[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR20220004967A - 돼지 써코바이러스 3형 (pcv3) 백신, 및 이의 제조 및 용도 - Google Patents

돼지 써코바이러스 3형 (pcv3) 백신, 및 이의 제조 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220004967A
KR20220004967A KR1020217032822A KR20217032822A KR20220004967A KR 20220004967 A KR20220004967 A KR 20220004967A KR 1020217032822 A KR1020217032822 A KR 1020217032822A KR 20217032822 A KR20217032822 A KR 20217032822A KR 20220004967 A KR20220004967 A KR 20220004967A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
pcv3
protein
dose
antigen
Prior art date
Application number
KR1020217032822A
Other languages
English (en)
Inventor
아룬 아이어
루이스 알레한드로 헤르난데스
애비 페터슨
베일리 아루다
루이스 가브리엘 히메네스-리롤라
데이비드 마이클 엔스트롬
에릭 엠 본
피네이로 파블로 이 피네이로
Original Assignee
뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드
아이오와 스테이트 유니버시티 리서치 파운데이션, 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드, 아이오와 스테이트 유니버시티 리서치 파운데이션, 인코퍼레이티드 filed Critical 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드
Publication of KR20220004967A publication Critical patent/KR20220004967A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/23—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 몇몇 임상 징후 (질환)의 치료를 위한 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 임상 징후는 PCV3 감염과 연관있다.

Description

돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 백신, 및 이의 제조 및 용도
관련 출원 및 참조로의 편입
본 출원은 2019년 4월 4일 출원된 미국 가출원 제62/829,400호의 우선권을 청구하고, 이의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 편입된다. 또한 WO 2006/072065 및 미국 특허 제6,103,526호; 제9,610,345호; 제9,669,087호 및 제10,450,351호를 참조하고, 이들 개시는 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다.
전술한 출원, 및 그 안에서 또는 그들 심사 동안 인용된 모든 문헌 ("출원 인용 문헌) 및 출원 인용 문헌에서 인용 또는 참조된 모든 문헌, 및 본 명세서에서 인용 또는 참조된 모든 문헌 ("본 명세서에서 인용된 문헌"), 및 본 명세서에서 인용된 문헌에서 인용 또는 참조된 모든 문헌은 본 명세서 또는 본 명세서에서 참조로 편입시킨 임의 문헌에서 언급되는 임의 제품에 대한 임의 제조사의 설명서, 기술서, 제품 사양서, 및 제품 시트와 함께 참조로 본 명세서에 편입되고, 본 발명의 실시에서 적용될 수 있다. 보다 특히, 모든 참조된 문헌은 각각의 개별 문헌이 참조로 편입된다고 특별히 개별적으로 표시한 바와 동일한 정도로 참조로 편입된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되고, 본 명세서에 참조로 편입된다. 서열목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 BI 19-AH009_ST25 (sequence listing).txt이다. 텍스트 파일은 188 KB이고; 2020년 4월 6일 생성되었으며; 명세서의 출원과 동시에, EFS-Web을 통해서 전자 제출되었다
본 발명의 분야
본 명세서는 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 배큘로바이러스 벡터를 개시한다. 본 명세서에서는 배큘로바이러스 유래된 PCV3 ORF2 및 BaculoG/PCV3 ORF2로부터 생산되는 조성물 및 백신이 또한 개시된다. 또한 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2를 코딩하는 돌연변이형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 배큘로바이러스 벡터가 개시된다. 또한 배큘로바이러스 유래된 돌연변이형 PCV3 ORF2 및 BaculoG/PCV3 ORF2로부터 생산되는 조성물 및 백신이 개시된다.
돼지 써코바이러스 3형 (PCV3)은 써코바이러스과의 써코바이러스 속에 속하는 비-엔벨로프형, 20면체 단일-가닥 DNA (ssDNA) 바이러스이다. 게놈은 2개의 주요 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 코딩하는데, ORF1은 복제-연관 단백질 (rep)을 코딩하고 ORF2는 바이러스의 항원성 특징을 결정하는 바이러스 캡시드 (cap) 단백질을 코딩한다. PCV3은 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2)와 유전자적으로 구별되며; 특히, 2종 바이러스 간에 rep 유전자는 오직 48% 아미노산 동일성 및 cap 유전자는 26% 아미노산 동일성만이 존재한다.
PCV3은 2016년 미국에서 최초로 보고되었다 (Palinski, Rachel, et al. "A Novel Porcine Circovirus Distantly Related to Known Circoviruses Is Associated with Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome and Reproductive Failure." Journal of Virology, vol. 91, no. 1, 26 Oct. 2016). 이 바이러스는 독일, 일본, 한국, 러시아, 중국, 태국, 이탈리아, 스페인, 덴마크, 대한민국, 폴란드, 브라질, 콜롬비아, 인도, 세르비아, 및 스웨덴을 포함하여 전세계에서 동정되었다. 검사가 날짜에 제한적이지만, 회고적 샘플에서 PCV3의 발견은 바이러스가 아마도 최초의 2017년 보고 전에 수십여년 동안 전세계적으로 돼지 개체군에서 순환하였을 것임을 의미한다. 검사가 증가하면서, PCV3이 더 많은 국가 및 더 오래된 샘플에서 동정될 것이라고 가정된다.
추가적으로, 발명의 명칭 "재조합 배큘로바이러스 발현 돼지 원형 고리 바이러스의 3형 Cap 단백질 및 이의 구축 방법 및 프라이머"의 중국 특허 출원 CN109207441A는 2018년 8월 12일 출원된 CN201810912587.1A에 대한 우선권을 청구한다. 이것은 돼지 원형 고리 바이러스의 3형 Cap 단백질의 제조를 위한 PCV3 ORF2의 배큘로바이러스 발현의 구축을 기술한다.
발명의 명칭 "재조합 배큘로바이러스 발현 돼지 원형 고리 바이러스의 3형 Cap 단백질 및 이의 구축 방법 및 프라이머"의 CN109207441A는 2018년 8월 12일 출원된 CN201810912587.1A에 대한 우선권을 청구한다. 이것은 마우스에서 배큘로바이러스 발현된 PCV3 ORF2의 투여를 기술하고 ELISA 혈청전환 데이터를 제공한다.
발명의 명칭 "3형 돼지 원형 고리 바이러스의 발현 및 재조합 배큘로바이러스의 Cap 단백질의 절두 및 이의 구축 방법 및 프라이머"의 CN109207522A는 2018년 8월 12일 출원된 CN201810912585.2A에 대한 우선권을 청구한다. 이것은 마우스에서 배큘로바이러스-절두형 CAP/ORF2의 투여를 기술하고 ELISA 혈청전환 데이터를 제공한다.
추가로, 발명의 명칭 "돼지 써코바이러스 3형 면역원성 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법"의 미국 특허 제10,450,351호 (즉, 출원 일련 번호 제15/768,356호)는 2018년 10월 25일에 US 2018/0305410 A1로서 최초로 공개되었다. 이것은 2015년 10월 16일 출원된 가출원 제62/242,866호에 대한 우선권을 청구한다 (발명자 Ben Hause, Kansas State University Research Foundation에 양도. 2016년 10월 26일 온라인 공개된 [Palinski, Rachel, et al. Journal of Virology, vol. 91, no. 1, 26 Oct. 2016, doi:10.1128/jvi.01879-16] 참조). 이것은 "PDNS와 일관된 임상 증상으로 급성 폐사된 만성 생식능 저하 농장의 5마리 모돈에서 수집된" 조직으로부터의 PCV3에 관한 것이다. 이 특허 출원은 농장이 어디에 위치하는지 언급되어 있지 않지만, 면역조직화학 (IHC) 및 정량적 PCR (qPCR)은 모돈 및 미라, 사산 및/또는 약한 태아에서 PCV2, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV), 및 인플루엔자 바이러스 (IAV)에 대해 음성이었다고 기술하고 있다. 이 특허 출원은 전파용 세포 배양이 아닌, 바이러스의 단리를 기술하고 있다.
'351 특허의 실시예는 PCV3 캡시드 유전자의 qPCR 검출, 바이러스의 단리, PCV3 캡시드 단백질의 클로닝, 항-PCV3 캡시드 단일클론 항체의 개발, PCV3 검출, 및 재조합 PCV3 캡시드 ELISA의 개발을 기술한다. 그러나, 백신 연구 또는 데이터는 기술되어 있지 않다.
최근에, PCV3 병인론을 평가하기 위해서 감염성 PCV3 DNA 클론을 4주령 및 8주령 특이적-병원체-무함유 자돈에게 비내로 접종시키는 것을 기술한 논문이 공개되었다. 그러나, PCV3 감염을 예방하기 위한 백신은 논의되지 않았다 (Jiang, Haijun, et al."Induction of Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome in Piglets by Infection with Porcine Circovirus Type 3", Journal of Virology, vol. 93, no. 4, 28 Nov. 2018, doi:10.1128/jvi.02045-18).
본 출원에서 임의 문헌의 인용 또는 확인은 그러한 문헌이 본 발명에 대한 종래 기술로서 이용가능하다는 인정이 아니다.
동물, 특히 돼지의 백신접종 또는 치료에 유용한 PCV3 ORF2 항원성 단백질 및 이의 변이체가 개시된다.
전형적으로, 돼지류는 돼지이다.
본 발명의 일부 양태에서, 돼지는 자돈이다. 전형적으로, 자돈은 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하의 모돈이다.
본 발명의 일부 양태에서, 돼지는 모돈 또는 미경산돈이다.
본 발명의 일부 양태에서 돼지는 1연령 미만, 전형적으로, 4개월령 초과 및 1연령 미만, 전형적으로 5개월령 초과 및 1연령 미만, 전형적으로 6개월령 초과 및 1연령 미만, 전형적으로 4개월령 내지 8개월령, 전형적으로 5개월령 내지 8개월령, 전형적으로 5개월령 내지 7개월령, 전형적으로 5개월령 내지 6월령인 모돈 또는 미경산돈 (즉, 미분만 모돈)이다.
본 발명의 일부 양태에서 돼지는 1연령 미만, 전형적으로 4개월령 초과 및 1연령 미만, 전형적으로 5개월령 초과 및 1연령 미만, 전형적으로 6개월령 초과 및 1연령 미만인 임신 모돈이다.
본 발명의 일부 양태에서 돼지는 1연령 미만, 전형적으로 4개월령 초과 및 1연령 미만, 전형적으로 5개월령 초과 및 1연령 미만, 전형적으로 6개월령 초과 및 1연령 미만, 전형적으로 4개월령 내지 8개월령, 전형적으로 5개월령 내지 8개월령, 전형적으로 5개월령 내지 7개월령, 전형적으로 5개월령 내지 6월령인 번식전 미경산돈이다.
"BaculoG/PCV3 ORF2"로부터 발현되는, 배큘로바이러스 유래된 PCV3 ORF2, 조성물, 및 3종 백신: BaculoG/PCV3 ORF2, P9; 생, 50% ISA 207VG 보강된, 백신; BaculoG/PCV3 ORF2, P9; 생, 20% 카르보폴 보강된 백신, 및 대조군 BaculoG/비삽입, P4; 생, 20% 카르보폴 보강된 백신의 개발을 개시한다. PCV3 질환을 예방하는 백신의 효능을 확인한 데이터가 제공된다.
또한 배큘로바이러스 유래된 사멸 바이러스 유래 PCV3 ORF2의 개발을 개시한다.
또한 배큘로바이러스 유래된 돌연변이형 사멸 바이러스 유래 PCV3 ORF2의 개발을 개시한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 PCV3 ORF2 단백질, 바람직하게 항원성 PCV3 ORF2 단백질 (PCV3 ORF2 항원)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 또한 이하 "본 발명의 조성물"이라고 한다. 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 용어 "본 발명의 조성물"은 "본 개시의 조성물"과 동등하다는 것을 이해한다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 면역조절제, 및/또는 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수의학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
본 개시는 또한 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질; 및 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 또는 발현 벡터, 면역조절제 및/또는 이의 임의 조합을 포함하는 수의학적으로 허용가능한 담체에 관한 것이다.
일 구현예에서 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제를 포함한다.
PCV3 ORF2는 a1, b1 또는 b2 그룹 유래일 수 있다 ([Fux et al., "Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct group of virus strains", Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3 (참조로 본 명세서에 편입)]의 아형분류 지정법 사용; 예를 들어, 표 4 참조). 따라서, 본 명세서에 언급되는 PCV3은 PCV3의 임의의 계통발생 분기군 또는 분기군의 조합이거나 또는 바람직하게 PCV3a 및 PCV3b로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게 PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 및 PCV3c로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 바람직하게 PCV3a ORF2 단백질 및 PCV3b ORF2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 PCV3 ORF2 단백질을 포함하거나, 또는 가장 바람직하게 PCV3의 임의의 계통발생 분기군 또는 분기군의 조합이거나 또는 PCV3a1 ORF2 단백질, PCV3b1 ORF2 단백질 및 PCV3b2 ORF2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 PCV3 ORF2 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 바람직하게 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 특정한 바람직한 양태에 따라서, PCV3 ORF2 단백질은 재조합 단백질, 또는 가장 바람직하게 재조합 배큘로바이러스 발현된 단백질이다. 따라서, 조성물은 바람직하게 재조합 PCV3 ORF2 단백질을 포함하거나, 또는 가장 바람직하게 배큘로바이러스 발현된 PCV3 ORF2 단백질을 포함한다.
다른 구현예에서, PCV3 ORF2 단백질은 PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 PCV3 ORF2 단백질이다. 유리하게, 발현 벡터는 배큘로바이러스이다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 PCV2 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의해 발현될 수 있는, PCV3 ORF 단백질을 더 포함한다. 유리하게, 발현 벡터는 배큘로바이러스이다.
더 나아가서, 조성물은 추가 돼지 병원체의 적어도 하나의 추가 항원을 더 포함할 수 있다. 돼지 병원체의 추가 항원 또는 항원들은 PRRSV 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 (Mycoplasma hyopneumoniae) 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 바이러스 항원, IAV 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 (Actinobacillus pleuropneumoniae) 항원, 에스케리치아 콜라이 항원 (Escherichia coli), 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원, 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) 항원, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에 (Erysipelothrix rhusiopathiae) 항원 또는 마이코플라스마 하이오리니스 (Mycoplasma hyorhinis) 항원을 포함한다.
다른 구현예에서, PCV3 ORF2 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재한다. 특정 구현예에서, 조성물은 PCV3 ORF2 단백질을 조성물 중 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL 범위의 양으로 가질 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서 조성물의 1 mL 용량은 약 1.6 ㎍의 PCV3 ORF2 단백질을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, PCV3 ORF2 단백질 또는 전체 PCV2 및 PCV3 ORF2 단백질은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재한다. 특정 구현예에서, 조성물은 전체 PCV3 및 PCV2 ORF2 단백질을 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL 범위의 양으로 가질 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서 조성물의 1 mL 용량은 약 1.6 ㎍의 조합된 PCV3 및 PCV2 ORF2 단백질을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 보강제는 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실 기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교돈 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로서 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하는 것인 라디칼 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기로 임의 치환 또는 치환되고 불포화 라디칼은 그 자체로 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 보강제가 존재할 수 있거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 당 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 존재한다. 특정 구현예에서, 조성물은 조성물의 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎ 범위로 보강제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서 조성물의 용량은 약 1 ㎎의 보강제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서 면역조절제는 인터루킨(들), 인터페론(들), 또는 다른 사이토카인(들)을 포함한다.
항생제(들)의 용량은 약 1 ㎍/mL 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들), 또는 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제(들)일 수 있다. 예를 들어, 조성물의 구현예는 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제(들)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서 항생제(들)는 젠타미신을 포함한다.
본 개시의 조성물은 (i) PCV3 ORF2 단백질, (ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함할 수 있다. 일 구현예에서 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가질 수 있고 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정될 수 있다. 다른 구현예에서, BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해서 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI로 처리된 세포 배양물로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유한다. 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물의 구현예는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해서 약 5 mM의 농도로 BEI가 처리된 세포 배양물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물의 용량은 잔류 BEI 및/또는 약 1 ㎎의 카르보폴, 카르보폴 971, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 임의 조성물은 단일 용량 또는 1회 샷 투여를 비롯하여, 다중-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장될 수 있다. 단일 투여는 모계 유래 항체의 존재를 극복할 수 있다고 추정된다.
일 구현예에서 조성물은 번식기 모돈/미경산돈에서 유리하게 사용을 위해 PCV3 및 PPV (VLP에 유리하게 포장) 및/또는 PRRSV일 수 있다. 이러한 일 구현예에서, 투여를 위해 하나 이상의 용량이 고려된다.
다른 양태에 따라서 본 발명의 조성물은 면역원성 조성물이다.
본 발명은 약물로서 사용을 위한 본 발명의 조성물을 더 제공한다.
추가로, 본 발명의 조성물은 백신으로서 사용을 위해 제공된다.
특정 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 조성물은 (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키기 위한 방법에서 사용을 위한 것이다.
다른 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 조성물은 동물에서 PCV3에 의한 감염으로 초래되는 임상 징후 또는 질환의 감소 또는 예방의 방법에서 사용을 위한 것이거나 또는 동물에서 PCV3에 의한 감염의 치료 또는 예방의 방법에서 사용을 위한 것이고, 상기 동물은 바람직하게 돼지이다.
또한, 본 발명의 조성물은 돼지, 특히 바람직하게 임신한 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키기 위한 방법에서 사용을 위해 제공된다.
여전히 다른 양태에 따라서, 본 발명의 조성물은 자돈에서 PCV3에 의한 감염으로 초래되는 임상 징후 또는 질환의 감소 또는 예방의 방법에서 사용을 위해서 제공되고, 자돈은 조성물이 투여될 때 모돈에 의해 포유되어야 한다.
따라서, 본 발명은 또한 자돈에서 PCV3에 의한 감염으로 초래되는 임상 징후 또는 질환의 감소 또는 예방의 방법에서 사용을 위한 본 발명의 조성물을 제공하고, 자돈은 본 발명의 조성물이 투여될 때 모돈에 의해 포유되어야 하고, 바람직하게 조성물이 투여된 상기 모돈은 상기 모돈이 임신 중이었을 때, 특히 상기 자돈, 또는 번식전 미경산돈을 임식 중이었을 때 면역원성 조성물이 투여된 모돈이다.
바람직하게, 상기 언급돈 방법 중 어느 하나에서 사용을 위한 본 발명의 조성물은 특히 상기 모돈에게 근육내로 또는 피내로 투여된다.
