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KR20220113728A - 항 클라우딘 항체 약물 접합체 및 그 의약 용도 - Google Patents

항 클라우딘 항체 약물 접합체 및 그 의약 용도 Download PDF

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KR20220113728A
KR20220113728A KR1020227022162A KR20227022162A KR20220113728A KR 20220113728 A KR20220113728 A KR 20220113728A KR 1020227022162 A KR1020227022162 A KR 1020227022162A KR 20227022162 A KR20227022162 A KR 20227022162A KR 20220113728 A KR20220113728 A KR 20220113728A
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KR
South Korea
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seq
val
thr
leu
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KR1020227022162A
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양 양.
지안얀 쑤
웨이캉 타오
Original Assignee
지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드
샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
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Filing date
Publication date
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Abstract

본 개시는 항 클라우딘 항체 약물 접합체 및 그 의약 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시는 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체에 관한 것으로서, 여기서, Pc는 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트이고, L, Y 및 n은 명세서에서 정의한 바와 같다.

Description

항 클라우딘 항체 약물 접합체 및 그 의약 용도
본 개시는 항 클라우딘 항체 약물 접합체, 특히 항 Claudin18.2 항체-Exatecan 유사체 접합체, 그 제조방법, 항체 약물 접합체를 포함하는 약학 조성물, 및 그의 Claudin18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증을 치료하기 위한 약물을 제조함에 있어서의 용도에 관한 것으로서, 특히 항암 약물을 제조함에 있어서의 용도에 관한 것이다.
여기에 진술하는 내용은 단지 본 공개와 관련되는 배경 정보를 제공하는 것으로서, 종래기술을 필연적으로 구성하는 것은 아니다.
클라우딘 18(Claudin-18, CLDN18)은 인간 체내 Claudin18 유전자에 의해 코딩되는 단백질인 것으로서, 세포간 밀착연접 단백질 패밀리에 속하며, 층세포 간의 분자 유동을 제어할 수 있다. Claudin 단백질 구조에는 네 개의 막관통 영역, 두 개의 세포외 영역을 포함하며, 그 N말단과 C말단은 세포기질 내에 존재한다. Claudin-18은 각각 Claudin 18.1 및 Claudin 18.2이라는 두 개의 스플라이스 변이체를 갖는데, 양자의 서열 간에는 단지 첫 번째 세포외 영역에서만 8개의 아미노산에 차이점이 있다. Claudin 18.1 및 Claudin 18.2의 발현 분포는 다소 상이한 것으로, Claudin 18.1은 정상적인 폐 세포에서 선택적으로 발현되고, Claudin 18.2는 정상 세포에서의 발현은 극히 제한되나, 여러 가지 종양(위암, 폐암 및 췌장암 등)에서는 빈번하게 이소성 활성화 및 과발현된다. Claudin18.2는 위암 및 기타 암증 유형의 잠재적인 치료 타깃으로 인정되며, 이 타겟에 대한 발견은 또한 위암 치료에 새로운 선택을 제공하기도 하였다.
항체-약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)는 단클론항체 또는 항체 프래그머트를 안정적인 화학 연결자 화합물을 통해 생물활성을 갖는 세포독소와 서로 연결시킴으로써, 항체역가 정상 세포 및 종양세포의 표면 항원에 대한 결합 특이성과 세포독성 물질에 대한 고효성을 충분히 이용한 동시에, 전자의 치료효과가 다소 떨어지는 점과 후자의 독성 부작용이 과하다는 점 등의 단점을 피하게 되었다. 이는 기존의 전통적인 화학요법 약물과 비교하면, 항체-약물 접합체가 보다 더 정확하게 종양세포에 결합하고 또한 정상세포에 대한 영향을 감소시킨다는 것을 의미한다.
지금까지 이미 Claudin18.2를 표적하는 항체 및 ADC 약물 관련 특허에 대한 보도가 있는 것으로서, 예컨대, WO2020200196A1, WO2016166122 및 WO2016165762이다. 하지만, 지금까지 여전히 보다 효과적이고 보다 안전적인 항 Claudin18.2 항체-약물 접합체를 개발하여, Claudin18.2 관련 종양의 치료에 보다 잘 이용하도록 할 필요가 있다.
본 출원은 2019년 12월 12일에 제출한 중국특허출원(출원번호 CN201911273041.7) 및 2020년 9월 30일에 제출한 중국특허출원(출원번호 CN202011060513.3)의 우선권을 청구한다.
본 개시는 항 Claudin18.2 항체의 ADC 및 그 용도에 관한 것으로서, 여기서 항 Claudin18.2 항체 또는 항원 결합 프래그먼트의 세포독성 물질인 익시테칸(Exatecan) 유사체와 접합하는 ADC 약물을 제공한다.
따라서, 본 개시는 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것을 목표로 하며,
Figure pct00001
여기서,
Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- 및 -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 듀테륨원자, 할로겐, 알킬기, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 알콕시기, 히드록실기, 아미노기, 시아노기, 니트로기, 히드록시 알킬기, 시클로 알킬기 및 헤테로고리기로부터 선택되거나; 또는, Ra 및 Rb는 그 연결되는 탄소원자와 함께 시클로 알킬기 또는 헤테로고리기를 형성하며;
R1은 할로겐, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 시클로 알킬기, 시클로알킬 알킬기, 알콕시 알킬기, 헤테로고리기, 아릴기 및 헤테로 아릴기로부터 선택되고; R2는 수소원자, 할로겐, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 시클로 알킬기, 시클로알킬 알킬기, 알콕시 알킬기, 헤테로고리기, 아릴기 및 헤테로 아릴기로부터 선택되거나; 또는, R1 및 R2는 그 연결되는 탄소원자와 함께 시클로 알킬기 또는 헤테로고리기를 형성하고;
또는, Ra 및 R2는 그 연결되는 탄소원자와 함께 시클로 알킬기 또는 헤테로고리기를 형성하며;
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 1 내지 10이며, n은 소수 또는 정수이고;
L은 연결자 유닛이며;
Pc는 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트이다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서, 여기서,
i) 상기 중쇄 가변영역은, 서열 SEQ ID NO: 3으로 제시되는 중쇄 가변영역의HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 동일한 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은, 서열 SEQ ID NO: 4으로 제시되는 경쇄 가변영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 동일한 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고; 또는
ii) 상기 중쇄 가변영역은, 서열 SEQ ID NO: 5로 제시되는 중쇄 가변영역의HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 동일한 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은, 서열 SEQ ID NO: 6으로 제시되는 경쇄 가변영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 동일한 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
본 공개의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서, 여기서,
iii) 상기 중쇄 가변영역은 서열이 각각 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11로 제시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열이 각각 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 제시되는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며; 또는
iv) 상기 중쇄 가변영역은 서열이 각각 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 17로 제시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열이 각각 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로 제시되는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체는 쥐 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체이다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서, 여기서,
(1) 상기 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3으로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며, 및 상기 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며;
(2) 상기 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 24로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며, 및 상기 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 21로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며;
(3) 상기 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며, 및 상기 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6으로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며; 또는
(4) 상기 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 31로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며, 및 상기 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 28로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가진다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체는 인간화 항체인 것으로서, 상기 인간화 항체는 인간 항체 유래의 프레임워크 영역 또는 그 프레임워크 영역 변이체를 포함하고, 상기 프레임워크 영역 변이체는 인간 항체의 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역에서 각각 최대 10개(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 아미노산 복귀 돌연변이를 가지며;
바람직하게는, 상기 프레임워크 영역 변이체는 이하 (a) 또는 (b)로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 것으로서,
(a) 상기 경쇄 가변영역에는 선택적으로 22S, 85I 및 87H로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되고, 및/또는 상기 중쇄 가변영역에는 선택적으로 48I, 82T 및 69M으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되며; 또는
(b) 상기 경쇄 가변영역에는 선택적으로 4L 또는 22S로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되고, 및/또는 상기 중쇄 가변영역에는 선택적으로 38K, 40R, 48I, 66K, 67A, 69L, 71L 및 73K로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되며;
바람직하게는, 상기 프레임워크 영역 변이체는 이하로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 것으로서,
(a-1) 상기 경쇄 가변영역에는 22S, 85I 및 87H의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되고, 및 상기 중쇄 가변영역에는 48I 및 82T의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되며; 또는
(b-1) 상기 경쇄 가변영역에는 4L로부터 선택되는 아미노산 복귀 돌연변이가 포함된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 이하에 나타난 바와 같은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서,
(vii) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 3으로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 4로 제시되며;
(viii) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 27로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 23으로 제시되며;
(ix) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 5로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 6으로 제시되며; 또는
(x) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 34로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30으로 제시되며;
바람직하게는, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 이하에 나타난 바와 같은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서,
(xi) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 31로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 29로 제시되며; 또는
(xii) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 26으로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 23으로 제시된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 제시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 항체 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역을 포함하는 것으로서; 바람직하게는, 상기 중쇄 불변영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변영역 및 그 일반 변이체로부터 선택되고, 상기 경쇄 불변영역은 인간 항체 κ 및 λ쇄 불변영역 및 그 일반 변이체로부터 선택되며; 보다 람직하게는, 상기 항체는 SEQ ID NO: 7로 제시되는 서열과 같은 중쇄 불변영역 및 SEQ ID NO: 8로 제시되는 서열과 같은 경쇄 불변영역을 포함하고; 가장 바람직하게는, 상기 항체는 SEQ ID NO: 35 또는 SEQ ID NO: 42로 제시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄와 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 39로 제시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄; 또는
SEQ ID NO: 37 또는 SEQ ID NO: 49로 제시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄와 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 38 또는 SEQ ID NO: 46으로 제시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄;를 포함한다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는,
(c) SEQ ID NO: 35로 제시된 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 36으로 제시된 서열과 같은 경쇄;
(d) SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 또는 SEQ ID NO: 45로 제시되는 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 또는 SEQ ID NO: 41로 제시되는 서열과 같은 경쇄;
(e) 서열 SEQ ID NO: 37로 제시되는 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 38로 제시되는 서열과 같은 경쇄; 또는
(f) 서열 SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 또는 SEQ ID NO: 52로 제시되는 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 또는 SEQ ID NO: 48로 제시되는 서열과 같은 경쇄;를 포함한다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체는,
SEQ ID NO: 44로 제시되는 아미노산 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 41로 제시되는 서열과 같은 경쇄를 포함하는 h1901-11; 또는
SEQ ID NO: 49로 제시되는 아미노산 서열과 같은 중쇄, 및 SEQ ID NO: 47로 제시되는 서열과 같은 경쇄를 포함하는 h1902-5;로부터 선택된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 상기 항원 결합 프래그먼트는 Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄 항체(scFv), 이합체화된 V영역(이중항체) 및 이황화결합으로 안정화된 V영역(dsFv)으로부터 선택된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있에서, n은 1 내지 10 사이의 정수 또는 소수일 수 있고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 평균치일 수 있다. n은 2 내지 8의 소수 또는 정수, 바람직하게는 3 내지 8의 소수 또는 정수, 보다 바람직하게는 5 내지 9의 소수 또는 정수, 또는 바람직하게는 2 내지 7의 소수 또는 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 3.5 내지 4.5의 소수 또는 정수이다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서,
여기서,
Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-이고;
Ra 및 Rb는 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 듀테륨원자, 할로겐 또는 알킬기로부터 선택되며;
R1은 할로겐화 알킬기 또는 C3-6 시클로 알킬기이고;
R2는 수소원자, 할로겐화 알킬기 또는 C3-6 시클로 알킬기로부터 선택되며;
또는, R1 및 R2는 그 연결되는 탄소원자와 함께 C3-6 시클로 알킬기를 형성하며;
m은 0 또는 1이다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, Y는,
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
Figure pct00007
및
Figure pct00008
로부터 선택되고;
여기서, Y의 O단은 연결자 유닛 L과 서로 연결된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 제공되는 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물에 있어서, 연결자 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이다.
일부 실시양태에서, L1은 -(숙신이미드-3-일-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- 또는 -C(O)-W-C(O)-로부터 선택되고, 여기서 W는 C1-8 알킬기, C1-8 알킬기- C3-6 시클로 알킬기 또는 1개 내지 8개 사슬원자의 직쇄 헤테로 알킬기로부터 선택되고, 상기 헤테로 알킬기는 1개 내지 3개의 N, O 또는 S로부터 선택되는 헤테로원자를 포함하며, 상기 C1-8 알킬기, C1-8 알킬기- C3-6 시클로 알킬기 또는 1개 내지 8개 사슬원자의 직쇄 헤테로 알킬기는 각각 독립적으로 선택적으로 할로겐, 히드록실기, 시아노기, 아미노기, 알킬기, 클로로알킬기, 듀테로화 알킬기, 알콕시기 및 시클로 알킬기로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 치환기에 의해 추가로 치환된다.
일부 실시양태에서, L2는 -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- 또는 화학 결합으로부터 선택되며, 여기서 p1은 1 내지 20의 정수이다.
일부 실시양태에서, L3은 2개 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기이며, 상기 아미노산은 페닐알라닌, 글리신, 발린, 라이신, 시트룰린, 세린, 글루타민산, 아스파르트산으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기이며, 또한 선택적으로 할로겐, 히드록실기, 시아노기, 아미노기, 알킬기, 클로로알킬기, 듀테로화 알킬기, 알콕시기 및 시클로 알킬기로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 치환기에 의해 추가로 치환된다.
일부 실시양태에서, L4는 -NR5(CR6R7)t-, -C(O)NR5-, -C(O)NR5(CH2)t- 및 화학 결합으로부터 선택되며, 여기서 t는 1 내지 6의 정수이다.
일부 실시양태에서, R3, R4 및 R5는 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기 및 히드록시 알킬기로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, R6 및 R7은 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐, 알킬기, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기 및 히드록시 알킬기로부터 선택된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물에 있어서, 연결자 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이고,
L1은 -(숙신이미드-3-일-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- 또는 -C(O)-W-C(O)-로부터 선택되고, 여기서 W는 C1-8 알킬기, C1-8 알킬기-시클로 알킬기 또는 1개 내지 8개 원자의 직쇄 헤테로 알킬기로부터 선택되고, 상기 헤테로 알킬기는 1개 내지 3개의 N, O 또는 S로부터 선택되는 헤테로원자를 포함하며, 상기 C1-8 알킬기, 시클로 알킬기 및 직쇄 헤테로 알킬기는 각각 독립적으로 선택적으로 할로겐, 히드록실기, 시아노기, 아미노기, 알킬기, 클로로화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 알콕시기 및 시클로 알킬기로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 치환기에 의해 추가로 치환되며;
L2는 -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- 또는 화학 결합으로부터 선택되며, 여기서 p1은 1 내지 20의 정수이며;
L3은 2개 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기이며, 상기 아미노산은 페닐알라닌, 글리신, 발린, 라이신, 시트룰린, 세린, 글루타민산, 아스파르트산으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기이며, 또한 선택적으로 할로겐, 히드록실기, 시아노기, 아미노기듀테로화, 알킬기, 클로로화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 알콕시기 및 시클로 알킬기로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 치환기에 의해 추가로 치환되며;
L4는 -NR5(CR6R7)t-, -C(O)NR5-, -C(O)NR5(CH2)t- 또는 화학 결합으로부터 선택되며, 여기서 t는 1 내지 6의 정수이고;
R3, R4 및 R5는 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기 및 히드록시 알킬기로부터 선택되며;
R6 및 R7은 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐, 알킬기, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기 및 히드록시 알킬기로부터 선택된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 연결자 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이고,
L1은
Figure pct00009
이고, s1은 2 내지 8의 정수이며;
L2는 화학 결합이며;
L3은 테트라펩티드 잔기이며; 바람직하게는, L3은 GGFG인 테트라펩티드 잔기(SEQ ID No.55)이며;
L4는 -NR5(CR6R7)t-이고, R5, R6 또는 R7은 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자 또는 알킬기이고, t는 1 또는 2이며;
여기서 상기 L1 단은 Pc와 서로 연결되고, L4 단은 Y와 서로 연결된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, -L-은,
Figure pct00010
이다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, -L-Y-는 선택적으로,
Figure pct00011
Figure pct00012
및
Figure pct00013
로부터 선택된다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염은 식(Pc-La-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염인 것으로서,
Figure pct00014
여기서,
W, L2, L3, R5, R6, R7은 앞서 연결자 유닛 -L-에서 정의한 바와 같고;
Pc, n, R1, R2, m은 식(Pc-L-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염은 식(Pc-Lb-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염인 것으로서,
Figure pct00015
여기서,
s1은 2 내지 8의 정수이고;
Pc, R1, R2, R5 내지 R7, m 및 n은 식(Pc-La-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 앞서 어느 한 항에 따른 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 리간드-약물 접합체는,
Figure pct00016
Figure pct00017
및
Figure pct00018
로부터 선택되고,
여기서, Pc 및 n은 식(Pc-L-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 제공되는 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 상기 리간드-약물 접합체는,
Figure pct00019
및
Figure pct00020
로부터 선택되고,
여기서, n은 식(Pc-L-Y-D)에서 정의한 바와 같고; 항체 h1902-5, h1901-11은 앞서 정의한 바와 같다.
본 개시는 식(Pc-La-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하는 방법을 추가로 제공하는 것으로서, 상기 방법은 이하 단계를 포함하고,
Figure pct00021
Figure pct00022
Pc'는 식(La-Y-D)로 표시되는 화합물과 공역반응을 진행하여, 식(Pc-La-Y-D)로 표시되는 화합물을 얻는 단계;
여기서,
Pc는 위에 기술한 바와 같은 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트이고; Pc'는 Pc를 환원시켜 얻는 것이며;
W, L2, L3, R1, R2, R5 내지 R7, m 및 n은 식(Pc-La-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
본 개시는 식(Pc-L'-D)로 표시되는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법을 추가로 제공하는 것으로서, 상기 방법은 이하 단계를 포함하고,
Figure pct00023
Figure pct00024
Pc가 환원된 후, 식 (L'-D)와 공역반응을 하여 화합물을 얻는 단계; 여기서,
Pc는 전술한 바와 같은 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트이고;
n은 식(Pc-L-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
다른 한 편으로, 본 개시는 약학 조성물을 제공하는 것으로서, 상기 약학 조성물은 앞서 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염, 및 일종 또는 다종의 약용 가능한 부형제, 희석제 또는 벡터를 포함한다.
다른 한 편으로, 본 개시는 앞서 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 또는그 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 포함하는 약학 조성물이 약물로서 사용되는 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 Claudin18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증을 치료하기 위한 것으로서; 상기 Claudin18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증은 바람직하게는 Claudin18.2 과발현 암이다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 암을 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 암은 바람직하게는 두경부 편평세포암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계암, 신경내분비종양, 인후암, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간담도암, 췌장암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포신세포암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수종 이형성 증후군, 크루켄버그 종양, 골수증식성 종양, 편평 세포 암종, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포 암종이고; 보다 바람직하게는, 상기 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구 풍부 거대 B- 세포 림프종 및 림프형질구성 림프종으로부터 선택되고, 상기 폐암은 비소세포폐암 및 소세포폐암으로부터 선택되며, 상기 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병으로부터 선택된다.
다른 한 편으로는, 본 개시는 앞서 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 Claudin18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증을 치료하기 위한 약물을 제조함에 있어서의 용도를 제공한다. 여기서, 상기 Claudin18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증은 Claudin18.2 과발현 암이다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 바람직하게는 두경부 편평세포암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계암, 신경내분비종양, 인후암, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간담도암, 췌장암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포신세포암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수종 이형성 증후군, 크루켄버그 종양, 골수증식성 종양, 편평 세포 암종, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포 암종이고; 보다 바람직하게는, 상기 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구 풍부 거대 B- 세포 림프종 및 림프형질구성 림프종으로부터 선택되고, 상기 폐암은 비소세포폐암 및 소세포폐암으로부터 선택되며, 상기 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병으로부터 선택된다.
다른 한 편으로, 본 개시는 앞서 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 앞서또는 그 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약물을 제조함에 있어서의 용도를 제공하는 것으로서, 상기 종양 및 암은 바람직하게는 두경부 편평세포암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계암, 신경내분비종양, 인후암, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간담도암, 췌장암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포신세포암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수종 이형성 증후군, 크루켄버그 종양, 골수증식성 종양, 편평 세포 암종, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포 암종이고; 보다 바람직하게는, 상기 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구 풍부 거대 B- 세포 림프종 및 림프형질구성 림프종으로부터 선택되고, 상기 폐암은 비소세포폐암 및 소세포폐암으로부터 선택되며, 상기 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병으로부터 선택된다.
다른 한 편으로, 본 개시는 추가로 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 피시험자에게 치료 유효량 또는 예방 유효량의 앞서 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 바람직하게는, 상기 종양은 Claudin18.2 과발현과 관련되는 암이다.
다른 한 편으로, 본 개시는 추가로 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 피시험자에게 치료 유효량 또는 예방 유효량의 앞서 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며; 상기 종양 및 암은 바람직하게는 두경부 편평세포암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계암, 신경내분비종양, 인후암, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간담도암, 췌장암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포신세포암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수종 이형성 증후군, 크루켄버그 종양, 골수증식성 종양, 편평 세포 암종, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포 암종이고; 보다 바람직하게는, 상기 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구 풍부 거대 B- 세포 림프종 및 림프형질구성 림프종으로부터 선택되고, 상기 폐암은 비소세포폐암 및 소세포폐암으로부터 선택되며, 상기 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병으로부터 선택된다.
