KR20220119520A - 간 질환을 치료하기 위한 치료 조합물 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 간 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 ACC 억제제를 FXR 효능제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 간 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

간 질환을 치료하기 위한 치료 조합물{THERAPEUTIC COMBINATIONS FOR TREATING LIVER DISEASES}

분야

본 개시내용은 간 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

서열 목록

본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되고, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 1212P3C_2018-03-26_Seq_Listing_ST25.txt이다. 2018년 3월 26일에 생성된 텍스트 파일은 크기가 2.32 KB이고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.

간 질환은 일반적으로 질환의 지속시간에 기초하여 급성 또는 만성으로서 분류된다. 간 질환은 감염, 손상, 약물 또는 독성 화합물, 알콜, 식품에서의 불순물에의 노출, 및 혈액에서의 정상 물질의 비정상적 빌드-업, 자가면역 과정, 유전적 결함 (예컨대 혈색소증), 또는 미지의 원인(들)에 의해 유발될 수 있다.

간 질환은 전세계적인 주요 사망 원인이다. 특히, 고지방 식이가 놀랍게도 간염과 유사한 방식으로 간을 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 미국 간 재단은 인구의 20 퍼센트 초과가 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)을 갖는 것으로 추정한다. 비만, 건강하지 않은 식이 및 좌식 생활방식이 NAFLD의 높은 유병률에 기여할 수 있는 것으로 시사된다. 치료되지 않은 상태로 둔 경우에, NAFLD는 비-알콜성 지방간염 (NASH)으로 진행되어 심각한 유해 효과를 유발할 수 있다. NASH가 발생되면, 이는 시간 경과에 따라 간의 팽창 및 반흔형성 (즉, 간경변증)을 유발한다.

예비 보고서는 긍정적인 생활방식의 변화가 간 손상을 예방하거나 역전시킬 수 있음을 시사하지만, NAFLD 또는 NASH에 대한 어떠한 유효한 의학적 치료도 없다. 따라서, 간 질환을 치료하기 위한 새로운 유효한 제약 작용제를 제공할 필요가 남아있다.

간 질환의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC) 억제제를 치료 유효량의 파르네소이드 X 수용체 (FXR) 효능제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 간 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 개시된다. 간 질환은 만성 및/또는 대사성 간 질환, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 및 비알콜성 지방간염 (NASH)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 간 질환일 수 있다.

특정 실시양태에서, 비알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 ACC 억제제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 비알콜성 지방간염 (NASH)을 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다.

본원에 제공된 방법에서, ACC 억제제 및 FXR 효능제는 공투여될 수 있다. 이러한 실시양태에서, ACC 억제제 및 FXR 효능제는 단일 제약 조성물로서 함께 투여되거나, 또는 1종 초과의 제약 조성물로 개별적으로 투여될 수 있다. 따라서, 치료 유효량의 ACC 억제제 및 치료 유효량의 FXR 효능제를 포함하는 제약 조성물이 또한 본원에 제공된다.

도 1. 뮤린 FFD 모델에서의 간 트리글리세리드 (umol/g). (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001, ANOVA에 의해 비히클과 유의하게 상의함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 2. 뮤린 FFD 모델에서의 ALT (IU/L). (*** p < 0.001; ANOVA에 의해 비히클과 유의하게 상의함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 3. 뮤린 FFD 모델에서의 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 간 섬유증 유전자 Col1a1의 간 발현. (**p < 0.01; ****p < 0.0001, ANOVA에 의해 비히클과 유의하게 상의함; #, t-검정에 의해 어느 한 단일 작용제와 유의하게 상이함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 4. 뮤린 FFD 모델에서의 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 간 섬유증 유전자 Timp1의 간 발현. (*p < 0.05; ****p < 0.0001, ANOVA에 의해 비히클과 유의하게 상의함; #, t-검정에 의해 어느 한 단일 작용제와 유의하게 상이함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 5. 래트 CDHFD 모델에서의 정량적 영상 분석에 의한 퍼센트 PSR 양성 면적. (**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, t-검정에 의해 비히클과 유의하게 상의함; & p < 0.001, t-검정에 의해 처리 시작과 유의하게 상이함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 6. 래트 CDHFD 모델에서의 정량적 영상 분석에 의한 퍼센트 α-SMA 양성 면적. (**p < 0.01, t-검정에 의해 비히클과 유의하게 상의함; & p < 0.001, t-검정에 의해 처리 시작과 유의하게 상이함; # p < 0.05, t-검정에 의해 어느 한 단일 작용제와 유의하게 상이함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 7. 래트 CDHFD 모델에서의 ELISA에 의해 혈장에서 측정된 Timp1 단백질. (*p < 0.05, t-검정에 의해 비히클과 유의하게 상의함; & p < 0.001, t-검정에 의해 처리 시작과 유의하게 상이함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 8. 래트 CDHFD 모델에서의 ELISA에 의해 혈장에서 측정된 히알루론산 (HA). (**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, t-검정에 의해 비히클과 유의하게 상의함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 9. 래트 CDHFD 모델에서의 ELISA에 의해 혈장에서 측정된 유형 III 콜라겐 (PIIINP)의 N-말단 프로펩티드. (*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001, t-검정에 의해 비히클과 유의하게 상의함; & p < 0.001, t-검정에 의해 처리 시작과 유의하게 상이함; # p < 0.05, t-검정에 의해 어느 한 단일 작용제와 유의하게 상이함). 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.

정의 및 일반적 파라미터

본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기 용어 및 어구는 일반적으로 이들이 사용되는 문맥에서 달리 나타낸 정도를 제외하고는, 하기 제시된 바와 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 바와 같이, 정량적 측정의 문맥에서 사용된 용어 "약"은 지시된 양 ± 10%, 또는 대안적으로 지시된 양 ± 5%, 또는 ± 1%를 의미한다.

용어 "제약상 허용되는 염"은 기본 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 본원에 개시된 화합물의 염을 지칭한다. 산 부가염 및 염기 부가염이 존재한다. 제약상 허용되는 산 부가염은 무기 및 유기 산으로부터 제조될 수 있다.

제약상 허용되는 염 (각각 산 부가염 또는 염기 부가염)을 형성하기 위한 기본 화합물과의 반응에 유용한 산 및 염기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 유사하게, 기본 화합물 (개시내용 상)로부터 제약상 허용되는 염을 제조하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Berge, et al. Journal of Pharmaceutical Science, Jan. 1977 vol. 66, No.1] 및 다른 자료에 개시되어 있다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 개시된 화합물 또는 그의 용도에 유해하지 않은 부형제 또는 작용제 예컨대 용매, 희석제, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약 활성 물질의 조성물을 제조하기 위한 이러한 담체 및 작용제의 용도는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 17th Ed. (1985); 및 Modern Pharmaceutics, Marcel Dekker, Inc. 3rd Ed. (G.S. Banker & C.T. Rhodes, Eds.)] 참조)

용어 "치료 유효량" 및 "유효량"은 상호교환가능하게 사용되고, 하기 정의된 바와 같은 치료를 필요로 하는 환자 (예를 들어, 인간)에게 1회 이상의 용량으로 투여되는 경우에, 이러한 치료를 실시하기에 충분한 화합물의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 검증된 처방자 또는 관리 제공자에 의해 결정되는 바와 같이, 환자, 치료되는 질환, 환자의 체중 및/또는 연령, 질환의 중증도, 또는 투여 방식에 따라 달라질 것이다.

