KR20220050182A - 항-cd22 항체 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
치료적 및/또는 진단적 목적을 위한 고친화성 항-CD22 항체 및 이를 사용하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 이러한 항-CD22 항체를 생산하는 방법이 또한 본 명세서에 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참고
본 출원은 2019년 8월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/889,739에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이것은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
분화 클러스터 22(CD22)는 렉틴의 SIGLEC 패밀리의 구성원이다. 이 분자는 미성숙 B-세포에 비해 성숙한 B 세포 표면 상에서 높은 수준으로 발현한다. B 세포 수용체(BCR) 시그널링에 대한 억제성 수용체로서 그것은 면역계의 과-활성화를 방지하는 데 조절 역할을 수행한다.
CD22는 급성 림프구성 백혈병 치료와 같은 백혈병 치료 및 전신 자가면역 질환의 치료를 위한 유망한 표적인 것으로 나타났다.
본 개시내용은 세포 표면 상에서 발현되는 CD22에 대해 높은 결합 친화성 및 특이성을 갖는 우수한 항-CD22 항체의 개발에 적어도 부분적으로 기반한다. 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 현재 전-임상 및 임상 연구에서 공지된 항-CD22 항체인, M971 및 RFB4(이로부터 BL22가 유래됨)와 상이한 CD22 에피토프에 결합한다. 추가로, IgG 형태의 특정 예시적인 항-CD22 항체(예를 들어, 클론 EP160-D02)는 세포 표면 CD22에 대한 높은 결합 친화성 및 특이성, 및 BL22 및 M971에 비해 더 높은 ADCC 활성을 나타냈다. 본 명세서에 제공된 결과는 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체가 암 세포와 같은 CD22+ 질환 세포에 대해 높은 치료적 효과를 가지는 것으로 예상될 것임을 나타낸다.
따라서, 본 개시내용의 일부 양태는 CD22에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 한다. 이러한 항-CD22 항체는 참고 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 CD22에 대한 결합으로부터 참고 항체에 대해 경쟁할 수 있다. 예시적인 참고 항체는 EP35-A7, EP35-B5, EP35-C6, EP35-C6, EP35-C8, EP35-D6, EP35-E6, EP35-E7, EP97-A01, EP97-A10, EP97-B03, EP97-F01, EP97-G05, EP160-C07, EP160-D02, EP160-E03, EP160-F04, EP160-F10, EP160-G04, EP160-G05, 및 EP160-H02을 포함하며, 그의 구조 정보는 아래에 제공되어 있다. 특정 예에서, 참고 항체는 EP160-D02이다. 다른 특정 예에서, 참고 항체는 EP97-B03이다.
일부 실시형태에서 항-CD22 항체는 다음을 포함할 수 있다: (a) 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)으로, 여기서 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3은 집합적으로 참고 항체의 중쇄 CDR과 적어도 80% 동일하거나/하고; (b) 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3)으로, 여기서 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 집합적으로 참고 항체의 경쇄 CDR과 적어도 80% 동일함. 일부 경우에, 항-CD22 항체는 세포 표면 상에서 발현된 CD22에 대해 10nm 미만(예를 들어, 1nM 미만)의 결합 친화성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 참고 항체의 HC CDR과 비교하여 8개 이하의 아미노산 잔기 변이를 집합적으로 함유하는 HC CDR을 포함할 수 있고; 및/또는 항체의 LC CDR은 참고 항체의 LC CDR과 비교하여 8개 이하의 아미노산 잔기 변이를 집합적으로 함유한다.
본 명세서에 개시된 임의의 항-CD22 항체는 참고 항체의 VH와 적어도 85% 동일한 VH, 및/또는 참고 항체의 VL과 적어도 85% 동일한 VL을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항-CD22 항체는 참고 항체와 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(HC CDR) 및 동일한 경쇄 상보성 결정 영역(LC CDR)을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 항-CD22 항체는 참고 항체와 동일한 VH 및 동일한 VL을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 항-CD22 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-CD22 항체는 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 예에서, 항-CD22 항체는, 예를 들어 서열번호: 40-59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단일-사슬 항체(scFv)이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 항-CD22 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 집합적으로 인코딩하는 핵산 또는 핵산 세트가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 핵산 또는 핵산 세트는 벡터 또는 벡터 세트, 예를 들어 발현 벡터(들)일 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 포유류 세포 또는 박테리아 세포), 뿐만 아니라 임의의 항-CD22 항체, 이러한 것을 인코딩하는 임의의 핵산(들), 또는 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 또한 본 개시내용의 범주 내이다.
추가로, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 약학적 조성물의 임의의 유효량을 CD22 억제를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CD22를 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서 대상체는 CD22 양성 질환 세포를 갖는 인간 환자일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 암 또는 자가면역 질환, 또는 CD22+ 세포와 관련된 기타 질환/장애를 갖는 인간 환자일 수 있다. 이러한 인간 환자는 CD22 양성 암세포(예를 들어, 조혈암 세포) 또는 CD22 양성 자가-반응성 면역 세포를 가질 수 있다. 또한 본 개시내용의 범주 내에는 본 명세서에 기재된 것과 같은 CD22+ 질환 세포를 포함하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학적 조성물, 뿐만 아니라 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 표적 질환을 치료하는데 사용을 위한 의약을 제조하기 위한 본 명세서에 개시된 임의의 항-CD22 항체의 용도가 있다.
더욱이, 본 개시내용은 (i) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 CD22를 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시키는 단계, 및 (ii) CD22에 대한 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, CD22의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 검출가능한 표지에 접합될 수 있다. 일부 예에서, CD22는 세포 표면 상에 발현된다. 일부 실시형태에서, 접촉시키는 단계는 항체를 대상체에게 투여함에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (i) CD22에 결합하는 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 제16항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 세포 배양물로부터 이렇게 생산된 항체를 수확하는 단계를 포함하는, CD22에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
발명의 하나 이상의 실시형태의 세부사항은 아래의 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 다음 도면 및 여러 실시형태의 상세한 설명, 그리고 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 본 명세서에 제시된 특정 실시형태의 상세한 설명과 조합한 도면을 참고하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 scFv 라이브러리 및 단일 중쇄(VH) 라이브러리와 같은 항체 라이브러리로부터 고친화성 CD22 결합제를 풍부화하기 위한 예시적인 전략을 나타내는 예시적 다이어그램이다.
도 2는 개별 양성 클론의 ELISA 스크리닝에 이어서 다중 라운드의 mRNA 디스플레이 선택을 통해 scFv 라이브러리로부터 얻은 예시적인 단일-사슬(scFv) CD22 결합제를 나타내는 다이어그램이다.
도 3a-3d는 표면 CD22를 발현하는 K562 세포에 대한 예시적인 항-CD22 항체의 적정 곡선을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 3a: 클론 EP-84-A6, EP84-F6, EP84-H7, 및 EP84-G12. 도 3b: 클론 EP97-A10 및 EP97-D06. 도 3c: 클론 EP160-C04, EP160-F04, EP160-C07, EP160-H02, EP160-D02, EP97-A10, EP97-B03, 및 EP97-G05. 도 3d: EP160-G04, EP160-G01, EP160-E03, EP160-F10, 및 EP160-G05.
도 4는 항-CD22 항체 M971의 존재 또는 부재에서 CD22-발현 K562 세포에 대해 표시된 예시적인 항-CD22 항체의 결합 곡선을 나타내는 다이어그램이다.
도 5는 재조합 또는 내인성 CD22를 발현하는 세포에 대한 항-CD22 항체 결합 활성을 나타내는 차트이다. 시험된 각각의 시험된 항-CD22 scFv 항체에 대해, 왼쪽에서 오른쪽으로 막대는 K562 세포, CD22 K562 세포, CD22 HEK293 세포, Daudi 세포 및 Raji 세포에 해당한다.
도 6은 예시적인 항-CD22 scFv EP097-G05를 사용한 내인성 CD22-양성 세포의 면역조직화학(IHC) 염색을 나타내는 사진이다.
도 7a 및 7b는 공지된 항-CD22 항체 M971 및 RFB4와 비교하여 예시적인 항-CD22 항체의 에피토프 비닝을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 7a: M971 항체에 대한 에피토프 비닝 검정. 도 7b: RFB4 항체로부터 유래된 BL22에 대한 에피토프 비닝.
도 8a-8c는 IgG 형식의 항-CD22 항체의 결합 활성 및 특이성을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 8a 표면 CD22를 발현하는 HEK293 세포를 이용한 결합 검정의 결과를 나타내는 다이어그램. 도 8b 표면 CD123을 발현하는 CHO-K1 세포를 이용한 결합 검정의 결과를 나타내는 다이어그램. 도 8c ELISA로 측정한 결합 활성의 결과를 나타내는 다이어그램.
도 9는 표지된 바와 같은 항-CD22 IgG 항체의 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC) 활성을 나타내는 다이어그램이다.
도 10은 세포 표면 CD22에 결합한 후 표지된 바와 같이 항-CD22 IgG 항체의 내재화를 나타내는 다이어그램이다.
도 1은 scFv 라이브러리 및 단일 중쇄(VH) 라이브러리와 같은 항체 라이브러리로부터 고친화성 CD22 결합제를 풍부화하기 위한 예시적인 전략을 나타내는 예시적 다이어그램이다.
도 2는 개별 양성 클론의 ELISA 스크리닝에 이어서 다중 라운드의 mRNA 디스플레이 선택을 통해 scFv 라이브러리로부터 얻은 예시적인 단일-사슬(scFv) CD22 결합제를 나타내는 다이어그램이다.
도 3a-3d는 표면 CD22를 발현하는 K562 세포에 대한 예시적인 항-CD22 항체의 적정 곡선을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 3a: 클론 EP-84-A6, EP84-F6, EP84-H7, 및 EP84-G12. 도 3b: 클론 EP97-A10 및 EP97-D06. 도 3c: 클론 EP160-C04, EP160-F04, EP160-C07, EP160-H02, EP160-D02, EP97-A10, EP97-B03, 및 EP97-G05. 도 3d: EP160-G04, EP160-G01, EP160-E03, EP160-F10, 및 EP160-G05.
도 4는 항-CD22 항체 M971의 존재 또는 부재에서 CD22-발현 K562 세포에 대해 표시된 예시적인 항-CD22 항체의 결합 곡선을 나타내는 다이어그램이다.
도 5는 재조합 또는 내인성 CD22를 발현하는 세포에 대한 항-CD22 항체 결합 활성을 나타내는 차트이다. 시험된 각각의 시험된 항-CD22 scFv 항체에 대해, 왼쪽에서 오른쪽으로 막대는 K562 세포, CD22 K562 세포, CD22 HEK293 세포, Daudi 세포 및 Raji 세포에 해당한다.
도 6은 예시적인 항-CD22 scFv EP097-G05를 사용한 내인성 CD22-양성 세포의 면역조직화학(IHC) 염색을 나타내는 사진이다.
도 7a 및 7b는 공지된 항-CD22 항체 M971 및 RFB4와 비교하여 예시적인 항-CD22 항체의 에피토프 비닝을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 7a: M971 항체에 대한 에피토프 비닝 검정. 도 7b: RFB4 항체로부터 유래된 BL22에 대한 에피토프 비닝.
도 8a-8c는 IgG 형식의 항-CD22 항체의 결합 활성 및 특이성을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 8a 표면 CD22를 발현하는 HEK293 세포를 이용한 결합 검정의 결과를 나타내는 다이어그램. 도 8b 표면 CD123을 발현하는 CHO-K1 세포를 이용한 결합 검정의 결과를 나타내는 다이어그램. 도 8c ELISA로 측정한 결합 활성의 결과를 나타내는 다이어그램.
도 9는 표지된 바와 같은 항-CD22 IgG 항체의 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC) 활성을 나타내는 다이어그램이다.
도 10은 세포 표면 CD22에 결합한 후 표지된 바와 같이 항-CD22 IgG 항체의 내재화를 나타내는 다이어그램이다.
특히 세포 표면 상에서 발현된 CD22인, 인간 CD22에 결합할 수 있는 항체("항-CD22 항체")가 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 CD22(예를 들어, 세포-표면 CD22)에 대한 높은 결합 친화성, 높은 안정성을 나타내고/내거나, 당업계에 공지된 완전 인간 항-CD22인 M971 같은 상이한 CD22 에피토프에 결합한다.
CD22는 주로 성숙한 B 세포 표면 상에서 발현되는 막관통 당단백질이다. 이 세포 표면 수용체는 수용체의 N-말단에 위치한 면역글로불린(Ig) 도메인을 통해 시알산에 특이적으로 결합한다. CD22는 BCR에 의해 매개되는 신호 전달 경로에 대한 억제성 수용체로 기능한다. 다양한 종으로부터의 CD22 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 인간 CD22의 아미노산 서열은 유전자은행 수탁 번호 NP_001762.2 하에서 발견될 수 있다.
CD22는 악성 B 세포 상에 존재하고 따라서 조혈암, 특히 B 세포 기원의 조혈암, 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병(ALL), B-세포 비-호지킨 림프종(NHL) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 치료하기 위한 유망한 표적이다. CD22는 또한 자가면역에 관여하므로 자가면역 질환을 치료하기 위한 표적이 될 것이다.
따라서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 CD22+ 질환 세포를 갖는 질환, 예를 들어 B-세포 계통의 암 또는 CD22+ 자가-반응성 면역 세포에 의해 매개되는 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료제로서 작용할 수 있다. 부가하여, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 CD22, 예를 들어, CD22-양성 세포의 존재를 검출하기 위한 진단제로서 작용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 항체는 또한 연구 목적으로 사용될 수 있다.
I.