본 개시는 또한 본 명세서에 개시된 임의의 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키기 위한 방법을 포괄한다. 동물은 돼지일 수 있다. 유리하게, 돼지는 (가축) 돼지 또는 자돈 또는 모돈일 수 있다. 돼지 또는 자돈은 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하일 수 있다. 투여는 병독성 돼지 써코바이러스에 노출의 적어도 1주 또는 2주 또는 3주 이내에 일어날 수 있다. 투여는 병독성 돼지 써코바이러스에 노출의 적어도 1주 또는 2주 또는 3주 이내에 일어날 수 있다. 일부 양태의 경우에, 투여는 단일, 1회 샷 투여; 또는 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 조성물의 단일, 1회 용량 투여를 포함할 수 있고; 및 다중-샷 또는 다중-용량 용법은 아닐 수 있다. 일부 양태 경우에, 투여는 본 발명의 단백질
또한, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 면역화하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동물에서 적어도 하나의 병원체에 의해 초래되는 임상 질환에 대해 돼지를 면역화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 면역원성 조성물은 감염의 임상 징후를 초래하는데 실패하지만 상기 적어도 하나의 병원체의 병원성 형태에 대해서 동물을 면역화시키는 면역 반응을 유도할 수 있고, 상기 적어도 하나의 병원체는 바람직하게 PCV3이다.
또한, 본 발명은 모돈에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 모돈은 임신 모돈일 수 있다. 대안적으로, 모돈은 미경산돈 (즉, 분만한적 없는 모돈) - 바람직하게 번식전 미경산돈일 수 있다.
또한, 본 발명은 자돈에서 PCV3에 의한 감염으로 초래되는 임상 징후 또는 임상 증상을 감소 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
- 본 발명의 조성물을 모돈에게 투여하는 단계, 및
- 상기 자돈이 상기 모돈에 의해 포유될 수 있게 하는 단계를 포함하고,
상기 모돈은 바람직하게 특히 상기 자돈을 임신 중인 모돈이다.
바람직하게, 후자의 상기 언급된 방법은
- 본 발명의 조성물을 상기 자돈을 임신 중인 모돈에게 투여하는 단계,
- 상기 모돈이 상기 자돈을 분만할 수 있게 하는 단계, 및
- 상기 자돈이 상기 모돈에 의해 포유될 수 있게 하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 자돈에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV)의 감염으로 초래되는 임상 징후 및/또는 임상 증상을 감소시키는 방법을 제공하고, 자돈은 본 발명의 조성물이 투여된 모돈이 포유해야 한다.
바람직하게, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에서, 적용가능한 경우에, 본 발명의 조성물은 특히 상기 모돈에게 근육내로 또는 피내로 투여된다.
다른 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물은 상기 모돈에게, 특히 근육내 또는 피내로, 2회 투여된다.
다른 바람직한 양태에서, 본 명세서에 언급되는, 임상 징후는 평균 1일 체중 증량의 감소 및 폐사로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 명세서에서 언급되는, 임상 징후는 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 배출로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 명세서에 언급되는, 임상 증상은 총 (gross) 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제, 및 PCV3 바이러스혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
여전히 추가의 바람직한 양태에서, 본 명세서에서 언급되는 임상 증상은 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생 또는 생산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시는 또한 본 명세서에 개시된 임의의 방법에서 (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대해 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응의 유도를 위한 조성물의 제조에서 사용을 위하거나, 또는 (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유도하기 위한 방법에서 사용을 위한, 본 명세서에 개시된 임의의 조성물의 용도; 또는 단독으로 또는 병용하여 본 명세서에 개시된 어느 하나의 조성물의 PCV3 ORF2 단백질의 용도를 포괄한다.
일 구현예에서 조성물은 유리하게 번식기 모돈/미경산돈에서 사용을 위한 PCV3 및 PPV (유리하게 VLP에 포장) 및/또는 PRRSV일 수 있다. 이러한 일 구현예에서, 투여를 위해 하나 이상의 용량이 고려될 수 있다. 이러한 특정 구현예는 PCV3 및 PPV 및 임의로 PSSRV에 대한 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반영의 유도를 위한 조성물의 제조에서 사용을 위하거나, 또는 PCV3 및 PPV 및 임의로 PSSRV에 대한 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유도하기 위한 방법에서 사용을 위한, PPV 단백질 및 임의로 PRRSV 단백질과 병용한 PCV3 ORF2 단백질의 용도를 포괄한다.
이러한 구현예에서, 조성물은 (i) 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질, 파보바이러스(PPV) 단백질 및 임의로 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 단백질 및 (ii) 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 면역조절제, 및/또는 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다. 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제를 포함할 수 있다. 조성물은 PCV3, PPV 및/또는 PRRSV에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키기 위한 방법에서 이용될 수 있다. 일 구현예에서 조성물은 돼지, 특히 바람직하게 임신 모돈에서 PCV에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법에서 이용될 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 자돈에서 PCV3의 감염으로 초래되는 임상 징후 또는 질환의 감소 또는 예방의 방법에서 이용될 수 있고, 자돈은 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다. 조성물은 근육내로 또는 피내로 투여될 수 있다. 구현예는 또한 동물에게 상기 조성물 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함할 수 있는, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키기 위한 방법에 관한 것이다. 구현예는 또한 상기 동물에서 적어도 하나의 병원체에 의해 초래되는 임상 질환에 대해 돼지를 면역화시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 조성물 중 어느 하나를 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 면역원성 조성물은 상기 적어도 하나의 병원체의 병원성 형태에 대해 동물을 면역화시키는 면역 반응을 유도시킬 수 있다.
PPV는 약 5100 뉴클레오티드의 단일 가닥 DNA 분자를 함유하는 파보바이러스과 내 프로토파보바이러스 속의 파보바이러스 아과의 자율 복제 바이러스이다 (Cotmore et al., 2014: Arch Virol.: 159(5): 1239-1247; Molitor et al., 1984: Virology: 137(2):241-54). DNA의 오직 마이너스 가닥만이 비리온으로 포장된다. 바이러스의 게놈은 3종의 캡시드 단백질 (VP1, VP2, VP3) 및 비-구조 단백질 (NS1)을 코딩한다. 파보바이러스의 캡시드 약 22-25 나노미터 직경이고 VP1 및 VP2 서브유닛으로 구성된다. 이들 단백질은 동일한 RNA 분자의 선택적 스플라이싱 형태로부터 유래되므로 서열이 중복된다. 또한, 돼지 파보바이러스는 고양이 범백혈구 감소증 바이러스, 개 파보바이러스 및 설치류 파보바이러스와 높은 수준의 서열 유사성을 나타낸다 (Ranz et al., 1989: J. gen. Virol: 70:2541-2553).
PPV 단백질은 불활성화되거나 또는 사멸된 전체 세포 또는 PPV의 서브유닛으로부터 유래될 수 있다. 유사하게, PPV 단백질은 재조합 PPV 단백질이다.
EP 0 551 449 A1은 돼지 파보바이러스에 대한 VP2 서브유닛 백신을 제조하기 위한 방법을 개시한다. Cadar D 등 (Infection, Genetics and Evolution 2012, 12: 1163-1171)은 멧돼지에서 돼지 파보바이러스의 계통학 및 진화 유전학을 기술한다. Streck A F 등 (Journal of General Virology 2011, 92: 2628-2636)은 돼지 파보바이러스의 캡시드 단백질에서 높은 비율의 바이러스 진화를 기술한다. WO 88/02026은 빈 바이러스 캡시드 백신에 관한 것이다.
Martinez C 등 (Vaccine, 1992, 10(10): 684-690)은 면역원성 활성이 높은 돼지 파보바이러스 빈 캡시드의 생산을 개시한다. Xu F 등 (Applied and Environmental Microbiology 2007, 73(21): 7041-7047)은 돼지 파보바이러스 VP2 단백질을 생산하는 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei)의 위내 투여 이후 마우스에서 면역 반응의 유도를 기술한다. 그리고 미국 특허 제10,485,866호는 PPV 바이러스 단백질 2 (VP2) 유리하게 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 PPV VP2를 포함하는 면역원성 조성물을 개시한다.
용어 "돼지 파보바이러스" 또는 "PPV"는 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 그러나, "돼지 파보바이러스"는 단일 가닥 DNA 분자를 함유하는 파보바이러스과 내 파보바이러스 속의 자율 복제 바이러스이다. 바이러스의 게놈은 3종 캡시드 단백질 (VP1, VP2, VP3) 및 1종 비-구조 단백질 (NS1)을 코딩한다. 돼지에서 PPV에 의해 초래되는 질환은 종종 SMEDI (stillbirth, mummification, embryonic death, and infertility의 두문자어)라고 지칭된다. 용어 "돼지 파보바이러스"는 돼지 파보바이러스의 모든 가능한 균주, 유전자형, 표현형, 및 혈청형을 포괄한다. 용어 "바이러스 단백질 2" 또는 "VP2"는 돼지 파보바이러스의 캡시드 단백질 VP2에 관한 것이다. 용어 "바이러스 단백질 2" 또는 "VP2"는 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS)은 전세계 돼지 산업에 현재 영향을 미치는 가장 중요한 질환으로서 많이 주시되고 있다. PRRS 바이러스 (PRRSV)는 아테리바이러스과로 분류되는 엔벨로프형 단일 가닥 RNA 바이러스이다. PRRSV의 상이한 단리주의 항원성 특징에 큰 가변성이 존재하고 감염을 예방하는데 효과적인 수단은 제한적이다. PRRS에 이용가능한 2종의 주요 그룹의 백신이 존재하는데, 약독화된 변형 생 바이러스 (MLV), 사멸 바이러스 백신 또는 재조합 백신이다. PRRSV의 바이러스 엔벨로프 단백질은 일반적으로 비리온 중 단백질의 존재비를 기반으로 주요 및 소수 단백질로 분류된다. 주요 바이러스 엔벨로프 단백질은 gp5 (ORF 5) 및 M (ORF 6)이고 이량체를 형성한다. 소수 엔벨로프 단백질은 gp2 (ORF2), gp3 (ORF3), gp4 (ORF4) 및 E (ORF2b) 및 아미도 새롭게 동정된 바이러스 단백질 gp5a (ORF 5a)이다. 활성 항원성 성분은 PRRSV 바이러스 유래의 ORF4, ORF5, ORF6, 또는 ORF7을 포함한다.
재조합 PRRSV 항원은 일정 PRRSV 항원을 보유하고 발현하는 하나 이상의 조작된, 재조합 아데노바이러스 벡터, 및 임의로 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 보강제, 부형제, 또는 비히클을 포함하는 벡터된 PRRSV 백신 또는 조성물에서 발현될 수 있다. 유리하게, 벡터는 아데노바이러스 벡터이지만 다른 벡터, 예컨대 배큘로바이러스가 또한 고려된다.
PRRSV는 본 명세서에 개시된 신규한 본 발명의 조성물은 모든 공지되었지만 아직 발견되지 않은 PRRSV 균주에 보편적으로 적용가능하므로, 임의 균주일 수 있다. PRRSV 바이러스는 약 50% 서열 상동성을 공유하는 "US" 및 "EU" 유형이라고 지칭되는 2종 유전자형으로서 존재한다 (Dea S et al. (2000). Arch Virol 145:659-88). 이들 2종 유전자형은 또한 그들 면역학적 성질을 통해 구별될 수 있다. 다양한 단리주에 대한 대부분의 시퀀싱 정보는 구조 단백질, 즉 바이러스 게놈의 오직 약 4%만을 차지하는 엔벨로프 단백질 GP5를 기반으로 하지만, 비-구조 단백질 (nsp)에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. PRRSV의 단리 및 백신의 제조는 수많은 공개물에 기술되어 있다 (WO 92/21375, WO 93/06211, WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930, US 10,039,821). PRRSV 항원은 PRRSV 소수 단백질 (예: gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 또는 E)을 임의 조합으로 포함하고, 임의로 추가의 PRRSV 주요 단백질 (예: gp5 또는 M)을 포함한다. 예를 들어, PRRSV 항원은 바이러스-유사 입자 (VLP)의 표면 상에 디스플레이될 수 있다. 다른 구현예에서, 항원의 가용성 형태는 숙주 동물에게 투여될 수 있고, 서로와, 또는 추가로, VSV-G의 성분, 또는 다른 바이러스 단백질과 단백질의 올리고머화 (삼량체화 포함) 또는 임의의 올리고머화 (삼량체화 모티프 포함) (예: 박테리아 GCN4 유래 모티프 등). 게다가, I형 바이러스 표면 당단백질의 TM/CT 도메인은 동일한 목적을 수행하도록 계획되고ㅡ 그러므로, VSV-G 유래 상응 도메인과 상호교환가능하다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 PRRSV E 항원, 폴리펩티드, 엑토도메인 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는, 변형된 PRRSV gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 또는 M 항원, 폴리펩티드, 엑토도메인, 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 또는 M의 존재하는 세포 국재화 서열은 이종성 유전자로부터의 세포-표면 발현 결정 서열로 치환되었다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 재-표적화 PRRSV 소수 단백질을 발현하는 제1 벡터, 및 재-표적화 PRRSV 주요 단백질을 발현하는 제2 벡터의, 2종 벡터의 혼합물을 포함한다.
유리한 구현예에서, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물은 필요로 하는 대상체에게 2회 용량으로 투여된다. 그러나, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물은 2회 이상의 용량으로 투여될 수 있고, 제1 용량은 제2 (부스터) 용량의 투여 전에 투여된다. 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 15일에 투여된다. 보다 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 15일 내지 40일에 투여된다. 보다 더 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 17일에 투여된다. 여전히 보다 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 17일 내지 30일에 투여된다. 보다 더 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 19일에 투여된다. 여전히 보다 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 19일 내지 25일에 투여된다. 가장 바람직하게 제2 용량은 제1 용량 이후 적어도 21일에 투여된다. 보다 더 바람직하게, 제2 용량은 제1 용량 이후 약 21일에 또는 제1 용량 이후 21일에 투여된다. 2-회 투여 용법의 바람직한 양태에서, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물의 제1 및 제2 용량 둘 모두는 동일한 양으로 투여된다. 바람직하게, 각 용량은 상기 명시된 바람직한 양이고, 제1 및 제2 용량에 대한 1 mL 또는 2 mL의 용량이 가장 바람직하다. 제1 및 제2 용량 용법 이외에도, 대안적인 구현예는 후속 용량을 더 포함한다. 예를 들어, 제3, 제4, 또는 제5 용량은 이들 양태에서 투여될 수 있다. 바람직하게, 후속 제3, 제4, 및 제5 용량 용법은 제1 용량과 동일한 양으로 투여되고, 용량 간 시간 기간은 상기 언급된 제1 및 제2 용량 간 시기와 일관된다.
대상체 당 용량 부피는 백신접종 경로 및 대상체의 연령에 의존한다. 바람직하게, 총 부피는 약 0.2 mL 내지 5 mL, 보다 바람직하게 약 0.5 mL 내지 3.0 mL, 보다 더 바람직하게 약 1.0 mL 내지 2.5 mL, 보다 더 바람직하게 약 1.0 mL 내지 2.0 mL이다. 가장 바람직한 부피는 용량 당 1 mL, 1.5 mL, 2 mL 또는 2.5 mL이다.
PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물은 바람직하게, 국소로 또는 전신으로 투여된다. 통상적으로 사용되는 적합한 투여 경로는 경구 또는 비경구 투여, 예컨대 비내, 정맥내, 피내, 경피, 근육내, 복강내, 피하를 비롯하여, 흡입을 포함한다. 그러나, 화합물의 작용 방식 및 성질에 의존하여, 면역원성 조성물은 또한 다른 경로를 통해서 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 다른 경로는 피내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 척수강내, 기관내, 피내, 심장내, 엽내, 엽내, 골수내, 폐내, 직장내, 및 질내를 포함한다. 그러나, 가장 바람직한 PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물은 피하로 또는 근육내로 투여된다. 가장 바람직한 PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물은 근육내로 투여된다.
일 양태에서, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 상기 면역원성 조성물은 근육내로 투여된다.
일 양태에서, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 상기 면역원성 조성물은 미경산돈 및/또는 모돈에게 투여된다.
바람직하게, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물은 적어도 3개월령, 보다 바람직하게 적어도 4개월령, 가장 바람직하게 적어도 5개월령인 미경산돈 및/또는 모돈에게 투여된다.
일 양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 3개월령인 미경산돈 및/또는 모돈에게 투여된다.
일 양태에서, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 상기 면역원성 조성물은 임신 전 미경산돈 및/또는 모돈에게 투여된다.
2샷 용법에서, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 상기 면역원성 조성물의 제2 용량은 유리하게 짝짓기/수정 전 2, 3, 4 또는 5주, 가장 바람직하게 짝짓기/수전 전 약 3주에 미경산돈 및/또는 모돈에게 투여된다. 바람직하게, 상기 면역원성 조성물의 제1 용량은 제2 용량의 투여 전 2, 3, 4, 5 또는 6주, 가장 바람직하게 제2 용량의 투여 전 약 3주에 미경산돈 및/또는 모돈에게 투여된다. 그러나, 2샷 용법이 적용된 후에, 바람직하게 미경산돈 및/또는 모돈은 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월마다, 가장 바람직하게 약 6개월마다 재-백신접종된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 임신 및 수유 동안 미경산돈 및/또는 모돈에게 투여된다.
본 발명의 일 양태에서, 면역원성 조성물은 임신 및 수유 동안 미경산돈 및/또는 모돈에게 안전한다.
또한 백신은 임신 114일 동안 전체 또는 2 또는 적어도 하나의 3개월에 PCV3이 챌린지되었을 때 사육 미경산돈 및 모돈을 보호할 수 있다고 주장된다.
또한 백신은 백신은 임신 114일 동안 전체 또는 2 또는 적어도 하나의 3개월에 PCV3이 챌린지되었을 때 백신접종된 미경산돈 및 백신접종된 모돈에서 미라, 사산, 및 태아의 발생을 유의하게 감소시킬 수 있다고 주장된다.
본 발명의 일 양태에서 면역원성 조성물은 임신 30일로부터, 바람직하게 임신 40일로부터 미경산돈 및/또는 모돈에게 안전하다.