용어 "치료" 또는 "치료하는"은 하기 목적을 위해 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 의미한다: (i) 질환의 발병을 지연시키는 것, 즉 질환의 임상 증상이 발생하지 않도록 하거나 또는 그의 발생을 지연시키는 것; (ii) 질환을 억제하는 것, 즉 임상 증상의 발생을 정지시키는 것; 및/또는 (iii) 질환을 완화시키는 것, 즉 임상 증상 또는 그의 중증도의 퇴행을 유발하는 것.

간 질환

간 질환은 질환의 지속시간에 기초한 간에 대한 급성 또는 만성 손상이다. 간 손상은 감염, 손상, 약물 또는 독성 화합물 예컨대 알콜 또는 식품에서의 불순물에의 노출, 혈액 중 정상 물질의 비정상적 빌드-업, 자가면역 과정, 유전적 결함 (예컨대 혈색소증), 또는 다른 미지의 원인에 의해 유발될 수 있다. 예시적인 간 질환은 간경변증, 간 섬유증, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알콜성 지방간염 (NASH), 알콜성 지방간염 (ASH), 간 허혈 재관류 손상, 원발성 담즙성 간경변증 (PBC), 원발성 경화성 담관염 (PSC), 및 바이러스성 및 알콜성 간염 둘 다를 포함한 간염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)은 간 세포에서 알콜에 의해 유발되지 않은 가외의 지방의 빌드 업이다. NAFLD는 간의 팽창 (즉, 지방간염)을 유발할 수 있으며, 이는 또한 시간 경과에 따라 반흔형성 (즉, 간경변증)을 유발할 수 있고, 간암 또는 간부전으로 이어질 수 있다. NAFLD는 간세포에서의 지방의 축적을 특징으로 하고, 종종 대사 증후군 (예를 들어 제2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 고지혈증, 고혈압)의 일부 측면과 연관된다. 이러한 질환의 빈도는 탄수화물-풍부 고지방 식이의 소비로 인해 점점 더 흔해지고 있다. NAFLD 환자의 하위세트 (~20%)는 비알콜성 지방간염 (NASH)을 발생시킨다.

지방간 질환의 하위유형인 NASH는 NAFLD의 보다 중증 형태이다. 이는 거대수포성 지방증, 간세포의 풍선 변성, 및/또는 궁극적으로 간 반흔형성 (즉, 섬유증)으로 이어지는 염증을 특징으로 한다. NASH로 진단받은 환자는 진행성 병기 간 섬유증 및 결국 간경변증으로 진행된다. 말기 질환을 갖는 간경변성 NASH 환자를 위한 현행 치료는 간 이식이다.

또 다른 흔한 간 질환은 원발성 경화성 담관염 (PSC)이다. 이는 간 내부 및 외부의 담관을 천천히 손상시키는 만성 또는 장기 간 질환이다. PSC를 갖는 환자에서, 담즙은 차단된 담관으로 인해 간 내에 축적되며, 여기서 이는 서서히 간 세포를 손상시키고 간경변증, 또는 간의 반흔형성을 유발한다. 현재, PSC를 치유하기 위한 어떠한 유효 치료도 없다. PSC를 갖는 많은 환자는 간부전으로 인해, 전형적으로 질환으로 진단받은 지 약 10년 후에 궁극적으로 간 이식을 필요로 한다. PSC는 또한 담관암으로 이어질 수 있다.

간 섬유증은 대부분 유형의 만성 간 질환에서 발생하는, 콜라겐을 포함한 세포외 매트릭스 단백질의 과도한 축적이다. 진행성 간 섬유증은 간경변증, 간부전 및 문맥 고혈압을 유발하며, 종종 간 이식을 필요로 한다.

방법

간 질환의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 ACC 억제제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 간 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 개시된다. 활성 간 질환의 존재는 혈액 중 상승된 효소 수준의 존재에 의해 검출될 수 있다. 구체적으로, 임상적으로 허용되는 정상 범위를 넘는 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)의 혈액 수준은 진행중인 간 손상을 나타내는 것으로 알려져 있다. ALT 및 AST의 혈액 수준에 대한 간 질환 환자의 상용 모니터링은 의학적 치료 시에 간 질환의 진행을 측정하기 위해 임상적으로 사용된다. 상승된 ALT 및 AST를 허용된 정상 범위 내로 감소시키는 것은 환자의 진행중인 간 손상의 중증도 감소를 반영하는 임상적 증거로 간주된다.

특정 실시양태에서, 간 질환은 만성 간 질환이다. 만성 간 질환은 간 실질의 진행성 파괴 및 재생을 수반하며, 섬유증 및 간경변증으로 이어진다. 일반적으로, 만성 간 질환은 바이러스 (예컨대 B형 간염, C형 간염, 시토메갈로바이러스 (CMV) 또는 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)), 독성제 또는 약물 (예컨대 알콜, 메토트렉세이트, 또는 니트로푸란토인), 대사 질환 (예컨대 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비-알콜성 지방간염 (NASH), 혈색소증, 또는 윌슨병), 자가면역 질환 (예컨대 자가면역 만성 간염, 원발성 담즙성 담관염 (이전에 원발성 담즙성 간경변증으로 알려짐) 또는 원발성 경화성 담관염) 또는 다른 원인 (예컨대 우심부전)에 의해 유발될 수 있다.

한 실시양태에서, 간경변증의 수준을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시양태에서, 간경변증은 병리학적으로 섬유증 및 결절성 재생을 동반한, 정상 현미경적 소엽성 아키텍처의 손실을 특징으로 한다. 간경변증의 정도를 측정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 간경변증의 수준은 약 5% 내지 약 100% 감소된다. 한 실시양태에서, 간경변증의 수준은 대상체에서 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 감소된다.

특정 실시양태에서, 간 질환은 대사성 간 질환이다. 한 실시양태에서, 간 질환은 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)이다. NAFLD는 인슐린 저항성 및 대사 증후군 (비만, 복합 고지혈증, 당뇨병 (제II형) 및 고혈압)과 연관된다. NAFLD는 질환 활성의 스펙트럼을 포괄하는 것으로 간주되고, 간에서의 지방 축적 (간 지방증)으로 시작된다.

