미만 HEK 단백질/ TU, 및 특정 추가 실례적 구현예에서, 50 pg 미만 HEK 단백질 /TU.
h. 100 초과 TU / ng P24 단백질, 및 특정 추가 실례적 구현예에서, 10,000 초과 TU /ng P24 단백질.
레트로바이러스성 입자는, 이들이 고객에게 방출되기 전에, 상기 제공된 것들의 일부 또는 전부를 포함하는 방출 사양에 대해 전형적으로 테스트된다. 각 입자의 효력은 ELISA에 의한 p24 바이러스성 캡시드 단백질, q-RT PCR에 의한 바이러스성 RNA 게놈 카피, qPCR-기반된 생산물-향상된 RT (PERT) 검정에 의한 역 전사효소 활성의 측정을 기반으로 정의될 수 있지만 생물검정에서 기능적 유전자 전달 형질도입 단위 (TU)를 측정함으로써 감염성 역가로 모두 전환될 수 있다.
생물검정 및 qPCR에 의한 완제품 및 정제된 벌크 레트로바이러스 물질의 감염성 역가의 결정은 레트로바이러스의 감염성 역가의 결정을 위한 예시적 분석 테스트 방법이다. 지표 세포 은행 (예컨대 F1XT)은 예를 들어 무혈청 배지에서 성장될 수 있고, 150,000 세포 / 웰로 씨딩될 수 있고, 이어서 레트로바이러스 산물의 일련의 희석액에 노출될 수 있다. 정제된 레트로바이러스 입자의 희석액은 지표 세포에서, 예를 들어 1:200 내지 1:1,600으로 이루어진다. 참조 표준 바이러스는 시스템 적합성을 위하여 첨가될 수 있다. 레트로바이러스로 4 일의 인큐베이션 이후, 세포는 수확되고, DNA 추출되고 정제된다. 인간 게놈 및 고유 레트로바이러스성 게놈 서열 플라스미드 pDNA 앰플리콘의 표준 곡선, 예를 들어 100-10,000,000 카피/ 웰은 사용되고, 이어서 레트로바이러스 입자에 노출된 세포 샘플의 게놈성 DNA가 첨가된다. 각 PCR 반응 경우에, 양쪽 레트로바이러스 앰플리콘 및 내인성 대조군 예컨대 hRNAseP의 Cq 값들은 반응마다 카피로 다시 외삽된다. 이들 값으로부터 통합된 게놈 카피 수는 계산된다. 일부 경우에, 지표 세포 예컨대 293T는 3배체인 것으로 특성규명되었고, 그러므로 세포당 단일 카피 유전자의 3개 카피가 계산에서 활용되어야 한다. 웰당 초기 생존가능한 세포 카운트, 세포에 첨가된 레트로바이러스의 부피 그리고 게놈 카피 수 비율을 사용하여 형질도입 단위 (TU) / ml 레트로바이러스 입자는 결정될 수 있다.
효력 테스팅은 순도 및 비활성도가 있는 방출 사양에 대해 효력 테스팅을 포함할 수 있다. 예를 들어, 최종 산물의 효력 방출 테스팅은 (예를 들면 바이러스성 단백질에 대해 ELISA를 수행함으로써, 예를 들어 렌티바이러스 경우에 적어도 100, 1,000, 2,000 또는 2,500 TU/ng p24의 컷오프가 있는 p24 캡시드 단백질 ELISA를 수행함으로써) 바이러스성 입자 정량에 비교하여 형질도입 단위 (TU)의 수, 및 예를 들어 유전자 변형된 세포에 노출된 리포터 세포주에 의한 인터페론 감마 방출을 측정함으로써, CAR 기능성의 측정을 포함할 수 있다.
그러한 레트로바이러스성 입자의 컨테이너를 포함하는, 본원에 키트 또는 단리된 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 양태 중 임의의 것에서, 충분한 재조합 레트로바이러스성 입자는 레트로바이러스성 입자를 사용하여 제조된 반응 혼합물에서 0.1 내지 50, 0.5 내지 50, 0.5 내지 20, 0.5 내지 10, 1 내지 25, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 7, 2 내지 3, 3 내지 10, 3 내지 15, 또는 5 내지 15 또는 적어도 0.1, 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 5, 10 또는 15의 MOI (형질도입 단위의 수, 또는 세포당 적용된 TU)를 달성하기 위해, 또는 적어도 0.1, 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 5, 10 또는 15의 MOI를 달성하기 위해 컨테이너에서 존재한다. 키트에서 제공된 바이러스 입자의 형질도입 단위는 개별 세포에서 너무 많은 통합체, 평균적으로 세포성 게놈당 3개 미만 렌티게놈 카피 및 더욱 바람직하게는 세포당 1개 카피를 생산하는 것을 방지하는 MOI를 사용할 수 있어야 한다. 키트 및 단리된 레트로바이러스성 입자 구현예 경우에, 그러한 MOI는 1x106 표적 세포/ml를 추정하는, 예를 들어 전혈의 경우에서, 1 x 106 PBMCs/ml의 혈액을 추정하는 1, 2.5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 250, 500, 또는 1,000 ml의 반응 혼합물에 기반될 수 있다. 따라서, 레트로바이러스성 입자의 컨테이너는 1 x 105 내지 1 x 109, 1 x 105 내지 1 x 108, 1 x 105 내지 5 x 107, 1 x 105 내지 1 x 107, 1 x 105 내지 1 x 106; 5 x 105 내지 1 x 109; 5 x 105 내지 1 x 108, 5 x 105 내지 5 x 107, 5 x 105 내지 1 x 107, 5 x 105 내지 1 x 106, 또는 1 x 107 내지 1 x 109, 1 x 107 내지 5 x 107, 1 x 106 내지 1 x 107, 및 1 x 106 내지 5 x 106 TU를 포함할 수 있다. 특정 실례적 구현예에서, 컨테이너는 1 x 107　내지 1 x 109, 5 x 106　내지 1 x 108,　1 x 106　내지 5 x 107, 1 x 106　내지 5 x 106 또는 5 x107　내지 1 x108　레트로바이러스성 형질도입 단위를 함유할 수 있다. 이론에 의해 제한됨 없이, 그러한 수의 입자는 1 내지 10의 MOI에 1 내지 100 ml의 혈액을 지원할 것이다.
레트로바이러스성 입자가 들어있는 각 컨테이너는, 예를 들어, 0.05 ml 내지 5 ml, 0.05 ml 내지 1 ml, 0.05 ml 내지 0.5 ml, 0.1 ml 내지 5 ml, 0.1 ml 내지 1 ml, 0.1 ml 내지 0.5 ml, 0.1 내지 10 ml, 0.5 내지 10 ml, 0.5 ml 내지 5 ml, 0.5 ml 내지 1 ml, 1.0 ml 내지 10.0 ml, 1.0 ml 내지 5.0 ml, 10 ml 내지 100 ml, 1 ml 내지 20 ml, 1 ml 내지 10 ml, 1 ml 내지 5 ml, 1 ml 내지 2 ml, 2 ml 내지 20 ml, 2 ml 내지 10 ml, 2 ml 내지 5 ml, 0.25 ml 내지 10 ml, 0.25 내지 5 ml, 또는 0.25 내지 2 ml의 부피를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 컨테이너에서 레트로바이러스성 입자는 (즉 감독 기관에 따라 GMP 또는 현행 GMP 요구사항에 따라 생산된) GMP-등급, 또는 cGMP-등급 레트로바이러스성 입자, 또는 GMP 시스템을 사용하여 수행된 레트로바이러스성 제조 공정의 산물이다. 그러한 레트로바이러스성 입자는 미국 FDA (즉 미국 GMP 또는 미국 cGMP), EMA (즉 EMA GMP 또는 EMA cGMP), 또는 중국의 국가 의약품 관리국 (NMPA) (즉 중국 FDA) (즉 NMPA GMP 또는 NMPA cGMP) 우수 의약품 제조관리 기준 (GMP)을 사용하여, 예를 들어 GMP 품질 시스템 및 GMP 절차적 관리를 사용하여 전형적으로 만들어진다. 이들 제품은 GMP 또는 cGMP 요구사항을 충족시키는 시설에서 전형적으로 생산된다. 그러한 제품은 GMP 또는 cGMP 규정에 기반된 엄격한 품질 관리 시스템 하에서 전형적으로 제조된다. GMP-등급 레트로바이러스성 입자는 전형적으로 멸균성이다. 이것은 예를 들어, 레트로바이러스성 입자, 예를 들어 실질적으로 순수한 레트로바이러스성 입자를, 0.45 um 또는 0.22 um 필터로 여과시킴으로써 성취될 수 있다. GMP-등급 레트로바이러스성 입자는 전형적으로 실질적으로 순수하고, 효력, 품질 및 안전성에 대하여 대조군 제조 테스트 사양으로 제조된다.
일부 구현예에서, 컨테이너에서 레트로바이러스성 입자를 포함하는 용액은 검출가능한 솟과 단백질이 없고, 이는 "무솟과"로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스성 입자의 그러한 용액은 무솟과일 수 있는 것은 솟과 단백질, 예컨대 솟과 혈청 단백질이 레트로바이러스 생산 동안 패키징 세포 배양시키기에서 사용되지 않기 때문이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스성 입자의 용액은 GMP-등급 및 무솟과이다. 실질적으로 순수한 핵산 용액은 전형적으로 무솟과이고 무솟과 액체배지에서 제조된다.
일부 양태에서, NK 세포 및/또는 실례적 구현예에서, T 세포를 변형시키기 위한 키트가 본원에 제공된다. 그와 같은 키트는 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포에 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 제1 전사 단위를 포함하는 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오타이드가 들어있는 하나 또는 복수의 컨테이너로, 하나 이상의 제1 전사 단위가, 때때로 제1 CAR로서 지칭된, 제1 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드를 인코딩하는, 컨테이너, 그리고 본원에 액세서리 키트 구성요소로 또한 불리는, 액세서리 구성요소(들)의 하나 이상의 컨테이너를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 (예를 들면 레트로바이러스성 입자)는, 예를 들어 -70 ℃ 이하 (예를 들면 -80 ℃)에서 냉동 저장될 수 있다.
레트로바이러스성 게놈 크기
본원에 제공된 방법 및 조성물에서, 재조합 레트로바이러스성 게놈, 비-제한 실례적 예에서, 렌티바이러스성 게놈은 바이러스성 입자에 패키징될 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 수에 제한이 있다. 본원에 제공된 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 인코딩 영역에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 인코딩 영역이 야생형 폴리펩타이드에 대하여 폴리뉴클레오타이드 인코딩 영역보다 더 적은 뉴클레오타이드에 의해 인코딩되도록 기능적 활성을 보유하는 절두 또는 다른 결실일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 인코딩 영역에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 하나의 프로모터에서 발현될 수 있는 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 하나의 융합 폴리펩타이드 및 하나의 프로모터로부터 둘 이상의 기능적 폴리펩타이드를 생성하기 위해 절단 신호를 가질 수 있다. 더욱이, 초기 생체외 형질도입후 필요 없는 일부 기능은 레트로바이러스성 게놈에서 포함되지 않고, 오히려 패키징 세포 막을 통해 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 표면에서 존재한다. 이들 다양한 전략은 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 내에서 패키징되는 기능적 요소를 최대화하기 위해 본원에 사용된다.
일부 구현예에서, 패키징될 재조합 레트로바이러스성 게놈은 범위의 저점으로 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 및 8,000개 뉴클레오타이드 내지 범위의 고점으로 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 및 11,000개 뉴클레오타이드일 수 있다. 패키징될 레트로바이러스성 게놈은 본원에 상세히 개시된 대로 제1 및 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징될 재조합 레트로바이러스성 게놈은 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 또는 11,000개 미만 뉴클레오타이드일 수 있다. 패키징될 수 있는 본원에 다른 곳에 논의된 기능은 레트로바이러스성 조립 및 패키징을 위하여 요구된 레트로바이러스성 서열, 예컨대 레트로바이러스성 rev, gag, 및 pol 코딩 영역, 뿐만 아니라 5' TR 및 3' TR, 또는 이들의 활성 절두된 단편, 레트로바이러스성 cis-작용 RNA 패키징 요소, 및 cPPT/CTS 요소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
조합
일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자에 의해 제공된 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 CAR의 특정 조합을 인코딩하는 하나 이상의 전사 단위를 갖는다. 본원에 제공된 일부 방법 및 조성물에서, 유전적으로 변형된 T 세포는 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자에 의한 T 세포의 형질도입후 하나 이상의 CAR의 조합을 포함한다. 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 제3 폴리펩타이드, 등의 지칭이 편의를 위한 것이고 "제1 폴리펩타이드"에 관한 요소 및 "제2 폴리펩타이드"에 관한 것들이 그 요소가 단지 참고 및 관례를 위하여, 전형적으로 그 특정 폴리펩타이드에 대한 추가 요소 또는 단계에서 제1 또는 제2로서 지칭되는 상이한 폴리펩티드 상에 있음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 CAR은 전사체에서, CAR을 인코딩하는 핵산이 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRE) 또는 하나 이상의 프로테아제 절단 펩타이드를 인코딩하는 핵산에 의해 분리되는 동일한 전사체 하에 T 세포 특이적 프로모터 또는 일반 프로모터 하에서 발현된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개 CAR을 인코딩하고 여기서 제1 CAR은 제1 항원에 결합할 수 있는 제1 세포외 항원 결합 도메인, 및 공-자극 도메인 (예를 들면 CD27, CD28, OX40, ICOS, 및 4-1BB)이 아닌 제1 세포내 신호전달 도메인 (예를 들면 CD3ζ 신호전달 도메인)을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 제2 세포외 항원 결합 도메인, 및 제2 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 예를 들어, 공-자극 분자의 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 또는 제2 항원은 HER2이고 다른 항원은 PSCA, PSMA, BCMA, VEGF이다. 특정 구현예에서, 제1, 제2, 또는 양쪽 세포외 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 단편 (예를 들면, scFv), 예를 들면, PSCA, PSMA, 또는 BCMA에 특이적인 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 또는 제2 세포외 항원 결합 도메인은 수용체, 예를 들면 VEGF에 대한 수용체, 즉, VEGFR이다.
추가의 서열
CAR은 하나 이상의 추가의 폴리펩타이드 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 여기에서 그러한 도메인은, 비제한적으로, 신호 서열; 에피토프 태그; 친화성 도메인; 및 존재 또는 활성이, 예를 들어 항체 검정에 의해 또는 검출가능한 신호를 생산하는 폴리펩타이드이기 때문에 검출될 수 있는 폴리펩타이드 (검출가능한 마커)를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 양태 또는 구현예 중 임의의 것에 대하여 추가의 도메인의 비-제한 예는 하기 기재된 경우에 하기 서열들 중 임의의 것에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함한다: 신호 서열, 에피토프 태그, 친화성 도메인, 또는 검출가능한 신호를 생산하는 폴리펩타이드.
대상체 CAR에서, 예를 들면, 대상체 CAR의 제1 폴리펩타이드에서 사용에 적합한 신호 서열은 자연-발생 신호 서열, 합성 (예를 들면, 인조) 신호 서열, 등을 포함하는 임의의 진핵 신호 서열를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 신호 서열은 CD8 신호 서열 (서열번호:72)일 수 있다.
적합한 에피토프 태그는, 비제한적으로, 혈구응집소 (HA; 예를 들면, YPYDVPDYA; 서열번호:73); FLAG (예를 들면,DYKDDDDK; 서열번호:74); c-myc (예를 들면, EQKLISEEDL; 서열번호:75), 및 기타 등등을 포함한다.
친화성 도메인은 식별 또는 정제에 유용한 결합 파트너, 예를 들면, 예컨대 고형 지지체에 부동화된 것과 상호작용할 수 있는 펩타이드 서열을 포함한다. 다중 연속 단일 아미노산, 예컨대 히스티딘을 인코딩하는 DNA 서열은, 발현된 단백질에 융합된 때, 수지 컬럼, 예컨대 니켈 세파로스에 고 친화성 결합에 의한 재조합 단백질의 1단계 정제에 사용될 수 있다. 예시적 친화성 도메인은 His5 (HHHHH; 서열번호:76), HisX6 (HHHHHH; 서열번호:77), c-myc (EQKLISEEDL; 서열번호:75), Flag (DYKDDDDK; 서열번호:74), Strep 태그 (WSHPQFEK; 서열번호:78), 혈구응집소, 예를 들면, HA 태그 (YPYDVPDYA; 서열번호:73), GST, 티오레톡신, 셀룰로스 결합 도메인, RYIRS (서열번호:79), Phe-His-His-Thr (서열번호:80), 키틴 결합 도메인, S-펩타이드, T7 펩타이드, SHCDR2 도메인, C-단부 RNA 태그, WEAAAREACCRECCARA (서열번호:81), 금속 결합 도메인, 예를 들면, 아연 결합 도메인 또는 칼슘 결합 도메인 예컨대 칼슘-결합 단백질로부터의 것들, 예를 들면, 칼모듈린, 트로포닌 C, 칼시뉴린 B, 미오신 경쇄, 리커버린, S-모듈린, 비시닌, VILIP, 뉴로칼신, 히포칼신, 프레퀘닌, 칼트락틴, 칼페인 대형-서브유닛, S100단백질, 파발부민, 칼빈딘 D9K, 칼빈딘 D28K, 및 칼레티닌, 인테인, 비오틴, 스트렙타비딘, MyoD, Id, 류신 지퍼 서열, 및 말토스 결합 단백질을 포함한다.
적당한 검출가능한 신호-생산 단백질은 예를 들면, 형광성 단백질; 산물로서 검출가능한 신호를 생성하는 반응을 촉매화시키는 효소; 및 기타 등등을 포함한다.
적합한 형광성 단백질은, 비제한적으로, 녹색 형광성 단백질 (GFP) 또는 이의 변이체, GFP의 청색 형광성 변이체 (BFP), GFP의 청록색 형광성 변이체 (CFP), GFP의 황색 형광성 변이체 (YFP), 향상된 GFP (EGFP), 향상된 CFP (ECFP), 향상된 YFP (EYFP), GFPS65T, 에메랄드(Emerald), 토파즈(Topaz) (TYFP), 베누스(Venus), 시트린(Citrine), mCitrine, GFPuv, 탈안정화된 EGFP (dEGFP), 탈안정화된 ECFP (dECFP), 탈안정화된 EYFP (dEYFP), mCFPm, 세룰린(Cerulean), T-Sapphire, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-단량체, J-Red, 이량체2, t-이량체2(12), mRFPl, 포실로포린, 레닐라(Renilla) GFP, 몬스터(Monster) GFP, paGFP, 캐데(Kaede) 단백질 및 고조 단백질, B-피코에리트린, R-피코에리트린 및 알로피코시아닌을 포함하는 피코빌리단백질 및 피코빌리단백질 컨쥬게이트를 포함한다. 형광성 단백질의 다른 예는 mHoneydew, mBanana, mOrange, dTomato, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrapel, mRaspberry, mGrape2, mPlum (Shaner 등. (2005) Nat. Methods 2:905-909), 및 기타 등등을 포함한다. 예를 들면, Matz 등 (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973에서 기재된 대로, 화충류 종으로부터 다양한 형광성 및 유색 단백질 중 임의의 것은 사용에 적합하다.
적합한 효소는, 비제한적으로, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 베타-갈락토시다제 (GAL), 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 베타-N-아세틸글루코사미니다제, β-글루쿠로니다제, 인버타제, 크산틴 옥시다제, 반딧불이 루시퍼라제, 글루코스 옥시다제 (GO), 및 기타 등등을 포함한다.
인식 및/또는 제거 도메인
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 중 임의의 것은 본원에 제공된 CAR 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산의 일부로서, 또는 이와 별도로 인식 또는 제거 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 그래서, 본원에 제공된 CAR 중 임의의 것은 인식 또는 제거 도메인을 포함할 수 있다. 인식 또는 제거 도메인은 T 세포 및/또는 NK 세포에서 발현되지만 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자에서 발현되지 않는다.
일부 구현예에서, 인식 또는 제거 도메인은 단순 포진 바이러스-유래된 효소 티미딘 키나제 (HSV-tk) 또는 유도가능한 카스파제-9에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 또는 제거 도메인은, 예를 들어 미국 특허 8,802,374에서 개시된 대로 변형된 내인성 세포-표면 분자를 포함할 수 있다. 변형된 내인성 세포-표면 분자는 임의의 세포-표면 관련된 수용체, 리간드, 당단백질, 세포 유착 분자, 항원, 인테그린, 또는 변형되는 분화의 클러스터 (CD)일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 내인성 세포-표면 분자는 절두된 티로신 키나제 수용체이다. 일 양태에서, 절두된 티로신 키나제 수용체는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리 (예를 들면, ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4)의 구성원이다. 일부 구현예에서, 인식 도메인은 EGFR 구성원의 세포외 도메인을 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 도메인은 EGFR 패밀리 구성원의 적어도 20개 연속 아미노산, 또는 예를 들어, EGFR 패밀리 구성원의 20 내지 50개 연속 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 서열번호:82는 EGFR 구성원의 세포외 도메인을 인식하는 항체에 의해 결합된 적절한 조건에 의해, 그리고 적절한 조건 하에서 인식되는 예시적 폴리펩타이드이다. 그러한 세포외 EGFR 에피토프는 본원에 eTag로서 때때로 지칭된다. 실례적 구현예에서, 그러한 에피토프는 상업적으로 이용가능한 항-EGFR 단클론성 항체에 의해 인식된다.
EGFR, ErbB1 및 HER1로서 또한 알려진, 상피 성장 인자 수용체는 세포외 리간드의 상피 성장 인자 패밀리의 구성원을 위한 세포-표면 수용체이다. EGFR 활성에서의 변경은 특정 암에 연루되었다. 일부 구현예에서, 인간 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 포함하는 EGFR 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자는 막 원위 EGF-결합 도메인 및 세포질성 신호전달 꼬리를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열의 제거에 의해 작제되지만, 항-EGFR 항체에 의해 인식된 세포외 막 근위 에피토프를 보유한다. 바람직하게는, 항체는 알려진, 상업적으로 이용가능한 항-EGFR 단클론성 항체, 예컨대 세툭시맙, 마투주맙, 네시투무맙 또는 파니투무맙이다.
다른 이들은 항-비오틴 마이크로비드와 조합으로 면역자성 선택에 비오틴화된-세툭시맙의 적용이 EGFRt-함유 작제물로 렌티바이러스적으로 형질도입된 T 세포를 세포 제조물에 대한 관찰가능한 독성 없이 집단의 2%만큼 낮은 것부터 90% 초과 순도까지 성공적으로 농축시키는 것을 보여주었다. 더욱이, 다른 이들은 이 불활성 EGFR 분자의 구성적 발현이 동위적으로 발현된 키메라 항원 수용체 (CAR), CD19R에 의해 지시된 대로 T 세포 표현형 또는 효과기 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다. 이밖에도, 다른 이들은 유세포 분석을 통해서, EGFR이 마우스에서 T 세포 생착을 위한 생체내 추적 마커로서 성공적으로 활용됨을 보여주었다. 더욱이, EGFR은 Erbitux® 매개된 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 경로를 통해서 자살 유전자 잠재성을 갖는 것으로 입증되었다. 본 개시내용의 발명자들은 렌티바이러스성 벡터를 사용하여 PBMC에서 eTag를 성공적으로 발현시켰고, 세툭시맙에 노출된 PBMC에 의한 시험관내 eTag의 발현이 PBMC에 효과적 제거 기전을 제공함을 알아내었다. 그래서, EGFR은 비-면역원성 선택 도구, 추적 마커, 및 면역치료적 잠재성을 갖는 형질도입된 T 세포를 위한 자살 유전자로서 사용될 수 있다. EGFR 핵산은 당업계에서 잘 알려진 수단에 의해 또한 검출될 수 있다.
본원에 제공된 일부 구현예에서, EGFR은 CAR을 또한 포함하는 단일 폴리펩타이드의 부분으로서 발현된다. 일부 구현예에서, EGFR 인식 도메인을 인코딩하는 아미노산 서열은 절단 신호 및/또는 리보솜 스킵 서열에 의해 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 아미노산 서열로부터 분리될 수 있다. 리보솜 스킵 및/또는 절단 신호는 당업계에서 알려진 임의의 리보솜 스킵 및/또는 절단 신호일 수 있다. 이론에 의해 제한됨 없이, 리보솜 스킵 서열은, 예를 들어 (본원에 2A-1로서 또한 지칭된) T2A (서열번호:83)일 수 있다. 이론에 의해 제한됨 없이, 절단 신호 및 리보솜 스킵 서열의 다른 예는 FMDV 2A (F2A); 말과 비염 A 바이러스 2A (E2A로서 약술됨); 돼지 테스코바이러스-1 2A (P2A); 및 토세아아시그나(Thoseaasigna) 바이러스 2A (T2A)를 포함한다. 일부 구현예에서, 인식 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 CAR과 동일한 전사체에 있을 수 있지만 내부 리보솜 진입 부위에 의해 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 분리될 수 있다.
본원에 경험적으로 예시된 대로 다른 구현예에서, 인식 도메인은 융합 폴리펩타이드의 부분으로서 발현될 수 있다. 그러한 작제물은, 특히 본원에 제공된 다른 "공간 절약" 요소와 조합으로, 별도 폴리펩타이드와 비교하여 RNA 게놈에서 더 적은 게놈 공간을 차지하는 이점을 제공한다.
서열의 재조합
특정 경우에, CAR, 예를 들면, CAR 도메인의 폴리펩타이드의 서열은 부위-특이적 재조합 기술의 사용을 통해서 세포에서 재배열 또는 결실될 수 있다. 특정 구현예에서, 특정한 CAR에 세포성 활성화-관련된 반응은 부위-특이적 재조합에 의해 변화될 수 있고, 예를 들면, 제1 활성화-관련된 반응을 유인하는 CAR의 제1 세포내 활성화 도메인은 제2 활성화-관련된 반응을 유인하는 제2 세포내 활성화 도메인에 대하여 교환될 수 있다. 당업자에 명백해질 바와 같이, 부위-특이적 재조합은 본원에 개시된 대로 CAR의 임의의 도메인 또는 서열을 임의의 다른 도메인 또는 서열과 교환하기 위해 세포에서 사용될 수 있다. 또한 당업자에 명백해질 바와 같이, 부위-특이적 재조합은 CAR의 임의의 도메인 또는 서열을 결실시키기 위해 세포에서 사용될 수 있다. 서열 및 도메인의 그러한 교환 및 절제는 당업계에서 알려지고, 예를 들면, Tone 등 (2013) Biotechnology and Bioengineering, 3219-3226에서 기재된 시그날로바디에서 도메인 스위칭을 참고하고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 개시된다. 생체내 부위-특이적 재조합을 수행하기 위한 기전 및 요구사항은 당업계에서 또한 잘 알려지고, 예를 들면, Grindley 등 (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605 및 Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA)을 참고하고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 편입된다.
CAR은 융합 단백질을 형성하기 위해 함께 상기 논의된 모든 상이한 도메인을 융합시킴으로써 생성되는 키메라 단백질이다. CAR은 본원에 논의된 대로 CAR의 상이한 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터에 의해 전형적으로 생성된다. 표적 세포에서 항원을 인식하고 이와 결합하도록 기능하는 본 발명의 ASTR은 조건부 활성이다. 구체적으로, ASTR은, 상응하는 야생형 단백질의 ASTR과 비교하면, 정상 생리학적 조건에서 덜한 활성 또는 비활성이고 표적항원과 결합에 대하여 종양 조건에서 활성이다.
종양 미세환경
고형 종양에서 암 세포는 암 세포의 성장 및 전이를 지원하기 위해 그들의 주변환경에서 종양 미세환경 (TME)을 형성할 수 있다. TME는 주변 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 다른 세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외 기질, 및 신생물성 형질전환을 촉진, 종양 성장 및 침습을 지원, 숙주 면역으로부터 종양을 보호, 치료적 내성을 조장, 및 휴면 전이가 번성할 수 있는 틈새를 제공할 수 있는 기계적 신호를 포함하는, 종양이 실재하는 세포성 환경이다. 종양 및 이의 주변 미세환경은 밀접하게 관련되고 지속적으로 상호작용한다. 종양은 세포외 신호를 방출하고, 종양 혈관신생을 촉진하고 말초 면역 관용을 유도함으로써 그들의 미세환경에 영향을 줄 수 있는 반면, 미세환경에서 면역 세포는 암성 세포의 성장 및 진화에 영향을 미칠 수 있다. Swarts 등 "Tumor Microenvironment Complexity: Emerging Roles in Cancer Therapy", Cancer Res, vol., 72, 2473-2480 페이지, 2012 참고.