CD22에 결합하는 항체
본 개시내용은 CD22, 예를 들어 인간 CD22에 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 세포 표면 상에 발현된 CD22에 결합할 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에 개시된 항체는 CD22-양성 세포(예를 들어, 백혈병 세포)를 표적화하기 위한 치료적 또는 진단적 목적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "항-CD22 항체"는 CD22 폴리펩티드(예를 들어, 세포 표면 상에 발현된 CD22 폴리펩티드)에 결합할 수 있는 임의의 항체를 지칭하며, 이는 적합한 공급원, 예를 들어 인간 또는 비-인간 포유류(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 영장류 예컨대 원숭이 등)의 것일 수 있다.
항체(복수형으로 상호교환적으로 사용됨)는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통하여 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적 결합을 할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세서에 사용된 용어 "항체", 예를 들어 항-CD22 항체는 온전한(예를 들어, 전장) 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라 그의 항원-결합 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일-사슬 항체(scFv), 항체 부분(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 CAR)을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 디아바디, 단일 도메인 항체(예를 들어, 나노바디와 같은 VH 단독 항체), 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체를 포함하는 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포괄한다. 항체, 예를 들어 항-갈렉틴-9 항체는 IgD, IgE, IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이의 하위-부류)과 같은 임의의 부류의 항체를 포함하고, 항체는 임의의 특정 부류일 필요는 없다. 그 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라 면역글로불린은 다른 부류로 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류인: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 몇 가지는 하위부류(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분할될 수 있다. 면역글로불린의 다른 부류에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 입실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3-차원 배열은 잘 알려져 있다.
전형적인 항체 분자는 일반적으로 항원 결합에 관여되는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역"("FR")으로 알려진 더 보존된 영역이 산재되어 있는, "상보성 결정 영역"("CDR")으로도 알려진 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는, 예를 들어, Kabat 정의, Chothia 정의, AbM 정의 및/또는 접촉 정의에 의해 당업계에 공지된 방법론을 사용하여 정확하게 식별될 수 있으며, 이들 모두는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Kabat, E.A., 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Chothia 등, (1989) Nature 342:877; Chothia, C. 등 (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; 및 Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004) 참고. 또한 hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs 참고).
본 명세서에 기재된 항-CD22 항체는 각각 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하는 전장 항체일 수 있다. 대안적으로, 항-CD22 항체는 전장 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 전장 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 기능성을 유지하는 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 그것은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 단일 사슬 Fv(scFv)로 알려진 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참고.
본 명세서에 기재된 항체는 적합한 기원, 예를 들어 뮤어라인, 랫트 또는 인간의 것일 수 있다. 이러한 항체는 비-천연으로 발생하고, 즉 인간의 행동 없이는 동물에서 생산되지 않을 것이다(예를 들어, 이러한 동물을 원하는 항원 또는 이의 단편으로 면역화하거나 항체 라이브러리로부터 단리). 본 명세서에 기재된 임의의 항체, 예를 들어 항-CD22 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. "모노클로날 항체"는 균질한 항체 모집단을 지칭하고 "폴리클로날 항체"는 이종 항체 모집단을 지칭한다. 이들 두 용어는 항체의 출처나 그것이 만들어지는 방식을 제한하지 않는다.
일부 실시형태에서, 항-CD22 항체는 인간 항체 라이브러리로부터 단리되거나 이식유전자 마우스에서 생성될 수 있는 인간 항체이다. 예를 들어, 완전한 인간 항체는 특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 이용가능한 마우스를 사용하여 획득될 수 있다. 보다 바람직한(예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 보다 강력한 면역 반응을 생성하도록 설계된 이식유전자 동물은 또한 인간화된 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 Amgen, Inc.(캘리포니아주 프리몬트 소재)로부터의 Xenomouse™ 및 Medarex, Inc.(뉴저지주 프린스턴 소재)로부터의 HuMAb-Mouse™ 및 TC Mouse™이다. 또 다른 대안에서, 항체는 파지 디스플레이 또는 효모 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 Winter 등, (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 참고. 대안적으로, 당업계에 공지된 파지, 효모 디스플레이, 포유류 세포 디스플레이, 또는 mRNA 디스플레이 기술과 같은 항체 라이브러리 디스플레이 기술을 사용하여 면역되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성할 수 있다.
다른 실시형태에서, 항-CD22 항체는 인간화된 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 특이적 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이의 항원-결합 단편인 비-인간(예를 들어, 뮤어라인) 항체의 형태를 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용체 항체)으로서, 수용체의 CDR로부터 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 하나 이상의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수용체 항체나 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열 중 어느 것에서도 발견되지 않지만 추가로 정제하고 항체 성능을 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것 중 적어도 일부를 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 다른 형태의 인간화된 항체는 원래 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)을 가지며, 이는 또한 원래의 항체로부터 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로 지칭된다. 인간화된 항체는 또한 친화성 성숙을 수반할 수 있다. 인간화된 항체를 구축하는 방법은 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Queen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989) 참고.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 키메라 항체일 수 있다. 키메라 항체는 제1 종으로부터의 가변 영역 또는 가변 영역의 일부 및 제2 종으로부터의 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이들 키메라 항체에서 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 한 종의 포유류(예를 들어, 마우스, 토끼 및 랫트와 같은 비-인간 포유류)에서 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 인간과 같은 다른 포유류로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 변형은 가변 영역 및/또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다. "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Morrison 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger 등 (1984) Nature 312, 604; 및 Takeda 등 (1984) Nature 314:452 참고.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD22 항체는 상응하는 표적 항원(예를 들어, CD22) 또는 그의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 당업계에서 잘 이해되는 용어이다. 분자가 대체 표적과의 것보다 특정 표적 항원과 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 지속시간 및/또는 더 큰 친화성으로 반응하는 경우 분자는 "특이적 결합"을 나타낸다고 한다. 항체가 다른 기질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 친화력, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속시간으로 결합하는 경우 항체는 표적 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합한다". 예를 들어, 항원(CD22) 또는 그 안의 항원성 에피토프에 특이적으로 (또는 우선적으로) 결합하는 항체는 이 표적 항원이 다른 항원 또는 동일한 항원에 있는 다른 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 친화력으로, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속시간으로 이 표적 항원을 결합하는 항체이다. 예를 들어, 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 표적 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있다는 것이 이 정의로 또한 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"이 반드시 (그것을 포함할 수는 있지만) 배타적 결합을 필요로 하는 것은 아니다. 일부 예에서, 표적 항원 또는 그의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 다른 항원 또는 동일한 항원에서 다른 에피토프에 결합하지 않을 수 있다(즉, 기준선 결합 활성만이 통상적인 방법에서 검출될 수 있음). 일부 예에서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 FMC63과 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 다른 예에서, 항-CD22 항체는 M971이 결합하는 CD22 에피토프와 중첩되지 않는 CD22 에피토프에 결합한다. M971의 VH 및 VL 서열은 당업계에 잘 알려져 있고 하기에 제공되어 있다(굵은체의 CDR):
M971-VH (서열번호:1):
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M971-VL (서열번호:2):
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일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD22 항체는 표적 항원(예를 들어, CD22) 또는 그의 항원성 에피토프에 대해 적합한 결합 친화성을 갖는다. 본 명세서에 사용된 "결합 친화성"는 겉보기 연합 상수 또는 KA를 지칭한다. KA는 해리 상수(KD)의 역수이다. 본 명세서에 기재된 항-CD22 항체는 CD22에 대해 적어도 100nM, 10nM, 1nM, 0.1nM 또는 미만의 결합 친화성(KD)를 가질 수 있다. 증가된 결합 친화성는 감소된 KD에 상응한다. 제2 항원에 비해 제1 항원에 대한 항체의 더 높은 친화성 결합은 제2 항원을 결합하는 것에 대한 KA(또는 수치 KD)보다 제1 항원을 결합하는 것에 대한 더 높은 KA(또는 더 작은 수치 KD)로 표시될 수 있다. 이러한 경우에, 항체는 제2 항원(예를 들어, 제2 형태에서의 동일한 제1 단백질 또는 그의 유사체; 또는 제2 단백질)에 비해 제1 항원(예를 들어, 제1 형태에서의 동일한 제1 단백질 또는 그의 유사체)에 대해 특이성을 가진다. 결합 친화성에서 차이(예를 들어, 특이성 또는 기타 비교 경우)는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 90, 100, 500, 1000, 10,000 또는 105배일 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 항-CD22 항체는 표적 항원 또는 그의 항원성 에피토프에 대한 항체의 결합 친화성를 증가시키기 위해 추가로 친화성 성숙될 수 있다.
결합 친화성(또는 결합 특이성)은 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 또는 분광법(예를 들어, 형광 검정 사용)을 포함한 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화성을 평가하기 위한 예시적인 조건은 HBS-P 완충액(10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 0.005%(v/v) 계면활성제 P20)에 있다. 이들 기술은 표적 단백질 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 결합된 결합 단백질의 농도([바운드])는 일반적으로 다음 식에 의해 프리 표적 단백질([프리])의 농도와 관련된다.
[바운드] = [프리]/(Kd+[프리])
때로는 예를 들어 ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 사용하여 결정되고, KA에 비례하고 따라서 더 높은 친화성이 예를 들어 2-배 더 높은지 여부를 결정하는 것과 같은, 비교에 사용될 수 있는, 친화성의 정량적 측정을 얻는 것, 친화성의 정성적 측정을 얻는 것, 또는 예를 들어 기능적 검정, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 검정에서의 활성에 의해 친화성의 추론을 얻는 것이 충분하기 때문에, KA를 정확히 결정하는 것이 항상 필요하지는 않다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 CD22-양성 세포에 대한 결합에 대해 10nM 미만, 예를 들어, < 1nM, < 0.5nM, 또는 0.1nM 미만의 EC50 값을 갖는다. 본 명세서에 사용된 EC50 값은 CD22-양성 세포 모집단에서 세포의 50%에 결합하는 데 필요한 항체의 최소 농도를 지칭한다. EC50 값은 통상적인 검정 및/또는 본 명세서에 개시된 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 아래의 실시예 참고.
다수의 예시적인 항-CD22 항체가 아래에 제공되어 있다(Chothia 접근법에 의해 결정된 굵은체에서의 CDR (Chothia 등 (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798, Tomlinson 등 (1995) EMBO J., 14, 4628-4638 및 Williams 등(1996) J. Mol. Biol., 264, 220-232). 또한 www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php 참고.
EP160-C07
V H (서열번호:3):
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EP160-F10 (단일 도메인 항체)
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EP97-A01
V H (서열번호:38)
EVQLVQSGGGVVQPGRSLKLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGWKGFDYWGQGTTVTVSS
V L (서열번호:39)
EIVLTQSPATLSVSPGEGVTLSCRASQSVSSNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASIKATDVPDRFSGGGSGTDFTLSISNLQSEDFAVYYCQQYHTWPPVTFGGGTKVEIK
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD22 항체는 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 항체(예를 들어, EP35-A7, EP35-B5, EP35-C6, EP35-C8, EP35-D6, EP35-E6, EP35-E7, EP97-A01, EP97-A10, EP97-B03, EP97-F01, EP97-G05, EP160-C07, EP160-D02, EP160-E03, EP160-F04, EP160-F10, EP160-G04, EP160-G05, EP160-H02, 및 EP97-A01)와 동일한 CD22 폴리펩티드의 에피토프에 결합하거나 CD22 항원에 대한 결합으로부터 예시적인 항체에 대해 경쟁한다. 일부 예에서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 EP160-D02와 동일한 CD22 폴리펩티드의 에피토프에 결합하거나 CD22 항원에 대한 결합으로부터 예시적인 항체에 대해 경쟁한다. 다른 예에서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 EP97-B03과 동일한 CD22 폴리펩티드의 에피토프에 결합하거나 CD22 항원에 대한 결합으로부터 예시적인 항체에 대해 경쟁한다
"에피토프"는 항체에 의해 인식되고 결합되는 표적 항원 상의 부위를 지칭한다. 부위는 완전히 아미노산 성분으로 구성되거나, 단백질의 아미노산(예를 들어, 글리코실 모이어티)의 화학적 변형으로 완전히 구성되거나, 이의 조합으로 구성될 수 있다. 중첩하는 에피토프는 적어도 하나의 공통 아미노산 잔기를 포함한다. 에피토프는 전형적으로 길이가 6-15개 아미노산인 선형일 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 형태적일 수 있다. 항체가 결합하는 에피토프는 일상적인 기술, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 하기 설명 참고). 본 명세서에 기재된 예시적인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 예시적인 항체와 정확하게 동일한 에피토프 또는 실질적으로 중첩되는 에피토프(예를 들어, 3개 미만의 비-중첩하는 아미노산 잔기, 2개 미만의 비-중첩하는 아미노산 잔기, 또는 단지 1개의 비-중첩하는 아미노산 잔기 함유)에 결합할 수 있다. 2개 항체가 동족 항원에 대한 결합으로부터 서로 경쟁하는지 여부는 당업계에 잘 알려진 경쟁 검정에 의해 결정될 수 있다.
일부 예에서, 항-CD22 항체는 본 명세서에 기재된 예시적인 항체와 동일한 VH 및/또는 VL CDR을 포함한다. 동일한 VH 및/또는 VL CDR을 갖는 2개의 항체는 동일한 접근법(예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은 Kabat 접근법, Chothia 접근법, AbM 접근법, 접촉 접근법 또는 IMGT 접근법. 예를 들어, bioinf.org.uk/abs/ 참고)에 의해 결정될 때 동일하다. 이러한 항-CD22 항체는 본 명세서에 기재된 예시적인 항체와 비교하여 동일한 VH, 동일한 VL, 또는 둘 모두를 가질 수 있다.