활성 화합물(예를 들어, 본 개시에 따른 리간드-약물 접합체, 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염)을 어떤 적당한 경로로 투약해도 적합한 형식으로 제조하고, 활성 화합물은 바람직하게는 단위 용량의 형식이거나 또는 피시험자가 일회량으로 스스로 투여할 수 있는 형식으로 한다. 본 개시의 단위 용량의 형식은 정제, 캡슐, 카세제, 바이알, 분말, 과립, 로젠지, 좌약, 재구성 분말 또는 액체 제제일 수 있다.
본 개시의 치료방법에서 사용되는 활성 화합물 또는 조성물에 대한 투여량은 일반적으로 질환의 엄중성, 피시험자의 체중 및 활성 화합물의 효능에 따라 달라진다. 하지만, 일반적인 가르침으로서, 적합한 단위 용량은 0.1mg 내지 1000mg일 수 있다.
활성 화합물을 제외하고 본 개시의 약학 조성물은 또한 일종 또는 다종의 보조제를 함유할 수 있는 것으로서, 상기 보조제는 충진제, 희석제, 접합제, 습윤제, 붕괴제 또는 부형제 등 성분으로부터 선택된다. 투약 방법에 따라, 조성물은 0.1중량% 내지 99중량%의 활성 화합물을 함유할 수 있다.
본 개시에서 제공되는 Claudin18.2 항체 및 그 항체 약물 접합체는 세포 표면 항원과의 양호한 친화력, 양호한 세포이입성 및 매우 강한 종양 억제성을 가지며, 또한 약물 응용 범위가 더 넓으므로, 임상 약물 응용에 적합하다.
도 1: 인간화 항체의 세포 차원에서 인간 Claudin18.2와 결합하는 FACS 검측 결과.
도 2: 인간화 항체의 NUGC4 세포이입 실험.
도 3a 내지 도 3c: 항체역가 서로 다른 Claudin18.2 발현 정도의 NUGC4 세포에서의 ADCC 효과 검측. 도 3a는 항체역가 야생형 NUGC4 세포(Claudin18.2 저발현)에서의 ADCC 효과 검측; 도 3b는 항체역가 Claudin18.2 중발현 NUGC4 세포에서의 ADCC 효과 검측; 도 3c는 항체역가 Claudin18.2 과발현 NUGC4 세포에서의 ADCC 효과 검측이다.
도 4: 본 개시 ADC-1의 종양 억제 실험결과.
도 5: 본 개시 ADC-2의 종양 억제 실험결과.
1. 용어
달리 한정하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시에 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 일치한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술한 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료를 채택하여 본 개시를 실시 또는 시험할 수 있으나, 본 명세서에서는 바람직한 방법 및 재료에 대해 설명한다. 본 개시에 대해 설명하고 보호를 청구하는 경우, 이하 정의에 따라 다음에 열거한 용어를 사용한다.
본 개시에서 상품명을 사용하는 경우, 해당 상품명 제품의 제제, 해당 상품명 제품의 비특허 약 및 활성약물 부분을 포함하려는 것이다.
달리 설명하지는 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다.
용어 "약물"이란, 유기체의 생리적 기능 및 병리적 상태를 바꾸고 또는 밝힐 수 있어, 질환의 예방, 진단 및 치료에 사용할 수 있는 화학물질임을 가리킨다. 약물은 세포독성 약물을 포함한다. 약물과 독물 사이에는 엄격한 경계가 없는 것으로, 독물이란 비교적 적은 용량으로도 즉시 유기체에 독해 작용을 일으키게 되면서 인체건강에 손해를 입히는 화학물질을 가리키는 것으로, 어떤 약물도 용량이 과하면 독성 반응을 일으킬 수 있다. 세포독성 약물이란, 즉 세포의 기능을 억제 또는 방지하고 및/또는 세포의 사망 또는 파괴를 일으키는 물질을 가리킨다. 세포독성 약물은 원칙적으로는 충분한 농도 하에서 종양세포를 죽일 수 있으나, 특이성이 결여되기 때문에, 종양세포를 죽이는 동시에 정상세포의 사멸도 초래하게 되어, 엄중한 부작용을 초래한다. 세포독성 약물은 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소와 같은 독소, 방사성 동위원소, (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 독소 약물, 화학요법 약물, 항생제 및 핵 리소좀을 포함한다.
용어 "연결자 유닛", "연결자" 또는 "연결 프래그먼트"란 일단은 리간드(예컨대 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트)와 연결되고, 다른 일단은 약물과 연결되는 화학구조 프래그먼트 또는 결합을 가리키며, 기타 연결자를 연결한 후 다시 약물과 서로 연결될 수도 있다.
열결자는 일종 또는 다종의 연결자 부재를 포함할 수 있다. 예시적인 연결자 부재는 6-말레이미도헥사노일("MC"), 말레이미도프로피오닐("MP"), 발린-시트룰린("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)발레레이트("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1 카르복실레이트("SMCC", 본 명세서에서는 "MCC"라도고 함) 및 N-숙신이미딜(4-요오도-아세틸)아미노벤조에이트("SIAB")를 포함한다. 연결자는 연장물, 스페이서 및 아미노산 유닛을 포함할 수 있으며, 본 분야에서 알려져 있는 방법(예컨대 US2005-0238649A1에 기재된 바와 같음)을 통해 합성할 수 있다. 연결자는 세포에서 약물 방출이 용이하게 한 "절단 가능 연결자"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정한 연결자(예를 들어, 히드라존), 프로테아제-민감성(예를 들어, 펩티다제-민감성) 연결자, 광불안정성 연결자, 디메틸 연결자 또는 이황화물 함유 연결자(문헌[Chari 등, Cancer Research 52: 127-131(1992); 미국특허 No.5, 208, 020])를 사용할 수 있다.
약어
연결자 어셈블리는,
구조식이 다음과 같은 MC=6-말레이미도헥사노일,
Figure pct00025
,
Val-Cit 또는 "vc"=발린-시트룰린(프로테아제 절단 가능 연결자 중의 예시적 디펩티드),
시트룰린=2-아미노-5-우레이도발레르산,
PAB=p-아미노벤질옥시카르보닐("자가 희생" 연결자 어셈블리의 예시),
Me-Val-Cit=N-메틸-발린-시트룰린(여기서 연결자 펩티드 결합은 카텝신B에 절단을 당하는 것을 방지하기 위하여 이미 수식됨),
MC(PEG)6-OH= 말레이미도헥사노일-폴리에틸렌 글리콜(항체 시스테인에 부착 가능),
SPP=N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)발레레이트,
SPDP= N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트,
SMCC=숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 및
IT=이미노티올란을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
용어 "리간드-약물 접합체"란 리간드가 연결자 유닛을 통해 생물활성을 갖는 약물과 서로 연결되는 것을 가리킨다. 본 개시에서, "리간드-약물 접합체"는 바람직하게는 항체-약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)인 것으로, 단클론항체 또는 항체 프래그먼트를 연결자 유닛을 통해 생물활성을 갖는 독성 약물과 서로 연결시키는 것을 가리킨다. 항체는 직접적으로 또는 연결자를 통해 약물에 접합될 수 있다. 각 항체의 평균 약물 모듈수(평균 약물 부하 또는 약물 로딩량은 n값으로 표시 가능)의 범위는 예를 들어 각 항체역가 0개 내지 20개의 약물 모듈에 접합될 수 있고, 일부 실시양태에서는 각 항체역가 1개 내지 약 10개의 약물 모듈에 접합하고, 일부 실시양태에서는 각 항체역가 1개 내지 약 8개의 약물 모듈에 접합하는 것이다.
용어 "평균 약물 부하" 또는 "약물 로딩량"이란 리간드-약물 접합체 분자 중 각 리간드에 로딩되는 세포 독성 약물의 평균 수량을 가리키는 것으로서, 약물량과 항체량의 비율로 표시할 수도 있으며, 약물 로딩량의 범위는 각 리간드(Pc)가 0개 내지 12개, 바람직하게는 1개 내지 10개의 세포독성 약물을 연결하는 것이다. 본 개시의 실시양태에서, 약물 로딩량은 n으로 표시되고, DAR(Drug-antibody Ratio)값으로 칭할 수도 있으며, n은 0 내지 12의 0이 아닌 정수 또는 소수일 수 있고, 바람직하게는, 1과 10 사이의 정수 또는 소수이며; 보다 바람직하게는 2 내지 8인 정수일 수도 있고, 소수일 수도 있으며; 가장 바람직하게는 3 내지 8인 정수일 수도 있고, 소수일 수도 있다. 예시적으로는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10의 평균치이다. UV/가시광 분광법, 질량 분석법, ELISA시험 및 HPLC특징과 같은 통상적인 방법으로 공역반응 후 각 ADC분자의 약물 평균 수량을 동정할 수 있다.
본 개시에서 사용하는 아미노산 세글자 코드와 한글자 코드는 J.biol.chem, 243, p3558(1968)에서 언급한 바와 같다.
클라우딘18(CLD18) 분자(Genbank 등록번호: 스플라이스 변이체1(CLD18A1): NP_057453, NM016369, 및 스플라이스 변이체2(CLD18A2 또는 Claudin18.2): NM_001002026, NP_001002026)는 내인성 막관통 단백질인 것으로서, 상피와 내피의 밀착연접에 위치된다. 밀착연접에서, 오클루딘(occludin)과 클라우딘은 가장 주요한 막관통 단백질 성분이다. 클라우딘의 강한 세포간 접착력 특성으로 인해, 이들은 용질의 세포 주변 전이를 방지 및 제어하고 세포막 지질과 단백질의 측방향 확산을 제한하여 세포 극성을 유지하는 1급 장벽을 생성한다. 밀착연접을 형성하는 단백질이 상피의 조직 구조에 참여하게 된다. 보도자료에 따르면, 이러한 단백질은 구조가 양호한 상피에서 거의 항체에 접근 불가하였으나, 종양 세포에서는 노출되었다는 것으로 보인다.
용어 "항체"란 면역글로불린을 가리키는 것으로서, 두 가닥의 중쇄와 두 가닥의 경쇄가 사슬간 이황화 결합에 의해 연결되는 것을 통해 형성되는 테트라펩티드 구조이다. 면역글로불린 중쇄 불변영역의 아미노산 구성과 배열 순서의 상이함에 따라, 면역글로불린을 다섯 종류로 나누거나, 또는 면역글로불린의 동종 유형, 즉, IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 칭할 수 있고, 그 대응되는 중쇄는 각각 μ사슬, δ사슬, γ사슬, α사슬, 및 ε사슬이다. 동일 종류의 Ig는 그 힌지 영역의 아미노산 구성 및 중쇄 이황화 결합의 수량 및 위치의 상이함에 따라, 서로 다른 하위 분류로 나눌 수 있는데, 예컨대 IgG를 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4으로 나눌 수 있다. 경쇄는 불변영역의 상이함에 따라 κ쇄 또는 λ쇄로 나눌 수 있다. 다섯 종류의 Ig에서 각 종류의 Ig는 모두 κ쇄 또는 λ쇄를 가질 수 있다.
전장 항체 중쇄 및 경쇄의 N단에 근접하는 약 110개의 아미노산의 서열이 변함이 매우 커서, 가변영역(Fv영역)이고; C단에 근접하는 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정적인 편이어서, 불변영역이다. 가변영역은 3개의 초가변영역(HVR) 및 4개의 서열이 상대적으로 보수적인 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 3개의 초가변영역이 항체의 특이성을 결정하여, 상보성 결정영역(CDR)이라고도 칭한다. 각 가닥의 경쇄 가변영역(LCVR) 및 중쇄 가변영역(HCVR)은 3개의 CDR 영역과 4개의 FR영역으로 구성되어, 아미노기단으로부터 카르복실기단까지 순차적으로 배열되는 순서는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4이다. 경쇄의 3개의 CDR영역은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3임을 가리키고; 중쇄의 3개의 CDR영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3임을 가리킨다.
용어 "완전 인간화 항체", "완전 인간 항체" 또는 "전 인간 항체", "전 인간화 단클론 항체"라고도 칭하는데, 그 항체의 가변영역과 불변영역은 모두 인간으로부터 유래된 것이다. 단클론 항체의 발전은 네 가지 단계를 거쳤는데, 각각 쥐 단클론항체, 키메라 단클론항체, 인간화 단클론항체 및 완전 인간 단클론항체이다. 완전 인간 항체의 제조와 관련되는 기술에는 주로 인간 하이브리드도마 기술, EBV 형질전환 B 림프구 기술, 파지 디스플레이기술(phage display), 형질전환 마우스(transgenic mouse) 항체 제조기술 및 단일 B세포 항체 제조기술 등이 있다.
용어 "항원 결합 프래그먼트"는 항체의 항원 결합 능력을 유지하는 하나 또는 다수 개의 프래그먼트이다. 전장 항체의 프래그먼트를 이용하여 항체의 항원 결합 기능을 진행할 수 있다는 것은 이미 보여줬다. "항원 결합 프래그먼트"에 포함되는 결합 프래그먼트는 Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄항체(scFv), 이합체화된 V영역(이중항체), 이황화결합 안정화된 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드 항원 결합 프래그먼트로부터 선택되어, 예시로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 단가 프래그먼트인 Fab 프래그먼트; (ii) 힌지영역 상의 이황화 브릿지를 통해 연결되는 두 개의 Fab 프래그먼트를 포함하는 이가 프래그먼트인 F(ab')2 프래그먼트; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 프래그먼트; (iv) 항체의 한 아암(arm)의 VH 및 VL 도메인으로 구성되는 Fv 프래그먼트; (v) VH 도메인으로 구성되는 단일 도메인 또는 dAb 프래그먼트(문헌[Ward 등, (1989)Nature341 : 544-546]); (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 선택적으로 합성된 연결자를 통해 연결된 두개 이상의 분리된 CDR의 조합;을 포함한다. 이외, Fv 프래그먼트의 두 개의 도메인 VL 및 VH가 분리된 유전자로 코딩되었으나, 재조합 방법을 사용하여 합성된 연결자를 통해 이들을 연결시킬 수 있으며, 이로써, VL 및 VH 영역이 서로 매칭되어 단가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단쇄 Fv(scFv)라 칭함; 예를 들어 문헌[Bird 등(1988) Science242: 423-426]; 및 문헌[Huston 등 (1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85: 5879-5883] 참조)을 생성할 수 있도록 한다. 이와 같은 단쇄 항체 역시 용어 항체의 "항원 결합 프래그먼트"에 포함시키고자 한다. 당업자에게 알려져 있는 통상적인 기술을 사용하여 이와 같은 항체 프래그먼트를 획득하고, 또한 완정한 항체에 대한 방식과 동일한 방식으로 기능성에 의해 프래그먼트를 선별한다. 완전 면역글로불린을 재조합 DNA 기술 또는 효소 촉진 또는 화학 단절을 실시함으로써 항원 결합 부분을 생성하게 된다. 항체는 서로 다른 종류의 항체일 수 있어, 예를 들어, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위 유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
통상적으로, Fab는 프로테아제 파파민으로(예를 들어, H쇄 224위치의 아미노산 잔기를 절단시킴) IgG 항체 분자로부터 얻어진 프래그먼트 중 약 50,000개 분자량을 가지며 또한 항원 결합 활성을 갖는 항체 프래그먼트를 처리하는 것으로서, 여기서 H사슬 N단 부분과 L사슬은 이황화 결합을 통해 결합된다.
통상적으로, F(ab')2는 효소 펩신으로 IgG 힌지영역 중 이황화 결합의 아래 부분을 소화함으로써 얻게 되는 것으로서, 그 분자량은 약 100,000이며, 또한 항원 결합 활성을 가지고, 힌지 위치가 서로 인접한 두 개의 Fab 영역의 항원 프래그먼트에 포함된다.
통상적으로, Fab'는 상기 F(ab')2의 힌지영역의 이황화결합을 절단시킴으로써 얻게 되는 분자량이 약 50,000이고 항원 결합 활성을 갖는 항체 프래그먼트이다.
이외, Fab' 프래그먼트를 코딩하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하여 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 Fab'를 발현함으로써 상기 Fab'를 생성한다.
용어 "단쇄 항체", "단쇄 Fv" 또는 "scFv"란, 연결자를 통해 연결되는 항체 중쇄 가변 도메인(또는 VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(또는 VL)을 포함하는 분자를 가리킨다. 이와 같은 scFv 분자는 NH2-VL-연결자-VH-COOH 또는 NH2-VH-연결자-VL-COOH와 같은 일반적 구조를 가질 수 있다. 적합한 종래기술의 연결자는 중복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 그 변이체로 구성되어, 예를 들어, 1개 내지 4개의 중복되는 변이체를 사용한다(문헌[Holliger 등(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448]). 본 개시에 사용될 수 있는 기타 연결자는 문헌[Alfthan 등(1995), Protein Eng.8: 725-731], 문헌[Choi 등(2001), Eur.J.Immuno l.31: 94-106], 문헌[Hu 등(1996), Cancer Res.56: 3055-3061], 문헌[Kipriyanov 등(1999), J.Mol.Biol.293: 41-56] 및 문헌[Roovers 등(2001), Cancer Immunol.]에 설명한 바와 같다.
용어 "CDR"이란 항체의 가변 도메인 내 항원 결합을 촉진하는 주요 6개의 초가변영역 중 하나임을 가리킨다. 통상적으로, 각 중쇄 가변영역에는 세 개의 CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 존재하고, 각 경쇄 가변영역에는 세 개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 존재한다. 여러 가지 공지의 방안 중의 임의의 한 가지 방안을 사용하여 CDR의 아미노산 서열 경계를 확정할 수 있다. 상기 6개의 CDR에 대한 가장 자주 사용되는 정의 중 하나는 문헌[Kabat E.A. 등, (1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)]에서 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 CDR의 Kabat에 대한 정의는 단지 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3과 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3에만 응용된다. 또한 "Chothia" 넘버링 규칙, "ABM" 넘버링 규칙, "contact" 넘버링 규칙(문헌[Martin, ACR. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J]. 2001]참조) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 넘버링 규칙(문헌[Lefranc M.P., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77(2003)])등을 포함한다.
용어 "항체 프레임워크"란, 가변 도메인 VL 또는 VH의 일부분임을 가리키는데, 해당 가변 도메인의 항원 결합 고리(CDR)의 받침대로 사용된다. 본질적으로 볼 때, 이는 CDR을 갖지 않는 가변 도메인이다.
용어 "에피토프" 또는 "항원결정기"란 면역글로불린 또는 항체역가 결합되는 항원의 부위를 가리킨다. 에피토프는 통상적으로 독특한 공간 구조로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속적 또는 비연속적인 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology, 제66권, G.E.Morris, Ed.(1996)]을 참조한다.
용엉 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합" 및 "특이적으로 결합"이란 항체의 미리 확정된 항원 상의 에피토프와의 결합을 가리킨다. 통상적으로, 항체는 대략 10-7M보다 작고, 예를 들어 대략 10-8M, 10-9M 또는 10-10M보다 작고 또는 보다 더 작은 친화력(KD)으로 결합된다.
용어 "KD"란 항체-항원 상호 작용의 해리 평형 상수를 가리킨다. 통상적으로, 본 개시의 항체(또는 항원 결합 프래그먼트)는 대략 10-7M보다 작고, 예를 들어 대략 10-8M 또는 10-9M보다 작은 해리 평형 상수(KD)로 Claudin18.2(또는 그 에피토프)에 결합되는 것으로서, 예를 들어, 본 개시에서 항체와 세포표면 항원과의 친화력은 FACS법을 사용하여 KD값을 측정한다.
용어 "핵산 분자"란 DNA 분자 또는 RNA 분자를 가리킨다. 핵산분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 핵산과 다른 하나의 핵산을 기능 관계에 놓은 경우, 핵산은 "유효 연결되는 것"이다. 예를 들어, 만약 촉진자 또는 증폭자가 코딩 서열의 전사에 영향을 끼친다면, 촉진자 또는 증폭자는 상기 코딩 서열에 유효적으로 연결된다.
아미노산 서열 "동일성"이란, 아미노산 서열을 비교하는 과정에서, 필요할 경우 간격을 인입하여, 최대 서열 동일성 백분율에 아르는 동시에, 그 어떠한 보수적인 치환도 서열 동일성의 일부분으로 간주하지 않는, 제1 서열 중 제2 서열의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 가리킨다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 측정하는 목표를 위하여, 비교는 본 분야 기술 범위 내의 여러 가지 방식으로 실현할 수 있는 것으로서, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR)소프트웨어와 같은 공개적으로 얻을 수 있는 소프트웨어를 사용할 수 있다. 당업자는 비교 측정에 적합하는 파라미터를 확정할 수 있는 것으로서, 비교 대상인 서열 전장에서 최대 비교를 달성하기 위해 필요한 모든 알고리즘을 포함한다.