TME는 종종 저산소성이다. 종양 덩어리가 확대함에 따라, 종양의 내부는 기존의 혈액 공급으로부터 멀리 떨어져 성장하고, 이는 TME에 산소를 충분히 공급하는데 어려움을 초래한다. 종양 환경에서 부분적 산소 압력은, 혈장에서 약 40 mm Hg로 부분적 산소 압력과 비교하면, 국소적으로 진전된 고형 종양의 50% 초과에서 5 mm Hg 미만이다. 대조적으로, 신체의 다른 부분들은 저산소성이 아니다. 저산소성 환경은, 뉴클레오타이드 절제 복구 및 미스매치 복구 경로 하향조절을 통해, 암 진행과 연관되는, 유전적 불안정성을 초래한다. 저산소증은 또한, 혈관신생을 유도하는, 저산소증-유도가능한 인자 I 알파 (HIF1-α)의 상향조절을 유발하고, 더 나쁜 예후 및 전이와 연관된 유전자의 활성화와 연관된다. Weber 등, "The tumor microenvironment," Surgical Oncology, vol. 21, pages 172- 177, 2012 및 Blagosklonny, "Antiangiogenic therapy and tumor progression," Cancer Cell, vol. 5, 13-17 페이지, 2004 참고.
이밖에도, 종양 세포는, 산소가 필요 없는, 락트산 발효로부터 생성된 에너지에 의존하는 경향이다. 그러므로, 종양 세포는 산소가 필요한 정상 호기성 호흡을 사용할 가능성이 적다. 락트산 발효 사용의 결말은, 전형적으로 어느 한쪽 중성 또는 약간 염기성인 신체의 다른 부분과 대조적으로, TME가 산성 (pH 6.5-6.9)이라는 것이다. 예를 들어, 인간 혈장은 약 7.4의 pH를 갖는다. Estrella 등, "Acidity Generated by the Tumor Microenvironment Drives Local Invasion," Cancer Research, vol. 73, 1524-1535 페이지, 2013 참고. TME에서 영양소 이용가능성은, 신체의 다른 부분에서 자리잡은 세포와 비교하면, 증식하는 암 세포의 상대적으로 높은 고 영양소 요구로 인해 또한 낮다.
추가로, TME는 또한 신체의 다른 부분에서 흔히 발견되지 않는 많은 별개의 세포 유형을 함유한다. 이들 세포 유형은 내피 세포 및 그들의 전구체, 혈관주위세포, 평활근 세포, 섬유아세포, 암종-연관된 섬유아세포, 근섬유아세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, T 및 B 림프구, 자연 살해 세포 및 항원 제시 세포 (APC) 예컨대 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다 (Lorusso 등, "The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis," Histochem Cell Biol, vol. 130, 1091-1103 페이지, 2008).
따라서, TME는 신체의 다른 부분의 것들과 상이한 적어도 몇몇 생리학적 조건, 예컨대 혈장내 생리학적 조건을 갖는다. TME는 신체의 다른 부분, 특히 혈장 (pH 7.4)보다 더 낮은 pH (산성)를 갖는다. TME는 신체의 다른 부분, 예컨대 혈장보다 더 낮은 산소의 농도를 갖는다. 또한, TME는 신체의 다른 부분, 특히 혈장보다 더 낮은 영양소 이용가능성을 갖는다. TME는 또한 신체의 다른 부분, 특히 혈장에서 흔히 발견되지 않는 일부 별개의 세포 유형을 갖는다.
실례적 구현예에서, 본 발명의 CAR은 야생형 생물학적 (즉 천연) 단백질, 예컨대, 예를 들어, 종양 치료를 위한 후보일 수 있는 포유류 생물 예컨대 마우스 또는 인간으로부터 단리된 야생형 또는 천연 항체로부터 생성된 조건부 활성 ASTR을 포함한다. 그러한 실례적 구현예에서 조건부 활성 ASTR은 TME, 예컨대 혈장 이외 신체의 부분에서 적어도 하나의 생리학적 조건 하에 천연 또는 야생형 생물학적 단백질보다 더 낮은 활성을 갖는 한편, TME에서 적어도 하나의 생리학적 조건 하에 천연 또는 야생형 생물학적 단백질보다 더 높은 활성을 갖는다. 그러한 조건부 활성 천연 또는 생물학적 단백질은 종양을 치료하기 위하여 TME에서 암 세포에 우선적으로 작용할 수 있고, 그래서 부작용을 일으킬 가능성이 더 적을 것이다. 항원이 TME에 노출되는 종양 세포의 표면에서 천연 또는 생물학적 단백질이 항원에 항체인 구현예에서, 조건부 활성 항체는 신체의 다른 부분, 예를 들면 비-TME에서 천연 또는 야생형 항체보다 항원에 더 낮은 친화성을 갖는 한편, TME에서 천연 또는 야생형 항체보다 항원에 더 높은 친화성을 갖는다. 그러한 조건부 활성 항체는 신체의 다른 부분에서 항원에 약하게 결합할 수 있거나 전혀 결합할 수 없지만, TME에서 항원에 더 큰 결합을 갖거나, 강력하고 단단히 결합한다.
슈도타이핑 요소
본원에 제공된 방법 및 조성물의 다수는 슈도타이핑 요소를 포함한다. 이종 외피 당단백질로 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 슈도타이핑은 전형적으로 바이러스의 친화성을 변경시키고 숙주 세포의 형질도입을 촉진시킨다. 본원에 사용된 경우에 슈도타이핑 요소는 표적 숙주 세포를 식별하고 결합시키는 하나 이상의 폴리펩타이드, 전형적으로 당단백질을 포함하는 "결합 폴리펩타이드", 및 레트로바이러스성 및 표적 숙주 세포 막의 융합을 매개하고, 이에 의해 레트로바이러스성 게놈이 표적 숙주 세포에 진입하게 하는 하나 이상의 "융합성 폴리펩타이드"를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 일부 구현예에서, 슈도타이핑 요소는 폴리펩타이드(들)/단백질(들)로서, 또는 폴리펩타이드(들)/단백질(들)을 인코딩하는 핵산 서열로서 제공된다.
일부 구현예에서, 슈도타이핑 요소는 고양잇과 내인성 바이러스 (RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스성 양쪽성 외피 단백질, 온코레트로바이러스성 에코트로픽 외피 단백질, 수포성 구내염 바이러스 외피 단백질 (VSV-G) (서열번호:85), 개코원숭이 레트로바이러스성 외피 당단백질 (BaEV) (서열번호:86), 쥣과 백혈병 외피 단백질 (MuLV)(서열번호:87), 인플루엔자 당단백질 HA 표면 당단백질 (HA), 인플루엔자 당단백질 뉴로미니다제 (NA), 파라믹소바이러스 홍역 외피 단백질 H, 파라믹소바이러스 홍역 외피 단백질 F, 및/또는 이들 외피 단백질 중 임의의 것의 기능적 변이체 또는 단편이다.
패키징 세포주/재조합 레트로바이러스성 입자의 제조 방법
본 개시내용은 포유류 패키징 세포 그리고 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 생산하는 패키징 세포주를 제공한다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 생산하는 세포주는 패키징 세포주로서 본원에 또한 지칭된다.
레트로바이러스성 입자를 제조하는 예시적 방법은 본원에, 예를 들어 본원에 실시예 섹션에서 제공된다. 그러한 방법은, 예를 들어, 4 플라스미드 패키징 시스템을 포함한다. 실례적 구현예에서, 4 플라스미드 패키징 시스템은 (i) gag/pol, (ii) rev, 및 (iii) 슈도타이핑 요소 예컨대 VSV-G를 인코딩하는 3 패키징 플라스미드를 포함한다. 4 플라스미드 패키징의 4번째 플라스미드는 게놈성 플라스미드이다. 추가 실례적 구현예에서, 게놈성 플라스미드는 자가-비활성화를 초래하는 3'LTR에서 결실이 들어있는 제3 세대 렌티바이러스성 발현 벡터이다.
패키징 세포주의 세포는 유착성 또는 현탁 세포일 수 있다. 예시적 세포 유형은 하기본원에 제공된다. 실례적 구현예에서, 패키징 세포주는 현탁 세포주, 즉 성장 동안 표면에 유착하지 않는 세포주일 수 있다. 세포는 화학적으로-정의된 배지 및/또는 무혈청 배지에서 성장될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 유착성 세포주에서 유래된 현탁 세포주일 수 있고, 예를 들어, HEK293 세포주는 당업계에서 알려진 방법에 따라 현탁-적응된 HEK293 세포주를 생성하기 위한 조건에서 성장될 수 있다. 패키징 세포주는 화학적으로 정의된 배지에서 전형적으로 성장된다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주 배지는 혈청을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주 배지는 당업계에서 알려진 대로, 혈청 대체물을 포함할 수 있다. 실례적 구현예에서, 패키징 세포주 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 그러한 배지는 미국 식품의약국 (FDA)의 현행 우수제조관리기준 (CGMP) 규정에 따라 제조된 화학적으로 정의된, 무혈청 제형일 수 있다. 패키징 세포주 배지는 무이종성이고 완전할 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주 배지는 생체외 세포 처리, 예컨대 FDA 510(k) 승인된 장치에서 사용을 위하여 감독 기관에 의해 제거되었다.
따라서, 일 양태에서, A. 무혈청 배지내 현탁액에서 패키징 세포를 배양시키는 단계로, 패키징 세포가 복제 불능 레트로바이러스성 입자의 패키징가능한 RNA 게놈, REV 단백질, gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 및 슈도타이핑 요소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계; 및 B. 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자를 무혈청 배지로부터 수확하는 단계를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 제조 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 CAR을 포함할 수 있고, 핵산 서열은 본원에 제공된 임의의 CAR 구현예를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 제1 항원-특이적 표적화 영역, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 항원-특이적 표적화 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인의 예는 본원에 다른 곳에 개시된다. 일부 구현예에서, 패키징가능한 RNA 게놈은 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 표적 세포가 T 세포 또는 NK 세포인 일부 구현예에서, 표적 세포에서 활성인 프로모터는 본원에 다른 곳에 개시된 대로, T 세포 또는 NK 세포에서 활성이다.
본 개시내용의 일부 양태는 세포, 실례적 예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 위하여, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자, 예컨대 렌티바이러스를 만들기 위한 패키징 세포로서 사용되는 포유류 세포를 포함하거나 상기이다.
본 개시내용의 일부 양태는 세포, 실례적 예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 위하여 바이러스, 예컨대 렌티바이러스를 만들기 위한 패키징 세포로서 사용되는 포유류 세포를 포함하거나 상기이다. 다양한 세포 중 임의의 것은 본 발명에 따라 바이러스, 또는 바이러스 입자, 예컨대 슈도타이핑된 재조합 레트로바이러스성 입자의 시험관내 생산을 위하여 선택될 수 있다. 진핵 세포, 특히 인간, 유인원, 갯과, 고양잇과, 말과 및 설치류 세포를 포함하는 포유류 세포가 전형적으로 사용된다. 실례적 예에서, 세포는 인간 세포이다. 추가 실례적 구현예에서, 세포는 무한으로 생식하고, 그러므로 불멸이다. 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있는 세포의 예는 NIH 3T3 세포, COS 세포, Madin-Darby 갯과 신장 세포, 인간 배아 293T 세포 및 그러한 세포에서 유래된 임의의 세포, 예컨대 293T 세포에서 유래되는 gpnlslacZ φNX 세포를 포함한다. 고도로 형질감염가능한 세포, 예컨대 인간 배아 신장 293T 세포는 사용될 수 있다. "고도로 형질감염가능한"은 세포의 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 80%가 도입된 DNA의 유전자를 발현시킬 수 있음을 의미한다.
적합한 포유류 세포는 일차 세포 및 불멸화된 세포주를 포함한다. 적합한 포유류 세포주는 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 설치류 (예를 들면, 마우스, 랫트) 세포주, 및 기타 등등을 포함한다. 적합한 포유류 세포주는, 비제한적으로, HeLa 세포 (예를 들면, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), CHO 세포 (예를 들면, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예를 들면, ATCC 번호 CRL-1573), 베로 세포, NIH 3T3 세포 (예를 들면, ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예를 들면, ATCC 번호 CCLlO), PC12 세포 (ATCC 번호 CRLCDR1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC 번호 CRLCDR1651), RATl 세포, 마우스 L 세포 (ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (ATCC 번호 CRLCDR1573), HLHepG2 세포, Hut-78, Jurkat, HL-60, NK 세포주 (예를 들면, NKL, NK92, 및 YTS), 및 기타 등등을 포함한다.
유전적으로 변형된 T 세포 및 NK 세포
본원에 방법 및 조성물의 구현예에서, 자체가 본 발명의 별도 양태인 유전적으로 변형된 림프구가 생산된다. 그러한 유전적으로 변형된 림프구는 유전적으로 변형된 및/또는 형질도입된 림프구일 수 있다. 일 양태에서, 본원에 제공된 혈액 또는 이의 구성요소에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 임의의 양태에 따른 방법을 사용하여 만들어진 유전적으로 변형된 T 세포 또는 NK 세포가 본원에 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포는 제1 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 유전적으로 변형되었다. 실례적 구현예에서, 제1 폴리펩타이드는 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CAR일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포는 CAR일 수 있는 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포는 표면에서 슈도타이핑 요소를 추가로 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 T 세포 또는 NK 세포의 CAR 및 슈도타이핑 요소는 본원에 개시된 양태, 구현예, 또는 하위구현예 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 림프구는, HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 폴리펩타이드를 발현시키도록 유전적으로 변형된 림프구 예컨대 T 세포 또는 NK 세포이다. 본원에 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, NK 세포는 NKT 세포이다. NKT 세포는 CD3을 발현시키고 αβ T-세포 수용체를 전형적으로 공발현시킬 뿐만 아니라, NK 세포 (예컨대 NK1.1 또는 CD56)와 전형적으로 연관되는 다양한 분자성 마커를 발현시키는 T 세포의 서브세트이다.
본 개시내용의 변형된 림프구는 본원에 제공된 항-HER2 CAR을 인코딩하는 전형적으로 핵산인 재조합 DNA 방법에 의해 림프구에 도입된 이종 핵산 서열을 소유한다. 예를 들어, 이종 서열은 실례적 구현예에서 본원에 제공된 림프구를 형질도입하는 방법 동안 림프구에 삽입된다. 이종 핵산은 림프구 내에서 발견되고 일부 구현예에서 변형된 림프구의 게놈으로 통합되거나 통합되지 않는다.
실례적 구현예에서, 이종 핵산은 유전적으로 변형된 림프구의 게놈으로 통합된다. 그러한 림프구는, 실례적 구현예에서, 재조합 레트로바이러스성 입자를 활용하는, 본원에 제공된 림프구를 형질도입하는 방법을 사용하여 생산된다. 그러한 재조합 레트로바이러스성 입자는 적어도 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 전형적으로 포함하는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 자체가 본 개시내용의 또 다른 양태를 형성하는 유전적으로 변형된 림프구를 생산하는데 사용될 수 있는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 및 복제 불능 레트로바이러스성 입자의 게놈에서 인코딩된 폴리뉴클레오타이드의 다양한 구현예가 본 개시내용의 다른 섹션에서 본원에 제공된다.
예를 들어, HER2를 결합시키기 위한 CAR을 인코딩하는 본원에 제공된 핵산 중 임의의 것을 포함하는, 본 개시내용의 유전적으로 변형된 림프구는 신체 외부에서 단리될 수 있다. 예를 들어, 그러한 림프구는 본원에 제공된 대로 생체외 형질도입에 사용되는 배지 및 다른 용액에서 발견될 수 있다. 림프구는 본원에 제공된 방법에서 대상체로부터 수집되고, 그 다음 형질도입의 방법 동안 유전적으로 변형되는 혈액에서 유전적으로 변형되지 않은 형태로 존재할 수 있다.
일부 양태에서, 용액, 예컨대 주입 용액, 실례적 구현예에서 동결보존 전달 용액, 또는 다른 전달 용액에서 현탁된 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 집단을 포함하는 전달 현탁액, 세포 요법 현탁액, 주입 현탁액, 세포 분산액, 또는 세포 현탁액이 본원에 제공되고, 여기서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 본원에 제공된 HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 실례적 구현예에서, 그러한 조성물은 세포 요법, 전형적으로 CAR-T 요법을 위하여 포유류 (예를 들면 인간) 대상체에 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 전달을 위한 약학적 또는 생물학적-등급 전달 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 현탁액, 세포 요법 현탁액, 주입 현탁액, 세포 현탁액, 또는 세포 분산액은 세포 전달, 및 실례적 구현예에서, 동결보존에 적합한 부형제를 포함하는 용액에 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 하기의 하나 이상, 또는 모두를 포함한다: 글루코스, 염화나트륨, 인간 알부민 용액, 주사용 덱스트란 40, 디메틸술폭시드, 글루콘산나트륨, 아세트산나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 나트륨-N-아세틸트립토파네이트, 나트륨 카프릴레이트, 알루미늄, 또는 세포 요법 현탁액 또는 분산액에 대하여 알려진 농도의 물. 그러한 세포 현탁액 또는 관련된 조성물에 사용되는 용액은 전형적으로 기저 배지 예컨대 식염수 또는 CSB, 및 임의로 본원에 개시된 대로 동결보존제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본원에 다른 곳에서 개시된 대로, 동결보존제 용액을 포함할 수 있다. 실례적 구현예에서, 동결보존제 용액은 동결보존제 주입 용액이며, 이는 세포가 동결되고 그 다음 해동 시 대상체에 주입될 수 있는 동결보존제이다. 예를 들어, 동결보존제 주입 용액은 20-40% 덱스트로스, 0.5-2% 덱스트란, 20-60% 인간 혈청 알부민, 5-15% DMSO, 예를 들어 Plasma-Lyte A (Baxter International), 덱스트로스, 및 염화나트륨의 조성을 갖는 비-발열성 IV 결정양 용액을 포함할 수 있다. 각 1000 mL의 Plasma-Lyte A는 함유하고, 그래서 본원에 동결보존제 주입 용액을 위한 기본 배지 중 괄호내 범위, 5.26 g (4-6 g) 염화나트륨, 370 mg (350-450 mg) 염화칼륨, 300 mg (200-400 mg) 염화마그네슘, 3.68 (3-4) g 및 5.02 g (4.5-5.5 g) 의 아세트산나트륨 및 글루콘산나트륨 각각을 가질 수 있고; 이는 140 mmol/L 나트륨, 5 mmol/L 칼륨, 1.5 mmol/L 마그네슘, 98 mmol/L 염화물, 그리고 27 mmol/L 및 23 mmol/L의 아세테이트 및 글루코네이트, 각각과 동등하다. 일부 구현예에서, 동결보존제 주입 용액은 CryoStor 냉동 배지이다. CAR-T 세포가 해동 및 대상체에의 임의적 전달을 위하여 동결보존될 수 있는 다른 예시적 동결보존제 주입 용액은 Cryostor CS5; 31.25% Plasma-Lyte A, 31.25% 덱스트로스, 0.45% NaCl, 7.5% DMSO, 1% 덱스트란 40, 및 5% HSA; 31.25% Plasma-Lyte A, 31.25% 덱스트로스, 0.45% NaCl, 7.5% DMSO, 1% 덱스트란 40, 및 5% HSA; 50% HSA, 40% PlasmaLyte, 및 10% DMSO; 및 Plasma-Lyte A, 5% HSA, 및 10% DMSO를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법 현탁액, 주입 현탁액, 세포 분산액, 또는 세포 현탁액은 세포를 고정하기 위하여, 특히 세포를 냉동 및 해동하기 위하여 구성되거나 적응된 멸균 컨테이너 (즉 극저온 컨테이너), 예컨대 세포 동결보존제 백 (예를 들면 Corning Inc. (Glendale, AZ), CryMACS™ (Miltenyl Biotec, San Diego, CA), CryStore™ 냉동 백 (Origen, Austin, TX), KryoSure™ 동결보존제 백 (Saint Gobain, Gaithersburg, MD))에 있고, 이는 세포가 냉동되지 않은 때 (예를 들면 이들이 해동된 후) 주입 백의 역할을 또한 할 수 있다. 실례적 구현예에서, 컨테이너, 예를 들면 주입 백은 대상체를 식별하기 위한 정보, 예컨대 환자 식별 정보를 포함한다. 일부 구현예에서, 백은 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA) 주입 백이다. 일부 구현예에서, 컨테이너 (예를 들면 백)은 전달 용액, 예컨대 동결보존제 주입 용액에서 유전적으로 변형된 세포의 부피를 포함한다. 그러한 부피는 범위의 저점으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 및 25 ml 내지 범위의 고점으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 및 100 ml, 예를 들어, 5 내지 100, 10 내지 50, 10 내지 30, 30 내지 50, 또는 10 내지 25 ml 수 있다. 일부 구현예에서, 컨테이너 (예를 들면 백)은 1x104 내지 1x1010, 또는 1x104 내지 1x109, 또는 1x104 내지 1x108, 또는 1x104 내지 1x1010, 또는 1x104 내지 1x109, 또는 1x104 내지 1x108 세포를 함유한다. 유전적으로 변형된 림프구는 이들이 유전적으로 변형된 후 이들이 대상체에 도입 또는 재도입된 후 대상체 내부에서 발견될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포 투여하기에 관한 추가 상세는 본원에 제공된다.
일 양태에서 이의 게놈내, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 형질도입된 및/또는 유전적으로 변형된 T 세포 또는 NK 세포가 본원에 제공된다. 전사 단위는 본원에 제공된 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산 중 임의의 것을 인코딩할 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에서, 폴리펩타이드의 발현은 제어 요소에 의해 조절될 수 있다.
조건부 활성화가능한 세포를 생성하는 방법
본 개시내용은 조건부 활성화가능한 세포의 생성 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로, 본 개시내용의 조건부 활성 CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터 (예를 들면 플라스미드 또는 바이러스), 또는 RNA (예를 들면, 시험관내 전사된 RNA)로 포유류 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 유전적으로 변형된 세포는 HER2의 존재 하에서 조건부 활성화가능하다. 유전적 변형은 생체내, 시험관내, 또는 생체외 실시될 수 있다. 세포는 전형적으로 면역 세포 (예를 들면, T 림프구, T-헬퍼 세포, 또는 NK 세포), 줄기 세포, 전구 세포, 등이다. 실례적 구현예에서, 세포는 T 세포이다.
일부 경우에, 유전적 변형은 생체외 실시될 수 있다. 예를 들어, T 림프구, 줄기 세포, T-헬퍼 세포, 또는 NK 세포는 개체로부터 수득되고; 개체로부터 수득된 세포는 유전적으로 변형되어 본 개시내용의 CAR을 발현시킨다. 유전적으로 변형된 세포는 HER2의 존재 하에서 조건부 활성화가능하다. 일부 경우에, 유전적으로 변형된 세포는 생체외 활성화된다. 다른 경우에, 유전적으로 변형된 세포는 개체 (예를 들면, 세포가 수득된 개체)에 도입되고; 유전적으로 변형된 세포는 생체내 활성화된다. 예를 들어, HER2가 개체에서 세포의 표면에 존재하는 경우, 항원을 투여할 필요가 없다. 유전적으로 변형된 세포는 개체에서 세포의 표면에 존재하는 항원과 접촉하고 유전적으로 변형된 세포는 활성화된다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포가 T 림프구인 경우, 유전적으로 변형된 세포는 CAR이 결합하는 이의 표면에서 HER2를 발현시키는 세포를 향하여 세포독성을 나타낼 수 있다.
일 양태에서, HER2를 조건부 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법이 본원에 제공되고, 여기서 본 방법은
a) 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 농축시켜 단리된 혈액으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 PBMC를 단리시키는 단계;
b) 효과적 조건 하에서 농축된 PBMC의 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 단계;
c) 효과적 조건 하에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자로 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키고, 이에 의해 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산하는 단계로, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 각각이 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 레트로바이러스성 게놈을 포함하고, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 본원에 제공된 임의의 구현예에 따라 CAB-CAR을 인코딩하는, 단계; 및
d) 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키고, 이에 의해 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계
를 포함한다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 확장된 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 수확하는 단계를 포함한다. 상기 양태의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, PBMC를 농축하기 전에, 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 본 방법은 추가로 수확된, 확장된 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에 도입하는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 이들이 대상체에 도입되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 14 일후 대상체에서 존재한다.
또 다른 양태에서, HER2를 조건부 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법이 본원에 제공되고, 여기서 본 방법은
a) 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 농축시켜 단리된 혈액으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 PBMC를 단리시키는 단계;
b) T 세포 및/또는 NK 세포를 합성 RNA로 형질감염시키고, 이에 의해 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산하는 단계로, 합성 RNA가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 본원에 제공된 임의의 구현예에 따라 CAB-CAR을 인코딩하는, 단계; 및
c) 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키고, 이에 의해 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계
를 포함한다.
혈액 수집
PBMC를 함유하는 혈액은 당업계에서 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 대상체로부터 수집 또는 수득될 수 있다. 예를 들어, 혈액은 혈액 및/또는 PBMC의 샘플이 수집되는 정맥천자 또는 임의의 다른 혈액 수집 방법에 의해 수집될 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 아래 논의된 대로 분리반출법에 의해 수득될 수 있다.
PBMC의 농축
조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법에서, T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 농축 단계에서 혈액 샘플의 다른 구성요소로부터 단리된다. 다른 혈액 구성요소 및 혈액 세포로부터 PBMC의 농축는 당업계에서 알려진 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어, 분리반출법, 및/또는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, Ficoll-Paque (GE Healthcare)가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체로부터 혈액을 채집하고, 특정한 세포 유형 (예컨대, 예를 들어, PBMC)을 분류제거하는 기구를 통해서 혈액을 통과시키고, 나머지를 다시 대상체로 반환하는 자동화된 분리반출법 분리기가 사용된다. 밀도 구배 원심분리는 분리반출법 후에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 백혈구감소 필터 장치를 사용하여 농축 및 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 자성 비드 활성화된 세포 분류하기는 그 다음 세포성 표현형 (즉 양성 선택)에 따라 PBMC, 예컨대, 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포로부터 특이적 세포 집단을 정제하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 PBMC로부터 제거될 수 있다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가일 수 있다. PBMC 농축 공정 도중, 하나 이상의 세정은 당업계에서 알려지는 대로 수행될 수 있고, 다음에 농축된 PBMC는 단리되고 그 다음 활성화된다. 세정 용액은 혈액 및/또는 PBMC를 세정하는데 적합한 임의의 용액 수 있다. 당업계에서 알려진 방법에 따라, 단리된 PBMC는 T 세포 및/또는 NK 세포를 배양시키는데 사용된 임의의 적합한 기초 배양 배지에서 재현탁될 수 있다. 일부 구현예에서, 배지는 HSA, 인간 AB+ 혈청, 대상체에서 유래된 혈청 및/또는 혈청 대체물로 보충될 수 있다.
PBMC의 활성화
본원에 제공된 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법은 전형적으로 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 활성화 제제로 단리된 PBMC 활성화 또는 자극하기의 단계를 포함한다. 활성화는 어느 한쪽 신선하게 단리된 PBMC 또는 이전에 동결보존된 PBMC에서 수행될 수 있다. 동결보존된 세포가 사용되는 경우에서, 세포는 사용에 앞서 개발된 프로토콜을 사용하여 해동될 수 있다.
배지는 활성화, 예컨대 생체외 공정을 위하여 당업계에서 알려진 것들 (비-제한 예로서, X-VIVO 15 (Lonza) 또는 CTS 배지 (Thermo Fisher)) 동안 전형적으로 존재한다. 일부 구현예에서, 배지는 HSA, 인간 AB+ 혈청, 대상체에서 유래된 혈청, 및/또는 혈청 대체물로 보충될 수 있다. 실례적 구현예에서, 배지는 혈청 대체물, 예컨대 CTS 혈청 대체물 (Thermo Fisher)로 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 배지는 HSA, 인간 AB+ 혈청, 대상체에서 유래된 혈청 및/또는 혈청 대체물로 보충될 수 있다.
하나 이상의 활성화 제제의 임의의 조합은 배지에 첨가되어 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산할 수 있다. 반응 혼합물은 전형적으로 형성되어 활성화를 수행한다. 일부 구현예에서, 반응 혼합물은 하나 이상의 활성화 제제를 배지에 첨가함으로써 형성될 수 있다. 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것에서, 하나 이상의 활성화 제제는 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포가 생산되도록 하는 유효량으로 사용된다.
