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KR20220092859A - 항-cxcr2 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-cxcr2 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20220092859A
KR20220092859A KR1020227010854A KR20227010854A KR20220092859A KR 20220092859 A KR20220092859 A KR 20220092859A KR 1020227010854 A KR1020227010854 A KR 1020227010854A KR 20227010854 A KR20227010854 A KR 20227010854A KR 20220092859 A KR20220092859 A KR 20220092859A
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seq
amino acid
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cancer
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광 양
샤오제 시
리차드 러너
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상하이테크 유니버시티
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Abstract

항-CXCR2 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 항체 또는 이의 단편은 CXCR2 단백질의 N-말단, 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 다양한 예에서, 항체 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 1의 VH CDR1, SEQ ID NO: 2의 VH CDR2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO:7-14 중 어느 하나의 VH CDR3, SEQ ID NO: 4의 VL CDR1, SEQ ID NO: 5의 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 6의 VL CDR3, 또는 이의 각각의 변이체를 포함한다. 질환 예컨대 암 및 염증성 질환을 치료하고 진단하기 위한 항체 또는 이의 단편을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

항-CXCR2 항체 및 이의 용도
본 발명은 그 내용이 전체로 본원에 참조로서 인용된, 2019 년 9 월 4 일에 출원된 PCT/CN2019/104336 의 우선권을 주장한다.
G 단백질 커플링된-수용체 (GPCR) 수퍼패밀리는 800개 이상의 구성원으로 이루어진, 인간 게놈의 가장 큰 패밀리 중 하나이고, 중추 신경계, 면역계, 및 심혈관계를 포함한, 다양한 장기 및 조직에서 광범위한 분포를 갖는다. GPCR은 인간에서 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에 널리 관여된다. 승인된 약물의 거의 40%는 GPCR을 통해서 그들 효과를 매개한다.
그들의 생리적 리간드의 진화적 상동성 및 성질을 기반으로, 대부분 GPCR 단백질은 다음의 5개 주요 패밀리 중 하나로 분류될 수 있다: 로돕신, 어드헤신, 세크레틴, 글루타메이트, 및 프리즐드/TAS2. 로돕신은 가장 크고 가장 불균질한 패밀리이고, 4개 서브패밀리, α, β, γ, 및 δ로 더욱 분류될 수 있다. 이들 단백질은 유사한 구조를 갖는다: 세포외 N-말단, 7개 경막 영역, 및 세포질 C-말단. 그들은 다양한 리간드, 예컨대 아미노산, 핵산, 펩티드 및 단백질과 상호작용을 통해서 다양한 세포외 자극을 감지하고, 리간드-유도된 입체배열 변화를 통해서 세포내 신호전달 경로를 활성화한다. 정규 신호전달에서, GPCR 신호는 C-말단의 특이적 세포질 영역 상에서 세포내 GTP-의존적 단백질 (G 단백질)의 동원을 통해서 전달된다 - 소위 G 단백질-의존적 신호전달. 이후에, 관여되는 특정 G 단백질에 의존하여, cAMP를 포함한 하류 경로 또는 PIP2 경로가 활성화된다.
게다가, 다른 세포내 스캐폴드 단백질, 예를 들어, β-어레스틴의 동원은 G 단백질-독립적 신호전달 사건을 활성화시키는 것으로 확인되었다. 다중 신호전달은 GPCR에게 세포 내에서 유사한 기능을 부여하고, 임의의 단일 표적 수용체를 특이적 하류 세포 활성과 연결시키는 관련 어세이를 디자인하는 것을 어렵게 만든다. 이들 중요한 표적에 대해서 고도로 효과적인 치료제를 개발하는 것은 약학 산업에서 여전히 도전으로 남아있다. 또한, 항체가 새로운 요법의 증가되는 공급원으로서 부상하고 있으나, 아직까지는 GPCR에 대해 단지 하나의 치료 항체만이 개발되었는데, 대체로 이들 막 단백질의 기능적 입체배열에 결합하는 항체를 생성시키는 것이 어렵기 때문이다.
조합 항체는 약물 발굴에서 강력한 도구로서 출현되었다. 파지 패닝으로부터 수득된 80종 이상의 항체가 임상 연구에 들어가 있고 그들 중 10종이 넘는 것들이 마케팅 승인을 받았다. 조합 항체 라이브러리 접근법은 최대 1014 의 별도 결합 분자로 이루어지는 레파토리의 광대한 다양성을 이용한다. 이러한 라이브러리로부터 선택된 항체는 다양한 기전이 확인되었고, 효현제, 길항제, 또는 역효현제로서 기능할 수 있거나 또는 중화될 수 있다. 일부 경우에 그들은 천연 리간드 범위를 넘어서 기능하는 것으로 확인되었다.
CXCR2 (C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2)는 케모카인 수용체 패밀리의 구성원으로서, 호중구 상에서 주로 발현된다. CXCR2는 보통 염증성 자극에 후속하는 호중구 주화성에 관여되는 것으로 확인되었다. 그러나, 호중구의 원치않는 이동은 대장염, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 천식, 및 사구체신염을 포함한, 염증과 연관된 다양한 질환에서 병리생리학의 큰 부분일 수 있다. 예를 들어, 이전 연구는 CXCR2의 고갈이 폐를 흡연-유도 염증 및 손상으로부터 보호한다고 보고하였다. 또한, CXCR2는 상이한 유형의 암의 진행에 참여하여, 종양 세포의 증식, 생존 및 전이에서 상당한 역할을 하고, 전체 종양 미세환경에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
이들 임상 소견을 고려하면, CXCR2-유도된 호중구 이동의 억제는 호중구-관련 염증성 질환 및 일부 암을 치료하기 위한, 중요하지만, 아직 실현되지 않은 전략으로서 확인되었다. CXCR2를 표적화하는 몇몇 소형 분자는 시험관내 또는 동물 연구에서 수용체에 대해 현저한 억제 효과가 이미 확인되었지만, 임상 상황에서 치료적 효능은 확인되지 않았다. 이것은 CXCR2에 대한 비-기능적 결합 및 오프-표적 효과로 인한 것으로 여겨진다.
반대로, 항체는 그들이 높은 특이성, 높은 혈청 안정성, 높은 안전성을 가지고, 그들 크기때문에 수용체와 리간드 결합을 차단한다는 점에서 이들 임상적 어려움을 극복할 수 있다. 그러나, 선택을 위해 천연 입체배열로 안정한 항체의 적절한 분량의 제조에서의 어려움때문에, GPCR을 표적화하는 기능적 항체를 발견하는 것은 도전이었다.
본 개시는 CXCR2에 결합할 수 있고, IL-8에 의한 이의 결합을 효과적으로 억제하거나 또는 완전히 차단하여서, IL8-유도 호중구 주화성을 억제할 수 있는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 이들 항체 및 단편은 IL8 자체가 높은 친화성 (나노-몰)으로 결합하는 문제를 극복할 수 있는 우수한 친화성 (예를 들어, 피코몰 수준)을 나타내어서, IL8 유도 세포 기능의 완전한 억제를 초래한다. 게다가, 이들 항체는 편향된 작용 효과 및 CXCR2의 활성화된 엔도시토시스를 나타내서, CXCR2-매개 병리학적 사건의 보다 효율적인 억제를 초래할 수 있다.
추가 실험은 시험된 항-CXCR2 항체가 주로 인간 CXCR2 단백질의 세포외 N-말단 중 일부 아미노산 잔기 (잔기 1-48, 특히 잔기 9-19) 의 측쇄를 통해서 CXCR2와 상호작용한다는 것을 확인하였다. 이러한 상호작용이 IL8 결합 및 IL8 유도된 세포 기능을 억제하는데 충분하였다는 것은 놀랍고도 예상치 못한 것인데, 적어도 CXCR2가 IL8 결합에 역시 관여되는 3개의 다른 세포외 도메인 (루프)을 갖는다고 보다 앞서 제안되었기 때문이다.
그러므로, 본 개시의 일 구현예에 따라서, 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 항체 또는 이의 단편은 인간 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2 (CXCR2) 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 결합은 SEQ ID NO:15의 잔기 9-19 내 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 D13, F14 및 W15 중 적어도 하나가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 적어도 F14 및 W15가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 적어도 D13, F14 및 W15가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 48 N-말단 잔기 외부의 임의 아미노산 잔기가 관여되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 CXCR2 및 IL-8 단백질 간 결합을 억제한다.
다른 구현예는 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 항체 또는 이의 단편은 인간 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2 (CXCR2) 단백질에 대한 특이성을 가지며, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고, VH CDR1은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:1로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고; VH CDR2는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:2로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고; VH CDR3은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열, SEQ ID NO:3으로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체, 또는 SEQ ID NO:7-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이체를 포함하고; VL CDR1은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:4로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고; VL CDR2는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:5로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고; VL CDR3은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:6으로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, VH CDR1은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하고; VH CDR2는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하고; VH CDR3은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:7-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이체를 포함하고; VL CDR1은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR2는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR3은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH CDR3은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH는 SEQ ID NO:17 또는 18의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:17 또는 18과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VH는 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:18과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VL은 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:19와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함한다.
치료 방법 및 용도가 또한 제공된다. 일 구현예에서, 치료를 필요로 하는 환자에서 암 또는 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공되고, 방법은 환자에게 본 개시의 항체 또는 이의 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 염증성 질환은 파킨슨병, 관절염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선, 건선성 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 소아 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 애디슨병, 셀리악병, 피부근염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 쇠그렌 증후군, I형 당뇨병, 혈관염, 포도막염, 아테롬성 동맥경화증 및 강직성 척추염 중 하나 이상이다.
도 1A-D. h CXCR2에 대한 밀접 결합 항체의 에피토프-유도 선택. (A) 인간 CXCR2의 세포외 N-말단 상의 IL-8 에피토프를 기반으로 파지 패닝을 통해 선택된 항체의 개략적인 예시도; (B) SPR에 의한 2종 조합 항체, abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 결합 친화성 측정 (센서그램 그래프의 적합화 곡선 및 KD 값); (C) CXCR2의 N-말단에 대한 선택된 항체의 결합 부위를 보여주는 HDX-MS 결과; (D) 인간 CXCR2 N-말단의 에피토프 서열 (녹색 및 붉은선)과 복합체 형성된 abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1 (각각 회색 및 보라색)의 3D 구조를 보여주는 분해된 결정 구조.
도 2A-B. abN48-IgG1 및 ab48-2-IgG1의 종 및 아형 특이성. (A) U2OS 세포막 상에서 과발현된 hCXCR2, hCXCR1, 및 mCXCR2에 대한 abN48-IgG1 또는 abN48-2-IgG1의 공-국재화. 모든 시험 수용체 단백질은 mCherry 형광 태그와 융합되었고, 면역세포형광 이미지는 공초점 현미경으로 캡처되었다; (B) U2OS 세포 상에서 과발현된 hCXCR2, hCXCR1, mCXCR2, rCXCR2, 토끼CXCR2 및 마카카CXCR2와 abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 표면 상호작용. 유세포측정을 사용해 항체 및 CXCR2 수용체 단백질 간 상호작용을 측정하였다.
도 3A-E. CXCR2 매개 세포 신호전달 경로. (A) Tango 리포터 유전자 어세이를 사용한 IL-8, GROα (CXCL1), 및 abN48 항체 리간드에 의한 β-어레스틴 신호전달의 활성화; (B) abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1에 의한 케모카인 유도된 β-어레스틴 신호전달의 억제. IL-8 (좌) 및 CXCL1 (우)의 유도 농도는 그들의 상응하는 EC80 값이었다; (C) FLIPR 측정을 사용한 IL-8, GROα (CXCL1), 및 abN48 항체 리간드에 의한 Ca2+ 유입의 활성화; (D) abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1에 의한 케모카인 유도된 Ca2+ 유입의 억제. IL-8 (좌) 및 CXCL1 (우)의 유도 농도는 그들의 상응하는 EC90 값이었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 계산된 EC50 및 IC50 값은 적합화 곡선 옆에 열거된다; (E) abN48 항체에 의한 CXCR2 내재화의 활성화. CXCR2 안정한 과발현 존재 또는 부재의 U2OS 세포가 abN48-IgG1 및 독소의 면역독소 복합체, 항체 또는 독소 단독에 대해 사용되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 4A-B. abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1은 IL-8 유도된 호중구 주화성을 강력하게 억제한다. (A) abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1 (FITC-접합)은 동일한 수준으로 인간 초대 호중구에 특이적으로 결합한다. (B) IL8 (10 nM) 유도된 호중구 주화성에 대한 abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 억제 효과는 주화성 어세이를 통해 결정하였다. 블랭크: IL8 또는 억제제 부재 배지, IL8: 10 nM IL8, iso: 10 nM 미관련 인간 IgG1 항체, MK: 1 μM 소형 분자 CXCR2 억제제 MK7123. 파란색 및 녹색 막대 위 백분율 (%) 값은 각각 다양한 농도의 abN48-2-IgG2 및 1 μM MK7123에 의해 유도된 호중구 주화성의 억제 백분율을 나타낸다.
도 5A-C. h CXCR2를 표적화하는 조합 항체의 선택. (A) 라이브러리 패닝으로부터 9종의 양성 클론이 분비형 조합 scFv 항체로서 발현되었고, 여기서 H8은 또한 abN48로 표시된다. pepN48과 이들 클론의 결합은 ELISA로 확인하였다. (B) 세포 표면에 발현된 hCXCR2에 대한 abN48 (H8)의 결합은 FACS를 통해서 측정하였다. (C) pepN48과 abN48 (H8)의 결합 친화성은 Biacore T200에서 SPR 어세이를 통해서 결정되었다.
도 6A-B. 전체 길이 abN48-IgG1 정제 및 돌연변이체 CDR3 서열 정렬. (A) abN48에서 abN48-IgG로 전체 길이 IgG1 형식 항체 구축의 예시, 및 abN48 및 abN48-IgG1의 SDS-PAGE. (B) 친화성 성숙화에서 돌연변이체 CDR3 서열의 Weblogo 분석.