바람직하게, PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물은 0.1 ㎍ 내지 150 ㎍, 바람직하게 0.25 ㎍ 내지 75 ㎍, 보다 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 37.5 ㎍, 보다 더 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 15 ㎍, 가장 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 6 ㎍의 PCV3, PPV 및/또는 PRRSV 항원을 포함한다. PCV3, PPV 및/또는 PRRSV를 포함하는 면역원성 조성물은 약 0.25 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 1.25 ㎍, 1.5 ㎍, 1.75 ㎍, 2 ㎍, 2.25 ㎍, 2.5 ㎍, 2.75 ㎍, 3 ㎍, 3.5 ㎍, 4 ㎍, 4.5 ㎍, 5 ㎍, 5.5 ㎍, 6 ㎍, 6.5 ㎍, 7 ㎍, 7.5 ㎍, 8 ㎍, 8.5 ㎍, 9 ㎍, 9.5 ㎍, 10 ㎍, 10.5 ㎍, 11 ㎍, 11.5 ㎍, 12 ㎍,, 12.5 ㎍, 13 ㎍, 13.5 ㎍, 14 ㎍, 14.5 ㎍ 또는 15 ㎍의 양일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서 면역원성 조성물은 0.1 ㎍ 내지 150 ㎍의 PPV VP2 항원, 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 30 ㎍의 PCV3, PPV 및/또는 PRRSV 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다.
일 양태에서, 면역원성 조성물은 동종성 및/또는 이종성 챌린지에 대해 보호된다.
PCV3 ORF2 단백질은 배양된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 생산될 수 있다. 방법은 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함할 수 있다. 불활성화는 당분야에서 이해되는 방식으로 수행된다. 예를 들어, 화학적 불활성화에서, 바이러스를 함유하는 적합한 바이러스 샘플 또는 혈청 샘플은 바이러스를 불활성화시키도록 충분히 높은 (또는, 불활성화제에 따라, 낮은) 온도 또는 pH에서 불활성화제의 충분한 양 또는 농도로 충분한 시간 동안 처리된다. 가열에 의한 불활성화는 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 온도 및 시간 동안 수행된다. 조사에 의한 불활성화는 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 빛의 파장 또는 다른 에너지원을 사용해 수행된다. 바이러스는 감염에 감수성인 세포를 감염시킬 수 없으면 불활성화된 것으로 간주된다. 불활성화 단계는 바이러스 불활성화제의 사용 또는 열 처리를 포함할 수 있다. 불활성화제는 아지리딘 화합물, 예컨대 BEI를 포함할 수 있다.
본 개시는 또한 PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. PCV3 ORF2는 그룹 a1, b1 또는 b2 유래일 수 있다 ([Fux et al., "Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct group of virus strains", Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3] (참조로 본 명세서에 편입됨)의 아형분류 지정법 사용; 예를 들어, 표 4 참조). 다른 구현예에서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 4와 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 재조합 벡터는 배큘로바이러스일 수 있다. 다른 구현예에서, 재조합 벡터는 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 포함할 수 있다.
본 개시 및 특히 청구항 및/또는 단락에서, 용어 예컨대 "포함하다", "포함한", "포함하는" 등은 미국 특허법에서 부여되는 의미를 가질 수 있고; 예를 들어, 그들은 "포괄하다", "포괄한", "포괄하는" 등을 의미할 수 있고; 용어 예컨대 "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지다"는 미국 특허법에서 그들에게 부여하는 의미를 가지고, 예를 들어, 그들은 분명하게 인용되지 않은 구성요소는 허용하지만, 본 개시의 기본 또는 신규 특징에 영향을 미치거나 또는 종래 기술에서 존재하는 구성요소는 배제한다는 것을 유의한다.
투여가 있는 돼지류, 돼지 또는 자돈은 PCV, 예컨대 PCV2 및/또는 PCV3에 대한 항체, 예를 들어 모계 항체를 가질 수 있다.
이들 및 다른 구현예는 하기 구체적인 설명으로부터 자명해지고 그에 포괄된다.
본 개시 및 특히 청구항 및/또는 단락에서, 용어 예컨대 "포함하다", "포함한", "포함하는" 등은 미국 특허법에서 그에 부여하는 의미를 가질 수 있고; 예를 들어, 그들은 "포괄하다", "포괄한", "포괄하는" 등을 의미할 수 있으며, 용어 예컨대 "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지다"는 미국 특허법에서 그들에게 부여하는 의미를 가질 수 있고, 예를 들어, 그들은 분명하게 인용되지 않은 구성요소는 허용하지만, 본 발명의 기본 또는 신규 특징에 영향을 미치거나 또는 종래 기술에서 존재하는 구성요소는 배제한다는 것을 유의한다.
이들 및 다른 구현예는 하기 구체적인 내용으로부터 자명해지고 그에 포괄된다.
특허 또는 특허 출원은 유색으로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 유색 도면(들)이 존재하는 이러한 특허 또는 특허 출원 공개물의 사본은 요청 및 필요한 비용의 지불 시에 사무국에서 제공하게 될 것이다.
예로서 제공되고, 기술된 특정 구현예에 오로지 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌, 하기 구체적인 내용은 첨부된 도면과 함께 최고로 이해될 수 있다.
도 1은 재조합 배큘로바이러스 BaculoG/PCV3 ORF2 중 PCV3 ORF2 뉴클레오티드 서열의 서열, SEQ ID NO:1이다.
도 2는 재조합 배큘로바이러스 BaculoG/PCV3 ORF2의 서열, SEQ ID NO:2이다.
도 3은 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터 (BaculoG/PCV3 ORF2 클론 4B4-2E12 Pre-MSV p8)의 제어 하에 PCV3 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스의 지도를 도시한다.
도 4는 연구일에 따른 혈청 중 그룹 중앙 log10 PCV3 DNA 게놈 카피수/mL을 도시한다; 그룹 1-5.
도 5는 분변 샘플 중 연구일에 따른 그룹 중앙 log10 PCV3 DNA 게놈 카피수/mL을 도시한다; 그룹 1-5.
도 6은 비강 샘플 중 연구일에 따른 그룹 중앙 log10 PCV3 DNA 게놈 카피수/mL을 도시한다; 그룹 1-5.
도 7은 연구일에 따른 기준치 조정된, 최소 제곱 그룹 평균 직장 온도 (℉)를 도시한다.
도 8은 일에 따른 기준치-조정된, 그룹 최소 제곱 평균 1일 체중 (kg)을 도시한다; 그룹 1-5.
도 9는 일에 따른 그룹 평균 체온 (℉)을 도시한다.
도 10은 챌린지 재료에 대해 사용된 PCV3 PCR 양성 조직 균질물에 대한 서열 정보를 도시한다 (SEQ ID NO: 3-5).
도 11은 7일부터 49일까지 그룹 1-5에 대한 중앙 PCR 값을 도시한다.
도 12는 7일부터 49일까지 그룹 7-9에 대한 중앙 PCR 값을 도시한다.
도 13은 7일부터 49일까지 그룹 1-5에 대한 분변 배출에 대한 중앙 PCR 값을 도시한다.
도 14는 7일부터 49일까지 그룹 1-5에 대한 비강 배출에 대한 중앙 PCR 값을 도시한다.
도 15는 평가의 14일부터 49일까지 그룹 1-6에 대한 산술 평균 직장 온도 값을 도시한다.
도 16은 그룹 1-5에 대한 그룹 및 일에 따른 최소-제곱 평균 온도 값을 도시한다.
도 17은 그룹 1-5에 대한 그룹 및 일에 따른 동물의 평균 직장 온도 (기준치 조정 최소-제곱)를 예시하는 선 도표이다.
도 18은 14일부터 49일까지 그룹 1-6에 대한 산술 평균 체중 값을 도시한다.
도 19는 그룹 1-5에 대한 그룹 및 일에 따른 체중 (최소-제곱) 평균을 도시한 선 그래프이다.
도 20은 그룹 및 일에 따른 (기준치 조정된) 체중에 대한 최소-제곱 평균에 대한 데이터를 도시하는 선 그래프이다.
도 21은 pre-MSV + 1 생산의 이력 그래프를 도시한다.
도 22A는 BaculoG/PCV3 ORF2의 감염 동안 세포 계측수를 도시하고 도 22B는 세포 생존능 및 크기를 도시한다.
도 23은 수확시 BaculoG/PCV3 ORF2 유체의 분석을 도시한다.
도 24는 72시간에 불활성화의 이미지를 도시한다.
도 25는 불활성화 후 BaculoG/PCV3 ORF2 항원에 대한 불활성화 조건의 웨스턴 비교를 도시한다.
도 26은 PCV3 ORF2 형광 도트 블롯을 도시한다.
도 27은 log10 게놈 카피수/mL을 기반으로 챌린지 후 돼지의 샘플 개체군 중 관찰된 바이러스혈증의 그래프를 도시한다. 모든 대조군 돼지는 챌린지 시기 동안 각 샘플채취 시점에 PCR로 결정하여 바이러스혈증이 있었고, 챌린지 시기 동안 각 샘플채취 시점에 바이러스 존재량은 백신접종에 의해 유의하게 감소되었다 (P≤0.0050).
도 28은 챌린지-전 (D12, D13, D14) 및 챌린지-후 (D14.5-D20)에 측정된 평균 직장 온도 (℉)의 그래프를 도시한다.
도 29는 D83 (임신 40일)에 챌린지된 미경산돈에서 관찰된 바이러스혈증의 그래프를 도시한다. 수치는 게놈 카피수/mL을 표시한다. Y-축은 0에서 정확하게 값을 나타내도록 선형 규모로 도시된다. 화살표는 1차 백신, 부스터, 및 챌린지의 투여를 표시한다.
도 30은 각 처리 그룹의 분만 모돈으로부터 관찰된 자가분해, 분쇄, 미라 출산된 자돈의 마릿수를 기반으로 영향받은 자돈의 백분율을 포시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 31은 PCV3 캡시드와 돼지 PCV2의 캡시드 및 부리와 깃털 질환 바이러스 (BFDV)의 캡시드의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다.
도 33은 리신 및 히스티딘에 돌연변이를 갖는 FG 루프의 PCV3 ORF2 돌연변이체의 구조를 도시한다.
도 33은 PCV3 캡시드 단백질에 대한 천연 중지 코돈이 돌연변이되었고 C-말단은 다음 중지 코돈까지 연장된 PCV3 ORF2 돌연변이체의 구조를 도시한다.
도 34는 리신 및 히스티딘에 돌연변이를 갖는 FG 루프의 PCV3 ORF2 돌연변이체 및 PCV3 캡시드 단백질에 대한 천연 중지 코돈이 돌연변이되고 C-말단이 다음 중지 코돈까지 연장된 PCV3 ORF2 돌연변이체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID NO: 6-9).
도 35는 돌연변이형 PCV3 ORF2"FG-PC"의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 10)을 도시한다.
본 개시는 PCV3 백신에 관한 것이다.
PCV3의 임의 서열이 고려된다 (참조: 예를 들어, [Phan, Tung Gia, et al. "Detection of a Novel Circovirus PCV3 in Pigs with Cardiac and Multi-Systemic Inflammation", Virology Journal, vol. 13, no. 1, 2016, p.184, doi:10.1186/s12985-016-0642-z] (2016년 11월 11일 공개) 및 [Fux et al., "Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct group of virus strains", Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3] (이의 개시는 참조로 편입됨)).
PCV3 ORF2 및 PCV3 게놈 서열은 KT869077 (GenBank)로부터 유래되었다. 플라스미드 중 전체 PCV3 게놈이 사용되었고 실시예에 기술되었다. ORF2 및 전체 게놈은 Genscript에서 합성하였다.
2가지 상이한 방법을 통해 유래된 재-원형화 PCV 게놈의, 2종 추가 구성체가 바이러스를 구제하기 위해 세포 배양에서 사용되었다.
하기 서열은 서열 목록에서 제공된다:
Figure pct00001
PCV3 ORF2 "FG"는 천연 PCV3 ORF2 단백질의 FG 루프에 아미노산 치환을 포함하는 본 발명에 따른 항원성 단백질이다.
PCV3 ORF2 "PC"는 천연 PCV3 ORF2 단백질의 C 말단에 아미노산 연장을 포함하는 본 발명에 따른 항원성 단백질이다.
바람직한 양태에서, 본 개시의 폴리펩티드는 재조합 PCV3 ORF2 단백질, 예컨대 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV3 ORF2 단백질이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 PCV3 ORF2 단백질"은 특히 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질 분자, 예컨대 재조합 DNA 기술로 생산되는, 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 기술의 예는 이후에 DNA에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하도록 숙주 세포를 형질감염, 또는 배큘로바이러스 발현 벡터의 경우에, 감염시키는데 사용되는, 적합한 발현 벡터, 바람직하게 배큘로바이러스 발현 벡터에 발현된 단백질을 코딩하는 DNA를 삽입시키는 경우를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 PCV3 ORF2 단백질"은 따라서, 특히 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질 분자를 의미한다.
특정 예에 따라서, 재조합 PCV3 ORF2 단백질은 하기 단계를 갖는 방법으로 제조된다: PCV3 ORF2에 대한 유전자를 배큘로바이러스 전달 벡터에 클로닝하는 단계; 전달 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 상동성 재조합을 통해 상기 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 단계; 및 다음으로 재조합 배큘로바이러스에 의한 감염 동안 PCV3 ORF2 단백질이 곤충 세포에서 발현되는 단계.
용어 "서열로 이루어진 재조합 PCV3 단백질"은 특히 또한 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 의해 영향받는 서열의 임의의 공번역 및/또는 번역후 변형 또는 변형들을 고려한다는 것을 더욱 이해한다. 따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 용어 "서열로 이루어진 재조합 PCV3 ORF2 단백질"은 또한 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 실시되는 하나 이상의 변형, 특히 바람직하게 글리코실화, 인산화, 및 아세틸화로 이루어진 군에서 선택되는, 단백질 생합성 및/또는 단백질 프로세싱에서 실시되는 아미노산 잔기의 변형을 갖는 서열에 관한 것이다.
바람직하게, 본 개시에 따른 재조합 PCV3 ORF2 단백질은 특히 배양된 곤충 세포에서, 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 생산되거나 또는 수득가능하다.
또 추가의 바람직한 양태에서, 본 개시의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 보다 바람직하게 적어도 94%, 보다 더 바람직하게 적어도 96%, 여전히 보다 바람직하게 적어도 98%, 또는 특히 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 PCV3 ORF2 단백질이다.
당분야에 공지된 바와 같은 "서열 동일성"은 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 기준 서열 및 기준 서열과 비교하려는 소정 서열 간 관계를 의미한다. 서열 동일성은 이러한 서열 스트링 간 일치도를 통해 결정되는, 서열 유사성의 최고 정도를 생성시키도록 최적으로 서열을 정렬시킨 후에 기준 서열과 소정 서열을 비교하여 결정된다. 이러한 정렬 시에, 서열 동일성은 위치별 기준으로 확인되고, 예를 들어, 서열은 그 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일하다면 특정 위치에서 "동일"하다. 이러한 위치 동일성의 총 수를 이후 기준 서열의 뉴클레오티드 또는 잔기의 총 수로 나누어서 서열 동일성 %를 제공한다. 서열 동일성은 그 교시가 참조로 본 명세서에 편입되는, 다음의 문헌들에 기술된 것들을 포함한, 공지 방법으로 쉽게 계산할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). 서열 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열 간 최대 일치도를 제공하도록 디자인된다. 서열 동일성을 결정하기 위한 방법은 소정 서열 간 서열 동일성을 결정하는 공공으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램에서 편집된다. 이러한 프로그램의 예는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처에서 공공으로 입수가능하다 (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 이의 교시는 참조로 본 명세서에 편입됨). 이들 프로그램은 소정 및 기준 서열 간 서열 동일성의 최고 수준을 생성시키기 위해서 디폴트 갭 가중치를 사용해 최적으로 서열을 정령한다. 예시된 바와 같이, 기준 뉴클레오티드와 적어도, 예를 들어, 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95%의 "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란, 소정 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드 당 최대 15, 바람직하게 최대 10, 보다 더 바람직하게 최대 5 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고 기준 서열과 동일한 것을 의도한다. 다른 말로, 기준 뉴클레오티드 서열에 대해서 적어도 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서, 기준 서열 중 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게 10%, 보다 더 바람직하게 5%가 결실될 수 있거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 중 총 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게 10%, 보다 더 바람직하게 5%의 많은 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접하는 그룹 또는 기준 서열 내 뉴클레오티드 중 개별적으로 산재된, 그들 말단 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있다. 유사하게, 기준 아미노산 서열과 적어도, 예를 들어, 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95%의 서열 동일성을 갖는 소정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 폴리펩티드의 소정 아미노산 서열이 소정 폴리펩티드 서열이 기준 아미노산 서열의 각 100 아미노산 당 최대 15, 바람직하게 최대 10, 보다 더 바람직하게 최대 5 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고 기준 서열과 동일한 것을 의도한다. 다른 말로, 기준 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95%의 서열 동일성을 갖는 소정 폴리펩티드 서열을 수득하기 위해서, 기준 서열 중 아미노산 잔기의 최대 15%, 바람직하게 최대 10%, 보다 더 바람직하게 최대 5%가 결실될 수 있거나 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 중 아미노산 잔기의 총 수의 최대 15%, 바람직하게 최대 10%, 보다 더 바람직하게 최대 5%의 많은 아미노산이 기술 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접하는 그룹 내 또는 기준 서열 중 잔기 중에 개별적으로 산재된, 그들 말단 위치 사이의 임의 위치에서 존재할 수 있다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환이 상이할 수 있다. 그러나, 보존성 치환은 서열 동일성을 결정할 때 일치로서 포함되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "서열 상동성"은 2개 서열의 관련도를 결정하는 방법을 의미한다. 서열 상동성을 결정하기 위해서, 둘 이상의 서열이 최적으로 정렬되고, 필요하면 갭이 도입된다. 그러나, "서열 동일성"과 대조적으로, 보존성 아미노산 치환은 서열 상동성을 결정할 때 일치도로서 계측된다. 다른 말로, 기준 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서, 기준 서열 중 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95%는 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드와 일치하거나 또는 그에 의한 보존성 치환을 포함할 수 있거나, 또는 기준 서열 중, 보존성 치환을 포함하지 않고, 최대 15%, 바람직하게 최대 10%, 보다 더 바람직하게 최대 5%의 다수 아미노산 또는 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 바람직하게, 상동성 서열은 적어도 50, 보다 더 바람직하게 100, 보다 더 바람직하게 250, 보다 더 바람직하게 500 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다.
"보존성 치환"은 전체 기능성이 유의하게 변화되지 않도록, 크기, 소수성 등을 포함한 유사한 특징 또는 성질을 갖는 다른 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 치환을 의미한다.
