KR20220115975A - 초-장기 작용 인슐린-fc 융합 단백질 및 사용 방법 - Google Patents
초-장기 작용 인슐린-fc 융합 단백질 및 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 당뇨병 치료에 사용하기 위한 재조합적으로 제조된 초-장기-작용 인슐린-Fc-융합 단백질을 제공한다. 인슐린-Fc-융합 단백질은 펩타이드 링커를 통해 인간 유래의 Fc-단편에 연결된 인슐린 폴리펩타이드를 포함한다. 얻어진 결과에 기반하여, 저비용 제조가 가능하고, 충분한 생체내 생활성을 나타내고, 생활성의 연장된 기간을 나타내고, 면역원성을 나타내지 않는 치료제를 생성하려면 이러한 요소 중 하나 이상에 대한 선택적 돌연변이 외에 인슐린 폴리펩타이드, 펩타이드 링커 및 Fc-단편의 명백하지 않은 조합이 필요하다. 예시적인 초-장기-작용 인슐린-Fc-융합 단백질, 이들 인슐린-Fc-융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 예시적인 인슐린-Fc-융합 단백질의 약제학적 제형이 사용 및 제조 방법에 추가로 제공된다.
Description
우선권 및 관련 출원
본 출원은 2019년 12월 19일에 출원된 미국 가출원 제 62/950,803호 및 2020년 3월 12일 출원에 출원된 미국 가출원 제 62/988,441호에 관한 것으로, 이에 대한 우선권 이익을 주장한다. 전술한 특허 출원 각각의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 기술은 인슐린-Fc-융합 단백질(fusion protein)의 조성물 및 인간의 당뇨병을 치료하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
본 기술의 배경에 대한 다음의 설명은 본 기술의 이해를 지원하기 위한 것일 뿐이며 본 기술에 대한 선행 기술을 기재하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
당뇨병은 인슐린 결핍 및/또는 인슐린의 비효율적인 사용을 특징으로 하는 만성 질병이다. 인슐린이 절대적으로 결핍된 당뇨병은 제1형 또는 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)으로 분류된다. 제1형 당뇨병 환자는 췌장의 인슐린-생성 β-세포의 면역학적 파괴와 결합된 유전적 소인이 있는 것으로 생각된다. 이에 비해, 일부 인슐린은 여전히 생성할 수 있지만 인슐린 저항성 또는 기타 기능 장애로 인해 상대적 결핍이 있는 당뇨병은 제2형 또는 인슐린-비-의존성 당뇨병(NIDDM)으로 분류된다. 제2형 당뇨병은 유전적 소인, 비만 및 특정 약물과 관련이 있다. 여성은 또한 임신성 당뇨병이라고 하는 임신 중에 일시적인 인슐린 저항성이 생길 수 있다. 일부 성인은 느린 진행 형태의 자가면역 당뇨병인 성인의 잠재성 자가면역 당뇨병(LADA)으로 진단된다. 제1형 당뇨병과 유사하게, LADA에서는 췌장의 인슐린-생성 β-세포가 파괴되지만 더 느린 속도로 진행된다. 작은 백분율의 사람들이 인슐린 생성을 방해하는 상염색체 우성 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 임의의 몇몇의 유전적 형태의 당뇨병을 지칭하는 젊은 성인 발병 당뇨병(MODY)으로 진단된다.
제1형 당뇨병, LADA 또는 MODY 환자의 췌장이 충분한 인슐린을 생성하지 않는 경우, 환자는 일반적으로 고혈당증으로 표시되는 비정형 혈당증 표현형을 나타낸다. 이러한 경우 환자는 만성 인슐린 주사 요법으로 치료된다. 제2형 및 임신성 당뇨병에서 환자는 췌장에서 생성되는 인슐린을 적절하게 활용할 수 없기 때문에 종종 고혈당증을 나타낸다. 이러한 경우 환자는 식이 및 운동의 변화에 관계없이 경구 약물로 치료할 수 있으나; 많은 대상체들은 결국 제1형 당뇨병 병태 (베타 세포 질량의 유의한 손실을 동반하는 췌장의 염증성 질병)와 유사하게 진행되고, 외인성 인슐린에 의존하게 된다. 당뇨병을 치료하지 않고 방치하면 체중 감소, 식욕 부진, 구토, 탈수, 운동 기능 문제, 혼수 상태, 심지어 사망에 이를 수 있다.
미국 인구 중 대략 3천만 명의 사람들, 또는 9.4%가 당뇨병을 앓고 있다. 제1형 당뇨병은 진단된 모든 당뇨병 사례의 약 5%를 차지하며 약 150만 명에서 발병된다. 현재 당뇨병 치료법에는 다양한 단기-작용 (예를 들어 Humalog® (Eli Lilly, Indianapolis, IN) 및 NovoLog® (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)) 및 장기-작용 인슐린 산물 (예를 들어 Lantus® (Sanofi, Paris, France) 및 Levemir® (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark))이 포함되고, 이는 하루에 다수 회 또는 착용 가능한 피하 주입 펌프를 통해 피하 주사된다. 빈번한 주사의 부담은 치료 요법 순응도 부족 및 과소-투여(under-dosing)를 초래하여 장기적으로 좋지 않은 건강 결과를 초래한다. 사실, 심혈관 사건, 절단 및 케톤산증으로 인해 매년 700만 명이 넘는 미국 성인이 당뇨병과 관련하여 퇴원하는 것으로 보고된다. 또한, 다른 병태들 중에서 저혈당증 및 고혈당증 위기로 인해 매년 1,400만 건 이상의 당뇨병 관련 응급실 방문이 미국 성인들 사이에서 보고된다. 당뇨병 진단을 받은 20세 이상의 미국 성인 중 신장 질병의 추정 유병률은 36% 이상이다. 당뇨병은 미국에서 7번째 주요 사망 원인이며, 연간 총 비용이 2,450억 달러 이상으로 추정된다. 따라서, 이 질병에 대한 비용 효과적이고 덜 부담스러운 치료 옵션이 필요하다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편을 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편은 링커(linker)에 의해 연결되고, 융합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
(서열번호 87).
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편을 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편은 링커에 의해 연결되고, Fc-단편은 인간 유래(human origin)이고, 다음 서열을 포함하고:
(서열번호 77)
(상기 서열에서, X1은 S, D, A, 또는 R임),
인슐린 폴리펩타이드는 C-사슬(C-chain)을 통해 인슐린 A-사슬 유사체(analog)에 연결된 인슐린 B-사슬 유사체로 이루어지고, 인슐린 폴리펩타이드의 인슐린 B-사슬 유사체의 N-말단으로부터 16번째 아미노산 (즉, B16)은 알라닌이다 (즉, B16A).
일부 실시양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 서열 
(서열번호 9)(상기 서열에서, X1은 D가 아니고, X2는 H가 아님)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 다음 서열을 포함한다:
일부 입체형태에서, 링커는 서열 
(서열번호 13)을 포함한다. 입체형태에서, 링커는 서열 
(서열번호 67)을 포함한다. 입체형태에서, 링커는 서열 
(서열번호 11)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
(서열번호 89).
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
(서열번호 78).
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
(서열번호 80).
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
(서열번호 82).
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함한다:
(서열번호 84).
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 하기 배향의 도메인(domain)을 포함한다: (N-말단) - 인슐린 폴리펩타이드 - 링커 - Fc-단편 - (C-말단).
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 동종이량체(homodimer)이다. 예를 들어, 융합 단백질의 동종이량체 백분율은 90% 초과이다. 일부 예를 들어, 융합 단백질은 HEK293 세포 또는 CHO 세포를 사용하여 제조되고, 단백질 A 비드(Protein A beads) 또는 단백질 A 컬럼(column)을 사용한 정제 후 생성된 동종이량체 역가(titer)는 150 mg/L 초과이다. 실시양태에서, 융합 단백질에 대한 인슐린 수용체 IC50은 5000 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질에 대한 인슐린 수용체 IC50은 2400 nM 이하이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질의 인간 FcRn 수용체 EC50은 1000 ng/mL 이하이다. 예를 들어, 3000 ng/mL의 융합 단백질의 비오티닐화(biotinylated)-Fc(감마)RI 농도에서의 인간 Fc(감마)RI 수용체 분석 OD450 비율(Ratio)은 0.50 이하이다. 실시양태에서, 1000 ng/mL의 비오티닐화-Clq 농도에서의 인간 Clq 분석 OD450 비율은 0.35 이하이다. 실시양태에서, 융합 단백질은 약제학적 조성물로 제형화된다. 일부 예를 들어, 약제학적 조성물에서 융합 단백질의 농도는 약 3 mg/mL 이상이다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 피하 투여에 적합한다.
실시양태에서, 생리학적 유효량의 융합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물은 환자의 혈당 수준(blood glucose level)을 저하시키는 방법으로서 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 당뇨병으로 진단된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 피하 투여된다. 융합 단백질은 환자에게 매일, 매주 2회, 또는 매주 1회 투여될 수 있다. 일부 예를 들어, 융합 단백질은 0.025 내지 0.500 mg/kg/주의 용량(dose)으로 매주 1회 환자에게 투여된다.
실시양태에서, 세포는 융합 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 세포는 융합 단백질을 인코딩(encoding)하는 핵산으로 형질감염될 수 있다. 일부 예를 들어, 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포이다.
실시양태에서, 서열번호 87의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 (cDNA)은 다음 핵산 서열을 포함한다:
(서열번호 88).
실시양태에서, 서열번호 89의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 (cDNA)은 다음 핵산 서열을 포함한다:
(서열번호 90).
실시양태에서, 서열번호 78의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 (cDNA)은 다음 핵산 서열을 포함한다:
(서열번호 79).
실시양태에서, 서열번호 80의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 (cDNA)은 다음 핵산 서열을 포함한다:
(서열번호 81).
실시양태에서, 서열번호 82의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 (cDNA)은 다음 핵산 서열을 포함한다:
(서열번호 83).
실시양태에서, 서열번호 84의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 (cDNA)은 다음 핵산 서열을 포함한다:
(서열번호 85).
도 1은 예시적 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체의 개략도를 나타낸다.
도 2는 0일에 0.2 mg/kg으로 서열번호 31의 동종이량체를 정맥내 투여한 N=3 개에 대한 0일부터 3일까지의 평균 공복 혈당 수준을 나타낸다.
도 3은 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 4는 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 37, 및 서열번호 38의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 5는 0일에 0.2 mg/kg으로 서열번호 36의 동종이량체를 정맥내 투여한 N=3 개에 대한 0일부터 7일까지의 평균 공복 혈당 수준을 나타낸다.
도 6은 0일에 0.33 mg/kg으로 서열번호 36의 동종이량체가 피하 투여된 N=6 개에 대한 0일부터 7일까지의 평균 공복 혈당 수준을 나타낸다.
도 7은 0일(0.30 mg/kg), 28일(0.33 mg/kg), 35일(0.33 mg/kg), 42일(0.50 mg/kg), 49일(1.00 mg/kg) 및 56일(1.00 mg/kg)에 서열번호 36의 동종이량체가 피하 투여된 N=3 개에 대한 평균 항-약물 항체 역가(μg/mL)를 나타낸다.
도 8은 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 및 서열번호 42의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 9는 0일(0.33 mg/kg), 7일(0.50 mg/kg), 14일(0.50 mg/kg) 및 21일(0.50 mg/kg)에 서열번호 42의 동종이량체가 피하 투여된 N=1 개에 대한 평균 항-약물 항체 역가 (μg/mL)를 나타낸다.
도 10은 서열번호 43의 동종이량체로 0일(0.33 mg/kg) 및 14일(0.16 mg/kg)에 피하 투여된 N=1 개에 대한 평균 항-약물 항체 역가(μg/mL)를 나타낸다.
도 11은 서열번호 43의 동종이량체로 0.33 mg/kg으로 0일에 피하 투여된 N=2 개에 대한 0일부터 7일까지의 평균 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 12는 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 13은 서열번호 43, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 및 서열번호 52의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 14는 서열번호 43, 서열번호 48 및 서열번호 53의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 15는 서열번호 43, 서열번호 51, 서열번호 52 및 서열번호 54의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 16은 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 43, 서열번호 55, 서열번호 56 및 서열번호 57의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 17은 0일에 0.16 mg/kg으로 서열번호 28의 동종이량체가 피하 투여된 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 18은 0일(0.16 mg/kg), 14일(0.16 mg/kg), 28일(0.16 mg/kg) 및 42일(0.16 mg/kg)에 서열번호 28의 동종이량체가 피하 투여된 N=1 개에 대한 항-약물 항체 역가(μg/mL)를 나타낸다.
도 19는 0일에 0.33 mg/kg으로 서열번호 26의 동종이량체가 피하 투여된 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 20은 0일 (0.33 mg/kg), 15일 (0.16 mg/kg), 31일 (0.16 mg/kg) 및 45일 (0.15 mg/kg)에 서열번호 26의 동종이량체가 피하 투여된 0일부터 60일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 21은 0일(0.33mg/kg), 15일(0.16mg/kg), 31일(0.16mg/kg) 및 45일(0.15 mg/kg)에 서열번호 26의 동종이량체로 피하 투여된 N=1 개에 대한 항-약물 항체 역가(qg/mL)를 나타낸다.
도 22는 서열번호 58의 동종이량체로 0.16 mg/kg으로 0일에 피하 투여된 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 23은 0일에 0.16 mg/kg으로 서열번호 59의 동종이량체를 피하 투여한 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 24는 서열번호 61 및 서열번호 62의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 25는 0일에 0.16 mg/kg으로 서열번호 61의 동종이량체를 피하 투여한 N=1 개에 대한 0일 내지 7일의 공복 혈당 수준 %, 및 0일에 0.16 mg/kg으로 서열번호 62의 동종이량체를 피하 투여한 N=1 개에 대한 0일 내지 7일의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 26은 개에게 사료를 제공한 시간에 더하여 서열번호 30의 동종이량체를 피하 투여한 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 27은 서열번호 76, 서열번호 91, 및 서열번호 78의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 28은 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 및 서열번호 95의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 29는 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 및 서열번호 86의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 30은 서열번호 87, 서열번호 96, 서열번호 78, 서열번호 97, 서열번호 89, 및 서열번호 98의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 31은 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 78) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 79)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 32는 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 80) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 81)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 33은 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 82) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 83)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 34는 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 84) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 85)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 35는 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 87) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 88)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 36은 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 89) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 90)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 37은 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 86) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 100)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 38은 서열번호 87 및 서열번호 89의 동종이량체를 300 μg/kg의 용량으로 피하 주사하기 1시간 전에 금식한 N=12 Balb/c 마우스에 대한 0시간 내지 10시간의 평균 공복 혈당 수준을 나타낸다.
도 2는 0일에 0.2 mg/kg으로 서열번호 31의 동종이량체를 정맥내 투여한 N=3 개에 대한 0일부터 3일까지의 평균 공복 혈당 수준을 나타낸다.
도 3은 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 4는 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 37, 및 서열번호 38의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 5는 0일에 0.2 mg/kg으로 서열번호 36의 동종이량체를 정맥내 투여한 N=3 개에 대한 0일부터 7일까지의 평균 공복 혈당 수준을 나타낸다.
도 6은 0일에 0.33 mg/kg으로 서열번호 36의 동종이량체가 피하 투여된 N=6 개에 대한 0일부터 7일까지의 평균 공복 혈당 수준을 나타낸다.
도 7은 0일(0.30 mg/kg), 28일(0.33 mg/kg), 35일(0.33 mg/kg), 42일(0.50 mg/kg), 49일(1.00 mg/kg) 및 56일(1.00 mg/kg)에 서열번호 36의 동종이량체가 피하 투여된 N=3 개에 대한 평균 항-약물 항체 역가(μg/mL)를 나타낸다.
도 8은 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 및 서열번호 42의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 9는 0일(0.33 mg/kg), 7일(0.50 mg/kg), 14일(0.50 mg/kg) 및 21일(0.50 mg/kg)에 서열번호 42의 동종이량체가 피하 투여된 N=1 개에 대한 평균 항-약물 항체 역가 (μg/mL)를 나타낸다.
도 10은 서열번호 43의 동종이량체로 0일(0.33 mg/kg) 및 14일(0.16 mg/kg)에 피하 투여된 N=1 개에 대한 평균 항-약물 항체 역가(μg/mL)를 나타낸다.
도 11은 서열번호 43의 동종이량체로 0.33 mg/kg으로 0일에 피하 투여된 N=2 개에 대한 0일부터 7일까지의 평균 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 12는 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 13은 서열번호 43, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 및 서열번호 52의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 14는 서열번호 43, 서열번호 48 및 서열번호 53의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 15는 서열번호 43, 서열번호 51, 서열번호 52 및 서열번호 54의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 16은 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 43, 서열번호 55, 서열번호 56 및 서열번호 57의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 17은 0일에 0.16 mg/kg으로 서열번호 28의 동종이량체가 피하 투여된 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 18은 0일(0.16 mg/kg), 14일(0.16 mg/kg), 28일(0.16 mg/kg) 및 42일(0.16 mg/kg)에 서열번호 28의 동종이량체가 피하 투여된 N=1 개에 대한 항-약물 항체 역가(μg/mL)를 나타낸다.
도 19는 0일에 0.33 mg/kg으로 서열번호 26의 동종이량체가 피하 투여된 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 20은 0일 (0.33 mg/kg), 15일 (0.16 mg/kg), 31일 (0.16 mg/kg) 및 45일 (0.15 mg/kg)에 서열번호 26의 동종이량체가 피하 투여된 0일부터 60일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 21은 0일(0.33mg/kg), 15일(0.16mg/kg), 31일(0.16mg/kg) 및 45일(0.15 mg/kg)에 서열번호 26의 동종이량체로 피하 투여된 N=1 개에 대한 항-약물 항체 역가(qg/mL)를 나타낸다.
도 22는 서열번호 58의 동종이량체로 0.16 mg/kg으로 0일에 피하 투여된 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 23은 0일에 0.16 mg/kg으로 서열번호 59의 동종이량체를 피하 투여한 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 24는 서열번호 61 및 서열번호 62의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 25는 0일에 0.16 mg/kg으로 서열번호 61의 동종이량체를 피하 투여한 N=1 개에 대한 0일 내지 7일의 공복 혈당 수준 %, 및 0일에 0.16 mg/kg으로 서열번호 62의 동종이량체를 피하 투여한 N=1 개에 대한 0일 내지 7일의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 26은 개에게 사료를 제공한 시간에 더하여 서열번호 30의 동종이량체를 피하 투여한 N=1 개에 대한 0일부터 7일까지의 공복 혈당 수준 %를 나타낸다.
도 27은 서열번호 76, 서열번호 91, 및 서열번호 78의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 28은 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 및 서열번호 95의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 29는 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 및 서열번호 86의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 30은 서열번호 87, 서열번호 96, 서열번호 78, 서열번호 97, 서열번호 89, 및 서열번호 98의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
도 31은 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 78) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 79)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 32는 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 80) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 81)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 33은 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 82) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 83)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 34는 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 84) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 85)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 35는 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 87) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 88)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 36은 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 89) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 90)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 37은 융합 단백질의 리더 서열 (서열번호 86) 및 이에 상응하는 핵산 서열 (서열번호 100)을 포함하는 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
도 38은 서열번호 87 및 서열번호 89의 동종이량체를 300 μg/kg의 용량으로 피하 주사하기 1시간 전에 금식한 N=12 Balb/c 마우스에 대한 0시간 내지 10시간의 평균 공복 혈당 수준을 나타낸다.
덜 빈번한 투여(예를 들어, 주 1회 주사)가 필요한 인슐린 치료는 환자에게 덜 부담이 될 것이며, 이는 더 나은 순응도, 더 나은 글루코스 제어 및 궁극적으로 더 나은 장기적 건강 결과로 이어진다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 인간 임상 용도를 위한 제안된 초-장기-작용 인슐린 치료는 생체내 작용을 연장하기 위해 인간 Fc-단편을 사용하는 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함한다. 당뇨병에 대한 초-장기-작용 치료에 적합한 인슐린-Fc-융합 단백질은 다양한 설계 목적을 충족해야 한다. 당뇨병에 대한 초-장기-작용 치료에 적합한 인슐린-Fc-융합 단백질은 포유류 세포, 예를 들어 인간 배아 신장(HEK, 예를 들어, HEK293) 세포에서 적절한 동종이량체 산물의 허용 가능한 역가(예를 들어, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포로부터 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포로부터 75 mg/L 초과, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포로부터 100 mg/L 초과, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포로부터 150 mg/L 초과 등)로 제조 가능해야 한다. 150 mg/L 초과의 동종이량체 역가를 갖는 인간 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태만만이 본 발명에 유용한 것으로 고려되며, 이는 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 동종이량체 역가가 이 수준보다 낮으면 비교적 상용화 인간 인슐린 시장에 대한 낮은 제조 비용 요건을 충족하는 안정적으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 동종이량체 역가가 상업적 생성으로 이어지지 않을 것이라는 경험이 입증되었기 때문이다.
또한, 인슐린-Fc-융합 단백질은 유의한 친화도로 IR에 결합해야 하며(예를 들어, 5000 nM 미만의 IC50, 4000 nM 미만의 IC50, 3000 nM 미만의 IC50, 2400 nM 미만의 IC50, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만의 IC50 등), 이는 4℃ IM-9 IR 결합 분석에서 측정되는 바와 같다. 경험에 따르면, 5000 nM 미만의 IR 활성 IC50 값을 나타내는 분자만이 필요한 생활성(bioactivity)을 나타낼 가능성이 있는 것으로 고려된다. 바람직한 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질은 2400 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만의 IR 활성 IC50 값을 나타낸다. 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 또한 덜 빈번한 투여를 정당화하기 위해 생체내에서 지속되는 생활성을 나타내야 한다(예를 들어, 약 2시간, 6시간, 9시간, 12시간, 18시간, 1일, 1.5일, 2일, 2.5일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상의 글루코스 저하 활성을 나타내야 함). 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 또한 생체내에서 연장된 계 체류 시간을 나타내야 한다(예를 들어, 혈청 반감기가 3일 이상이어야 함). 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 지속된 생활성 및 연장된 체류 시간은 항체 및 Fc-융합 단백질의 연장된 생체내 제거 반감기에 관여하는 FcRn 수용체에 결합하는 능력에 의해 예측될 수 있다. FcRn 수용체 활성은 일반적으로 인슐린-Fc-융합 단백질이 이의 최대 결합 (즉, EC50 값)의 절반에 도달하도록 하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도에 의해 측정되며, 이는 마이크로플레이트 판독기에서 측정된 OD 450 nm 값을 사용한 분석(예를 들어, 효소 결합 면역흡착제 분석(EFISA) 분석)에서 측정되는 바와 같다. 경험에 기반하여, 1500 ng/mL 이하(더욱 바람직하게는 1000 ng/mL 미만)의 인간 FcRn 수용체 EC50 값을 나타내는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 주 1회 투여를 정당화하기에 충분히 긴 반감기를 나타낼 가능성이 가장 높다.
마지막으로, 당뇨병과 같은 만성 질병의 치료에 유용하기 위해, 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 항-약물 항체, 특히 반복 투여 후 분자의 생활성을 중화시키는 항체의 생성을 유도해서는 안된다. 불리한 면역원성 반응을 유도하는 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 경향은 먼저 옵소닌화 분자의 포식 작용, 염증 매개체의 방출 및 항체-의존성 세포 독성을 포함하여 많은 면역계 효과기 기능에서 핵심적인 역할을 하는 Fc(감마)RI 수용체에 결합하는 능력에 의해 예측될 수 있다. Fc(감마)RI 수용체 활성은 일반적으로 소정의 농도의 인슐린-Fc-융합 단백질에서 효소 결합 면역흡착 분석법(EFISA) 분석에서 마이크로플레이트 판독기에서 얻은 450 nm 파장에서의 흡광도(OD450) 값으로 측정된다. 경험에 기반하여, 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서 인간 Fc(감마)RI 수용체 분석 OD450 비율(이 비율에 대한 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 서열번호 76임)이 0.50 이하로 나타나는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 주 1회 반복 투여를 정당화하기에 충분히 낮은 면역원성을 나타낼 가능성이 있다. 유해한 면역원성 반응을 유도하는 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 경향은 또한 식세포에 의한 결합 분자 제거, 추가 식세포를 유도하는 염증 및 세포-사멸 막 공격 복합체의 활성화를 유도하는 보체 전달계를 활성화하는 보체 성분 1q(C1q)에 결합하는 능력에 의해 예측될 수 있다. C1q 활성은 일반적으로 마이크로플레이트에 코팅된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 소정의 농도에서 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 분석에서 마이크로플레이트 판독기에서 얻은 OD450 값에 의해 측정된다. 경험에 기반하여, 1000 ng/mL 미만의 비오티닐화-C1q 농도에서 인간 C1q 수용체 분석 OD450 비율(이 비율에 대한 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 서열번호 76임)이 0.35 이하인 것으로 나타나는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 주 1회 반복 투여를 정당화하기에 충분히 낮은 면역원성을 나타낼 가능성이 있다.
인간 임상 용도를 위한 제안된 초-장기-작용 인슐린 치료는 생체내 작용을 연장하기 위해 인간 Fc-단편을 사용하는 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함한다. 다양한 설계의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 거동을 이해하기 위해, 개에 대한 초-장기-작용 인슐린으로 유용한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 먼저 고려하였다. 인간 Fc-단편은 면역원성이 있어 개의 항약물 항체 생성을 유도할 수 있을 것으로 예상되기 때문에 인간 Fc-단편을 개 Fc-단편으로 대체하였다.
그러나, 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 인간 Fc-단편과 임의의 개 Fc-단편 사이의 단순한 교체가 반드시 허용 가능한 동종이량체 역가(예를 들어, 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가) 또는 충분히 높은 NAOC 값(예를 들어, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC)을 갖는 산물을 생성하지는 않았다. 예를 들어, 일부 경우에는 Fc-단편에 대한 특정 이소형(예를 들어, 개 IgGB)만이 설계 목적을 충족하기에 충분히 높은 동종이량체 역가(예를 들어, 50 mg/L 초과의 개 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 역가) 및 허용 가능하게 높은 NAOC 값(예를 들어, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC)을 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하였다. 다른 경우에, 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 인슐린 폴리펩타이드의 특정 아미노산은 표적 종에서 면역원성인 것으로 밝혀졌으며, 이에 따라 허용 가능한 높은 NAOC 값(예를 들어, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과 NAOC 값) 및 3차 주간 피하 투여 후 0.50 초과의 NAOCR 값을 갖는 표적 종에서 비-면역원성 및 생활성인 상대적으로 적은 수의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 찾기 위해 부위 지정 돌연변이가 필요했다.
추가의 경우에, Fc-단편이 글리코실화를 방지하도록 돌연변이되어 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 면역원성을 추가로 감소시켰을 때, Fc-단편의 특정 아미노산 돌연변이만이 적절한 동종이량체 역가(예를 들어, 50 mg/L 초과의 개 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대한 동종이량체 역가) 및 NAOC 값(예를 들어, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC 값)을 유도한다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 또한, 적절한 동종이량체 역가(예를 들어, 50 mg/L 초과의 개 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 동종이량체 역가) 및 NAOC 값(예를 들어, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC 값)을 갖고, 또한 3차 주간 피하 투여 후 0.05 초과의 NAOCR 값을 달성하는 Fc-돌연변이된 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하기 위해 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 인슐린 보체에 추가 돌연변이가 필요한 것으로 나타났다.
인간 초-장기-작용 인슐린의 경우, 동종이량체 역가를 최대화하고 제조 비용을 감소시키기 위해, 인간 IgG 분자의 상이한 이소형(예를 들어, IgG1 및 IgG2)에 기반한 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하였다. 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 IgG2 분자에 기반한 Fc-단편에서 IgG1 분자에 기반한 Fc-단편으로의 교체가 IR 또는 FcRn 결합 활성을 유의하게 손상시키지 않으면서 평균 동종이량체 역가를 50% 이상 증가시켰다는 것이 다소 예기치 않게 발견되었다. 그러나, 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서 인간 Fc(감마)RI 수용체 분석 OD450 비율(이 비율에 대한 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 서열번호 76임)이 0.50을 훨씬 초과하고, 1000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 인간 C1q 수용체 분석 OD450 비율(이 비율에 대한 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 서열번호 76임)이 0.35를 훨씬 초과하는 것을 감안할 때, 생성된 IgG1-유래 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 면역계와 유해하게 상호작용하고 중화 항체를 발생시킬 가능성이 훨씬 더 높은 것으로 고려되었다.
부적절한 면역원성을 감소시키기 위한 시도에서, 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 숙주 세포에서 합성 동안 Fc-단편의 글리코실화를 방지하도록 돌연변이되었다. 구체적으로, Fc(감마)RI 및 C1q 상호작용을 감소시키면서 개선된 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체-수율을 유지하기 위해, IgG1 Fc 영역의 중쇄의 CH2 도메인에서 보존된 아스파라긴(N)-글리코실화 부위를 상이한 아미노산(예를 들어, S, D, A, R 및 Q)으로 돌연변이시켰다. 흥미롭게도, S, D, A 및 R 돌연변이된 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 글리코실화 모 입체형태에 비해 개선된 동종이량체 역가를 제공했으나; 보존된 아스파라긴(N)-글리코실화 부위에서 Q 돌연변이를 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 동종이량체 역가는 제조 요건의 낮은 비용을 지원하기에는 너무 낮았다(즉, 인간 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대한 150 mg/L 설계 목적 미만). 추가로, Fc(감마)RI 및 C1q 결합은 S, D, A 및 R 돌연변이된 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대해 유의하게 감소하였다. 그러나, 이러한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 수율 및 면역원성의 개선은 예상외로 글리코실화 모 입체형태에 비해 더 낮은 FcRn 결합 친화도 및 유의하게 더 낮은 IR 결합에 의해 상쇄되었으며, 이는 생체내 생활성 및 체류 시간의 허용 불가능한 감소를 나타낸다.
개 유래의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 예기치 않게 발견된 바와 같이, 인간 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 인슐린 서열의 단일 아미노산을 변경함으로써, S, D, A 및 R 돌연변이된 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 면역원성 및 수율의 개선이 유지되거나 개선되고, IR 및 FcRn 결합 친화도가 원 글리코실화 모 입체형태에 비해 감소되기 보다는 증가하였다(예를 들어, 더 낮은 IR 분석 IC50 값). 따라서, 생성된 비-글리코실화 돌연변이 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 허용가능한 생체내 글루코스 저하 효능 및 연장된 체류 시간을 나타낼 것으로 예상된다. 예기치 않게, 보존된 아스파라긴(N)-글리코실화 부위에서 Q 돌연변이로 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 동일한 아미노산을 변경하면 이미 저조한 동종이량체 역가가 유의하게 감소했다.
S, D, A 및 R 비-글리코실화 돌연변이 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 특성이 추가로 조작될 수 있는 방법을 이해하기 위해 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 링커 영역을 변형시키고, 인슐린 폴리펩타이드를 Fc-단편으로 연결하였다. 테스트 결과는 링커의 부재 하에 생성된 개 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 동종이량체 역가가 허용할 수 없을 정도로 낮음을 나타내었다(즉, 50 mg/L 미만). 동일한 길이의 링커를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 경우, 동종이량체 역가, IR 및 FcRn 수용체 결합, 및 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 Fc(감마)RI 및 C1q 결합 측면에서 특정 아미노산 서열이 다른 것보다 유리함이 발견되었다.
따라서, 각각 돌연변이된 인슐린 폴리펩타이드, 비-글리코실화-Fc-단편, 및 돌연변이된 인슐린 폴리펩타이드와 글리코실화되지 않은 Fc-단편 사이의 링커를 포함하는 특이적 제조가능 고순도 장기-작용 생활성 비-면역원성 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 제공되며, 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 허용 가능한 높은 동종이량체 역가(예를 들어, 150 mg/L 초과 동종이량체 역가), IR 분석 IC50 값(예를 들어, 5000 nM 미만, 2400 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만의 IC50 ), 인간 FcRn 수용체 EC50 값(예를 들어, 1500 ng/L 이하 및 더욱 바람직하게는 1000 ng/mL 미만의 EC50), 인간 Fc(감마)RI 수용체 OD 450 비율(예를 들어, 이 비율에 대한 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 서열번호 76인 경우, 0.50 이하의 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 수용체 농도에서의 OD450 비율), 및 인간 C1q 수용체 OD 450 비율(예를 들어, 이 비율에 대한 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 서열번호 76인 경우 0.35 이하의 1000 ng/mL의 비오티닐화-Clq 농도에서의 OD450 비율)의 설계 목적을 충족한다. 이들 예시적인 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 주 1회 반복 투여를 정당화하기에 충분히 긴 반감기를 나타내어 당뇨병 치료에 적합하게 만드는 충분히 낮은 면역원성을 나타낼 것으로 예상된다.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수형 관사 ("a" 및 "an")은 관사의 문법적 대상 중 하나 이상, 예를 들어 적어도 하나를 지칭한다. 본 명세서에서 "~를 포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 "하나"라는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정밀도가 주어지면 측정된 양에 대해 허용 가능한 오차 정도를 의미한다. 예시적인 오차 정도는 소정의 값 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 일반적으로 10% 이내, 보다 일반적으로 5% 이내이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 장애(예를 들어, 본 명세서에 기재된 장애)를 치료하는데 효과적인 분자, 화합물, 접합체 또는 물질의 양, "치료 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 단일 또는 다회 용량 투여(들) 시, 이러한 치료가 없을 때 예상되는 것 이상으로 대상체를 치료하거나 장애(예를 들어, 본 명세서에 기재된 장애)가 있는 대상체를 치료, 완화, 경감 또는 개선하는데 효과적인 분자, 화합물, 접합체 또는 물질의 양을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유사체"는 화학 구조가 다른 화합물 또는 접합체와 유사하지만 적어도 하나의 측면에서 상이한 화합물 또는 접합체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물 또는 접합체, 예를 들어 인슐린)를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 면역글로불린 분자(Ig), 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원과 특이적으로 결합하는, 예를 들어 면역반응하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 도메인"은 면역글로불린의 가변 또는 불변 영역을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 도메인"은 면역글로불린의 가변 또는 불변 영역을 지칭한다. 항체가 포유류(예를 들어, 인간)의 경우에 IgA, IgM, 또는 IgG와 같은 몇 개의 부류를 포함한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 면역글로불린의 부류는 개의 경우 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD 및 인간의 경우 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은 상이한 이소형으로 추가로 분류될 수 있다. 당업자는 소정의 면역글로불린 부류의 면역글로불린 이소형이 서로 다른 아미노산 서열, 구조 및 기능적 특성(예를 들어, Fc(감마) 수용체에 대한 상이한 결합 친화도)을 포함할 것임을 인식할 것이다. "~와 특이적으로 결합하다" 또는 "~와 면역반응하다"는 항체가 적절한 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하고 다른 폴리펩타이드에 대해 더 낮은 친화도를 가지며, 예를 들어 다른 폴리펩타이드와 반응하지 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "곡선-하-면적" 또는 "AUC"는 인슐린-Fc-융합 단백질의 소정의 용량 투여 후 대상체에 대한 FBGL%(공복 혈당 수준) 대 시간 곡선 하의 혼입 면적을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "곡선 상 면적(area-over-curve)" 또는 "AOC"는 AOC가 FBGF% 아래의 총 가능한 면적 대 시간 곡선 및 AUC 값 사이의 차이와 같도록 인슐린-Fc-융합 단백질의 생물학적 효능의 척도로서 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "정규화된 곡선 상 면적", "정규화된 AOC", 또는 "NAOC"는 AOC 값을 투여된 인슐린-Fc-융합 단백질의 실제 용량으로 나눈 값이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "정규화된 AOC 비율" 또는 "NAOCR"은 인슐린-Fc-융합 단백질의 특정 투여로 인한 NAOC 대 일련의 투여시 인슐린-Fc-융합 단백질의 1차 투여로 인한 NAOC의 비율이다. 따라서 NAOCR은 반복 투여 후 인슐린-Fc-융합 단백질의 생물학적 활성 변화의 척도를 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "생활성", "활성", "생물학적 활성", "효능", "생활성 효능" 또는 "생물학적 효능"은 인슐린-Fc-융합 단백질이 표적 대상체에서 IR을 활성화시키고/거나, 혈당 수준의 감소를 유도하는 정도를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "시험관내 활성" 또는 "IR 활성"은 인슐린-Fc-융합 단백질이 IR에 결합하는 친화도를 지칭하며, 일반적으로 인슐린-Fc-융합 단백질이 경쟁 결합 분석에서 IR의 인슐린 참조 표준의 절반을 대체하는 농도(즉, IC50)에 의해 측정된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "생체내 활성"은 인슐린-Fc-융합 단백질의 투여 후 표적 대상체의 공복 혈당 수준의 감소 정도 및 기간을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "생합성", "재조합 합성" 또는 "재조합으로 제조된"은 세포를 인슐린-Fc-융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, 벡터) (예를 들어, 전체 인슐린-Fc-융합 단백질이 단일 핵산 분자에 의해 인코딩되는 경우)로 형질감염시킴으로써 인슐린-Fc-융합 단백질이 숙주 세포내에서 발현되는 과정을 지칭한다. 예시적인 숙주 세포는 포유류 세포, 예를 들어 HEK293 세포 또는 CHO 세포를 포함한다. 세포는 당업계의 표준 방법을 사용하여 배양될 수 있고 발현된 인슐린-Fc-융합 단백질은 당업계의 표준 방법을 사용하여 세포 배양물로부터 수확 및 정제될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 표면 수용체"는 일반적으로 세포막의 외부 표면에 존재하고, 가용성 분자, 예를 들어 혈액 공급에서 순환하는 분자와 상호작용하는 단백질과 같은 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 호르몬 수용체(예를 들어, 인슐린 호르몬 수용체 또는 인슐린 수용체(IR)) 또는 항체의 Fc-단편 또는 Fc 영역에 결합하는 Fc 수용체(예를 들어, Fc(감마)) 수용체, 예를 들어 Fc(감마)RI, 또는 Fc 신생아 수용체, 예를 들어 FcRn)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "시험관내 활성" 또는 "Fc(감마) 수용체 활성" 또는 "Fc(감마) 수용체 결합" 또는 "FcRn 수용체 활성" 또는 "FcRn 결합"은 인슐린-Fc-융합 단백질이 Fc 수용체(예를 들어, Fc(감마) 수용체 또는 FcRn 수용체)에 결합하는 친화도를 지칭하고, 마이크로플레이트 판독기에서 측정된 OD 450 nm 값을 사용하여 분석(예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 분석)에서 측정되는 바와 같이, 일반적으로 인슐린-Fc-융합 단백질이 최대 결합의 절반(즉, EC50 값)에 도달하도록 하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도에 의해 측정된다. 대안적으로, 인슐린-Fc-융합 단백질이 Fc 수용체(예를 들어, Fc(감마) 수용체 또는 FcRn 수용체)에 결합하는 친화도는 인슐린-Fc-융합 단백질의 소정의 농도에서의 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 분석에서 마이크로플레이트 판독기에서 얻은 OD 450 nm 값에 의해 측정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "C1q" 또는 "보체 성분 1q"는 선천 면역계의 일부인 보체계에 관여하는 단백질 복합체를 의미한다. Clq는 Clr 및 Cls와 함께 Cl 복합체를 형성한다. C1q는 수지상 세포에 의한 T 세포 및 B 세포로의 특이적 항원 제시에 관여하는 역할을 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "공복 혈당 수준" 또는 "FBGL"은 음식이 투여되지 않는 기간이 종료되고 인슐린-Fc-융합 단백질이 투여되는 시점 직전에 표적 대상체의 평균 혈당 수준을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "공복 혈당 수준 퍼센트", 공복 혈당 수준%", 또는 "FBGL%"이라는 용어는 소정의 혈당 수준 대 공복 혈당 수준에 100을 곱한 비율을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성의" 또는 "면역원성"은 소정의 분자(예를 들어, 본 발명의 인슐린-Fc-융합 단백질)가 표적 대상체의 면역계를 자극하여 분자의 반복 투여 후, 대상체가 상기 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(즉, 항-약물 항체)를 발생시키는 능력을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "중화", "중화 항체" 또는 "중화 항-약물 항체"는 항체가 표적 대상체에서 화합물의 생물학적 활성을 방해하는 능력을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성 에피토프", '면역원성 핫스팟(hot spot)" 또는 "핫스팟"은 항-약물 항체의 중간 또는 강한 결합에 관여하는 소정의 분자(예를 들어, 본 발명의 인슐린-Fc-융합 단백질)의 돌연변이 또는 에피토프를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인슐린 참조 표준"은 (i) 포유류(예를 들어, 개 또는 인간)로부터의 천연 발생 인슐린; (ii) Fc-단편을 포함하지 않는 인슐린 폴리펩타이드; 또는 (iii) 표준 치료 인슐린(예를 들어, 시판 인슐린) 중 어느 하나이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단량체"는 단일 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 또는 융합 단백질을 지칭한다. 실시양태에서, "단량체"는 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 또는 융합 단백질, 예를 들어 단일 폴리펩타이드이고, 인슐린 및 Fc-단편 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결되어 단일 폴리펩타이드를 형성한다. 실시양태에서, 단량체는 단일 핵산 분자에 의해 인코딩된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "N-말단"은 아미노산의 알파-아미노기(예를 들어, 두 번째 탄소 원자가 아미노산의 카보닐기의 일부인 경우, 두 번째 탄소 원자에 인접 위치하는 하나의 탄소 원자에 공유결합된 유리 아미노)인 유리 아민기를 포함하는 아미노산에 의해 개시되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 개시를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "C-말단"은 카복실산 기의 탄소 원자가 아미노산의 알파-아미노기에 인접 위치하는 경우, 카복실산기를 포함하는 아미노산에 의해 종결되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 말단을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "OD450", "450 nm에서의 광학 밀도", 및 "450 nm에서의 흡광도"는 상호 혼용될 수 있고 마이크로플레이트 판독기를 사용한 분석, 예를 들어, 마이크로플레이트-기반 분석, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석, 예를 들어 ELISA 분석에서 샘플을 통과하는 450 nm에서의 흡광도를 판독하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 특정 분석에 대한 "OD450 비율"은 특정 시간에 구동된 1차 시험 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 얻은 OD450 값을 다른 시간에 2차 시험 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 얻은 OD450 값과 비교하는 방법을 의미한다. OD450 비율은 1차 시험 항목에 대한 OD450 값을 참조 인슐린-Fc-융합 단백질의 OD450 값으로 나누어 얻는다. 유사하게, 2차 시험 항목에 대한 OD450 값을 1차 시험 항목의 OD450 비율을 계산하는데 사용된 동일한 참조 인슐린-Fc-융합 단백질의 OD450 값으로 나눔으로써 2차 시험 항목에 대한 두 번째 OD450 비율을 얻을 수 있다. 그 결과, 1차 시험 인슐린-Fc-융합 단백질과 2차 시험 인슐린-Fc-융합 단백질의 분석 특성을 비교할 수 있다. OD450 비율을 계산하는데 사용된 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 서열번호 76이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "약역학" 또는 "PD"는 일반적으로 대상체에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 생물학적 효과를 지칭한다. 구체적으로, 본 명세서에서 PD는 인슐린-Fc-융합 단백질의 투여 후 대상체에서 시간 경과에 따른 공복 혈당 수준의 감소의 척도를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "약동학" 또는 "PK"는 일반적으로 흡수, 분포, 대사 및 배출의 측면에서 인슐린-Fc-융합 단백질과 대상체의 신체의 특징적인 상호작용을 지칭한다. 구체적으로, 본 명세서에서 PK는 인슐린-Fc-융합 단백질 투여 후 소정의 시간에 대상체의 혈액 또는 혈청 내 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "반감기"는 약물 제거를 위한 1차 지수 붕괴 모델로부터 계산된 바와 같이 대상체의 혈액 또는 혈청 내 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도가 원래 값의 절반에 도달하는데 걸리는 시간을 지칭한다. 더 큰 "반감기" 값을 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질은 표적 대상체에서 더 긴 작용 지속시간을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에서 "서열 동일성" "서열 상동성" "상동성" 또는 "동일한"이라는 용어는 변이체의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열의 특정 인접 절편이 정렬되고 참조 서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열과 비교되는 경우, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 변이체 및 참조 서열 내에 존재함을 기재한다. 서열 정렬 및 서열 간의 동일성을 결정하는 방법은 유사성을 위해 서열을 배열, 정렬 및 비교하는 Clustal Omega의 사용을 포함하여 당업계에 공지되어 있으며, 소프트웨어는 각 서열 위치를 강조 표시하고 해당 위치의 모든 서열을 비교하고 다음 점수 중 하나를 지정한다: 하나의 완전히 보존된 잔기가 있는 서열 위치에 대한 "*"(별표), ";"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5 초과의 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 나타내고, "."(마침표)는 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5 이하의 점수로 약간 유사한 특성 그룹 간의 보존을 나타내고, "-"(대시)는 서열 간격을 나타내고, 이는 서열의 특정 범위 내 특정 비교 세트 내에 국소 상동성이 존재하지 않음을 의미하고, 빈 공간 " "은 비교된 서열에서 해당 특정 위치에 대한 서열 상동성이 거의 또는 전혀 없음을 나타낸다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York); and ALIGN program Dayhoff (1978) in Atlas of Polypeptide Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.)]을 참조한다. 2개의 뉴클레오타이드 서열의 최적 정렬과 관련하여, 변이체 뉴클레오타이드 서열의 인접 절편은 참조 뉴클레오타이드 서열에 대해 추가 뉴클레오타이드 또는 결실된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 유사하게, 2개의 아미노산 서열의 최적 정렬을 위해, 변이체 아미노산 서열의 인접 절편은 참조 아미노산 서열에 대해 추가의 아미노산 잔기 또는 결실된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 참조 뉴클레오타이드 서열 또는 참조 아미노산 서열과의 비교에 사용되는 인접 절편은 적어도 6, 10, 15, 또는 20개의 인접 뉴클레오타이드, 또는 아미노산 잔기를 포함할 것이고, 30, 40, 50, 100 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기일 수 있다. 변이체의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열에 갭을 포함하는 것과 관련된 증가된 서열 동일성에 대한 수정은 갭 페널티를 할당하여 수행할 수 있다. 서열 정렬 방법은 당업계에 공지되어 있다.