도 7. SEC-HPLC에 의한 재조합 조합 항체의 균질성 분석. 붉은색 직사각형 테두리로 강조한 어깨 피크는 42℃에서 항체 단백질의 인큐베이션 동안 생성된 불순물을 나타낸다.
도 8. CXCR2 매개 β-어레스틴 신호전달에 대한 조합 항체의 역작용 효과. hCXCR2의 막 발현에 의해 유도된 내재 β-어레스틴 동원 (기준치로서 표시된 붉은색 막대로 표시)은 상이한 농도의 abN48-IgG1 (녹색 막대) 및 abN48-2-IgG1 (파란색 막대)의 존재 하에서 유의하게 감소되었다.
도 9A-B. 에피토프 영역의 맵핑을 위한 h CXCR2의 N-말단의 절두 돌연변이유발. (A) CXCR2-N-말단의 디자인된 N-말단 또는 C-말단 절두된 합성 펩티드의 개략적인 예시도; (B) hCXCR2의 N-말단 펩티드 및 abN48-IgG1 (회색) 또는 abN48-2-IgG1 (검은색) 간 상호작용.
도 10A-B. abN48/NT9-19 단백질 복합체의 전체 구조. (A) 하나의 비대칭 유닛의 2개 abN48을 만화 모델로서 도시하였고, 결합된 NT9-19 펩티드는 1.1σ로 윤곽을 그린 2Fo-Fc 전자 밀도 맵이 둘러싼 노란색 스틱 모델로서 도시하였다. 좌측 abN48은 회색으로 착색하였고 나머지는 다음과 같이 착색하였다: 경쇄, 청록색; 중쇄, 음영; 경쇄 CDR, tv_녹색; 중쇄 CDR, tv_붉은색. (B) 하나의 abN48/NT9-19 단백질 복합체에서, NT9-19의 잔기 EDFWK12-16aa는 전자 밀도 (좌)로부터 충분히 추적할 수 있었는데 반해서, 나머지는, 잔기 FW14-15aa에 대한 전자 밀도만을 확인할 수 있었다 (우). 전자 밀도로부터 추적할 수 있는 잔기는 1.1σ에서 윤곽을 그린 바다색 (좌) 또는 보라색 (우) 밀도 맵이 둘러싼 노란색 스틱 모델로서 도시되었다.
도 11A-C. CXCR2_N의 잔기 EDFWK12-16aa는 주로 소수성 상호작용을 통해서 abN48의 CDR 루프와 상호작용한다. (A) NT9-19와 복합체 형성한 abN48의 측면 구조 (좌) 및 상면 구조 (우). 중쇄의 CDR 루프는 tv_붉은색으로 착색되고 경쇄는 tv_녹색으로 착색되고, abN48 경쇄의 나머지는 청록색으로 착색되고 abN48 중쇄의 나머지는 음영 착색된다. NT9-19의 잔기 EDFWK12-16aa는 전자 밀도로부터 추적할 수 있고 1.1σ에서 윤곽을 그린 2Fo-Fc 전자 밀도가 둘러싸인 노란색 스틱 모델로서 도시된다. CDR 루프를 제외하고, abN48의 나머지는 명확함을 위해 투명하게 하였다. (B) NT9-19의 잔기 FW14-15aa는 abN48의 상단에서 CDR 루프에 의해 형성된 대형 소수성 포켓에 적당하게 맞는다. abN48의 정전기 표면 도면은 +10 V (진한 파란색) 내지 -10 V (진한 붉은색) 범위로, 국부 정전기 전위에 따라서 착색된다. (C) NT9-19의 F14 및 W15는 그들의 부피 큰 방향족 측쇄를 abN48의 CDR 루프에 의해 형성된 소수성 구멍에 삽입시켜서, 주로 abN48로부터의 잔기와 강력한 π-π 적층 상호작용을 형성한다. NT9-19의 잔기 EDFWK12-16aa 및 abN48 상의 관련 잔기는 모두 스틱 모델로서 도시되었고 (A)에서와 동일한 색으로 착색되었다.
도 12A-B. 에피토프 맵핑을 위한 부위-지정 돌연변이유발법. hCXCR2 N-말단 상의 IL-8 결합 영역 내 아미노산 잔기 (D13, F14, W15, K16)에 대해서 알라닌-스캔 부위-지정 돌연변이유발법을 수행하였다. hCXCR2의 점 돌연변이체는 mCherry 융합 단백질로서 U2OS 세포 상에서 이소성으로 발현되었고, abN48-IgG1 항체로 염색되었다. (A) ICC; 및 (B) FACS 결과는 모두 D13, F14 및 W15가 항체 결합을 위한 3개의 핵산 잔기라는 것을 확인하였다.
정의
용어 "한" 또는 "하나" 독립체는 하나 이상의 그 독립체를 의미한다는 것을 유의하고, 예를 들어, "한 항체"는 하나 이상의 항체를 의미한다는 것을 이해한다. 이와 같이, 용어 "한" (또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 단수 "폴리펩티드"를 비롯하여 다수 "폴리펩티드"를 포괄하고자 하며, 아미드 결합 (펩티드 결합이라고도 알려짐)에 의해 선형적으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 의미한다. 용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산의 임의 사슬 또는 사슬들을 의미하고, 생성물의 특정 길이를 의미하는 것이 아니다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 의미하고자 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에, 또는 그와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 제한없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 기지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해적 절단, 또는 비천연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함한, 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 의미하고자 한다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유도될 수 있거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되는 것은 아니다. 화학적 합성을 포함하여, 임의 방식으로 생성될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개 펩티드 간에 또는 2개 핵산 분자 간에 서열 유사성을 의미한다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각 서열 내 위치를 비교하여 결정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 간 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 일치하거나 또는 상동성인 위치의 수의 함수이다. "미관련" 또는 "비상동성" 서열은 본 개시의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 그러나 바람직하게 25% 미만의 동일성을 공유한다.
용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오티드"는 핵산의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보체와 일정 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 의미한다. 이중 가닥 핵산의 상동성은 이의 상보체와 일정 정도의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하고자 한다. 일 양태에서, 핵산의 상동체는 핵산 또는 이의 상보체와 혼성화할 수 있다. 유사하게, "동등한 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열과 일정 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 양태에서, 서열 동일성은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 양태에서, 동등한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 부가, 결실, 치환, 및 그들 조합을 갖는다. 일부 양태에서, 동등한 서열은 기준 서열의 활성 (예를 들어, 에피토프-결합) 또는 구조 (예를 들어, 염-가교)를 보유한다.
본 명세서에서 사용되는 "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩티드"는 항원을 특이적으로 인식하여 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 의미한다. 항체는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬일 수 있다. 따라서, 용어 "항체"는 항원과 결합의 생물학적 활성을 갖는 면역글로불린 분자의 적어도 일부분을 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드 함유 분자를 포함한다. 이러한 예는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 이의 임의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 부분을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 항체의 부분 예컨대 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 등이다. 구조와 무관하게, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합된다. 용어 "항체 단편"은 압타머, 스피겔머, 및 디아바디를 포함한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특이적 항원과 결합하여 복합체를 형성하는 항체처럼 작용하는 임의의 합성 또는 유전자 조작된 단백질을 포함한다.
"단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 의미한다. 일부 양태에서, 영역은 10개 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드와 연결된다. 링커는 가요성을 위해 글리신을 비롯하여, 가용성을 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있고, VH 의 N-말단을 VL 의 C-말단과 연결시킬 수 있거나, 또는 그 반대일 수도 있다. 이러한 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 본래 면역글로불린의 특이성을 보유한다. ScFv 분자는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기술되어 있다.
용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 광범위한 부류의 폴리펩티드를 포괄한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론 (γ, μ, α, δ, ε)으로서 분류되고 이 중 일부는 하위부류 (예를 들어, γ1-γ4)로 분류된다는 것을 이해할 것이다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 항체의 "부류"를 결정하는 것은 이 사슬의 성질이다. 면역글로불린 하위부류 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 등은 충분히 특징규명되어 있고 기능적 특수화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 부류 및 이소타입 각각의 변형된 형태는 본 개시의 관점에서 당업자가 쉽게 인식할 수 있고, 따라서, 본 개시의 범주 내에 있다. 모든 면역글로불린 부류는 분명하게 본 개시의 범주내에 있고, 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관한 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤 분자량의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 53,000-70,000 분자량의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4개 사슬은 전형적으로 "Y" 입체배열로 디술피드 결합에 의해서 연결되며, 경쇄는 "Y"의 입부분에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 괄호로 묶는다.
본 개시의 항체, 이의 항원-결합 폴리펩티드, 변이체, 또는 유도체는 다클론, 단일클론, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 단편, 단쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, 디술피드-연결 Fv (sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 명세서에 개시된 항-Id 항체 내지 LIGHT 항체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.
경쇄는 카파 또는 람다 (κ, λ)로서 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유적으로 결합되고, 2개 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포, 또는 유전자 조작 숙주 세포에 의해 생성될 때 공유 디술피드 연결 또는 비공유 연결을 통해서 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 입체배열의 양갈래 말단에서 N-말단으로부터 각 사슬의 바닥에서 C-말단으로 이어진다.
경쇄 및 중쇄 둘 모두는 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 분류된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 (VK) 및 중쇄 (VH) 부분 둘 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 이해할 것이다. 반대로, 경쇄 (CK) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 성질 예컨대 분비, 태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관례에 따라서 불변 영역 도메인의 번호매김은 그들이 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 멀어지게 되면 증가된다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단은 불변 영역이고; CH3 및 CK 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기 표시된 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하여 특이적으로 결합하도록 허용한다. 즉, 항체의 VK 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 서브세트는 조합되어 3차원 항원-결합 부위를 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각 팔부 말단에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 보다 특히, 항원-결합 부위는 VH 및 VK 사슬 각각에 3개 CDR (즉, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에 의해 한정된다. 일부 예에서, 예를 들어, 낙타 종으로부터 유래되거나 또는 낙타 면역글로불린을 기반으로 조작된 일정 면역글로불린 분자에서, 완전한 면역글로불린 분자는 경쇄없이, 오직 중쇄만으로 이루어질 수 있다. 참조: 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).
천연 발생 항체에서, 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 6개 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 이의 3차원 입체배열을 취하게 되듯이 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치된 아미노산의 짧은 불연속 서열이다. "프레임워크" 영역이라고 하는, 항원-결합 도메인 내 아미노산의 나머지는 적은 분자간 가변성을 보인다. 프레임워크 영역은 대체로 β-시트 입체배열을 채택하고, CDR은 연결된 루프를 형성하고, 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬간, 비공유 상호작용에 의해서 올바른 배향으로 CDR의 위치화를 위해 제공되는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 한정한다. 이러한 상보성 표면은 이의 동족 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 그들이 정확하게 한정되었으므로, 당업자가 임의의 소정 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 쉽게 확인할 수 있다 (참조: "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kbat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987)).
당분야에서 사용되고/되거나 허용되는 용어의 둘 이상의 정의가 존재하는 경우에, 본 명세서에서 사용되는 용어의 정의는 달리 명확하게 반대로 명시하지 않으면 모든 이러한 의미를 포함하고자 한다. 특정예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에 존재하는 불연속 항원 조합 부위를 설명하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 사용이다. 특정 영역은 그들 전체로 참조하여 본 명세서에 편입되는, 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)]에 기술되어 있다. 카밧 (Kabat) 및 초티아 (Chothia)에 따른 CDR 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 서브세트 또는 중복을 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 의미하는 정의의 적용은 본 명세서에서 정의되고 사용되는 용어의 범주 내에 두고자 한다. 상기 인용된 참조 각각에 의해 정의되는 바와 같은 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표에 기재된다. 특정 CDR을 포괄하는 정확한 잔기의 수는 CDR의 서열 및 크기에 의존하여 가변적일 수 있다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어떠한 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있다.
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Kabat 등은 또한 임의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호매김 체계를 정의하였다. 당업자는 서열 자체 이상의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 임의의 가변 도메인 서열에 대해 이러한 "카밧 번호매김" 체계를 분명하게 지정할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "카밧 번호매김"은 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 기재된 번호매김 체계를 의미한다.
상기 표 이외에도, 카밧 번호매김 체계는 다음과 같이 CDR 영역을 기술한다: CDR-H1은 대략 아미노산 31 (즉, 제1 시스테인 잔기 이후 대략 9 잔기)에서 시작하여, 대략 5-7 아미노산을 포함하고, 다음 트립토판 잔기에서 종료된다. CDR-H2는 CDR-H1의 종료 이후에 15번째 잔기에서 시작하여, 대략 16-19 아미노산을 포함하고, 다음 아르기닌 또는 리신 잔기에서 종료된다. CDR-H3은 CDR-H2의 종료 이후 대략 33 아미노산 잔기에서 시작하여, 3-25 아미노산을 포함하고, 서열 W-G-X-G에서 종료되며, 여기서 X는 임의 아미노산이다. CDR-L1은 대략 잔기 24 (즉, 시스테인 잔기 이후)에서 시작하여, 대략 10-17 잔기를 포함하고, 다음 트립토판 잔기에서 종료된다. CDR-L2는 CDR-L1의 종료 이후 대략 16번째 잔기에서 시작하여 대략 7 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2의 종료 이후 (즉, 시스테인 잔기 이후) 대략 33 잔기에서 시작하여, 대략 7-11 잔기를 포함하고, 서열 F 또는 W-G-X-G에서 종료되며, 여기서 X는 임의 아미노산이다.
본 명세서에 개시된 항체는 새 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원일 수 있다. 바람직하게, 항체는 인간, 쥣과동물, 당나귀, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 리마, 말, 또는 닭 항체이다. 다른 구현예에서, 가변 영역은 기원이 콘드릭토이드 (condricthoid) (예를 들어, 상어 유래)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "중쇄 불변 영역"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드는 CH1 도메인, 힌지 (예를 들어, 상부, 중간부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 개시에서 사용을 위한 항원-결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함한 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, 및 CH2 도메인을 포함한 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함한 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, 및 CH3 도메인을 포함한 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함한 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 본 개시에서 사용을 위한 항체는 CH2 도메인의 적어도 일부 (예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 결여될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 중쇄 불변 영역은 변형되어서 천연 발생 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 다를 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
본 명세서에 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 불변 영역은 IgGl 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 불변 영역은 부분적으로 IgGl 분자로부터, 그리고 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgGl 분자로부터, 그리고 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래하는 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
"경쇄-중쇄 쌍"은 경쇄의 CL 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인 간 디술피드 결합을 통해서 이량체를 형성할 수 있는 경쇄 및 중쇄의 컬렉션을 의미한다.