용어 "발현 벡터"란 그와 연결된 다른 하나의 핵산을 운반할 수 있는 핵산분자를 가리킨다. 일 실시양태에서, 벡터는 "플라스미드"인 것으로서, 이는 다른 DNA 구간을 그 안에서 연결시킬 수 있는 고리형 이중 가닥 DNA 고리를 가리킨다. 다른 하나의 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 다른 DNA 구간을 바이러스 유전자 그룹에 연결시킬 수 있다. 본 명세서에서 공개하는 벡터는 이미 이들을 인입한 숙주세포에서 자가 복제(예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터와 부가형 포유동물 벡터)를 할 수 있고 또는 숙주세포 인입 후 숙주세포의 유전자 그룹에 통합될 수 있어, 숙주 유전자 그룹의 복제에 따라 함께 복제(예를 들어, 비부가형 포유동물 벡터)된다.
종래기술에서 잘 알려져 있는 항체 및 항원 결합 프래그먼트를 생산 및 정제하는 방법으로는, 예컨대, 콜드 스프링의 항체 실험 기술 지침, 제5장 내자 제8장 및 제15장이다. 항원 결합 프래그먼트 역시 마찬가지로 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 프래그먼트는 유전자 공학 방법에 의해 비인간 CDR 영역에 하나 또는 다수 개의 인간 FR 영역을 추가한다. 인간 FR 생식계열 서열은 IMGT 인간 항체 가변영역 생식계열 유전자 데이터베이스를 MOE 소프트웨어와 비교함을 통해, ImMunoGeneTics(IMGT)의 사이트 http://imgt.cines.fr로부터 얻을 수 있거나, 또는 면역글로불린 잡지, Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001ISBN012441351로부터 얻을 수 있다.
용어 "숙주세포"란 이미 발현 벡터를 인입한 세포를 가리킨다. 숙주세포는 세균, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환이 용이한 세포는 대장균(Escherichia coli) 또는 살모넬라균(Salmonella)의 균주와 같은 장내세균과(enterobacteriaceae)의 구성원; 고초균(Bacillus subtilis)과 같은 바실루스과(Bacillaceae) ; 폐렴구균(Pneumococcus) ; 연쇄구균(Streptococcus) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae);를 포함한다. 적당한 미생물로는 출아형효모(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스 효모(Pichia pastoris)를 포함한다. 적당한 동물 숙주세포로는 CHO(중국 햄스터 난소 세포주) 및 NS0 세포를 포함한다.
본 개시의 공정화된 항체 또는 항원 결합 프래그먼트는 통상적인 방법으로 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA 서열은 발현 벡터에 복제하여 재조합할 수 있다. 재조합된 면역글로불린 발현 벡터는 안정적으로 숙주세포를 형질전환할 수 있다. 좀 더 추천할 만한 종래기술로는, 포유동물 발현 시스템은 항체의 글리코실화를 초래하게 되며, 특히 Fc 영역의 N단 사이트에서 초래하게 된다. 양성 클론에 대한 배양은 생물 반응기의 배지에서 확대되어 항체를 생산한다. 항체를 분비한 배양액은 통상적인 기술로 정제할 수 있다. 예를 들어, A 또는 G Sepharose FF 컬럼으로 정제할 수 있다. 비특이적 결합 성분을 세척한다. 다시 pH 경사법으로 결합된 항체를 세척하고, SDS-PAGE로 항체 프래그먼트를 검사, 수집한다. 항체는 통상적인 방법으로 여과하여 농축할 수 있다. 용해 가능한 혼합체 및 폴리머가 역시 통상적인 방법, 예를 들어 분자체, 이자교환으로 제거할 수 있다. 얻어진 산물은 즉시 냉동(예를 들어 -70℃) 또는 동결 건조해야 한다.
용어 "펩티드"란, 아미노산과 단백질 사이에 처하는 화합물 프래그먼트를 가리키는 것으로서, 2개 이상의 아미노산 분자가 펩티드결합을 통해 서로 연결되어 형성되는, 단백질의 구조와 기능 프래그먼트이다.
용어 "당"이란, C, H, O 세 가지 원소로 구성된 생물 대분자임을 가리키는 것으로서, 단당류, 이당류 및 다당류 등으로 나눌 수 있다.
용어 "알킬기"란, 포화지방족탄화수소기임을 가리키는 것으로서, 이는 1개 내지 20개 탄소원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 원자단이며, 바람직하게는 1개 내지 12개 탄소원자를 함유하는 알킬기, 보다 바람직하게는 1개 내지 10개 탄소원자를 함유하는 알킬기, 가장 바람직하게는 1개 내지 6개의 탄소원자(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 탄소원자 함유)를 함유하는 알킬기이다. 비제한적인 예시로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필 , 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3 -디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, n-헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 2,3-디메틸펜틸 , 2,4-디메틸펜틸, 2,2-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, n-옥틸, 2,3-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실에틸헥실, 2,2-디메틸헥실, 3,3-디메틸헥실, 4,4-디메틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, 4-에틸헥실, 2-메틸-2-에틸펜틸, 2-메틸-3-에틸펜틸, n-노닐, 2-메틸-2-에틸헥실, 2-메틸-3-에틸헥실, 2,2-디에틸펜틸, n-데실, 3,3-디에틸헥실, 2,2-디에틸헥실 및 이들의 각종 분지쇄 이성질체 등을 포함한다. 보다 바람직하게는 1개 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 저급 알킬기이고, 비제한적인 실시예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸 프로필프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필 , 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3 -디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸 등을 포함한다. 알킬기는 치환 또는 비치환될 수 있는 것으로서, 치환되는 경우, 알킬기는 임의의 사용 가능한 연결점 상에서 하나 또는 다수 개의 치환기에 의해 치환될 수 있고, 상기 치환기는 바람직하게는 독립적으로 알킬기, 알케닐, 알키닐, 알콕시기, 알킬티오, 알킬아미노기, 할로겐, 메르캅토기, 히드록실기, 니트로기, 시아노기, 시클로 알킬기, 헤테로시클로 알킬기, 아릴기, 헤테로 아릴기, 시클로 알콕시기, 헤테로시클로 알콕시기, 시클로 알킬티오, 헤테로시클로 알킬티오 및 옥시기로부터 선택된다.
용어 "헤테로 알킬기"란 하나의 또는 다수 개의 N, O 또는 S로부터 선택되는 헤테로원자를 함유하는 알킬기를 가리키는 것으로서, 여기서 알킬기는 위에 정의한 바와 같다.
용어 "알킬렌"이란 포화된 직쇄 또는 분지쇄 지방족 탄화수소기임을 가리키는 것으로서, 이는 2개의 모체 알케인의 동일 탄소원자 또는 두 개의 서로 다른 탄소원자에서 두 개의 수소원자를 제거하여 파생된 잔기를 갖는, 1개 내지 20개 탄소원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 원자단이며, 바람직하게는 1개 내지 12개 탄소원자를 함유하고, 보다 바람직하게는 1개 내지 6개 탄소원자(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 탄소원자 함유)를 함유하는 알킬렌이다. 알킬렌의 비제한적인 실시예로는 메틸렌(-CH2-), 1,1-에틸렌(-CH(CH3)-), 1,2-에틸렌(-CH2CH2)-, 1,1-프로필렌(-CH(CH2CH3)-), 1,2-프로필렌(-CH2CH(CH3)-), 1,3-프로필렌(-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸렌(-CH2CH2CH2CH2-) 및 1,5-부틸렌(-CH2CH2CH2CH2CH2-) 등을 포함하되 이에 한정되지는 않는다. 알킬렌은 치환 또는 비치환될 수 있는 것으로서, 치환되는 경우, 치환기는 임의의 사용 가능한 연결점에서 치환될 수 있고, 상기 치환기는 바람직하게는 독립적으로 선택적으로 알킬기, 알케닐, 알키닐, 알콕시기, 알킬티오, 알킬아미노기, 할로겐, 메르캅토기, 히드록실기, 니트로기, 시아노기, 시클로 알킬기, 헤테로고리기, 아릴기, 헤테로 아릴기, 시클로 알콕시기, 헤테로시클로 알콕시기, 시클로 알킬티오, 헤테로시클로 알킬티오 및 옥시기로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 치환기에 의해 치환된다.
용어 "알콕시기"란, -O-(알킬기) 및 -O-(비치환된 시클로 알킬기)임을 가리키는 것으로서, 여기서 알킬기 또는 시클로 알킬기에 대한 정의는 위에 기술한 바와 같다. 알콕시기의 비제한적인 예시로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 시클로프로폭시, 시클로부톡시, 시클로펜틸옥시, 시클로헥실옥시를 포함한다. 알콕시기는 선택적으로 치환 또는 비치환될 수 있는 것으로서, 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 독립적으로 알킬기, 알케닐, 알키닐, 알콕시기, 알킬티오, 알킬아미노기, 할로겐, 메르캅토기, 히드록실기, 니트로기, 시아노기, 시클로 알킬기, 헤테로시클로 알킬기, 아릴기, 헤테로 아릴기, 시클로 알콕시기, 헤테로시클로 알콕시기, 시클로 알킬티오 및 헤테로시클로 알킬티오로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 원자단이다.
용어 "시클로 알킬기"란 포화 또는 부분 불포화 단환 또는 다환 고리형 탄화수소 치환기를 가리키는 것으로서, 시클로 알킬기 고리는 3개 내지 20개 탄소원자를 포함하고, 바람직하게는 3개 내지 12개 탄소원자를 포함하며, 보다 바람직하게는 3개 내지 10개 탄소원자를 포함하며, 가장 바람직하게는 3개 내지 8개 탄소원자를 포함한다(3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 탄소원자 포함). 단환 시클로 알킬기의 비제한적인 예시로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헥사디에닐, 시클로헵틸, 시클로헵타트리에닐 및 시클로옥틸 등을 포함하고; 다환 시클로 알킬기는 스피로 고리, 축합 고리 및 브릿지 고리의 시클로 알킬기를 포함한다.
용어 "헤테로고리기"란, 포화 또는 부분 비포화의 단환 또는 다환 환형 탄화수소 치환기를 가리키는 것으로서, 이는 3개 내지 20개 고리원자를 포함하며, 여기서 하나 또는 다수 개의 고리원자는 질소, 산소 또는 S(O)m(여기서 m은 0, 1 또는 2의 정수)으로부터 선택되는 헤테로원자이나, -O-O-, -O-S- 또는 -S-S-의 고리부분은 포함되지 않고, 나머지 고리원자는 탄소이다. 바람직하게는 3개 내지 12개의 고리원자를 포함하고, 여기서 1개 내지 4개의 고리원자는 헤테로원자이고(1개, 2개, 3개 또는 4개 헤테로원자); 보다 바람직하게는 시클로 알킬기 고리는 3개 내지 10개 고리원자를 포함한다(3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 9개 또는 10개 고리원자 포함). 단환 헤테로고리기의 비제한적인 예시로는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 호모피페라지닐 등을 포함한다. 다환 헤테로고리기는 스피로 고리, 축합 고리 및 브릿지 고리의 헤테로고리기를 포함한다.
용어 "스피로 헤테로고리기"란, 5원 내지 20원의 단환 간에 하나의 원자(스피로 원자라 함)를 공용하는 다환 헤테로고리기를 가리키는 것으로서, 여기서 하나 또는 다수 개의 고리원자는 질소, 산소 또는 S(O)m(여기서 m은 0 내지 2의 정수)으로부터 선택되는 헤테로원자이고, 나머지 고리원자는 탄소이다. 이는 하나 또는 다수 개의 이중 결합을 가질 수 있으나, 완전히 공액된 π 전자 시스템을 갖는 고리는 없다. 바람직하게는 6원 내지 14원이고, 보다 바람직하게는 7원 내지 10원이다. 고리와 고리 간에 공유하는 스피로 원자의 수에 따라, 스피로 헤테로고리기를 단 스피로 헤테로고리기, 쌍 스피로 헤테로고리기 또는 다 스피로 헤테로고리기로 구분하고, 바람직하게는 단 스피로 헤테로고리기 및 쌍 스피로 헤테로고리기이다. 보다 바람직하게는 4원/4원, 4원/5원, 4원/6원, 5원/5원 또는 5원/6원 단 스피로 헤테로고리기이다. 스피로 헤테로고리기의 비제한적인 예시로는,
Figure pct00026
및
Figure pct00027
를 포함한다.
용어 "축합 헤테로고리기"란 5원 내지 20원임을 가리키는 것으로서, 시스템 중의 각 고리와 시스템의 기타 고리는 인접한 한 쌍의 원자의 다환 헤테로고리기를 공유하고, 하나 또는 다수 개의 고리는 하나 또는 다수 개의 이중 결합을 함유할 수 있으나, 완전히 공액된 π 전자 시스템을 갖는 고리는 없으며, 여기서 하나 또는 다수 개의 고리원자는 질소, 산소 또는 S(O)m(여기서 m은 0, 1 또는 2의 정수)으로부터 선택되는 헤테로원자이고, 나머지 고리원자는 탄소이다. 바람직하게는 6원 내지 14원이고, 보다 바람직하게는 7원 내지 10원이다(7원, 8원, 9원 또는 10원 고리). 고리를 구성하는 수에 따라 이환, 삼환, 사환 또는 다환 축합 헤테로고리기로 나눌 수 있고, 바람직하게는 이환 또는 삼환이고, 보다 바람직하게는 5원/5원 또는 5원/6원의 이환 축합 헤테로고리기이다. 축합 헤테로고리기의 비제한적인 예시로는,
Figure pct00028
Figure pct00029
및
Figure pct00030
를 포함하다.
용어 "브릿지 헤테로고리기"란 5원 내지 14원 중, 임의의 두 개의 고리가 두 개의 직접 연결되지 않는 원자를 공용하는 다환 헤테로고리기임을 가리키는 것으로서, 이는 하나 또는 다수 개의 이중 결합을 함유할 수 있으나, 완전히 공액된 π 전자 시스템을 갖는 고리는 없으며, 여기서 하나 또는 다수 개의 고리원자는 질소, 산소 또는 S(O)m(여기서 m은 0, 1 또는 2의 정수)으로부터 선택되는 헤테로원자이고, 나머지 고리원자는 탄소이다. 바람직하게는 6원 내지 14원이고, 보다 바람직하게는 7원 내지 10원이다(7원, 8원, 9원 또는 10원 고리). 고리를 구성하는 수에 따라 이환, 삼환, 사환 또는 다환 브릿지 헤테로고리기로 나눌 수 있고, 바람직하게는 이환, 삼환 또는 사환이고, 보다 바람직하게는 이환 또는 삼환이다. 브릿지 헤테로고리기의 비제한적인 예시로는,
Figure pct00031
Figure pct00032
및
Figure pct00033
를 포함한다.
상기 헤테로고리기 고리는 아릴기, 헤테로 아릴기 또는 시클로 알킬기 고리에 축합될 수 있는 것으로서, 여기서 모체 구조와 함께 연결된 고리는 헤테로고리기이며, 이의 비제한적인 예시로는,
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
및
Figure pct00037
등을 포함한다.
헤테로고리기는 선택적으로 치환 또는 비치환될 수 있는 것으로서, 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 독립적으로 알킬기, 알케닐, 알키닐, 알콕시기, 알킬티오, 알킬아미노기, 할로겐, 메르캅토기, 히드록실기, 니트로기, 시아노기, 시클로 알킬기, 헤테로시클로 알킬기, 아릴기, 헤테로 아릴기, 시클로 알콕시기, 헤테로시클로 알콕시기, 시클로 알킬티오, 헤테로시클로 알킬티오 및 옥시기로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 원자단이다.
용어 "아릴기"란 공액의 π 전자 시스템을 갖는 6원 내지 14원의 전탄소 단환 또는 축합 다환(다시말해 인접 탄소원자쌍을 공유하는 고리) 원자단임을 가리키는 것으로서, 바람직하게는 6원 내지 10원(6원, 7원, 8원, 9원或10원)의 예를 들어 페닐 및 나프틸이며, 바람직하게는 페닐이다. 상기 아릴기 고리는 헤테로 아릴기, 헤테로고리기 또는 시클로 알킬기 고리에 축합될 수 있는 것으로서, 여기서 모체 구조와 함께 연결되는 고리는 아릴기 고리이며, 이의 비제한적인 예시로는,
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
및
Figure pct00050
를 포함한다.
아릴기는 치환 또는 비치환될 수 있는 것으로서, 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 독립적으로 알킬기, 알케닐, 알키닐, 알콕시기, 알킬티오, 알킬아미노기, 할로겐, 메르캅토기, 히드록실기, 니트로기, 시아노기, 시클로 알킬기, 헤테로시클로 알킬기, 아릴기, 헤테로 아릴기, 시클로 알콕시기, 헤테로시클로 알콕시기, 시클로 알킬티오 및 헤테로시클로 알킬티오로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 원자단이다.
용어 "헤테로 아릴기"란 1개 내지 4개 헤테로원자(1개, 2개, 3개 또는 4개 헤테로원자), 5개 내지 14개 고리원자를 포함하는 헤테로 방향족 계열임을 가리키며, 여기서 헤테로원자는 산소, 황, 질소로부터 선택된다. 헤테로 아릴기는 바람직하게는 5원 내지 10원(5원, 6원, 7원, 8원, 9원 또는 10원 헤테로 아릴기)이고, 보다 바람직하게는 5원 또는 6원의 예를 들어 푸릴, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, N-알킬피롤릴, 피리미디닐, 피라지닐, 이미다졸릴 및 테트라졸릴 등이다. 상기 헤테로 아릴기 고리는 아릴기, 헤테로고리기 또는 시클로 알킬기 고리 상에 축합될 수 있는 것으로서, 여기서, 모체 구조와 함께 연결되는 고리는 헤테로 아릴기 고리이며, 이의 비제한적인 예시로는,
Figure pct00051
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및
Figure pct00060
를 포함한다.
헤테로 아릴기는 선택적으로 치환 또는 비치환될 수 있는 것으로서, 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 독립적으로 알킬기, 알케닐, 알키닐, 알콕시기, 알킬티오, 알킬아미노기, 할로겐, 메르캅토기, 히드록실기, 니트로기, 시아노기, 시클로 알킬기, 헤테로시클로 알킬기, 아릴기, 헤테로 아릴기, 시클로 알콕시기, 헤테로시클로 알콕시기, 시클로 알킬티오 및 헤테로시클로 알킬티오로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 원자단이다.
용어 "아미노기 보호기"는 분자 기타 부위가 반응할 때 아미노기가 변하지 않도록 유지하기 위하여, 탈기가 용이한 원자단으로 아미노기를 보호하는 것이다. 비제한적인 실시예로는 9-플루오렌메톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 아세틸, 벤질, 알릴 및 p-메톡시벤질 등을 포함한다. 이러한 원자단은 선택적으로 할로겐, 알콕시기 또는 니트로기로부터 선태되는 1개 내지 3개의 치환기(1개, 2개 또는 3개 치환기)에 의해 치환될 수 있다. 상기 아미노기 보호기는 바람직하게는 9-플루오렌메톡시카르보닐이다.
용어 "할로겐화 알킬기"란, 알킬기 상의 수소가 하나 또는 다수 개의 할로겐에 의해 치환됨을 가리키는 것으로서, 여기서 알킬기는 위에 정의한 바와 같다.
용어 "듀테로화 알킬기"란, 알킬기 상의 수소가 하나 또는 다수 개의 듀테륨에 의해 치환됨을 가리키는 것으로서, 여기서 알킬기는 위에 정의한 바와 같다.
용어 "히드록시 알킬기"란, 알킬기 상의 수소가 하나 또는 다수 개의 히드록시기에 의해 치환됨을 가리키는 것으로서, 여기서 알킬기는 위에 정의한 바와 같다.
용어 "히드록실기"는 -OH 원자단을 가리킨다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브로 또는 요오드를 가리킨다.
용어 "아미노기"는 -NH2를 가리킨다.
용어 "니트로기"는 -NO2를 가리킨다.
용어 "시아노기"는 -CN을 가리킨다.
용어 "아미도기"는 -C(O)N(알킬기) 또는 (시클로 알킬기)를 가리키는 것으로서, 여기서 알킬기, 시클로 알킬기는 위에 정의한 바와 같다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 이어서 설명되는 사건 또는 환경이 발생할 수 있으나 반드시 발생하는 것은 아님을 의미하는 것으로서, 해당 설명은 해당 사건 또는 환경이 발생하거나 또는 발생하지 않는 상황을 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 알킬기에 의해 치환되는 헤테로 고리기"는 알킬기가 존재할 수 있으나 반드시 존재하는 것은 아님을 의미하는 것으로서, 해당 설명은 헤테로 고리기가 알킬기에 의해 치환되는 상황과 헤테로고리기가 알킬기에 의해 치환되지 않는 상황을 포함한다.
"치환되는"은 원자단 중의 하나 또는 다수 개(바람직하게는 최대 5개, 보다 바람직하게는 1개, 2개 또는 3개)의 수소원자가 각각 독립적으로 치환기에 의해 치환되는 것을 가리킨다. 치환기는 단지 이들이 처할 수 있는 화학 위치에 처하는 것으로서, 당업자는 많은 노력을 기울이지 않고도 가능 또는 불가능한 치환을 확정(실험 또는 이론을 통함)할 수 있다. 예를 들어, 유리 수소를 갖는 아미노기 또는 히드록실기가 불포화(예컨대 올리핀계) 결합을 갖는 탄소원자와 결합할 때 안정적이지 않을 수 있다.