비만 및 인슐린 저항성 둘 다는 NAFLD의 질환 과정에서 강력한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 불량한 식이 이외에, NAFLD는 여러 다른 기지의 원인을 갖는다. 예를 들어, NAFLD는 특정 의약, 예컨대 아미오다론, 항바이러스 약물 (예를 들어, 뉴클레오시드 유사체), 아스피린 (드물게 소아 라이에 증후군의 일부로서), 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 타목시펜, 또는 테트라시클린에 의해 유발될 수 있다. NAFLD는 또한 고과당 옥수수 시럽의 존재를 통해 청량 음료의 소모에 연관되었으며, 비록 수크로스의 소모가 유사한 효과를 제시하지만 (그의 프룩토스로의 분해로 인한 것일 가능성 있음), 이는 복부에서의 지방의 증가된 침착을 유발할 수 있다. 이러한 감수성에 대한 2개의 유전자 돌연변이가 확인되었기 때문에 유전학이 또한 소정의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

치료되지 않은 상태로 둔 경우에, NAFLD는 지방증이 염증 및 섬유증과 조합된 상태인 NAFLD의 가장 극단적인 형태인 비-알콜성 지방간염 (NASH)으로 발달될 수 있다. NASH는 간경변증의 주요 원인으로 여겨진다. 따라서, 비알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 ACC 억제제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 비알콜성 지방간염 (NASH)을 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다.

또한, 간 섬유증의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 ACC 억제제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 간 섬유증을 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 간 섬유증은 대부분 유형의 만성 간 질환에서 발생하는, 콜라겐을 포함한 세포외 매트릭스 단백질의 과도한 축적이다. 특정 실시양태에서, 진행성 간 섬유증은 간경변증 및 간부전을 유발한다. 간 조직상태, 예컨대 섬유증, 소엽성 간염 및 문맥주위 가교 괴사의 정도의 변화를 측정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

한 실시양태에서, 섬유성 조직의 형성, 유섬유종 또는 섬유성 변성인 간 섬유증의 수준은 약 90% 초과 감소된다. 한 실시양태에서, 섬유성 조직의 형성, 유섬유종 또는 섬유성 변성인 섬유증의 수준은 적어도 약 90%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 적어도 약 50%, 적어도 약 40%, 적어도 약 30%, 적어도 약 20%, 적어도 약 10%, 적어도 약 5% 또는 적어도 약 2% 감소된다.

한 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물은 간에서 섬유생성의 수준을 감소시킨다. 간 섬유생성은 섬유증으로 알려져 있는, 간에서의 과잉의 세포외 매트릭스 성분의 침착으로 이어지는 과정이다. 이는 다수의 상태, 예컨대 만성 바이러스성 B형 및 C형 간염, 알콜성 간 질환, 약물-유도된 간 질환, 혈색소증, 자가면역 간염, 윌슨병, 원발성 담즙성 담관염 (이전에 원발성 담즙성 간경변증으로 알려짐), 경화성 담관염, 간 주혈흡충증 및 다른 것들에서 관찰된다. 한 실시양태에서, 섬유생성의 수준은 약 90% 초과 감소된다. 한 실시양태에서, 섬유생성의 수준은 적어도 약 90%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 적어도 약 50%, 적어도 40%, 적어도 약 30%, 적어도 약 20%, 적어도 약 10%, 적어도 약 5% 또는 적어도 2% 감소된다.

또 다른 실시양태에서, 원발성 경화성 담관염 (PSC)의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 ACC 억제제를 치료 유효량의 FXR 효능제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 원발성 경화성 담관염 (PSC)을 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다.

NASH를 갖는 환자는 후성학적 시험에서 건강한 환자보다 평균적으로 약 2.8세 더 많은 것으로 관찰되었다. 따라서, 한 실시양태에서, NASH의 치료에 유용한 화합물은 후성학적 연령 또는 NASH로 인한 노화 효과를 둔화, 개선 또는 역전시키는 데 유용할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 ACC 억제제와 FXR 효능제의 조합물과 같은 NASH의 치료를 위한 조합 요법이 NASH로 인한 노화 효과의 개선 또는 역전에 유용할 수 있다.

한 실시양태에서, ACC 억제제 및 FXR 효능제는 조합 제제로 함께 투여되거나 또는 개별 제약 조성물로 투여될 수 있으며, 여기서 각각의 억제제는 임의의 적합한 투여 형태로 제제화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 ACC 억제제 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물 및 FXR 효능제 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 개별적으로 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용에 따른 조합 제제는 ACC 억제제 및 FXR 효능제를 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 및 임의로 다른 치료제와 함께 포함한다. 활성 성분을 함유하는 조합 제제는 의도된 투여 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다.

ACC 억제제

본원에 개시된 방법 및 제약 조성물의 특정 실시양태에서, ACC 억제제는 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

본원에 개시된 방법 및 제약 조성물의 특정 실시양태에서, ACC 억제제는 화학식 (II)의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예컨대 PCT 국제 출원 공개 번호 WO 2013/071169에 기재된 것을 사용하여 합성 및 특징화될 수 있다. 한 실시양태에서, ACC 억제제는 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 한 실시양태에서, ACC 억제제는 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

FXR 효능제

본원에 개시된 방법 및 제약 조성물의 특정 실시양태에서, FXR 효능제는 화학식 (III)의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

본원에 개시된 방법 및 제약 조성물의 특정 실시양태에서, FXR 효능제는 화학식 (IV)의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

화학식 (III) 및 화학식 (IV)의 화합물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예컨대 미국 공개 번호 2014/0221659에 기재된 것을 사용하여 합성 및 특징화될 수 있다.

투약 및 투여

활성 성분을 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 하기 기재된 바와 같은 제약 제제 또는 제약 조성물로서 존재하는 것이 바람직할 수 있다. 본 개시내용의 수의학 및 인간 용도 둘 다를 위한 제제는 활성 성분 중 적어도 1종을 1종 이상의 그에 대한 허용되는 담체 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 포함한다. 담체(들)는 제제의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "허용되는" 것이어야 하고, 그의 수용자에게 생리학상 무해하여야 한다.

각각의 활성 성분은 통상의 실시에 따라 선택될 통상적인 담체 및 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 정제는 부형제, 활택제, 충전제, 결합제 등을 함유할 수 있다. 수성 제제는 멸균 형태로 제조되고, 경구 투여 이외의 것에 의한 전달을 위해 의도되는 경우에는 일반적으로 등장성일 것이다. 모든 제제는 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986)]에 제시된 것과 같은 부형제를 임의로 함유할 것이다. 부형제는 아스코르브산 및 다른 항산화제, 킬레이트화제 예컨대 EDTA, 탄수화물 예컨대 덱스트린, 히드록시알킬셀룰로스, 히드록시알킬메틸셀룰로스, 스테아르산 등을 포함한다. 제제의 pH는 약 3 내지 약 11 범위이지만, 통상적으로는 약 7 내지 10이다.

활성 성분의 치료 유효량은 통상적인 용량 증량 연구를 사용하여 숙련된 임상의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 각각의 활성 성분은 0.01 mg 내지 1 그램 용량으로 투여될 것이다. 한 실시양태에서, 투여량은 약 10 mg 내지 450 mg일 것이다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 약 25 내지 약 250 mg일 것이다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 약 50 또는 100 mg일 것이다. 한 실시양태에서, 투여량은 약 100 mg일 것이다. 한 실시양태에서, 20 mg의 ACC 억제제가 투여된다. 구체적 실시양태에서, 20 mg의 화학식 (II)의 화합물이 투여된다. 한 실시양태에서, 30 mg의 FXR 효능제가 투여된다. 구체적 실시양태에서, 30 mg의 화학식 (III)의 화합물이 투여된다. 활성 성분이 1일 1회, 2회 또는 3회 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 활성 성분은 1주 1회 또는 2회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 또는 6주마다 1회 투여될 수 있다.