또한 본 개시내용의 범주 내에 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 예시적인 항-CD22 항체의 기능적 변이체가 있다(예를 들어, EP160-D2 또는 EP97-B03). 이러한 기능적 변이체는 구조적으로 및 기능적으로 모두 예시적인 항체에 실질적으로 유사하다. 기능적 변이체는 예시적인 항체와 실질적으로 동일한 VH 및 VL CDR을 포함한다. 예를 들어, 그것은 항체의 총 CDR 영역에서 최대 8개(예를 들어, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1)의 아미노산 잔기 변이만을 포함할 수 있고 CD22의 동일한 에피토프에 실질적으로 유사한 친화성(예를 들어, 동일한 정도의 KD 값을 가짐)으로 결합한다. 일부 예에서, 기능적 변이체는 예시적인 항체와 동일한 중쇄 CDR3, 및 선택적으로 예시적인 항체와 동일한 경쇄 CDR3을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 기능적 변이체는 예시적인 항체와 동일한 중쇄 CDR2를 가질 수 있다. 이러한 항-CD22 항체는 예시적인 항체의 VH와 비교하여 중쇄 CDR1에서만 CDR 아미노산 잔기 변이를 갖는 VH 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항-CD22 항체는 예시적인 항체와 동일한 VL CDR3, 및 선택적으로 동일한 VL CDR1 또는 VL CDR2를 갖는 VL 단편을 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 아미노산 잔기 변이는 보존적 아미노산 잔기 치환일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대적 전하 또는 크기 특성을 변경하지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 이러한 방법을 편집하는 참고문헌, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, 등, eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., New York에서 발견되는 것과 같은 당업자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 다음 군 내의 아미노산 중에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
일부 실시형태에서, 항-CD22 항체는 본 명세서에 기재된 예시적인 항체의 VH CDR과 비교하여 개별적으로 또는 집합적으로 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 98%) 서열 동일성인 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-CD22 항체는 본 명세서에 기재된 예시적인 항체로 VL CDR과 비교하여 개별적으로 또는 집합적으로 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 98%) 서열 동일성인 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "개별적으로"는 항체의 하나의 CDR이 예시적인 항체의 상응하는 CDR에 대해 표시된 서열 동일성을 공유함을 의미한다. "집합적으로"는 조합된 항체의 3개의 VH 또는 VL CDR이 조합된 예시적인 항체의 상응하는 3개의 VH 또는 VL CDR에 대해 표시된 서열 동일성을 공유함을 의미한다.
두 아미노산 서열의 "퍼센트 동일성"은 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993에서와 같이 변형된, Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul, 등 J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=3으로 수행되어 관심 있는 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 2개 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997에 기술된 바와 같이 갭이 있는 BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 갭이 있는 BLAST 프로그램을 이용할 때 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 항-CD22 항체의 중쇄는 중쇄 불변 영역 (CH) 또는 그의 일부(예를 들어, CH1, CH2, CH3, 또는 그의 조합)를 추가로 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 임의의 적합한 기원, 예를 들어 인간, 마우스, 랫트 또는 토끼의 것일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-CD22 항체의 경쇄는 당업계에 공지된 임의의 CL일 수 있는 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, CL은 카파 경쇄이다. 다른 예에서, CL은 람다 경쇄이다. 항체 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 IMGT 데이터베이스(www.imgt.org) 또는 www.vbase2.org/vbstat.php에서 제공된 것이며, 이들 둘 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD22 항체는 단쇄 항체(scFv)일 수 있다. scFv 항체는 가요성 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있는 VH 단편 및 VL 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서 scFv 항체는 VH →VL 방향(N-말단에서 C-말단으로)에 있을 수 있다. 다른 경우에, scFv 항체는 VL →VH 방향(N-말단에서 C-말단으로)에 있을 수 있다. 예시적인 scFv 항-CD22 항체는 하기에 제공된다(굵은체인 CDR 및 굵은체이고 밑줄친 펩티드 링커):
EP160-C07 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:40)
QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDAVAGSRGYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSVSPGEGVTLSCRASQSVSSNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASIKATDVPDRFSGGGSGTDFTLSISNLQSEDFAVYYCQQYHTWPPVTFGEGTKVEIK
EP160-E03 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:41)
EVQLVQSGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGWTGFDYWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSVSPGEGVTLSCRASQSVSSNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASIKATDVPDRFSGGGSGTDFTLSISNLQSEDFAVYYCQQYHTWPPVTFGGGTKVEIK
EP160-F10 (단일 사슬 항체; 서열번호:42)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFRNYGMQWVRQTPDKGLEWVAVTAHDGTVQYYVDSVKGRFTISRDNSKDTLYLQMNSLRVADTAVYYCAKEATPRAADHFDYWGQGTLGTVSS
EP97-A10 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:43)
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EP97-B03 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:44)
QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYGITWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKFQGRVTLTTDTSTSIAYMELRSLTSDDTAVYYCATGGQEDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNSWPPLTFGGGTKVEIK
EP160-D02 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:45)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDPLEPLESDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS EIVMTQSPATLSVSPGEGVTLSCRASQSVSSNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASIKATDVPDRFSGGGSGTDFSLSITNLQSEDFAVYYCQQYHTWPPVTFGGGTKVEIK
EP160-G04 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:46)
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EP160-H02 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:47)
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EP160-G05 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:48)
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EP35-F7 (EP97-A01에 동일, (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:49)
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EP35-C6 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:50)
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EP35-A7 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:51)
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EP35-D6 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:52)
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EP35-E6 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:53)
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EP35-C8 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:54)
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EP160-F04 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:55)
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EP35-B05 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:56)
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EP97-G05 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:57)
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EP97-F01 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:58)
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EP97-A01 (scFv, VH-VL 방향; 서열번호:59)
EVQLVQSGGGVVQPGRSLKLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGWKGFDYWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSVSPGEGVTLSCRASQSVSSNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASIKATDVPDRFSGGGSGTDFTLSISNLQSEDFAVYYCQQYHTWPPVTFGGGTKVEIK
본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 항-CD22 항체, 예를 들어 EP160-D2 또는 EP97-B03과 같은 여기에 제공된 예시적인 항-CD22 항체는 CD22-양성 세포(예를 들어, B 세포)의 활성을 결합 및 억제(예를 들어, 감소 또는 제거)할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD22 항체는 적어도 30%(예를 들어, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과로, 그 안의 임의의 증분을 포함함)까지 CD22-양성 세포의 활성을 결합 및 억제할 수 있다. 본 명세서에 기재된 항-CD22 항체의 억제 활성은 당업계에 공지된 일상적인 방법, 예를 들어 Ki, app 값을 측정하기 위한 검정에 의해 결정될 수 있다.
일부 예에서, 항체의 Ki app 값은 관련 반응의 정도에 대한 항체의 상이한 농도의 억제 효과를 측정함에 의해 결정될 수 있고; 변형된 Morrison 방정식(방정식 1)에 대한 억제제 농도의 함수로서 유사-1차 속도 상수(v)에서의 변화를 적정하는 것은 겉보기 Ki 값의 추정치를 산출한다. 경쟁 억제제의 경우 Ki app는 Ki app 대 기질 농도의 플롯의 선형 회귀 분석에서 추출된 y-절편으로부터 얻어질 수 있다.
A가 v o /E와 동등한 경우, 억제제(I)의 부재에서 효소적 반응의 초기 속도(v o )를 총 효소 농도(E)로 나눈 값이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD22 항체는 표적 항원 또는 항원 에피토프에 대해 1000, 500, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5pM 이하의 Ki app 값을 가질 수 있다.
II.
항-CD22 항체의 제조
본 명세서에 기재된 바와 같은 CD22에 결합할 수 있는 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 참고. 일부 실시형태에서, 항체는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 생산될 수 있다. 대안적으로, 항-CD22 항체는 적합한 라이브러리(예를 들어, 인간 항체 라이브러리)로부터 동정될 수 있다.
일부 경우에, 고친화성 완전 인간 CD22 결합제는 도 1에 예시된 스크리닝 전략에 따라 인간 항체 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 또한 아래 실시예 1 참고. 이 전략은 CD22 발현 세포 상의 광범위하고 활성인 에피토프를 커버하기 위해 라이브러리 다양성을 최대화하는 것을 허용한다.
원하는 경우, (예를 들어, 하이브리도마 세포주에 의해 생성되거나 항체 라이브러리로부터 단리된) 관심 있는 항체(모노클로날 또는 폴리클로날)는 시퀀싱될 수 있고 폴리뉴클레오티드 서열은 그 다음 발현 또는 증식을 위해 벡터 안으로 클로닝될 수 있다. 관심 있는 항체를 인코딩하는 서열은 숙주 세포에서 벡터에 유지될 수 있고, 숙주 세포는 그 다음 확장되어 향후 사용을 위해 동결될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 항체를 인간화하거나 항체의 친화성(친화성 성숙) 또는 다른 특성을 개선하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 비-인간 공급원으로부터 유래하고 인간에서 임상 시험 및 치료에 사용되기 위한 경우 면역 반응을 회피하기 위해 인간 불변 영역을 보다 닮도록 조작될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표적 항원에 대한 더 큰 친화성 및/또는 특이성과 CD22의 활성을 증진시키는 데 있어서 더 큰 효능을 획득하기 위해 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항체에 대해 이루어질 수 있고 여전히 표적 항원에 대한 그의 결합 특이성을 유지할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
대안적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 항원(CD22 분자)에 결합할 수 있는 항체는 일상적인 실행을 통해 적합한 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 라이브러리를 사용하여 일상적인 스크리닝 과정을 통해 표적 항원(예를 들어, 세포 표면 CD22와 같은 인간 CD22)에 결합하는 단백질을 동정할 수 있다. 선택 과정에서, 폴리펩티드 성분은 표적 항원 또는 이의 단편으로 탐침되고, 폴리펩티드 성분이 표적에 결합하는 경우, 항체 라이브러리 구성원은 전형적으로 지지체 상의 유지에 의해 동정된다. 유지된 디스플레이 라이브러리 구성원은 지지체로부터 회수되고 분석된다. 분석은 유사하거나 유사하지 않은 조건 하에서 증폭 및 후속 선택을 포함할 수 있다. 예를 들어, 긍정적인 선택과 부정적인 선택을 교대로 할 수 있다. 분석은 또한 폴리펩티드 성분의 아미노산 서열을 결정하는 것과 상세한 특성규명을 위해 폴리펩티드 성분의 정제를 포함할 수 있다.
파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 또는 포유류 디스플레이 기술을 포함하여, 본 명세서에 기재된 표적 항원에 결합할 수 있는 항체를 동정하고 단리하기 위해 당업계에 공지된 다수의 일상적인 방법이 있다.
온전한 항체(전장 항체)의 항원-결합 단편은 일상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 F(ab')2 단편의 이황화 가교를 환원시킴에 의해 생성될 수 있는 Fab 단편과, 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있다.
인간화된 항체, 키메라 항체, 단일-사슬 항체 및 이중특이적 항체와 같은 유전적으로 조작된 항체는, 예를 들어, 통상적인 재조합 기술을 통해 생산될 수 있다. 일 예에서, 표적 항원에 특이적인 모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함에 의해) 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 하나 이상의 발현 벡터 안에 배치될 수 있으며, 이것은 그런 다음 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻기 위해, 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 안으로 형질감염된다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 87/04462 참고. 그런 다음 DNA는, 예를 들어, Morrison 등, (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851인, 상동성 뮤어라인 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함에 의해, 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결함에 의해 변형될 수 있다. 그 방식에서, 표적 항원의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체와 같은 유전적으로 조작된 항체가 제조될 수 있다.
"키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Morrison 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger 등 (1984) Nature 312, 604; and Takeda 등 (1984) Nature 314:452 참고.
인간화된 항체를 구축하는 방법도 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Queen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989) 참고. 일 예에서, 모 비-인간 항체의 VH 및 VL의 가변 영역은 당업계에 공지된 방법에 따라 3-차원 분자 모델링 분석에 적용된다. 다음으로, 올바른 CDR 구조의 형성에 중요할 것으로 예상되는 프레임워크 아미노산 잔기는 동일한 분자 모델링 분석을 사용하여 동정된다. 병행하여, 모 비-인간 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 갖는 인간 VH 및 VL 사슬은 검색 질의로서 모 VH 및 VL 서열을 사용하여 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 동정된다. 그런 다음 인간 VH 및 VL 수용체 유전자가 선택된다.
선택된 인간 수용체 유전자 내의 CDR 영역은 모 비-인간 항체 또는 그의 기능적 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요한 경우, CDR 영역과의 상호작용에서 중요할 것으로 예상되는 모 사슬의 프레임워크 영역 내의 잔기(상기 설명 참고)는 인간 수용체 유전자에서 상응하는 잔기를 대체하는 데 사용될 수 있다.
단일-사슬 항체는 중쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 경쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 연결함에 의해 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 가요성 링커는 2개의 가변 영역 사이에 통합된다. 대안적으로, 단일 사슬 항체의 생산에 대해 기술된 기술(미국 특허 번호 4,946,778 및 4,704,692)은 파지-디스플레이, 효모-디스플레이, 포유류 세포-디스플레이, 또는 mRNA-디스플레이 scFv 라이브러리를 생산하도록 조정될 수 있고 CD22에 특이적인 scFv 클론은 일상적인 절차에 따라 라이브러리로부터 동정될 수 있다. 양성 클론은 CD22 활성을 증진시키는 클론을 동정하기 위해 추가 스크리닝을 받을 수 있다.
당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 방법에 따라 수득된 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 항원이 결합하는 에피토프 또는 "에피토프 매핑"을 동정하는 것이다. 예를 들어, Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999의 11장에 설명된 바와 같이 항체-항원 복합체의 결정 구조 해결, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 검정 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함한 단백질 상의 에피토프의 위치를 매핑하고 특성화하기 위한 당업계에 공지된 많은 방법이 있다. 추가 예에서, 에피토프 매핑을 사용하여 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 단일 스트레치의 아미노산에 함유될 수 있거나, 단일 스트레치에 반드시 함유될 필요는 없을 수 있는 아미노산의 3-차원 상호작용에 의해 형성된 형태적 에피토프(1차 구조 선형 서열)일 수 있다. 다양한 길이(예를 들어, 적어도 4-6개 아미노산 길이)의 펩티드가 단리되거나 (예를 들어, 재조합적으로) 합성될 수 있고 항체와의 결합 검정에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 표적 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하고 항체에 의한 결합을 결정함에 의해 체계적인 스크리닝에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, 표적 항원을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 무작위로 또는 특정 유전자 구성에 의해 단편화되고 항원의 발현된 단편과 시험되는 항체와의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은 예를 들어, PCR에 의해 생성될 수 있고 그 다음 방사성 아미노산의 존재에서 시험관내에서 단백질로 전사되고 번역될 수 있다. 방사성활성으로 표지된 항원 단편에 대한 항체의 결합이 그 다음 면역침강 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파지 입자의 표면 상에 디스플레이되는 무작위 펩티드 서열의 큰 라이브러리(파지 라이브러리)를 사용하여 동정될 수 있다.