실시양태에서, 두 서열 사이의 동일성 또는 "상동성" 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성된다. 예를 들어, 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는 12의 갭 개방 패널티 및 2의 갭 확장 패널티, BLOSUM 매트릭스 62로 아핀(affine) 6 갭 검색을 사용하는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 사용하여 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 문헌[Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다. 실시양태에서, 뉴클레오타이드 서열의 동일성 퍼센트는 25의 갭 개방 패널티 및 5의 갭 확장 패널티를 사용하는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 사용하여 결정된다. 서열 동일성의 이러한 결정은 예를 들어, TimeLogic의 DeCypher 하드웨어 가속기를 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성"은 예를 들어 베타 가닥, 나선 및 접힘의 공통 구조 특성 및 공통 공간 분포를 위치시켜 2개 이상의 단백질을 비교하는데 사용된다. 따라서 상동 단백질 구조는 공간 분석에 의해 정의된다. 구조적 상동성을 측정하는 단계는 공간의 기하학적 위상 특징을 계산하는 단계를 포함한다. 3차원(3D) 단백질 구조를 생성하고 분석하는데 사용되는 한 가지 접근 방식은 3D 유사성이 2D 유사성을 반영한다는 사실에 기반하여 유사한 서열을 찾는 방식으로 작동하는 상동성 모델링(비교 모델링 또는 정보-기반 모델링이라고도 함)이다. 상동 구조는 서열 유사성을 필요 조건으로 의미하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 질병 또는 장애, 예를 들어 당뇨병 또는 본 명세서에 기재된 다른 질병 또는 장애를 갖는 개 동물 및 인간, 또는 정상 대상체를 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "역가" 또는 "수율"은 세포 배양 부피당 생합성(예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어, HEK293 세포 또는 CHO 세포에서 생성됨)으로부터 생성된 융합 단백질 산물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질)의 양을 지칭한다. 산물의 양은 생성 공정의 임의의 단계(예를 들어, 정제 전 또는 후)에서 결정할 수 있지만 수율 또는 역가는 항상 원 세포 배양물의 부피당 표시된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "산물 수율" 또는 "총 단백질 수율"은 세포에 의해 발현되고 하나 이상의 친화도 크로마토그래피 단계를 통해 정제된 인슐린-Fc-융합 단백질(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G)의 총량을 지칭하고 인슐린-Fc-융합 단백질의 단량체, 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체, 및 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체의 고차 분자 응집체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "동종이량체 퍼센트" 또는 "동종이량체 %"는 적절한 동종이량체인 융합 단백질 산물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질)의 비율을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "동종이량체 역가"는 세포 배양 부피당 보고된 단백질 A 정제 단계 후 동종이량체 % 및 총 단백질 수율의 산물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 질병 또는 장애가 있는 대상체를 질병 또는 장애의 적어도 하나의 증상이 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 관해, 개선 또는 개선되도록 하는 요법, 예를 들어 본 명세서에 기재된 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 투여에 대상체를 적용하는 것을 지칭한다. 치료는 질병 또는 장애, 또는 질병 또는 장애의 증상을 완화, 경감, 변경, 관해, 개선, 개선시키거나, 이에 영향을 미치는 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 질병 또는 장애 증상의 퇴행 또는 악화를 억제할 수 있다.
인슐린-Fc-융합 단백질 성분 및 구조
본 개시내용은 펩타이드 링커를 통해 종-특이적 Fc-단편에 연결된 인슐린 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질(즉, 인슐린-Fc-융합 단백질)의 조성물, 및 당뇨병(예를 들어, 인간 및/또는 개)을 치료하는 이의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "융합 단백질" 및 "인슐린-Fc-융합 단백질"은 예를 들어, 펩타이드 결합을 통해 공유결합된 상이한 공급원(상이한 단백질, 폴리펩타이드, 세포 등)으로부터의 하나 초과의 부분을 포함하는 단백질을 지칭한다. 인슐린-Fc-융합 단백질은 (i) 각 부분을 인코딩하는 유전자를 단일 핵산 분자에 연결하고 (ii) 숙주 세포(예를 들어, HEK 또는 CHO)에서 핵산 분자가 (N-말단)- 인슐린 폴리펩타이드- 링커- Fc-단편- (C-말단)과 같이 인코딩하는 단백질을 발현함으로써 공유결합된다. 완전 재조합 합성 접근방식은 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편을 별도로 합성한 다음 화학적으로 접합하는 방법보다 유리하다. 화학적 접합 단계 및 후속 정제 공정은 제조 복잡성을 증가시키고 산물 수율을 감소시키며 비용을 증가시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이량체"는 공유결합된 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 또는 융합 단백질을 지칭한다. 실시양태에서, 2개의 동일한 폴리펩타이드가 (예를 들어, 이황화 결합을 통해) 공유결합되어 "동종이량체"(도 1에 도식적으로 표시됨)를 형성한다. 이황화 결합은 도 1에 도시되어 있으며; 실제로 이황화 결합의 총 수는 도 1에 도시된 수보다 크거나 작을 수 있다. 실시양태에서, 동종이량체는 단일 핵산 분자에 의해 인코딩되며, 동종이량체는 먼저 인슐린-Fc-융합 단백질 단량체를 형성한 다음, 세포내부에서 추가 처리시 2개의 동일한 인슐린-Fc-융합 단백질 단량체를 동종이량체로 조립함으로써 세포내부에서 재조합적으로 생성된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다량체", "다량체의" 또는 "다량체의 상태"는 Fc-융합 단백질 이량체와 평형을 이룰 수 있거나 영구적으로 응집된 형태의 Fc-융합 단백질 이량체(예를 들어, Fc-융합 단백질 동종이량체의 이량체, Fc-융합 단백질 동종이량체의 삼량체, Fc-융합 단백질 동종이량체의 사량체, 또는 5개 이상의 Fc-융합 단백질 동종이량체를 포함하는 다량체 응집체)로서 작용할 수 있는 Fc-융합 단백질 이량체의 비-공유 결합 형태를 지칭한다. Fc-융합 단백질의 다량체 형태는 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체의 것과 상이한 물리적, 안정성 또는 약리학적 활성을 가질 수 있음을 예상할 수 있다.
인슐린 폴리펩타이드
인슐린 폴리펩타이드는 예를 들어 췌장 내의 랑게르한스 섬에서 β-세포에 의해 생성된 인슐린 또는 인슐린 유사체일 수 있다. 인슐린은 혈액에서 글루코스의 흡수를 조절함으로써 기능한다. 증가된 단백질 및 글루코스 수준과 같은 자극에 따라 인슐린은 β-세포에서 방출되고 IR에 결합하여 포유류(예를 들어, 인간) 대사의 많은 양상에 영향을 미치는 신호 전달계를 개시한다. 이 과정의 중단은 몇몇의 질병, 특히 당뇨병, 인슐린종, 인슐린 저항성, 대사 증후군 및 다낭성 난소 증후군과 직접 관련이 있다. 본 개시내용의 인슐린 유사체는 인슐린의 구조와 관련될 수 있지만 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인슐린 유사체는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 특정 특징 또는 특성에 영향을 미칠 수 있는 인슐린에 대한 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 화학적 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 변형 또는 변이는 참조 표준에 비해 세포 표면 수용체(예를 들어, 인슐린 호르몬 수용체)에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 구조, 안정성, pH 감응성, 생활성, 또는 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있다.
인슐린의 아미노산 서열은 진화 전반에 걸쳐, 특히 척추동물에서 강하게 보존되어 있다. 예를 들어, 천연 개와 돼지 인슐린은 인간 인슐린과 단 하나의 아미노산만 다르고, 천연 소 인슐린은 인간 인슐린과 단 3개의 아미노산만 다르며, 천연 고양이 인슐린은 인간 인슐린과 단 4개의 아미노산만 다르다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "B-사슬 또는 B-사슬 유사체", "C-펩타이드" 또는 "C-사슬", 및 "A-사슬 또는 A-사슬 유사체"는 도 1에 도시된 바와 같은 인슐린 폴리펩타이드의 펩타이드 절편을 지칭한다. 인슐린은 이황화 결합(예를 들어, 하나 이상의 B-사슬 시스테인 측쇄 티올과 하나 이상의 A-사슬 시스테인 측쇄 티올에 의해 형성되는 이황화 결합)을 통해 연결된 2개의 펩타이드 사슬 (즉, B-사슬 및 A-사슬)을 포함하는 51개의 아미노산 호르몬이다. 인슐린의 A-사슬은 길이가 21개 아미노산이고 인슐린의 B-사슬은 길이가 30개 아미노산이다. 인슐린의 천연 형태에서 A-사슬은 2개의 A-사슬 시스테인 측쇄 티올에 의해 형성된 1개의 사슬내 이황화 결합을 포함한다. 참조 목적을 위해, 서열번호 1의 인간 인슐린 B-사슬 및 서열번호 2의 인간 인슐린 A-사슬에 대한 서열이 하기에 제시되어 있다:
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인슐린" 또는 "인슐린 폴리펩타이드"는 성숙 인슐린, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 및 천연 발생 인슐린, 또는 이의 유사체를 포괄한다. 실시양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 전장 인슐린 폴리펩타이드 또는 이의 단편일 수 있다. 실시양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 성숙 인슐린, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 또는 천연 발생 인슐린으로부터의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다.
인슐린은 일반적으로 N-말단--B-사슬:C-사슬:A-사슬--C-말단 폴리펩타이드로 배열되며, C-사슬은 생활성을 형성하기 위해 절단된다. 참조 목적으로, C-사슬(즉, 인간 프로 인슐린)을 포함하는 전체 인간 인슐린 분자의 서열은 C-사슬에 밑줄이 표시된 아래에 표시된다:
(서열번호 3).
단일 사슬-인슐린 폴리펩타이드에서 생활성의 2개의 폴리펩타이드로의 형질전환은 2개의 엔도프로테아제로서, C-펩타이드-B 사슬 연결 및 PC2를 분해하는 유형 I 엔도프로테아제, PCI 및 PC3 및 정확히 올바른 위치에서 C-펩타이드-A 사슬 결합을 절단하는 유형 II 엔도프로테아제에 의한 글루코스-자극 인슐린 분비 이전에 랑게르한스 섬의 β-세포내에서 정상적으로 이루어진다. 그러나 인슐린과 같은 치료 분자의 생합성에 사용되는 세포계(예를 들어, 박테리아, 효모 및 포유류(예를 들어, HEK 및 CHO) 세포계)에는 이 경로가 없으므로 형질전환은 화학적 또는 효소적 방법을 사용하는 단일 사슬 폴리펩타이드의 발현 및 수확 후에 이루어져야 한다. 발현 및 수확 후 C-사슬을 절단하는 모든 알려진 기술은 A-사슬의 N-말단 직전에 라이신에서 종결되도록 C-사슬을 먼저 변형하는 것에 의존한다. 그런 다음, 라이신 잔기의 C-말단에서 펩타이드 결합을 특이적으로 절단하는 트립신 또는 Lys-C 패밀리에서 선택된 효소를 사용하여 단일 사슬-인슐린 폴리펩타이드는 C-사슬의 C-말단 라이신 및 B-사슬의 N-말단에서 29번째 위치에 있는 C-말단 라이신에서 절단된다. 일부 경우에는 생성된 생활성 2-사슬-인슐린이 B-사슬의 N-말단에서 30번째 위치에서 절단된 아미노산을 다시 부착하지 않고 사용되며, 일부 경우에는 B-사슬의 N-말단에서 30번째 위치에서 절단된 아미노산이 추가적인 효소적 방법을 사용하여 분자에 다시 추가된다. 이러한 과정은 인슐린이 전체 2개 사슬 폴리펩타이드 형태에 단 하나의 라이신만을 포함하기 때문에 인슐린과 잘 작동한다. 그러나, 이 과정은 모든 알려진 Fc-단편이 다수의 라이신 잔기를 포함하기 때문에 본 명세서에 포함된 인슐린-Fc-융합 단백질에 사용할 수 없다. 따라서, 효소적 절단 과정은 Fc-단편을 비-기능성 부분으로 분해함으로써 생체내에서 인슐린 폴리펩타이드의 작용을 연장시키는 Fc-단편의 능력을 제거할 것이다. 따라서, 본 발명의 인슐린-Fc-융합 단백질은 C-사슬 절단이 필요하지 않고 따라서 단일 사슬 형태로 생활성인 인슐린 폴리펩타이드를 포함해야 한다.
다수의 생활성 단일 사슬-인슐린 폴리펩타이드가 당업계에 기재되어 있다. 모든 경우에, 단일 사슬-인슐린 폴리펩타이드는 천연 2-사슬-인슐린과 유사한 수준에서 생활성을 달성하기 위해 정전기 균형을 달성하고, 응집을 방지하고, IR 결합 및/또는 하류 신호전달을 강화하기 위해 특정 아미노산 부위에서 돌연변이된 A-사슬 및 B-사슬 뿐만 아니라 특정 길이 및 조성의 C-사슬을 포함한다. 여기서, 펩타이드 절편 상의 돌연변이 위치는 절편의 명칭(예를 들어, B-사슬, C-사슬, A-사슬)과 그 절편의 N-말단으로부터 계수되는 아미노산의 수를 이용하여 표기된다. 예를 들어, "B16"이라는 표기는 B-사슬의 아미노산 서열의 N-말단에서 16번째 아미노산을 지칭한다. "A8"이라는 표기는 A-사슬의 N-말단에서 8번째 아미노산을 지칭한다. 또한, 아미노산이 특정 위치에서 천연 형태에서 새로운 아미노산으로 돌연변이되는 경우, 그 위치에 새로운 아미노산에 대한 한 글자 아미노산 코드가 추가된다. 예를 들어, B 16A는 B-사슬의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 16번째 아미노산에서의 알라닌 돌연변이를 지칭하고 A8H는 A-사슬의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 8번째 아미노산에서의 히스티딘 돌연변이를 지칭한다.
US9855318B2는 서열 
(서열번호 72)의 C-사슬("제1 링커"), A-사슬의 치환, 및 B-사슬의 치환 및 결실을 갖는 단일 사슬-인슐린 유사체를 기재한다( 비-천연 아미노산은 밑줄 표시되고 결실된 천연 아미노산은 밑줄 Z로 표시됨):
(서열번호 7_NULL).
다음은 인슐린 폴리펩타이드 서열의 표기법에서 제거된 기호 Z의 부재 아미노산을 제외하고 위에 나타낸 서열의 재작성이다. 다시, 이전과 같이 비-천연 아미노산에 밑줄이 표시되어 있다. 두 개의 개별 표기법에도 불구하고 쌍을 이루는 서열은 정확히 동일한 인슐린 폴리펩타이드를 지칭한다.
(서열번호 7)
일부 실시양태에서, 예기치 않게, 알라닌이 서열번호 7에서 B-사슬의 N-말단으로부터 위치 16 (즉, B16)에서 글루탐산으로 치환된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 낮은 Fc(감마)RI 및 C1q 결합 친화도에 의해 측정된 바와 같이 감소된 면역원성을 유지하면서 인슐린-Fc-융합 단백질의 개선된 동종이량체 역가, IR 결합 친화도, 및 FcRn 결합을 유도하는 서열번호 10을 생성함을 발견하였다. B16에서 이러한 특정 아미노산 치환은 원래 이 위치의 알라닌이 인슐린-특이적 T 세포를 활성화할 수 있는 능력을 감소시킨다고 알려져 있다는 사실에 의해 동기화되었다(문헌[Alieva, D.G., Gaur, A., Jin, L., Wegmann, D., Gottlieb, P.A., Pahuja, A., Johnson, E.B., Motheral, T., Putnam, A., Crowe, P.D., Ling, N., Boehme, S.A., Conlon, P.J., (2002) Diabetes Vol. 51, No. 7 pp 2126-2134]). 서열번호 10은 밑줄이 표시된 각각의 비-천연 아미노산과 함께 아래에 나열된다:
(서열번호 10).
링커
일부 예를 들어, 인슐린 폴리펩타이드의 C-말단은 Fc-단편의 N-말단에 직접 연결된다(예를 들어, 무링커 또는 링커 부재). 다른 예에서, 재조합적으로 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질의 성공적인 작제는 인슐린 폴리펩타이드를 Fc-단편에 연결하는 링커가 필요하다. 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 인슐린 폴리펩타이드와 아미노산(예를 들어, 천연 또는 비-천연 아미노산)을 포함하는 Fc-단편 사이에 펩타이드 링커를 포함한다. 실시양태에서, 펩타이드 링커는 예를 들어 단일 핵산 분자가 펩타이드 링커 및 Fc-단편뿐만 아니라, 인슐린 폴리펩타이드 내의 다양한 펩타이드를 인코딩할 수 있도록 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있다. 펩타이드 링커의 선택(예를 들어, 길이, 조성, 소수성 및 2차 구조)은 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 제조 가능성(즉, 동종이량체 역가), 화학적 및 효소적 안정성, 생활성(즉, NAOC 값), 생활성과 상관관계가 있는 매개변수(즉, FcRn 분석 EC50 값) 및 인슐린-Fc-융합 단백질의 면역원성에 영향을 줄 수 있다(문헌[Chen, X., Zaro, J., Shen, W.C., Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65(10): 1357-1369]). 표 1은 동종이량체 역가 및 생활성을 개선하기 위한 목적으로 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 설계에 사용된 몇 개의 링커를 나열한다.
실시양태에서, 펩타이드 링커는 서열: 
(서열번호 13)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 펩타이드 링커는 서열: 
(서열번호 12)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 펩타이드 링커는 서열: 
(서열번호 67) 또는 서열: 
(서열번호 11)를 포함한다.
서열번호 13과 같은 펩타이드 링커를 사용하여 재조합적으로 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 작제할 때 인슐린 A-사슬의 C-말단과 펩타이드 링커의 N-말단 사이의 부적절한 효소적 절단의 가능성에 주의를 기울여야 한다. 인슐린 폴리펩타이드로부터의 Fc-단편 및 링커의 절단은 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 연장된 기간의 생활성을 제공할 수 없도록 할 것이다. 알려진 효소 절단 부위는 아스파라긴-글리신 결합 사이에 존재한다(문헌[Vlasak, J., Ionescu, R., (2011) MAbs Vol. 3, No. 3 pp 253-263]). 서열번호 13의 바람직한 펩타이드 링커를 포함하는 많은 펩타이드 링커 실시양태에서, N-말단 아미노산은 글리신이다. 또한, 인슐린 A-사슬의 C-말단(즉, A-사슬의 N-말단에서 21번째 아미노산(즉, A21))은 아스파라긴이다. 따라서, A21 아스파라긴은 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 펩타이드 링커 및 A-사슬 사이에 형성될 잠재적으로 효소적으로 절단 가능한 아스파라긴-글리신 결합을 제거하기 위해 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드에서 누락된다. 예상외로, A-사슬의 C-말단에 아스파라긴을 보유하는 서열번호 8의 인슐린 폴리펩타이드로부터 작제된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 허용가능한 동종이량체 역가(즉, 50 mg/L 초과의 개 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 동종이량체 역가), 개에서 허용가능한 생체내 생활성(즉, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC), 다중 투여 후 지속적인 수준의 생활성(즉, 개에 3차 주사 후 0.5 초과의 NAOCR 값)의 포유류 세포에서의 제조 가능성을 나타낸다. 결과는 이전 교시를 기반으로 한 예상과 달리, 적어도 본 명세서에 개시된 Fc-단편 서열을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대해 인슐린 폴리펩타이드와 펩타이드 링커 사이에 아스파라긴-글리신 연결을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 효소적 절단 또는 불활성화 위험이 없음을 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 동일한 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편 조성물에 대해 서열번호 13의 글루타민(Q)을 알라닌(A)으로 돌연변이시켜 
(서열번호 67)의 펩타이드 링커를 생성하고, 더 높은 동종이량체 역가, IR에 대한 증가된 결합 친화도 및 FcRn 수용체에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 생성됨을 발견하였다.
또 다른 실시양태에서, 동일한 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편 조성물에 대해 동종이량체 역가 또는 인슐린-Fc-융합 단백질의 FcRn 수용체에 대한 결합 친화도에 유의한 영향을 미치지 않으나 IR 분석 IC50 값이 60% 증가되면서 서열번호 67의 펩타이드 링커가 단축될 수 있다는 것이 발견되었다. 단축된 펩타이드 링커는 다음 서열을 포함한다:
Fc-단편
용어 "Fc-단편", "Fc 영역", "Fc 도메인" 또는 "Fc 폴리펩타이드"는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 본 명세서에서 사용된다. Fc-단편, 영역, 도메인 또는 폴리펩타이드는 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체/돌연변이 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 일반적으로 중쇄의 힌지 영역, 중쇄의 CH2 영역 및 중쇄의 CH3 영역의 일부 또는 전체를 포함한다. Fc-융합 단백질의 2개의 동일하지만 별개의 단량체로부터의 Fc-융합 단백질의 동종이량체를 형성하기 위해 개 또는 인간 Fc-단편의 힌지 영역은 중쇄의 CH1 도메인을 중쇄의 CH2 영역에 연결하고 하나 이상의 중쇄간 이황화 가교를 형성하는 하나 이상의 시스테인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 힌지 영역은 천연 발생 아미노산 서열 또는 비-천연 발생 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
Fc 수용체(FcR)는 항체의 Fc-단편 또는 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭한다. 실시양태에서, FcR은 개 또는 인간 FcR의 천연 서열이다. 실시양태에서, FcR은 IgG 항체의 Fc-단편 또는 Fc 영역에 결합하는 것이고(감마 수용체), 제한 없이 이들 수용체의 대립인자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 Fc(감마)RI, Fc(감마)RIIa, Fc(감마)RIIb, 및 Fc(감마)RIII 하위클래스의 수용체를 포함한다. "FcR"은 또한 모체 IgG 분자를 태아로 전달하는 역할을 하고, 또한 생체내 항체 및 Fc-융합 단백질의 연장된 생체내 제거 반감기에 관여하는 신생아 허용사슬 FcRn을 포함한다(문헌[Guyer et al., 1976 J. Immunol., 117:587; Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249]). 당업자는 한 종의 포유류 FcR(예를 들어, 인간 유래의 FcR)이 동일한 종의 Fc-단편(예를 들어, 인간 유래)을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 시험관내 결합이 가능하고 또한 때때로 다른 포유류 종의 Fc-단편(예를 들어, 개 유래)의 시험관내 결합이 가능함을 이해할 것이다. 실시양태에서, 인간 유래의 FcR은 이의 FcR 결합 특성을 평가하기 위해 인간 또는 개 유래의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 결합 특성을 측정하기 위해 시험관내(예를 들어, 분석에서) 사용된다. 실시양태에서, 개 유래의 FcR은 개 유래의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 결합을 측정하기 위해 시험관내(예를 들어, 분석에서) 사용된다.
실시양태에서, 천연 개 및 인간 IgG 이소형 Fc-단편 아미노산 서열에서 종종 발견되는 C-말단 라이신(즉, Fc-단편 서열의 마지막 아미노산을 나타내는 라이신)은 제조 중 부적절한 아미노산 서열 변이체의 우발적 생성(예를 들어, C-말단 라이신을 포함하는 Fc-단편이 C-말단 라이신이 누락된 Fc-단편과 혼합되어 세포내에서 적절한 단백질의 생성 중에 발생할 수 있음)을 방지하기 위해 누락된다(문헌[Dick, LW., (2008) Biotechnol Bioeng. Aug 15;100(6) ppl 132-43]).
개 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에서, Fc-단편은 개 IgGA Fc-단편(서열번호 14), 개 IgGB Fc-단편(서열번호 15), 개 IgGC Fc-단편(서열번호 16), 또는 개 IgGD Fc-단편(서열번호 17)의 Fc 영역(예를 들어, 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인)을 포함한다. 따라서 개 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 C-말단 라이신이 부재하는 개 Fc-단편 서열은 다음과 같다:
(서열번호 14)
(서열번호 15)
(서열번호 16)
(서열번호 17).
인간 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서, C-말단 라이신이 부재하는 인간 Fc-단편 서열은 다음과 같다:
(서열번호 73)
(서열번호 74).
개의 경우, 개 IgGA 이소형의 Fc(감마) 효과기 기능의 부재로 인해(인간의 인간 IgG2 이소형과 매우 유사함) 임의의 부적절한 면역원성을 최소화하기 위해 개의 IgGA가 바람직하다. 그러나, 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드 및 서열번호 11의 펩타이드 링커를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에서, 예기치 않게 개의 IgGA 단편(서열번호 14)을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 적절한 동종이량체의 낮은 역가(즉, 50 mg/L 미만의 개 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 역가)로 고도로 응집된 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 개에서 비-생활성이었으며(즉, NAOC 값은 150 FBGL%·일·kg/mg 미만임), 아마도 이는 높은 수준의 응집(예를 들어, 낮은 동종이량체%)으로 인한 것이다. 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드, 개의 IgGA Fc-단편(서열번호 14) 및/또는 링커를 돌연변이시켰음에도 불구하고, 적절한 동종이량체의 충분히 낮은 응집도 및 충분히 높은 역가를 나타내는 개 IgGA Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태는 없었다. 그러나, 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 개 IgGA Fc-단편(서열번호 14)을 개 IgGB Fc-단편(서열번호 15)으로 교체하면 적절한 동종이량체의 비교적 높은 역가를 갖는 유의하게 덜 응집된 화합물이 생성되었다. 또한, 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드 및 개 IgGB Fc-단편(서열번호 15)을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 개에서 생활성을 나타내어 수일에 걸쳐 글루코스-저하 생활성을 나타내었다(즉, NAOC 값은 150 FBGL%·일·kg/mg 초과임).
개의 IgGA Fc-단편에 대한 개의 IgGB Fc-단편에 대한 선호도는 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드 및 서열번호 13의 펩타이드 링커를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 확인되었으며, 둘 모두 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드 및 서열번호 11의 펩타이드 링커와 유의하게 다르다. 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드 및 서열번호 13의 펩타이드 링커를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 개 IgGA(서열번호 14), 개 IgGB(서열번호 15), 개 IgGC(서열번호 16) 또는 개 IgGD(서열번호 17) 면역글로불린의 Fc-단편을 사용하여 합성된다. 통상적인 정제 방법을 사용하여, 개 IgGA 및 개 IgGB를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태만이 임의의 유의한 단백질 수율을 나타내었다. 그러나 이전에 본 바와 같이, 인슐린-Fc-융합 단백질의 개 IgGA 입체형태는 낮은 수준의 생활성으로 고도로 응집되었고, 인슐린-Fc-융합 단백질의 개 IgGB 입체형태는 낮은 수준의 응집(즉, 높은 동종이량체%), 적절한 동종이량체의 높은 역가(즉, 개 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 동종이량체 역가가 50 mg/L 초과임) 및 개에서 생활성을 저하시키는 장기간 글루코스의 유의한 수준(즉, NAOC 값은 150 FBGL%·일·kg/mg 초과임)을 나타내었다. 대체 정제 방법을 사용하여 인슐린-Fc-융합 단백질의 개 IgGC 입체형태가 낮은 응집도로 복원되었지만 개에서는 최소한의 생활성을 보였고(즉, NAOC 값은 150 FBGL%·일·kg/mg 미만임), 이는 아마도 FcRn 수용체에 대한 낮은 친화도 때문일 것이다. 따라서, 개-특이적 산물과 관련하여, 개 IgGB(서열번호 15)는 인슐린 폴리펩타이드의 선택에 관계없이 개에서 사용되는 모든 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대해 바람직한 Fc-단편이다.
개의 IgGB 이소형이 개 IgGA 이소형보다 더 높은 친화도로 개 Fc(감마) 수용체와 상호작용한다는 점을 감안할 때, 개 IgGB를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 반복된 주사 후에 부적절한 면역원성의 위험이 있을 수 있다. 따라서, 개 Fc(감마)RI 수용체에 대한 친화도를 감소시키면서 더 큰 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체 역가를 유지하기 위한 노력의 일환으로 개의 IgGB Fc-단편에 대한 다양한 돌연변이가 조사되었다.
Fc(감마)RI 상호작용을 감소시키는 한 방법은 숙주 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 합성 동안 Fc-단편의 글리코실화를 방지하거나 탈글리코실화시키는 단계를 포함한다. 각 IgG 단편은 Fc 영역의 각 중쇄의 CH2 도메인에 보존된 아스파라긴(N)-글리코실화 부위를 포함한다. 여기서, 보존된 N-글리코실화 부위를 지칭하기 위해 사용된 표기법은 "cNg"이다. 합성된 인슐린-Fc-융합 단백질에서 부착된 글리칸을 제거하는 한 가지 방법은 cNg 부위를 돌연변이시켜 숙주 세포에서 생성하는 동안 글리칸이 완전히 부착되는 것을 방지하는 것이다. 여기서, cNg 돌연변이를 설명하기 위해 사용된 표기법은 cNg-(치환된 아미노산)이다. 예를 들어, cNg 부위의 아스파라긴이 세린으로 돌연변이되면 이 돌연변이는 "cNg-S"로 표기된다.
인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 B-사슬의 N-말단으로부터 cNg 부위의 절대 위치는 인슐린 폴리펩타이드의 길이, 링커의 길이, 및 cNg 부위 이전의 Fc-단편의 임의의 누락된 아미노산에 따라 변한다. 여기서, 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질 서열에서 cNg 부위의 절대 위치를 지칭하기 위해 사용되는 표기법(인슐린-Fc-융합 단백질의 B-사슬의 N-말단로부터 계수하여 측정됨)은 "NB(번호)"이다. 예를 들어, cNg 부위가 B-사슬의 N-말단에서 계수하여 155번째 아미노산 위치에 있는 경우, 이 부위의 절대 위치는 "cNg-NB155"로 지칭된다. 추가적인 예로서, cNg 부위가 B-사슬의 N-말단으로부터 계수하여 155번째 아미노산 위치에서 발견되고 이 부위의 아스파라긴이 세린으로 돌연변이된 경우, 이 돌연변이는 "cNg-NB155-S"로 기록된다.
서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드 및 cNg-Q, cNg-S, cNg-D 및 cNg-K 돌연변이를 갖는 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에서, 예기치 않게 cNg-K 및 cNg-S 돌연변이를 포함하는 화합물만이 50 mg/L 초과의 개 인슐린-Fc-융합 단백질의 필수 동종이량체 역가 및 가장 낮은 Fc(감마)RI 결합 친화도를 나타낸 것으로 밝혀졌다. 한편, 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드 및 cNg-S 돌연변이를 갖는 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에서, 결과적으로 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질이 상응하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태와 비교하여 개에서 유의하게 덜 생활성이지만 천연 개 IgGB Fc를 포함함이 예기치 않게 발견되었다(즉, NAOC 값은 천연 글리코실화 부위 아미노산, 예를 들어 cNg-N을 포함하는 상응하는 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 유의하게 더 낮음). 인슐린-Fc-융합 단백질의 생활성은 인슐린 폴리펩타이드 서열번호 10에 대해 전술한 바와 같이 B16 아미노산이 알라닌으로 돌연변이되었을 때 cNg-S 돌연변이에서 예기치 않게 복원되었다(즉, NAOC 값이 유의하게 증가함). 종합하면, 바람직한 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태를 확인하기 위해 실험이 필요하도록 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 Fc-단편에 대한 cNg 돌연변이의 선택과 인슐린 폴리펩타이드의 조성 사이에 예상치 못한 유의한 상호작용이 존재한다. 특정 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에서, cNg-S 돌연변이를 포함하는 개 IgGB Fc-돌연변이가 바람직하고 밑줄이 표시된 cNg-S가 있는 서열은 다음과 같이 표시된다:
(서열번호 18).