용어 "약학 조성물"은 일종 또는 다종의 본 명세서에 따른 화합물 또는 그 생리학적으로/약용 가능한 염 또는 전구체 약물과 기타 화학성분의 혼합물, 및 기타 성분 예를 들어 생리학적으로/약용 가능한 벡터 및 부형제를 함유하는 것을 나타낸다. 약학 조성물은 생물체에 대한 투약을 촉진하고, 활성성분의 흡수에 유리하도록 하여 생물활성을 발휘하는 것을 목표로 한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염" 또는 "약용 가능한 염"이란, 본 개시 리간드-약물 접합체의 염, 또는 본 개시에 따른 활성 화합물의 염을 가리키는 것으로서, 이와 같은 염은 피시험자에게 사용될 때 안정성과 유효성을 가지며, 또한 가져야할 생물활성을 갖으며, 본 개시의 리간드-약물 접합체는 적어도 하나의 아미노기를 함유하므로, 산과 염을 형성할 수 있고, 약용 가능한 염의 비제한적인 예시로는, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 중황산염, 구연산염, 아세트산염, 숙신산염, 아스코르브산염, 옥살산염, 질산염, 배산염, 인산수소염, 인산이수소, 살리실산염, 구연산수소, 주석산염, 말레산염, 푸마르산염, 포름산염, 황산벤조산에탄, 산염, p-톨루엔술포네이트를 포함한다.
본 개시의 일 실시방식에서, 세포독성 약물은 연결자 유닛을 통해 항체의 메르캅토기에 접합된다.
이하와 같은 비제한적인 방법을 이용하여 리간드 세포독성 약물 접합체의 로딩량을 제어할 수 있다.
(1) 연결 시약과 단일항체의 몰비를 제어;
(2) 반응시간 및 온도를 제어;
(3) 서로 다른 반응 시약을 선택.
통상적인 약학 조성물에 대한 제조는 중국 약전을 참조한다.
본 개시의 약물에 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 벡터"는 약물이 피시험자 체내에 투입되는 방식과 체내에서의 분포를 바꾸고 약물의 방출속도를 제어하고 약물을 표적 장기까지 운반하는 체계를 가리킨다. 약물 벡터 방출 및 표적 시스템은 약물의 분해 및 손실을 감소시키고, 부작용을 낮추고, 생물 이용율을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 벡터로서 사용될 수 있는 고분자 계면활성제는 그 독특한 양친성 구조로 인해, 스스로 조합하여, 여러 가지 형식의 집합체를 형성할 수 있는 것으로서, 바람직한 예시로는 미셀, 마이크로에멀젼, 젤, 액정, 소포 등이 있다. 이러한 집합체는 약물분자를 감싸 운송할 수 있는 능력을 갖는 동시에, 또한 막에 대한 양호한 삼투성을 가지는 점으로 인해, 뛰어난 약물 벡터로 사용될 수 있다.
용어 "부형제"는 약학 조성물 중 활성 화합물을 제외한 부가물을 가리키는 것으로서, 보조제라고도 칭할 수 있다. 예를 들어, 정제 중의 접합제, 충진제, 붕해제, 윤활제; 반고체 제제 중의 연고제, 크림제의 기질 부분; 액체 제제 중의 방부제, 항산화제, 방취제, 방향제, 용융제, 유화제, 가용화제, 삼투압 조절제, 착색제; 등이 모두 부형제라고 칭할 수 있다.
용어 "희석제"는 또한 충진제라고도 칭하는데, 이의 주요 용도는 정제의 중량과 부피를 증가시키는 것이다. 희석제의 추가는 일정의 정해진 부피 크기를 보장할 뿐만 아니라, 주요 성분의 용량 차이를 줄이고, 약물의 압축 성형성 등을 개선한다. 정제의 약물에 유성 성분이 함유될 경우, 흡수제를 추가하여 유성 물질을 흡수해야 하여 "건조"상태를 유지하도록 하여, 정제로 제조되기에 유리하도록 한다. 예를 들어, 전분, 유당, 칼슘의 무기염, 아비셀 등이다.
약학 조성물은 무균 주사 수용액 형식일 수 있다. 사용하는 허용 가능한 용매 및 용제에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있을 수 있다. 무균 주사 제제는 활성성분이 유상에 녹는 무균 주사 수중유적형 미탁제일 수 있다. 예를 들어, 활성성분을 대두유와 레시틴의 혼합물에 녹인다. 그 다음, 오일 용액을 물과 글리세린의 혼합물에 추가하여 미탁제를 형성한다. 부분적 대량 주사를 통해, 주사액 또는 미탁제를 피시험자의 혈류에 주입할 수 있다. 또는, 가장 좋기는 본 개시 화합물의 변하지 않은 순환 농도를 유지할 수 있는 방식으로 용액 및 미탁제를 투여한다. 이와 같은 변하지 않은 농도를 유지하기 위하여, 연속 정맥 내 약물전달 장치를 사용할 수 있다. 이와 같은 장치의 예시로는 Deltec CADD-PLUS. TM. 5400형 정맥 주사펌프이다.
약학 조성물은 근육내 또는 피하 투약하기 위한 무균 주사액 또는 오일 현택액의 형식일 수 있다. 종래 기술에 따라, 위에 기술한 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 해당 현택액을 배합할 수 있다. 무균 주사제제 역시 무균 경구외 수용 가능한 희석제 또는 용매에서 제조한 무균 주사용액 또는 현탁액일 수 있어, 예를 들어 1,3-부탄디올에서 제조하는 용액이다. 이외, 간편하게 무균 고정유를 용매 또는 현탁 매개로 사용할 수 있다. 이와 같은 목적을 위하여, 합성 모노아실글리세롤 또는 디글리세리드를 포함하는 모든 배합된 고정유를 사용할 수 있다. 이외, 올레인산과 같은 지방산으로도 주사제를 제조할 수 있다.
2. 합성 방법
합성의 목적을 달성하기 위하여, 하기와 같은 합성 기술방안을 채택한다.
식(Pc-La-Y-D)로 표시되는 화합물의 제조방법은, 하기와 같은 단계를 포함하고,
Figure pct00061
Figure pct00062
Pc가 환원된 후, 식(La-Y-D)와 공역반응을 하여, 식(Pc-La-Y-D)로 표시되는 화합물을 얻는 단계; 환원제는 바람직하게는 TCEP이고, 특별히, 바람직하게는 항체의 이황화 결합이 환원된 것이며;
여기서: Pc, W, L2, L3, R1, R2, R5 내지 R7, m 및 n은 식(Pc-La-Y-D)에서 정의한 바와 같다.
위 설명서에서는 본 개시의 일종 또는 다종의 실시양태에 대한 세부사항을 제시하였다. 본 명세서에 기술한 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법 및 재료를 사용하여 본 개시를 실시 또는 시험할 수 있으나, 이하에서는 바람직한 방법 및 재료에 대하여 설명한다. 명세서 및 청구범위를 통해, 본 개시의 기타 특징, 목적 및 장점은 자명하게 드러난다. 명세서 및 청구범위에서, 앞뒤 문맥에서 명확하게 설명하지 않은 한, 단수 형식은 복수 지시물을 포함한다. 별도로 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시에 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 명세서에서 인용한 모든 특허 및 출판물은 다 인용을 통해 본문에 포함된다. 이하 실시예를 제안하는 것은, 본 개시의 바람직한 실시양태을 보다 더 전면적으로 설명하기 위한 것이다. 이들 실시예는 어떤 방식으로도 본 개시의 범위를 한정하는 것으로 이해해서는 아니될 것이며, 본 개시의 범위는 청구범위에 의해 한정된다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
1. 항체의 제조
실시예 1-1: claudin18.2 과발현 세포주 구축
pCDH-hClaudin18.2 렌티바이러스 발현벡터 플라스미드와 pVSV-G, pCMV-dR8.91 렌티바이러스 시스템 패키징 벡터를 Lipofectamine 3000 형질전환제를 이용하여 바이러스 패키징 세포 293T에 형질전환하고; 바이러스를 함유하는 배양지 상청액을 수집하고, 여과하여 초고속 원심분리를 실행하고; 농축된 후의 바이러스로 인간 위 인환 세포함 세포주 NUGC4를 감염시키고, puromycin을 통해 2주 내지 3주 동안 선별하고, 그 다음 FACS 단세포 선별을 진행한다.
종양 IHC 점수에 따라 Claudin18.2 발현정도를 구분한다. 종양 IHC 점수가 3점인 종양 Claudin18.2 발현 수준에 상당한 세포가 과발현세포이고; 종양 IHC 점수가 2점인 종양 Claudin18.2 발현 수준에 상당한 세포가 중등 발현 세포이다. FACS를 통해 렌티바이러스 감염된 NUGC4 세포표면의 Claudin18.2 발현을 검측하여, Claudin18.2 발현량이 높은 NUGC4/hClaudin18.2 단클론 세포주를 선별한다. 동시에 FACS를 통해 야생형 NUGC4 세포표면의 Claudin18.2 발현을 검측하여, Claudin18.2 발현량이 중등 정도의 NUGC4 클론 세포주를 선별하고, 야생형 NUGC4는 Claudin18.2 저발현량 세포이다.
선별한 단클론 세포주를 증식하고 배양하여, 후속 실험을 위해 냉동 보관한다.
Claudin18.2 서열 Genbank: NP_001002026: (SEQ ID NO: 1)
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV;
Claudin18.2 DNA 서열: (SEQ ID NO: 2)
1 AGAATTGCGC TGTCCACTTG TCGTGTGGCT CTGTGTCGAC ACTGTGCGCC ACCATGGCCG
61 TGACTGCCTG TCAGGGCTTG GGGTTCGTGG TTTCACTGAT TGGGATTGCG GGCATCATTG
121 CTGCCACCTG CATGGACCAG TGGAGCACCC AAGACTTGTA CAACAACCCC GTAACAGCTG
181 TTTTCAACTA CCAGGGGCTG TGGCGCTCCT GTGTCCGAGA GAGCTCTGGC TTCACCGAGT
241 GCCGGGGCTA CTTCACCCTG CTGGGGCTGC CAGCCATGCT GCAGGCAGTG CGAGCCCTGA
301 TGATCGTAGG CATCGTCCTG GGTGCCATTG GCCTCCTGGT ATCCATCTTT GCCCTGAAAT
361 GCATCCGCAT TGGCAGCATG GAGGACTCTG CCAAAGCCAA CATGACACTG ACCTCCGGGA
421 TCATGTTCAT TGTCTCAGGT CTTTGTGCAA TTGCTGGAGT GTCTGTGTTT GCCAACATGC
481 TGGTGACTAA CTTCTGGATG TCCACAGCTA ACATGTACAC CGGCATGGGT GGGATGGTGC
541 AGACTGTTCA GACCAGGTAC ACATTTGGTG CGGCTCTGTT CGTGGGCTGG GTCGCTGGAG
601 GCCTCACACT AATTGGGGGT GTGATGATGT GCATCGCCTG CCGGGGCCTG GCACCAGAAG
661 AAACCAACTA CAAAGCCGTT TCTTATCATG CCTCAGGCCA CAGTGTTGCC TACAAGCCTG
721 GAGGCTTCAA GGCCAGCACT GGCTTTGGGT CCAACACCAA AAACAAGAAG ATATACGATG
781 GAGGTGCCCG CACAGAGGAC GAGGTACAAT CTTATCCTTC CAAGCACGAC TATGTGTAAT
841 GCTCTAAGAC CTCTCAGCAC GGGCGGAAGA AACTCCCGGA GAGCTCACCC AAAAAACAAG
901 GAGATCCCAT CTAGATTTCT TCTTGCTTTT GACTCACAGC TGGAAGTTAG AAAAGCCTCG
961 ATTTCATCTT TGGAGAGGCC AAATGGTCTT AGCCTCAGTC TCTGTCTCTA AATATTCCAC
1021 CATAAAACAG CTGAGTTATT TATGAATTAG AGGCTATAGC TCACATTTTC AATCCTCTAT
1081 TTCTTTTTTT AAATATAACT TTCTACTCTG ATGAGAGAAT GTGGTTTTAA TCTCTCTCTC
1141 ACATTTTGAT GATTTAGACA GACTCCCCCT CTTCCTCCTA GTCAATAAAC CCATTGATGA
1201 TCTATTTCCC AGCTTATCCC CAAGAAAACT TTTGAAAGGA AAGAGTAGAC CCAAAGATGT
1261 TATTTTCTGC TGTTTGAATT TTGTCTCCCC ACCCCCAACT TGGCTAGTAA TAAACACTTA
1321 CTGAAGAAGA AGCAATAAGA GAAAGATATT TGTAATCTCT CCAGCCCATG ATCTCGGTTT
1381 TCTTACACTG TGATCTTAAA AGTTACCAAA CCAAAGTCAT TTTCAGTTTG AGGCAACCAA
1441 ACCTTTCTAC TGCTGTTGAC ATCTTCTTAT TACAGCAACA CCATTCTAGG AGTTTCCTGA
1501 GCTCTCCACT GGAGTCCTCT TTCTGTCGCG GGTCAGAAAT TGTCCCTAGA TGAATGAGAA
1561 AATTATTTTT TTTAATTTAA GTCCTAAATA TAGTTAAAAT AAATAATGTT TTAGTAAAAT
1621 GATACACTAT CTCTGTGAAA TAGCCTCACC CCTACATGTG GATAGAAGGA AATGAAAAAA
1681 TAATTGCTTT GACATTGTCT ATATGGTACT TTGTAAAGTC ATGCTTAAGT ACAAATTCCA
1741 TGAAAAGCTC ACTGATCCTA ATTCTTTCCC TTTGAGGTCT CTATGGCTCT GATTGTACAT
1801 GATAGTAAGT GTAAGCCATG TAAAAAGTAA ATAATGTCTG GGCACAGTGG CTCACGCCTG
1861 TAATCCTAGC ACTTTGGGAG GCTGAGGAGG AAGGATCACT TGAGCCCAGA AGTTCGAGAC
1921 TAGCCTGGGC AACATGGAGA AGCCCTGTCT CTACAAAATA CAGAGAGAAA AAATCAGCCA
1981 GTCATGGTGG CCTACACCTG TAGTCCCAGC ATTCCGGGAG GCTGAGGTGG GAGGATCACT
2041 TGAGCCCAGG GAGGTTGGGG CTGCAGTGAG CCATGATCAC ACCACTGCAC TCCAGCCAGG
2101 TGACATAGCG AGATCCTGTC TAAAAAAATA AAAAATAAAT AATGGAACAC AGCAAGTCCT
2161 AGGAAGTAGG TTAAAACTAA TTCTTTAAAA AAAAAAAAAA GTTGAGCCTG AATTAAATGT
2221 AATGTTTCCA AGTGACAGGT ATCCACATTT GCATGGTTAC AAGCCACTGC CAGTTAGCAG
2281 TAGCACTTTC CTGGCACTGT GGTCGGTTTT GTTTTGTTTT GCTTTGTTTA GAGACGGGGT
2341 CTCACTTTCC AGGCTGGCCT CAAACTCCTG CACTCAAGCA ATTCTTCTAC CCTGGCCTCC
2401 CAAGTAGCTG GAATTACAGG TGTGCGCCAT CACAACTAGC TGGTGGTCAG TTTTGTTACT
2461 CTGAGAGCTG TTCACTTCTC TGAATTCACC TAGAGTGGTT GGACCATCAG ATGTTTGGGC
2521 AAAACTGAAA GCTCTTTGCA ACCACACACC TTCCCTGAGC TTACATCACT GCCCTTTTGA
2581 GCAGAAAGTC TAAATTCCTT CCAAGACAGT AGAATTCCAT CCCAGTACCA AAGCCAGATA
2641 GGCCCCCTAG GAAACTGAGG TAAGAGCAGT CTCTAAAAAC TACCCACAGC AGCATTGGTG
2701 CAGGGGAACT TGGCCATTAG GTTATTATTT GAGAGGAAAG TCCTCACATC AATAGTACAT
2761 ATGAAAGTGA CCTCCAAGGG GATTGGTGAA TACTCATAAG GATCTTCAGG CTGAACAGAC
2821 TATGTCTGGG GAAAGAACGG ATTATGCCCC ATTAAATAAC AAGTTGTGTT CAAGAGTCAG
2881 AGCAGTGAGC TCAGAGGCCC TTCTCACTGA GACAGCAACA TTTAAACCAA ACCAGAGGAA
2941 GTATTTGTGG AACTCACTGC CTCAGTTTGG GTAAAGGATG AGCAGACAAG TCAACTAAAG
3001 AAAAAAGAAA AGCAAGGAGG AGGGTTGAGC AATCTAGAGC ATGGAGTTTG TTAAGTGCTC
3061 TCTGGATTTG AGTTGAAGAG CATCCATTTG AGTTGAAGGC CACAGGGCAC AATGAGCTCT
3121 CCCTTCTACC ACCAGAAAGT CCCTGGTCAG GTCTCAGGTA GTGCGGTGTG GCTCAGCTGG
3181 GTTTTTAATT AGCGCATTCT CTATCCAACA TTTAATTGTT TGAAAGCCTC CATATAGTTA
3241 GATTGTGCTT TGTAATTTTG TTGTTGTTGC TCTATCTTAT TGTATATGCA TTGAGTATTA
3301 ACCTGAATGT TTTGTTACTT AAATATTAAA AACACTGTTA TCCTACAGTT.
실시예 1-2: 항 인간claudin18.2 단클론 항체 생산
1. 면역
항 인간Claudin18.2 단클론 항체는 면역 생쥐를 통해 생성. 실험은 암컷의 6-8주령이 된 SJL 흰 생쥐를 사용한다(베이징 Weitong Lihua 실험 동물 기술 유한 회사, 동물생산면허증: SCXK(경)2012-0001). 사육환경: SPF등급. 생쥐 구입 후, 실험실 환경에서 1주 사육, 12/12시간 명암주기 조절, 온도 20℃ 내지 25℃; 습도 40% 내지 60%. 환경에 적응한 생쥐를 다음 방안에 따라 면역을 진행한다. 면역항원은 huClaudin18.2-HEK293 세포(인간 Claudin18.2 플라스미드를 형질전환한 HEK-293 안정 세포주).
면역방안: 첫번째 세포 면역 전, TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No. T2684)를 이용하여 0.1mL/마리 생쥐 복막 내(IP) 주사 후, 30분 후 각 생쥐 복막 내(IP)에 생리식염수 0.1mL을 주사하고 1x108/mL 농도가 될 때까지 세포액을 희석한다. 세포를 골고루 날리게 불은 후, 접종을 진행하며, 시점은 0, 14, 28, 42, 56일이다. 21, 35, 49, 63일에 채혈하여, ELISA방법으로 생쥐 혈청 중의 항체 역가를 확정한다. 4차 내지 5차 면역 후, 혈청 중 항체 역가가 높고 역가가 플랫폼에 기울이는 생쥐를 선택하여 비장세포 융합을 진행한다. 비장세포 융합 3일 전에 면역을 강화시켜 복막 내(IP) 1x107 세포를 주사한다.
2. 비장세포 융합
최적화 PEG에 의해 매개된 융합 단계를 채택하여 비장 림프구세포와 골수종 세포Sp2/0 세포(ATCC® CRL-8287™)를 융합하여 하이브리드도마 세포를 얻는다. 융합하여 얻은 하이브리드도마 세포를 0.5x106/mL 내지 1x106/mL의 밀도로 완전 배지(20% FBS, 1xHAT, 1xOPI 함유한 IMDM 배지)를 통해 현탁시키고, 100μL/웰로 96웰 플레이트에 주입하고, 37℃, 5％ CO2에서 3일 내지 4일 동안 인큐베이션한 후, HAT 완전 배지 100μL/웰을 보충하여, 바늘 끝과 같은 클론이 형성될 때까지 계속하여 3일 내지 4일 동안 배양한다. 상청액 제거 후, 200μL/웰의 HT 완전 배지(20%FBS, 1xHT 및 1xOPI 함유된 IMDM 배지) 추가하여, 37℃, 5％CO2에서 3일 동안 배양 후 ELISA 검측을 진행한다.
3. 하이브리드도마 세포 선별
하이브리드도마 세포 성장 밀도에 따라, ELISA 방법을 결부시켜 하이브리드도마 배양 상청액을 검측한다. huClaudin18.2-HEK293 세포와의 결합능력이 강하는 동시에 HEK293 세포와 결합하지 않은 세포를 선택하여 즉시에 증폭하여 냉동 보관하고, 단세포 클론을 획득할 때까지 2번 내지 3번의 서브클론을 진행한다.
각 회차의 서브클론 세포 역시 모두 세포 결합 실험 검측을 진행해야 한다. 위 실험을 통해 선별하여 하이브리드도마 클론을 얻고, 무혈청 세포 배양법으로 항체를 제조하고, 검측 예시에서 사용하기 위해 예시적 정제에 따라 항체를 정제한다.
실시예 1-3: 쥐 항체의 인간화
체외 활성이 높은 단클론 하이브리드도마 세포주 mAb1901, mAb1902를 선별하여, 그 중의 단클론 항체 서열을 복제한 다음, 인간화, 발현 재조합 및 활성 평가를 진행한다.