본 발명은 또한 PCV3 단백질의 돌연변이, 예컨대 제한없이 PCV3 캡시드 단백질의 돌연변이를 포괄한다. PCV2 및 부리와 깃털 질환 바이러스 (BFDV) 간 캡시드 아미노산 서열의 분기성에도 불구하고, 결정 구조는 그들 서열 분기성에도 불구하고 매우 유사하다. 유리하게, PCV3의 돌연변이는 PCV3은 바이러스-유사 입자 (VLP)를 안정화시키는 것이다. PCV3 캡시드 단백질은 VLP로 자가-조립되어야 하지만, PCV3 단백질의 발현 수준은 PCV2 캡시드 단백즐과 비교하여 유의하게 더 낮다. 특히, 단백질의 오직 약 20%만이 VLP로 조립되는 반면 단백질의 나머지 80%는 불용성 분획으로 응집된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 단백질은 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질에 비해서 VLP의 수율이 더 높을 수 있다. 더 높은 수율, 특히- 그리고 예를 들어, -은 더 높은 몰 수율과 관련된다는 것을 이해한다. 대안적으로 표현하면, 본 발명의 변이체 단백질은 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질에 비해서 CAP (캡시드 (ORF2) 단백질) VLP의 조립을 더 많이 할 수 있다. 더 높은 수율의 예는 적어도 5% 더 높은 수율, 또는 적어도 10% 더 높은 수율, 또는 적어도 15% 더 높은 수율, 또는 적어도 20% 더 높은 수율, 또는 적어도 25% 더 높은 수율, 또는 적어도 30% 더 높은 수율, 또는 적어도 35% 더 높은 수율, 또는 적어도 40% 더 높은 수율, 또는 적어도 50% 더 높은 수율을 포함한다. 따라서, 예를 들어, PCV3 ORF2 단백질의 변형이 없다면, 배큘로바이러스 발현에 의해서, 예를 들어, 20% PCV3 가용성 단백질 (VLP) 및 80% PCV3 불용성 단백질이 존재하고, 변형이 있으면, 대신에 25%, 또는 30%, 또는 35%, 또는 40%, 또는 45%, 또는 50%, 또는 55%, 또는 60% 이상의 PCV3 가용성 단백질 (VLP) (그리하여 PCV3 가용성 단백질 (VLP)의 5% 또는 10%, 또는 15%, 또는 20%, 또는 25%, 또는 30%, 또는 35%, 또는 40%, 또는 45% 등의 증가가 존재)이 존재하고, 이것은 더 높은 수율을 의미한다. 유리하게, PCV3 ORF2 단백질의 변형으로, VLP 수율 (가용성 PCV3 단백질)은 재조합 배큘로바이러스 시스템에 의해 발현되는 PCV3 단백질의 적어도 50%이다.
본 발명에서 사용에 적합한 어세이 및 기술은 돼지 써코바이러스 캡시드 (ORF2) 단백질의 바이러스-유사 입자 (VLP)로의 조립 및 분해를 추적 또는 정량하는데 사용된 것들을 포함하고 이들은 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA), 임의로 은 염색 또는 쿠마시 염색의 SDS/PAGE, 웨스턴 블롯, 면역블롯, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 동적 광 산란법 (DLS) 또는 다중-각도 광 산란법 (MALS), 투사 전자 현미경 (TEM), 분석용 초원심분리, 및 임의로 고성능 액상 크로마토그래피 (HPLC)와 결합된 형광 분광 분석 (FSA)을 포함한다. 추가의 적합한 기술은 또한 단백질-핵산 복합체의 아가로스 겔 지연 시험, 면역 확산 시험, 예를 들어 단순 방사 면역확산법 (SRID), 나노입자 추적 분석 (NTA), 물질대사 표지화 및 화학발광 효소-기반 어세이를 포함할 수 있다. 이들 어세이 각각은 당분야에 충분히 공지되어 있고, 예를 들어, 하기의 문헌들에 기술되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다: Fang, Mingli et al. "Detection of the Assembly and Disassembly of PCV2b Virus-like Particles Using Fluorescence Spectroscopy Analysis", Intervirology vol.58, 2015, pp.318-323; Thompson, Christine et al. "Analytical technologies for influenza virus-like particle candidate vaccines: challenges and emerging approaches", Virology Journal vol 10, 2013, p.141; Steppert, Petra et al."Quantification and characterization of Virus-like Particles by size-exclusion chromatography and nanoparticle tracking analysis", Journal of Chromatography A vol.1487, 2017, pp.89-99; Yadav, Shalini et al. "A facile quantitative assay for viral particle genesis reveals cooperativity in virion assembly and saturation of an antiviral protein", Virology, vol 429, No. 2, 2012, pp. 155-162; 및 Zeltins, Andris"Construction and Characterization of Virus-like Particles: A Review" Molecular Biotechnology vol.53, 2013, pp. 92-107.
일 양태에서, 본 발명의 변이체 단백질은 웨스턴 불롯 분석으로 결정가능한 바와 같이 SEQ ID NO. 1에 의해 코딩되는 단백질에 비해서 VLP의 수율이 더 높을 수 있다. 다른 말로, 본 발명의 변이체 단백질은 웨스턴 블롯 분석으로 결정가능한 바와 같이 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질에 비해서 CAP VLP의 조립을 더 많이 할 수 있다.
본 명세서에서 논의되는 다양한 구현예에서 예를 들어, VLP 수율을 증가시키기 위해서 PCV3 ORF2 캡시드 단백질 돌연변이 또는 돌연변이들이 존재한다. 예를 들어, 다양한 구현예에서 FG 루프에 1, 2, 3, 또는 4 돌연변이가 존재할 수 있다. 본 명세서에서 예시하고 기술되는 구현예는 QPFS (예를 들어, PCV2 ORF2 단백질 모티프)로 치환된 PCV3 ORF2 단백질 FG 루프의 SKKK을 포함할 수 있다. 치환(들)을 만드는 경우에, 당업자는 S를 Q로만 치환하거나 또는 제1 K를 P로만 치환하거나 또는 제2 K를 F로만 치환하거나 또는 제3 K를 S로만 치환하거나, 또는 이들 치환의 임의 조합, 예를 들어, S를 Q 및 제1 K를 P로 또는 S를 Q 및 제2 K를 F로 또는 S를 Q 및 제3 K를 S로, 또는 S를 Q 및 제1 K를 P로, 및 제2 K를 F, 또는 S를 Q 및 제1 K를 P로 및 제3 K를 S로 치환 등에 의해 본 발명을 실시할 수 있다. 유사하게, 이들 구현예에서, FG 루프 내 치환(들) 또는 돌연변이(들) 이외에도 또는 그에 대안으로서, 당업자는 PCV3 ORF2 단백질의 C-말단에 아미노산을 첨가하여 본 발명을 실시할 수 있다. C-말단에 첨가 또는 연장없이, PCV3 ORF2 단백질은 다른 써코바이러스 ORF2 또는 캡시드 단백질의 C-말단이 노출된 것과 대비하여, 3차원 구조에서 매장될 수 있다. PCV3 ORF2 단백질의 C-말단의 첨가 또는 연장이 존재하는 구현예에서, 다른 써코바이러스, 예컨대, 예를 들어, PCV2로부터의 모티프를 PCV3 ORF2 단백질의 C-말단에 첨가하거나 또는 연장시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 당업자는 PCV2 ORF2 단백질 또는 캡시드 단백질의 C-말단에 존재하는 아미노산, 예컨대 PCV2 ORF2 단백질 또는 캡시드 단백질의 아미노산 215-234 또는 215-233을 PCV3 ORF2 단백질의 C-말단에 첨가하거나 또는 연장시킬 수 있다. 당업자는 PCV3 ORF2 단백질 또는 캡시드 단백질에 PCV2 ORF2 단백질 또는 캡시드 단백질의 에피토프(들)를 첨가하거나 또는 연장시킬 수 있다. 이와 관련하여, [Trible et al.,"Antibody Recognition of Porcine Circovirus Type 2 Capsid Protein Epitopes after Vaccination, Infection and Disease, Clinical and Vaccine Immunology 18(5): 749-757 (2011) doi:10.1128/CVI.00418-10] (참조로 본 명세서에 편입됨)을 언급한다. PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질에서 면역반응성 영역은 잔기 47 내지 85, 165 내지 200, 및 200 내지 233 사이라고 보고된다. PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질의 항체 반응성 영역은 아미노산 23 내지 43, 71 내지 85, 117 내지 131, 및 171 내지 202 사이로 보고된다. 아미노산 117 내지 131의 PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질 영역은 우성 항체 인식 영역으로서 보고되고, 아미노산 156 내지 162, 175 내지 192, 195 내지 202 및 228 내지 223은 항체 인식과 연관된다고 보고된다. 다른 PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질 에피토프는 169-STIDYFQPNNKR, 예를 들어, 아미노산 169-180 (Y-173, F-174, Q-175, 및 K-179 아미노산 잔기는 항체 인식에 기여할 수 있음)이다. 다른 PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질 에피토프는 아미노산 43-233, 43-135, 43-160, 91-160, 43-180, 160-233, 135-233 및 91-233을 비롯하여, 아미노산 169-188일 수 있다. PCV2 ORF2 에피토프(들)의 임의 조합, 또는 임의의 이들은 PCV3 ORF2 (캡시드) 단백질에 C-말단 연장 또는 첨가될 수 있다. 이와 관련하여, PCV3 ORF2의 C-말단 연장은 최대 약 200 아미노산, 또는 최대 약 190 아미노산, 또는 최대 약 185 아미노산, 또는 최대 약 180 아미노산, 또는 최대 약 175 아미노산, 또는 최대 약 170 아미노산 또는 최대 약 165 아미노산, 또는 최대 약 160 아미노산 또는 최대 약 155 아미노산, 또는 최대 약 150 아미노산, 또는 최대 약 145 아미노산, 또는 최대 약 140 아미노산, 또는 최대 약 135 아미노산, 또는 최대 약 130 아미노산, 또는 최대 약 125 아미노산, 또는 최대 약 120 아미노산, 또는 최대 약 115 아미노산, 또는 최대 약 110 아미노산, 또는 최대 약 105 아미노산, 또는 최대 약 100 아미노산, 최대 약 90 아미노산, 또는 최대 약 80 아미노산 또는 최대 약 70 아미노산, 또는 최대 약 60 아미노산, 또는 최대 약 50 아미노산, 또는 최대 약 40 아미노산, 또는 최대 약 30 아미노산의 길이, 예를 들어, 1-50 아미노산 또는 10-50 아미노산 또는 10-40 아미노산 또는 20 내지 40 아미노산 또는 약 30 아미노산의 길이일 수 있다고 언급된다.
조성물이 본 발명의 PCV3 ORF2 (캡시드) 단백질을 함유하는 구현예에서, 예를 들어, 이러한 단백질은 돌연변이되었고, 예를 들어, 돌연변이는 C-말단의 첨가 또는 연장을 포함하고, 예를 들어, C-말단의 첨가 또는 연장은 PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질의 에피토프(들)를 포함하고, 조성물은 또한 PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질 (예를 들어, PCV2 및 PCV3 또는 이의 징후 또는 증상 또는 병태에 대한 1회-샷 투여 경우, 예를 들어 각각 배큘로바이러스 발현에 의하고, 예를 들어, 예컨대 본 개시 전반에 개시된 항원(들) 또는 돼지 병원체(들)의 하나 이상의 항원과 함께 또는 단독으로)을 포함하고, PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질 에피토프(들)은 조성물에 포함되는 PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질의 것과 동일하거나 또는 상이한 분기군인 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, PCV2 ORF2 (캡시드) 단백질 성분이 PCV2a 균주 (Ingelvac CircoFlex가 기반으로 할 수 있음) 유래라면, PCV3 ORF2 캡시드 단백질 (C-말단) 상의 첨가 또는 연장은 상이한 분기군, 예를 들어, PCV2b, PCV2c, 또는 PCVd-mPCV2b 유전자형에서 유래하는 것이 유리할 수 있다. PCV2 유전자형 또는 균주 또는 분기군과 관련하여, [Franzo et al.,"Revisiting the taxonomical classification of Porcine Circovirus type w (PCV2): still a real challenge," Virol J 12: 131 (2015) doi: 10.1186/s12985-015-0361-x (참조로 본 명세서에 편입됨)을 언급한다. PCV3 ORF2 캡시드 단백질 C-말단 첨가 또는 연장은 조성물의 PCV2 ORF2 캡시드 단백질 성분의 것과 동일한 분기군, 균주, 또는 유전자형이거나, 또는 상이한 분기군, 균주, 또는 유전자형이지만, 하나 이상의 PCV2 분기군, 균주, 또는 유전자형에 대해 면역학적 반응을 제공하는 PCV2 ORF2 캡시드 단백질의 에피토프인 것이 유리할 수 있다. 전술한, 보다 일반적으로, 본 개시 전반에서 논의되는 본 발명의 돌연변이형 PCV3 ORF2 캡시드 단백질과 관련하여, 본 발명은 이러한 돌연변이형 PCV3 ORF2 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 함유하는, 벡터, 예컨대 배큘로바이러스 벡터 (배큘로바이러스 발현 시스템을 통해서 PCV2 ORF2 캡시드 단백질을 발현하기 위한 그의 방법 및 재료는 본 명세서에 개시된 바와 같은 이러한 돌연변이형 단백질을 포함한 PCV3 ORF2 캡시드 단백질을 비롯하여, PCV2 ORF2 캡시드 단백질을 발현시키기 위해, 본 발명의 조성물에 이것이 포함되는 것이 바람직하다면, 본 발명의 실시에서 적용될 수 있으므로, 그에 인용되는 문헌과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는, EP 2 460821 A2 참조), 및 예컨대 벡터로 관련 세포를 감염 또는 형질감염 시켜서 본 발명의 이러한 돌연변이형 PCV3 ORF2 캡시드 단백질을 제조 또는 발현시키는 방법 (예를 들어, 벡터가 배큘로바이러스면, 관련 세포는 곤충 또는 Sf 또는 Sf+ 세포일 수 있음; 그에 인용된 문헌과 함께 참조로 본 명세서에 편입되는 EP 2 460 821 A2 참조)을 이해한다. 예를 들어, 고체를 분리하고 가용성 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 액체 또는 상청액을 유지시켜서, 발현 또는 생산 이후에 단백질을 회수 또는 단리하는 것이 유리하다. 이 단락뿐만 아니라 본 개시 전반에서 논의되는 조성물은 돌연변이형 PCV3 ORF2 캡시드 단백질 (및 임의로 추가로 PCV2 ORF2 캡시드 단백질 및/또는 돼지 병원체의 하나 이상의 추가 항원)을 본 개시 전반에서 논의되는 바와 같은 양으로 함유할 수 있고, 본 개시 전반에서 논의되는 용법(들), 예컨대 1회-샷, 또는 단일 용량, 투여로 투여할 수 있고, 본 개시 전반에서 논의되는 바와 같이 돼지 또는 자돈에게 그렇게 투여될 수 있다.
본 발명의 상황에서, 조성물, 예컨대 면역학적 조성물에서 항원으로서의 본 발명의 단백질은 PCV3에 대한 면역 반응을 유도, 자극 또는 증강시켜서 대상체에서 PCV3 감염-연관 질환 또는 병태를 예방 또는 치료한다.
이전 연구들은 N-말단 아르기닌 풍부 모티프 (ARM) 내에 존재하는 NLS 도메인 및 전체-길이 PCV3 cap 유전자의 발현이 단백질의 미스폴딩을 초래할 수 있고 10-12 nm의 원형 바이러스 복합체의 형성을 유도한다는 것을 보여주었다 (Sarker et al. Nat Commun. 2016 Oct 4; 7():13014). Wang 등 (AMB Expr 10, 3 (2020) https://doi.org/10.1186/s13568-019-0940-0)은 이. 콜라이에서 성공적으로 발현된 자기-조립되는 PCV3 VLP의 능력을 보고하였고 임상 돼지 혈청의 특이적 항체를 검사하기 위한 ELISA의 개발에 적용되었다. 특히, 이. 콜라이에서 재조합 PCV3 Cap의 높은 수준의 발현을 획득하기 위해서, 야생형 전체 Cap (wt-eCap)의 유전자는 임상 샘플로부터 증폭시켰고, 3개의 최적화된 전체 Cap (opti-eCap) 및 wt-eCap을 갖는 동일 아미노산 서열을 코딩하는 하나의 최적화된 Cap 결실된 핵 위치 신호 (NLS) (opti-dCap) 유전자 단편은 이. 콜라이의 코돈 편향성을 기반으로 합성하였다. 본 발명과 달리, PCV3 캡시드의 NLS 이외의 영역은 VLP 조립 및/또는 안정성과 관련하여 표적화되지 않았다. 더 나아가서, NLS의 제거는 반드시 개선된 VLP 조립을 일으키지 않는다. 그러나, 본 발명의 구현예는 예를 들어, 본 명세서에 논의되는 하나 이상의 FG 루프 돌연변이 및/또는 C-말단 연장(들)이외에도, PCV3 ORF2 캡시드 단백질 NLS의 제거 또는 변경을 포함할 수 있다.
유리한 구현예에서, 본 발명은 PCV 단백질, 예컨대 제한없이 PCV3 캡시드 단백질 중 양으로 하전된 아미노산을 코딩하는 돌연변이 영역을 포괄한다. 특히, PCV3 캡시드는 PCV3 캡시드의 5-배 계면에 위치된, FG 루프에 대량의 양전하를 함유한다. 이 영역 내 대량의 양전하는 VLP에서 예상되는 바와 같이, 핵산의 존재없이 반발력을 일으킬 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 양으로 하전된 아미노산은 중성 및/또는 음으로 하전된 아미노산으로 돌연변이된다. 유리한 구현예에서, 이 루프 내 리신 및 히스티딘은 PCV2 캡시드 유래의 아미노산으로 돌연변이된다 (SEQ ID NO: 6).
일 구현예에서, 본 발명은 비-조작된 PCV3 ORF2 단백질과 비교하여 감소된 양의 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 조작된 PCV3 ORF2 단백질을 제공한다. 비-조작된 단백질은 야생형 또는 천연 발생 PCV3 ORF2 단백질일 수 있거나 또는 패키지가능한 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재 하에서 개선된 자가-조립같이, 캡시드 형성 활성을 개선시키는 것이 바람직한 다른 목적을 위해 이미 변형된 ORF2 단백질일 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산은 치환된, 예컨대 하나 이상의 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘, 또는 이의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 둘 이상의 양으로 하전된 아미노산이 치환된다. 일 구현예에서, 셋 이상의 양으로 하전된 아미노산이 치환된다. 일정 구현예에서, ORF2 단백질의 영역, 예컨대 제한없이 FG 루프와 연관된 전하는 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산으로 치환하여 더 음성으로 만든다. 일정 구현예에서, 양으로 하전된 아미노산은 적게 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고/되거나, 비-양으로 하전된 아미노산은 더 음으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 즉, ORF2의 영역의 전하는 양 전하를 제거하고, 음전하를 첨가하거나, 또는 둘 모두에 의해 만들어질 수 있다.