이전에 표시된 바와 같이, 다양한 면역글로불린 부류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배열은 충분히 공지되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1 (대부분의 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CH2 도메인"은 예를 들어, 통상의 번호매김 체계를 사용하여 항체의 약 잔기 244에서 잔기 360으로 연장된 중쇄 분자의 일부분을 포함한다 (잔기 244 내지 360, 카밧 번호매김 체계; 및 잔기 231-340, EU 번호매김 체계; 참조: Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍형성하지 않는다는 점에서 독특하다. 대신에, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬은 온전한 천연 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 또한, CH3 도메인이 CH2 도메인으로부터 IgG 분자의 C-말단으로 연장되고 대략 108 잔기를 포함한다는 것이 충분히 보고되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 일부를 포함한다. 이러한 힌지 영역은 대략 25 잔기를 포함하고, 가요성이어서, 2개 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있게 한다. 힌지 영역은 3개의 별도 도메인: 상부, 중간부, 및 하부 힌지 도메인으로 세분될 수 있다 (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).
본 명세서에서 사용되는 용어 "디술피드 결합"은 2개 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 디술피드 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올 기를 포함한다. 대부분의 천연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CK 영역은 디술피드 결합에 의해 연결되고 2개 중쇄는 카밧 번호매김 체계를 사용해 239 및 242에 상응하는 위치 (위치 226 또는 229, EU 번호매김 체계)에서 2개 디술피드 결합을 통해 연결된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득되거나 또는 유도되고 불변 영역 (본 개시에 따라서 온전하거나, 부분적일 수 있거나 또는 변형될 수 있음)은 제2 종으로부터 수득되는 임의 항체를 의미하고자 한다. 일정 구현예에서 표적 결합 영역 또는 부위는 비인간 공급원 (예를 들어, 마우스 또는 영장류) 유래일 것이고 불변 영역은 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 "인간화 백분율"은 인간화 도메인 및 배선 도메인 간 프레임워크 아미노산 편차 (즉, 비-CDR 편차)의 개수를 결정하고, 그 개수를 아미노산의 총 개수로부터 차감한 다음에, 아미노산의 총 개수로 나누고 100을 곱하여 계산된다.
"특이적으로 결합하다" 또는 "특이성을 갖다"란, 일반적으로 항체가 이의 항원-결합 도메인을 통해서 에피토프에 결합하고, 결합은 항원-결합 도메인 및 에피토프간 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이러한 정의에 따라서, 항체는 무작위의, 비관련 에피토프에 결합하는 것에 비해서 이의 항원-결합 도메인을 통해서, 더 쉽게, 그 에피토프에 결합할 때, 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 한다. 용어 "특이성"은 일정 항체가 일정 에피토프에 결합하는 상대적 친화성을 한정하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"에 비해서 소정 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는다고 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련 에피토프 "D"에 대해 갖는 것에 비해서 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방학적 또는 예방적 조치를 의미하고, 여기서 목적은 비바람직한 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 진행을 예방하거나 또는 둔화 (축소)시키는 것이다. 유리하거나 또는 바람직한 임상 결과는 검출가능 또는 검출불가능 여부와 무관하게, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 경감 또는 일시적 경감, 및 관해 (부분 또는 전체)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 이들은 이미 병태 또는 장애가 있는 이들을 비롯하여 병태 또는 장애를 예방해야 하는 병태 또는 장애를 가질 경향이 있는 이들을 포함한다.
"대상체", 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"이란, 진단, 예후, 또는 요법이 바람직한 임의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원, 스포츠, 또는 반려 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 예컨대 "치료를 필요로 하는 환자" 또는 "치료를 필요로 하는 대상체"는 예를 들어, 검출, 진단 과정 및/또는 치료에 사용되는 본 개시의 항체 또는 조성물의 투여로 이득을 얻을 수 있는, 대상체, 예컨대 포유동물 대상체를 포함한다.
항-CXCR2 항체 및 이의 단편
인간 CXCR2 단백질은 4개 세포외 단편을 갖는 경막 단백질이다. 각각의 N-말단 및 3개 세포외 루프는 IL8의 결합에 연루되어 있다. 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Ahuja, S.K. et al., (1996) The Journal of biological chemistry 271, 225-232; Katancik, J.A., et al., (1997) Biochemical and Biophysical Research Communications 232, 663-668; Luo, Z.W., et al., (1997) Protein Engineering 10, 1039-1045; Berkamp, S., et al., (2017) Journal of Biomolecular Nmr 69, 111-121; Park, S.H. et al., (2017) Biophysical Journal 113, 2695-2705; Park, S.H. et al., (2011) J Mol Biol 414, 194-203; 및 Park, S.H. et al., (2012) Nature 491, 779-783.
서열 분석 및 검사를 통해서, 본 발명자는 항체 스크리닝을 위한 에피토프로서 N-말단 세포외 단편을 확인하였다. 놀랍게도, 대규모 스크리닝 (1011 후보물의 라이브러리 유래)으로부터 수득되고 N-말단에 대한 선택적 결합 (피코-몰 역가)을 나타내는 항체 그룹은 IL8 결합을 효과적으로 차단할 수 있었고 IL8-유도 호중구 주화성을 강력하게 억제할 수 있었다. 우수한 친화성은 IL8 자체가 높은 친화성 (나노-몰)으로 결합하여, IL8 유도된 세포 기능의 완전한 억제를 초래하는 문제를 극복하였다. 또한, 이들 항체는 역작용 효과를 보였고 CXCR2에 의한 내재 β-어레스틴 동원을 현저하게 억제하였다. 게다가, 이들 항체는 편향된 작용 효과 및 CXCR2의 활성화된 엔도시토시스를 나타내서, CXCR2-매개 병리적 사건의 보다 효율적인 억제를 야기할 수 있었다.
실험 데이터는 이들 항체 및 그들 항원-결합 단편이 추가 스크리닝으로 수득될 수 있는 것들과 함께, CXCR2 신호전달과 연관된 질환 및 병태, 예컨대 암, 감염, 염증성 및 자가면역 질환을 치료하는데 유용할 수 있다는 것을 보여준다.
본 개시의 일 구현예에 따라서, 인간 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2 (CXCR2) 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 결합은 세포외 N-말단 내 하나 이상의 아미노산 잔기가 관여된다 (즉, MEDFNMESDS FEDFWKGEDL SNYSYSSTLP PFLLDAAPCE PESLEINK; SEQ ID NO:15). 일부 구현예에서, 결합은 적어도 SEQ ID NO:15의 잔기 9-19 (즉, DSFEDFWKGED, SEQ ID NO:16) 내 하나 이상의 아미노산 잔기가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 48 N-말단 잔기 외부의 임의 아미노산 잔기, 예컨대 3개 세포외 루프 내 것들이 관여하지 않거나, 또는 적어도 요구되지 않는다.
일부 구현예에서, 결합은 SEQ ID NO:15의 D13, F14 및 W15 중 적어도 하나가 관여된다 (또는 다른 말로, 그에 항체 또는 단편이 결합한다). 일부 구현예에서, 결합은 적어도 D13이 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 적어도 F14가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 적어도 W15가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 적어도 D13 및 F14가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 적어도 D13 및 W15가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 적어도 F14 및 W15가 관여된다. 일부 구현예에서, 결합은 D13, F14 및/또는 W15 이외에도 SEQ ID NO:15 내 적어도 다른 잔기가 관여된다.
일부 구현예에서, 결합은 IL8 결합의 억제, 그와의 경쟁, 또는 그의 완전한 제거에서 효과적이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 단편은 IL8 매개 CXCR2 신호전달, 또는 내재 CXCR2 신호전달을 억제할 수 있다.
본 개시의 일부 구현예는 인간 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2 (CXCR2) 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 항체 또는 단편은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, CDR은 표 A에 표시된 서열을 비롯하여, 그들 변이체를 포함한다. 표 B는 실험예에서 역시 시험된 VH CDR3의 일부 변이체를 열거한다.
Figure pct00002
일부 구현예에서, 표 A에 표시된 바와 같이, VH CDR1은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하고; VH CDR2는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:2로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고; VH CDR3은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:7-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이체를 포함하고; VL CDR1은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR2는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR3은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항-CXCR2 항체는 1개, 2개, 또는 3개의 추가 변형을 갖는, 표 A에 열거된 바와 같은 VH 및 VL CDR를 포함한다. 이러한 변형은 아미노산의 부가, 결실, 또는 치환일 수 있다. 일부 구현예에서 치환은 보존성 아미노산 치환이다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에서 정의되어 있고, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩티드 내 불필수 아미노산 잔기는 바람직하게 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 구현예에서, 아미노산 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 조성 및/또는 순서가 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 치환될 수 있다.
보존성 아미노산 치환의 비제한적인 예는 하기 표에 제공되며, 여기서 0 이상의 유사성 점수는 2개 아미노산 간 보존성 치환을 의미한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 구현예에서, 본 개시의 항-CXCR2 항체는 SEQ ID NO:17 또는 18의 VH, SEQ ID NO: 19의 VL, 또는 그들의 개별 생물학적 동등물을 포함한다. VH 또는 VL의 생물학적 동등물은 지정된 아미노산을 포함하지만 전체 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열이다. 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 생물학적 동등물은 SEQ ID NO: 18과 전체 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖지만 CDR (SEQ ID NO: 1-6 또는 그들 변이체)을 보유하는 VH일 수 있다. 일 구현예에서, VH는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 갖고 VL은 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, VH는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖고 VL은 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 갖는다.
또한 본 명세서에 개시된 항체는 변형되어서 그들이 유래된 천연 발생 결합 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다를 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 지정된 단백질로부터 유래되는 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 유사할 수 있고, 예를 들어, 출발 서열과 일정 백분율의 동일성을 갖고, 예를 들어, 출발 서열과 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다.
일정 구현예에서, 항체는 항체와 정상적으로 회합되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시적인 변형은 하기에 보다 상세히 기술된다. 예를 들어, 본 개시의 항체는 가요성 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티 (예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 표지)를 첨가하여 변형될 수 있다.
본 개시의 항체, 이의 변이체, 또는 유도체는 즉, 공유 부착이 항체가 에피토프에 결합하는 것을 방해하지 않도록 항체에 임의 유형의 분자의 공유 부착을 통해 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 제한없이, 항체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 인산화, 아미드화, 기지 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해적 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 연결 등에 의해 변형될 수 있다. 제한없이, 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 물질대사 합성 등을 포함한, 기지 기술을 통해서 임의의 수많은 화학적 변형이 수행될 수 있다. 추가로, 항체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 치료제, 프로드러그, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약학제, 또는 PEG에 접합될 수 있다.
항체는 검출가능 표지 예컨대 방사능 표지, 면역조절제, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오티드, 광활성 치료제 또는 진단제, 약물 또는 독소일 수 있는 세포독성제, 초음파 증강제, 비방사성 표지, 이의 조합, 및 당분야에 공지된 다른 이러한 작용제를 포함할 수 있는, 치료제에 접합될 수 있거나 또는 융합될 수 있다.
항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 항체의 제조 방법
본 개시는 또한 본 개시의 항체, 이의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드 분자 또는 별도 폴리뉴클레오티드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩티드의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 이의 변이체 또는 유도체를 코딩할 수 있다. 추가로, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드 분자 또는 별도 폴리뉴클레오티드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩티드의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부, 이의 변이체 또는 유도체를 코딩할 수 있다.
항체를 제조하는 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있고 본 명세서에 기술되어 있다. 일정 구현에에서, 본 개시의 항원-결합 폴리펩티드의 가변 및 불변 영역 둘 모두는 완전히 인간이다. 완전 인간 항체는 당분야에 기술되고 본 명세서에 기술된 기술을 사용해 제조될 수 있다. 예를 들어, 특이적 항원에 대한 완전 인간 항체는 그의 내생성 유전자좌는 불능이지만, 항원성 챌린지에 대응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형된 유전자이식 동물에게 항원을 투여해 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 기술은 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제6,150,584호; 제6,458,592호; 제6,420,140호에 기술되어 있다.
일정 구현예에서, 제조된 항체는 치료하려는 동물, 예를 들어, 인간에서 유해한 면역 반응을 유발하지 않을 것이다. 일 구현예에서, 본 개시의 항원-결합 폴리펩티드, 이의 변이체, 또는 유도체는 당분야에서 인식하는 기술을 사용해 그들 면역원성을 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 항체는 인간화, 영장류화, 탈면역화될 수 있거나, 또는 키메라 항체를 만들 수 있다. 이들 유형의 항체는 부모 항체의 항원-결합 성질을 보유하거나 또는 실질적으로 보유하지만, 인간에서 덜 면역원성인, 비-인간 항체, 전형적으로 쥣과동물 또는 영장류 항체로부터 유래된다. 이것은 (a) 키메라 항체를 생성하도록 인간 불변 영역 상에 전체 비-인간 가변 도메인의 이식; (b) 핵심 프레임워크 잔기를 보유하거나 또는 보유하지 않는 인간 프레임워크 및 불변 영역에 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 중 하나 이상의 적어도 일부분의 이식; 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 부분으로 그들의 "은폐" 를 포함한, 다양한 방법을 통해서 달성될 수 있다. 이러한 방법은 하기 문헌들에 개시되어 있고, 이들 모두는 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 및 제6,190,370호.