일부 구현예에서, 활성화 제제는 T-세포 자극 또는 공-자극 분자, T 세포 사이토카인, 또는 임의의 다른 적합한 미토겐 (예를 들면, 테트라데카노일 포르볼 아세테이트 (TPA), 파이토헤마글루티닌 (PHA), 콘카나발린 A (conA), 지질다당류 (LPS), 포케위드 미토겐 (PWM)), T-세포 자극 또는 공-자극 분자에 대한 자연 리간드, 포스포-항원, 또는 아미노비스포스포네이트, 예컨대 졸레드로네이트를 표적하거나 이에 결합하는 폴리펩타이드 또는 항체 (예를 들면 항-CD2, 항-CD3, 및/또는 항-CD28) 또는 이의 기능적 단편일 수 있다. 다양한 항체 및 이의 기능적 단편은 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화 또는 자극하는 것으로 당업계에서 알려진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항체 또는 이의 기능적 단편은 고체 표면, 예컨대 비드에서 부동화될 수 있다.
T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입
본원에 제공된 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법은 전형적으로 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포 형질전환 또는 형질도입의 단계를 포함한다. 그러한 방법의 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 발현 벡터 예컨대 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자와 생체외 접촉되어 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전적으로 변형시킨다. 이론에 의해 제한됨 없이, 접촉의 기간 동안 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합하여 그 지점에 레트로바이러스성 및 숙주 세포 막이 융합하기 시작한다. 그 다음, 형질도입의 공정을 통해서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자로부터 유전성 물질은 T 세포 및/또는 NK 세포에 진입하고 전형적으로 숙주 세포 DNA에 편입된다. 따라서, 그러한 방법은 형질도입에 의해 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자, 예컨대 복제 불능 재조합 렌티바이러스성 입자로 생체외 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 방법이 당업계에서 알려진다. 예시적 방법은, 예를 들면, Wang 등 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper 등 (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 등 (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri 등 (2003) Blood. 102(2): 497-505에서 기재된다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자와 접촉될 수 있다. 실례적 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 복제 불능 재조합 렌티바이러스성 입자와 접촉될 수 있다.
형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장
본원에 제공된 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법의 실례적 구현예에서, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포는 수확 전에 확장된다. 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것에서, 배지는 활성화 및 형질도입을 위하여 존재하고 형질도입후 추가로 첨가 또는 교환되어, 확장을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 배지는 활성화 동안 형성된 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 확장에 사용된 배지는 전형적으로 활성화 및 형질도입에서 사용된 동일한 기본 배지, 예컨대 생체외 공정을 위하여, 특히 T 세포 및/또는 NK 세포를 위하여 당업계에서 알려진 것들을 포함한다 (비-제한 예로서, X-VIVO 15 (Lonza) 또는 Optimizer CTS 배지 (Thermo Fisher)). 일부 구현예에서, 배지는 HSA, 인간 AB+ 혈청, 대상체에서 유래된 혈청, 및/또는 혈청 대체물, 예컨대 CTS 혈청 대체물 (Thermo Fisher)로 보충될 수 있다. 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7, 또는 IL-15, 또는 HSA에서 발견된 것들은 활성화, 형질도입, 및 확장 이전, 동안, 및/또는 이후 배지에 첨가될 수 있다. 세포 확장은 특정 일수 동안 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 확장은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21 일 동안 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 확장은 범위의 저점으로 4, 5, 6, 7, 또는 8 일 내지 범위의 고점으로 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21 일 동안 수행될 수 있다. 특정 실례적 구현예에서, 확장은 6 내지 12 일, 또는 8 내지 10 일 동안 수행될 수 있다.
세포 수확하기
본원에 제공된 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법에서는 전형적으로 확장하기 후에 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 수확하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포는 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 수확하기 동안 농축 또는 수집될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 당업계에서 알려진 임의의 적합한 세정 용액을 사용하여 수확하기 동안 1회 이상 세정될 수 있다. 수확하기의 끝에, T 세포 및/또는 NK 세포는 당업계에서 알려진 임의의 적합한 배지에서 재현탁될 수 있다. 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것에서, 확장된 T 세포 및/또는 NK 세포의 수확하기는 확장 완료 기준에 근거하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 확장 완료 기준은 락테이트 농도, 세포 밀도, 또는 확장에서의 일수일 수 있다.
일부 구현예에서, 수확된 세포는 대상체에 도입, 다시 도입, 재도입, 주입, 또는 재주입될 수 있다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 대상체에 재도입 전에 하기 기재된 대로 동결보존될 수 있다. 실례적 구현예에서, 수확된 세포는 세포를 먼저 동결보존시킴 없이 대상체에 도입, 다시 도입, 재도입, 주입, 또는 재주입될 수 있다. 대상체는 혈액이 수집된 전형적으로 동일한 대상체이다.
본 개시내용 내내, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포는 생체외 형질도입 동안 세포에 편입되는 핵산들 중 적어도 하나를 보유하는 형질도입된 세포의 자손을 포함한다. 형질도입된 세포 "재도입하기"를 인용하는 본원에 방법에서, 그러한 세포가 전형적으로 대상체의 혈액으로부터 수집되는 때 형질도입된 상태가 아님이 이해될 것이다.
세포 도입/재도입
본원에 개시된 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법의 특정 구현예에서, 수확된 T 세포 및/또는 NK 세포는 치료적 효과를 위하여 대상체에서 도입, 다시 도입, 재도입, 주입, 또는 재주입될 수 있다. 재도입될 T 세포 및/또는 NK 세포의 수는, 치료적으로 효과적 용량일 수 있는, 예정된 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 예정된 용량은 세포에서 발현되는 CAR (예를 들면, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포에서 발현된 항원-특이적 표적화 영역의 친화성 및 밀도), 표적 세포의 유형, 질환의 성질 또는 치료 중인 생리학적 조건, 또는 조합에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 수확된 세포의 예정된 용량은 대상체의 질량, 예를 들어, 대상체의 세포 / 킬로그램 (세포/kg)에 기반될 수 있다. 투여될 약학적 조성물에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 추가 상세는 본원에 제공되고, 용량 범위 및 투여의 루트를 포함하여, 본원에 제공된다.
세포 동결보존
본원에 제공된 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 수확된 세포는 나중 시간에 사용을 위하여 예정된 용량에, 본원에 추가로 상세히 논의된 대로, 극저온 컨테이너 예컨대 동결보존 백 (즉 크라이오 백)에서 동결보존될 수 있다. 세포를 동결보존시키는 방법 및 시약은 당업계에서 잘-알려진다. 동결보존은 본원에 구현예에서 제공된 T 세포 및/또는 NK 세포 중 임의의 것 농축하기의 단계 및/또는 하나 이상의 세정을 포함할 수 있다. 본 방법은, 전달 용액 및 적합한 동결보존 용액일 수 있는, 희석제 용액에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, 동결보존 혼합물 또는 현탁액 형성하기의 단계를 또한 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 당업계에서 알려지는 대로 동결보존 혼합물 냉동하기의 단계를 포함할 수 있다.
비-제한 구체적 예로서, 일단 세포가 하나 이상의 크라이오 백에서 냉동하기를 위하여 제형화되면, 백은 밀봉되고, 냉동 동결 장치, 예컨대 CryoMed 7455 (Thermo Fisher)에 배치하고, 백은 37℃에서 4℃까지 점진적 온도 감소 램프 및 그 다음 -80℃로 단계적으로 동결된다. 세포는 그 다음 예를 들어 12-36 시간후 액체 질소로 이동될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 동결보존 용액은, 저 분자성 분자 예컨대 당, 글리세롤 (트레할로스 및 수크로스) 및 디메틸 술폭시드 (DMSO), 뿐만 아니라 큰 중합체성 분자 (예를 들면, 폴리비닐피롤리돈 및 하이드록시에틸 전분)를 포함하는, 하나 이상의 비-전해질을 포함할 수 있다. 동결보존 용액에 관한 추가 상세는 본원에 제공된다.
동결보존된 T 세포 및/또는 NK 세포의 해동 방법은 당업계에서 알려진다. 자가 세포 도입/주입 경우에, 이것은 전형적으로 재도입 (즉 주입) 전에 극저온 컨테이너 (예를 들면 크라이오 백)에서 제공된 개인 식별 정보로 대상체의 동일성을 확인하는 단계를 포함한다. 주입 부피는 그 다음 체중, 용량, 및 CAR 양성 T 세포 및/또는 NK 세포 밀도 (세포/ml)를 결정함으로써 계산될 수 있다. 극저온 컨테이너 (예를 들면 크라이오 백)에서 세포는 그 다음, 예를 들어 37C 수조에서 해동된다. 극저온 컨테이너에서 존재하는 임의의 세포 덩어리는 교반에 의해 제거될 수 있다. 세포 현탁액은 그 다음, 예를 들어 정맥내로 본원에 제공된 속도들 중 임의의 것, 예를 들어 주사기 또는 주사기 펌프를 이용한 0.25 내지 5 ml/분 또는 0.75 내지 1.25 ml/분으로 전달될 수 있다.
특성규명 및 상업적 생산 방법
본 개시내용은 과학적 실험작업에서 그리고 상업적 생산을 위하여 조사 시약으로서 사용될 수 있는 다양한 방법 및 조성물을 제공한다. 그러한 과학적 실험작업은 본원에 제공된 림프구를 유전적으로 변형시키는, 예를 들어 형질도입하는 방법을 사용하여 림프구, 예컨대 NK 세포 및 실례적 구현예에서, T 세포의 특성규명을 위한 방법을 포함할 수 있다. 그러한 방법은 예를 들어, 활성화가 그러한 세포를 형질도입가능하게 하는 상세된 분자성 기전 및 림프구의 활성화를 연구하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 예를 들어, T 세포 증식 및 생존에 영향을 미치는 인자를 더욱 잘 이해하기 위한 조사 도구로서 유용성을 가질 유전적으로 변형된 림프구가 본원에 제공된다. 그러한 유전적으로 변형된 림프구, 예컨대 NK 세포 및 실례적 구현예에서 T 세포는 더욱이 상업적 생산, 예를 들어, 상업적 제품의 생산에서 사용 또는 테스트 및 수확될 수 있는, 특정 인자, 예컨대 성장 인자 및 면역조절 제제의 생산에 사용될 수 있다.
림프구의 과학적 실험 및/또는 특성규명은 림프구 분석하기 또는 비교하기에 유용한 본원에 제공된 양태, 구현예, 또는 하위구현예 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자로 형질도입될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입은 본 개시내용의 폴리펩타이드, 예를 들어, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
면역 세포의 활성화 방법
본 개시내용은 시험관내, 생체내, 또는 생체외 면역 세포의 활성화 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 HER2로 면역 세포를 (시험관내, 생체내, 또는 생체외) 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기에서 면역 세포는 본 개시내용의 조건부 활성 CAR을 생산하도록 (즉 발현시키도록) 유전적으로 변형되었다. HER2의 존재 하에서, 조건부 활성 CAR은 면역 세포를 활성화시키고, 이에 의해 활성화된 면역 세포를 생산한다. 면역 세포는, 예를 들면, 세포독성 T 림프구, NK 세포, CD4+ T 세포, T 조절 (Treg) 세포, γδ-T 세포, NK-T 세포, 호중구, 등을 포함한다. 실례적 구현예에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이고, 특히 실례적 구현예에서, 면역 세포는 NK-T 세포를 포함하는 T 세포이다. 그러한 실례적 구현예에서 활성화하기는 전형적으로 T 세포 또는 NK 세포의 세포독성 활성을 활성화하기이다. 그러한 방법은 복수의 면역 세포 (예를 들면 T 세포 또는 NK 세포)를 사용하여 수행될 수 있다. 추가 실례적 구현예에서, 접촉하기는 HER2를 발현시키는 표적 포유류 세포를 면역 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. T 세포 또는 NK 세포의 활성화를 위한 그러한 방법은 T 세포 또는 NK 세포에 의한 사이토카인의 방출 예컨대 IFN-γ 또는 IL-2의 방출, HER2를 발현시키는 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 세포독성 활성에서의 증가, T 세포 또는 NK 세포에서 IFNγ 및/또는 IL-2의 세포내 발현에서의 증가, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 분석에 의해 측정된 경우에 T 세포 또는 NK 세포에 의한 CD107a 및/또는 CD69의 발현에서의 증가, 및 T 세포 또는 NK 세포의 증식에서의 증가를 검출함으로써 검출될 수 있다. 본원에 예는 T 세포 및/또는 NK 세포의 활성화의 이들 검출 방법의 일부에 대하여 상세를 제공한다.
본원에 제공된 추가 양태는, 표적 포유류 세포를 면역 세포와 시험관내, 생체내, 또는 생체외 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 포유류 세포에 면역 세포 (예를 들면 T 세포 또는 NK 세포)를 결합시키는 방법을 포함하고, 여기서 표적 포유류 세포는 HER2를 발현시키고, 면역 세포는 HER2에 결합하는 본원에 제공된 CAR들 중 임의의 것을 발현시킨다. 그러한 결합하기는 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 그러한 방법은 복수의 면역 세포 (예를 들면 T 세포 또는 NK 세포)를 사용하여 수행될 수 있다. 사이토카인의 방출 및 세포독성 활성에서의 증가에 의한 T 세포 또는 NK 세포의 활성화를 검출함으로써 검출된 경우에, 그러한 결합하는 방법은 본원에 실시예에서 제공된다.
면역 세포를 결합 또는 활성화하는 방법에서 접촉하기는, 본원에 실례적 구현예에서 면역 세포 (예를 들면 T 세포 또는 NK 세포)를 7.4 미만의 pH에 미세환경에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, pH는 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9 미만, 또는 5.8 내지 7.0의 범위, 실례적 구현예에서 6.0 내지 6.8의 범위, 6.1 내지 6.9의 범위, 6.2 내지 6.8의 범위, 또는 범위의 저점으로 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5 내지 범위의 고점으로 6.6, 6.7, 6.8, 및 6.9일 수 있다. 그러한 실례적 구현예에서, CAR은 본원에 제공된 HER2를 인식하는, 본원에 개시된 CAB-CAR들 중 임의의 것이다.
유전적으로 변형된 면역 세포 (예를 들면, T 림프구, NK 세포)를 HER2와 접촉하기는, HER2의 부재 하에서 면역 세포에 의해 생산된 사이토카인의 양과 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 10-배 초과만큼 면역 세포에 의한 사이토카인의 생산을 증가시킬 수 있다. 유전적으로 변형된 면역 세포 (예를 들면, T 림프구 또는 NK 세포)를 HER2와 접촉하기는, HER2의 부재 하에서 면역 세포에 의해 분비된 사이토카인의 양과 비교하여, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 2-배, 적어도 2.5-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 또는 10-배 초과만큼 면역 세포에 의한 사이토카인의 분비를 증가시킬 수 있다. 생산이 증가될 수 있는 사이토카인은, 비제한적으로, IL-2 및 IFN-γ를 포함한다.
유전적으로 변형된 세포독성 세포 (예를 들면, 세포독성 T 림프구)를 HER2와 접촉하기는, HER2의 부재 하에서 세포독성 세포의 세포독성 활성에 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 10-배 초과만큼 세포독성 세포의 세포독성 활성을 증가시킬 수 있다.
유전적으로 변형된 면역 세포 (예를 들면, T 림프구, NK 세포)를 HER2와 접촉하기는, HER2의 부재 하에서 면역 세포의 CD107a 및/또는 CD69의 발현에 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 10-배 초과만큼 세포의 CD107a 및/또는 CD69의 발현을 증가시킬 수 있다.
예를 들면, 숙주 면역 세포에 의존하는 다른 구현예에서, 유전적으로 변형된 숙주 세포를 항원과 접촉하기는 세포 증식, 세포 생존, 세포사, 및 기타 등등을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
치료 방법
본 개시내용은 본원에 제공된 항-HER2 CAB-CAR을 포함하는 장애를 치료하는 다양한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본 개시내용의 CAB-CAR이, T 림프구 또는 NK 세포에서 존재하고 상기에 의해 발현된 때, 표적 세포를 향하여 세포독성을 매개할 수 있다는 사실을 이용한다. 본원에 제공된 CAB-CAR T 세포 및/또는 NK 세포의 집단이 도입/투여되는 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 또는 자가일 수 있다. 본 개시내용의 CAB-CAR은 특정 표적 조건 하에 표적 세포에서 존재하는 항원에 결합하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 T 림프구 또는 NK 세포에 의한 표적 세포의 사멸을 매개하여 CAB-CAR을 생산한다. CAB-CAR의 ASTR은 전형적으로 표적 세포의 표면에서 존재하는 항원에 결합한다. 따라서, 추가 양태에서, 본 개시내용은 약제의 제조 또는 조제에서 본원에 제공된 임의의 CAB-CAR을 인코딩하는 핵산의 용도를 제공한다.
표적 세포는, 비제한적으로, 암 세포를 포함한다. 그래서, 본 개시내용은 표적 암 세포의 사멸, 또는 성장 억제 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체 CAR을 생산하기 위해 유전적으로 변형되는 세포독성 면역 효과기 세포 (예를 들면, 세포독성 T 세포, 또는 NK 세포)를 접촉시키는 단계를 포함하고, 이로써 T 림프구 또는 NK 세포는 표적 암 세포의 표면에서 존재하는 항원을 인식하고, 표적 세포의 사멸을 매개한다. 그러한 방법의 실례적 양태는 암을 치료하는 방법을 제공한다. CAB-CAR은 암을 치료하기 위한 또는 종양 또는 암 세포를 표적화하기 위한 용도에 제한되지 않고, 오히려 순환 장애, 관절염, 다발성 경화증, 자가면역 장애, 피부과 장애, 바이러스성 질환 및 장애의 치료를 포함하는 하나 이상의 적응증에서 사용하기 및 다양한 진단적 형식에서의 사용하기에 적절할 수 있다. 본원에 특정 실례적 구현예에서, 본원에 제공된 항-HER2 CAR을 발현시키거나 발현시킬 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포는 HER2 단백질 발현 또는 과발현과 연관된 암을 갖는 대상체에 전달된다. 그러한 암은, 반드시 비제한적으로, 유방암, 난소암, 방광 암종, 담낭암, 폐암, 자궁경부암, 장암, 간외 또는 간내 담관암, 침샘관 암종, 식도, 식도위 접합부 암 및 위 선암종 그리고 위장관 기질 종양을 포함하는 위암, 결장암, 비-소세포 및 소세포 소-세포 폐암을 포함하는 폐암, 췌장암 예컨대 췌장 선암종, 음경암, 뇌하수체암, 전립선암, 연조직 육종, 복막 육종 및 후복막 육종을 포함하는 육종, 단독 섬유성 종양, 흉선암, 갑상선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 자궁내막암, 교모세포종 예컨대 다형성 교모세포종, 신경교종, 희소돌기아교종, 두경부 암종, 간세포 암종, 소장 악성종양, 흑색종, 신경내분비 종양, 또는 기타 HER2 단백질 발현 또는 과발현 암을 포함한다. HER2는 상피 기원의 악성종양 및 간엽, 신경내분비 조직, 중추 신경계, 및 신장에서 유래된 암에서 전형적으로 과발현되고 그래서 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 이들 유형의 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 암에서 HER2 발현의 다양한 형태에 관한 정보는, 예를 들어, "HER2 expression status in diverse cancers: review of results from 37,992 patients", Yan, Min 등, Cancer Metastasis Rev., (2015) 34:157-164에서 찾아질 수 있다. HER2 발현 또는 과발현과 연관된 질환은 외음부 파제트병을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, 염증성 사이토카인 분비 억제 (예를 들면, 종양-연관된 대식세포로부터), 종양 혈관계 (예를 들면, 종양내 혈관계 또는 종양-연관된 혈관계) 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제에 사용을 위한 항-HER2 ASTR 및/또는 CAR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 병태의 치료 방법은 항-HER2 ASTR 및/또는 CAR을 포함할 수 있다 실례적 구현예에서, 항-HER2 CAB CAR T 세포 및/또는 NK 세포는 HER2 양성 암을 갖는 포유동물 (예를 들면 인간) 대상체에 전달되어 대상체에 대하여, 생존의 지속기간을 증가시키거나, 객관적 관해를 개시하거나, 암을 제어하거나, 암의 진행을 억제시킨다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체에서 암의 치료 방법을 제공한다. 이와 같이 본 개시내용은 본원에 제공된 항-HER2 CAB-CAR을 사용하는 암, 특히 HER2를 발현시키는 암에 대해 입양 세포성 요법을 위한 방법을 제공한다. 따라서, 일 양태에서 본 방법은 하기를 포함한다: A. 본원에 제공된 대로 HER2에 관한 CAB-CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현시키도록 구성된 발현 벡터를, 대상체로부터 수득된 말초 혈액 세포에 도입하여 유전적으로 조작된 세포독성 세포 (예컨대 T 세포 또는 NK 세포)를 생산하는 단계; 및 B. 유전적으로 조작된 세포독성 세포를 대상체에 투여하는 단계. 상기 단계 A의 실례적 구현예를 제공하는 그러한 세포를 활성화, 형질도입 및 전형적으로 확장시키기 위해 T 세포를 처리하는 상세된 방법은 본원에 제공된다.
치료 방법은 포유동물에서 항-종양 면역성 제공하기, HER2의 상승된 발현과 연관된 질환, 장애, 또는 병태를 갖는 포유동물 치료하기, 암 (예를 들면 유방암, 위암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 또는 요로상피성 방광암)을 가진 인간 치료하기, 포유동물에서 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단 생성하기, 인간에서 유전적으로 변형된 T 세포의 집단 확장하기, 및 본원에 예시적 구현예 섹션에서 제공된 포유동물 (예를 들면 인간)에서 표적 세포 집단 또는 조직에 T 세포-매개된 면역 반응 자극하기의 방법을 포함한다.
대상체, 포유동물, 및/또는 인간을 포함하는 본원에 제공된 구현예의 양태 중 임의의 것의 특정 구현예에서, 포유동물 (예를 들면 인간) 대상체는 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법으로서 트라스투주맙 요법을 이전에 받았다. 일부 구현예에서, 포유동물 (예를 들면 인간) 대상체는, 특정 실례적 구현예에서, 포유류 대상체가 트라스투주맙 요법 (즉, 허셉틴(Herceptin) 요법), 또는 이의 바이오시밀러로 치료된 후 재발된 재발성 암 (예를 들면 재발성 유방암)을 갖는다.
대상체, 포유동물, 및/또는 인간, 및 임의로 대상체에 세포 투여하기의 단계를 포함하는 본원에 제공된 구현예의 양태 중 임의의 것의 특정 구현예에서, 실례적 구현예에서, 포유동물은 HER2 양성 암을 갖는다. 일부 구현예에서, HER2 양성 암은 HER2를 과발현시키는 세포에 의해 야기된 암이다. 일부 구현예에서, 과발현은 암성이 아닌 유사한 세포에 비해 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5-배 과발현일 수 있다. 한 구현예에서, HER2 양성 암은 HER2 유전자 증폭을 갖는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유류 대상체 (예를 들면 인간)는 분석된 모든 종양 세포의 적어도 50%가 HER2 양성인 종양을 갖는다. 종양의 HER2 발현을 검출하고 측정하는 방법이 당업계에서 알려진다. 일부 구현예에서, HER2 양성은 세포 표면에서 HER2의 발현 (예를 들면, 면역조직화학 (IHC))에 의해, 유전자 증폭 (예를 들면, FISH 또는 PCR)에 의해, 또는 HER2 mRNA의 발현 (예를 들면, qPCR)에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, HER2는 HER2, 예를 들어 허셉틴, 동반 진단제에 의해 결정된 경우에 양성이다. 일부 구현예에서, HER2 동반 진단제는 FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc.), PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (Abbott Molecular Inc.), InSite Her-2/neu KIT (Biogenex Laboratories, Inc.), INFORM HER-2/neu (Ventana Medical Systems, Inc.), PATHWAY 항-Her2/neu (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (Ventana Medical Systems, Inc.), INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail (Ventana Medical Systems, Inc.), VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail (Ventana Medical Systems, Inc.), SPOT-LIGHT HER2 CISH Kit (Life Technologies Corp.), Bond Oracle HER2 IHC System (Leica Biosystems), HER2 CISH pharmDx Kit (Dako Denmark A/S), HercepTest (Dako Denmark A/S), 또는 HER2 FISH pharmDx Kit (Dako Denmark A/S)이다. 비-제한 구체적 예에서, HER2 발현은 Roche HER2 항체 (4B5)를 사용하는 종양 조직의 표준 염색을 사용하여 분석되고, "Guidelines for HER2 Detection of Breast Cancer (2019 Edition)" 및 "Guidelines for HER2 Detection of Gastric Cancer (2016 Edition)"에 따라 해석된다. 특정 구현예에서, 종양 세포는 모든 종양 세포의 ≥50%를 차지한다. 위암 및 유방암 이외 HER2 3+ 고형 종양 경우에, FISH는 실례적 구현예에서 HER2의 발현을 확인하기 위해 수행되고; HER2 표적화된 요법 후 재발이 있는 환자 경우에, 생검 및 IHC는, 실례적 구현예에서, HER2 발현을 검출하기 위해 다시 수행하고;
일부 구현예에서, 인간 대상체는 대부분 또는 실례적 구현예에서, 모두의 하기 혈액 파라미터를 갖는다: 헤모글로빈 (HGB) ≥90 g/L, 2주 이내에 수혈 없음; 백색 혈액 세포 (WBC) ≥2.5×109/L; 절대 호중구 수 (ANC) ≥1.5×109/L; 혈소판 수 (PLT) ≥ 80×109/L; -총 빌리루빈 (TBIL) ≤3.0ng/dL 또는 ≤1.5 ULN; 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) ≤ 2.5×ULN; 비정상적 간 기능이 간세포 암종 또는 종양 간 전이에 의해 야기되면, AST 및 ALT는 ≤5×ULN임; 및 혈청 크레아티닌 (Cr)≤1.5×ULN; 또는 크레아티닌 청소율 (CrCl)≥50mL/분.
CAR은 본원에 개시된 HER2를 인식하는 CAB-CAR 중 임의의 것, 특히 이들 항원을 발현시키는 암 세포에 세포독성인 것들일 수 있다. 항-HER2 CAB-CAR을 인코딩하는 발현 벡터는 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 백혈구를 벡터로 형질감염시킴으로써 말초 혈액 세포에 도입될 수 있다. 특정 실례적 구현예에서, 벡터는 재조합 바이러스, 예컨대 일부 구현예에서 재조합 렌티바이러스인 재조합 레트로바이러스이다. 일부 구현예에서, 암은 HER2를 발현시키는 연조직 육종 또는 중피종이고 대상체 (예를 들면 연조직 육종 환자 또는 중피종 환자)의 T 세포 및/또는 NK 세포는 항-HER2 CAR, 예를 들어 본원에 개시된 항-HER2 CAB-CAR로 형질도입된다.
본원에 제공된 장애를 치료하는 방법은 전형적으로 본원에 제공된 항-HER2 CAB-CAR을 발현시키는 유전적으로 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 본원에 논의된 대로 전달 용액, 예를 들어 동결보존제 전달 용액에서 존재한다. 일부 구현예에서, 전달 용액은 본원에 다른 곳에 개시된 대로 백, 예컨대 주입 백 안에 있다. 일부 구현예에서, 투여는 정맥내 투여, 피하 투여, 또는 종양내 투여일 수 있다. 일부 구현예에서, 정맥내 투여는 범위의 저점으로 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 및 20 ml/분 내지 범위의 고점으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 및 35 ml/분, 예를 들어 5 내지 30, 10 내지 25, 또는 10 내지 20 ml/분의 주입 속도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여하기는 1회 투여로 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여하기는 2회 이상, 예를 들어, 3회 이상, 4회 이상, 또는 5회 이상, 별도 투여로 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 투여는 1개 초과 백, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 백을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는, 예를 들어 동결보존제 전달 용액에서 냉동되고, 투여 전에 해동되어야 한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 세포 분산액 안에 있다. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 정맥내로 투여되는 방법에서, 전형적으로 1 x 104 세포/kg 내지 1 x 1010 세포/kg 체중, 예를 들면, 1 x 104 내지 1 x109, 예를 들면 1 x 105 및 1 x 107 CAR 양성 T 및/또는 NK 세포/kg 체중은 비경구 투여에 적합한 완충액으로 전달된다. 일부 구현예에서, 50 kg 이하 계량한 대상체에의 투여는 kg 체중당 본원에 제공된 항-HER2 CAB-CAR을 발현시키는 0.2 x 106 내지 5.0 x 108 또는 0.2 x 106 내지 5.0 x 106 CAR 양성 T 및/또는 NK 세포를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 50 kg 초과 계량한 대상체에의 투여는 본원에 제공된 항-HER2 CAB-CAR을 발현시키는 0.1 x 108 내지 6 x 108 CAR 양성 T 및/또는 NK 세포, 예를 들어, 본원에 제공된 항-HER2 CAB-CAR을 발현시키는 0.1 x 108 내지 2.5 x 108 또는 0.6 x 108 내지 6 x 108 T 및/또는 NK 세포를 함유할 수 있다. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 종양내로 투여되는 방법에서, 전형적으로 1 x 106 CAR 양성 T 세포 내지 5 x 108 CAR 양성 T 세포는 등장성 용액으로 전달된다. 특정 구현예에서, 세포는 전달 현탁액에서 1x104 내지 1x1010 세포/ml 또는 1x106 내지 1x109 세포/ml의 농도이다.