대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 정의된 라이브러리는 단순 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 에피토프 결합에 필요한, 충분한, 및/또는 필수적인 잔기를 동정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 도메인 스와핑 실험은 CD22의 다양한 단편이 밀접하게 관련되어 있지만 항원적으로 구별되는 단백질(예컨대, 종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 또 다른 구성원)로부터의 서열로 대체(스와핑)된 표적 항원의 돌연변이체를 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이체 CD22에 대한 항체의 결합을 평가함에 의해, 항체 결합에 대한 특정 항원 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
대안적으로, 경쟁 검정은 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 동일한 항원에 결합하는 것으로 알려진 다른 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 경쟁 검정은 당업자에게 잘 알려져 있다.
일부 예에서, 항-CD22 항체는 하기에 예시된 바와 같은 재조합 기술에 의해 제조된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD22 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은 하나의 발현 벡터 안으로 클로닝될 수 있고, 각각의 뉴클레오티드 서열은 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일 예에서, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 각각은 별개의 프롬터에 작동가능하게 연결되어 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 중쇄 및 경쇄 둘 모두가 동일한 프로모터로부터 발현되도록 단일 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 필요한 경우 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 중쇄 및 경쇄 인코딩 서열 사이에 삽입될 수 있다.
일부 예에서, 항체의 2개 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이한 세포 안으로 도입될 수 있는 2개 벡터 안으로 클로닝된다. 2개 사슬이 상이한 세포에서 발현되는 경우, 이들 각각은 이를 발현하는 숙주 세포로부터 단리될 수 있고, 단리된 중쇄 및 경쇄는 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 혼합되고 인큐베이션될 수 있다.
일반적으로, 항체의 하나 또는 모든 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 적합한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 적합한 발현 벡터 안으로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 및 벡터는 서로 쌍을 이루고 리가아제로 함께 연결될 수 있는 각 분자 상에 상보적 말단을 생성하기 위해 적절한 조건 하에서 제한 효소와 접촉될 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 유전자의 말단에 결찰될 수 있다. 이들 합성 링커는 벡터에서 특정 제한 부위에 해당하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 벡터/프로모터의 선택은 항체를 생산하는데 사용하기 위한 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이다.
사이토메갈로바이러스(CMV) 개재 초기 프로모터, 바이러스 LTR 예컨대 로우스 사르코마 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 대장균 lac UV5 프로모터, 및 단순 포진 tk 바이러스 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 프로모터가 본 명세서에 기재된 항체의 발현에 사용될 수 있다.
조절 가능한 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이러한 조절가능한 프로모터는 lac 오퍼레이터-담지 포유류 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하기 위한 전사 조절제로서 대장균으로부터의 lac 리프레서를 사용하는 것들[Brown, M. 등, Cell, 49:603-612 (1987)], 테트라사이클린 리프레서(tetR)을 사용하는 것들[Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. 등, Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]을 포함한다. 다른 시스템은 FK506 이량체, 아스트라디올을 사용하는 VP16 또는 p65, RU486, 디페놀 무리슬레론 또는 라파마이신을 포함한다. 유도가능한 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad로부터 이용가능하다.
오페론과 함께 리프레서를 포함하는 조절가능한 프로모터가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 대장균으로부터의 lac 리프레서는 테트라사이클린 리프레서(tetR)와 전사 활성자(VP 16)를 조합한 lac 오퍼레이터-담지 포유류 세포 프로모터[M. Brown 등, Cell, 49:603-612 (1987); Gossen and Bujard (1992); M. Gossen 등, Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]로부터의 전사를 조절하기 위한 전사 조절자로서 기능할 수 있어 tetR-포유류 세포 전사 활성자 융합 단백질인, tTa(tetR-VP 16)를 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 주요 즉시-초기 프로모터로부터 유래된 tetO-담지 최소 프로모터로 생성하고 포유류 세포에서 유전자 발현을 제어하기 위한 tetR-tet 오퍼레이터 시스템을 생성한다. 일 실시형태에서, 테트라사이클린 유도가능한 스위치가 사용된다. tetR-포유류 세포 전사 인자 융합 유도체보다 테트라사이클린 리프레서(tetR) 단독은 테트라사이클린 오퍼레이터가 CMVIE 프로모터의 TATA 요소에 대해 하류에 적절히 위치될 때 포유류 세포에서 유전자 발현을 조절하는 강력한 전사-조절자로서 기능할 수 있다(Yao 등, Human Gene Therapy, 10(16):1392-1399 (2003)). 이 테트라사이클린 유도가능한 스위치의 한 가지 특별한 이점은, 일부 경우에 그의 조절가능한 효과를 달성하기 위해, 세포에 대해 독성일 수 있는(Gossen 등, Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)) 테트라사이클린 리프레서-포유류 세포 전사활성자 또는 리프레서 융합 단백질의 사용을 필요로 하지 않는다는 점이다.
추가로, 벡터는 예를 들어 다음 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다: 포유류 세포에서 안정하거나 일시적인 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자와 같은 선택가능한 마커 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 즉시 초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터 전사 종결 및 RNA 처리 신호; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제 기점 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위(IRES), 다양한 다중 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 이식유전자를 함유하는 벡터를 생성하기 위한 적합한 벡터 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 이용가능하다.
본 명세서에 기재된 방법을 실행하는데 유용한 폴리아데닐화 신호의 예는 인간 콜라겐 I 폴리아데닐화 신호, 인간 콜라겐 II 폴리아데닐화 신호, 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
임의의 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 항체를 생산하기 위해 적합한 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 숙주 세포는 항체 또는 이의 임의의 폴리펩티드 사슬의 발현에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 이러한 항체 또는 그의 폴리펩티드 사슬은 통상적인 방법, 예를 들어 친화성 정제를 통해 배양된 세포에 의해 (예를 들어, 세포 또는 배양 상청액으로부터) 회수될 수 있다. 필요한 경우, 항체의 폴리펩티드 사슬은 항체의 생산을 허용하는 적합한 기간 동안 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체를 제조하는 방법은 본 명세서에 또한 기재된 바와 같은, 항-CD22 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 인코딩하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 통상적인 방법, 예를 들어 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포(예를 들어, dhfr-CHO 세포) 안으로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체 숙주 세포는 세포 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있는 항체를 형성하는 2개 폴리펩티드 사슬의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 선택되고 배양될 수 있다. 필요한 경우, 숙주 세포로부터 회수된 2개 사슬은 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
일 예에서, 2개 재조합 발현 벡터가 제공되는데, 하나는 항-CD22 항체의 중쇄를 인코딩하고 다른 하나는 항-CD22 항체의 경쇄를 인코딩한다. 2개 재조합 발현 벡터 둘 모두는 통상적인 방법, 예를 들어 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포(예를 들어, dhfr-CHO 세포) 안으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 각각의 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체는 항체의 폴리펩티드 사슬의 발현을 허용하는 적합한 조건하에서 선택되고 배양될 수 있다. 2개 발현 벡터가 동일한 숙주 세포 안으로 도입되는 경우, 그 안에서 생산된 항체는 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우, 폴리펩티드 사슬은 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있고 그 다음 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 2개 발현 벡터가 상이한 숙주 세포 안으로 도입되는 경우, 그들 각각은 상응하는 숙주 세포 또는 상응하는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 2개 폴리펩티드 사슬은 그 다음 항체의 형성에 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술이 재조합 발현 벡터를 준비하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체의 회수를 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 커플링된 매트릭스를 갖는 친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD22 항체의 중쇄, 경쇄, 또는 둘 모두를 인코딩하는 임의의 핵산, 이러한 것을 함유하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터); 및 벡터를 포함하는 숙주 세포는 본 개시내용의 범주 내에 있다.
III.
항-CD22 항체의 응용
본 명세서에 개시된 임의의 항-CD22 항체는 치료, 진단 및/또는 연구 목적을 위해 사용될 수 있으며, 이들 모두는 본 개시내용의 범주 내에 있다.
약학적 조성물
항체, 뿐만 아니라 인코딩 핵산 또는 핵산 세트, 그러한 것을 포함하는 벡터, 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포는, 본 명세서에 기재된 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체(부형제)와 혼합되어 표적 질환을 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물을 형성할 수 있다. "허용가능한"은 담체가 조성물의 활성 성분과 양립가능해야 하고 (바람직하게는 활성 성분을 안정화할 수 있어야 함) 치료되어 지는 대상체에게 유해하지 않아야 함을 의미한다. 완충액을 포함하는 약학적으로 허용가능한 부형제(담체)는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover 참고.
본 발명의 방법에 사용되는 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 포함할 수 있다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수령체에게 무독성이고 인산염, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노오스 또는 덱스트란을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본 명세서에 기술된 약학적 조성물은 Epstein, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있는 항체(또는 인코딩 핵산)를 함유하는 리포솜을 포함한다. 순환 시간이 향상된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 정의된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경의 리포솜을 생성한다.
항체 또는 인코딩 핵산(들)은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)를 참고한다.
다른 예에서, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 서방성 형식으로 제형화될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 된다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐 알코올)), 폴리락티드(미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 약학적 조성물은 멸균되어야 한다. 이것은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘로 관통할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 배치된다.
본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여를 위한 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제와 같은 단위 투여 형태일 수 있다.
정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 약학적 담체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트 또는 검과 같은 통상적인 정제 성분, 및 다른 약학적 희석제, 예를 들면, 물과 혼합되어 본 발명의 화합물 또는 이의 비-독성 약학적으로 허용가능한 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성할 수 있다. 이들 예비제형 조성물을 균질한 것으로 언급하는 경우, 활성 성분이 조성물 전체에 고르게 분산되어 조성물이 정제, 환제 및 캡슐과 같은 동등하게 효과적인 단위 투여 형태로 용이하게 세분될 수 있음을 의미한다. 이 고체 예비제형 조성물은 그 다음 0.1 내지 약 500mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분화된다. 신규 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나 달리 배합되어 장기간 작용의 이점을 부여하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여량 및 외부 투여량 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자 위에 엔벨로프의 형태로 된다. 두 성분은 위에서 분해에 저항하고 내부 성분이 그대로 십이지장 안으로 통과하게 하거나 방출이 지연되도록 작용하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다수의 중합체성 산 및 셀락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질과 중합체성 산의 혼합물을 포함하는 물질 같은, 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있다.
적합한 계면-활성제는 특히 폴리옥시에틸렌소르비탄(예를 들어, Tween™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 기타 소르비탄(예를 들어, Span™ 20, 40, 60, 80 또는 85)과 같은 비-이온성 제제를 포함한다. 계면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5%의 계면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요한 경우 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 기타 약학적으로 허용가능한 비히클이 첨가될 수 있음이 이해될 것이다.
적합한 에멀젼은 Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ 및 Lipiphysan™과 같은 상업적으로 이용가능한 지방 에멀젼을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나 대안적으로 오일(예를 들어, 대두유, 홍화유, 면실유, 참깨유, 옥수수유 또는 아몬드유) 및 인지질(예를 들어, 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴)과 혼합시 형성된 에멀젼 및 물에 용해될 수 있다. 에멀젼의 장성을 조정하기 위해 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있음을 이해할 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20%의 오일, 예를 들어 5 내지 20%를 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0μm, 특히 0.1 내지 0.5μm의 지방 방울을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0의 범위인 pH를 갖는다.
에멀젼 조성물은 항체를 Intralipid™ 또는 이의 성분(대두유, 계란 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하여 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 통기용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 수성 또는 유기 용매, 또는 이의 혼합물, 및 분말에 용액 및 현탁액을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같은 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 구강 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.
바람직하게는 멸균된 약학적으로 허용가능한 용매 내 조성물은 기체를 사용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나 분무 장치가 안면 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.
치료적 응용
본 명세서에 개시된 방법을 실행하기 위해, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물의 유효량은, 예를 들어, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절-내, 활막내, 척추강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 일정 기간에 걸쳐 연속 주입에 의하거나 큰 환약으로, 정맥내 투여와 같은 적절한 경로를 통해 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 포함하여, 액체 제형에 대해 상업적으로 이용가능한 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제형은 직접적으로 분무될 수 있고 동결건조된 분말은 재구성 후 분무될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는 플루오로카본 제형 및 정량 흡입기를 사용하여 에어로졸화되거나 동결건조되고 밀링된 분말로서 흡입될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 치료되는 대상체는 포유류, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유류는 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 랫트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 CD22+ 질환 세포를 보유하는 것을 특징으로 하는 표적 질환/장애를 갖거나 가질 위험이 있거나 가질 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 이러한 표적 질환/장애의 예는 조혈암, 예를 들어 B 세포 계통의 암을 포함한다. 예는 림프구성 백혈병, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하는 혈액학적 B 세포 신생물; B-세포 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및 B-세포 비-호지킨 림프종(NHL)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, CD22+ 질환 세포는 자가항원에 특이적인 면역 세포(예를 들어, B 세포)일 수 있다.
표적 암이 있는 대상체는 일상적인 의료 검사, 예를 들어 실험실 검사, 장기 기능 검사, CT 스캔 또는 초음파에 의해 동정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 치료되는 대상체는 항암 요법, 예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법 또는 수술을 받았거나 받고 있는 인간 암 환자일 수 있다.