유리한 구현예에서, 본 방법은 PCV 단백질, 예컨대 제한없이 PCV3 캡시드 단백질에 추가 아미노산을 첨가하는 것을 포괄한다. PCV3 캡시드 C-말단의 짧은 소수성 성질은 캡시드에 매장된 C-말단을 야기시킬 것이고 핵산의 존재없이 VLP 불안정성을 초래할 수 있다. 대조적으로, PCV2 및 BFDV 캡시드 단백질의 C-말단은 캡시드로부터 멀리 돌출된다. 일 구현예에서 PCV3 캡시드의 C-말단은 약 1 내지 50 아미노산, 약 10 내지 40, 아미노산, 또는 약 20 내지 30 아미노산 만큼 연장된다. 다른 구현예에서, PCV3 캡시드의 C-말단은 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39 또는 약 40 아미노산 만큼 연장된다. 유리한 구현예에서, PCV3 캡시드 단백질의 C-말단은 중지 코돈을 돌연변이시켜 연장된다. 특히 유리한 구현예에서, PCV3 캡시드 단백질에 대한 천연 중지 코돈은 돌연변이되고 C-말단은 바이러스 서열 내 다음 중지 코돈까지 연장되었다 (SEQ ID NO: 7). 다른 구현예에서, PCV 캡시드의 C-말단은 다른 돼지 써코바이러스의 C-말단으로 교환될 수 있고/있거나 연장될 수 있다. PCV3 캡시드 단백질의 C-말단은 약 50 내지 약 200 아미노산, 약 60 내지 약 190 아미노산, 약 70 내지 약 180 아미노산, 약 80 내지 약 170 아미노산, 약 90 내지 약 160 아미노산 또는 약 100 내지 약 150 아미노산이 연장될 수 있다.
일정 구현예에서, C-말단 연장은 예를 들어 중지 코돈의 돌연변이에 의해서, PCV3 캡시드의 C-말단에 아미노산의 첨가를 포함한다. 중지 코돈은 결실, 치환, 또는 삽입을 통해 돌연변이될 수 있다. 일정 구현예에서, C-말단 연장은 C-말단으로부터 하나의 잔기, 또는 C-말단으로부터 2개 잔기, 또는 C-말단으로부터 상류에 3개 잔기, 또는 4개 잔기, 또는 5개 잔기, 또는 6개, 또는 7개, 또는 8개, 또는 그 이상의 잔기의 아미노산의 삽입을 포함하여, C-말단 근처에 아미노산의 삽입을 포함한다. 일 구현예에서 잔기는 음으로 하전된 아미노산의 임의 세트일 수 있다.
본 발명의 단백질은 본 명세서에 예시되고 기술된 정확한 서열과 상이할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라서 서열이 기능하는 한, 표시된 서열에 결실, 첨가, 및 치환을 고려한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 보존성 성질, 즉 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 치환일 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 4개 패밀리로 분류된다: (1) 산성--아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 이소류신 또는 발린으로 류신의 단리 또는 비-천연 발생 치환, 또는 그 반대; 글루타메이트로 아스파테이트의 치환; 또는 그 반대; 세린으로 트레오닌의 치환 또는 그 반대; 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 보존성 치환은 생물학적 활성에 대해 주요한 효과를 갖지 않는다는 것을 타당하게 예측가능하다. 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 소수의 아미노산 치환을 보유하지만 예시되고 기술된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 그러므로, 본 발명의 범주 내이다.
본 발명은 본 발명의 항원의 기능적 및/또는 항원적으로 균등한 변이체 및 유도체 및 이의 기능적으로 균등한 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포괄한다. 이들 기능적으로 균등한 변이체, 유도체, 및 단편은 항원성 활성을 유지하는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않는 DNA 서열 내 변화를 비롯하여, 아미노산 잔기의 보존성 치환을 일으키는 것, 하나 또는 소수의 아미노산 결실 또는 첨가, 및 아미노산 유사체에 의한 아미노산 잔기의 치환은 코딩된 폴리펩티드의 성질에 유의하게 영향을 미치지 않을 것들이다. 보존성 아미노산 치환은 글리신/알라닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌/메티오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신/트립토판이다. 일 구현예에서 변이체는 관심 항원, 에피토프, 면역원, 펩티드 또는 폴리펩티드와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 치환은 아미노산을 유사한 화학적 구조, 유사한 화학적 성질 또는 유사한 측쇄 부피의 다른 아미노산으로 치환시키는 보존성 변화를 도입시킨다. 도입된 아미노산은 그들이 치환되는 아미노산에 대해 유사한 극성, 친수성, 또는 소수성을 가질 수 있다. 보존성 아미노산 변화는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우에, 이것은 또한 아미노산 측쇄에 대해 수치요법 척도를 참조하여 결정할 수 있다.
보존성 아미노산 변화는 또한 아미노산 서열의 보존을 위한 채점 매트릭스의 PAM (Point Accepted Mutation) 또는 BLOSUM (BLOcks Substitution Matrix) 패밀리를 참조하여 결정할 수 있다. 따라서, 보존성 아미노산 변화는 균등한 그룹의 구성원일 수 있고, 기준 및 돌연변이체 폴리펩티드 사슬의 정렬에서 사용을 위해 선택되는 채점 매트릭스의 유사성 표시에서 상호 양성 점수를 갖는 아미노산의 세트이다.
비극성 아미노산이 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 아미노산 프롤린은 비극성으로서 분류되지만, 또한 강성의 성질을 갖고 2차 구조의 변화를 초래할 수 있다. 예를 들어, 프롤린은 종종 헬릭스의 말단에서 발견된다. 또한, 소정 아미노산 잔기의 측쇄의 특별한 상황에 의존하여, 예를 들어, 일반적으로 이의 방향족 고리로 인해 비-극성으로서 분류되는 아미노산 티로신은 이의 히드록실 기를 통해서 극성 아미노산 잔기 예컨대 트레오닌에 유사한 기능성 효과를 가질 수 있다. 따라서, 티로신은 본 발명의 목적을 위해서 비-극성 및 극성 아미노산 둘 모두인 것을 고려할 수 있다. 더 나아가서, 극성 또는 친수성으로서 설명되는 아미노산은 비하전 또는 하전될 수 있고, 또한 염기성 또는 산성일 수 있다. 아미노산 히스티딘은 7 근처에서 pKa 값을 갖는다고 충분히 공지되어 있어서, 단백질 환경에 의존하여 중성 pH에서, 이의 측쇄에 양성화될 수 있거나 또는 양성화되지 않을 수 있어서, 전하를 보유할 수 있거나 또는 보유하지 않을 수 있다. 따라서, 히스티딘은 본 발명의 목적을 위해서 극성 하전 또는 극성 비하전 아미노산 잔기인 것을 고려할 수 있다.
본 명세서에서 논의되는 돌연변이는 일반적으로 당분야에 공지된 방법, 예컨대 단백질의 부위 지정 돌연변이유발법, PCR 및 유전자 셔플링 방법을 사용하거나 또는 부위-지정 돌연변이유발법의 사이클에서 다수 돌연변이원 올리고뉴클레오티드의 사용을 통해서 단백질에 도입된다. 따라서, 돌연변이는 지정적 또는 무작위적 방식으로 도입될 수 있다. 따라서 돌연변이유발 방법은 하나 이상의 상이한 돌연변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 생성시킨다.
배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터 (BaculoG/PCV3 ORF2 Clone 4B4-2E12 Pre-MSV p8; lot no.3624-039)의 제어 하에 돼지 써코바이러스 3형 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스의 개발은 실시예 1에 기술된다. 일부 구현예에서, 백신에서 실시예 1에 기술된 이러한 재조합 배큘로바이러스의 사용은 재조합 바이러스의 사멸 및/또는 불활성화된 형태를 포괄할 수 있다. 대안적으로, 일부 백신에서, 예를 들어, 실시예 1에 표시된 것과 유사한, 재조합 바이러스는 생, 변형 바이러스로서 사용될 수 있다.
도 1B는 재조합 배큘로바이러스 BaculoG/PCV3 ORF2의 서열, SEQ ID NO:2을 제공한다. 골격 서열 주석은 Genbank 등록번호 NC_001623 유래이다. 당업자는 DNA 서열의 복잡성을 고려하면 구성체마다 골격 중 소수 돌연변이가 예상된다는 것을 이해할 것이다. 구성체의 맵은 도 2에 도시된다. 배큘로바이러스 발현 벡터, BaculoG/PCV3 ORF2는 PCV3 백신 및/또는 대조군을 개발하는데 사용될 수 있다. 소정 백신 및/또는 대조군에 바람직한 보강제는 사용되는 발현 벡터의 유형을 기반으로, 상이할 수 있고, 예를 들어, 생, 생 변형, 불활성화, 또는 사멸될 수 있다. 보강제 유형은 사용되는 벡터 (예를 들어, 바이러스)의 상태를 기반으로 가변적일 수 있다. 백신에서 사용되는 보강제의 양은 사전결정될 수 있고, 예를 들어, 사전결정된 백분율은 소정 보강제 및/또는 보강제의 조합에 대해 소정 범위 (예를 들어, 백신 중 중량 백분율 및/또는 부피 백분율) 내에 있는 것을 선택할 수 있다. 일부 예에서, 예를 들어, 생 백신을 사용할 때, 다수 보강제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 보강제 예컨대 카르보폴 및 몬타니드 ISA 207VG의 조합이 사용될 수 있다. 대안적으로, 생 발현 벡터, 예컨대 BaculoG/PCV3 ORF2를 포함하는 백신은 ISA 207VG 및/또는 카르보폴로 보강될 수 있다. 예를 들어, 보강제는 사전결정된 농도로 백신에 존재할 수 있다. 예를 들어, 백신은 백신의 중량을 기준으로 50% 농도의 ISA 207VG를 포함할 수 있다. 대안적으로, 생 BaculoG/PCV3 ORF2를 포함하는 다른 백신은 보강제, 예컨대 카르보폴을 백신의 부피를 기준으로 20%로 포함할 수 있다.
사멸된 발현 벡터, 예컨대 바이러스를 포함하는 백신은 보강제로서 카르보폴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사멸된 BaculoG/PCV3 ORF2를 포함하는 백신은 일부 구현예에서, 효과적인 보강제로서 카르보폴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 백신은 보강제를 사전결정된 양으로, 예를 들어, 백신의 사전결정된 중량 또는 부피 백분율로 포함할 수 있다. 특히, 사멸된 BaculoG/PCV3 ORF2를 포함하는 백신은 카르보폴을 백신의 부피를 기준으로 20%로 포함할 수 있다. 대안적으로, 백신은 백신 용액의 중량의 약 50%로 보강제 및 사멸된 BaculoG/PCV3 ORF2를 포함할 수 있다.
예를 들어, 사멸된 BaculoG/PCV3 ORF2를 포함하는 백신은 ISA 207VG를 보강제로서 백신의 사전결정된 중량 백분율, 예컨대 50%로 포함할 수 있다.
예를 들어, 배큘로바이러스 발현 벡터 BaculoG/PCV3 ORF2는 본 명세서에 요약된 바와 같이 2종 PCV3 백신 및 대조군을 개발하는데 사용되었다:
BaculoG/PCV3 ORF2, P9의 개발; 생, 50% ISA 207VG 보강 백신 (백신을 개발하는데 사용되는 방법은 실시예 3에 개시됨).
BaculoG/PCV3 ORF2, P9의 개발; 생, 20% 카르보폴 보강 백신 (백신을 개발하는데 사용되는 방법은 실시예 4에 개시됨).
대조군 - BaculoG/비삽입, P4의 개발; 생, 20% 카르보폴 보강 백신 (백신을 개발하는데 사용되는 방법은 실시예 5에 개시됨).
BaculoG/PCV3 ORF2, P9의 개발; 사멸, 50% ISA 207VG 보강 백신 (백신을 개발하는데 사용되는 방법은 실시예 3에 개시됨).
BaculoG/PCV3 ORF2, P9의 개발; 사멸, 20% 카르보폴 보강 백신 (백신을 개발하는데 사용되는 방법은 실시예 4에 개시됨).
대조군 - BaculoG/비삽입, P4의 개발; 사멸, 20% 카르보폴 보강 백신 (백신을 개발하는데 사용되는 방법은 실시예 5에 개시됨).
백신의 효능은 PCV3 전체 바이러스 및 PCR 양성 조직을 사용해 시험될 수 있다 (저계측수). 조직으로부터의 균질물을 생성시키고 시퀀싱할 수 있다. 균질물 및/또는 전체 바이러스는 백신접종된 동물을 챌린지하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 백신의 효능을 검사하기 위해서, PCV3 전체 바이러스 및 PCR 양성 조직 (저계측수)을 제공하였다. 조직으로부터의 균질물을 생성시켰고 시퀀싱하였다. 균질물 및 전체 바이러스는 백신접종된 동물을 챌린지하는데 사용될 수 있다.
본 개시의 PCV3 재조합 ORF2 단백질 서브유닛 백신 및/또는 면역원성 조성물은 (PCV2 ORF2 단백질 대신) PCV3 ORF2 단백질을 발현하도록 변형된, WO 2006/072065, 실시예 1의 방법을 사용해 제조될 수 있다.
PCV3 ORF2 코딩 서열은 PCV3 게놈 DNA 및/또는 합성적으로 합성된 PCV3 ORF2로부터 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해서 증폭될 수 있다. 제한효소 부위는 바람직한 코딩 서열을 전달 벡터에 삽입시켜 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 증폭된 PCV3 ORF2 코딩 서열은 측접된 제한 효소 부위와 함께 출발 코돈의 바로 5'에 코작 공통 서열을 포함할 수 있다 (참조: 예를 들어, Kozak M (October 1987) Nucleic Acids Res.15 (20): 8125-8148).
일부 구현예에서, 증폭된 PCV3 ORF2 코딩 서열은 바람직한 전달 벡터를 생성시키기 위해서 측접 제한효소 부위를 이용하여 배큘로바이러스 전달 벡터에 서브클로닝될 수 있다. 예를 들어, 증폭된 PCV3 ORF2 코딩 서열은 전달 벡터 예컨대 pVL1392-PCV3 ORF2 또는 pVL1393-PCV3 ORF2를 생성시키기 위해서 측접된 제한효소 부위를 이용하여 배큘로바이러스 전달 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 당분야에 일반적으로 공지된 다른 전달 벡터가 사용될 수 있다. 재조합 배큘로바이러스는 전달 벡터 및 배큘로바이러스 DNA로 곤충 세포의 공-형질감염을 통해 생성될 수 있다. 사용된 배큘로바이러스 DNA는 선형화 및/또는 원형 배큘로바이러스 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 재조합 배큘로바이러스는 전달 벡터 (예를 들어, 예컨대 pVL1392-PCV3 ORF2 및/또는 pVL1393-PCV3) 및 선형화 BaculoGoldTM 배큘로바이러스 DNA로 Sf9 (스포돕테라 프루지페르다) 곤충 세포의 공-형질감염을 통해서 생성될 수 있다. 선형화된 배큘로바이러스 DNA는 오토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) 핵 다면체증 바이러스 (AcNPV)로부터 유래될 수 있고 폴리헤드린 유전자좌에 치명적인 결실을 함유할 수 있고, 그러므로, 살아있는 배큘로바이러스의 구제는 전달 벡터, 예컨대 pVL1392-PCV3 ORF2 및/또는 pVL1393-PCV3 ORF2에 의한 공-형질감염 시에 생성될 수 있다. 최종 재조합 배큘로바이러스는 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 PCV3 ORF2 코딩 서열을 포함할 수 있다. 재조합 배큘로바이러스는 Sf9 곤충 세포에서 증폭될 수 있고 이후에 Sf9 곤충 세포에서 제한 희석 클로닝을 통해 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 전체 길이 원형 배큘로바이러스 DNA 예컨대 Bac-to-Bac이 사용될 수 있다. 예를 들어, Bac-to-Bac은 폴리헤드론 유전자좌에 관심 유전자를 삽입시키기 위해 트랜스포존-매개 재조합을 사용할 수 있다. 당분야에 공지된 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 상업화 동안 방법의 잠재적 안정성을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 백신에서 증가된 안정성을 부여하는 배큘로바이러스가 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 마스터 세포 배양물로 플라스크를 파종한 후에, 플라스크는 사전결정된 온도에서 특별한 시간 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 배양물은 27℃에서 4시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 다음으로 각각의 플라스크는 PCV3 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스가 파종될 수 있다. 예를 들어, PCV3 ORF2 유전자를 함유하는 pVL1392 플라스미드는 BaculoGold® (BD Biosciences Pharmingen) 배큘로바이러스 DNA로 Sf+ 곤충 세포 (Protein Sciences, Meriden, CT)를 공-형질감염시켜서 PCV3 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스를 생성시킬 수 있다. PCV3 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스는 플라스-정제될 수 있고 마스터 씨드 바이러스 (MSV)는 SF+ 세포주 상에서 전파되어, 분취시켜서, -70℃에서 저장되었다. MSV는 배큘로바이러스 특이적 프라이머를 사용한 PCR-RFLP를 통해서 PCV3 ORF2 배큘로바이러스로서 양성으로 확인될 수 있다. MSV 또는 워킹 씨드 바이러스를 생성시키기 위해 PCV3 ORF2 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포는 간접 형광 항체 어세이에서 다클론 혈청 또는 단일클론 항체에 의해 검출되는 PCV3 ORF2 항원을 발현시킬 수 있다. 추가로, PCV3 ORF2 배큘로바이러스의 정체는 N-말단 아미노산 시퀀싱을 통해서 확인할 수 있다. PCV3 ORF2 배큘로바이러스 MSV는 또한 9 C.F.R. 섹션 113.27 (c), 113.28, 및 113.55에 따라 순도에 대해 검사된다. 스피너 플라스크에 파종된 각각의 재조합 배큘로바이러스는 다양한 다중 감염도 (MOI)를 가질 수 있다.