일반적으로, 인간 Fc IgG2 이소형은 Fc(감마) 효과기 기능의 부재 및 따라서 부적절한 면역원성을 유도하는 더 낮은 경향으로 인해 다른 이소형보다 바람직하다. 예시로서, Fc(감마)RI 결합 및 C1q 결합 ELIS As의 한 실시양태에서, 인간 IgG1 단편을 포함하는 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태는 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서 인간 Fc(감마)RI 결합 분석 OD450가 2.078인 것으로 나타났고, 1000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 인간 C1q 결합 분석 OD450이 3.006인 것으로 나타났으며, 이러한 높은 값은 환자에서 면역원성을 나타낼 서열번호 76의 가능성을 나타낸다. 이와 달리, Fc(감마)RI 결합 및 C1q 결합 ELIS의 동일한 실시양태에서, 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(서열번호 75), 서열번호 13의 펩타이드 링커 및 인간 IgG2 Fc-단편(서열번호 74)은 3,000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서 인간 Fc(감마)RI 결합 분석 OD450이 0.093이고 1,000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 인간 C1q 결합 분석 OD450이 0.928인 것으로 나타났고, 이는 환자에서 면역원성을 나타내는 서열번호 75의 가능성이 유의하게 감소되었음을 나타낸다.
인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대한 OD450 측정치의 절대값은 예를 들어 분석 실시양태의 작은 변동으로 인해 ELISA의 실시양태마다 다를 수 있다. 이는 테스트 중인 인슐린-Fc-융합 입체형태의 농도가 일정하게 유지되는 경우에도 다양한 ELISA 실시양태에 걸쳐 다양한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대한 OD450의 절대값 측정 비교의 신뢰도를 떨어뜨린다. 이와 달리, 동일한 ELISA 실시양태(다시 인슐린-Fc-융합 단백질 농도를 일정하게 유지)에서 두 번째 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 OD450 측정과 ELISA 실시양태에서 하나의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 OD450 측정값의 비율은 서로 다른 ELISA 실시양태에 걸쳐 동일한 2개의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대해 비교적 안정적일 것이다. 따라서, 인간 Fc(감마)RI 결합 분석 및 C1q 결합 분석에 대한 OD450에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질 설계 목적는 OD 450 비율로 표시되었으며, 비율은 분석 중인 인슐린-Fc-융합 단백질의 절대 OD450 값 대 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 절대 OD 450 값으로 구성되고, 두 측정 모두 동일한 ELISA 실험 내에서 이루어진다. Fc(감마)RI 결합 ELISA OD450에서 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태 샘플 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도는 3000 ng/mL로 설정되고 C1q 결합 ELISA OD450에서 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태 샘플 비오티닐화-C1q 농도는 테스트된 모든 샘플에 대해 1000 ng/mL로 설정된다.
서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(인간 IgG1 Fc-단편 포함)는 Fc(감마)RI 결합 ELISA 및 C1q 결합 ELISA OD450 비율 계산을 위한 참조 인슐린-Fc-융합 단백질로서 사용된다. 위에 제공된 측정된 OD450 값을 사용한 서열번호 75의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(인간 IgG2 Fc-단편 포함)에 대한 Fc(감마)RI 결합 ELISA OD450 비율은 다음과 같다:
위에 제공된 측정된 OD450 값을 사용하여 서열번호 75의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대한 C1q 결합 ELISA OD450 비율은 다음과 같다:
서열번호 75의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(hIgG2) 대 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(hIgG1)의 Fc(감마)RI 결합 ELISA OD450 비율 및 C1q 결합 ELISA OD450 비율은 부적절한 면역원성에 대한 경향을 감소시키기 위해 상이한 인슐린-Fc-융합 입체형태에 대한 Fc(감마)RI 결합 및 C1q 결합을 평가하기 위한 설계 목적을 생성하는데 사용된 목표지향적 기준을 나타낸다. 따라서, 인간 Fc(감마)RI 결합에 대해 수립된 설계 목적(시험 중인 인슐린-Fc-융합 단백질의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도가 3000 ng/mL인 경우)은 OD450 비율이 0.50 미만인 것이고 인간 C1q 결합에 대해 수립된 설계 목적(시험 중인 인슐린-Fc-융합 단백질의 비오티닐화-C1q 농도는 1000 ng/mL임)은 OD450 비율이 0.35 미만인 것이다.
인간 IgG2 Fc-단편을 포함하는 이러한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(서열번호 75)의 2개의 개별 합성으로부터 생성된 평균 동종이량체 역가는 117 mg/L이었다.
이에 비해, 서열번호 7의 동일한 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 동일한 펩타이드 링커, 및 인간 IgG1 단편(서열번호 73)을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태(서열번호 76)에서, 인슐린-Fc-융합 단백질은 180 mg/L의 2개의 개별 합성으로부터 평균 동종이량체 역가를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 인간 IgG2 단편을 포함하는 유사한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대해 획득된 것의 50%를 초과한다. 인간 IgG1 이소형이 인간 IgG2 이소형보다 더 높은 친화도로 인간 Fc(감마)RI 수용체와 상호작용한다는 점을 감안할 때, 인간 IgG1을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 반복 주사 후 부적절한 면역원성의 위험이 있을 수 있다.
따라서, 인간 Fc(감마)RI 수용체 및 C1q에 대한 친화도를 감소시키면서 더 큰 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체 역가를 유지하기 위한 노력의 일환으로 인간 IgG1 Fc-단편에 대한 다양한 돌연변이가 조사되었다.
이전에 논의된 바와 같이, Fc(감마)RI 상호작용을 감소시키는 한 방법은 숙주 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 합성 동안 Fc-단편의 글리코실화를 방지하거나 탈글리코실화하는 단계를 포함한다. 합성된 인슐린-Fc-융합 단백질에서 부착된 글리칸을 제거하는 한 가지 방법은 cNg 부위를 돌연변이시켜 숙주 세포에서 생성하는 동안 글리칸이 완전히 부착되는 것을 방지하는 것이다.
cNg 부위에 밑줄이 표시된 돌연변이된 인간 IgG1 Fc-단편 일반화 입체형태는 다음과 같다:
(서열번호 77),
(상기 서열에서, 예를 들어 X1은 S, D, A, R 또는 Q임).
서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 펩타이드 링커, 및 서열번호 77(상기 서열에서, X1은 S임)의 인간 IgG1 Fc-단편을 포함하는 인간 IgG1 Fc-단편(즉, cNg-NB155-S 돌연변이)는 다음과 같다:
(서열번호 91).
서열번호 91의 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태가 글리코실화 모 물질(서열번호 76)에 비해 개선된 동종이량체 역가를 제공한다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 추가로, 서열번호 76의 참조 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 서열번호 91의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 대한 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서의 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율은 0.50 미만이고 서열번호 76의 참조 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 서열번호 91의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대해 1,000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율은 0.35 미만이었다. 그러나, 서열번호 76의 모 글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질에 대비한 서열번호 91의 생성된 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질은 감소된 IR 결합(증가된 IR 분석 IC50 값) 및 감소된 FcRn 결합 친화도(증가된 EC50 값)를 나타내었고, 이는 각각 생체내 체류 시간에 따른 생물학적 활성의 허용할 수 없는 감소 가능성이 높음을 나타낸다.
인슐린-Fc-융합 단백질
인슐린 폴리펩타이드, Fc-단편, 및 인슐린 폴리펩타이드와 Fc-단편 사이의 링커를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 본 명세서에서 제공된다. 실시양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단으로 하기 배향의 도메인을 포함한다: (N-말단)-- B-사슬- C-사슬- A-사슬-- (C-말단). 실시양태에서, 인슐린 폴리펩타이드는 Fc-단편의 N-말단 측에 위치한다. 실시양태에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 하기 배향의 도메인을 포함한다: 도 1에 도시된 바와 같은 (N-말단)-- 인슐린 폴리펩타이드-- 링커-- Fc-단편-- (C-말단) (예를 들어, (N-말단)-- B-사슬-- C-사슬-- A-사슬-- 링커-- Fc-단편-- (C-말단)).
개 인슐린-Fc-융합 단백질
실시양태에서, 서열번호 5의 바람직한 비-면역원성 생활성 인슐린 폴리펩타이드를 서열번호 13의 바람직한 링커를 사용하여 서열번호 15의 바람직한 개 IgGB Fc-단편과 조합하여 개에서 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC 값 및 개에서 일련의 반복 주사에서 3차 주사 후 0.5 초과의 NAOCR 값을 나타내는 서열번호 20의 높은 동종이량체 역가-수율 비-응집성 생활성 비-면역원성 개 인슐린-Fc-융합 입체형태의 패밀리를 생성하였다. 다음은 밑줄이 표시된 비-천연 아미노산이 있는 서열번호 20을 보여준다:
(서열번호 20),
(상기 서열에서, X1은 D가 아니고, X2는 H가 아니고, X3은 부재하거나 N임).
서열번호 20을 포함하는 바람직한 개 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에서, X1은 H이고, X2는 T이고, X3은 부재하거나 N이다. 이러한 선택은 개에서 50 mg/L 초과 동종이량체 역가, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과 NAOC 값, 및 개에 대한 일련의 반복 주사 중 3차 주사 후 0.5 초과 NAOCR 값을 나타내는 서열번호 21의 높은 동종이량체 역가-수율 비-응집성 생활성 비-면역원성 개 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하였다. 다음은 밑줄이 표시된 비-천연 아미노산이 있는 서열번호 21을 보여준다:
(서열번호 21),
(상기 서열에서, X3은 부재하거나 N임).
바람직한 실시양태에서, X3은 서열번호 21에 존재하지 않아 개에서 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 150 FBGL%·일· kg/mg 초과 NAOC 값, 및 개에 대한 일련의 반복 주사에서 3차 주사 후 0.5 초과의 NAOCR 값을 나타내는 서열번호 26의 높은 동종이량체-수율 비-응집성 생활성 비-면역원성 개 인슐린-Fc-융합 단백질을 생성한다. 다음은 밑줄이 표시된 비-천연 아미노산이 있는 서열번호 26을 보여준다:
(서열번호 26).
바람직한 실시양태에서, 서열번호 21에서 X3은 N인 경우, 개에서 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 150 FBGL%·일· kg/mg 초과의 NAOC 값, 개에 대한 일련의 반복 주사에서 3차 주사 후 0.5 초과의 NAOCR 값을 나타내는 서열번호 28의 높은 동종이량체 역가-수율 비-응집성 생활성 비-면역원성 개 인슐린-Fc-융합 단백질이 생성된다. 다음은 밑줄이 표시된 비-천연 아미노산이 있는 서열번호 28을 보여준다:
(서열번호 28).
바람직한 실시양태에서, 서열번호 18의 바람직한 비-글리코실화 cNg-S 돌연변이된 개 IgGB Fc-단편을 서열번호 13의 바람직한 링커를 사용하여 서열번호 9의 바람직한 B16A 돌연변이 인슐린 폴리펩타이드 서열과 조합하여, 개에서 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 150 FBGL%·일· kg/mg 초과의 NAOC, 개에 대한 일련의 반복 주사에서 3차 주사 후 0.5 초과의 NAOCR 값을 나타내는 서열번호 22의 높은 동종이량체 역가-수율 비-응집성 생활성 비-면역원성 개 인슐린-Fc-융합 단백질 패밀리를 생성한다. 다음은 밑줄이 표시된 비-천연 아미노산이 있는 서열번호 22를 보여준다:
(서열번호 22),
(상기 서열에서, X1은 D가 아니고 X2는 H가 아님).
바람직한 실시양태에서, 서열번호 22의 X1은 H이고 X2는 T인 경우, 개에서 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC 값, 및 개에 대한 일련의 반복 주사에서 3차 주사 후 0.5 초과의 NAOCR 값을 나타내는 서열번호 30의 높은 동종이량체 역가-수율 비-응집성 생활성 비-면역원성 개 인슐린-Fc-융합 단백질이 생성된다. 다음은 밑줄이 표시된 비-천연 아미노산이 있는 서열번호 30을 보여준다:
(서열번호 30).
서열번호 30의 고도로 제조가능하고 효과적인 초-장기-작용 개 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태의 예상치 못한 발견으로 인해, 본 발명자들은 인간 환자를 위한 유사하게 제조가능하고 효과적인 초-장기-작용 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하려는 시도를 하게 되었다.
인간 인슐린-Fc-융합 단백질
다른 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 동일한 거동을 나타내는지를 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다. cNg 부위에 밑줄이 표시된 인간 IgG1 Fc-단편의 일반화 입체형태는 다음과 같다:
(서열번호 77),
(상기 서열에서, X1은 S, D, A, R 또는 Q임).
서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드(B16A 돌연변이 없음)와 서열번호 13의 링커, 및 글리코실화를 방지하기 위한 cNg 돌연변이 옵션을 갖는 인간 IgG1 Fc-단편 입체형태를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태(서열번호 77, 상기 서열에서, X1은 S, D, A, R 또는 Q임)은 다음과 같다:
(서열번호 91)
(서열번호 92)
(서열번호 93)
(서열번호 94)
(서열번호 95).
서열번호 13의 바람직한 링커 및 서열번호 77의 인간 IgG1 Fc-단편을 사용하여 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드를 포함하는 실시양태(상기 서열에서, X1은 S (cNg-NB155-S -서열번호 91), D (cNg-NB155-D - 서열번호 92), A (cNg-NB155-A - 서열번호 93), R (cNg-NB155-R - 서열번호 94), 또는 Q (cNg-NB155-Q - 서열번호 95)임)에서, 이들 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 각각이 글리코실화 모 물질(서열번호 76)에 비해 개선된 동종이량체 역가를 제공한다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 추가적으로, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94 및 서열번호 95의 각각의 탈글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해, 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서의 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율(OD450 비율 계산에 사용된 참조 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질임)은 모두 0.50 미만이고, 1,000 ng/mL의 비오티닐화-Clq 농도에서의 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율(OD450 비율 계산에 사용된 참조 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질임)은 또한 0.35 미만이었다. 그러나, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94 및 서열번호 95의 탈글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질은 모두 글리코실화 모 물질(서열번호 76)에 비해 더 낮은 IR 결합 친화도(더 높은 IR 분석 IC50 값), 더 낮은 FcRn 결합 친화도(더 높은 EC50 값)를 나타내었고, 이는 이들 화합물이 생체내에서 허용할 수 없는 생활성 및 체류 시간 감소를 나타낼 가능성이 높음을 나타낸다. 예상외로, 서열번호 13의 바람직한 링커 및 서열번호 77의 인간 IgG1 Fc-단편을 사용하는 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드를 포함하는 실시양태(서열번호 95)(상기 서열에서, X1은 Q임)에서, 생성된 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질은 136 mg/L의 동종이량체 역가를 제공하여, 이러한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 150 mg/L의 동종이량체 역가에 대한 설계 목적을 충족시키지 못했다.
도 28은 서열번호 75(천연 인간 IgG2 포함) 및 서열번호 76(천연 인간 IgG1 포함)의 병렬 서열 비교를 나타내고, 서열은 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 및 서열번호 95의 변이체를 포함한다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
이전에 논의된 개 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태와 관련하여 예상치 못한 결과로부터의 정보를 적용하여, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에서 인슐린 폴리펩타이드의 B-사슬 상의 16번째 아미노산(B16)은 알라닌으로 돌연변이되어 서열번호 78 (cNg-NB155-S 포함), 서열번호 80 (cNg-NB155-D 포함), 서열번호 82 (cNg-NB155-A 포함), 서열번호 84 (cNg-NB155-R 포함)가 생성된다. B16 아미노산이 상기 기재된 바와 같이 알라닌으로 돌연변이되어 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드가 생성될 때, 증가된 동종이량체 역가 또는 Fc(감마)RI 및 C1q 결합 친화도의 감소가 손상되지 않으면서, 허용가능한 인슐린 수용체 결합은 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82 및 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 예기치 않게 복원되었다(즉, IR 결합 및 FcRn 수용체 결합 친화도가 유의하게 증가되었음).
바람직한 실시양태에서, 서열번호 78의 인간 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 링커, 및 서열번호 77의 인간 IgG1 Fc-단편의 cNg-NB155-S 돌연변이를 포함한다. 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질은 150 mg/L 초과의 동종이량체 역가를 나타낸다. 다음은 B16A 및 cNg-NB155-S 돌연변이가 밑줄로 표시된 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질을 보여준다:
(서열번호 78).
개 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대한 예상치 못한 발견과 유사하게, cNg-NB155-S 돌연변이를 갖는 인간 IgGl Fc-단편 및 B16A 돌연변이를 포함하는 서열번호 78의 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태의 생활성은 B16A 돌연변이가 부재하는 서열번호 91의 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태의 생활성과 비교하여 예기치 않게 복원되었다(즉, IR 결합 및 FcRn 수용체 결합 친화도가 유의하게 증가함). 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태는 2400 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만의 IR 분석 IC50 값, 1500 ng/L 미만, 더욱 바람직하게는 1000 ng/mL 미만의 인간 FcRn 분석 EC50 값, 0.50 미만의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도 3,000 ng/mL에서의 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율(OD450 비율 계산에 사용된 참조 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질임), 및 0.35 미만의 1,000 ng/mL의 비오티닐화-Clq 농도에서 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율(OD450 비율 계산에 사용된 참조 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질임)을 나타내었다.
바람직한 실시양태에서, 서열번호 80의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 링커, 및 서열번호 77의 Fc-단편의 cNg-NB155-D 돌연변이를 포함한다(상기 서열에서, X1은 D임). 서열번호 80의 인슐린-Fc-융합 단백질은 150 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 2400 nM 미만의 IR 분석 IC50 값, 1000 ng/mL 미만의 인간 FcRn 분석 EC50 값, 0.50 미만의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도 3,000 ng/mL에서의 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율, 및 0.35 미만의 1,000 ng/mL의 비오티닐화-Clq 농도에서의 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율을 나타낸다. 다음은 B16A 및 cNg-NB155-D 돌연변이가 밑줄로 표시된 서열번호 80을 보여준다:
(서열번호 80).
바람직한 실시양태에서, 서열번호 82의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 링커, 및 서열번호 77의 Fc-단편의 cNg-NB155-A 돌연변이를 포함한다(상기 서열에서, X1은 A임). 서열번호 82의 인슐린-Fc-융합 단백질은 150 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 2400 nM 미만의 IR 분석 IC50 값, 1000 ng/mL 미만의 인간 FcRn 분석 EC50 값, 0.50 미만의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도 3,000 ng/mL에서의 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율, 및 0.35 미만의 비오티닐화-Clq 농도 1,000 ng/mL에서의 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율을 나타낸다. 다음은 B16A 및 cNg-NB155-A 돌연변이가 밑줄로 표시된 서열번호 82를 보여준다:
(서열번호 82).
바람직한 실시양태에서, 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 링커, 및 서열번호 77의 Fc-단편의 cNg-NB155-R 돌연변이를 포함한다(상기 서열에서, X1은 R임). 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질은 150 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 2400 nM 미만의 IR 분석 IC50 값, 1000 ng/mL 미만의 인간 FcRn 분석 EC50 값, 0.50 미만의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도 3,000 ng/mL에서의 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율, 및 0.35 미만의 비오티닐화-Clq 농도 1,000 ng/mL에서의 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율을 나타낸다. 다음은 B16A 및 cNg-NB155-R 돌연변이가 밑줄로 표시된 서열번호 84를 보여준다:
(서열번호 84).
서열번호 78의 경우와 같이, 인슐린 폴리펩타이드의 B-사슬 상의 16번째 아미노산(B16)이 알라닌으로 돌연변이되었을 때(서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드 생성), 서열번호 92, 서열번호 93, 및 서열번호 94의 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 Fc(감마)RI 및 C1q 결합 친화도의 감소 또는 증가된 동종이량체 역가를 손상시키지 않으면서, cNg-NB155-D, cNg-NB155-A, cNg-NB155-R 및 cNg-NB155-Q 돌연변이를 포함하는 인간 IgGl Fc-단편을 포함하는 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94 및 서열번호 95)의 생활성이 복원되었다(즉, IR 결합 및 FcRn 수용체 결합 친화도가 유의하게 증가함)(이전에 논의된 바와 같이, 서열번호 95의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 동종이량체 역가는 150 mg/L의 설계 목적을 충족하지 못함).
그러나, 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 링커, 및 서열번호 77의 Fc-단편의 cNg-NB155-Q 돌연변이를 포함하는 서열번호 86의 인슐린-Fc-융합 단백질 (상기 서열에서, X1은 Q임)은 서열번호 95의 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 Fc(감마)RI 및 C1q 결합 친화도의 감소를 나타내지 않았지만, 서열번호 86의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 동종이량체 역가는 서열번호 95의 것에서 111 mg/L로 더 떨어졌으며, 이는 150 mg/L 초과의 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체 역가의 설계 목적을 충족하지 않는다. 다음은 B16A 및 cNg-NB155-Q 돌연변이가 밑줄로 표시된 서열번호 86을 보여준다:
(서열번호 86).
이들 결과는 인간 IgG1 Fc-단편에 대한 cNg 돌연변이의 선택과 인슐린 폴리펩타이드의 조성 사이에 예상치 못한 유의한 상호작용이 있어서 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질의 IR 및 FcRn 결합 친화도와 관련하여 바람직한 입체형태를 확인하기 위한 실험이 필요함을 나타낸다.
일부 입체형태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 N-말단에 리더 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다른 입체형태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 예를 들어 N-말단에서 리더 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예시적인 리더 서열은 아미노산 서열: MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (서열번호 24)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 예를 들어, 세포(예를 들어, 진핵생물, 예를 들어, 포유류 세포)에서의 발현(예를 들어, 재조합 발현)을 위한 리더 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 특정 실시양태에서, 리더 서열은 발현 동안, 예를 들어 세포 배양에서 절단된다. 리더 서열을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열은 핵산 서열: atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcc(서열번호 23)를 포함한다. 실시양태에서, 서열번호 23의 예시적인 핵산은 서열번호 24의 예시적인 리더 서열을 인코딩한다.
서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 포함하는 바람직한 실시양태에서, 핵산 서열(리더 서열에 밑줄 표시됨)은 다음과 같다:
(서열번호 79).
서열번호 80의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 포함하는 바람직한 실시양태에서, 핵산 서열(리더 서열에 밑줄 표시됨)은 다음과 같다:
(서열번호 81).
서열번호 82의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 포함하는 바람직한 실시양태에서, 핵산 서열(리더 서열에 밑줄 표시됨)은 다음과 같다:
(서열번호 83).
서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 포함하는 바람직한 실시양태에서, 핵산 서열(리더 서열에 밑줄 표시됨)은 다음과 같다:
(서열번호 85).
서열번호 86의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 포함하는 바람직한 실시양태에서, 핵산 서열(리더 서열에 밑줄 표시됨)은 다음과 같다:
(서열번호 100).
일부 적용에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 특성을 추가로 변형시키기 위해 공유적으로 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 인슐린-Fc-융합 단백질은 문헌[Dozier, J.; Distefano, M. Site-Specific PEGylation of Therapeutic Proteins. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16(10), 25831-25864)]에 기재된 바와 같이 그의 순환 반감기를 추가로 연장시키는 다양한 길이의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자에 접합될 수 있다. 이러한 접합 방법 중 하나는 아실 전달 반응을 통한 1차 아민(예를 들어, PEG 분자 말단)과 글루타민의 카복사미드기(예를 들어, 표적 단백질, 예를 들어, 표적 인슐린-Fc-융합 단백질의 Q) 사이의 공유 결합을 생성시키는 이른바 트랜스글루타미나제(transglutaminase)라는 효소의 부류에 의존한다 (문헌[Dozier, J.; Distefano, M., page 25853]). 서열번호 86 및 서열번호 95의 인슐린-Fc-융합 단백질의 위치 NB153에 있는 Q는 바람직한 TGase 접합 부위이지만, 각각의 인슐린-Fc-융합 단백질이 
(서열번호 13) 링커를 포함하고, 링커는 또한 Q 잔기에서 접합될 것이다. 따라서 링커 Q 부위에서 부적절한 TGase 접합을 최소화하기 위해 링커에서 글루타민(Q)에 대한 알라닌(A) 돌연변를 테스트했다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드, 
(서열번호 67)의 링커, 및 서열번호 77의 Fc-단편의 cNg-NB155-S 돌연변이를 포함한다(상기 서열에서, X1은 S임). 서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질은 150 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 2400 nM 미만의 IR 분석 IC50 값, 1000 ng/mL 미만의 인간 FcRn 분석 EC50 값, 0.50 미만의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도 3,000 ng/mL에서의 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율, 및 0.35 미만의 1,000 ng/mL의 비오티닐화-Clq 농도에서의 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율을 나타낸다. 다음은 B16A 및 cNg-NB155-S 돌연변이뿐만 아니라 링커 서열이 밑줄 표시된 서열번호 87을 보여준다:
(서열번호 87).
서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 실시양태에서, 핵산 서열(리더 서열에 밑줄 표시됨)은 다음과 같다:
(서열번호 88).
Fc-융합 단백질 접합체의 링커 길이는 수율에서 생활성에 이르는 융합 단백질의 특성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 링커의 길이로 인한 수율 또는 기능의 임의의 이득 또는 손실을 결정하기 위해 더 짧은 링커를 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 시험하였다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드, 
(서열번호 11)의 링커, 및 서열번호 77의 Fc-단편을 포함한다(상기 서열에서, X1은 S임). 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질은 150 mg/L 초과의 동종이량체 역가, 2400 nM 미만의 IR 분석 IC50 값, 1000 ng/mL 미만의 인간 FcRn 분석 EC50 값, 0.50 미만의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도 3,000 ng/mL에서의 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율, 및 0.35 미만의 1,000 ng/mL의 비오티닐화-Clq 농도에서의 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율을 나타낸다.
다음은 B16A 및 cNg-NB155-S 돌연변이뿐만 아니라 링커 서열에 밑줄 표시된 서열번호 89를 보여준다:
(서열번호 89).
서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 실시양태에서, 핵산 서열(리더 서열에 밑줄 표시됨)은 다음과 같다:
(서열번호 90).
일반적으로 바람직한 입체형태에서, 다양한 링커 (서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 67)와 서열번호 10의 바람직한 B16A-돌연변이 인슐린 폴리펩타이드와 조합된 서열번호 77(상기 서열에서, X1은 S, D, A 또는 R임)의 낮은 면역원성 비-글리코실화 cNg-돌연변이 인간 IgG1 Fc-단편은 높은 동종이량체 역가-수율 생활성 비-면역원성 인간 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태 패밀리를 생성하며, 이는 당뇨병 환자에서 주 1회 만성 투여를 가능하게 하는 충분한 생체내 효능 및 작용 지속 시간을 나타낼 것으로 예상된다.
인슐린-Fc-융합 단백질 생성
실시양태에서, 융합 단백질은 실시예 섹션에 더 상세히 기재된 바와 같이 세포에 의해 발현될 수 있다.
발현 및 정제
실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질은 예를 들어 진핵 세포, 예를 들어 포유류 세포 또는 비-포유류 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 발현에 사용되는 예시적인 포유류 세포는 HEK 세포(예를 들어, HEK293 세포) 또는 CHO 세포를 포함한다. CHO 세포는 다양한 균주 또는 하위 분류(예를 들어, CHO DG44, CHO-M 및 CHO-K1)로 세분될 수 있으며 이러한 세포 균주 중 일부는 특정 유형의 핵산 분자(예를 들어, DNA를 포함하는 벡터) 또는 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 특정 세포 성장 배지 조성물과의 최정의 사용을 위해 유전자 조작될 수 있다. 실시양태에서, 세포는 인슐린-Fc-융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 벡터)로 형질감염된다(예를 들어, 전체 인슐린-Fc-융합 단백질이 단일 핵산 분자에 의해 인코딩되는 경우). 실시양태에서, HEK293 세포는 인슐린-Fc-융합 단백질을 인코딩하지만 숙주 세포가 인슐린-Fc-융합 단백질의 유의한 수준의 발현을 중단하기 전에 일정 기간(예를 들어, 3일, 4일, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일 이상) 동안 인슐린-Fc-융합 단백질의 일시적 발현만을 야기한다(즉, 일시적 형질감염). 인슐린-Fc-융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포는 종종, 다중 인슐린-Fc-융합 단백질 후보의 제조 및 스크리닝을 용이하게 하는, 재조합 단백질의 보다 신속한 생성을 가능하게 한다. 실시양태에서, CHO 세포는 숙주 세포 DNA에 영구적으로 혼입되고 세포가 적절하게 배양되는한 인슐린-Fc-융합 단백질의 일관되고 영구적인 발현(즉, 안정한 형질감염)을 유도하는 벡터로 형질감염된다. 인슐린-Fc-융합 단백질을 인코딩하는 핵산으로 안정적으로 형질감염된 CHO 세포 및 CHO 세포주는 종종 개발 시간이 더 오래 걸리지만, 이들은 종종 더 높은 총 단백질 수율을 생성하고 저비용 산물(예를 들어, 상대적으로 시판 인간 인슐린 시장을 위한 산물)의 제조를 더 용이하게 한다. 세포 및 세포주는 당업계의 표준 방법을 사용하여 배양될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 서열번호 79 (서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 서열번호 81 (서열번호 80의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 서열번호 83(서열번호 82의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 서열번호 85(서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 서열번호 88(서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 및 서열번호 90(서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응)을 갖는 cDNA 서열 중 어느 하나를 포함하는 HEK 세포는 인슐린-Fc-융합 단백질을 발현시키는데 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 서열번호 79 (서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 서열번호 81 (서열번호 80의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 서열번호 83 (서열번호 82의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 서열번호 85 (서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 서열번호 88 (서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응), 및 서열번호 90 (서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 상응)을 갖는 cDNA 서열 중 어느 하나를 포함하는 CHO 세포는 인슐린-Fc-융합 단백질을 발현시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질은 세포로부터 (예를 들어, 세포의 용해에 의해) 단리되거나 정제된다. 다른 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질은 세포에 의해 분비되고 세포가 성장한 세포 배양 배지로부터 정제되거나 단리된다. 인슐린-Fc-융합 단백질의 정제는 컬럼 크로마토그래피(예를 들어, 친화도 크로마토그래피)를 사용하거나 특정 분자에 대한 크기, 전하 및/또는 친화도의 차이를 기반으로 하는 다른 분리 방법을 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 정제는 예를 들어, 단백질 A 비드에 공유 결합된 단백질 A에 중성 용액 pH에서 고친화도로 결합되게 하는 Fc-단편을 포함하는 단백질을 유발하는 단백질 A 비드 또는 단백질 A 컬럼을 사용함으로써 Fc-단편을 포함하는 단백질을 선택하거나 농축하는 단계를 포함한다. 결합된 인슐린-Fc-융합 단백질은 용액 변수의 변화(예를 들어, 용액 pH의 감소)에 의해 단백질 A 비드로부터 용출될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 겔 여과 크로마토그래피와 같은 다른 분리 방법도 대안적으로 또는 추가로 사용할 수 있다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 정제는 단백질 제제를 여과 또는 원심분리하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 추가 정제는 정용여과, 한외여과, 및 다양한 크기의 다공성 막을 통한 여과뿐만 아니라 부형제를 사용한 최종 제형을 포함한다.
정제된 인슐린-Fc-융합 단백질은 다양한 방법, 예를 들어 280 nm에서의 흡광도(예를 들어, 총 단백질 수율 결정), 크기 배제 또는 모세관 전기영동(예를 들어, 분자량, 응집 퍼센트 및/또는 순도 결정), 질량 분석(MS) 및/또는 액체 크로마토그래피(LC-MS)(예를 들어, 순도 및/또는 글리코실화 결정) 및/또는 EFISA(예를 들어, 항-인슐린 항체에 대한 결합 정도, 예를 들어 친화도 결정)를 사용하여 순도, 총 단백질 수율, 구조 및/또는 활성에 대해 특성화될 수 있다. 특성화의 예시적인 방법은 또한 실시예 섹션에 기재되어 있다.
실시양태에서, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 및 단백질 A 정제에서의 생성 후 인슐린-Fc-융합 단백질의 총 단백질 수율은 5 mg/L, 10 mg/L, 또는 20 mg/L 초과이다. 바람직한 실시양태에서, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 및 단백질 A 정제에서의 생성 후 인간 인슐린-Fc-융합 단백질의 총 단백질 수율은 100 mg/L 초과(예를 들어, 150 mg/L 초과)이다. 실시양태에서, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 및 단백질 A 정제에서의 생성 후 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 %는 70% 초과(예를 들어, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과)이다. 바람직한 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 총 단백질 수율과 동종이량체 % 사이의 곱으로 계산되는, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 및 단백질 A 정제에서의 생성 후 인간 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 역가는 100 mg/L 초과(예를 들어, 150 mg/L 초과)이다. 동종이량체 역가가 150 mg/L 초과의 인간 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태만이 본 발명에서 유용한 것으로 고려되었는데, 이는 경험에 따르면 이 수준 미만의 동종이량체 역가가 상대적으로 시판 인간 인슐린 시장에 대한 엄격하게 낮은 제조 비용 요건을 충족하는 CHO 세포에서 상업적 생성 역가를 초래하지 않을 가능성이 있음이 입증되었기 때문이다.
실시양태에서, 안정적으로 형질감염된 CHO 세포(예를 들어, CHO 세포주 또는 CHO 세포 클론) 및 단백질 A 정제에서 생성 후 인슐린-Fc-융합 단백질의 총 단백질 수율은 100 mg 초과의 인슐린-Fc-융합 단백질/L(예를 들어, 배양 배지의 mg/L)이다. 바람직한 실시양태에서, 안정하게 형질감염된 CHO 세포(예를 들어, CHO 세포주 또는 CHO 세포 클론) 및 단백질 A 정제에서 생성 후 인슐린-Fc-융합 단백질의 총 단백질 수율은 150 mg 초과의 인슐린-Fc-융합 단백질/L 배양 배지(예를 들어, 200 mg/L 초과, 300 mg/L 초과, 400 mg/L 초과, 500 mg/L 초과, 600 mg/L 초과 또는 그 이상)이다. 실시양태에서, 안정적으로 형질감염된 CHO 세포(예를 들어, CHO 세포주 또는 CHO 세포 클론) 및 단백질 A 정제에서 생성 후 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 %는 70% 초과(예를 들어, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과)이다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 총 단백질 수율과 동종이량체 % 사이의 곱으로 계산되는 안정적으로 형질감염된 CHO 세포 (예를 들어 CHO 세포주 또는 CHO 세포 클론) 및 단백질 A 정제에서의 생성 후 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 역가는 150 mg/L 초과(예를 들어, 200 mg/L 초과, 300 mg/L 초과, 400 mg/L 초과, 500 mg/L 초과, 600 mg/L 초과)이다.
인슐린-Fc-융합 단백질의 기능적 특징
표적 대상체(예를 들어, 개 또는 인간)에서 인슐린 수용체와 상호작용하여 혈당을 저하시키는 방법이 본 명세서에 기재되어 있으며, 상기 방법은 대상체에게 인슐린-Fc-융합 단백질, 예를 들어 본 명세서에 기재된 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 당뇨병(예를 들어, 개의 경우 개 당뇨병, 또는 인간의 경우 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병)으로 진단되었다.
실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질은 실시예 12에 기재된 4℃ IM-9 IR 결합 분석에서 IC50에 의해 측정되는 바와 같이(예를 들어, 5000 nM 미만의 IC50, 4000 nM 미만 IC50, 3000 nM 미만 IC50, 2400 nM 미만 IC, 2000 nM 미만 IC50), 상당한 친화도로 IR에 결합한다. 경험에 기반하여, 5000 nM 미만, 바람직하게는 2400 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만의 IR 활성 IC50 값을 나타내는 화합물만이 표적 대상체에서 생활성을 나타낼 가능성이 있는 것으로 고려되었다. 일반적으로, 더 높은 친화도 IR 결합(즉, 더 낮은 IC50 값)이 바람직하다. 그러나, 인슐린 및 인슐린 유사체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 인슐린 폴리펩타이드)의 제거는 주로 IR에 대한 결합에 이어 IR 내재화 및 세포내 분해를 통해 조절된다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 너무 높은 IR 결합 친화도(즉, 너무 낮은 IC50, 예를 들어 500 nM 미만의 IC50)를 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 순환에서 너무 빨리 제거되어 표적 대상체의 글루코스-저하 생활성의 적절한 기간보다 짧을 수 있다.
실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 실시예 19에 따라 측정된 바와 같이 인슐린-Fc-융합 단백질 참조 표준의 것보다 더 높은 친화도로 FcRn 수용체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재되고 인간 FcRn 수용체 분석에 의해 측정된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 FcRn 수용체 친화도는 1500 ng/mL 이하, 더욱 바람직하게는 1000 ng/mL 이하이다.
실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질은 대상체에서 투여 후 글루코스 수준(예를 들어, 혈당 수준)을 저하시킬 수 있다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 글루코스 저하 활성은 인슐린 참조 표준의 것보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 활성 기간은 투여전 공복 혈당 수준에 비해 공복 혈당의 감소, 예를 들어 통계적으로 유의한 감소에 의해 측정될 수 있다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 활성 기간(예를 들어, 투여전 수준에 비해 대상체에서 공복 혈당 수준이 통계적으로 유의하게 감소하는 시간)은 약 2시간 초과이다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 활성 기간(예를 들어, 투여 전 수준에 비해 대상체에서 혈당 수준이 통계적으로 유의하게 감소하는 시간)은 최소한 약 6시간, 9시간, 12시간, 18시간, 1일, 1.5일, 2일, 2.5일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상이다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질은 장기-작용성이다(예를 들어, 혈청에서 긴 반감기를 갖음).
실시양태에서, 표적 대상체에서 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질의 혈청 반감기는 인슐린 참조 표준 또는 대조군 제형의 것보다 더 길다. 실시양태에서, 표적 대상체에서 인슐린-Fc-융합 단백질(예를 들어, 투여 시 대상체의 혈액내)의 혈청 반감기는 약 2시간보다 길다. 실시양태에서, 표적 대상체에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 혈청 반감기는 약 0.5일, 1일, 2일, 또는 2.5일이다. 바람직한 실시양태에서, 표적 대상체에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 혈청 반감기는 약 3일 이상이다.
실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질의 효능 및 생활성 기간의 조합은 FBGL%·일· kg/mg 단위의 mg/kg의 소정의 투여량에 대해 정규화된 공복 혈당 퍼센트(FBGL%) 곡선 (NAOC)에 걸친 면적을 계산함으로써 정량화될 수 있다. 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질의 NAOC는 150 FBGL%·일·kg/mg 초과(예를 들어, 200 FBGL%·일·kg/mg 초과, 250 FBGL%·일·kg/mg 초과)이다. 다시, 경험에 기반하여, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC 값에서 표적 대상체의 투여량 요건은 허용 가능한 치료 비용을 달성하기에 충분히 낮을 것이다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 NAOC는 표적 대상체에서 반복 투여 후에 유지되어야만 한다(즉, 인슐린-Fc-융합 단백질의 1차 투여 후 NAOC에 대한 3차 투여 후 NAOC의 비율이 0.5 초과(예를 들어, 0.6 초과, 0.7 초과, 0.8 초과, 0.9 초과, 또는 그 이상)임).
