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KR20220124718A - 암 치료를 위한 개선된 인간 메틸 티오아데노신/아데노신 고갈 효소 변이체 - Google Patents

암 치료를 위한 개선된 인간 메틸 티오아데노신/아데노신 고갈 효소 변이체 Download PDF

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KR20220124718A
KR20220124718A KR1020227024213A KR20227024213A KR20220124718A KR 20220124718 A KR20220124718 A KR 20220124718A KR 1020227024213 A KR1020227024213 A KR 1020227024213A KR 20227024213 A KR20227024213 A KR 20227024213A KR 20220124718 A KR20220124718 A KR 20220124718A
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KR
South Korea
Prior art keywords
polypeptide
mtap
cases
kda
pegylated
Prior art date
Application number
KR1020227024213A
Other languages
English (en)
Inventor
에버렛 스톤
Original Assignee
더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 filed Critical 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

MTA/ADO-분해 효소 활성을 갖는 접합된 폴리펩티드와 관련된 조성물이 본 명세서에 개시된다. 접합된 폴리펩티드는 촉매 활성을 유지하면서 최대 접합을 가능하게 하도록 조작된다. 또한, 접합된 폴리펩티드와 관련된 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포가 개시된다. 암을 치료하기 위해 상기를 포함하는 약제학적 제형을 사용하는 방법이 추가로 개시된다.

Description

암 치료를 위한 개선된 인간 메틸 티오아데노신/아데노신 고갈 효소 변이체
상호 참조
본 출원은 2020년 1월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/958,161호의 이익을 주장하고, 이는 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
연방정부가 후원하는 연구에 관한 소명
본 발명은 국립 보건원에서 수여한 조성금 번호 R01 CA189623 및 R01 CA240700하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 일정 권리를 갖고 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 2021년 1월 6일에 작성된 ASCII 카피의 명칭은 UTFBP1227WO_ST25이고, 크기는 84722바이트이다.
분야
본 발명은 일반적으로 의학 및 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이는 암 치료를 위해 메틸티오아데노신(MTA) 및/또는 아데노신(ADO)을 고갈시키는 효소에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 이는 인간 치료에 적합한 MTA 및/또는 ADO 분해 활성을 갖는 인간 효소의 조작, 약리학적 최적화 및 프로세스 개발에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
메틸티오아데노신 포스포릴라제(MTAP)의 염색체 9p21.3에서 호모접합성 유전자 결실은 골육종, 췌장암 및 척색종의 약 30-40%에서 관찰되는 일반적인 이벤트이고, 중피종, T- 세포 급성 림프모구성 백혈병 및 신경교종에서는 더 높은 상실(65-70%)가 확인되었다[참조: Bertino et al., 2011]. MTAP는 폴리아민 합성의 부산물인 메틸티오아데노신(MTA)을 메틸티오리보스-1'-포스페이트(MTR-1'-P)와 아데닌으로 분해하고, 이들은 메티오닌(methionine) 및 퓨린 회수 경로로 재순환된다. MTAP 상실은 진행성 질환 및 더 나쁜 결과와 상관된다. 고형 종양(solid tumor) 및 림프종에서의 MTAP 결실은 이의 기질인 MTA의 축적 및 분비의 증가를 초래한다[참조: Stevens et al., 2008; Stevens et al., 2009; Stevens et al., 2010]. 흑색종 세포에서의 연구에 따르면, 종양과 정상 조직의 MTA 농도가 유의하게 높은 것은 침습성 및 악성 종양의 현저한 특성과 상관관계가 있다고 보고되었다[참조: Stevens et al., 2009]. 유사하게는, 간세포 암종(HCC)에서 MTAP 결핍증은 MTA 수준 및 HCC 증식의 증가와 강력한 상관관계를 나타내고, 간 성상 세포에서 종양형성촉진 유전자 발현 프로파일을 증가시켰다[참조: Kirovski et al., 2011].
MTAP 유전자의 상실은 염색체 9p21에 대한 근접성으로 인해 세포 사이클 조절인자인 CDKN2A와 함께 단순한 방관자의 동시-결실인 것으로 일반적으로 생각되었다. 그러나, 위암 및 피부 T 세포 림프종 연구에서, MTAP 결실은 CDKN2A 상실과는 독립적으로 발생하고, 더 나쁜 결과와 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Kim et al., 2011; Woollard et al., 2016]. 뮤린 녹아웃 모델에서, 호모접합형 MTAP-/- null 마우스는 배아 치사 표현형을 갖는 반면, MTAP+/- 헤테로접합체는 정상적으로 발달하지만, T 세포 림프종에서 조기에 사망한다는 것이 발견되었다[참조: Kadariya et al., 2009]. 이러한 발견과 일치하게, 상염색체 우성 유전성 악성종양, 악성 섬유성 조직구종을 수반한 골간 수질 협착증(DMSMFH)은 엑손 스키핑, 선택적 스플라이싱 및 최종적으로 기능부전 MTAP 유전자 산물을 유도하는 MTAP 유전자 내의 돌연변이에 기인하고, 이는 CDKN2A와는 독립적인 종양 억제 역할을 나타낸다[참조: Camacho-Vanegas et al., 2012].
MTAP의 결실 또는 억제는 강력한 면역억제 특성을 갖는 것으로 밝혀진 MTA의 축적 및 배설을 유도한다. MTA와의 인큐베이션은 나이브 림프구의 증식과 분화를 중단시키고, 활성화된 인간 T 세포에 대해 세포독성을 나타낸다. 특히, MTA는 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 중지하고, CD25 및 CD69 등의 활성화 마커의 상향조절을 방지하며, 사전-자극된 세포독성 T 림프구에서 아폽토시스를 유도한다[참조: Henrich et al., 2016]. 이전 보고서에서는, 외인성 MTA가 DNA 합성, 단백질 합성 및 항원 또는 동종이계 세포로 자극시킨 인간 림프구 배양물의 증식을 억제하는 것도 밝혀졌고, 이러한 효과는 MTA 비함유 세포를 세척함으로써 역전될 수 있다[참조: Vandenbark et al., 1980]. 기계론적으로, 최근 보고서에 따르면, 히스톤의 메틸화에 의해 크로마틴 리모델링 및 유전자 발현을 조절하는 SAM 의존성 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라제(PRMT)가 MTA의 면역억제 효과를 촉진하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타냈다. 특히, PRMT5 발현은 기억 T 세포의 활성화 및 확장에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다[참조: Webb, Amici et al. 2017]. MTA는 대부분의 메틸트랜스퍼라제의 유의한 억제제는 아니지만, KI가 0.26μM인 PRMT5의 매우 강력한 억제제이고[참조: Marjon, Cameron et al. 2016], 따라서 MTA의 면역억제 메커니즘에 기여할 가능성이 있다. 예를 들면, MTA 억제제와 PRMT5 억제제는 모두 T 세포 증식, 생존율 및 기능을 저하시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Strobl, Schaffer et al. 2020].
MTA는 또한 아데노신 수용체 A2a 및 A2b의 작용제로서 작용하여 마크로파지에서 관용성의 표현형을 생성할 수 있다[참조: Keyel et al., 2014]. 유사하게는, 악성 흑색종에 대한 실험에서, MTA는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 3(MMP3)의 유도에 의해 섬유아세포에서 종양 촉진의 역할을 유발하는 것으로 관찰되었다[참조: Stevens et al., 2009]. MTAP 결실의 결과가 면역 이펙터 세포를 억제하고, MTA의 축적을 통해 관용원성 간질 세포 표현형을 촉진하도록 작용한다는 증거는 이것이 암에서 가장 일반적인 유전자 결실 중 하나인 이유에 대한 명확한 메커니즘을 시사한다. 종양으로부터 배출된 MTA는 종양 세포가 면역 감시 및 제거를 회피하는 데 도움이 되는 면역 체크포인트로서 간주될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일 측면에서, 조성물은 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 폴리펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 접합 부위(conjugation site)를 제거하도록 조작되어 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 적어도 100개의 연속 아미노산에 대해 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 트레오닌(Threonine) 18, 트레오닌 197, 세린(Serine) 178, 발린(Valine) 233 및 메티오닌 196에 상응하는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 제1 리신(lysine) 또는 제1 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 1의 리신 225에 상응하는 아미노산은 접합 부위를 제거하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 1의 리신 238에 상응하는 아미노산은 접합 부위를 제거하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 리신 225에 상응하는 아미노산 또는 리신 238에 상응하는 아미노산은 아르기닌으로 치환된다.
일부 실시양태에서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해(phosphorolysis)를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km은 적어도 1.5×105 M-1s-1이다. 일부 실시양태에서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km은 약 1.5×105 M-1s-1 내지 3.0×105 M-1s-1이다. 일부 실시양태에서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km은 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 Vmax의 적어도 50%이다. 일부 실시양태에서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 폴리펩티드의 Vmax는 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 Vmax의 적어도 50%이다. 일부 실시양태에서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 폴리펩티드의 Km은 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 Km의 2배 이하이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 및 이의 폴리펩티드에 접합된 적어도 하나의 중합체를 포함하고, 여기서 중합체는 비접합된(unconjugated) 폴리펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 5000kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 평균 분자량이 약 500kDa 내지 약 1000kDa, 약 800kDa 내지 약 1600kDa, 약 1500kDa 내지 약 3000kDa, 약 2000kDa 내지 약 4000kDa, 약 2500kDa 내지 약 5000kDa, 약 3000kDa 내지 약 6000kDa, 약 4,000kDa 내지 약 8,000kDa, 약 6,000kDa 내지 약 12,000kDa, 약 10,000kDa 내지 약 20,000kDa, 또는 약 15,000kDa 내지 약 30,000kDa이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체는 폴리펩티드의 제2 리신 또는 제2 시스테인에 접합된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 및 이의 폴리펩티드의 집단(population)을 포함하고, 여기서 집단은 폴리펩티드의 삼량체(trimer)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 및 이의 폴리펩티드의 집단을 포함하고, 여기서 폴리펩티드의 적어도 80%는 적어도 하나의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 적어도 80%은 적어도 하나의 중합체 중의 적어도 3개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 적어도 80%은 적어도 하나의 중합체 중의 적어도 6개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드당 중합체의 수는 가우스 분포(Gaussian distribution)를 구성한다. 일부 실시양태에서, 가우스 분포는 폴리펩티드당 2±1, 3±1, 4±1, 또는 6±1 중합체의 모드(mode)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 가우스 분포는 폴리펩티드당 8±3 중합체의 모드를 갖는다.
일부 실시양태에서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km은 적어도 1.5×105 M-1s-1이다. 일부 실시양태에서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km은 약 1.5×105 M-1s-1 내지 3.0×105 M-1s-1이다. 일부 실시양태에서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km은 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 Vmax의 적어도 50%이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 Vmax는 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 Vmax의 적어도 50%이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 Km은 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 Km의 2배 이하이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 이종 펩티드 세그먼트(heterologous peptide segment)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 펩티드 세그먼트은 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 단편, 또는 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산이 본 명세서에서 제공된다. 일 측면에서, 핵산은 본 명세서에 기재된 및 이의 폴리펩티드를 암호화(encoding)하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 세균, 진균, 곤충 또는 포유동물에서의 발현을 위해 코돈 최적화(codon optimizing)된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 세균에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시양태에서, 세균은 이. 콜라이(E. coli)이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열번호 4 및 6 중 하나에 따른 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터(expression vector)가 본 명세서에서 제공된다. 일 측면에서, 발현 벡터는 본 명세서에 기재된 및 이의 핵산을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포가 본 명세서에서 제공된다. 일 측면에서, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 및 이의 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세균 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포이다.
일부 실시양태에서, 약제학적 제형이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 제형은 본 명세서에 기재된 및 이의 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체에 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 측면에서, 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법은 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 유효량의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 적어도 36시간의 혈청 반감기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 및 이의 약제학적 제형이다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 종양으로 진단받았다. 일부 실시양태에서, 환자는 고형 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 혈액학적 종양(hematological tumor)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 유방 암종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 결장 암종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 골육종, 췌장암, 척색종, 중피종, T-세포 ALL, 신경교종, 신장 세포 암종, 흑색종, 편평 세포 암종, 담낭암, 위암, 또는 간세포 암종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 MTAP 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 감소된 수준의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 폴리펩티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 감소된 수준의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 CD73을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 CD39를 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 MTA를 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 ADO를 갖는다. 일부 실시양태에서, 참조 수준은 건강한 대상체(subject)에서의 수준이다. 일부 실시양태에서, 참조 수준은 환자의 건강한 조직에서의 수준이다.
일부 실시양태에서, 환자는 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 제형은 종양내로, 정맥내로, 피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 안내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 방광내로(intravesicularlly), 점막으로, 심낭내로, 제대내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접 입욕시키는 국소 관류에 의해, 카테터(catheter)를 통해, 또는 세정(lavage)을 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 면역요법에 대한 감수성(sensitivity)을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)의 투여에 반응하지 않았다.
일부 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항암 요법은 외과 요법, 화학요법, 방사선 요법, 동결 요법(cryotherapy), 호르몬 요법, 면역 요법 또는 사이토카인 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항암 요법은 면역 체크포인트 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, BMS-036559 또는 CK-301을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-223, AMP-514, 세미플리맙 또는 PDR-001을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CTLA-4 요법은 이필리무맙 또는 트레멜리무맙을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항암 요법은 입양(adoptive) T-세포 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 입양 T-세포 요법은 MTAP 효소의 투여 후에 투여된다.
일부 실시양태에서, 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 측면에서, 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법은 MTAP 효소를 발현하도록 조작되는 T-세포를 포함하는 입양 T-세포 요법을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암의 전이는 지연, 감소 또는 예방된다.
일부 실시양태에서, 종양을 갖는 환자에게 치료적 적용을 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 및 이의 MTAP 효소, 본 명세서에 기재된 및 이의 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 및 이의 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
혈청 및 종양 미세환경 중의 MTA 및/또는 ADO를 효율적으로 분해할 수 있도록 조작되는 포유동물 MTAP 효소(즉, MTase 효소)가 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된 MTase 효소 및/또는 ADO 분해 효소는 천연 효소와 비교하여 MTA- 및/또는 ADO-분해 촉매 활성을 갖는 인간, 영장류, 포유동물 또는 원핵생물의 폴리펩티드 서열을 포함하는 신규 효소를 제공한다. 따라서, 이러한 변형된 효소는 암 치료에 적합할 수 있고, 낮은 면역원성과 개선된 혈청 안정성을 가질 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 임의의 소정 MTase 효소는 MTA만을 효율적으로 분해하거나, MTA와 ADO 둘 다를 효율적으로 분해할 수 있다.
따라서, 일 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드, 특히 MTA- 및/또는 ADO-분해 활성을 갖는 MTAP 효소 변이체가 제공된다. 예를 들면, 변이체는 인간 MTAP 등의 인간 효소로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 효소 변이체는 천연 MTAP 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 천연 폴리펩티드는 서열번호 1 및 7 내지 35 중 어느 하나에 따른 MTAP 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 효소 변이체는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 측면에서, MTA 및/또는 ADO를 분해할 수 있는 변형된 MTase를 포함하는 폴리펩티드가 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 생리학적 조건하에서 MTA 및/또는 ADO를 분해할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 MTA 및/또는 ADO에 대해 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 104, 105, 106 s-1M-1 또는 그 중에서 도출 가능한 임의의 범위의 촉매 효율(kcat/KM)을 가질 수 있다.
혈청 안정성을 증가시키기 위해, 변형된 MTase를 하나 이상의 폴리에테르 분자에 연결시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 리신 또는 시스테인 등의 특정 아미노산 잔기를 통해 PEG에 연결시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 천연 MTase는 화학적 변형, 치환, 삽입, 결실 및/또는 절단 등의 하나 이상의 기타 변형에 의해 변형시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 천연 MTase는 치환에 의해 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 치환의 수는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상일 수 있다.
일부 경우에, PEG화 천연 인간 메틸티오아데노신 포스포릴라제(MTAP) 효소의 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서 PEG화 MTAP 효소는 각각 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드의 호모삼량체를 포함하고, PEG화 MTAP 효소의 적어도 약 80%은 서브유닛당 1, 2, 3, 4 또는 5개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 서브유닛당 1, 2, 3, 4 또는 5개의 PEG 분자를 포함하는 PEG화 MTAP 효소의 적어도 약 80%는 서브유닛당 PEG 분자의 가우스 분포를 갖는다. 일부 측면에서, 서브유닛당 1, 2, 3, 4 또는 5개의 PEG 분자를 포함하는 PEG화 MTAP 효소의 적어도 약 80%는 서브유닛당 3±1개의 PEG 분자의 모드를 갖는다. 일부 측면에서, PEG화 MTAP 효소의 20% 이하는 서브유닛당 0, 6, 7, 8 또는 그 이상의 PEG 분자를 포함한다. 일부 측면에서, PEG 분자는 약 5000의 분자량을 갖는다.
일부 경우에, 천연 인간 메틸티오아데노신 포스포릴라제(MTAP) 효소의 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 제공되고, 여기서 변이체 MTAP는 서열번호 1에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 1에 대하여 K225R(예를 들면, 서열번호 3 참조) 또는 K238R(예를 들면, 서열번호 5 참조) 치환을 포함한다. 이 경우에, 폴리펩티드는 임의의 바람직한 정도로 PEG화될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 또한 이종 아미노산 서열에 연결된 변형된 MTase를 포함하는 폴리펩티드를 고려한다. 예를 들면, 변형된 MTase는 융합 단백질로서 이종 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 MTase는 IgG Fc, 알부민, 알부민 결합 펩티드, 또는 XTEN 폴리펩티드 등의 아미노산 서열에 연결되어, 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서, 이러한 변형된 MTase를 암호화하는 핵산이 고려된다. 일 측면에서, 핵산은 세균에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있다. 특정 실시양태에서, 세균은 이. 콜라이(E. coli)이다. 다른 측면에서, 핵산은 진균(예를 들면, 효모), 곤충 세포, 또는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있다. 본 발명은 이러한 핵산을 함유하는 발현 벡터 등의 벡터를 추가로 고려한다. 특정 실시양태에서, 변형된 MTase를 암호화하는 핵산은 이종 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일 실시양태에서, 변형된 MTase는 벡터(예를 들면, 유전자 치료 벡터)에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 이러한 바이러스는 표적 세포에서 변형된 MTase-암호화 핵산의 발현을 가능하게 하기 위해 재조합 DNA 기술에 의해 변형되었을 수 있다. 이러한 벡터는 비바이러스(예: 플라스미드) 또는 바이러스(예: 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 백시니아 바이러스) 기원의 벡터로부터 유래할 수 있다. 비-바이러스 벡터는 바람직하게는 세포막을 통과하는 DNA의 진입을 용이하게 하는 약제와 복합체를 형성한다. 이러한 비-바이러스 벡터 복합체의 예에는 DNA 및 지질 기반 전달 시스템의 축합을 촉진하는 폴리양이온 제제를 포함하는 제형이 포함된다. 지질 기반 전달 시스템의 예에는 핵산의 리포솜 기반 전달이 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 고려한다. 숙주 세포는 세균(예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)), 진균 세포(예를 들면, 효모), 곤충 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 변형된 MTase를 발현하기 위해 숙주 세포 내로 도입된다. 단백질은 임의의 적합한 방식으로 발현될 수 있다. 일 실시양태에서, 단백질은 단백질이 글리코실화되도록 숙주 세포에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 단백질은 단백질이 비글리코실화되도록 숙주 세포에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 핵산은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형 중에 존재한다. 폴리펩티드는 천연 PEG화 MTase 폴리펩티드 또는 변형된 MTase 폴리펩티드일 수 있다. 핵산은 천연 PEG화 MTase 폴리펩티드 또는 변형된 MTase 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
일 실시양태에서, 암을 갖거나 암을 발증할 위험이 있는 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 이는 상기 기재된 바와 같이 치료 유효량의 MTase를 포함하는 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 환자는 마우스 등의 임의의 동물일 수 있다. 예를 들면, 환자는 포유동물, 특히 영장류, 보다 구체적으로 인간 환자일 수 있다.
일부 측면에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 측면에서, 종양은 혈액학적 종양이다. 일부 측면에서, 종양은 골육종, 췌장암, 척색종, 중피종, T-세포 ALL, 신경교종, 신장 세포 암종, 흑색종, 편평 세포 암종, 담낭암, 위암, 또는 간세포 암종이다.
일부 측면에서, 종양은 MTAP 수준을 감소시켰다. 특정 측면에서, 종양은 MTAP 결실을 갖는다. 일부 측면에서, 종양은 참조 샘플과 비교하여 증가된 수준의 CD73을 갖는다. 일부 측면에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 CD73 및 임의로 감소된 수준의 MTAP를 갖는다. 일부 측면에서, 종양은 참조 샘플과 비교하여 증가된 수준의 CD39를 갖는다. 일부 측면에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 MTA를 갖는다. 일부 측면에서, 종양은 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 ADO를 갖는다. 일부 측면에서, 참조 수준은 환자의 건강한 조직에서의 수준이다. 일부 측면에서, 참조 수준은 건강한 대상체의 수준이다.
일부 측면에서, 환자는 이전에 암 치료를 받았고, 암의 재발을 예방하기 위해 효소가 투여된다. 일부 측면에서, 이 방법은 전이를 예방하는 방법이다. 일부 측면에서, 이 방법은 면역요법에 대한 감수성을 증가시키는 방법이다. 일부 측면에서, 환자는 이전에 면역 체크포인트 억제제의 투여에 반응하지 않았다. 일부 측면에서, 이 방법은 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 제2 항암 요법은 면역 체크포인트 차단, 입양 T 세포 요법, 외과 요법, 화학요법, 방사선 요법, 동결요법, 호르몬 요법, 면역요법 또는 사이토카인 요법이다. 일부 측면에서, 제2 항암 요법은 입양 T 세포 요법, 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, BMS-036559 또는 CK-301을 포함한다. 특정 측면에서, 항-PD1 항체에는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-223, AMP-514, 세미플리맙 또는 PDR-001이 포함된다. 특정 측면에서, 항-CTLA-4 요법은 이필리무맙 또는 트레멜리무맙을 포함한다. 일부 측면에서, 입양 T-세포 요법은 변이체 MTAP 효소의 투여 후에 투여된다. 일부 측면에서, 입양 T-세포 요법은 변이체 MTAP 효소를 발현하도록 조작되는 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 MTA 고갈에 감수성이 있는 임의의 암이다. 일 실시양태에서, 본 발명은 이러한 폴리펩티드를 포함하는 제형을 투여하는 단계를 포함하는 종양 세포 또는 암 환자를 치료하는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 투여는 암 세포의 적어도 일부가 사멸되도록 하는 조건하에 발생한다. 또 다른 실시양태에서, 제형은 생리학적 조건에서 MTA 분해 활성을 갖도록 변형된 MTase를 포함하고, 추가로 부착된 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제형은 상기 논의된 임의의 MTase 변이체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 제형이다. 이러한 약제학적으로 허용되는 부형제는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 상기 MTase 변이체 모두는 인간 치료에 유용한 것으로 고려될 수 있다.
생체내 적용에서, 종양 세포를 치료하는 것은 종양 세포 집단을 위한 영양 배지를 MTase와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 실시양태에서, 배지는, MTA-고갈이 요구되는 경우, 혈액, 림프액, 척수액 및 이와 유사한 체액일 수 있다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 변형된 MTase를 함유하는 이러한 제형은 정맥내로, 피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 활막내로, 기관내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 종양내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심낭내로, 배꼽내로, 안내로, 경구로, 국소로, 흡입, 주입, 연속 주입, 국소 관류에 의해, 카테터를 통해, 세정을 통해, 지질 조성물(예: 리포솜)에서, 또는 당업자에게 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 전술한 것의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다.
일 실시양태에서, 변형된 MTase 또는 변형된 MTase를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물이 대상체의 종양 치료에 사용하기 위해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 종양 치료용 약제의 제조에서 변형된 MTase 또는 변형된 MTase를 암호화하는 핵산의 용도가 제공된다. 변형된 MTase는 실시양태의 임의의 변형된 MTase일 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물의 문맥에서 논의된 실시양태는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관한 실시양태는 본 발명의 다른 방법 및 조성물에도 적용될 수 있다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 수 있기 때문에, 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내면서, 상세한 설명 및 특정 예는 예시의 목적으로만 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 양호한 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적 실시양태를 설명하는 이하의 상세한 설명 및 첨부 도면("도" 또는 "도면들")을 참조함으로써 수득될 수 있다.
도 1a-e. 정의된 PEG화 및 호모 사피엔스로부터의 MTAP 폴리펩티드의 약리학적 동력학에 미치는 영향. 도 1a는 0, 10, 20, 50 또는 100배 몰 과량(X)의 PEG와 반응한 호모 사피엔스 MTAP(hs-MTAP) 폴리펩티드의 SDS-PAGE 겔을 제공한다. 도 1b-e는 모의-PEG화 hs-MTAP 폴리펩티드와, 10X PEG(도 1b), 20X PEG(도 1c), 50X PEG(도 1d) 및 100X PEG(도 1e)로 변형된 hs-MTAP 폴리펩티드의 반응 동역학을 비교한다.
도 2a-c. 정의된 PEG화 및 5개 이상의 PEG 모이어티에 접합될 때에 높은 촉매 활성을 유지하는 호모 사피엔스 MTAP 폴리펩티드의 2개 변이체의 효소 동력학에 대한 영향. 도 2a는 0x 또는 100X PEG와 반응한 K225R 및 K238R 치환을 갖는 hs-MTAP 폴리펩티드의 SDS-PAGE 겔을 제공한다. 0X 및 100X PEG를 갖는 hs-MTAP-K225R 폴리펩티드(도 2b) 및 0X 및 100X PEG를 갖는 hs-MTAP-K238R 폴리펩티드(도 2c) 사이의 반응 동역학의 비교가 도시된다.
도 3a-b. 암과 면역억제에서 MTAP와 CDKN2A의 역할. 도 3a는, 항-PD-L1 항체로 치료한 경우, CDKN2A(CDKN2A -/-)에 대해 호모접합성인 비소세포 폐암(NSCLC) 환자가 야생형 CDKN2A 또는 이형 접합 CDKN2A 돌연변이를 갖는 NSCLC 환자와 비교하여 더 짧은 무진행 생존을 가졌음을 나타낸다. 도 3b는 MTAP 카피 중 하나 또는 둘 모두의 결실이 두경부암에서 면역억제에 기여하는 것을 나타낸다. CD8A의 통계적으로 유의한 감소는 MTAP 유전자좌의 결실에 의해서만 관찰되었다.
도 4a-b. MTAP 폴리펩티드에 의한 암 치료. 도 4a는 PEG화 MTAP 폴리펩티드가 종양 미세환경에서 MTA를 분해하여 T-세포 침윤을 강화할 수 있는 방법을 예시한다. 도 4b는 50mg/kg hs-MTAP의 첨가 후 0, 4 또는 24시간에서 백혈병 동종이식 종양(L1210)의 미세환경에서 MTA 수준의 막대 그래프를 나타낸다.
도 5a-c. 표적 암 치료에서 PEG화-MTAP 폴리펩티드의 치료 가능성. 도 5a-5b는 PEG화-MTAP 폴리펩티드(PEG-MTAP)의 존재 또는 부재하에 치료된 마우스에서 MTAP +/+(도 5a) 및 MTAP -/-(도 5b) B6-F10 흑색종 세포 동종이식 종양의 성장을 나타내는 선 그래프이다. PEG-MTAP 치료는 대조군과 비교하여 MTAP +/+ 종양의 성장을 변경하지 않았다. 대조적으로, PEG-MTAP 치료는 대조군과 비교하여 MTAP -/- 종양의 성장을 유의하게 감소시켰다. 더욱이, 완전 관해(CR)는 MTAP -/- 종양을 갖는 7마리 중 3마리의 마우스에서 관찰되었다. 도 5c는 도 5b에서 마우스의 생존에 대한 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. PEG-MTAP로 치료한 마우스의 평균 생존기간은 약 32일이고, 대조군(21일)보다 11일 길었다.
도 6a-d. CD8+ T-세포는 MTAP에 의한 B6-F10 흑색종 세포 동종이식 종양 성장의 억제에 필요하다. MTAP 치료는, 미치료 대조군(도 6a)과 비교한 경우, 종양의 성장을 유의하게 감소시킨다(도 6c). 6마리 중 2마리도 완전 관해(CR)를 달성했다. 항-CD8 항체는 종양 성장을 증가시켰고(도 6b), MTAP 치료의 효과를 차단했다(도 6d).
도 7a-d. PEG-MTAP 치료는 B6-F10 흑색종 동종이식 종양의 종양 미세환경에서 CD8+/K167+(도 7a), CD4+/K167+(도 7b) 및 CD8+/그랜자임 B+(도 7c) 종양 침윤 림프구(TIL)의 수 및 종양 배출 림프절에서 총 림프구의 수(도 7d)를 증가시킬 수 있다.
도 8a-c. B16-MTAP-/- 흑색종 종양 모델에서 림프구 집단에 대한 PEG화 hs-MTAP 폴리펩티드(PEG-hs-MTAP)의 효과. 도 8a는 PEG-hs-MTAP 투여가 TCR3β+ 세포에서 CD4+ 세포의 백분율을 증가시켰음을 나타낸다. 도 8b는 PEG-hs-MTAP 투여가 CD45+ 세포에서 TCRβ-, NK1.1+ 세포의 백분율을 증가시켰음을 나타낸다. 도 8c는 PEG-hs-MTAP 투여가 Ki67+인 CD8+/그랜자임 B+ 세포의 백분율을 증가시켰음을 나타낸다.
도 9a-b. MTAN 폴리펩티드에 의한 암 치료. 도 9a는 살모넬라 엔테리카(PEG-se-MTAN)로부터의 MTAN 폴리펩티드 또는 PBS 비히클 대조군에 의한 치료 후의 마우스에서 L1210 백혈병 세포 동종이식 종양의 성장을 나타낸다. PEG-se-MTAN은 L1210 종양의 성장을 유의하게 지연시켰다. 도 9b는 도 9a의 치료 및 미치료 마우스의 생존율에 대한 카플란-마이어 플롯을 나타낸다(p < 0.0035). PEG-se-MTAN에 의한 치료는 L1210 마우스 백혈병 동종이식 종양을 갖는 마우스의 생존율을 증가시켰다.
도 10a-f. PEG-se-MTAN 폴리펩티드로 치료된 L1210 백혈병 세포 동종이식편의 종양 및 종양 배출 림프절(TDLN)에서 림프구 서브타입의 평가. 종양에서, PEG-se-MTAN 투여는 CD45+ 생존 세포의 백분율로서 TCRβ+ 세포(도 10a), 및 모든 생존 세포의 백분율로서 CD4+ Ki67+ 세포(도 10b) 및 CD8+ Ki67+ 세포(도 10c)를 증가시켰다. TDLN에서, PEG-MTAN의 투여는 모든 생존 세포의 백분율로서 TCRβ+ 세포(도 10d), CD11b+ 세포(도 10e) 및 F4/80+ 세포(도 10f)를 증가시켰다.