활성 성분에 대한 제약 조성물은 상기 투여 경로에 적합한 것을 포함할 수 있다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 기술분야에 널리 공지된 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 기술 및 제제는 일반적으로 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA)]에서 발견된다. 이러한 방법은 활성 성분을 1종 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하고 친밀하게 회합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 성형함으로써 제조된다.

경구 투여에 적합한 제제는 이산 단위 예컨대 각각 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 카쉐 또는 정제로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 활성 성분은 또한 볼루스, 연약, 또는 페이스트로서 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성 성분은 피하 주사로서 투여될 수 있다.

정제는, 임의로 1종 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 표면 활성제와 임의로 혼합된, 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축시킴으로써 제조될 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤된 분말화 활성 성분의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 임의로 코팅 또는 스코어링될 수 있으며, 그로부터의 활성 성분의 느린 또는 제어 방출이 제공되도록 임의로 제제화된다.

활성 성분은 상태에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 적합한 경로는 경구, 직장, 비강, 국소 (협측 및 설하 포함), 질 및 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척수강내 및 경막외 포함) 등을 포함한다. 바람직한 경로는, 예를 들어 수용자의 상태에 따라 달라질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 특정 실시양태에서, 활성 성분은 경구로 생체이용가능하고, 따라서 경구로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 환자는 인간이다.

본원에 개시된 방법에서 조합하여 사용되는 경우, ACC 억제제 및 FXR 효능제는 단일 제약 조성물, 예를 들어 고정 용량 조합물로 함께 투여되거나, 또는 1종 초과의 제약 조성물로 개별적으로 (공동으로 또는 순차적으로) 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, ACC 억제제 및 FXR 효능제는 함께 투여된다. 다른 실시양태에서, ACC 억제제 및 FXR 효능제는 개별적으로 투여된다. 일부 측면에서, ACC 억제제는 FXR 효능제 이전에 투여된다. 일부 측면에서, FXR 효능제는 ACC 억제제 이전에 투여된다. 개별적으로 투여되는 경우에, ACC 억제제 및 FXR 효능제는 환자에게 동일하거나 상이한 전달 경로에 의해 투여될 수 있다.

제약 조성물

본 개시내용의 제약 조성물은 화학식 (I)의 화합물 및 화학식 (II)의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ACC 억제제의 유효량, 및 화학식 (III)의 화합물 및 화학식 (IV)의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 FXR 효능제의 유효량을 포함한다.

예를 들어, 경구용으로 사용되는 경우에, 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 오일 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르가 제조될 수 있다. 경구 사용을 위해 의도된 조성물은 제약 조성물의 제조에 대한 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있고, 이러한 조성물은 맛우수한 제제를 제공하기 위해 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제를 포함한 1종 이상의 작용제를 함유할 수 있다. 활성 성분을 정제의 제조에 적합한 비-독성 제약상 허용되는 부형제와 혼합하여 함유하는 정제가 허용된다. 이들 부형제는, 예를 들어, 불활성 희석제, 예컨대, 예를 들어, 탄산칼슘 또는 탄산나트륨, 락토스, 락토스 1수화물, 크로스카르멜로스 소듐, 포비돈, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 예를 들어 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대, 예를 들어, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예컨대, 예를 들어, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 비코팅될 수 있거나, 또는 마이크로캡슐화를 포함한 공지된 기술에 의해 코팅되어 위장관에서의 붕해 및 흡착을 지연시키고 그에 의해 더 오랜 기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예컨대 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 단독으로 또는 왁스와 함께 사용될 수 있다.

경구 사용을 위한 제제는 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예컨대 예를 들어 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.

본 개시내용의 수성 현탁액은 활성 물질을 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 함유한다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예컨대, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 및 분산제 또는 습윤제 예컨대, 예를 들어, 자연 발생 포스파티드 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함한다. 수성 현탁액은 1종 이상의 보존제, 예컨대 예를 들어 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시-벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향미제 및 1종 이상의 감미제, 예컨대, 예를 들어, 수크로스 또는 사카린을 또한 함유할 수 있다.

오일 현탁액은 활성 성분을 식물성 오일, 예컨대, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일, 또는 미네랄 오일, 예컨대 예를 들어 액체 파라핀 중에 현탁시킴으로서 제제화될 수 있다. 경구 현탁액은 증점제, 예컨대, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제, 예컨대, 예를 들어, 상기 제시된 것, 및 향미제가 맛우수한 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이들 조성물은 항산화제 예컨대, 예를 들어, 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조에 적합한 본 개시내용의 분산성 분말 및 과립은 활성 성분을 분산제 또는 습윤제, 현탁화제, 및 1종 이상의 보존제와 혼합하여 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제는 상기 개시된 것들에 의해 예시된다. 추가의 부형제, 예를 들어 감미제, 향미제 및 착색제가 또한 제공될 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 또한 수중유 에멀젼 형태일 수 있다. 유성 상은 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 미네랄 오일, 예를 들어 액체 파라핀, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 자연 발생 검, 예컨대, 예를 들어, 아카시아 검 및 트라가칸트 검, 자연 발생 포스파티드, 예컨대, 예를 들어, 대두 레시틴, 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예컨대, 예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트, 및 이들 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예컨대, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 에멀젼은 또한 감미제 및 향미제를 함유할 수 있다. 시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예컨대 예를 들어, 글리세롤, 소르비톨 또는 수크로스로 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 또한 완화제, 보존제, 향미제 또는 착색제를 함유할 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 멸균 주사가능한 제제, 예컨대, 예를 들어, 멸균 주사가능한 수성 또는 유질 현탁액 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 상기 언급된 그러한 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 비-독성 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예컨대, 예를 들어, 1,3-부탄-디올 중 용액일 수 있거나, 또는 동결건조 분말로서 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 무자극 고정 오일이 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 예를 들어 올레산이 마찬가지로 주사제의 제조에 사용될 수 있다.

단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정한 투여 방식, 예컨대 경구 투여 또는 피하 주사에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여하도록 의도된 시한-방출 제제는, 총 조성물의 약 5 내지 약 95% (중량:중량)로 달라질 수 있는 적절하고도 편리한 양의 담체 물질과 배합된 대략 1 내지 1000 mg의 활성 물질을 함유할 수 있다. 제약 조성물은 투여를 위해 용이하게 측정가능한 양을 제공하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주입을 위해 의도되는 수용액은 용액 밀리리터당 활성 성분 약 3 내지 500 μg을 함유하여, 약 30 mL/시간의 속도의 적합한 부피로 주입될 수 있다. 피하 투여를 위해 제제화되는 경우에, 제제는 전형적으로 약 2 내지 약 4개월의 기간에 걸쳐 1개월에 약 2회 투여된다.

비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 및 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다.

제제는 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조된 (동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조된다. 바람직한 단위 투여 제제는, 본원에 상기 인용된 바와 같이, 활성 성분의 1일 용량 또는 단위 1일 하위-용량, 또는 그의 적절한 분획을 함유하는 것이다.