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 실시예 15에 따라 측정된 바와 같이 인슐린-Fc-융합 단백질 참조 표준의 것보다 더 낮은 친화도로 Fc(감마) 수용체에 결합한다. 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 친화도 대 인슐린-Fc-융합 단백질 참조 표준(즉, 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질)의 비율은 0.50 미만(예를 들어, 0.40 미만, 0.30 미만, 0.20 미만)이다. 일부 실시양태에서, 3000 ng/mL 비오티닐화-Fc(감마)RI에서 인간 Fc(감마)RI 수용체 분석에 의해 측정된 바와 같은 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 분석 OD450 비율(서열번호 76의 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 대비)는 0.50 이하이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 실시예 16에 따라 측정된 바와 같이 인슐린-Fc-융합 단백질 참조 표준의 것보다 더 낮은 친화도로 C1q에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질의 C1q 결합 친화도 대 인슐린-Fc-융합 단백질 참조 표준(즉, 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질)의 비율은 0.50 미만(예를 들어, 0.40 미만, 0.30 미만, 0.20 미만)이다. 일부 실시양태에서, 1000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 인간 C1q 결합 분석 OD450 비율에 의해 측정된 인슐린-Fc-융합 단백질의 C1q 결합 친화도(서열번호 76의 참조 인슐린-Fc-융합 단백질 대비)는 0.35 이하이다.
치료방법 및 대상체 선택의 특징
당뇨병(예를 들어, 인간의 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병)을 치료하는 방법으로서, 표적 대상체에 인슐린-Fc-융합 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태)의 투여를 포함하는 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
실시양태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 사용된 참조 표준은 참조 치료 또는 참조 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 참조는 당뇨병 치료를 위한 표준 치료제(예를 들어, 개 당뇨병에 대한 표준 치료제 또는 인간에서 제1형 당뇨병에 대한 표준 치료제 또는 인간에서 제2형 당뇨병에 대한 표준 치료제)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 참조 표준은 시판되는 인슐린 또는 인슐린 유사체이다. 일부 실시양태에서, 참조 표준은 장기-지속성 인슐린, 중간-지속성 인슐린, 단기-지속성 인슐린, 신속-작용성 인슐린, 단기-작용성, 중간-작용, 장기-작용성 인슐린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개 인슐린에 대한 참조 표준은 Vetsulin®, Prozinc®, 인슐린 NPH, 인슐린 글라진(glargine)(Lantus®) 또는 재조합 인간 인슐린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 인슐린에 대한 참조 표준은 Humalog®, NovoLog®, Novolin®R (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), Novolin®N (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), Humulin®R (Eli Lilly, Indianapolis, IN), Humulin®N (Eli Lilly, Indianapolis, IN), Lantus®, 및 Levemir®, 또는 일반 재조합 인간 인슐린을 포함한다.
실시양태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 사용되는 참조 표준은 당뇨병 요법(예를 들어, 개 당뇨병 요법 또는 인간 당뇨병 요법)의 결과, 예를 들어 본 명세서에 기재된 결과를 포함한다.
실시양태에서, 참조 표준은 표적 대상체가 당뇨병이 있는 경우 요법, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 요법의 개시 전에 표적 대상체에서 마커(예를 들어, 혈당 또는 HbA1c)의 수준이다. 실시양태에서, 표적 대상체의 혈당 수준은 요법 개시 전 200 mg/dL 초과(예를 들어, 최소한 250 mg/dL, 300 mg/dL, 350 mg/dL, 400 mg/dL 이상)이다. 실시양태에서, 개의 프룩토사민(fructosamine) 수준은 요법 개시 전에 250마이크로몰/L, 350마이크로몰/L 초과(예를 들어, 최소한 400마이크로몰/L, 450마이크로몰/L, 500마이크로몰/L, 550마이크로몰/L, 600마이크로몰/L 초과, 650 마이크로몰/L, 700 마이크로몰/L, 750 마이크로몰/L 이상)이다. 실시양태에서, 인간 표적 대상체의 HbA1c 수준은 요법 개시 전에 7mmol/L 초과(예를 들어, 7.5mmol/L, 8mmol/L, 9mmol/L, 10mmol/L, 11mmol/L, 12mmol/L 이상)이다. 실시양태에서, 참조 표준은 질병의 존재, 진행 또는 중증도의 척도이다. 실시양태에서, 참조 표준은 요법, 예를 들어 본 명세서에 기재된 인슐린-Fc-융합 단백질 요법의 개시 전 질병 증상의 존재 또는 중증도의 척도이며, 예를 들어 표적 대상체는 당뇨병이 있다.
약제학적 조성물 및 투여 경로
표적 대상체에서 혈당을 저하시키는데 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 약제학적 조성물에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 양 및 농도뿐만 아니라, 표적 대상체에게 투여되는 약제학적 조성물의 양은 대상체의 의학적으로 관련된 특성(예를 들어, 연령, 체중, 성별, 기타 의학적 상태 등), 약제학적 조성물에서 화합물의 용해도, 화합물의 효능 및 활성, 및 약제학적 조성물의 투여 방식과 같은 임상적으로 관련된 인자를 기반으로 선택될 수 있다. 투여 경로 및 투여량 요법(Dosage Regime)에 대한 추가 정보는 문헌[Pergamon Press 1990의 Comprehensive Medicinal Chemistry(Corwin Hansch; 편집 위원회 의장)] 5권의 25.3장을 참조한다.
본 개시내용의 제형은 비경구 투여에 적합한 제형을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"이라는 문구는 일반적으로 정맥내 또는 피하 주사에 의한 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제, 예를 들어 Tween 유사 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)은 Tween-유사 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트-20, Tween-20 또는 Tween-80을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)은 약 0.001% 내지 약 2%, 또는 약 0.005% 내지 약 0.1% 또는 약 0.01% 내지 약 0.5% 농도의 Tween-유사 계면활성제, 예를 들어 Tween-80을 포함한다.
일부 실시양태에서, 수성 담체 중 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도는 약 3 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 수성 담체 중 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도는 약 6 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 수성 담체 중 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도는 약 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 12 mg/mL, 15 mg/mL 이상이다.
일부 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질은 일시 투여, 주입, 또는 정맥내 가압으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 주사기 주사, 펌프, 펜, 바늘 또는 유치 카테터(indwelling catheter)를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 인슐린-Fc-융합 단백질은 피하 일시 주사에 의해 투여된다. 도입 방법은 충전식 또는 생분해성 장치로도 제공될 수 있다. 최근 몇 년 동안 단백질성 바이오의약을 포함한 약물의 제어된 전달을 위해 다양한 서방성 중합체 장치가 개발되고 생체내에서 시험되었다. 생분해성 및 비분해성 중합체를 포함하는 다양한 생체적합성 중합체(하이드로겔 포함)를 사용하여 특정 표적 부위에서 화합물의 지속 방출을 위한 이식체를 형성할 수 있다.
투여량(Dosage)
본 명세서에 기재된 입체형태의 인슐린-Fc-융합 단백질의 실제 투여량 수준은 특정 표적 대상체(예를 들어, 개 또는 인간)에 대해 적절한 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 특정 융합 단백질, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 융합 단백질과 조합하여 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료 대상체의 연령, 성별, 중량, 상태, 일반적 건강 및 이전 병력 및 의학계에 알려져 있는 유사 인자를 포함한 다양한 인자에 따라 달라진다.
일반적으로, 인슐린-Fc-융합 단백질의 적합한 용량은 치료 효과를 생성하는데 효과적인 가장 낮은 투여량의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 위에서 설명한 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 표적 대상체에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질의 정맥내 및 피하 투여량은 약 0.001 내지 약 1 mg/킬로그램 (예를 들어 mg/kg) 체중/일, 예를 들어, 약 0.001 내지 1 mg/kg/일, 약 0.01 내지 0.1 mg/kg/일, 약 0.1 내지 1 mg/kg/일, 또는 약 0.01 내지 1 mg/kg/일의 범위일 것이다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 0.025 내지 4 mg/킬로그램 체중/주, 예를 들어, 0.025 내지 1.0 mg/kg/주의 용량으로 투여된다.
본 개시내용은 임의의 상기 언급된 약제학적 조성물 및 제제에서의 인슐린-Fc-융합 단백질의 제형화를 고려한다. 또한, 본 개시내용은 임의의 상기 투여 경로를 통한 투여를 고려한다. 당업자는 치료되는 병태 및 치료되는 대상체의 전반적인 건강, 연령 및 크기에 기반하여 적절한 제형 및 투여 경로를 선택할 수 있다.
실시예
본 기술은 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
일반적인 방법, 분석, 및 재료
실시예 1: HEK293 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 합성 및 제조 방법.
인슐린-Fc-융합 단백질을 다음과 같이 합성하였다. 대상 유전자 서열을 독점 소프트웨어(LakePharma, Belmont, CA)를 사용하여 작제하고 고발현 포유류 벡터에 클로닝하였다. HEK293 세포를 형질감염 24시간 전에 진탕 플라스크에 시딩하고 화학적으로 정의된 무-혈청 배지를 사용하여 성장시켰다. 대상 인슐린-Fc-융합 단백질을 인코딩하는 DNA 발현 작제물을 일시적 형질감염을 위한 표준 작동 절차(LakePharma, Belmont, CA)를 사용하여 HEK293 세포의 현탁액 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 20시간 후, 세포를 계수하여 생존 및 생존 세포 수를 결정하고, 역가를 ForteBio® Octet®(Pall ForteBio LLC, Fremont, CA)로 측정했다. 일시적인 형질감염 생성 구동 전체에 걸쳐 추가 판독값을 획득했다. 배양물을 5일째 또는 그 이후에 수확하였다.
실시예 2: CHO 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 합성 및 제조 방법.
CHO 세포주를 원래 CHO-K1(LakePharma, Belmont, CA)에서 유도하고, 내인성 글루타민 합성효소(GS) 유전자를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합 기술에 의해 녹아웃하였다. 안정한 발현 DNA 벡터를 CHO 발현 및 GS 선택을 위해 설계 및 최적화하고, 고발현 포유류 벡터(LakePharma, Belmont, CA)에 혼입하였다. 확장 실험을 시작하기 전에 완성된 각 작제물의 서열을 확인했다. 현탁액 적응 CHO 세포를 화학적으로 정의된 배지(CD OptiCHO; Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 37℃의 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. CHO 세포 배양에 혈청 또는 기타 동물-유래 산물을 사용하지 않았다.
지수 성장 단계 동안 CD OptiCHO 배지에서 성장하는 약 8천만 개의 현탁액-적응된 CHO 세포를 80 μg DNA로 MaxCyte® STX® 시스템(MaxCyte, Inc., Gaithersburg, MD)을 사용하여 전기천공에 의해 형질감염시켜, 각각의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 안정한 CHO 세포주를 생성시켰다(DNA 작제물은 인슐린-Fc-융합 단백질의 전장 서열을 포함함). 24시간 후, 형질감염된 세포를 계수하고 인슐린-Fc-융합 유전자의 안정적인 혼입을 위한 선택 하에 적용하였다. 형질감염된 세포를 진탕 플라스크에서 0.5x106 세포/mL의 세포 밀도로 0 내지 100 μM 메티오닌 술폭시민(MSX)을 포함하는 CD OptiCHO 선택 배지에 시딩하고 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 선택 과정 동안, 안정한 CHO 풀이 성장 속도와 생존율을 복원할 때까지 세포를 회전시키고 새로운 선택 배지에 2 내지 3일마다 재현탁했다. 세포 배양을 성장 및 역가에 대해 모니터링하였다.
세포를 2.5x106 세포/mL로 성장시켰다. 세포 은행을 위한 수확 당시 생존율은 95% 이상이었다. 그 다음, 세포를 원심분리하고, 세포 펠릿을 7.5% 디메틸 술폭사이드(DMSO)가 포함된 CD OptiCHO 배지에 재현탁하여 바이알당 15x106 세포/mL의 세포 수로 재현탁시켰다. 바이알을 액체 질소에 보관하기 위해 동결저장하였다.
CHO 세포를 사용하여 다음과 같이 소규모 생성을 수행하였다. 37℃에서 100 μM MSX를 포함하는 CD OptiCHO 성장 배지에서 생성을 위해 세포를 확장하고 필요한 경우 약 14 내지 21일 동안 글루코스 및 추가 아미노산이 보충된 CD OptiCHO 성장 배지를 필요에 따라 2 내지 4일마다 공급했다. 안정한 풀 생성 구동에서 수확한 조절된 배지 상청액을 원심분리기 회전에 의해 정화했다. 단백질을 결합 완충액으로 미리 평형화시킨 단백질 A(MabSelect, GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom) 컬럼에서 구동시켰다. 그런 다음 세척 완충액을 OD280 값(NanoDrop, Thermo Scientific)이 배경 수준 또는 그 근처에 있는 것으로 측정될 때까지 컬럼에 통과시켰다. 인슐린-Fc-융합 단백질을 pH가 낮은 완충액을 사용하여 용출하고, 용출 분획을 수집하고, 각 분획의 OD280 값을 기록하였다. 표적 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 분획을 풀링하고 선택적으로 0.2 μM 막 필터를 사용하여 추가로 여과하였다.
세포주를 선택적으로 단일클론성으로 추가로 서브클로닝하고, 선택적으로 당업계의 숙련자에게 공지된 방법인 제한 희석 방법을 사용하여 고역가 인슐린-Fc-융합 단백질-발현 클론에 대해 추가로 선택하였다. 고역가의 단일클론 인슐린-Fc-융합 단백질 발현 세포주를 얻은 후, 인슐린-Fc-융합 단백질의 생성을 MSX가 부재하는 성장 배지에서, 또는 선택적으로 MSX를 포함하는 성장 배지에서 전술한 바와 같이 달성하여, 재조합 CHO-생성 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 세포 배양 상청액을 획득하였다. MSX 농도를 더 높은 산물 역가를 산출할 수 있는 클론에 대한 추가 선택성을 확인하기 위해 시간이 지남에 따라 선택적으로 증가시켰다.
실시예 3: CHO 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 합성 및 제조 방법.
CHO 세포주를 원래 CHO-K1(LakePharma, Belmont, CA)에서 유도하고, 내인성 글루타민 합성효소(GS) 유전자를 당업계에 공지된 방법을 사용하는 재조합 기술에 의해 녹아웃시킨다. 안정적인 발현 DNA 벡터를 CHO 발현 및 GS 선택을 위해 설계 및 최적화하고, 고발현 포유류 벡터(LakePharma, Belmont, CA)에 혼입한다. 확장 실험을 시작하기 전에 완성된 각 작제물의 서열을 확인한다. 현탁액 적응 CHO 세포를 화학적으로 정의된 배지(CD OptiCHO; Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 37℃의 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 배양한다. CHO 세포 배양에 혈청 또는 기타 동물-유래 산물을 사용하지 않는다.
지수 성장 단계 동안 CD OptiCHO 배지에서 성장하는 약 8천만 개의 현탁액-적응된 CHO 세포를 80 μg DNA로 MaxCyte® STX® 시스템(MaxCyte, Inc., Gaithersburg, MD)을 사용하여 전기천공에 의해 형질감염시켜, 각각의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 안정한 CHO 세포주를 생성시켰다(DNA 작제물은 인슐린-Fc-융합 단백질의 전장 서열을 포함함). 24시간 후, 형질감염된 세포를 계수하고 인슐린-Fc-융합 유전자의 안정적인 혼입을 위한 선택 하에 적용하였다. 형질감염된 세포를 진탕 플라스크에서 0.5x106 세포/mL의 세포 밀도로 0 내지 100 μM 메티오닌 술폭시민(MSX)을 포함하는 CD OptiCHO 선택 배지에 시딩하고 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 선택 과정 동안, 안정한 CHO 풀이 성장 속도와 생존율을 복원할 때까지 세포를 회전시키고 새로운 선택 배지에 2 내지 3일마다 재현탁했다. 세포 배양을 성장 및 역가에 대해 모니터링하였다.
세포를 2.5x106 세포/mL로 성장시켰다. 세포 은행을 위한 수확 당시 생존율은 95% 이상이었다. 그 다음, 세포를 원심분리하고, 세포 펠릿을 7.5% 디메틸 술폭사이드(DMSO)가 포함된 CD OptiCHO 배지에 재현탁하여 바이알당 15x106 세포/mL의 세포 수로 재현탁시켰다. 바이알을 액체 질소에 보관하기 위해 동결저장하였다.
CHO 세포를 사용하여 다음과 같이 소규모 생성을 수행하였다. 37℃에서 100 μM MSX를 포함하는 CD OptiCHO 성장 배지에서 생성을 위해 세포를 확장하고 필요한 경우 약 14 내지 21일 동안 글루코스 및 추가 아미노산이 보충된 CD OptiCHO 성장 배지를 필요에 따라 2 내지 4일마다 공급했다. 안정한 풀 생성 구동에서 수확한 조절된 배지 상청액을 원심분리기 회전에 의해 정화했다. 단백질을 결합 완충액으로 미리 평형화시킨 단백질 A(MabSelect, GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom) 컬럼에서 구동시켰다. 그런 다음 세척 완충액을 OD280 값(NanoDrop, Thermo Scientific)이 배경 수준 또는 그 근처에 있는 것으로 측정될 때까지 컬럼에 통과시켰다. 인슐린-Fc-융합 단백질을 pH가 낮은 완충액을 사용하여 용출하고, 용출 분획을 수집하고, 각 분획의 OD280 값을 기록하였다. 표적 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 분획을 풀링하고 선택적으로 0.2 μM 막 필터를 사용하여 추가로 여과하였다.
세포주를 선택적으로 단일클론성으로 추가로 서브클로닝하고, 선택적으로 당업계의 숙련자에게 공지된 방법인 제한 희석 방법을 사용하여 고역가 인슐린-Fc-융합 단백질-발현 클론에 대해 추가로 선택하였다. 고역가의 단일클론 인슐린-Fc-융합 단백질 발현 세포주를 얻은 후, 인슐린-Fc-융합 단백질의 생성을 MSX가 부재하는 성장 배지에서, 또는 선택적으로 MSX를 포함하는 성장 배지에서 전술한 바와 같이 달성하여, 재조합 CHO-생성 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 세포 배양 상청액을 획득하였다. MSX 농도를 더 높은 산물 역가를 산출할 수 있는 클론에 대한 추가 선택성을 확인하기 위해 시간이 지남에 따라 선택적으로 증가시켰다.
실시예 4: 인슐린-Fc-융합 단백질의 정제.
인슐린-Fc-융합 단백질의 정제를 다음과 같이 수행하였다. 분비된 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 조절 배지 상청액을 일시적으로 형질감염된 HEK, 안정적으로 형질감염된 HEK, 또는 안정적으로 형질감염된 CHO 생성 구동으로부터 수확하고 원심분리에 의해 정화하였다. 적절한 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 상청액을 단백질 A 컬럼에 구동시키고, 0.15 내지 0.50 M 염화나트륨을 포함하는 다양한 세척 완충액으로 세척한 후, 낮은 pH 용액을 사용하여 용출시켰다. 그 후, 적절한 단백질을 포함하는 용출된 분획을 풀링하고 완충액을 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액으로 교체하였다. 0.2 μm 막 필터를 사용하여 최종 여과 단계를 수행했다. 최종 단백질 농도를 280 nm에서 용액 광학 밀도로부터 계산하였다. 필요에 따라 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온 교환 비드 수지 또는 양이온 교환 비드 수지 사용), 겔 여과 크로마토그래피 또는 기타 방법에 의한 추가의 선택적 정제를 수행하였다.
실시예 5: 인슐린-Fc-융합 단백질의 정제.
인슐린-Fc-융합 단백질의 정제를 다음과 같이 수행한다. 분비된 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 조절 배지 상청액을 일시적으로 형질감염된 HEK, 안정적으로 형질감염된 HEK, 또는 안정적으로 형질감염된 CHO 생성 구동으로부터 수확하고 원심분리에 의해 정화한다. 적절한 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 상청액을 단백질 A 컬럼에 구동시키고, 0.15 내지 0.50 M 염화나트륨을 포함하는 다양한 세척 완충액으로 세척한 후, 낮은 pH 용액을 사용하여 용출시킨다. 그 후, 적절한 단백질을 포함하는 용출된 분획을 풀링하고 완충액을 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액으로 교체한다. 0.2 μm 막 필터를 사용하여 최종 여과 단계를 수행한다. 최종 단백질 농도를 280 nm에서 용액 광학 밀도로부터 계산한다. 필요에 따라 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온 교환 비드 수지 또는 양이온 교환 비드 수지 사용), 겔 여과 크로마토그래피 또는 기타 방법에 의한 추가의 선택적 정제를 수행한다.
실시예 6: 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의한 구조 확인.
모세관 전기영동 소듐 도데실 술페이트(CE-SDS) 분석을 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액에 용해된 정제된 인슐린-Fc-융합 단백질의 용액 상에서 LabChip® GXII (Perkin Elmer, Waltham, MA)에서 수행하고, 전기영동도를 작도했다. 비환원 조건에서 샘플을 확인된 분자량(MW) 단백질 표준에 대해 구동하였으며, 용출 피크는 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체의 '겉보기' MW를 나타낸다.
환원 조건 하에(예를 들어, 인슐린-Fc-융합 동종이량체의 이황화 결합을 파괴하는 베타-메르캅토에탄올 사용), 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질 단량체의 겉보기 MW를 인슐린-Fc-융합 단백질의 구조적 순도가 정확할 가능성이 있는지를 결정하는 방식으로 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체의 절반 분자량과 비교한다.
실시예 7: 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의한 구조 확인.
모세관 전기영동 소듐 도데실 술페이트(CE-SDS) 분석을 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액에 용해된 정제된 인슐린-Fc-융합 단백질의 용액 상에서 LabChip® GXII (Perkin Elmer, Waltham, MA)에서 수행하고, 전기영동도를 작도했다. 비환원 조건에서 샘플을 확인된 분자량(MW) 단백질 표준에 대해 구동하였으며, 용출 피크는 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체의 '겉보기' MW를 나타낸다.
환원 조건 하에(예를 들어, 인슐린-Fc-융합 동종이량체의 이황화 결합을 파괴하는 베타-메르캅토에탄올 사용), 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질 단량체의 겉보기 MW를 인슐린-Fc-융합 단백질의 구조적 순도가 정확할 가능성이 있는지를 결정하는 방식으로 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체의 절반 분자량과 비교한다.
실시예 8: 글리칸을 포함하는 화합물에 대한 글리칸 제거를 이용한 LC-MS에 의한 서열 확인.
인슐린-Fc-융합 단백질이 자연적으로 글리코실화된 경우에 질량 분광법(MS)을 통해 인슐린-Fc-융합 단백질 질량의 정확한 추정치를 얻기 위해, 샘플을 먼저 처리하여 MS 분석을 방해할 수 있는 자연 발생 글리칸을 제거하였다. 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충 용액에 용해된 100 μL의 2.5 mg/mL 인슐린-Fc-융합 단백질을 Zeba 탈염 컬럼(Pierce, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 5 mM EDTA를 포함하는 0.1M Tris, pH 8.0 완충액으로 먼저 완충액 교체했다. 이 용액에 1.67 μL의 PNGase F 효소(Prozyme N-글리카나제)를 첨가하여 융합 단백질에 존재하는 N-연결 글리칸(예를 들어, cNg-N 부위에 위치한 아스파라긴의 측쇄에 연결된 글리칸)을 제거하고 혼합물을 인큐베이터에서 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 샘플을 LC-MS(NovaBioassays, Woburn, MA)를 통해 분석하여 글리칸이 부재하는 적절한 동종이량체에 해당하는 분자의 분자량을 얻었다. cNg-아스파라긴에서 글리칸을 절단하는데 사용된 효소적 과정이 아스파라긴 측쇄를 탈아민화하여 아스파라긴산을 형성하고 이렇게 함으로써 효소 처리된 동종이량체는 전체적으로 동종이량체에 존재하는 각 사슬에 대해 1 Da의 질량에 해당하는 2 Da를 얻기 때문에 이 질량을 추가로 수정하였다. 따라서 실제 분자량은 분석 샘플에서 인슐린-Fc-융합 단백질 구조의 효소적 변형을 수정하기 위해 측정된 질량에서 2 Da를 뺀 값이었다.
인슐린-Fc-융합 단백질 아미노산 조성이 cNg 부위에 자연적인 글리코실화가 발생하는 것을 방지하는 경우, LC-MS(NovaBioassays, Woburn, MA)를 사용하여 PNGase 효소로 분자를 전처리하지 않고, 인슐린-Fc-융합 단백질 질량의 정확한 추정치를 직접적으로 얻었다.
실시예 9: 글리칸을 포함하는 화합물에 대한 글리칸 제거를 이용한 LC-MS에 의한 서열 확인.
인슐린-Fc-융합 단백질이 자연적으로 글리코실화된 경우에 질량 분광법(MS)을 통해 인슐린-Fc-융합 단백질 질량의 정확한 추정치를 얻기 위해, 샘플을 먼저 처리하여 MS 분석을 방해할 수 있는 자연 발생 글리칸을 제거한다. 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충 용액에 용해된 100 μL의 2.5 mg/mL 인슐린-Fc-융합 단백질을 Zeba 탈염 컬럼(Pierce, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 5 mM EDTA를 포함하는 0.1M Tris, pH 8.0 완충액으로 먼저 완충액 교체한다. 이 용액에 1.67 μL의 PNGase F 효소(Prozyme N-글리카나제)를 첨가하여 융합 단백질에 존재하는 N-연결 글리칸(예를 들어, cNg-N 부위에 위치한 아스파라긴의 측쇄에 연결된 글리칸)을 제거하고 혼합물을 인큐베이터에서 밤새 37℃에서 인큐베이션한다. 그런 다음 샘플을 LC-MS(NovaBioassays, Woburn, MA)를 통해 분석하여 글리칸이 부재하는 적절한 동종이량체에 해당하는 분자의 분자량을 얻는다. cNg-아스파라긴에서 글리칸을 절단하는데 사용된 효소적 과정이 아스파라긴 측쇄를 탈아민화하여 아스파라긴산을 형성하고 이렇게 함으로써 효소 처리된 동종이량체는 전체적으로 동종이량체에 존재하는 각 사슬에 대해 1 Da의 질량에 해당하는 2 Da를 얻기 때문에 이 질량을 추가로 수정한다. 따라서 실제 분자량은 분석 샘플에서 인슐린-Fc-융합 단백질 구조의 효소적 변형을 수정하기 위해 측정된 질량에서 2 Da를 뺀 값이다.
인슐린-Fc-융합 단백질 아미노산 조성이 cNg 부위에 자연적인 글리코실화가 발생하는 것을 방지하는 경우, LC-MS(NovaBioassays, Woburn, MA)를 사용하여 PNGase 효소로 분자를 전처리하지 않고, 인슐린-Fc-융합 단백질 질량의 정확한 추정치를 직접적으로 얻을 수 있다.
실시예 10: 크기-배제 크로마토그래피에 의한 동종이량체%.
인슐린-Fc-융합 단백질의 크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 280 nm의 파장에서 2998 포토다이오드 어레이(Photodiode array)에 연결된 Waters 2795HT HPLC(Waters Corporation, Milford, MA)를 사용하여 수행하였다. 대상 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 샘플 100 μL 이하를 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl 및 0.05% w/v 아지드화나트륨 pH 6.2을 포함하는 이동상으로 0.2 mL/분의 유속으로 작동하는 MAbPac SEC-1, 5pm, 4 x 300 mm 컬럼(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 주입했다. MAbPac SEC-1 컬럼은 분자 크기 분리 원리에 따라 작동한다. 따라서, 더 큰 가용성 인슐린-Fc 응집체(예를 들어, 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체의 다량체)는 더 앞선 체류 시간에 용출되고, 응집되지 않은 동종이량체는 이후의 체류 시간에 용출된다. 분석 SEC-HPLC를 통해 응집된 다량체 동종이량체로부터 동종이량체의 혼합물 분리시, 비응집 동종이량체의 백분율 측면에서 인슐린-Fc-융합 단백질 용액의 순도를 확인하였다.
실시예 11: 크기-배제 크로마토그래피에 의한 동종이량체%.
인슐린-Fc-융합 단백질의 크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 280 nm의 파장에서 2998 포토다이오드 어레이에 연결된 Waters 2795HT HPLC(Waters Corporation, Milford, MA)를 사용하여 수행한다. 대상 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 샘플 100 μL 이하를 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl 및 0.05% w/v 아지드화나트륨 pH 6.2을 포함하는 이동상으로 0.2 mL/분의 유속으로 작동하는 MAbPac SEC-1, 5pm, 4 x 300 mm 컬럼(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 주입한다. MAbPac SEC-1 컬럼은 분자 크기 분리 원리에 따라 작동한다. 따라서 더 큰 가용성 인슐린-Fc 응집체(예를 들어, 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체의 다량체)는 더 앞선 체류 시간에 용출되고, 응집되지 않은 동종이량체는 이후의 체류 시간에 용출될 것이다. 분석 SEC-HPLC를 통해 응집된 다량체 동종이량체로부터 동종이량체의 혼합물 분리시, 비응집 동종이량체의 백분율 측면에서 인슐린-Fc-융합 단백질 용액의 순도를 확인한다.
실시예 12: 4℃에서 예시적인 인슐린-Fc-융합 단백질의 시험관내 IM-9 인슐린 수용체(IR) 결합.
인간 IR을 발현하는 인간 IM-9 세포(ATTC# CCL-159)를 완전한 RPMI 5% FBS 배지에서 배양하고 70 내지 80% 컨플루언스(confluence)로 유지하였다. IM-9 세포의 배양물을 250xg(약 1000 rpm)에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화했다. 세포를 HBSS 또는 PBS 완충액으로 1회 세척하고, 저온 FACS 염색 배지(HBSS/2 mM EDTA/0.1% Na-아지드 + 4% 말 혈청)에 8x106 세포/mL의 농도로 재현탁하고 시험 용액을 제조할 때까지 빙냉 또는 4℃에서 유지하였다. 인슐린-Fc 단백질을 1.2 mL 튜브에서 2x 농도로 1:3 연속 희석으로 FACS 완충액에 희석하고(각 희석액의 약 60 μL 부피), 용액을 피펫팅할 준비가 될 때까지 빙냉 하에 저온 유지했다.
비오티닐화-RHI를 FACS 염색 배지에서 1.25 μg/mL의 농도로 희석하였다. V 바닥 미세역가 플레이트의 각 웰에 연속 희석된 시험 화합물 40 μL 및 1.25 μg/mL 비오틴-RHI 8 μL를 첨가하고 천천히 교반하여 혼합하고 빙냉 하에 배치하였다. 40 μL의 IM-9 세포 현탁액(8x106 세포/mL)을 다채널 피펫으로 각 웰에 첨가하고 다시 부드럽게 혼합하고 30분 동안 빙냉 하에 인큐베이션하여 IM-9 세포의 IR에 대한 경쟁적 결합을 가능하게 했다. 그런 다음 V-바닥 플레이트를 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인하여 275 μL의 빙냉 FACS 세척 완충액(HBSS/2 mM EDTA/0.1% Na-아지드 + 0.5% 말 혈청)으로 세포를 두 번 세척했다. 그런 다음, 세포를 1:100 희석된 스트렙타비딘(Streptavidin)-PE(Life Technologies)를 포함하는 40 μL의 FACS 염색 배지에 빙냉 하에 20분 동안 재현탁시켰다. 그런 다음 세포를 275 μL의 빙냉 FACS 완충액으로 한 번 세척하고 마지막으로 실온에서 10분 동안 3% 파라포름알데히드로 고정했다. 그런 다음 세포를 275 μL의 빙냉 FACS 완충액으로 1회 세척하고 분석을 위해 250 μL의 FACS 완충액에 재현탁시켰다.
이어서, 세포를 포함하는 V-바닥 플레이트를 Guava 8-HT 유세포 분석기(Millipore)에서 분석하였다. IR에 대한 비오티닐화-RHI 결합을 시험 화합물의 각 농도에 대한 FACS FL-2 채널 상의 세포의 중앙 형광 강도(MFI)에 의해 정량화하였다. 대조군 웰을 비오티닐화-RHI로만 표지하고 각 시험 화합물 농도로부터 초래된 억제율(%)을 계산하는데 사용하였다. IM-9 세포에 대한 비오티닐화 RHI 결합의 시험 화합물에 의한 억제%를 시험 화합물의 로그 농도에 대해 작도하고, 결과 IC50 값을 시험 화합물에 대해 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 계산하였다. 따라서 시험 화합물의 더 낮은 IC50 값은 더 낮은 농도에서 더 높은 수준의 비오티닐화-RHI 억제를 나타내며 이는 IR에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질의 더 강한 결합을 나타낸다. 비표지 재조합 인간 인슐린(RHI)과 같은 대조군 화합물을 또한 소정의 화합물 IC50이 비율(IC50(화합물)/IC50(RHI))이 될 수 있는 RHI IC50을 생성하기 위한 내부 표준으로 사용하였다. 더 낮은 IC50 비율은 RHI에 대한 더 유사한 결합(IR에 대한 더 강한 결합)을 나타내고, 더 높은 IC50 비율은 RHI에 비해 IR에 대한 더 약한 결합을 나타낸다.
실시예 13: 4℃에서 예시적인 인슐린-Fc-융합 단백질의 시험관내 IM-9 인슐린 수용체(IR) 결합.
인간 IR을 발현하는 인간 IM-9 세포(ATTC# CCL-159)를 완전한 RPMI 5% FBS 배지에서 배양하고 70 내지 80% 컨플루언스로 유지한다. IM-9 세포의 배양물을 250xg(약 1000 rpm)에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 세포를 HBSS 또는 PBS 완충액으로 1회 세척하고, 저온 FACS 염색 배지(HBSS/2 mM EDTA/0.1% Na-아지드 + 4% 말 혈청)에 8x106 세포/mL의 농도로 재현탁하고 시험 용액을 제조할 때까지 빙냉 또는 4℃에서 유지한다. 인슐린-Fc 단백질을 1.2 mL 튜브에서 2x 농도로 1:3 연속 희석으로 FACS 완충액에 희석하고(각 희석액의 약 60 μL 부피), 용액을 피펫팅할 준비가 될 때까지 빙냉 하에 저온 유지한다.
비오티닐화-RHI를 FACS 염색 배지에서 1.25 μg/mL의 농도로 희석한다. V 바닥 미세역가 플레이트의 각 웰에 연속 희석된 시험 화합물 40 μL 및 1.25 μg/mL 비오틴-RHI 8 μL를 첨가하고 천천히 교반하여 혼합하고 빙냉 하에 배치한다. 40 μL의 IM-9 세포 현탁액(8x106 세포/mL)을 다채널 피펫으로 각 웰에 첨가하고 다시 부드럽게 혼합하고 30분 동안 빙냉 하에 인큐베이션하여 IM-9 세포의 IR에 대한 경쟁적 결합을 가능하게 한다. 그런 다음 V-바닥 플레이트를 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인하여 275 μL의 빙냉 FACS 세척 완충액(HBSS/2 mM EDTA/0.1% Na-아지드 + 0.5% 말 혈청)으로 세포를 두 번 세척한다. 그런 다음, 세포를 1:100 희석된 스트렙타비딘-PE(Life Technologies)를 포함하는 40 μL의 FACS 염색 배지에 빙냉 하에 20분 동안 재현탁시킨다. 그런 다음 세포를 275 μL의 빙냉 FACS 완충액으로 한 번 세척하고 마지막으로 실온에서 10분 동안 3% 파라포름알데히드로 고정한다. 그런 다음 세포를 275 μL의 빙냉 FACS 완충액으로 1회 세척하고 분석을 위해 250 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
이어서, 세포를 포함하는 V-바닥 플레이트를 Guava 8-HT 유세포 분석기(Millipore)에서 분석한다. IR에 대한 비오티닐화-RHI 결합을 시험 화합물의 각 농도에 대한 FACS FL-2 채널 상의 세포의 중앙 형광 강도(MFI)에 의해 정량화한다. 대조군 웰을 비오티닐화-RHI로만 표지하고 각 시험 화합물 농도로부터 초래된 억제율(%)을 계산하는데 사용한다. IM-9 세포에 대한 비오티닐화 RHI 결합의 시험 화합물에 의한 억제%를 시험 화합물의 로그 농도에 대해 작도하고, 결과 IC50 값을 시험 화합물에 대해 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 계산한다. 따라서 시험 화합물의 더 낮은 IC50 값은 더 낮은 농도에서 더 높은 수준의 비오티닐화-RHI 억제를 나타내며 이는 IR에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질의 더 강한 결합을 나타낸다. 비표지 재조합 인간 인슐린(RHI)과 같은 대조군 화합물을 또한 소정의 화합물 IC50이 비율(IC50(화합물)/IC50(RHI))이 될 수 있는 RHI IC50을 생성하기 위한 내부 표준으로 사용한다. 더 낮은 IC50 비율은 RHI에 대한 더 유사한 결합(IR에 대한 더 강한 결합)을 나타내고, 더 높은 IC50 비율은 RHI에 비해 IR에 대한 더 약한 결합을 나타낸다.
실시예 14: 시험관내 인간 Fc(감마)RI 결합 친화도 분석.
pH 7.4에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc(감마)RI에 대한 결합을 인간 Fc(감마)RI(즉, rhFc(감마)RI)를 사용하여 다음과 같이 ELISA 분석을 사용하여 수행하였다. 인슐린-Fc-융합 단백질을 pH 9.6의 중탄산나트륨 완충액에서 10 μg/mL로 희석하고 Maxisorp(Nunc) 미세역가 플레이트에 밤새 4℃에서 코팅한 후 미세 플레이트 스트립을 PBST(PBS/0.05% Tween-20) 완충액으로 5회 세척하고, Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단했다. 비오티닐화 rhFc(감마)RI(재조합 인간 Fc(감마)RI; R&D Systems)의 연속 희석액을 PBST/10% Superblock 완충액에서 3000 ng/mL 내지 4.1 ng/mL로 제조하고 인슐린-Fc-융합 단백질로 코팅된 마이크로플레이트 스트립에 100 μL/웰로 로딩했다. 미세역가 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 5회 세척한 다음 PBST/10% Superblock 완충액에 1:10000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 μL/웰을 로딩했다. 45분 동안 인큐베이션한 후, 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 다시 5회 세척하였다. TMB를 첨가하여 결합된 Fc(감마)RI 단백질을 확인하고 ELISA 정지 시약(Boston Bioproducts)으로 정지시켰다. 플레이트를 450 nm에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하고 OD450 값(인슐린-Fc 단백질에 대한 rhFc(감마)RI의 결합에 비례)을 각 웰에 첨가된 rhFc(감마)RI의 로그 농도에 대해 작도하여 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하였다. 다소 유사한 곡선을 갖는 화합물 그룹의 경우, 더 높은 농도 중 하나, 예를 들어 3000 ng/mL의 rhFc(감마)RI 농도의 OD450을 코팅된 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물 간의 차이를 확인하는데 사용할 수 있다. 서로 다른 시간에 구동된 다수의 인슐린-Fc-융합 단백질 간의 차이를 비교하기 위해, 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율을 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서 얻은 시험 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물의 OD450 값을 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서 얻은 서열번호 76의 참조 인슐린-Fc-융합 단백질의 OD450 값으로 나눈 값으로 계산했다.