도 11a-b. 마우스 4T1 유방암 동종이식편의 PEG-MTAN 폴리펩티드 및 항-CTLA4 항체에 의한 병용 치료의 효능. 도 11a는, 비히클(좌측 상부), PEG-MTAN 폴리펩티드(우측 상부), 항-CTLA4 항체(좌측 하부) 또는 PEG-MTAN 폴리펩티드와 항-CTLA4 항체의 조합(우측 하부)에 의한 치료 후의 종양 용적(mm3) 및 시간(경과 일수)의 상관을 나타낸다. PEG-MTAN 폴리펩티드(50mg/kg) 또는 항-CTLA4 항체(10mg/kg, 클론 UC10-4F10-11, Bio X Cell)의 개별 투여는 종양의 성장을 억제하는 반면, 이들의 조합은 둘 중 하나에 의한 치료 단독보다 강력한 억제를 제공했다. 도 11b는 비히클, PEG-MTAN 폴리펩티드, 항-CTLA4, 또는 PEG-MTAN 폴리펩티드와 항-CTLA4 항체의 조합에 의한 치료 후에 폐 전이의 수를 나타낸다. PEG-MTAN 폴리펩티드(50mg/kg), 항-CTLA4 항체(10mg/kg, 클론 UC10-4F10-11, Bio X Cell) 또는 이들의 조합은 폐 전이의 수를 유의하게 감소시켰다.
도 12a-d. 마우스 CT26 결장암 동종이식편(MTAPlow CD73+)의 PEG-MTAN 폴리펩티드와 항-PD-1 항체에 의한 조합 치료의 효능. 비히클 대조군(도 12a), 항-PD-1 항체(클론 RMP1-14, BioXCell # BE0146, 10mg/kg 2x 주)(도 12b), PEG-MTAN(50mg/kg 3x 주)(도 12c), 또는 PEG-MTAN과 항-PD-1 항체의 조합(도 12d)을 CT26 암종 동종이식편 이식 후 15일 및 25일차에 투여했다. PEG-MTAN 폴리펩티드 또는 항-PD-1 항체의 개별 투여는 종양의 성장을 억제하는 반면, 이들의 조합은 단독 치료보다 더 강력한 억제를 제공했다. 추가로, 완전 관해(CR)는 병용 치료를 받은 3마리의 마우스에서 관찰된 반면, 단독 치료만으로 CR을 달성한 것은 1마리의 마우스 뿐이었다.
도 13은 PEG화 MTAP K238R 폴리펩티드(MTAP K238R)의 존재 또는 부재하에 치료된 마우스에서 CT26 세포 동종이식 종양의 성장을 나타낸다. PEG화 MTAP K238R 치료는 PBS 대조군과 비교하여 CT26 종양의 성장을 감소시켰다. 추가로, 완전한 관해(CR)는 PEG화 MTAP K238R 폴리펩티드로 치료된 6마리 중 2마리의 마우스에서 관찰되었다.
암 치료를 위한 PEG화 MTAP 폴리펩티드를 제공하기 위한 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 방법, 약제학적 조성물, 및 키트가 본 명세서에서 제공된다. 일부 예에서, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 혈청을 포함하는 세포외 환경에서 더 높은 촉매 활성 또는 단백질 안정성을 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본 명세서에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서만 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다수의 변형, 변경 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 발생할 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대체안이 본 발명을 실시할 때에 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 이하의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위의 범위 내의 방법 및 구조 및 이들의 균등물은 이에 의해 커버되는 것으로 의도된다.
정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 청구범위(들)에서 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, "a" 또는 "an"이라는 단어는 하나 또는 둘 이상을 의미할 수 있다.
특허청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 대체물만을 지칭하도록 명시적으로 지시되지 않는 한, 또는 대체물이 상호 배타적인 경우를 제외하고, "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
이 출원 전체를 통해, "약"이라는 용어는 값이 장치에 대한 고유한 오차의 변동, 값을 결정하는 데 사용되는 방법, 연구 대상 사이에 존재하는 변동 또는 언급된 값의 10% 이내인 값을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)"(및 "포함하다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)" 등의 포함하는의 임의 형태), "갖는(having)"(및 "갖다(have)" 및 "갖는다(has)" 등의 갖는의 임의 형태) 및 "포함하는(including)"(및 "포함하다(includes)" 및 "포함한다(include)" 등의 포함하는의 임의 형태) 또는 "함유하는(containing)"(및 "함유하다(contains)" 및 "함유한다(contain)" 등의 함유하는의 임의 형태)은 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
용어 "대상체", "숙주", "환자" 및 "개인"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 진단 또는 치료가 필요한 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 다른 대상에는 소, 개, 고양이, 기니 피그, 래빗, 랫트, 마우스, 말 등이 포함될 수 있다.
세포에 적용되는 경우, 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 치료 작제물이 표적 기관에 전달되거나, 또는 표적 세포와 직접 병치되는 프로세스를 설명하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭할 수 있다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 수 있는 경우, 분자는 그 위치에서 상동일 수 있다. 서열 사이의 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 정합하는 또는 상동성 위치의 수의 함수일 수 있다. "비관련" 또는 "비-상동" 서열은 본 개시의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다. 서열 상동성은 참조 서열에 대한 서열의 % 동일성을 지칭할 수 있다. 실제 문제로서, 임의의 특정 서열이 본 명세서에 기재된 임의의 서열(본 명세서에 기재된 특정 핵산 서열에 상응할 수 있음)에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있든지, 이러한 특정 폴리펩티드 서열은 베스트피트(Bestfit) 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) 등의 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 베스트피트 또는 이의 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 참조 서열에 대해, 예를 들면, 95% 동일한지의 여부를 결정하는 경우, 동일성 백분율이 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고, 전체 참조 서열의 최대 5%의 서열 상동성의 갭이 허용될 수 있도록, 파라미터를 설정할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 호환적으로 사용되고, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체인 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 이하는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예: 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 유전자간 DNA(헤테로크로마틱 DNA를 포함하지만 이들로 한정되지 않음), 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 서열의 단리된 DNA, 서열의 단리된 RNA. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 등의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 제공될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 표지 성분과의 접합에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 이 용어는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자를 모두 지칭한다. 예를 들면, 포스포티오에이트 골격을 갖는 핵산을 포함하는 핵산은 하나 이상의 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 반응성 모이어티는 또 다른 분자, 예를 들면, 공유, 비공유 또는 기타 상호작용을 통해, 예를 들면, 핵산 또는 폴리펩티드와 반응할 수 있는 임의의 그룹을 포함한다. 예를 들면, 핵산은 공유, 비공유 또는 기타 상호작용을 통해 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산과 반응하는 아미노산 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 달리 명시 또는 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 개시의 임의의 실시양태는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 2개의 상보적 단일 가닥 형태 각각을 모두 포함한다.
본 개시의 방법에서 유용한 폴리뉴클레오티드는 천연 핵산 서열 및 이의 변이체, 인공 핵산 서열, 또는 이러한 서열의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, DNA 서열은 유사한 RNA 서열과 교환 가능하다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 RNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, RNA 서열은 유사한 DNA 서열과 교환 가능하다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 U 및 T는 본 명세서에 제공된 서열에서 교환될 수 있다.
"표준 아미노산"은 인체에서 자연적으로 발견되는 20개 아미노산을 지칭한다. 치환, 돌연변이 또는 치환 변이체는 통상 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 교환하는 것을 포함하고, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 특히 이의 이펙터 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다.
치환은 보존적일 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다. 즉, 하나의 아미노산이 유사한 형상과 전하를 갖는 아미노산으로 치환된다. 보존적 치환은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 이하의 변경이 포함된다: 알라닌으로부터 세린으로; 아르기닌으로부터 리신으로; 아스파라긴으로부터 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파테이트로부터 글루타메이트로; 시스테인으로부터 세린으로; 글루타민으로부터 아스파라긴으로; 글루타메이트로부터 아스파테이트로; 글리신으로부터 프롤린으로; 히스티딘으로부터 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신으로부터 류신 또는 발린으로; 류신으로부터 발린 또는 이소류신으로; 리신으로부터 아르기닌으로; 메티오닌으로부터 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌으로부터 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린으로부터 트레오닌으로; 트레오닌으로부터 세린으로; 트립토판으로부터 티로신으로; 티로신으로부터 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린으로부터 이소류신 또는 류신으로.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 호환적으로 사용되고, 이들의 가장 넓은 의미에서 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모방체의 화합물을 지칭한다. 이 용어는 또한, 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 기타 조작에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다.
치료 조성물과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "단위 용량"은 대상체에 대한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각 단위는 필요한 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 관련하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다.
호환적으로 사용되는 용어 "세포", "세포들" 및 "세포 집단"은 하나 이상의 포유동물 세포를 의미한다. 이 용어는 세포 또는 세포 집단의 자손을 포함한다. 당업자는 "세포"가 단일 세포의 자손을 포함하고, 자연적, 우발적 또는 의도적 돌연변이 또는 변화로 인해 자손과 이의 원래 모 세포와 사이에 변이가 있음을 인식할 것이다.
용어 "면역요법"은 질환 항원에 대한 면역 반응을 조절함으로써 질환(예를 들면, 암)을 치료하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "암 세포"는 종양성 세포 표현형을 나타내는 세포를 지칭하고, 이는, 예를 들면, 비정상적 세포 성장, 비정상적 세포 증식, 밀도 의존성 성장 억제의 상실, 고정-비의존성 성장 가능성, 면역저하된 비인간 동물 모델에서 종양 성장 또는 발달을 촉진하는 능력, 또는 세포 형질전환의 적절한 지표 중의 하나 이상을 특징으로 할 수 있다. "암 세포"는 본 명세서에서 "종양 세포" 또는 "암 세포"와 호환적으로 사용될 수 있고, 고형 종양 및 액체 종양의 암 세포를 포함한다. "암"은 본 명세서에서 "종양"과 호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "고형 종양" 또는 "고형암"은 통상 낭종 또는 액체 영역을 포함하지 않는 종양을 지칭한다. 고형 종양은 뇌 및 기타 중추신경계 종양(뇌수막, 뇌, 척수, 뇌신경 및 중추신경계의 다른 부분의 종양, 예를 들면, 교모세포종(glioblastomas) 또는 수모세포종(medulla blastomas)을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 두경부암(head or neck cancer); 유방 종양(breast tumors); 순환계 종양(심장, 종격동 및 흉막, 기타 흉강내 기관, 혈관 종양 및 종양 관련 혈관 조직을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 배설계 종양(신장, 신우, 요관, 방광, 이의 기타 불특정 비뇨기 기관의 종양을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 위장관 종양(식도, 위, 소장, 결장, 결장직장, 직장 S자 결절, 직장, 항문 및 항문관의 종양, 간 및 간내 담관, 담낭, 담도, 기타 및 불특정 부분, 췌장, 기타 및 소화 기관을 수반하는 종양을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 구강 종양(입술, 혀, 잇몸, 입천장, 구개 및 입의 기타 부분, 이하선 및 침샘의 기타 부분, 편도선, 중인두, 비인두, 이상동, 하인두 및 입술, 구강 및 인두의 기타 부위의 종양을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 생식계 종양(외음부, 질, 자궁경부, 자궁체, 자궁, 난소 및 기타 여성 생식기와 관련된 기타 부위, 태반, 음경, 전립선, 고환 및 남성 생식기와 관련된 기타 부위의 종양을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 호흡기 종양(비강 및 중이, 부비동, 후두, 기관, 기관지 및 폐의 종양, 예를 들면, 소세포 폐암(small cell lung cancer) 또는 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 골격계 종양(수족의 골 및 관절 연골, 골 관절 연골 및 기타 부위의 종양을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 피부 종양(피부의 악성 흑색종, 비-흑색종 피부암, 피부의 기저 세포 암종, 피부의 편평 세포 암종, 중피종, 카포시 육종을 포함하지만 이들로 한정되지 않음); 및 말초 신경 및 자율 신경계, 결합 조직 및 연조직, 후복막 및 복막, 눈 및 부속기, 갑상선, 부신 및 기타 내분비선 및 관련 구조를 포함하는 기타 조직을 수반하는 종양, 림프절의 이차 및 불특정 악성 신생물, 호흡기계 및 소화기계의 이차 악성 신생물 및 기타 부위의 이차 악성 신생물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "액체 암" 또는 "액체 종양"은 혈액, 림프 및 골수 등의 체액에 존재하는 암 세포를 지칭한다. 액체 암에는 백혈병(leukemia), 골수종(myeloma), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome; MDS) 및 액체 림프종(liquid lymphomas)이 포함된다. 액체 림프종에는 낭종 또는 액체 영역을 포함하는 림프종이 포함된다. 본 명세서에 사용된 액체 암은 육종 및 암종 등의 고체 종양, 또는 낭종 또는 액체 영역을 포함하지 않는 고체 림프종을 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "접합체"는 공유 결합에 의해 함께 연결된 적어도 2개의 분자 또는 분자 모이어티를 지칭한다. 분자 또는 분자 모이어티는, 결합에 의해 연결되면, 다른 분자 또는 분자 모이어티에 "접합"되는 것으로 간주된다. 따라서, "비접합된" 분자 또는 분자 모이어티는 공유 결합에 의해 연결되지 않는다.
용어 "PEG화"는, 단백질 또는 약물을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다른 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자(들)의 공유 부착의 프로세스를 지칭한다. PEG화 단백질은 "PEG화"된 것으로 지칭될 수 있다. PEG화 폴리펩티드는 PEG화되지 않은 동등한 폴리펩티드 또는 PEG화되지 않은 폴리펩티드와는 질적 또는 양적으로 상이한 특성을 가질 수 있다.
용어 "유효량"은 유익한 또는 목적하는 임상 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 이 용도의 목적을 위해, 항체 또는 폴리펩티드의 유효량은 질환 상태의 진행을 진단, 완화, 개선, 안정화, 역전, 감속 또는 지연시키기에 충분한 양이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 비-자연 발생 방식으로 작동 가능하게 연결된 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라 단백질을 지칭한다. 융합 단백질은 하나 이상의 자연 발생 또는 재조합으로 생성된 단백질로부터의 도메인으로 구성된 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 일반적으로 각각의 도메인은 상이한 기능을 한다. 이와 관련하여, 용어 "링커"는 이러한 도메인을 함께 연결하기 위해(임의로, 융합된 단백질 도메인의 형태를 보존하고/하거나, 각각의 기능을 손상시킬 수 있는 융합된 단백질 도메인 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 방지하기 위해) 사용되는 단백질 단편을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "반감기"(반감기; T 1/2)는 폴리펩티드의 농도가 시험관내 또는 생체내에서, 예를 들면, 포유동물에서의 주사 후에 절반으로 저하하는 데 필요한 시간을 지칭한다.
용어 "작동 가능한 조합으로", "작동 가능한 순서로" 및 "작동 가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 성분이 이들의 의도된 방식으로 기능하는 것을 가능하게 하는 관계에 있는 연결, 예를 들면, 핵산 분자가 소정 유전자의 전사 또는 목적하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있도록 하는 방식으로 핵산 서열의 연결, 또는 융합 단백질이 생성되는 방식으로 아미노산 서열의 연결을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "KM"은 효소에 대한 미카엘리스-멘텐 상수를 지칭하고, 소정 효소가 효소 촉매 반응에서 이의 최대 속도의 1/2을 생성하는 특정 기질의 농도로서 정의된다. KM은 효소의 기질 결합 친화성을 측정하기 위해 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "kcat"는 턴오버 수(turnover number), 또는 각 효소 부위가 단위 시간당 생성물로 전환되고 효소가 최대 효율로 작용하는 는 기질 분자의 수를 지칭한다. kcat은 효소의 촉매 속도를 측정하기 위해 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "kcat/KM"은 특이성 상수이고, 이는 효소가 기질을 생성물로 얼마나 효율적으로 전환시키는지의 척도이다. kcat/KM은 효소의 촉매 효율을 측정하기 위해 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Vmax"는 효소 반응의 최대 속도를 지칭한다. 효소가 기질로 포화되면, 효소 반응은 최대 속도에 도달할 수 있다. Vmax는 kcat과 효소 농도의 곱일 수 있다. Vmax는 효소의 촉매 속도를 측정하기 위해 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "촉매 활성"은 기질 전환 또는 효소 생성의 효소 동역학의 임의의 정성적 또는 정량적 특성을 지칭한다. 촉매 활성은 KM, kcat, Vmax, 또는 본 명세서 및 이들의 임의의 유도체를 사용하여 측정할 수 있다. 기타 효소 동역학 측정도 사용할 수 있다.
용어 "MTase"는 MTA의 메틸티오리보스-1-포스페이트(MTR-1-R) 또는 메틸티오리보스(MTR) 및 아데닌으로의 가인산분해 또는 가수분해, 게다가 아데노신의 리보스-1-포스페이트 또는 리보스 및 아데닌으로의 인산분해 또는 가수분해를 촉매하는 임의의 효소를 지칭한다. 이것은 폴리아민의 대사와 아데닌 및 메티오닌 회수 경로에 역할을 할 수 있다. 이는 영장류 형태의 MTAP, 또는 특히 인간 형태의 MTAP 또는 원핵생물 형태의 MTAN을 포함할 수 있다.
용어 "MTAP"는 메틸티오아데노신 포스포릴라제를 지칭한다. 이는 MTA의 메틸티오리보스-1-포스페이트(MTR-1-R)와 아데닌으로의 가인산분해, 및 아데노신의 리보스-1-포스페이트와 아데닌으로의 가인산분해를 촉매할 수 있다. 인간 형태의 MTAP는 호모 사피엔스 MTAP 또는 hs-MTAP로 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, MTAP는 폴리펩티드 또는 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 핵산을 의미할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, MTAP는 또한 PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 PEG-접합 MTAP 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
용어 "MTAN"은 메틸티오아데노신 뉴클레오시다제를 지칭한다. 이것은 MTA의 메틸티오리보스(MTR)와 아데닌으로의 가수분해, 게다가 아데노신의 리보스와 아데닌으로의 가수분해를 촉매할 수 있다. MTAN의 원핵생물 형태는 세균 MTAN, 예를 들면, 살모넬라 엔테리카 MTAN 또는 se-MTAN을 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, MTAN은 폴리펩티드 또는 MTAN 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 핵산을 의미할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, MTAN은 또한 PEG화 MTAN 폴리펩티드 또는 PEG-접합 MTAN 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
용어 "인간"은 호모 사피엔스를 지칭한다.
폴리펩티드의 용어 "접합 부위"는 또 다른 실체에 대한 공유 결합, 부착, 접합 또는 연결을 위한 부위로서 작용하는 아미노산 잔기 또는 화학 그룹을 지칭한다. 하나의 예시적 실체는 PEG 중합체이다.
암 치료를 위한 PEG화 메틸티오아데노신 포스포릴라제 ( MTAP ) 폴리펩티드
MTase은, 일부 경우에, 질환의 치료에 사용할 수 있다. 일부 경우에, 질환은 암을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 질환은 면역계와 관련된 질환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 질환은 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 결함과 관련된 상태를 포함할 수 있다. 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 결함은 경우에 따라 MTAP의 유전적 또는 비유전적 상실, 억제, 돌연변이 또는 하향-조절로 인해 발생할 수 있다.
일부 경우에, MTase는 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 메틸티오아데노신(MTA)의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 수행할 수 있는 효소 활성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTase는 MTAP 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTase는 인간 MTAP 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 경우에, MTase는 MTA의 메틸티오리보스 및 아데닌으로의 가수분해를 수행할 수 있는 효소 활성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTase는 살모넬라 엔테리카 MTAN 등의 세균 MTAN을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 포스페이트와 S-메틸-5'티오아데노신을 아데닌과 S-메틸-5-티오-α-D-리보스 1-포스페이트로 전환할 수 있다. 일부 경우에, 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 5'-메틸티오투베르신 또는 5'-클로로포르마이신에 의해 억제될 수 있다. 일부 경우에, MTAP의 활성은 세균, 효모, 마우스, 소, 인간 또는 기타 생물에서 발견될 수 있다.
일부 경우에, MTase는 MTA 또는 아데노신(ADO)을 이화할 수 있는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, MTase는 세포외 또는 세포내 MTA 또는 ADO를 분해할 수 있다. 일부 경우에, 세포외 MTA 또는 ADO가 종양 미세환경(TME)에 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포외 MTA 또는 ADO는 혈청에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, MTase는 혈청에서 MTA 또는 ADO를 분해할 수 있다. 다른 실시양태에서, MTase는 TME에서 MTA 또는 ADO를 분해할 수 있다.
일부 실시양태에서, MTase는 MTA 또는 ADO 분해 활성을 갖는 세균, 진균, 식물 또는 동물의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTase 폴리펩티드 서열은 MTA 또는 ADO를 분해할 수 있는 포유동물 MTAP 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, MTAP 폴리펩티드 서열은 MTA 또는 ADO를 분해할 수 있는 인간 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, MTase는 ADO 또는 MTA를 분해할 수 있는 자연 발생 또는 변형된 MTAP 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, MTase는 ADO 또는 MTA를 분해할 수 있는 자연 발생 또는 변형된 MTAN 또는 원핵생물 MTAN을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, MTase 폴리펩티드는 생리학적 조건하에 ADO 또는 MTA를 분해할 수 있다. 다른 경우에, MTase 폴리펩티드는 시험관내 조건하에서 ADO 또는 MTA를 분해할 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 자연 발생 또는 비-자연 발생 MTAP 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 자연 발생 MTAP 폴리펩티드는 야생형 서열을 갖는 MTAP 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자연 발생 MTAP 폴리펩티드는 화학적 변형, 치환, 삽입, 결실, 융합 또는 절단 등의 하나 이상의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자연 발생 MTAP 폴리펩티드는 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자연 발생 MTAP 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 그 이상의 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자연 발생 MTAP 폴리펩티드는 보존적 치환, 비-보존적 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이의 활성 부위, 염기-결합 부위 또는 메틸티오리보스-결합 부위 외부에 있는 부위에서 변형될 수 있고, 여전히 이의 촉매 활성을 유지한다. 다른 경우에, 자연 발생 MTAP 폴리펩티드는 단백질 결합 활성, 단백질 안정성, 단백질 국소화, 비기질 결합 활성, 화학적 변형 활성, 화학적으로 변형되는 단백질 능력, 단백질 폴딩, 단백질 수송, 본 명세서 및 이들의 유도체, 또는 본 명세서 및 이들의 조합을 조절할 수 있는 위치에서 변형될 수 있다. 본 명세서에 기재된 및 이의 변조는 증가 또는 감소를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
일부 경우에, MTAP 활성을 갖는 MTAP 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성(또는 그 중에서 도출 가능한 임의의 범위)을 갖는 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, MTAP 활성을 갖는 MTAP 폴리펩티드는 서열번호 1의 적어도 또는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 또는 284개 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 활성을 갖는 MTAP 폴리펩티드는 서열번호 1의 1-10, 5-15, 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40, 35-45, 40-50, 45-55, 50-60, 55-65, 60-70, 65-75, 70-80, 75-85, 80-90, 85-95, 90-100, 95-105, 100-110, 105-115, 110-120, 115-125, 120-130, 125-135, 130-140, 135-145, 140-150, 145-155, 150-160, 155-165, 160-170, 165-175, 170-180, 175-185, 180-190, 185-195, 190-200, 195-205, 200-210, 205-215, 210-220, 215-225, 220-230, 225-235, 230-240, 235-245, 240-250, 245-255, 250-260, 255-265, 260-270, 265-275, 270-280 또는 275-284개 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 활성을 갖는 MTAP 폴리펩티드는 서열번호 1의 적어도 200개의 아미노산에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 활성을 갖는 MTAP 폴리펩티드는 서열번호 1의 적어도 200개의 아미노산에 대해 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 서열 및 서열번호 1의 Thr18, Thr197, Ser178, Val233 및 Met196을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 3개의 MTAP 폴리펩티드는 약 32kDa의 동일한 3개의 서브미트를 갖는 호모삼량체로서 조합될 수 있다. 다른 경우에, 2개의 MTAP 폴리펩티드는 호모이량체로서 조합될 수 있다[참조: Appleby et al., 1999]. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드 호모삼량체는 C3 대칭성에 의해 관련된 3개의 동일하거나 유사한 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드 호모삼량체에서 각 MTAP 폴리펩티드의 활성 부위는 각 MTAP 폴리펩티드 사이의 계면 근처에 위치할 수 있다. 일부 경우에, 서열번호 1의 서열을 갖는 MTAP 폴리펩티드의 활성 부위는 MTAP 폴리펩티드의 T18, R60, H61, T93, A94, F177, S178, M196, T197, T219, D220, D222, V233, V236 또는 L237을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열번호 1의 서열을 갖는 제1 MTAP 폴리펩티드의 활성 부위는 서열번호 1의 서열을 갖는 제2 MTAP 폴리펩티드의 H137 또는 L279를 포함할 수 있고, 이는 호모삼량체에서 제1 MTAP 폴리펩티드의 계면을 형성한다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 활성제는 서열번호 1의 T18, R60, H61, T93, A94, F177, S178, H137, M196, T197, T219, D220, D222, V233, V236, L237 또는 L279의 구조적 등가 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 구조적 등가의 잔기는 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 도입되는 문헌[참조: Appleby et al.]에 의해 기재된 MTAP 폴리펩티드의 3차원 구조에 기초하여 동정될 수 있다.
PEG화 MTAP 폴리펩티드
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 PEG화되지 않은 MTAP 폴리펩티드와 비교하여 변형, 제거 또는 부가된 특성을 가질 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 PEG화되지 않은 MTAP 폴리펩티드와 비교하여 조절된 특성을 가질 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 조정된 크기, 용해도, 단백질분해 효소에 대한 접근성, 면역원성 및 항원성, 신체-체류성, 안정성, 또는 본 명세서 및 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 크기 증가, 용해도 증가, 단백질분해 효소에 대한 접근성 감소, 면역원성 및 항원성 감소, 신체 체류 시간 및 안정성 증가, 또는 본 명세서 및 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 리신 잔기에서 PEG화될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 리신 잔기가 PEG화되는 것을 방지하기 위해 리신 잔기를 제거하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 리신 잔기가 PEG화되는 것을 방지하기 위해 리신 잔기를 또 다른 아미노산으로 치환하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드에서 또 다른 아미노산으로 치환된 리신 잔기는 활성 부위 또는 결합 부위에 가깝게 위치할 수 있다. 일부 경우에, 활성 부위 또는 결합 부위에 가까운 리신 잔기를 치환하면, 해당 리신 잔기에서 PEG화를 방지할 수 있다. 일부 경우에, 활성 부위 또는 결합 부위에 가까운 리신 잔기를 치환함으로써 PEG 분자 또는 PEG화 반응이 MTAP 폴리펩티드의 촉매 활성 또는 기질 특이성에 영향을 미치는 것을 방지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환 또는 결실되는 MTAP 폴리펩티드의 리신 잔기는 서열번호 1의 리신(또는 K) 11, 32, 40, 49, 51, 71, 82, 147, 157, 158, 166, 206, 225, 238, 241, 246, 248, 271 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치환 또는 결실되는 MTAP 폴리펩티드의 리신 잔기는 서열번호 1의 K225 또는 K238 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 리신 잔기는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린 또는 본 명세서 및 이들의 유도체를 포함하는 표준 아미노산 중 어느 하나로 치환될 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드의 리신은 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기 또는 본 명세서 및 이의 임의의 유도체로 치환될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 리신은 아르기닌으로 치환될 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 시스테인 잔기에서 PEG화될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 시스테인 잔기가 PEG화되는 것을 방지하기 위해 시스테인 잔기를 제거하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 시스테인 잔기가 PEG화되는 것을 방지하기 위해 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산으로 치환하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드에서 또 다른 아미노산으로 치환되는 시스테인은 활성 부위 또는 결합 부위에 가깝게 위치할 수 있다. 일부 경우에, 활성 부위 또는 결합에 가까운 시스테인 잔기를 치환함으로써 해당 시스테인 잔기에서 PEG화를 방지할 수 있다. 일부 경우에, 활성 부위 또는 결합 부위에 가까운 시스테인 잔기를 치환함으로써 PEG 분자 또는 PEG화 반응이 MTAP 폴리펩티드의 촉매 활성 또는 기질 특이성에 영향을 미치는 것을 방지할 수 있다. 일부 경우에, 치환 또는 결실되는 MTAP 폴리펩티드의 시스테인 잔기는 서열번호 1의 시스테인(또는 C) 55, 86, 95, 131, 136, 145, 163, 211, 223 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치환 또는 결실되는 MTAP 폴리펩티드의 리신 잔기는 서열번호 1의 C96, C136 또는 C223 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 시스테인 잔기는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 또는 본 명세서 또는 이의 유도체를 포함하는 표준 아미노산 중 어느 하나로 치환될 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드의 시스테인은 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기 또는 본 명세서 및 이의 임의의 유도체로 치환될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 시스테인은 아르기닌으로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 1의 K225R 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이를 갖는 MTAP 폴리펩티드는 서열번호 3의 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 3에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성(또는 그 중에서 도출 가능한 임의의 범위)을 갖는 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 3의 적어도 또는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 또는 284개 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 3의 1-10, 5-15, 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40, 35-45, 40-50, 45-55, 50-60, 55-65, 60-70, 65-75, 70-80, 75-85, 80-90, 85-95, 90-100, 95-105, 100-110, 105-115, 110-120, 115-125, 120-130, 125-135, 130-140, 135-145, 140-150, 145-155, 150-160, 155-165, 160-170, 165-175, 170-180, 175-185, 180-190, 185-195, 190-200, 195-205, 200-210, 205-215, 210-220, 215-225, 220-230, 225-235, 230-240, 235-245, 240-250, 245-255, 250-260, 255-265, 260-270, 265-275, 270-280 또는 275-284개 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 3의 적어도 200개 아미노산에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 3의 적어도 200개 아미노산에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 서열 및 서열번호 3의 Thr18, Thr197, Ser178, Val233 및 Met196을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 1의 K238R 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 경우에, K238R 돌연변이를 갖는 MTAP 폴리펩티드는 서열번호 5의 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 5에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성(또는 그 중에서 도출 가능한 임의의 범위)를 갖는 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 5의 적어도 또는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 또는 284개 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 5의 1-10, 5-15, 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40, 35-45, 40-50, 45-55, 50-60, 55-65, 60-70, 65-75, 70-80, 75-85, 80-90, 85-95, 90-100, 95-105, 100-110, 105-115, 110-120, 115-125, 120-130, 125-135, 130-140, 135-145, 140-150, 145-155, 150-160, 155-165, 160-170, 165-175, 170-180, 175-185, 180-190, 185-195, 190-200, 195-205, 200-210, 205-215, 210-220, 215-225, 220-230, 225-235, 230-240, 235-245, 240-250, 245-255, 250-260, 255-265, 260-270, 265-275, 270-280 또는 275-284개 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 5의 적어도 200개 아미노산에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 서열번호 5의 적어도 200개 아미노산에 대해 적어도 약 80% 동일성을 갖는 서열 및 서열번호 5의 Thr18, Thr197, Ser178, Val233 및 Met196을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 기재된 및 이의 임의의 MTAP 또는 MTAN 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 측정은 MTAP 폴리펩티드의 V0, Vmax, KM, kcat 또는 이들의 조합을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 측정은 시험관내 반응을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 측정은 생체내 반응을 포함할 수 있다.