탈-면역화는 또한 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "탈-면역화"는 T-세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변경을 포함한다 (참조, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호: WO/9852976 A1 및 WO/0034317 A2). 예를 들어, 출발 항체로부터 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 분석하고 서열 내 상보성-결정 영역 (CDR)과 관련된 에피토프의 위치 및 다른 핵심 잔기를 보여주는 각각의 V 영역으로부터 인간 T-세포 에피토프 "맵"을 생성시킨다. T-세포 에피토프 맵으로부터의 개별 T-세포 에피토프는 최종 항체의 활성이 변경될 위험성이 낮은 대안 아미노산 치환을 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함한, 다양한 대안 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 디자인되고 이들 서열은 이후에 다양한 결합 폴리펩티드에 도입된다. 전형적으로, 12 내지 24개 변이체 항체가 생성되고, 결합 및/또는 기능에 대해 시험된다. 변형된 가변 및 인간 불변 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현 벡터에 클로닝하고 이후 전체 항체의 생산을 위한 세포주로 플라스미드를 도입시킨다. 다음으로 항체를 적절한 생화학적 및 생물학적 어세이에서 비교하고, 최적 변이체를 확인한다.
본 개시의 항원-결합 폴리펩티드의 결합 특이성은 시험관내 어세이 예컨대 면역침전법, 방사면역어세이 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA)를 통해서 결정될 수 있다.
대안적으로, 단쇄 단위의 생산을 위해 기술된 기술 (미국 특허 제4,694,778호; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879- 5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989))은 본 개시의 단쇄 단위를 생산하도록 적합화될 수 있다. 단쇄 단위는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결하여 형성되어서, 단쇄 융합 펩티드를 생성시킨다. 이. 콜라이에서 기능성 Fv 단편의 조립을 위한 기술을 또한 사용할 수 있다 (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).
단쇄 Fv (scFv) 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 하기 문헌들에 기술된 것들을 포함한다: 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). 인간에서 항체의 생체내 사용 및 시험관내 검출 어세이를 포함한, 일부 용도 경우에, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래되는 분자, 예컨대 쥣과동물 단일클론 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조하고, 이들은 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다: Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816397호.
인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 바람직한 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터 유래된 항체 분자이다. 종종, 인간 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원-결합을 변경, 바람직하게 개선시키기 위해서 CDR 도너 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 예를 들어, 항원-결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 흔치 않은 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교를 통하여, 당분야에 충분히 공지된 방법으로 확인된다 (예를 들어, 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, Queen et al., 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) 참조). 항체는 예를 들어, CDR-이식(EP 239,400; PCT 공개 번호 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니어링 또는 재표면화 (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. USA 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링 (전문이 참조로 편입되는, 미국 특허 제5,565,332호)을 포함한, 당분야에 공지된 다양한 기술을 사용해 인간화될 수 있다.
완전한 인간 항체는 인간 환자의 치료적 처치에서 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이 방법을 포함하는, 당분야에 공지된 다양한 방법으로 만들 수 있다. 또한, 각각 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, 하기 문헌들을 참조한다: 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공개 번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741.
인간 항체는 또한 기능적 내생성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 유전자이식 마우스를 사용해 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위적으로 또는 상동성 재조합을 통해서 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역은 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에도 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합을 통해서 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 동시에 비-기능성이 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형 결실이 내생성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포를 확장시키고 배반포에 미세주입하여 키메라 마우스를 생성시킨다. 이후 키메라 마우스는 교배되어서 인간 항체를 발현하는 동형 자손을 생산한다. 유전자이식 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 바람직한 표적 폴리펩티드의 전부 또는 일부에 의해 보통의 방식으로 면역화된다. 항원에 대해 유도된 단일클론 항체는 통상의 하이브리도마 기술을 사용해 면역화된, 유전자이식 마우스로부터 수득될 수 있다. 유전자이식 마우스에 의해 보유된 인간 면역글로불린 이식유전자는 B-세포 분화 동안 재배열되고, 이후 종류 변환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체 생산을 위한 이러한 기술의 고찰을 위해서, [Lonberg and Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995)]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 이러한 기술 및 이러한 항체 생산을 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해, 예를 들어, 하기 문헌들을 참조하고, 이들은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다: PCT 공개 번호 WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 및 제5,939,598호. 또한, Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) 및 GenPharm (San Jose, Calif.) 같은 회사들은 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용해 선택된 항원에 대해 유도된 인간 항체를 제공하도록 계약할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 또한 "유도 선택"이라고 하는 기술을 사용해 생성될 수 있다. 이러한 접근법에서 선택된 비-인간 단일클론 항체, 예를 들어 마우스 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하는데 사용된다 (Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). 또한, 미국 특허 제5,565,332호를 참조하고, 이의 전문이 참조로 본 명세서에 편입됨).
다른 구현예에서, 바람직한 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들어, 쥣과동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용)를 사용해 쉽게 단리될 수 있고 시퀀싱될 수 있다. 단리되어 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 단리되면, DNA를 발현 벡터에 위치시키고, 이것은 이후 달리 면역글로불린을 생산하지 않는, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 보다 특히, 단리된 DNA (본 명세서에 기술된 바와 같이 합성될 수 있음)를 사용하여 참조로 본 명세서에 편입되는, 1995년 1월 25일 출원된 Newman 등의 미국 특허 제5,658,570호에 기술된 바와 같이 항체의 제조를 위해 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝할 수 있다. 본질적으로, 이것은 선택된 세포로부터 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 이러한 목적에 적합한 프라이머는 또한 미국 특허 제5,658,570호에 기술되어 있다. 이하에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 바람직한 항체를 발현하는 형질전환된 세포는 비교적 큰 분량으로 성장시켜서 면역글로불린의 임상적 및 상업적 공급물을 제공할 수 있다.
추가로, 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여, 본 개시의 항원-결합 폴리펩티드의 하나 이상의 CDR을 프레임워크 영역, 예를 들어 인간 프레임워크 영역 내에 삽입시켜서 비-인간 항체를 인간화시킬 수 있다. 프레임워크 영역은 천연 발생 또는 공통 프레임워크 영역일 수 있고, 바람직하게 인간 프레임워크 영역이다 (예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 목록에 대해 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998)]을 참조함). 바람직하게, 프레임워크 영역 및 CDR의 조합으로 생성된 폴리뉴클레오티드는 바람직한 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프, 예를 들어 LIGHT에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 바람직하게, 하나 이상의 아미노산 치환이 프레임워크 영역 내에 만들어질 수 있고, 바람직하게, 아미노산 치환은 이의 항원에 대한 항체의 결합을 개선시킨다. 추가로, 이러한 방법은 하나 이상의 사슬내 디술피드 결합이 결여된 항체 분자를 생성하기 위해서 사슬내 디술피드 결합에 관여되는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 만드는데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 변경이 본 개시에 포괄되고 당분야의 기술 내이다.
또한, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께, 적절한 항원 특이성의, 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱하여 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))이 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 쥣과동물 단일클론 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것이다.
재조합 항체를 생성시키기 위한 또 다른 고도로 효율적인 수단이 [Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992)]에 개시되어 있다. 특히, 이러한 기술은 원숭이 가변 도메인 및 인간 불변 서열을 함유하는 영장류화된 항체를 생성시킨다. 이러한 참조는 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다. 더욱이, 이러한 기술은 또한 일반 양도된 미국 특허 제5,658,570호, 제5,693,780호 및 제5,756,096호에 기술되고, 이들 각각은 참조로 본 명세서에 편입된다.
대안적으로, 당업자에게 충분히 공지된 기술을 사용하여 항체-생산 세포주를 선택하고 배양할 수 있다. 이러한 기술은 다양한 실험실 매뉴얼 및 주요 공개물에 기술되어 있다. 이와 관련하여, 하기 기술된 바와 같이 본 개시에서 사용에 적합한 기술은 보충판을 포함하여, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, [Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)]에 기술되어 있다.
추가로, 제한없이, 아미노산 치환을 일으키는, 부위-지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법을 포함한, 당업자에게 공지된 표준 기술이 본 개시의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 변이체 (유도체 포함)는 기준 가변 중쇄 영역, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 가변 경쇄 영역, CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3에 대해서, 50 미만의 아미노산 치환, 40 미만의 아미노산 치환, 30 미만의 아미노산 치환, 25 미만의 아미노산 치환, 20 미만의 아미노산 치환, 15 미만의 아미노산 치환, 10 미만의 아미노산 치환, 5 미만의 아미노산 치환, 4 미만의 아미노산 치환, 3 미만의 아미노산 치환, 또는 2 미만의 아미노산 치환을 코딩한다. 대안적으로, 돌연변이는 예컨대 포화 돌연변이유발법에 의해서, 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라서 무작위적으로 도입될 수 있고, 최종 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
암 치료
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 개시의 항체, 변이체 또는 유도체는 일정 치료 및 진단 방법에서 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 본 명세서에 기술된 하나 이상의 장애 또는 병태를 치료하기 위해, 환자, 예컨대 인간 환자에게 본 개시의 항체 또는 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 항체-기반 요법에 관한 것이다. 본 개시의 치료적 생성물은 본 개시의 항체 (본 명세서에 기술된 바와 같은 이의 변이체 및 유도체 포함) 및 본 개시의 항체를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 (본 명세서에 기술된 바와 같은 이의 변이체 및 유도체 포함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 항체 및 단편은 암을 치료하거나 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 케모카인 수용체 CXCR2 및 이의 리간드는 종양 및 다양한 염증성 질환의 진행에 연루된다. CXCL/CXCR2 축의 활성화는 PI3K, p38/ERK, 및 JAK 경로를 포함한, 다수의 신호전달 경로를 활성화시키고, 세포 생존 및 이동을 조절한다. CXCL/CXCR2 축은 종양 미세환경에서 그리고 염증 부위로 호중구 동원에서 필수 역할을 한다. 만성 염증 동안 호중구의 광대한 침윤은 다양한 염증성 질환에서 가장 중요한 병원성 인자 중 하나이다.
본 개시의 항체 또는 단편으로 적합하게 치료할 수 있는 종양은 방광암, 비소세포 폐암, 신장암, 유방암, 요도암, 직직장암, 두경부암, 편평 세포 암, 메르켈 세포 암종, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 및 소세포 폐암을 포함한다. 따라서, 본 개시의 항체는 임의의 하나 이상의 이러한 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법이 또한 본 개시에서 제공된다. 본 개시의 항-CXCR2 항체와 접촉되는 (또는 대안적으로 본 개시의 항-CXCR2 항체를 발현하도록 조작된), 적합한 세포가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 또는 조작 시에, 세포는 이후 치료를 필요로 하는 암 환자에게 도입될 수 있다. 암 환자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의 유형의 암을 가질 수 있다. 세포 (예를 들어, T 세포)는 예를 들어, 제한없이, 종양-침윤성 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 암 환자 자신으로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 도너에 의해서 또는 세포 은행으로부터 제공되었다. 세포가 암 환자로부터 단리되는 경우에, 바람직하지 않은 면역 반응을 최소화시킬 수 있다.
본 개시의 항체 또는 이의 변이체, 또는 유도체로 치료, 예방, 진단, 및/또는 예측할 수 있는, 증가된 세포 생존과 연관된 추가 질환 또는 병태는 제한없이, 악성종의 진행 및/또는 전이 및 관련 장애 예컨대 백혈병 (급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병 (골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병 포함) 포함) 및 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병)), 진성 다혈구증, 림프종 (예를 들어, 호지킨 질환 및 비호지킨 질환), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄 질환, 및 제한없이, 육종 및 암종 예컨대 섬유육중, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 대장 암종, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 자궁내막암, 흑색종, 전립선암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 빌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 속귀신경집종, 핍지신경교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아세포종을 포함한 고형 종양을 포함한다.
염증성 질환의 치료
실험예에서 입증하는 바와 같이, 본 개시의 항체는 면역 반응을 변화시킬 수 있어서, 염증성 질환 및 병태, 자가면역 질환, 및 감염을 치료하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 항체, 단편, 및 조성물에 의해 치료되는 염증성 질환 또는 병태는 알츠하이머병, 애디슨병, 아테롬성 동맥경화증, 강직성 척추염, 관절염, 골관절염 (OA), 류마티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염 (PA), 강직성 척추염, 천식, 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐색성 폐 질환 (COPD), 크론병, 대장염, 피부염, 게실염, 섬유근육통, 간염, 과민성 장 증후군 (IBS), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 신장염, 파킨슨병 (PD), 혈관염, 및 궤양성 대장염 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 개시된 항체, 단편, 및 조성물로 치료하려는 자가면역 질환 또는 병태는 원형 탈모증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 피부근염, 당뇨병 (1형), 셀리악병, 자가면역 소아 특발성 관절염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 특발성 혈소판감소성 자반증, 중증 근무력증, 자가면역 심근염, 다발성 경화증, 천포창/유사 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발성근염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 류마티스성 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇠그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 자가면역 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 포도막염, 백반증, 및 다발혈관염 수반 육아종증 (베게너병) 중 하나 이상을 포함한다.
류마티스성 관절염 (RA)은 주로 관절에 발병되는 장기간 자가면역 장애이다. 전형적으로 뜨겁고, 팽창된, 통증성 관절을 야기한다. 통증 및 뻣뻣함은 종종 휴식 이후에 악화된다. 가장 일반적으로, 손목과 손이 관여되며, 전형적으로 신체의 양쪽 측면 상에서 동일한 관절이 관여된다. 질환은 또한 신체의 다른 부분에서 발병될 수 있다. 류마티스성 관절염의 원인이 불분명하지만, 유전적 및 환경적 인자의 조합이 관여된다고 여겨진다. 근본적인 기전은 관절을 공격하는 신체 면역계가 관여된다. 이러한 결과로 관절낭의 비대화 및 염증이 야기된다. 치료의 목적은 통증을 감소시키고, 염증을 감소시키며, 개인의 전체적 기능을 개선시키는 것이다. 통증 약물, 스테로이드, 및 NSAID가 증상에 도움을 주기 위해 빈번하게 사용된다. 질환-변형 항류마티스 약물 (DMARD)이라 불리는 약물군, 예컨대 히드록시클로로퀸 및 메토트렉세이트는 질환의 진행을 둔화시키려는 시도로 사용될 수 있다.