실시예 15: 시험관내 인간 Fc(감마)RI 결합 친화도 분석.
pH 7.4에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc(감마)RI에 대한 결합을 인간 Fc(감마)RI(즉, rhFc(감마)RI)를 사용하여 다음과 같이 ELISA 분석을 사용하여 수행한다. 인슐린-Fc-융합 단백질을 pH 9.6의 중탄산나트륨 완충액에서 10 μg/mL로 희석하고 Maxisorp(Nunc) 미세역가 플레이트에 밤새 4℃에서 코팅한 후 미세 플레이트 스트립을 PBST(PBS/0.05% Tween-20) 완충액으로 5회 세척하고, Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단한다. 비오티닐화 rhFc(감마)RI(재조합 인간 Fc(감마)RI; R&D Systems)의 연속 희석액을 PBST/10% Superblock 완충액에서 3000 ng/mL 내지 4.1 ng/mL로 제조하고 인슐린-Fc-융합 단백질로 코팅된 마이크로플레이트 스트립에 100 μL/웰로 로딩한다. 미세역가 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 5회 세척한 다음 PBST/10% Superblock 완충액에 1:10000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 μL/웰을 로딩한다. 45분 동안 인큐베이션한 후, 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 다시 5회 세척한다. TMB를 첨가하여 결합된 Fc(감마)RI 단백질을 확인하고 ELISA 정지 시약(Boston Bioproducts)으로 정지시킨다. 플레이트를 450 nm에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하고 OD450 값(인슐린-Fc 단백질에 대한 rhFc(감마)RI의 결합에 비례)을 각 웰에 첨가된 rhFc(감마)RI의 로그 농도에 대해 작도하여 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성한다. 다소 유사한 곡선을 갖는 화합물 그룹의 경우, 더 높은 농도 중 하나, 예를 들어 3000 ng/mL의 rhFc(감마)RI 농도의 OD450을 코팅된 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물 간의 차이를 확인하는데 사용할 수 있다. 서로 다른 시간에 구동된 다수의 인슐린-Fc-융합 단백질 간의 차이를 비교하기 위해, 인간 Fc(감마)RI 분석 OD450 비율을 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서 얻은 시험 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물의 OD450 값을 3000 ng/mL의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도에서 얻은 서열번호 76의 참조 인슐린-Fc-융합 단백질의 OD450 값으로 나눈 값으로 계산한다.
실시예 16: 시험관내 C1q 결합 친화도 분석.
pH 7.4에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 보체 성분 C1q에 대한 결합을 인간 보체 성분 C1q를 사용하여 다음과 같이 ELISA 분석을 사용하여 수행하였다. 인슐린-Fc-융합 단백질을 pH 9.6의 중탄산나트륨 완충액에서 10 μg/mL로 희석하고 Maxisorp(Nunc) 미세역가 플레이트에 밤새 4℃에서 코팅한 후 미세 플레이트 스트립을 PBST(PBS/0.05% Tween-20) 완충액으로 5회 세척하고, Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단했다. 비오티닐화 보체 성분 C1q(인간 보체 성분 C1q; Sigma-Aldrich)의 연속 희석액을 PBST/10% Superblock 완충액에서 1000 ng/mL 내지 1.4 ng/mL로 제조하고 인슐린-Fc-융합 단백질로 코팅된 마이크로플레이트 스트립에 100 μL/웰로 로딩했다. 미세역가 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 5회 세척한 다음 PBST/10% Superblock 완충액에 1:12000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 μL/웰을 로딩했다. 45분 동안 인큐베이션한 후, 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 다시 5회 세척하였다. TMB를 첨가하여 결합된 보체 C1q 단백질을 확인하고 ELISA 정지 시약(Boston Bioproducts)으로 정지시켰다. 플레이트 흡광도를 450 nm에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하고(OD450), OD450 값(인슐린-Fc 단백질에 대한 보체 성분 C1q의 결합에 비례)을 각 웰에 첨가된 보체 성분 C1q의 로그 농도에 대해 작도하여 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하였다. 다소 유사한 곡선을 갖는 화합물 그룹의 경우, 더 높은 농도 중 하나, 예를 들어 1000 ng/mL의 보체 성분 C1q 농도의 OD450을 코팅된 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물 간의 차이를 확인하는데 사용하였다. 서로 다른 시간에 구동된 다수의 인슐린-Fc-융합 단백질 간의 차이를 비교하기 위해, 인간 C1q 분석 OD450 비율을 1000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 얻은 시험 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물의 OD450 값을 1000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 얻은 서열번호 76의 참조 인슐린-Fc-융합 단백질의 OD450 값으로 나눈 값으로 계산했다.
실시예 17: 시험관내 C1q 결합 친화도 분석.
pH 7.4에서 인슐린-Fc-융합 단백질의 보체 성분 C1q에 대한 결합을 인간 보체 성분 C1q를 사용하여 다음과 같이 ELISA 분석을 사용하여 수행한다. 인슐린-Fc 화합물을 pH 9.6의 중탄산나트륨 완충액에서 10 μg/mL로 희석하고 Maxisorp(Nunc) 미세역가 플레이트에 밤새 4℃에서 코팅한 후 미세 플레이트 스트립을 PBST(PBS/0.05% Tween-20) 완충액으로 5회 세척하고, Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단한다. 비오티닐화 보체 성분 C1q(인간 보체 성분 C1q; Sigma-Aldrich)의 연속 희석액을 PBST/10% Superblock 완충액에서 1000 ng/mL 내지 1.4 ng/mL로 제조하고 인슐린-Fc-융합 단백질로 코팅된 마이크로플레이트 스트립에 100 μL/웰로 로딩한다. 미세역가 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 5회 세척한 다음 PBST/10% Superblock 완충액에 1:12000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 μL/웰을 로딩한다. 45분 동안 인큐베이션한 후, 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 다시 5회 세척한다. TMB를 첨가하여 결합된 보체 C1q 단백질을 확인하고 ELISA 정지 시약(Boston Bioproducts)으로 정지시킨다. 플레이트 흡광도를 450 nm에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하고(OD450), OD450 값(인슐린-Fc 단백질에 대한 보체 성분 C1q의 결합에 비례)을 각 웰에 첨가된 보체 성분 C1q의 로그 농도에 대해 작도하여 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성한다. 다소 유사한 곡선을 갖는 화합물 그룹의 경우, 더 높은 농도 중 하나, 예를 들어 1000 ng/mL의 보체 성분 C1q 농도의 OD450을 코팅된 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물 간의 차이를 확인하는데 사용할 수 있다. 서로 다른 시간에 구동된 다수의 인슐린-Fc-융합 단백질 간의 차이를 비교하기 위해, 인간 C1q 분석 OD450 비율을 1000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 얻은 시험 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물의 OD450 값을 1000 ng/mL의 비오티닐화-C1q 농도에서 얻은 서열번호 76의 참조 인슐린-Fc-융합 단백질의 OD450 값으로 나눈 값으로 계산한다.
실시예 18: 개 FcRn 수용체에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질 친화도의 시험관내 측정.
개 FcRn 수용체에 대한 개 IgG 유래의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 시험관내 결합 친화도를 pH 5.5의 용액에서 수행된 ELISA 기술을 통해 측정하였다. 약산성 pH는 Fc-단편-포함 분자가 FcRn 수용체에 결합하기 위한 바람직한 결합 환경이다. 생체내에서 세포는 표면과 엔도솜 내부에서 FcRn을 발현한다. Fc-단편을 포함하는 분자가 자연적인 과정(예를 들어, 음세포 작용 또는 내포 작용)을 통해 세포로 유입됨에 따라 pH는 엔도솜에서 더 낮은 pH로 변경되며, FcRn 수용체는 Fc-단편 포함 분자에 결합하고, 이외에는 엔도솜-리소좀 구획에서 분해되어, 이러한 분자는 pH가 중성에 가까운 세포 표면(예를 들어, pH 7.0 내지 7.4)으로 다시 재순환된다. 중성 pH는 FcRn 수용체에 대한 결합에 불리하고 Fc-단편 포함 분자가 다시 순환으로 방출되도록 한다. 이는 Fc-단편-포함 분자가 생체내에서 연장된 순환 약동학적 반감기를 나타내는 주요 메커니즘이다.
개 유래의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질을 중탄산나트륨 pH 9.6 완충액에서 10 μg/ml로 희석하고 실온에서 1 내지 2시간 동안 Maxisorb ELISA 플레이트 스트립에 이중 반복 실험으로 코팅하였다. 그런 다음 스트립을 PBST(PBS/0.1% Tween-20) 완충액으로 4회 세척하고 Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단했다. 그런 다음 FcRn 결합을 위한 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween(50 mM MES/150 mM NaCl/0.1% Tween-20) 완충액으로 다시 두 번 세척한 다음 FcRn 시약(비오티닐화 개 FcRn; Immunitrack)을 첨가했다. 비오티닐화 FcRn 시약의 연속 희석액(1:3X 희석액)을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween/10% Superblock 완충액에서 1000 ng/ml 내지 0.45 ng/mL 농도로 제조하고 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물로 코팅된 스트립 상에서 다중 채널 피펫터를 사용하여 100 μL/웰로 로딩했다. 그런 다음, 분석 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FcRn 결합 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween 완충액으로 4회 세척한 다음, pH 5.5 MES/NaCl/10% Superblock 완충액에 1:10000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 μL/웰을 로딩하였다. 45분 동안 인큐베이션한 후 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween 완충액으로 다시 4회 세척했다. 마지막으로 TMB를 첨가하여 결합된 비오티닐화-개 FcRn 시약을 확인하고 ELISA 정지 시약으로 발색을 정지시켰다. 플레이트를 450 nm의 파장에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하였다. OD 값(인슐린-Fc-융합 단백질 시험 화합물에 대한 개-FcRn의 결합에 비례)을 각 웰에 첨가된 FcRn의 로그 농도에 대해 작도하여, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하였다. 각 결합 곡선에 대한 EC50 값을 계산하여 서로 다른 화합물을 비교했다.
실시예 19: 인간 FcRn 수용체에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질 친화도의 시험관내 측정.
인간 FcRn 수용체에 대한 인간 IgG 유래의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 시험관내 결합 친화도를 pH 5.5의 용액에서 수행된 ELISA 기술을 통해 측정하였다. 약산성 pH는 Fc-단편-포함 분자가 FcRn 수용체에 결합하기 위한 바람직한 결합 환경이다. 생체내에서 세포는 표면과 엔도솜 내부에서 FcRn을 발현한다. Fc-단편을 포함하는 분자가 자연적인 과정(예를 들어, 음세포 작용 또는 내포 작용)을 통해 세포로 유입됨에 따라 pH는 엔도솜에서 더 낮은 pH로 변경되며, FcRn 수용체는 Fc-단편 포함 분자에 결합하고, 이외에는 엔도솜-리소좀 구획에서 분해되어, 이러한 분자는 pH가 중성에 가까운 세포 표면(예를 들어, pH 7.0 내지 7.4)으로 다시 재순환된다. 중성 pH는 FcRn 수용체에 대한 결합에 불리하고 Fc-단편 포함 분자가 다시 순환으로 방출되도록 한다. 이는 Fc-단편-포함 분자가 생체내에서 연장된 순환 약동학적 반감기를 나타내는 주요 메커니즘이다.
Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질을 중탄산나트륨 pH 9.6 완충액에서 10 μg/mL로 희석하고 실온에서 1 내지 2시간 동안 Maxisorb ELISA 플레이트 스트립에 이중 반복 실험으로 코팅하였다. 그런 다음 스트립을 PBST(PBS/0.1% Tween-20) 완충액으로 5회 세척하고 Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단했다. 그런 다음 FcRn 결합을 위한 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween(50 mM MES/150 mM NaCl/0.1% Tween-20) 완충액으로 다시 3회 세척한 다음 FcRn 시약(비오티닐화 인간 FcRn; Immunitrack)을 첨가했다. 비오티닐화 FcRn 시약의 연속 희석액(1:3X 희석액)을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween/5% Superblock 완충액에서 6000 ng/mL 내지 8.23 ng/mL 농도로 제조하고 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물로 코팅된 스트립 상에서 다중 채널 피펫터를 사용하여 100 μL/웰로 로딩했다. 그런 다음, 분석 플레이트를 실온에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. FcRn 결합 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween 완충액으로 4회 세척한 다음, pH 5.5 MES/NaCl/5% Superblock 완충액에 1:10000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 μL/웰을 로딩하였다. 45분 동안 인큐베이션한 후 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween 완충액으로 다시 5회 세척했다. 마지막으로 TMB를 첨가하여 결합된 비오티닐화-FcRn 시약을 확인하고 ELISA 정지 시약으로 발색을 정지시켰다. 플레이트를 450 nm의 파장에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하였다. OD450 값(인슐린-Fc-융합 단백질 시험 화합물에 대한 인간-FcRn의 결합에 비례)을 각 웰에 첨가된 FcRn의 로그 농도에 대해 작도하여, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하였다. 각 결합 곡선에 대한 EC50 값을 계산하여 서로 다른 화합물을 비교했다.
실시예 20: 인간 FcRn 수용체에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질 친화도의 시험관내 측정.
인간 FcRn 수용체에 대한 인간 IgG 유래의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 시험관내 결합 친화도를 pH 5.5의 용액에서 수행된 ELISA 기술을 통해 측정한다. 약산성 pH는 Fc-단편-포함 분자가 FcRn 수용체에 결합하기 위한 바람직한 결합 환경이다. 생체내에서 세포는 표면과 엔도솜 내부에서 FcRn을 발현한다. Fc-단편을 포함하는 분자가 자연적인 과정(예를 들어, 음세포 작용 또는 내포 작용)을 통해 세포로 유입됨에 따라 pH는 엔도솜에서 더 낮은 pH로 변경되며, FcRn 수용체는 Fc-단편 포함 분자에 결합하고, 이외에는 엔도솜-리소좀 구획에서 분해되어, 이러한 분자는 pH가 중성에 가까운 세포 표면(예를 들어, pH 7.0 내지 7.4)으로 다시 재순환된다. 중성 pH는 FcRn 수용체에 대한 결합에 불리하고 Fc-단편 포함 분자가 다시 순환으로 방출되도록 한다. 이는 Fc-단편-포함 분자가 생체내에서 연장된 순환 약동학적 반감기를 나타내는 주요 메커니즘이다.
Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질을 중탄산나트륨 pH 9.6 완충액에서 10 μg/mL로 희석하고 실온에서 1 내지 2시간 동안 Maxisorb ELISA 플레이트 스트립에 이중 반복 실험으로 코팅한다. 그런 다음 스트립을 PBST(PBS/0.1% Tween-20) 완충액으로 5회 세척하고 Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단한다. 그런 다음 FcRn 결합을 위한 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween(50 mM MES/150 mM NaCl/0.1% Tween-20) 완충액으로 다시 3회 세척한 다음 FcRn 시약(비오티닐화 인간 FcRn; Immunitrack)을 첨가한다. 비오티닐화 FcRn 시약의 연속 희석액(1:3X 희석액)을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween/5% Superblock 완충액에서 6000 ng/mL 내지 8.23 ng/mL 농도로 제조하고 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물로 코팅된 스트립 상에서 다중 채널 피펫터를 사용하여 100 μL/웰로 로딩한다. 그런 다음, 분석 플레이트를 실온에서 5시간 동안 인큐베이션한다. FcRn 결합 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween 완충액으로 4회 세척한 다음, pH 5.5 MES/NaCl/5% Superblock 완충액에 1:10000으로 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 μL/웰을 로딩한다. 45분 동안 인큐베이션한 후 스트립을 pH 5.5 MES/NaCl/Tween 완충액으로 다시 5회 세척한다. 마지막으로 TMB를 첨가하여 결합된 비오티닐화-FcRn 시약을 확인하고 ELISA 정지 시약으로 발색을 정지시킨다. 플레이트를 450 nm의 파장에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독한다. OD450 값(인슐린-Fc-융합 단백질 시험 화합물에 대한 인간-FcRn의 결합에 비례)을 각 웰에 첨가된 FcRn의 로그 농도에 대해 작도하여, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성한다. 각 결합 곡선에 대한 EC50 값을 계산하여 서로 다른 화합물을 비교한다.
실시예 21: 개에서 개 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 투여 후 생체내 약역학(PD)의 결정을 위한 일반 절차.
인슐린-Fc-융합 단백질을 개에서 공복 혈당 수준에 대한 효과에 대해 다음과 같이 평가하였다. N=1, 2, 3 이상의 건강한 항체가 부재하는 체중이 대략 10 내지 15 kg인 개를 사용하였고, 각각의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 하나씩 사용하였다. 동물을 또한 아나필락시, 혼수, 고통, 통증 등의 징후에 대해 매일 2회 관찰하고, 선택적으로 일부 화합물의 경우, 항-약물 항체를 중화시키는 잠재적인 유도의 핵심 신호로서 화합물의 글루코스 저하 능력이 시간이 지남에 따라 감소하는지 관찰하기 위해 추가로 매주 3회의 피하 주사에 의한 처리를 계속하였다. 0일째에, 동물에 7.0 내지 8.0의 용액 pH에서, 0.08 내지 0.80 mg 인슐린-Fc-융합 단백질/kg(또는 몰 기준으로 대략 1.2 내지 12.3 nmol/kg 또는 대략 0.4 내지 4.0 U/kg 인슐린 균등물)의 용량으로, 10 내지 50 mM 인산수소나트륨, 50 내지 150 mM 염화나트륨, 0.005 내지 0.05% v/v Tween-80, 및 선택적으로 0.02 내지 1.00 mg/mL 농도의 정균제(예를 들어, 페놀, m-크레졸 또는 메틸파라벤)의 용액에 1 내지 10 mg/mL 농도의 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체를 포함하는 약제학적 조성물의 정맥내 또는 피하 투여를 통해 단일 주사를 제공하였다. 0일째, 주사 직전과 주사 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 및 480분 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7일 후에 적절한 정맥에서 혈액을 수집했다.
각 시점에 대해 최소 1 mL의 전혈을 수집하였다. 글루코스 수준 판독값을 약 한 방울의 혈액이 필요한 글루코스 측정기(ACCU-CHEK® Aviva Plus)를 사용하여 즉시 결정하였다. 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생활성을 평가하기 위해 0일부터 7일까지의 평균 공복 혈당 수준%(FBGL%)을 작도하였다.
실시예 22: 개에서 개 인슐린-Fc-융합 단백질의 반복 투여 후 생체내 약역학(PD)의 결정을 위한 일반 절차.
인슐린-Fc-융합 단백질을 다음과 같이 반복 주사에 걸쳐 혈당 수준에 대한 효과에 대해 평가하였다. 약 10 kg 내지 20 kg의 건강하고 항체가 부재하는 개를 사용하고, 각 동물에게 인슐린-Fc-융합 단백질의 투여량을 투여했다. 동물을 아나필락시스, 혼수, 고통, 통증 및 기타 부정적인 부작용의 징후에 대해 하루에 두 번 관찰하고, 선택적으로 일부 화합물의 경우 시간이 지남에 따라 글루코스 저하 능력이 감소하여 생체내 중화 항-약물 항체가 존재할 수 있음을 나타내는지를 관찰하기 위해 추가로 2 내지 5회 피하 주사를 계속했다. 0일째에, 동물에 7.0 내지 8.0의 용액 pH에서, 0.08 내지 0.80 mg 인슐린-Fc-융합 단백질/kg(또는 몰 기준으로 대략 1.2 내지 12.3 nmol/kg 또는 대략 0.4 내지 4.0 U/kg 인슐린 균등물)의 용량으로, 10 내지 50 mM 인산수소나트륨, 50 내지 150 mM 염화나트륨, 0.005 내지 0.05% v/v Tween-80, 및 선택적으로 0.02 내지 1.00 mg/mL 농도의 정균제(예를 들어, 페놀, m-크레졸 또는 메틸파라벤)의 용액에 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 단일 피하 주사를 제공하였다. 0일째, 주사 직전과 주사 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 및 480분 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7일 후에 적절한 정맥에서 혈액을 수집했다.
후속 피하 주사를 주 1회 이하의 빈도로 제공하고, 일부 경우에 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질 제형의 약역학에 기반하여 상이한 간격으로 주사를 제공하였다. 각각의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 후속 주사를 인슐린-Fc-융합 단백질의 입증된 약역학에 따라 더 높거나 더 낮은 용량으로 조정하였다. 예를 들어, 0일째 1차 주사의 투여량이 혈당 저하에 비효과적인 것으로 확인되면 주사된 인슐린-Fc-융합 단백질의 후속 투여 수준을 상향 조정하였다. 유사한 방식으로, 0일째 1차 주사의 투여량이 너무 강한 방식으로 글루코스를 저하시키는 것으로 확인되면, 주사된 인슐린-Fc-융합 단백질의 후속 투여 수준을 하향 조정했다. 중간 투여량 또는 최종 투여량도 필요에 따라 유사한 방식으로 조정할 수 있는 것으로 나타났다. 각 투여량에 대해, 주사 직전과 주사 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 및 480분 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일(및 선택적으로 14일) 후에 적절한 정맥에서 혈액을 수집했다. 각 시점에 대해 최소 1 mL의 전혈을 수집했다. 약 한 방울의 혈액이 필요한 글루코스 측정기(ACCU-CHEK® Aviva Plus) 사용하여 글루코스 수준 판독값을 즉시 결정하였다. 연구 전반에 걸쳐 평균 공복 혈당 수준%(FBGL%)을 시간에 대해 작도하였으며, 이에 의해 융합 단백질의 생활성을 결정할 수 있다.
각 투여량의 생활성을 결정하기 위해, 곡선-하-면적 (AOC) 분석을 다음과 같이 수행하였다. FBGL% 대 시간 데이터를 배열한 후 데이터를 데이터 분석 소프트웨어(GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego CA)에 입력했다. 소프트웨어를 사용하여 먼저 곡선-하-면적 분석(AUC)을 수행하여 각 투여량에 대한 FBGF% 대 시간 곡선-하-면적을 혼입했다. AUC 데이터를 적절한 AOC 데이터로 변환하기 위해 다음 식을 사용하였다: AOC = TPA - AUC; 상기 식에서, TPA는 각 투여량 수명(예를 들어, 7일, 14일 등)에 100%를 곱하여 얻은 총 가능한 면적이다(100%는 FBGF% 대 시간 곡선의 y = 100%를 나타냄). 예를 들어, 투여량 수명이 7일이고 계산된 AUC가 500 FBGF%일인 경우 AOC에 대해 계산 결과는 다음과 같다: AOC = (100 FBGF% x 7일) - (500 FBGF%·일) = 200 FBGF%·일. 주사 1, 주사 2, 주사 3 등에 대한 AOC 값을 얻기 위해 일련의 주사 투여량에서 각 주사 투여량에 대해 분석을 수행했다.
인슐린-Fc-융합 단백질의 투여량이 이전에 논의된 바와 같이 다양할 수 있기 때문에, 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 계산된 모든 AOC 값을 인슐린-Fc-융합 단백질의 특정 투여량으로 정규화하는 것이 종종 더 편리하다. 그렇게 하면 소정의 연구의 주사에 걸쳐 투여량 수준이 변하더라도 다수의 주사에 걸쳐 인슐린-Fc-융합 단백질의 글루코스 저하 효능을 편리하게 비교할 수 있다. 소정의 투여량에 대한 정규화 AOC(NAOC)를 다음과 같이 계산하였다: NAOC = AOC/D(FBGF%·일·kg/mg 단위); 상기 식에서, D는 mg/kg 단위로 동물에 주사된 실제 투여량이다. NAOC 값을 소정의 동물에 대한 일련의 주사에서 각 주사에 대해 계산하고 동일한 인슐린-Fc-융합 단백질 제형이 제공된 동물 그룹에 걸쳐 평균을 냈다.
NAOC 비율(NAOCR)을 각 주사(예를 들어, 주사 1, 2, 3,...N)에 대한 NAOC 값을 취하고 다음과 같이 주사 1에서 NAOC에 의해 소정의 주사에 대한 각 NAOC를 나누어 소정의 동물에 대한 일련의 주사에서 각 주사에 대해 계산하였다: NAOCR = (NAOC(N차 주사) / NAOC(주사 1)). 일련의 주사에서 N차 주사에 대한 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질 제형의 NAOCR을 평가함으로써, 일련의 N 투여량에 걸쳐 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 글루코스 저하 활성이 실질적으로 그 생활성을 유지했는지(예를 들어, 0.5 초과의 N차 투여량에 대한 NAOCR) 또는 N 투여량 과정에 걸쳐 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 글루코스 저하 활성이 그 효능의 유의한 부분을 상실했는지(예를 들어, N차 투여량의 NAOCR은 0.5 미만임)를 결정할 수 있었으며, 이는 생체내 중화 항-약물 항체의 잠재적 형성을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, 3차 피하 주사 후 NAOC 대 1차 피하 주사 후 NAOC의 비율은 0.5보다 컸다(즉, 3차 피하 주사의 NAOCR은 0.5 초과임).
실시예 23: 개 혈청에서 개 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 약동학(PK)의 결정을 위한 일반 절차.
개 혈청에서 개 이소형의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도를 측정하기 위한 분석을 다음과 같이 수행하였다. 분석은 혈청 샘플의 치료 화합물을 ELISA 플레이트에 코팅된 항 인슐린/프로인슐린 단일클론 항체(mAb)에 의해 포획한 다음 HRP-접합된 항-개 IgG Fc-특이적 항체에 의해 검출한 후, 발색을 위한 TMB 기판 시스템을 사용하는 샌드위치 ELISA 형식으로 구성되었다. Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc)를 코팅 완충액(pH=9.6 탄산나트륨-소듐 바이오카보네이트 완충액) 중 항-인슐린 mAb 클론 D6C4(Biorad)로 5 μg/ml로 4℃에서 밤새 코팅했다. 그런 다음 플레이트를 PBST(PBS + 0.05% Tween 20)로 5회 세척하고 SuperBlock 차단 용액(ThermoFisher)으로 실온에서 최소 1시간 동안(또는 4℃에서 밤새) 차단했다. 시험 혈청 샘플을 PBST/SB/20%HS 샘플 희석 완충액(PBS+0.1%Tween 20+10% SuperBlock+20% 말 혈청)에서 1:20으로 희석하였다. 표준 곡선을 작도하기 위해 대상 인슐린-Fc-융합 단백질을 샘플 희석 완충액(PBST/SB/20%HS) + 풀링된 비글 혈청(BioIVT)의 5%에서 200 ng/ml 내지 0.82 ng/ml의 농도 범위에서 1:2.5 연속 희석으로 희석했다. 이중 반복 실험으로 표준 및 희석된 혈청 샘플을 100 μL/웰로 차단된 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플 및 표준을 PBST로 5회 세척하였다. HRP-접합된 염소 항-개 IgG Fc(Sigma) 검출 항체를 PBST/SB/20%HS 완충액에서 약 1:15,000으로 희석하고 100 μl를 모든 웰에 첨가하고 암소에서 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 탈이온수로 1회 세척하고 실온에서 8 내지 10분 동안 100 mL/웰 TMB(Invitrogen)를 첨가하여 발색시켰다. 그런 다음 100 μl/웰 ELISA 정지 용액(Boston Bioproducts)을 첨가하여 발색을 정지시키고 SpectraMax 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 30분 이내에 판독했다. 샘플에서 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물의 농도를 SoftMaxPro 소프트웨어를 사용하여 4-PL 곡선에 대한 보간법에 의해 계산하였다.
실시예 24: 개 혈청에서 항-약물 항체를 측정하기 위한 분석 프로토콜.
시험 화합물에 대한 ADA를 측정하기 위해 Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc)를 10 μg/mL로 코팅 완충액(pH=9.6 카보네이트-바이오카보네이트 완충액) 중 희석된 대상 인슐린-Fc-융합 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 개 IgG 유래의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 인슐린 부분에 대한 ADA를 측정하기 위해, 플레이트를 코팅 완충액에서 30 μg/mL의 정제된 인슐린으로 코팅하였다. 그런 다음 플레이트를 PBST(PBS + 0.05% Tween 20)로 5회 세척하고 SuperBlock 차단 용액(ThermoFisher, Waltham MA)으로 적어도 1시간 동안 (또는 밤새) 차단했다. 개 IgG 단위의 ADA를 계산하기 위해 스트립을 300 내지 4.69 ng/ml 농도의 pH=9.6 Carb-Biocarb 코팅 완충액에서 개 IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA)의 1:2 연속 희석액으로 4℃에서 밤새 직접 코팅하여, 7-포인트 유사 표준 곡선을 작도하는데 사용하였다. 표준 스트립 플레이트를 또한 세척하고 SuperBlock 차단 용액으로 적얻 1시간 동안(또는 밤새) 차단했다.
시험 혈청 샘플을 PBST/SB/20%HS 샘플 희석 완충액(PBS+0.1% Tween 20+10% SuperBlock+20% 말 혈청) 중에 1:100 이상(통상적으로 1:200으로 시험됨)으로 희석하고, 인슐린-Fc-융합 단백질 코팅된(또는 RHI 코팅된) 스트립에 100 μL/웰로 이중 반복 실험으로 첨가하였다. 개의 IgG 코팅된 표준 스트립의 이중 반복 실험 스트립을 또한 각 플레이트에 첨가하고 PBST/SB(PBS+0.1% Tween 20+10% SuperBlock) 완충액을 100 μL/웰로 채웠다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 PBST로 5회 세척하였다. ADA의 검출을 위해 HRP 접합 염소 항 고양이 IgG F(ab')2(항 고양이 IgG F(ab')2 시약을 개 항체에 교차 반응시킴; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA)를 PBST/SB에서 1:10000으로 희석하고, 샘플 및 표준 웰 모두에 100 μL/웰로 첨가하고 암소에서 실온에서 45분 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 PBST로 5회 세척한 다음 탈이온수로 1회 세척한 후 100 μL/웰 TMB 기질(Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham MA)을 실온에서 암소에서 15 내지 20분 동안 첨가하여 발색시켰다. 그 다음, 100 μL/웰의 ELISA 정지 용액(Boston Bioproducts)을 첨가하여 발색을 정지시키고 30분 이내에 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 판독했다. 항-약물 항체 농도를 SoftMax Pro Software(Molecular Devices, San Jose CA)를 사용하여 4-PL 유사 표준 곡선의 OD 값을 보간하여 결정했다.
검출된 ADA의 특이성을 입증하기 위해 "억제" 분석을 수행하였다. 약물 억제 ADA 분석에서, 혈청 샘플을 PBST/SB/20%HS 완충액에 1:100 희석하고 300 μg/mL의 관련 치료 화합물(1:200에서 최종 샘플 희석 및 150 μg/mL의 최종 억제 화합물)의 동일한 부피와 혼합하고 실온에서 30 내지 40분 동안 인큐베이션하여 항-약물 항체가 유리 억제제(즉, 치료 화합물)에 결합하도록 하였다. 사전 인큐베이션 후, 샘플을 인슐린-Fc-융합 단백질 코팅된(또는 RHI 코팅된) 스트립에 100 μL/웰로 이중 반복 실험으로 첨가하였다. 억제 화합물이 부재하는 PBST/SB/20%HS 완충액에서 1:200으로 희석된 샘플을 또한 개 IgG 코팅된 표준의 이중 반복 실험 스트립과 함께 샘플 플레이트에서 시험하였다. 분석 절차의 나머지 단계는 위에서 설명한 대로 수행하였다. 약물 억제 웰에서 측정된 ADA를 비억제 ADA 농도와 일치시켜 ADA의 특이성을 평가했다. 약물 억제 웰에서 ADA 신호의 유의한 억제가 관찰된 경우, 이는 ADA가 치료 화합물에 특이적임을 의미했다.
실시예 25: 마우스에서 인간 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 투여 후 생체내 약역학(PD)의 결정을 위한 일반 절차.
인슐린-Fc-융합 단백질을 공복 혈당 수준에 대한 효과에 대해 다음과 같이 평가하였다. 데이터를 그룹당 N=3 balb/c 마우스 또는 당뇨병 wt NOD 마우스(Jackson Laboratories)에서 수집하였다. 실험 1시간 전에 동물을 금식시킨 후 시간 = 0시간에 수산화나트륨 및/또는 염산을 사용하여 조정된 최종 용액 pH 7.0 내지 8.0에서 10 내지 50 mM 인산수소나트륨, 50 내지 150 mM 염화나트륨, 0.005 내지 0.05% v/v Tween-80, 및 선택적으로 0.02 내지 1.00 mg/mL의 농도의 정균제(예를 들어, 페놀, m-크레졸 또는 메틸파라벤)의 용액에서 300 μg/kg의 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도에서 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체를 포함하는 약제학적 조성물을 마우스에 1회 피하 투여하였다.
각 시점에 대해 혈액 샘플을 수집하고 약 한 방울의 혈액이 필요한 글루코스 측정기(AlphaTRAK® 2 pet glucometer)를 사용하여 글루코스 수준 판독값을 즉시 결정했다. 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생활성을 평가하기 위해 0 내지 9시간의 평균 공복 혈당 수준%(FBGL%)을 작도하였다.
실시예 26: 마우스에서 인간 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 투여 후 생체내 약역학(PD)의 결정을 위한 일반 절차.
인슐린-Fc-융합 단백질을 공복 혈당 수준에 대한 효과에 대해 다음과 같이 평가한다. 데이터를 그룹당 N=3 balb/c 마우스 또는 당뇨병 wt NOD 마우스(Jackson Laboratories)에서 수집한다. 실험 1시간 전에 동물을 금식시킨 후 시간 = 0시간에 수산화나트륨 및/또는 염산을 사용하여 조정된 최종 용액 pH 7.0 내지 8.0에서 10 내지 50 mM 인산수소나트륨, 50 내지 150 mM 염화나트륨, 0.005 내지 0.05% v/v Tween-80, 및 선택적으로 0.02 내지 1.00 mg/mL의 농도의 정균제(예를 들어, 페놀, m-크레졸 또는 메틸파라벤)의 용액에서 300 μg/kg의 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도에서 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체를 포함하는 약제학적 조성물을 마우스에 1회 피하 투여한다.
각 시점에 대해 혈액 샘플을 수집하고 약 한 방울의 혈액이 필요한 글루코스 측정기(AlphaTRAK® 2 pet glucometer)를 사용하여 글루코스 수준 판독값을 즉시 결정한다. 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생활성을 평가하기 위해 0 내지 9시간의 평균 공복 혈당 수준%(FBGL%)을 작도한다.
실시예 27: 면역원성 에피토프 확인을 위한 분석 절차.
라이브러리의 각 화합물을 ELISA 마이크로플레이트 웰의 각각의 개별 스트립에 코팅하는 것을 제외하고는 실시예 25의 항-약물 항체 ELISA 분석에 기재된 바와 유사한 방식으로 Maxisorp ELISA 마이크로플레이트(Nunc)를 공지된 아미노산 서열을 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체 화합물의 라이브러리로 코팅하고, 코팅된 플레이트를 차단하였다. 라이브러리 내의 화합물은 다양한 B-사슬, C-사슬 및 A-사슬 아미노산 돌연변이, 상이한 링커 조성, 및 일부 인간 유래를 포함하는 상이한 Fc-단편 조성을 포함하는 상이한 인슐린 폴리펩타이드 아미노산 조성을 갖는 다양한 인슐린-Fc-융합 단백질을 포함한다. 별도로, 일부 플레이트 스트립 웰을 실시예 24에 기재된 바와 같이 각각 개 IgG 단위에서 항-약물 항체(ADA)를 계산하기 위해 개 IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA)의 1:2 연속 희석액으로 직접 코팅한다.
인슐린-Fc-융합 단백질의 반복 투여량이 제공된 각각의 개로부터 얻은 혈청을 먼저 실시예 24의 항-약물 항체 ELISA 분석에서 스크리닝하였다. 실시예 24의 분석에서 중간 또는 높은 양성(예를 들어, 항체의 중간 또는 높은 역가)을 나타내는 혈청 샘플을 PBST/SB/20%HS 샘플 희석 완충액(PBS+0.1% Tween 20+10% SuperBlock+20% 말 혈청)에서 연속 희석(1:200 내지 1:8000)하고 RT에서 1시간 동안 인슐린-Fc-융합 단백질 화합물의 라이브러리로 코팅된 플레이트에 첨가한다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBST로 5회 세척한다. 코팅된 화합물 라이브러리에 교차 반응할 수 있는 개 항체의 검출을 위해, 개 IgG에 교차 반응성인 HRP 접합된 염소 항-고양이 IgG F(ab')2(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove PA)를 PBST/SB에서 1:10000으로 희석하고, 샘플 및 표준 웰 모두에 100 μL/웰로 첨가하고 암소에서 RT에서 45분 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 탈이온수로 1회 세척하고 100 μL/웰 TMB 기질(Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham MA)을 15 내지 20분 동안 실온에서 암소에서 첨가하여 발색시킨다. 그런 다음 100 μL/웰의 ELISA 정지 용액(Boston Bioproducts, Ashland MA)을 첨가하여 발색을 정지시키고 30분 이내에 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 흡광도를 판독한다. 혈청 샘플에 존재하는 항화합물 교차 반응성 항체 농도를 SoftMax Pro Software(Molecular Devices, San Jose CA)를 사용하여 직접 코팅된 개 IgG 항체 대조군에 대한 4-PL 유사-표준 곡선의 OD 값을 보간하여 결정한다.
분석으로부터 생성된 항체 농도와 코팅된 인슐린-Fc-융합 단백질 라이브러리의 공지된 아미노산 조성의 상관관계를 확인함으로써, 특정 아미노산 돌연변이 또는 에피토프가 분석에서 다양한 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체에 대한 결합 없음, 약한 결합 또는 강한 결합을 나타내는 총 항체 신호의 부재, 그 일부, 대부분 또는 전부의 발생에 관여하는지를 결정할 수 있다. 중간 또는 강한 결합에 관여하는 돌연변이 또는 에피토프는 본 명세서에서 면역원성 "핫스팟"으로 지칭된다.
실시예 28: 높은 동종이량체 역가 및 허용가능한 수준의 급성 및 반복 투여 생활성을 갖는 개 인슐린-Fc-융합 단백질을 얻기 위한 설계 과정.