일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 야생형 또는 변이체 MTAP 폴리펩티드 또는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 적어도 약 1×104 M-1s-1, 2×104 M-1s-1, 3×104 M-1s-1, 4×104 M-1s-1, 5×104 M-1s-1, 6×104 M-1s-1, 7×104 M-1s-1, 8×104 M-1s-1, 9×104 M-1s-1, 1×105 M-1s-1, 1.1×105 M-1s-1, 1.2×105 M-1s-1, 1.3×105 M-1s-1, 1.4×105 M-1s-1, 1.5×105 M-1s-1, 1.6×105 M-1s-1, 1.7×105 M-1s-1, 1.8×105 M-1s-1, 1.9×105 M-1s-1, 2×105 M-1s-1, 2.1×105 M-1s-1, 2.2×105 M-1s-1, 2.3×105 M-1s-1, 2.4×105 M-1s-1, 2.5×105 M-1s-1, 2.6×105 M-1s-1, 2.7×105 M-1s-1, 2.8×105 M-1s-1, 2.9×105 M-1s-1, 3×105 M-1s-1, 3.1×105 M-1s-1, 3.2×105 M-1s-1, 3.3×105 M-1s-1, 3.4×105 M-1s-1, 3.5×105 M-1s-1, 3.6×105 M-1s-1, 3.7×105 M-1s-1, 3.8×105 M-1s-1, 3.9×105 M-1s-1, 4×105 M-1s-1, 4.1×105 M-1s-1, 4.2×105 M-1s-1, 4.3×105 M-1s-1, 4.4×105 M-1s-1, 4.5×105 M-1s-1, 4.6×105 M-1s-1, 4.7×105 M-1s-1, 4.8×105 M-1s-1, 4.9×105 M-1s-1, 5×105 M-1s-1, 6×105 M-1s-1, 7×105 M-1s-1, 8×105 M-1s-1, 9×105 M-1s-1, 1×106 M-1s-1, 2×106 M-1s-1, 3×106 M-1s-1, 4×106 M-1s-1 또는 5×106 M-1s-1일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 또는 비-PEG화 야생형 또는 변이체 MTAP 폴리펩티드 또는 K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대해 kcat/KM이 1×104 내지 2×104 M-1s-1, 1.5×104 내지 2.5×104 M-1s-1, 2×104 내지 3×104 M-1s-1, 2.5×104 내지 3.5×104 M-1s-1, 3×104 내지 4×104 M-1s-1, 3.5×104 내지 4.5×104 M-1s-1, 4×104 내지 5×104 M-1s-1, 4.5×104 내지 5.5×104 M-1s-1, 5×104 내지 6×104 M-1s-1, 5.5×104 내지 6.5×104 M-1s-1, 6×104 내지 7×104 M-1s-1, 6.5×104 내지 7.5×104 M-1s-1, 7×104 내지 8×104 M-1s-1, 7.5×104 내지 8.5×104 M-1s-1, 8×104 내지 9×104 M-1s-1, 8.5×104 내지 1×105 M-1s-1, 9×105 내지 1.1×105 M-1s-1, 1×105 내지 1.2×105 M-1s-1, 1.1×105 내지 1.3×105 M-1s-1, 1.2×105 내지 1.4×105 M-1s-1, 1.3×105 내지 1.5×105 M-1s-1, 1.4×105 내지 1.6×105 M-1s-1, 1.5×105 내지 1.7×105 M-1s-1, 1.6×105 내지 1.8×105 M-1s-1, 1.7×105 내지 1.9×105 M-1s-1, 1.8×105 내지 2×105 M-1s-1, 1.9×105 내지 2.1×105 M-1s-1, 2×105 내지 2.2×105 M-1s-1, 2.1×105 내지 2.3×105 M-1s-1, 2.2×105 내지 2.4×105 M-1s-1, 2.3×105 내지 2.5×105 M-1s-1, 2.4×105 내지 2.6×105 M-1s-1, 2.5×105 내지 2.7×105 M-1s-1, 2.6×105 내지 2.8×105 M-1s-1, 2.7×105 내지 2.9×105 M-1s-1, 2.8×105 내지 3×105 M-1s-1, 2.9×105 내지 3.1×105 M-1s-1, 3×105 내지 3.2×105 M-1s-1, 3.1×105 내지 3.3×105 M-1s-1, 3.2×105 내지 3.4×105 M-1s-1, 3.3×105 내지 3.5×105 M-1s-1, 3.4×105 내지 3.6×105 M-1s-1, 3.5×105 내지 3.7×105 M-1s-1, 3.6×105 내지 3.8×105 M-1s-1, 3.7×105 내지 3.9×105 M-1s-1, 3.8×105 내지 4×105 M-1s-1, 3.9×105 내지 4.1×105 M-1s-1, 4×105 내지 4.2×105 M-1s-1, 4.1×105 내지 4.3×105 M-1s-1, 4.2×105 내지 4.4×105 M-1s-1, 4.3×105 내지 4.5×105 M-1s-1, 4.4×105 내지 4.6×105 M-1s-1, 4.5×105 내지 4.7×105 M-1s-1, 4.6×105 내지 4.8×105 M-1s-1, 4.7×105 내지 4.9×105 M-1s-1, 4.8×105 내지 5×105 M-1s-1일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 또는 비-PEG화 야생형 또는 변이체 MTAP 폴리펩티드 또는 K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 약 1.9×105 내지 약 2.3×105 M-1s-1일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 또는 비-PEG화 야생형 또는 변이체 MTAP 폴리펩티드 또는 K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 약 1.9×105 M-1s-1일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 또는 비-PEG화 야생형 또는 변이체 MTAP 폴리펩티드 또는 K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 약 2.3×105 M-1s-1일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 또는 비-PEG화 야생형 또는 변이체 MTAP 폴리펩티드 또는 K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 약 1.5×105 내지 약 3×105 M-1s-1일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 또는 비-PEG화 야생형 또는 변이체 MTAP 폴리펩티드 또는 K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 적어도 약 1.5×105 M-1s-1일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 또는 비-PEG화 야생형 또는 변이체 MTAP 폴리펩티드 또는 K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 약 3×105 M-1s-1일 수 있다.
일부 예에서, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 Vmax가 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%일 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드는 Vmax가 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90% 또는 80 내지 100%일 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 Vmax가 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 적어도 50%일 수 있다.
일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 kcat/KM이 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 111%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195% 또는 200%일 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 KM이 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 80 내지 100%, 90 내지 110%, 100 내지 150%, 120 내지 180%, 150 내지 200%, 170 내지 220%, 200 내지 250%, 220 내지 270%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%일 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 KM이 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 2배 이하, 즉 200% 이하일 수 있다.
일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 kcat가 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930%, 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990% 또는 1000%일 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 kcat가 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 80 내지 100%, 90 내지 110%, 100 내지 150%, 120 내지 180%, 150 내지 200%, 170 내지 220%, 200 내지 250%, 220 내지 270%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950% 또는 900 내지 1,000%일 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 kcat가 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 적어도 50%일 수 있다.
일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 kcat/KM이 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%, 510%, 520%, 530%, 540%, 550%, 560%, 570%, 580%, 590%, 600%, 610%, 620%, 630%, 640%, 650%, 660%, 670%, 680%, 690%, 700%, 710%, 720%, 730%, 740%, 750%, 760%, 770%, 780%, 790%, 800%, 810%, 820%, 830%, 840%, 850%, 860%, 870%, 880%, 890%, 900%, 910%, 920%, 930%, 940%, 950%, 960%, 970%, 980%, 990% 또는 1000%일 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 kcat/KM이 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 80 내지 100%, 90 내지 110%, 100 내지 150%, 120 내지 180%, 150 내지 200%, 170 내지 220%, 200 내지 250%, 220 내지 270%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950% 또는 900 내지 1000%일 수 있다. 일부 경우에, K225R 돌연변이 또는 K238R 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드 또는 리신 또는 시스테인 돌연변이를 갖는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성은 kcat/KM이 서열번호 1을 포함하는 PEG화 또는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 적어도 50%일 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 폴리펩티드의 2차 또는 3차 구조를 변경하지 않는다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 활성에 영향을 미치지 않으면서 MTAP 폴리펩티드의 2차 또는 3차 구조를 변경할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 폴리펩티드의 분자 크기, 전하 또는 수용체 결합 능력을 변경할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 세망내피계(RES), 신장, 비장 또는 간에 의한 MTAP 폴리펩티드의 클리어런스를 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 폴리펩티드의 순환 시간을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 효소 또는 단백질에 의한 접근을 방지하는 MTAP 폴리펩티드의 입체 장애, 마스크 또는 차폐를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 입체 장애, 마스크 또는 차폐는 MTAP 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성을 감소시킬 수도 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화를 위한 PEG 분자는 친수성, 가요성 및 생체적합성 스페이서를 포함할 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화를 위한 PEG 분자는 또한 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카복실산 또는 NHS 에스테르를 포함할 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 폴리펩티드의 혈청 반감기를 조절할 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
MTase의 PEG화는, 일부 경우에, 효소의 유체역학적 반경을 증가시켜 혈청 지속성을 증가시킬 수 있다. 특정 측면에서, 개시된 폴리펩티드는 표적 세포 상의 외부 수용체 또는 결합 부위에 특이적이고 안정적으로 결합하는 능력을 갖는 리간드 등의 임의의 표적화제에 접합될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 공개 제2009/0304666호).
일부 실시양태에서, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 폴리펩티드의 유체역학적 반경을 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000% 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 폴리펩티드의 유체역학적 반경을 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 80 내지 100%, 90 내지 110%, 100 내지 150%, 120 내지 180%, 150 내지 200%, 170 내지 220%, 200 내지 250%, 220 내지 270%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950% 또는 900 내지 1,000%의 양까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 49시간, 50시간, 51시간, 52시간, 53시간, 54시간, 55시간, 56시간, 57시간, 58시간, 59시간, 60시간, 61시간, 62시간, 63시간, 64시간, 65시간, 66시간, 67시간, 68시간, 69시간, 70시간, 71시간, 72시간, 84시간, 96시간, 108시간, 120시간, 132시간, 144시간, 156시간, 168시간, 180시간, 190시간 또는 200시간의 혈청 반감기를 가질 수 있다. 다른 경우에, 일부 실시양태에서, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 1 내지 5시간, 2 내지 6시간, 3 내지 7시간, 4 내지 8시간, 5 내지 9시간, 6 내지 10시간, 7 내지 11시간, 8 내지 12시간, 9 내지 13시간, 10 내지 14시간, 11 내지 15시간, 12 내지 16시간, 13 내지 17시간, 14 내지 18시간, 12 내지 24시간, 18 내지 30시간, 24 내지 36시간, 30 내지 42시간, 36 내지 48시간, 42 내지 46시간, 43 내지 47시간, 44 내지 48시간, 45 내지 49시간, 46 내지 50시간, 47 내지 51시간, 48 내지 52시간, 49 내지 53시간, 50 내지 54시간, 51 내지 55시간, 52 내지 56시간, 53 내지 57시간, 54 내지 58시간, 55 내지 59시간, 56 내지 60시간, 57 내지 61시간, 58 내지 62시간, 59 내지 63시간, 60 내지 64시간, 61 내지 65시간, 62 내지 66시간, 63 내지 67시간, 64 내지 68시간, 65 내지 69시간, 66 내지 70시간, 67 내지 71시간, 68 내지 72시간, 66 내지 78시간, 72 내지 84시간, 78 내지 90시간, 84 내지 96시간, 90 내지 102시간, 96 내지 108시간, 102 내지 114시간, 108 내지 120시간, 114 내지 126시간, 120 내지 132시간, 126 내지 138시간, 132 내지 144시간, 138 내지 150시간, 144 내지 156시간, 150 내지 162시간, 156 내지 168시간, 162 내지 174시간, 168 내지 180시간, 174 내지 186시간, 180 내지 192시간, 186 내지 198시간 또는 192 내지 204시간의 혈청 반감기를 가질 수 있다. 다른 경우에, PEG화 폴리펩티드는 적어도 또는 약 57시간의 혈청 반감기를 가질 수 있다. 다른 경우에, PEG화 폴리펩티드는 적어도 또는 약 36시간의 혈청 반감기를 가질 수 있다.
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 900% 또는 1000% 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드보다 10 내지 100%, 50 내지 150%, 100 내지 200%, 150 내지 250%, 200 내지 300%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950% 또는 900 내지 1000% 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있다.
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 900% 또는 1000% 더 긴 세포외 반감기를 가질 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드보다 10 내지 100%, 50 내지 150%, 100 내지 200%, 150 내지 250%, 200 내지 300%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950% 또는 900 내지 1000% 더 긴 세포외 반감기를 가질 수 있다.
일부 경우에, 리신 치환 또는 결실을 포함하는 MTAP 폴리펩티드는 MTAP 폴리펩티드는 MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 감소시키지 않으면서 MTAP가 최대로 PEG화되도록 할 수 있다. 일부 경우에, K225R 치환, K238R 치환, 이의 구조적 등가물, 또는 이들의 조합을 포함하는 MTAP 폴리펩티드는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드와 비교하여 이의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성 수준을 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 감소시키지 않으면서 MTAP가 최대로 PEG화되도록 할 수 있다. 일부 경우에, K225R 치환, K238R 치환, 이들의 구조적 등가물, 또는 이들의 조합을 포함하는 MTAP 폴리펩티드는 MTAP를 최대로 PEG화할 수 있게 하고, MTAP 폴리펩티드가 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드와 비교하여 이의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 감소시키는 것을 방지할 수 있다. 일부 경우에, K225R 치환, K238R 치환, 이들의 구조적 등가물, 또는 이들의 조합을 포함하는 MTAP 폴리펩티드는 비-PEG화 MTAP 폴리펩티드의 활성과 비교하여 이의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 측정하는 것은 MTA 또는 ADO-분해 활성을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTA 또는 ADO 분해 활성은 아데닌 검출 등의 MTA 또는 ADO 분해로부터 발생하는 생성물을 검출하기 위한 임의의 검정에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에, MTA 또는 ADO-분해 활성은 아데닌, 메틸티오리보스-포스페이트, 메틸티오리보스 또는 S-메틸-5-티오-α-D-리보스 1-포스페이트의 검출 등의 MTA 또는 ADO의 분해로부터 발생하는 생성물의 양을 검출하기 위한 임의의 검정에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에, MTA 또는 ADO-분해 활성은 MTA, ADO 또는 S-메틸-5'티오아데노신을 포함하는 MTA 또는 ADO의 분해에서 기질의 양을 검출하기 위한 임의의 검정에 의해 측정될 수 있다. 다른 경우에, MTA 또는 ADO-분해 활성은 메틸티오투베르신 또는 5'-클로로포마이신을 포함하는 억제제에 의해 MTAP 폴리펩티드의 억제 수준을 검출하기 위한 임의의 검정에 의해 측정될 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 변형은 MTAP 폴리펩티드에 대한 원하는 특성을 발생시키거나 또는 포함하도록 생성, 유도 또는 변형할 수 있다. 일부 경우에, 원하는 특성은 MTAP 폴리펩티드의 효소 활성 또는 폴리펩티드 존재량의 증가를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 조절하기 위한 변형을 가질 수 있다. 이러한 조절은 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형은 MTAP 폴리펩티드의 발현 또는 안정성의 증가를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형은 MTAP 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 서열 또는 구조를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 변형은 MTAP 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 변형은 MTAP 폴리펩티드의 아미노산에 영향을 미치지 않으면서 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 중의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 전사물의 5' 또는 3' UTR의 변형을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형은 또한, 예를 들면, 인트론 서열 등의 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 전사물의 임의의 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 변형은 또한, MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전사물의 코딩 영역에서의 변형을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 이러한 아미노산 잔기는 본 명세서에 기재된 또는 이의 활성 부위를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 구조 분석, 상동성 분석 또는 컴퓨터 예측을 기반으로 다른 잔기도 특정할 수 있다. 다른 경우에, 상이한 변형 부위를 갖는 폴리펩티드 집단이 생성될 수 있다. 일부 경우에, MTA 및/또는 ADO-분해 활성이 증가된 돌연변이체 폴리펩티드를 돌연변이체 집단으로부터 선택할 수 있다. 원하는 돌연변이체의 선택은 본 명세서에 기재된 및 이의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 측정 방법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 및 이의 임의의 원하는 특성을 갖는 돌연변이체 폴리펩티드가 선택될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 이종성 펩티드 또는 화학적 변형을 포함할 수 있다. 이종 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 및 이의 임의의 이러한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 및 이의 화학 반응을 포함할 수 있다.
PEG화 MTAP 폴리펩티드는, 일부 경우에, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상의 PEG 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 1 내지 10, 2 내지 11, 3 내지 12, 4 내지 13, 5 내지 14, 6 내지 15, 7 내지 16, 8 내지 17, 9 내지 18, 10 내지 19, 11 내지 20, 12 내지 21, 13 내지 22, 14 내지 23, 15 내지 24, 16 내지 25, 17 내지 26, 18 내지 27, 19 내지 28, 20 내지 29, 21 내지 30, 22 내지 31, 23 내지 32, 24 내지 33, 25 내지 34, 26 내지 35개의 PEG 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드에 접합된 PEG 분자의 수는 가우스 분포를 따를 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 PEG 분자에 접합될 확률이 약 80%일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 0, 6, 7 또는 8개의 PEG 분자에 접합될 확률이 약 20%일 수 있다. 다른 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 0, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상의 PEG 분자에 접합될 확률이 약 20%일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 8개 이상의 PEG 분자에 접합될 확률이 약 1%일 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드에 접합된 PEG 분자의 수 모드는 1 ± 1, 2 ± 1, 3 ± 1, 4 ± 1, 5 ± 1, 6 ± 1, 7 ± 1, 8 ± 1, 9 ± 1, 10 ± 1, 1 ± 2, 2 ± 2, 3 ± 2, 4 ± 2, 5 ± 2, 6 ± 2, 7 ± 2, 8 ± 2, 9 ± 2, 10 ± 2, 1 ± 3, 2 ± 3, 3 ± 3, 4 ± 3, 5 ± 3, 6 ± 3, 7 ± 3, 8 ± 3, 9 ± 3 또는 10 ± 3을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드에 접합된 PEG 분자의 수의 모드는 2 ± 1, 3 ± 1, 4 ± 1 또는 6 ± 1을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드에 접합된 PEG 분자의 수 모드는 8 ± 3을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 평균 분자량이 약 500kDa 내지 약 1000kDa, 약 800kDa 내지 약 1600kDa, 약 1500kDa 내지 약 3000kDa, 약 2000kDa 내지 약 4000kDa, 약 2500kDa 내지 약 5000kDa, 약 3000kDa 내지 약 6000kDa, 약 4,000kDa 내지 약 8,000kDa, 약 6,000kDa 내지 약 12,000kDa, 약 10,000kDa 내지 약 20,000kDa, 또는 약 15,000kDa 내지 약 10,000kDa이다.
일부 경우에, PEG는 서열번호 1의 Lys11, Lys32, Lys40, Lys49, Lys51, Lys71, Lys82, Lys147, Lys158, Lys158, Lys166, Lys206, Lys225, Lys238, Lys241, Lys246, Lys248 또는 Lys271 또는 MTAP 효소 활성을 갖는 상동성 MTAP 폴리펩티드의 상응하는 위치, 또는 이들의 임의의 조합에 접합될 수 있다. 일부 경우에, PEG는 서열번호 1의 Cys55, Cys86, Cys95, Cys131, Cys136, Cys145, Cys211 또는 Cys223 또는 MTAP 효소 활성을 갖는 상동성 MTAP 폴리펩티드의 상응하는 위치, 또는 이들의 임의의 조합에 접합될 수 있다.
일부 경우에서, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 촉매 효율(kcat/KM)이 약 1×103, 2×103, 3×103, 4×103, 5×103, 6×103, 7×103, 8×103, 9×103, 1×104, 2×104, 3×104, 4×104, 5×104, 6×104, 7×104, 8×104, 9×104, 9×104, 1×105, 2×105, 3×105, 4×105, 5×105, 6×105, 7×105, 8×105, 9×105, 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108 또는 9×108 s-1M-1일 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 0.5×103 내지 2×103, 1.5×103 내지 3×103, 2.5×103 내지 4×103, 3.5×103 내지 5×103, 4.5×103 내지 6×103, 5.5×103 내지 7×103, 6.5×103 내지 8×103, 7.5×103 내지 9×103, 8.5×103 내지 1×104, 0.5×104 내지 2×104, 1.5×104 내지 3×104, 2.5×104 내지 4×104, 3.5×104 내지 5×104, 4.5×104 내지 6×104, 5.5×104 내지 7×104, 6.5×104 내지 8×104, 7.5×104 내지 9×104, 8.5×104 내지 1×105, 0.5×105 내지 2×105, 1.5×105 내지 3×105, 2.5×105 내지 4×105, 3.5×105 내지 5×105, 4.5×105 내지 6×105, 5.5×105 내지 7×105, 6.5×105 내지 8×105, 7.5×105 내지 9×105, 8.5×105 내지 1×106, 0.5×106 내지 2×106, 1.5×106 내지 3×106, 2.5×106 내지 4×106, 3.5×106 내지 5×106, 4.5×106 내지 6×106, 5.5×106 내지 7×106, 6.5×106 내지 8×106, 7.5×106 내지 9×106, 8.5×106 내지 1×107, 0.5×107 내지 2×107, 1.5×107 내지 3×107, 2.5×107 내지 4×107, 3.5×107 내지 5×107, 4.5×107 내지 6×107, 5.5×107 내지 7×107, 6.5×107 내지 8×107, 7.5×107 내지 9×107, 8.5×107 내지 1×108, 0.5×108 내지 2×108, 1.5×108 내지 3×108, 2.5×108 내지 4×108, 3.5×108 내지 5×108, 4.5×108 내지 6×108, 5.5×108 내지 7×108, 6.5×108 내지 8×108 또는 7.5×108 내지 9×108 s-1M-1일 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 적어도 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 1×104, 1×105, 1×106 s-1M-1 또는 그 중에서 도출 가능한 임의의 범위일 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 MTA 또는 ADO에 대한 kcat/KM이 적어도 또는 약 1×105 s-1M-1일 수 있다.
일부 실시양태에서, PEG화 MTAP 또는 MTAN은, 종양을 보유하는 대상체에서 투여하면, 종양 미세환경(TME)에 침투하는 T-세포의 수를 투여 부재 또는 투여 전의 TME에 침윤하는 세포 수의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000%, 6000%, 7000%, 8000%, 9000% 또는 20000%까지 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG화 MTAP는, 종양을 보유하는 대상체에서 투여하면, TME에 침윤하는 T-세포의 수를 투여 부재 또는 투여 전의 TME에 침윤하는 세포 수의 10 내지 30%, 20 내지 40%, 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 80 내지 100%, 90 내지 150%, 100 내지 200%, 150 내지 250%, 200 내지 300%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950%, 900 내지 1000%, 950 내지 2000%, 1500 내지 2500%, 2000 내지 3000%, 2500 내지 3500%, 3000 내지 4000%, 3500 내지 4500%, 4000 내지 5000%, 4500 내지 5000%, 5000 내지 6000%, 5500 내지 6500%, 6000 내지 7000%, 6500 내지 7500%, 7000 내지 8000%, 7500 내지 8500%, 8000 내지 9000%, 8500 내지 9500%, 9000 내지 10000% 또는 9500 내지 20000%까지 증가시킬 수 있다.
암과 면역억제에서의 MTAP
일부 경우에, MTAP는 암의 마커이다. 일부 경우에, MTAP의 기능 상실 돌연변이가 암을 유발하거나 촉진할 수 있다. 다른 경우에, MTAP의 호모접합성 유전자 결실이 암을 유발하거나 촉진할 수 있다. 다른 경우에, MTAP의 호모접합성 유전자 결실 또는 기능 상실 돌연변이는 치료 성적의 불량과 관련될 수 있다. 일부 경우에, MTAP의 결실 또는 기능 상실과 관련된 암은 골육종(osteosarcomas), 췌장암(pancreatic cancers), 척색종(chordomas), 중피종(mesothelioma), T 세포 급성 림프모구성 백혈병(T-cell acute lymphoblastic leukemias) 또는 신경교종(gliomas)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 또는 MTAP 활성의 유전적 또는 비유전적 상실 또는 억제는 암 세포 증식을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 또는 MTAP의 활성의 유전적 또는 비유전적 상실 또는 억제는 암 또는 비암 세포에서 종양형성촉진 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 또는 MTAP 활성의 유전적 또는 비유전적 상실 또는 억제는 간세포 암종의 증식을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 또는 MTAP 활성의 유전적 또는 비유전적 상실 또는 억제는 간 성상 세포에서 종양형성촉진 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
일부 경우에, MTAP의 유전적 상실은 MTA의 분비의 증가 및 MTA의 축적을 초래할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 활성의 상실은 MTA 분비의 증가 및 MTA의 축적을 초래할 수 있다. 다른 경우에, MTAP 발현의 억제는 또한 MTA의 분비의 증가 및 MTA의 축적을 초래할 수 있다. 일부 경우에, MTA의 축적은 세포외일 수 있다. 다른 경우에, MTA의 축적은 세포내일 수 있다. 다른 경우에, 암에서 MTAP의 상실 또는 억제는 TME에서 축적 MTA를 유발할 수 있다. 일부 경우에, TME는 비-종양 세포, 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 신호전달 분자 또는 세포외 매트릭스(ECM)를 포함하는 종양 주변의 환경 또는 주변 조직을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 정상 조직보다 MTA가 축적된 암은 MTA가 축적되지 않은 암과 비교하여 침습성 및 악성도가 더 높을 수 있다.
일부 경우에, 염색체 9q21.3의 유전적 결실과 관련된 암의 위험은 MTAP의 결실 또는 기능 상실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 염색체 9q21.3에서 MTAP의 결실과 CDKN2A의 결실은 독립적으로 암 발증에 기여할 수 있다. 일부 경우에, MTAP의 헤테로접합성 유전자 결실은 T 세포 림프종과 관련된다. 일부 경우에, 엑손 스키핑, 선택적 스플라이싱 또는 기능장애 MTAP 폴리펩티드를 유도하는 MTAP 유전자 내의 돌연변이는 CDKN2A 돌연변이와는 독립적으로 암과 연관된다. 일부 경우에, 암은 악성 섬유성 조직구종(DMSMFH)을 수반하는 하수체 수질 협착증을 포함할 수 있다.
일부 경우에, MTA의 축적은 면역 억제를 유발할 수 있다. 일부 경우에, MTAP의 유전적 또는 비유전적 상실 또는 억제에 의해 유발된 면역 억제; MTA의 축적; 또는 이들 둘 다의 조합은 T-세포의 증식 또는 분화의 억제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역억제는 항원-특이적 CD8+ T-세포의 확장의 억제를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 면역억제는 T-세포에서 CD25 또는 CD69의 상향조절된 발현의 억제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역억제는 사전-자극된 세포독성 T 림프구에서 아폽토시스의 유도를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTA의 축적(예: 외인성 MTA의 추가)은 또한 항원 또는 동종이계 세포로 자극된 인간 림프구 배양물의 DNA 합성, 단백질 합성 및 증식을 억제할 수 있다. 일부 경우에, MTA 축적의 효과는 MTA 제거(예: 외인성 MTA 세척)로 역전될 수 있다. 일부 경우에, MTA는 아데노신 수용체 A2a 및 A2b의 작용제로서 작용하여 마크로파지에서 관용원성의 표현형을 생성할 수 있다. 다른 경우에, MTA는 또한 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 3(MMP3)의 유도에 의해 섬유아세포에서 종양을 유발할 수 있다. 일부 경우에, 종양에 의해 배출된 MTA는 종양 세포가 면역계에 의한 감시 및 제거를 회피하는 것을 가능하게 했다. 일부 경우에, MTA가 T 세포의 PRMT5 수용체를 억제하여 면역억제를 유발할 수 있다. 일부 경우에, MTA는 PRMT5를 억제할 수 있다. 일부 경우에, MTA는 시험관 내에서 PRMT5를 억제할 수 있다. 다른 경우에, MTA는 생체내에서 PRMT5를 억제할 수 있다. 일부 경우에, MTA는 약 0.26μM의 억제제 상수로 PRMT5를 억제할 수 있다. 일부 경우에, MTA에 의한 PRMT5의 억제는 T 세포의 증식, 생존율 또는 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 경우에, MTAP 또는 MTAP의 활성의 유전적 또는 비유전적 상실 또는 억제에 의한 세포외 ADO 축적도 면역억제를 유발할 수 있다. 일부 경우에, TME에 ADO가 축적되면, 항-PD/LI 또는 항-CTLA4 항체에 대한 내성이 유발될 수도 있다. 일부 경우에, ADO가 사멸하는 세포에 의해 방출될 수 있다. 일부 경우에, ADO는 아데노신 수용체에 결합할 수 있다. 일부 경우에, ADO는 A1R, A2A3, A2BR 또는 A3R을 포함하는 G-단백질 커플링된 ADO 수용체에 결합할 수 있다. 일부 경우에, ADO는 CD73에 의해 AMP로부터 변환될 수 있다. 다른 경우에, AMP는 CD39에 의해 ADP 또는 ATP로부터 변환될 수 있다.
PEG화 MTAP 폴리펩티드에 의한 암 치료
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 사용하여 암을 치료할 수 있다. 일부 경우에, 암은 MTAP 유전자의 유전적 결실을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 암은 MTAP 유전자의 기능 상실 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암은 MTAP 폴리펩티드의 활성 상실을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 암은 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 유전적 돌연변이의 부재하에 MTAP 폴리펩티드의 활성의 상실 또는 감소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암은 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 유전적 돌연변이의 부재하에 MTAP 폴리펩티드의 활성의 상실 또는 감소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암은 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 상실 또는 감소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 활성의 상실 또는 감소 또는 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 상실은 참조 수준과의 비교에 기초하여 확인될 수 있다.
일부 경우에, 참조 수준의 활성은 정상 또는 건강한 조직 또는 대상체의 활성 수준을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 정상 또는 건강한 대상체는 MTAP 폴리펩티드 또는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 활성을 증가 또는 감소시키는 질환 또는 상태를 포함하지 않을 수 있다. 정상 또는 건강한 대상체는 건강할 수 있다. 다른 경우에, 정상 또는 건강한 대상체는 암을 갖지 않을 수 있다. 일부 경우에, 정상 또는 건강한 대상체는, 집단 내의 평균적 대상체와 비교한 경우, 암 발증 위험이 더 높지 않을 수 있다. 다른 경우에, 대상체에서 참조 수준의 활성은 대상체에서 정상 또는 건강한 조직의 활성 수준을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 대상체에서 참조 수준의 활성은 다른 대상체에서 정상 또는 건강한 조직의 활성 수준을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 조직 내의 참조 수준의 활성은 건강한 상태의 동등한 조직 내의 활성 수준을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 대상체에서 참조 수준의 활성은 또 다른 정상 또는 건강한 대상체에서 정상 또는 건강한 조직의 활성 수준을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 참조 수준은 시험관 내에서 정의될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드 또는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 참조 수준의 활성은 MTAP 폴리펩티드의 야생형 서열, 발현 수준 또는 존재량 수준을 갖는 세포의 MTAP 폴리펩티드 또는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 활성 수준을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 암 또는 암 세포에서 MTAP 발현 또는 활성은 참조 수준과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드 또는 PEG-MTAP에 의한 치료는 종양 미세환경에서 MTA의 세포외 농도를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소시킨다. MTAP 결실을 포함하는 암 또는 암 세포는 방광, 뇌, 유방, 헴, 결장, 폐, 췌장 또는 피부암 세포를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 참조 수준은 건강한 대상체의 수준을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 참조 수준은 건강한 대상체의 조직내 수준을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 참조 수준은 본 명세서에 기재된 및 이의 약제학적 조성물과 함께 투여되는 대상체의 건강한 조직내 수준을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, PEG화 MTAP 폴리펩티드는 낮은 면역원성 위험을 가질 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드는 낮은 면역원성 위험을 가질 수 없다.