실시예

실시예 1. 마우스 NASH 모델에서의 효능

하기 연구를 수행하여 비알콜성 지방간염 (NASH) 마우스 모델에서의 ACC 억제제 및 FXR 효능제의 조합물의 효능을, 모델에서의 개별 작용제 단독의 효능과 비교하여 평가하였다. 총 6개월 동안 포화 지방, 콜레스테롤 및 당이 높은 "패스트 푸드" 식이 (FFD)를 만성 투여함으로써 수컷 C57BL/6 마우스에서 NASH를 유도하였고, 반면에 린(lean) 대조군 동물은 정상 사료 식이를 유지하였다. NASH 표현형은 6개월 후 대조군 마우스와 비교하여 FFD 마우스에서 확립되었고, 거대수포성 지방증, 상승된 ALT 및 AST, 및 간 성상 세포 활성화와 연관된 증가된 수준의 전사체에 의해 특징화되었다. 문헌 [Charlton M, et al. Fast food diet mouse: novel small animal model of NASH with ballooning, progressive fibrosis, and high physiological fidelity to the human condition. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology 2011; 301 (5):G825-34]을 참조한다.

5개월 후, FFD 마우스를 후속적으로 위약 (비히클), ACC 억제제 (화학식 (I)), FXR 효능제 (화학식 (III)), 또는 화학식 (I) 및 화학식 (III)의 조합물로 1개월 동안 처리하였다. 대조군 마우스는 전체 6개월 연구 기간 동안 정상 사료 식이를 유지하였다. 종점 분석은 간 트리글리세리드의 생화학적 정량화, 혈장 ALT, 및 간에서의 섬유화유발 전사체 Timp1 및 Col1A1의 측정을 포함하였다.

방법

동물

수컷 C57CL/6 마우스 (연구 시작시에 12주령)를 본 연구에서 사용하였다. 동물을 연구하기 위해 사용된 모든 절차는 미국 농무부의 동물 복지법 (9 CFR 파트 1, 2, 및 3); 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침 (실험 동물 연구를 위한 기관, 국립 아카데미 출판부, 워싱턴 디.씨.); 및 국립 보건원, 실험 동물 복지국을 준수하였다.

FFD 마우스 모델에 대한 생존-중 실험 프로토콜

실험 설계가 표 1에 제시된다. 연구 동물에게 표준 사료 식이 (하를란 테클라드 글로벌 다이어츠(Harlan Teklad Global Diets) 2014, TD2014) 또는 상업적으로 입수가능한 고지방, 고콜레스테롤 식이 (리서치 다이어츠 인크(Research Diets Inc), DB12079B) (FFD)를 투여하였다. FFD를 투여받는 동물에게 하기와 같이 제제화된 음용수 중 프룩토스/글루코스를 투여하였다: 23.1 g의 프룩토스 (시그마(Sigma), F2543) 및 17.2 g의 글루코스 (시그마, 49158)를 1000 mL의 음용수 내로 혼합하였다.

화학식 (I)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물 단독, 또는 화학식 (I) 및 화학식 (III)의 화합물의 조합물을 연구의 최종월 (제5월 - 제6월) 동안 투여하였다. 화학식 (I)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물을 역삼투수 중 0.5% 소듐 카르복시메틸셀룰로스 (중간 점도), 1% w/w 에탄올, 98.5% w/w 50 mM 트리스 완충제, pH 8 중에 제제화하였다. 화학식 (I)의 화합물을 0.1 또는 0.2 mg/mL로 제제화하고 표 1에 제공된 용량으로 제공하고, 화학식 (III)의 화합물을 2 mg/mL로 제제화하고 표 1에 제공된 용량으로 제공하였다.

PO 투여 7일 전에 시작하여, 군 1 - 6에서의 동물에게 비히클 BID를 모의 투여하였다. 모의 투여는 동물이 경구 위관영양 용량 투여에 적응하도록 설계되었다. 연구 제1일에 시작하여, 모든 용량 군 내의 동물에게 매일 3회; 순차적으로 AM (7:00 +/- 1시간) 내에 2회, 및 저녁 (19:00 +/- 1시간)에 1회, 28일 동안 (투여 제29일까지) 하기 (표 1)에 약술된 바와 같이 화합물을 함유하지 않는 제제 (군 1, 비히클) 또는 적절한 화합물을 함유하는 제제의 동일한 부피를 투여하였다. 제29일에 각각의 군을 2개로 나누고, 절반은 투여 2시간 후에 희생시키고, 절반은 투여 8시간 후에 희생시켰다.

표 1. 실험 설계 및 용량 군

뮤린 간으로부터의 트리글리세리드의 정량화

조직 추출: 마우스 간 조직 샘플 (25 ± 10 mg, 동결 상태에서 정확하게 칭량됨)을 균질화하고, 트리아실글리세리드 분획 뿐만 아니라 유리 및 에스테르화된 콜레스테롤 분획을 유기 상 내로 추출하는 수불혼화성 유기 용매 혼합물로 추출하였다. 원심분리 후, 트리아실글리세리드, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르를 함유하는 유기 상부 층의 분취액을 에탄올로 10배 또는 25배 희석하였다. 이 희석액의 2개의 별개의 분취액을 취하였다. 하나의 분취액은 트리아실글리세리드에 대해 분석하였고, 두 번째 분취액은 총 콜레스테롤 결정에 사용하였다.

트리실글리세리드 결정: 트리아실글리세리드 결정을 위해, 25배 희석액의 하나의 분취액 (또는 낮은 트리아실글리세리드 함량을 갖는 샘플의 경우 희석 없음)을 질소 스트림 하에 증발시켰다. 건조된 추출물을 초음파처리 하에 PBS 용액 중 0.1% 소듐 도데실 술페이트로 단계적으로 재구성하고, 이어서 트리아실글리세리드 결정 시약 (인피니티(Infinity)™ 트리글리세리드 액체 안정 시약, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 제품 데이터 시트, 인피니티™, 트리글리세리드 액체 안정 시약)과 혼합하였다.

이 시약 용액은 여러 효소, 보조인자 및 발색 시약 4-아미노안티피린을 함유하였다. 이러한 시약을 사용한 트리아실글리세리드 (TAG)의 결정은 문헌 [Wako, Product Data Sheet, Triacylglyceride - G Code No. 997-69801, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Dallas, TX]의 방법, 및 문헌 [McGowan et al., (McGowan, MW, et al., Clin. Chem 1983:29:538) 및 Fossati et al. (Fosseti, P. Prenciple L. Clin Chem. 1892:28:2077-80)]에 의한 변형에 기초하였으며, 이는 하기와 같다:

1. 트리글리세리드를 리파제에 의해 유리 지방산 및 글리세롤로 효소적으로 가수분해시킨다.

2. 글리세롤을 글리세롤 키나제 (GK)와 아데노신 트리포스페이트 (ATP)에 의해 인산화시켜 글리세롤-3-포스페이트 및 아데노신 디포스페이트를 생성한다.

3. 글리세롤-3-포스페이트를 글리세롤 포스페이트 옥시다제에 의해 디히드록시아세톤 포스페이트 (DAP)에 의해 산화시켜 과산화수소 (H₂O₂)를 생성한다.