골관절염 (OA)은 관절 연골 및 밑에 있는 뼈의 파괴로 인한 관절 질환의 한 유형이다. 가장 일반적인 증상은 관절 통증 및 뻣뻣함이다. 초기에, 증상은 단지 운동 이후에만 일어날 수 있지만, 시간 경과에 따라 일정해진다. 다른 증상은 관절 부종, 운동 범위의 감소, 및 등에 발병되면 팔 및 다리의 쇠약 또는 마비를 포함할 수 있다. 원인은 이전의 관절 손상, 비정상적인 관절 또는 사지 발달, 및 유전 인자를 포함한다. 과체중 경우, 한쪽 다리길이가 상이한 경우, 및 높은 수준의 관절 스트레스를 유발하는 직업을 갖는 경우에 위험성이 더 크다. 골관절염은 저등급 염증성 과정 및 관절에 대한 기계적 스트레스로 인해 초래되는 것으로 여겨진다. 치료는 운동, 관절 스트레스를 줄이려는 노력, 지원 그룹, 및 통증 약물을 포함한다.
다발성 경화증 (MS)은 뇌 및 척수의 신경 세포의 절연 덮개부가 손상된 탈수초성 질환이다. 이러한 손상은 소통하는 신경계 일부의 능력을 파괴하여, 그 결과로 육체적, 정신적, 및 때때로 정신의학적 문제를 포함한, 광범위 징후 및 증상을 야기한다. 특별한 증상은 복시, 한쪽 눈 실명, 근육 쇠약, 감각 장애, 또는 조정 장애를 포함할 수 있다. 원인이 불분명하지만, 근본적인 기전은 면역계에 의한 파괴 또는 미엘린-생산 세포의 실패로 여겨진다. 다발성 경화증에 대해 알려진 치료는 없다. 치료는 공격 이후 기능을 개선시키고 새로운 공격을 예방하고자 한다.
천식을 폐 기도의 일반적인 장기간 염증성 질환이다. 가변적 재발성 증상, 가역적 기류 폐쇄, 및 기관지 경련을 특징으로 한다. 증상은 천명, 기침, 가슴 조임, 및 숨가쁨의 증상 발현을 포함한다. 천식은 유전적 및 환경적 인자의 조합에 의해 초래되는 것으로 여겨진다. 환경적 인자는 공기 오염 및 알레르겐에 노출을 포함한다. 천식은 증상의 빈도, 1초 최대 호기량 (FEV1), 및 최고 호기 유속에 따라 분류된다. 이것은 또한 아토피성 또는 비아토피성으로 분류될 수 있고, 아토피는 1형 과민성 반응이 발생될 소인을 의미한다. 천식 치료제는 없다. 증상은 알레르겐 및 자극제같은, 촉발제를 피하고, 흡입 코르티코스테로이드의 사용으로 예방될 수 있다. 천식 증상이 제어되지 않으면 흡입 코르티코스테로이드 이외에도 지속성 베타 효현제 (LABA) 또는 항류코트리엔제가 사용될 수 있다. 빠르게 악화되는 증상의 치료제는 일반적으로 흡입 속효성 베타-2 효현제 예컨대 살부타몰 및 경구 복용 코르티코스테로이드이다. 매우 중증 사례 경우에, 정맥내 코르티코스테로이드, 마그네슘 술페이트, 및 입원이 필요할 수 있다.
만성 폐색성 폐 질환 (COPD)는 장기간의 빈약한 기류를 특징으로 하는 폐색성 폐 질환의 한 유형이다. COPD는 2개의 주요 병태, 기종 및 만성 기관지염을 포함할 수 있다. 기종에서, 많은 공기 주머니 사이의 벽이 손상된다. 그 결과로, 공기 주머니는 그들 형태를 상실하여 늘어지게 된다. 이러한 손상은 또한 공기 주머니의 벽을 파괴하여, 많은 작은 주머니 대신에 소수의 더 큰 공기 주머니를 초래한다. 이것이 일어나면, 폐에서의 가스 교환량이 감소된다. 만성 기관지염에서, 기도 내막이 지속적으로 자극받아서 염증이 일어나고, 이것이 내막의 팽창을 초래한다. 많은 두꺼운 점액이 기도에 형성되어서, 숨쉬기 어렵게 만든다. COPD에 대해 알려진 치료는 없지만, 증상은 치료가능하고 이의 진행을 지연시킬 수 있다.
투여
항체, 변이체의 투여 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항원-결합 폴리펩티드 또는 조성물은 임의의 편리한 경로를 통해서, 예를 들어 주입 또는 볼러스 주사를 통해서, 상피 또는 점액피부 내막 (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 따라서 본 개시의 항원-결합 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물은 경구, 직장, 비경구, 수조내, 질내, 복강내, 국부 (분말, 연고, 점적액 또는 경피 팻치로서), 구강, 또는 경구 또는 코 스프레이로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함한 투여 방식을 의미한다.
투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 또한, 뇌실내 및 척수강내 주사를 포함한, 임의의 적합한 경로를 통해서 중추 신경계로 본 개시의 항체를 도입시키는 것이 바람직할 수 있고; 뇌실내 주사는 예를 들어, 리저버, 예컨대 오마야 리저버에 부착된, 뇌실내 카테터를 통해서 용이해질 수 있다. 폐 투여는 또한 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용, 및 에어로졸화제와의 제제화에 의해 적용될 수 있다.
본 개시의 항체 폴리펩티드 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이것은 예를 들어, 제한없이, 수술 동안 국소 주입에 의해서, 예를 들어, 수술 후 상처 드레싱과 함께, 국소 도포에 의해서, 주사에 의해서, 카테터를 통해서, 좌제를 통해서, 또는 임플란트를 통해서 달성될 수 있고, 상기 임플란트는 막, 예컨대 시알라스틱 막, 또는 섬유를 포함하는, 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 재료이다. 바람직하게, 본 개시의 항체를 포함한, 단백질이 투여될 때, 단백질이 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의해야만 한다.
다른 구현예에서, 항체 또는 조성물은 비히클, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (참조: Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; see generally ibid.)
일반적인 제안으로서, 본 개시의 항원-결합 폴리펩티드의 환자에게 투여되는 용량은 전형적으로 환자 체중 기준으로 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 환자 체중 기준으로 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 또는 환자 체중 기준으로 1 mg/kg 내지 10 mg/kg 이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종 유래 항체에 비해서 인간 신체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 더 낮은 용량의 인간 항체 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 또한, 본 개시의 항체의 투여 빈도 및 용량은 변형 예컨대, 예를 들어, 지질화를 통해 항체의 흡수 및 조직 침투 (예를 들어, 뇌)를 증강시켜 감소시킬 수 있다.
본 개시의 항체, 이의 변이체, 또는 유도체의 투여 단계를 포함하는, 감염성 또는 악성 질환, 병태, 또는 장애를 치료하기 위한 방법은 전형적으로 시험관내에서 시험되고 나서, 인간에서 사용하기 전에 바람직한 치료적 또는 예방적 활성에 대해, 허용가능한 동물 모델에서 생체내 시험된다. 유전자이식 동물을 포함한, 적합한 동물 모델은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 항원-결합 폴리펩티드의 치료적 유용성을 입증하기 위한 시험관내 어세이는 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩티드의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩티드의 효과는 당업자에게 공지된 기술, 예컨대 본 명세서의 다른 곳에 개시된 어세이를 이용해 결정될 수 있다. 본 개시에 따라서, 특이적 항원-결합 폴리펩티드의 투여가 지시되는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 어세이는 환자 조직 샘플을 배양 성장시키고, 화합물에 노출시키거나 또는 아니면 투여하고, 조직 샘플에 대한 이러한 화합물의 효과를 관찰하는 시험관내 세포 배양 어세이를 포함한다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 본 개시의 항체 또는 본 개시의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 리포솜 내 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 엔도시토시스 (참조: 예를 들어, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), 레트로바이러스 또는 다른 벡터 등의 일부로서 핵산의 구축이다.
진단 방법
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 진단 및 예후 목적에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플에서 CXCR2의 발현을 검출하는 방법이 제공되고, 방법은 항체 또는 이의 단편이 CXCR2에 결합되는 조건 하에서 본 개시의 항체 또는 이의 단편과 샘플을 접촉시키는 단계, 및 샘플 중 CXCR2의 발현을 지시하는 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
바람직하게 세포를 포함하는 샘플은 암 환자일 수 있거나 또는 진단을 원하는 환자일 수 있는, 환자로부터 수득될 수 있다. 세포는 환자로부터의 종양 조직 또는 종양 블록, 혈액 샘플, 소변 샘플 또는 임의 샘플의 세포이다. 샘플의 임의적 전처리 시에, 샘플은 샘플 중에 잠재적으로 존재하는 CXCR2 단백질과 항체가 상호작용하도록 허용하는 조건 하에서 본 개시의 항체와 인큐베이션될 수 있다. ELISA 같은 방법이 사용될 수 있고, 항-CXCR2 항체를 사용해 샘플 중 CXCR2 단백질의 존재를 검출한다.
샘플 중 CXCR2 단백질의 존재 (임의로 양 또는 농도로의) 는 환자가 항체를 사용한 치료에 적합하다는 지시로서, 또는 환자가 암 치료에 반응하였다 (또는 반응하지 않았다)는 지시로서, 암의 진단을 위해 사용될 수 있다. 예후 방법 경우에, 검출은 치료의 진행을 지시하도록 암 치료의 개시 시에, 일정 단계에서, 1회, 2회 이상 수행될 수 있다.
조성물
본 개시는 또한 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 항체의 유효량, 및 허용가능한 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 제2 항암제 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관이 승인하였거나 또는 미국 약전 또는 동물, 보다 특히 인간에서 사용을 위해 일반적으로 인식되는 다른 약전에 열거된 것을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용가능한 담체"는 일반적으로 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화재 또는 임의 유형의 제제 보조제일 것이다.
용어 "담체"는 치료제와 투여되는 희석제, 보강제, 부형제, 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학 담체는 멸균된 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함한 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 참깨유 등일 수 있다. 약학 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체는 물이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용 용액을 위한 액상 담체로서 적용될 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 포도당, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 바람직하다면 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 바이술파이트; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 및 등장성 조절제 예컨대 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스가 또한 고려된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체 예컨대 트리글리세리드와 좌제로서 제제화될 수 있다. 경구 투여는 표준 담체 예컨대 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 참조로 본 명세서에 편입되는 [Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 바람직하게 정제된 형태의 항원-결합 폴리펩티드의 치료적 유효량을, 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 적합한 양의 담체와 함께 함유하게 될 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰풀, 1회용 시린지 또는 다수 용량 바이알에 동봉된다.
일 구현예에서, 조성물은 인간에게 정맥내 투여에 적합한 약학 조성물로서 통상의 절차에 따라서 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중 용액이다. 필요하면, 조성물은 또한 주사 부위의 통증을 완화하도록 가용화제 및 국소 마취제 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 예를 들어, 기밀 밀봉 용기 예컨대 활성제의 분량이 표시된 앰풀 또는 샤세트 중 건조 동결 분말 또는 무수 농축물로서, 단위 제형에 함께 혼합되거나 또는 별도로 공급된다. 조성물이 주입으로 투여되는 경우에, 멸균 약학 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우에, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀은 성분이 투여 전에 혼합될 수 있게 제공될 수 있다.
본 개시의 화합물은 중성 또는 염 형태로서 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 음이온 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등에서 유래된 것들과 형성된 것, 및 양이온 예컨대 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 철 히드록시드, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 형성된 것을 포함한다.
실시예
실시예 1: 실험 절차
세포 배양
HEK293F 세포 (#R79007; Thermo Fisher Scientific)는 FreeStyle 293 발현 배지 (#12338-026; Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다. U2OS 세포주 (ATCC-HTB96; cell bank of Chinese Academy of Science, Shanghai)는 10% (vol/vol) FBS를 함유하는 McCoy's 5A 배지 (#16600-082, Gibco)에서 유지시켰다. Tango™ CXCR2-bla U2OS 세포주 (#K1807; Thermo Fisher Scientific)는 제조사의 설명서에 따라서 McCoy's 5A 배지를 기반으로 하는 성장 배지에서 유지시켰다. CHO-K1 세포는 10% (v/v) FBS를 함유하는 F12K 배지 (#21127022; Thermo Fisher Scientific)에서 배양시켰다.
조합 항체 라이브러리 패닝
이의 N-말단에 바이오틴이 표지된 인간 CXCR2의 N-말단 세포외 도메인과 동일한 48 아미노산의 펩티드 (MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINK; SEQ ID NO:15) (pepN48)를 파지 패닝을 위한 항원으로서 합성하였다 (Chinese Peptide). 패닝 철자는 이전에 기술된 바와 같은 수정된 프로토콜에 따랐다. 간략하게, ∼1011 다양성을 갖는 조합 scFv 항체 라이브러리를 나타내는 파지 입자를 항원 pepN48과 인큐베이션시켰다. 다음으로 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드 (#21925; Pierce)를 용액에 첨가하여 파지-결합된 바이오틴화 항원을 풀 다운하였다. 결합된 파지는 미결합된 파지를 세척해 버린 후 글리신-HCl (pH 2.0)로 용출시키고 XL-1 blue 세포 (#200228; Agilent)의 감염에 사용하였다. 감염된 세포는 헬퍼 파지 VCSM13 (#200251; Agilent)의 도움으로 다음 라운드의 패닝을 위해 파지 입자를 생성시키는데 사용되었다. 3라운드의 농축 이후에, 콜로니를 떼어내서 파지 ELISA로 시험하였고, 이후 모든 양성 클론을 시퀀싱하였다. 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템 (IMGT)을 이들 콜로니의 서열의 contig 분석에 사용하였다. 9종의 별개 scFv 서열이 고도로 농축되었다.