일부 경우에, 암은 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것과 같은 악성 세포 유형을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암은 췌장, 결장, 맹장, 위, 담낭, 피부, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기관의 종양을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암은 골수 종양, T 또는 B 세포의 악성종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함하는 혈액학적 종양을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암은 또한 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 백혈병(leukemia), 편평 세포암(squamous cell cancer), 폐암(lung cancer)(소세포 폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 폐 선암종(adenocarcinoma of the lung) 및 폐의 편평 상피암(squamous carcinoma of the lung)을 포함), 복막암(cancer of the peritoneum), 간세포암(hepatocellular cancer), 위암(gastric cancer) 또는 위장암(stomach cancer)(위장관암(gastrointestinal cancer) 및 위장관기질암(gastrointestinal stromal cancer)을 포함), 췌장암(pancreatic cancer), 교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암(salivary gland carcinoma), 신장암 또는 신암(kidney or renal cancer), 신세포암종(renal cell carcinoma), 전립선암(prostate cancer), 외음부암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 각종 두경부암(various types of head and neck cancer), 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma), 흑색종(melanoma), 표재성 전이 흑색종(superficial spreading melanoma), 흑색종 악성 흑색종(lentigo malignant melanoma), 선단 흑자 흑색종(acral lentiginous melanomas), 결절 흑색종(nodular melanomas), 게다가 B 세포 림프종(B-cell lymphoma)(저등급/여포성 비호지킨 림프종(low grade/follicular non-Hodgkin's lymphoma; NHL); 소림프구성(small lymphocytic; SL) NHL; 중급/여포(intermediate grade/follicular) NHL; 중간 등급 확산(intermediate grade diffuse) NHL; 고급 면역모세포(high grade immunoblastic) NHL; 고급 림프모구(high grade lymphoblastic) NHL; 고급 소형 비절단 세포(high grade small non-cleaved cell) NHL; 벌키한 질환(bulky disease) NHL; 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma); AIDS 관련 림프종(AIDS-related lymphoma); 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia)을 포함), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia; CLL), 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia; ALL), 모발상 세포 백혈병(Hairy cell leukemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML) 및 만성 골수아구성 백혈병(chronic myeloblastic leukemia)을 포함한다.
일부 경우에, 암은 신생물(neoplasm), 악성; 암종(carcinoma); 암종(carcinoma), 미분화; 거대 및 방추 세포 암종(giant and spindle cell carcinoma); 소세포 암종(small cell carcinoma); 유두암(papillary carcinoma); 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma); 림프상피암(lymphoepithelial carcinoma); 기저 세포 암(basal cell carcinoma); 모모체 암종(pilomatrix carcinoma); 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma); 유두 이행 세포 암종(papillary transitional cell carcinoma); 선암종(adenocarcinoma); 가스트린종(gastrinoma), 악성; 담관암종(cholangiocarcinoma); 간세포 암(hepatocellular carcinoma); 결합된 간세포 암종(combined hepatocellular carcinoma) 및 담관암종(cholangiocarcinoma); 섬유주 선암종(trabecular adenocarcinoma); 선양 낭성 암종(adenoid cystic carcinoma); 샘종성 폴립의 샘암종(adenocarcinoma in adenomatous polyp); 선암종(adenocarcinoma), 가족성 용종증 대장균(familial polyposis coli); 고형암종(solid carcinoma); 카르시노이드 종양(carcinoid tumor), 악성; 분지-폐포 선암종(branchiolo-alveolar adenocarcinoma); 유두 선암종(papillary adenocarcinoma); 발색단 암종(chromophobe carcinoma); 호산구 암종(acidophil carcinoma); 호산성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기구 암종(basophil carcinoma); 투명 세포 선암종(clear cell adenocarcinoma); 과립 세포 암종(granular cell carcinoma); 여포 선암종(follicular adenocarcinoma); 유두 및 여포 선암종(papillary and follicular adenocarcinoma); 비피막 경화성 암종(nonencapsulating sclerosing carcinoma); 부신 피질 암종(adrenal cortical carcinoma); 자궁내막암종(endometroid carcinoma); 피부 부속기 암종(skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종(sebaceous adenocarcinoma); 귀질 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma); 낭선암종(cystadenocarcinoma); 유두 낭선암종(papillary cystadenocarcinoma); 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점액성 낭선암종(mucinous cystadenocarcinoma); 점액성 선암종(mucinous adenocarcinoma); 인장 고리 세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤성 유관 암종(infiltrating duct carcinoma); 수질암(medullary carcinoma); 소엽 암종(lobular carcinoma); 염증성 암종(inflammatory carcinoma); 파제트병(paget’s disease), 유방; 포상 세포 암종(acinar cell carcinoma); 선편평암종(adenosquamous carcinoma); 편평상피화생을 수반하는 선암종(adenocarcinoma w/squamous metaplasia); 흉선종(thymoma), 악성; 난소 기질 종양(ovarian stromal tumor), 악성; 테코마(thecoma), 악성; 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor), 악성; 남성모세포종(androblastoma), 악성; 세르톨리 세포 암종(sertoli cell carcinoma); 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor), 악성; 지질 세포 종양(lipid cell tumor), 악성; 부신경절종(paraganglioma), 악성; 유방외 부신경절종(extra-mammary paraganglioma), 악성; 갈색 세포종(pheochromocytoma); 사구체육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종(malignant melanoma); 흑자 흑색종(amelanotic melanoma); 표재성 확산 흑색종(superficial spreading melanoma); 거대 색소 모반의 악성 흑색종(malignant melanoma in giant pigmented nevus); 상피세포 흑색종(epithelioid cell melanoma); 청색 모반(blue nevus), 악성; 육종(sarcoma); 섬유육종(fibrosarcoma); 섬유성 조직구종(fibrous histiocytoma), 악성; 점액육종(myxosarcoma); 지방육종(liposarcoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 배아 횡문근육종(embryonal rhabdomyosarcoma); 폐포 횡문근육종(alveolar rhabdomyosarcoma); 기질 육종(stromal sarcoma); 혼합 종양(mixed tumor), 악성; 뮬러 혼합 종양(mullerian mixed tumor); 신모세포종(nephroblastoma); 간모세포종(hepatoblastoma); 암육종(carcinosarcoma); 간엽종(mesenchymoma), 악성; 브레너 종양(brenner tumor), 악성; 엽상 종양(phyllodes tumor), 악성; 활액 육종(synovial sarcoma); 중피종(mesothelioma), 악성; 이상생식세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 기형종(teratoma), 악성; 난소 기질(struma ovarii), 악성; 융모막암종(choriocarcinoma); 중신종(mesonephroma), 악성; 혈관육종(hemangiosarcoma); 혈관내피종(hemangioendothelioma), 악성; 카포시 육종(kaposi's sarcoma); 혈관 주위 세포종(hemangiopericytoma), 악성; 림프관육종(lymphangiosarcoma); 골육종(osteosarcoma); 피질근방 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종(chondrosarcoma); 연골모세포종(chondroblastoma), 악성; 중간엽 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 뼈의 거대 세포 종양(giant cell tumor of bone); 유윙 육종(ewing's sarcoma); 치성 종양(odontogenic tumor), 악성; 변색성 상아육종(ameloblastic odontosarcoma); 흑색모세포종(ameloblastoma), 악성; 변색성 섬유육종(ameloblastic fibrosarcoma); 송과종(pinealoma), 악성; 척색종(chordoma); 신경교종(glioma), 악성; 뇌실막종(ependymoma); 성상세포종(astrocytoma); 원형질 성상세포종(protoplasmic astrocytoma); 원섬유성 성상세포종(fibrillary astrocytoma); 성상모세포종(astroblastoma); 교모세포종(glioblastoma); 희소돌기아교종(oligodendroglioma); 희소돌기모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽(primitive neuroectodermal); 소뇌 육종(cerebellar sarcoma); 신경절신경모세포종(ganglioneuroblastoma); 신경 모세포종(neuroblastoma); 망막모세포종(retinoblastoma); 후각 신경성 종양(olfactory neurogenic tumor); 수막종(meningioma), 악성; 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 신경연종(neurilemmoma), 악성; 과립 세포 종양(granular cell tumor), 악성; 악성 림프종(malignant lymphoma); 호지킨병(hodgkin's disease); 호지킨스(hodgkin's); 부육아종(paragranuloma); 악성 림프종(malignant lymphoma), 소림프구성(small lymphocytic); 악성 림프종(malignant lymphoma), 대세포(large cell), 미만성; 악성 림프종(malignant lymphoma), 여포; 균상 식육종(mycosis fungoides); 기타 특정 비호지킨 림프종(non-hodgkin's lymphomas); 악성 조직구증(malignant histiocytosis); 다발성 골수종(multiple myeloma); 비만 세포 육종(mast cell sarcoma); 면역증식성 소장 질환(immunoproliferative small intestinal disease); 백혈병(leukemia); 림프성 백혈병(lymphoid leukemia); 형질 세포 백혈병(plasma cell leukemia); 적혈구백혈병(erythroleukemia); 림프육종 세포 백혈병(lymphosarcoma cell leukemia); 골수성 백혈병(myeloid leukemia); 호염기성 백혈병(basophilic leukemia); 호산구성 백혈병(eosinophilic leukemia); 단핵구 백혈병(monocytic leukemia); 비만 세포 백혈병(mast cell leukemia); 거핵모구성 백혈병(megakaryoblastic leukemia); 골수 육종(myeloid sarcoma); 및 모세포 백혈병(hairy cell leukemia)을 포함할 수 있다.
핵산
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 DNA, RNA, LNA, PNA, 또는 MTAP 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 본 명세서 및 이의 임의의 유도체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열번호 2를 포함하는 핵산은 서열번호 1을 포함하는 MTAP 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 서열번호 4를 포함하는 핵산은 서열번호 3을 포함하는 MTAP 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 서열번호 6을 포함하는 핵산은 서열번호 5를 포함하는 MTAP 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 또한 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용되는 생물을 기반으로 코돈 최적화될 수 있다.
MTAP 폴리펩티드의 PEG화
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 PEG의 반응성 유도체와 MTAP 폴리펩티드의 인큐베이션에 의해 달성될 수 있다. 일부 경우에, PEG화는 공유 결합일 수 있다. 다른 경우에, PEG화는 비공유 결합일 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화는 MTAP 폴리펩티드가 PEG에 접합되는 것을 의미할 수 있다. 다른 경우에, PEG화는 PEG 분자를 천연 또는 재조합 MTAP 폴리펩티드, 본 명세서 및 이의 단편, 또는 본 명세서 및 이의 일부에 연결하는 것을 포함할 수 있다.
일부 경우에, PEG 분자는 리신, 세린, 히스티딘, 티로신, 시스테인, N-말단 아민, 페닐알라닌, C-말단 시스테인, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, N-말단, C-말단, 또는 MTAP 폴리펩티드의 본 명세서 및 이의 임의의 조합에서 MTAP 폴리펩티드에서 부착, 접합 또는 연결될 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 MTAP 폴리펩티드의 리신 또는 시스테인에서 MTAP 폴리펩티드에 부착, 접합 또는 연결될 수 있다. 일부 경우에, C-말단 카복실산은 또한 MTAP 폴리펩티드의 PEG화에 사용될 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 MTAP 폴리펩티드의 리신 및 시스테인에서 MTAP 폴리펩티드에 부착, 접합 또는 연결될 수 있다.
일부 경우에, PEG 분자는 동일한 반응성 모이어티로 각 말단에서 활성화될 수 있고, 즉 PEG 분자는 "호모이관능성"이다. 다른 경우에, PEG 분자는 각각의 말단에서 상이한 반응성 모이어티에서 활성화될 수 있고, 즉 PEG 분자는 "헤테로이관능성" 또는 "헤테로관능성"이다. 일부 경우에, PEG 분자의 화학적 활성 또는 활성화된 유도체를 제조하여 PEG 분자를 MTAP 폴리펩티드에 부착시킬 수 있다.
일부 경우에, PEG 분자는 숙신이미딜 에스테르, 알데히드, 말레이미드, p-니트로페닐 카보네이트 에스테르, 본 명세서 및 이의 임의의 유도체, 또는 본 명세서 및 이의 임의의 조합에서 MTAP 폴리펩티드에 부착, 접합 또는 연결될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화를 위한 PEG 분자의 생성은 무수물, 산 염화물, 클로로포르메이트 또는 카보네이트를 포함하는 하이드록실 그룹과 반응하는 그룹과 PEG 분자를 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드의 PEG화를 위한 PEG 분자의 생성은 알데히드, 에스테르 또는 아미드를 포함하는 관능기와 반응하는 그룹과 PEG 분자를 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 메톡시 PEG 분자는 MTAP 폴리펩티드의 PEG화에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 폴리에틸렌 글리콜(PEG 디올)을 또한 MTAP 폴리펩티드의 PEG화에 사용할 수 있다. 일부 경우에, 디올 그룹은 헤테로- 또는 호모이량체의 PEG화 MTAP 폴리펩티드를 작성하기 위해 양쪽 말단에서 변형될 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 친핵성 부위에서 PEG화될 수 있다. 다른 경우에, 친핵성 부위는 양성자화되지 않은 티올 그룹 또는 아미노 또는 아민 그룹을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 리신의 측쇄 또는 단백질의 N-말단 상의 아미노 또는 아민 그룹은 MTAP 폴리펩티드의 PEG화에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 단백질은 리신의 측쇄 또는 단백질의 N-말단에 있는 아민 또는 아미노 그룹의 알킬화에 의해 PEG 분자에 접합될 수 있다. 일부 경우에, PEG-알데히드, NHS-PEG, PEG 트레실레이트, PEG 이소티오시아네이트 또는 숙신이미드 PEG 분자를 사용하여 MTAP 폴리펩티드 상의 리신 측쇄에 있는 아미노 그룹을 접합할 수 있다. 다른 경우에, 숙신이미딜 카보네이트(PEG-SC), 벤조트리아졸 카보네이트(PEG-BTC), 페닐 카보네이트, 카보닐이미다졸 또는 티아졸리딘-2-티온을 MTAP 폴리펩티드의 PEG화에 사용할 수도 있다. 일부 경우에, 염화시아누르 활성화된 PEG 분자는 MTAP 폴리펩티드의 리신의 1급 아민 그룹과 반응하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, PEG 알데히드 유도체(예를 들면, 메톡시 PEG 프로피온알데히드 또는 mPEG-프로피온알데히드)를 사용하여, 나트륨 시아노보로하이드라이드를 사용한 환원적 알킬화에 의해 MTAP 폴리펩티드의 리신의 아미노 그룹과의 안정한 2급 아민 결합을 형성할 수 있다. 일부 경우에, pH가 낮은 반응을 사용하여, PEG화를 아미노 그룹의 특정 그룹에 대해 지시할 수 있다. 이러한 아미노 그룹의 특정 그룹은 낮은 pKa를 갖는 아미노 그룹을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 양성자화되지 않은 티올 그룹은 시스테인의 측쇄를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG 말레이미드, PEG 요오도아세테이트, PEG 티올 또는 PEG 비닐설폰을 사용하여 시스테인에서 MTAP 폴리펩티드를 PEG화할 수 있다. 일부 경우에, 천연 시스테인을 PEG화에 사용할 수 있다. 다른 경우에, 시스테인 잔기는 PEG화를 위해 MTAP 폴리펩티드 내로 조작될 수 있다. 이러한 조작은 시스테인을 MTAP 폴리펩티드에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 시스테인은 MTAP 폴리펩티드의 임의의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 일부 경우에, 시스테인 기반 PEG화는 PEG에 부착된 말레이미드 그룹을 유리 시스테인과 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유리 시스테인은 디설파이드 결합에 관여하지 않을 수 있다.
일부 경우에, PEG는 MTAP 폴리펩티드의 디설파이드 결합에서 MTAP 폴리펩티드에 접합시킬 수 있다. 일부 경우에, 디설파이드 결합 기반 PEG화는 온화한 조건하에 디설파이드를 환원시키고, 디설파이드에 관여하는 시스테인을 비스(티올) 특이적 시약으로 표지하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 디티오말레이미드를 사용하여 디설파이드 결합 기반 PEG화를 생성할 수 있다.
일부 경우에, PEG는 티로신 잔기에서 MTAP 폴리펩티드에 접합시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 티로신을 4-페닐-3H-1,2,4-트리아졸린-3,5(4H)-디온(PTAD)과 반응시켜 MTAP와 PEG 사이에 공유 결합을 생성할 수 있다. 일부 경우에, PEG-PTAD 접합체를 먼저 생성하고, MTAP 폴리펩티드의 티로신과 반응시킬 수 있다.
일부 경우에, PEG화는 MTAP 폴리펩티드의 직접 화학적 합성에 의해 제조될 수 있고, 여기서 MTAP 폴리펩티드는 고체상 펩티드 합성(SPPS)에 부착되고, PEG는 커플링 단계 중 하나에 도입되거나, MTAP 폴리펩티드의 천연 화학적 특징의 직접 화학적 부착에 의해 도입된다. 일부 경우에, 천연 화학적 특징은 본 명세서에 기재된 및 이의 PEG화 접합 부위에 존재하는 화학적 특징을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 천연 화학적 특징은 또한 알킬화-함유 잔기를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 아지드-PEG 접합체를 후이스겐(Huisgen) 1,3-쌍극자 환화부가 반응으로 알킬화-함유 잔기에 부착시킬 수 있다. 다른 경우에, PEG는 Fmoc-아스파라긴을 사용하여 MTAP 폴리펩티드에 접합시킬 수 있고, 여기서 Fmoc-아스파라긴은 SPPS 동안 MTAP 폴리펩티드에 도입된다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 아민 기반 PEG화의 경우, PEG화 반응에서 최적화되는 파라미터는 폴리펩티드 농도, 몰 기준의 PEG-대-폴리펩티드 비, 온도 또는 pH, 반응 시간을 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드의 티올 기반 PEG화의 경우, PEG화 반응에서 최적화되는 파라미터는 폴리펩티드 농도, 몰 기준의 PEG-대-폴리펩티드 비율, 온도, pH, 반응 시간 또는 산소의 배제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG화 반응은 MTAP 폴리펩티드의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. PEG화 반응을 개시하기 전에, PEG 분자의 반응성을 알아야 한다. 일부 경우에, 예를 들면, PEG 분자가 MTAP 폴리펩티드의 PEG화 반응에서 70%만 활성인 경우, 사용되는 PEG 분자의 양은 활성 PEG 분자만 MTAP-PEG 반응 화학양론에서 계산될 수 있도록 보장해야 한다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)
일부 경우에, PEG 분자는 중합체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 옥사이드의 단독중합체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 또는 폴리옥시에틸렌(POE)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 화학식 I을 포함할 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서, n은 단위의 수이다. 일부 경우에, PEG 분자는 44.05n + 18.02g/mol의 분자량을 가질 수 있고, 여기서 n은 화학식 I에서와 같은 단위의 수이다. 일부 경우에, PEG 분자 종의 분자량을 사용하여, 화학식 I 또는 본 명세서 및 이의 유도체 등의 단위의 수를 계산할 수 있고, 그 반대의 경우도 동일하다. 일부 경우에, PEG 분자는 또한 화학식 H-(O-CH2-CH2)n-OH 또는 C2nH4n+2On +1을 가질 수 있고, 여기서 n은 단위의 수이다.
일부 경우에, PEG 분자는 PEG-N으로 표시될 수 있고, 여기서 N은 화학식 I의 n 등의 단위의 수를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 또한 화학식 H-(O-CH2-CH2)n-OH 또는 C2nH4n + 2On +1을 가질 수 있고, 여기서 n은 단위의 수이다. 일부 경우에, 단위의 수가 상이한 PEG 분자는 상이한 특성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 저분자량의 PEG 분자는 점성 또는 무색 액체일 수 있다. 다른 경우에, 고분자량의 PEG 분자가 높은 융점으로 결정화될 수 있다. 높은 융점은 70℃보다 높을 수 있다.
일부 경우에, PEG 분자는 평균 분자량이 약 100kDa, 150kDa, 200kDa, 250kDa, 300kDa, 350kDa, 400kDa, 450kDa, 500kDa, 550kDa, 600kDa, 650kDa, 700kDa, 750kDa, 800kDa, 850kDa, 900kDa, 950kDa, 1000kDa, 1050kDa, 1100kDa, 1150kDa, 1150kDa, 1200kDa, 1250kDa, 1250kDa, 1310kDa, 1550kDa, 1600kDa, 1650kDa, 1700kDa, 1750kDa, 1800kDa, 1850kDa, 1900kDa, 1950kDa, 2000kDa, 2050kDa, 2100kDa, 2150kDa, 2200kDa, 2250kDa, 2300kDa, 2350kDa, 2400kDa, 2450kDa, 2500kDa, 2550kDa, 2600kDa, 2650kDa, 2700kDa, 2750kDa, 2800kDa, 2850kDa, 2900kDa, 2950kDa, 3000kDa, 3050kDa, 3100kDa, 3150kDa, 3200kDa, 3250kDa, 3300kDa, 3350kDa, 3400kDa, 3450kDa, 3500kDa, 4000kDa, 5000kDa, 6000kDa, 7000kDa, 8000kDa, 9000kDa, 10000kDa, 11000kDa, 12000kDa, 13000kDa, 14000kDa, 15000kDa, 16000kDa, 17000kDa, 18000kDa, 19000kDa, 20000kDa, 21000kDa, 22000kDa, 23000kDa, 24000kDa, 25000kDa, 26000kDa, 27000kDa, 28000kDa, 29000kDa, 30000kDa, 31000kDa, 32000kDa, 33000kDa, 34000kDa, 35000kDa 또는 35000kDa 이상일 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 평균 분자량이 약 100 내지 약 1000kDa, 약 500 내지 약 1500kDa, 약 1000 내지 약 2000kDa, 약 1500 내지 약 2500kDa, 약 2000 내지 3000kDa, 약 2500 내지 약 3500kDa, 약 3000 내지 약 4000kDa, 약 3500 내지 약 4500kDa, 약 4000 내지 약 5000kDa, 약 4500 내지 약 5500kDa, 약 5000 내지 약 6000kDa, 약 5500 내지 약 6500kDa, 약 6000 내지 약 7000kDa, 약 6500 내지 약 7500kDa, 약 7000 내지 약 8000kDa, 약 7500 내지 약 8500kDa, 약 8000 내지 약 9000kDa, 약 8500 내지 약 9500kDa, 약 9000 내지 약 10000kDa, 약 9500 내지 약 10500kDa, 약 10000 내지 약 11000kDa, 약 10500 내지 약 11500kDa, 약 11000 내지 약 12000kDa, 약 11500 내지 약 12500kDa, 약 12000 내지 약 13000kDa, 약 12500 내지 약 13500kDa, 약 13000 내지 약 14000kDa, 약 13500 내지 약 14500kDa, 약 14000 내지 약 15000kDa, 약 14500 내지 약 15500kDa, 약 15000 내지 약 16000kDa, 약 15500 내지 약 16500kDa, 약 16000 내지 약 17000kDa, 약 16500 내지 약 17500kDa, 약 17000 내지 약 18000kDa, 약 17500 내지 약 18500kDa, 약 18000 내지 약 19000kDa, 약 18500 내지 약 19500kDa, 약 19000 내지 약 20000kDa, 약 19500 내지 약 20500kDa, 약 20000 내지 약 21000kDa, 약 20500 내지 약 21500kDa, 약 21000 내지 약 22000kDa, 약 21500 내지 약 22500kDa, 약 22000 내지 약 23000kDa, 약 22500 내지 약 23500kDa, 약 23000 내지 약 24000kDa, 약 23500 내지 약 24500kDa, 약 24000 내지 약 25000kDa, 약 24500 내지 약 25500kDa, 약 25000 내지 약 26000kDa, 약 25500 내지 약 26500kDa, 약 26000 내지 약 27000kDa, 약 26500 내지 약 27500kDa, 약 27000 내지 약 28000kDa, 약 27500 내지 약 28500kDa, 약 28000 내지 약 29000kDa, 약 28500 내지 약 29500kDa, 약 29000 내지 약 30000kDa, 약 29500 내지 약 30500kDa, 약 30000 내지 약 31000kDa, 약 30500 내지 약 31500kDa, 약 31000 내지 약 32000kDa, 약 31500 내지 약 32500kDa, 약 32000 내지 약 33000kDa, 약 32500 내지 약 33500kDa, 약 33000 내지 약 34000kDa, 약 33500 내지 약 34500kDa 또는 약 34000 내지 약 35000kDa일 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 평균 분자량이 약 5000kDa일 수 있다. 다른 경우에, PEG 분자는 평균 분자량이 약 500kDa 내지 약 1000kDa, 약 800kDa 내지약 1600kDa, 약 1500kDa 내지 약 3000kDa, 약 2000kDa 내지 약 4000kDa, 약 2500kDa 내지 약 5000kDa, 약 3000kDa 내지 약 6000kDa, 약 4,000kDa 내지 약 8,000kDa, 약 6,000kDa 내지 약 12,000kDa, 약 10,000kDa 내지 약 20,000kDa 또는 약 15,000kDa 내지 약 30,000kDa일 수 있다.
일부 경우에, PEG 분자는 -40℃ 내지 -70℃의 유리 전이 온도(Tg)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자를 극성 또는 비극성 용매에 용해시킬 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자를 친수성 용매에 용해시킬 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 유기 용매에 용해시킬 수 있다. 이러한 유기 용매 중 하나는 알코올, 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 톨루엔, 아세토니트릴, 벤젠, 디클로로메탄, 클로로포름, 본 명세서 및 이의 유도체, 또는 본 명세서 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다른 경우에, PEG 분자는 또한 양친매성일 수 있다.
일부 경우에, PEG 분자는 분지형, 성상형, 선형, 빗형 구조; 본 명세서 및 이의 유도체; 또는 본 명세서 및 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 말단 하이드록실 그룹을 포함할 수 있다. 다른 경우에, PEG 분자는 말단 하이드록실 그룹을 대칭 또는 비대칭 관능기로 전환할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자 또는 PEG 분자를 포함하는 임의의 제품은 생물학적 불활성일 수 있다. 생물학적 불활성은 생물학적 반응에 대한 내성을 포함할 수 있다. 이러한 생물학적 반응 중 하나는 PEG 분자 또는 PEG를 포함하는 임의의 제조물의 분해를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 생물학적 불활성은 최소한의 고유 생물학적 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 낮은 면역원성을 가질 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 면역원성을 갖지 않을 수 있다. 실체의 면역원성은 실체가 면역계에 제시 또는 투여되거나, 또는 면역계에 의해 검출될 때에, 실체에 대한 면역 반응을 유발 또는 활성화하는 실체의 능력을 포함할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는, 면역계에 투여 또는 제시된 경우, PEG 분자에 대한 면역 반응을 유도하지 않을 수 있다. 다른 경우에, PEG 분자는 독성이 없을 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 높은 삼투압을 생성할 수 있다. 일부 경우에, PEG 분자는 하이드로겔에 가교될 수 있다. 다른 경우에, PEG 분자는 전하를 띠지 않을 수 있다.
일부 경우에, PEO 또는 POE는 분자량이 약 1×105 g/mol, 2×105 g/mol, 3×105 g/mol, 4×105 g/mol, 5×105 g/mol, 6×105 g/mol, 7×105 g/mol, 8×105 g/mol, 9×105 g/mol, 1×106 g/mol, 2×106 g/mol, 3×106 g/mol, 4×106 g/mol, 5×106 g/mol, 6×106 g/mol, 7×106 g/mol, 8×106 g/mol, 9×106 g/mol, 1×107 g/mol 또는 그 이상일 수 있다.
융합 단백질
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 이종 개체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이종 객체는 이종 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드와 이종 펩티드를 융합 단백질로서 연결할 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드 및 이종 펩티드를 포함하는 융합 단백질은 동일한 번역 단위로 구성될 수 있고, 여기서 MTAP 폴리펩티드 및 이종 펩티드는 동일한 ATG 개시 코돈을 공유할 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드 및 이종 펩티드는 공유 결합에 의해 연결시킬 수 있다. 이러한 공유 결합은 펩티드 결합을 포함할 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드 및 이종 펩티드는 비공유 결합을 가질 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드와 이종 펩티드는 동일한 번역 단위로 구성되지 않을 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 항체, 성장 인자, 호르몬, 펩티드, 앱타머, 화학물질, 약물, 핵산, 사이토카인, 본 명세서 및 이의 임의의 유도체, 본 명세서 및 이의 임의의 생물학적 등가물, 또는 본 명세서 및 이의 임의의 조합을 포함하는 세포-표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들면, 실시양태에 따른 세포 표적화 모이어티는 흑색종 세포 등의 피부암 세포에 결합할 수 있다. gp240 항원은 다양한 흑색종에서 발현되지만, 정상 조직에서는 발현되지 않는다는 것이 입증되었다. 따라서, 실시양태의 특정 측면에서, MTAP 폴리펩티드 및 gp240에 결합하는 세포-표적화 모이어티를 포함하는 세포 표적화 작제물이 제공된다. 일부 경우에, gp240 결합 분자는 ZME-018(225.28S) 항체 또는 9.2.27 항체 등의 항체일 수 있다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, gp240 결합 분자는 scFvMEL 항체 등의 일본쇄 항체일 수 있다. 따라서, 본 발명의 매우 특정한 실시양태에서, scFvMEL에 접합된 MTase를 포함하는 세포 표적화 작제물이 제공된다.
일부 경우에, 세포 표적화 모이어티를 포함하는 MTAP 폴리펩티드는 유방암 세포에 대해 지시될 수 있다. 일부 경우에, 세포 표적화 모이어티는 Her-2/neu에 결합할 수 있다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드는 항-Her-2/neu 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 융합 단백질은 MTAP 폴리펩티드 및 일본쇄 항-Her-2/neu 항체 scFv23을 포함하는 표적화 모이어티를 포함한다. 다른 경우에, MTAP 폴리펩티드 및 Her-2/neu에 결합하는 scFv(FRP5)를 포함하는 표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질은 또한 현재의 실시양태의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다[참조: von Minckwitz et al., 2005].
일부 경우에, 세포 표적화 모이어티는 복수 유형의 암 세포에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 유방암, 육종 및 신경모세포종[참조: Onda et al., 2004]에서 발현되는 당단백질에 결합하는 8H9 모노클로날 항체 및 이로부터 유도된 일본쇄 항체는 표적화 모이어티로 사용될 수 있다. 다른 경우에, 세포 표적화 모이어티는 미국 특허 출원번호 제2004/005647호 및 문헌[참조: Winthrop et al., 2003]에 기재된 세포 표적화제를 포함할 수 있고, 이는 MUC-1, 다양한 암 유형에서 발현되는 항원에 결합한다. 일부 경우에, 특정 실시양태에서, 실시양태에 따른 세포 표적화 작제물은 복수의 암 또는 종양 유형에 대해 표적화시킬 수 있는 것으로 이해된다.
특정 세포 표면 분자는 인간 융모막 고나도트로핀 수용체 및 고나도트로핀 방출 호르몬 수용체 등의 호르몬 수용체를 포함하는 종양 세포에서 고도로 발현된다[참조: Nechushtan et al., 1997]. 일부 경우에, 암 세포에 의해 발현되는 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 펩티드는 암 요법에서 암을 특이적으로 표적화하는 세포 표적화 모이어티로서 사용될 수 있다.