전달 현탁액은 전형적으로 특정 품질 제어 방출 기준을 충족시킬 것이다. 그래서, 특정 구현예에서, 전달 현탁액에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 50%, 60% 또는 70% 이상의 퍼센트 생존력; 40%, 50%, 또는 60% 이상의 CD3 양성률; 및/또는 (실례적 구현예에서 "및") 5%, 10%, 또는 15% 이상의 CD3 및 CAR 양성률을 가질 것이다. 다른 구현예에서, 전달 현탁액에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 또는 70% 내지 95%의 퍼센트 생존력; 40% 내지 90%, 50% 내지 90%, 또는 60% 내지 90%의 CD3 양성률; 및/또는 (실례적 구현예에서 "및") 5% 내지 50%, 10% 내지 50%, 또는 15% 내지 50%의 CD3 및 CAR 양성률을 가질 것이다. 더욱이, 평균적으로, 또는 60%, 70%, 90%, 90%, 95%, 99%, 또는 측정된 전부로 실례적 구현예에서 전달 현탁액에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 게놈당 CAR-인코딩 핵산의 3개 이하 카피를 갖는다. 더욱이, 본원에 제공된 전달 현탁액은, 실례적 구현예에서 10 EU/mL 이하의 내독소 수준을 갖는다.
일부 구현예에서, 투여될 림프구는 백, 및 실례적 구현예에서, 주입 백, 예컨대 크라이오 주입 백에서 그리고 추가 실례적 구현예에서, 대상체를 식별하기 위한 정보, 예컨대 환자 식별 정보를 포함하는 주입 백에서 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 백은 범위의 저점으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 및 25 ml 내지 범위의 고점으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 및 100 ml의 림프구의 부피를 포함한다.
일부 구현예에서, 투여하기의 예시적 방법은 크라이오 백 또는 주입 백, 또는 실례적 구현예에서, 주입에 사용되는 크라이오 백에서 대상체를 식별하기 위한 정보 (환자 식별 정보)로 대상체의 동일성을 확인하는 단계, (더 작은 아동 및 더 작은 부피에 맞게 조정된) 10 ml 내지 20 ml/분의 정맥내 주입으로 유전적으로 변형된 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 주입 백에서의 부피는 10 ml 내지 50 ml이다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 주입 백은 투여하기를 포함하는 임의의 방법에서 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 주입 백이 투여하기를 포함하는 방법에서 사용되는 경우, 다음 백은 이전의 주입 백이 안전하게 투여된 때까지 해동되지 않는다. 일부 구현예에서, 튜브화는 정상 식염수로 프라이밍한 다음 주입 백은 튜브화를 통해서 투여된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 범위의 저점으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 및 25 ml의 식염수 내지 범위의 고점으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 및 100 ml의 식염수, 예를 들어, 5 내지 100, 10 내지 50, 또는 10 내지 30 ml로 주입 백을 린스처리하는 단계, 및 주입 백으로부터 식염수를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에 CAR 세포의 투여는, 대상체의 면역계의 활성에 일시적으로 또는 확실하게 영향을 미칠 수 있는 (면역 억제), 대상체에 약물 또는 치료 (예를 들면, 디벌킹, 방사선), 예컨대 림프구제거 약물, T, NK 및/또는 B 세포를 고갈시키는 약물, 또는 면역 세포의 특정 서브세트의 활성을 감소시키는 약물의 투여에 의해 선행된다. 비-제한 구현예에서, 대상체에 림프구제거 화학치료적 레지멘의 투여는 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에 투여하기 전에 수행된다. CAR-T 요법의 당업계에서 알려진 표준 림프구제거 화학치료적 레지멘 중 임의의 것은 본원에 방법과 사용될 수 있다. 비-제한 실례적 구현예에서, 화학치료적 레지멘은 벤다무스틴을 포함하거나, 사이클로포스파미드 및/또는 플루다라빈을 포함한다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 약 10-50 mg/m2 (예를 들면, 약 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 또는 45-50 mg/m2)의 투약량으로, 예를 들면, 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 약 200-300 mg/m2 (예를 들면, 약 200-225, 225-250, 250-275, 또는 275-300 mg/m2)의 투약량으로, 예를 들면, 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 벤다무스틴은 50-150 mg/m2 (70-130, 75-125, 75-115, 80-100, 85-95, 또는 90 mg/m2)으로, 예를 들면 정맥내로 투여된다.
플루다라빈은 예를 들어 2-6, 2-4, 3-5, 3-4, 4-5, 3 일 또는 4 일, 전형적으로 연속 일 동안 투여될 수 있다. 사이클로포스파미드는, 예를 들어 플루다라빈과 함께 투여된 때 플루다라빈과 같은 날에 시작하여, 1-4 일, 2-4 일 2-3 일 또는 3 일, 전형적으로 연속 일 동안 전달될 수 있다. 벤다무스틴은 1-4, 2-4, 2-3, 또는 3 일 동안, 예를 들어 전달될 수 있다. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 림프구제거 레지멘의 투여의 완료 1 내지 21, 2 내지 14, 2 내지 10, 2 내지 7, 또는 2 내지 5 일후 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 1 내지 30, 2 내지 15, 2 내지 11, 2 내지 7, 3 내지 5, 또는 2 내지 4 일전 1, 2, 3, 4, 또는 5 연속 일 동안, 실례적에서 3 연속 일 동안 림프구제거 화학요법이 투여될 수 있다 일부 구현예에서, 대상체의 백색 혈액 세포 수는 이것이 특정 컷오프 (예를 들면 1x109)를 능가함을 보장하기 위해 측정되거나, 림프구제거 레지멘은 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 투여하기 전에 수행되지 않는다. 일부 구현예에서, 투여는 인터류킨 또는 이의 변형된 버전의 투여에 선행, 동반, 및/또는 후행된다. 예를 들어, 본원에 제공된 일부 구현예는 T 세포의 증식 활성화하기 및/또는 활성 사멸하기를 향하여 편향되는 특정 IL-2 수용체에 결합하고/거나 지속된 방출을 갖는 IL-2, 또는 IL-2의 변형된 버전의 공-투여를 포함한다. 예를 들어, 변형된 IL-2는 특정 구현예에서 peg화된 IL-2이고, NKTR-214 (Nektar Therapeutics, San Francisco, CA)일 수 있다. 다른 구현예에서, 변형된 IL-2는 ALKS 4230 (Alkermes, Inc.)이다.
본원에 개시된 방법에 의한 요법에 따를 수 있는 암종은, 비제한적으로, 식도 암종, 간세포 암종, 기저 세포 암종 (피부암의 한 형태), 편평 세포 암종 (다양한 조직), 이행 세포 암종 (방광의 악성 신생물)을 포함하는 방광 암종, 기관지 암종, 결장 암종, 결장직장 암종, 위 암종, 폐의 소세포 암종 및 비-소세포 암종을 포함하는 폐 암종, 부신피질 암종, 갑상선 암종, 췌장 암종, 유방 암종, 난소 암종, 전립선 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 신세포 암종, 상피내 유관 암종 또는 담관 암종, 융모막암종, 정액종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부 암종, 자궁 암종, 고환 암종, 골형성 암종, 상피 암종, 및 비인두 암종을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 의한 요법에 따를 수 있는 육종은, 비제한적으로, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 척색종, 골형성 육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 육종, 평활근육종, 횡문근육종, 및 기타 연조직 육종을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 의한 요법에 따를 수 있는 다른 고형 종양은, 비제한적으로, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 따라 치료할 수 있는 다른 암은 비정형 수막종 (뇌), 섬 세포 암종 (췌장), 수질 암종 (갑상선), 간엽종 (장), 간세포 암종 (간), 간모세포종 (간), 투명 세포 암종 (신장), 및 신경섬유종 종격동을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료하는 암은 HER2 양성 종양 또는 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료하는 암은 유방암, 위암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 또는 요로상피성 방광암을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에서의 암은 재발성 또는 불응성 HER2 양성 고형 종양이다. 종양은, (AJCC 제8판에 따른) IV 기의 TNM 병기화로, 조직학 또는 세포학에 의해 표준 치료에 실패한 것으로 확인된 진행성 고형 종양일 수 있다. 특정 구현예에서, RECIST 1.1 표준에 따라, 적어도 하나의 측정가능한 병변이 있고, 즉 CT 횡단면 영상 또는 자기 공명 영상 (MRI)에 따라 비-림프절 병변의 장경이 ≥10 mm이거나, 림프절 병변의 단경이 ≥15 mm이고; 대상체는 일부 구현예에서 0-1의 동부 협동 종양학 그룹 (ECOG PS)을 가질 수 있다.
종양과 싸우기 위해 숙주의 면역 기능 향상시키기는 본 발명의 방법과 연대하여 사용될 수 있다. 종래의 방법은 (i) APC 향상, 예컨대 (a) 외래 MHC 동종항원을 인코딩하는 DNA의 종양에 주사, 또는 (b) 종양의 면역 항원 인식의 가능성을 증가시키는 유전자 (예를 들면, 면역 자극 사이토카인, GM-CSF, 공-자극 분자 B7.1, B7.2)로 생검된 종양 세포를 형질감염시키기, (iii) 입양 세포성 면역요법, 또는 활성화된 종양-특이적 T 세포를 이용한 치료를 포함한다. 입양 세포성 면역요법은 종양-침윤 숙주 T-림프구 단리시키기, 시험관내, 예컨대 IL-2 또는 종양 또는 양쪽에 의한 자극을 통해서 집단 확장시키기를 포함한다. 추가적으로, 기능장애성인 단리된 T-세포는 또한 항-PD-LCDR1 항체의 시험관내 적용에 의해 활성화될 수 있다. 그렇게 활성화되는 T-세포는 그 다음 숙주에 재투여될 수 있다. 이들 방법 중 하나 이상은 본원에 제공된 CAR-T 방법과 조합으로 사용될 수 있다.
조합 요법
일부 구현예에서, 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것의 항-HER2 CAR 세포 (예를 들면 T 세포 및/또는 NK 세포)는 표준 암 요법과 조합으로, 요법에 암/환자 불응성으로, 또는 요법에 아쥬반트 요법으로서 투여된다. 실례적 구현예에서, 본원에 방법에서 포유류 (예를 들면 인간) 대상체는 항-HER2 항체 요법 예컨대 트라스투주맙 요법에 불응성이거나 HER2 양성인 재발성 고형 종양을 갖는다. 그러한 방법은 본원에 제공된 항-HER2 CAR 세포 중 임의의 것, 또는 본원에 제공된 항-HER2 CAR을 인코딩하는 RNA 투여하기, 및 표준 암 요법 투여하기의 단계를 포함하는 방법에서 임의의 방법 또는 조성물을 조합시킨다. 표준 암 요법은 수술 (예를 들면, 암성 조직의 외과적 제거), 방사선 요법 (예를 들면, 방사선요법, X-선 요법, 방사선조사) 또는 암 세포를 죽이고 종양을 축소시키기 위한 이온화 방사선의 사용을 포함한다. 방사선 요법은 어느 한쪽 외부 빔 방사선요법 (EBRT)을 통해 외부적으로 또는 근접요법, 골수 이식, 화학치료적 처치 또는 신속하게 분열하는 세포에 일반적으로 영향을 미치는 세포독성 약물의 적용, 표적화된 요법, 또는 암 세포의 조절되지 않은 단백질에 특이적으로 영향을 미치는 제제 (예를 들면, 티로신 키나제 억제제 이마티닙, 제피티닙, 단클론성 항체, 광역학 요법), 생물학적 반응 조절제 치료, 면역요법 또는 숙주의 면역 반응 향상 (예를 들면, 백신), 호르몬성 요법 또는 호르몬의 차단 (예를 들면, 종양이 호르몬 민감성인 경우), 혈관신생 억제제 또는 혈관 형성 및 성장의 차단, 및 통증, 메스꺼움, 구토, 설사 및 출혈을 줄이기 위해 치유의 질을 향상시키기에 관한 완화적 치유 또는 치료를 통해 내부적으로 투여될 수 있다. 진통제 예컨대 모르핀 및 옥시코돈, 항-구토제 예컨대 온단세트론 및 아프레피탄트는 더욱 적극적 치료 레지멘및 전술한 특정 조합을 허용할 수 있다.
방사선 요법은, 비제한적으로, 어느 한쪽 외부적으로 적용된 공급원 예컨대 빔으로부터, 또는 작은 방사성 소스의 이식에 의해 전달되는 x-선 또는 감마 선을 포함한다.
암 치료에서 사용에 적합한 항체 (항-암 항체-기반된 생물제)는, 비제한적으로, 네이키드 항체, 예를 들면, 트라스투주맙 (허셉틴 (항-HER2)), 베바시주맙 (AvastinTM), 세툭시맙 (ErbituxTM), 파니투무맙 (VectibixTM), 이필리무맙 (YervoyTM), 리툭시맙 (Rituxan), 알렘투주맙 (LemtradaTM), 오파투무맙 (ArzerraTM), 오레고보맙 (OvaRexTM), 람브롤리주맙 (MK-3475), 퍼투주맙 (PerjetaTM), 라니비주맙 (LucentisTM) 등, 및 컨쥬게이션된 항체, 예를 들면, 젬투주맙 오조가미신 (MylortargTM), 브렌툭시맙 베도틴 90Y-표지화된 이브리투모맙 티욱세탄 (ZevalinTM), 131I-표지화된 토시투모마 (AdcetrisTM), (BexxarTM), 등을 포함한다. 암 치료에서 사용에 적합한 항체는, 비제한적으로, 종양-연관된 항원에 대해 제기된 항체를 포함한다. 그러한 항원은, 비제한적으로, CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산-결합 단백질, 강글리오시드 (예를 들면, GD2, GD3, GM2, 등.), Ley, VEGF, VEGFR, 인테그린 알파-V-베타-3, 인테그린 알파-5-베타-l, EGFR, ERBB2, ERBB3, MET, IGFlR, EPHA3, TRAILRl, TRAILR2, RANKL, PAP, 테나신, 등을 포함한다.
본원에 실례적 구현예에서, 항-암 항체 치료제는 항-HER2 항체 생물제, 예를 들어 트라스투주맙 또는 이의 바이오시밀러 예컨대 트라스투주맙-ANNS (Kanjinti™ (Amgen, Thousand Oaks, CA))이다. 실시예 5에서 입증된 대로, 본원에 제공된 항-HER2 CAR은 허셉틴 요법에 내성인 환자에 효과적으로 투여될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 임의의 양태 또는 구현예에서 대상체 또는 공급원 또는 T 세포 및/또는 NK 세포는 트라스투주맙 요법, 또는 이의 바이오시밀러를 받았거나 받고 있는 대상체, 또는 그러한 요법에 내성이거나, 상당한 유해 이벤트를 경험하고, 일부 구현예에서 트라스투주맙 요법에 알러지성인 대상체일 수 있다.
본 개시내용의 방법과 관련하여 사용에 적합한 생물학적 반응 조절제는, 비제한적으로, (1) 티로신 키나제 (RTK) 활성의 억제제; (2) 세린/트레오닌 키나제 활성의 억제제; (3) 종양-연관된 항원 길항제, 예컨대 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체; (4) 세포자멸사 수용체 효능제; (5) 인터류킨-2; (6) 인터페론-α.; (7) 인터페론 -γ; (8) 콜로니- 자극 인자; (9) 혈관신생의 억제제; 및 (10) 종양 괴사 인자의 길항제를 포함한다.
화학치료적 제제는 암 세포의 증식을 감소시키는 비-펩타이드성 (즉, 비-단백질성) 화합물이고, 세포독성 제제 및 및 세포증식억제성 제제를 포괄한다. 화학치료적 제제의 비-제한 예는 알킬화 제제, 니트로소우레아, 항대사물질, 항종양 항생제, 식물 (빈카) 알칼로이드, 및 스테로이드 호르몬을 포함한다.
세포성 증식을 감소시키는 작용을 하는 제제는 당업계에서 알려지고 널리 사용된다. 그러한 제제는, 비제한적으로, 메클로레타민, 사이클로포스파미드 (CytoxanTM), 멜팔란 (L-사르콜리신), 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 세무스틴 (메틸-CCNU), 스트렙토조신, 클로로조토신, 우라실 머스타드, 클로르메틴, 이포스파미드, 클로람부실에틸렌, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포라민, 부술판, 다카르바진, 및 테모졸로미드를 포함하는 알킬화 제제, 예컨대 질소 머스타드, 니트로소우레아, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 및 트리아젠을 포함한다.
항대사물질 제제는, 비제한적으로, 시타라빈 (CYTOSAR-U), 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실 (5-FU), 플록수리딘 (FudR), 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 펜토스타틴, 5-플루오로우라실 (5-FU), 메토트렉세이트, 10-프로파길-5,8-디데아자폴레이트 (PDDF, CB37 l 7), 5,8-디데아자테트라하이드로엽산 (DDATHF), 류코보린, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 및 젬시타빈을 포함하는 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 및 아데노신 데아미나제 억제제를 포함한다.
적합한 자연 산물 및 그들의 유도체, (예를 들면, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생제, 효소, 림포카인, 및 에피포도필로톡신)은, 비제한적으로, Ara-C, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere®), 데옥시코포르마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 아자티오프린; 브레퀴나르; 알칼로이드, 예를 들면 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 등; 포도필로톡신, 예를 들면 에토포시드, 테니포시드 등; 항생제, 예를 들면 안트라사이클린, 다우노루비신 하이드로클로라이드 (다우노마이신, 루비도마이신, 세루비딘), 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 모르폴리노 유도체 등; 페녹시존 비스사이클로펩타이드, 예를 들면 닥티노마이신; 염기성 글리코펩타이드, 예를 들면 블레오마이신; 안트라퀴논 글리코시드, 예를 들면 플리카마이신 (미트라마이신); 안트라세네디온, 예를 들면 미톡산트론; 아지리노피롤로 인돌레디온, 예를 들면 미토마이신; 거대환식 면역억압제, 예를 들면 사이클로스포린, FK-506 (타크롤리무스, 프로그라프), 라파마이신 등; 및 기타 등등을 포함한다.
다른 항-증식성 세포독성 제제는 나벨벤, CPT-11, 아나스트로졸, 레트라졸, 카페시타빈, 렐록사핀, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 및 드롤록사핀이다.
항증식성 활성을 갖는 미세소관 영향 제제는 또한 사용에 적합하고, 비제한적으로, 알로콜히신 (NSC 406042), 할리콘드린(Halichondrin) B (NSC 609395), 콜히친 (NSC 757), 콜히친 유도체 (예를 들면, NSC 33410), 돌스타틴 10 (NSC 376128), 메이탄신 (NSC 153858), 리족신 (NSC 332598), 파클리탁셀 (Taxol®), Taxol® 유도체, 도세탁셀 (Taxotere®), 티오콜히신 (NSC 361792), 트리틸 시스테린, 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴 술페이트, 비제한적으로, 에오프틸론 A, 에포틸론 B, 디스코더몰리드를 포함하는 자연 및 합성 에포틸론; 에스트라무스틴, 노코다졸, 및 기타 등등을 포함한다.
사용에 적합한 호르몬 조절제 및 (합성 유사체를 포함하는) 스테로이드는, 비제한적으로, 아드레노코르티코스테로이드, 예를 들면 프레드니손, 덱사메타손 등; 에스트로겐 및 프레게스틴, 예를 들면 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 에스트라디올, 클로미펜, 타목시펜; 등; 및 부신피질 억압제, 예를 들면 아미노글루테티미드; l 7a-에티닐에스트라디올; 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스토락톤, 메틸프레드니솔론, 메틸- 테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 하이드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 류프롤라이드, 플루타미드(Flutamide) (Drogenil), 토레미펜(Toremifene) (Fareston), 및 Zoladex®를 포함한다. 에스트로겐은 증식 및 분화를 자극시키고, 그러므로 에스트로겐 수용체에 결합하는 화합물은 이 활성을 차단하는데 사용된다. 코르티코스테로이드는 T 세포 증식을 억제시킬 수 있다.
다른 화학치료적 제제는 금속 착물, 예를 들면 시스플라틴 (cis-DDP), 카르보플라틴, 등; 우레아, 예를 들면 하이드록시우레아; 및 하이드라진, 예를 들면 N-메틸하이드라진; 에피도필로톡신; 토포이소머라제 억제제; 프로카르바진; 미톡산트론; 류코보린; 테가푸르; 등을 포함한다. 다른 관심의 항-증식성 제제는 면역억제제, 예를 들면 마이코페놀산, 탈리도미드, 데속시스페구알린, 아자스포린, 레플루노미드, 미조리빈, 아자스피란 (SKF 105685); Iressa® (ZD 1839, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7- 메톡시-6-(3-(4-모르폴리닐)프로폭시)퀴나졸린 ); 등을 포함한다.
"탁산"은 파클리탁셀, 뿐만 아니라 임의의 활성 탁산 유도체 또는 전구약물을 포함한다. (본원에 유사체, 제형, 및 유도체 예컨대, 예를 들어, 도세탁셀, TAXOLTM, TAXOTERETM (도세탁셀의 제형), 파클리탁셀의 10-데스아세틸 유사체 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시카르보닐 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야 하는) "파클리탁셀"은 당업자에 알려진 기법을 활용하여 용이하게 제조될 수 있거나 (또한 WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; 미국 특허 번호 5,294,637; 5,283,253; 5,279,949; 5,274,137; 5,202,448; 5,200,534; 5,229,529; 및 EP 590,267 참고), 예를 들어, 미주리주 세인트루이스, Sigma Chemical Co.를 포함하는 다양한 상업적 공급원 (탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)로부터 T7402; 또는 탁수스 이안나넨시스(Taxus yannanensis)로부터 T-1912)으로부터 수득될 수 있다.
파클리탁셀은 파클리탁셀의 일반 화학적으로 이용가능한 형태뿐 아니라, 유사체 및 유도체 (예를 들면, 상기 언급된 대로, TaxotereTM 도세탁셀) 및 파클리탁셀 컨쥬게이트 (예를 들면, 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란, 또는 파클리탁셀-자일로스)를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "탁산" 내에 또한 포함된 것은 양쪽 친수성 유도체, 및 소수성 유도체를 포함하는 다양한 알려진 유도체이다. 탁산 유도체는, 비제한적으로, 국제 특허 출원 번호 WO 99/18113에서 기재된 갈락토스 및 만노스 유도체; WO 99/14209에서 기재된 피페라지노 및 다른 유도체; WO 99/09021, WO 98/22451, 및 미국 특허 번호 5,869,680에서 기재된 탁산 유도체; WO 98/28288에서 기재된 6-티오 유도체; 미국 특허 번호 5,821,263에서 기재된 술펜아미드 유도체; 및 미국 특허 번호 5,415,869에서 기재된 탁솔 유도체를 포함한다. 비제한적으로, WO 98/58927; WO 98/13059; 및 미국 특허 번호 5,824,701에서 기재된 것들을 포함하는 파클리탁셀의 전구약물을 추가로 포함한다.
예시적 구현예
본 개시내용은 HER2에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 HER2에 결합하는 조건부 활성 CAR, 그리고 그러한 CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 CAR을 생산하기 위해 유전적으로 변형된 세포, 및 그러한 세포의 제조 방법을 제공한다. 본 개시내용의 CAR은, 입양 세포 요법 예컨대 CAR 요법, 예를 들어 암에 대한 CAR 요법을 수행하는 방법을 포함하는, 또한 제공되는, 다양한 방법에서 사용될 수 있다.
일부 비-제한 예시적 양태 및 구현예가 본 섹션에서 제공된다. 일 양태에서 HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로,
a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인
을 포함하는 상기 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되고, 여기서 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 여기서 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서: HCDR1 서열은 GFNIKDTYIH (서열번호:131)이고; HCDR2 서열은 X1IYPTNGYTX2YADSVKG (서열번호:137)이고; HCDR3 서열은 WGGDGFYAMDY (서열번호:133)이고; ASTR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: LCDR1 서열은 RASQDVNTX3VA (서열번호:142)이고; LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고; LCDR3 서열은 QQX4YTTPPT (서열번호:143)이고, 식중 X1은 R 또는 K이고, X2는 R 또는 E이고, X3은 A 또는 D이고, X4는 H, D 또는 E이고; 여기서 ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 각각 R, R, A 및 H 이외이다.
바로 위 양태 및 본원에 제공된 임의의 다른 양태의 일부 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4는 각각 R, R, A, 및 H 이다. 바로 위 양태 및 본원에 제공된 임의의 다른 양태의 실례적 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4는 각각 R, R, A, 및 H 이외이다. 일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 X1, X2, X3, 및 X4는 각각 R, R, D, 및 H (VL-A032D); 각각 R, R, A, 및 D (VL-H091D); 각각 R, R, A, 및 E (VL-H091E); 각각 K, R, A, 및 H (VH-R050K); 또는 각각 R, E, A, 및 H (VH-R059E)일 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다. 서열번호:119의 FR은 잔기 1-25, 잔기 36-49, 잔기 67-98, 및 잔기 110-120을 포함한다. 서열번호:122의 FR은 잔기 1-23, 잔기 35-49, 잔기 57-88, 및 잔기 98-107을 포함한다.
또 다른 양태에서, HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로,
a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인
을 포함하는 상기 CAR이 본원에 제공되고, 여기서 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 여기서 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서: HCDR1 서열은 GFNIKDTYIH (서열번호:131)이고; HCDR2 서열은 X1IYPTNGYTX2YADSVKG (서열번호:137)이고; HCDR3 서열은 WGGDGFYAMDY (서열번호:133)이고; ASTR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서: LCDR1 서열은 RASQDVNTX3VA (서열번호:142)이고; LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고; LCDR3 서열은 QQX4YTTPPT (서열번호:143)이고, 식중 X1은 R 또는 K이고, X2는 R 또는 E이고, X3은 A 또는 D이고, X4는 H, D 또는 E이고; 여기서 ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 각각 R, R, A, 및 H 이외이다.
바로 위 양태 및 본원에 제공된 임의의 다른 양태의 일부 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4는 각각 R, R, A, 및 H이다. 바로 위 양태 및 본원에 제공된 임의의 다른 양태의 실례적 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4는 각각 R, R, A 및 H 이외이다. 일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 X1, X2, X3, 및 X4는 각각 R, R, D, 및 H (VL-A032D); 각각 R, R, A, 및 D (VL-H091D); 각각 R, R, A, 및 E (VL-H091E); 각각 K, R, A, 및 H (VH-R050K); 또는 각각 R, E, A, 및 H (VH-R059E)일 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다.