하이브리드도마로부터 서열을 복제하는 과정은 다음과 같다. 대수성장기의 하이브리드도마 세포를 수집하고, Trizol(Invitrogen, 15596-018)로 RNA(키트 설명서의 단계에 따라)를 추출하여, 역전사한다(PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, cat # 2680A). 역전사하여 얻은 cDNA를 mouse Ig-Primer Set(Novagen, TB326 Rev.B 0503)로 PCR 증폭한 후 시퀀싱 회사에 보내고 시퀀싱을 한다. 얻은 하이브리드도마 세포 DNA 서열과 대응되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3 내지 6으로 제시된다.
mAb1901쥐 중쇄 가변영역(SEQ ID NO: 3)
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSS;
mAb1901쥐 경쇄 가변영역(SEQ ID NO: 4)
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELK;
mAb1902쥐 중쇄 가변영역(SEQ ID NO: 5)
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSS;
mAb1902쥐 경쇄 가변영역(SEQ ID NO: 6)
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIK;
상기 쥐 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 각각 하기의 인간 IgG1 항체의 중쇄 불변영역 및 인간 κ 경쇄 불변영역과 연결하여 키메라 항체 ch1901 및 ch1902를 형성한다.
불변영역은 이하 서열로부터 선택된다.
인간 IgG1 항체의 중쇄 불변영역: (SEQ ID NO: 7)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
인간 κ 경쇄 불변영역: (SEQ ID NO: 8)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
쥐 단클론 항체 인간화는 본 분야의 수많은 문헌에서 공개적으로 개시한 방법과 같이 진행한다. 간단히 말하자면, 인간 불변 도메인으로 모체(쥐 항체) 불변 도메인을 대체하여, 쥐 항체와 인간 항체의 동원성에 따라 인간 생식계열 항체 서열을 선택하여, CDR 이식을 진행한다. 본 발명은 활성이 좋은 후보 분자를 선택하여 인간화를 진행하였으며, 결과는 다음과 같다.
1. 쥐 항체의 CDR 영역
표 1에서 VH/VL CDR의 아미노산 잔기는 Kabat 넘버링 시스템으로 확정 및 주석하였다.
쥐 항체의 CDR 서열은 표 1과 같다.
표 1. 쥐 항체의 CDR 서열
Figure pct00063
2. 인간 생식계열 FR 영역 서열 선택
획득한 쥐 항체 VH/VLCDR 전형적 구조를 기초로 하여, 중쇄, 경쇄의 가변영역 서열을 항체 Germline 데이터베이스와 비교하여, 동원성이 높은 인간 생식계열 모델을 얻게 된다. 여기서, 인간 생식계열 경쇄 프레임워크 영역은 인간 κ 경쇄 유전자로부터 유래된다.
2.1. mAb1901의 인간화 개조 및 복귀 돌연변이 설계
적당한 인간 항체 생식계열을 선택하여, mAb1901 쥐 항체에 대하여 인간화 개조를 진행하여, 쥐 항체 mAb1901의 CDR 영역을 선택한 인간화 모델로 이식하고, 인간화 가변영역을 대체한 후, IgG 불변영역과 재조합하여 완정한 항체를 형성한다. 동시에, 인간화 항체의 V 영역 중의 FR 영역에 대하여 복귀 돌연변이를 진행하는 것으로서, 예시적인 복귀 돌연변이 형식 및 조합은 다음과 같다.
표 2. mAb1901 인간화 항체 및 복귀 돌연변이*
Figure pct00064
* 표에서 모든 아미노산 위치 번호는 Kabat 넘버링 규칙에 따라 부여된 번호이고, 중쇄 가변영역의 N82T에서, 82는 Kabat 규칙의 위치 82A이다.
표 3. mAb1901 인간화 항체 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역 서열
Figure pct00065
위 표에서 대응되는 중쇄 가변영역은 SEQ ID NO: 7로 제시되는 인간 IgG1 중쇄 불변영역과 연결하여 전장 항체의 중쇄를 형성하고, 경쇄 가변영역은 SEQ ID NO: 8로 제시되는 인간 κ 경쇄 불변영역과 연결하여 전장 항체의 경쇄를 형성한다. 기타 실시양태에서, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 역시 각각 기타 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역과 연결하여 전장 항체를 형성할 수 있다.
2.2. mAb1902의 인간화 개조 및 복귀 돌연변이 설계
적당한 인간 항체 생식계열을 선택하여, mAb1902 쥐 항체에 대하여 인간화 개조를 진행하여, 쥐 항체 mAb1902의 CDR 영역을 선택한 인간화 모델로 이식하고, 인간화 가변영역을 대체한 후, IgG 불변영역과 재조합하여 완정한 항체를 형성한다. 동시에, 인간화 항체의 V 영역 중의 FR 영역에 대하여 복귀 돌연변이를 진행하는 것으로서, 예시적인 복귀 돌연변이 형식 및 조합은 다음과 같다.
표 4. mAb1902 인간화 항체 및 그 복귀 돌연변이 설계*
Figure pct00066
* 표에서 모든 아미노산 위치 번호는 Kabat 넘버링 규칙에 따라 부여된 번호이다.
표 5. mAb1902 인간화 항체 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역 서열
Figure pct00067
위 표에서 대응되는 중쇄 가변영역은 SEQ ID NO: 7로 제시되는 인간 IgG1 중쇄 불변영역과 연결하여 전장 항체의 중쇄를 형성하고, 경쇄 가변영역은 SEQ ID NO: 8로 제시되는 인간 κ 경쇄 불변영역과 연결하여 전장 항체의 경쇄를 형성한다.
키메라 항체 ch1901
ch1901 중쇄: (SEQ ID NO: 35)
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
ch1901 경쇄(SEQ ID NO: 36)
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;
키메라 항체 ch1902
ch1902 중쇄(SEQ ID NO: 37)
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
ch1902 경쇄(SEQ ID NO: 38)
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
표 6은 mAb1901의 인간화 항체를 보여준다.
표 6. mAb1901 인간화 항체
Figure pct00068
비고: 표에서 인간화 항체 h1901-1의 중쇄는 H1이고, 경쇄는 L1이며, 나머지 것은 이런 식으로 유추된다. mAb1901의 인간화 항체의 전장 항체 경쇄 및 중쇄 서열은 다음 표 7과 같다.
표 7. mAb1901 이간화 항체 경쇄 및 중쇄 서열
Figure pct00069
Figure pct00070
표 8은 mAb1902의 인간화 항체를 보여준다.
표8. mAb1902 인간화 항체
Figure pct00071
비고: 표에서 인간화 항체 h1902-1의 중쇄는 H11이고, 경쇄는 L11이며, 나머지 것은 이런 식으로 유추된다.
mAb1902의 인간화 항체 경쇄 및 중쇄 서열은 다음 표9와 같다.
표 9. mAb1901 인간화 항체 경쇄 및 중쇄 서열
Figure pct00072
Figure pct00073
본 개시의 양성 대조 항체가 IMAB-362임(출처 WO2016166122)
IMAB-362 중쇄: (SEQ ID NO: 53)
1 QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN
51 IYPSDSYTNY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTRSW
101 RGNSFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK;
IMAB-362 경쇄: (SEQ ID NO: 54)
1 DIVMTQSPSS LTVTAGEKVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP
51 KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCQNDYSY
101 PFTFGSGTKL EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA
151 KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC
201 EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC.
통상적인 유전자 복제, 재조합 발현 방법을 이용하여 상기 항체를 각각 복제, 발현, 정제한다.
2. 화합물의 제조
본 개시 실시예에서 구체적인 조건이 밝히지 않은 실험방법은, 통상적으로 일반적인 조건, 혹은 원료 또는 제품 제조업체에서 건의한 조건에 따른다. 구체적 출처를 밝히지 않은 시약은 시판되는 일반적인 시약이다.
화합물의 구조는 핵자기공명(NMR) 또는 질량분석(MS)을 통해 확인한다. NMR 측정은 Bruker AVANCE-400 핵자기공명기를 사용하고, 측정 용액은 듀테로화 디메틸 설폭사이드(DMSO-d6), 듀테로화 클로로포름(CDCl3), 듀테로화 메탄올(CD3OD)이고, 내부 표준은 테트라메틸실란(TMS)이고, 화학적 이동은 10-6(ppm)을 단위로 한다.
MS 측정은 FINNIGAN LCQAd (ESI) 질량분석기(생산업체: Thermo, 모델명: Finnigan LCQ advantage MAX)를 사용한다.
UPLC 측정은 Waters Acquity UPLC SQD 액체 크로마토그래피 질량분석기를 사용한다.
HPLC 측정은 Agilent 1200DAD 고압 액체 크로마토그래피(Sunfire C18 150x4.6mm 크로마토그래피 컬럼) 및 Waters 2695-2996 고압 액체 크로마토그래피(Gimini C18 150x4.6mm 크로마토그래피 컬럼)를 사용한다.
UV-HPLC 측정은 Thermo nanodrop2000 자외선 분광 광도계를 사용한다.
증식 억제율 및 IC50값 측정은 PHERA starFS 마이크로플레이트 리더(독일 BMG사)를 사용한다.
박막 크로마토그래피 실리카겔 플레이트는 Yantai Huanghai HSGF254 또는 Qingdao GF254 실리카겔 플레이트를 사용하며, 박막 크로마토그래피(TLC)에 사용되는 실리카겔 플레이트의 규격은 0.15mm 내지 0.2mm이며, TLC가 제품을 분리 및 정제하기 위한 채택한 플레이트의 규격은 0.4mm 내지 0.5mm이다.
컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 Yantai Huanghai 200메쉬 내지 300메쉬의 실리카겔을 벡터로 사용한다.
본 개시의 알려진 시재료는 본 분야에서 이미 알려져 있는 방법에 따라 합성되거나, 또는 ABCR GmbH & Co.KG, Acros Organnics, Aldrich Chemical Company, Shaoyuan Chemical Technology(Accela ChemBio Inc), Darui Chemicals 등 회사로부터 구입할 수 있다.
별도로 설명하지 않는 한, 실시예의 반응은 다 아르곤 분위기 또는 질소 분위기 하에서 진행된다.
아르곤 분위기 또는 질소 분위기란 플라스크에 약 1L 용적의 아르곤 풍선 또는 질소 풍선을 연결시킨 것을 가리킨다.
수소 분위기란 플라스크에 약 1L 용적의 수소 풍선을 연결시킨 것을 가리킨다.
가압수소화 반응은 Parr 3916EKX형 수소화 기기 및 Qinglan QL-500형 수소 발생기 또는 HC2-SS형 수소화 기기를 사용한다.
수소화 반응은 통상적으로 진공으로 만들어 수소를 주입하는 조작을 3번 반복하는 것이다.
마이크로파 반응은 CEM Discover-S 908860형 마이크로파 반응기를 사용한다.
별도로 설명하지 않는 한, 실시예의 용액은 수용액을 가리킨다.
별도로 설명하지 않는 한, 실시예의 반응 온도는 실온이다.
실온은 가장 적합한 반응 온도이며, 온도 범위는 20℃ 내지 30℃이다.
실시예 중 pH=6.5의 PBS 완충액의 배합: KH2PO4 8.5g, K2HPO4.3H2O 8.56g, NaCl 5.85g, EDTA 1.5g을 취하여 플라스크에 넣은 후, 부피를 2L로 정한 후, 이들을 초음파로 전부 용해시켜, 골고루 섞어서 흔들면 얻게 된다.
화합물 정제에 사용되는 컬럼 크로마토그래피용 용리액 체계 및 박층 크로마토그래피용 현상제 체계는, A: 디클로로메탄 및 이소프로판올 체계, B: 디클로로메탄 및 메탄올 체계, C: 석유 에테르 및 에틸 아세테이트 체계;을 포함하고, 화합물의 극성에 따라 용매의 부피비를 조절하고, 또한 소량의 트리에틸아민과 산성 또는 염기성 시약을 추가하여 조절할 수도 있다.
본 개시의 일부 화합물은 Q-TOF LC/MS를 통해 표시되는 것이다. Q-TOF LC/MS는 Agilent 6530 고분해능 사중극자-비행시간차 질량분석기와 Agilent 1290-Infinity 초고성능 액체 크로마토그래피(Agilent Poroshell 300SB-C8 5μm, 2.1x75mm 컬럼)를 사용한다.
본 개시의 항체 약물 접합체의 Y-D 약물 부분에 대해서는 PCT/CN2019/107873을 참조하고, 관련 화합물의 합성 및 시험에 대한 내용은 본 특허에 인용된다. 여기서, 인용된 비제한적인 합성 실시예는 다음과 같다.
실시예 1
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-히드록시 시클로프로판-1-포름아미드1
Figure pct00074
Figure pct00075
익시테칸 메실레이트(Exatecan Mesylate) 1b(2.0mg, 3.76μmol, 특허출원 "EP0737686A1"에 공개된 방법으로 제조하고 얻음)에 N,N-디메틸포름아미드 1mL을 첨가하고, 빙수욕(ice bath)에서 0℃ 내지 5℃로 냉각한 다음, 트리에틸아민을 드롭방식으로 첨가하여, 반응액이 투명해질 때까지 교반한다. 반응액에 순차적으로 1-히드록시 시클로프로필카르복실산 1a(1.4mg, 3.7μmol, 공지된 방법 "문헌[Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984]"에 의해 제조되고 얻음) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진 -2-일)-4-메틸 모르폴린 클로라이드(3.8mg, 13.7μmol)를 추가하고, 추가 완료되면, 0℃ 내지 5℃에서 2시간 동안 교반한다. 반응액에 5mL의 물을 추가하여 반응을 ??칭한 다음, 에틸 아세테이트(8mLx3)로 반응액을 추출하고, 유기상을 합병하여, 포화 염화나트륨 용액(5mLx2)으로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 박층 크로마토그래피로 현상제 체계 B로 정제하여, 표제 생성물 1(1.6mg, 수율: 82.1%)을 얻는다.
MS m/z (ESI): 520.2 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.90-7.84 (m, 1H), 7.80-7.68 (m, 1H), 5.80-5.70 (m, 1H), 5.62-5.54 (m, 2H), 5.44-5.32 (m, 2H), 5.28-5.10 (m, 2H), 3.40-3.15 (m, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.23 (t, 1H), 2.06-1.75 (m, 2H), 1.68-1.56 (m, 1H), 1.22-1.18 (m, 2H), 1.04-0.98 (m, 2H), 0.89 (t, 3H).
실시예 2
(S)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시 아세트아미드 2-A
(R)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시 아세트아마이드 2-B
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
1b(4mg, 7.53μmol)에 에탄올 2mL 및 N,N-디메틸포름아미드 0.4mL을 추가하고, 아르곤으로 세 번 치환한 후, 빙수욕에서 0℃ 내지 5℃로 냉각시킨 후, 0.3mL의 N-메틸모르폴린을 드립방식으로 첨가하고, 반응액이 투명해질 때까지 교반한다. 반응액에 2-시클로프로필-2-히드록시 아세트산 2a(2.3mg, 19.8μmol, 특허출원 "WO2013106717"에 기재된 방법으로 제조되고 얻음), 1-히드록시 벤조트리아졸(3mg, 22.4μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(4.3mg, 22.4μmol)를 순차적으로 추가하고, 추가 완료되면, 0℃ 내지 5℃에서 1시간 동안 교반한다. 빙수욕을 철거하고, 30℃로 가열시키고 2시간 동안 교반한다. 반응액을 감압 농축하여, 얻어진 조생성물인 화합물2를 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm; 이동상: A-워터(10mmol NH4OAc), B-아세토니트릴, 구배 용리, 유속: 18mL/분)로 정제하여, 상응하는 성분을 수집하고, 감압 농축하여, 표제 생성물(2-A: 1.5mg, 2-B: 1.5mg)을 수득한다.
MS m/z (ESI): 534.0 [M+1]
단일 구성 화합물 2-B(비교적 짧은 머무름 시간)
UPLC분석: 머무름 시간 1.06분, 순도: 88%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm, 이동상: A-워터(5mmol NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.37 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.58-5.56 (m, 1H), 5.48 (d, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.32-5.29 (m, 2H), 3.60 (t, 1H), 3.19-3.13 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.83 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.34-1.28 (m, 1H), 0.86 (t, 3H), 0.50-0.39 (m, 4H).
단일 구성 화합물 2-A(비교적 긴 머무름 시간)
UPLC분석: 머무름 시간1.10분, 순도: 86%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm, 이동상: A-워터(5mmol NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.35 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.58-5.53 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.37 (d, 1H), 5.32 (t, 1H), 3.62 (t, 1H), 3.20-3.15 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.25-2.16 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.21-1.14 (m, 1H), 0.87 (t, 3H), 0.47-0.35 (m, 4H).
실시예 3
(S)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3,3,3-트리플루오로-2-히드록시히드록시 프로피온아미드 3-A
(R)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3,3,3-트리플루오로-2-히드록시히드록시 프로피온아미드 3-B
Figure pct00079
Figure pct00080
1b(5.0mg, 9.41μmol)에 에탄올 2mL 및 N,N-디메틸포름아미드 0.4mL을 추가하고, 빙수욕에서 0℃ 내지 5℃로 냉각시킨 후, N-메틸모르폴린 0.3mL을 드롭방식으로 첨가하고, 반응액이 투명해질 때까지 교반한다. 3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로피온산 3a(4.1mg, 28.4μmol, 판매 업체 Alfa), 1-히드록시 벤조트리아졸(3.8mg, 28.1μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(5.4mg, 28.2μmol)를 순차적으로 추가하고, 추가 완료되면, 0℃ 내지 5℃에서 10분 동안 교반한다. 빙수욕을 철거하고, 30℃로 가열시키고 8시간 동안 교반한다. 반응액을 감압 농축하여, 얻어진 조생성물인 화합물3를 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm; 이동상: A-워터(10mmol NH4OAc), B-아세토니트릴, 구배 용리, 유속: 18mL/분)로 정제하여, 상응하는 성분을 수집하고, 감압 농축하여, 표제 생성물(3-A: 1.5mg, 3-B: 1.5mg)을 수득한다.
MS m/z (ESI): 561.9 [M+1].
단일 구성 화합물(비교적 짧은 머무름 시간)
UPLC분석: 머무름 시간 1.11분, 순도: 88%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm, 이동상: A-워터(5mmol NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.94 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.20 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.61-5.55 (m, 1H), 5.45-5.23 (m, 3H), 5.15-5.06 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.26-2.20 (m, 1H), 2.16-2.08 (m, 1H), 2.02-1.94 (m, 1H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H).
단일 구성 화합물 (비교적 긴 머무름 시간)
UPLC분석: 머무름 시간 1.19분, 순도: 90% (크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm, 이동상: A-워터(5mmol NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.97 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.16 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.63-5.55 (m, 1H), 5.45-5.20 (m, 3H), 5.16-5.07 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.22-2.14 (m, 1H), 2.04-1.95 (m, 2H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H).
실시예 4
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-트리플루오로-1-히드록시히드록시 프로피온아미드 4
Figure pct00081
Figure pct00082
1b(3.0mg, 5.64μmol)에 N,N-디메틸포름아미드 1mL을 첨가하고, 빙수욕에서 0℃ 내지 5℃로 냉각시킨 후, 트리에틸아민 한 방울을 드롭방식으로 첨가하고, 반응액이 투명해질 때까지 교반한다. 반응액에 1-하이드록시-사이클로펜탄카복실산 4a(2.2mg, 16.9μmol, 특허출원 "WO2013106717"에 공개된 방법에 의해 제조되고 얻음) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 클로라이드(4.7mg, 16.9μmol)를 순차적으로 추가하고, 추가 완료되면, 0℃ 내지 5℃에서 1시간 동안 교반한다. 반응액에 5mL의 물을 추가하여 반응을 ??칭한 다음, 에틸 아세테이트(10mLx3)로 반응액을 추출하고, 유기상을 합병하여, 포화 염화나트륨 용액(5mLx2)으로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 박층 크로마토그래피로 현상제 체계 B로 정제하여, 표제 생성물 4(2.5mg, 수율: 80.9%)을 얻는다.
MS m/z (ESI): 548.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.73-7.62 (m, 2H), 5.75-5.62 (m, 1H), 5.46-5.32 (m, 2H), 5.26-5.10 (m, 1H), 3.30-3.10 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.28-2.20 (m, 2H), 2.08-1.84 (m, 8H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.04-1.00 (m, 2H), 0.89 (t, 3H).
실시예 5
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-(히드록시메틸)시클로 프로판-1-카르복사미드 5
Figure pct00083
Figure pct00084
1b(2.0mg, 3.76μmol)에 N,N-디메틸포름아미드 1mL을 첨가하고, 빙수욕에서 0℃ 내지 5℃로 냉각시킨 후, 트리에틸아민 한 방울을 드롭방식으로 첨가하고, 반응액이 투명해질 때까지 교반한다. 반응액에 1-(히드록시메틸)-시클로펜탄카르복실산 5a (0.87mg, 7.5μmol, 특허출원 "WO201396771"에 공개된 방법으로 제조되고 얻음) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸 모르폴린 클로라이드(2mg, 7.24μmol)를 순차적으로 추가하고, 추가 완료되면, 0℃ 내지 5℃에서 2시간 동안 교반한다. 반응액에 5mL의 물을 추가하여 반응을 ??칭한 다음, 에틸 아세테이트(8mLx3)로 반응액을 추출하고, 유기상을 합병하여, 포화 염화나트륨 용액(5mLx2)으로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 박층 크로마토그래피로 현상제 체계 B로 정제하여, 표제 생성물 5(1.0mg, 수율: 50%)을 얻는다.