일부 경우에, 면역 체크포인트 차단 억제제는 세포 표적화 모이어티로 사용될 수 있다. 일부 경우에, 면역 체크포인트 차단 억제제를 사용하여 MTAP 폴리펩티드와의 융합 단백질을 형성할 수 있다. 다른 경우에, PD-1, PDL-1 또는 PDL-2에 길항하는 항체 또는 이의 단편(예: scFv)(예: 미국 특허 제8,735,553호, 제8,354,509호 및 제8,008,449호; PCT 출원번호 WO2009/101611 및 WO2009/114335에 기재된 항체)는 MTAP 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 또 다른 예에서, CTLA-4를 인식하는 항체 또는 이의 단편(예: scFc)(예: 미국 특허 제8,119,129호 및 PCT 출원번호 WO 01/14424, WO 98/42752 및 WO 00/37504)은 MTAP 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 및 이의 임의의 체크포인트 차단 분자는 세포 표적화 모이어티로서 사용될 수 있다.
링커
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 이관능성 가교 시약에 의해 이종 개체에 화학적으로 접합시킬 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 이종 개체에 화학적으로 접합시킬 수 있다.
일부 경우에, 적합한 펩티드 링커는 Gly-Ser 링커를 포함한다.
이관능성 가교 시약은 친화성 매트릭스의 제조, 다양한 구조의 변형 및 안정화, 리간드 및 수용체 결합 부위의 동정, 및 구조적 연구를 포함하는 다양한 목적을 위해 광범위하게 사용되고 있고, 당해 기술분야에 공지되어 있다.
일부 경우에, 이관능성 가교 시약은 호모이관능성 시약을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 2개의 동일한 관능기를 갖는 호모이관능성 시약은 동일하거나 상이한 거대분자 또는 거대분자의 서브유닛 사이의 가교 및 이들의 특이적 결합 부위에 대한 폴리펩티드 리간드의 연결을 유도하는 데 매우 효율적일 수 있다. 일부 경우에, 이관능성 가교 시약은 2개의 상이한 관능기를 함유하는 헤테로이관능성 시약을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 헤테로이관능성 시약은 2개의 상이한 관능기의 상이한 반응성으로 선택적이고 순차적으로 가교결합을 제어할 수 있다. 일부 경우에, 이관능성 가교 시약은 이들의 관능기, 예를 들면, 아미노-, 설프하이드릴-, 구아니딘-, 인돌-, 카복실-특이적 그룹의 특이성에 따라 분류할 수 있다. 일부 경우에, 유리 아미노에 대한 가교 시약은 이들의 상업적 이용 가능성, 합성 용이성 및 이들이 적용될 수 있는 온화한 반응 조건을 기반으로 사용할 수 있다.
일부 경우에, 헤테로이관능성 가교 시약은 1급 아민-반응성 그룹 및 티올-반응성 그룹을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 헤테로이관능성 가교 시약 및 가교 시약을 사용하는 방법이 기재되어 있다(미국 특허 제5,889,155호, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 구체적으로 도입됨). 가교 시약은 친핵성 하이드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 결합하여, 일례로서, 유리 티올에 대한 알데히드의 커플링을 가능하게 가교 시약은 다양한 관능기를 가교하도록 변형될 수 있다.
추가로, 항체-항원 상호작용, 아비딘 비오틴 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 티오에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 포스포에스테르 결합, 포스포아미드 결합, 무수물 결합, 디설파이드 결합, 이온성 및 소수성 상호작용, 이중특이성 항체 및 항체 단편, 또는 이들의 조합을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 다른 연결/커플링제 및/또는 메커니즘을 사용하여 MTAP 폴리펩티드를 조합할 수 있다.
일부 경우에, 혈액 중의 적당한 안정성을 갖는 가교제를 사용할 수 있다. 표적화제 및 치료제/예방제를 접합하기 위해 성공적으로 사용될 수 있는 다수 유형의 디설파이드 결합 함유 링커가 공지되어 있다. 일부 경우에, 입체 장애가 있는 디설파이드 결합을 포함하는 링커는 생체내에서 링커에 접합되는 분자의 더 큰 안정성을 제공할 수 있다. 따라서, 이러한 링커는 연결제의 하나의 그룹이다.
일부 경우에, 이에 따라, 비장애 링커를 사용할 수도 있다. 보호된 디설파이드를 함유 또는 생성하는 것으로 간주되지 않는 기타 유용한 가교제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다[참조: Wawrzynczak and Thorpe, 1987]. 이러한 가교제의 사용은 당해 기술분야에 잘 이해되어 있다. 일부 경우에, 유연한 링커를 사용할 수 있다.
일부 경우에, 화학적으로 접합되면, 펩티드를 정제하여 비접합된 약제 및 기타 오염 물질로부터 접합체를 분리할 수 있다. 일부 경우에, 이들을 임상적으로 유용하도록 하기에 충분한 정도의 순도의 접합체를 제공할 때에 사용하기 위해 다수의 정제 기술이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 정제 방법은 겔 여과, 겔 투과 또는 고속 액체 크로마토그래피 등의 크기 분리를 기반으로 하는 방법을 포함할 수 있고, 일반적으로 가장 많이 사용된다. 블루-세파로스 분리 등의 기타 크로마토그래피 기술도 사용할 수 있다. 봉입체로부터 융합 단백질을 정제하는 종래의 방법은 나트륨 N-라우로일-사르코신(SLS) 등의 약한 세정제를 사용하는 것 등이 유용할 수 있다.
벡터
본 명세서에 제공된 핵산은 임의의 적합한 수단에 의해 전달될 수 있다. 일부 경우에, 적절한 수단은 벡터를 포함한다. 이하를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 임의의 벡터 시스템을 사용할 수 있다: 플라스미드 벡터, 미니서클 벡터, 선형 DNA 벡터, 강아지 골 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터, 리포솜, 나노입자, 엑소솜, 세포외 소포, 나노메쉬, 이들의 변형된 버전, 이들의 양호한 제조 기준 버전, 이들의 키메라, 및 이들의 임의의 조합. 일부 경우에, 벡터를 사용하여 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 제공된 RNA의 영역에 하이브리드화하는 표적화 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 중합체 기반 나노입자, 아미노 지질 기반 나노입자, 금속 나노입자(예: 금 기반 나노입자 등), 이들 중 임의의 것의 일부, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 바이러스 벡터가 아닐 수 있다. 비-바이러스 방법은 폴리뉴클레오티드 등을 포함하는 조성물의 네이키드 전달을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에서 제공된 변형을 폴리뉴클레오티드에 도입하여, 네이키드 폴리뉴클레오티드로서 전달되는 경우의 안정성을 증가시키고 분해를 방지할 수 있다. 다른 경우에, 비-바이러스 접근법은 나노입자, 리포솜 등의 사용을 이용할 수 있다.
숙주 세포
일부 경우에, 숙주 세포는 MTAP 폴리펩티드 및 이의 접합체의 발현 및 분비를 가능하게 하도록 형질전환될 수 있는 임의의 것일 수 있다. 일부 경우에, 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 효모 또는 사상균을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세균은 에스케리키아(Escherichia) 및 바실러스(Bacillus)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 세균은 이. 콜라이(E.coli) 또는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 키우이베로마이세스(Kiuyveromyces) 속, 한세눌라(Hansenula) 속 또는 피키아(Pichia) 속에 속하는 효모를 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 일부 경우에, 사상균은 아스퍼길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 아클리아(Achlya), 포도스포라(Podospora), 엔도티아(Endothia), 무코르(Mucor), 코클리오볼루스(Cochliobolus) 또는 피리쿨라리아(Pyricularia)를 포함하는 발현 숙주로서 사용될 수 있다.
일부 경우에, 숙주 세포의 세균 균주 또는 효모 균주는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) MC1061, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BRB1의 유도체[참조: Sibakov et al., 1984], 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) SAI123[참조: Iordanescu, 1975] 또는 스트렙토콕쿠스 리비단스(Streptococcus lividans)[참조: Hopwood et al.], 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) AH 22[참조: Mellor et al., 1983], 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아스퍼길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼길루스 아와모리(Aspergillus awamori)[참조: Ward, 1989] 또는 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)[참조: Penttila et al., 1987; Harkki et al., 1989]를 포함할 수 있다.
일부 경우에, ab MTAP 폴리펩티드는 포유동물 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 일부 경우에, 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL61), 랫트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 랫트 간세포종 세포(H-4-II-E; ATCCCRL 1548), SV40-형질전환된 원숭이 신장 세포(COS-1; ATCC CRL 1650), 및 뮤린 배아 세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함할 수 있다.
일부 경우에, MTAP 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 숙주 세포는 모 세포주를 배양하기 위해 통상 사용되는 조건하에 배양될 수 있다. 일부 경우에, MTAP 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 숙주 세포는, 통상 태아 소 혈청 등의 5% 내지 10% 혈청이 보충된, 표준 RPMI, MEM, IMEM 또는 DMEM 등의 생리학적 염 및 영양소를 함유하는 표준 배지에서 배양될 수 있다. 다른 경우에, 배양 조건은 단백질의 원하는 수준이 달성될 때까지, 정지 또는 롤러 배양에서 37℃에서 배양된 배양물을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 곤충 숙주 세포는 MTAP 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용할 수 있다. 일부 경우에, 곤충 숙주 세포는 Sf9, Sf21, 하이 파이브(High Five) 또는 S2 세포를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 곤충 발현 숙주 세포는 바큘로바이러스 발현 시스템을 포함할 수 있다.
투여
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 대상체에게 전달 또는 투여하기 위한 조성물 또는 제형으로 할 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물의 투여는 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물을 원하는 생물학적 작용 부위에 전달하는 것을 가능하게 하기 위해 사용될 수 있는 방법을 지칭한다. 전달에는 영향을 받는 조직 또는 신체 영역에 직접 적용하는 것이 포함될 수 있다. 전달에는 두개내 주사가 포함될 수 있다. 전달에는 실질 주사, 경막내 주사, 심실내 주사, 또는 수조내 주사가 포함될 수 있다. PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 방법은 흡입에 의해, 동맥내 주사, 뇌실내 주사, 수조내 주사, 근육내 주사, 안와내 주사, 실질내 주사, 복강내 주사, 척수내 주사, 척수강내 주사, 정맥내 주사, 뇌실내 주사, 정위 주사, 피하 주사, 또는 이의 임의의 조합에 의한 것일 수 있다. 전달에는 비경구 투여(정맥내, 피하, 척추강내, 복강내, 근육내, 혈관내 또는 점진적 주입을 포함), 경구 투여, 흡입 투여, 십이지장내 투여, 직장 투여가 포함될 수 있다. 전달에는 피부 등의 표면의 외부 표면에 대한 국소 투여(예: 로션, 크림, 연고 등)가 포함될 수 있다. 일부 경우에, 투여는 실질 주사, 경막내 주사, 뇌실내 주사, 수조내 주사, 정맥내 주사 또는 비강내 투여 또는 이들의 임의의 조합에 의한 것이다. 일부 경우에, 대상체는 감독 없이 조성물을 투여할 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 의료 전문가(예: 의사, 간호사, 의사의 조수, 질서 있는, 호스피스 노동자 등)의 감독하에 조성물을 투여할 수 있다. 의료 전문가가 조성물을 투여할 수 있다. 일부 경우에, 미용 전문가가 조성물을 투여할 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 또한 연동 수단에 의해 전달되거나, 요로 내로 직접 주사되거나, 또는 MTA 또는 ADO를 위한 잠재적인 바이오센서를 함유할 수 있는 카테터에 연결된 펌프에 의해 투여될 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 또한 종양내로, 정맥내로, 피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 안내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심낭내로, 배꼽내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접 입욕시키는 국소 관류에 의해, 카테터를 통해, 또는 세정을 통해 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 암을 갖는 개체를 치료하는 방법은 암을 갖거나 또는 암이 의심되는 개체에게 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 암을 갖는 개체를 치료하는 방법은 또한 암이 없거나 또는 암이 의심되는 개체에게 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이들의 약제학적 조성물의 투여 또는 적용은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100일 연속 또는 비연속 일의 치료 기간 동안 수행될 수 있다. 치료 기간은 약 1 내지 약 30일, 약 2 내지 약 30일, 약 3 내지 약 30일, 약 4 내지 약 30일, 약 5 내지 약 30일, 약 6 내지 약 30일, 약 7 내지 약 30일, 약 8 내지 약 30일, 약 9 내지 약 30일, 약 10 내지 약 30일, 약 11 내지 약 30일, 약 12 내지 약 30일, 약 13 내지 약 30일, 약 14 내지 약 30일, 약 15 내지 약 30일, 약 16 내지 약 30일, 약 17 내지 약 30일, 약 18 내지 약 30일, 약 19 내지 약 30일, 약 20 내지 약 30일, 약 21 내지 약 30일, 약 22 내지 약 30일, 약 23 내지 약 30일, 약 24 내지 약 30일, 약 25 내지 약 30일, 약 26 내지 약 30일, 약 27 내지 약 30일, 약 28 내지 약 30일, 또는 약 29 내지 약 30일일 수 있다.
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물의 투여 또는 적용은 적어도 약 1주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 1년, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년, 적어도 약 4년, 적어도 약 5년, 적어도 약 6년, 적어도 약 7년, 적어도 약 8년, 적어도 약 9년, 적어도 약 10년, 적어도 약 15년, 적어도 약 20년, 또는 그 이상의 투여 기간 동안 실시될 수 있다. 투여는 대상체의 생애에 걸쳐 반복적으로, 예를 들면, 대상체의 생애에 걸쳐 1개월에 1회 또는 1년에 1회 실시될 수 있다. 투여는 적어도 약 1년, 5년, 10년, 15년, 20년, 25년, 30년 또는 그 이상 동안 1개월에 1회 또는 1년에 1회 등의 대상체의 인생의 상당한 부분에 걸쳐 반복적으로 수행될 수 있다.
일부 경우에, 임의의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물을 투여하여, 질환 또는 상태의 증상을 감소시키고/시키거나 질환 또는 상태를 감소시킨다. 일부 경우에, 유효량은 목적하는 효과를 달성하기에 충분할 수 있다. 치료적 또는 예방적 적용의 문맥에서, 유효량은 문제가 되는 상태의 유형 및 중증도, 및 일반적 건강, 연령, 성별, 체중 및 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물에 대한 내성 등의 개별 대상체의 특성에 의존한다.
투약
PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 본 명세서 및 이들의 약제학적 조성물의 투여 또는 적용은 1일에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24회 실시될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 개별화 종양 백신 또는 약제학적 조성물의 투여 또는 적용은 1주에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21회 실시될 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물의 투여 또는 적용은 1개월에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 또는 90회 실시될 수 있다.
PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 단일 용량 또는 분할 용량으로 투여/적용될 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 제1 시점 및 제2 시점에서 투여될 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 2주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년 또는 그 이상의 투여 시간의 차이와 함께 제1 투여가 다른 투여 전에 투여되도록 투여될 수 있다.
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 및 이의 PEG화 MTAP 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 종양의 크기를 축소시킬 수 있다. 다른 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물은 PEG화 MTAP 폴리펩티드의 투여 전의 종양 크기의 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%까지 종양의 크기를 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물의 투여 전의 종양 크기의 1 내지 10%, 5 내지 15%, 10 내지 20%, 15 내지 25%, 20 내지 30%, 25 내지 35%, 30 내지 40%, 35 내지 45%, 40 내지 50%, 45 내지 55%, 50 내지 60%, 55 내지 65%, 60 내지 70%, 65 내지 75%, 70 내지 80%, 75 내지 85%, 80 내지 90%, 85 내지 95%, 또는 90 내지 100%까지 종양의 크기를 감소시킬 수 있다.
일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물은 암세포의 수를 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물의 투여 전의 암 세포 수의 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%까지 암 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물의 투여 전의 암 세포 수의 1 내지 10%, 5 내지 15%, 10 내지 20%, 15 내지 25%, 20 내지 30%, 25 내지 35%, 30 내지 40%, 35 내지 45%, 40 내지 50%, 45 내지 55%, 50 내지 60%, 55 내지 65%, 60 내지 70%, 65 내지 75%, 70 내지 80%, 75 내지 85%, 80 내지 90%, 85 내지 95%, 또는 90 내지 100%까지 암 세포의 수를 감소시킬 수 있다.
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 및 이의 PEG화 MTAP 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 종양의 전이를 감소시키거나 예방할 수 있다. 다른 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드의 투여 부재하의 종양 전이의 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%까지 종양의 전이를 감소 또는 예방할 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물의 투여 부재하의 종양 전이의 1 내지 10%, 5 내지 15%, 10 내지 20%, 15 내지 25%, 20 내지 30%, 25 내지 35%, 30 내지 40%, 35 내지 45%, 40 내지 50%, 45 내지 55%, 50 내지 60%, 55 내지 65%, 60 내지 70%, 65 내지 75%, 70 내지 80%, 75 내지 85%, 80 내지 90%, 85 내지 95%, 또는 90 내지 100%까지 종양의 전이를 감소 또는 예방할 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 종양의 전이를 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9 개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 21년, 22년, 23년, 24년, 25년, 26년, 27년, 28년, 29년, 30년, 31년, 32년, 33년, 34년, 35년, 36년, 37년, 38년, 39년, 40년, 41년, 42년, 43년, 44년, 45년, 46년, 47년, 48년, 49년, 50년 또는 50년 이상 지연시킬 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 종양의 전이를 1일 내지 1개월, 25일 내지 6개월, 5개월 내지 12개월, 10개월 내지 2년, 1년 내지 5년, 4년 내지 10년, 9년 내지 15년, 14년 내지 20년, 19년 내지 25년, 24년 내지 30년, 29년 내지 35년, 34년 내지 40년, 39년 내지 45년, 또는 44년 내지 50년의 시간에 걸쳐 지연시킬 수 있다.
일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물을 투여한 대상체의 수명을 연장시킬 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물을 투여한 대상체의 수명을 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 21년, 22년, 23년, 24년, 25년, 26년, 27년, 28년, 29년, 30년, 31년, 32년, 33년, 34년, 35년, 36년, 37년, 38년, 39년, 40년, 41년, 42년, 43년, 44년, 45년, 46년, 47년, 48년, 49년, 50년 또는 50년 이상까지 연장시킬 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물을 투여한 대상체의 수명을 1일 내지 1개월, 25일 내지 6개월, 5개월 내지 12개월, 10개월 내지 2년, 1년 내지 5년, 4년 내지 10년, 9년 내지 15년, 14년 내지 20년, 19년 내지 25년, 24년 내지 30년, 29년 내지 35년, 34년 내지 40년, 39년 내지 45년, 또는 44년 내지 50년까지 연장시킬 수 있다.
일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물을 투여한 대상체의 암의 발증을 지연시킬 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 약제학적 조성물을 투여한 대상체의 암 발증을 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 21년, 22년, 23년, 24년, 25년, 26년, 27년, 28년, 29년, 30년, 31년, 32년, 33년, 34년, 35년, 36년, 37년, 38년, 39년, 40년, 41년, 42년, 43년, 44년, 45년, 46년, 47년, 48년, 49년, 50년 또는 50년 이상까지 지연시킬 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 대상체의 암 발증을 1일 내지 1개월, 25일 내지 6개월, 5개월 내지 12개월, 10개월 내지 2년, 1년 내지 5년, 4년 내지 10년, 9년 내지 15년, 14년 내지 20년, 19년 내지 25년, 24년 내지 30년, 29년 내지 35년, 34년 내지 40년, 39년 내지 45년, 또는 44년 내지 50년까지 지연시킬 수 있다.
일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 MTA 수준을 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000%, 6000%, 7000%, 8000%, 9000%, 10000%, 20000%, 30000%, 40000%, 50000%, 60000%, 70000%, 80000%, 90000% 또는 100000% 저하시킬 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 MTA 수준을 10 내지 30%, 20 내지 40%, 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 80 내지 100%, 90 내지 150%, 100 내지 200%, 150 내지 250%, 200 내지 300%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950%, 900 내지 1000%, 950 내지 2000%, 1500 내지 2500%, 2000 내지 3000%, 2500 내지 3500%, 3000 내지 4000%, 3500 내지 4500%, 4000 내지 5000%, 4500 내지 5500%, 5000 내지 6000%, 5500 내지 6500%, 6000 내지 7000%, 6500 내지 7500%, 7000 내지 8000%, 7500 내지 8500%, 8000 내지 9000%, 8500 내지 9500%, 9000 내지 10000%, 9500 내지 20000%, 15000 내지 25000%, 20000 내지 30000%, 25000 내지 35000%, 30000 내지 40000%, 35000 내지 45000%, 40000 내지 50000%, 45000 내지 55000%, 50000 내지 60000%, 55000 내지 65000%, 60000 내지 70000%, 65000 내지 75000%, 70000 내지 80000%, 75000 내지 85000%, 80000 내지 90000%, 85000 내지 95000% 또는 90000 내지 100000% 저하시킬 수 있다.
일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 ADO 수준을 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000%, 6000%, 7000%, 8000%, 9000%, 10000%, 20000%, 30000%, 40000%, 50000%, 60000%, 70000%, 80000%, 90000% 또는 100000% 저하시킬 수 있다. 일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이의 약제학적 조성물은 ADO 수준을 10 내지 30%, 20 내지 40%, 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 80 내지 100%, 90 내지 150%, 100 내지 200%, 150 내지 250%, 200 내지 300%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950%, 900 내지 1000%, 950 내지 2000%, 1500 내지 2500%, 2000 내지 3000%, 2500 내지 3500%, 3000 내지 4000%, 3500 내지 4500%, 4000 내지 5000%, 4500 내지 5500%, 5000 내지 6000%, 5500 내지 6500%, 6000 내지 7000%, 6500 내지 7500%, 7000 내지 8000%, 7500 내지 8500%, 8000 내지 9000%, 8500 내지 9500%, 9000 내지 10000%, 9500 내지 20000%, 15000 내지 25000%, 20000 내지 30000%, 25000 내지 35000%, 30000 내지 40000%, 35000 내지 45000%, 40000 내지 50000%, 45000 내지 55000%, 50000 내지 60000%, 55000 내지 65000%, 60000 내지 70000%, 65000 내지 75000%, 70000 내지 80000%, 75000 내지 85000%, 80000 내지 90000%, 85000 내지 95000% 또는 90000 내지 100000% 저하시킬 수 있다.
일부 경우에, MTA 또는 ADO 수준의 감소는 포유동물의 순환에서 생체내에서, 조직 배양 또는 기타 생물학적 배지에서 MTA 또는 ADO 감소가 필요한 경우에는 시험관내에서, 생물학적 유체, 세포 또는 조직이 신체 외부에서 조작되고, 후속적으로 환자 포유동물의 신체로 복귀하는 생체외 절차에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 순환, 배양 배지, 생물학적 유체 또는 세포로부터 MTA 또는 ADO의 감소를 수행하여, 처리되는 물질에 접근할 수 있는 MTA 또는 ADO의 양을 감소시킬 수 있고, 따라서 접촉되는 물질 중의 주변 MTA 또는 ADO를 분해하도록, MTA 또는 ADO 분해 조건하에 고갈될 물질을 MTA 또는 ADO 분해량의 MTAP 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이들의 약제학적 조성물의 MTA 또는 ADO-분해 효율은 적용에 따라 광범위하게 변할 수 있고; 물질에 존재하는 MTA 및/또는 ADO의 양, 원하는 고갈 속도, 및 투여된 물질에의 노출에 대한 물질의 내성에 따라 달라질 수 있다. 일부 경우에, 물질 중의 MTA 또는 ADO 수준, 따라서 물질로부터의 MTA 또는 ADO의 고갈 속도는 당해 기술분야에 공지된 다양한 화학적 및 생화학적 방법에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다. 일부 경우에, MTA- 또는 ADO-분해량은 본 명세서에 추가로 기재될 수 있고, 0.001 내지 100단위(U)의 MTase, 바람직하게는 약 0.01 내지 10U, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 5U MTase/밀리리터(mL)의 처리 물질의 범위일 수 있다.
일부 경우에, MTA 또는 ADO-분해의 조건은 MTAP 폴리펩티드의 생물학적 활성과 적합성이 있는 완충액 및 온도 조건을 포함할 수 있고, 효소와 적합성이 있는 적당한 온도, 염 및 pH 조건, 예를 들면, 생리학적 조건을 포함할 수 있다. 예시적 조건은, 생리학적 조건이 포함되지만, 약 4 내지 40℃, 약 0.05 내지 0.2M NaCl에 상당하는 이온 강도, 및 약 5 내지 9의 pH를 포함할 수 있다.
일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서 및 이들의 약제학적 조성물은 단위 용량의 주사에 의해 통상적으로 정맥내 투여될 수 있다.
일부 경우에, 투여되는 양은 치료 대상체, 효소를 활용하는 대상체 시스템의 능력, 목적하는 치료 효과의 정도에 의존한다. 일부 경우에, 투여에 필요한 효소의 정확한 양은 시술자의 판단에 의존할 수 있고, 각 개인에 고유하다. 일부 경우에, 전신 적용에 적합한 투여량 범위가 본 명세서에 개시되어 있고, 투여 경로에 의존할 수 있다. 일부 경우에, 초기 투여 및 부스터 주사에 적합한 섭생이 또한 고려될 수 있고, 초기 투여, 이어서 후속 주사 또는 기타 투여에 의한 1시간 이상의 간격으로 반복 투여에 의해 대표될 수 있다. 일부 경우에, 투여는 본 명세서에 기재되어 있고, MTAP 폴리펩티드의 높은 혈청 및 조직 수준을 지속적으로 유지하고, 반대로 MTA 또는 ADO의 낮은 혈청 및 조직 수준을 유지하기 위해 특히 바람직하다. 일부 경우에, 생체내 요법을 위해 지정된 범위에서 혈액 농도를 유지하기에 충분한 지속적 정맥내 주입이 고려될 수 있다.
일부 경우에, 유효량의 PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물은 투여되는 물질에 기초하여 조정될 수 있다. 일부 경우에, PEG화 MTAP 폴리펩티드, PEG화 MTAP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 약제학적 조성물의 유효량은 본 명세서에 기재되고 추구되는 이의 치료상 바람직한 결과에 기초하여 변할 수 있다.
일부 경우에, 치료학적 유효량의 MTAP 폴리펩티드는 환자의 순환 중의 MTA 또는 ADO의 감소를 포함하는 목적하는 효과를 달성하기 위해 계산된 소정 양을 포함할 수 있다. 따라서, MTAP 폴리펩티드의 투여를 위한 투여량 범위는 목적하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 것이다. 투여량은 과점성 증후군, 폐부종, 울혈성 심부전 등의 부작용을 일으킬 정도로 많아서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환의 정도에 따라 상이할 것이고, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 합병증이 발생한 경우에는 개별 의사가 투여량을 조정할 수 있다.
다른 경우에, MTAP 폴리펩티드의 치료적 유효량은, 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여되는 경우, mL당 약 0.001 내지 약 100 단위(U), 바람직하게는 약 0.1U 초과, 더 바람직하게는 1U MTase/mL 초과의 혈관내 (혈장) 또는 국소 농도를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 전형적 투여량은 체중을 기준으로 투여될 수 있고, 약 5 내지 1000U/kg/일, 바람직하게는 약 5 내지 100U/kg/일, 더 바람직하게는 약 10 내지 50U/kg/일, 더 바람직하게는 약 20 내지 40 U/kg/일의 범위이다.