ELISA
아비딘 (#21121; Pierce)을 카보네이트-바이카보네이트 완충액 (#C3041; Sigma) 중에 2 ng/㎕의 최종 농도로 희석하였다. 96-웰 ELISA 플레이트 (Corning Costar)는 4℃에서 밤새 아비딘 용액 (25 ㎕/웰)으로 코팅하였다. 웰은 150 ㎕/웰 PBST 완충액 (PBS 중 0.05% TWEEN20)으로 1회 세척하였다. PBS에 용해된 50 ng의 항원 (2 ng/㎕)을 각 웰에 첨가하였고 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 웰을 3회 PBST로 세척하였고 M-PBST (PBST 중 3% 우유, 150 ㎕/웰)로 37℃에서 5분 동안 차단시켰다. M-PBST 완충액의 제거 후에, 25 ㎕의 항체 용액 (적절한 농도로 M-PBST 완충액에 희석)을 각 웰에 첨가하였고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고 나서, PBST로 5회 반복 세척하였다. 항-M13 HRP-접합된 2차 항체 (1:3,000 희석; #27-9421-01, GE) 또는 항-인간 Fc HRP-접합 2차 항체 (1:3,000 희석; #A0170, Sigma)를 웰에 첨가하였고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 다음으로, 웰을 5회 PBST로 세척하고 나서, 50 ㎕/웰 ABTS 용액 (#11684302001; Roche)과 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 흡광도는 405 nm에서 플레이트 판독기 (EnSpire; PerkinElmer) 상에서 측정하였다.
항체의 발현 및 정제
후보 scFv 항체를 코딩하는 DNA 서열은 인간 IgG1의 전체 Fc 도메인과 scFv-Fc 단백질의 발현을 위해 pFuse 발현 벡터 (#pfuse-hg1fc2; InvivoGen)에 클로닝하였다. 전체 길이 IgG1 형태를 갖는 항체의 경우에, scFv 서열로부터의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 (VH & VL)을 각각 중쇄 및 경쇄의 전체 불변 도메인 (CH & CL)을 갖는 플라스미드에 클로닝하였다. 항체는 HEK293K 세포로 scFv-Fc 발현 플라스미드의 형질감염, 또는 전체 길이 항체를 위해 등몰량의 중쇄 및 경쇄 플라스미드의 공-형질감염을 통해서 발현시킨 다음에 5일 동안 세포 배양하였다. 배지 중 항체는 AKTAxpress 정제제 (GE Healthcare)에 의해 HiTrap 단백질 A HP 컬럼 (#17-0403-03; GE Healthcare)을 사용해 정제되었다. 정제된 항체를 농축하였고 PBS 완충액 (pH7.4) 중에 -80℃에서 저장하였다.
크기-배제-컬럼 HPLC (SEC-HPLC)
SEC-HPLC 실험을 수행하여 정제된 재조합 항체의 열-안정성 및 균질성을 결정하였다. 간략하게, 항체 용액을 먼저 20 mg/mL로 농축하였고, 42℃에서 5일 동안 인큐베이션시켰다. 최종 항체 용액을 HPLC를 통해서 SEC 컬럼 (Nanofilm SEC-250) 상에서 Tris (pH 8.1) 중 0.05% DDM/0.01% CHS의 러닝 완충액을 사용해 분석하였다. 응집물 및 분해물은 단백질 균질성 결과를 통해 평가하였다.
유세포측정
세포는 표적 막 단백질을 함유하는 발현 플라스미드로 형질감염되었다. 24시간 후에, 세포를 디쉬로부터 탈착시키고 FACS 완충액 (PBS 중 0.5% BSA, 2 mM EDTA 존재)에 재현탁시켰다. 튜브 당 500,000 세포를 FACS 완충액 중 2 ㎍/mL의 상응하는 항체와 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 최종 세포는 2회 FACS 완충액으로 세척하였고, 그 다음에 2 ㎍/mL 2차 항체, Alexa FluorTM 488 염소 항-인간 IgG (H+L) (#A11013; Life Technologies)와 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. FACS 완충액으로 2회 세척 후에, 세포를 PBS에 재현탁하였고 CytoFLEX S (Beckman Coulter)로 분석하였다.
면역형광 어세이
세포를 폴리-D-리신-코팅된 유리 바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (PerkinElmer)에 플레이팅하고 배양하였다. 표적 막 단백질을 발현하는 플라스미드를 Lipofectamine 3000을 사용해 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 실온에서 고정시킨 다음에, 각각 5분간, PBS로 3회 세척하였다. 다음으로 세포를 1% BSA (PBS에 용해)로 30분 동안 37℃에서 차단하였다. 차단 이후에, 세포를 상응하는 항체 (1% BSA/PBS, 2 ㎍/mL에 희석)와 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 2 ㎍/mL 2차 항체, Alexa FluorTM 488 염소 항-인간 IgG (H+L) (#A11013; Life Technologies)를 1% BSA PBS 완충액 중 세포와 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. DAPI (#10236276001; Roche)는 핵 염색을 위해 첨가되었다. PBS로 3회 세척 후, 염색된 세포를 공초점 현미경 (ZEISS LSM710) 상에서 면역형광 분석을 위해 PBS에 유지시켰다.
표현-플라스몬-공명 (SPR)
바이오틴화된 항원 (정제된 단백질 또는 펩티드)을 SA 바이오센서 칩 (GE healthcare)의 스트렙타비딘 코팅된 표면 상에 로딩하여 단일 분자 층을 형성시켰다. 항체와 항원 간 상호작용은 Biacore T200 시스템 (GE Healthcare)으로 수행하였다. 간략하게, 시험 항체는 0.5, 1, 2, 5, 10 nM의 상이한 농도까지 러닝 완충액, HBS-EP+ 완충액 (GE Healthcare)에 연속 희석하였고, 항원과 항체 간 분자 상호작용의 검출을 위해 칩의 표면 상에 흘려주었다. 결합/해리의 운동학을 측정하였고 적절한 단백질-단백질 상호작용 모델에 적합화시켜서 상응하는 결합 상수 (KD)를 계산하였다.
효모 디스플레이를 사용한 친화성 성숙화
선택된 항체 (abN48-IgG1)의 중쇄 및 경쇄의 DNA 서열을 효모 표면 디스플레이 벡터 pYD-HA에 클로닝하였다. 무작위 돌연변이된 H-CDR3 영역을 함유하는 플라스미드를 사용하여서 중복 PCR로 CDR3-다양화 중쇄를 생성시켰다. CDR3-다양화 중쇄 단편 및 선형화된 골격 플라스미드를 전기천공을 통해서 EBY100 효모 세포에 형질감염시켜 효모 세포의 내재 상동성 재조합 전략을 사용한 효모-기반 Fab 돌연변이유발 라이브러리의 구축을 완료하였다.
돌연변이유발 라이브러리로 형질전환된 EBY100 효모 세포를 SD/Trp- 배지 (#630308; Clontech) 중에서 OD600 = 1 까지 성장시키고 나서 SG/R-CAA 배지에 20℃에서 18-24시간 동안 진탕하면서 유도시켰다. 세포를 FACS 완충액 (PBS 중 0.5% BSA, 2 mM EDTA 존재)으로 세척하고 나서, pepN48 및 항-c-myc 닭 IgY 분획 (#A21281; Life Technologies)을 세포 현탁액 (1:500 희석)에 첨가하였고 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 세포를 3회 FACS 완충액으로 세척하고 나서, R-파이코에리쓰린 접합된 스트렙타비딘 (#21627, Thermo Fisher Scientic) 및 FITC 접합된 염소 항-닭 2차 항체 (#PA1-28794; Invitrogen)를 세포 현탁액 (1:500 희석)에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 세포는 3회 FACS 완충액으로 세척 후에 유세포측정기 (CytoFLEX S; Beckman Coulter)로 분석하였다. 라이브러리 스크리닝을 위해서, 각 라운드의 형광-표지된 효모 세포는 wBD FACSAria III 유세포측정기 (FACSAria III; BD)로 분류하였다. pepN48의 농도는 1 nM에서 0.25 nM로 각 선택 라운드에서 점진적으로 감소되었다.
Tango 어세이
Tango 어세이에서, hCXCR2는 외생성 전사 인자에 융합되었고, 그 사이에, β-어레스틴과 융합된 비-천연 프로테아제에 대한 특이적 절단 서열이 연결되었다. hCXCR2에 리간드가 결합되어 막의 탈감작화를 촉발시키면, 세포내 어레스틴-프로테아제 융합 단백질이 활성화된 수용체에 동원되고, 융합된 전사 인자가 프로테아제에 의해 절단되어 핵으로 들어가게 되고, 그 결과로 520 nm 파장에서 형광 발광하는 리포터 유전자의 활성화를 일으켰다. Tango 어세이는 LiveBLAzer FRET-B/G 로딩 키트 (#K1030; Invitrogen)의 제조사 설명서에 따라 수행되었다. 간략하게, Tango CXCR2-bla U2OS 세포는 웰 당 20,000 세포로 CellCarrier-96 (PerkinElmer) 플레이트 상에 플레이팅되었고, 배지 중에 37℃/5% CO2 에서 밤새 배양되었다. 최종 세포는 키트에 제공된 어세이 배지에 재접종되었고, 48시간 동안 37℃/5% CO2 에서 인큐베이션되었다. 상이한 농도의 IL8 같은 리간드, Groα (CXCL1) 및 항체 리간드를 상기 세포와 37℃/5% CO2 에서 밤새 혼합하여 그들 효현제 효과를 측정하였다.
abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 억제 연구를 위해서, 세포를 먼저 상이한 농도의 항체와 30분 동안 37℃/5% CO2 에서 처리하고 나서, 20 nM IL8 또는 Groα (CXCL1) (EC80)를 첨가하였고 밤새 37℃/5% CO2 에서 인큐베이션시켰다. 세포를 용해시키기 전에, 검출 기질 혼합물을 첨가하였고 세포와 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 파장 460 nm에서 여기시 520 nm 파장에서 형광 방출을 기록하였고 형광 플레이트 판독기 (EnVision, PerkinElmer)에서 정량하였다.
칼슘 유입
칼슘 이온 유입 어세이는 hCXCR2 및 Gα16 단백질 둘 모두를 안정하게 발현하는 내부 CHO 세포에서 수행하였다. 세포는 웰 당 20,000 세포로 384-웰 플레이트에 플레이팅하였고 1% FBS가 보충된 성장 배지 중에서 4-6시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하였고, 최종 세포를 2회 HBSS 완충액으로 세척하였다. 신선하게 제조된 칼슘 염료, Fluo-4 Direct™ (#F10471; Invitrogen)를 함유하는 25 ㎕의 로딩 용액을 각 웰에 첨가하였고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 어세이 플레이트는 FLIPR 검출을 수행하기 전에 실온에서 평형화되게 하였다. 효현제 효과의 측정을 위해서, IL8, Groα (CXCL1), 및 조합 항체에 대한 상이한 농도의 5 ㎕ 리간드 스톡 (HBSS 완충액 중)을 염료-로딩된 세포를 함유하는 각 웰에 신속하게 혼합하였고, 즉시 FLIPR 판독기 (Tetra Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices) 상에 파장 494 nm (여기) 및 516 nm (방출)에서 기록하였다. 최종 어세이 농도는 IL8 및 Groα (CXCL1) 경우에 100, 25, 6.2, 1.6, 0.39, 0.098, 0.024, 0.0061 nM 이었고; abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG 경우에 3600, 900, 225, 56, 14, 3.5, 0.88, 0.22 nM이었다.
abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 억제 연구를 위해서, 상이한 농도의 abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1를 갖는 5 ㎕ HBSS 스톡을 먼저 25 ㎕ 염료-로딩된 CHO 세포를 함유하는 각각의 상응하는 웰에 혼합하고 나서, 실온에서 30분 동안 평형화하였다. Ca2+ 유입 신호는 신속하게 IL-8 (2.5 nM의 어세이 중 최종 농도) 또는 Groα (CXCL1) (7 nM의 어세이 중 최종 농도)의 5 ㎕ HBSS 스톡을 FLIPR 상의 각 웰에 혼합하여 개시시켰다. 어세이 중 abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 최종 농도는 각각 IL8 억제의 경우에 3600 nM, 1200, 400, 130, 44, 15, 4.9, 1.6 nM 이었고, Groα (CXCL1) 억제의 경우에 3600, 900, 225, 56, 14, 3.5, 0.88, 0.22 nM이었다. Ca2+ 유입의 형광 신호는 상기 기술된 바와 같이 실시간 기록하였다.
hCXCR2 의 내재화
IgG에 특이적으로 결합하여 면역독소 복합체를 형성하는, 어댑터-독소 융합 단백질, AL2-PE38KDEL을 이용하는 변형된 방법을 사용하여 항체 자극된 CXCR2 엔도시토시스를 측정하였다 (Hou, S.-C. et al., (2016). Scientific reports 6, 31878). 최종 면역독소 복합체는 세포로 진입했을 때 세포 사멸을 유도한다. 간략하게, AL2-PE38KDEL을 1:1 몰 비율로 항체 용액에 첨가하였고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켜서 면역독소 복합체를 생성시켰다. 면역독소는 상이한 최종 농도로 hCXCR2가 과발현된 세포와 혼합되었고, 4시간 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 최종 세포는 신선한 배지에 재접종하였고, 3일 동안 37℃/5% CO2 에서 배양하였다. WST-1 (#W201-12; Dojindo)은 제조사 프로토콜에 따라서 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존능을 결정하는데 사용되었다.
호중구 주화성
호중구 이동은 8-㎛ 포어 크기 막이 구비된 24-웰 트랜스웰 챔버 (#3422, Corning Costar)에서 검출하였다. 초대 인간 호중구 (#PBN-1F, MT-BIO)를 주화성 배지 (0.5% BSA 존재의 RPMI 1640 배지)에 5×105 세포/mL 까지 현탁하였다. 이들 호중구 샘플은 상이한 농도로 abN48-IgG1, abN48-2-IgG1, 이소타입 항체, CXCR1/2 억제제 나바릭신 (MK7123, #HY-10198, MedChemExpress)과 주화성 배지 중에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 화학주성, 재조합 인간 IL8 (#Z03262-25, GenScript)은 10 nM의 농도로 각각의 하부 챔버 중 600 ㎕ 주화성 배지에 함유되었다. 250 ㎕의 호중구 현탁액을 각각의 상부 챔버에 로딩하였고 60분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 하부 챔버 내 주화성 배지 중 세포는 혈구계측기 (#717810, BRAND)로 계측하였다.
결정화, X-선 데이터 수집, 및 구조 결정.