4. 퍼옥시다제에 의해 촉매된 트린더⁵-유형 색상 반응에서, H₂O₂를 4-아미노안티피린 (4-AAP) 및 3,5-디클로로-2-히드록시벤젠 술포네이트 (DHBS)와 반응시켜 적색 염료를 생성한다. 이러한 염료의 흡광도는 샘플 내에 존재하는 트리글리세리드의 농도에 비례한다.

37℃에서 30분 동안 트리아실글리세리드 결정 시약과 함께 인큐베이션한 후, 샘플을 마이크로타이터 플레이트로 옮기고, 마이크로플레이트 판독기 (스펙트라맥스(SpectraMax) M2, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))에서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정량화를 트리아실글리세리드 참조 표준물로서의 글리세릴 트리올레에이트 (트리올레인)를 사용하여 강화 보정 표준물로부터 생성된 선형 최소 제곱 회귀 분석을 사용하여 수행하였다. 보정 표준 샘플은 조직 샘플과 동일한 추출 및 인큐베이션 단계를 거쳤다. 가중 보정 및 농도 계산은 마이크로소프트 엑셀 2013을 사용하여 수행하였다. 최종 조직 함량은 μmol 트리아실글리세리드 (TAG) / g 간 조직으로 주어졌다.

ALT

혈청을 말단 부검에서 모든 마우스로부터 수집하였다. 피리독살-5'-포스페이트를 사용하여 피루베이트에 의해 혈청 ALT를 측정하고, 코바스 히타치 6000 케미스트리 시스템(Cobas Hitachi 6000 Chemistry System) (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)) 상에서 분석하였다.

유전자 발현

대략 100 mg의 동결 좌측 엽 덩어리를 용해 및 RNA 추출을 위해 DC3 테라퓨틱스, 엘엘씨(DC3 Therapeutics, LLC)로 보냈다. 나노스트링 검정을, RNA 전사체를 측정하기 위해 제조업체의 지시에 따라 엔카운터(nCounter) 마스터 키트 (나노스트링)에 함유된 모든 시약 및 소모품을 사용하여 수행하였다. 간략하게, 110개의 간 섬유증 관련 유전자 및 6개의 대조군 하우스키핑 유전자를 표적화하는 색상 코딩된 리포터 프로브 (표 2)를 혼성화 완충제 및 포획 프로브를 포함하는 반응에서 100 ng RNA 샘플과 함께 예열된 65℃ 써모사이클러에서 16 내지 22시간 동안 밤새 혼성화시켰다. 인큐베이션 후, 샘플을 프렙 스테이션 상에 놓고, 여기서 잉여량의 프로브를 제거하고, 프로브-전사체 복합체를 스트렙타비딘 코팅된 카트리지 상에 고정시켰다. 마지막으로, 카트리지를 엔카운터 디지털 분석기 (나노스트링 테크놀로지스(NanoString Technologies), 워싱턴주 시애틀)에서 영상화하였다. nSover 3.0 소프트웨어를 사용하여 6개의 하우스키핑 유전자 (B2m, Hprt, Pgk1, Rpl13a, Rpn1, 및 Sfrs4)의 기하 평균에 대해 모든 전사체를 정규화하였다.

표 2: 나노스트링 프로브

결과

실시예 1은 ACC 억제제 및 FXR 효능제로의 조합 치료가 NASH의 마우스 모델에서 단독 투여된 어느 한 작용제보다 더 큰 효능을 생성한다는 것을 입증한다. 특히, 도 1은 개별 작용제에 비해 화학식 (I)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물의 조합물의 사용시 간 트리글리세리드의 유의한 감소를 보여주고, 도 2는 개별 작용제에 비해 화학식 (I)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물의 조합물의 사용시 혈청 ALT의 유의한 감소를 보여주고, 도 3 및 도 4는 각각, 개별 작용제에 비해 화학식 (I)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물의 조합물의 사용시 Col1a1 및 Timp1의 간 발현의 유의한 감소를 보여준다.

실시예 2. NASH의 래트 모델에서의 효능

하기 연구를 수행하여 섬유증을 동반한 비알콜성 지방간염 (NASH)의 설치류 모델에서 이 모델에서의 개별 작용제 단독의 효능에 비해 ACC 억제제 및 FXR 효능제의 조합물의 효능을 평가하였다. 이 모델에서, 섬유증을 동반한 NASH를 수컷 위스타 래트에서 콜린-결핍 고지방 식이 (CDHFD)의 투여에 의해 유도하였다.

동물

수컷 위스타 (Crl:Wi(Han)) 래트 (도착시 8-9주령)를 찰스 리버(Charles River) (노스 캐롤라이나주 롤리)로부터 획득하고, 현행 연구에서 사용하였다. 본 연구는 동물 복지법 규정의 최종 규칙 (미국 연방 규정집, 타이틀 9), 실험 동물 복지국으로부터의 실험 동물의 인간 관리 및 사용에 대한 공중 보건복지 정책, 및 국립 연구 협의회로부터의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침의 모든 적용가능한 섹션을 준수하였다.

비히클 제조

비히클, 탈이온수 중의 w/v 50 mM 트리스 완충제 (pH 8)를 사용 전에 제조하고, 2-8℃를 유지하도록 설정된 냉장고에 저장하였다. 1 L를 제조하기 위해, 800 mL의 온수 (~80℃)를 적절한 용기에 첨가하고, 급격한 볼텍스가 형성될 때까지 격렬하게 교반하였다. 5.0 그램의 소듐 메틸셀룰로스를 볼텍스에 소듐 카르복시메틸셀룰로스에 천천히 첨가하였다. 모든 카르복시메틸셀룰로스가 용해될 때까지 교반을 계속하고, 용액을 주위 온도로 냉각시켰다. 5.12 g의 트리스 HCl을 용기에 첨가하였다. 2.12 g의 트리스 염기를 용기에 첨가하였다. 10 g의 에탄올을 용기에 첨가하였다. 성분을 대략 15분 동안 교반하여, 모든 고체가 용해되도록 하였다. QS 물을 부드럽게 혼합하면서 1 L에 첨가하였다.

연구 설계

음식물을 자유롭게 제공하였고, 연구의 모든 동물에게 표 3에 약술된 바와 같이 콜린-결핍, 고지방, 고콜레스테롤 식이 (CDHFD; 리서치 다이어츠, A16092003)를, 표준 식이 (5CR4)를 받은 대조군 사료 군인 군 1을 제외하고 연구 제1일에 제공하였다. 희생 당일에, 간을 수거하고 파라핀 포매하고, 혈장을 수집하고 동결시켰다. 희생 당일에는 동물에게 투여하지 않았다.

표 3. 실험 설계 및 용량 군

조직을 네바다주 리노 소재의 찰스 리버에 의해 수집하고, 캘리포니아주 헤이워드 소재의 히스토-테크(Histo-tec)에서 파라핀에 포매시킨 다음, 포스터 시티 소재의 길리아드 사이언시스(Gilead Sciences)로 수송하였다. 샘플을 5 μm로 절편화하고, 절편을 후속 염색을 위해 유리 슬라이드 상에 탑재하였다.