일부 실시양태에서, 용량은 또한 약 1×101 ㎍/kg/체중, 약 2×101 ㎍/kg/체중, 약 3×101 ㎍/kg/체중, 약 4×101 ㎍/kg/체중, 약 5×101 ㎍/kg/체중, 약 6×101 ㎍/kg/체중, 약 7×101 ㎍/kg/체중, 약 8×101 ㎍/kg/체중, 약 9×101 ㎍/kg/체중, 약 1×102 ㎍/kg/체중, 약 2×102 ㎍/kg/체중, 약 3×102 ㎍/kg/체중, 약 4×102 ㎍/kg/체중, 약 5×102 ㎍/kg/체중, 약 6×102 ㎍/kg/체중, 약 7×102 ㎍/kg/체중, 약 8×102 ㎍/kg/체중, 약 9×102 ㎍/kg/체중, 약 1×103 ㎍/kg/체중, 약 2×103 ㎍/kg/체중, 약 3×103 ㎍/kg/체중, 약 4×103 ㎍/kg/체중, 약 5×103 ㎍/kg/체중, 약 6×103 ㎍/kg/체중, 약 7×103 ㎍/kg/체중, 약 8×103 ㎍/kg/체중, 약 9×103 ㎍/kg/체중, 약 1×104 ㎍/kg/체중, 약 2×104 ㎍/kg/체중, 약 3×104 ㎍/kg/체중, 약 4×104 ㎍/kg/체중, 약 5×104 ㎍/kg/체중, 약 6×104 ㎍/kg/체중, 약 7×104 ㎍/kg/체중, 약 8×104 ㎍/kg/체중, 약 9×104 ㎍/kg/체중, 약 1×105 ㎍/kg/체중, 약 2×105 ㎍/kg/체중, 약 3×105 ㎍/kg/체중, 약 4×105 ㎍/kg/체중, 약 5×105 ㎍/kg/체중, 약 6×105 ㎍/kg/체중, 약 7×105 ㎍/kg/체중, 약 8×105 ㎍/kg/체중, 약 9×105 ㎍/kg/체중, 약 1×106 ㎍/kg/체중, 약 2×106 ㎍/kg/체중, 약 3×106 ㎍/kg/체중, 약 4×106 ㎍/kg/체중, 약 5×106 ㎍/kg/체중, 약 6×106 ㎍/kg/체중, 약 7×106 ㎍/kg/체중, 약 8×106 ㎍/kg/체중, 약 9×106 ㎍/kg/체중, 약 1×107 ㎍/kg/체중, 약 2×107 ㎍/kg/체중, 약 3×107 ㎍/kg/체중, 약 4×107 ㎍/kg/체중, 약 5×107 ㎍/kg/체중, 약 6×107 ㎍/kg/체중, 약 7×107 ㎍/kg/체중, 약 8×107 ㎍/kg/체중, 약 9×107 ㎍/kg/체중, 약 1×108 ㎍/kg/체중, 약 2×108 ㎍/kg/체중, 약 3×108 ㎍/kg/체중, 약 4×108 ㎍/kg/체중, 약 5×108 ㎍/kg/체중, 약 6×108 ㎍/kg/체중, 약 7×108 ㎍/kg/체중, 약 8×108 ㎍/kg/체중, 약 9×108 ㎍/kg/체중, 약 1×109 ㎍/kg/체중, 약 2×109 ㎍/kg/체중, 약 3×109 ㎍/kg/체중, 약 4×109 ㎍/kg/체중, 약 5×109 ㎍/kg/체중, 약 6×109 ㎍/kg/체중, 약 7×109 ㎍/kg/체중, 약 8×109 ㎍/kg/체중, 약 9×109 ㎍/kg/체중, 약 1×1010 ㎍/kg/체중, 약 2×1010 ㎍/kg/체중, 약 3×1010 ㎍/kg/체중, 약 4×1010 ㎍/kg/체중, 약 5×1010 ㎍/kg/체중, 약 6×1010 ㎍/kg/체중, 약 7×1010 ㎍/kg/체중, 약 8×1010 ㎍/kg/체중 또는 약 9×1010 ㎍/kg/체중을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 또한 0.5×101 내지 2×101 ㎍/kg/체중, 1.5×101 내지 3×101 ㎍/kg/체중, 2.5×101 내지 4×101 ㎍/kg/체중, 3.5×101 내지 5×101 ㎍/kg/체중, 4.5×101 내지 6×101 ㎍/kg/체중, 5.5×101 내지 7×101 ㎍/kg/체중, 6.5×101 내지 8×101 ㎍/kg/체중, 7.5×101 내지 9×101 ㎍/kg/체중, 8.5×101 내지 1×101 ㎍/kg/체중, 0.5×102 내지 2×102 ㎍/kg/체중, 1.5×102 내지 3×102 ㎍/kg/체중, 2.5×102 내지 4×102 ㎍/kg/체중, 3.5×102 내지 5×102 ㎍/kg/체중, 4.5×102 6×102 ㎍/kg/체중, 5.5×102 내지 7×102 ㎍/kg/체중, 6.5×102 내지 8×102 ㎍/kg/체중, 7.5×102 내지 9×102 ㎍/kg/체중, 8.5×102 내지 1×103 ㎍/kg/체중, 0.5×103 내지 2×103 ㎍/kg/체중, 1.5×103 내지 3×103 ㎍/kg/체중, 2.5×103 내지 4×103 ㎍/kg/체중, 3.5×103 내지 5×103 ㎍/kg/체중, 4.5×103 내지 6×103 ㎍/kg/체중, 5.5×103 내지 7×103 ㎍/kg/체중, 6.5×103 내지 8×103 ㎍/kg/체중, 7.5×103 내지 9×103 ㎍/kg/체중, 8.5×103 내지 1×104 ㎍/kg/체중, 0.5×104 내지 2×104 ㎍/kg/체중, 1.5×104 내지 3×104 ㎍/kg/체중, 2.5×104 내지 4×104 ㎍/kg/체중, 3.5×104 내지 5×104 ㎍/kg/체중, 4.5×104 내지 6×104 ㎍/kg/체중, 5.5×104 내지 7×104 ㎍/kg/체중, 6.5×104 내지 8×104 ㎍/kg/체중, 7.5×104 내지 9×104 ㎍/ kg/체중, 8.5×104 내지 1×105 ㎍/kg/체중, 0.5×105 내지 2×105 ㎍/kg/체중, 1.5×105 내지 3×105 ㎍/kg/체중, 2.5×105 내지 4×105 ㎍/kg/체중, 3.5×105 내지 5×105 ㎍/kg/체중, 4.5×105 내지 6×105 ㎍/kg/체중, 5.5×105 내지 7×105 ㎍/kg/체중, 6.5×105 내지 8×105 ㎍/kg/체중, 7.5×105 내지 9×105 ㎍/kg/체중, 8.5×105 내지 1×106 ㎍/kg/체중, 0.5×106 내지 2×106 ㎍/kg/체중, 1.5×106 내지 3×106 ㎍/kg/체중, 2.5×106 내지 4×106 ㎍/kg/체중, 3.5×106 내지 5×106 ㎍/kg/체중, 4.5×106 내지 6×106 ㎍/kg/체중, 5.5×106 내지 7×106 ㎍/kg/체중, 6.5×106 내지 8×106 ㎍/kg/체중, 7.5×106 내지 9×106 ㎍/kg/체중, 8.5×106 내지 1×107 ㎍/kg/체중, 0.5×107 내지 2×107 ㎍/kg/체중, 1.5×107 내지 3×107 ㎍/kg/체중, 2.5×107 내지 4×107 ㎍/kg/체중, 3.5×107 내지 5×107 ㎍/kg/체중, 4.5×107 내지 6×107 ㎍/kg/체중, 5.5×107 내지 7×107 ㎍/kg/체중, 6.5×107 내지 8×107 ㎍/kg/체중, 7.5×107 내지 9×107 ㎍/kg/체중, 8.5×107 내지 1×108 ㎍/kg/체중, 0.5×108 내지 2×108 ㎍/kg/체중, 1.5×108 내지 3×108 ㎍/kg/체중, 2.5×108 내지 4×108 ㎍/kg/체중, 3.5×108 내지 5×108 ㎍/kg/체중, 4.5×108 내지 6×108 ㎍/kg/체중, 5.5×108 내지 7×108 ㎍/kg/체중, 6.5×108 내지 8×108 ㎍/kg/체중, 7.5×108 내지 9×108 ㎍/kg/체중, 8.5×108 내지 1×109 ㎍/kg/체중, 0.5×109 내지 2×109 ㎍/kg/체중, 1.5×109 내지 3×109 ㎍/kg/체중, 2.5×109 내지 4×109 ㎍/kg/체중, 3.5×109 내지 5×109 ㎍/kg/체중, 4.5×109 내지 6×109 ㎍/kg/체중, 5.5×109 내지 7×109 ㎍/kg/체중, 6.5×109 내지 8×109 ㎍/kg/체중, 7.5×109 내지 9×109 ㎍/kg/체중, 8.5×109 내지 1×1010 ㎍/kg/체중, 0.5×1010 내지 2×1010 ㎍/kg/체중, 1.5×1010 내지 3×1010 ㎍/kg/체중, 2.5×1010 내지 4×1010 ㎍/kg/체중, 3.5×1010 내지 5×1010 ㎍/kg/체중, 4.5×1010 내지 6×1010 ㎍/kg/체중, 5.5×1010 내지 7×1010 ㎍/kg/체중, 6.5×1010 내지 8×1010 ㎍/kg/체중, 7.5×1010 내지 9×1010 10㎍/kg/체중 또는 8.5×1010 내지 1×1010 ㎍/kg/체중을 포함할 수 있다.
동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투여량은 체중, 상태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 특발성 및 투여 경로 등의 물리적 및 생리학적 요인에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여를 담당하는 의사는, 어떠한 경우에도, 조성물의 활성 성분(들) 농도 및 개별 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들면, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 활성 화합물은, 예를 들면, 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 그 중에서 도출 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물(들)의 양은 화합물의 임의의 소정 단위 투여량으로 적절한 용량이 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품의 저장 수명 및 기타 약리학적 고려사항 등의 요인은 이러한 약제학적 제형을 제조하는 분야의 당업자에 의해 고려될 것이고, 그 자체로 다양한 투여량 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
다른 비제한적 예에서, 용량은 또한 투여당 약 1 ㎍/kg/체중, 약 5 ㎍/kg/체중, 약 10 ㎍/kg/체중, 약 50 ㎍/kg/체중, 약 100 ㎍/kg/체중, 약 200 ㎍/kg/체중, 약 350 ㎍/kg/체중, 약 500 ㎍/kg/체중, 약 1 mg/kg/체중, 약 5 mg/kg/체중, 약 10 mg/kg/체중, 약 50 mg/kg/체중, 약 100 mg/kg/체중, 약 200 mg/kg/체중, 약 350 mg/kg/체중, 약 500 mg/kg/체중, 약 1000 mg/kg/체중 이상, 및 그 중에서 도출 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 수치로부터 도출 가능한 범위의 비제한적 예에서, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 ㎍/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중 범위 등이 전술한 수치를 기준으로 투여될 수 있다.
단백질 정제
일부 경우에, 단백질 정제 기술은, 하나의 수준에서, 폴리펩티드 및 비폴리펩티드 분획으로 세포, 조직 또는 기관의 균질화 및 조 분별화와 관련된 기술을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 목적 단백질 또는 폴리펩티드는, 달리 명시되지 않는 한, 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질성을 위한 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 일부 경우에, 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피 및 등전점 초점이 또한 사용될 수 있다. 일부 경우에, 펩티드 정제 방법은 고속 액체 크로마토그래피(FPLC) 또는 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)일 수 있다.
일부 경우에, 정제된 단백질 또는 펩티드는 다른 성분으로부터 단리가능한 조성물을 포함할 수 있고, 여기서 단백질 또는 펩티드는 이의 자연적으로 수득가능한 상태에 대하여 어느 정도로 정제된다. 다른 경우에, 단리 또는 정제된 단백질 또는 펩티드는 또한 그것이 자연적으로 발생할 수 있는 환경을 포함하지 않는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 정제된 단백질은 다른 다양한 성분을 제거하기 위해 분획화에 제공되고 이의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 유지하는 단백질 또는 펩티드 조성물을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 정제되는 단백질은 조성물의 주요 성분을 형성하는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 조성물의 주요 성분은 조성물 중의 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 단백질 정제는 황산암모늄, PEG, 항체 등에 의한 침전, 또는 열 변성, 이어서 원심분리; 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트 및 친화성 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피 단계; 등전점 초점; 겔 전기영동; 및 이들 기술과 다른 기술의 조합을 포함할 수 있다. 당해 기술분야에서 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 실시하는 순서를 변경할 수 있거나, 또는 특정 단계를 생략할 수 있으며, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드를 제조하기 위한 적합한 방법을 초래하는 것으로 믿어진다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법은 본 개시에 비추어 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법은, 일부 경우에, 활성 분획의 비활성을 결정하거나, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 분획의 순도를 평가하는 방법은 분획의 비활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 비활성과 비교하여 "배의 정제 수"에 의해 평가되는, 그 중의 순도의 정도를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는, 일부 경우에, 정제를 추적하기 위해 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출 가능한 활성을 나타내는지의 여부에 의존할 수 있다.
일부 경우에, 단백질 또는 펩티드는 항상 가장 정제된 상태로 제공되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 특정 실시양태에서 거의 정제되지 않은 생성물이 유용할 수 있다. 일부 경우에, 부분 정제는 더 적은 수의 정제 단계를 조합하여 사용하거나, 또는 동일한 일반 정제 방식의 상이한 형태를 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, HPLC 장치를 사용하여 실시되는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 저압 크로마토그래피 시스템을 사용하는 동일한 기술보다 더 큰 "배"의 정제를 초래할 것으로 이해된다. 보다 낮은 정도의 상대적 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 완전한 회수에서 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는 점에서 이점을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, MTAP 또는 PEG화 MTAP 폴리펩티드를 단리 또는 정제할 수 있다. 예를 들면, 정제를 용이하게 하기 위해, His 태그 또는 친화성 에피토프를 이러한 MTAP 또는 PEG화 MTAP 폴리펩티드에 포함시킬 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 분리되는 물질과 이 물질이 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특이적 친화성에 의존하는 크로마토그래피 절차이다. 이것은 수용체-리간드 유형의 상호작용이다. 컬럼 물질은 결합 파트너 중 하나를 불용성 매트릭스에 공유 결합시킴으로써 합성된다. 이어서, 컬럼 물질은 용액으로부터 물질을 특이적으로 흡착할 수 있다. 용출은, 결합이 일어나지 않는 조건(예: pH, 이온 강도, 온도 변경)을 변경함으로써 발생한다. 매트릭스는 분자를 상당한 정도로 흡착하지 않고 광범위한 화학적, 물리적, 열적 안정성을 갖는 물질이어야 한다. 리간드는 이의 결합 특성에 영향을 미치지 않는 방식으로 결합되어야 한다. 리간드는 또한 비교적 견고한 결합을 제공해야 한다. 샘플 또는 리간드를 파괴하지 않고 물질을 용출할 수 있어야 한다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 중의 분자를 이의 크기 또는 보다 기술적 용어로 유체역학적 용적을 기준으로 분리하는 크로마토그래피 방법이다. 이것은 통상 단백질 및 산업용 중합체 등의 거대 분자 또는 거대분자 복합체에 적용된다. 통상, 수용액을 사용하여 샘플을 컬럼에 수송하는 경우, 이 기술은 겔 여과 크로마토그래피라고 하며, 유기 용매를 이동상으로 사용하는 경우에 사용되는 겔 투과 크로마토그래피라는 명칭과 대조된다.
SEC의 기본 원리는 다양한 크기의 입자가 상이한 속도로 고정상으로부터 용출(여과)된다는 것이다. 이에 의해, 크기에 따라 입자 용액이 분리된다. 모든 입자가 동시에 또는 거의 동시에 로딩되는 경우, 동일한 크기의 입자가 함께 용출되어야 한다. 각 크기 배제 컬럼에는 분리할 수 있는 분자량 범위가 있다. 배제 한계는 이 범위의 상한에서 분자량을 정의하고, 분자가 너무 커서 정지상에 포획되는 곳이다. 투과 한계는 분리 범위의 하한에서 분자량을 정의하고, 충분히 작은 크기의 분자가 정지상의 세공에 완전히 침투할 수 있고, 이 분자량 이하의 모든 분자는 너무 작아서 단일 밴드로서 용출되는 곳이다.
고속 액체 크로마토그래피(또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC)는 화합물을 분리, 동정 및 정량화하기 위해 생화학 및 분석 화학에서 빈번히 사용되는 컬럼 크로마토그래피의 일종이다. HPLC는 크로마토그래피 충전제(고정상)을 보유하는 컬럼, 컬럼 내에서 이동상을 이동시키는 펌프, 분자의 체류 시간을 나타내는 검출기를 이용한다. 체류 시간은 고정상, 분석 대상의 분자 및 사용된 용매 사이의 상호 작용에 따라 상이하다.
일부 경우에, 본 명세서에 기재되지 않은 및 이의 당업자에게 공지된 임의의 단백질 정제 기술이 또한 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
일부 경우에, 약제학적 조성물은 면역요법에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 약제학적 조성물에 의해 증가된 면역요법에 대한 감수성은 대상체에 대한 면역요법의 유효량, 용량, 또는 치료적 또는 생물학적 효과를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 약제학적 조성물에 의해 증가된 면역요법에 대한 감수성은 대상체에 대한 면역요법의 유효량, 용량 또는 치료적 또는 생물학적 효과를 약제학적 조성물을 투여받지 않은 또 다른 대상체에 대한 면역요법의 것들과 비교하여 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 약제학적 조성물에 의해 증가된 면역요법에 대한 감수성은 대상체에 대한 면역요법의 유효량, 용량, 또는 치료적 또는 생물학적 효과를 약제학적 조성물을 투여받기 전의 대상체에 대한 면역요법의 것들과 비교하여 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 면역요법에 대한 감수성을 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000%, 6000%, 7000%, 8000%, 9000%, 10000%, 20000%, 30000%, 40000%, 50000%, 60000%, 70000%, 80000%, 90000% 또는 100000% 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 면역요법에 대한 감수성을 10 내지 30%, 20 내지 40%, 30 내지 50%, 40 내지 60%, 50 내지 70%, 60 내지 80%, 70 내지 90%, 80 내지 100%, 90 내지 150%, 100 내지 200%, 150 내지 250%, 200 내지 300%, 250 내지 350%, 300 내지 400%, 350 내지 450%, 400 내지 500%, 450 내지 550%, 500 내지 600%, 550 내지 650%, 600 내지 700%, 650 내지 750%, 700 내지 800%, 750 내지 850%, 800 내지 900%, 850 내지 950%, 900 내지 1000%, 950 내지 2000%, 1500 내지 2500%, 2000 내지 3000%, 2500 내지 3500%, 3000 내지 4000%, 3500 내지 4500%, 4000 내지 5000%, 4500 내지 5500%, 5000 내지 6000%, 5500 내지 6500%, 6000 내지 7000%, 6500 내지 7500%, 7000 내지 8000%, 7500 내지 8500%, 8000 내지 9000%, 8500 내지 9500%, 9000 내지 10000%, 9500 내지 20000%, 15000 내지 25000%, 20000 내지 30000%, 25000 내지 35000%, 30000 내지 40000%, 35000 내지 45000%, 40000 내지 50000%, 45000 내지 55000%, 50000 내지 60000%, 55000 내지 65000%, 60000 내지 70000%, 65000 내지 75000%, 70000 내지 80000%, 75000 내지 85000%, 80000 내지 90000%, 85000 내지 95000% 또는 90000 내지 100000% 증가시킬 수 있다.
MTAP 폴리펩티드는 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 본 명세서에 기재된 및 이의 임의의 경로를 사용하여 투여될 수 있다.
본 발명은 치료 조제물의 특정한 성질에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들면, 이러한 조성물은 생리학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 희석제 및 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이들 치료용 조제물은 다른 치료제와 유사한 방식으로 가축 등의 수의학적 용도 및 인간에서의 임상 용도를 위해 포유동물에 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능에 필요한 투여량은 사용 유형 및 투여 방식, 게다가 개별 대상체의 특정 요구사항에 따라 달라질 것이다.
이러한 조성물은 전형적으로 주사제로서의 액체 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 적합한 희석제 및 부형제는, 예를 들면, 물, 생리식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등, 및 이들의 조합이다. 추가로, 필요에 따라, 조성물은 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제 등의 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 용해 또는 분산된 유효량의 하나 이상의 MTase 또는 추가 약제를 포함할 수 있다. 어구 "약제학적 또는 약리학적으로 허용되는"은, 필요에 따라, 예를 들면, 인간 등의 동물에게 투여될 때, 유해한, 알레르기성 또는 기타 유해한 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 단리된 적어도 하나의 MTase, 또는 추가 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물의 제조는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 참조에 의해 본 명세서에 도입됨]에 예시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 동물(예: 사람) 투여의 경우, 조제물은 FDA 생물학적 표준 사무국에서 요구하는 무균성, 발열성, 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족해야 하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 방부제(예: 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 방부제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 예를 들면, 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 물질 및 이들의 조합을 포함한다[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 참조에 의해 본 명세서에 도입됨). 종래의 담체가 활성 성분과 적합성이 없는 경우를 제외하고, 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
본 발명의 특정 실시양태는 이들이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되어야 하는지의 여부, 및 주사 등의 투여 경로에 대해 멸균되어야 하는지의 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 정맥내로, 피내로, 경피로, 경막내로, 동맥내로, 복강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 점막으로, 경구로, 국소로, 국재로, 흡입(예를 들면, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접 입욕시키는 국소 관류에 의해, 카테터를 통해, 세정을 통해, 지질 조성물(예: 리포솜)에서, 또는 당업자에게 공지되어 있는 기타 방법 또는 상기의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 참조에 의해 본 명세서에 도입됨).
변형된 폴리펩티드는 유리 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 산 부가염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 유리 아미노 그룹으로 형성된 것, 또는 무기산, 예를 들면, 염산 또는 인산으로 형성된 것, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산 등의 유기산으로 형성된 것을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철 등의 무기 염기; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인 등의 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화 시, 용액은 투여 제형과 적합성이 있는 방식으로 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 주사용 용액 등의 비경구 투여용으로 제형화된 것 또는 폐로의 전달을 위한 에어로졸 또는 약물 방출 캡슐 등의 소화기 투여용으로 제형화된 것 등의 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
추가로, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제의 존재 또는 부재하에 약제학적으로 허용되는 담체에서 제공될 수 있다. 담체는 동화될 수 있어야 하고, 액체, 반고체, 즉 페이스트 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 종래의 매질, 약제, 희석제 또는 담체가 수용자 또는 그 안에 함유되는 조성물의 치료 효과에 유해한 경우를 제외하고, 방법의 실시에 사용하기 위한 투여 가능한 조성물에서 이의 사용은 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 식염수 용액, 지질, 리포솜, 수지, 결합제, 충전제 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 미생물 작용의 방지는 파라벤(예를 들면, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 항균제 및 항진균제 등의 방부제에 의해 야기될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 즉 용액, 현탁액, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 이러한 절차는 당업자에게 일상적이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 완전히 조합되거나 또는 혼합된다. 혼합은 분쇄 등의 편리한 방식으로 수행할 수 있다. 조성물을 치료 활성의 상실, 즉 위의 변성으로부터 보호하기 위해 안정제를 혼합 프로세스에 또한 첨가할 수 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예에는 완충액, 아미노산, 예컨대, 글리신 및 리신, 탄수화물, 예컨대, 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 소르비톨, 만니톨 등이 포함된다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 MTAP 폴리펩티드, 하나 이상의 지질, 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 용도에 관한 것일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "지질"은 물에 불용성이고 유기 용매로 추출가능한 것을 특징으로 하는 임의의 광범위한 물질을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 광범위한 부류의 화합물은 당업자에게 공지되어 있고, 용어 "지질"이 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이는 임의의 특정 구조에 한정되지 않는다. 예로서는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 포함하는 화합물이 포함된다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성(즉, 인간에 의해 설계 또는 생산)될 수 있다. 그러나, 지질은 통상 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세리드, 스테로이드, 테르펜, 리소지질, 글리코스핑고지질, 당지질, 설파티드, 에테르- 및 에스테르-결합 지방산을 갖는 지질, 중합성 지질 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 지질로서 당업자에 의해 이해되는, 본 명세서에 구체적으로 기재된 것 이외의 화합물도 또한 조성물 및 방법에 포함된다.
당업자는 지질 비히클 중에 조성물을 분산시키기 위해 사용될 수 있는 기술의 범위에 정통할 것이다. 예를 들면, MTase 또는 이의 융합 단백질은 지질을 함유하는 용액에 분산되고, 지질과 용해되고, 지질과 유화되고, 지질과 혼합되고, 지질과 조합되고, 지질과 공유 결합되고, 지질 중의 현탁액으로 함유되고, 미셀 또는 리포솜을 함유하거나 복합체를 형성하거나, 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 회합된다. 분산액은 리포솜의 형성을 초래할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
병용 치료
특정 실시양태에서, 본 실시양태의 조성물 및 방법은 제2 요법 또는 추가 요법과 조합하여 MTAP 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 병용 요법을 포함하는 방법 및 조성물은 치료 효과 또는 보호 효과를 증강시키고/시키거나 다른 요법의 치료 효과를 증가시킨다. 치료적 및 예방적 방법 및 조성물은 목적하는 효과를 달성하기에 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이 프로세스는 MTAP 폴리펩티드와 제2 요법을 모두 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조직, 기관 또는 세포는 하나 이상의 약제(즉, MTAP 폴리펩티드 또는 제2 약제)를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)에 노출되거나, 또는 조직, 기관 및/또는 세포를 2개 이상의 상이한 조성물 또는 약제와 접촉시킴으로써 이루어질 수 있고, 여기서 하나의 조성물은 1) MTAP 폴리펩티드, 2) 제2 약제, 또는 3) MTAP 폴리펩티드와 제2 약제 둘 다를 제공한다. 또한, 이러한 병용 요법은 외과적 요법과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
MTAP 폴리펩티드는 제2 치료와 비교하여 전, 동안, 후에, 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시로부터 수분, 수일, 수주의 범위의 간격으로 이루어질 수 있다. MTAP 폴리펩티드가 제2 약제와는 별도로 환자에게 제공되는 실시양태에서, 일반적으로 각 전달 시간 사이에 상당한 기간이 만료되지 않도록 하여, 2개의 치료가 여전히 환자에 대한 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있게 한다. 이러한 경우에, 서로 약 12 내지 24시간 또는 72시간 이내에, 보다 구체적으로 서로 약 6 내지 12시간 이내에 환자에게 MTAP 폴리펩티드 및 제2 요법을 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 치료 기간을 대폭 연장하는 것이 바람직할 수도 있고, 여기서 각각의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7)로부터 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)가 경과한다.
특정 실시양태에서, 치료 코스는 1 내지 90일 이상 지속될 것이다(이러한 범위에는 개재 일수가 포함된다). MTAP 폴리펩티드는 1일차 내지 90일차 중 임의의 일자(이러한 범위는 개재하는 일자를 포함함) 또는 이들의 임의의 조합에 제공될 수 있고, 또 다른 치료는 1일차 내지 90일차 중 임의의 일자(이러한 범위는 개재하는 일자를 포함함) 또는 이들의 조합을 포함한다. 1일(24시간 기간) 이내에, 환자는 치료(들)의 1회 또는 복수회의 투여를 제공할 수 있다. 더욱이, 치료 코스 후에, 치료가 수행되지 않는 기간이 있는 것으로 고려된다. 이 기간은 환자의 예후, 체력, 건강 등의 상태에 따라 1 내지 7일간 및/또는 1 내지 5주간 및/또는 1 내지 12개월 또는 그 이상(이러한 범위에는 개재하는 일자를 포함함) 지속할 수 있다. 필요에 따라, 치료 사이클이 반복될 것으로 예상된다.
다양한 조합이 사용될 수 있다. 이하의 예에서는 MTAP 폴리펩티드는 "A"이고, 제2 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A .
환자에 대한 임의의 화합물의 투여 또는 본 실시양태의 요법은, 존재하는 경우, 약제의 독성을 고려하여 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 존재한다.
화학요법
본 실시양태에 따르면, 매우 다양한 화학요법제를 사용할 수 있다. 용어 "화학요법"은 암을 치료하기 위해 약물을 사용하는 것을 지칭한다. "화학요법제"는 암의 치료에서 투여되는 화합물 또는 조성물을 암시하기 위해 사용된다. 이러한 약제 또는 약물은, 세포 내에서 이들의 활동 방식, 예를 들면, 이들이 세포 사이클에 영향을 미치는지의 여부 및 어느 단계에서 영향을 미치는지의 여부에 의해 분류된다. 또는, 약제는 DNA를 직접 가교-연결하는 능력, DNA에 삽입하는 능력, 또는 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 능력을 기반으로 특성화될 수 있다.
화학요법제의 예에는 티오테파 및 사이클로포스파미드 등의 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판 등의 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파 등의 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드 및 우라실 머스타드 등의 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴 등의 니트로우레아; 엔디인 항생제(예: 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마I 및 칼리케아미신 오메가I1) 등의 항생제; 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 클로드로네이트 등의 비스포스포네이트; 에스페라미신; 게다가 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백 에네디인 항생물질 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 테토루비신, 6-디아자-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C 등의 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트리포마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU) 등의 항대사물질; 데놉테린, 프테롭테린 및 트리메트렉세이트 등의 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌 등의 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록수리딘 등의 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄 및 테스토락톤 등의 안드로겐; 미토탄 및 트리로스탄 등의 항-부신; 프롤린산 등의 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신 등의 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡크산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로속크산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK 다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴 등의 백금 배위 착물; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미톡크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예: CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로니틴(DMFO); 레티노산 등의 레티노이드; 카페시타빈; 카르보플라틴, 프로카르바진, 플리코마이신, 젬시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 탄스페라제 억제제, 트랜스플라티늄, 및 상기 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
방사선요법
DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되는 다른 요인에는 일반적으로 γ-선, X-선 및/또는 종양 세포에 대한 방사성 동위원소의 직접 전달로서 공지된 것이 포함된다. 마이크로파, 양성자 빔 조사(미국 특허 제5,760,395호 및 제4,870,287호) 및 UV 조사 등의 기타 형태의 DNA 손상 인자도 고려된다. 이러한 모든 요인은 DNA, DNA 전구체, DNA 복제 및 수복, 염색체 조립 및 유지에 대한 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 가장 높다. X선의 선량 범위는 장기간(3 내지 4주간) 동안 1일당 50 내지 200 뢴트겐의 선량으로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량까지의 범위이다. 방사성 동위원소의 선량 범위는 매우 다양하고, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도와 종류, 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
면역요법
당업자는 면역요법이 실시양태의 방법과 조합하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료의 문맥에서, 면역치료제는 일반적으로 암세포를 표적화하여 파괴하기 위해 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙(RITUXAN®)은 이러한 예이다. 면역 이펙터는, 예를 들면, 종양 세포 표면 상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독이 치료의 이펙터 역할을 할 수 있거나, 다른 세포를 동원하여 세포 사멸에 영향을 미칠 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학요법제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합시킬 수 있고, 단순히 표적화제로서 작용할 수 있다. 또는, 이펙터는 종양 세포 표적과 직접적 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다.
면역요법의 일 측면에서, 종양 세포는 표적화에 용이한, 즉 대다수의 다른 세포에는 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 다수의 종양 마커가 존재하고, 이들 중 임의의 것이 본 실시양태의 문맥에서 표적화에 적합할 수 있다. 일반적 종양 마커에는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 포함된다. 면역요법의 다른 측면은 항암 효과와 면역 자극 효과를 조합하는 것이다. IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN 등의 사이토카인, MIP-1, MCP-1, IL-8 등의 케모카인 및 FLT3 리간드 등의 성장 인자를 포함한 면역 자극 분자도 존재한다.
현재 조사 중 또는 사용 중의 면역요법의 예는 면역 애주번트, 예를 들면, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물[참조: U.S. 특허 제5,801,005호 및 제5,739,169호; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998]; 사이토카인 요법, 예를 들면, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF[참조: Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998]; 유전자 요법, 예를 들면, TNF, IL-1, IL-2 및 p53[참조: Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; U.S. 특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호]; 및 모노클로날 항체, 예를 들면, 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2 및 항-p185[참조: Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; U.S. 특허 제5,824,311호]이다. 하나 이상의 항암 요법이 본 명세서에 기재된 항체 요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 면역요법은 면역 체크포인트 억제제일 수 있다. 면역 체크포인트는 신호(예: 공-자극 분자)를 켜거나 신호를 끈다. 면역 체크포인트는 신호(예: 공-자극 분자)를 켜거나 신호를 끈다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 면역 체크포인트 단백질에는 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(CD276으로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), CCL5, CD27, CD38, CD8A, CMKLR1, 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4, CD152로도 공지됨), CXCL9, CXCR5, 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질(GITR), HLA-DRB1, ICOS(CD278로도 공지됨), HLA-DQA1, HLA-E, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 1(IDO1), 킬러-세포 면역글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3, CD223으로도 공지됨), Mer 티로신 키나제(MerTK), NKG7, OX40(CD134라고도 공지됨), 프로그램된 사멸 1(PD-1), 프로그램된 사멸-리간드 1(PD-L1, CD274로도 공지됨), PDCD1LG2, PSMB10, STAT1, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역 수용체(TIGIT), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3), T-세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA, C10orf54로도 공지됨) 및 4-1BB(CD137)가 포함된다. 특히, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적으로 한다.
면역 체크포인트 억제제는 소분자 등의 약물, 리간드 또는 수용체의 재조합 형태, 또는 인간 항체 등의 항체일 수 있다(예: 국제 특허 공보 WO2015/016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252- 264, 2012, 둘 다 참조에 의해 본 명세서에 도입됨). 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제를 사용할 수 있고, 특히 키메라화, 인간화 또는 인간 형태의 항체를 사용할 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 본 개시에서 언급된 특정 항체에는 대안적 및/또는 등가의 명칭이 사용될 수 있다. 이러한 대안적 및/또는 등가의 명칭은 본 개시의 문맥에서 호환가능하다. 예를 들면, 람브롤리주맙은 대안적 및 등가의 명칭 MK-3475 및 펨브롤리주맙으로도 공지되어 있는 것으로 알려져 있다.