CXCR의 잔기 1-48 및 9-19에 상응하는, 각각 2개 펩티드, pepN48 및 pepN9-19는 Sangon Biotech에 의해 합성되었다. 펩티드의 순도 및 정체는 HPLC 및 질량 분광법으로 시험하였다. abN48 Fab는 PBS 완충액 pH 7.4 중에 4℃에서 밤새 abN48-IgG1 (람다 유형)의 파파인 (Sigma-Aldrich, 1:50 w/w 비율) 절단을 통해 생성시켰다. 절단 후에, abN48 Fab를 HiTrap 람다 HP 컬럼 (GE Healthcare)에 로딩하였고 0.1 M 소듐 아세테이트, pH 3.0으로 용출시켰다. 용출 분획을 풀링하였고 20 mM Tris pH 7.5 및 50 mM NaCl을 함유하는 완충액으로 평형화된 Superdex200 증가 10/300GL 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare)에 즉시 적용하였다. 겔 여과 컬럼으로부터 정제된 abN48 Fab를 함유하는 분획을 풀링하였고 1:3의 몰 비율로 pepN9-19 (Sangon Biotech)와 혼합하였다. 혼합물은 추가 농축 전에 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. abN48-2 Fab 및 pepN9-19 복합체는 유사한 프로토콜에 따라서 조립하였다.
Fab 항체의 결정 - 펩티드 복합체는 현적, 증기 확산 방법을 사용하여 18℃에서 수득하였다. pepN9-19와 복합체 형성된 abN48 Fab의 회절 품질 결정은 1 ㎕ 단백질 용액 (15 mg/mL) 과 1 ㎕ 리저버 용액 (0.1 M HEPES 소듐 pH 7.5; 2% v/v 폴리에틸렌 글리콜 400; 2.0 M 암모늄 술페이트)을 혼합하여 실리콘화 커버 클립 상에서 성장시켰다. pepN9-19와 복합체 형성된 abN48-2 Fab의 결정은 0.1 M HEPES pH 7.5; 25% w/v 폴리에틸렌 글리콜 3, 350 중에 수득되었다.
결정은 저온 저장제로서 20% 글리세롤을 첨가한 후에 데이터 수집을 위해 액체 질소에 급속 냉각시켰다. 회절 데이터는 0.9789Å의 파장에서 상하이 신크로트론 방사선 설비 (Shanghai Synchrotron Radiation Facility) (SSRF)의 빔라인 BL19U1에서 수집하였고 HKL3000 프로그램으로 처리하였다. pepN9-19와 복합체 형성된 abN48 Fab의 구조는 PHENIX에서 Phaser 프로그램으로 분자 치환에 의해 해결하였다. 검색 모델은 SWISS-MODEL로 구축된 VH 도메인 및 4E10 Fab 구조 (PDBID: 4XCN, chain L)로부터의 VL 도메인을 조합하여 생성시켰다. pepN9-19와 복합체 형성된 abN48-2의 구조는 분자 대체 검색 모델로서 abN48-pepN9-19 복합체 구조를 사용해 유사하게 해결하였다. 초기 모델은 COOT 및 Refmac5 in ccp4i를 사용하여 수동 구축 및 정밀화의 사이클을 통해서 더욱 개선되었다. 최종 모델의 품질은 MolProbity로 분석하였다. 데이터 수집 및 정밀 통계의 요약은 표 S2에 요약되어 있고 도면은 프로그램 PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.1 Schrodinger, LLC)을 사용해 만들었다. 정전기 계산은 PDB2PQR로 수행하였다.
수소-중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)
pepN48 단독의 아미드 수소 교환은 10℃에서 50 μM의 1 ㎕ pepN48을 19 ㎕ D2O 완충액 (25 mM Tris, pD 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP)에 희석하여 개시하였다. 상이한 시점 (0초, 10초, 30초, 60초, 및 120초)에, 차가운 켄칭 완충액 (400 mM KH2PO4/K2PO4, pH 2.2, 50 mM TCEP)의 첨가로 표지화 반응을 켄칭하였고 액체 질소에 즉시 냉동시켰다. abN48의 존재 하에서 pepN48의 HDX-MS를 위해, 50 μM의 1 ㎕ pepN48을 67 μM의 1 ㎕ abN48와 먼저 혼합하였다. 다음으로 혼합물은 켄칭 및 급속-냉동 이전에 18 ㎕ D2O 완충액을 첨가하여 0초, 10초, 30초, 60초, 또는 120초 동안 표지화하였다. 모든 냉동 샘플은 분석까지 -80℃에 저장하였다.
해동된 샘플은 인라인 펩티드 분해 및 탈염이 장착된 HPLC-MS (Agilent 1100) 시스템에 즉시 주입하였다. 탈염 분해물을 이어서 18분 농도구배 동안 Hypersil Gold™ 분석 컬럼 (Thermo)에서 분리시켰고 Orbitrap 융합 질량 분광계 (Thermo)로 직접 분석하였다. HPLC 시스템은 임의의 캐리오버를 최소화하기 위해서 샘플 간 블랭크 주입으로 광범위 세정하였다. 펩티드 확인은 orbi/orbi 모드 하에 직렬 MS/MS를 통해 수행되었다. 모든 MS/MS 스펙트럼은 MASCOT 프로그램을 사용해 분석하였고, 최종 PSM은 1%의 FDR로 필터링하였다. 펩티드 도심의 초기 분석은 HD-Examiner v1.3 (Sierra Analytics)을 사용해 수행하였고 모든 펩티드는 체류 시간, 전하 상태, m/z 범위 및 중복 펩티드의 존재를 검토하여 수동으로 검증하였다. pepN48의 펩티드 커버리지는 100%로 확인되었고, 각 펩티드의 상대적 중수소 수준 (%D)은 전체 중수소화 샘플이 현재 LC 상황에서 90% D를 보유한다는 가정으로 HD-Examiner를 사용해 자동으로 계산하였다.
통계 분석
모든 통계 검사는 Graphpad Prism 7 소프트웨어로 수행하였다. 측정 값은 달리 표시하지 않으면 평균 또는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. P 값 < 0.05 가 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 2. 인간 CXCR2에 결합하는 조합 항체의 선택
인간 CXCR2 단백질은 세포의 외부에 3개의 세포외 루프 및 N-말단을 갖는 경막 단백질이다. 각각의 N-말단 및 3개 루프는 IL8에 대한 CXCR2의 결합에 연루된다 (Ahuja, S.K. et al., (1996) The Journal of biological chemistry 271, 225-232; Katancik, J.A., et al., (1997) Biochemical and Biophysical Research Communications 232, 663-668; Luo, Z.W., et al., (1997) Protein Engineering 10, 1039-1045; Berkamp, S., et al., (2017) Journal of Biomolecular Nmr 69, 111-121; Park, S.H. et al., (2017) Biophysical Journal 113, 2695-2705; Park, S.H. et al., (2011) J Mol Biol 414, 194-203; 및 Park, S.H. et al., (2012) Nature 491, 779-783).
서열 분석을 통해서, 본 발명자는 CXCR2 매개 IL8 신호전달을 표적화하는 고도의 선택적이고 강력한 조합 항체의 패닝 및 최적화에서 에피토프로서 세포외 N-말단 48 아미노산을 표적화하기로 결정하였다. 인간 CXCR2의 가요성 N-말단의 처음 48 아미노산에 상응하는 펩티드 (pepN48, 도 1A)를 합성하였다 (Chinese Peptide, Hangzhou). 1011 조합 라이브러리 및 pepN48을 사용한 파지 패닝의 3 라운드를 수행하였다. 패닝에서 높은 농축을 보이는 9종 scFv 서열을 pFuse 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 각각의 scFv 조합 항체의 발현 및 친화성 결합은 pepN48 펩티드의 존재 하에서 세포 상청액의 ELISA 스크리닝을 통해서 확인하였다 (도 5A). FACS를 사용한 상청액의 추가 분석은 오직 하나의 클론 H8 (abN48)이 USOS 세포 상에서 막 인간 CXCR2-mCherry를 인식하였음을 보여주었다 (도 5B). H8 (abN48) scFv 조합 항체를 과발현시키고, 균질하게 정제하였으며, Biacore 상에서 SPR 분석을 수행하였다. pepN48과 H8 (abN48)의 KD 값은 2.6 Х 10-9 M로 결정되었다 (도 5C).
실시예 3. 전체 길이 IgG1 조합 항체의 생성 및 친화성 성숙화
H8 (abN48)의 결합 친화성을 최적화하기 위해서, scFv 항체는 먼저 IgG1 형식의 전체 길이 조합 항체로 전환되었고 (도 6A), abN48-IgG1로 명명되었다. pepN48과 abN48-IgG1의 KD 값은 7.8 Х 10-10 M로 확인되었다 (도 1B). 이의 scFv 형태와 비교하여 abN48-IgG1의 개선된 친화성은 Fab 입체배열은 효모 디스플레이에 의한 친화성 성숙화를 사용해 더욱 최적화될 수 있다는 것을 시사한다. 표적화된 에피토프 서열에 대한 최적 결합제(들)를 찾을 기회를 최대화하기 위해서, abN48-IgG1의 VH 상의 모든 11개 CDR3 잔기, GYCSSTSCYDY 를 무작위 돌연변이시켰고, 최종 Fab 서열은 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 발현하는 GAL1-10 이중-방향 프로모터를 함유하는 pESC 벡터를 사용해 효모 표면 상에 디스플레이하였다. 이것은 >107 의 다양성 부피의 조합 항체 라이브러리를 생성시켰다. pepN48에 대한 4라운드의 패닝 이후에, 8종의 고도로 농축된 서열, abN48-1 내지 abN48-8이 100종의 양성 클론으로부터 선택되었고, 시퀀싱 분석으로 확인하였다. Weblogo 분석은 농축된 서열 내 가장 빈번한 돌연변이는 S5R 및 S7R로서, 새로운 조합 항체, abN48-2의 서열을 구성한다 (도 5B). 8개 서열을 pFuse 벡터에 서브클로닝하였고 HEK293T 세포에 의해 발현시켰다. 8종의 정제된 항체의 결합 친화성 및 균질성은 각각 SPR 및 SEC-HPLC로 결정하였다 (표 1 및 도 7).
Figure pct00005
모든 새로운 구성체는 pepN48과 나노몰 이하 내지 피코몰의 결합 친화성을 보여서, CXCR2의 N-말단 상의 공유된 공통 에피토프 서열을 시사한다. 도 1B에 도시된 바와 같은, 조합 항체, abN48-2-IgG1은 7.2 Х 10-12 M의 KD 값의 피코-몰 결합 친화성을 나타냈고, abN48-IgG1과 비교하여 100배 개선을 나타냈다. 또한, 42℃에서 5일 동안 인큐베이션 이후에, abN48-2-IgG1은 검출가능한 응집체 또는 분해를 보이지 않았다 (도 7, 윗줄 오른쪽)
Figure pct00006
pepN48와 ab48-2-IgG1 또는 abN48-IgG1 간 상호작용을 더욱 검증하였고 HDX-MS 방법을 사용해 각각 잔기 12 - 19 및 13 - 21로 맵핑되었다 (도 1C).
실시예 4. hCXCR2에 특이적으로 결합하는 조합 항체 종 및 아형
abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 종 및 아형 특이성을 결정하기 위해서, hCXCR1-mCherry, hCXCR2-mCherry, mCXCR2-mCherry, rCXCR2-mCherry, rbCXCR2-mCherry, 및 mcCXCR2-mCherry를 함유하는 유전자 구성체를 U2OS 세포에서 과발현시켰다. hCXCR1-mCherry, hCXCR2-mCherry, mCXCR2-mCherry를 과발현하는 U2OS와 abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 면역형광 공동-국재화는 양쪽 항체가 표면 hCXCR2를 특이적으로 인식하였음을 보여주었다 (도 2A). 이러한 높은 특이성은 FACS 분석으로 더욱 확인되었으며, abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1 둘 모두는 인간의 CXCR2 (hCXCR2), 및 보다 밀접하게 관련된 종인 마카크 원숭이 (mcCXCR2)에는 독점적으로 결합되었지만, 마우스, 래트 또는 토끼의 CXCR1, 또는 CXCR2에는 결합하지 않았다 (도 2B).
실시예 5. 조합 항체는 hCXCR2 매개 β-어레스틴 신호전달 및 칼슘 유입을 강력하게 억제한다
hCXCR2-특이적 항체 결합제의 세포 기능을 이해하기 위해서, 2개의 독립적 신호전달 경로로서, CXCR2에 의해 매개되는, β-어레스틴 동원 및 세포질 Ca2+ 유입을 각각 Tango 및 FLIPR 방법을 사용해 평가하였다. β-어레스틴 동원은 G 단백질-독립적 세포내 사건인데 반해서, Ca2+ 유입은 Gα 단백질 활성화에 의해 생산된 IP3에 반응성으로, 세포질 망상 구조체 (ER)로부터 세포질로 Ca2+ 의 방출 결과이며, 둘 모두는 CXCR2 활성화와 직접적으로 연관된 것으로 알려져 있다.
천연 리간드 및 2종의 선택된 조합 항체는 먼저 Tango 어세이를 사용하여 β-어레스틴 동원에서 그들 작용 효과에 대해 먼저 시험되었다. 오직 2종의 천연 리간드, IL8 및 Groα가 β-어레스틴 동원을 유도하였고 각각 4.5 nM 및 5.3 nM의 겉보기 EC50 값을 가졌다 (도 3A). 다른 한편으로, 2종 항체, abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1은 100 nM 까지 동원의 활성화를 보이지 않았지만, 천연 리간드 유도된 동원의 완전한 억제 (EC80 수준에서)를 보였고 IL8에 대해 각각 2.8 nM 및 0.90 nM의 겉보기 IC50 값, 및 Groα에 대해 각각 4.7 nM 및 0.37 nM의 겉보기 IC50 값을 가졌다 (도 3B). abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1 둘 모두는 역작용 효과를 보였고, 20 nM에서 양쪽 항체는 CXCR2 발현에 의한 내재 β-어레스틴 동원을 현저하게 억제하였다는 것을 유의한다 (도 8).