MS m/z (ESI): 533.9 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.07 (s, 1H), 7.23-7.18 (m, 2H), 6.71-6.64 (m, 1H), 6.55-6.51 (m, 1H), 5.36-5.27 (m, 2H), 4.67-4.61 (m, 2H), 3.53-3.48 (m, 1H), 3.30-3.22 (m, 2H), 3.18-3.13 (m, 1H), 2.71-2.61 (m, 2H), 2.35-2.28 (m, 1H), 2.04-1.91 (m, 4H), 1.53-1.40 (m, 3H), 0.91-0.75 (m, 4H).
실시예 6
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-(히드록시메틸)시클로뷰테인-1-카르복사미드 6
Figure pct00085
Figure pct00086
1b(3.0mg, 5.64μmol)에 N,N-디메틸포름아미드 1mL을 첨가하고, 빙수욕에서 0℃ 내지 5℃로 냉각시킨 후, 트리에틸아민 한 방울을 드롭방식으로 첨가하고, 반응액이 투명해질 때까지 교반한다. 반응액에 1-(히드록시메틸)시클로부탄-1-카르복실산 6a(2.2mg, 16.9μmol; "문헌[Journal of the American Chemical Society, 2014, vol.136, #22, p.8138-8142]"에 공개된 방법을 채택하여 제조하고 얻음) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 클로라이드(4.7mg, 16.9μmol)를 순차적으로 추가하고, 추가 완료되면, 0℃ 내지 5°C에서 1시간 동안 교반한다. 반응액에 5mL의 물을 추가하여 반응을 ??칭한 다음, 에틸 아세테이트(10mLx3)로 반응액을 추출하고, 유기상을 합병하여, 포화 염화나트륨 용액(5mLx2)으로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 박층 크로마토그래피로 현상제 체계 B로 정제하여, 표제 생성물 6(2.1mg, 수율: 67.9%)을 얻는다.
MS m/z (ESI): 548.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 7.85-7.62 (m, 1H), 6.88 (br, 1H), 5.87-5.48 (m, 2H), 5.47-5.33 (m, 1H), 5.31-5.06 (m, 1H), 4.25-3.91 (m, 2H), 3.25 (br, 1H), 2.60-2.32 (m, 3H), 2.23 (t, 1H), 2.15-1.95 (m, 3H), 1.70-1.56 (m, 2H), 1.41-1.17 (m, 9H), 1.03 (s, 1H), 0.95-0.80 (m, 2H).
실시예 7
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록실기-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-히드록시 시클로뷰테인-1-카르복사미드 7
Figure pct00087
Figure pct00088
1b(3.0mg, 5.64μmol)에 에탄올 2mL 및 N,N-디메틸포름아미드 0.4mL을 추가하고, 빙수욕에서 0℃ 내지 5℃로 냉각시킨 후, N-메틸모르폴린 0.3mL을 드롭방식으로 첨가하고, 반응액이 투명해질 때까지 교반한다. 반응액에 1-히드록시시클로 부탄카르복실산 7a (2.0mg, 17.22μmol, 판매 업체 Yaoshi), 1-히드록시 벤조트리아졸(2.3mg, 17.0μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(3.2mg, 16.7μmol)을 순차적으로 추가하고, 추가 완료되면, 0℃ 내지 5℃에서 10분 동안 교반한다. 빙수욕을 철거하고, 상온에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 현상제 체계 B로 박층크로마토그래피로 정제하여, 표제물 7(2.5mg, 수율: 83.1%)을 얻는다.
MS m/z (ESI): 534.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.28 (d, 1H), 7.75 (d, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.59-5.51 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.20-5.01 (m, 2H), 3.27-3.17 (m, 1H), 3.15-3.05 (m, 1H), 2.71-2.63 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.12-2.05 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.92-1.78 (m, 4H), 1.50-1.42 (m, 1H), 0.90-0.83 (m, 4H).
실시예 8
1-(((S)-7-벤질-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,5,8,11,14-펜타자에이코실)옥시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록실기-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로 프로판-1-카르복사미드 8
Figure pct00089
Figure pct00090
단계1
벤질 1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세트아미도)메톡시)시클로프로판-1-카르복실레이트 8c
벤질 1-히드록시시클로프로판-1-카르복실레이트 8a(104mg, 0.54mmol; 특허 출원 "US2005/20645"에 공개된 방법에 의해 제조되고 얻음) 및 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세트아미도)메틸 아세테이트 8b(100mg, 0.27mmol; 특허 출원 "CN105829346A"에 공개된 방법으로 제조되고 얻음)을 반응 플라스크에 추가하고, 5mL의 테트라히드로푸란을 추가하고, 아르곤으로 세 번 치환하고, 빙수욕에서 온도를 0℃ 내지 5℃로 내리고, 칼륨 tert-부톡사이드(61mg, 0.54mmol)를 추가하고, 빙수욕을 철거하고, 온도를 실온으로 올리고 10분 동안 교반한 다음, 20mL의 얼음물을 추가하고, 에틸 아세테이트(5mLx2) 및 클로로포름(5mLx5)으로 추출하고, 유기상을 합병하여 농축시킨다. 얻어진 잔류물을 3mL의 1,4-디옥산에 용해시키고, 0.6mL의 물을 추가하고, 중탄산나트륨(27mg, 0.32mmol) 및 9-플루오렌 메틸 클로로포르메이트(70mg, 0.27mmol)를 추가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한다. 20mL의 물을 추가하고, 에틸 아세테이트(8mLx3)로 추출하고, 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 현상제 체계 B로 정제하여, 표제 생성물 8c(100mg, 수율: 73.6%)를 얻는다.
MS m/z (ESI): 501.0 [M+1].
단계2
1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세트아미도)메톡시)시클로프로판-1-카르복실산 8d
8c(50mg, 0.10mmol)를 3mL의 테트라히드로푸란과 에틸 아세테이트(V:V=2:1)의 혼합 용매에 용해시키고, 팔라듐탄소(25mg, 함량 10%)을 추가하고, 수소로 세 번 치환하고, 실온에서 1시간 동안 교반하여 반응시킨다. 반응액을 셀라이트로 여과하고, 필터 케이크를 테트라히드로푸란으로 세척하고, 여과액을 농축하여, 표제 생성물 8d(41mg, 수율: 100%)를 얻는다.
MS m/z (ESI): 411.0 [M+1].
단계3
(9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-(((1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로프로폭시 )메틸)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트 8e
반응 플라스크에 1b(7mg, 0.013mmol)를 추가하고, N,N-디메틸포름아미드 1mL을 추가하고, 아르곤으로 세 번 치환하고, 빙수욕에서 온도를 0℃ 내지 5℃로 내리고, 트리에틸아민 한 방울을 드롭방식으로 첨가하고, 8d(7mg, 0.017mmol)의 N,N-디메틸포름아미드 용액 0.5mL을 추가하고, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸 클로로모르폴린 염(7mg, 0.026mmol)을 추가하고, 빙수욕에서 35분 동안 교반한다. 10mL의 물을 추가하고, 에틸 아세테이트(5mLx3)로 추출하고, 유기상을 포화 염화나트륨 용액(10mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 여과액을 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 박층 크로마토그래피로 현상제 체계 B로 정제하여, 표제 생성물 8e(8.5mg, 78.0% 수율)를 얻는다.
MS m/z (ESI): 828.0 [M+1].
단계4
1-((2-아미노아세트아미도)메톡시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 8f
8e(4mg, 4.84μmol)를 디클로로메탄 0.2mL에 용해시키고, 디에틸아민 0.1mL을 추가하고, 실온에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 감압 농축하고 톨루엔 2mL을 추가하여 감압 농축하고, 이를 두 번 반복하고, n-헥산 3mL을 추가하여 비팅하고, 상층 n-헥산을 부어 내고, 이를 세 번 반복한 후, 감압 농축하여, 조생성물인 표제 생성물 8f(2.9mg)를 얻고, 그 생성물은 정제하지 않고 바로 다음 단계에 사용된다.
MS m/z (ESI): 606.0 [M+1].
단계5
1-(((S)-7-벤질-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,5,8,11,14-펜타자에이코실)옥시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록실기-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로 프로판-1-카르복사미드 8
조생성물 8f(2.9mg, 4.84μmol)를 0.5mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 아르곤으로 세 번 치환하고, 빙수욕에서 온도를 0℃ 내지 5℃로 내리고, (S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)헥사미도)아세트아미도)아세트아미도)-3-페닐프로피온산 8g(2.7mg, 5.80μmol, 특허 출원 "EP2907824"에 개시된 방법에 의해 제조되고 얻음)의 N,N-디메틸포름아미드 용액 0.3mL을 추가하고, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 클로라이드(2.7mg, 9.67μmol)를 추가하고, 빙수욕에서 교반하면서 30분 동안 반응한 다음, 빙수욕을 철거하고, 온돌를 실온으로 올려 15분 동안 교반한다. 반응액을 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm; 이동상: A-워터(10mmol NH4OAc): B-아세토니트릴, 구배 용리, 유속: 18mL/분)로 정제하여, 상응하는 성분을 수집하고, 감압 농축하여 표제 생성물 8(2mg, 수율: 39.0%)을 얻는다.
MS m/z (ESI): 1060.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 9.01 (d, 1H), 8.77 (t, 1H), 8.21 (t, 1H), 8.08-7.92 (m, 2H), 7.73 (d, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.24-7.07 (m, 4H), 6.98 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.61 (q, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.32 (t, 1H), 5.12 (q, 2H), 4.62 (t, 1H), 4.52 (t, 1H), 4.40-4.32 (m, 1H), 3.73-3.47 (m, 8H), 3.16-3.04 (m, 2H), 2.89 (dd, 1H), 2.69-2.55 (m, 2H), 2.37-2.23 (m, 4H), 2.12-1.93 (m, 4H), 1.90-1.74 (m, 2H), 1.52-1.38 (m, 4H), 1.33-1.11 (m, 5H), 0.91-0.81 (m, 4H).
실시예 9
N-((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사데카-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-A
N-((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사데카-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-B
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
단계1
벤질 2-시클로프로필-2-히드록시아세테이트 9a
2a(1.3g, 11.2mmol; 특허출원 "WO2013/106717"에 공개된 방법으로 제조되고 얻음)를 아세토니트릴 50mL에 용해시킨 후, 탄산칼륨(6.18g, 44.8mmol), 브롬화벤질(1.33mL, 11.2mmol) 및 테트라부틸암모늄 요오다이드(413mg, 1.1mmol)를 순차적으로 추가한다. 반응액을 실온에서 48시간 동안 교반하고, 셀라이트로 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트(10mL)로 헹구고, 여과액을 합병하여 감압 농축하고, 얻어진 잔류물을 현상제 체계 C로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 표제 생성물 9a(2g, 수율: 86.9%)를 얻는다.
단계2
10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아잔덱-11-벤질산 에스테르 9b
9a(120.9mg, 0.586mmol) 및 8b (180mg, 0.489mmol)를 반응 플라스크에 추가하고, 4mL의 테트라히드로푸란을 추가하고, 아르곤으로 세 번 치환하고, 빙수욕에서 온도를 0℃ 내지 5℃로 내린 다음, 칼륨 tert-부톡사이드(109mg, 0.98mmol)를 추가하고, 빙수욕을 철거하여, 실온으로 온도를 올리고, 40분 동안 교반하고, 10mL의 얼음물을 추가하고, 에틸 아세테이트(20mLx2) 및 클로로포름(10mLx5)으로 추출하고, 유기상을 합병하여 농축한다. 얻어진 잔류물을 4mL의 디옥산에 용해시키고, 2mL의 물을 추가하고, 중탄산나트륨(49.2mg, 0.586mmol) 및 9-플루오렌 메틸 클로로포르메이트(126mg, 0.49mmol)를 추가하고, 실온에서 2시간 동안 교반한다. 20mL의 물을 추가하고, 에틸 아세테이트(10mLx3)로 추출하고, 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 여과액을 감압 농축한다. 얻어진 잔류물을 현상제 체계 C로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 표제 생성물 9b(48mg, 수율: 19%)를 얻는다.
MS m/z (ESI): 515.0 [M+1].
단계3
10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아잔덱-11-산 9c
9b(20mg, 0.038mmol)를 4.5mL의 테트라히드로푸란과 에틸 아세테이트(V:V=2:1)의 혼합 용매에 용해시키고, 팔라듐탄소(12mg, 함량 10%, 건조형)을 추가하고, 수소로 세 번 치환하고, 실온에서 1시간 동안 교반하여 반응시킨다. 반응액을 셀라이트로 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 헹구고, 여과액을 농축하여, 조생성물인 표제 생성물 9c(13mg)를 얻고, 그 생성물은 정제하지 않고 바로 다음 단계에 투입되어 반응한다.
MS m/z (ESI): 424.9 [M+1].
단계4
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(((1-사이클로프로필-2-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리진[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-2-옥소에톡시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트 9d
1b(10mg, 18.8μmol)를 반응 플라스크에 추가하고, N,N-디메틸포름아미드 1mL을 추가하고, 아르곤으로 세 번 치환하고, 빙수욕에서 온도를 0℃ 내지 5℃로 내리고, 트리에틸아민 한 방울 드롭방식으로 첨가하고, 조생성물 9c(13mg, 30.6μmol), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 클로라이드(16.9mg, 61.2μmol)를 추가하고, 빙수욕에서 40분 동안 교반하여 반응시킨다. 10mL의 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트(10mLx3)로 추출하고, 유기상을 합병한다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(10mLx2)으로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조, 여과하고, 여과액을 감압 농축한다. 얻어진 잔류물을 현상제 체계 B로 박층크로마토그래피로 정제하여, 표제물 9d(19mg, 수율: 73.6%)을 얻는다.
MS m/z (ESI): 842.1[M+1].
단계5
2-((2-아미노아세트아미도)메톡시)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아세트아미드 9e
9d(19mg, 22.6μmol)를 디클로로메탄 2mL에 용해시키고, 디에틸아민 1mL을 추가하고, 실온에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 감압 농축하고, 톨루엔 1mL을 추가하여 감압 농축하고, 이를 두 번 반복한다. 잔류물에 n-헥산 3mL을 추가하여 비팅하고, 정치 후 상청액을 부어 내고, 고체를 남겨둔다. 고체 잔류물을 감압 농축하고, 펌핑 건조시켜 조생성물인 표제 생성물 9e(17mg)를 얻고, 그 생성물은 정제하지 않고 바로 다음 단계에 투입되어 반응한다.
MS m/z (ESI): 638.0[M+18].
단계6
N-((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사데카-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-A
N-((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌라지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사데카-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-B
조생성물 9e(13.9mg, 22.4μmol)를 0.6mL N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 아르곤으로 세 번 치환하고, 빙수욕에서 온도를 0℃ 내지 5℃로 내리고, 8g(21.2mg, 44.8μmol)의 N,N-디메틸포름아미드 용액 0.3mL을 추가하고, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴린 클로라이드(18.5mg, 67.3μmol)를 추가하고, 빙수욕에서 10분 동안 교반 반응하고, 빙수욕을 절거하고, 실온으로 온도를 올려 1시간 동안 교반하면서 반응시켜, 화합물 9를 생성한다. 반응액을 고성능 액체 크로마토그래피(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm; 이동상: A-워터(10mmol NH4OAc): B-아세토니트릴, 구배 용리, 유속: 18mL/분)로 정제하여, 상응하는 성분을 수집하고, 감압 농축하여 표제 생성물(9-A: 2.4mg, 9-B: 1.7mg)을 얻는다.
MS m/z (ESI): 1074.4 [M+1].
단일 구성 화합물 9-A(비교적 짧은 머무름 시간):
UPLC분석: 머무름 시간1.14분, 순도: 85% (크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm, 이동상: A-물(5mmol NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.60 (t, 1H), 8.51-8.49 (d, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.96 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.15 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.65-5.54 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 3H), 4.74-4.62 (m, 1H), 4.54-4.40 (m, 2H), 3.76-3.64 (m, 4H), 3.62-3.48 (m, 2H), 3.20-3.07 (m, 2H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.80-2.62 (m, 1H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.15 (m, 2H), 2.15-2.04 (m, 2H), 1.93-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 5H), 0.87 (t, 3H), 0.64-0.38 (m, 4H).
단일 구성 화합물 9-B(비교적 긴 머무름 시간):
UPLC분석: 머무름 시간1.16분, 순도: 89%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm, 이동상: A-물(5mmol NH4OAc), B-아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.68-8.60 (m, 1H), 8.58-8.50 (m, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.94 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.13 (m, 3H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.60-5.50 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 2H), 4.78-4.68 (m, 1H), 4.60-4.40 (m, 2H), 3.76-3.58 (m, 4H), 3.58-3.48 (m, 1H), 3.20-3.10 (m, 2H), 3.08-2.97 (m, 2H), 2.80-2.72 (m, 2H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.13 (m, 2H), 2.13-2.04 (m, 2H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 4H), 0.91-0.79 (m, 3H), 0.53-0.34 (m, 4H).
3. 항 Claudin18.2 항체 ADC 접합체의 제조
ADC 원액 약물 로딩량 분석
가. UV-HPLC 방법
본 개시 일부 ADC 실시예의 DAR값의 n 계산방법은 UV-HPLC를 사용하였고, 구체적으로 다음과 같다.
1. 측정방법:
석신산나트륨 완충액을 담은 큐벳을 기준 큐벳 및 샘플측정 큐빗에 각각 놓은 후, 용매 블랭크를 제거한 후, 시험용 용액이 담긴 큐벳을 샘플측정 큐벳에 놓고, 280nm 및 370nm에서의 흡광도를 측정한다.
2. 결과 계산: 자외선 분광광도법(사용기기: Thermo nanodrop2000 자외선분광광도계)으로 ADC 원액 로딩량을 측정하는 것으로서, 그 원리는 어느 한 파장 하에서 ADC 원액의 총 흡광치는 약물과 단클론항체의 해당 파장 하에서의 흡광치의 합에 대등하다는 것이며, 즉,
(1) A280nm＝εmab-280bCmab+εDrug-280bCDrug
εDrug-280: 약물의 280nm에서의 평균 몰 흡광계수 5100;
CDrug: 약물의 농도;
εmab-280: 단일 항체 원액의 280nm에서의 평균 몰 흡광계수 214600;
Cmab: 단일 항체 원액의 농도;
b: 광학 거리는 1cm임.
이와 마찬가지로 샘플의 370nm 하에서의 총흡광치 방정식을 얻을 수 있다.
(2) A370nm＝εmab-370bCmab+εDrug-370bCDrug
εDrug-370: 약물의 370nm에서의 평균 몰 흡광계수 19000;
CDrug: 약물의 농도;
εmab-370: 약물의 370nm에서의 평균 몰 흡광계수는 0임;
Cmab: 단일 항체 원액의 농도;
b: 광학 거리는 1cm임.
(1) 및 (2) 두 가지 방정식에 의해, 단클론항체와 약물의 두 가지 검측 파장 하에서의 흡광계수 및 농도 데이터를 결합하여 약물의 로딩량을 계산할 수 있다.
약물 로딩량=CDrug/Cmab.
나. RP-HPLC 방법
본 개시 일부 ADC 실시예의 DAR값의 계산방법은 RP-HPLC(역상 고성능 액체 크로마토그래피)를 사용하였고, 구체적으로 다음과 같다.
1. 측정방법:
네이키드 항체(접합되지 않은 항체)와 시험용 ADC 샘플(농도 1mg/mL)에 DDT(sigma) 4μL을 추가하여 환원시키고, 37℃에서 1시간 동안 수욕하고 나서 내부 삽입관에 넣는다. 고성능 액체 크로마토그래피 Agilent 1200로 검측을 진행하고, 크로마토그래피 컬럼은 Agilent PLRP-S 1000A 8μm 4.6*250mm를 사용하며, 컬럼 온도: 80°C; DAD 검출기 파장: 280nm, 유속: 1mL/분, 샘플 주입량: 40μL; 이어서, 샘플과 네이키드 항체의 스펙트럼 비교를 통해, 경쇄와 중쇄의 위치를 구별한 다음, 샘플 검체의 스펙트럼에 대해 점수를 누계하여, DAR값의 n을 계산한다.
2. 용액 배합
1) 0.25M DTT용액:
배합 예시: DTT 5.78mg을 취하여, 150μL 정화수를 추가하여 충분히 용해시켜서, 0.25M DTT 용액을 얻고, -20℃에서 보관한다.
2) 이동상A(0.1% TFA 수용액):
배합 예시: 메스실린더로 1000mL 정화수를 취하여, 1mL TFA (sigma)를 추가하여, 충분히 골고루 흔든 후 사용하는데, 2℃ 내지 8℃에서 14일 동안 보관한다.
3) 이동상B(0.1% TFA 아세토니트릴 용액):
배합 예시: 메스실린더로 1000mL 아세토니트릴을 취하여, 1mL TFA를 추가하여, 충분히 골고루 흔든 후 사용하는데, 2℃ 내지 8℃에서 14일 동안 보관한다.
3. 데이터분석
샘플과 네이키드 항체의 스펙트럼을 비교하여, 경쇄와 중쇄의 위치를 구분한 다음, 샘플 검체의 스펙트럼에 대해 점수를 누계하여, DAR값(n)을 계산한다.