일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 리간드 결합 파트너에 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 특정 측면에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PD-L1 및/또는 PD-L2이다. 또 다른 실시양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 이의 결합 파트너에 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 특정 측면에서, PD-L1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 실시양태에서, PD-L2 결합 길항제는 이의 결합 파트너에 대한 PD-L2의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 측면에서, PD-L2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드일 수 있다. 예시적 항체는 미국 특허 제8,735,553호, 제8,354,509호 및 제8,008,449호에 기재되어 있고, 이들 모두는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다. 본 명세서에 제공된 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제는 미국 특허 출원 공개번호 제2014/0294898호, 제2014/022021호 및 제2011/0008369호에 기재된 것과 같이 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이들 모두는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체)이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 면역어드헤신(예를 들면, 불변 영역(예를 들면, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다. 일부 실시양태에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 및 OPDIVO®로도 공지된 니볼루맙은 WO 제2006/121168호에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA® 및 SCH-900475로도 공지된 펨브롤리주맙은 WO 제2009/114335호에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로도 공지된 CT-011은 WO 제2009/101611호에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로도 공지된 AMP-224는 WO 제2010/027827호 및 WO 제2011/066342호에 기재된 PD-L2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
본 명세서에서 제공되는 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 CD152로도 공지된 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 수탁번호 L15006을 갖고 있다. CTLA-4는 T 세포 표면에서 발견되고, 항원 제시 세포의 표면에서 CD80 또는 CD86에 결합하면 "오프" 스위치로서 기능한다. CTLA-4는 T 세포 공-자극 단백질인 CD28과 유사하고, 두 분자 모두가 항원 제시 세포 상에서 각각 B7-1 및 B7-2라고도 하는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA-4는 억제성 신호를 T 세포에 전달하는 반면, CD28은 자극성 신호를 전달한다. 세포내 CTLA-4는 조절성 T 세포에서도 발견되고, 이들의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체와 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제성 수용체인 CTLA-4의 발현을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식된 항-CTLA-4 항체를 사용할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제8,119,129호; PCT 공개공보 WO 제01/14424호, WO 제98/42752호, WO 제00/37504호(CP675,206, 트레멜리무맙으로도 공지됨; 이전에는 티실리무맙); 미국 특허 제6,207,156호; 문헌[참조: Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA, 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology, 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); and Mokyr et al. (1998) Cancer Res, 58:5301-5304]에 개시된 항-CTLA-4 항체를 본 명세서에 개시된 방법에서 사용할 수 있다. 상기 언급된 각각의 간행물의 교시는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다. CTLA-4에 대한 결합에 대해 이러한 당해 기술분야에서 인식되는 항체와 경쟁하는 항체를 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, 인간화 CTLA-4 항체는 국제 특허 출원 WO 제2001/014424호, WO 제2000/037504호 및 미국 특허 제8,017,114호에 기재되어 있고; 이들 모두는 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
예시적 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(10D1, MDX-010, MDX-101, 및 Yervoy®로도 공지됨) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체(예를 들면, WO 제01/14424호 참조)이다. 다른 실시양태에서, 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 일 실시양태에서, 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 상기 언급된 항체와 CTLA-4 상의 동일한 에피토프와 결합 및/또는 결합하기 위해 경쟁한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 갖는다(예를 들면, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95% 또는 99%의 가변 영역 동일성). CTLA-4를 조절하기 위한 기타 분자에는 미국 특허 제5844905호, 제5885796호 및 국제 특허 출원 번호 WO 제1995001994호 및 WO 제1998042752호(이들 모두는 참조에 의해 본 명세서에 도입됨)에 기재된 것과 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체; 미국 특허 제8329867호(이는 참조에 의해 본 명세서에 도입됨)에 기재된 것과 같은 면역어드헤신이 포함된다.
본 명세서에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 CD223으로도 공지된 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3)이다. 인간 LAG-3의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP-002277을 갖는다. LAG-3는 활성화된 T 세포, 자연 킬러 세포, B 세포 및 형질세포양 수지상 세포의 표면에서 발견된다. LAG-3는, 항원 제시 세포의 표면에서 MHC 클래스 II에 결합하면, "오프" 스위치로서 기능한다. LAG-3의 억제는 이펙터 T 세포와 억제제 조절 T 세포를 모두 활성화한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-LAG-3 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-LAG-3 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-LAG-3 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-LAG-3 항체는 렐라틀리맙(BMS-986016으로도 공지됨) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체(예를 들면, WO 제2015/116539호 참조)이다. 다른 예시적 항-LAG-3 항체에는 TSR-033(예를 들면, WO 제2018/201096호 참조), MK-4280 및 REGN3767이 포함된다. MGD013은 WO 제2017/019846호에 기재된 항-LAG-3/PD-1 이중특이성 항체이다. FS118은 WO 제2017/220569호에 기재된 항-LAG-3/PD-L1 이중특이성 항체이다.
본 명세서에서 제공되는 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 C10orf54로도 공지된 V-도메인 Ig T-세포 활성화 억제인자(VISTA)이다. 인간 VISTA의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_071436을 갖는다. VISTA는 백혈구에서 발견되고, T 세포 이펙터 기능을 억제한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-VISTA3 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-VISTA 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-VISTA 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-VISTA 항체는 JNJ-61610588(온바틸리맙으로도 공지됨)이다(예를 들면, WO 제2015/097536호, WO 제2016/207717호, WO 제2017/137830호, WO 제2017/175058호 참조). VISTA는 또한 PD-L1 및 VISTA 모두를 선택적으로 표적화하는 소분자 CA-170으로 억제될 수 있다(예를 들면, WO 제2015/033299호, WO 제2015/033301호 참조).
본 명세서에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)이다. 인간 IDO의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_002155를 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 소분자 IDO 억제제이다. 예시적 소분자에는 BMS-986205, 에파카도스타트(INCB24360) 및 나복시모드(GDC-0919)가 포함된다.
본 명세서에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 CD38이다. 인간 CD38의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_001766을 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CD38 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CD38 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-CD38 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-CD38 항체는 다라투무맙이다(예를 들면, 미국 특허 제7,829,673호 참조).
본 명세서에서 제공되는 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 CD278로도 공지된 ICOS이다. 인간 ICOS의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_036224를 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-ICOS 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-ICOS 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-ICOS 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-ICOS 항체에는 JTX-2011(예를 들면, WO 제2016/154177호, WO 제2018/187191호 참조) 및 GSK3359609(예를 들면, WO 제2016/059602호 참조)가 포함된다.
본 명세서에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역수용체(TIGIT)이다. 인간 TIGIT의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_776160을 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-TIGIT 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-TIGIT 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-TIGIT 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-TIGIT 항체는 MK-7684이다(예를 들면, WO 제2017/030823호, WO 제2016/028656호 참조).
본 명세서에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 CD134로도 공지된 OX40이다. 인간 OX40의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_003318을 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-OX40 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-OX40 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-OX40 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-OX40 항체는 PF-04518600이다(예를 들면, WO 제2017/130076호 참조). ATOR-1015는 CTLA4 및 OX40을 표적화하는 이중특이성 항체이다(예를 들면, WO 제2017/182672호, WO 제2018/091740호, WO 제2018/202649호, WO 제2018/002339호 참조).
본 명세서에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질(GITR)(또한 TNFRSF18 및 AITR로도 공지됨)이다. 인간 GITR의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_004186을 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-GITR 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-GITR 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-GITR 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-GITR 항체는 TRX518이다(예를 들면, WO 제2006/105021호 참조).
본 명세서에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 HAVCR2로도 공지된 T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM3)이다. 인간 TIM3의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_116171을 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-TIM3 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질, 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-TIM3 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-TIM3 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-TIM3 항체에는 LY3321367(예를 들면, WO 제2018/039020호 참조), MBG453(예를 들면, WO 제2015/117002호 참조) 및 TSR-022(예를 들면, WO 제2018/08546호 참조)가 포함된다.
본 명세서에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트 단백질은 CD137, TNFRSF9 및 ILA로도 공지된 4-1BB이다. 인간 4-1BB의 완전한 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 NP_001552를 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-4-1BB 항체(예를 들면, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-4-1BB 항체(또는 이로부터 유래하는 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 또는, 당해 기술분야에서 인식되는 항-4-1BB 항체를 사용할 수 있다. 예시적 항-4-1BB 항체는 PF-05082566(우토밀루맙; 예를 들면, WO 제2012/032433호 참조)이다.
일부 실시양태에서, 면역 요법은 생체외에서 생성된 자가 항원-특이적 T-세포의 전달을 포함하는 입양 면역요법일 수 있다. 입양 면역요법에 사용되는 T 세포는 항원 특이적 T 세포의 확장 또는 유전 공학을 통한 T 세포의 재지시에 의해 생성될 수 있다[참조: Park, Rosenberg et al. 2011]. 종양 특이적 T 세포의 단리 및 전달은 흑색종의 치료에 성공적인 것으로 나타났다. T 세포의 새로운 특이성은 형질전환 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전적 전달을 통해 성공적으로 생성되었다[참조: Jena, Dotti et al. 2010]. CAR은 단일 융합 분자 내의 하나 이상의 신호전달 도메인과 관련된 표적화 모이어티로 이루어진 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 일본쇄 항체(scFv)의 항원 결합 도메인으로 구성되고, 유연한 링커에 의해 연결된 모노클로날 항체의 경쇄 및 가변 단편을 포함한다. 수용체 또는 리간드 도메인을 기반으로 하는 결합 모이어티도 성공적으로 사용되었다. 1세대 CAR에 대한 신호전달 도메인은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마 쇄의 세포질 영역으로부터 유래한다. CAR은 림프종 및 고형 종양을 포함하는 다양한 악성종양으로부터의 종양 세포 표면에서 발현된 항원에 대해 T 세포를 성공적으로 재지시하도록 했다[참조: Jena, Dotti et al. 2010].
일 실시양태에서, 본 출원은 암 치료를 위한 병용 요법을 제공하고, 병용 요법은 입양 T-세포 요법 및 체크포인트 억제제를 포함한다. 일 측면에서, 입양 T-세포 요법은 자가 및/또는 동종이계 T-세포를 포함한다. 또 다른 측면에서, 자가 및/또는 동종이계 T-세포는 종양 항원에 대해 표적화된다. MTAP 폴리펩티드는 입양 T-세포 요법의 투여 전 및/또는 투여와 동시에 환자에게 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 자가 및/또는 동종이계 T-세포는 MTAP 폴리펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다.
수술
암 환자의 약 60%는 예방적, 진단적 또는 병기 분류, 치유적 및 완화적 수술을 포함하는 특정 유형의 수술을 받게 된다. 치유적 수술은 암 조직의 전체 또는 일부를 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴하는 절제를 포함하고, 본 실시양태의 치료, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체 요법 등의 기타 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 지칭한다. 종양 절제 외에, 수술에 의한 치료에는 레이저 수술, 동결 수술, 전기 수술, 현미경 제어 수술(모스 수술) 등이 포함된다.
암 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전체를 절제하면, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사 또는 추가 항암 요법을 수반하는 해당 부위의 국소 적용에 의해 달성할 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월마다 반복할 수 있다. 이러한 치료법은 다양한 복용량을 가질 수 있다.
기타 약제
치료의 치료 효능을 개선하기 위해, 다른 약제를 본 실시양태의 특정 측면과 조합하여 사용할 수 있음이 고려된다. 이러한 추가 약제에는 세포 표면 수용체 및 GAP 접합의 상향조절에 영향을 미치는 약제, 세포증식억제제 및 분화제, 세포 접착 억제제, 아폽토시스 유도제에 대한 과증식성 세포의 감수성을 증가시키는 약제, 또는 기타 생물학적 약제가 포함된다. GAP 접합의 수를 증가시킴으로써 세포간 신호전달의 증가는 인접하는 과증식 세포 집단에 대한 항과증식 효과를 증가시킬 것이다. 다른 실시양태에서, 세포증식억제제 또는 분화제를 본 실시양태의 특정 측면과 조합하여 사용하여, 치료의 항과증식성 효능을 개선할 수 있다. 세포 접착의 억제제는 본 실시양태의 효능을 개선하기 위해 고려된다. 세포 접착 억제제의 예는 초점 접착 키나제(FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 항체 c225 등의 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 감수성을 증가시키는 기타 약제를, 치료 효능을 개선하기 위해 본 실시양태의 특정 측면과 조합하여 사용할 수 있다는 것이 추가로 고려된다.
키트
본 발명의 특정 측면은 치료 키트 등의 키트를 제공할 수 있다. 예를 들면, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 약제학적 조성물 및 임의로 이들의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 이러한 조성물의 투여를 달성하기 위한 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다. 예를 들면, 대상 키트는 암성 종양 내로 조성물의 직접 정맥내 주사를 달성하기 위한 약제학적 조성물 및 카테터를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상 키트는, 전달 장치와 함께 사용하기 위해, 임의로 의약품으로서 제형화되거나 동결건조된 MTAP 폴리펩티드의 사전 충전된 앰플을 포함할 수 있다.
키트는 라벨을 갖는 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기에는, 예를 들면, 병, 바이알 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등의 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 전술한 바와 같은 치료적 또는 비치료적 용도에 효과적인 MTAP 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 유지할 수 있다. 용기의 라벨은 조성물이 특정 요법 또는 비치료적 용도에 사용된다는 것을 나타낼 수 있고, 또한 상기에서 설명한 바와 같은 생체내 또는 시험관내 사용에 대한 지침을 나타낼 수도 있다. 본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기재된 용기 및 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서를 갖는 팩키지 삽입물을 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 재료를 포함하는 하나 이상의 기타 용기를 포함할 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 발명자가 발견한 기술을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시되는 특정 실시양태에서 많은 변화가 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 유사하거나 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1: 정의된 PEG화 및 호모 사피엔스 로부터 MTAP 폴리펩티드의 약리학적 동역학에 대한 이의 영향
MTAP 폴리펩티드 및 PEG에 접합된 MTAP 폴리펩티드가 본 명세서에서 제공된다.
호모 사피엔스 MTAP(hs-MTAP) 효소(서열번호 1)를 정제했다. 호모 사피엔스 MTAP의 MTAP 효소를 암호화하는 개방 판독을 포함하는 DNA 작제물은 IDT 소프트웨어를 사용하여 설계된 이. 콜라이(E. coli) 코돈 최적화 유전자 블록의 중첩 연장 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 작제되었다. 전장 유전자는 N-말단 Ncol 제한 효소 절단 부위, N-말단 His6 태그, 이. 콜라이 코돈 최적화 hs-MTAP 유전자, 정지 코돈 및 C-말단 EcoRI 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 상기 언급된 제한 부위를 사용하여 조립된 DNA 작제물을 pET-28a+ 벡터(Novagen)에 클로닝했다. 이어서, 이 작제물을 사용하여 발현을 위해 BL21(DE3) 이. 콜라이를 형질전환했다. 세포는 50mg/L의 카나마이신을 포함하는 테리픽 브로스(TB) 배지에서 210rpm으로 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 37℃에서 밤새 계속 진탕시키면서 IPTG(0.5mM 최종 농도)를 첨가하여 OD600 약 1.0에 도달했을 때 발현이 유도되었다. 이어서, 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 50mM 인산나트륨(pH 7.4), 300mM NaCl, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드 및 1㎍/mL DNase를 함유하는 용해 완충액에 재현탁시켰다. 용해는 프렌치 프레스에 의해 달성되었고, 용해물은 4℃에서 1시간 동안 20,000×g에서 원심분리하여 미립자를 제거했다. 이어서, 상청액을 5μm 주사기 필터를 통해 여과하고 50mM 인산나트륨(pH 7.4), 300mM NaCl 완충액으로 미리 평형화된 Ni-NT A/아가로스 컬럼(Qiagen)에 적용했다. 컬럼에 용해물을 로딩한 후, 수지를 50mM 인산나트륨(pH 7.4), 300mM NaCl, 20mM 이미다졸 완충액의 5컬럼 용적(CV)으로 세척했다. 이어서, 유속은 1% v/v 트리톤-Xll4를 함유하는 100 CV의 내독소 비함유 PBS(Coming)로 컬럼을 서서히 세척하여 세균 발현 시스템의 전형적 오염물질인 임의의 지다당류(LPS 또는 엔도톡신)를 제거하도록 설정되었다. 이어서, 세척된 효소를 250mM 이미다졸을 포함하는 5 CV의 내독소 비함유 PBS에서 용출시키고, 수지를 내독소 비함유 PBS의 제2 5 CV 부분으로 세정했다. 이때, 효소는 새로운 PBS로 완충액 교환하여 이미다졸을 제거하고, 10% 글리세롤을 첨가했다. 분취량은 -80℃에서 저장하기 위해 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 또는, 효소는 즉시 새로 제조된 멸균 100mM 인산나트륨(pH 8.4)으로 완충액 교환하여 이미다졸을 제거하고 PEG화를 위해 준비시켰다. 효소 순도는 전형적으로 SDS-PAGE 분석을 기반으로 하여 >95%였고, 전형적 수율은 약 65mg/L 배양액의 평균이었다. 단백질 양은 Abs280nm를 측정하고 29,950 M-1cm-1의 계산된 효소 흡광 계수를 사용하여 평가했다.
정제된 내독소 비함유 hs-MTAP 폴리펩티드를 새로 제조된 100mM 인산나트륨(pH 8.4)으로 완전히 완충액 교환하고, 5mg/mL로 농축시켰다. 생성된 용액을 10X, 20X, 50X 또는 100X 몰 과량의 고체 메톡실 PEG 석신이미딜 카보네이트 5000 MW(NOF Corporation)와 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 미반응된 PEG는 100kDa 컷오프 원심분리 여과 장치(Amicon)에서 신선한 내독소 비함유 PBS로 완충액으로 완전히 교환하여 용액에서 제거했다. 내독소 수준은 크로모-LAL 동역학 발색 내독소 시험 키트(Associates of Cape Cod, Inc.)를 사용하여 정량화되었다. 상기 기재된 방식으로 세척된 효소는 전형적으로 정제된 hs-MTAP의 내독소 수준 < 10 EU/mg을 초래했다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, PEG화 물질을 SDS-PAGE 및 겔 밀도측정법에 의해 조사하여 각 반응 조건에 대한 PEG화 정도를 결정했다. 이러한 조건하에, hs-MTAP에 대한 PEG의 비율은 가우스 분포를 따르는 것으로 밝혀졌다. 10X prep은 서브유닛당 약 2 PEG 분자의 모드를 표시하고, 20X prep은 서브유닛당 약 4 PEG 분자의 모드를 표시하고, 50X prep은 서브유닛당 약 6 PEG 분자의 모드를 표시하고, 100X prep은 서브유닛당 약 8 PEG 분자의 모드를 표시했다.
몰배 PEG 과량(즉, 0X, 10X, 20X, 50X 및 100X)으로 정의된 바와 같이, 천연 hs-MTAP 및 차등적으로 PEG화 hs-MTAP 조제물 각각에 대한 동역학은 다른 곳에 기재된 바와 같이 시간 및 기질 농도의 함수로서 분광광도계 검정에 의해 정량화했다[참조: Singh, Shi et al. 2004]. 생성되는 데이터는 더 높은 기질 농도에서 관찰된 2상 선형 속도를 기재하기 위해 추가 2차 속도 상수를 갖는 미카엘리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten equation)에 적합시켰다. 이러한 조건하에, 10X 및 20X prep은 도 1b 및 1c에 도시된 바와 같이, 모든 시험된 기질 농도에서 양호하게 보존된 운동 활성을 나타냈다. 50X 및 100X prep은 도 1d 및 1e에 도시된 바와 같이, 0X prep와 비교하여, 더 낮은 기질 농도에서 감소된 활성을 나타낸다.
PEG화 동역학은 완충액 조성과 pH, 및 PEG 및 단백질 반응물의 농도에 의해 지배된다. 1급 아민 접합 PEG 시약은 비효소적으로 용이하게 가수분해되고; 따라서, 리신 변형을 가능하게 하기 위해 PEG의 큰 몰 과량에 대한 요구 사항이 있다. PEG화 동역학은 또한 단백질 내에서 발견되는 리신 잔기의 수와 표면 노출된 리신 잔기가 묻힌 잔기보다 더 용이하게 반응하는 이들의 국소 환경에 다소 의존할 것이다. 따라서, PEG화되는 소정 단백질에 대한 간단한 경험적 프로세스가 개발되었고, 여기서 반응 조건은 PEG의 목적하는 분포가 확실하게 달성되도록 정의된 pH에서 정의된 완충액 조성물과 함께 정의된 단백질 및 PEG 농도와 함께 사용된다.
이러한 모든 데이터를 고려하여 기질 농도 범위 0-25μM에서 높은 촉매 속도를 보존하는 야생형 hs-MTAP(서열번호 1)의 PEG화에 대한 바람직한 실시양태는 가우스 분포에 따르는 정의된 수의 PEG화 이벤트를 갖는 제형이고, 여기서 단백질의 ≥80%는 3 ± 1 PEG 분자의 모드로 서브유닛당 1, 2, 3, 4 또는 5개의 PEG 분자를 함유하고, 단백질의 약 20%는 0, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 PEG 분자를 갖는다.
실시예 2: 정의된 PEG화 및 호모 사피엔스 로부터 2개 MTAP 폴리펩티드 변이체의 약리학적 동역학의 이의 영향
hs-MTAP 폴리펩티드(서열번호 1)를 코딩하는 유전자는 높은 PEG:단백질 비율에서 효소 활성이 개선된 변이체를 생성하기 위한 출발점으로 사용되었다. PEG화는 hs-MTAP 리신 잔기를 공유적으로 변형시키고, 광범위한 PEG화는 효소 동역학에 부정적 영향을 미치며, 이는 활성 부위 근처의 특정 리신 잔기의 PEG 접합이 촉매 작용에 중요한 도메인 이동에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 활성 부위 근처의 루프에 위치된 다수의 리신 잔기는 중첩 연장 PCR에 의해 아르기닌 잔기로 단독으로 돌연변이되었다. 최종 조립된 PCR 생성물을 NcoI 및 EcoRI로 분해하고, T4 DNA 리가제를 사용하여 pET28a 벡터에 결찰시켰다. 각각의 변이체는 후속적으로 발현되고, 정제되고, 이전에 기재된 바와 같이 100배 몰 과량의 고체 메톡실 PEG 석신이미딜 카보네이트 5000 MW(NOF Corporation)에 접합되었다. 이들 변이체에 대한 반응 동역학은 효소의 천연 및 100X PEG화 형태 모두에 대해 결정되었다. 2개의 변이체(K225R, 서열번호 3; 및 K238R, 서열번호 5)가 동정되었고, 이는 광범위하게 PEG화된 경우에도(도 2a) 모든 기질 농도에서 높은 k cat /K m 을 유지했다(도 2b 및 2c). MTAP-K225R의 k cat /K m 은 1.9×105 M-1s-1이다. MTAP-K238R의 k cat /K m 은 2.3×105 M-1s-1이다. 100X PEG화 MTAP-K225R의 k cat /K m 은 1.9×105 M-1s-1이다. 100X PEG화 MTAP-K238R의 k cat /K m 은 2.3×105 M-1s-1이다.
따라서, hs-MTAP-K225R 및 hs-MTAP-K238R 변이체는 생체내 안정성을 개선하기 위한 리신 PEG화에 의한 제형이 촉매 활성을 손상시키지 않으면서 임의의 목적하는 양의 PEG 접합에서 구현될 수 있다는 점에서 야생형 효소에 대한 개선을 나타낸다.
실시예 3: 암에서 MTAP 돌연변이는 감소된 T-세포 침윤 및 면역요법에 대한 내성과 관련이 있다
메틸티오아데노신 포스포릴라제(MTAP)는 메티오닌 및 퓨린 회수를 위해 메틸티오아데노신(MTA)을 사용하는 하우스키핑 효소이다. 9p21에서 MTAP 유전자의 염색체 결실은 모든 인간 암의 약 15%에서 발생하고, 종양 면역 세포 침윤물 수준의 감소 및 전체 생존 감소를 수반한다. MTAP 유전자좌는 CDKN2A 세포 사이클 억제제 유전자에 인접해 있다. CDKN2A의 결실은 항-PD-L1로 치료된 비소세포 폐암 환자의 무진행 생존율 감소와 관련이 있다. 도 3a. 문헌[참조: Rizvi et al. J Clin Oncol 2018]을 참조한다. CDKN2A 결실은 또한 진행성 요로 상피 세포 암종[참조: Nassar et al, Br. J. Cancer, 2020] 환자의 항 PDL-1 치료에 대한 내성 및 흑색종 환자[참조: Gao et al, Cell, 2016]의 항-CTLA4 요법(이필리무맙)에 대한 내성과 관련이 있다. CDKN2A 돌연변이는 원래 9p21.3 결실과 관련된 암 표현형의 원인인 것으로 생각되었고, MTAP는 방관자 공동-결실로서 사용되었다. 그러나, 증가하는 증거는 MTAP 결실이 종양 형성 또는 촉진에서 CDKN2와 독립적으로 작용할 수 있음을 시사한다. 도 3b에 도시된 바와 같이, MTAP의 호모접합성 또는 헤테로접합성 결실은 CD8A의 계수에 의해 측정된 바와 같이 면역계의 활성화를 유의하게 감소시켰고, CDKN2 결실과 독립적으로 작용한다. MTAP 결실은 또한 세포외 MTA 수준의 증가를 초래한다. 실제로, MTAP가 결실된 암 세포주는 결실이 없는 세포주와 비교하여 배양 배지에서 더 많은 양의 MTA를 생산했다. 문헌[참조: Marjon et al. Cell Report 2016]을 참조한다. 이러한 결과를 설명하는 한 가지 가설은 MTAP -/- 암 세포에 의해 방출된 세포외 MTA가 T-세포에서 PRMT5 아르기닌 메틸트랜스퍼라제를 억제하여 면역 억제를 유도한다는 것이다[참조: Henrich et al, Oncoimmunology. 2016; Strobl et al, Molecular Cancer Therapeutics, 2020].
이러한 데이터를 기반으로 하여, MTAP 결핍 암을 재조합 PEG 접합 MTAP로 치료하는 것을 제안했다. 도 4a에 도시된 바와 같이, PEG화 MTAP는 MTAP 결실을 갖는 암 세포에 의해 방출된 세포외 MTA를 대사하여 메틸티오리보스-1 포스페이트(MTR-1-P) 및 아데닌을 산출한다. 생성되는 세포외 MTA의 감소는 T 세포에서 PRMT5의 억제를 제거하여 이들이 활성화되도록 하고 암을 표적화할 수 있도록 한다. 실제로, 재조합 MTAP 폴리펩티드를 종양 보유 마우스에 첨가하면, 도 4b에 도시된 바와 같이, 24시간에 걸쳐 세포외 MTA 수준이 약 80% 감소되었다. 이러한 결과는 외인성 MTAP를 투여하는 것이 9p23.1에서 MTAP 결실 또는 MTAP 활성에서 다른 감소로 인한 상승된 MTA 수준을 갖는 암을 치료하기 위한 효과적 표적화 요법일 수 있음을 시사한다.
실시예 4: PEG화 MTAP에 의한 암 요법
B16-F10 흑색종 세포를 사용하여 MTAP -/- 세포주 모델을 생성하여 MTAP의 생물학적 기능과 종양에 대한 대사적 및 숙주 면역계에 대한 MTA 축적의 결과를 연구했다. ThermoFisher를 통해 구입된 Cas9 단백질(TrueCut™ Cas9 단백질 v2) 및 합성 단일 가이드 RNA는 리포펙타민(Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9 형질감염 시약)을 사용하여 야생형 B16-F10 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 제한 희석 방법을 사용하여 10개의 96-웰 플레이트에 플레이팅했다. 플레이트를 매일 단일 세포 클론에 대해 검사했다. 컨플루언시에 도달한 후(형질감염 후 10 내지 14일), 동정된 단일 세포 클론을 확장시키고, 웨스턴 블롯팅 또는 Q-PCR을 통해 MTAP 발현에 대해 분석했다. 임의의 MTAP 발현이 결여된 클론은 클로닝 및 서열분석에 의해 유전자 파괴에 대해 검증했다. MTAP 결실 세포주는 본 명세서에 기재된 MTAP 유전자 및 이의 활성, 생화학적 또는 생물학적 활성을 분석하기 위한 임의의 방법 또는 검정에 사용될 수 있다.
PEG화 MTAP 폴리펩티드에 의한 치료는 MTAP 결실을 갖는 종양에 효과적이다. C57/BL6 마우스의 2개 코호트 각각에 5×104 야생형 B16-F10 흑색종 세포 또는 MTAP 결실을 갖는 B16-F10 흑색종 세포를 피하 접종했다. 종양이 55mm3의 평균 크기에 도달했을 때, 마우스를 비히클(PBS) 또는 50mg/kg의 PEG-MTAP 폴리펩티드로 2주 동안 종양 주변 주사에 의해 1주 3회 처리했다. PEG-MTAP는 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 대조군 MTAP +/+ 종양에 거의 영향을 미치지 않았지만, MTAP -/- 종양의 성장을 유의하게 억제했다. 실제로, MTAP -/- 종양을 갖는 마우스 7마리 중 3마리에서 완전한 관해(CR)가 관찰되었다. 이러한 관찰과 일치하게, PEG-MTAP는 도 5c에 도시된 바와 같이, B16-F10 MTAP -/- 종양을 갖는 마우스의 생존을 증가시켰다.
CD8+ T-세포는 도 6에 도시된 바와 같이 PEG-MTAP에 의한 효과적 치료에 필요하다. C57/BL6 마우스는 MTAP 결실을 갖는 5×104 B16-F10 흑색종 세포로 피하 접종했다. 종양이 55mm3의 평균 크기에 도달했을 때, 마우스를 2주 동안 종양 주변 주사에 의해 50mg/kg의 MTAP의 존재 또는 부재하에 대조군 이소형 항체 또는 항-CD8 항체로 처리했다. 이전과 같이, MTAP 치료는 종양 성장을 지연시켰고 6마리 중 2마리의 마우스가 완전 관해(CR)를 달성했다(도 6a 및 6c). 항-CD8 항체를 사용한 CD8+ T-세포의 고갈은 대조군 마우스에서 종양 성장을 증강시켰고(도 6b), MTAP 폴리펩티드의 유익한 효과를 차단했다(도 6d). 이러한 결과는 MTAP를 투여함으로써 MTA가 종양 미세환경에서 고갈될 때 CD8+ T-세포가 종양 성장을 감소시킬 수 있음을 시사한다. 실시예 2에 기재된 PEG화 MTAP 변이체에 대해서도 유사한 결과가 예상될 것이다.
PEG-MTAP 치료는, 도 7에 도시된 바와 같이, CD8+/K167+, CD4+/K167+ 및 CD8+/그랜자임B+ T-세포를 포함하는 종양 미세환경에서 더 많은 수의 종양 침윤성 림프구를 초래한다. T-세포 증식 상태는 또한 PEG-MTAP를 사용한 생체내 치료시 구출된다. 실시예 2의 PEG화 MTAP 변이체에 대해서도 유사한 결과가 예상될 것이다.
PEG-MTAP에 의한 치료는 또한 B16-F10 흑색종 동종이식편의 면역 세포 침윤을 증가시킨다. B16-F10 MTAP -/- 종양 샘플을 보유하는 C57/BL6 마우스로부터의 FACS 분석에 의해 관찰된 림프구 패널을 2회 투여량의 PEG-MTAP 또는 비히클(투여 후 24시간 분석됨)로 치료한 후에 평가했다. 치료된 그룹은 비히클 처리된 대조군과 비교하여 CD4+ T 세포 및 NK1.1+ 자연 킬러 세포의 백분율의 대폭 증가 및 증식성 CD8+ 그랜자임 B+ T 세포의 백분율의 대폭 증가를 나타냈다(도 8a-c). 실시예 2에 기재된 PEG화 MTAP 변이체에 대해서도 유사한 결과가 예상될 것이다.
실시예 5: MTA 분해에 의한 L1210 마우스 백혈병 동종이식편의 치료
살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 효소인 메틸티오아데노신 뉴클레오시다제(MTAN)도 MTA를 대사한다. DBA/2 마우스(n = 17)는 5×104 세포의 매우 공격적 L1210 뮤린 백혈병 세포주를 피하 옆구리 주사로 각각 접종했다. 종양이 추가의 8일 동안 확립되도록 한 후(종양 평균 = 90mm3), 마우스를 2개 그룹으로 분할했다. 대조군(n=8)은 종양이 >2500mm3 크기에 도달할 때까지 3일마다 종양 주변 주사에 의해 PBS 비히클 대조군으로 처리했다. 실험군(n=9)은 종양이 >2500mm3 크기의 종점에 도달할 때까지 3일마다 종양 주변 주사에 의해 50mg/kg의 활성 PEG-se-MTAN을 사용한 것을 제외하고 동일한 방식으로 처리했다. L1210 백혈병 종양의 성장 속도는 비히클 대조군과 비교하여 PEG-se-MTAN이 투여된 치료군에서 유의하게(3.5배) 감소되어(도 9a), 통계적으로 유의한 수명 연장, p< 0.0035를 초래했다(도 9b). 실시예 2에 기재된 PEG화 MTAP 변이체에 대해서도 유사한 결과가 예상될 것이다.