배큘로바이러스의 파종 이후에, 플라스크는 27 ± 2℃에서 7일 동안 인큐베이션될 수 있고 또한 그 시간 동안 100 rpm에서 교반될 수 있다. 플라스크는 환기캡을 사용하여 공기가 흐를 수 있게 할 수 있다. 이러한 플라스크로부터의 샘플을 다음 7일 동안 24시간 마다 채취할 수 있다. 추출 후에, 각 샘플을 원심분리할 수 있고, 펠렛 및 상청액 둘 모두를 분리시킨 다음에 0.45-1.0 ㎛ 포어 크기 막을 통해 미세여과시킬 수 있다.
최종 샘플 중 ORF3의 양을 이후 ELISA 어세이를 통해서 정량될 수 있다. ELISA 어세이는 0.05 M 카보네이트 완충액 (pH 9.6) 중에 1:6000으로 희석된 항-PCV3 항체로 수행할 수 있다. 다음으로 100 ㎕의 항체를 마이크로타이터 플라이트의 웰이 위치시키고, 밀봉하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션시킬 수 있다. 이어 플레이트는 0.5 mL의 Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO), 100 mL의 1OX D-PBS (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA), 및 899.5 mL의 증류수를 포함하는 세척 용액으로 3회 세척하였다. 이후에, 250 ㎕의 차단 용액 (증류수로 100 mL까지 10 mL의 D-PBS QS 중 5 g 카네이션 탈지분유 (Nestle, Glendale, CA))은 각 웰에 첨가된다. 다음 단계는 검사 플레이트를 세척하고 사전 희석된 항원을 첨가하는 것이다. 사전 희석된 항원은 200 ㎕의 희석 용액 (999.5 mL D-PBS 중 0.5 mL Tween 20)을 희석 플레이트 상의 각 웰에 첨가하여 생성시킨다. 이어 샘플을 1:240 비율 및 1:480 비율로 희석하고, 100 ㎕의 각각의 이들 희석된 샘플을 희석 플레이트의 상부 웰 중 하나에 첨가한다 (즉, 하나의 상부 웰은 100 ㎕의 1:240 희석물을 수용하고 나머지는 100 ㎕의 1:480 희석물을 수용함). 다음으로 100 ㎕를 각각의 연속 웰로부터 제거하여 이것을 플레이트 상의 다음 웰로 옮겨서 플레이트의 나머지에서 연속 희석을 수행할 수 있다. 각각의 웰은 다음 전달을 수행하기 전에 혼합된다. 검사 플레이트 세척은 세척 완충액으로 3회 플레이트를 세척하는 단계를 포함한다. 다음으로 플레이트를 밀봉하고 세척 완충액으로 3회 이상 세척하기 전에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 사용되는 검출 항체는 PCV ORF2에 대한 항체이다. 희석 용액 중에 1 대 300으로 희석되고, 100 ㎕의 희석된 검출 항체가 웰에 첨가된다. 플레이트를 밀봉하고 세척 완충액으로 3회 세척하기 전에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 접합체 희석물은 1% 농도까지 희석 용액에 정상 토끼 혈청 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)을 첨가하여 제조된다.
접합 항체 염소 항-마우스 (H+1)-HRP (Jackson Immunoresearch)는 1:10,000 까지 접합체 희석물에 희석된다. 100 ㎕의 희석된 접합 항체가 웰 각각에 첨가된다. 이어서 플레이트를 밀봉하고 세척 완충액으로 3회 세척 전에 45분 동안 37℃에서 인큐베이션된다. 동일 부피의 퍼옥시다제 기질 B (KPL)와 혼합된, 100 ㎕의 기질 (TMB Peroxidase Substrate, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, MD)이 각 웰에 첨가된다. 플레이트는 실온에서 15분 동안 인큐베이션된다. 다음으로 100 ㎕의 IN HCL 용액을 모든 웰에 첨가하여 반응을 중지시킨다. 다음으로 플레이트를 ELISA 판독기를 통해 판독한다.
유리한 곤충 세포를 배양할 수 있고, PCV3 ORF2 단백질은 무혈청 조건 하에서; 예컨대 USP 6,103,526의 무혈청 곤충 세포 (expresSF+ 세포주) 하에서 생산된다.
미국 특허 제9610345호 및 제9669087호에 개시된 보강제, 세포 배양 상청액, 보존제, 안정화제, 바이러스 벡터, 면역조절제, 및 용량을 고려하고 이들 둘은 참조로 본 명세서에 편입된다.
본 명세서에서 사용되는 면역원성 조성물은 PCV3에 대한 면역 반응을 유도하고 PCV3 감염과 연관된 임상 증상의 중증도를 예방, 감소, 및/또는 경감시키는데 효과적이다. 조성물은 일반적으로 적어도 하나의 PCV3 항원을 포함한다.
돼지에서 PCV3은 광범위하게 다양한 증상을 나타낼 수 있고 많은 경우에 개별 동물은 잠재적 증상의 오직 적은 서브세트를 나타낸다. PCV3의 존재와 연관된 증상은 바이러스혈증, 바이러스 배출, 예를 들어, 신체 배출물, 예컨대 초유, 모유, 분변, 타액, 및 눈 면봉 중 바이러스 핵산의 존재를 포함한다. 예를 들어, 그 개시가 참조로 편입되는, [Jiang et al., "Induction of porcine dermatitis and nephropathy syndrome in piglets by infection with porcine circovirus type 3", J. Virol. doi:10.1128/JVI.02045-18]은 PCV3으로 자돈의 접종 및 최종 임상 징후의 관찰에 관한 것이다. 본 개시는 본 개시의 조성물을 투여하여 PCV3에 의해 초래되는 돼지 피부염 및 신장병증 증후군 (PDNS)-유사 질환, 림프구 이형성증 및 괴사의 증상을 치료 및/또는 감소시키는 것에 관한 것이다.
특히 어린 돼지 또는 자돈, 예를 들어, 15주령 미만, 예컨대 10주령 미만, 예를 들어, 6주령 미만, 예를 들어, 3주령, 2주령 또는 1주령 미만 또는 출생시 돼지 또는 자돈에서 항체의 단순 존재는 PCV3에 노출 및/또는 질환을 의미하는 것이 아닐 수 있다. PCV3에 대한 노출 및/또는 항체를 갖는 돼지 또는 자돈은 예를 들어, 증상의 중증도를 감소 또는 예방 또는 경감하여, 본 개시의 조성물의 이득을 여전히 누릴 수 있다.
따라서, 본 개시의 조성물은 보호 면역 반응일 수 있는 면역 반응을 유발하는 방법을 비롯하여, 증상의 중증도를 감소 또는 예방 또는 경감시키는 방법에서 사용할 수 있고, 증상의 중증도를 감소 또는 예방 또는 경감시키기 위한 용량, 제제 등은 면역 반응을 유발하는 방법을 위한 것이다. 따라서, 면역 반응의 유발과 관련하여 본 명세서에서 기술된 방법에 있어서, 이들 방법은 증상의 중증도를 감소 또는 예방 또는 경감시키기 위해 실시될 수 있고; 면역 반응을 유발시키는데 유용한, 본 명세서에 기술된 조성물은 유사하게 증상의 중증도를 감소 또는 예방 또는 경감시키기 위해서 그리고 그를 위한 조성물 (뿐만 아니라 면역 반응을 유발시키기 위한 조성물)에 유용하다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성 조성물"은 PCV3 항원을 함유하는 임의의 약학 조성물을 의미하고, 이러한 조성물은 대상체에서 PCV3 감염-연관 질환 또는 병태를 예방하거나 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직한 면역원성 조성물은 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시킬 수 있거나, 자극시킬 수 있거나, 또는 증강시킬 수 있다. 따라서 이 용어는 하기 기술된 바와 같은 서브유닛 면역원성 조성물뿐만 아니라, 전체 사멸, 또는 약독화 및/또는 불활성화 PCV3을 함유하는 조성물을 포괄한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서브유닛 면역원성 조성물"은 모든 항원은 아니나, PCV3으로부터의 항원에서 유래하거나 또는 그에 상동성인, 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드 또는 항원을 함유하는 조성물을 의미한다. 이러한 조성물은 온전한 PCV3이 실질적으로 없다. 따라서, "서브유닛 면역원성 조성물"은 PCV3으로부터의 적어도 부분적으로 정제 또는 분획화 (바람직하게 실질적으로 정제)된 면역원성 폴리펩티드, 또는 이의 재조합 유사체로부터 제조된다. 서브유닛 면역원성 조성물은 PCV3으로부터의 다른 항원 또는 폴리펩티드가 실질적으로 없는 관심 서브유닛 항원 또는 항원들, 또는 분획화된 형태를 포함할 수 있다. 바람직한 면역원성 서브유닛 조물은 하기 기술된 바와 같은 PCV3 ORF2 단백질을 포함한다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 또는 면역 반응"은 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주 내에서의 발생이다. 일반적으로, "면역 반응"은 하기 효과 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 관심 조성물 또는 백신에 포함되는 항원 또는 항원들에 특이적으로 유도되는, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γδ T 세포의 생산 또는 활성화. 바람직하게, 숙주는 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타내서 새로운 감염에 대한 내성이 증강되고/되거나 질환의 임상 중증도가 감소된다. 이러한 보호는 상기 기술된 바와 같은 PCV3 감염과 연관된 하나 이상의 증상의 수 또는 중증도의 감소, 또는 결여에 의해 입증될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드 또는 "항원"은 상기 기술된 바와 같은 면역학적 반응을 유발시키는 아미노산 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 임의의 PCV3 단백질의 전체 길이 서열, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. 용어 "면역원성 단편"은 하나 이상의 에피토프를 포함하여서, 상기 기술된 면역학적 반응을 유발시키는, 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당분야에 충분히 공지된, 임의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용해 확인할 수 있다. 예를 들어, [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 고형 지지체 상에서 다수의 펩티드, 단백질 분자의 일부분에 상응하는 펩티드를 동시에 합성하고, 지지체에 여전히 펩티드를 부착시킨 상태로 항체와 펩티드를 반응시켜서 결정할 수 있다. 이러한 기술은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제4,708,871호; [Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002]; [Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]에 기술되어 있으며, 이들 모두를 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 유사하게, 입체구조 에피토프는 아미노산의 공간적 입체구조를 예컨대 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명을 통해 결정하여 쉽게 확인된다. 예를 들어, [Epitope Mapping Protocols, 상동]을 참조한다.
합성 항원, 예를 들어, 폴리에피토프, 측접 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성 유래 항원이 또한, 이 정의에 포함된다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun.28-Jul.3, 1998.
본 개시의 바람직한 구현예에서, 면역 반응을 유도하고, 보다 바람직하게, PCV3 감염의 임상 징후에 대한 보호 면역성을 부여하는 면역원성 조성물이 제공된다. 조성물은 가장 바람직하게 조성물의 항원성 성분으로서, PCV3의 ORF2에 의해 발현되는, 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 과정 내에서, 조성물의 제조를 위해 본 명세서에서 사용되는, PCV3 ORF2 DNA 및 단백질은 PCV3 단리주 내에서 고도로 보존된 도메인이고, 그리하여, 임의의 PCV3 ORF2는 본 명세서에서 사용되는 PCV3 ORF2 DNA 및/또는 폴리펩티드의 공급원으로서 효과적일 것이다. 바람직한 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열로부터 번역된다. 바람직한 PCV3 ORF2 폴리펩티드가 본 명세서에서 제공되지만, 이러한 서열이 서열 상동성에서 6 내지 10%만큼 다양할 수 있고 여전히 면역원성 조성물에서 유용하게 만드는 항원성 특징을 보유한다는 것을 당업자는 이해한다. 게다가, 변형된 항원의 항원성 특징은 변형된 항원이 SEQ ID NO: 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, PCV3 ORF2 단백질과 비교하여 보호 면역성의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%를 부여할 때, 여전히 유지된다. 본 명세서에서 사용되는 "면역원성 조성물"은 PCV3 ORF2 단백질에 대한 세포 및/또는 항원-매개 면역 반응의 숙주 내 "면역학적 반응"을 유발시키는 PCV3 ORF2 단백질을 의미한다. 바람직하게, 이러한 면역원성 조성물은 PCV3에 대한 면역 반응을 유발 또는 증강시킬 수 있어서, PCV3 감염에 대한 보호 면역을 부여하고 이와 연관된 하나 이상, 및 바람직하게 모든 임상 징후의 발생, 중증도의 감소, 또는 예방을 제공한다.
일부 형태에서, PCV3 ORF2 단백질의 면역원성 부분은 조성물 중 항원성 성분으로서 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성 부분"은 각각 PCV3 ORF2 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드의 절두 및/또는 치환된 형태, 또는 단편을 의미한다. 바람직하게, 이러한 절두 및/또는 치환된 형태, 또는 단편은 전체-길이 ORF2 폴리펩티드로부터 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함할 것이다. 보다 바람직하게, 절두 또는 치환된 형태, 또는 단편은 전체-길이 ORF2 폴리펩티드로부터 적어도 10개, 보다 바람직하게 적어도 15개, 및 여전히 보다 바람직하게 적어도 19개의 인접한 아미노산을 가질 것이다. 이러한 서열은 더 큰 단편 또는 절두 형태의 일부일 수 있다는 것을 더욱 이해한다.
본 명세서에 제공되는 추가의 바람직한 PCV3 ORF2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 이러한 서열이 서열 상동성에서 6 내지 20% 만큼 다양할 수 있고 면역원성 조성물에서 유용하게 만드는 항원성 특징을 여전히 보유한다는 것을 당업자는 이해한다. 일부 형태에서, 이러한 PVC3 ORF2 폴리펩티드의 절두 또는 치환된 형태, 또는 단편은 조성물에서 항원성 성분으로서 사용된다. 바람직하게, 이러한 절두 또는 치환된 형태, 또는 단편은 전체-길이 ORF2 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 보다 바람직하게, 절두 또는 치환된 형태, 또는 단편은 전체-길이 ORF2 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 1의 적어도 30개, 보다 바람직하게 적어도 45개, 및 여전히 보다 바람직하게 적어도 57개의 인접한 뉴클레오티드를 가질 것이다.
당분야에 공지된 바와 같은 "서열 동일성"은 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 기준 서열 및 기준 서열과 비교하려는 소정 서열 간 관계를 의미한다. 서열 동일성은 이러한 서열의 스트링 간 일치성을 통해 결정되는, 서열 유사성의 최고 정도를 생성하도록 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 기준 서열과 소정 서열을 비교하여 결정된다. 이러한 정렬 시에, 서열 동일성은 위치별 기준으로 확인되며, 예를 들어, 서열은 그 위치에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일한 경우에 특정 위치에서 "동일"하다. 이러한 위치 동일성의 총 수는 기준 서열 중 뉴클레오티드 또는 잔기의 총 수로 나누어서 서열 동일성 %를 제공한다. 서열 동일성은 그의 교시가 참조로 본 명세서에 편입되는, 하기 문헌들에 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 공지 방법으로 쉽게 계산할 수 있다: Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). 서열 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열 간 최대 일치를 제공하도록 디자인된다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 소정 서열 간 서열 동일성을 결정하는 공공으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 분류된다. 이러한 프로그램의 예는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처로부터 공공으로 입수가능하다 (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 이의 교시는 참조로 본 명세서에 편입됨). 이들 프로그램은 소정 및 기준 서열 간 서열 동일성의 최고 수준을 생성시키기 위해 디폴트 갭 가중치를 사용하여 서열을 최적으로 정렬시킨다. 예시된 바와 같이, 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어, 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95%의 "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란, 소정 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 소정 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각 100개 뉴클레오티드 당 최대 15개, 바람직하게 최대 10개, 보다 더 바람직하게 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고 기준 서열과 동일하다는 것을 의도한다. 다른 말로, 기준 뉴클레오티드 서열에 대해서 적어도 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서, 기준 서열 내 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게 10%, 보다 더 바람직하게 5%는 결실될 수 있거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 중 총 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게 10%, 보다 더 바람직하게 5%의 다수 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접한 그룹 내 또는 기준 서열 내 뉴클레오티드 중에 개별적으로 개재된, 말단 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있다. 유사하게, 기준 아미노산 서열과 적어도, 예를 들어, 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95% 서열 동일성을 갖는 소정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 폴리펩티드의 소정 아미노산 서열은 소정 폴리펩티드 서열이 기준 아미노산 서열의 각 100개 아미노산 당 최대 15개, 바람직하게 최대 10개, 보다 더 바람직하게 최대 5개 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고 기준 서열과 동일하다는 것을 의도한다. 다른 말로, 기준 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95% 서열 동일성을 갖는 소정 폴리펩티드 서열을 수득하기 위해서, 기준 서열 내 아미노산 잔기의 최대 15%, 바람직하게 최대 10%, 보다 더 바람직하게 최대 5%는 결실될 수 있거나 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 내 아미노산 잔기의 총 개수의 최대 15%, 바람직하게 최대 10%, 보다 더 바람직하게 최대 5%의 다수 아미노산이 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접한 그룹 내 또는 기준 서열 내 잔기 중에 개별적으로 산재하는, 말단 위치 사이 임의 위치에서 일어날 수 있다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환만큼 상이하다. 그러나, 보존성 치환은 서열 동일성을 결정할 때 일치로서 포함되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "서열 상동성"은 2개 서열의 관련성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 서열 상동성을 결정하기 위해서, 둘 이상의 서열은 최적으로 정렬되고, 갭은 필요하다면 도입된다. 그러나, "서열 동일성"과 대조적으로, 보존성 아미노산 치환은 서열 상동성을 결정할 때 일치로서 계측된다. 다른 말로, 기준 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서, 기준 서열 내 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 85%, 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 95%는 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드로의 보존성 치환을 포함하거나 또는 일치해야 하거나, 또는 기준 서열 중, 보존성 치환을 포함하지 않는, 총 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게 최대 10%, 보다 더 바람직하게 최대 5%의 다수 아미노산 또는 뉴클레오티드는 기준 서열에 삽입될 수 있다. 바람직하게 상동성 서열은 적어도 50, 보다 더 바람직하게 적어도 100, 보다 더 바람직하게 적어도 250, 및 보다 더 바람직하게 적어도 500 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다.
"보존성 치환"은 전체 기능성을 유의하게 변화시키지 않도록, 크기, 소수성 등을 포함한 유사한 특징 또는 성질을 갖는 다른 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 치환을 의미한다.
"단리된"은 이의 천연 상태로부터 "인간에 의해" 변경된 것을 의미하고, 즉, 자연계에서 일어나면, 이의 본래 환경으로부터 변화 또는 제거된 것, 또는 둘 모두를 의미한다. 예를 들어, 살아있는 유기체에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된"것이 아니지만, 이의 천연 상태의 함께 존재하는 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 용어가 본 명세서에서 적용되는 바와 같이, "단리된" 것이다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 면역원성 조성물은 또한 PCV3 ORF2 단백질을 포함하는 조성물을 의미하고, 여기서 상기 PCV3 ORF2 단백질은 상기 기술된, 임의의 것들이다.