피크로시리우스 레드 염색: 절편을 0.2% 포스포몰리브데넘산 (EMS, Cat# 26357-01)에서 사전처리한 다음, 후속적으로 포화 피크르산 용액 (EMS, Cat#26357-02) 중 0.1% (W/V) 시리우스 레드 88-89-1에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 0.01N HCl (EMS, Cat# 26357)에서 분화시키고, 등급화된 알콜에서 탈수시켰다.

피크로시리우스 레드 (PSR) 염색된 슬라이드의 전체 슬라이드 영상을 레이카(Leica) AT2 스캐너를 사용하여 40X 배율로 캡처하였다. 디지털 슬라이드 영상을 스캐닝 품질에 대해 체크하고, 주석을 달고, 레이카 디지털 영상 허브 아카이브 내의 적절한 네트워크 폴더로 내보내기하였다. PSR의 정도 및 강도를 결정하기 위해, 비시오팜(Visiopharm) 영상 분석 소프트웨어 (비시오팜, 덴마크 회르숄름)를 사용하여 전체 슬라이드 영상 상에서 정량적 영상 분석을 수행하였다. 총 PSR-염색된 면적을 측정하고, 염색된 총 간 면적의 백분율로서 표현하였다. 결과는 도 7에 제시된다.

α-SMA: 절편을 크실렌의 3회 교체에서 각각 5분 동안 탈파라핀화하고, 후속적으로 100% EtOH의 3회 교체, 95% EtOH의 1회 교체, 80% EtOH의 1회 교체에서 각각 3분 동안 재수화시키고; 이어서 증류수에서 2회 연속 헹구었다. 이어서, 절편을 퍼옥시화 1 (바이오케어 메디칼(Biocare Medical), Cat# PX968) 내인성 퍼옥시다제 차단제에서 5분 동안 인큐베이션하고, 증류수에서 헹구었다. 이어서, 열 유도된 에피토프 회복을 리빌 데클로아커(Reveal Decloaker) (바이오케어 메디칼, Cat# RV1000M)를 사용하여 95℃에서 40분 동안 탈클로킹 챔버 NxGen (바이오케어 메디칼, Cat# DC2012)으로 수행하고, 이어서 회수 완충제를 증류수로 교체하여 점진적으로 냉각시키고, 트리스 완충 염수 (TBS)에 넣었다. 하기 단계를 사용하여 인텔리패스(Intellipath) 자동염색기 (바이오케어 메디칼, Cat# IPS0001)를 사용하여 제조된 슬라이드 상에서 면역조직화학을 수행하였다:

1. 300 uL의 배경 퍼니셔 (바이오케어 메디칼, Cat# IP974G20)를 슬라이드에 적용하고, 10분 동안 인큐베이션하고; 이어서 TBS로 세척하였다.

2. 다 빈치 그린 희석제 (바이오케어 메디칼, Cat# PD900L) 중에서 1:50 희석된 마우스 모노클로날 SMA, 클론 1A4, (바이오케어 메디칼, Cat# CM001)의 1차 항체 300uL를 적용하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고; 이어서 TBS로 세척하였다.

3. 300uL의 마우스 온 래트 HRP 중합체 (바이오케어 메디칼, Cat# MRT621H)를 적용하고, 30분 동안 인큐베이션하고; 이어서 TBS로 세척하였다.

4. DSB를 제조하였다: 1 방울의 DSB 발색원/ 1 ml 기질 완충제 (바이오케어 메디칼, 각각 Cat# BRI 4014C / BRI 4013). 300 uL 딥 스페이스 블랙 (DSB) 발색원을 5분 동안 적용하고; 이어서 증류수로 세척하였다.

5. 뉴클리어 패스트 레드(Nuclear Fast Red) (바이오케어 메디칼, Cat# STNFRLT)를 사용하여 1분 동안 대조염색하고; 이어서 증류수로 세척하였다.

슬라이드를 기기로부터 제거하고, 일련의 등급화된 조직학적 등급 알콜을 통해 크실렌으로 탈수시키고, 커버슬립을 덮었다.

α-SMA 염색된 슬라이드의 전체 슬라이드 영상을 레이카 AT2 스캐너를 사용하여 40X 배율로 캡처하였다. 디지털 슬라이드 영상을 스캐닝 품질에 대해 체크하고, 주석을 달고, 레이카 디지털 이미지 허브 아카이브 내의 적절한 네트워크 폴더로 내보내기하였다. α-SMA의 정도 및 강도를 결정하기 위해, 비시오팜 영상 분석 소프트웨어 (비시오팜, 덴마크 회르숄름)를 사용하여 전체 슬라이드 영상 상에서 정량적 영상 분석을 수행하였다. 총 α-SMA-염색된 면적을 측정하고, 염색된 총 간 면적의 백분율로서 표현하였다.

혈장 TIMP-1 ELISA: 혈장 TIMP-1 농도를 상업적으로 입수가능한 래트 TIMP-1 특이적 ELISA 키트 (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스, Cat # RTM100)를 사용하여 이중으로 결정하였다. TIMP-1을 제조업체의 설명서에 따라 약간의 변형을 가하여 혈장에서 검정하였다. 완충제 RD1-21 (50 μl)을 마우스 항-TIMP-1로 사전-코팅된 ELISA 플레이트 웰에 첨가하였다. ELISA 이전에, 래트 TIMP-1 (NS0-발현된 재조합 TIMP-1: 2400-37.5 pg/mL)의 7 포인트 표준 곡선을 생성하고, 혈장 샘플을 완충제 RD5-17에서 1:20 희석하였다. 샘플 및 표준물 (각각 50 μl)을 RD1-21을 함유하는 웰에 이중으로 첨가하고, 오비탈 플레이트 진탕기 (300 rpm) 상에서 2시간 동안 인큐베이션하였다 (실온). 항원 포획 후, 플레이트를 자동화 플레이트 세척기를 사용하여 세척 완충제로 5회 세척하였다 (350 μL/웰/세척). 세척 후, 래트 TIMP-1 접합체 (100 μl)를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 오비탈 플레이트 진탕기 (300 rpm) 상에서 2시간 동안 인큐베이션하였다 (실온). 이어서, 플레이트를 5회 세척하고, 기질 용액 (100 μl)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 빛으로부터 보호하면서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 정지 용액 (100 μl)을 각 웰에 첨가하였다. 광학 밀도 (O.D.) 흡광도를 스펙트라맥스 190 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스, 캘리포니아주 서니베일) 상에서 450nm에서 즉시 결정하였다. 각각의 표준물 및 샘플에 대한 상대 O.D.를 블랭크 샘플에 대해 배경 보정하고, 4 파라미터 곡선 피트 방법을 사용하여 O.D.의 TIMP-1 농도로의 전환을 위한 표준 곡선을 생성하였다. 20의 희석 배율을 사용하여 소프트맥스 프로5 소프트웨어를 사용하여 미지의 샘플 TIMP-1 농도를 결정하였다. 결과는 도 7에 제시된다.