PEG-se-MTAN은 또한 L1210 마우스 백혈병 동종이식편으로 림프구 침윤을 증가시켰다. PEG-MTAN 또는 비히클 대조군의 3회 치료 후 L1210 동종이식편을 보유하는 DBA/2 마우스의 종양 및 종양 배수 림프절(TDLN)로부터 FACS 분석에 의해 관찰된 림프구 패널을 평가했다. PEG-MTAN 투여는 시험관내 관찰과 일치하는 CD4+ 및 특히 CD8+ T 세포에서 대폭 증강된 증식과 함께 종양 침윤성 림프구(TIL)의 집단에서 대폭 증가를 초래했다(도 10a-c). 매우 중요하게는, 치료된 TDLN은 또한 T 세포의 대폭 증가 및 증강된 T 세포 활성화를 나타내는 골수 유래 세포의 감소된 집단(도 10d-f)을 나타냈다. 실시예 2의 PEG화 MTAP 변이체에 대해서도 유사한 결과가 예상될 것이다.
실시예 6: 뮤린 4T1 유방 암종 동종이식편의 PEG- MTAN /항- CTLA4 치료의 효능
ADO의 고갈 및 항-CTLA4 항체 면역 체크포인트 억제와 조합하여 종양 성장을 제어하는 효능을 평가하기 위해, BALB/C 마우스의 4개 코호트에 유선 지방 패드에 50,000개의 4T1 세포를 접종하고 종양을 확립하도록 했다. 4T1은 종양 미세환경에서 ADO를 가질 것으로 예상되지만, MTA는 그렇지 않은 MTAP고 CD73+ 종양 모델이다. 마우스를 비히클, PEG-MTAN(50mg/kg), 항-CTLA4 항체(10mg/kg, 클론 UC10-4F10-11, Bio X Cell), 또는 PEG-MTAN/항-CTLA4 항체의 조합으로 치료했다. PEG-MTAN 및 항-CTLA4 단일 약제 아암은 모두 원발성 종양 성장을 지연시켰고, 조합은 더 효과적이었고, 적어도 치료적 부가성을 나타낸다(도 11a). 4T1이 폐 전이를 형성함에 따라, 폐 조직을 조사하여 종양 콜론화를 정량화했다. 모든 처리된 그룹은 비히클 대조군과 비교하여 상당히 더 적은 전이성 종양 폐 결절을 나타냈고(도 11b), 전이시 ADO의 역할을 예시한다. 실시예 2의 PEG화 MTAP 변이체에 대해서도 유사한 결과가 예상될 것이다.
실시예 7: 뮤린 CT26 결장 암종 동종이식편(MTAP 저 CD73+)의 PEG- MTAN 폴리펩티드/항-PD-1 항체 치료의 효능
CT26 세포주는 일반적으로 MTAP와 함께 공동 결실되는 CDKN2에 대한 호모접합성 null로 공지되어 있지만[참조: Castle et al, 2014]; MTAP가 결실되지 않은 동안, 이의 발현은 심각하게 손상되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 세포주는 CD73을 발현하고[참조: Sun et al, 2017], 따라서 종양 미세환경에서 아데노신을 생성할 것으로 예상된다. MTAP저 CD73+ 종양 모델에서 ADO 및/또는 MTA 고갈의 임의의 잠재적 효능을 단일 작용제로서 또는 항-PD-1 항체 면역 체크포인트 억제제 요법과 조합하여 조사하기 위해, CT26 종양을 보유하는 Balb/c 마우스의 4개 그룹을 이소형 대조군 항체, PEG-MTAN 폴리펩티드(50mg/kg 3×주), 항-PD-1 항체(클론 RMP1-14, BioXCell # BE0146, 10mg/kg 2×주), 또는 PEG-MTAN 및 항-PD-1 조합으로 총 2주 동안 처리했다. 대조군과 비교하여, 항-PD-1 항체 및 PEG-MTAN 폴리펩티드 둘 모두는 이분산 효과를 유도했지만, 중요하게는 두 단일 약제 아암에서 완전한 관해(CR)를 산출했다. 현저하게도, 항-PD-1/PEG-MTAN 조합은 전체 그룹에서 종양 성장 억제를 나타냈고, 부가적 또는 상승적 효능을 시사하는 3개의 완전한 반응(도 12a-d)을 유도했다.
실시예 2의 PEG화 MTAP 변이체에 대해서도 유사한 결과가 예상될 것이다. 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 결함이 암 또는 질환에 기여하는 경우 다른 암 또는 질환도 본 명세서에 기재된 치료에 의해 표적화될 수 있다.
실시예 8: CT26 동종이식편 종양에 대한 고도로 PEG화 PEG- MTAP 폴리펩티드의 효능
CT26 종양을 보유하는 Balb/c 마우스의 2개 그룹을 PBS 또는 실시예 2의 고도로 PEG화 MTAP K238 변이체 폴리펩티드의 50mg/kg 3×주로 처리했다. 고도로 PEG화 MTAP K238 변이체는 종양 성장을 감소시켰고, 6마리의 처리된 마우스 중 2마리에서 완전한 관해를 야기했다(도 13).
실시예 9: MTAP 폴리펩티드의 동역학적 파라미터를 측정하기 위한 검정
MTAP 폴리펩티드에 의한 MTA 분해 및 아데닌 생산의 동역학적 파라미터를 측정하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
MTAP 폴리펩티드 또는 PEG화된 MTAP 폴리펩티드의 동역학적 파라미터는 분광광도계 검정에 의해 정량화되고, 여기서 효소 기질인 MTA의 최대 흡광도 감소는 다른 곳에서 기재된 바와 같이[참조: Singh et al, 2004] 시간의 함수로서 모니터링된다. MTA 용액은 PBS(pH 7.4)에서 제조되어 6mM 내지 200pM 범위의 최종 농도를 초래한다. MTA는 275nm에서 λmax에서 분해 생성물인 아데닌과 흡광 계수의 차이가 1,600M-1cm-1인 반면, 반응의 다른 생성물인 메틸티오리보스-1'-포스페이트/메틸티오리보스는 275nm에서 눈에 띄게 흡수되지 않는다. 반응은 효소 용액(최종 농도: -10nM)을 기질 용액과 함께 첨가하여 신속하게 혼합하고, 경시적으로 275nm에서 흡광도를 측정하여 37℃에서 기질 MTA의 손실을 모니터링함으로써 개시된다. 생성되는 데이터는 동역학적 상수를 결정하기 위해 처리되고 미카엘리스-멘텐 방정식에 적합시킨다. 동역학적 파라미터, 예를 들면, V max , V 0 , kcat , K M , 이들의 유도체 등이 계산된다.
실시예 10: MTase 폴리펩티드의 동역학적 안정성
실시예 1 및 2의 PEG화 hs-MTAP 폴리펩티드 및 실시예 5의 PEG화 se-MTAN의 동역학적 안정성은 37℃에서 100mM 인산 완충액(pH 7.4)에서 효소를 인큐베이팅하여 결정했다. 4일 동안 MTAP 폴리펩티드의 분취량을 인큐베이션으로부터 회수하고, 실시예 9에 기재된 바와 같이 MTA를 분해하는 능력에 대해 평가했다. 생성되는 데이터를 처리하고 지수 방정식에 적합시켜 감소 속도를 결정했다. 이러한 조건하에서, 실시예 2의 PEG화 hs-MTAP 폴리펩티드는 57시간의 반감기(T1/2)를 갖는 것으로 밝혀졌고, 실시예 5의 se-MTAN은 56시간의 유사한 T1/2를 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 11: MTase 폴리펩티드의 생체내 안정성
MTAP 폴리펩티드 또는 PEG-MTAP 폴리펩티드의 생체내 안정성은 포유동물 또는 인간 대상체에 대한 폴리펩티드의 정맥내 주사로 결정된다. 혈액 샘플은 다양한 시점에서 수집된다. ELISA 검정은 혈장 또는 혈청내 폴리펩티드의 양을 정량화하기 위해 사용된다. 혈청 반감기는 폴리펩티드의 농도가 대상체에 주사 후 절반으로 저하되는 시간으로 결정된다.
본 명세서에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시양태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 방법 및 단계에 또는 방법의 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 약제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안 본 명세서에 기재된 약제를 대체할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 치환체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
이하의 참고문헌은 이들이 본 명세서에 기재된 것들을 보완하는 예시적 절차 또는 기타 상세를 제공하는 범위에서 참조에 의해 본 명세서에 구체적으로 도입된다.
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Figure pct00003
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SEQUENCE LISTING <110> Board of Regents, The University of Texas System <120> IMPROVED HUMAN METHYLTHIOADENOSINE/ADENOSINE DEPLETING ENZYME VARIANTS FOR CANCER THERAPY <130> UTFB.P1227WO <140> not yet known <141> 2021-01-06 <150> US 62/958,161 <151> 2020-01-07 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Met Arg Pro Gln Ser Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 His Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala 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Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Thr Arg Pro Gln Thr Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 Arg Ser Cys Ser Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Leu Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ser Glu Ser Ile Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Ile Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Leu Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Met Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 260 265 270 Met Ala Gln Phe Ser Val Leu Leu Pro Arg His 275 280 <210> 24 <211> 283 <212> PRT <213> Castor canadensis <400> 24 Met Ala Leu Ser Ala Ala Gly Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Ser Ile Arg Pro Gln Thr Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 His Ser Cys Ser Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Val Val Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Phe Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Ile Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Ile Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Ile Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Met Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 260 265 270 Met Ala Gln Phe Ser Val Leu Leu Pro Arg His 275 280 <210> 25 <211> 283 <212> PRT <213> Chrysochloris asiatica <400> 25 Met Ala Ser Gly Ala Ala Thr Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Asp Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Gln Gly Cys Thr His Ile Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Ile Leu Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Ser Ile Arg Pro Gln Thr Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 Arg Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Ile Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Phe Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Ile Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Lys Val Leu Lys Asn Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Met Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 260 265 270 Met Ala Gln Phe Ser Val Leu Val Pro Arg His 275 280 <210> 26 <211> 283 <212> PRT <213> Myotis lucifugus <400> 26 Met Ala Ser Gly Ala Thr Leu Pro Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Met Arg Pro Gln Thr Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 His Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Thr Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Tyr His Ser Lys Gly Thr Met Leu Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Ile Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Leu Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Val Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Met Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 260 265 270 Met Ala Gln Phe Ser Val Leu Leu Pro Arg His 275 280 <210> 27 <211> 283 <212> PRT <213> Pteropus alecto <400> 27 Met Val Pro Gly Ala Ser Pro Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Thr Arg Pro Gln Thr Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 His Pro Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Leu Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Phe Met Phe Arg Gly Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Leu Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Met Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 260 265 270 Met Ala Gln Phe Ser Val Leu Leu Pro Arg His 275 280 <210> 28 <211> 283 <212> PRT <213> Tupaia chinensis <400> 28 Met Ala Ser Gly Ala Ala Asn Asn Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu 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Loxodonta africana <400> 29 Met Ala Ser Ser Ala Ala Thr Thr Thr Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Val Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Thr Arg Pro Gln Thr Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 Arg Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Ile Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Leu Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 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Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 His Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Val Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Val Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Phe Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Ile Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Met Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 260 265 270 Met Ala His Phe Ser Val Leu Leu Pro Arg His 275 280 <210> 31 <211> 280 <212> PRT <213> Mandrillus leucophaeus <400> 31 Met Ala Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Met Arg Pro Gln Ser Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 His Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Val Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Phe Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Ile Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Thr Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Val 260 265 270 Arg Ser Ala Phe Tyr Leu Leu Pro 275 280 <210> 32 <211> 283 <212> PRT <213> Eptesicus fuscus <400> 32 Met Ala Ser Gly Ala Thr Pro Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Ala Met Arg Pro Gln Thr Phe Tyr Asp Gly Asn 115 120 125 His Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Tyr His Ser Lys Gly Thr Val Leu Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Ile Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Leu Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Val Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Met Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 260 265 270 Met Ala Gln Phe Ser Val Leu Leu Pro Arg His 275 280 <210> 33 <211> 334 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 33 Met Ala Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Met Arg Pro Gln Ser Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 His Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Val Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Phe Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Ile Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Thr Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Met 260 265 270 Ile Lys Phe Gln Met Ile Leu Ser Glu Gly Tyr His Pro Phe Asn Ile 275 280 285 Gln Glu Ser Pro Phe Tyr Arg Gly Leu Leu Asp Phe Pro Ser Val Gly 290 295 300 His Gly Arg Gly Glu Ile Leu Pro Leu Ser Pro Leu Asp Leu Ala Gly 305 310 315 320 Tyr Cys Phe Gln Gln Pro Met Gln Pro Pro Cys Pro Asp Ser 325 330 <210> 34 <211> 280 <212> PRT <213> Nomascus leucogenys <400> 34 Met Ala Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Val Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Met Arg Pro Gln Ser Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 His Ser Cys Ala Arg Gly Val Cys His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Met Val Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Phe Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Ile Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Arg Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Thr Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Val 260 265 270 Arg Ser Ala Val Gln Leu Pro Pro 275 280 <210> 35 <211> 283 <212> PRT <213> Trichechus manatus latirostris <400> 35 Met Ala Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Val Lys Ile Gly Ile Ile Gly 1 5 10 15 Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Lys 20 25 30 Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys Pro Ser Asp Ala Leu Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Ile Lys Asn Val Asp Cys Val Leu Leu Ala Arg His Gly Arg Gln 50 55 60 His Thr Ile Met Pro Ser Lys Val Asn Tyr Gln Ala Asn Ile Trp Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Glu Gly Cys Thr His Val Ile Val Thr Thr Ala Cys Gly 85 90 95 Ser Leu Arg Glu Glu Ile Gln Pro Gly Asp Ile Ile Ile Ile Asp Gln 100 105 110 Phe Ile Asp Arg Thr Thr Val Arg Pro Gln Thr Phe Tyr Asp Gly Ser 115 120 125 Cys Ser Ser Ala Arg Gly Val Gly His Ile Pro Met Ala Glu Pro Phe 130 135 140 Cys Pro Lys Thr Arg Glu Val Leu Ile Glu Thr Ala Lys Lys Leu Gly 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Lys Gly Thr Val Ile Thr Ile Glu Gly Pro Arg 165 170 175 Phe Ser Ser Arg Ala Glu Ser Leu Met Phe Arg Thr Trp Gly Ala Asp 180 185 190 Val Ile Asn Met Thr Thr Val Pro Glu Val Val Leu Ala Lys Glu Ala 195 200 205 Gly Val Cys Tyr Ala Ser Ile Ala Met Ala Thr Asp Tyr Asp Cys Trp 210 215 220 Lys Glu His Glu Glu Ala Val Ser Val Asp Lys Val Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Lys Glu Asn Ala Asn Lys Ala Lys Ser Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro 245 250 255 Gln Ile Gly Ser Met Glu Trp Ser Glu Thr Leu His Asn Leu Lys Asn 260 265 270 Met Ala Gln Phe Ser Val Leu Leu Pro Arg His 275 280

Claims (77)

  1. 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 폴리펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 접합 부위(conjugate site)를 제거하도록 조작되어 있는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 1의 적어도 100개의 연속 아미노산에 대해 적어도 80%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 트레오닌(Threonine) 18, 트레오닌 197, 세린(Serine) 178, 발린(Valine) 233 및 메티오닌(Methionine) 196에 상응하는 아미노산을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제1 리신(lysine) 또는 제1 시스테인을 포함하는, 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 서열번호 1의 리신(Lysine) 225에 상응하는 아미노산이 접합 부위를 제거하도록 조작되는, 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 서열번호 1의 리신 238에 상응하는 아미노산이 접합 부위를 제거하도록 조작되는, 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 리신 225에 상응하는 아미노산 또는 상기 리신 238에 상응하는 아미노산이 아르기닌으로 치환되는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해(phosphorolysis)를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km이 적어도 1.5×105 M-1s-1인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km이 약 1.5×105 M-1s-1 내지 3.0×105 M-1s-1인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km이 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 Vmax의 적어도 50%인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Vmax가 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 Vmax의 적어도 50%인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Km이 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 Km의 2배 이하인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩티드에 접합된 적어도 하나의 중합체를 포함하는 조성물로서, 상기 중합체는 비접합된(unconjugated) 폴리펩티드와 비교하여 상기 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 적어도 하나의 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 5000kDa의 평균 분자량을 갖는, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 약 500kDa 내지 약 1000kDa, 약 800kDa 내지 약 1600kDa, 약 1500kDa 내지 약 3000kDa, 약 2000kDa 내지 약 4000kDa, 약 2500kDa 내지 약 5000kDa, 약 3000kDa 내지 약 6000kDa, 약 4,000kDa 내지 약 8,000kDa, 약 6,000kDa 내지 약 12,000kDa, 약 10,000kDa 내지 약 20,000kDa, 또는 약 20,000kDa 내지 약 30,000kDa의 평균 분자량을 갖는, 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 중합체가 상기 폴리펩티드의 제2 리신 또는 제2 시스테인에 접합되는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 집단(population)을 포함하는 조성물로서, 상기 집단은 상기 폴리펩티드의 삼량체(trimer)를 포함하는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 폴리펩티드의 적어도 80%가 상기 적어도 하나의 중합체를 포함하는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 적어도 80%가 상기 적어도 하나의 중합체 중의 적어도 3개를 포함하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 적어도 80%가 상기 적어도 하나의 중합체 중의 적어도 6개를 포함하는, 조성물.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드당 중합체의 수가 가우스 분포(Gaussian distribution)를 포함하는, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 가우스 분포가 폴리펩티드당 2±1, 3±1, 4±1, 또는 6±1 중합체의 모드(mode)를 갖는, 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 가우스 분포가 폴리펩티드당 8±3 중합체의 모드를 갖는, 조성물.
  24. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km이 적어도 1.5×105 M-1s-1인, 조성물.
  25. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km이 약 1.5×105 M-1s-1 내지 3.0×105 M-1s-1인, 조성물.
  26. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸티오아데노신의 메틸티오리보스-포스페이트 및 아데닌으로의 가인산분해를 위한 상기 폴리펩티드의 Kcat/Km이 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 Vmax의 적어도 50%인, 조성물.
  27. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 상기 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 Vmax가 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 상기 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 Vmax의 적어도 50%인, 조성물.
  28. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 상기 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 Km이 서열번호 1을 포함하는 메틸티오아데노신 포스포릴라제의 상기 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성의 Km의 2배 이하인, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 펩티드 세그먼트(heterologous peptide segment)를 추가로 포함하는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 이종 펩티드 세그먼트가 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함하는, 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 표적화 모이어티가 항체 또는 이의 단편, 또는 펩티드를 포함하는, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩티드를 암호화(encoding)하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  33. 제32항에 있어서, 상기 핵산이 세균, 진균, 곤충 또는 포유동물에서의 발현을 위해 코돈 최적화(codon optimizing)되는, 핵산.
  34. 제33항에 있어서, 상기 핵산이 세균에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는, 핵산.
  35. 제34항에 있어서, 상기 세균이 이. 콜라이(E. coli)인, 핵산.
  36. 제32항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 4 및 6 중의 하나에 따른 서열을 포함하는, 핵산.
  37. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항의 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터(expression vector).
  38. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항의 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 숙주 세포가 세균 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  40. 제39항에 있어서, 상기 세균 세포가 이. 콜라이 세포인, 숙주 세포.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 상기 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체 중에 포함하는, 약제학적 제형.
  42. 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서,
    메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 유효량의 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩티드가 적어도 36시간의 혈청 반감기를 갖는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 조성물이 제41항의 상기 약제학적 제형인, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 환자가 이전에 상기 종양으로 진단된 환자인, 방법.
  45. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 환자가 고형 종양(solid tumor)을 갖는, 방법.
  46. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 종양이 혈액학적 종양(hematological tumor)을 포함하는, 방법.
  47. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 종양이 흑색종(melanoma)을 포함하는, 방법.
  48. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 종양이 유방 암종(breast carcinoma)을 포함하는, 방법.
  49. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 종양이 결장 암종(colon carcinoma)을 포함하는, 방법.
  50. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 종양이 골육종(osteosarcoma), 췌장암(pancreatic cancer), 척색종(chordoma), 중피종(mesothelioma), T-세포 ALL, 신경교종(glioma), 신세포 암종(renal cell carcinoma), 흑색종(melanoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 담낭암(gallbladder cancer), 위암(gastric cancer), 또는 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)을 포함하는, 방법.
  51. 제42항에 있어서, 상기 종양이 MTAP 결실을 갖는, 방법.
  52. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 참조 수준과 비교하여 감소된 수준의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 폴리펩티드를 갖는, 방법.
  53. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 참조 수준과 비교하여 감소된 수준의 메틸티오아데노신 포스포릴라제 활성을 갖는, 방법.
  54. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 CD73을 갖는, 방법.
  55. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 CD39를 갖는, 방법.
  56. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 MTA를 갖는, 방법.
  57. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양이 참조 수준과 비교하여 증가된 수준의 ADO를 갖는, 방법.
  58. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 수준이 건강한 대상체(subject)에서의 수준인, 방법.
  59. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 수준이 상기 환자의 건강한 조직에서의 수준인, 방법.
  60. 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간 환자인, 방법.
  61. 제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 종양내로, 정맥내로, 피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 안내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심낭내로, 배꼽내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접 입욕시키는 국소 관류에 의해, 카테터(catheter)를 통해, 또는 세정(lavage)을 통해 투여되는, 방법.
  62. 제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 면역요법에 대한 감수성(sensitivity)을 증가시키는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 환자가 이전에 면역 체크포인트 억제제의 투여에 반응하지 않았던, 방법.
  64. 제42항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 제2 항암 요법이 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 동결 요법(cryotherapy), 호르몬 요법, 면역 요법 또는 사이토카인 요법을 포함하는, 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 제2 항암 요법이 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체가 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, BMS-036559 또는 CK-301을 포함하는, 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 항-PD1 항체를 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 항-PD1 항체가 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-223, AMP-514, 세미플리맙 또는 PDR-001을 포함하는, 방법.
  71. 제66항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 항-CTLA-4 요법이 이필리무맙 또는 트레멜리무맙을 포함하는, 방법.
  73. 제66항에 있어서, 상기 제2 항암 요법이 입양(adoptive) T-세포 요법을 포함하는, 방법.
  74. 제74항에 있어서, 상기 입양 T-세포 요법이 상기 MTAP 효소의 상기 투여 후에 투여되는, 방법.
  75. 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 MTAP 효소를 발현하도록 조작되는 T-세포를 포함하는 입양 T-세포 요법을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제42항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암의 전이가 지연, 감소 또는 예방되는, 방법.
  77. 종양을 갖는 환자에게 치료적 적용을 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 상기 MTAP 효소, 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제41항의 약제학적 조성물의 용도.
KR1020227024213A 2020-01-07 2021-01-06 암 치료를 위한 개선된 인간 메틸 티오아데노신/아데노신 고갈 효소 변이체 KR20220124718A (ko)

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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220124718A (ko) 2020-01-07 2022-09-14 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 치료를 위한 개선된 인간 메틸 티오아데노신/아데노신 고갈 효소 변이체
CN116313062B (zh) * 2023-05-18 2023-07-21 四川省肿瘤医院 一种肺腺癌预后模型

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
US4870287A (en) 1988-03-03 1989-09-26 Loma Linda University Medical Center Multi-station proton beam therapy system
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5329028A (en) 1992-08-05 1994-07-12 Genentech, Inc. Carbohydrate-directed cross-linking reagents
US5801029A (en) 1993-02-16 1998-09-01 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
JPH08506247A (ja) 1993-07-09 1996-07-09 アムジェン ボールダー インコーポレイテッド 組換えｃｔｌａ４ポリペプチドおよびその製造方法
US6911309B2 (en) * 1993-12-29 2005-06-28 The Regents Of The University Of Californnia Nucleic acids encoding MTAse
GB9506466D0 (en) 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
US6870037B1 (en) 1995-07-03 2005-03-22 Arch Development Corporation Methylthioadenosine phosphorylase compositions and methods of use in the diagnosis and treatment of proliferative disorders
US5760395A (en) 1996-04-18 1998-06-02 Universities Research Assoc., Inc. Method and apparatus for laser-controlled proton beam radiology
US5739169A (en) 1996-05-31 1998-04-14 Procept, Incorporated Aromatic compounds for inhibiting immune response
US5844905A (en) 1996-07-09 1998-12-01 International Business Machines Corporation Extensions to distributed MAC protocols with collision avoidance using RTS/CTS exchange
WO1998042752A1 (en) 1997-03-21 1998-10-01 Brigham And Women's Hospital Inc. Immunotherapeutic ctla-4 binding peptides
UA76936C2 (en) 1998-12-23 2006-10-16 Pfizer Human monoclonal antibody binding the antigen-4 of cytotoxic t-lymphocyte (ctla-4), nucleic acid, cell line, method of obtaining transgenic mammal, method to increase producing il-2 or ifn-? in the t-cells of a patient, method to treat and pharmaceutical composition used in treatment of cancer, inflammation or autoimmune disease, including the antibody
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
DE60033530T2 (de) 1999-08-24 2007-10-31 Medarex Inc. Humane antikörper gegen ctla-4 und deren verwendungen
CN1321765A (zh) 2000-04-29 2001-11-14 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人甲硫基腺苷磷酸化酶37和编码这种多肽的多核苷酸
US7183388B2 (en) 2001-03-30 2007-02-27 The Regents Of The University Of California Anti-MUC-1 single chain antibodies for tumor targeting
CA2516191A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Salmedix, Inc Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers
US20070207158A1 (en) 2003-06-17 2007-09-06 Harrison Roger G Conjugate for the specific targeting of anticancer agents to tumor cells or tumor vasculature and production thereof
KR20070111542A (ko) 2005-03-09 2007-11-21 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 치료유전자의 종양-특이적, 발현 고효율을 위한 신규한ｈＴＭＣ 프로모터 및 벡터
ES2716874T3 (es) 2005-03-23 2019-06-17 Genmab As Anticuerpos contra cd38 para el tratamiento del mieloma múltiple
PT2343320T (pt) 2005-03-25 2018-01-23 Gitr Inc Anticorpos anti-gitr e as suas utilizações
EP1896582A4 (en) 2005-05-09 2009-04-08 Ono Pharmaceutical Co HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES FOR PROGRAMMED DEATH 1 (MP-1) AND METHODS FOR TREATING CANCER USING ANTI-MP-1 ANTIBODIES ALONE OR ASSOCIATED WITH OTHER IMMUNOTHERAPIES
GB0620715D0 (en) 2006-10-18 2006-11-29 Univ Durham Ethanol production
CN102131828B (zh) 2007-06-18 2015-06-17 默沙东有限责任公司 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体
DK2242773T3 (en) 2008-02-11 2017-09-25 Cure Tech Ltd Monoclonal antibodies for tumor treatment
WO2009114335A2 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Merck & Co., Inc. Pd-1 binding proteins
WO2010014784A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-ctla4 antibody with diverse therapeutic regimens for the synergistic treatment of proliferative diseases
WO2010098788A2 (en) 2008-08-25 2010-09-02 Amplimmune, Inc. Pd-i antagonists and methods for treating infectious disease
EP2504028A4 (en) 2009-11-24 2014-04-09 Amplimmune Inc SIMULTANEOUS INHIBITION OF PD-L1 / PD-L2
WO2011103584A2 (en) 2010-02-19 2011-08-25 Xencor, Inc. Novel ctla4-ig immunoadhesins
PL2614082T3 (pl) 2010-09-09 2019-02-28 Pfizer Inc. Cząsteczki wiążące 4-1BB
EP2506015A1 (en) 2011-04-01 2012-10-03 Universität Regensburg A prognostic and therapeutic signature for malignant melanoma
CN104619722B (zh) 2012-06-22 2022-10-04 达特茅斯大学理事会 新型vista-ig构建体和vista-ig用于治疗自身免疫性、过敏性和炎性疾病的用途
JP2014022858A (ja) 2012-07-17 2014-02-03 Murata Mfg Co Ltd 電力増幅器
US9308236B2 (en) 2013-03-15 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic inhibitors of the PD-1/PD-L1 and CD80(B7-1)/PD-L1 protein/protein interactions
WO2015016718A1 (en) 2013-08-02 2015-02-05 Bionovion Holding B.V. Combining cd27 agonists and immune checkpoint inhibition for immune stimulation
PT3041828T (pt) 2013-09-06 2018-10-09 Aurigene Discovery Tech Ltd Derivados 1,3,4-0xadiazoles como imonomoduladores
KR102362277B1 (ko) 2013-09-06 2022-02-11 오리진 디스커버리 테크놀로지스 리미티드 면역조절제로서 1,2,4-옥사디아졸 유도체
CA3078121A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Beigene Switzerland Gmbh Anti-pd1 antibodies and their use as therapeutics and diagnostics
CA2935378C (en) 2013-12-24 2023-04-18 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista antibodies and fragments
ES2902369T3 (es) 2014-01-28 2022-03-28 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-LAG-3 para tratar neoplasias malignas hemáticas
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
TWI790593B (zh) 2014-08-19 2023-01-21 美商默沙東有限責任公司 抗tigit抗體
WO2016038550A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Novartis Ag Inhibition of prmt5 to treat mtap-deficiency-related diseases
WO2016059602A2 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Glaxo Group Limited Methods of treating cancer and related compositions
SG11201707769VA (en) 2015-03-23 2017-10-30 Jounce Therapeutics Inc Antibodies to icos
EP3722314A1 (en) 2015-06-24 2020-10-14 Janssen Pharmaceutica NV Anti-vista antibodies and fragments
MX2018001227A (es) 2015-07-30 2018-03-26 Macrogenics Inc Moleculas de union a pd-1 y metodos de uso de las mismas.
CA2994555A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-tigit antibodies
US20190031765A1 (en) 2016-01-25 2019-01-31 Pfizer Inc. Combination of an ox40 agonist and a 4-1bb agonist monoclonal antibody for treating cancer
CA3014013A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista (b7h5) antibodies
WO2017175058A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
AU2017252233A1 (en) 2016-04-22 2018-11-15 Alligator Bioscience Ab Novel bispecific polypeptides against CD137
DK3472207T3 (da) 2016-06-20 2021-04-12 F Star Delta Ltd Bindingsmolekyler, der binder pd-l1 og lag-3
GB201611530D0 (en) 2016-07-01 2016-08-17 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides
JOP20190013A1 (ar) 2016-08-25 2019-01-31 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ (تي آي ام -3)
MX2019005116A (es) 2016-11-01 2019-11-12 Anaptysbio Inc Anticuerpos dirigidos contra la proteina de inmunoglobulina de linfocitos t y de mucina 3 (tim-3).
GB201619648D0 (en) 2016-11-21 2017-01-04 Alligator Bioscience Ab Novel antibodies and uses thereof
WO2018100536A1 (en) * 2016-12-01 2018-06-07 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Methods of treating cancer
WO2018187191A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Jounce Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of cancer
JP2020517695A (ja) 2017-04-27 2020-06-18 テサロ， インコーポレイテッド リンパ球活性化遺伝子−３（ｌａｇ−３）に対する抗体薬およびそれらの使用
KR20200002889A (ko) 2017-05-02 2020-01-08 엘리게이터 바이오사이언스 에이비 Ox40 및 ctla-4에 대한 이중특이적 항체
WO2019126455A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Enzyme-mediated depletion of adenosine and/or methylthioadenosine
KR20220124718A (ko) 2020-01-07 2022-09-14 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 치료를 위한 개선된 인간 메틸 티오아데노신/아데노신 고갈 효소 변이체

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