실례적 구현예에서, 위 단락에서의 양태에서 제공된 항-HER2 CAR 중 임의의 것의 ASTR은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이 5 내지 50개 (예를 들면 10개 내지 40개, 15개 내지 30개) 아미노산 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 임의의 양태 또는 구현예에 대하여 ASTR은 각자가 서열번호: 119 및 서열번호:122, 각각에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖고, K로서 X1, E로서 X2, D로서 X3, 또는 D 또는 E로서 X4의 1, 2, 3 또는 모두 4개를 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은, K로서 X1, E로서 X2, D로서 X3, 또는 D 또는 E로서 X4의 1, 2, 3 또는 모두 4개를 제외하고, 각자가 서열번호:119 및 서열번호:122 각각에 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로,
a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인
을 포함하는 상기 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되고, 여기서 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 여기서 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서: HCDR1 서열은 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고; HCDR2 서열은 RIX2PTX3X4YX5RYADSVKG (서열번호:139)이고; HCDR3 서열은 WGGDGFYX6MDY (서열번호:140)이고; ASTR은 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서: LCDR1 서열은 RASQDVNTX7VA (서열번호:142)이고; LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고; LCDR3 서열은 QQX8YTTPPT (서열번호:143)이고, 식중 X1은 N 또는 W이고; X2는 Y, D, 또는 K이고; X3은 N 또는 A이고; X4는 G 또는 K이고; X5는 T 또는 D이고;X6은 A 또는 E이고; X7은 A 또는 D이고; X8은 H, D, 또는 E이고; 여기서 ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, 및 X8의 조합은 각각 N, Y, N, G, T, A, A, 및 H 이외이다. 일부 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 가변 영역 돌연변이 S119E를 포함할 수 있다 일부 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, 및 X8의 조합은 각각 N, Y, N, G, T, A, A, 및 H이고, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함한다.
또 다른 양태에서, HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로,
a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인
을 포함하는 상기 CAR이 본원에 제공되고, 여기서 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 여기서 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서: HCDR1 서열은 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고; HCDR2 서열은 RIX2PTX3X4YX5RYADSVKG (서열번호:139)이고; HCDR3 서열은 WGGDGFYX6MDY (서열번호:140)이고; ASTR은 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서: LCDR1 서열은 RASQDVNTX7VA (서열번호:142)이고; LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고; LCDR3 서열은 QQX8YTTPPT (서열번호:143)이고, 식중 X1은 N 또는 W이고; X2는 Y, D, 또는 K이고; X3은 N 또는 A이고; X4는 G 또는 K이고; X5는 T 또는 D이고; X6은 A 또는 E이고; X7은 A 또는 D이고; X8은 H, D, 또는 E이고; 여기서 ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 X7, 및 X8의 조합은 각각 N, Y, N, G, T, A, A, 및 H 이외이다. 일부 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, 및 X8의 조합은 각각 N, Y, N, G, T, A, A, 및 H이고, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함한다.
실례적 구현예에서, 위 단락에서의 양태에서 제공된 항-HER2 CAR 중 임의의 것의 ASTR은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이 5개 내지 50개 (예를 들면 10개 내지 40개, 15개 내지 30개) 아미노산 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 임의의 양태 또는 구현예에 대하여 ASTR은 각자가 서열번호: 119에 및 서열번호:122, 각각에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖고, ASTR, 각각에서 위치 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, 및 X8에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 N, Y, N, G, T, A, A, 및 H를 포함하고, ASTR은 임의로 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은 각자가, ASTR, 각각에서 위치 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, 및 X8에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 N, Y, N, G, T, A, A, 및 H를 제외하고, 서열번호:119 및 서열번호:122 각각에 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로
a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인
을 포함하는 상기 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공되고, 여기서 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 여기서 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서: HCDR1 서열은 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고; HCDR2 서열은 X2IX3PTX4X5YX6X7YADSVKG (서열번호:141)이고; HCDR3 서열은 WGGDGFYX8MDY (서열번호:140)이고; ASTR은 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서: LCDR1 서열은 RASQDVNTX9VA (서열번호:142)이고; LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고; LCDR3 서열은 QQX10YTTPPT (서열번호:143)이고, 식중 X1은 N 또는 W이고, X2는 R 또는 K이고, X3은 Y, D, 또는 K이고, X4는 N 또는 A이고, X5는 G 또는 K이고, X6은 T 또는 D이고, X7은 R 또는 E이고, X8은 A 또는 E이고, X9는 A 또는 D이고, X10은 H, D, 또는 E이고; 여기서 ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 조합은 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H 이외이다;. 일부 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 조합은 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H이고, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함한다.
또 다른 양태에서, HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로,
a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인
을 포함하는 상기 CAR이 본원에 제공되고, 여기서 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 여기서 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서: HCDR1 서열은 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고; HCDR2 서열은 X2IX3PTX4X5YX6X7YADSVKG (서열번호:141)이고; HCDR3 서열은 WGGDGFYX8MDY (서열번호:140)이고; ASTR은 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서: LCDR1 서열은 RASQDVNTX9VA (서열번호:142)이고; LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고; LCDR3 서열은 QQX10YTTPPT (서열번호:143)이고, 식중 X1은 N 또는 W이고, X2는 R 또는 K이고, X3은 Y, D, 또는 K이고, X4는 N 또는 A이고, X5는 G 또는 K이고, X6은 T 또는 D이고, X7은 R 또는 E이고, X8은 A 또는 E이고, X9는 A 또는 D이고, X10은 H, D, 또는 E이고; 여기서 ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 조합은 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H 이외이다;. 일부 구현예에서, ASTR의 나머지는 CDR 이외 서열번호:119의 중쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 중쇄 가변 영역 (중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역), 및 CDR 이외 서열번호:122의 경쇄 가변 영역에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 경쇄 가변 영역 (경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역)을 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 조합은 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H이고, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함한다.
실례적 구현예에서, 위 단락에서의 양태에서 제공된 항-HER2 CAR 중 임의의 것의 ASTR은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이 5개 내지 50개 (예를 들면 10개 내지 40개, 15개 내지 30개) 아미노산 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 임의의 양태 또는 구현예에 대하여 ASTR은 각자가 서열번호: 119에 및 서열번호:122, 각각에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖고, ASTR, 각각에서 위치 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 X9 X10에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H를 포함하고, ASTR은 임의로 서열번호:119에서 넘버링된 경우에 중쇄 돌연변이 S119E를 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은 각자가, ASTR, 각각에서 위치 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 X9 X10에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H를 제외하고, 서열번호:119 및 서열번호:122 각각에 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는다.
CAR, 전달 현탁액, 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, ASTR은 VL-A032D, VL-H091D, VL-H091E, VH-R050K, 또는 VH-R059E 그리고, 하기 중 임의의 것에서, 임의로 동일한 N에서 C 배향으로, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는, 5개 내지 50개 아미노산 링커에 의해 전형적으로 분리된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
a. 실시예 2에서 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:153-248),
b. 실시예 2에서 조건부의 활성에 대하여 테스트된 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:157-248),
c. 실시예 2의 표 2에서 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:153-236),
d. 실시예 2의 표 3에서 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:154, 156, 159-162, 172-173, 175-176, 199, 또는 224), 또는
e. 실시예 2의 표 4에서 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:157-178).
CAR, 전달 현탁액, 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, ASTR은 VL-A032D, VL-H091D, VL-H091E, VH-R050K, 또는 VH-R059E를 포함할 수 있고 ASTR은 하기 중 임의의 것에서 전체 ASTR 서열에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는다:
a. 실시예 2에서 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:153-248),
b. 실시예 2에서 조건부의 활성에 대하여 테스트된 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:157-248),
c. 실시예 2의 표 2에서 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:153-236),
d. 실시예 2의 표 3에서 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:154, 156, 159-162, 172-173, 175-176, 199, 또는 224), 또는
e. 실시예 2의 표 4에서 ASTR들 중 어느 하나 (서열번호:157-178).
일부 구현예에서, 본원에 제공된 ASTR 중 임의의 것은 보존적 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:119에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있고 (서열번호:119에 비해 넘버링된) 하기 돌연변이들 중 하나 이상을 포함할 수 있고: Y033W, R059K, R059V, R059L, R059I, W099F, W099Y, D102E, D102K, D102R, D102H, D102G, D102S, D102T, D102N, D102Q, D102A, D102V, D102L, D102I, D102M, D102P, D102F, D102W, D102Y, G103S, G103T, G103A, G103L, Y100T, Y100F, T102E, T102K, T102R, T102G, T102S, T102C, T102Q, T102A, T102V, T102L, T102I, T102M, T102W, T102Y, F104R, F104V, F104L, F104I, F104M, F104P, F104W, F104Y, Y105T, Y105F, Y109E, Y109K, Y109R, Y109G, Y109S, Y109T, Y109C, Y109Q, Y109A, Y109V, Y109L, Y109I, Y109M, 또는 Y109W, 이들 각각은 파지 스크린에서 식별되었다 (Gerstner 등, 2002, J Mol Biol 321(5):851-862). 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:119에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있고 (서열번호:119에 비해 넘버링된) 하기 돌연변이들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: A072R, T074D, A079L, S097A, 또는 Y109V (Carter 등, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9). 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:119의 잔기 72, 74, 79, 97, 및 109에 하기 아미노산을 가진 서열번호:119에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다 (이들 아미노산 조합은 Carter 등 (1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9)의 각각의 4D5 변이체의 중쇄에서 개시된다): R, D, L, A, 및 V, 각각 (4D5-1); A, D, L, A, 및 V, 각각 (4D5-2); A, T, A, S, 및 V, 각각 (4D5-3); A, T, L, S, 및 V, 각각 (4D5-4); A, T, A, S, 및 V, 각각 (4D5-5); A, T, A, S, 및 V, 각각 (4D5-6); A, T, A, S, 및 Y, 각각 (4D5-7); 또는 A, T, A, S, 및 Y, 각각 (4D5-8).
일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:122에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:122에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있고 (서열번호:122에 비해 넘버링된) 하기 돌연변이들 중 하나 이상을 포함할 수 있고: N030G, N030S, N030L, N030I, Y049D, Y049E, Y049S, Y049T, Y049C, Y049Q, Y049A, Y049V, Y049L, Y049I, Y049M, Y049F, Y049W, Y049Y, F053K, F053R, F053G, F053S, F053T, F053A, F053V, F053L, F053I, F053M, F053W, F053Y, Y055D, Y055R, Y055H, Y055S, Y055T, Y055A, Y055V, Y055L, Y055F, Y055W, H091N, H091I, H091F, H091W, H091Y, Y092G, Y092S, Y092N, Y092M, Y092F, Y092W, T094S, T094N, T094L, T094M, T094F, 또는 T094W, 이들의 각각은 파지 스크린에서 식별되었다 (Gerstner 등, 2002, J Mol Biol 321(5):851-862). 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:122에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있고 (서열번호:122에 비해 넘버링된) 하기 돌연변이들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: Y055E 또는 R066G, 및 실례적 구현예에서 본원에 실시예에서 개시된 대로 Y055E (Carter 등, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9). 실례적 구현예에서, ASTR은 변형된 ASTR일 수 있고 서열번호:122의 잔기 55 및 66에 하기 아미노산을 가진 서열번호:122에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다 (이들 아미노산 조합은 Carter 등. (1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9)의 각자 4D5 변이체의 VL에서 개시된다): E 및 G, 각각 (4D5-1, 4D5-2, 및 4D5-3); E 및 R, 각각 (4D5-4, 4D5-5, 및 4D5-7); 및 Y 및 R, 각각 (4D5-6 및 4D5-8).
일부 구현예에서, ASTR은 실시예 2에서 ASTR 중 어느 하나의 서열 (서열번호:153-248)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 실시예 2에서 조건부의 활성에 대하여 테스트된 ASTR 중 어느 하나의 서열 (서열번호:157-248)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 실시예 2의 표 2에서 ASTR 중 어느 하나의 서열 (서열번호:153-236)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 실시예 2의 표 3에서 ASTR 중 어느 하나의 서열 (서열번호:154, 156, 159-162, 172-173, 175-176, 199, 또는 224)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 실시예 2의 표 4에서 ASTR 중 어느 하나의 서열 (서열번호:157-178)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, ASTR은, 다른 쇄의 어느 한쪽 VH 또는 VL N-말단을 가진, VH (서열번호:119 및 123-125) 및 VL (서열번호:122 및 126-130)의 조합들 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 여기서 조합은 VL-1 (서열번호:122)과 VH-1 (서열번호:119)의 조합들 중 임의의 것이 아니다. 일부 구현예에서, ASTR은 표 2에서 나타난 대로 VH 또는 VL N-말단을 가진 표 2에서 VH (서열번호:119 및 123-125) 및 VL (서열번호:122 및 126-130)의 조합들 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 여기서 조합은 VL-1 (서열번호:122)과 VH-1 (서열번호:119)의 조합들 중 임의의 것이 아니다. 이들 구현예들 중 임의의 것에서, VH 및 VL은 본원에 다른 곳에 제공된 링커들 중 임의의 것과 연결될 수 있다.
본원에 CAR 양태에서 제공된 대로, CAR은 ASTR, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 단일 전장 융합 폴리펩타이드이다. 다른 대안적 양태에서, 그러한 CAR은, 본원에 논의된 대로, 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 Split-Car일 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, 특정 실례적 구현예에서 CAR의 ASTR은 서열번호:119 및 122의 양쪽 서열을 포함하지 않는다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, CAR의 ASTR은 서열번호:119의 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일-쇄 가변 항체 단편과 동일한 HER2의 에피토프에 결합할 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, ASTR은 단일-쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 및 2가 단일-쇄 항체 또는 디아바디일 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단일-쇄 가변 단편일 수 있다.
중쇄 및 경쇄를 포함하는 ASTR과, CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, 중쇄 및 경쇄는 링커에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 길이로 5개 내지 100개 아미노산, 예를 들어, 길이로 5개 내지 50개 아미노산, 길이로 10개 내지 40개 아미노산, 또는 길이로 10개 내지 30개 아미노산일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호:1, 63-71, 144, 152, 또는 249 중 어느 하나일 수 있다.
중쇄 및 경쇄를 포함하는 ASTR과, CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, 중쇄는 경쇄에 N-말단일 수 있거나 경쇄는 중쇄에 N-말단일 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, CAR은 아미노 말단부터 카복시 말단까지, ASTR, 스토크 도메인, 막관통 도메인, 임의적 공-자극 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 단리된 핵산은 인식 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 도메인은 세포내 활성화 도메인에 C-말단이다. 일부 구현예에서, 스토크 도메인 및 막관통 도메인은 조합 스토크 및 막관통 도메인이다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, ASTR의 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체 또는 이의 단편은 비-TME에서 발생하는 상이한 pH와 비교하면 TME에서 pH에 HER2 단백질에 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있다. 그러한 CAR은 조건부 활성으로서 지칭될 수 있고, 본원에 CAB-CAR로서 또한 지칭된다. 일부 구현예에서, CAR을 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포는 CAR이 HER2를 결합시키는 때 활성화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 CAR은 비-TME에서 pH, 예를 들면, pH 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5에 비교하여 TME에서 pH, 예를 들면, pH 6.5, 6.6 6.7, 6.8 또는 6.9에 증가된 항-HER2 CAR 활성을 갖는 항-HER2 CAB-CAR일 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 항-HER2 CAR 활성은 HER2-발현 표적 세포와 인큐베이션시 T 세포의 활성화일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포의 활성화는 T 세포에 의한 T 세포 활성화 바이오마커의 증가된 발현, (세포내 또는 분비된) T 세포에 의한 사이토카인 생산, T 세포의 증식, 및 T 세포에 의한 표적 세포 사멸 중 하나 이상을 분석함으로써 결정될 수 있고, 여기서 상기 CAR 활성은 검정에서 측정되고, 여기서 본원에 제공된 CAR 중 임의의 것을 발현시키도록 유전적으로 변형된 세포 및 HER2-발현 표적 세포는 검정을 수행하기 위하여 유효 시간 동안 검정 배지에서 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 활성화는 T 세포에 의한 T 세포 활성화 바이오마커의 증가된 발현, T 세포에 의한 사이토카인 방출, 및 T 세포의 증식 중 하나 이상을 분석함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 마커, 예컨대 CD69 및 CD107a의 증가된 발현은 유세포 분석에 의해 검정될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화된 T 세포, 예컨대 IFNγ 및 IL-2에 의해 생산된 사이토카인은 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 검정될 수 있다. 투과성화된 세포의 유세포 분석은 세포내 사이토카인을 검출하는데 사용될 수 있다. ELISA 또는 샘플에서 여러 분석물을 측정하는 면역검정, 예컨대 R&D Systems에 의해 제공된 Luminex 검정은 분비된 사이토카인의 검출에 사용될 수 있다. T 세포 활성화 마커의 증가된 발현 및 사이토카인 생산을 검정하기 위한 대표적 방법은 실시예 3에 나타난다. 일부 구현예에서, T 세포의 증식은, 당업계에서 알려진 방법을 사용하여, 세포 추적 염료 희석에 의해 증식하는 세포의 구별되는 생성을 모니터링함으로써 검정될 수 있다. 일부 방법에서 세포의 모든 생성은 유세포 분석 히스토그램에서 상이한 피크로서 나타난다. 일부 구현예에서, 셀트레이스 바이올렛 키트는, 실시예 3에서 나타난 대로, T 세포 증식을 검정하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포에 의한 표적 세포 사멸은, 실시예 2에서 나타난 대로, 루시퍼라제 검정 또는 시험관내 실시간 사멸 검정에 의해 분석될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 pH에 CAB-CAR과 또 다른 pH에 CAB-CAR 사이 또는 CAB-CAR과 벤치마크 항체 사이 차이는, 본원에 다른 곳에 제공된 대로, 통계적 테스트를 사용하여 비교될 수 있다. 일부 구현예에서, CAB-CAR 활성은 생체내 검정을 사용하여 검출 및 분석될 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 생체내 검정은 HER-2 발현 종양을 갖거나 가질 포유동물 예컨대 마우스에 유전적으로 변형된 CAR-T 및/또는 NK 세포를 투여하고, 투여 후 경시적으로 종양의 크기를 분석함으로써 수행될 수 있다. 그러한 생체내 검정의 추가 구현예에서, TME 외부에 자리잡은 HER2-발현 세포의 사멸은 분석될 수 있다. 이들 생체내 검정에서 CAB-CAR은 TME의 외부에서, 예컨대 간. I, 예를 들어 제1 및 제2 pH에 각각에서 자리잡은 HER2-발현 세포에 비교해서 TME에서 HER2-발현 세포를 우선적으로 사멸시킬 것이다,
상기 기재된 시험관내 및 생체내 T 세포 활성화 검정에서 사용된 표적 세포는 HER2를 자연적으로 발현시킬 수 있거나 이들은 이식유전자의 강제된 발현에 의해 HER2를 발현시킬 수 있다. HER2를 자연적으로 발현시키고 이들 검정에 사용될 수 있는 대표적 세포주는_MCF-7, SK-OV-3, BT474, NCI-87, SK-BR-3, KATOIII, AGS,SNU-1, SNU-5, 및 Hs 746T를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 HER2를 발현시키도록 형질도입된다. 일부 구현예에서 HER2를 발현시키도록 형질도입된 표적 세포는 전장 인간 HER2를 발현시킨다. 일부 구현예에서 HER2를 발현시키도록 형질도입된 표적 세포는 ASTR에 의해 인식된 HER2 에피토프를 포함하는 인간 HER2 또는 이의 단편의 세포외 도메인을 포함하는 절두된 및/또는 융합 단백질을 발현시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 T 세포 및/또는 NK 세포는 pH에 유사한 의존이 있는 비-TME에서 발생하는 상이한 pH와 비교하면 TME에서 pH에 더욱 활성화된다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포 활성화는 HER2를 발현시키는 세포의 증가된 사멸, 사이토카인의 증가된 분비, 및/또는 증가된 증식을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, TME에서 pH는 5.0 내지 6.8의 범위일 수 있고 비-TME에서 pH는 7.0 내지 7.6의 범위일 수 있고, 예를 들어, TME에서 pH는 6.5 내지 6.8의 범위일 수 있고 비-TME에서 pH는 7.2 내지 7.5의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 ASTR의 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체 또는 이의 단편 할 수 있다 7.4의 pH에 비교하여 6.7의 pH에 HER2 단백질에 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR의 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체 또는 이의 단편은 TME에서 pH에 HER2 단백질에 대한 결합 친화성 대 비-TME에서 상이한 pH에 HER2 단백질에 대한 결합 친화성의 비 적어도 약 1.5:1, 적어도 약 2:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 8:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 70:1, 또는 적어도 약 100:1을 갖는다. 일부 구현예에서,
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, CAR의 ASTR은 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:119의 전체 가변 영역 또는 프레임워크 영역 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ASTR은 서열번호:122의 전체 가변 영역 또는 프레임워크 영역 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것에서, ASTR은 서열번호:119에서 넘버링에 기반된 중쇄의 위치 119에 S 내지 E 돌연변이를 포함할 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, CAR은, 본원에 다른 곳에 개시된 대로, 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열번호:72일 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, CAR은 스토크 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스토크 도메인은, 본원에 다른 곳에 개시된 대로, 서열번호:3-16 중 임의의 것일 수 있다. CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, CAR은 막관통 도메인 또는 조합된 스토크 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인 또는 조합된 스토크 및 막관통 도메인은, 본원에 다른 곳에 개시된 대로, CD8 알파 TM (서열번호:17); b) CD8 베타 TM (서열번호:18); c) CD4 TM (서열번호:19); d) CD3Z TM (서열번호:20); e) CD28 TM (서열번호:21); f) CD134 (OX40) TM: (서열번호:22); g) CD7 TM (서열번호:23); h) CD8 스토크 및 TM (서열번호:24); 및 i) CD28 스토크 및 TM (서열번호:25)일 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, 세포내 활성화 도메인은 본원에 다른 곳에 개시된 대로 CD3Z, CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, DAP12, FCERlG, FCGR2A, FCGR2C, DAP10/CD28, 또는 ZAP70에 적어도 80%, 90%, 또는 95%를 가질 수 있거나 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 (서열번호:26-52)에 적어도 80%, 90%, 또는 95%를 가질 수 있거나 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, CAR은 공-자극 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인 또는 4-1BB (CD137), B7-HCDR3, CD2, CD7, CD27, CD28, Lck 결합 (IC△)을 위하여 결실된 CD28, CD30, CD40, ICOS, OX40, BTLA, GITR, HVEM, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, BAFFR, SLAMf7, NKP80 (KLRF1), CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Rα, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, IA4, VLA1, VLA-6, C49f, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD18, CD19, CD29, CD49a, CD49D, CD69, CD84, CD96 (Tactile), CD103, CD160 (BY55), CRLF2, CSF2RB, CSF2RA, CSF3R, EPOR, LFA-1, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), FCGRA2, GHR, SLAMF4 (C244, 2B4), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PD-1, PSGL1, C100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, PAG/Cbp, SLP-76, TILR2, TILR4, TILR7, TILR9, Fc 수용체 감마 쇄, Fc 수용체 ε쇄, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR1, IFNGR2, IFNLR1, IL1R1, IL1RAP, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL6ST, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL18R1, IL18RAP, IL20RA, IL20RB, IL21R, IL22RA1, IL23R, IL27RA, IL31RA, LEPR, LIFR, LMP1, MPL, MYD88, OSMR, 또는 PRLR의 공자극 도메인, 또는 이들의 기능적 돌연변이체 및/또는 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공-자극 도메인은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 또는 서열번호:53-62 또는 84의 모두의 스트레치에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진 도메인을 포함할 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, 핵산은 인식 도메인, 예를 들면, eTag를 인코딩할 수 있고, 인식 도메인을 인코딩하는 핵산은, 본원에 다른 곳에 개시된 대로, 리보솜 스킵 서열에 의해 CAR을 인코딩하는 핵산으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스킵 서열은 T2A (2A-1)일 수 있다.
CAR 또는 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하거나, 임의로 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, CAR은 인식 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 도메인은 감독 기관-승인된 항체에 의해 인식될 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 도메인은 EGFR의 적어도 20개 연속 아미노산일 수 있다.
CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것의 실례적 구현예에서, 핵산은 인간 대상체에서 발현을 위하여 코돈 최적화된다. 따라서, CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것의 특정 구현예에서,
a. X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 R, R, D, 및 H, 각각 (A032D)이고, 중쇄 가변 영역은 핵산 서열 서열번호:145에 의해 인코딩되고, 경쇄 가변 영역은 핵산 서열 서열번호:149에 의해 인코딩되거나;
b. X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 R, R, A, 및 D, 각각 (H091D)이고, 중쇄 가변 영역은 핵산 서열 서열번호:145에 의해 인코딩되고, 경쇄 가변 영역은 핵산 서열 서열번호:150에 의해 인코딩되거나;
c. X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 R, R, A, 및 E, 각각 (H091E)이고, 중쇄 가변 영역은 핵산 서열 서열번호:145에 의해 인코딩되고, 경쇄 가변 영역은 핵산 서열 서열번호:151에 의해 인코딩된다.
CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예 중 임의의 것의 특정 구현예에서,
a. X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 K, R, A, 및 H, 각각 (R050K)이고, 경쇄 가변 영역은 서열번호:148에 의해 인코딩되고 항체 중쇄 가변 영역은 핵산 서열 서열번호:146에 의해 인코딩되거나;
b. X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 R, E, A, 및 H, 각각 (R059E)이고, 경쇄 가변 영역은 서열번호:148에 의해 인코딩되고 항체 중쇄 가변 영역은 핵산 서열 서열번호:147에 의해 인코딩된다.
또 다른 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 게놈을 포함하는 단리된 재조합 T 세포 또는 NK 세포가 본원에 제공되고, 여기서 하나 이상의 핵산 서열은 상기 구현예 중 임의의 것의 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 핵산 서열은 인식 도메인을 추가로 인코딩할 수 있고, 여기서 인식 도메인을 인코딩하는 핵산은 상기 개시된 리보솜 스킵 서열에 의해 CAR을 인코딩하는 핵산으로부터 분리된다.
또 다른 양태에서, 7.0 미만의 pH에 미세환경에서 T 세포 및/또는 NK 세포와 표적 포유류 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 또는 NK 세포를 활성화시키는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 표적 포유류 세포는 HER2를 발현시키고, 여기서 T 세포 또는 NK 세포는 상기 구현예 중 임의의 것의 CAR을 발현시킨다. 제 28 항에 있어서, 미세환경이 6.5 내지 6.8 pH를 갖는, 방법. 일부 구현예에서, 활성화는 사이토카인의 증가된 발현 및/또는 생산 및/또는 분비 및/또는 증가된 증식을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포는 접촉하기 전에 T 세포 또는 NK 세포에 의해 발현된 IL-2 또는 IFN-γ의 발현에 비교하여 IL-2 또는 IFN-γ의 발현을, 예를 들어, 적어도 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배만큼 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포의 세포독성 활성은 접촉하기 전에 T 세포 또는 NK 세포의 세포독성 활성에 비교하여 적어도 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 포유류 세포는 T 세포 또는 NK 세포의 활성화 후에 용해될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 접촉하기 전에, T 세포 또는 NK 세포를 이의 게놈내 CAR을 인코딩하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자로 형질도입시켜, T 세포 또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입하기는 생체외 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 미세환경의 pH를 7.0 이상의 pH로 증가시키고, 이에 의해 T 세포 또는 NK 세포의 활성화를 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 미세환경은, 인간 대상체에 있을 수 있는, 종양일 수 있다. 일부 구현예에서, 미세환경은 시험관내 또는 생체외일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법에서 활성화된 세포는 T 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 방법에서 활성화된 세포는 NK 세포일 수 있다.
또 다른 양태에서, 포유동물에서 항-종양 면역성의 제공 방법으로서, 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것의 CAR을 발현시키도록 유전적으로 변형된 세포의 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 항-종양 면역성은 HER2를 발현시키는 종양에 대해 항-종양 면역성을 제공하고, 이에 의해 포유동물에서 항-종양 면역성을 제공한다. 더욱 또 다른 양태에서 본원에 포유동물에서 항-종양 면역성을 제공하기 위한 키트의 제조에서, 이의 게놈내 본원에 제공된 임의의 CAR을 인코딩하는 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도가 본원에 제공된다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 HER2 양성 암을 갖는다. 이론에 의해 제한됨 없이, CAR-변형된 세포에 의해 유인된 항-종양 면역성 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있다. CAR-매개된 면역 반응은 CAR-변형된 세포가 CAR에서 ASTR에 특이적인 면역 반응을 유도하는 입양 면역요법 접근법의 부분일 수 있다. 예를 들어, 항-HER2 ASTR로 본원에 제공된 CAR을 발현시키는 세포는 HER2를 발현시키는 세포에 대해 특이적으로 면역 반응을 유인한다.
또 다른 양태에서, HER2의 상승된 발현과 연관된 질환, 장애, 또는 병태를 갖는 포유동물의 치료 방법으로서, 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것의 CAR을 발현시키도록 유전적으로 변형된 세포의 유효량을 포유동물에 투여하고, 이에 의해 포유동물을 치료하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 더욱 또 다른 양태에서 HER2의 상승된 발현과 연관된 질환, 장애, 또는 병태를 갖는 포유동물을 치료하기 위한 키트의 제조에서, 이의 게놈내 본원에 제공된 임의의 CAR을 인코딩하는 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도가 본원에 제공된다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 실례적 구현예에서, 질환은 암이고 포유동물은 HER2 양성 암을 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포는 본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 의해 유전적으로 변형된다.