다음으로 Ca2+ 유입의 자극이 IL8, Groα, 및 조합 항체에 대해 시험되었다. 천연 리간드, IL8 및 Groα는 Ca2+ 유입의 용량-의존적 활성화를 보였고, 각각 0.42 nM 및 1.7 nM의 EC50 값을 갖는다 (도 3C). 흥미롭게도, 단단한 결합의 항체, abN48-2-IgG1은 10 - 1000 nM 범위의 고농도에서 부분 작용 효과를 나타냈고 겉보기 EC50 값은 310 nM이었다 (도 3C). 다른 한편으로, abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1 둘 모두는 천연 리간드 유도된 (EC90 수준에서) Ca2+ 유입의 용량-의존적 억제를 나타냈고, IL8에 대해 각각 190 nM 및 44 nM의 IC50 값, 및 Groα에 대해 각각 1000 nM 및 110 nM의 IC50 값을 갖는다 (도 3D).
abN48-IgG1과 비교하여 abN48-2-IgG1에 의한 CXCR 매개 신호전달에 대한 길항 효과의 관찰된 증강은 CXCR2의 N-말단 에피토프 서열과의 이의 개선된 결합 친화성과 일관적이다.
실시예 6. 조합 항체는 hCXCR2의 내재화를 강력하게 유도하였다
IL8은 또한 5 - 10 nM에서 CXCR2의 엔도시토시스 신호전달을 유도하는 것으로 확인되었다. CXCR2 엔도시토시스에 대한 조합 항체 리간드의 효과를 시험하기 위해서, CXCR2의 내재화는 FcR 수용체가 아닌 막 hCXCR2를 과발현하는 U2OS 세포를 사용해 조사하였다. abN48-IgG1 또는 abN48-2-IgG1의 면역독소 복합체가 분자 프로브로서 사용되었다. 도 3E에 도시된 바와 같이, abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1의 면역독소 복합체만이 hCXCR2 과발현 U2OS의 용량-의존적 세포독성을 보여주었다. hCXCR2 발현이 없는 U2OS 세포를 비롯하여 미관련 조합 항체의 면역독소 복합체는 실험 조건 하에서 검출가능한 세포독성을 보이지 않았다. abN48-IgG1 또는 abN48-2-IgG1의 활성화 효과는 매우 민감하였고 겉보기 EC50 값은 0.1 nM 미만이었다.
실시예 7. 단일클론 항체, abN48-2-IgG1은 IL8-유도된 호중구 주화성을 강력하게 억제하였다
호중구 주화성은 먼 급성 손상 또는 감염성 부위에서 분비된 이의 상응하는 케모카인의 농도구배에 따라서 일어난다. CXCR2가 주로 호중구 상에서 발현되는 것으로 알려져 있고 이의 인식 리간드, IL8은 많은 병리학적 과정에서 핵심 조절제인 것으로 확인되었으므로, IL8-CXCR2 축은 중요한 치료적 중재 표적을 구성한다. 이 실시예는 초대 인간 호중구를 사용하여, 최적화된 조합 항체, abN48-2-IgG1의 주화성 연구를 수행하였다. 다양한 호중구는 전혈 수집물로부터 면역-자성 비드 분리를 통해서 음성적으로 선택하였고, 순도는 CD15+, CD16+, CD11b+, CD66b+ (MT-Bio, Shanghai)에 대해 검증되었다.
먼저, 인간 호중구 상에서 hCXCR2의 막 발현은 abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG1 둘 모두를 사용한 면역-염색으로 확인하였다 (도 4A). FACS 분석은 호중구 세포의 전체 개체군이 이전 문헌 보고서와 일관되게 abN48-IgG1 또는 abN48-2-IgG1에 의해 포획될 수 있다는 것을 보여주었다. 다음으로 IL8에 의한 호중구 주화성은 트랜스웰 이동 어세이에서 시험되었다. 조합 항체, abN48-2-IgG1은 최대 IL8 농도 (10 nM)에 의해 유도된 호중구 주화성의 용량-의존적이고, 매우 강력하며, 완전한 억제를 보여주었다 (도 4B). 도 4B에 도시된 바와 같이, abN48-2-IgG1은 1 nM에서 75% 억제, 그리고 20 nM에서 120% 억제하여, 호중구 주화성의 극도로 강력한 억제를 보여주었지만, 소형 분자 CXCR1/CXCR2 이중 억제제, MK7123은 1 μM에서 호중구 주화성의 100% 억제를 보여주었다. abN48-2-IgG1에 의한 케모카인 의존적 및 독립적인 호중구 이동의 완전한 차단의 관찰은 호중구의 기준치 내재적 이동에서 CXCR2의 관여를 시사할 수 있다.
실시예 8. X-선 결정학 및 돌연변이유발에 의해 특징규명된 abN48 항체 및 CXCR2의 N-말단 간 상호작용
HDX-MS 결과 (도 1C)를 기반으로, 결정학 연구를 위한 pepN48의 최소 상호작용 펩티드 서열을 확인하기 위해서, 이 실시예는 pepN48 펩티드의 N-말단 및 C-말단으로부터 일련의 절두체를 디자인하였고, 최소 9 - 19 아미노산 (aa) 펩티드 (pepN9-19, DSFEDFWKGED, SEQ ID NO:16)가 pepN48과 비슷한 수준으로 abN48-IgG1 및 abN48-2-IgG2 둘 모두의 Fab 형태에 결합되었지만, 9 - 19 aa가 결여된 pepN48 (pepN48Δ9-19)은 항체에 의해 더 이상 인식되지 않았다 (도 9).
2.8Å의 최종 분해능까지 pepN9-19와 복합체를 형성한 abN48 및 abN48-2 (Fab 형태)의 결정 구조 (도 1D, 표 3). 하나의 비대칭 유닛에 2개의 abN48/pep9-19 단백질 복합체 (프로토머)가 존재한다 (도 10A). 하나의 이러한 프로토머 중 결합된 pepN9-19의 전자 밀도 (도 10B, 좌)는 나머지 것 (도 10B, 우)에 비해서 훨씬 양호하였고, 따라서 이 실시예는 전자에 대한 분석에 집중하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
특히, 양쪽 abN48/pepN9-19 프로토머에서, pepN9-19의 FW14-15aa는 전자 밀도로부터 충분히 추적할 수 있어서 (도 10B) 이들 2개 잔기가 abN48 및 pepN9-19 간 결합을 한정하는데 핵심적인 역할을 한다는 것을 의미한다. 실제로, abN48의 CDR 루프는 이의 가변 영역의 상부에서 거대한 소수성 구멍을 형성하는 방식으로 배열된다 (도 11A 및 11B). 잔기 F14 및 W15는 그들의 부피 큰 방향족 측쇄를 이러한 소수성 구멍에 삽입시켜서, abN48의 CDR2L을 제외하고 모든 CDR 루프 상의 잔기와 강력한 소수성 상호작용을 형성한다 (도 11C). 특히, CDR3L의 W104 및 F106을 비롯하여, abN48의 CDR3H의 W111은, abN48의 경쇄 프레임 영역 내 Y38 및 중쇄 프레임 영역 내 W48과도 상호작용하는, pepN9-19로부터의 W15와 강력한 π-π 적층 상호작용을 형성한다 (도 11C). 한편, pepN9-19로부터의 F14는 CDR1L의 Y36을 비롯하여, abN48의 경쇄 프레임 영역의 F48 및 Y38과 강력한 π-π 적층 상호작용을 형성한다 (도 11C). CDR2H의 W51 이외에도, pepN9-19로부터의 K16의 측쇄에 대해 소수적으로 포장되어서, 또한 abN48 및 NT9-19 간 높은 친화성 상호작용에 기여한다 (도 11C). 그리하여, abN48/NT9-19의 구조는 확실히 CXCR2의 N-말단 영역으로부터의 F14 및 W15가 abN48 및 abN48-2가 인식하는 핵심 에피토프라는 것을 의미한다. 흥미롭게도, abN48의 CDR2H 및 CDR3H 둘 모두는 역-평형 β-시트로서 존재하고, CDR3H은 α-가닥 내 디술피드 결합의 쌍 (C102-C107)에 의해 안정화된다. CDR 루프의 유사한 입체배열이 매우 드물지만, 이전에도 관찰된 적이 있었다.
추가 검증을 위해서, 이 실시예는 hCXCR2의 N-말단의 잔기 D13, F14, W15, 및 K16에 대한 알라닌-스캔 부위-지정 돌연변이유발법을 수행하였다. 돌연변이체 구성체는 mCherry와 융합시켰고 U2OS 세포 상에서 발현시킨 다음 FACS 및 면역세포형광법으로 검토하였다 (도 12). 결과는 D13, F14 및 W15가 항체 리간드의 결합을 위한 결정적인 에피토프라는 결정 분석과 일관되었다. 따라서, 우리는 CXCR2로부터의 W15가 IL8 및 CXCR2 간 상호작용에 아마도 매우 중요하고 abN48는 CXCR2의 F14-W15 결합에서 IL8을 능가하여 CXCR2를 길항할 수 있다고 생각한다.
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본 개시는 본 개시의 개별 양태의 단일 예시로서 의도되는 기술된 특정 구현예에 의해 범쥐를 제한하려는 것이 아니고, 기능적으로 동등한 임의 조성물 또는 방법이 본 개시의 범주 내에 속한다. 본 개시의 정신 또는 범주를 벗어나지 않고 본 개시의 방법 및 조성물에 다양한 변형 및 변동이 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 개시는 그들이 첨부된 청구항 및 그들 동등물의 범주 내에 온다면, 본 개시의 변형 및 변동을 포괄하고자 한다.
본 명세서에서 언급되는 모든 공개물 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물 또는 특허 출원이 특별히 개별적으로 참조로 편입된다고 표시한 바와 동일한 정도까지 참조로 본 명세서에 편입된다.
<110> ShanghaiTech University <120> ANTI-CXCR2 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 49BD-298538-WO2 <150> PCT/CN2019/104336 <151> 2019-09-04 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Gly Tyr Cys Ser Arg Thr Arg Cys Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Arg Ile Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Ala Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Gly Phe Cys Thr Arg Thr Ile Cys Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Gly Tyr Cys Ser Phe Ala Ile Cys Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Gly Tyr Cys Asn Arg Thr Arg Cys Tyr Asp His 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Gly Tyr Cys Ser Arg Phe Asn Cys Lys Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Gly Tyr Cys Ser Pro Ser Gly Cys Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Gly Tyr Cys Gly Arg Ala Arg Cys Thr Ser Phe 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Gly Tyr Cys Ser Arg Ser Arg Cys Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Met Glu Asp Phe Asn Met Glu Ser Asp Ser Phe Glu Asp Phe Trp Lys 1 5 10 15 Gly Glu Asp Leu Ser Asn Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Pro Pro Phe 20 25 30 Leu Leu Asp Ala Ala Pro Cys Glu Pro Glu Ser Leu Glu Ile Asn Lys 35 40 45 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Asp Ser Phe Glu Asp Phe Trp Lys Gly Glu Asp 1 5 10 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Tyr Cys Ser Arg Thr Arg Cys Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30 Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Phe 35 40 45 Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Thr Val Leu Gly 115

Claims (26)

  1. 항체 또는 이의 단편으로서, 항체 또는 이의 단편은 인간 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2 (CXCR2) 단백질에 대한 특이성을 갖고, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
    VH CDR1은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:1로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고;
    VH CDR2는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:2로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고;
    VH CDR3은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열, SEQ ID NO:3으로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체, 또는 SEQ ID NO:7-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이체를 포함하고;
    VL CDR1은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:4로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고;
    VL CDR2는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:5로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고;
    VL CDR3은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:6으로부터의 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    VH CDR1은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하고;
    VH CDR2는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하고;
    VH CDR3은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:7-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이체를 포함하고;
    VL CDR1은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하고;
    VL CDR2는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하고;
    VL CDR3은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  3. 제2항에 있어서, VH CDR3은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항에 있어서, 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이의 조합을 더 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 항체인 항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, VH는 SEQ ID NO: 17 또는 18의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 17 또는 18과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, VH는 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:18과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, VL은 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:19와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  9. 항체 또는 이의 단편으로서, 항체 또는 이의 단편은 인간 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 2 (CXCR2) 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 결합은 SEQ ID NO:15의 잔기 9-19 내 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 관여되는 것인 항체 또는 이의 단편.
  10. 제9항에 있어서, 결합은 D13, F14 및 W15 중 적어도 하나가 관여되는 것인 항체 또는 이의 단편.
  11. 제9항에 있어서, 결합은 적어도 F14 및 W15가 관여되는 것인 항체 또는 이의 단편.
  12. 제9항에 있어서, 결합은 적어도 D13, F14 및 W15가 관여되는 것인 항체 또는 이의 단편.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 결합은 48 N-말단 잔기 외부의 임의의 아미노산 잔기는 관여되지 않는 것인 항체 또는 이의 단편.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 CXCR2 및 IL-8 단백질 간 결합을 억제하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 전체 인간 항체인 항체 또는 이의 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세포.
  18. 치료를 필요로 하는 환자에서 암 또는 염증성 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  20. 제18항에 있어서, 염증성 질환은 파킨슨병, 관절염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선, 건선성 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 소아 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 애디슨병, 셀리악병, 피부근염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 쇠그렌 증후군, I형 당뇨병, 혈관염, 포도막염, 아테롬성 동맥경화증 및 강직성 척추염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  21. 제18항에 있어서, 염증성 질환은 감염으로 초래되는 것인 치료 방법.
  22. 암 또는 염증성 질환의 치료를 위한 약물의 제조를 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편의 용도.
  23. 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) T 세포를 시험관내에서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편으로 처치하는 단계; 및
    (b) 처치된 T 세포를 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 것인 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단계 (a) 전에, T 세포를 환자로부터 단리하는 단계를 더 포함하는 것인 치료 방법.
  25. 제23항에 있어서, T 세포는 종양-침윤성 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이의 조합인 것인 치료 방법.
  26. 샘플 중 CXCR2의 발현을 검출하는 방법으로서, 항체 또는 이의 단편이 CXCR2에 결합하는 조건 하에서 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편과 샘플을 접촉시키는 단계, 및 샘플 중 CXCR2의 발현을 지시하는 결합을 검출하는 단계를 포함하는 것인 검출 방법.
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