본 발명의 상세한 설명에 기재된 설계 목적을 달성하기 위한 과정은 다음 단계를 포함하였다. 먼저, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 인슐린 폴리펩타이드를 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질이 최소한의 면역원성을 가진 장기-작용성 생활성 산물을 생성할 가능성이 가장 높도록 특정 IgG 이소형의 종-특이적 Fc-단편 및 링커와 조합하였다(예를 들어, 최소 Fc(감마)수용체 I 결합으로 종-특이적 IgG 이소형을 선택함). 적절한 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 준비하고 벡터(LakePharma, San Carlos, CA)에 클로닝한 다음, 벡터를 사용하여 실시예 1에 기재된 절차에 따라 HEK 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 그런 다음, 인슐린-Fc-융합 단백질을 실시예 4에 따라 정제하고 전체 단백질 수율 및 동종이량체%를 실시예 10에 따라 측정했다. 동종이량체 역가가 50 mg/L 초과의 후보만을 허용 가능한 것으로 고려하였으며, 이는 동물용 산물에 대한 엄격하게 낮은 제조 비용 요건을 충족하는 상업적 생성 역가를 야기하지 않을 수 있기 때문이다. 그 다음, 선택된 인슐린-Fc-융합 단백질을 실시예 12에 기재된 바와 같이 시험관내 인슐린 수용체 결합 연구를 통해 생활성의 지표에 대해 스크리닝하였다. 경험에 기반하여, 5000 nM 미만의 IR 활성 IC50 값을 나타내는 화합물만을 표적 종에서 생활성을 나타낼 가능성이 있는 것으로 고려하였다. 시험관내 IR IC50 값은 유용한 정성적 스크리닝 도구이지만 인간 인슐린 수용체를 발현하는 인간 IM-9 세포를 활용하므로 개 IR과 인간 IR 사이의 일부 작은 친화도 차이를 포착하지 못할 수 있다. 또한, 인슐린 수용체 결합 이외의 인자가 화합물의 생체내 생활성에 영향을 미칠 수 있다(예를 들어, 생체내 약동학적 제거 반감기를 연장할 수 있도록 하는 개 FcRn에 대한 친화도). 따라서, 제조 및 IR 활성 IC50 값 관점에서 허용가능한 선택된 인슐린-Fc-융합 단백질을 적절한 효능 및/또는 생활성 기간(예를 들어, 150 FBGL%·일·kg/mg 미만의 NAOC)을 갖는 임의의 물질을 스크리닝하기 위해 뱅활성 개에 대해 추가로 스크리닝하였다. 다시, 경험에 기반하여, 150 FBGL%·일·kg/mg 초과의 NAOC 값에서 대상 종의 투여량 요건은 허용 가능한 치료 비용에 도달할 수 있을 정도로 충분히 낮을 것이다. 마지막으로, 관련 기술 분야에서 거의 언급되지 않는 추가 평가 기준을 추가하였다. 하기 실시예에서 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 예기치 않게, 1차 투여 후 표적 종에서 허용가능한 NAOC 수준을 나타내는 많은 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태는 반복 투여 후에 그 수준의 생활성을 유지하는데 실패한다. 또한, 대부분의 경우 표적 종에서 반복 투여 생활성의 감소는 중화 항-약물 항체의 발달과 상관관계가 있다. 항-약물 항체를 생성하는 이러한 경향 및 활성 유지 실패에 의해 이러한 인슐린-Fc-융합 단백질은 개 당뇨병과 같은 만성 질병 치료에 사용할 수 없다. 따라서, 최소 수준의 항-약물 항체와 함께 허용 가능한 수준의 반복 투여 생활성(예를 들어, 1차 투여량에 비해 3차 투여량에 대해 0.5 초과의 NAOCR 값)을 나타내는 인슐린-Fc-융합 단백질만을 본 발명에서 사용하기에 허용가능한 것으로 고려하였다.
실시예 29: 높은 동종이량체 역가 및 허용 가능한 수준의 급성 및 반복 투여 생활성을 갖는 인간 인슐린-Fc-융합 단백질을 얻기 위한 설계 과정.
본 발명의 상세한 설명에 기재된 설계 목적을 달성하기 위한 과정은 다음 단계를 포함하였다. 먼저, 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질이 장기-작용 생활성 산물을 생성할 가능성이 가장 크도록 서열번호 7 또는 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드를 특정 IgG 이소형(IgG2 또는 IgG1)의 인간 Fc-단편 및 링커와 조합하였다. 적절한 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 준비하고 벡터(LakePharma, San Carlos, CA)에 클로닝한 다음, 벡터를 사용하여 실시예 1에 기재된 절차에 따라 HEK 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 그런 다음, 인슐린-Fc-융합 단백질을 실시예 4에 따라 정제하고 총 단백질 수율 및 동종이량체%를 실시예 10에 따라 측정하고 동종이량체 역가를 계산하였다. 동종이량체 역가가 150 mg/L 초과의 후보만을 허용가능한 것으로 고려하였으며, 이는 이 수준보다 낮은 동종이량체 역가는 높은 동종이량체 역가가 안정적으로 감염된 CHO 세포주로 해석될 가능성이 없고 따라서 상대적으로 시판 인간 인슐린 시장에 대한 낮은 제조 비용 요건을 충족하는 상업적 생성 역가를 초래할 가능성이 없기 때문이다. 이어서, 실시예 12에 기재된 바와 같이 시험관내 IR 결합 연구를 통해 생활성의 지표에 대해 선택된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 스크리닝하였다. 경험에 기반하여, 2400 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만의 IR 활성 IC50 값을 나타내는 화합물만을 생체내에서 생활성을 나타낼 가능성이 있는 것으로 고려하였다. 시험관내 IR IC50 값은, 분석이 인간 IR을 발현하는 인간 IM-9 세포를 활용하고, 더 큰 결합(더 낮은 IR IC50 값)이, 감소된 결합(더 높은 IR IC50 값)을 갖는 화합물과 비교하여, 소정의 투여량에 대해 더 큰 생체내 효능을 제공할 것으로 예상되기 때문에 유용한 정성적 스크리닝 도구이다. 또한, IR 결합 이외의 인자가 화합물의 생체내 생활성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 인간 FcRn 수용체에 대한 Fc-융합 단백질의 친화도는 화합물의 생체내 약동학적 제거 반감기와 관련이 있다. 수일 이상의 인슐린-Fc-융합 단백질의 연장된 생체내 반감기는 시험관내 인간 FcRn 결합 분석(실시예 19)에 의해 측정되는 바와 같이 1500 ng/mL 미만 및 더욱 바람직하게는 1000 ng/mL 미만의 EC50 값과 비례적 상관관계에 있다.
제조, IR 활성 IC50 값 및 인간 FcRn 활성 EC50 값 영역에서 허용가능한 선택된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 인간 Fc(감마)RI 수용체 및 인간 C1q 결합 친화도를 시험함으로써 생체내 면역원성에 대한 가능성에 대해 추가로 스크리닝하였다. 이러한 면역계 요소에 더 강하게 결합하는 분자는 항원 세포 제시(APC) 증가로 이러질 가능성이 더 높고 더 큰 면역원성 프로파일을 나타내며, 이는 항-약물 항체로 측정되는 바와 같다. 항-약물 항체는 바람직하지 않으며 분자의 생체내 약동학적 반감기를 방해하거나 약물의 활성을 중화시키거나 두 기능을 모두 수행할 수 있다. 잠재적인 항약물 항체가 인슐린-Fc 생체내 기능에 미치는 영향은 유의하게 문제가 될 수 있다. 따라서 Fc(감마)RI(실시예 14) 및 C1q(실시예 16)에 대한 후보 인슐린-Fc-융합 단백질을 스크리닝하여 부적절한 항원 제시 및 잠재적인 항약물 항체 유도 면역원성의 위험을 완화하기 위한 작업을 수행하였다(문헌[Guilliams, Martin & Bruhns, Pierre & Saeys, Yvan & Hammad, Hamida & Fambrecht, Bart. (2014). The function of Fc gamma receptors in dendritic cells and macrophages. Nature reviews. Immunology. 14. 10.1038/nri3582]). 인간 Fc(감마)RI 결합(시험 중인 인슐린-Fc-융합 단백질의 비오티닐화-Fc(감마)RI 농도가 3000 ng/mL인 경우)에 대해 설정된 설계 목적은 0.50 미만의 OD450 비율이고 (서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태 대비), C1q 결합에 대해 설정된 설계 목적(시험 중인 인슐린-Fc-융합 단백질의 비오티닐화-C1q 농도는 1000 ng/mL임)은 0.35의 OD450 비율이다 (서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태 대비).
다른 곳에서 기재된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 포함 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 예상외로 인간 IgG2 Fc 포함 입체형태보다 훨씬 더 높은 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 따라서 제조 가능성과 관련하여 바람직하였다. 그러나, 인간 IgG1 Fc 포함 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 cNg 부위에 천연 N-연결된 글리코실화를 포함할 때 종종 Fc(감마)RI 및 C1q 둘 모두에 대해 매우 높은 결합을 나타내며, 이들 모이어티 중 하나 또는 둘 모두에 대한 강한 결합은 생체내 항원 제시 및 면역원성 개선에 대한 높은 가능성과 상관관계가 있다(문헌[Kouser, L., Madhukaran, S. P., Shastri, A., Saraon, A., Ferluga, J., Al-Mozaini, M., & Kishore, U. (2015). Emerging and Novel Functions of Complement Protein Clq. Frontiers in Immunology, 6, 317. doi:10.3389/fimmu.2015.00317]). 따라서, 생합성 동안 천연 글리코실화를 방지하기 위해 천연 글리코실화 부위(cNg)가 돌연변이된 제1 스크리닝 화합물에 의해 hlgG1 이소형 Fc-포함 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 수 개의 변이체를 시험하였다. 그런 다음 이들 분자를 인슐린 폴리펩타이드 조성을 조작함으로써 특성이 개선되도록 추가로 돌연변이시켰다. 마지막으로, 다양한 설계 특성을 더 최적화할 수 있는지 확인하기 위해 조성과 길이가 다른 수 개의 링커 변이체를 조사했다. 다수의 라운드의 최적화를 통한 스크리닝 후, 허용 가능한 수준의 동종이량체 역가, IR 결합, FcRn 결합, Fc(감마)RI 결합 및 C1q 결합을 나타내는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태만을 본 발명에서 사용하기에 허용가능한 것으로 고려하였다.
결과 - 개 Fc-단편을 포함하는 인슐린-FC 융합 단백질
실시예 30: 개 Fc IgGA 이소형을 포함하는 개 인슐린-Fc-융합 단백질.
서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드 서열과 개 IgGA 이소형(서열번호 14)의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질을 서열번호 11의 펩타이드 링커를 사용하여 생성하기 위한 연구를 수행하였다. 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질의 전체 아미노산 서열은 다음과 같다:
(서열번호 31).
서열번호 31의 인슐린-Fc-융합 단백질을 실시예 1에 따라 HEK 세포에서 합성하고 실시예 4에 따라 정제하였다. 단백질 A 정제 단계 후 단백질 수율은 22 mg/L이었다. 인슐린-Fc-융합 단백질의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 동종이량체 %를 실시예 10에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였고, 이는 24%인 것으로 결정되었으며, 이는 높은 정도의 동종이량체 응집체를 나타낸다. 따라서 생성된 동종이량체 역가는 5 mg/L에 불과했다. 요약하면, HEK 세포에서 서열번호 31의 인슐린-Fc-융합 단백질의 제조는 높은 수준의 응집체 및 낮은 동종이량체 역가(5 mg/L)를 초래하여 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가의 설계 목적을 충족시키지 못했다.
그럼에도 불구하고, 서열번호 31의 인슐린-Fc-융합 단백질은 생물학적 활성에 대해 평가된 바와 같다. 먼저, 서열번호 31의 인슐린-Fc-융합 단백질의 인슐린 수용체 결합을 실시예 12에 따라 측정하였고, 그 결과 화합물이 생체내에서 생활성일 가능성이 있음을 나타내는 2,733 nM의 IC50 값이 나타났다(즉, 5000 nM 미만의 IC50).
다음으로, 서열번호 31의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 약역학(PD)을 실시예 21에 따라 N=3 개에 화합물을 단일 정맥내 투여한 후 측정하였다. 도 2는 시간의 함수로서 서열번호 31의 공복 혈당 수준 퍼센트를 나타낸다. 서열번호 31에 대한 NAOC를 실시예 22의 절차에 따라 105 FBGL%·일·kg/mg인 것으로 계산하였다. 서열번호 31의 생체내 반감기를 실시예 23의 방법을 사용하여 1일 미만인 것으로 계산하였다. 상대적으로 낮은 NAOC는 샘플에서 많은 양의 응집체(즉, 낮은 동종이량체 %)의 결과일 가능성이 높지만, 순환 중에 남아 있는 가용성 동종이량체는 여전히 약동학적 제거 반감기가 1일 미만이었고, 이에 따라 주 1회 투여가 지원되지 않을 것으로 판단되었다.
실시예 31: 개 IgGA 이소형을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc-단편 영역의 돌연변이.
서열번호 31의 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 함량%를 증가시키고, 생활성을 개선하고, 반감기 증가를 증가시키기 위해, 분자간 결합(예를 들어, 분자 간의 Fc-단편-Fc-단편 상호작용)을 방지하고, FcRn 수용체에 대한 더 강한 결합(예를 들어, FcRn에 대한 더 높은 친화도)을 촉진하여 재순환 및 전신 순환 시간을 증가시키기 위한 시도로서, Fc-단편 CH3 영역에 돌연변이를 삽입하였다. 하기 인슐린-Fc-융합 단백질을 실시예 1에 따라 HEK 세포에서 합성하고, 실시예 4에 따라 정제하고, 실시예 6, 실시예 8 및 실시예 10에 따라 시험하였으며, 그 시험 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 서열번호 31에 대한 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35의 서열 정렬 및 아미노산 서열의 차이가 도 3에 나타나 있다.
(서열번호 32)
(서열번호 33)
(서열번호 34)
(서열번호 35)
개 IgGA 변이체에 기반한 인슐린-Fc-융합 단백질은 상응하는 단백질 수율, 동종이량체% 및 동종이량체 역가와 함께 표 2에 나열되어 있다. 결과는 IgGA Fc-단편에 대한 다양한 돌연변이가 동종이량체% 및 동종이량체 역가를 개선하는 대신 5 mg/L 미만의 극도로 낮은 동종이량체 역가를 갖는 고도로 응집된 단백질을 발생시켰음을 보여준다. 이와 같이, 화합물의 생체내 생활성 및 약동학을 평가할 수 없었다.
실시예 32: 다른 개 Fc-단편 이소형을 사용한 개 인슐린-Fc-융합 단백질.
전술한 바와 같이, 개 IgGA는 개에서 Fc(감마) I 효과기 기능의 부재로 인해 개에 대한 비-면역원성 인슐린-Fc-융합 단백질을 생성하기 위한 Fc-단편에 대한 바람직한 이소형인 것으로 생각된다(인간에서 인간 IgG2 이소형과 매우 유사함). 그러나, 개 IgGA Fc-단편으로 제조된 인슐린-Fc-융합 단백질은 고도로 응집하였고, 허용할 수 없을 정도로 낮은 동종이량체 역가 및 허용할 수 없을 정도로 낮은 수준의 생활성 및 작용 기간을 나타내었다. 따라서, 다른 개 IgG 이소형(서열번호 15의 개 IgGB), 서열번호 16의 개 IgGC 및 서열번호 17의 개 IgGD)로부터의 Fc-단편을 서열번호 31의 인슐린-Fc-융합체의 개 IgGA Fc-단편에 대한 대체물로 평가하였다. 개의 IgGB, IgGC, 및 IgGD 이소형에 기반한 Fc-단편을 포함하는 3개의 인슐린-Fc-융합 단백질을 서열번호 4의 동일한 인슐린 폴리펩타이드 및 서열번호 11의 펩타이드 링커를 사용하여 합성하고, 이를 사용하여, 서열번호 31의 인슐린-Fc-융합 단백질을 생성하였다. 실시예 1에 따른 HEK293 세포에서 단백질을 제조하였다. 이어서, 실시예 4에 따라 단백질 A 컬럼을 사용하여 인슐린-Fc-융합 단백질을 정제하였다. 인슐린-Fc-융합 단백질의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 동종이량체%를 실시예 10에 따라 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 이의 서열은 하기에 제시되어 있고, 서열번호 31에 대한 서열 정렬 비교는 도 4에 제시되어 있다:
(서열번호 36)
(서열번호 37)
(서열번호 38)
생성된 단백질 수율, 동종이량체% 및 동종이량체 역가는 표 3에 제공된다. 예상외로, 개의 IgGB 이소형에 기반한 Fc-단편을 포함하는 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질만이 50 mg/L 초과의 설계 기준을 충족하는 동종이량체 역가를 나타내었다. 개의 IgGC 이소형에 기반한 Fc-단편을 포함하는 서열번호 37의 인슐린-Fc-융합 단백질은 어떠한 화합물도 전혀 생성하지 않았고, 개 IgGD 이소형에 기반한 Fc-단편을 포함하는 서열번호 38의 인슐린-Fc-융합 단백질은 유의한 단백질 수율을 나타내었지만 응집도가 높아서 동종이량체 역가가 허용할 수 없을 정도로 낮았다.
서열번호 36 및 서열번호 38의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 시험관내 인슐린 수용체 결합을 실시예 12의 절차에 따라 시험하였다. 서열번호 38의 인슐린-Fc-융합 단백질은 5000 nM 초과의 IC50을 나타내었으며, 이는 이 화합물이 생체내에서 생활성을 보일 가능성이 매우 낮다는 것을 나타낸다. 그러나, 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질은 28 nM의 IC50을 나타내어 이 서열이 생체내에서 생활성일 가능성이 있음을 나타낸다.
실시예 33: 개 IgGB 이소형 Fc-단편과 함께 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 효능.
실시예 32의 적절한 동종이량체 역가 및 인슐린 수용체 활성 결과를 감안할 때, 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질을 N=3의 건강하고 항체가 부재하는 약 10 kg의 비글견 각각에 정맥내 주사한 후 실시예 21에 따라 생체내 생활성에 대해 시험하였다. 별도의 실험에서, 화합물을 N=3의 나이브 비글견에게 피하 투여하였다. 도 5는 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 정맥내 투여에 대한 시간에 대한 FBGL%을 나타내고, 도 6은 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 피하 투여에 대한 시간에 대한 FBGL%을 나타내며, 이들 둘 모두는 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질이 개에서 유의하게 생활성임을 나타낸다.
NAOC를 인슐린-Fc-융합 단백질의 상대적 생활성 및 작용 기간을 결정하기 위해 실시예 22의 절차에 따라 계산하였다. 정맥 주사된 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 NAOC는 399 FBGL%·일·kg/mg으로, 정맥 주사된 서열번호 31의 인슐린-Fc-융합 단백질의 NAOC의 3.8배였으며, 이는 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 대 개 IgGA Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 유의하게 증가된 생활성을 나타낸다. 피하 주사된 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 NAOC는 366 FBGL%·일·kg/mg이었고, 이는 정맥내 투여를 통해 얻은 것과 유사한 피하 투여를 통한 생활성 수준을 나타낸다.
실시예 34: 개 IgGB 이소형 Fc-단편과 함께 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 반복 피하 투여 후 생체내 면역학적 스크리닝.
서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 반복 투여 피하 생활성을 실시예 22에 기재된 방법에 따라 개에서 시험하였다. N=3 동물에게 0일, 35일 및 42일째에 피하 투여하고, FBGL%를 실시예 22에 따라 각 투여 후 7일 시간대에 대해 측정했다. NAOC 및 NAOCR을 반복된 피하 주사 각각에 대해 실시예 22의 절차에 따라 계산하였다. 표 4에 예시된 바와 같이, 개에게 반복 피하 투여는 NAOCR의 유의한 감소로 측정된 바와 같이 3차 투여에 의한 생활성의 유의한 감소를 예기치 않게 나타냈다(즉, 3차 주사에 대한 NAOC는 0.40 또는 1차 주사에 대한 NAOC의 40%에 불과했다.
임의의 특정 설명에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 개에서 3차의 반복 피하 투여 후 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생활성의 유의한 감소의 원인은 생물학적 활성을 중화시키는 항약물 항체의 발달에 기인하는 것으로 가정하였다. 항-약물 항체는 인슐린-Fc-융합 단백질의 인슐린 폴리펩타이드, 링커, 또는 Fc-단편 부분에 대해 유도될 수 있다. 면역원성 반응은 항원 제시 세포, T 보조 세포, B 세포 및 이와 관련된 사이토카인 간의 상호작용으로 나타나며, 이는 약물에 대한 내인성 항체(예를 들어, 항-약물 항체)의 생성으로 이어질 수 있다. 결합 항체는 인슐린-Fc-융합 단백질에 결합할 수 있는 모든 이소형이며, 이들은 실시예 24에 기재된 바와 같이 면역분석에서 검출될 수 있다. 인슐린-Fc-융합 단백질의 기능적 활성을 억제하는 중화 항체는 일반적으로 생활성에 필요한 에피토프에 대해 유도된다. 이것이 사실인지를 평가하기 위해, 각 투여량의 투여 전 및 실시예 11 및 실시예 12에 기재된 실험 종료 시에 수집된 혈청을 시험하여 실시예 24에 따른 항-약물 항체의 수준을 정량화하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 항-약물 항체의 수준은 화합물의 다중 피하 투여로 실제로 증가하였고, 이는 중화 항-약물 항체의 생성이 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 3차 주사 후 NAOCR 감소의 원인이 될 가능성이 있음을 나타낸다.
실시예 35: 면역원성의 잠재적 위험을 감소시키기 위한 개 IgGB 이소형 Fc-단편과 함께 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드를 포함하는 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질.
실시예 32 및 실시예 33에 나타낸 바와 같이, 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질은 개에서 허용가능한 동종이량체 함량%, 동종이량체 역가 및 생활성을 나타내었으나; 당뇨병과 같은 만성 질병에 대한 이의 사용은 반복 피하 투여에 따른 생활성 감소(실시예 34) 및 항-약물 항체 생성(실시예 34)에 의해 손상된다. 임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 항-약물 항체의 생성 및 생활성 감소의 가능한 원인 중 하나는 개 면역계의 다양한 수용체(예를 들어, Fc(감마) 수용체, 예를 들어 Fc(감마)RI)와 개 IgGB Fc-단편의 중가된 상호작용이다. 그럼에도 불구하고, 개 IgGB 이소형은 Fc-단편에 대해 사용될 때 제조 가능성 및 단일 투여 생활성 설계 목적을 충족시키는 인슐린-Fc-융합 단백질을 생성한 4개의 개 IgG 이소형 중 유일한 하나였다(실시예 28). 본 발명의 상세한 설명에 기재된 바와 같이, Fc(감마) 상호작용을 감소시키는 한 방법은 숙주 세포에서 합성 동안 글리코실화를 방지하기 위해 Fc-단편 cNg 부위를 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 따라서, 실시예 14에 기재된 시험관내 인간 Fc(감마)RI 분석에서 결합에 의해 측정한 바와 같이, 생체내에서 Fc(감마) 수용체에 대한 Fc-단편의 결합 친화도를 감소시키기 위해 서열번호 36의 Fc-단편 영역에 cNg 부위 돌연변이를 생성시켰다. 글리칸 부재의 검증을 PNGase F 처리 단계가 생략된 실시예 8의 LC-MS 방법을 사용하여 수행하였다. 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질에서 cNg 부위의 위치는 cNg-NB139이다. 서열번호 36에 대한 돌연변이는 cNg-NB139-Q의 돌연변이를 포함하는 서열번호 39, cNg-NB139-S의 돌연변이를 포함하는 서열번호 40, cNg-NB139-D의 돌연변이를 포함하는 서열번호 41, 및 cNg-NB139-K의 돌연변이를 포함하는 서열번호 42를 포함하였다. cNg-돌연변이된 인슐린-Fc-융합 단백질의 전체 아미노산 서열은 아래에 나열되어 있고(NB139 위치에 밑줄 표시됨), 생성된 서열 정렬은 도 8에 도시되어 있다 (Clustal Omega):
(서열번호 39)
(서열번호 40)
(서열번호 41)
(서열번호 42).
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고, 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 인슐린-Fc-융합 단백질의 구조를 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 동종이량체%를 실시예 10에 따라 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 표 5에 나타난 바와 같이, 서열번호 40, 서열번호 41, 및 서열번호 42의 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 역가는 설계 목적을 충족하였으며, 예기치 않게 cNg-NB139-Q 돌연변이를 포함하는 서열번호 39의 인슐린-Fc-융합 단백질은 동종이량체 역가에 대한 설계 목적을 충족하지 못했다.
나머지 3개의 화합물 중 감소된 면역원성을 나타낼 가능성이 가장 큰 화합물을 결정하기 위해, Fc(감마) 수용체 결합을 실시예 15의 절차에 따라 측정하였다. 낮은 Fc(감마) 수용체 결합은 최소 면역원성과 상관관계가 있을 가능성이 가장 크다. 표 6은 이들 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I 결합을 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 결합과 비교한 것이며, 이는 예상외로, cNg-D 돌연변이를 포함하는 서열번호 41의 인슐린-Fc-융합 단백질이 cNg-S 돌연변이를 포함하는 서열번호 40 및 cNg-K 돌연변이를 포함하는 서열번호 42의 인슐린-Fc-융합 단백질의 약 2배인 Fc(감마) 수용체 결합 활성을 나타냄을 보여준다. 따라서, cNg-S 돌연변이 및 cNg-K 돌연변이를 포함하는 후자의 두 화합물을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질만이 개에서 반복 투여 생활성 시험에 적합한 것으로 고려하였다.
실시예 36: 비-글리코실화 cNg-K 및 cNg-S 개 IgGB 이소형 Fc-단편을 사용한 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드의 생체내 생활성 및 면역원성의 평가.
cNg-S 돌연변이를 포함하는 서열번호 40의 인슐린-Fc-융합 단백질이 개에서 반복 투여 생활성 기능을 개선하는지 확인하기 위해, 화합물을 0일, 7일, 14일 및 28일째에 실시예 22의 절차에 따라 N=1의 개에게 피하 투여하였다. 개의 FBGL%이 너무 낮게 떨어졌을 때, 개에게 혈당을 안전한 수준으로 증가시키기 위해 사료를 제공하였다. 1차 주사에 대한 NAOC는 191 FBGL%·일·kg/mg이었고, 이는 서열번호 40의 인슐린-Fc-융합 단백질이 생체내에서 만족스럽게 생활성임을 보여주었다. NAOC 및 NAOCR을 또한 실시예 22의 일반적인 절차에 따라 각각의 후속 투여에 대해 측정하였고, 이는 투여량이 투여된 시간부터 다음 투여량이 투여되기 직전까지 계산하였다. 표 7에 나타낸 NAOC 및 NAOCR은 서열번호 40의 인슐린-Fc-융합 단백질이 4회 투여량 요법의 투여량 3 및 4에서 유의하게 감소된 NAOCR을 나타내었다는 것을 보여준다. 따라서 cNg-S 변이를 포함하는 서열번호 40의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질보다 4배 더 낮은 저 Fc(감마)RI 결합을 나타냄에도 불구하고 개에서 반복 투여 생활성을 나타내지 못하였다.
cNg-K 돌연변이를 포함하는 서열번호 42의 인슐린-Fc-융합 단백질이 개에서 반복 투여 생활성 기능을 개선하는지 결정하기 위해, 화합물을 0일, 7일, 14일 및 28일째에 실시예 22의 절차에 따라 N=1의 개에게 피하 투여하였다. 개의 FBGL%이 너무 낮게 떨어졌을 때, 개에게 혈당을 안전한 수준으로 증가시키기 위해 사료를 제공하였다. 1차 주사에 대한 NAOC는 449 FBGL%·일·kg/mg이었고, 이는 서열번호 42의 인슐린-Fc-융합 단백질이 생체내에서 만족스럽게 생활성임을 보여주었다. 화합물의 약동학적 프로파일을 또한 ELISA를 사용하여 실시예 23의 방법에 의해 측정하였고, 2-구획 모델을 데이터에 적용하여, 이의 제거 반감기가 약 0.9일인 것으로 결정하였다. NAOC 및 NAOCR은 또한 실시예 22의 일반적인 절차에 따라 각각의 후속 투여에 대해 측정하고, 이를 투여량이 투여된 시간부터 다음 투여량이 투여되기 직전까지 계산하였다. 표 8에 나타낸 NAOC 및 NAOCR은 서열번호 42의 인슐린-Fc-융합 단백질이 4회 투여에 걸쳐 0.6 초과의 NAOCR을 유지한다는 것을 보여준다. 따라서, 예상외로 cNg-K 돌연변이를 포함하는 서열번호 42의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 글리코실화되지 않은 유일한 돌연변이로서 개에서 반복 투여 생활성이 유의하게 개선되었다.
항-약물 및 항-인슐린 항체의 수준을 또한 실시예 24에 따라 치료 과정(28일) 전체 및 추가 2주 동안 측정하였다. 도 9는 서열번호 42의 인슐린-Fc-융합 단백질이 개에서 반복 피하 투여에 의해 항-약물 항체를 여전히 생성했지만, 항-약물 항체 역가가 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질에 의해 생성된 것보다 훨씬 더 낮음을 나타낸다(실시예 32).
실시예 37: 항-약물 항체를 포함하는 개 혈청의 스크리닝 및 인슐린 폴리펩타이드의 B10D 및 A8H 위치에서 잠재적 면역원성 에피토프의 확인.
개 IgGB Fc-단편의 cNg 부위를 Lys로 돌연변이시키면(즉, cNg-K), 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드 및 서열번호 11의 펩타이드 링커를 포함하는 인슐린 융합 단백질의 반복 투여 생활성이 개선되었으나(실시예 36), 생성된 서열번호 42의 인슐린-Fc-융합 단백질은 여전히 항-약물 항체를 발생시켰다(실시예 36). 따라서, 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드가 개의 면역계가 유도하는 특정 에피토프(즉, 면역원성 "핫스팟")를 예기치 않게 포함할 수 있다고 가정하였다. 따라서, 실시예 24에 기재된 혈청 샘플에 존재하는 항체의 결합 특이성을 실시예 27의 일반 절차에 따라 평가하였다. 코팅된 인슐린-Fc-융합 단백질 라이브러리에 대한 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질의 반복 투여로부터 항체-포함 혈청 샘플의 분석(실시예 32)은 서열번호 5의 인슐린 폴리펩타이드 서열 내에 존재하는 예기치 않은 2개의 주요 "핫스팟"이 있음을 나타내었다: B-사슬의 N-말단으로부터 10번째 위치 (즉, B1O)에서의 아스파르트산 돌연변이, 및 별도로 A-사슬의 N-말단 끝에서 8번째 위치(즉, A8)에 있는 히스티딘 돌연변이. 결과는 이들 2개의 특정 아미노산 돌연변이를 포함하는 인슐린 폴리펩타이드 아미노산 조성물을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질이 개에서 면역원성일 가능성이 있고 따라서 반복 주사 후 생활성을 중화시키는 항-약물 항체를 생성할 가능성이 있음을 시사한다. 따라서, 장기간에 걸쳐 개에게 반복적으로 투여해야 하는 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 B10 아스파라긴산 및 A8 히스티딘을 포함하지 않는 인슐린 폴리펩타이드가 바람직한 것으로 결정하였다(예를 들어, 개 당뇨병을 치료하기 위함).
실시예 38: 면역성의 잠재적 위험을 감소시키기 위해 인슐린 폴리펩타이드의 B10D 및 A8H 돌연변이가 천연 조성물로 복원된, 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드 및 비-글리코실화 개 IgGB 이소형 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질.
"핫스팟" 돌연변이를 대체하는 것이 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드 및 개 IgGB 이소형 단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 면역원성 및 반복 투여 생활성을 개선할 것인지를 평가하기 위해, 인슐린 폴리펩타이드의 B10 및 A8 아미노산이 각각 하기에 나열된 천연 히스티딘 및 트레오닌 조성(서열번호 63)으로 복원된 예시적인 인슐린-Fc-융합 단백질(서열번호 43)을 합성하였고, 비-천연 아미노산은 밑줄 표시되어 있다.
(서열번호 63).
또한, 비-글리코실화 cNg 돌연변이의 추가적인 잠재적 이점을 고려할 때, 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질은 cNg-Q 돌연변이를 포함한다. 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질의 전체 아미노산 서열은 다음과 같다:
(서열번호 43).
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고, 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 그 결과 단백질 수율은 21 mg/L에 불과하였다. 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 10에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같은 동종이량체%는 98.0%로서, 단백질에 응집체가 상대적으로 없음을 나타낸다.
21 mg/L의 비교적 낮은 동종이량체 역가에도 불구하고 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질을 각각 실시예 22, 실시예 23 및 실시예 23의 절차에 따라 개에서 생체내 생활성 및 면역원성에 대해 평가하였다. 도 10은 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질에서 그의 천연 아미노산에 대한 B10D 및 A8H 돌연변이(즉, B10H 및 A8T)의 복원이 모 화합물(서열번호 36)의 면역원성을 유의하게 감소시켰다는 것을 나타낸다.
그러나, 도 11에 도시된 바와 같이, 천연 B10 및 A8 아미노산을 포함하는 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질은 생활성이 아니었다(즉, NAOC는 필질적으로 0이었음).
실시예 39: 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 관련 인슐린-Fc-융합 단백질의 생활성을 개선하기 위해 서열번호 63의 인슐린 폴리펩타이드에 추가의 B-사슬 및 A-사슬 돌연변이를 혼입하려는 시도.
서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질이 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질(실시예 33)과 비교하여 항-약물 항체(실시예 38)를 생성하지 않았다는 사실은 서열번호 4의 인슐린 폴리펩타이드에서 B10D 및 A8H 돌연변이가 항-약물 항체의 생성에 관여하는 면역원성 에피토프일 가능성이 있다는 이론에 대해 강력한 증거를 제공한다. 그러나, 서열번호 36의 것과 비교하여 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 효능의 부재는 이들 2개의 아미노산 돌연변이가 또한 허용가능한 수준의 생활성 획득에 관여함을 나타낸다. 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 생체내 효능의 부재는 실시예 12의 방법에 따른 인슐린 수용체 결합 분석에 의해 측정된 높은 IC50(하기 표 9에 나타냄)과 상관관계가 있다. 따라서, 인슐린 폴리펩타이드에 천연 B10 및 A8 아미노산을 유지함으로써 낮은 정도의 면역원성을 유지하면서 인슐린-Fc-융합 단백질 생활성을 증가시키기 위한(즉, 인슐린 수용체 결합 분석 IC50 값을 5000 nM 미만, 또는 더욱 바람직하게는 4000 nM 미만, 또는 훨씬 더욱 바람직하게는 3000 nM 미만으로 감소시키기 위한) 추가의 노력이 필요했다.
인슐린 B-사슬 및 A-사슬의 다양한 부분이 IR에 대한 강한 결합에 필요한 것으로 알려져 있다(문헌[Hubbard S.R., "Structural biology: Insulin meets its receptor", Nature. 2013; 493(7431): 171-172]). 따라서 B10 및 A8을 천연 인슐린과 동일하게 유지하고 C-사슬 및 펩타이드 링커를 일정하게 유지하면서 B-사슬 또는 A-사슬의 일부를 변형시켰다. 몇몇의 이러한 인슐린-Fc-융합 단백질을 실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 제조하고, 실시예 4에 따라 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제하였다. 이의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 이의 동종이량체 함량 %를 실시예 10에 따라 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하고, 이의 인슐린 수용체 결합 친화도를 실시예 12에 따라 측정하였다. 이의 서열은 하기에 제시되어 있고, 서열번호 43에 대한 생성된 서열 정렬은 도 12에 도시되어 있다 (Clustal Omega).
(서열번호 44)
(서열번호 45)
(서열번호 46)
(서열번호 47)
(서열번호 48)
3개의 경우(서열번호 44, 서열번호 45, 및 서열번호 47)에서만 제안된 돌연변이가 서열번호 43과 비교하여 IR 결합을 개선하였다(즉, IC50 값을 저하시킴). 그러나 돌연변이 중 어느 것도 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가의 제조 설계 목적을 충족하는 화합물을 생성하지 않았으며 일부 경우에는 돌연변이로 인해 제조 가능성이 유의하게 감소했다(예를 들어, 20 mg/L 미만 동종이량체 역가).
실시예 40: 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 관련 인슐린-Fc-융합 단백질의 생활성을 개선하기 위해 서열번호 63의 인슐린 폴리펩타이드에 C-사슬 돌연변이를 혼입하려는 시도.
실시예 39에서 얻은 결과는 서열번호 63의 인슐린 폴리펩타이드의 A-사슬 및 B-사슬을 돌연변이시키려는 모든 시도가 관련 인슐린-Fc-융합체의 예상외의 낮은 HEK 동종이량체 역가(즉, 25 mg/L 이하의 동종이량체 역가)를 야기하였음을 보여준다. 따라서 추가 실험이 필요했다. 본 실시예에서는 서열번호 63의 인슐린 폴리펩타이드의 C-사슬 조성을 더 길게 제조하거나 가요성을 증가시켜 돌연변이를 유발하였다. 천연 인슐린(예를 들어, 인간 인슐린)은 인슐린 수용체에 결합할 때 B-사슬 및 A-사슬 접힘의 이동을 포함하는 유의한 입체형태적 변화가 진행된 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Menting, et al., Nature, 2013, 493(7431): pp241-245]). 천연 인슐린은 본 발명의 인슐린 폴리펩타이드와 달리 인슐린 수용체에서 이러한 입체형태적 변화가 자유롭게 진행될 수 있는데, 이는 천연 형태의 2사슬 폴리펩타이드이고 A- 및 B-사슬의 이동을 제한하는 C-사슬이 부재하는 2개의 이황화 결합을 통해서만 연결되기 때문이다. 임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 서열번호 63의 인슐린 폴리펩타이드 내에 포함된 C-사슬이 너무 가요성이고/거나(예를 들어, B-사슬와 A-사슬 사이의 용이한 이동을 가능하게 하지 않는 아미노산 조성 및 서열), 너무 짧어서(예를 들어, B-사슬의 C-말단과 A-사슬의 N-말단 사이에 아미노산이 충분하지 않음), 인슐린 폴리펩타이드가 인슐린 수용체에 대한 강한 결합을 위해 요구되는 필요한 분자 모양의 변화가 진행되는 것을 방지한다고 가정하였다. 따라서, 몇몇의 인슐린-Fc-융합 단백질은 도 13에 도시된 서열번호 43에 대한 생성된 서열 정렬과 함께 하기에 도시된 바와 같은 인슐린 폴리펩타이드 C-사슬의 변이를 갖는 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질에 기반하여 합성하였다(Clustal Omega).
(서열번호 49)
(서열번호 50)
(서열번호 51)
(서열번호 52)
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고, 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 실시예 6에 따라 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 이의 구조를 확인하였으며, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 이의 동종이량체 함량 %를 실시예 10에 따라 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였고, 이의 인슐린 수용체 결합 친화도를 실시예 12에 따라 측정하였다. 결과는 표 10에 제시된다. 가장 긴 C-사슬(
- 서열번호 71)을 포함하는 단 하나의 경우(서열번호 50), 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질과 비교하여 C-사슬 돌연변이는 인슐린 수용체 결합 친화도를 유의하게 개선시켰다(3000 nM 미만의 IC50). 그러나, 이들 C-사슬 돌연변이 인슐린-Fc-융합 단백질 중 어느 것도 제조 설계 목적인 50 mg/L 초과의 동종이량체 역가를 나타내지 않았다. 사실, 한 경우(서열번호 49)에서 C-사슬 돌연변이는 예기치 않게 유의하게 더 낮은 동종이량체 역가를 초래하였다.