또 다른 양태에서, 암 (예를 들면 유방암, 위암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 또는 요로상피성 방광암)을 가진 포유동물의 치료 방법으로서, 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것의 CAR을 발현시키도록 유전적으로 변형된 T 세포를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 초기 유방암, 전이성 유방암, 또는 위암을 가진 포유동물을 치료하는 단계를 포함한다. 더욱 또 다른 양태에서 유방암, 위암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 또는 요로상피성 방광암을 가진 포유동물을 치료하기 위한 키트의 제조에서, 이의 게놈내 본원에 제공된 임의의 CAR을 인코딩하는 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도가 본원에 제공된다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 실례적 구현예에서, 포유류 (예를 들면 인간) 대상체는 HER2+ 고형 종양(들)을 포함하는 재발성 암을 갖거나, 선행 요법에 불응성인 암을 갖는다. 실례적 구현예에서, 암은 유방암, 예를 들어 초기 유방암이다. 일부 구현예에서, 유방암은 림프절로 전이되지 않은 초기 유방암, 즉 결절-음성 질환이다. 일부 구현예에서, 결절-음성 질환은 에스트로겐 수용체/프로게스테론 수용체 (ER/PR)-음성이어야 하거나 적어도 하나의 고-위험 속성을 가져야 하고, 여기서 고-위험 속성은 적어도 2 cm의 종양 크기, 35세 이상의 대상체, 또는 2 또는 3의 종양 등급이다. 실례적 구현예에서, 암은 HER2 양성 암이다. 일부 구현예에서, T 세포는 본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 의해 유전적으로 변형된다.
또 다른 양태에서, 포유동물, 실례적 구현예에서 인간에서 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단의 생성 방법으로서, 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것의 CAR을 발현시키도록 유전적으로 변형된 T 세포를 포유동물 (예를 들면 인간)에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단은 투여후 적어도 7, 14, 21, 또는 28 일 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 또는 1, 2, 3, 4, 또는 5 년 동안 포유동물에서 지속한다. 더욱 또 다른 양태에서 포유동물에서 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단을 생성하기 위한 키트의 제조에서, 이의 게놈내 본원에 제공된 임의의 CAR을 인코딩하는 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도가 본원에 제공되고, 여기서 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단은 투여후 적어도 7, 14, 21, 또는 28 일 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 또는 1, 2, 3, 4, 또는 5 년 동안 포유동물에서 지속한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단은 포유동물에 투여된 T 세포, 포유동물에 투여된 T 세포의 자손, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단은 기억 T 세포를 포함한다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 HER2 양성 암을 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포는 본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 의해 유전적으로 변형된다.
또 다른 양태에서, 포유동물에서 유전적으로 변형된 T 세포의 집단의 확장 방법으로서, 본원에 개시된 구현예 중 임의의 것의 CAR을 발현시키도록 유전적으로 변형된 T 세포를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 투여된 유전적으로 변형된 T 세포는 포유동물에서 자손 T 세포의 집단을 생산한다. 더욱 또 다른 양태에서 포유동물에서 유전적으로 변형된 T 세포의 집단을 확장시키기 위한 키트의 제조에서, 이의 게놈내 본원에 제공된 임의의 CAR을 인코딩하는 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도가 본원에 제공된다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 일부 구현예에서, 포유동물에서 자손 T 세포는 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 구현예에서, 자손 T 세포의 집단은 투여후 적어도 7, 14, 21, 또는 28 일 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 또는 1, 2, 3, 4, 또는 5 년 동안 포유동물에서 지속한다. 일부 구현예에서, T 세포는 본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 의해 유전적으로 변형된다.
또 다른 양태에서, 포유동물 (예를 들면 인간)에서 표적 세포 집단 또는 조직에 T 세포-매개된 면역 반응을 자극시키는 방법으로서, 본원에 제공된 임의의 CAR을 발현시키도록 유전적으로 변형된 세포의 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 더욱 또 다른 양태에서 포유동물에서 표적 세포 집단 또는 조직에 T 세포-매개된 면역 반응을 자극시키기 위한 키트의 제조에서, 이의 게놈내 본원에 제공된 임의의 CAR을 인코딩하는 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도가 본원에 제공된다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 실례적 구현예에서, 포유동물은 HER2 양성 암을 갖는다.
투여하기의 단계를 포함하는 본원에 제공된 구현예의 양태 중 임의의 것의 특정 구현예에서, 투여하기는 본원에 치료 방법 섹션에서 개시된 대로 정맥내 투여, 피하 투여, 또는 종양내 투여를 통해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여하기 전에, 유전적으로 변형된 세포는, 예를 들어, 조건부 활성화가능한 세포를 생성하는 방법 섹션에서 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 단리된 혈액으로부터 농축된 최상부 단리물 T 세포 및/또는 NK 세포인 PBMC, a) 단리된 혈액으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 PBMC를 단리시키기 위해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 농축시키는 단계; b) 효과적 조건 하에서 농축된 PBMC의 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 단계; c) 효과적 조건 하에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자로 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키고, 이에 의해 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산하는 단계로서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 각각이 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 레트로바이러스성 게놈을 포함하고, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 본원에 제공된 임의의 구현예에 따라 CAB-CAR을 인코딩하는, 단계; 및 d) 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키고, 이에 의해 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
대상체, 포유동물, 및/또는 인간, 및 임의로 대상체에 세포를 투여하는 단계를 포함하는 본원에 제공된 구현예의 양태 중 임의의 것의 특정 구현예에서, 실례적 구현예에서, 포유동물은 HER2 양성 암, 실례적 구현예에서, HER2 양성 고형 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 그러한 암은 재발성 HER2 양성 암 (예를 들면 고형 종양)이다. 일부 구현예에서, HER2 양성 암은 HER2를 과발현시키는 세포에 의해 야기된 암이다. 한 구현예에서, HER2 양성 암은 HER2 유전자 증폭을 갖는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, HER2 양성 암은, 감독 기관-승인된 테스트, 예를 들어 미국 FDA-승인된 테스트, EMA-승인된 테스트, 또는 중국-FDA 승인된 테스트, 예를 들어, 본원에 다른 곳에 개시된 동반 진단 테스트 중 임의의 것에 의해 식별된다. 일부 구현예에서, 포유류 대상체 (예를 들면 인간)는 분석된 모든 종양 세포의 적어도 50%가 HER2 양성인 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투여하기는 HER2+ 암을 치료하는데, 또는 포유류 (예를 들면 인간) 대상체에서 하나 이상의 HER2+ 종양의 크기를 감소시키는데 효과적 용량 투여하기이다.
세포(들)을 임의로 투여하는 대상체, 포유동물, 또는 인간을 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예, 또는 세포(들), 특정 구현예에서 NK 세포(들), 및 실례적 구현예에서 T 세포(들)에 관한 양태 중 임의의 것의 특정 구현예에서, 대상체, 포유동물, 및/또는 인간 또는 T 세포(들) 및/또는 NK 세포(들)의 공급원은 항-HER2 항체 생물학적 요법, 예컨대 트라스투주맙 요법, 또는 이의 바이오시밀러를 이전에 받았거나, 현재 받고 있는 대상체, 또는 그러한 요법에 불응성이거나, 그러한 항-HER2 요법에서 상당한 유해 이벤트를 경험하고, 일부 구현예에서 이에 알러지성인 대상체이다. 일부 구현예에서, 포유동물 (예를 들면 인간) 대상체는 선행 트라스투주맙 요법을 네오아쥬반트 또는 아쥬반트 요법으로서 받았다. 일부 구현예에서, 포유동물 (예를 들면 인간) 대상체는, 특정 실례적 구현예에서, 포유류 대상체가 트라스투주맙 요법 (즉 허셉틴 요법), 또는 이의 바이오시밀러로 치료된 후 재발한 재발성 암 (예를 들면 재발성 유방암)을 갖는다.
본원에 방법 또는 용도 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 포유류 (예를 들면 인간) 대상체는 본원에 제공된 T 세포 및/또는 NK 세포의 집단이 대상체에 투여되기 전에 림프구제거 화학요법으로 치료된다. 예를 들어, 대상체는 본원에 제공된 T 세포 및/또는 NK 세포의 집단이 투여되기 전에 1, 2, 3, 4, 또는 5 연속 일 동안, 실례적으로 3 연속 일, 1 내지 30, 2 내지 15, 2 내지 11, 2 내지 7, 3 내지 5, 또는 2 내지 4 일 동안 림프구제거 화학요법이 투여될 수 있다. 대상체는 본원에 제공된 T 세포 및/또는 NK 세포 투여하기 전에 15 내지 120분 또는 30 내지 60분 아세트아미노펜 및/또는 디펜히드라민 또는 또 다른 H1-항히스타민이 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 조건부 활성화가능한 T 세포 또는 NK 세포를 제조하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 본 방법은 상기 구현예의 단리된 핵산 중 임의의 것에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 T 세포 또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법이 본원에 제공되고, 여기서 본 방법은 a) 단리된 혈액으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 PBMC를 단리시키기 위해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 농축시키는 단계; b) 효과적 조건 하에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자로 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키고, 이에 의해 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산하는 단계로서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자 각각이 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 레트로바이러스성 게놈을 포함하고, 하나 이상의 핵산 서열이 상기 구현예 중 임의의 것의 단리된 핵산을 포함하는, 단계; 및 d) 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 임의로 확장시키고, 이에 의해 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 수확하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 수확된 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에 도입하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 조건부 활성화가능한 T 세포 또는 NK 세포를 제조하는 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 변형된 T 또는 NK 세포가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 상기 구현예에서 단리된 핵산 중 임의의 것 그리고 CAR을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 복제 불능 레트로바이러스성 입자일 수 있다. 특정 실례적 구현예에서, 발현 벡터는 렌티바이러스성 벡터이다.
또 다른 양태에서, 상기 구현예의 단리된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자는 실례적 구현예에서, 전형적으로 렌티바이러스성 입자 발현 벡터인 렌티바이러스성 입자이다.또 다른 양태에서, 전달 용액에서 현탁된, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포, 실례적 구현예에서 T 세포의 집단을 포함하는 세포 현탁액, 주입가능한 현탁액, 또는 전달 현탁액이 본원에 제공되고, 여기서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 HER2를 결합시키기 위한 CAR을 인코딩하는, 본원에 제공된 핵산 중 임의의 것을 포함한다. 그러한 핵산은, 예를 들어, 본 예시적 구현예 섹션에서 제공된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 비-제한 예로서, 일 구현예에서, 핵산은 HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로,
a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인
을 포함하는 상기 CAR을 인코딩하고, 여기서 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 여기서 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서
HCDR1 서열은 GFNIKDTYIH (서열번호:131)이고;
HCDR2 서열은 X1IYPTNGYTX2YADSVKG (서열번호:137)이고;
HCDR3 서열은 WGGDGFYAMDY (서열번호:133)이고;
ASTR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서
LCDR1 서열은 RASQDVNTX3VA (서열번호:142)이고;
LCDR2 서열은 SASFLYS (서열번호:135)이고;
LCDR3 서열은 QQX4YTTPPT (서열번호:143)이고,
식중 X1은 R 또는 K이고, X2는 R 또는 E이고, X3은 A 또는 D이고, X4는 H, D 또는 E이고;
역서 ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4의 조합은 각각 R, R, A, 및 H 이외이다.
전달 용액은 5 내지 100 ml 또는 5 내지 50, 10 내지 50, 5 내지 50, 또는 5 내지 25 ml의 주입 용액, 실례적 구현예에서, 동결보존 주입 용액을 포함할 수 있다. 전달 용액은, 실례적 구현예에서 주입 백인, 컨테이너에 봉입된다. 전달 현탁액은 전달 동결보존 전달 용액에서 현탁액내 1x104 내지 1x1010, 예를 들어 1x104 내지 1x109, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 투여된 세포는 동종이형 세포일 수 있다. 실례적 구현예에서, 세포는 자가 세포이다. 숙련된 기술자는 본 명세서가 "HER2 CAB" 또는 "HER2 CAB-CAR"를 지칭하는 때 "HER2"가 HER2 또는 이의 에피토프를 인식하는 ASTR을 지칭한다는 것을 인식할 것이다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 제조 및 사용 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되고, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하기 위한 것이 아니고, 아래 실험들이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이 아니다. 사용된 숫자 (예를 들면 양, 온도, 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오류 및 편차는 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 근처이다. 표준 약어, 예를 들면, bp, 염기 쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스(들); bp, 염기 쌍(들); nt, 뉴클레오타이드(들); i.m., 근육내(로); i.p., 복강내(로); s.c., 피하(로); i.v., 정맥내(로); 및 기타 등등은 사용될 수 있다.
실시예 1: 인간 HER2 단백질에 조건부 활성 항-HER2 항체의 결합 활성
HER2 벤치마크 항체 (BM) 및 잠재적 CAB 항체의 항체 중쇄 및 경쇄는 전장 IgG 항체로서 발현되었고 ELISA를 사용하여 테스트되어 다양한 pH 값에 인간 HER2 단백질에의 결합을 측정하였다. 본 실시예에서 테스트된 CAB 항체는 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL)에서 돌연변이를 가졌고, 다른 쇄는 A032D 돌연변이가 있는 경쇄, 또는 아래 나타난 대로 BM 항체의 경쇄 또는 중쇄이었다. 항체는 2개 그룹에서 테스트되었고 (도 1a 및 1b) 중쇄 및 경쇄의 하기 조합을 포함하였다: 도 1a에서 - VH-wt/VL-wt (BM); VH-R050K/VL-wt; VH-R059E/VL-wt; VH-wt/VL-A032D; VH-wt/VL-H091D; VH-wt/VL-H091E; 및 도 1b에서 - VH-wt/VL-wt (BM); VH-N028W/VL-A032D; VH-Y052K/VL-A032D; VH-Y052D/VL-A032D; VH-N055A/VL-A032D; VH-G056K/VL-A032D; VH-T058D/VL-A032D; VH-A1063/VL-A032D; 및 VH-S119E/VL-A032D.
pH 범위 ELISA 검정
탄산염-중탄산염 코팅 완충액 중 100 μL의 1 μg/mL 재조합 인간 HER2 항원은 ELISA 플레이트로 피펫팅되었다. 플레이트는 밀봉 필름으로 피복되었고 4 ℃에 밤새 인큐베이션되었다. 플레이트는 경사분리되었고 잔류 액체는 툭툭 쳐져서 종이 타월의 더미로 빠져나왔다. 웰은 200 μL의 다양한 pH 인큐베이션 완충액을 웰에 분배하고 내용물을 완전히 흡인시킴으로써 2회 세정되었다. 200 μL의 다양한 pH 인큐베이션 완충액 (pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.4)은 웰에 첨가되었다. 플레이트는 밀봉 필름으로 피복되었고 실온에 60 분 동안 (200 rpm으로 설정된) 플레이트 진탕기에 배치되었다. 플레이트는 경사분리되었고 잔류 액체는 툭툭 쳐져서 종이 타월의 더미로 빠져나왔다. 테스트 서브스턴스는 pH 인큐베이션 완충액 (pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.4)에서 100 ng/mL까지 일련으로 희석되었다. 100 μL/웰의 희석된 테스트 서브스턴스는 플레이트에 첨가되었다. 플레이트는 밀봉 필름으로 피복되었고 실온에 60 분 동안 (200 rpm으로 설정된) 플레이트 진탕기에 배치되었다. 플레이트는 경사분리되었고 잔류 액체는 툭툭 쳐져서 종이 타월의 더미로 빠져나왔다. 웰은 200 μL의 pH 세정 완충액 (pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.4)을 첨가하고 완전히 흡인시킴으로써 3회 세정되었다. 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 이차 항체는 pH 인큐베이션 완충액 (pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.4)에서 1:2500으로 희석되었다. 100 μL 희석된 HRP 이차 항체는 각 웰에 첨가되었다. 플레이트는 밀봉 필름으로 피복되었고 실온에 60 분 동안 (200 rpm으로 설정된) 플레이트 진탕기에 배치되었다. 플레이트는 경사분리되었고 잔류 액체는 툭툭 쳐져서 종이 타월의 더미로 빠져나왔다. 웰은 200 μL의 pH 세정 완충액 (pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.4)을 첨가하고 완전히 흡인시킴으로써 3회 세정되었다. 50 μL의 3, 3', 5, 5' 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액은 각 웰에 첨가되었고 3 분 동안 실온에 인큐베이션되었다. 50 μL/웰의 1N 염산 (HCl)은 각 웰에 첨가되었다. 플레이트는 PerkinElmer EnSpire 2300 Multilabel Reader를 사용하여 450 nm에서 판독되었다.
결과
조건부 활성 항체의 각각 경우에, 중쇄 및 경쇄는 도 1a 및 1b에서 도시된 다양한 pH 값에 결합으로 상기 논의된 바와 같다. Y-축은 450 nm에 광학 밀도 (OD)를 도시한다. X-축은 인큐베이션 및 세정 완충액의 pH (pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.4)를 도시한다. 각 pH에 대하여 평균 OD 값은 GraphPad Prism 5.03을 사용하여 완충액의 pH에 대해 플롯팅되었다. 곡선 맞춤은 소프트웨어에 내장된 4-파라미터 모델을 사용하여 실시되었다. pH 6.0에서 결합 활성은 100%로 설정되었다. 결과는 도 1a 및 1b에서 도시된다. 테스트된 돌연변이는 더 낮은 pH에서, 예를 들어 6.0 또는 6.7 대 7.4의 pH에서 증가된 결합을 가진 환경에서 pH에 의존하는 HER2에 조건부 활성 결합을 보여주었다.
도 1b에서 CAB 항체에 대한 pH 곡선 (50% 결합 활성)의 변곡점은 아래 표 5에서 나타난다.
Figure pct00002
실시예 2: HER2 표적화를 위한 키메라 항원 수용체의 생산 및 시험관내 사멸 검정에 의한 활성의 분석
본 실시예는 본 발명의 특정 구현예의 CAR을 제조하는 방법을 입증하고, 이들 CAR을 발현시키는 CAR-T 세포의 사멸 활성을 입증한다. 게다가, 실례적 CAB-CAR로 제조된 일부 CAR-T 세포에 대하여 CAB CAR 활성을 입증하는 개념증명 실험은 제공된다. 7.4의 pH와 비교하면 6.7의 pH에서 HER2에 증가된 결합을 나타냈던 실시예 1의 항체의 일부를 구성하였던 항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은 수득되었고 중쇄 및 경쇄의 양쪽 배향으로 클로닝되어 96개 scFv ASTR의 패널을 함유하는 CAR을 인코딩하는 발현 벡터의 패널을 생성하였다. T 세포는 렌티바이러스성 입자 발현 벡터로 형질도입되었고 형질도입된 세포는 HER2-발현 표적을 사멸시키는 그들의 능력에 대하여 그리고 pH 7.4에 비교해서 pH 6.7에서 더 큰 사멸로 조건부 사멸시키는 그들의 능력에 대하여 HER2 양성 표적 세포에 대해 시험관내 종양 대리 검정에서 테스트되었다.
일시적 형질감염에 의한 재조합 렌티바이러스성 입자 생산
"F1XT 세포" 명칭의, Freestyle™ 293 Expression Medium (ThermoFisher Scientific)에서 일련의 성장에 의해 현탁 배양에 적응된 293T 세포 (Lenti-X™ 293T, Clontech)는 패키징 세포로서 사용되었다.
전형적 4 벡터 패키징 시스템은 사용되었고 (i) gag/pol, (ii) rev, 및 (iii) 슈도타이핑 요소 VSV-G를 인코딩하였던 3개 패키징 플라스미드를 포함하였다. 본 패키징 시스템의 4번째 벡터는 CD8 신호 펩타이드 (서열번호:72), 인간 HER2를 인식하는 scFv의 패널로부터 하나의 scFv, CD8 스토크 및 막관통 서열 (서열번호:24), CD137 세포내 도메인 (서열번호:53), 및 CD3z (서열번호:28) 이어서 EF1-a 프로모터에 의해 모두 구동된 T2A 및 eTag로부터 세포내 활성화 도메인으로 구성된 CAR을 인코딩하였던 (자가-불활성화를 초래하는 3' LTR에서 결실을 함유하는) 제3 세대 렌티바이러스성 발현 벡터 (CD8sp:aHER2:CD8:CD137:CD3z-T2A-eTag)인, 게놈성 플라스미드이었다. GMCSF 신호 펩타이드 및 EF1-a 프로모터에 의해 구동된 eTag를 인코딩하지만, CAR이 없는 렌티바이러스성 벡터 F1-0-01은 대조군 (GMCSFsp:eTag)으로서 사용되었다.
플라스미드 DNA는 패키징 세포를 함유하는 모든 30 mL의 배양액에 대하여 1.5 ml Gibco™ Opti-MEM™ 성장 배지에서 용해되었다. (약산에 용해된) 폴리에틸렌이민 (PEI) (Polysciences)은 1.5 ml Gibco™ Opti-MEM™에서 2 μg/mL까지 희석되었다. PEI 및 DNA의 3ml 혼합물은 2개의 제조된 시약을 2μg의 PEI 대 1μg의 DNA의 비로 조합함으로써 제조되었다. 5-분 실온 인큐베이션 후에, 2개 용액은 함께 철저히 혼합되었고, 실온에서 20 분 더 인큐베이션되었다. 최종 부피 (3 ml)는 125 mL 삼각 플라스크에서 1 × 106 세포/mL로 현탁액내 30ml의 패키징 세포에 첨가되었다. 세포는 그 다음 125 rpm으로 회전하고 형질감염을 위하여 8% CO2로 72 시간 동안 37 ℃에 인큐베이션되었다.
72 시간 후에, 상청액은 수확되었고 10 분 동안 1,200g로 원심분리에 의해 정화되었다. 정화된 상청액은 새로운 튜브로 경사분리되었다. 바이러스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전에 의해 정화된 상청액으로부터 정제되었다. 1/4 부피 PEG는 정화된 상청액에 첨가되었고 4 ℃에 밤새 인큐베이션되었다. 혼합물은 그 다음 (50ml 원추형 튜브에 대하여) 1 시간 동안 1600g로 또는 (500ml 원추형 튜브에 대하여) 1.5 시간 동안 1800g로 원심분리되었다. 상청액은 폐기되었고, 렌티바이러스성 입자 펠렛은 2% 락토스가 있는 PBS내 패키징 세포 배양액의 초기 부피의 1:100으로 재현탁되었다.
렌티바이러스성 입자는 일련의 희석 및 이식유전자 발현의 분석에 의해, 293T 및/또는 Jurkat 세포에의 형질도입 및 Lenti-X™ qRT-PCR Titration Kit (#631235) 또는 Takara로부터 p24 검정 ELISA 키트 (Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit#632200)를 사용하여 렌티바이러스성 게놈에 대한 FACS 또는 qPCR에 의한 이식유전자 발현의 분석에 의해 적정되었다.
T 세포 형질도입 및 확장
제조업체의 지침에 따라 RossetteSep™ 인간 T 세포 농축 칵테일 (Stemcell Technologies)을 사용하여 전체 인간 혈액으로부터 이전에 단리된 냉동된 범 T 세포는 0 일차에 해동되었고 인간 T 세포 배지 (X-VIVO15 (Lonza #04-418Q), 5% 인간 AB 혈청 (Valley Biomedical Inc., #HP1022), 재조합 인간 IL-2 (R&D 202-IL-010)로 보충된 1% N-아세틸 L-시스테인 (Sigma-Aldrich #A9165)에서 100 IU/mL의 최종 농도로 배양되었다. 1 일차에, 일차 인간 T 세포는 500,000세포/웰로 12-웰 플레이트에 씨딩되었고 1:3 세포:비드 비로 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Thermo #11131D)를 사용하여 활성화되었다. 2 일차에, 렌티바이러스성 입자는 10의 MOI로 웰에 첨가되었다. 형질도입된 T 세포는 또 다른 2 일 동안 인간 T 세포 배지내 ~106/mL로 유지되었고, 그 다음 IL-2로 보충된 30 mL/웰의 인간 T 세포 배지가 있는 6-웰- G-Rex 플레이트의 웰로 이동되었다. 세포는 이틀에 한번 IL-2를 첨가하면서 적어도 10 일 동안 배양되었다. 형질도입 효율은 세툭시맙, CD3, CD4, 및 CD8로 세포를 염색하고, Novocyte 유세포 분석기 (ACEA)를 사용하여 eTAG의 발현에 대하여 T 세포를 사정함으로써 11 일차에 사정되었다.
사멸 검정
양쪽 루시퍼라제-기반된 사멸 검정 및 실시간 사멸 검정은 형질도입된 T 세포의 세포독성 활성을 측정하는데 사용되었다. 상기 기재된 대로 HER2에 관한 CAR (온-테스트 CAR-T 세포)로 형질도입된 일차 T 세포는 효과기 세포로서 사용되었다.
루시퍼라제-기반된 사멸 검정 경우에, HER2의 세포외 도메인 및 초파리 루시퍼라제 (CHO-S-HER2 FFLuc)와 함께 인간 PDGFR의 세포내 도메인의 막관통 및 처음 5개 잔기를 포함하는 변형된 인간 HER2를 안정하게 발현시키도록 조작된 CHO-S 세포는 표적 세포로서 사용되었다. 냉동된 효과기 세포는 해동되었고 100 IU/ML의 IL-2를 함유하는 인간 T 세포 배지에서 2 일 동안 휴지되었다. 표적 세포는 삼중으로 pH 6.7 및 pH 7.4로 조정된 40mM HEPES 및 PIPES를 함유하는 인간 T 세포 배지에서 96 웰 편평 바닥 플레이트내 30,000 세포 / 웰로 씨딩되었고 37 ℃ 및 5% CO2에 1 시간 동안 부착하게 되었다. eTag 발현에 의해 측정된 경우에 성공적으로 형질도입된 효과기 세포는 9:1의 효과기:표적 비로 배양액에 첨가되었고 37 ℃ 및 5% CO2에 표준 가습된 인큐베이터에서 배양되었다. 참조로서, 각 플레이트는 효과기 세포가 첨가되지 않았던 것에 삼중으로 pH 6.7 및 pH 7.4에서 표적 세포를 포함하였다. 2, 4, 및 6, 시간 시점에 또는 4, 5, 및 6 시간 시점에, 플레이트는 아래로 회전되었고, 상청액은 제거되었고, 용해되지 않은 세포에서 잔류하는 루시퍼라제는 제조업체의 지시에 따라 One-Glo™ Luciferase Assay System (Promega)을 사용하여 검정되었다. 형광 잔류는 (측정된 형광) / (표적 단독 형광의 평균) x 100%로서 계산되었다. 용해는 100% - 형광 잔류로서 계산되었다. 일부 후보는 상이한 날에 운용된 2개 별도 검정에서 포함되었다.
실시간 사멸 검정 경우에, 형질도입된 T 세포의 세포독성 활성은 xCELLigence System (ACEA)에 의해 측정되었다. HER2의 세포외 도메인 및 인간 PDGFR의 세포내 도메인의 막관통 및 처음 5개 잔기를 포함하는 변형된 인간 HER2를 안정하게 발현시키도록 조작된 CHO-S 세포는 표적 세포로서 사용되었다. 냉동된 효과기 세포는 해동되었고 100 IU/ML의 IL-2를 함유하는 인간 T 세포 배지에서 2 일 동안 휴지되었다. 표적 세포는 pH 6.7 및 7.4에 40mM HEPES 및 PIPES를 함유하는 인간 T 세포 배지를 이용한 실험 1일 전에 20K 세포/웰로 E-플레이트에 씨딩되었다. 검정의 당일에, 휴지된 효과기 세포는 3:1, 1:1, 및 일부 경우에, 0.3:1의 효과기 세포/표적 세포 비 (E/T)로 실험적 웰에 첨가되었다. 임피던스 판독은 효과기 세포 첨가 후에 대략 30 시간 동안 매 5 분 실시되었고 임피던스는 세포 지수(CI)로서 보고되었다. 구체적 세포용해의 백분율은 다음처럼 계산되었다 ((CI 표적 + 대조군 바이러스 형질도입된 효과기 T 세포) - (CI 표적 + HER2에 관한 CAR로 형질도입된 효과기 T 세포)) / (CI 표적 + 대조군 바이러스 형질도입된 효과기 T 세포) × 100.