추가 양태에 따라서, PCV3 ORF2 단백질은 바람직한 면역 반응의 유도, 즉 PCV3 감염으로 인한 하나 이상의 임상 징후의 발생의 감소, 중증도의 경감, 또는 예방에 효과적인 항원 포함 수준에서 면역학적 조성물에 제공된다. 바람직하게, PCV3 ORF2 단백질 포함 수준은 최종 면역원성 조성물 (㎍/mL) 중 적어도 0.2 ㎍ 항원/mL, 보다 바람직하게 약 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 여전히 보다 바람직하게 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 보다 더 바람직하게 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 여전히 보다 바람직하게 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 여전히 보다 바람직하게 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 여전히 보다 바람직하게 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 보다 더 바람직하게 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 보다 더 바람직하게 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 여전히 보다 바람직하게 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 보다 더 바람직하게 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 보다 더 바람직하게 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 및 가장 바람직하게 약 1.6 ㎍/mL이다.
추가 양태에 따라서, ORF2 항원 포함 수준은 최종 항원성 조성물 (㎍/용량)의 용량 당 상기 기술된 바와 같은 적어도 0.2 ㎍ PCV3 ORF2 단백질, 보다 바람직하게 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 여전히 보다 바람직하게 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 여전히 보다 바람직하게 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 여전히 보다 바람직하게 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 여전히 보다 바람직하게 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 여전히 보다 바람직하게 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 및 가장 바람직하게 약 1.6 ㎍/용량이다. 일 구현예에서, ORF2 항원 (예를 들어, PCV3 ORF2 단백질)은 약 1.3 내지 약 3 ㎍의 범위의 최종 조성물의 용량으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 최종 항원성 조성물은 1 mL 용량 중에 약 1.6 ㎍의 PCV3 ORF2 단백질을 포함할 수 있다.
본 개시에 따라서 면역원성 조성물에서 사용되는 PCV3 ORF2 폴리펩티드는 PCV3 ORF2의 단리 및 정제, 표준 단백질 합성, 및 재조합 방법론을 포함한 임의 방식으로 유도될 수 있다. PCV3 ORF2 폴리펩티드를 수득하기 위한 바람직한 방법은 미국 특허 출원 일련번호 제11/034,797호에서 제공되고, 이의 교시 및 내용은 참조로 본 명세서에 편입된다. 간략하게, 감수성 세포는 PCV3 ORF2 DNA 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 벡터로 감염되고, PCV3 ORF2 폴리펩티드는 재조합 바이러스에 의해 발현되고, 발현된 PCV3 ORF2 폴리펩티드는 상청액으로부터 여과를 통해 회수하고 바람직하게 이원 에틸렌이민을 사용하는 임의의 통상적인 방법을 통해서 불활성화시키고, 그 다음에 중화시켜서 불활성화 과정을 중지시킨다.
본 명세서에서 사용되는 면역원성 조성물은 또한 i) 바람직하게 상기 기술된 농도로, 상기 기술된 임의의 PCV3 ORF2 단백질, 및 ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게 재조합 배큘로바이러스의 적어도 일부분을 포함하는 조성물을 의미한다. 게다가, 면역원성 조성물은 i) 바람직하게 상기 기술된 농도로, 상기 기술된 임의의 PCV3 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게 재조합 배큘로바이러스의 적어도 일부분, 및 iii) 세포 배양 상청액의 일부분을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 면역원성 조성물은 또한 i) 바람직하게 상기 기술된 농도로, 상기 기술된 임의의 PCV3 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게 재조합 배큘로바이러스의 적어도 일부분, 및 iii) 세포 배양물의 일부분을 포함하는 조성물을 의미하고, 여기서 성분의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 면역원성 조성물은 또한 i) 바람직하게 상기 기술된 농도로, 상기 기술된 임의의 PCV3 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii) 세포 배양물의 일부분, 및 iv) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제 바람직하게 BEI를 포함하는 조성물을 의미하고, 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가질 수 있다. 바람직하게, BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키는데 효과적인 농도로 존재한다. 효과적인 농도는 상기 기술된다.
본 명세서에서 사용되는 면역원성 조성물은 또한 i) 바람직하게 상기 기술된 농도로, 상기 기술된 임의의 PCV3 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii) 세포 배양물의 일부분, iv) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제 바람직하게 BEI, 및 v) 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 중지시키기 위한 중화제를 포함하는 조성물을 의미하고, 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가질 수 있다. 바람직하게, 불활성화제가 BEI이면, 상기 조성물은 BEI와 동량의 소듐 티오술페이트를 포함한다.
폴리펩티드는 PCV3 감염에 감수성인 동물에게 투여할 수 있는 조성물에 도입된다. 바람직한 형태에서, 조성물은 또한 당업자에게 공지된 추가 성분을 포함할 수 있다 (또한, [Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton] 참조). 추가로, 조성물은 하나 이상의 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "수의학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 면역원성 조성물은 보강제, 바람직하게 카르보폴, 및 생리적 염수와 혼합되는, 바람직하게 상기 기술된 농도로, 여기서 제공되는 바와 같은 PCV3 ORF2 단백질을 포함한다.
당업자는 본 명세서에서 사용되는 조성물이 기지의 주사가능한, 생리적으로 허용가능한 멸균 용약을 유입시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉석 사용 용액의 제조를 위해서, 수성 등장성 용액, 예컨대, 예를 들어 염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액은 쉽게 이용가능하다. 또한, 본 개시의 면역원성 및 백신 조성물은 희석제, 등장화제, 안정화제, 또는 보강제를 포함할 수 있다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 특히 소듐 클로라이드, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정화제는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "보강제"는 알루미늄 히드록시드 및 알루미늄 포스페이트, 사포닌, 예를 들어, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, Ala.), 유중수 에멀션, 수중유 에멀션, 수중유중수 에멀션을 포함할 수 있다. 에멀션은 특히 경질 액상 파라핀 오일 (유럽 약전 유형); 이소프레노이드 오일 예컨대 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 생성되는 스쿠알란 또는 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기를 함유하는 산 또는 알콜의 에스테르, 보다 특히 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르 기반일 수 있다. 오일은 에멀션을 형성하도록 유화제와 조합하여 사용된다. 유화제는 바람직하게 비이온성 계면활성제, 특히 임의로 에톡시화되는, 솔비탄, 만니드 (예를 들어, 언히드로만니톨 올레에이트), 글리콜, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르, 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 Pluronic 제품, 특히 L121이다. [Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, pp 51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]을 참조한다.
예를 들어, ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 페이지 147에 기술된 SPT 에멀션, 및 동일 책의 페이지 183에 기술된 에멀션 MF59를 사용하는 것이 가능하다.
보강제의 추가 예는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이다. 유리한 보강제 화합물은 특히 당 또는 다가알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교되는, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 용어 카보머로 공지되어 있다 (Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). 당업자는 또한 적어도 3개 히드록실의 수소 원자가 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼에 의해 치환된 것인 적어도 3개 히드록실 기, 바람직하게 8개 이하의 히드록실 기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 이러한 아크릴계 중합체를 기술하는 미국 특허 제2,909,462호를 언급할 수 있다. 바람직한 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예를 들어 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이다. 불포화 라디칼은 그 자체로 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있다. 카르보폴 명칭으로 판매되는 제품 (BF Goodrich, Ohio, USA)이 특히 적절하다. 그들은 알릴 수크로스 또는 알릴 펜타에리쓰리톨과 가교된다. 특히, 카르보폴 974P, 934P 및 971P를 언급할 수 있다. 가장 바람직한 것은 바람직하게 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양, 보다 더 바람직하게 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양, 및 가장 바람직하게 용량 당 약 1 ㎎의 양으로, 카르보폴의 사용, 특히 카르보폴 971P의 사용이다. 특히, 최종 조성물의 용량은 카르보폴 또는 카르보폴 971을 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎ 범위의 카르보폴로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 최종 조성물의 용량은 약 1 ㎎의 카르보폴 971을 포함할 수 있다.
추가의 적합한 보강제는 특히 RIBI 보강제 시스템 (Ribi Inc.), 블록 공중합체 (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 보강제, 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소, 콜레라 독소, IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게, 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게, 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게, 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게, 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 첨가된다.
추가로, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 가장 바람직하게, 본 명세서에서 제공되는 조성물은 시험관내 배양된 세포의 상청액으로부터 회수된 PCV3 ORF2 단백질을 함유하고, 상기 세포는 PCV3 ORF2 DNA를 함유하고 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터로 감염되었고, 상기 세포 배양물은 바이러스 벡터를 불활성화시키기 위한 약 2 내지 약 8 mM BEI, 바람직하게 약 5 mM BEI, 및 동등한 농도의 중화제, 바람직하게 약 2 내지 약 8 mM, 바람직하게 약 5 mM의 최종 농도의 소듐 티오술페이트 용액으로 처리되었다.
본 개시는 또한 i) 바람직하게 상기 기술된 농도의 상기 기술된 임의의 PCV3 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii) 세포 배양물의 일부분, iv) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게 BEI, 및 v) 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 중지시키는 중화제, 바람직하게 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; 및 vi) 상기 기술된 양의 적합한 보강제, 바람직하게 카르보폴 971을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고; 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 갖는다. 추가 양태에 따라서, 이러한 면역원성 조성물은 생리적으로 허용가능한 농도로 약학적으로 허용가능한 염, 바람직하게 포스페이트 염을 더 포함한다. 바람직하게, 상기 면역원성 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5를 의미하는, 생리적 pH로 조정된다.
일 구현예에서, 면역원성 조성물은 1 mL 용량 중에 i) 적어도 일부 PCV3 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 배큘로바이러스, iii) 세포 배양물, iv) 약 2 내지 약 8 mM 범위의 농도를 갖는 불활성화제 (예를 들어, BEI), v) 불활성화제와 동등한 양의 중화제 (예를 들어, 소듐 티오술페이트); 및 vi) 사정결정된 양의 보강제 (예를 들어, 카르보폴 971), 및 vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함하는 조성물을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 성분은 i. PCV3 ORF2 단백질, ii. 단백질을 발현하는 배큘로바이러스 및 iii. 세포 배양물을 포함하는 성분의 조합의 90%가 1 ㎛ 미만의 크기를 갖도록 선택될 수 있다. 또한, 일부 구현예에서, 면역원성 조성물의 하나 이상의 성분은 면역원성 조성물이 약 6.5 내지 약 7.5 범위의 pH를 갖도록 선택될 수 있다. 양 및/또는 농도와 관련된 결정 및/또는 성분의 선택은 면역원성 조성물의 안정성, 제조 용이성, 지료의 이용가능성, 치료하려는 동물의 연령, 크기, 및/또는 상태, 및/또는 바람직한 결과에 영향을 미치는 다양한 인자에 관한 것일 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 면역원성 조성물은 1 mL 당 i) 상기 기술된 적어도 1.6 ㎍의 PCV3 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, iii) 세포 배양물의 일부분, iv) 약 2 내지 8 mM의 BEI, v) BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; 및 vi) 약 1 ㎎의 카르보폴 971, 및 vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함하는 조성물을 의미하고; 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가질 수 있고 상기 면역원성 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정된다.
면역원성 조성물은 하나 이상의 다른 면역조절제, 예컨대, 예를 들어 인터루킨, 인터페론, 또는 다른 사이토카인 (예컨대, 제한없이, IL-1, IL-2, IL-7, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마 등)을 더 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 젠타미신 및 머티올레이트를 포함할 수 있다. 본 개시의 상황에서 유용한 보강제 및 첨가제의 양 및 농도는 당업자가 쉽게 결정할 수 있지만, 본 개시는 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 보강제를 포함하는 조성물을 고려한다. 일부 구현예에서, 백신 조성물의 1 밀리리터 용량 당 약 250 ㎍ 양의 보강제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 60 ㎍/mL 범위의 농도로 항생제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 면역원성 조성물은 또한 i) 바람직하게 상기 기술된 농도로 상기 기술된 임의의 PCV3 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii) 세포 배양물의 일부분, iv) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제 바람직하게 BEI, 및 v) 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 중지시키는 중화제, 바람직하게 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; vi) 상기 기술된 양의 적합한 보강제, 바람직하게 카르보폴 971; vii) 약학적으로 허용가능한 농도의 염수 완충제, 바람직하게 포스페이트 염, 및 viii) 항-미생물학적 활성제를 포함하는 조성물을 의미하고; 성분 i) 내지 iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 갖는다.
본 개시에 따른 조성물은 피내, 기관내, 또는 질내로 적용될 수 있다. 조성물은 바람직하게 근육내 또는 비내, 가장 바람직하게 근육내로 적용될 수 있다. 동물 신체에서, 표적 조직으로 직접 주사 또는 정맥내를 통해서 상기 기술된 바와 같은 약학 조성물을 적용하는 것이 유리한 것으로 증명될 수 있다. 전신 적용을 위해서, 정맥내, 혈관내, 근육내, 비내, 동맥내, 복강내, 경구, 입위 또는 척추강내 경로가 바람직하다. 보다 국소의 적용은 피하, 피내, 피내, 심장내, 엽내, 골수내, 폐내로 또는 치료하려는 조직 (결합-, 뼈-, 근육-, 신경-, 상피 조직) 내 또는 그 근처에 직접적으로 실시될 수 있다. 치료의 유효성 및 바람직한 지속기간에 의존하여, 본 개시에 따른 조성물은 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로, 예를 들어 며칠, 몇주, 또는 몇개월 동안 1일 기반으로 상이한 용량으로 투여될 수 있다. 또한 단일 용량을 비롯하여 다수 용량이 고려된다. 또한 돼지 병원체의 다른 항원과 조합 백신이 고려된다. 바람직한 조합 조성물은 PCV3 ORF2 단백질 및 PPV, PRRSV 항원, 엠. 하이오뉴모니아에 항원 (상청액 또는 박테린), 또는 PRRSV 항원 및 엠. 하이오뉴모니아에 항원 (상청액 또는 박테린) 또는 PCV2 ORF2 단백질과 전술한 임의 조합을 함유한다.
일부 구현예에서, 투약 용법은 바람직한 효과, 예컨대 동물 및/또는 그들 자손에서의 면역 반응을 유도하기 위한 PCV3 ORF2의 유효량을 전달하기 위해 개발될 수 있다. 투약 용법과 관련된 결정은 바람직한 결과, 면역원성 조성물에서 사용을 위해 선택된 성분, 투여 경로, 예컨대 비경구 및/또는 피하 투여, 전달된 수 또는 용량, 예를 들어, 단일 투여 또는 다수 용량, 및/또는 치료하려는 동물 또는 동물 개체군의 특별한 성질, 예를 들어, 동물의 연령, 크기, 및/또는 상태에 관한 것일 수 있다. 동물의 상태는 예를 들어, 건강 상태, 임신 상태, 크기 등을 의미할 수 있다. 따라서, 모돈 및 자돈은 상이한 유효 용량을 요구할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 치료 방법은 바람직한 결과를 기반으로 상이할 수 있다. 예를 들어, 모돈은 돼지 써코바이러스와 관련된 병태를 억제 및/또는 예방하기 위해 치료될 수 있거나 또는 모돈은 그의 자돈에서 돼지 써코바이러스의 감염의 부정적 효과를 억제 및/또는 예방하기 위해 치료될 수 있다.
투약 용법은 PCV3 ORF2 단백질의 사전결정된 양을 포함하는 면역원성 조성물의 하나 이상의 용량을 포함할 수 있다. 예를 들어, 투약 용법은 약 2 마이크로그램 내지 약 400 마이크로그램 범위의 용량으로 PCV3 ORF2 단백질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 특정 면역원성 조성물의 투약 용법은 약 2 마이크로그램 초과의 PCV3 ORF2 단백질을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 특정 면역원성 조성물의 각 용량은 PCV3 ORF2 단백질을 약 4 마이크로그램 초과의 양으로 포함할 수 있다. 면역원성 조성물에 대한 일부 투약 용법 구현예는 적어도 약 8 마이크로그램 용량으로 PCV3 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시되는 바와 같은 면역원성 조성물의 일부 투약 용법은 적어도 하나의 용량이 약 16 마이크로그램 초과의 바람직한 PCV3 ORF2 단백질을 포함하도록 구조화될 수 있다.
일 구현예에서, 투약 용법은 동물 내에서 특이적 PCV3 ORF2 단백질의 바람직한 발현을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 돼지에 적절한 벡터 및/또는 발현 시스템을 포함하는 면역원성 조성물을 고려하면, 면역원성 조성물로 전달되는 벡터는 생체 내에서 약 2 마이크로그램 내지 약 400 마이크로그램 범위인 양으로 PCV3 ORF2 단백질을 전달할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 일 구현예에서, 특정 면역원성 조성물의 투약 용법은 동물에게 약 2 마이크로그램 초과의 PCV3 ORF2 단백질의 양을 전달하도록 구조화된다. 일부 예에서, 특정 면역원성 조성물의 투약 용법은 동물에게 약 4 마이크로그램 초과의 PCV3 ORF2 단백질의 양을 전달하도록 구조화된다. 면역원성 조성물에 대한 일부 투약 용법 구현예는 동물에게 약 8 마이크로그램 초과의 PCV3 ORF2 단백질의 양을 전달하도록 구조화된다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 면역원성 조성물의 일부 투약 용법은 약 16 마이크로그램 초과의 바람직한 PCV3 ORF2 단백질이 동물에게 전달될 수 있도록 구조화될 수 있다.
투약 용법은 또한 투여 경로 및/또는 횟수에 대한 지침을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물 및 바람직한 결과에 의존하여 특정 연령, 특히, 약 1주령, 2주령, 또는 3주령의 자돈에게 면역원성 조성물의 용량을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 예에서, 자돈은 약 7일 내지 약 28일 범위의 연령에서 면역원성 조성물이 투여될 수 있다. 투약 용법 구현예에서, 돼지는 약 14일 내지 약 26일 범위의 연령에서 면역원성 조성물이 투여될 수 있다. 예를 들어, 자돈에 대한 투여창은 약 16일 내지 약 26일의 연령 범위에서 선택될 수 있다. 일부 투약 용법 구현예는 약 18일 내지 약 24일 범위의 연령의 자돈에게 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
면역원성 조성물은 재조합 PCV3 ORF2 단백질을 포함할 수 있다. 특히, 면역원성 조성물은 배큘로바이러스로부터 발현되는 재조합 PCV3 ORF2 단백질을 포함할 수 있다.