표적 자가면역 질환을 갖는 대상체는 또한 일상적인 의료 검사에 의해 동정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 치료되는 대상체는 자가면역 질환을 갖는 인간 환자일 수 있다. 이러한 인간 환자는 자가면역 질환에 대한 치료를 받았거나 받고 있을 수 있다.
임의의 그러한 표적 질환/장애를 갖는 것으로 의심되는 대상체는 질환/장애의 하나 이상의 증상을 보일 수 있다. 질환/장애에 대한 위험이 있는 대상체는 그 질환/장애에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 대상체일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여 대상체에 치료적 효과를 부여하는 데 필요한 각 활성제의 양을 지칭한다. 항체의 양이 치료적 효과를 달성했는지 여부의 결정은 당업자에게 자명할 것이다. 유효량은 치료되는 특정 병태, 병태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 매개변수, 치료의 기간, 병행 요법의 특성(있는 경우), 특정 투여의 경로 및 의료 종사자의 지식 및 전문지식 내에서 유사한 요인에 의존하여 당업자에 의해 인지되는 바와 같이 다양하다. 이들 요인은 당업자에게 잘 알려져 있으며 일상적인 실험으로 해결될 수 있다. 일반적으로 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉 건전한 의학적 판단에 따른 가장 안전한 용량을 사용하는 것이 바람직하다.
반감기와 같은 경험적 고려 사항은 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체와 같은 인간 면역계와 양립할 수 있는 항체를 사용하여 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여의 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있고, 일반적으로 반드시 그런 것은 아니지만 표적 질환/장애의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연을 기반으로 한다. 대안적으로, 항체의 지속된 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.
일 예에서, 본 명세서에 기술된 항체에 대한 투여량은 항체의 1회 이상의 투여(들)를 받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체에게 작용제의 증분 용량이 제공된다. 작용제의 효능을 평가하기 위해 질환/장애의 지표가 따를 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 임의의 항체의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 약 2mg/kg일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 1일 투여량은 상기에 언급한 요인에 따라 약 0.1μg/kg 내지 3μg/kg 내지 30μg/kg 내지 300μg/kg 내지 3mg/kg, 내지 30mg/kg 내지 100mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 병태에 따라, 원하는 증상의 억제가 발생할 때까지 또는 표적 질환 또는 장애 또는 그의 증상을 완화시키기에 충분한 치료적 수준이 달성될 때까지 치료는 지속된다. 예시적인 투여 요법은 약 2mg/kg의 초기 용량을 투여한 다음, 항체의 약 1mg/kg의 매주 유지 용량을 투여하거나, 격주로 약 1mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 의사가 달성하고자 하는 약동학적 쇠약의 패턴에 따라 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 일주일에 1-4회 투여가 고려된다. 일부 실시형태에서, 약 3μg/mg 내지 약 2mg/kg(예컨대 약 3μg/mg, 약 10μg/mg, 약 30μg/mg, 약 100μg/mg, 약 300μg/mg, 약 1mg/kg 및 약 2mg/kg)의 범위인 투여가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 빈도는 매주, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 매월, 2개월마다 또는 3개월마다 또는 그 이상마다 1회이다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다. 투여 요법(사용된 항체 포함)은 시간이 지남에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시형태에서, 정상 체중의 성인 환자의 경우, 약 0.3 내지 5.00mg/kg의 범위인 용량이 투여될 수 있다. 일부 예에서, 본 명세서에 기재된 항-CD22 항체의 투여량은 10mg/kg일 수 있다. 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정 개체와 그 개체의 병력뿐만 아니라 개별 제제의 특성(예컨대 약제의 반감기 및 기타 당업계에 잘 알려진 고려 사항)에 의존할 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 적절한 투여량은 사용된 특정 항체, 항체들, 및/또는 비-항체 펩티드 (또는 그의 조성물), 질환/장애의 유형 및 중증도, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되었는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 작용제에 대한 반응, 주치의의 재량에 의존할 것이다. 전형적으로 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항체를 투여할 것이다. 일부 실시형태에서, 원하는 결과는 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응에서의 증가이다. 투여량이 원하는 결과를 초래했는지 여부를 결정하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 하나 이상의 항체의 투여는 예를 들어 수령체의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적 또는 예방적인지 여부, 및 숙련된 의사에게 공지된 기타 요인에 의존하여 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 예를 들어, 표적 질환 또는 장애가 전개하기 전, 동안 또는 후에 일련의 간격을 둔 용량일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료하는"은 장애, 질환의 증상 또는 질환이나 장애에 대한 소인을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 교정, 개량, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로, 표적 질환 또는 장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환/장애에 대한 소인이 있는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
표적 질환/장애를 완화시키는 것은 질환의 전개 또는 진행을 지연시키거나 질병 중증도를 감소시키거나 생존을 연장시키는 것을 포함한다. 질환을 완화하거나 생존을 연장하는 것은 반드시 치료적 결과를 필요로 하는 것은 아니다. 여기에 사용된 바와 같이, 표적 질환 또는 장애의 전개를 "지연시키는 것"은 질환의 진행을 억제, 방해, 늦춤, 지연, 안정화 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은 질환의 병력 및/또는 치료되어 지는 개체에 따라 다양한 시간의 길이가 될 수 있다. 질환의 전개를 "지연" 또는 완화하거나 질환의 발병을 지연시키는 방법은 주어진 시간 프레임에서 질환의 하나 이상의 증상이 전개할 확률을 줄이고, 및/또는 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 줄이는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 수의 대상체를 사용한 임상 연구를 기반으로 한다.
질환의 "전개" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 뒤이은 진행을 의미한다. 질환의 전개는 당업계에 잘 알려진 표준 임상 기술을 사용하여 검출가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 전개는 또한 검출불가능할 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전개 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "전개"에는 발생, 재발 및 발병이 포함된다. 본 명세서에 사용된 표적 질환 또는 장애의 "발병" 또는 "발생"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.
치료되는 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 의약 분야에서의 통상인에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 약학적 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다. 이 조성물은 또한 다른 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있으며, 예를 들어 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 부가하여, 1-, 3- 또는 6-개월 데포 주사가능한 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하는 것과 같은 주사가능한 데포 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 약학적 조성물은 안내로 또는 유리체내로 투여된다.
주사가능한 조성물은 식물성 오일, 디메틸락타미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 다양한 담체를 함유할 수 있다. 정맥 주사의 경우, 수용성 항체는 드립 방법에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해 항체 및 생리학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 약학적 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용가능한 부형제는 예를 들어 5% 덱스트로스, 0.9% 식염수, 링거액 또는 기타 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제형은 주사용수, 0.9% 식염수 또는 5% 글루코스 용액과 같은 약학적 부형제에 용해되어 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 항체는 부위-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예는 항체 또는 국소 전달 카테터의 다양한 이식가능한 데포 소스, 예컨대 주입 카테터, 유치 카테터 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외막 랩, 션트 및 스텐트 또는 기타 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568 참고.
안티센스 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료적 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수령체-매개된 DNA 전달 기술은 예를 들어, Findeis 등, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou 등, Gene Therapeutics: Methods Andand Applications Ofof Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu 등, J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu 등, J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu 등, J. Biol. Chem. (1991) 266:338에 기술되어 있다.
폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 항체를 인코딩하는 것들)를 함유하는 치료적 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여에 대해 약 100ng 내지 약 200mg의 DNA의 범위로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 500ng 내지 약 50mg, 약 1μg 내지 약 2mg, 약 5μg 내지 약 500μg, 및 약 20μg 내지 약 100μg의 DNA 또는 그 초과의 농도 범위가 또한 유전자 요법 프로토콜 동안 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 치료적 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 또는 비-바이러스 기원의 것일 수 있다(일반적으로, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148 참고). 이러한 코딩 서열의 발현은 내인성 포유류 또는 이종 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적이거나 조절될 수 있다.
원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기반 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클은 재조합 레트로바이러스(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242 참고), 알파바이러스-기반 벡터(예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참고)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147에 기술된 바와 같은 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 이용될 수 있다.
사멸된 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다중양이온 축합 DNA(예를 들어, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 참고); 리간드-연결된 DNA(예를 들어, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985 참고); 진핵 세포 전달 비히클 세포(예를 들어, 미국 특허 번호 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참고) 및 핵산 전하 중화 또는 세포 막과의 융합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-바이러스 전달 비히클 및 방법이 또한 이용될 수 있다. 네이키드 DNA가 또한 이용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 PCT 공개 번호 WO 90/11092 및 미국 특허 번호 5,580,859에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜은 미국 특허 번호 5,422,120; PCT 공개 번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 특허 번호 0524968에 기술되어 있다. 추가 접근법은 Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411, 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581에 기술되어 있다.
본 명세서에 기술된 방법에 사용되는 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정 대상체 및 그 대상체의 병력에 의존할 것이다.
일부 실시형태에서, 하나 초과의 항체, 또는 항체 및 또 다른 적합한 치료제의 조합이 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 항체는 또한 작용제의 효과를 증진 및/또는 보완하는 역할을 하는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다.
표적 질환/장애에 대한 치료 효능은 당업계에 잘-알려진 방법에 의해 평가될 수 있다.
질환의 치료에 사용하기 위한 키트
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 조혈암과 같은 표적 질환을 치료 또는 완화하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 항-CD22 항체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 것을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항-CD22 항체는 제2 치료제와 함께-사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따른 사용 설명서를 포함할 수 있다. 포함된 설명서는 본 명세서에 기재된 것과 같은 표적 질환을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 완화시키기 위한 항-CD22 항체, 및 선택적으로 제2 치료제의 투여의 설명을 포함할 수 있다. 키트는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 진단 방법을 적용하는 것 같이, 개체가 표적 질환을 갖고 있는지 여부를 동정하는 것에 기반하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 설명서는 표적 질환의 위험이 있는 개체에게 항체를 투여하는 것의 설명을 포함한다.
항-CD22 항체의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여의 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 발명의 키트에 제공된 설명서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 작성된 설명서이지만, 기계-판독가능한 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 수반된 설명서)도 허용가능하다.
라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 암 또는 면역 장애(예를 들어, 자가면역 질환)와 같은 질환을 치료, 발병 지연 및/또는 완화에 사용된다는 것을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 실행하기 위한 설명서가 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적절한 포장으로 되어 있다. 적절한 포장에는 바이알, 병, 단지, 가요성 포장(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 백) 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 또한 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기) 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에 기재된 것과 같은 항-CD22 항체이다.
키트는 추가 구성요소 예컨대 완충액 및 설명적 정보를 선택적으로 제공할 수 있다. 정상적으로 키트는 용기와 용기 위 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발명은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반 기술
본 개시내용의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, 등, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, 등 eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, 등, eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985≫; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984≫; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986≫; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986≫; and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel 등 (eds.)과 같은 문헌에 완전하게 설명되어 있다.
더 이상의 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기반하여 본 발명을 그 최대한으로 이용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 다음의 특정 실시형태는 단지 예시적이고, 어떤 식으로든 개시내용의 나머지 부분의 제한이 아닌 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 본 명세서에 참고된 목적 또는 주제를 위해 참고로 포함된다.
실시예 1. 완전 인간 항-CD22 항체의 생성
세포-표면 인간 CD22에 대한 결합 특이성을 갖는 완전 인간 항체는 인간 항체 라이브러리로부터 다음과 같이 동정되었다.
CD22 과발현 재조합 세포주의 생성
HEK293 및 K562 세포(ATCC)를 C-말단에서 플래그 및 Myc 태그와 융합된 전장 인간 CD22를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 수반하는 pCMV6-엔트리 벡터로 형질감염시켰다. G418 약물 선택 과정은 CD22-발현 세포의 폴리클로날, 약물 내성 풀을 산출했다. 병행하여, 음성 대조군으로 사용하기 위해 빈 pCMV6-엔트리 벡터로 전달된 모 세포주를 생성했다. CD22-발현 세포를 FACS에 의해 분류하여 CD22-발현 세포의 풀을 산출하였다. 풀은 G418 약물 선택 하에서 확장되었다. 그런 다음 단일 세포 분류를 수행하고 이어서 추가 약물 선택을 수행하여 클론 세포주를 생성했다. FACS에 의해 CD22 발현에 대해 클론 주를 스크리닝하였다. CD22의 높은 발현 수준을 나타내는 세포주를 본 명세서에 개시된 바와 같은 선택, 스크리닝 및 검정에 사용하기 위해 선택하였다.
인간 항체 라이브러리로부터 항-CD22 항체에 대한 스크리닝
천연 인간 항체 라이브러리는 다중 순수 건강 공여자와 자가면역 질환 환자 공여자의 골수 MNC 및 PBMC로부터 작제되었다. VH 및 VL 도메인(VH 및 VL 라이브러리 생성) 둘 모두의 전체 면역글로불린 레퍼토리를 캡처하기 위해 RT-PCR을 수행했다. 단일-사슬 항체(scFv) 라이브러리는 그 다음 VH 및 VL 셔플링에 의해 작제되었다. 라이브러리 크기는 1012-13으로 예측된다. VH 및 scFv 라이브러리는 mRNA 디스플레이에 의한 선택을 위해 각각 항체 단편의 N-말단 및 C-말단에 대한 플래그 태그에서 시험관내 전사 및 번역 신호를 삽입하도록 추가로 변형되었다.