실시예 41: 생활성을 개선시키기 위해 펩타이드 링커 돌연변이를 서열번호 63의 인슐린 폴리펩타이드 및 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질에 혼입하려는 시도.
임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질의 약한 인슐린 수용체 결합에 대한 또 다른 가능한 이유는 펩타이드 링커를 통해 인슐린 폴리펩타이드에 부착된 훨씬 더 큰 Fc-단편 분자의 근접성으로부터 초래되는 인슐린 폴리펩타이드와 인슐린 수용체 사이의 입체적 방해를 포함하는 것으로 고려된다. 더 짧은 펩타이드 링커 또는 더 단단히 접힌 펩타이드 링커는 잠재적으로 이 문제를 악화시키는 것으로 생각되며, 더 긴 펩타이드 링커 또는 자체 접힘에 내성이 있는 펩타이드 링커(예를 들어, 분자 강성이 더 큰 링커)는 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편 사이에 더 많은 공간을 생성하여 이 문제를 완화할 수 있다. 인슐린 폴리펩타이드와 Fc-단편 사이의 증가된 공간은 또한 인슐린 수용체와 Fc-단편 사이의 거리를 증가시켜 인슐린 수용체 결합 동안 간섭을 감소시킬 것이다. 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질을 작제하기 위해 사용된 서열번호 11의 펩타이드 링커(즉, 
)는 링커를 포함하는 아미노산이 측쇄를 포함하지 않기 때문에(즉, 글리신 및 알라닌 아미노산만 포함) 잠재적으로 너무 짧고/거나 너무 가요성인 것으로 가정하였다. 따라서, 이 가정을 시험하기 위해, 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질의 2개의 다른 인슐린-Fc-융합 단백질 변이체를 합성하였다. 서열번호 48의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질을 작제하는데 사용된 것과 동일하지만 A 사슬의 N-말단에서 21번째 위치(즉, A21)에 있는 아스파라긴이 부재하는(즉, des-A21) 인슐린 폴리펩타이드를 가진 펩타이드 링커를 포함하였다. 이 특정 돌연변이를 혼입시켜, A-사슬과 펩타이드 링커 사이의 접합부가 분자의 단백질 수율 및/또는 생활성에 영향을 미치는지를 확인하였다. 서열번호 53의 다른 인슐린-Fc-융합 단백질은 이 des-A21NA A-사슬 돌연변이와 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질을 작제하는데 사용된 길이의 두 배 이상인 펩타이드 링커를 포함한다. 이 더 긴 펩타이드 링커에서 알라닌은 유리하지 않으며 대신 극성 아미드 측쇄를 포함하는 글루타민으로 대체된다. 글루타민 치환은 펩타이드 링커의 친수성을 증가시키고 잠재적으로 링커가 자체적으로 접히는 것을 방지할 것으로 예상하였다. 서열은 도 14에 도시된 서열번호 43에 대한 생성된 서열 정렬과 함께 하기에 제시된다 (Clustal Omega).
(서열번호 53)
(서열번호 48)
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 2개의 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고, 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 이의 동종이량체 함량%를 실시예 10에 따라 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였고, 이의 인슐린 수용체 결합 친화도를 실시예 12에 따라 측정하였다. 결과가 표 11에 제공된다. 상이한 조성의 더 긴 펩타이드 링커(서열번호 53에 대한 
(서열번호 13) 대 서열번호 43에 대한 
(서열번호 11))의 혼입은 IC50 값의 유의한 감소에 의해 측정된 바와 같이, 인슐린 수용체 결합을 개선시켰으며, 이는 더 긴 링커가 다른 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 인슐린 수용체 결합을 증가시키기 위한 전략일 수 있음을 나타낸다. 그러나, 더 긴 링커의 혼입은 여전히 동종이량체 역가를 50 mg/L 초과의 제조 설계 목적 이상으로 개선하지 못했다.
실시예 42: 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 관련 인슐린-Fc-융합 단백질의 동종이량체 역가를 개선하기 위해 서열번호 63의 인슐린 폴리펩타이드의 B-사슬의 부분을 결실시키려는 시도.
실시예 41의 결과는 펩타이드 링커를 변형시켜, 천연 B10 및 A8 아미노산을 포함하는 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질의 인슐린 수용체 결합 친화도를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 그러나, 펩타이드 링커 돌연변이는 제조 설계 목적을 충족하기에 충분히 동종이량체 역가를 증가시키지 못했다. 동종이량체 역가는 세포내 합성 및 세포내 처리를 포함하는, 몇몇 특성의 기능이기 때문에, 예상컨대 인슐린-Fc 분자가 합성 동안 및 후에, 동종이량체의 2개의 단량체 사이의 분자간에 또는 2개 이상의 개별 동종이량체 사이의 분자간에, 자체 결합(즉, 응집)하는 것으로 가정하였다. 이러한 응집은 실시예 1, 실시예 4 및 실시예 10에 기재된 생성 과정 동안 세포 배양 상청액으로부터 얻은 동종이량체 역가를 허용할 수 없을 정도로 감소시킬 것이다. 인슐린-Fc-융합 단백질 분자 사이의 이러한 잠재적인 상호작용은 부분적으로 자체 결합하고 응집체를 형성하는 인슐린의 잘 알려진 경향으로 인한 것일 수 있다. 인슐린이 자체 결합하는 경향을 감소시키는 당업계에 공지된 한 방법은 B-사슬의 C-말단 근처의 아미노산을 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 인슐린 리스프로(lispro)(B28K; B29P 돌연변이) 및 인슐린 아스파르트(aspart)(B28D 돌연변이)는 결합 및 응집을 방지하여 용액 내에 주로 단량체 형태의 인슐린을 생성하는 비-천연 B-사슬 돌연변이를 갖는 잘 알려진 시판 2 사슬-인슐린이다. 응집을 방지하기 위한 또 다른 접근방식은 아미노산 구조적 결실을 포함한다. 예를 들어, 데스펜타펩타이드 인슐린(DPPI)으로 알려진 2 사슬-인슐린(DPPI; 문헌[Brange J., Dodson G.G., Edwards J., Holden P.H., Whittingham J.L. 1997b. "A model of insulin fibrils derived from the x-ray crystal structure of a monomeric insulin (despentapeptide insulin)" Proteins 27 507-516] 참조)은 B-사슬의 5개의 C-말단 아미노산(YTPKT)이 제거된 것을 제외하고 천연 2 사슬 인간 인슐린과 동일하다. DPPI는 천연 2 사슬 인간 인슐린과 비교하여 인슐린 수용체에 대한 결합 친화도가 더 낮지만 용액 중 완전히 단량체이며, 이는 DPPI 분자 사이에 유의한 결합 또는 응집이 없음을 의미한다. 따라서, 분자내 및 분자간 자체 결합의 가능성을 감소시키고 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체 역가를 개선하기 위한 시도에서, 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질의 수 개의 변이체를 DPPI, 인슐린 리스프로 및 인슐린 아스파르트에 대해 위에서 설명한 바와 같은 부분 B-사슬 아미노산 절단 및 B-사슬 아미노산 돌연변이를 사용하여 작제하였다. 서열은 도 15에 도시된 서열번호 43에 대한 생성된 서열 정렬과 함께 하기에 제시된다 (Clustal Omega).
(서열번호 51)
(서열번호 52)
(서열번호 54)
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 이의 동종이량체 함량 %를 실시예 10에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였고, 이의 인슐린 수용체 결합 친화도를 실시예 12에 따라 측정하였다. 결과는 표 12에 제공된다. 생성된 화합물의 동종이량체 역가는 1개의 경우(서열번호 51)에서만 유의하게 증가하였지만, 놀랍게도 모든 돌연변이 화합물(서열번호 51, 서열번호 54, 및 서열번호 52)에서 인슐린 수용체 친화도가 개선되었다.
실시예 43: 동종이량체 역가 및 생활성을 추가로 개선하기 위해 서열번호 43의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 B-사슬, C-사슬, 및 A-사슬 돌연변이, B-사슬 절단, 및 링커 돌연변이의 조합시도.
실시예 39, 실시예 40, 실시예 41 및 실시예 42에 나타낸 바와 같이, 비-면역원성 천연 B10 및 A8 아미노산을 포함하는 인슐린 폴리펩타이드를 개 IgGB Fc-단편과 성공적으로 혼입하여 허용 가능한 인슐린 수용체 활성 및 동종이량체 역가를 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질을 형성하는 단일 전략은 없었다. 따라서 더 긴 C-사슬, 더 긴 펩타이드 링커 및 B-사슬의 C-말단 아미노산 절단의 개념이 조합되었다. 또한, 잠재적으로 자체 결합 및 응집 경향을 추가로 감소시키기 위해 생리학적 pH에서 음전하 또는 양전하를 띠는 측기를 포함하는 소수성이 적은 아미노산을 사용하여 천연 인슐린 소수성 아미노산 잔기 부위에 추가 점 돌연변이를 도입했다. 돌연변이의 예로는 티로신에서 알라닌으로, 티로신에서 글루탐산으로, 이소류신에서 트레오닌으로, 페닐알라닌에서 히스티딘으로의 돌연변이가 포함된다. 또한 분석을 단순화하기 위해 모든 경우에 개 IgGB Fc-단편의 cNg 부위를 천연 아스파라긴으로 복원시켰다. 이들 인슐린-Fc-융합 단백질 변이체에 대한 서열은 도 16에 도시된 서열번호 43에 대한 생성된 서열 정렬과 함께 하기에 제시되어 있다 (Clustal Omega).
(서열번호 55)
(서열번호 56)
(서열번호 28)
(서열번호 26)
(서열번호 57)
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고, 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 실시예 6에 따라 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 이의 구조를 확인하였으며, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 이의 동종이량체 함량 %를 실시예 10에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였고, 이의 인슐린 수용체 결합 친화도를 실시예 12에 따라 측정하였다. 결과는 표 13에 제공된다. 결과는 특정 B-사슬 및 A-사슬 아미노산의 소수성을 감소시키고, 더 길고 더 가요성인 C-펩타이드 서열을 사용하고, 몇몇 C-말단 B-사슬 아미노산을 절단하고, 더 긴 펩타이드 링커를 사용하는 것을 조합하여, 최소 동종이량체 역가 및 인슐린 수용체 결합 활성 설계 기준을 충족하는 몇몇의 유용한 인슐린-Fc-융합 단백질을 생성했음을 보여준다. 서열번호 56, 서열번호 28, 서열번호 26 및 서열번호 57은 서열번호 43 또는 서열번호 55보다 더욱 바람직한 인슐린 수용체 IC50 값(3000 nM 미만) 및 더욱 바람직한 HEK 동종이량체 역가 값(100 mg/ L 초과)을 나타내었다. 놀랍게도, 단지 소수의 아미노산을 변경하면 인슐린 수용체 친화도의 다중 개선을 유도하고, 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질의 경우, 서열번호 43의 원래 인슐린-Fc-융합 단백질에 비해 동종이량체 역가의 극적인 증가를 초래하였다.
실시예 44: 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 펩타이드 링커, 및 서열번호 15의 개 IgGB Fc-단편으로부터 작제된 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 생활성, 반복 투여 생활성 및 면역성.
실시예 43의 양성 동종이량체 역가 및 인슐린 수용체 결합 활성 결과를 감안할 때, 가장 유망한 인슐린-Fc-융합 단백질 중 2개(서열번호 26 및 서열번호 28)를 개에서 시험하여 반복 투여 생활성 및 면역원성을 평가하였다. 각 화합물은 서열번호 13의 더 길고 더 친수성인 펩타이드 링커와 서열번호 15의 고 제조 가능성 저 응집성의 개 IgGB Fc-단편을 포함한다. 가장 중요한 것은 두 인슐린-Fc-융합 단백질이 추정상 면역원성이 적은 천연 면역원성 천연 B10 및 A8 아미노산을 갖는 인슐린 폴리펩타이드(즉, 일반 서열번호 6)를 포함한다는 것이다. 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질의 경우, 위치 A21에 아스파라긴이 존재한다(즉, 인슐린 폴리펩타이드는 서열번호 8을 포함함). 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질의 경우, 위치 A21에 아스파라긴이 존재하지 않는다(즉, 인슐린 폴리펩타이드는 서열번호 7을 포함함).
서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 생활성을 실시예 21의 절차에 따라 N=1 개에서 시험하였다. 단일 피하 투여에 대한 도 17에 제시된 결과는 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질이 실시예 22의 절차에 따라 계산된 1076 FBGL%·일·kg/mg의 NAOC로 실제로 생체내에서 생활성임을 보여준다. 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질의 약동학적 프로파일을 ELISA를 사용하여 실시예 23의 방법에 의해 측정하고, 2-구획 모델을 데이터에 적용하여, 이의 제거 반감기가 3.5일인 것으로 결정하였다.
이어서, 실시예 15의 절차에 따라 초기 주사 후 14일, 28일 및 42일째에 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질을 N=1 개에게 계속해서 피하 투여함으로써 반복 투여 생활성을 평가하였다. 개의 FBGL%이 너무 낮게 떨어졌을 때, 개에게 혈당을 안전한 수준으로 증가시키기 위해 사료를 제공하였다. NAOC 및 NAOCR을 실시예 22의 일반 절차에 따라 각 후속 투여에 대해 측정하고, 이를 투여량이 투여된 시간부터 다음 투여량이 투여되기 직전까지 계산하였다. 표 14에 나타낸 NAOC 및 NAOCR은 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질이 4회 투여에 걸쳐 0.8 초과의 NAOCR을 유지하여 반복 투여 생활성 설계 목적을 충족함을 나타낸다.
실시예 24의 절차에 따라 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질의 면역원성을 시험하였다. 도 18은 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질이 반복 투여 실험 전반에 걸쳐 생체내 생활성의 유지와 일치하여 생체내에서 명백한 면역원성을 나타내지 않음을 보여준다.
인슐린 폴리펩타이드 사슬의 A21에 아스파라긴이 존재하지 않는 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질을 또한 개에서 반복 투여 생활성 기능에 대해 평가하였다. 화합물을 실시예 22의 절차에 따라 0일, 14일, 28일 및 42일째에 N=1개의 개에게 피하 투여하였다. 개의 FBGL%이 너무 낮게 떨어졌을 때, 개에게 혈당을 안전한 수준으로 증가시키기 위해 사료를 제공하였다. 1차 주사에 대한 NAOC는 인상적인 2278 FBGL%·일·kg/mg으로, 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질이 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질의 거의 두 배의 효능으로 생체내에서 만족스럽게 생활성을 나타냄을 보여준다. 인슐린-Fc-융합 단백질의 약동학적 프로파일을 ELISA를 사용하여 실시예 23의 방법에 의해 측정하고, 2-구획 모델을 적용하여, 이의 제거 반감기를 4.1 ± 0.7일인 것으로 결정하였다. 도 19 및 도 20은 서열번호 26의 동종이량체를 투여받은 동물에 대한 단일 투여 혈당 조절 및 다회 투여의 수주간의 혈당 제어를 나타낸다. NAOC 및 NAOCR을 또한 실시예 22의 일반 절차에 따라 각 후속 투여에 대해 측정하고, 이를 투여량이 투여된 시간에서 다음 투여량이 투여되기 직전까지 계산하였다. 표 15에 나타낸 NAOC 및 NAOCR은 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질이 4회 투여량에 걸쳐 1.0 이상의 NAOCR을 유지하여 실시예 29에 기재된 반복 투여 생활성 설계 목적을 충족함을 나타낸다.
실시예 24의 절차에 따라 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질의 면역원성을 시험하였다. 도 21은 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질이 반복 투여 실험 전반에 걸쳐 생체내 생활성의 유지와 일치하여 생체내에서 명백한 면역원성을 나타내지 않음을 보여준다.
본 발명의 상세한 설명에서 논의된 바와 같이, 알려진 효소 절단 부위는 아스파라긴-글리신 결합 사이에 존재한다(문헌[Vlasak, J., Ionescu, R., (2011) MAbs Vol. 3, No. 3 pp 253-263]). 서열번호 13의 펩타이드 링커와 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질에 포함된 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드에서 A 사슬의 21번째 아미노산(즉, A21)의 아스파라긴이 누락되면, A-사슬의 C-말단과 펩타이드 링커의 N-말단 사이의 아스파라긴-글리신 결합의 효소적 절단 가능성이 제거된다. 그러나, 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 13의 펩타이드 링커와 서열번호 8의 인슐린 폴리펩타이드를 포함하며, 이는 A21에서 아스파라긴을 유지한다. 따라서, 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질은 합성 동안 또는 피하 투여 후 생체내에서 효소적으로 분해될 것으로 예상되었을 것이다. 그러나, 오히려 예기치 않게 서열번호 28의 인슐린-Fc-융합 단백질은 그의 생활성을 손상시키는 효소 분해의 징후 없이 허용가능한 동종이량체 역가를 갖는 HEK 세포에서 제조가능하고 생체내에서 허용가능한 생활성을 나타내었다.
실시예 45: 바람직한 서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드 및 바람직한 서열번호 13의 펩타이드 링커를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 최적 제조 가능성 및 생체내 효능에 대한 개의 IgGB 이소형 Fc-단편의 확인.
실시예 43 및 실시예 44에 기재된 바와 같이 비-면역원성, 고수율, 고순도 및 고생활성 인슐린-Fc-융합 단백질을 생성하는 신규한 인슐린 폴리펩타이드 및 펩타이드 링커 조합을 발견했지만, 실시예 32 및 실시예 33의 인슐린-Fc-융합 단백질의 경우에서와 같이 개 IgGB Fc-단편이 동종이량체 역가 및 생활성과 관련하여 여전히 바람직한 이소형인지에 관해 여전히 의문이 남아 있었다. 따라서, 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질의 인슐린 폴리펩타이드(서열번호 7) 및 펩타이드 링커(서열번호 13)를 일관되게 유지하고, 서열번호 15의 개 IgGB Fc-단편을 서열번호 14의 개 IgGA Fc-단편, 서열번호 16의 개 IgGC Fc-단편, 또는 서열번호 17의 개 IgGD Fc-단편으로 대체한 추가의 인슐린-Fc-융합 단백질을 설계하였다. 이들 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질 변이체에 대한 서열은 하기에 제시되어 있다:
(서열번호 26)
(서열번호 58)
(서열번호 59)
(서열번호 60).
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고, 실시예 4에 따라 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 이용하여 정제하였다. 실시예 6에 따라 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 이의 구조를 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 이의 동종이량체 함량 %를 실시예 10에 따라 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였고, 이의 인슐린 수용체 결합 친화도를 실시예 12에 따라 측정하였다. 또한, 실시예 15에 따라 개 FcRn 수용체에 대한 인슐린-Fc-융합 단백질 친화도를 측정하였다. 표 16에 나타난 바와 같이, 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질이 이러한 서열 중 가장 높은 동종이량체 역가를 나타내었다. 개 IgGA Fc-단편을 포함하는 서열번호 58의 인슐린-Fc-융합 단백질은 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제할 때 부적절한 동종이량체 역가를 나타내었으나; 단백질 G 컬럼을 사용하여 정제한 경우 동종이량체 역가가 유의하게 개선되어 50 mg/L 초과의 설계 목적을 초과했다. 개의 IgGC Fc-단편을 포함하는 서열번호 59의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해서도 마찬가지였다. 개의 IgGD Fc-단편을 포함하는 서열번호 60의 인슐린-Fc-융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼으로 정제될 때 어떠한 화합물도 생성하지 않았다. 따라서, 상이한 인슐린 폴리펩타이드(서열번호 4) 및 펩타이드 링커(서열번호 11)를 포함하는 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질로 입증된 바와 같이, 개의 IgGB가 동종이량체 역가와 관련하여 바람직한 Fc-단편이었다(실시예 32 참조).
단백질 G를 통해 정제된 개 IgGA Fc-단편을 포함하는 서열번호 58의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 생활성을 실시예 21의 절차에 따라 시험하였다. 결과는 도 22에 도시하였으며, 서열번호 58의 인슐린-Fc-융합 단백질이 실시예 22에 따라 계산된 단지 174 FBGL%·일·kg/mg의 NAOC로 생체내에서 다소 생활성임을 보여준다.
개 IgGC Fc-단편을 포함하는 서열번호 59의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 생활성을 실시예 21의 절차에 따라 시험된 단백질 G를 통해 정제하였다. 도 23은 서열번호 59의 인슐린-Fc-융합 단백질이 실시예 22에 따라 계산된 단지 39 FBGL%·일·kg/mg의 NAOC로 생체내에서 다소 생활성임을 보여준다.
따라서, 상이한 인슐린 폴리펩타이드(서열번호 4 및 펩타이드 링커(서열번호 11)를 포함하는 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질로 입증된 바와 같이, 개 IgGB가 생활성과 관련하여 바람직한 Fc-단편이었다(위의 실시예 32 및 실시예 33 및 표 16 참조).
실시예 46: 면역원성의 잠재적 위험을 감소시키기 위한 서열번호 8의 인슐린 폴리펩타이드, 서열번호 13의 펩타이드 링커, 및 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 비-글루코실화 인슐린-Fc-융합 단백질.
서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질이 모든 설계 목적을 충족하지만(실시예 28), 연장된 치료 기간(예를 들어, 6개월, 1년, 2년 이상))에 걸쳐 면역원성의 위험이 있을 수 있거나 없을 수 있거나, 당뇨병 치료를 위한 이 인슐린-Fc-융합 단백질의 사용을 손상시킬 수 있다. 본 발명의 상세한 설명과 실시예 34 및 실시예 35에 기재된 바와 같이, 반복 투여 후 생활성 감소의 가능한 원인 중 하나는 개 IgGB Fc-단편과 개의 면역계의 부적절한 상호작용으로 중화 항 - 약물 항체의 생성이 초래된다는 것이다. 그러나, 실시예 45에 나타난 결과는 예기치 않게 개의 IgGB 이소형이 적절한 제조 가능성 및 생활성을 산출하는 4개의 개 IgG 이소형 중 유일한 옵션임을 보여준다. 따라서, 장기간의 만성 면역원성 위험을 감소시켜야 하는 낮은 Fc(감마)RI 수용체 결합을 나타내는 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질을 달성하기 위해 추가의 Fc-돌연변이를 연구하였다.
본 발명의 상세한 설명에 기재된 바와 같이, Fc(감마)RI 상호작용을 감소시키는 한 방법은 숙주 세포에서 합성 동안 글리코실화를 방지하기 위해 Fc-단편 cNg 부위를 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 따라서, 실시예 15에 기재된 시험관내 인간 Fc(감마)RI 분석에서 결합에 의해 측정한 바와 같이, 생체내에서 Fc(감마) 수용체에 대한 Fc-단편의 결합 친화도를 감소시키기 위해 서열번호 26의 Fc-단편 영역에 cNg 부위 돌연변이를 발생시켰다. 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질에서 cNg 부위의 위치는 cNg-NB151이다. 서열번호 26에 대한 돌연변이는 cNg-NB151-S 돌연변이를 포함하는 서열번호 62 및 동일한 cNg-NB 151-S 돌연변이 및 NB 119-A 돌연변이를 포함하는 서열번호 61을 포함하였다. 문헌[Lo, M. et al. "Effector attenuating substitutions that maintain antibody stability 및 reduce toxicity in mice", J. Biol. Chem. (2017), pp. 1-20]에 의해 마우스 항체에서의 사용에 대해서만 기재된 바와 같이 Fc(감마)RI와의 상호작용을 감소시키기 위한 추가 시도에서 NB 119-A를 혼입하였다. 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질의 전체 아미노산 서열은 도 24에 도시된 그의 서열 정렬(Clustal Omega)과 함께 하기에 나열된다(명확성을 위해 NB119 및 NB151 부위는 밑줄 표시됨):
(서열번호 61)
(서열번호 62).
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 이의 동종이량체 함량%를 실시예 10에 따라 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였고, 이의 인슐린 수용체 결합 친화도를 실시예 12에 따라 측정하였다. 표 17에 나타난 바와 같이, Fc-단편에 cNg-NB151-S 돌연변이를 혼입하면 동종이량체 %가 감소하며, 이는 허용할 수 없을 정도로 높은 수준의 응집을 나타낸다(즉, 동종이량체%가 70% 바로 위까지 떨어짐).
서열번호 61 및 서열번호 62의 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 생활성을 실시예 21의 절차에 따라 각각 N=1의 개에서 시험하였다. 단일 피하 투여에 대한 도 25에 도시된 결과는 두 화합물이 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질보다 생체내에서 생활성이 유의하게 더 낮음을 보여준다(서열번호 62에 대한 NAOC = 574 FBGL%·일·kg/mg; 서열번호 61에 대한 NAOC = 921 FBGL%·일·kg/mg). 결과는 서열번호 26의 인슐린-Fc-융합 단백질의 글리코실화되지 않은 형태를 생성하기 위해 Fc-단편에 cNg-NB151-S 돌연변이를 혼입하면 생성된 화합물의 생체내 생활성이 예기치 않게 감소한다는 것을 나타낸다.
cNg-NB151-S 부위 돌연변이를 포함하는 서열번호 62의 인슐린-Fc-융합 단백질의 응집 정도를 감소시키고 생활성을 개선하기 위한 시도로, 다양한 인슐린-폴리펩타이드 B-사슬 변이체를 응집에 관여하는 것으로 생각되는 영역의 돌연변이에 의해 조사하였다. 실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질을 제조하고, 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 이의 동종이량체 함량%를 실시예 10에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 시험된 B-사슬 변이체 중에, B-사슬의 N-말단으로부터 16번째 아미노산(즉, B16)에서 티로신에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 하나의 인슐린-Fc-융합 단백질(서열번호 30)은 예기치 않게 높은 동종이량체 역가(105 mg/L)와 낮은 응집(99% 동종이량체)을 나타내어, 그 결과 104 mg/L의 동종이량체 역가를 갖는 것으로 나타났다. 실시예 12에 따라 측정된 인슐린 수용체 결합은 2040 nM의 IC50으로 허용가능하였다. 실시예 16에 따라 측정한 FcRn 수용체 결합 친화도 EC50 값은 1194 ng/mL였다. 서열번호 30의 인슐린-Fc-융합 단백질의 약동학적 프로파일을 ELISA를 사용하여 실시예 23의 방법에 의해 측정하고, 2-구획 모델을 데이터에 적용하여, 이의 제거 반감기를 4.1 ± 0.7일로 결정하였다. 서열번호 30의 서열은 하기에 제시되어 있다(명확성을 위해 B16A 및 cNg-NB151-S 돌연변이에 밑줄 표시됨).
(서열번호 30).
이어서, 서열번호 30의 인슐린-Fc-융합 단백질을 개에서 반복 투여 생활성 기능에 대해 평가하였다. 화합물을 실시예 22의 절차에 따라 0일, 7일, 14일 및 28일에 N=1의 개에 피하 투여하였다. 개의 FBGL%이 너무 낮게 떨어졌을 때, 개에게 혈당을 안전한 수준으로 증가시키기 위해 사료를 제공하였다. 예상외로, 서열번호 62의 인슐린-Fc-융합 단백질과 비교하여, B16A 돌연변이를 포함하는 서열번호 30의 인슐린-Fc-융합 단백질의 1차 주사에 대한 NAOC는 유의하게 더 높았다(1185 FBGL%·일·kg/mg). 1차 투여 생체내 생활성 그래프가 도 26에 도시되어 있다. 화합물의 약동학적 프로파일을 또한 ELISA를 사용하여 실시예 23의 방법에 의해 측정하고, 2-구획 모델을 데이터에 적용하여, 이의 제거 반감기를 3.5일로 결정하였다. NAOC 및 NAOCR을 또한 실시예 22의 일반적인 절차에 따라 각각의 후속 투여에 대해 측정하고, 이를 투여량이 투여된 시간부터 다음 투여량이 투여되기 직전까지 계산하였다. 표 18에 나타낸 NAOC 및 NAOCR은 서열번호 30의 인슐린-Fc-융합 단백질이 4회 투여량에 걸쳐 0.6 이상의 NAOCR을 유지하여 반복 투여 생활성 설계 목적을 충족함을 나타낸다. 종합하면, 결과는 서열번호 26의 적합한 비-글리코실화 cNg-S 변이체를 얻기 위해 인슐린 B-사슬 서열을 돌연변이시킬 필요가 있음을 나타낸다. 따라서, 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드가 cNg-돌연변이 개 IgGB Fc-단편을 포함하는 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질을 위해 바람직하였다.
마지막으로, 선택된 화합물을 실시예 15의 절차에 따라 Fc(감마) 수용체 결합 활성을 측정함으로써 면역계와 상호작용할 가능성에 대해 시험하였다. 표 19는 이들 인슐린-Fc-융합 단백질과 Fc(감마) 수용체 I 결합을 서열번호 36의 인슐린-Fc-융합 단백질과 Fc(감마) 수용체 결합과 비교한 것이다. 글리코실화되지 않은 인슐린-Fc-융합 단백질(cNg-S 돌연변이를 통해 달성됨)이 서열번호 36에 대한 가장 낮은 Fc(감마) 수용체 결합 비율을 나타내었다는 것을 알 수 있다.
실시예 47: 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 통해 제조된 개 IgGB 유래의 Fc-단편을 포함하는 바람직한 인슐린-Fc-융합 단백질을 사용한 예시적인 CHO-기반 생성 구동.
서열번호 26 또는 서열번호 30을 인코딩하는 벡터로 안정적으로 형질감염된 별도의 CHO 세포주를 실시예 2에 기재된 바와 같이 작제하였다. 유가식 진탕 플라스크 14일 생성 구동(0.5 내지 2.0 L 배지 규모)을 37℃ 및 5% 이산화탄소로 설정된 인큐베이터-진탕기에서 5x105 세포/mL로 시딩하고, 성장 배지로서 Dynamis를 CD OptiCHO로 대체하고(ThermoFisher), Efficient Feed C(ThermoFisher)를 사료로 사용한 것을 제외하고는 위의 실시예 2에 기재된 대로 구동을 수행했다. 생성 구동 3일째부터 사료를 3% v/v로 첨가하고 4일째에 진탕 플라스크 온도를 32℃로 조정하고 인큐베이터 진탕기 이산화탄소 농도를 5%에서 2%로 낮추었다. 구동 동안, 세포는 8 내지 14x106 세포/mL 사이로 증가했고, 14일째에 생성 구동을 수확하여 세포를 제거하고 배양 상청액을 정제하고 시험하여 실시예 4, 실시예 6, 실시예 8 및 실시예 10에 기재된 바와 같이 인슐린-Fc-융합 단백질을 얻었다. 표 20은 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 사용한 생성 구동에서 얻은 제조 데이터를 기재한다.
실시예 48: 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 통해 제조된 개 IgGB 유래의 Fc-단편을 포함하는 바람직한 인슐린-Fc-융합 단백질을 사용한 예시적인 CHO-기반 생성 구동.
서열번호 28을 인코딩하는 벡터로 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 실시예 2에 기재된 바와 같이 작제한다. 유가식 진탕 플라스크 14일 생성 구동(0.5 내지 2.0 L 배지 규모)을 37℃ 및 5% 이산화탄소로 설정된 인큐베이터-진탕기에서 5x105 세포/mL로 시딩하고, 성장 배지로서 Dynamis를 CD OptiCHO로 대체하고(ThermoFisher), Efficient Feed C(ThermoFisher)를 사료로 사용한 것을 제외하고는 위의 실시예 2에 기재된 대로 구동을 수행했다. 생성 구동 3일째부터 사료를 3% v/v로 첨가하고 4일째에 진탕 플라스크 온도를 32℃로 조정하고 인큐베이터 진탕기 이산화탄소 농도를 5%에서 2%로 낮추었다. 14일째에 생성 구동을 수확하여 세포를 제거하고 배양 상청액을 정제하고 시험하여 실시예 4, 실시예 6, 실시예 8 및 실시예 10에 기재된 바와 같이 인슐린-Fc-융합 단백질을 얻었다. 생성된 생성 구동은 서열번호 28의 200 mg/L 초과의 단백질 수율, 95% 초과 동종이량체, 및 190 mg/L 초과의 동종이량체 역가를 제공할 것으로 예상된다.
결과 - 인간 Fc-단편을 포함하는 인슐린-FC 융합 단백질
실시예 49: 인간 Fc IgG1 및 IgG2 이소형의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질.
서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드 서열 및 인간 IgG2 이소형(서열번호 74)의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질을 서열번호 13의 펩타이드 링커를 이용하여 생성하고자 하였다. 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질의 전체 아미노산 서열은 다음과 같다:
(서열번호 75).
서열번호 7의 인슐린 폴리펩타이드 서열 및 인간 IgG1 이소형(서열번호 73)의 Fc-단편을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질을 서열번호 13의 펩타이드 링커를 사용하여 생성하기 위한 추가의 시도가 이루어졌다. 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질의 전체 아미노산 서열은 다음과 같다:
(서열번호 76).
서열번호 75 및 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 실시예 1에 따라 HEK 세포에서 합성하고 실시예 4에 따라 정제하였다. 총 단백질 수율은 각각의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대한 2개의 개별 합성 및 단백질 A 정제 단계 후 표 21에 나타낸 바와 같은 평균 동종이량체 역가를 제공하였다. 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거를 이용하여 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 10에 따라 크기-배제 크로마토그래피를 수행하고 하기 표 21에 나타낸 바와 같이 결정하였다. 요약하면, HEK 세포에서 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질의 제조는 150 mg/L 초과의 동종이량체 역가의 설계 목적을 충족시키는 허용가능한 응집체 및 동종이량체 역가 수준을 초래하고, HEK 세포에서 서열번호 75의 인슐린-Fc-융합 단백질의 제조는 동종이량체 역가 설계 목적을 충족하지 못했다.
다음으로, 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질을 생체내 생활성에 대한 가능성에 대해 평가하였다. 먼저, 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질의 IR 결합을 실시예 12에 따라 측정하였고, 그 결과 화합물이 생체내에서 생활성일 가능성이 있음을 나타내는(즉, 2400 nM 미만의 IC50) 1799 nM의 IC50 값이 나타났다. FcRn 분석 EC50 값은 578 ng/mL이었고, 이는 개 스크리닝 연구(예를 들어, 실시예 28에 기재된 바와 같음) 또는 인간 당뇨병 환자에서 측정할 때 연장된 생체내 생활성 프로파일을 가질 가능성이 높음을 나타낸다.
다음으로, 실시예 14 및 실시예 16의 방법으로 Fc(감마)RI 및 C1q에 대한 각 화합물의 시험관내 결합을 측정하여 부적절한 면역원성 가능성에 대한 경향을 스크리닝하였다. 서열번호 75는 각각 0.045 및 0.309의 Fc(감마)RI 및 C1q 분석 OD450 비율(OD450 비율에서 참조 인슐린-Fc-융합 단백질은 서열번호 76임)은 서열번호 75의 동종이량체가 Fc(감마)RI 결합(0.50 미만의 분석 OD450 비율) 및 C1q 결합(0.35 미만의 분석 OD450 비율)에 대한 설계 목적(실시예 29)을 충족했음을 나타낸다. 그러나, 상술한 바와 같이, HEK 세포에서 서열번호 75의 인슐린-Fc-융합 단백질의 수율은 동종이량체 역가 설계 목적을 충족시키지 못했다.
실시예 50: 인간 IgG1 이소형을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc-단편 영역의 cNg 돌연변이.
서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질의 FcRn 수용체에 대한 동종이량체 함량%, IR 결합 친화도 및 허용 가능한 결합 친화도를 유지하기 위한 시도에서, Fc(감마)RI 및 C1q에 대한 결합을 감소시키기 위해, cNg-S 돌연변이를 Fc-단편 CH3 영역에 삽입하여, 다음과 같은 서열번호 91의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하였다:
(서열번호 91).
서열번호 91의 비-글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 실시예 1에 따라 HEK 세포에서 합성하고, 실시예 4에 따라 정제하고, 실시예 6, 실시예 8, 실시예 10, 실시예 12, 실시예 14 및 실시예 16에 따라 시험하였고, 결과는 서열번호 76의 모 글리코실화 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 결과와 함께 총 단백질 수율, 동종이량체% 및 동종이량체 역가를 나타내는 표 22에 나타낸 바와 같다. 결과는 서열번호 76의 인간 IgG1 Fc-단편 내의 cNg-S 돌연변이가 서열번호 91의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 야기하는 것이 Fc(감마)RI 친화도 및 C1q 친화도의 바람직한 감소를 초래하였음을 보여준다. 서열번호 91의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 동종이량체 역가는 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 동종이량체 역가에 비해 유의하게 증가하였다. 동종이량체 역가의 개선에도 불구하고, 서열번호 91의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 2400 nM 초과(2400 nM 미만의 설계 기준 외부)의 서열번호 76의 것보다 실질적으로 더 높은(즉, 더 낮은 IR 친화도) IR 분석 IC50 값을 제공했으며, 이는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 허용 가능한 효능을 나타내거나 설계 목적을 충족할 가능성이 없음을 나타낸다(실시예 29).
실시예 51: 돌연변이된 인슐린 폴리펩타이드(서열번호 10), 링커(서열번호 13), 및 cNg-S 돌연변이가 있는 Fc IgG1 이소형을 사용한 인간 인슐린-Fc-융합 단백질.
상기 기재된 바와 같이, cNg-S, IgG1 이소형 Fc-단편 돌연변이는 Fc(감마)RI 및 C1q에 대한 친화도가 유의하게 감소된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하였지만, 이러한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 IR 수용체 친화도가 허용할 수 없을 정도로 낮았다(즉, 2400 nM 초과의 IC50 값). 따라서, 돌연변이가 개선된 IR 친화도를 유도하는지 알아보기 위한 노력의 일환으로 인슐린 폴리펩타이드에 대한 돌연변이를 발생시키고, 생성된 물질을 IR IC50 분석에 대해 스크리닝하였다. 티로신에서 알라닌으로의 전환을 B-사슬의 N-말단으로부터 16번째 아미노산(즉, B16A)에 유발시켜, 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드를 제공하였다. 서열번호 10의 돌연변이된 인슐린 폴리펩타이드 및 펩타이드 링커 서열번호 13을 X1이 S인 서열번호 77의 cNg 돌연변이된 Fc-단편과 함께 사용하여, 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하였다. 실시예 15에 기재된 시험관내 인간 Fc(감마)RI 분석에서 결합에 의해 측정된 바와 같이, 생체내에서 Fc(감마) 수용체에 대한 Fc-단편의 결합 친화도를 감소시키기 위해 Fc-단편 영역에 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 cNg-S 돌연변이를 유발하였다. 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질에서 cNg-S 부위의 위치는 cNg 부위에서 "N"에서 "S"로의 돌연변이를 포함하는 cNg-NB155이다.
서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 제조하고, 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제하였다. 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 구조를 실시예 6에 따라 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 확인하고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거의 부재 하에 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. 서열번호 78의 화합물 MW를 효소적 탈글리코실화의 부재 하에 실시예 8의 LC-MS 방법에 의해 평가하였다. 서열번호 78의 표적 질량은 65046.9 Da이고, 측정된 질량은 65046.7 Da로, 서열번호 78의 화합물 아미노산 조성과 동종이량체 구조가 정확함을 확인시켜주었다.