결과
5.0 내지 6.7 대 7.4의 pH에서 HER2에 증가된 결합을 갖는 항체로부터 식별된 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 작제된 ASTR을 포함하였던 HER2를 결합시키기 위한 후보 키메라 항원 수용체 (CAR)의 패널은 제조되었다 (예를 들면, 실시예 1 참고). 그러므로, 이들 CAR은 그러므로 (때때로 본원에 (CAB-CAR)로서 지칭된) 정상 조직에 비교하여 종양 환경의 감소된 pH에서 증가된 활성을 갖는 것으로 믿어진다. CAR은 HER2에 관한 그러한 ASTR의 패널을 다른 CAR 도메인 및 eTag 도메인과 조립함으로써 제조되었다. 본원에 기재된 사멸 검정에서 사용된 ASTR은 96개의 고유 scFv에 상이한 조합 및 배향으로 정렬된 4개 항체 중쇄, 2개 링커, 및 6개 항체 경쇄에서 유래되었다. 이들 ASTR에서 포함된 중쇄는 벤치마크 중쇄, VH-1 (서열번호:119), VH-1에 기반된 후술 중쇄; 돌연변이 R059E를 함유하였던 VH-2 (서열번호:123), 돌연변이 R050K를 함유하였던 VH-3 (서열번호:124), 및 양쪽 돌연변이 R050K 및 R059E를 함유하였던 VH-4 (서열번호:125)이었다. 15개 아미노산 링커, 링커 A (서열번호:63), 또는 30개 아미노산 링커, 링커 B (서열번호:64)는 중쇄 및 경쇄를 결합시켰다. 이들 ASTR에서 경쇄는 벤치마크 경쇄, VL-1 (서열번호:122), 및 VL-1에 기반된 후술 경쇄; 돌연변이 H091E를 함유하였던 VL-2 (서열번호:126), 돌연변이 H091D를 함유하였던 VL-3 (서열번호:127), 돌연변이 A032D를 함유하였던 VL-4 (서열번호:128), 양쪽 돌연변이 A032D 및 H091D를 함유하였던 VL-5 (서열번호:129), 및 양쪽 돌연변이 A032D 및 H091E를 함유하였던 VL-6 (서열번호:130)이었다. 본 실시예에서 사용된 CAR 도메인은 CD8 스토크 및 막관통 서열 (서열번호:24), CD137 세포내 공-자극 도메인 (서열번호:53), 및 CD3z로부터 세포내 활성화 도메인 (서열번호:28)이었다.
본 실시예에서 상기 기재된 대로 CAR의 ASTR을 형성하기 위한 적어도 하나의 구성에서 scFv로서 배열된 때, 양쪽 벤치마크 및 돌연변이체를 포함하는, 중쇄 및 경쇄의 각각은, eTag 단독을 인코딩하는 작제물로 형질도입된 효과기 세포보다 양호하게, 루시퍼라제 검정에서 pH6.7 및/또는 pH7.4에 CHO-S-HER2 표적을 사멸시키기 위한 이들 작제물로 형질도입된 효과기 세포의 능력에 의해 결정된 경우 기능적 CAR을 형성하는 능력을 보유하였다. 표 2는, 루시퍼라제 검정에서 CHO-S-HER2 표적 세포를 인식하고 사멸시키는 능력을 입증하였던, 테스트된 96개 구성들 중 84개에 대하여 CAR 작제물, 형질도입 효율, N-말단 쇄, 링커, C-말단 쇄, 및 scFv ASTR 서열 ID를 보여준다.
Figure pct00003
Figure pct00004
본 루시퍼라제 검정에서, 배경 수준 이상의 CHO-S-HER2 세포의 사멸은 하기 작제물에 대하여 관찰되지 않았다; X4-85 (F1-4-06) (서열번호:237), X4-86 (F1-4-19) (서열번호:238), X4-87 (F1-4-24) (서열번호:239), X4-88 (F1-4-55) (서열번호:240), X4-89 (F1-4-58) (서열번호:241), X4-90 (F1-4-59) (서열번호:242), X4-91 (F1-4-62) (서열번호:243), X4-92 (F1-4-68) (서열번호:244), X4-93 (F1-4-70) (서열번호:245), X4-94 (F1-4-78) (서열번호:246), X4-95 (F1-4-87) (서열번호:247), 및 X4-96 (F1-4-92) (서열번호:248). 이들 작제물은 추가로 특성규명되지 않았다. 본 발명자들은, 하지만, 이들 작제물이 최적화되었다면, ASTR이 HER2를 결합하는 것으로 입증된 중 및 경 항체 쇄를 사용하여 설계됨에 따라 이들 ASTR의 일부 또는 전부가 CHO-S-HER2 세포 또는 다른 HER2-발현 세포의 CAR 사멸을 촉진시킬 수 있음이 가능하다고 믿는다 (예를 들면, 실시예 1 참고).
CHO-S-HER2 세포에 대한 일차 T 및 NK 세포에서 발현된 후보 CAR의 세포독성 활성은 상기 기재된 루시퍼라제 검정을 사용하여 7.4의 pH (생리학적 pH) 및 6.7의 pH (대리 종양 검정 조건)에서 분석되었다. 지시된 CAR로 형질도입된 효과기 세포에 의해 4 내지 6 시간에 CHO-S-HER2 표적의 퍼센트 용해를 도시하는 플롯은 도 2 및 도 3에서 도시된다. 도 2에서 CAR의 ASTR은 모두 구조 경쇄 - 링커 A - 중쇄. rk; X4-20 (R059E), X4-21 (R050K), X4-23 (H091D), X4-24 (A032D), 및 X4-72 (H091E)를 갖는다. 도 2에서 X4-04에 대한 그래프는 벤치마크 작제물이 사멸 활성을 나타내지만, 퍼센트 용해가, 이것이 야생형 CAR인 것을 나타내는, 7.4 및 6.7의 pH에서, 특히 6 시간 시점에 필적함을 도시한다. 도 2에서 다른 CAR의 각각 경우에, 퍼센트 용해는 X4-20, X4-21, X4-23, X4-24, 및 X4-72가 각 CAB-CAR인 것을 나타내는 pH 7.4 보다 pH 6.7에서 더 크다.
도3에서 데이터는 돌연변이 H091D가 도입된 벤치마크 항체 경쇄 (VL-3) 및 VH-1을 포함하는 CAR에 비교해서 벤치마크 항체 경쇄 (VL-1) 및 벤치마크 항체 중쇄 (VH-1)를 포함하는 CAR의 사멸 활성을 보여준다. 도 3a는 링커 A에 의해 어느 한쪽 배향으로 연결된 VL-1 및 VH-1을 포함하는 CAR이 CAB 활성을 나타내지 않고 그래서 야생형 CAR인 것을 도시한다. 대조적으로, 링커 A에 의해 어느 한쪽 배향으로 연결된 VL-3 및 VH-1을 포함하는 CAR은 CAB CAR이다. 비슷하게, 도 3b는 링커 B에 의해 어느 한쪽 배향으로 연결된 VL-1 및 VH-1을 포함하는 CAR이 CAB 활성을 나타내지 않고 그래서 야생형 CAR인 것을 도시하다. 대조적으로, 링커 B에 의해 어느 한쪽 배향으로 연결된 VL-3 및 VH-1을 포함하는 CAR은 CAB CAR이다. 그러므로, 링커 및 항체 쇄의 배향은 변화될 수 있고, VL-3을 포함하는 이들 CAR은 CAB 활성을 유지한다.
표 3에서 데이터는 중쇄 및 경쇄의 배향이 역전되는 때 CAB-CAR 활성을 보유하는 능력이 VL-3의 H091D 돌연변이에 고유하지 않음을 보여준다. 표 3은 대표적 CAR 작제물, 형질도입 효율, scFv에서 중 및 경 항체 쇄의 배향, 벤치마크 서열에 비교해서 각 CAR 작제물에 존재하는 돌연변이, pH 6.7 대 7.4에서의 용해 비, 및 이 용해 비에 기반된 작제물의 카테고리를 보여준다. 후보는 그들의 pH 6.7 대 7.4 용해 비 성능에 기반하여 3개 카테고리 중 하나로 그룹화되었고; 작제물의 모두는 6 시간에 25% 초과 용해를 산출하였다. 1.12 이하의 낮은 내지 높은 pH에 % 용해의 비를 산출하였던 그들 후보 CAR은 야생형 활성 ("WT")을 갖는 것으로서 카테고리화되었고, 1.12 초과의 낮은 내지 높은 pH에 % 용해의 비를 산출하였던 그들 후보는 CAB 활성 ("CAB")을 갖는 것으로서 카테고리화되었다. 1.12 컷오프는 이들 검정에서 벤치마크의 성능에 기반되었다. 각 검정에서 샘플 경우에, 삼중으로 운용된 샘플의 중앙값은 퍼센트 용해에 사용되었다. 2개의 별도 검정에서 운용된 샘플 경우에, 퍼센트 용해의 평균은 사용되었다.
Figure pct00005
항체 검정에서 CAB 활성을 담당하는 것으로서 식별된 중쇄 또는 경쇄 돌연변이체를 갖는 ASTR을 포함하였던 CAR 작제물의 모두 (예를 들면, 실시예 1 참고)는 X4-47을 제외하고 이 루시퍼라제 사멸 검정에 의해 CAB-CAR 활성을 가졌다. X4-47은, 하지만, X4-47이 CAB-CAR인 것을 나타내는, 양쪽 3:1 및 1:1의 효과기 대 표적 비에 실시간 임피던스-기반된 사멸 검정에서 CAB-CAR 활성을 나타냈다.
도 4는 2개 샘플에 대하여 실시간 사멸 검정의 결과를 도시한다. 도 4a는 벤치마크 CAR, X4-03을 발현시키는 효과기 세포에 의한 CHO-S-HER2 표적 세포의 사멸을 도시한다. pH 6.7 및 7.4에 퍼센트 특이적 용해는 필적하여, X4-03이 CAB-CAR이 아님을 나타낸다. 대조적으로, 도 4b는 pH 7.4보다 pH 6.7에서 더 큰 퍼센트 특이적 용해를 도시하여, X4-16이 CAB-CAR임을 나타낸다. X4-16 (서열번호:168)의 scFv는 양쪽 R050K 및 R059E 돌연변이를 포함하여, CAB 활성을 담당하는 개별 돌연변이가 조합되어 CAB CAR을 생성할 수 있음을 입증한다.
22개 CAR은 CHO-S-HER2 표적 세포를 사용하는 적어도 하나의 루시퍼라제 또는 실시간 임피던스-기반된 사멸 검정 일차 스크린에서 높은 pH에 비교해서 낮은 pH에서 더 큰 사멸과 함께 루시퍼라제 검정에서 사멸 및 강한 CAB 활성을 보여주었다. 이들 22개 CAB CAR에 대하여 ASTR의 동일성 및 서열은 표 4에 제공된다.
Figure pct00006
실시예 3: 활성화 마커의 발현, 사이토카인 생산, 및 증식에 의한 대표적 CAB CAR의 추가 시험관내 분석
본 실시예에서, HER2 CAR 후보는 종양 미세환경 (TME) 조건 (pH 6.7) 및 정상 생리학적 조건 (pH 7.4) 하에서 HER2 양성 표적 세포에 CAR-T 세포의 노출 후 활성화 마커의 그들의 발현, 사이토카인의 생산, 및 증식을 연구함으로써 시험관내 CAB 활성에 대하여 테스트되었다.
재조합 렌티바이러스성 입자는 실시예 2에서 기재된 대로 생산되었다. 상이한 HER2 CAR 변이체를 인코딩하였던 몇몇 게놈성 플라스미드는 사용되었다. "WT1"은 IgK 신호 펩타이드 (서열번호: 250), 자체가 CAB 활성을 나타내지 않는 항체 중쇄 및 경쇄 조합을 포함하였고 링커 C에 의해 연결된 scFv (서열번호: 249), CD8 스토크 및 막관통 서열 (서열번호: 24), CD137 세포내 도메인 (서열번호: 53), 및 CD3z (서열번호:28) 이어서 EF1-a 프로모터에 의해 모두 구동된 T2A 및 eTag로부터 세포내 활성화 도메인으로 구성된 비-CAB CAR 대조군이다. 본 실시예에서 연구된 후보 CAB-CART 1 내지 4의 각각은 CAB CAR 활성을 나타내는 경우 실시예 2에서 식별된 동일한 항체 중쇄 (VH-A) 및 항체 경쇄 (VL-A)를 포함하였다. 게다가, 항체 쇄는 후보 1 내지 4의 각각에 대하여 동일한 배향에서 배열되었다. 후보 1 내지 4는 신호 펩타이드의 그들의 조합, 링커, 및 히스티딘 태그 (서열번호: 251)가 scFv와 CD8 스토크 사이 스토크 영역에서 존재하는지 여부만 상이하다. 신호 펩타이드는 어느 한쪽 IgK 신호 펩타이드 (서열번호: 250) 또는 CD8 신호 펩타이드 (서열번호: 72)에서 나왔다. 링커는 어느 한쪽 링커 "A" (서열번호: 249), 링커 "B" (서열번호: 1), 또는 링커 "C" (서열번호: 64)이었다. T 세포는 이들 렌티바이러스성 입자로 형질도입되었고 실시예 2에서 기재된 대로 확장되었고 냉동되었다.
하기 방법은 온-테스트 형질도입된 T 세포가, HER2를 발현시키는 것으로 알려지는, MCF-7 세포와 조합된 때 활성화 마커 및 사이토카인 생산을 검사함으로써 CAR-T 세포 활성화를 사정하는데 사용되었다. 1 일차에, 냉동된 형질도입된 T 세포는 해동되었고 효과기 세포로서 사용을 위하여 37 ℃ 및 5% CO2에 100 IU/ML의 IL-2를 함유하는 X-VIVO 15에 2 일 동안 인큐베이션되었다. 2 일차에, MCF-7 표적 세포는 높은 및 낮은 pH에 100μl 표적 세포 배지 (10% 열 불활성화된 FBS, 1% Pen/Strep, 1%MEM NEAA, 1% 피루브산나트륨을 함유하고 pH 6.7 또는 pH 7.4로 조정된 40mM HEPES 및 PIPES를 함유하는 DMEM)에서 96 웰 편평 바닥 플레이트내 30,000 세포 / 웰로 씨딩되었고, 37℃ 및 5% CO2에 인큐베이션되었다. 3 일차에, 높은 및 낮은 pH에 100μl 효과기 세포 배지 (X-VIVO15 (Lonza #04-418Q), 5% 인간 AB 혈청 (Valley Biomedical Inc., #HP1022), 1% N-아세틸 L-시스테인 (Sigma-Aldrich #A9165), 0.9% 1N NaOH 그리고 pH 6.7 또는 pH 7.4로 조정된 40mM HEPES 및 PIPES 함유)내 90,000개의 적절한 효과기 T 세포는 플레이팅된 표적 세포에 첨가되었고 37℃ 및 5% CO2에 인큐베이션되었다. CD69 표면 발현의 분석을 위하여, 자극된 세포는 4 일차에 수확되었고 CD69, eTag, CD3, CD4, 및 CD8에 대하여 염색되었다. 세포내 IFN 감마의 분석을 위하여, 자극된 세포는 4 일차에 수확되었고 BD Perm/Wash Buffer (BD Biosciences Cat# 554723)로 투과된 후 eTag, CD3, CD4, CD8, 및 IFN 감마에 대하여 염색되었다.
CD107a 표면 발현의 분석을 위하여, 항-CD107a PE (eBioscience Cat# 12-1079-42), 브레펠딘 A, 및 모넨신은 자극의 시작에 첨가되었다. 세포는 5 시간 동안 37℃ 및 5% CO2에 인큐베이션되었다. 5 시간의 자극 후에, 세포는 eTag, CD3, CD4, 및 CD8에 대하여 염색되었다. 염색된 세포는 BD 사이토픽스(Cytofix)를 사용하여 고정되었고 4℃에 밤새 FACS 완충액에 방치되었다. 이들 검정에서 사용된 상업적 항체는 항-CD3 (Biolegend Cat# 317344), 항-CD4 (Biolegend Cat# 317412), 항-CD8 (Biolegend Cat# 301048), 항-CD69 (BioLegend CAT#310932), 항-CD107a (eBioscience Cat# 12-1079-42) 및 항-IFNγ (BD Pharmigen Cat#557643 또는 #552887)이었다.
하기 방법은 CAR-T 세포 활성화의 지표로서 증식을 사정하는데 사용되었다. 1 일차에, 냉동된 형질도입된 T 세포는 해동되었고 효과기 세포로서 사용을 위하여 37 ℃ 및 5% CO2에 5% AB 혈청, 10mM NAC, 및 100 IU/ML의 IL-2를 함유하는 X-VIVO 15에서 2 일 동안 인큐베이션되었다. 3 일차에, MCF-7 표적 세포는 10 μg/ml의 최종 농도에서 미토마이신 C로 처리되었고, 3시간 동안 37℃ 및 5% CO2에 인큐베이션되었고, PBS에서 세정되었다. MCF7 세포는 그 다음 500μl 표적 세포 배지 (10% 열 불활성화된 FBS, 1% Pen/Strep, 1%MEM NEAA, 1% 피루브산나트륨을 함유하고 pH 6.7 또는 pH 7.4로 조정된 40mM HEPES 및 PIPES를 함유하는 DMEM)에서 48 웰 편평 바닥 플레이트내 100,000 세포 / 웰로 씨딩되었다. 효과기 세포는 수확되었고 제조업체의 프로토콜 (#C34557, ThermoFisher)에 따라 셀트레이스 바이올렛으로 표지화되었다. pH 6.7 또는 pH7.4에서 500 μl의 표적 세포 배지내 100,000 CAR+ 효과기 세포는 상응하는 pH에서 표적 세포에 첨가되어 1:1의 효과기 대 표적 비를 확립하였고 37℃ 및 5% CO2에 인큐베이션되었다. 8 일차에, 세포는 수집되었고 CD3, CD8, 및 7AAD에 대하여 염색되었다. 효과기 세포가 증식함에 따라, 셀트레이스 바이올렛의 양은 감소하고 유세포 분석에 의해 검출가능하다. 이들 검정에서 사용된 상업적 항체는 항-CD3 (Biolegend Cat# 317306), 항-CD4 (Biolegend Cat# 317412), 항-CD8 (Biolegend Cat# 300914), 및 항-7AAD (Biolegend Cat# 420404)이었다.
이들 대표적 시험관내 검정에 의해 측정된 경우 TME 및 정상 생리학적 조건 하에서, HER2를 발현시키는 것으로 알려지는, MCF7 표적 세포에 의한 이들 후보 CAB CAR-T 효과기 세포의 T 세포 활성화의 상대 수준은 도 5 내지 8에서 도시된다.
도 5는 MCF7 표적으로 1 일의 공배양 후에 CD3+eTAG+ 세포에서 CD69의 MFI를 도시한다. 대조군 CAR, WT1은 높은 pH에 비교해서 낮은 pH에 CD69 MFI에서 약간의 감소를 보여주었다. 대조적으로, 후보 1 내지 4는 낮은 pH에 비교해서 높은 pH에 CD69 MFI에서 상당한 감소를 보여주었다. (도시되지 않은) 별도 검정에서, 경쇄에서 돌연변이, Y55E가 없다면 후보 2와 동일한 아미노산 서열을 가졌던 5번째 후보, 후보 5는 인간 유방암 세포주 BT-474가 표적으로서 사용된 때 낮은 pH에 비교해서 높은 pH에 CD69 MFI에서 상당한 감소를 보여주었고, 후보 5가 또한 CAB CAR임을 나타냈다.
도 6은 MCF7 표적으로 1 일의 공배양 후에 세포내 IFNγ를 함유하는 CD3+eTAG+ 세포의 백분율을 도시한다. IFNγ를 발현시키는 WT1 세포의 백분율은 낮은 및 높은 pH 하에서 동등하였다. 대조적으로, 후보 1 내지 4의 백분율 대략 2배는 낮은 pH의 조건 하에서 그리고 높은 pH에 비교하여 세포내 IFNγ를 발현시켰다.
도 7은 MCF7 표적 세포로 5 시간의 공배양 후에 CD107a를 발현시키는 CD3+eTAG+ 세포의 백분율을 도시한다. IFNγ를 이용한 관찰과 유사한, CD107a를 발현시키는 WT1 세포의 백분율은 낮은 및 높은 pH 하에서 동등하였고, 한편 후보 1 내지 4의 백분율 대략 2배는 낮은 pH의 조건 하에서 그리고 높은 pH에 비교하여 CD107a를 발현시켰다.
도 8은 증식 검정으로부터 결과의 예를 도시한다. 세포 당 셀트레이스 바이올렛의 양은 세포가 증식함에 따라 감소한다. 이것은 구별되는 다중 피크로서 살아있는, CD3+ 게이팅된 세포의 히스토그램에서 보여질 수 있다. 양쪽 낮은 및 높은 pH에 5 일 동안 MCF7 표적 세포로 공배양된 WT1 효과기는 증식을 나타내는 다중 피크를 보여준다. 대조적으로, 5 일 동안 MCF7 표적 세포로 공배양된 후보 2 CAR 효과기는 높은 pH가 아닌 낮은 pH 증식 (다중 피크)을 보여준다.
다함께 이들 결과는 후보 1 내지 4가 정상 생리학적 환경에 비교해서 TME에서 한 pH에 더 큰 활성을 가진 CAB CAR인 것을 보여준다. 그러므로, CAB-CAR 형식으로 CAB 활성을 나타내는 주어진 항체 중쇄 및 경쇄 조합 경우에, 상이한 신호 펩타이드, 링커, 및 스토크는 사용될 수 있고 CAR은 CAB 활성을 유지할 수 있다. 게다가, CAB-CAR 활성은 후보 2에서 사용된 경쇄의 위치 55에 티로신이, 4D5-7에서 또한 존재하는 돌연변이인, 글루탐산으로 돌연변이되는 때 보유되었다 (Carter 등, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9). 그래서, 본원에 제공된 후보 CAB-CAR이 위치 55에서 티로신을 포함할 수 있고 그들의 CAB-CAR 활성을 보유할 수 있다고 믿어진다. 마지막으로, 본 실시예는 CAR이 CAB CAR인지 여부 및 pH 또는 6.7에서 다소 활성인지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 4개 추가의 시험관내 검정을 입증하고, 이는 정상 생리학적 환경에 비교해서 TME의 pH와 유사한 것으로 믿어진다.
실시예 4: HER2 CAB-CAR은 생체내 모델에서 감소된 표적내 종양외 효과로 종양 사멸을 나타낸다
하이브리드 종양 퇴행 및 안전성 사정 연구는 수행되어 조건부 표적에 예시적 CAB-CAR의 활성을 검사하였고 TME의 외부에 자리잡은 HER2-발현 간세포의 표적내 종양외 사멸을 감소시키면서 피하 HER2-발현 종양을 해결하였다.
재조합 렌티바이러스성 입자는 실시예 2에서 기재된 대로 생산되었다. 게놈성 플라스미드는 HER2 CAR 이어서 EF1-a 프로모터에 의해 구동된 T2A 및 eTag를 인코딩하였다. CAR은 상기 실시예에서 식별된 어느 한쪽 CAB-CAR 또는 비-CAB CAR ("WT CAR")이었다. 바이러스성 상청액은 심층 여과, TFF, 벤조나제 처리, 정용여과, 및 제형화의 조합에 의해 정제되어, 비-인간 동물 단백질이 없는 실질적으로 순수한 바이러스성 입자를 생성하였다. 바이러스성 입자는 10의 MOI에서 새로 단리된 PBMC를 형질도입하는데 사용되었고 세포는 12일 동안 생체외 확장되었다.
B-NDG 마우스를 사용하는 이종이식 모델은 이 연구를 위하여 선정되었다. B-NDG는 성숙한 T 세포, NK 세포, 및 B 세포가 부족한 마우스의 균주이고 현재까지 기재된 가장 면역결핍 마우스 균주 중에 있다. 면역계의 이들 세포성 성분의 제거는 전형적으로 인간 PBMC가 숙주로부터의 선천성, 체액성, 또는 적응성 면역 반응 없이 생착할 수 있도록 수행된다. 인간에서 방사선 또는 림프구제거 화학요법 후에만 정상적으로 존재하는 항상성 사이토카인의 농도는 쥣과 세포외 공통 감마 쇄의 부재로 인해 달성되고, 이는 입양적으로 이동된 인간 세포가 그러한 사이토카인을 받을 수 있게 한다. 동시에, 이들 동물은 또한 표적-발현 종양을 사멸시키기 위한 CAR의 효능을 검사하도록 종양 이종이식 표적을 생착시키는데 활용될 수 있다. 효과기 세포성 제품에서 이종반응성 T 세포 수용체 항원의 존재가 결국 이식편 대 숙주 질환을 발생시킬 한편, 이들 모델은 동물 약리학 및 급성 내약성의 단기 평가를 가능하게 한다.
-42 일차에, 6-8 주령 암컷 B-NDG (Biocytogen) 마우스는 PBS-Matrigel내 10M SK-OV-3 난소 종양 세포로 피하로 (SC) 접종되었다. -14 일차에, 측접 트랜스포존 부위로 인간 전장 HER2 및 초파리 루시퍼라제를 인코딩하는 pDNA는 수력학적 유전자 전달에 의해 트랜스포사제 pDNA와 투여되어 인간 HER2 항원의 간 발현을 유도하였다. 0 일차에, 마우스는 단일 용량의 50x106 CAB-CAR 세포 (4마리 마우스), 50x106 WT CAR 세포 (6마리 마우스), 또는 DPBS 대조군 (6마리 마우스)로 정맥내로 (IV) 주사되었다. 종양은 1주에 2 또는 3 회 캘리퍼를 사용하여 측정되었고 종양 부피는 하기 방정식을 사용하여 계산되었다: (최장 직경 * 최단 직경2)/2. IVIS에 의한 마우스의 생체내 이미지화는 이소플루란 마취 하에서 루시페린 기질 주사 이후 매주 이미지를 캡처함으로써 간의 생물발광을 관찰하는데 사용되었다.
마우스의 각 그룹에 대한 평균 종양 부피는 도 9에서 도시된다. CAB-CAR 및 WT-CAR의 투여는 7 일차에 시작하는 SK-OV-3 종양의 유사한 퇴행을 초래하였고, 종양은 27 일차까지 캘리퍼에 의해 검출불가능하였다. CAB-CAR 및 WT-CAR은 또한 (표시되지 않은) FACS 및 qPCR 방법에 의해 측정된 경우에 용량화 4 주후 검출의 한계 미만으로 수축 그리고 14 일차까지 정점이 된 유사한 약동학적 혈액 확장을 입증하였다. 도 10a에서 마우스의 IVIS 이미지는 인간 HER2-루시퍼라제가 -1 일차에 모든 마우스에서 유사한 수준으로 간에서 발현되었음을 보여준다. WT-CAR 세포로 용량화된 마우스의 간에서 HER2-루시퍼라제의 감소는 9 일차까지 검출가능한 HER2-루시에라제 없이 3 일차까지 보여졌다. 대조적으로, CAB-CAR 세포로 용량화된 마우스의 간세포에서 HER2-루시퍼라제 발현은 단지 적당하게 감소하였다. 본 이미지에서 루시퍼라제 활성의 정량화는 도 10b에서 lg (총 플럭스)의 그래프에서 도시된다. 그래서, HER2 CAB-CAR 세포는 HER2-발현 세포의 표적내 종양외 사멸 거의 없이 HER2 종양을 표적화하고 사멸시킬 수 있다.
이들 데이터는 상기 개시된 시험관내 검정에 의한 CAB-CAR로서 식별된 후보가 생체내 CAB-CAR인 것을 입증한다. 그래서, 이들 시험관내 검정은 시험관내 CAB-CAR일뿐 아니라, 생체내인 CAR 작제물을 식별하는 것으로 보인다. 게다가, 이 하이브리드 종양 퇴행 및 안전성 모델은 CAR이 CAB-CAR인 것을 식별 및/또는 확인하는데 사용될 수 있다. 이들 결과는 CAB-CAR이 조건부의 활성을 나타내지 않는 HER2 CAR보다 더 큰 안전성 프로파일로 HER2+ 암을 처리하는데 효과적일 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 5: HER2 CAR은 생체내 모델에서 트라스투주맙 내성 종양을 사멸 및 해결할 수 있다
트라스투주맙이 HER2 과발현 종양을 가진 환자 치료하기에서 효능을 보여주는 한편, 효과적 초기 트라스투주맙 요법을 이용한 대부분의 환자들은 12 개월 내에 내성을 발달시킨다. 본 연구의 목적은 마우스 모델에서 트라스투주맙 및 CAR 요법의 효능을 테스트 및 비교하는 것이었다.