계산 공식은 다음과 같다.
Figure pct00094
총 LC 피크 면적=LC 피크 면적+LC+1 피크 면적
총 HC 피크 면적=HC 피크 면적+HC+1 피크 면적+HC+2 피크 면적+HC+3 피크 면적
LC DAR=Σ(연결 약물수*피크 면적 백분율)/총 LC피크 면적
HC DAR=Σ(연결 약물수*피크 면적 백분율)/총 HC피크 면적
DAR=LC DAR+HC DAR.
Claudin18.2 항체-약물 접합체 제조 실시예
실시예 3-1, 3-2: ADC-1, ADC-2
Figure pct00095
Figure pct00096
37℃ 조건 하에서, 항체 h1902-5을 함유한 PBS 완충액(pH=6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액; 10.0mg/mL, 320.0mL, 21.62μmol)에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 수용액(10mM, 11.03mL, 110.3μmol)을 추가하고, 수조 셰이커에 넣어서, 37℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 수욕을 통해 반응액의 온도를 25℃로 내린다.
화합물 9-A(350mg, 303mol)를 13.2mL의 아세토니트릴 및 6.6mL의 DMSO에 용해시킨 후, 25℃로 온도를 내린 상기 반응액에 추가하고, 수조 셰이커에 넣어서, 25℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다.
얻어진 반응액을 순차적으로 5L의 PBS 완충액(50mM, pH=6.5, 4% 아세토니트릴, 2% DMSO) 및 5L의 석신산 완충액(10mM, pH=5.3)으로 한외여과막 정제를 진행하여, 소분자를 제거하고, 수크로스를 60mg/mL까지, 폴리소르베이트-20을 0.2mg/mL까지 추가하여, 최종적으로 일반식 항체 약물 접합체 h1902-5-9-A의 예시적 생성물 ADC-1(10mM, pH=5.3 석신산; 10mg/mL, 2.626g)을 얻는다. 수율: 81.81%.
UV-HPLC 계산 평균값: n=6.8.
위 방법을 사용하는 경우, 항체 h1901-11로 h1902-5을 대체하고 화합물 9-A와 함께 일반식 항체 약물 접합체 h1901-11-9-A의 예시적 생성물 ADC-2를 제조하여 얻을 수 있는데, DAR 값의 n=7.1.
실시예 3-3 ADC-3
37℃ 조건 하에서, 항체 h1901-11의 PBS 완충제 수용액 (pH=6.5인 0.05 M의 PBS 완충제 수용액; 10.0mg/mL, 1mL, 67.5 nmol)에 배합된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 수용액(10mM, 10.1μL, 101nmol)을 추가하여, 수조 셰이커에 넣고, 37℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 수욕을 통해 반응액의 온도를 25℃로 내린다.
화합물 9-A(0.58mg, 540nmol)를 34μL DMSO에 용해시키고, 상기 반응액에 추가한 후, 수조 셰이커에 넣어서, 25 ℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 반응액을 Sephadex G25 겔 컬럼으로 탈염화하여 정제한 다음(용리상: pH가 6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액, 0.001M의 EDTA 함유), 항체 약물 접합체 h1901-11-9-A의 예시적 생성물 ADC-3의 PBS 완충액(0.72mg/mL, 11.2mL)을 얻고, 4℃에서 보관한다. RP-HPLC 계산 평균값: n=2.51.
실시예 3-4 ADC-4
37℃ 조건 하에서, 항체 h1901-11의 PBS 완충제 수용액 (pH=6.5인 0.05 M의 PBS 완충제 수용액; 10.0mg/mL, 1mL, 67.5 nmol)에 배합된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 수용액(10mM, 16.9μL, 169nmol)을 추가하여, 수조 셰이커에 넣고, 37℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 수욕을 통해 반응액의 온도를 25℃로 내린다.
화합물 9-A(0.73mg, 680nmol)를 43μL DMSO에 용해시키고, 상기 반응액에 추가한 후, 수조 셰이커에 넣어서, 25 ℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 반응액을 Sephadex G25 겔 컬럼으로 탈염화하여 정제한 다음(용리상: pH가 6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액, 0.001M의 EDTA 함유), 항체 약물 접합체 h1901-11-9-A의 예시적 생성물 ADC-4의 PBS 완충액(0.62mg/mL, 12.5mL)을 얻고, 4℃에서 보관한다. RP-HPLC 계산 평균값: n=4.06.
실시예 3-5 ADC-5
37℃ 조건 하에서, 항체 h1901-11의 PBS 완충제 수용액 (pH=6.5인 0.05 M의 PBS 완충제 수용액; 10.0mg/mL, 1mL, 67.5 nmol)에 배합된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 수용액(10mM, 35.8μL, 358nmol)을 추가하여, 수조 셰이커에 넣고, 37℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 수욕을 통해 반응액의 온도를 25℃로 내린다.
화합물 9-A(1.09mg, 1015nmol)를 64μL DMSO에 용해시키고, 상기 반응액에 추가한 후, 수조 셰이커에 넣어서, 25 ℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 반응액을 Sephadex G25 겔 컬럼으로 탈염화하여 정제한 다음(용리상: pH가 6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액, 0.001M의 EDTA 함유), 항체 약물 접합체 h1901-11-9-A의 예시적 생성물 ADC-5의 PBS 완충액(0.54mg/mL, 12.5mL)을 얻고, 4℃에서 보관한다. RP-HPLC 계산 평균값: n=6.8.
실시예 3-6 ADC-6
37℃ 조건 하에서, 항체 h1902-5의 PBS 완충제 수용액 (pH=6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액; 10.0mg/mL, 1.08mL, 72.9nmol)에 배합된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 수용액(10mM, 10.9μL, 109nmol)을 추가하여, 수조 셰이커에 넣고, 37℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 수욕을 통해 반응액의 온도를 25℃로 내린다.
화합물 9-A(0.63mg, 587nmol)를 40μL DMSO에 용해시키고, 상기 반응액에 추가한 후, 수조 셰이커에 넣어서, 25 ℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 반응액을 Sephadex G25 겔 컬럼으로 탈염화하여 정제한 다음(용리상: pH가 6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액, 0.001M의 EDTA 함유), 항체 약물 접합체 h1902-5-9-A의 예시적 생성물 ADC-6의 PBS 완충액(0.7mg/mL, 13.0mL)을 얻고, 4℃에서 보관한다. RP-HPLC 계산 평균값: n=2.69.
실시예 3-7 ADC-7
37℃ 조건 하에서, 항체 h1902-5의 PBS 완충제 수용액 (pH=6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액; 10.0mg/mL, 1.08mL, 72.9nmol)에 배합된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 수용액(10mM, 18.3μL, 183nmol)을 추가하여, 수조 셰이커에 넣고, 37℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 수욕을 통해 반응액의 온도를 25℃로 내린다.
화합물 9-A(0.79mg, 736nmol)를 50μL DMSO에 용해시키고, 상기 반응액에 추가한 후, 수조 셰이커에 넣어서, 25 ℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 반응액을 Sephadex G25 겔 컬럼으로 탈염화하여 정제한 다음(용리상: pH가 6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액, 0.001M의 EDTA 함유), 항체 약물 접합체 h1902-5-9-A의 예시적 생성물 ADC-7의 PBS 완충액(0.6mg/mL, 14.0mL)을 얻고, 4℃에서 보관한다. RP-HPLC 계산 평균값: n=4.25.
실시예 3-8 ADC-8
37℃ 조건 하에서, 항체 h1902-5의 PBS 완충제 수용액 (pH=6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액; 10.0mg/mL, 1.08mL, 72.9nmol)에 배합된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 수용액(10mM, 38.7μL, 387nmol)을 추가하여, 수조 셰이커에 넣고, 37℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 수욕을 통해 반응액의 온도를 25℃로 내린다.
화합물 9-A(1.18mg, 1099nmol)를 70μL DMSO에 용해시키고, 상기 반응액에 추가한 후, 수조 셰이커에 넣어서, 25 ℃ 하에서 진탕하면서 3시간 동안 반응을 진행한 후, 반응을 종료한다. 반응액을 Sephadex G25 겔 컬럼으로 탈염화하여 정제한 다음(용리상: pH가 6.5인 0.05M의 PBS 완충제 수용액, 0.001M의 EDTA 함유), 항체 약물 접합체 h1902-5-9-A의 예시적 생성물 ADC-8의 PBS 완충액(0.56mg/mL, 14.2mL)을 얻고, 4℃에서 보관한다. RP-HPLC 계산 평균값: n=7.01.
실시예 3-9 ADC-9
12℃ 조건 하에서, 항체 h1902-5을 함유한 히스티딘-아세트산-Tris/EDTA 완충액(pH 7.2의 10mM 히스티딘-아세트산-Tris 및 2.5 mM EDTA의 완충액; 20.6g/L, 6.49L, 0.91mmol )에 배합된 TCEP 히스티딘 완충액(10mM 히스티딘 완충액; 1.717mM, 1.16L 1.99mmol)을 추가하여, 항온 수욕 포트에 넣은 후, 12℃ 하에서 2시간 동안 교반하면서 반응시키고, 반응을 종료하면, 중간체 I 용액을 얻는다.
화합물 9-A(4.72g, 4.39mmol )를 0.38L의 DMSO에 용해시켜, 화합물 9-A의 DMSO 용액을 생성한다. 미리 상기 중간체 I 용액에 0.38L DMSO를 추가한 후, 상기 화합물 9-A의 DMSO 용액을 추가하여, 항온 수욕 포트에 넣고, 12℃ 하에서 1시간 동안 교반하면서 반응시킨 다음, 반응을 종료한다.
상기 반응액을 Capto S Impact 양이온 크로마토그래피 컬럼으로 정제하여, 9개 컬럼 부피의 10%(v/v)DMSO가 함유된 0.05M 초산 완충액(pH=5.0) 및 6개 컬럼 부피의 0.05M 초산 완충액(pH=5.0)으로 각각 세척한 다음, 0.05M 초산, 0.30M 염화나트륨 완충액(pH=5.5)으로 용리하여, 반응액에서의 유리 독소 및 잔류 용매를 제거한다. 22℃ 하에서, 양이온 용리액을 7배 부피로 등부피 한외여과하여(한외여과막 팩은 30KD의 폴리셀룰로오스 필름팩 사용), h1902-5-9-A의 예시적 생성물 ADC-9를 얻는다. RP-HPLC 계산 평균값: n=4.1.
본 실시예에서 획득한 약물 로딩량은 비제한적인 실시예로서, 당업자는 반응조건 및 시약의 조정에 따라, 서로 다른 DAR값(1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 8, 보다 바람직하게는 2 내지 8, 2 내지 7)의 접합제를 얻는 것이다.
생물학적 평가
시험예 1: 세포 Cell 수준 ELISA 결합 실험
Cell based ELISA실험은 Claudin18.2 항체의 결합 특성을 검사하기 위한 것이다. 안정적으로 Claudin18.2를 발현하는 NUGC4 세포를 96웰 플레이트에 배양하고, 밀도가 90%까지 성장하면 4% 파라포름알데히드를 추가하여 1시간 동안 세포를 고정시키고, PBST 완충액(pH 7.4 PBS, 0.05% Tween-20 함유)으로 플레이트를 3회 세척한 후, PBS 희석한 5% 탈지우유(Guang Ming 탈지분유) 차단액 200μL/웰을 추가하여, 37℃ 인큐베이터에서 2.5시간 인큐베이션하거나 또는 4℃에서 하룻 밤(16시간 내지 18시간)동안 방치하여 밀폐한다. 밀폐 종료 후, 차단액을 버리고, PBST 완충액으로 플레이트를 3회 세척한 후, 50μL/웰 샘플 희석제(pH7.4 PBS, 1% r우유 함유)로 희석한 서로 다른 농도의 검측 대상인 항체를 추가하여, 37℃ 인큐베이터에 넣어서 2시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 종료 후, PBST로 플레이트를 5회 세척하고, 100μL/웰 샘플 희석제로 희석한 HRP 표기의 염소 항 인간 2차 항체(문헌[Jackson Immuno Research, 109-035-003])를 추가하여, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. PBST로 플레이트를 6회 세척 후, 50μL/웰 TMB 현색기질(KPL, 52-00-03)을 추가하여, 실온에서 10분 내지 15분 동안 인큐베이션하고, 50μL/웰 1M H2SO4을 추가하여 반응을 종료하고, MD Versa Max TM 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 흡수값을 읽고, Claudin18.2 항체의 Claudin18.2에 대한 결합 EC50값을 계산한다.
표 10. 하이브리드도마 항체 결합 활성
Figure pct00097
표 11. mAb1901 인간화 항체 결합 활성
Figure pct00098
표 12. mAb1902 인간화 항체 결합 활성
Figure pct00099
시험예 2: 항체 세포 수준 결합 실험
안정적으로 Claudin18.2를 발현하는 NUGC4 세포를 FACS 완충액(2% 소태아혈청(Gibco, 10099141) pH7.4 PBS(Sigma, P4417-100TAB))으로 1x106/mL의 세포 현탁액을 제조하여, 100μL/웰로 96웰의 원형바닥 플레이트(Corning, 3795)에 추가한다. 원심분리하여 상청액을 제거한 후, 50μL/웰 FACS 완충액으로 희석한 서로 다른 농도의 검측 대상인 Claudin18.2 항체를 추가하여, 4℃ 냉장고에 넣고 빛을 피해서 1시간 동안 인큐베이션한다. FACS 완충액 300g으로 3회 원심분리하여 세척한 후, 작업 농도의 Alexa Fluor 488 염소 항 인간 IgG (H+L)(invitrogen, A-11013)을 추가하여, 4℃ 냉장고에 넣고 빛을 피해서 40분 동안 인큐베이션한다. FACS 완충액 300g으로 3회 원심분리하여 세척한 후, BD FACS CantoII 유세포 분석기에서 기하 평균수 형광 강도를 검측하여, Claudin18.2 항체의 안정적으로 Claudin18.2를 발현하는 NUGC4 세포에 대한 결합 EC50값을 계산하는 것으로서, 결과는 도 1과 같다.
시험예3: 항체 이입 실험
DyLight 488 NHS Ester(thermofisher, 46403) 미리 표기된 검측 대상 Claudin18.2 항체를 5μg/mL의 최종농도로 안정적으로 Claudin18.2를 발현하는 1x106/mL의 NUGC4 세포에 추가하여, 얼음에 놓은 후 빛을 피하여 1시간 동안 인큐베이션하고, 미리 냉각시킨 FACS 완충액(pH7.4 PBS, 2% 소태아혈청)으로 3회 원심분리하여 세척한 다음, 상청액을 제거한 후, 미리 가열된 완전 배지에 추가하고, 37℃의 5% CO2 세포 배양함에 넣는다. 각각 0, 0.5, 1, 2, 4시간 후에 세포를 꺼내서, 얼음에 놓고 빛을 피해서 보관한다. 샘플이 모두 수집된 후, 300g을 저온에서 원심분리하여 상청액을 제거하고, 용리 완충액(pH1.7 0.05M글리신, 0.1M 염화나트륨)을 추가한 후, 실온에서 7분 동안 인큐베이션하고, FACS 완충액 300g으로 원심분리하여 1회 세척한 다음, BD FACS CantoII 유세포 분석기 상에서 기하 평균수 형광 강도를 검측하여, Claudin18.2 항체의 안정적으로 Claudin18.2를 발현하는 NUGC4 세포에 대한 이입 효율을 계산한다. 결과(도 2 참조)에 의하면, 인간화 항체는 양호한 세포 이입 효율을 갖는다는 것을 보여준다.
시험예 4: 유세포 기술에 기반한 항체 친화력 측정
실험 당일, HEK293/hClaudin18.2 세포를 수집하여 U 바닥 96웰 플레이트에 넣는데, 각 웰에 1x105개 내지 2x105개 세포가 있다. 시작 농도 5μg/mL, 2x 구배 희석(12개 농도점)한 인간 Claudin18.2 항체를 추가하여, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하는데, 양성 대조는 IMAB362이고, 이와 동시에 항체를 추가하지 않은 음성 대조도 설치한다. 원심분리하여 항체를 제거하고, 다시 100μL/웰 FITC 항 인간 IgG Fc 항체(200x)를 추가하여, 4℃에서 빛을 피해서 30분 동안 인큐베이션하고, PBS+2% FBS로 두 번 세척한 후, 유세포 분석기 검사를 준비한다. BD FACS CantoII을 시동하고, 예열이 완료된 후 BD FACSDiva 소프트웨어를 열어서, 새로운 실험을 구축하여, HEK293/hClaudin18.2 음성대조 샘플을 검측하고, FSC 및 SSC 전압을 적당한 수치로 조절하여 저장한다. Quantum™ FITC-5 MESF Kit 설명서에 따라, 블랭크 샐픔 B 및 표준 곡선 1을 각각 검측하여, FITC 전압을 적당한 수치로 조절하여 저장한다. 저장된 전압 하에서 U 바닥 96웰 플레이트의 샘플을 검측하고, 데이터를 기록한다. Flowjo 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 분석하여 Geo 평균값을 얻고, Quantum™ FITC-5 MESF Kit 설명서에 따라 MESF-Geo Mean 표준곡선을 피팅하고, FITC 항 인간 IgG Fc 항체의 농도 형광값에 근거하여, HEK293/hClaudin18.2 세포와 결합하는 인간 Claudin18.2 항체의 몰농도 및 유리 항체 농도를 계산하고, Scatchard 그래픽법을 이용하여 항체의 Bmax 및 해리 상수 KD를 계산한다. 결과는 표 13과 같다.
표 13. 인간화 항체 세포 수준 친화력
Figure pct00100
시험예 5: 항체의 ADCC 효과 평가
각종 NUGC4 세포(고/중/저 발현 Claudin18.2)를 소화하여, 1000rpm으로 원심분리 후, 재현탁하여 카운팅한다. 세포를 3x105세포/mL의 밀도로 10% FBS(뉴질랜드 초저 IgG 소태아혈청, Gibco, 1921005PJ)가 추가된 무페놀 RPMI 1640에 재현탁한다(Gibco, 11835-030). 96웰 플레이트(Corning, 3903)에, 각 웰에 25μL의 세포(7500개/웰)를 추가한다. 항체를 상기 무페놀 배지에 희석하여, 3x 항체 희석액으로 배합되고, 세포 플레이트에 25μL/웰의 항체를 추가한다. 37℃에서, 5% CO2 배양함에서 0.5시간 동안 인큐베이션한다.
작동세포(FcrR3A-V158-NFAT-RE-Jurkat 세포)를 수집하여, 1000rpm으로 원심분리 후, 재현탁하여 카운팅한다. 세포를 3x106세포/mL의 밀도로 10% FBS(뉴질랜드 초저IgG 소태아혈청)가 추가된 무페놀 RPMI 1640에 재현탁하고, 실험 플레이트에 각 웰에 25μL 세포(7.5x104개 세포/웰)를 추가한다. 37℃에서, 5% CO2 배양함에서 6시간 동안 인큐베이션한다.
실험 플레이트의 각 웰에 75μL/웰의 Bright-Glo(Promega, E2610 )를 추가하고, 마이크로플레이트 리더(PerkinElmer , VITOR3)로 화학적 발광(luminescence)을 검측한다.
결과(표 14 및 도 3a-도 3c 참조)에 의하면, 저(도 3a)-중(도 3b)-고(도 3c)의 서로 다른 정도로 Claudin18.2를 발현하는 NUGC4 세포에서, 항체 h1901-11 및 h1902-5는 모두 매우 강한 ADCC 활성을 보여준다.
표 14. 항체가 Claudin18.2 발현 정도가 서로 다른 NUGC4 세포에서의 ADCC 효과
단위 IC50(ng/mL)
Figure pct00101
시험예 6: 화합물의 종양세포 체외 증식 억제에 대한 시험
가. 시험 목적
본 실험은 본 개시의 화합물의 U87MG 세포(교종세포, 중국과학기술원 세포 저장고, Catalog # TCHu138) 및 SK-BR-3 종양세포(인간 유방암 세포, ATCC, 상품번호 HTB-30)의 체외 증식에 대한 억제 활성을 검측하는 것을 목적으로 한다. 서로 다른 농도의 화합물 체외 처리 세포를 6일 배양 후, CTG (CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, Promega, 상품번호: G7573) 시약을 사용하여 세포의 증식에 대한 검사를 진행하고, IC50값에 따라 해당 화합물의 체외 활성을 평가한다.
나. 실험 방법
다음으로는 U87MG 세포에 대한 체외 증식 억제 시험방법을 예시로 하여, 본 개시의 화합물의 종양세포에 대한 체외 증식 억제 활성을 테스트하는 방법을 예로 들어 설명한다. 본 방법은 기타 종양세포의 체외 증식 억제활성 시험에도 적용되나, 이에 한정하지는 않는다.
1. 세포배양: U87MG 및 SK-BR-3 세포를 각각 10% FBS의 EMEM 배지(GE, 상품번호 SH30024.01) 및 10% FBS가 함유된 McCoy's 5A 배지(Gibco, 상품번호 16600-108)로 배양한다.