혈장 PIIINP: 혈장 PIIINP 농도를 상업적으로 입수가능한 래트 프로콜라겐 III N-말단 프로펩티드 (PIIINP) ELISA 키트 (바이오마틱(Biomatik), 델라웨어주 윌밍톤, Cat# EKU06788)를 사용하여 이중으로 결정하였다. PIIINP를 제조업체의 설명서에 따라 약간의 변형을 가하여 PBS에서 50배 희석된 혈장에서 검정하였다. 표준 희석제에서 재구성된 표준 원액으로부터 7개의 표준물 (2,000 pg/mL, 1,000 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62.5 pg/mL, 31.2 pg/mL)을 제조하였다. 각각 100 μL의 표준물, 블랭크 및 샘플을 적절한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 실러로 덮고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 각 웰로부터 액체를 제거한 후, 검출 시약 A 작업 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 플레이트 실러로 덮은 다음, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 350 μL의 1× 세척액으로 세척하고, 1~2분 동안 3회 정치시켰다. 마지막 세척 후, 임의의 남아있는 세척 완충제를 가만히 따라내고 흡수지에 대해 블롯팅함으로써 제거하였다. 이어서, 100 μL의 검출 시약 B 작업 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 플레이트 실러로 덮고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 흡인/세척 과정을 총 5회 반복하였다. 90 μL의 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 새로운 플레이트 실러로 덮고, 빛으로부터 보호하면서 37℃에서 10 - 20분 동안 인큐베이션하였다. 기질 용액의 첨가에 의해 액체가 청색으로 변하였다. 마지막으로 50 μL의 정지 용액을 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 액체가 황색으로 변하였다. 플레이트의 측면을 부드럽게 두드려 액체를 혼합하였다. 광학 밀도 (O.D.) 흡광도를 스펙트라맥스 190 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스, 캘리포니아주 서니베일) 상에서 450nm에서 즉시 결정하였다. 각각의 표준물 및 샘플에 대한 상대 O.D.를 블랭크 샘플에 대해 배경 보정하고, 4 파라미터 곡선 피트 방법을 사용하여 O.D.의 PIIINP 농도로의 전환을 위한 표준 곡선을 생성하였다. 50의 희석 배율을 사용하여 소프트맥스 프로5 소프트웨어를 사용하여 미지의 샘플 PIIINP 농도를 결정하였다. 결과는 도 9에 제시된다.

혈장 히알루론산 (HA) 검정: 혈장 HA 농도를 상업적으로 입수가능한 HA 시험 키트 (코르게닉스, 인크.(Corgenix, Inc.), 콜로라도주 브룸필드, Cat# 029-001)를 사용하여 이중으로 결정하였다. 제조업체의 설명서에 따라 약간의 변형을 가하여 HA를 혈장에서 검정하였다. 검정 이전에, HA 참조 용액 (800-12.5 ng/mL)의 7 포인트 표준 곡선을 생성하고, 각각의 참조 샘플 및 혈장 샘플을 1부 대 10부 반응 완충제 (300 μl 반응 완충제에 대해 30 μl 참조물/샘플)로 희석하였다. 샘플 및 표준물 (100 μl)을 HA 결합 단백질 (HABP)로 사전-코팅된 마이크로플레이트 웰에 이중으로 첨가하고, 오비탈 플레이트 진탕기 (300 rpm) 상에서 60분 동안 인큐베이션하였다 (실온). 항원 포획 후, 플레이트를 자동화 플레이트 세척기를 사용하여 PBS로 4회 세척하였다 (350 μL/웰/세척). 세척 후, HRP-접합된 HABP (100 μl)를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 오비탈 플레이트 진탕기 (300 rpm) 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다 (실온). 이어서, 플레이트를 4회 세척하고, 1-성분 기질 용액 (100 μl)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 빛으로부터 보호하면서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 정지 용액 (100 μl)을 각 웰에 첨가하였다. 광학 밀도 (O.D.) 흡광도를 스펙트라맥스 190 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스, 캘리포니아주 서니베일) 상에서 450nm에서 즉시 결정하였다. 각각의 표준물 및 샘플에 대한 상대 O.D.를 블랭크 샘플에 대해 배경 보정하고, 4 파라미터 곡선 피트 방법을 사용하여 O.D.의 HA 농도로의 전환을 위한 표준 곡선을 생성하였다. 희석되지 않은 미지의 샘플 HA 농도를 소프트맥스 프로5 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 결과는 도 8에 제시된다.

결과

실시예 2는 ACC 억제제 및 FXR 효능제를 사용한 조합 치료가 NASH의 래트 모델에서 단독 투여된 어느 한 작용제보다 더 큰 효능을 생성한다는 것을 입증한다. 특히, 도 5-9는 비히클에 비해 화학식 (I)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물의 조합물의 사용시, 퍼센트 피크로시리우스 양성 면적, 퍼센트 α-SMA 양성 면적, 및 섬유증과 연관된 3종의 혈장 마커, TIMP1, HA 및 PIIINP를 포함한 섬유증의 마커의 유의한 감소를 보여준다. 도 6 및 도 9는 각각 개별 작용제에 비해 화학식 (I)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물의 조합물의 사용시 α-SMA 및 PIIINP의 유의한 감소를 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> Gilead Sciences, Inc. <120> THERAPEUTIC COMBINATIONS FOR TREATING LIVER DISEASES <130> 1212.P3C <150> 62/477,697 <151> 2017-03-28 <150> 62/482,105 <151> 2017-04-05 <150> 62/586,354 <151> 2017-11-15 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 aagcctctgt ggatatgccc acaagtccca gaaccgcagt gaagagtttc tcatcacggg 60 ccgcctaagg aacggaaatt tgcacatcag tgcctgcagc 100 <210> 2 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 caatggtgag acgtggaaac ccgaggtatg cttgatctgt atctgccaca atggcacggc 60 tgtgtgcgat gacgtgcaat gcaatgaaga actggactgt 100 <210> 3 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 catacgcctg cagagttaag catgccagta tggccgagcc caagaccgtc tactgggatc 60 gagacatgtg atcaagcatc atgatgctct gaagattcat 100 <210> 4 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 tgctgaggcg gcgagggaga gcgttgggct tacctcactg ctttccggag cggtagcacc 60 tcctccgccg gcttcctcct cagaccgctt tttgccgcga 100 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 ccggcattct gcacgcttca aaagcgcacg tctgccgcgc tgttctcctc ttcctcatct 60 ccgggccttt cgacctcacg gtgttgccaa aatgtcgctt 100 <210> 6 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 atgggatccc tccaccctat gacaagaaaa agcggatggt ggtccctgct gctctcaagg 60 ttgttcggct gaagcctacc agaaagtttg cttacctggg 100 <210> 7 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 ggcagcctga cagtgggatc tcctccattc gttcttttaa gaccatcctt cctgctgccg 60 cccaggatgt ctattaccgg gatgagattg gtaatgtttc 100 <210> 8 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 gatgctcaca agggacgcaa aaacgaagga gtgattgaat ttgtgtctta ctctgatatg 60 aaaagagctt tggaaaagct ggacggaact gaagtcaacg g 101

Claims (1)

1. 비-알콜성 지방간염 (NASH)을 치료하기 위한 치료 조합물의 사용.
   

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