실시예 4에서 생성된 비-인간 동물 단백질이 없는 실질적으로 순수한 바이러스성 입자는 본 실시예 5에서 사용되었다. -14 일차에, 6-8 주령 암컷 B-NDG (Biocytogen) 마우스는 PBS-Matrigel에서 7x106 NCI-87 위 상피 세포로 SC 접종되었다. 0 일차에, 마우스는 단일 용량의 50x106 CAB-CAR 세포 (6마리 마우스), 50x106 WT CAR 세포 (6마리 마우스), 또는 DPBS 대조군 (6마리 마우스)으로 IV 주사되었고, 4 mg/kg (낮은 용량) 또는 30 mg/kg (높은 용량)의 용량에서 트라스투주맙으로 복강내로 (IP) 주사되었고 3 주 동안 2 mg/kg (낮은 용량) 또는 10 mg/kg (높은 용량)에서 주간 IP 용량으로 트라스투주맙에서 유지되었다. 42 일차에, 높은 용량 트라스투주맙을 받았던 마우스는 단일 용량의 50x106 CAB-CAR 세포로 IV 주사되었다. 종양은 1 주에 2 또는 3 회 캘리퍼를 사용하여 측정되었고 종양 부피는 하기 방정식을 사용하여 계산되었다: (최장 직경 * 최단 직경2)/2.
이들 마우스에서 종양 부피는 도 11에서 도시된다. WT CAR 및 CAB-CAR 제품은 주사후 7 일차부터 시작하는 높은 효능으로 종양 퇴행을 야기시켰고, 27 일차까지 완전한 퇴행을 야기시켰다. 낮은 용량에서 트라스투주맙으로 치료된 종양은 DPBS 대조군과 유사한 역학으로 진행하였다. 높은 용량에서 트라스투주맙으로 치료된 종양은 41 일차까지 50% 종양 성장 억제를 나타냈다. 42 일차에 CAB-CAR로 이 그룹의 마우스의 추가 치료는 계속된 HER2 단클론성 항체 용량화에 불응성인 큰 확립된 종양의 완전한 퇴행을 초래하였다.
여기에 제시된 실시예는 트라스투주맙에서 종양 진행후 HER2 양성 종양을 치료하기 위한 CAR, 및 특히 CAB-CAR의 용도를 뒷받침한다.
개시된 구현예, 실시예 및 실험은 본 개시내용의 범위를 제한 또는 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들면, 양, 온도, 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차는 고려되어야 한다. 설명된 대로 방법에서 변형은 실험이 예시하기 위한 기본적 양태 변경시킴 없이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
당업자는 본 개시내용의 범위 및 사상 내에서 많은 수정 및 다른 구현예를 고안할 수 있다. 실제로, 기재된 재료, 방법, 도면, 실험, 실시예, 및 구현예의 변형은 본 개시내용의 기본적 양태 변경시킴 없이 숙련된 기술자에 의해 이루어질 수 있다. 개시된 구현예 중 임의의 것은 임의의 다른 개시된 구현예와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 경우에, 일부 개념은 특정 구현예를 참조하여 기재되었다. 하지만, 당업자는 아래 청구항에 제시된 대로 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정 및 변화가 이루어질 수 있음을 인지한다. 따라서, 본 명세서 및 도면은 국한적 의미보다 오히려 실례적인 것으로 간주되어야 하고, 모든 그러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> EXUMA BIOTECH CORP. BIOATLA, LLC FROST, Gregory Ian ONUFFER, James Joseph KUNDU, Anirban SHORT, Jay M. FREY, Gerhard CHANG, Hwai Wen <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TO HER2 AND METHODS OF USE THEREOF <130> F1.005.WO.01 <150> US 62/964,947 <151> 2020-01-23 <160> 257 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 1 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> Stalk <400> 3 Phe Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu 1 5 10 15 Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro 20 25 30 Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 35 40 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Hinge <400> 4 Cys Pro Pro Cys 1 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Hinge <400> 5 Asp Lys Thr His Thr 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Hinge <400> 6 Cys Pro Glu Pro 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<222> (1)..(101) <223> DAP12 Activating domain isoform 4 <400> 46 Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu 20 25 30 Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu 35 40 45 Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala 50 55 60 Glu Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln 65 70 75 80 Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln 85 90 95 Arg Pro Tyr Tyr Lys 100 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> DAP12 Activating domain isoform 5 <400> 47 Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser 1 5 10 15 Asp Leu Asn Thr Gln 20 <210> 48 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(86) <223> FCERlG Activating domain isoform 1 <400> 48 Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ala Leu Gly Glu 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(1)..(41) <223> IC? 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(7)..(7) <223> n is T or U <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n, if present, is G <400> 108 ccaccangn 9 <210> 109 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is T or U <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n, if present, is G <400> 109 ccgccangn 9 <210> 110 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is T or U <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n, if present, is G <400> 110 gccgccgcca ngn 13 <210> 111 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is T or U <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n, if present, is G <400> 111 gccgccacca ngn 13 <210> 112 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Kozak sequence <400> 112 gccgccacca ug 12 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> SIBR (synthetic inhibitory BIC-derived RNA) <400> 113 ctggaggctt gctgaaggct gtatgctg 28 <210> 114 <211> 45 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> 3? microRNA flanking sequence of miR-155 <400> 114 caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcc 45 <210> 115 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: synthetic DNA encoding stem <400> 115 gttttggcca ctgactgac 19 <210> 116 <400> 116 000 <210> 117 <400> 117 000 <210> 118 <400> 118 000 <210> 119 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: VH-1 <400> 119 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 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<223> X is Y, D, or K <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> X is N or A <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> X is G or K <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X is T or D <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> X is R or E <400> 141 Xaa Ile Xaa Pro Thr Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 142 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LCDR1 A032X <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> X is A or D <400> 142 Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Xaa Val Ala 1 5 10 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LCDR3 H091X <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> X is H, D, or E <400> 143 Gln Gln Xaa Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 144 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 144 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 145 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 145 150 155 160 Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln 165 170 175 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Tyr Pro Thr Asn 180 185 190 Gly Tyr Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 195 200 205 Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 210 215 220 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly 225 230 235 240 Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 245 250 255 Ser <210> 245 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ScFv F1-4-70 <400> 245 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 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Synthetic: ScFv F1-4-78 <400> 246 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr 165 170 175 Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp 210 215 220 Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 247 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ScFv F1-4-87 <400> 247 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Tyr Pro Thr 165 170 175 Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp 210 215 220 Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 248 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ScFv F1-4-92 <400> 248 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Tyr Pro Thr 165 170 175 Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp 210 215 220 Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 249 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker C <400> 249 Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly 1 5 10 15 Ser <210> 250 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> IgK Signal peptide <400> 250 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile 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Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Asp Ser Arg Glu Arg Asn Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 255 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Synthetic: VL-FR consensus 1 <400> 255 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Val Ser Phe Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Thr Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 105 <210> 256 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Synthetic: VL-FR consensus 2 <400> 256 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser 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Claims (66)

  1. HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 단리된 핵산으로서,
    상기 CAR은
    a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
    b) 막관통 도메인; 및
    c) 세포내 활성화 도메인을 포함하고,
    상기 막관통 도메인은 ASTR과 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하며,
    상기 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고,
    상기 HCDR1 서열이 GFNIKDTYIH (서열번호:131)이고;
    상기 HCDR2 서열이 X1IYPTNGYTX2YADSVKG (서열번호:137)이고;
    상기 HCDR3 서열이 WGGDGFYAMDY (서열번호:133)이고;
    상기 ASTR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 LCDR1 서열이 RASQDVNTX3VA (서열번호:142)이고;
    상기 LCDR2 서열이 SASFLYS (서열번호:135)이고;
    상기 LCDR3 서열이 QQX4YTTPPT (서열번호:143)이고,
    식중 X1이 R 또는 K이고, X2가 R 또는 E이고, X3이 A 또는 D이고, X4가 H, D 또는 E이고;
    상기 ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4의 조합이 각각 R, R, A, 및 H 이외인, 단리된 핵산.
  2. HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로서,
    상기 CAR은
    a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
    b) 막관통 도메인; 및
    c) 세포내 활성화 도메인
    을 포함하고,
    상기 막관통 도메인은 상기 ASTR과 상기 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 상기 ASTR은 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR은 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서
    상기 HCDR1 서열이 GFNIKDTYIH (서열번호:131)이고;
    상기 HCDR2 서열이 X1IYPTNGYTX2YADSVKG (서열번호:137)이고;
    상기 HCDR3 서열이 WGGDGFYAMDY (서열번호:133)이고;
    상기 ASTR은 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 LCDR1 서열이 RASQDVNTX3VA (서열번호:142)이고;
    상기 LCDR2 서열이 SASFLYS (서열번호:135)이고;
    상기 LCDR3 서열이 QQX4YTTPPT (서열번호:143)이고,
    식중 X1이 R 또는 K이고, X2가 R 또는 E이고, X3이 A 또는 D이고, X4가 H, D 또는 E이고;
    상기 ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 R, R, A, 및 H 이외인, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  3. 전달 용액에서 현탁된 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 집단을 포함하는 전달 현탁액에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로,
    a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
    b) 막관통 도메인; 및
    c) 세포내 활성화 도메인
    을 포함하는 상기 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하고,
    상기 막관통 도메인이 상기 ASTR과 상기 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 상기 ASTR이 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR이 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서
    상기 HCDR1 서열이 GFNIKDTYIH (서열번호:131)이고;
    상기 HCDR2 서열이 X1IYPTNGYTX2YADSVKG (서열번호:137)이고;
    상기 HCDR3 서열이 WGGDGFYAMDY (서열번호:133)이고;
    상기 ASTR이 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서
    상기 LCDR1 서열이 RASQDVNTX3VA (서열번호:142)이고;
    상기 LCDR2 서열이 SASFLYS (서열번호:135)이고;
    상기 LCDR3 서열이 QQX4YTTPPT (서열번호:143)이고,
    식중 X1이 R 또는 K이고, X2가 R 또는 E이고, X3이 A 또는 D이고, X4가 H, D 또는 E이고;
    상기 ASTR에서 X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 R, R, A, 및 H 이외인, 전달 현탁액.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 R, R, D, 및 H; 각각 R, R, A, 및 D; 각각 R, R, A, 및 E; 각각 K, R, A, 및 H; 또는 각각 R, E, A, 및 H이고, 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역이 길이로 5 내지 50개 아미노산 링커에 의해 분리되고, 상기 중쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 119에 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 122에 적어도 90% 동일한, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 R, R, D, 및 H; 각각 R, R, A, 및 D; 또는 각각 R, R, A, 및 E이고, 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역이 길이로 5 내지 50개 아미노산 링커에 의해 분리되고, 상기 중쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 119에 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 122에 적어도 90% 동일한, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 K, R, A, 및 H; 또는 각각 R, E, A, 및 H이고, 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역이 길이로 5 내지 50개 아미노산 링커에 의해 분리되고, 상기 중쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 119에 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 122에 적어도 90% 동일한, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 7.4의 pH에 비교하여 6.7의 pH에 증가된 항-HER2 CAR 활성을 갖는 조건부 활성 CAR인, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 119에 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 122에 적어도 90% 동일한, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 119에 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 122에 적어도 90% 동일한, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 (HCVR)이 서열번호:119의 잔기 1-25, 잔기 36-49, 잔기 67-98, 및 잔기 110-120에 의해 형성된 상기 HCVR 프레임워크 영역에 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 HCVR 프레임워크 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역 (LCVR)이 서열번호:122의 잔기 1-23, 잔기 35-49, 잔기 57-88, 및 잔기 98-107에 의해 형성된 상기 LCVR 프레임워크 영역에 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 LCVR 프레임워크 영역을 포함하는, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 (HCVR) 프레임워크 영역이 서열번호:119의 잔기 1-25, 잔기 36-49, 잔기 67-98, 및 잔기 110-120을 포함하고 상기 경쇄 가변 영역 (LCVR) 프레임워크 영역이 서열번호:122의 잔기 1-23, 잔기 35-49, 잔기 57-88, 및 잔기 98-107을 포함하는, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ASTR의 상기 중쇄 및 상기 경쇄를 갖는 항체 또는 이의 단편이 7.4의 pH에 비교하여 6.7의 pH에 HER2에 증가된 결합을 나타내는, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ASTR이 서열번호:119의 상기 항체 중쇄 가변 영역 및 서열번호:122의 상기 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 단일-쇄 가변 항체 단편과 동일한 HER2의 에피토프에 결합하는, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  14. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ASTR이 단일-쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 및 2가 단일-쇄 항체 또는 디아바디로부터 선택된 항체인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  15. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ASTR이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일-쇄 가변 단편인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 링커에 의해 분리되고, 상기 링커가 길이로 5 내지 50개 아미노산인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  17. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역이 링커에 의해 분리되고, 상기 링커가 서열번호:1, 63-71, 144, 152, 또는 249 중 하나를 포함하는, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  18. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 중쇄가 상기 경쇄에 N-말단이고, 상기 중쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 119에 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 122에 적어도 90% 동일한, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  19. 제 4 항에 있어서, 상기 중쇄가 상기 경쇄에 N-말단인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  20. 제 5 항에 있어서, 상기 중쇄가 상기 경쇄에 N-말단인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  21. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 경쇄가 상기 중쇄에 N-말단인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  22. 제 4 항에 있어서, 상기 경쇄가 상기 중쇄에 N-말단인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  23. 제 5 항에 있어서, 상기 경쇄가 상기 중쇄에 N-말단인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  24. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 추가로 스토크 도메인 및 공-자극 도메인을 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체가 아미노 말단부터 카복시 말단까지, 상기 ASTR, 상기 스토크 도메인, 상기 막관통 도메인, 상기 공-자극 도메인, 및 상기 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 세포내 활성화 도메인이 CD3Z 활성화 도메인이고 상기 공-자극 도메인이 IC△ 공-자극 도메인, CD28 공-자극 도메인, CD137 공-자극 도메인이거나, 양쪽 IC△ 공-자극 도메인 및 CD137 공-자극 도메인, 또는 CD28 공-자극 도메인 및 CD137 공-자극 도메인을 포함하는, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 스토크 도메인이 CD8 스토크 도메인 또는 CD28 스토크 도메인이고, 상기 막관통 도메인이 CD8 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인이고, 상기 세포내 활성화 도메인이 CD3Z 활성화 도메인이고, 상기 공-자극 도메인이 CD137 공-자극 도메인, CD28 공-자극 도메인, 또는 IC△ 공-자극 도메인인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 공-자극 도메인이 CD137 공-자극 도메인인, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  28. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 CAR이 추가로 인식 도메인을 포함하는, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 인식 도메인이 감독 기관-승인된 항체에 의해 인식되는, 단리된 핵산, 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 인식 도메인이 EGFR의 적어도 20개 연속 아미노산인, 단리된 핵산 키메라 항원 수용체, 또는 전달 현탁액.
  31. 제 7 항에 있어서, 상기 항-HER2 CAR 활성이 HER2 발현 표적 세포로 인큐베이션시 T 세포의 활성화인, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  32. 제 31 항에 있어서, T 세포의 상기 활성화가 T 세포에 의한 T 세포 활성화 바이오마커의 증가된 발현, T 세포에 의한 사이토카인 생산, T 세포의 증식, 및 T 세포에 의한 표적 세포 사멸 중 하나 이상을 분석함으로써 결정되고, 상기 CAR 활성이 제 1 항의 상기 단리된 핵산 또는 제 6 항의 상기 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산 어느 한쪽으로 형질도입된 온-테스트 CAR-T 세포 및 HER2-발현 표적 세포가 상기 검정을 수행하기 위한 유효 시간 동안 검정 배지에서 함께 인큐베이션되는 시험관내 검정에서 측정되는, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  33. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    X1, X2, X3, 및 X4의 조합이 각각 R, R, D, 및 H이고, 상기 중쇄 가변 영역이 핵산 서열 서열번호:145에 의해 인코딩되고, 상기 경쇄 가변 영역이 핵산 서열 서열번호:149에 의해 인코딩되거나;
    X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 R, R, A, 및 D이고, 상기 중쇄 가변 영역이 핵산 서열 서열번호:145에 의해 인코딩되고, 상기 경쇄 가변 영역이 핵산 서열 서열번호:150에 의해 인코딩되거나;
    X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 R, R, A, 및 E이고, 상기 중쇄 가변 영역이 핵산 서열 서열번호:145에 의해 인코딩되고, 상기 경쇄 가변 영역이 핵산 서열 서열번호:151에 의해 인코딩되는,
    단리된 핵산, CAR 또는 전달 현탁액.
  34. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 K, R, A, 및 H이고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호:148에 의해 인코딩되고 상기 중쇄 가변 영역이 핵산 서열 서열번호:146에 의해 인코딩되거나;
    X1, X2, X3, 및 X4의 상기 조합이 각각 R, E, A, 및 H이고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호:148에 의해 인코딩되고 상기 중쇄 가변 영역이 핵산 서열 서열번호:147에 의해 인코딩되는,
    단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  35. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 ASTR이 서열번호:157-236 중 어느 하나인, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  36. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 ASTR이 서열번호:157-178 중 어느 하나인, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  37. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 게놈을 포함하는 단리된 재조합 T 세포 또는 NK 세포로서, 상기 하나 이상의 핵산 서열이 제 1 항의 단리된 핵산을 포함하는, 단리된 재조합 T 세포 또는 NK 세포.
  38. 제 37 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 CAR이 상기 프로모터에 작동가능하게 연결되고 상기 CAR을 인코딩하는 상기 핵산 서열이 인식 도메인을 추가로 인코딩하고, 상기 인식 도메인을 인코딩하는 핵산이 리보솜 스킵 서열에 의해 상기 CAR을 인코딩하는 핵산으로부터 분리되는, 단리된 재조합 T 세포 또는 NK 세포 또는 전달 현탁액.
  39. 제 1 항의 단리된 핵산 및 상기 CAR을 인코딩하는 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는, 발현 벡터.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 발현 벡터가 복제 불능 레트로바이러스성 입자인, 발현 벡터.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 발현 벡터가 렌티바이러스성 벡터인, 발현 벡터.
  42. HER2+ 암을 갖는 인간을 치료하기 위한 키트의 제조에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도로서, 상기 키트의 용도가 상기 HER2+ 암을 갖는 인간에, 용량의 제 1 항 또는 제 58 항의 상기 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포, 또는 제 3 항 또는 제 60 항의 전달 현탁액의 1 내지 4개 컨테이너를 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
  43. HER2+ 암을 갖는 인간의 치료 방법으로서, 상기 HER2+ 암을 갖는 인간에, 유효 용량의 제 1 항 또는 제 58 항의 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포, 또는 제 3 항 또는 제 60 항의 전달 현탁액의 1 내지 4개 컨테이너를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. HER2+ 암을 갖는 인간에서 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단을 생성하기 위한 키트의 제조에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자의 용도로서, 상기 키트의 용도가 상기 HER2+ 암을 갖는 인간에, 제 1 항 또는 제 58 항의 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포, 또는 제 3 항 또는 제 60 항의 전달 현탁액의 1 내지 4개 컨테이너를 투여하는 단계를 포함하고, 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단이 투여후 적어도 21 일 동안 인간에서 지속하는, 용도.
  45. HER2+ 암을 갖는 인간에서 유전적으로 변형된 T 세포의 지속하는 집단의 생성 방법으로서, 상기 방법은 상기 HER2+ 암을 갖는 인간에, 제 1 항 또는 제 58 항의 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포, 또는 제 3 항 또는 제 60 항의 전달 현탁액의 1 내지 4개 컨테이너를 투여하는 단계를 포함하고,
    유전적으로 변형된 T 세포의 상기 지속하는 집단이 투여후 적어도 21 일 동안 인간에서 지속하는, 방법.
  46. 제 42 항 또는 제 44 항, 또는 제 43 항 또는 제 45 항에 있어서, 상기 HER2+ 암이 유방암, 위암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 또는 요로상피성 방광암인, 용도 또는 방법.
  47. 제 42 항 또는 제 44 항, 또는 제 43 항 또는 제 45 항에 있어서, 상기 인간이 이전에 트라스투주맙 요법을 받았던, 용도 또는 방법.
  48. 제 42 항 또는 제 44 항, 또는 제 43 항 또는 제 45 항에 있어서, 상기 용량이 인간에서 HER2+ 종양의 크기를 감소시키는데 효과적인, 용도 또는 방법.
  49. 제 42 항 또는 제 44 항, 또는 제 43 항 또는 제 45 항에 있어서, 1 x 104 세포/kg 내지 1 x 109 세포/kg의 상기 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 인간에 투여되고, 상기 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 자가 세포인, 용도 또는 방법.
  50. 조건부 활성화가능한 T 세포 또는 NK 세포를 제조하는 방법으로서, 제 1 항의 단리된 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 상기 T 세포 또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 생체외 방법으로서, 상기 방법은
    a) 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 농축시켜 단리된 혈액으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 PBMC를 단리시키는 단계;
    b) 효과적 조건 하에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자로 상기 활성화된 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산하는 단계로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스성 입자가 각각 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 레트로바이러스성 게놈을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열이 제 1 항의 단리된 핵산을 포함하는, 단계; 및
    c) 임의로 상기 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키고, 이에 의해 상기 조건부 활성화가능한 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계
    를 포함하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 방법이 상기 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 포유류 대상체에 상기 수확된 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제 51 항의 방법에 의해 생산된, 변형된 T 세포의 집단.
  55. 제 3 항에 있어서, 상기 전달 용액이 5 내지 100 ml의 동결보존 주입 용액인, 전달 현탁액.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 전달 현탁액이 주입 백 내부에 함유되는, 전달 용액.
  57. 제 55 항 또는 제 56 항에 있어서, 동결보존 전달 용액에서 현탁액내 1x104 내지 1x1010 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, 전달 현탁액.
  58. HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 단리된 핵산으로서,
    상기 CAR은
    a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
    b) 막관통 도메인; 및
    c) 세포내 활성화 도메인
    을 포함하고,
    상기 막관통 도메인이 상기 ASTR과 상기 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 상기 ASTR이 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR이 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고,
    상기 HCDR1 서열이 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고;
    상기 HCDR2 서열이 X2IX3PTX4X5YX6X7YADSVKG (서열번호:141)이고;
    상기 HCDR3 서열이 WGGDGFYX8MDY (서열번호:140)이고;
    상기 ASTR이 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR이 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서
    상기 LCDR1 서열이 RASQDVNTX9VA (서열번호:142)이고;
    상기 LCDR2 서열이 SASFLYS (서열번호:135)이고;
    상기 LCDR3 서열이 QQX10YTTPPT (서열번호:143)이고,
    식중 X1이 N 또는 W이고, X2가 R 또는 K이고, X3이 Y, D, 또는 K이고, X4가 N 또는 A이고, X5가 G 또는 K이고, X6이 T 또는 D이고, X7이 R 또는 E이고, X8이 A 또는 E이고, X9가 A 또는 D이고, X10이 H, D, 또는 E이고;
    상기 ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 상기 조합이 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H 이외인, 단리된 핵산.
  59. HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)로서,
    상기 CAR은
    a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
    b) 막관통 도메인; 및
    c) 세포내 활성화 도메인
    을 포함하고,
    상기 막관통 도메인이 상기 ASTR과 상기 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 상기 ASTR이 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR이 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서
    상기 HCDR1 서열이 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고;
    상기 HCDR2 서열이 X2IX3PTX4X5YX6X7YADSVKG (서열번호:141)이고;
    상기 HCDR3 서열이 WGGDGFYX8MDY (서열번호:140)이고;
    상기 ASTR이 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR이 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서
    상기 LCDR1 서열이 RASQDVNTX9VA (서열번호:142)이고;
    상기 LCDR2 서열이 SASFLYS (서열번호:135)이고;
    상기 LCDR3 서열이 QQX10YTTPPT (서열번호:143)이고,
    식중 X1이 N 또는 W이고, X2가 R 또는 K이고, X3이 Y, D, 또는 K이고, X4가 N 또는 A이고, X5가 G 또는 K이고, X6이 T 또는 D이고, X7이 R 또는 E이고, X8이 A 또는 E이고, X9가 A 또는 D이고, X10이 H, D, 또는 E이고;
    상기 ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 조합이 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H 이외인, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  60. 전달 용액 내 현탁된 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 집단을 포함하는 전달 현탁액으로서, 상기 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 HER2를 결합시키기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 CAR은,
    a) HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR);
    b) 막관통 도메인; 및
    c) 세포내 활성화 도메인
    을 포함하고,
    상기 막관통 도메인이 상기 ASTR과 상기 세포내 활성화 도메인 사이에 위치하고, 상기 ASTR이 3개 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 CDR이 서열 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 갖고, 여기서
    상기 HCDR1 서열이 GFX1IKDTYIH (서열번호:138)이고;
    상기 HCDR2 서열이 X2IX3PTX4X5YX6X7YADSVKG (서열번호:141)이고;
    상기 HCDR3 서열이 WGGDGFYX8MDY (서열번호:140)이고;
    상기 ASTR이 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDR이 서열 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖고, 여기서
    상기 LCDR1 서열이 RASQDVNTX9VA (서열번호:142)이고;
    상기 LCDR2 서열이 SASFLYS (서열번호:135)이고;
    상기 LCDR3 서열이 QQX10YTTPPT (서열번호:143)이고,
    식중 X1이 N 또는 W이고, X2가 R 또는 K이고, X3이 Y, D, 또는 K이고, X4가 N 또는 A이고, X5가 G 또는 K이고, X6이 T 또는 D이고, X7이 R 또는 E이고, X8이 A 또는 E이고, X9가 A 또는 D이고, X10이 H, D, 또는 E이고;
    상기 ASTR에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 조합이 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H 이외인, 전달 현탁액.
  61. 제 58 항, 제 59 항 또는 제 60 항에 있어서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, 및 X10의 상기 조합이 각각 W, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H (N028W); 각각 N, K, Y, N, G, T, R, A, A, 및 H (R050K); 각각 N, R, D, N, G, T, R, A, A, 및 H (Y052D); 각각 N, R, K, N, G, T, R, A, A, 및 H (Y052K); 각각 N, R, Y, A, G, T, R, A, A, 및 H (N055A); 각각 N, R, Y, N, K, T, R, A, A, 및 H (G056K); 각각 N, R, Y, N, G, D, R, A, A, 및 H (T058D); 각각 N, R, Y, N, G, T, E, A, A, 및 H (R059E); 각각 N, R, Y, N, G, T, R, E, A, 및 H (A106E); 각각 N, R, Y, N, G, T, R, R, D, 및 H (A032D); 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 D (H091D); 각각 N, R, Y, N, G, T, R, A, A, 및 E (H091E); 각각 N, R, K, N, G, T, R, R, D, 및 H (Y052K/A032D); 각각 N, R, Y, N, K, T, R, R, D, 및 H (G056K/A032D); 각각 N, R, Y, N, G, D, R, D, A, 및 H (T058D/A032D); 또는 각각 N, R, Y, N, G, T, R, E, D, 및 H (A106E/A032D)인, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  62. 제 58 항, 제 59 항 또는 제 60 항에 있어서, 상기 CAR이 7.4의 pH에 비교하여 6.7의 pH에 증가된 항-HER2 CAR 활성을 갖는 조건부 활성 CAR인, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  63. 제 58 항, 제 59 항 또는 제 60 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 119에 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 122에 적어도 90% 동일한, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 (HCVR)이 서열번호: 119의 상기 HCVR 프레임워크 영역에 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 HCVR 프레임워크 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역 (LCVR)이 서열번호: 122의 상기 LCVR 프레임워크 영역에 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 LCVR 프레임워크 영역을 포함하는, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 (HCVR) 프레임워크 영역이 서열번호: 119의 상기 HCVR 프레임워크 영역에 동일하고 상기 경쇄 가변 영역 (LCVR) 프레임워크 영역이 서열번호: 122의 상기 LCVR 프레임워크 영역에 동일한, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
  66. 제 62 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 119에 적어도 90% 동일하고, 상기 경쇄 가변 영역의 상기 서열이 서열번호: 122에 적어도 90% 동일한, 단리된 핵산, CAR, 또는 전달 현탁액.
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