2. 세포준비. 대수성장기의 U87MG 및 SK-BR-3 세포를 취하여, PBS(인산염 완충액, Shanghai Yuanpei Biotechnology Co., Ltd.)로 1회 세척한 후, 2mL 내지 3mL 트립신(0.25% Trypsin-EDTA (1x), Gibico, Life Technologies 회사)을 추가하여 2분 내지 3분 동안 소화하여, 세포가 완전히 소화되면, 10mL 내지 15mL의 세포 배양액을 추가하여, 소화된 세포를 용리하여, 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여, 상청액은 제거한 다음, 10mL 내지 20mL의 세포 배양액을 추가하여 세포를 재현탁하여, 단세포 현탁액을 만든다.
3. 세포 분주. U87MG 및 SK-BR-3 단세포 현탁액을 골고루 섞은 후, 세포 배양액으로 생세포 밀도가 각각 2.75x103세포/mL 및 8.25x103세포/mL 될 때까지 조정하고, 밀도 조정된 세포 현탁액을 골고루 섞어서 180 μL/웰로 96웰 세포 배양 플레이트에 추가한다. 96웰 플레이트 외주 웰에는 200μL 배지만 추가한다. 배양 플레이트를 배양함에서 24시간 동안 배양한다(37℃, 5% CO2).
4. 화합물 준비. DMSO(디메틸 설폭사이드, Shanghai Titan Technology Co., Ltd.)로 화합물을 용해시켜, 초기 농도가 10mM인 저장액을 배합한다.
소분자 화합물의 시작 농도는 500nM이고, 약물 배합 방법은 다음과 같다.
96웰 U형 바닥 약물 배합 플레이트의 첫 번째 열에 서로 다른 시험 대상 샘플 30μL을 각각 추가하고, 샘플 농도는 100μM이고; 2번째 열 내지 11번째 열의 각 웰에 20μL DMSO를 추가한다. 첫 번째 열의 샘플 10μL을 두 번째 열의 DMSO 20μL에 넣고 골고루 섞은 다음, 10μL의 샘플을 세 번째 열에 넣고, 이와 같은 방식으로 10번째 열에까지 추가한다. 약물 배합 플레이트의 각 웰에 있는 약물 5μL을 EMEM 배지 95μL에 넣고 잘 섞은 다음, 필요할 때에 사용된다.
ADC의 시작 농도는 10nM 또는 500nM이고, 약물 배합 방법은 다음과 같다.
96웰 플레이트의 첫 번째 열에 100μL의 서로 다른 검사 대상 샘플을 넣고, 샘플 농도는 100nM 또는 5μM이고; 2번째 열 내지 11번째 열의 각 웰에 100μL PBS를 추가한다. 첫 번째 열의 샘플 50μL을 두 번째 열의 PBS 100μL에 넣고 잘 섞은 다음, 50μL의 샘플을 취하여 세 번째 열에 넣고, 이와 같은 방식으로 10번째 열까지 3배 희석한다.
5. 샘플 추가 작업. 배지에 20μL 배합된 서로 다른 농도의 검사 대상 샘플을 추가하고, 각 샘플은 2복공이다. 배양 플레이트를 배양함에서 6일 동안 인큐베이션한다(37℃, 5% CO2).
6. 현색 작업. 96웰 세포배양 플레이트를 꺼내서, 각 웰에 90μL CTG 용액을 추가하여, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
7. 플레이트 읽기 작업. 96웰 세포배양 플레이트를 꺼내서, 마이크로플레이트 리더(BMG labtech , PHERAstar FS)에 놓은 후, 마이크로플레이트 리더로 화학적 발광을 측정한다.
다. 데이터 분석
Microsoft Excel, Graphpad Prism 5를 이용하여 데이터를 분석 처리한다. 실시예 결과는 다음 표와 같다.
표 15. 본 개시의 소분자 프래그먼트의 SK-BR-3 세포 및 U87 세포 체외 증식 억제에 대한 IC50값
Figure pct00102
결론: 본 개시의 소분자 프래그먼트는 SK-BR-3 세포 및 U87 세포에 대해 현저한 증식 억제 활성을 갖고, 비대칭중심은 화합물의 억제 활성에 대해 일정한 영향을 미친다.
시험예 7: ADC 분자세포 활성 실험
본 실험은 CellTiter-Glo Luminescence Cell Viability Assay를 이용하여 ADC 분자의 체외에서의 인간 위암세포주에 대한 살상 작용을 검측한다. 1일째, NUGC4-claudin18.2 저 발현, NUGC4-claudin18.2 중 발현, NUGC4-claudin18.2 고 발현 세포를 수집하고, 밀도를 2.5x104/mL로 조정하고, 96웰 백색 투명 플레이트에 90μL/웰, 각 웰당 약 2500개 세포를 추가한다. 37℃, 5% CO2 배양함에서 하룻밤 동안 배양한다. 2일째, U형 바닥 96웰 플레이트에서 샘플을 희석하고(시작 농도는 5μM, 4x 구배 희석, 9개 농도점), 세포 플레이트에 10μL/웰 희석된 샘플을 추가한다. 37℃, 5% CO2 6일 동안 배양한다. 8일째, 세포 배양 플레이트를 꺼내서, 50μL/웰 Cell Titer-Glo Reagent를 추가하여, 실온에서 2분 내지 3분 동안 둔 후, PHERAstar FS 리드기에서 형광치를 읽는다. GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 데이터분석을 진행한다. 표 16을 참조한다.
표 16. 본 개시의 ADC 분자 체외세포 살상작용
Figure pct00103
체내 활성 생물학 평가
시험예 8: ADC 분자 체내 약효 평가
Balb/c 누드 우측 옆구리 피하에 인간 위암 세포 NUGC4(Claudin18.2 중등 발현) 세포(5x106의 50% matrigel 마트리겔 기질/마리당 함유)를 접종하고, 0일째 그룹을 나누고, 8마리/그룹, 총 5그룹이다. 평균 종양 부피는 약 84.41mm3이다.
ADC 복강내 주사하고, 총 3회 투약하고, 마리당 체중 10g에 0.1mL를 주사하여, 각각 0일째, 4일째, 11일째에 투약한다.
그룹을 나눈 당일로부터, ADC 복강내 주사를 시작하고, 5일 간격으로 투약하여 총 4회 투약하며, 마리당 체중 10g에 0.1mL를 주사한다.
매 주마다 종양 부피 및 체중을 2회 측정하고, 데이터를 기록한다.
Excel 2003 통계 소프트웨어 사용: 평균치는 avg로 계산; SD값은 STDEV로 계산; SEM값은 STDEV/SQRT로 계산; 그룹 간 차이값인 P값은 TTEST로 계산한다.
종양 부피(V) 계산 공식: V＝1/2xL장xL단 2
상대적 부피(RTV)=VT/V0
종양 억제율(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
여기서 V0, VT는 각각 실험 시작 시(처음 투약 당일을 0일째로 한다) 및 측정 계수 시의 종양 부피이다. CRTV, TRTV는 각각 실험 종료 시의 블랭크 대조그룹 및 실험그룹의 상대적 종양 부피이다. 결과는 표 17 및 도 4, 도 5를 참조한다.
표 17. ADC 종양 억제 실험결과
Figure pct00104
vs 블랭크: ** p<0.01.
<110> 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드(Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.) 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드(Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.) <120> 항 클라우딘 항체 약물 접합체 및 그 의약 용도 <130> 702137CPCT <140> PCT/CN2020 <141> 2020-12-11 <150> CN201911273041.7 <151> 2019-12-12 <150> CN202011060513.3 <151> 2020-09-30 <160> 55 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> 호모 사피엔스 <400> 1 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 2 <211> 3350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agaattgcgc tgtccacttg tcgtgtggct ctgtgtcgac actgtgcgcc accatggccg 60 tgactgcctg tcagggcttg gggttcgtgg tttcactgat tgggattgcg ggcatcattg 120 ctgccacctg catggaccag tggagcaccc aagacttgta caacaacccc gtaacagctg 180 ttttcaacta ccaggggctg tggcgctcct gtgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240 gccggggcta cttcaccctg ctggggctgc cagccatgct 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Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 46 <211> 220 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <221> CHAIN <223> L11 <400> 46 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 47 <211> 220 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <221> CHAIN <223> L12 <400> 47 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 48 <211> 220 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <221> CHAIN <223> L13 <400> 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 49 <211> 448 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <221> CHAIN <223> H11 <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 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170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 51 <211> 448 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <221> CHAIN <223> H13 <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 52 <211> 448 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <221> CHAIN <223> H14 <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 53 <211> 448 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <221> CHAIN <223> IMAB-362 중쇄 <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 54 <211> 220 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <221> CHAIN <223> IMAB-362 경쇄 <400> 54 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> 인공서열(Artificial Sequence) <220> <223> 테트라펩티드 연결자 <400> 55 Gly Gly Phe Gly 1 4

Claims (26)

  1. 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염으로서,
    Figure pct00105

    여기서,
    Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- 및 -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-로부터 선택되고;
    Ra 및 Rb는 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 듀테륨원자, 할로겐, 알킬기, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 알콕시기, 히드록실기, 아미노기, 시아노기, 니트로기, 히드록시 알킬기, 시클로 알킬기 및 헤테로고리기로부터 선택되거나; 또는, Ra 및 Rb는 그 연결되는 탄소원자와 함께 시클로 알킬기 또는 헤테로고리기를 형성하며;
    R1은 할로겐, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 시클로 알킬기, 시클로알킬 알킬기, 알콕시 알킬기, 헤테로고리기, 아릴기 및 헤테로 아릴기로부터 선택되고; R2는 수소원자, 할로겐, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 시클로 알킬기, 시클로알킬 알킬기, 알콕시 알킬기, 헤테로고리기, 아릴기 및 헤테로 아릴기로부터 선택되거나; 또는, R1 및 R2는 그 연결되는 탄소원자와 함께 시클로 알킬기 또는 헤테로고리기를 형성하고;
    또는, Ra 및 R2는 그 연결되는 탄소원자와 함께 시클로 알킬기 또는 헤테로고리기를 형성하며;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    n은 1 내지 10이며, n은 소수 또는 정수이고;
    L은 연결자 유닛이며;
    Pc는 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트인, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서, 여기서,
    i) 상기 중쇄 가변영역은, 서열 SEQ ID NO: 3으로 제시되는 중쇄 가변영역의HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 동일한 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은, 서열 SEQ ID NO: 4으로 제시되는 경쇄 가변영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 동일한 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고; 또는
    ii) 상기 중쇄 가변영역은, 서열 SEQ ID NO: 5로 제시되는 중쇄 가변영역의HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 동일한 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은, 서열 SEQ ID NO: 6으로 제시되는 경쇄 가변영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 동일한 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서, 여기서,
    iii) 상기 중쇄 가변영역은 서열이 각각 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11로 제시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열이 각각 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 제시되는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며; 또는
    iv) 상기 중쇄 가변영역은 서열이 각각 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 17로 제시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열이 각각 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로 제시되는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체는 쥐 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항 내지 제4항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서, 여기서,
    (1) 상기 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3으로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며, 및 상기 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며;
    (2) 상기 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 24로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며, 및 상기 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 21로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며;
    (3) 상기 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며, 및 상기 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6으로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며; 또는
    (4) 상기 중쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 31로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지며, 및 상기 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 28로 제시되거나 또는 이와 적어도 90% 동일성을 가지는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체는 인간화 항체인 것으로서, 상기 인간화 항체는 인간 항체 유래의 프레임워크 영역 또는 그 프레임워크 영역 변이체를 포함하고, 상기 프레임워크 영역 변이체는 인간 항체의 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역에서 각각 최대 10개의 아미노산 복귀 돌연변이을 가지며;
    바람직하게는, 상기 프레임워크 영역 변이체는 이하 (a) 또는 (b)로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 것으로서,
    (a) 상기 경쇄 가변영역에는 선택적으로 22S, 85I 및 87H로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되고, 및/또는 상기 중쇄 가변영역에는 선택적으로 48I, 82T 및 69M으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되며; 또는
    (b) 상기 경쇄 가변영역에는 선택적으로 4L 및 22S로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되고, 및/또는 상기 중쇄 가변영역에는 선택적으로 38K, 40R, 48I, 66K, 67A, 69L, 71L 및 73K로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되며;
    바람직하게는, 상기 프레임워크 영역 변이체는 이하로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 것으로서,
    (a-1) 상기 경쇄 가변영역에는 22S, 85I 및 87H의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되고, 및 상기 중쇄 가변영역에는 48I 및 82T의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되며; 또는
    (b-1) 상기 경쇄 가변영역에는 4L의 아미노산 복귀 돌연변이가 포함되는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 이하에 나타난 바와 같은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서,
    (vii) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 3으로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 4로 제시되며;
    (viii) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 27로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 23으로 제시되며;
    (ix) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 5로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 6으로 제시되며; 또는
    (x) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 또는 SEQ ID NO: 34로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30으로 제시되며;
    바람직하게는, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 이하에 나타난 바와 같은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로서,
    (xi) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 31로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 29로 제시되며; 또는
    (xii) 상기 중쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 26으로 제시되고 및 상기 경쇄 가변영역 서열은 SEQ ID NO: 23으로 제시되는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 항체의 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역을 포함하는 것으로서;
    바람직하게는, 상기 중쇄 불변영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변영역 및 그 일반 변이체로부터 선택되고, 상기 경쇄 불변영역은 인간 항체 κ 및 λ 쇄 불변영역 및 그 일반 변이체로부터 선택되며;
    보다 바람직하게는, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 SEQ ID NO: 7로 제시되는 서열과 같은 중쇄 불변영역 및 SEQ ID NO: 8로 제시되는 서열과 같은 경쇄 불변영역을 포함하며;
    가장 바람직하게는, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, SEQ ID NO: 35 또는 SEQ ID NO: 42로 제시되는 중쇄와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 39로 제시되는 경쇄와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄; 또는
    SEQ ID NO: 37 또는 SEQ ID NO: 49로 제시되는 중쇄와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 38 또는 SEQ ID NO: 46으로 제시되는 경쇄와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄;를 포함하는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는,
    (c) SEQ ID NO: 35로 제시된 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 36으로 제시된 서열과 같은 경쇄;
    (d) SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 또는 SEQ ID NO: 45로 제시되는 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 또는 SEQ ID NO: 41로 제시되는 서열과 같은 경쇄;
    (e) 서열 SEQ ID NO: 37로 제시되는 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 38로 제시되는 서열과 같은 경쇄; 또는
    (f) 서열 SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 또는 SEQ ID NO: 52로 제시되는 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 또는 SEQ ID NO: 48로 제시되는 서열과 같은 경쇄;를 포함하는, 식(Pc-L-Y-D)로 제시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Claudin18.2 항체는,
    SEQ ID NO: 44로 제시되는 아미노산 서열과 같은 중쇄 및 SEQ ID NO: 41로 제시되는 아미노산 서열과 같은 경쇄를 포함하는 h1901-11; 또는
    SEQ ID NO: 49로 제시되는 아미노산 서열과 같은 중쇄, 및 SEQ ID NO: 47로 제시되는 아미노산 서열과 같은 경쇄를 포함하는 h1902-5;로부터 선택되는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서, n은 2 내지 8의 소수 또는 정수, 바람직하게는 3.5 내지 4.5의 소수 또는 정수인, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서,
    Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-이고;
    Ra 및 Rb는 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 듀테륨원자, 할로겐 또는 알킬기로부터 선택되며;
    R1은 할로겐화 알킬기 또는 C3-6 시클로 알킬기이고;
    R2는 수소원자, 할로겐화 알킬기 또는 C3-6 시클로 알킬기로부터 선택되며;
    또는, R1 및 R2는 그 연결되는 탄소원자와 함께 C3-6 시클로 알킬기를 형성하며;
    m은 0 또는 1인, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 Y는,
    Figure pct00106
    ,
    Figure pct00107
    ,
    Figure pct00108
    ,
    Figure pct00109
    ,
    Figure pct00110
    ,
    Figure pct00111
    및
    Figure pct00112
    로부터 선택되고;
    여기서, Y의 O단은 연결자 유닛 L과 서로 연결되는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결자 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이고,
    L1은 -(숙신이미드-3-일-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- 또는 -C(O)-W-C(O)-로부터 선택되고, 여기서 W는 C1-8 알킬기, C1-8 알킬기- C3-6 시클로 알킬기 및 1개 내지 8개 사슬 원자의 직쇄 헤테로 알킬기로부터 선택되고, 상기 헤테로 알킬기는 1개 내지 3개의 N, O 및 S로부터 선택되는 헤테로 원자를 포함하며, 상기 C1-8 알킬기, C1-8 알킬기- C3-6 시클로 알킬기 또는 1개 내지 8개 사슬 원자의 직쇄 헤테로 알킬기는 각각 독립적으로 선택적으로 할로겐, 히드록실기, 시아노기, 아미노기, 알킬기, 클로로화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 알콕시기 및 시클로 알킬기로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 치환기에 의해 추가로 치환되며;
    L2는 -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- 또는 화학 결합으로부터 선택되며, 여기서 p1은 1 내지 20의 정수이며;
    L3은 2개 내지 7개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기이며, 상기 아미노산은 페닐알라닌, 글리신, 발린, 라이신, 시트룰린, 세린, 글루타민산, 아스파르트산으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기이며, 또한 선택적으로 할로겐, 히드록실기, 시아노기, 아미노기듀테로화, 알킬기, 클로로화 알킬기, 듀테로화 알킬기, 알콕시기 및 시클로 알킬기로부터 선택되는 하나 또는 다수 개의 치환기에 의해 추가로 치환되며;
    L4는 -NR5(CR6R7)t-, -C(O)NR5-, -C(O)NR5(CH2)t- 및 화학 결합으로부터 선택되며, 여기서 t는 1 내지 6의 정수이고;
    R3, R4 및 R5는 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기 및 히드록시 알킬기로부터 선택되며;
    R6 및 R7은 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐, 알킬기, 할로겐화 알킬기, 듀테로화 알킬기 및 히드록시 알킬기로부터 선택되는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  15. 제1항 내지 제14한 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결자 유닛 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이고,
    L1은
    Figure pct00113
    이고, s1은 2 내지 8의 정수이며;
    L2는 화학 결합이며;
    L3은 테트라펩티드 잔기; 바람직하게는 GGFG인 테트라펩티드 잔기이며;
    L4는 -NR5(CR6R7)t-이고, R5, R6 또는 R7은 동일하거나 또는 동일하지 않으며, 각각 독립적으로 수소원자 또는 알킬기이고, t는 1 또는 2이며;
    여기서, L1 단은 Pc와 서로 연결되고, L4 단은 Y와 서로 연결되는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 -L-은,
    Figure pct00114
    인, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 -L-Y-는 선택적으로,
    Figure pct00115

    Figure pct00116
    및
    Figure pct00117
    로부터 선택되는, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 식(Pc-La-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염인 것으로서,
    Figure pct00118

    여기서,
    W, L2, L3, R5, R6, R7은 제14항에 정의한 바와 같고;
    Pc, n, R1, R2, m은 제1항에 정의한 바와 같은, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 식(Pc-Lb-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염인 것으로서,
    Figure pct00119

    여기서,
    s1은 2 내지 8의 정수이고;
    Pc, R1, R2, R5 내지 R7, m 및 n은 제18항에 정의한 바와 같은, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드-약물 접합체는,
    Figure pct00120

    Figure pct00121
    및
    Figure pct00122
    로부터 선택되고,
    여기서, Pc 및 n은 제1항에 정의한 바와 같은, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드-약물 접합체는,
    Figure pct00123
    및
    Figure pct00124
    로부터 선택되고,
    여기서, n은 제1항에 정의한 바와 같고; 항체 h1902-5, h1901-11은 제10항에 정의한 바와 같은, 식(Pc-L-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염.
  22. 식(Pc-La-Y-D)로 표시되는 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 이하와 같이,
    Figure pct00125

    Figure pct00126

    Pc'는 식(La-Y-D)로 표시되는 화합물과 공역반응을 진행하여, 식(Pc-La-Y-D)로 표시되는 화합물을 얻는 단계를 포함하는 것으로서,
    여기서,
    Pc는 항 Claudin18.2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트이고; Pc'는 Pc를 환원시켜 얻는 것이며;
    W, L2, L3, R1, R2, R5 내지 R7, m 및 n은 제18항에 정의한 바와 같은, 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염, 및 일종 또는 다종의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 벡터를 포함하는, 약학 조성물.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 제23항에 따른 약학 조성물의 Claudin18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증을 치료하기 위한 약물을 제조함에 있어서의 용도.
  25. 제24항에 있어서, 상기 Claudin18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증은 Claudin18.2 과발현 암인, 용도.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 리간드-약물 접합체 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 제23항에 따른 약학 조성물의 종양 및 암을 치료 및/또는 예방하는 약물을 제조함에 있어서의 용도로서, 상기 종양 및 암은 바람직하게는 두경부 편평세포암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계암, 신경내분비종양, 인후암, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간담도암, 췌장암, 위암, 위장관암, 장암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포신세포암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수종 이형성 증후군, 크루켄버그 종양, 골수증식성 종양, 편평 세포 암종, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포 암종이고; 보다 바람직하게는, 상기 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구 풍부 거대 B- 세포 림프종 및 림프형질구성 림프종으로부터 선택되고, 상기 폐암은 비소세포폐암 및 소세포폐암으로부터 선택되며, 상기 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병으로부터 선택되는, 용도.
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