동종이량체%를 실시예 10에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. cNg-돌연변이 인슐린-Fc-융합 단백질의 전체 아미노산 서열은 하기에 나열되어 있다(NB155 위치에 밑줄 표시됨):
(서열번호 78).
서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 생성된 총 단백질 수율, 동종이량체%, 및 동종이량체 역가는 표 23에 제공되며, 서열번호 76 및 서열번호 91의 것과 비교되어 있다. 비-글리코실화 cNg-S 돌연변이된 인슐린-Fc-융합 단백질과 함께 인슐린 폴리펩타이드 서열에 B16A 돌연변이를 포함하면 서열번호 76에 비해 동종이량체 역가가 개선되었다. 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 시험관내 IR 결합을 실시예 12의 절차에 따라 시험하였다. 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질에 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드에 B16A 돌연변이를 포함시키면 인슐린 폴리펩타이드가 B16E 돌연변이(서열번호 7)를 포함하는 서열번호 91과 비교하여 IR 친화도가 유의하게 개선되었다(즉, 더 낮은 IR IC50 분석 값). 상이한 인슐린-Fc-융합 단백질(US 10,597,435의 서열번호 3)에서 이러한 B16A 돌연변이가 5000 nM 초과의 IR IC50 분석 값을 제공하고 생체내에서 글루코스-저하 생활성을 나타내지 않았다는 점을 고려할 때 이는 특히 놀라운 것이다. 아미노산 서열의 차이가 표시된 서열번호 76, 서열번호 78 및 서열번호 91의 서열 정렬을 도 27에 나타내었다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
또한, 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질의 인슐린 폴리펩타이드에 B16A 돌연변이를 포함시키면(서열번호 10을 초래함) 실시예 19의 절차에 의해 측정된 바와 같이 허용가능한 FcRn 결합이 유도하였으며, 이는 이 인슐린-Fc-융합 단백질이 생체내에서 연장된 약동학적 반감기를 나타내고 생체내에서 연장된 글루코스-저하 생활성 프로파일을 나타낼 가능성이 있음을 나타낸다. 서열번호 78에 대한 FcRn 결합 친화도는 B16A 돌연변이를 포함하지 않는 유사한 인슐린-Fc-융합 단백질(서열번호 91)보다 더 크고(FcRn 결합 분석에서 더 낮은 EC50에 의해 나타나는 바와 같음), 이는 B16A 돌연변이의 포함이 IR 수용체 친화도 외에 FcRn 수용체 친화도에 예기치 않게 영향을 미친다는 것을 추가로 강조함에 유의한다. 더 높은 FcRn 친화도는 종종 생체내에서 더 긴 치료 약동학적 반감기와 상관관계가 있기 때문에 FcRn 수용체 친화도의 이러한 점진적인 증가는 바람직할 수 있다고 고려된다.
Fc(감마)RI 및 C1q 결합 특성을 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 실시예 14 및 실시예 16의 방법에 의해 측정하였고, 이는 허용가능한 것으로 나타났다. C1q 결합 친화도는 또한 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 훨씬 더 낮았고, 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질에 비해 C1q 결합의 80% 초과 감소를 보였다. 따라서, 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질은 제조 가능성, 생체내 효능, 연장된 생체내 생활성 및 낮은 면역원성에 대한 설계 목적(실시예 29)를 충족하였다.
실시예 52: 인간 IgG1 이소형을 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 Fc-단편 영역의 대안적인 cNg 돌연변이.
서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 유사한 동종이량체 함량% 및 IR 결합 친화도를 유지하면서 연장된 생체내 생활성 및 면역원성에 대한 낮은 잠재성 및 FcRn 수용체에 대한 허용 가능한 결합 친화도를 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 생성하기 위한 추가 시도로서, Fc(감마)RI 및 C1q에 대한 결합을 감소시키기 위한 시도로서, 교대 cNg 돌연변이를 Fc-단편 CH3 영역에 삽입하여 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94 및 서열번호 95를 생성하였다. 실시예 1에 따라 HEK 세포에서 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태를 합성하고, 실시예 4에 따라 정제하고, 실시예 6, 실시예 8, 실시예 10, 실시예 12, 실시예14 및 실시예 16에 따라 시험하였고, 그 결과는 표 24에 나타낸 바와 같다. 아미노산 서열의 차이를 강조 표시한 것으로서, 서열번호 75, 서열번호 76 및 서열번호 91에 대한 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 및 서열번호 95의 서열 정렬을 도 28에 나타내었다(Clustal Omega). "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 대한 전체 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있으며, cNg 돌연변이에 밑줄 표시되어 있다.
(서열번호 92)
(서열번호 93)
(서열번호 94)
(서열번호 95).
서열번호 77의 인간 IgG1 Fc-단편을 포함하는 상기 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태(상기 서열에서, X1은 D, A, R 및 Q임)는 서열번호 76과 함께 표 24에 열거되어 있으며, 상응하는 총 단백질 수율, 동종이량체% 및 동종이량체 역가가 제시되어 있다. 결과는 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94 및 서열번호 95에 대한 인간 IgG1 Fc-단편 내에 포함된 cNg 부위에 대한 다양한 돌연변이가 Fc( 감마)RI 친화도 및 Clq 친화도를 적절하게 저하시켰음을 보여준다. 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94의 동종이량체 역가는 서열번호 76에 비해 유의하게 증가하였다. 서열번호 95의 동종이량체 역가는 너무 낮아서 설계 목적을 충족하지 않았으며(실시예 29) 따라서 인슐린 수용체 결합을 평가하지 않았다. 동종이량체 역가의 개선에도 불구하고, 서열번호 92, 서열번호 93, 및 서열번호 94는 모든 경우에 IR 분석 IC50 값이 2400 nM 초과였고, 서열번호 76의 것보다 실질적으로 더 높았다(즉, 더 낮은 IR 친화도). 모든 경우에 IR 분석 IC50 값은 2400 nM 미만의 설계 기준보다 더 컸으며, 이는 이러한 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태가 허용 가능한 효능 및 산물 비용을 나타내지 않을 가능성이 있음을 나타낸다. 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 및 서열번호 95 중 어느 것도 설계 목적을 충족하지 않는다(실시예 29).
실시예 53: 인슐린 폴리펩타이드(서열번호 10), 링커(서열번호 13), 및 다양한 cNg 돌연변이를 포함하는 Fc IgG1 이소형을 사용한 인간 인슐린-Fc-융합 단백질 .
상기 기재된 바와 같이, cNg-부위, IgG1 이소형 Fc-단편 돌연변이는 Fc(감마)RI 및 C1q에 대해 유의하게 감소된 친화도를 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질을 생성하지만, 이들 화합물은 허용될 수 없을 정도로 낮은 IR 수용체 친화도를 갖는다(즉, 2400nM 초과의 IC50 값). 따라서, 서열번호 78에서 인슐린 폴리펩타이드에 생성된 동일한 돌연변이(티로신에서 알라닌으로의 전환을 B-사슬의 N-말단로부터 16번째 아미노산(즉, B16A)에서 유발시켜, 서열번호 10의 인슐린 폴리펩타이드를 제공함)를 유발시키고, 생성된 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 IR IC50 분석에 대해 스크리닝하여 돌연변이된 인슐린 폴리펩타이드 중 임의의 것이 개선된 IR 친화도를 유도하는지 확인하였다. 서열번호 10의 돌연변이된 인슐린 폴리펩타이드 및 서열번호 13의 펩타이드 링커를 사용하여 하기 제시된 바와 같은 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 및 서열번호 86의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 제조하였다. 이들 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태 각각은 실시예 15에 기재된 바와 같은 시험관내 인간 Fc(감마)RI 분석에서 결합에 의해 측정되는 바와 같이, Fc(감마) 수용체에 대한 Fc-단편의 결합 친화도를 감소시키기 위해 Fc-단편에 유발된 cNg 부위 돌연변이를 포함한다. 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 및 서열번호 86의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 cNg 부위의 위치는 cNg-NB155이다. 서열번호 80의 인슐린-Fc-융합 단백질은 cNg 부위에서 "N"에서 "D"로의 돌연변이를 포함한다. 서열번호 82의 인슐린-Fc-융합 단백질은 cNg 부위에서 "N"에서 "A"로의 돌연변이를 포함한다. 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질은 cNg 부위에서 "N"에서 "R"로의 돌연변이를 포함한다. 서열번호 86의 인슐린-Fc-융합 단백질은 cNg 부위에서 "N"에서 "Q"로의 돌연변이를 포함한다.
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 단백질을 제조하였다. 놀랍게도, B16A 돌연변이와 함께 cNg-NB155-Q 돌연변이를 포함하는 서열번호 86의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대한 동종이량체 역가는 동종이량체 역가에 대한 설계 목적을 충족하는데 필요한 것보다 유의하게 더 낮았다. 이어서, 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 사용하여 서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 정제하였다. 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하였고, 실시예 8에 따라 글리칸 제거의 부재 하에 LC-MS에 의해 서열을 추가로 확인하였다. 서열번호 80의 인슐린-Fc-융합 단백질의 화합물 MW를 효소적 탈글리코실화의 부재 하에 실시예 8의 LC-MS 방법에 의해 평가하였다. 서열번호 80의 표적 질량은 65102.9 Da이고, 측정된 질량은 65102.8 Da로, 서열번호 80의 화합물 아미노산 조성과 동종이량체 구조가 정확함을 확인시켜 주었다. 서열번호 82의 인슐린-Fc-융합 단백질의 화합물 MW를 효소적 탈글리코실화의 부재 하에 실시예 8의 LC-MS 방법에 의해 평가하였다. 서열번호 82의 표적 질량은 65014.9 Da이고, 측정된 질량은 65014.9 Da로, 서열번호 82의 화합물 아미노산 조성 및 동종이량체 구조가 정확함을 확인시켜 주었다. 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질의 화합물 MW를 효소적 탈글리코실화의 부재 하에 실시예 8의 LC-MS 방법에 의해 평가하였다. 서열번호 84의 표적 질량은 65185.1 Da이고, 측정된 질량은 65184.8 Da로, 서열번호 84의 화합물 아미노산 조성 및 동종이량체 구조가 정확함을 확인시켜 주었다.
동종이량체%를 실시예 10에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. cNg-돌연변이 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 전체 아미노산 서열은 하기에 나열되어 있고(서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 및 서열번호 86, NB155 위치에 밑줄 표시됨), 생성된 서열 정렬이 도 29의 서열번호 76 및 서열번호 78에 대해 도시되어 있다(Clustal Omega). "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
(서열번호 80)
(서열번호 82)
(서열번호 84)
(서열번호 86).
생성된 총 단백질 수율, 동종이량체%, 및 동종이량체 역가는 표 25에 제공된다. 비-글리코실화 cNg가 돌연변이된 인슐린 폴리펩타이드 서열의 B16A 돌연변이를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 서열번호 86을 제외하고 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태는 서열번호 76에 비해 동종이량체 역가를 개선시켰다. cNg-NB155-D 조성물은 222 mg/L에서 가장 높은 동종이량체 역가를 나타내었다. 인슐린-Fc-융합 단백질에 대한 시험관내 IR 결합을 실시예 12의 절차에 따라 시험하였다. 서열번호 78의 경우에서와 같이, 서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태의 인슐린 폴리펩타이드 내로 B16A 돌연변이를 포함시키면 인슐린 폴리펩타이드가 B16E 돌연변이를 포함하는 서열번호 92, 서열번호 93, 및 서열번호 94의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태와 비교하여 IR 친화도의 유의한 개선(즉, 더 낮은 IR IC50 분석 값)이 초래되었다.
또한, 서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질의 인슐린 폴리펩타이드에 B16A 돌연변이를 포함함으로써 실시예 19의 절차에 의해 측정된 바와 같은 이러한 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태에 대한 허용가능한 FcRn 결합을 유도하였으며, 이는 이러한 화합물이 연장된 생체내 약동학적 반감기를 나타내고 연장된 생체내 글루코스-저하 생활성 프로파일을 나타낼 가능성이 있음을 시사한다. B16A 돌연변이를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 84)에 대한 FcRn 결합 친화도가 B16A 돌연변이를 포함하지 않는 유사한 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(서열번호 92, 서열번호 93, 및 서열번호 94)보다 유의하게 더 크다는 것이 주목하고(예를 들어, FcRn 결합 분석에서 더 낮은 EC50), 이는 B16A 돌연변이를 포함시키면 IR 수용체 친화도 이외에 FcRn 수용체 친화도에 예기치 않은 영향을 미침을 추가로 추가로 강조한다. 이러한 증분 증가 FcRn 수용체 친화도는 바람직할 수 있는데, 그 이유는 더 높은 FcRn 친화도가 종종 생체내에서 더 긴 치료 약동학적 반감기와 상관관계가 있기 때문이다.
Fc(감마)RI 및 C1q 결합 특성을 서열번호 80, 서열번호 82 및 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에 대해 실시예 14 및 실시예 16의 방법에 의해 측정하였으며, 이는 허용 가능한 것으로 나타났다. 추가로, Fc(감마)RI 결합 친화도는 cNg-NB155-R(서열번호 84) 돌연변이로 매우 유의하게 감소하여, 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질에 비해 Fc(감마)RI 결합의 80% 초과 감소를 나타냈다. C1q 결합 친화도는 또한 서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질에 대해 훨씬 더 낮았고, 이러한 모든 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태는 서열번호 76의 인슐린-Fc-융합 단백질에 비해 C1q 결합의 80% 초과 감소를 나타내었다. 따라서, 서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 82의 인슐린-Fc-융합 단백질은 제조 가능성, 생체내 효능, 연장된 생체내 생활성 및 낮은 면역원성에 대한 설계 목적(실시예 29)을 충족했다.
실시예 54: 인슐린 폴리펩타이드 서열번호 10, cNg-S 돌연변이를 포함하는 Fc IgG1 이소형, 및 다양한 링커를 갖는 인간 인슐린-Fc-융합 단백질.
상기 기재된 바와 같이, cNg 부위에서의 IgG1 이소형 Fc-단편 돌연변이 및 인슐린 폴리펩타이드 상의 돌연변이는 IR, FcRn, Fc(감마)RI 수용체 및 C1q 결합을 포함하는 물질 특성의 예상치 못한 변화를 야기하였다. 링커 조성물이 이러한 특성에 어떻게 영향을 미쳤는지 더 잘 이해하기 위해, 서열번호 10의 B16A-돌연변이 인슐린 폴리펩타이드, cNg 돌연변이를 갖는 글리코실화되지 않은 hlgG1 Fc-단편 (서열번호 77, X1은 S임) 및 서열번호 13의 링커 서열을 포함하는 특정 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태(서열번호 78)를 시작점으로 선택하였고, 링커 길이 및 조성이 하기 표 26에 나타난 바와 같이 변형되었다.
서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 87, 및 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질 실시양태를 실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 제조하였다. 이어서, 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 실시예 4에 따른 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제하였다. 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 구조를 비환원 및 환원 CE-SDS에 의해 실시예 6에 따라 확인하고고, 서열을 실시예 8에 따라 글리칸 제거 부재 하에 LC-MS에 의해 추가로 확인하였다. PNGase F 처리 단계를 생략하고 실시예 8의 LC-MS 방법을 사용하여 글리칸 부재의 검증을 수행하였다. 서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 화합물 MW를 효소적 탈글리코실화 부재 하에 실시예 8의 LC-MS 방법에 의해 평가하였다. 표적 질량은 64704.6 Da이고 측정된 질량은 64704.4 Da로 서열번호 87의 화합물 아미노산 조성과 동종이량체 구조가 정확함을 확인시켰다. 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 화합물 MW를 효소적 탈글리코실화 부재 하에 실시예 8의 LC-MS 방법에 의해 평가하였다. 표적 질량은 63279.2 Da이고 측정 질량은 63278.8 Da로 서열번호 89의 화합물 아미노산 조성 및 동종이량체 구조가 정확함을 확인시켰다.
동종이량체%를 실시예 10에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 시험관내 IM-9 IR 결합 IC50을 실시예 12에 기재된 바와 같이 측정하고, Fc(감마) 수용체 결합 친화도를 실시예 15에 기재된 바와 같은 시험관내 인간 Fc(감마)RI 분석을 사용하여 측정하고, 실시예 16에 기재된 바와 같이 Clq 결합 친화도를 측정하고, 실시예 19에 기재된 바와 같이 인간 FcRn 수용체에 대한 친화도를 측정하였다. 결과를 표 27에 제공하였다.
생성된 인슐린-Fc-융합 단백질의 전체 아미노산 서열은 아래에 나열되어 있다(cNg-S 위치에 밑줄 표시됨). 도 30 (Clustal Omega)은 서열번호 87, 서열번호 96, 서열번호 78, 서열번호 97, 서열번호 89, 및 서열번호 98의 병렬 서열 비교를 나타낸다. "*"은 소정의 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타내고, ";", "." 또는 공백은 각각 소정의 서열 위치에서 서열에 걸쳐 보존적, 보통 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 나타낸다.
(서열번호 87)
(서열번호 96)
(서열번호 97)
(서열번호 89)
(서열번호 98).
결과는 링커가 부재하는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서 인슐린 폴리펩타이드의 C-말단이 Fc-단편(서열번호 98)의 N-말단에 직접 연결되어 있고, 동종이량체 역가는 허용할 수 없을 정도로 낮음(즉, 38 mg/L)을 나타낸다. 적어도 9개의 아미노산 길이를 포함하는 글리신-글루타민 링커 조성물(서열번호 97, 서열번호 78, 및 서열번호 96)을 갖는 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태에서, 링커 길이에 따라 달라지는 물리화학적 특성의 임의의 유의한 경향이 없는 것으로 나타났다. 글리신-알라닌 조성물의 링커를 포함하는 서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태와 글리신-글루타민 조성물의 링커를 포함하는 서열번호 78의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 비교하면, 21개 아미노산의 동일한 링커 길이에 대해, 서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태가 개선된 동종이량체 역가, 더 강한 IR 결합 및 더 강한 FcRn 결합을 나타내면서 거의 동일한 Fc(감마)RI 및 C1q 결합 특성을 나타나는 것으로 제시된다. 따라서, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호87, 및 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태는 모두 설계 목적을 충족시켰지만(실시예 29), 서열번호 87의 동종이량체가 바람직한 실시양태이다.
실시예 55: B16A 인슐린 폴리펩타이드 돌연변이, cNg-NB155-X 부위 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 이소형 Fc-단편, 및 링커(서열번호 13)를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 효능.
실시예 53의 적절한 동종이량체 역가, IR 활성 및 FcRn 활성 결과를 감안할 때, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질은 체중이 대략 10 kg인 N=3의 건강한 항체 부재 비글 개 각각에 피하 주사한 후 실시예 22에 따라 생체내 생활성에 대해 시험한다. 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 84의 각각의 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 피하 투여에 대한 시간에 대한 FBGL%의 그래프를 작도하였고, FBGL% 대 시간 데이터는 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 및 서열번호 84의 인슐린-Fc-융합 단백질이 개에서 유의하게 생활성임을 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 56: B16A 인슐린 폴리펩타이드 돌연변이, cNg-NB155-S 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 이소형 Fc-단편, 및 링커(서열번호 11)를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 효능.
실시예 54의 적절한 동종이량체 역가, IR 활성 및 FcRn 활성 결과를 감안할 때, 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질은 체중이 대략 10 kg인 N=3의 건강한 항체 부재 비글 개 각각에 피하 주사한 후 실시예 22에 따라 생체내 생활성에 대해 시험한다. 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 피하 투여에 대한 시간에 대한 FBGL%의 그래프를 작도하였고, FBGL% 대 시간 데이터는 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질이 개에서 유의하게 생활성임을 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 57: B16A 인슐린 폴리펩타이드 돌연변이, cNg-NB155-S 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 이소형 Fc-단편, 및 링커(서열번호 67)를 포함하는 인슐린-Fc-융합 단백질의 생체내 효능.
실시예 54의 적절한 동종이량체 역가, IR 활성 및 FcRn 활성 결과를 감안할 때, 서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질은 체중이 대략 10 kg인 N=3의 건강한 항체 부재 비글 개 각각에 피하 주사한 후 실시예 22에 따라 생체내 생활성에 대해 시험한다. 서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 피하 투여에 대한 시간에 대한 FBGL%의 그래프를 작도하였고, FBGL% 대 시간 데이터는 서열번호 87의 인슐린-Fc-융합 단백질이 개에서 유의하게 생활성임을 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 58: 안정하게 형질감염된 CHO 세포주를 통해 제조된 인간 IgG1 유래의 Fc-단편을 포함하는 바람직한 인슐린-Fc-융합 단백질을 사용한 예시적인 CHO-기반 생성 구동.
서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 87 및 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태를 인코딩하는 벡터로 안정적으로 형질감염된 분리된 CHO 세포주를 실시예 2에 기재된 대로 작제한다. 유가식 진탕 플라스크 14일 생성 구동(0.5 내지 2.0 L 배지 규모)을 37℃ 및 5% 이산화탄소로 설정된 인큐베이터-진탕기에서 5x105 세포/mL로 시딩하고, 성장 배지로서 Dynamis를 CD OptiCHO로 대체하고(ThermoFisher), Efficient Feed C(ThermoFisher)를 사료로 사용한 것을 제외하고는 위의 실시예 2에 기재된 대로 구동을 수행한다. 생성 구동 3일째부터 사료를 3% v/v로 첨가하고 4일째에 진탕 플라스크 온도를 32℃로 조정하고 인큐베이터 진탕기 이산화탄소 농도를 5%에서 2%로 낮춘다. 구동 동안, 세포는 8 내지 14x106 세포/mL 사이로 증가하고, 14일째에 생성 구동을 수확하여 세포를 제거하고 배양 상청액을 정제하고 시험하여 실시예 4, 실시예 6, 실시예 8 및 실시예 10에 기재된 바와 같이 인슐린-Fc-융합 단백질을 얻는다. 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 사용한 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 87 및 서열번호 89의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 개별 생성 구동으로부터의 제조 및 시험관내 시험 데이터는 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 얻은 것보다 더 큰 동종이량체 역가를 나타내고, IR, FcRn 수용체, Fc(감마)RI 수용체 결합 및 C1q 결합 특성은 설계 목적을 충족시킬 것으로 예상된다 (실시예 29).
실시예 59: 마우스에서 인간 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 투여 후 생체내 약역학(PD).
인슐린-Fc-융합 단백질을 공복 혈당 수준에 대한 효과에 대해 다음과 같이 평가하였다. 데이터를 그룹당 N=3 balb/c 마우스 또는 당뇨병 wt NOD 마우스(Jackson Laboratories)에서 수집하였다. 실험 1시간 전에 동물을 금식시킨 후 시간 = 0시간에 수산화나트륨 및/또는 염산을 사용하여 조정된 최종 용액 pH 7.0 내지 8.0에서 10 내지 50 mM 인산수소나트륨, 50 내지 150 mM 염화나트륨, 0.005 내지 0.05% v/v Tween-80, 및 선택적으로 0.02 내지 1.00 mg/mL의 농도의 정균제(예를 들어, 페놀, m-크레졸 또는 메틸파라벤)의 용액에서 300 μg/kg의 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도에서 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체를 포함하는 약제학적 조성물을 마우스에 1회 피하 투여하였다.
각 시점에 대해 혈액 샘플을 수집하고 약 한 방울의 혈액이 필요한 글루코스 측정기(AlphaTRAK® 2 pet glucometer)를 사용하여 글루코스 수준 판독값을 즉시 결정했다. 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 생활성을 평가하기 위해 0 내지 9시간의 평균 공복 혈당 수준%(FBGL%)을 작도하였다. 서열번호 87 및 서열번호 89의 단일 피하 투여에 대한 도 38에 도시된 결과는 마우스에서 두 화합물 모두 유의한 생활성을 나타냄을 보여준다.
실시예 60: 마우스에서 인간 인슐린-Fc-융합 단백질의 단일 투여 후 생체내 약역학(PD).
인슐린-Fc-융합 단백질을 공복 혈당 수준에 대한 효과에 대해 다음과 같이 평가하였다. 데이터를 그룹당 N=3 balb/c 마우스 또는 당뇨병 wt NOD 마우스(Jackson Laboratories)에서 수집한다다. 실험 1시간 전에 동물을 금식시킨 후 시간 = 0시간에 수산화나트륨 및/또는 염산을 사용하여 조정된 최종 용액 pH 7.0 내지 8.0에서 10 내지 50 mM 인산수소나트륨, 50 내지 150 mM 염화나트륨, 0.005 내지 0.05% v/v Tween-80, 및 선택적으로 0.02 내지 1.00 mg/mL의 농도의 정균제(예를 들어, 페놀, m-크레졸 또는 메틸파라벤)의 용액에서 300 μg/kg의 인슐린-Fc-융합 단백질의 농도에서 인슐린-Fc-융합 단백질 동종이량체를 포함하는 약제학적 조성물을 마우스에 1회 피하 투여한다.
각 시점에 대해 혈액 샘플을 수집하고 약 한 방울의 혈액이 필요한 글루코스 측정기(AlphaTRAK® 2 pet glucometer)를 사용하여 글루코스 수준 판독값을 즉시 결정한다. 소정의 인슐린-Fc-융합 단백질 입체형태의 생활성을 평가하기 위해 0 내지 9시간의 평균 공복 혈당 수준%(FBGL%)을 작도한다. 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 또는 서열번호 84의 단일 피하 투여는 마우스에서 두 화합물 모두 유의한 생활성을 나타냄을 보여준다.
실시예 61: 예시적 인슐린-Fc-융합 단백질 도메인 및 서열.
상기 실시예에 사용된 예시적 인슐린-Fc-융합 단백질 아미노산 서열 및 상응하는 DNA 서열은 도 31, 도 32, 도 33, 도 34, 도 35, 도 36 및 도 37에 도시되어 있다.
균등물
청구범위에서, 단수형 ("a", "an" 및 "the") 관사는 반대로 나타내거나 문맥상 달리 명확하지 않는 한 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"이 포함된 청구항 또는 설명은 반대로 나타내거나 문맥상 달리 명확하지 않는 한 그룹 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 모두가 소정의 산물 또는 과정에 존재하거나 사용되거나 달리 관련이 있는 경우 충족된 것으로 고려된다. 본 개시내용은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 소정의 산물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않으면 이와 관련된 실시양태를 포함한다. 본 개시내용은 그룹 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 소정의 산물 또는 과정에 존재하거나 사용되거나 달리 관련된 실시양태를 포함한다.
또한, 본 개시내용은 열거된 청구항 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 절 및 설명 용어가 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함한다. 예를 들어, 다른 청구항에 종속된 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속된 임의의 다른 청구항에 존재하는 하나 이상의 제한을 포함하도록 수정될 수 있다. 예를 들어, 마쿠시 그룹 형식에서 요소가 목록으로 표시되는 경우, 요소의 각 하위 그룹이 또한 공개되며 임의의 요소(들)는 그룹에서 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용 또는 본 개시내용의 양상/양상들이 특정 요소 및/또는 특징을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 개시내용의 특정 실시양태 또는 본 개시내용의 양상은 그러한 요소 및/또는 특징을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어짐이 이해되어야 한다. 단순함을 위해, 이러한 실시양태는 본 명세서에 구체적으로 제시되지 않았다. 또한 용어 "~(들)를 포함하다", "~를 포함하는", "~(들)를 포괄하나" 및 "~를 포괄하는"은 공개된 것으로 의도되고 이의 사용은 추가 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 점에 유의한다. 범위가 제공되는 경우, 한계 점이 포함된다. 더욱이, 달리 표시되거나 문맥상 달리 명확하고, 당업자에 의해 이해되는 한, 범위로 표시된 값은 본 개시내용의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 문맥상 달리 명시하지 않는 한 범위의 하한 단위의 10분의 1까지 가정할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> AKSTON BIOSCIENCES CORPORATION
<120> ULTRA-LONG ACTING INSULIN-FC FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE
<130> ABC-038US
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human insulin B-chain
<400> 1
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human insulin A-chain
<400> 2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 3
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human ProInsulin
<400> 3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 4
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin Polypeptide
<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin Polypeptide
<220>
<221> Xaa
<222> (10)..(10)
<223> Xaa is not D
<220>
<221> Xaa
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<223> Xaa is not H
<220>
<221> Xaa
<222> (58)..(58)
<223> Xaa is absent or N
<400> 5
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa
50 55
<210> 6
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin Polypeptide
<220>
<221> Xaa
<222> (58)..(58)
<223> Xaa is absent or N
<400> 6
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa
50 55
<210> 7
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin Polypeptide
<400> 7
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin Polypeptide
<400> 8
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55
<210> 9
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin Polypeptide
<220>
<221> Xaa
<222> (10)..(10)
<223> Xaa is not D
<220>
<221> Xaa
<222> (45)..(45)
<223> Xaa is not H
<400> 9
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55
<210> 10
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin Polypeptide
<400> 10
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly
20
<210> 14
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc Fragment dIgGA
<400> 14
Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile
20 25 30
Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His
50 55 60
Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys
85 90 95
Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu
100 105 110
Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser
130 135 140
Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu
145 150 155 160
Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr
165 170 175
Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala
195 200 205
Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser
210 215 220
His Ser Pro Gly
225
<210> 15
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc Fragment dIgGB
<400> 15
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr
85 90 95
Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
165 170 175
Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 16
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc Fragment dIgGC
<400> 16
Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg
20 25 30
Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro
35 40 45
Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala
50 55 60
Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe
85 90 95
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile
100 105 110
Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln
165 170 175
Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro
210 215 220
Gly
225
<210> 17
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc Fragment dIgGD
<400> 17
Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys
85 90 95
Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln
165 170 175
Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro
210 215 220
Gly
225
<210> 18
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc Fragment dIgGB-cNg-S
<400> 18
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys
50 55 60
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr
85 90 95
Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
165 170 175
Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 19
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1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
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<221> Xaa
<222> (10)..(10)
<223> Xaa is not D
<220>
<221> Xaa
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<223> Xaa is not H
<220>
<221> Xaa
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<400> 20
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35 40 45
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Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp
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<213> Artificial Sequence
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<223> Insulin-Fc Fusion Protein
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<213> Artificial Sequence
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<223> Insulin-Fc Fusion Protein
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<223> cDNA for Insulin-Fc Fusion Protein
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ctgcccagcc ccatcgagag gaccatcagc aaggccaggg gccaggccca ccagccatct 660
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ctctacagca aattgagcgt tgacaaaagc aggtggcagc gaggcgacac cttcatctgc 900
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ggatag 966
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 32
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 33
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Ala
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Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met
275 280 285
His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser
290 295 300
Pro Gly
305
<210> 59
<211> 303
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 59
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Cys Asn
65 70 75 80
Asn Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
85 90 95
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro
100 105 110
Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val
115 120 125
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr
130 135 140
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
145 150 155 160
Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys
165 170 175
Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser
180 185 190
Lys Thr Pro Gly Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro
195 200 205
Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val
210 215 220
Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly
225 230 235 240
Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 60
<211> 303
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 60
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ile
65 70 75 80
Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
165 170 175
Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile
210 215 220
Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly
225 230 235 240
Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 61
<211> 302
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 61
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Ala Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
165 170 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
210 215 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
245 250 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 62
<211> 302
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 62
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
165 170 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
210 215 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
245 250 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 63
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin Polypeptide
<400> 63
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 65
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly
<210> 66
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 66
Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Lys Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly
<210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly
20
<210> 68
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 68
Ser Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly
20
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 69
His Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly
20
<210> 70
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 70
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gln Gly Gly Gly Gly Gly
20
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-Chain
<400> 71
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-Chain
<400> 72
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 73
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc Fragment hIgG1
<400> 73
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 74
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc Fragment hIgG2
<400> 74
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 75
<211> 299
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 75
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
85 90 95
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
100 105 110
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
115 120 125
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
130 135 140
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
145 150 155 160
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
165 170 175
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
180 185 190
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
210 215 220
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
245 250 255
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
260 265 270
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
275 280 285
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 76
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 76
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys
65 70 75 80
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
85 90 95
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
100 105 110
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
115 120 125
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
130 135 140
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
145 150 155 160
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
165 170 175
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
180 185 190
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
195 200 205
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
210 215 220
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
225 230 235 240
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
245 250 255
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
260 265 270
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
275 280 285
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 77
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc Fragment hIgG1 Consensus
<220>
<221> Xaa
<222> (77)..(77)
<223> Xaa is S,D,A,R or Q
<400> 77
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 78
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 78
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys
65 70 75 80
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
85 90 95
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
100 105 110
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
115 120 125
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
130 135 140
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val
145 150 155 160
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
165 170 175
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
180 185 190
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
195 200 205
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
210 215 220
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
225 230 235 240
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
245 250 255
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
260 265 270
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
275 280 285
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 79
<211> 972
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA for Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 79
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggcactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg agacaaaact 300
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 360
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 420
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 480
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca gcagcacgta ccgtgtggtc 540
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 600
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 660
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 720
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 780
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 840
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 900
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 960
tctccgggtt ag 972
<210> 80
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 80
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
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260 265 270
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
275 280 285
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 93
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 93
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys
65 70 75 80
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
85 90 95
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
275 280 285
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295 300
<210> 94
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 94
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
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50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Insulin-Fc Fusion Protein
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1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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225 230 235 240
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290 295 300
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Insulin-Fc Fusion Protein
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Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
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Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
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Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
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305
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<211> 292
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 97
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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50 55 60
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275 280 285
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 98
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
50 55 60
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
65 70 75 80
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
85 90 95
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
100 105 110
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
115 120 125
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
130 135 140
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
145 150 155 160
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
165 170 175
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
180 185 190
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
195 200 205
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
210 215 220
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
225 230 235 240
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
245 250 255
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
260 265 270
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
275 280
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<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 99
Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly
20 25
<210> 100
<211> 972
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA for Insulin-Fc Fusion Protein
<400> 100
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60
gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggcactcgt gtgcggcgag 120
cggggcttcc actacggggg tggcggagga ggttctggtg gcggcggagg catcgtggaa 180
cagtgctgca cctccacctg ctccctggac cagctggaaa actactgcgg tggcggaggt 240
ggtcaaggag gcggtggaca gggtggaggt gggcagggag gaggcggggg agacaaaact 300
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 360
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 420
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 480
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtacc aaagcacgta ccgtgtggtc 540
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 600
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 660
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 720
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 780
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 840
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 900
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 960
tctccgggtt ag 972
Claims (40)
- 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편을 포함하는 융합 단백질(fusion protein)로서, 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편은 링커(linker)에 의해 연결되고, 융합 단백질은 다음 서열을 포함하는, 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편을 포함하는 융합 단백질:
(서열번호 87). - 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편을 포함하는 융합 단백질로서, 인슐린 폴리펩타이드 및 Fc-단편은 링커에 의해 연결되고, Fc-단편은 인간 유래(human origin)이고, 다음 서열을 포함하고:
(서열번호 77)
(상기 서열에서, X1은 S, D, A, 또는 R이다),
인슐린 폴리펩타이드는 C-사슬(C-chain)을 통해 인슐린 A-사슬 유사체(analog)에 연결된 인슐린 B-사슬 유사체로 이루어지고, 인슐린 폴리펩타이드의 인슐린 B-사슬 유사체의 N-말단으로부터 16번째 아미노산 (즉, B16)은 알라닌인 (즉, B16A), 융합 단백질. - 제2항에 있어서, 인슐린 폴리펩타이드는 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 9)
(상기 서열에서, X1은 D가 아니고, X2는 H가 아니다). - 제3항에 있어서, 인슐린 폴리펩타이드는 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 10). - 제2항에 있어서, 링커는 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 67). - 제2항에 있어서, 링커는 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 13). - 제6항에 있어서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 78). - 제6항에 있어서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 80). - 제6항에 있어서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 82). - 제6항에 있어서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 84). - 제2항에 있어서, 링커는 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 11). - 제11항에 있어서, 융합 단백질은 다음 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(서열번호 89). - 제2항에 있어서 N-말단에서 C-말단으로 하기 배향의 도메인(domain): (N-말단) - 인슐린 폴리펩타이드 - 링커 - Fc-단편 - (C-말단)을 포함하는, 융합 단백질.
- 제2항에 있어서, 융합 단백질은 동종이량체(homodimer)인, 융합 단백질.
- 제1항, 제7항, 제8항, 제9항, 제10항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 동종이량체인, 융합 단백질.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 융합 단백질의 동종이량체 백분율은 90% 초과인, 융합 단백질.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 융합 단백질은 HEK293 세포 또는 CHO 세포 중 하나를 사용하여 제조되고, 단백질 A 비드(Protein A bead) 또는 단백질 A 컬럼(column)을 사용한 정제 후 생성된 동종이량체 역가(titer)는 150 mg/L 초과인, 융합 단백질.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 융합 단백질의 인슐린 수용체 IC50은 5000 nM 이하인, 융합 단백질.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 융합 단백질의 인슐린 수용체 IC50은 2400 nM 이하인, 융합 단백질.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 융합 단백질의 인간 FcRn 수용체 EC50은 1000 ng/mL 이하인, 융합 단백질.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 3000 ng/mL의 융합 단백질의 비오티닐화(biotinylated)-Fc(감마)RI 농도에서의 인간 Fc(감마)RI 수용체 분석 OD450 비율(Ratio)은 0.50 이하인, 융합 단백질.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 1000 ng/mL의 비오티닐화-Clq 농도에서의 인간 Clq 분석 OD450 비율은 0.35 이하인, 융합 단백질.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 융합 단백질은 약제학적 조성물로 제형화되는, 융합 단백질.
- 제23항에 있어서, 융합 단백질은 약제학적 조성물에서 약 3 mg/mL 이상의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
- 제23항에 있어서, 조성물은 피하 투여에 적합한, 약제학적 조성물.
- 환자의 혈당 수준(blood glucose level)을 저하시키는 방법으로서, 본 방법은 생리학적 유효량의 제14항 또는 제15항의 융합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 환자는 당뇨병으로 진단되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 융합 단백질은 피하 투여되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 융합 단백질은 환자에게 매일, 1주 2회 또는 1주 1회 투여되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 융합 단백질은 0.025 내지 0.5 mg/kg/주의 용량(dose)으로 환자에게 매주 1회 투여되는, 방법.
- 제1항, 제7항, 제8항, 제9항, 제10항 또는 제12항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하도록 조작된 세포.
- 제31항에 있어서, 세포는 융합 단백질을 인코딩(encoding)하는 핵산으로 형질감염되는, 세포.
- 제31항에 있어서, 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포인, 세포.
- 제2항의 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA.
- 다음 핵산 서열을 포함하는 서열번호 87의 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA:
(서열번호 88). - 다음 핵산 서열을 포함하는 서열번호 78의 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA:
(서열번호 79). - 다음 핵산 서열을 포함하는 서열번호 80의 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA:
(서열번호 81). - 다음 핵산 서열을 포함하는 서열번호 82의 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA:
(서열번호 83). - 다음 핵산 서열을 포함하는 서열번호 84의 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA:
(서열번호 85). - 다음 핵산 서열을 포함하는 서열번호 89의 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA:
(서열번호 90).
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