그 다음 mRNA 디스플레이 기술은 통상적인 실행에 따라 상기 작제된 VH 및 scFv 라이브러리로부터 CD22 결합제의 동정을 위해 사용되었다(예를 들어, US6258558B1 참고, 이의 관련 개시내용은 본 명세서에 참고된 주제 또는 목적에 대해 본 명세서에 참고로 포함된다. 간략하게, DNA 라이브러리는 먼저 mRNA 라이브러리로 전사된 다음 퓨로마이신 링커를 통한 공유 커플링에 의해 mRNA-VH 또는 scFv 융합 라이브러리로 번역된다. 그런 다음 라이브러리를 정제하고 mRNA/cDNA 융합 라이브러리로 전환한다. 융합 라이브러리를 먼저 인간 IgG(음성 선택) 또는 K562 세포로 카운터 선택하여 비-특이적 결합제를 제거하고, 이어서 단백질 G 자기 비드(라운드 1-3) 또는 CD22 과발현 재조합 K562 세포(라운드 4) 상에 포획된 재조합 CD22-Fc 융합 단백질에 대한 선택을 제거하였다. PCR 증폭에 의해 CD22 결합제가 회수되고 농후화되었다. 라운드 3에서, 농후화된 VH 라이브러리는 상기에서 언급한 순수한 VL 라이브러리와 셔플링에 의해 scFv 라이브러리로 전환되었고 3회 초과 라운드에 대해 추가로 농후화되었다. 총 4 라운드의 선택을 실행하여 도 1에 예시된 바와 같이 고도로 농후화된 항-CD22 항체 풀을 생성하였다.
농후화된 항-CD22 항체 풀은 TOP 10 적격 세포로 형질전환된, 박테리아의 원형질막주위 발현 벡터 pET22b에 클로닝되었다. 각각의 scFv 분자는 정제 및 검정 검출을 위해 C-말단 플래그 및 6xHIS 태그를 갖도록 조작되었다. TOP 10 세포로부터 클론을 풀링하고 miniprep DNA를 제조하고 이어서 발현을 위해 박테리아의 Rosetta II 균주로 형질전환했다. 단일 클론을 선정하고, 성장시키고, 발현을 위해 96 웰 플레이트에서 0.1mM IPTG로 유도하였다. 항-CD22 항체를 동정하기 위한 검정을 위해 30℃에서 16-24시간 유도 후 상청액을 수집하였다.
상청액 샘플을 샌드위치 ELISA 검정으로 평가하여 그 안에 함유된 항-CD22 scFv 항체의 존재/수준을 결정하였다. 간략하게, 96 웰 플레이트를 웰당 50μL의 총 부피인 1x PBS에서 2μg/mL의 최종 농도에서 항-HIS 태그 항체(R&D Systems)로 고정화되었다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하고 이어서 웰당 200μL의 슈퍼블록 완충액으로 1시간 동안 차단했다. 100μl의 1:10 1XPBST 희석된 상청액을 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. CD22 scFv의 발현 수준은 1시간 동안 1x PBST에서 1:5000으로 희석된, HRP-접합된 항-플래그 항체 50μL와 함께 플레이트 내의 혼합물을 인큐베이션함에 의해 검출하였다. 각 단계 사이에 플레이트를 플레이트 세정기에서 1XPBST로 3회 세정했다. 그런 다음 플레이트를 50μl의 TMB 기질로 5분 동안 현상하고 50μl의 2N 황산을 첨가하여 중단시켰다. 플레이트는 바이오텍(Biotek) 플레이트 판독기에서 OD450nm에서 판독되었고 데이터는 엑셀(Excel) 막대 그래프로 분석되었다.
CD22 결합 스크리닝 ELISA를 현상하여 개별 CD22 결합제를 동정하였다. 간략하게, 96 웰 플레이트는 웰당 50μL의 총 부피 내 1x PBS 중 2μg/mL의 최종 농도에서 인간 CD22-Fc 단백질 또는 대조군으로서 인간 Fc로 고정화되었다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하고 이어서 웰당 200μL의 슈퍼블록 완충액으로 1시간 동안 차단했다. 100μl의 상청액을 Fc 및 CD22-Fc 융합 단백질 고정화된 웰에 각각 첨가하고 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. CD22 결합은 1x PBST 내 1:5000으로 희석된 50μL의 HRP-접합된 항-플래그 항체를 추가함에 의해 검출되었다. 각 단계 사이에 플레이트를 플레이트 세정기에서 1XPBST로 3회 세정했다. 그런 다음 플레이트를 50μl의 TMB 기질로 5분 동안 현상하고 50μl의 2N 황산을 첨가하여 중단시켰다. 플레이트를 OD450nm 바이오텍 플레이트 판독기에서 판독하고 결합 및 선택성을 엑셀 막대 그래프로 분석했다.
다수의 양성 항-CD22 클론이 도 2에 예시된 바와 같이 본 명세서에 개시된 스크리닝 과정에서 동정되었다.
실시예 2. 세포 표면-발현된 CD22에 결합할 수 있는 예시적인 항-CD22 클론의 동정
대장균 세포에서 항-CD22 항체의 생산 및 정제
상기 실시예 1에 개시된 스크리닝 과정에서 동정된 VH 또는 항-CD22 scFv 항체를 발현하는 세포를 글리세롤 스톡 플레이트에서 선정하고 통기성 막이 있는 Thomson 24-웰 플레이트에서 5mL 배양물로 밤새 성장시켰다. 본 명세서의 실시예에 기술된 바와 같은 박테리아 세포는 37℃에서, 달리 특정되지 않는 한, 또한 추가된 안티폼-204의 1:5,000 희석액을 갖는, 테리픽 브로쓰 컴플릿(Terrific Broth Complete) 플러스 100μg/mL 카르베니실린과 34μg/mL 클로람페니콜에서 225RPM에서 진탕하여 성장되었다. 그 다음 밤새 스타터 배양물을 사용하여 스타터 배양물의 적절한 희석 비율에서 더 큰 배양물을 지정된 생산 배양물(예를 들어, 125mL Thomson Ultra Yield 플라스크 중 50mL 배양물, 250mL Ultra Yield Thomson 플라스크 중 100mL 배양물 또는 500mL Ultra Yield Thomson 플라스크 중 250mL 배양물)에 접종하고 OD600이 0.5-0.8 사이가 될 때까지 성장시켰다. 이 시점에서 배양물은 VH의 경우 0.5mM 및 0.1mM scFv에서 최종 농도의 IPTG로 유도되고 30℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 그런 다음 배양물을 5,000 x g에서 30분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화하고 상청액을 추가 분석을 위해 0.2μm 멸균 PES 막을 통해 필터 멸균했다.
항체 단편을 정제하기 위해, 3μl GE Ni 세파로스 엑셀 수지를 1mL의 여과된 상청액과 혼합하고 10mL 또는 20mL BioRad Econo-Pac 컬럼 상에 장입했다. 장입하기 전에 컬럼의 수지는 적어도 20 컬럼 부피(CV) 완충액 A(1xPBS, 500mM로 추가된 여분의 NaCl로 pH 7.4)로 평형을 이루었다. 필터 멸균된 상청액은 1mL/분으로 유량을 조절하거나 동일한 패킹된 수지 베드에 2회에 걸쳐 붓는 방식을 통해 중력 흐름에 의해 정제되었다. 그런 다음 컬럼을 다음 완충액으로 세정하였다: 10 CV 완충액 A, 20CV 완충액 B(1xPBS, 500mM까지 여분의 NaCl 및 30mM 이미다졸로 pH 7.4). 필요한 경우 2개의 디톡스 완충액을 사용하여 내독소를 제거했다. 250mL 발현 배양액에서 항체 단편을 정제하기 위해, 항체-결합 컬럼을 20CV 완충액 C(1xPBS 500mM까지 여분의 NaCl로 pH7.4, 1% Tx114), 20CV 완충액 D(1x PBS 500mM까지 여분의 NaCl로 pH7.4, 1% Tx100 + 0.2% TNBP) 및 40CV 완충액 E(1xPBS 500mM까지 여분의 NaCl로 pH7.4)로 세정하였다.
단백질은 총 6개의 분획(0.5CV 사전 용리, 5x 1CV 용리)에서 용리 완충액 F(1xPBS 500mM까지 여분의 NaCl, 및 500mM 이미다졸로 pH7.4)로 용리되었다. 분획을 브래드포드 검정(100ul 희석된 브래드포드 용액 + 10ul 샘플)에서 실행했다. 밝은 파란 색상을 갖는 분획을 모아 A280 확장 계수로 그 단백질 농도를 측정하였다. 정제된 항체의 순도를 분석하기 위해 SDS-PAGE 겔 검정을 수행하였다.
대부분의 경우, 정제된 항체의 열적 안정성을 측정하기 위해 Tm 이동 열 안정성 검정을 수행하였다.
FACS 분석에 의한 항-CD22 scFv 항체의 세포 표면 결합 활성
세포 표면-발현된 CD22에 대한 각각의 항-CD22 항체의 결합 EC50 값을 결정하기 위해, 각각의 정제된 scFv 단백질을 전체 배지에서 2-배 일련의 희석으로 100nM로부터 적정하였다. 희석된 샘플을 얼음 상의 96 웰 플레이트에서 CD22-발현 HEK293 세포(CD22/HEK293 세포)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1200rpm에서 회전시켜 결합되지 않은 항체를 제거했다. 그런 다음 세포를 웰당 200μL의 전체 배지로 한 번 세정했다. 샘플을 알렉사 플루오르 488-접합된 항-His 항체(2차 항체, 100μL, 1:1000 희석)와 혼합하고 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 샘플을 4℃에서 5분 동안 1200rpm으로 회전하고 웰당 200uL의 1x PBS로 두 번 세정했다. 생성된 샘플을 200uL의 1x PBS에서 재구성하고 Guava EasyCyte에서 판독했다. 알렉사 플루오르 488-양성 세포만 계산하여 분석을 수행한 다음 Prism 8.1 소프트웨어에 플롯팅했다.
이 연구에서 결정된 바와 같이 세포 표면 CD22에 결합할 수 있는 예시적인 항-CD22 클론. 도 3a-3d는 표시된 바와 같은 다양한 농도에서 다중 예시적인 항-CD22 클론의 결합 곡선을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 다수의 항-CD22 항체의 CD22/K562 세포에 대한 결합 친화성은 하기 표 1에 제공되어 있다:
[표 1]. 세포 표면 CD22에 대한 예시적인 항-CD22 항체의 결합 친화성
실시예 3. M971 및/또는 BL22로 항-CD22 분자의 에피토프 비닝
M971로 항-CD22 scFv 항체의 에피토프 비닝
에피토프 비닝 검정은 상기 실시예에 개시된 바와 같이 본 명세서에서 동정된 임의의 CD22 결합제가 CD22에 대한 결합으로부터 항-CD22 항체인 M971에 대해 경쟁할 수 있는지 여부를 연구하기 위해 수행되었다. 간략하게, CD22 과발현 재조합 K562 세포를 200nM의 본 명세서에 개시된 정제된 항-CD22 scFv 항체 또는 200nM의 정제된 항-CD22 scFv 및 20nM의 M971 IgG 항체를 함유하는 사전-혼합물로 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1200rpm에서 회전시켰다. CD22-발현 K562 세포에 대한 항-CD22 scFv의 결합 활성은 암소에서 4℃에서 30분 동안 알렉사 플루오르 647-접합된 항-His 항체(100uL, 1:1000 희석)로 포함되었다. 이렇게 형성된 혼합물을 4℃에서 5분 동안 1200rpm에서 회전시키고 웰당 200uL의 1x PBS로 두 번 세정하였다. 이렇게 수집된 세포를 200uL의 1x PBS로 재구성하고 Attune 유세포분석기 상에서 판독했다. 재조합 K562 세포를 과발현하는 CD22에 대한 200nM 항-CD22 scFv 항체의 결합 히스토그램 대 동일한 재조합 세포에 대한 20nM M971 IgG 항체와 사전-혼합된 200nM 항-CD22 scFv 항체의 결합 히스토그램을 중첩함에 의해 분석을 수행하였다. 이렇게 획득된 결과는 EP160-G04, EP97-B03, EP160-H02, EP97-A10, EP160-E03, EP160-F04, EP97-A01, EP35-C6, EP160-F10, EP160-G05, EP160-C07, EP35-E6, EP35-C8, 및 EP35-F07을 포함하여 시험된 scFv 항체의 어느 것도 세포 표면 CD22에 대한 결합으로부터 M971에 대해 경쟁한다는 것을 도시한다.
M971로 에피토프 비닝은 ELISA 검정에 의해 추가로 확인되었다. 간단히, 384-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 2μg/mL의 재조합 인간 CD22 또는 재조합 인간 Fc로 코팅했다. 그 다음 플레이트를 실온에서 1시간 동안 피어스 슈퍼블록 완충액으로 차단하였다. 200nM의 본 명세서에 개시된 바와 같은 정제된 항-CD22 scFv 항체 또는 200nM의 정제된 항-CD22 scFv 및 100nM의 M971 IgG 항체를 함유하는 사전-혼합물을 재조합 인간 Fc 또는 재조합 인간 CD22로 사전-코팅된 플레이트 안으로 장입하였다. 그 다음 플레이트를 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 25uL의 HRP-접합된 항-플래그 항체(1:5000 희석)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 암소에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 각 단계 사이에 80uL의 1x PBST로 3회 세정했다. 그 후 플레이트를 20uL의 1-단계 울트라 TMB-ELISA 기질 용액으로 5분 동안 현상하고 이어서 20uL의 2N 황산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트는 바이오텍 플레이트 판독기 상에서 OD450에서 판독되었다. 분석은 재조합 인간 CD22 단백질의 플레이트 상에서 200nM 항-CD22 scFv 항체 단독 대 100nM IgG M971 항체와 사전-혼합된 200nM 항-CD22 scFv의 결합을 비교하는 엑셀 막대 그래프 상에 그래프화함에 의해 수행되었다.
도 4에 도시된 바와 같이, 표지된 바와 같은 예시적인 항-CD22 scFv 항체 중 어느 것도 CD22에 대한 결합으로부터 M971에 대해 경쟁하지 않는다.
M971 및 BL22에 비교된 항-CD22 항체 결합 에피토프
BL22(CAT-3888로도 알려짐)는 B 세포 악성종양의 치료를 위한 치료제로 제안된 재조합 항-CD22 면역독소이고, 당업계에 공지되어 있다. BL22는 PE38로 명명된 슈도모나스 외독소 A의 끝이 절단된 형태에 융합된 마우스 항-CD22 모로클로날 항체 RFB4의 이황화 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함하는 재조합 융합 단백질이다. RFB4의 에피토프 특이성 및 조직 반응성은 Li 등, Cell Immunol. 118(1):85-99 (1989)에 보고되어 있다.
M971 및 BL22로 CD22 EP160-D02 항체 에피토프 비닝은 EP160-D02 scFv 및 CD22 과발현 재조합 K562 세포주로 FACS 분석에 의해 수행되었다. 정제된 항-CD22 scFv는 1시간 동안 얼음 상에서 각각 200nM 및 5.13nM, 1.77nM의 M971 또는 0.7nM, 0.175nM의 BL22 mAb의 사전-혼합물로부터 2배 일련의 희석을 하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1200rpm에서 회전시켰다. 항-CD22 scFv의 결합 활성은 100uL의 1:1000 희석된 이차 항체를 첨가함에 의해 항-His 알렉사 플루오르 647에 의해 검출되었고 암소에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션되었다. 샘플을 4℃에서 5분 동안 1200rpm에서 회전시키고 웰당 200uL의 1x PBS로 두 번 세정했다. 세포를 200uL의 1x PBS로 재구성하고 Attune 유세포분석기 상에서 판독했다. 분석은 M971 및 BL22 mAb의 존재 및 부재에서 CD22 과발현 재조합 K562 세포 상의 항-CD22 scFv 양성 염색 세포를 계수함에 의해 수행하였다. EC50은 Prism 8.0을 사용하여 계산되었다.
도 7a 및 7b에 도시된 바와 같이, M971 및 BL22의 존재는 CD22-발현 K562 세포에 대한 클론 EP160-D02의 결합 활성에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 이는 M971 및 BL22가 세포 표면 CD22에 대한 결합에 대해 EP160-D02와 경쟁하지 않는다는 것을 나타낸다. 달리 말하면, 결과는 EP160-D02가 M971 또는 BL22와 동일한 에피토프에 결합하지 않음을 나타낸다. 이 검정에서 측정된 EP160-D02의 EC50 및 IC50 값은 아래 표 2 및 3에 제공되어 있다.
[표 2]. M971의 존재 또는 부재에서 EP160-D02의 EC
50
값
[표 3]. BL22의 존재 또는 부재에서 EP160-D02의 IC
50
값
요약하면, 이들 에피토프 비닝 검정으로부터의 결과는 본 명세서에 보고된 예시적인 항-CD22 항체(예를 들어, EP160-D02)가 공지된 항-CD22 항체 M971 및 RFB4와 비교하여 동일한 CD22 에피토프에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 이와 같이, 본 명세서에 개시된 예시적인 항-CD22 항체는 공지된 항-CD22 항체에 비해 적어도 일부 양태에서 상이한 생물활성을 가질 것으로 예상될 것이다.
실시예 4. 항-CD22 scFv 항체의 결합 동역학
CD22에 대한 항-CD22 scFv의 결합의 동역학 분석은 Biacore T200으로 SPR 기술에 의해 검정되었다. 검정은 Biacore T200 제어 소프트웨어 버전 2.0으로 실행되었다. 각 주기에 대해 1μg/mL의 인간 CD22-Fc 융합 단백질이 단백질 G 센서 칩 상의 1xHBST 완충액에서 유동 세포 2 상에 10ul/분의 유속으로 60초 동안 캡처되었다. 2-배 일련의 희석된 HIS 태그 정제된 항-CD22 scFv를 참고 유동 세포 1 및 CD22 캡처된 유동 세포 2 둘 모두 상에 150초 동안 30ul/분의 유속으로 주입한 후 300초 동안 세정했다. 그런 다음 유동 세포를 30ul/분의 유속으로 60초 동안 글리신 pH 2로 재생했다. 96 웰 플레이트에서 항-CD22 scFv당 100-0nM로부터의 8개 농도 지점을 검정하였다. CD22 단백질에 결합하는 scFv의 동역학은 Biacore T200 평가 소프트웨어 3000으로 분석하였다. 특이적 결합 반응 단위는 CD22 포획된 유동 세포 2에서 참조 유동 세포 1에 대한 결합의 공제로부터 유도되었다. 결과는 하기 표 4에 제공되어 있다.
[표 4]. 예시적인 항-CD22 scFv 항체의 결합 동역학
실시예 5. 예시적인 항-CD22 scFv 항체의 열 안정성 평가
이 실시예에서 각 샘플과 대조군은 결과를 재현할 수 있는지 확인하기 위해 최소한 이중으로 준비했다. 각 샘플의 정확한 위치를 샘플 실행 및 분석을 위한 소프트웨어와 일치시킬 수 있도록 플레이트 맵을 엑셀에서 먼저 설계하였다.
8x까지 단백질 열 이동 염료의 새로운 희석액(1000x)을 물에 준비했다. LifeTech에 의한 MicroAmp Optical 96 웰 플레이트 또는 8 캡 스트라이프를 실험에 사용했다. 다음 시약이 열거된 순서대로 추가되었다:
1차 샘플: 5ul 단백질 열 이동 완충액,
2차 샘플: 물에 0.4mg/mL로 희석된 12.5ul 샘플,
3차 샘플: 20ul/웰의 총 부피에 대해 2.5ul 희석된 열 이동 염료 8x.
음성 대조군 샘플: 단백질이 없는 12.5ul 완충액
양성 대조군 샘플: 2.0uL 단백질 열 이동 대조군 단백질을 갖는 10.5ul 물.
열 이동 염료를 한 번 첨가하면 위 아래로 10회 피펫팅되었다. 그런 다음 플레이트 또는 스트립을 MicroAmp Optical 필름의 캡으로 밀봉하여 1분 동안 1000RPM으로 회전시켰다. 그 후, 플레이트 또는 스트립을 Thermo Fisher에 의한 Quant Studio 3 기기에 넣고 진행 방법을 다음과 같이 수행하였다.
- 1단계: 시간 2분으로 25.0°까지 100% 램프 속도
- 2단계: 시간 2분으로 99.0℃까지 1% 램프 속도.
그런 다음 QuantStudio 설계 및 분석 소프트웨어 및 단백질 열 이동 소프트웨어 1.3을 사용하여 샘플 및 후속 Tm을 분석 (및 Tm 계산)했다. 결과를 하기 표 5에 나타내었다:
[표 5]. 예시적인 항-CD22 항체의 열 이동 검정
실시예 6: 항-CD22 항체는 세포 표면 상의 내인성 CD22 및 재조합 CD22에 결합한다
EP97-G05, EP97-A10, EP160-E03, 및 EP160-H02를 포함하는 예시적인 항-CD22 scFv 항체는 FACS를 사용하여 세포 표면 상에서 발현된 내인성 CD22 및 세포 표면 상에서 발현된 재조합 CD22에 결합하는 그의 능력에 대해 시험되었다.
간략하게, 200nM의 각각의 정제된 항-CD22 scFv 항체(HIS 태그 함유)를 전체 배지에서 희석하고 얼음 상의 96 웰 플레이트에서 Daudi, Raji, CD22/HEK293, CD22/K562 및 K562 세포주로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1200rpm으로 회전시켜 결합되지 않은 scFv를 제거했다. 그런 다음 세포를 웰당 200uL의 전체 배지로 한 번 세정했다. 100uL의 희석된 이차 항체를 첨가함에 의해 항-HIS 비오틴/스트렙타비딘 알렉사® 플루오르 647로 샘플을 검출하고 암소에서 4C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 4℃에서 5분 동안 1200rpm으로 회전시키고 웰당 200uL의 1x PBS로 두 번 세정했다. 샘플을 200uL의 1x PBS로 재구성하고 Attune NxT 세포측정기 상에서 판독했다. 분석은 음성 및 표적 세포주 둘 모두 상으로 결합하는 CD22 단백질의 오버레이 히스토그램을 플롯팅한 Attune NxT 소프트웨어에 의해 수행했다. 검정에 대한 양성 및 음성(배경) 대조군으로서 항-CD22 마우스 항체 및 항-HIS 비오틴/스트렙타비딘 2차 알렉사 플루오르 647.
도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 4개 항-CD22 scFv 항체는 시험된 항체 농도에서 세포 표면 상에서 재조합 CD22를 발현하는 HEK 및 K562 세포에 결합한다. 항-CD22 scFv는 세포 표면 상에 내인성 CD22를 발현하는 Daudi 및 Raji 세포에 결합하는 것으로 또한 밝혀졌다.
더욱이, 면역조직화학(IHC) 연구를 IHC 염색 프로토콜을 사용하여 Ventana Ultra 자동화 플랫폼 상에서 수행된 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) FFPE 조직 블록으로부터의 5-mm 섹션으로 수행했다. 간략하게, 탈파라핀화 및 재수화 후, 항원 검색을 표준 CC1 항체 검색(EDTA 기반 항원 검색 완충액, pH 9.0, Cat#950-500)으로 수행했다. 조직을 염색 단계 사이에 Ventana 디스커버리 워시, Cat#905-510 및 디스커버리 반응 완충액, Cat#950-300으로 투과시키고 세정했다. 디스커버리 억제제 CM Cat#764-4307 및 비특이적 염색을 위한 IHC/ICC IHC 단백질 차단제(Invitrogen Cat# 00-4952-54) 사전처리를 염색 동안 적용했다.
인간 Fc 단편에 융합된 예시적인 항-CD22 scFv, EP97-G05를 37℃에서 60분 동안 10ug/ml의 농도에서 상기 언급된 조직 샘플로 인큐베이션하고 이어서 1/250 희석에서 항-인간 IgG FC HRP 항체로 인큐베이션하였다(Abcam Cat# ab98624). Ventana ChromapDAB 키트(Cat# 760-159)를 최종 IHC 단계에 사용했다. 모든 섹션은 헤마톡실린으로 대조염색되었고 전체 슬라이드는 Aperio AT2 스캔스코프 및 Indica labs CytoNuclear v1.6 알고리즘을 사용한 이미지 분석으로 이미지화되었다.
도 7에 도시된 바와 같이, EP97-G05는 본 명세서에 기술된 이 IHC 연구에서 CD22-양성 DLBCL 조직에 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이 항체가 질환 세포 상에 발현될 수 있는 내인성 CD22에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: 항-CD22 IgG 항체의 제조 및 특성화
(i) 항-CD22 IgG 항체의 재조합 생산
항-CD22 ScFv 항체는 일상적인 관행에 따라 IgG 형식으로 전환되었다. 간략하게, VH 및 VL 서열은 인간 IgG1k 골격의 불변 도메인에 융합되었다. 유전자는 포유류 발현을 위해 최적화된 코돈이고, 합성되고 Life Technologies에 의한 pCDNA3.4 발현 벡터에 서브클로닝되었다. 항체는 표준 프로토콜에 따라 자유형 시스템(Invitrogen)에서 ExpiHEK293-F 세포에서 일시적으로 발현되었다. 세포를 수확하기 전에 5일 동안 성장시켰다. 상층액을 원심분리에 의해 수집하고 0.2μm PES 막을 통해 여과하였다.
Fc 융합 작용제는 먼저 MabSelect PrismA 단백질 A 수지(GE Health)로 정제하였다. 단백질을 100mM Gly pH2.5 플러스 150mM NaCl로 용리하고 20mM Tris-HCl pH 8.0 플러스 300mM NaCl로 신속하게 중화시켰다.
그런 다음 항체를 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼으로 추가 정제했다. 단량체 피크 분획을 모으고 농축하였다. 최종 정제된 단백질은 10EU/mg 미만의 내독소를 가지고 1xPBS 완충액에 보관되었다.
(ii) 항-CD22 IgG 항체 세포 결합 활성
CD22 과발현 재조합 세포주에 대한 항-CD22 IgG의 EC50을 FACS 결합 검정에 의해 결정하였다. 정제된 IgG는 12배를 위해 전체 배지에서 2-배 일련의 희석을 하였다. 희석된 IgG를 얼음 상에서 96 웰 플레이트에서 웰당 100,000개 CD22 K562 세포로 1시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1200rpm에서 회전시켜 결합되지 않은 항체를 제거했다. 그런 다음 세포를 웰당 200uL의 전체 배지로 한 번 세정했다. BL22는 항-CD22 항체의 양성 대조군으로 사용되었고 CD123(CD22는 아님)을 발현하는 CHO-K1 세포는 음성 대조군으로 사용되었다.
샘플을 100uL의 1:1000 희석된 이차 항체를 첨가함에 의해 항-hFc 알렉사 플루오르 488로 검출하고 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 샘플을 4℃에서 5분 동안 1200rpm으로 회전시키고 웰당 200uL의 1x PBS로 두 번 세정했다. 샘플을 200uL의 1x PBS로 재구성하고 Guava EasyCyte 상에서 판독했다. 분석은 양성 알렉사 플루오르 488 세포만 계수함에 의해 수행한 다음 Prism 8.1 소프트웨어에 플롯팅했다.
도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, IgG 형식의 클론 EP160-D02는 세포 표면 CD22에 대한 강한 결합을 나타내었지만 세포 표면 CD123에 대한 결합은 나타내지 않았다. 예시적인 EP160-D2(IgG) 항체의 EC50 값은 하기 표 6 및 7에 제공되어 있다.
[표 6]. 세포 표면 CD22에 대한 결합의 EC
50
값
[표 7]. 세포 표면 CD123에 대한 결합의 EC
50
값
항-CD22 IgG 항체에 의한 세포 표면 CD22에 대한 결합은 또한 ELISA에 의해 결정되었고 유사한 결과가 관찰되었다. 도 8c 및 하기 표 8 참고.
[표 8]. ELISA에 의한 항-CD22 IgG 항체의 EC
50
값
(iii) 항-CD22 IgG 항체 ADCC 활성
항체-의존성 세포-매개된 세포독성으로도 지칭되는, 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)은 면역계의 이펙터 세포가 항체와 계합하여 항체가 결합하는 표적 세포를 적극적으로 용리시키는 세포-매개된 세포독성 과정의 작용기전이다.
항-CD22 IgG 항체의 ADCC 활성은 Promega ADCC Bioreporter 검정 키트로 시험되었다. 간략하게, 30,000개 CD22/HEK293 표적 세포를 백색 바닥 평평한 96 웰 검정 플레이트 상에 도말하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 항체는 ADCC 검정 완충액에서 200nM에서 3-배 일련의 희석을 하였다. 표적 세포로부터 상청액을 제거하였다. 25μL의 항체 희석액과 혼합된 25μL의 ADCC 검정 완충액을 세포의 각 웰에 첨가하였다. 이펙터 세포를 첨가하기 전에 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
이펙터 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 해동하고 25μL의 이펙터 세포를 각 표적 세포/항체 혼합물에 도말했다. 플레이트를 37C에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
다음날, 샘플을 실온에서 30분 동안 평형화한 다음 75μL의 실온 Bio-glow 시약을 첨가하고 암소에서 30분 동안 실온 진탕에서 인큐베이션하였다. Bio-glow 시약은 제조 프로토콜에 따라 준비되었다. 플레이트를 Biotek Neo2 플레이트 판독기 상에서 발광으로 판독하고 데이터를 Prism 8.0 상에 그래프로 표시했다.
이 검정으로부터 얻은 결과는 EP97-B03 및 EP160-D02를 포함하는 예시적인 항-CD22 IgG 항체가 ADCC 활성을 나타내는 반면 대조군 항체 M971은 ADCC 활성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않았음을 나타낸다. 적어도 클론 EP160-D02는 BL22에 비해 더 나은 ADCC 활성을 나타냈다. 시험된 항체의 EC50 값은 하기 표 9에 제공되어 있다:
[표 9]. ADCC 검정에서 항-CD22 항체의 EC
50
(iv) 항-CD22 IgG 항체 내재화 활성
항-CD22 항체 내재화의 동역학은 이미지-기반 형광 검정으로 결정되었다. 간략하게, 30,000개 CD22/HEK293 표적 세포를 폴리-L-리신 처리된 96 웰 흑색 바닥 플레이트 상에 도말하고 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. CD22 IgG 및 2차 항체 pHrodo를 페놀 레드가 없는 10% RPMI에서 각각 4nM 및 120nM의 최종 농도로 희석하고 암소에서 최소 5분 동안 실온에서 인큐베이션했다.
그런 다음 배지를 표적 세포에서 제거하고 100μL의 항체/2차 pHrodo 혼합물을 세포에 첨가했다. 세포는 즉시 Cytation 5 상에서 RFP 및 명시야를 사용하여 37℃에서 2시간마다 이미지화되었다. 내재화 속도는 Cytation 5 분석 소프트웨어에 의해 정량화되고 Prism 8.0에 의해 분석되었다.
도 10에 도시된 바와 같이, 클론 EP160-D02 및 EP97-B03은 비록 BL22 분자의 내재화보다 느리지만 세포의 내재화를 나타내었다. 하기 표 10을 또한 참고한다.
[표 10]. 항-CD22 IgG 항체의 국제화
기타 실시형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.
이상의 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 그 사상 및 범주를 벗어나지 않고 발명을 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 다양한 변경 및 변형을 가할 수 있다. 따라서, 다른 실시형태도 청구범위 내에 포함된다.
등가물
몇 가지 발명의 실시형태가 본 명세서에서 기술되고 예시되었지만, 당업자는 기능을 수행하고/하거나 본 명세서에 기술된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 수 있을 것이고, 이러한 변경 및/또는 변형 각각은 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 당업자는 본 명세서에 기술된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시를 의미하고 실제 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성이 특정 적용 또는 발명의 교시가 사용된 적용에 의존한다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 일상적인 것을 넘지 않는 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 특정 발명의 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시형태는 단지 예로서 제시되고 첨부된 청구범위 및 그에 상응하는 등가물의 범위 내에서 발명의 실시형태는 구체적으로 기술되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용의 발명의 실시형태는 본 명세서에 기재된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 대한 것이다. 부가하여, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 서로 일치하지 않는 경우 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법 2개 이상의 조합은 본 개시내용의 발명의 범주 내에 포함된다.
본 명세서에서 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전 정의, 참고로 포함된 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미보다 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 공개된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참고로 포함되며, 이것은 일부 경우에는 문서 전체를 포함할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본 명세서에 사용된 부정관사 "a" 및 "an"은 명백하게 반대로 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 본 명세서에 사용된 문구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소, 즉 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 다중 요소는 동일한 방식으로, 즉, 요소 중 "하나 이상"이 그렇게 결합되는 것으로 해석되어야 한다. 구체적으로 식별된 이들 요소에 관련되든 관련되지 않든 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소는 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 조합하여 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 일 실시형태에서 A만을 언급할 수 있고(선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 다른 실시형태에서, B만(선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, A와 B 둘 모두(선택적으로 다른 요소들을 포함함); 등을 언급할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본 명세서에 사용된 "또는"은 상기에서 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때 "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 적어도 하나를 포함하지만, 또한 부재 또는 요소의 목록 중 하나 초과, 그리고 선택적으로 추가의 나열되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "중 하나만" 또는 "중 정확히 하나" 또는 청구 범위에서 사용되는 경우 "구성된"과 같이 명확하게 반대로 표시된 용어만은 부재 또는 요소의 목록의 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 나타낸다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "그 중 하나", "그 중 단지 하나" 또는 "그 중 정확히 하나"와 같은 독점성 용어가 앞에 오는 경우 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 것이지만 둘 모두는 아님")을 나타내는 것으로만 해석된다. "본질적으로 구성된"은 특허청구범위에서 사용될 때 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 갖는다.
명세서 및 청구범위에서 본 명세서에 사용된, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 문구 "적어도 하나"는 요소의 목록에서 요소 중 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소 목록 내에 구체적으로 나열된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함해야 하는 것은 아니고 요소 목록에서 요소의 임의의 조합을 제외하지도 않는 것으로 이해되어야 한다. 이 정의는 또한 "적어도 하나"라는 문구가 언급하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든, 요소 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 이외의 요소가 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비-제한적인 예로서 "A 및 B 중 적어도 하나"(또는 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시형태에서, B가 존재하지 않고 (선택적으로 B 이외의 요소를 포함함) 하나 초과의 A를 선택적으로 포함하는 적어도 하나; 또 다른 실시형태에서, A가 존재하지 않고 (선택적으로 A 이외의 요소를 포함함) 하나 초과의 B를 선택적으로 포함하는 적어도 하나; 또 다른 실시형태에서, 하나 초과의 A를 선택적으로 포함하는 적어도 하나 및 하나 초과의 B를 선택적으로 포함하는 적어도 하나 (및 선택적으로 다른 요소들을 포함함); 등을 나타낼 수 있다.
또한 명확하게 반대로 표시되지 않는 한, 하나 이상의 단계 또는 행위를 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 행위가 언급된 순서로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ELPIS BIOPHARMACEUTICALS
<120> ANTI-CD22 ANTIBODIES AND USES THEREOF
<130> 112139-0013/7001WO00
<140> PCT/US2020/047479
<141> 2020-08-21
<150> 62/889,739
<151> 2019-08-21
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<170> PatentIn version 3.5
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Leu Glu Pro Leu Glu Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Ser Ile Thr Asn Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Gln Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Asn Trp Ala Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Gly Ile Lys
100 105
<210> 16
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Pro Glu Tyr Ser Ser Ser Ala Gly Thr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Thr Asn Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Ser Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Thr Asp Gly Gly Ser Gln His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ala Asn Asn Lys Asn Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Pro Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 22
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Thr Val Thr Thr Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 23
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Glu Tyr Asn
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Ser Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Leu Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ile Phe Gly Gly Arg Asp Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Ile Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Arg
100 105
<210> 26
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Pro Phe Ser Thr Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Lys Ser Glu Ala His Gly Gly Thr Thr His Tyr Ala Pro
50 55 60
Pro Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Gly Asp Phe Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 27
Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Gly Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Gly Ser Ser Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 29
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Ser Ile Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 31
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Glu Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Gly Asn Ser Pro Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 33
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Pro Pro
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Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 35
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Leu Gln Ser
65 70 75 80
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Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ile Ala Ala Ala Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 37
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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<210> 38
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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85 90 95
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100 105 110
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115
<210> 39
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 39
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 40
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Ala Arg Asp Ala Val Ala Gly Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
165 170 175
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro
180 185 190
Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile
195 200 205
Ser Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
210 215 220
His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 41
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
130 135 140
Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser
195 200 205
Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His
210 215 220
Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 42
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Ala His Asp Gly Thr Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ala Thr Pro Arg Ala Ala Asp His Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Gly Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Ile Ala Val Ala Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr
180 185 190
Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Ser Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr His Thr Trp Thr Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys
<210> 44
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 44
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
1 5 10 15
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Ile
20 25 30
Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
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Gly Gly Gln Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
145 150 155 160
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
165 170 175
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
195 200 205
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Pro Pro
210 215 220
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 45
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Leu Glu Pro Leu Glu Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr
130 135 140
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Ser
195 200 205
Ile Thr Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser
130 135 140
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
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Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
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Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Asn Trp
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Gly Ile Lys
225 230 235
<210> 47
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Pro Glu Tyr Ser Ser Ser Ala Gly Thr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala
180 185 190
Thr Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Ser Ile Thr Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr His Thr Trp Ser Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 48
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser
130 135 140
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
145 150 155 160
Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
165 170 175
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp
210 215 220
Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 49
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Trp Lys Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
130 135 140
Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser
195 200 205
Asn Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His
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Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 50
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Thr Asp Gly Gly Ser Gln His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Pro Arg Val Thr Gly Asn Thr Gly Tyr Asp Tyr Asp
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn
145 150 155 160
Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ala Asn Asn Lys Asn Cys
165 170 175
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
210 215 220
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 51
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Thr Val Thr Thr Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp
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Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
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Arg Ser Ser Arg Ser Leu Glu Tyr Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
165 170 175
Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys
180 185 190
Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
210 215 220
Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp Pro Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 52
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn
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Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Tyr Ile Ser Thr Ser Ser Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
145 150 155 160
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
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180 185 190
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Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Arg
225 230 235
<210> 53
<211> 235
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Pro Phe Ser Thr Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Lys Ser Glu Ala His Gly Gly Thr Thr His Tyr Ala Pro
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100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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130 135 140
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
195 200 205
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
210 215 220
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 54
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
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195 200 205
Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
210 215 220
His Thr Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 55
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg
180 185 190
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195 200 205
Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr
210 215 220
Trp Pro Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Ser Val Ser Pro Gly Glu Gly Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
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Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 60
His His His His His His
1 5
Claims (26)
- CD22에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 참고 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 CD22에 대한 결합으로부터 참고 항체에 대해 경쟁하고, 여기서 참고 항체는 EP35-A7, EP35-B05, EP35-C6, EP35-C8, EP35-D6, EP35-E6, EP35-E7, EP97-A01, EP97-A10, EP97-B03, EP97-F01, EP97-G05, EP160-C07, EP160-D02, EP160-E03, EP160-F04, EP160-F10, EP160-G04, EP160-G05, 및 EP188-B10EP160-H02로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 항체.
- 제1항에 있어서, 항체는 다음을 포함하는, 단리된 항체:
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)으로, 여기서 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3은 집합적으로 참고 항체의 중쇄 CDR과 적어도 80% 동일함; 및/또는
(b) 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3)으로, 여기서 LC CDR1, LC CDR2 , 및 LC CDR3은 집합적으로 참고 항체의 경쇄 CDR과 적어도 80% 동일함. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체의 HC CDR은 참고 항체의 HC CDR과 비교하여 8개 이하의 아미노산 잔기 변이를 집합적으로 함유하고; 및/또는 항체의 LC CDR은 참고 항체의 LC CDR과 비교하여 8개 이하의 아미노산 잔기 변이를 집합적으로 함유하는, 단리된 항체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 참고 항체의 VH와 적어도 85% 동일한 VH 및/또는 참고 항체의 VL과 적어도 85% 동일한 VL을 포함하는, 단리된 항체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 세포 표면 상에 발현된 CD22에 대해 10nM 미만의 결합 친화성을 갖는, 단리된 항체.
- 제5항에 있어서, 항체는 세포 표면 상에 발현된 CD22에 대해 1nM 미만의 결합 친화성을 갖는, 단리된 항체.
- 제1항에 있어서, 참고 항체와 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(HC CDR) 및 동일한 경쇄 상보성 결정 영역(LC CDR)을 포함하는, 단리된 항체.
- 제7항에 있어서, 참고 항체와 동일한 VH 및 동일한 VL을 포함하는, 단리된 항체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체인, 단리된 항체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 단리된 항체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단일-사슬 항체(scFv)인, 단리된 항체.
- 제11항에 있어서, 항체는 서열번호: 40-59로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 집합적으로 인코딩하는 핵산 또는 핵산 세트.
- 제13항에 있어서, 벡터 또는 벡터 세트인, 핵산 또는 핵산 세트.
- 제14항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인, 핵산 또는 핵산 세트.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 핵산 또는 핵산들, 또는 제16항의 숙주 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 제17항의 약학적 조성물의 임의의 유효량을 CD22 억제를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CD22를 억제하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 대상체는 CD22 양성 질환 세포를 갖는 인간 환자인, 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 대상체는 암 또는 자가면역 질환에 걸린 인간 환자인, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 인간 환자는 CD22 양성 암 세포 또는 CD22 양성 자가-반응 면역 세포를 갖는, 방법.
- CD22의 존재를 검출하기 위한 방법으로서,
(i) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 CD22를 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시키는 단계, 및
(ii) CD22에 대한 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법. - 제22항에 있어서, 상기 항체는 검출가능한 표지에 접합되는, 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 CD22는 세포 표면 상에 발현되는, 방법.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 항체를 대상체에게 투여함에 의해 수행되는, 방법.
- CD22에 결합하는 항체를 생산하는 방법으로서,
(i) CD22에 결합하는 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 제16항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(ii) 세포 배양물로부터 이렇게 생산된 항체를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
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