또한, 일부 예에서, 재조합 PCV3 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물은 하나 이상의 용량의 추가 항원, 예를 들어, PCV2 ORF2, PPV, PRRSV, 및/또는 엠. 하이오뉴모니아에 ("M. Hyo") 유래의 항원과 조합하여 투여될 수 있다. PRRSV 항원은 약독화 생 백신일 수 있다. M. Hyo. 항원은 박테린, 상청액, 또는 박테린과 상청액의 조합일 수 있다.
다수 용량의 면역원성 조성물이 투약 용법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투약 용법은 재조합 PCV3 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물의 용량 및 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물의 용량으로 만들어질 수 있다. 일례에서, 용량은 재조합 PCV3 ORF2 단백질 및 PCV2 ORF2 단백질의 대략 동등한 양을 포함할 수 있다. 투약 용법의 일 구현예는 재조합 PCV3 ORF2 단백질 및 재조합 PCV2 ORF2를 포함하는 면역원성 조성물의 용량을 포함할 수 있고, 이들 둘은 배큘로바이러스 시스템 발현 시스템을 사용해 발현될 수 있다.
재조합 PCV3 ORF2 면역원성 조성물의 일 구현예는 추가 항원, 예를 들어 항원 예컨대 PCV3 ORF2 유래 재조합 단백질을 비롯하여, 약독성 생 PRRSV 및/또는 박테린, 상청액, 또는 박테린과 M. Hyo의 상청액의 조합을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물의 일부 구현예는 PCV3 ORF2 및 PCV2 ORF2 유래의 배큘로바이러스 발현된 재조합 단백질을 비롯하여, PRRSV (예를 들어, 약독화 생 백신) 및/또는 M. Hyo의 항원 (예를 들어, 박테린 및/또는 상청액)을 포함할 수 있다. 또한, 일부 예에서, 면역원성 조성물은 PCV3 ORF2 단백질을 PCV2 ORF2 단백질, 약독화 생 PRRSV, 및/또는 M. Hyo 박테린 및/또는 상청액과 조합하여 포함할 수 있다.
면역원성 조성물은 재조합 PCV3 ORF2 단백질 및 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함할 수 있다. 일례에서, 용량은 대략 균등한 양의 재조합 PCV3 ORF2 단백질 및 PCV2 ORF2 단백질을 포함할 수 있다. 투약 용법의 구현예는 재조합 PCV3 ORF2 단백질 및 재조합 PCV2 ORF2를 포함하는 면역원성 조성물의 용량을 포함할 수 있고, 이들 둘은 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용해 발현될 수 있다.
면역원성 조성물의 일부 구현예는 PRRSV 및/또는 M. Hyo 항원을 비롯하여, PCV3 ORF2로부터의 배큘로바이러스 발현된 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 또한, PCV3 ORF2 및 PCV2 ORF2로부터의 배큘로바이러스 발현된 재조합 단백질은 PRRSV 및/또는 M. Hyo의 항원과 조합하여 면역원성 조성물을 형성할 수 있다. 상기 개시된 바와 같이, 추가 항원은 약독화 생 PRRSV 및/또는 M Hyo 박테린 및/또는 상청액을 포함할 수 있다.
예를 들어, 면역원성 조성물은 재조합 PCV3 ORF2 단백질 및 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 면역원성 조성물은 대략 동등한 양의 재조합 PCV3 ORF2 단백질 및 PCV2 ORF2 단백질을 포함한다. 면역원성 조성물의 일부 구현예는 PRRSV 및/또는 M. Hyo를 비롯하여, PCV3 ORF2 및 PCV2 ORF2 유래의 배큘로바이러스 발현된 재조합 단백질의 조합을 포함할 수 있다.
투약 용법은 양돈의 경제학을 개선하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물, 예컨대 백신은 모돈, 자돈, 또는 둘 모두를 보호하려는 노력으로 모돈 및/또는 자돈에게 투여될 수 있다.
특히, 임신 전 모돈의 백신접종은 모돈이 PCV3에 노출에 의해 챌린지된 경우에 분만시 미라, 사산 및/또는 약한 자돈의 수를 감소시킬 수 있다. 일반적으로, PCV3은 생식 질환으로 여겨질 수 있다. 또한, 불활성화된 배큘로바이러스-발현된 PCV3 ORF2 백신의 사용은 모돈에서 바이러스 복제를 감소 및/또는 억제시킬 수 있다. 복제에서 이러한 감소는 약 4%의 비율로 백신접종 모돈에 대한 분만 시 미라의 수를 감소시킬 수 있다. 이러한 감소는 돼지 생산자에 대한 상당한 경제적 영향을 가질 수 있다.
백신이 임신 114일 동안 전체 또는 2회 또는 적어도 하나의 3개월에 PCV3으로 챌린지 시 모돈 및 교배 미경산돈을 보호할 수 있다고 더욱 주장한다.
또한 백신이 임신 114일 동안 전체 또는 2회 또는 적어도 하나의 3개월에 PCV3으로 챌린지 시 백신접종된 모돈 및 백신접종된 미경산돈에서 미라, 사산, 및 태아의 발생을 유의하게 감소시킬 수 있다고 주장한다.
투약 용법은 교배 전에 본 명세서에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물의 적어도 하나의 용량을 어린 모돈 (즉, 5개월령 이하)에게 백신접종하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물의 용량은 교배 전에 일 (1) mL 용량으로서 근육내로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신의 하나 이상의 용량이 모돈에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 제1 백신이 제공될 수 있고 이어서 21일 이후 및 교배 전에 부스터 백신이 후속될 수 있다. 일부 구현예에서, 모돈은 부스터 백신접종 이후 14일 내지 21일 범위에서 교배될 수 있다. 이러한 시간 기간은 모돈이 면역 반응을 상승시킬 수 있게 허용한다. 이러한 투약 용법의 이용은 분만 시 미라의 수를 감소 및/또는 억제시킬 수 있다.
또한, PCV3 항원 (즉, 재조합 PCV3 ORF2)을 포함하는 면역원성 조성물의 1 mL 용량을 투여하는 단계를 포함하는 투약 용법의 사용은 PCV3으로 감염된 돼지에서 림프선염, 림프 고갈 및/또는 다핵/거대 조직구를 감소, 경감, 및/또는 억제시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 배큘로바이러스 발현된 PCV3 ORF2 백신을 사용해 약 3주령의 자돈을 백신접종시키기 위한 투약 용법은 자돈이 이후에 PCV3에 의해 챌린지되면 바이러스 존재량을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 백신접종된 자돈의 조직에서 복제 바이러스의 양은 미백신접종 자돈에 비해 감소될 수 있다. 또한, PCV3 ORF2 백신으로 자돈의 백신접종은 이후에 PCV3에 노출되는 미백신접종 자돈에 비해서 백신접종 자돈에서 폐사, 임상 징후, 총 병변, 및/또는 조직학적 병변을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 자극제" 또는 "면역자극제"는 바람직하게 특이적 면역 반응, 예를 들어 특이적 병원체에 대한 면역 반응을 개시 또는 증가시키지 않고, 면역 반응을 촉발시킬 수 있는 임의의 작용제 또는 조성물을 의미한다. 적합한 용량으로 면역 자극제를 투여하도록 더욱 지시된다. 유리하게, 면역 자극제는 키홀 림펫 헤마시아닌 (KLH) 및/또는 불완전 프로인트 보강제 (IFA)이다. 본 명세서에서 사용되는, 면역 자극제의 역할은 보강제가 아닌, 챌린지 증강제이다. 유리하게, KLH는 1 ㎎ KLH/mL을 함유하는 IFA에 유화되어 챌린지 전 2일 및 챌린지 후 2일에 근육내로 투여될 수 있다.
추가 고려에 따라서, 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질이 제공되고, 상기 단백질은 PCV3 ORF2 단백질의 기능적 항원성 변이체이고, 상기 단백질은 특히 또는 이하 "추가 고려의 단백질"이라고 한다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 PCV3 ORF2 단백질의 기능적 항원성 변이체이다.
바람직한 일 양태에서, 추가 고려의 단백질은 PCV3 ORF2의 치환 및/또는 연장을 포함한다.
다른 바람직한 양태에서, 추가 고려의 단백질은 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 항원성 변이체이고/이거나 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 바이러스-유사 입자 (VLP)의 수율을 더 높게 할 수 있다.
바람직하게, 상기 기능적 항원성 변이체는 웨스턴 블롯 분석으로 결정가능한 바와 같이 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질에 비해서 VLP의 수율을 더 높게 할 수 있다.
바람직한 일 양태에 따라서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 소수의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 갖는다.
다른 바람직한 양태에 따라서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내에 하나 이상의 치환을 가지고, 바람직하게 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 및/또는 K 잔기 및/또는 H 잔기의 하나 이상의 치환을 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에 따라서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 및/또는 K 잔기의 하나 이상의 치환을 포함한다.
역시 추가의 바람직한 양태에 따라서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 또는 H 잔기 및 모든 K 잔기의 치환을 포함한다.
여전히 다른 바람직한 양태에서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 적어도 S 및/또는 H 및 임의의 K의 Q 또는 P 또는 F 또는 S로의 치환을 포함한다.
여전히 추가의 바람직한 양태에서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH 내 모티프 SKKK의 QPFS로의 치환 또는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH 내 모티프 KKKH의 QPFS로의 치환을 포함한다.
또 다른 추가의 바람직한 양태에서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩가능하다.
여전히 추가의 바람직한 양태에서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩된다.
특히 바람직한 양태에 따라서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고, 바람직하게 상기 연장은 전부이거나 또는 써코바이러스과 바이러스 유래 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 연장의 적어도 일부분은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 대체한다.
다른 바람직한 양태에 따라서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 100개 아미노산 길이이다.
추가의 바람직한 양태에 따라서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 50개 아미노산 길이이다.
또 다른 바람직한 양태에 따라서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이다.
특히 바람직한 일 양태에서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 갖는다.
바람직하게, 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이고/이거나, 상기 연장은 서열 VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR의 전부를 포함한다.
추가의 바람직한 양태에서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩가능하다.
바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 86% 또는 적어도 약 87% 또는 적어도 약 적어도 88% 또는 적어도 약 89%의 서열 동일성 및/또는 서열 상동성, 예를 들어, 약 83% 내지 약 89%, 예컨대 84% 또는 85% 또는 86% 또는 87% 또는 88% 또는 89% 범위의 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/이거나, 단백질은 재조합 단백질이고, 상기 단백질은 FG 루프에 하나 이상의 치환을 갖는다.
바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 86% 또는 적어도 약 87% 또는 적어도 약 적어도 88% 또는 적어도 약 89%의 서열 동일성 및/또는 서열 상동성, 예를 들어, 약 83% 내지 약 89%, 예컨대 84% 또는 85% 또는 86% 또는 87% 또는 88% 또는 89% 범위의 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이고, 상기 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 갖는다.
바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 FG 루프에 하나 이상의 치환을 갖는 FG 루프를 포함하고 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 더 포함하고, 변이체 단백질의 서열은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 86% 또는 적어도 약 87% 또는 적어도 약 적어도 88% 또는 적어도 약 89%의 서열 동일성 및/또는 서열 상동성, 예를 들어, 약 83% 내지 약 89%, 예컨대 84% 또는 85% 또는 86% 또는 87% 또는 88% 또는 89% 범위의 서열 동일성 및/또는 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이다.
다른 바람직한 양태에서, 추가 고려의 단백질은 재조합 DNA 기술로 제조된 재조합 단백질이다.
여전히 다른 바람직한 양태에서, 추가 고려의 단백질은 배큘로바이러스 발현된 단백질이다.
바람직하게, 상기 PCV3은 PCV3의 임의의 계통발생 분기군 또는 분기군의 조합이다.
바람직하게, 상기 PCV3은 PCV3a 및 PCV3b로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, 상기 PCV3은 바람직하게 PCV3a1, PCV3b1 및 PCV3b2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PCV3은 또한 PCV3c (BMC Vet Res.2019 Jul 15;15(1):244. doi: 10.1186/s12917-019-1977-7)로부터 선택될 수 있다.
보다 특히, 상기 PCV3 ORF2는 바람직하게 그룹 a1, b1 또는 b2 유래이다 ([Fux et al., "Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct group of virus strains", Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3] (참조로 본 명세서에 편입)의 아형분류 지정법 사용; 예를 들어, 표 4 참조).
바람직한 양태에서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:1과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오?? 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
다른 바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:6과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
또 다른 바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:7과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
역시 추가의 바람직한 양태에서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이다.
여전히 다른 바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이다.
여전히 다른 바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이고, 상기 단백질은 FG 루프에 하나 이상의 치환을 갖는다.
바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이다.
다른 바람직한 양태에서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이고, 상기 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C 말단부를 갖는다.
바람직한 양태에 따라서, 상기 단백질은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 단백질이다.
바람직한 양태에 따라서, 상기 단백질은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 배큘로바이러스 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 단백질이다.
다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 뉴클레오티드 서열은 추가 고려의 단백질을 코딩하고, 상기 뉴클레오티드는 또한 이하 "추가 고려의 뉴클레오티드 서열"이라고 한다.
추가의 바람직한 양태에서, 벡터가 제공되고, 벡터는 추가 고려의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 벡터는 또한 이하 "추가 고려의 벡터"라고 한다.
또한, 재조합 벡터가 제공되고, 재조합 벡터는 추가 고려의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 발현 숙주가 제공되고, 발현 숙주는 추가 고려의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염되고, 상기 발현 숙주는 또한 이하 "추가 고려의 발현 숙주"라고 한다.
또한, 배큘로바이러스 발현 숙주가 제공되고, 배큘로바이러스 발현 숙주는 추가 고려의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염되고, 상기 배큘로바이러스 발현 숙주는 또한 이하 "추가 고려의 배큘로바이러스 발현 숙주"라고 한다.
또한, 추가 고려의 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 추가 고려의 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 방법은 추가 고려의 벡터를 발현시키는 단계를 포함한다.
또한, 추가 고려의 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 방법은 추가 고려의 재조합 벡터를 발현시키는 단계를 포함한다.
또한, 추가 고려의 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 방법은 단백질의 발현을 야기시키도록 추가 고려의 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
또한, 추가 고려의 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 방법은 추가 고려의 뉴클레오티드 서열 또는 추가 고려에 따른 벡터로 발현 숙주를 형질감염시키는 단계, 및 단백질의 발현을 야기시키도록 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
또한, 추가 고려의 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 방법은 단백질의 발현을 야기시키도록 추가 고려의 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
또한, 추가 고려의 단백질을 제조하는 방법이 제공되고, 방법은 추가 고려의 뉴클레오티드 서열 또는 추가에 따른 벡터로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계, 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법에서, 발현된 단백질의 충분한 수준이 획득되었을 때 불활성화제가 사용되고 불활성화제는 바람직하게 이원성 에틸렌이민 (BEI)이고 발현된 단백질의 충분한 수준이 획득되었을 때 사용된다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법은 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법은 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함하고; 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 갖는다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법은 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함하고; 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가지고, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정된다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법은 배양된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법은 배양된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하고; 방법은 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법은 배양된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하고; 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법은 배양된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하고; 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함하고; 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법은 배양된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하고; 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함하고; 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함하고; 아지리딘 화합물은 BEI를 포함한다.
또한, 단백질이 제공되고, 상기 단백질은 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법에 의해 수득가능하다.
또한, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법으로 수득가능한 단백질을 포함하는 조성물이 제공되고, 조성물은 바람직하게 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 또한, 추가 고려의 단백질을 제조하는 임의의 상기 방법에 의해 수득가능한 조성물이 제공되고, 조성물은 바람직하게 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
특히, 임의 상기 조성물은 또한 이하 "추가 고려의 조성물"이라고 한다.
추가 고려의 조성물에서, 단백질은 바람직하게 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물은 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 및/또는 면역조절제 중 어느 하나 이상을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합 중 어느 하나 이상이다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고, 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드 중 하나 이상을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 조성물의 약 50 ㎍ 내지 약 2000의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 중 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 조성물의 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 조성물의 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 약 1 ㎎의 양으로 존재한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 면역조절제를 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 면역조절제를 포함하고; 면역조절제는 인터루킨(들), 인터페론(들), 또는 다른 사이토카인(들) 중 어느 하나 이상이다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 항생제(들)를 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 항생제(들)를 포함하고; 항생제(들)는 젠타미신을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 항생제(들)를 포함하고; 조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들)를 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 항생제(들)를 포함하고;조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제(들)를 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 추가 항원을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 추가 항원을 포함하고; 상기 추가 항원은 PCV3 ORF2 항원이 아니다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 추가 항원을 포함하고; 상기 추가 항원은 PCV3 항원이 아니다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 추가 돼지 병원체의 항원을 더 포함하고, 상기 병원체는 PCV2, PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원 중 어느 하나 이상이다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 추가 돼지 병원체의 항원을 더 포함하고, 상기 조성물은 PCV2의 항원, PRRSV의 항원 및 PPV의 항원 중 하나 이상을 더 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 PCV2 ORF2 단백질이다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 재조합 PCV2 ORF2 단백질이다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질이다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 제형으로 존재한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 단일 용량 또는 1회 샷 투여를 위해 제제화 및/또는 포장된다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 다수-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장된다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 2-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장된다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 10 용량을 함유한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 50 용량을 함유한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 100 용량을 함유한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 200 용량을 함유한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 250 용량을 함유한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 PCV2의 항원을 포함하고; PCV2 항원은 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질이고; 단백질 또는 PCV3 ORF 단백질 및 PCV2 ORF 단백질의 조합된 총량은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 염을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 불활성화된 바이러스 벡터 및/또는 세포 배양물 상청액을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 불활성화된 바이러스 벡터 및 세포 배양물 상청액을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 (i) 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 (i) 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함하고; BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI가 처리된 세포 배양물 유래이고/이거나, 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유하고/하거나, 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유한다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 추가 고려의 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물이다.
바람직하게, 추가 고려의 조성물이 제공되고, 조성물은 추가 고려의 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제; 및 상기 언급된 바와 같은 추가 항원을 포함하는 면역원성 조성물이다.
또한, 추가 고려의 조성물을 제조하는 방법이 제공되고, 추가 고려의 단백질은 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합된다.
또한, 추가 고려의 조성물을 제조하는 방법이 제공되고, 추가 고려의 단백질은 담체, 희석제 또는 부형제; 및 추가 항원과 혼합된다.
또한, 추가 고려의 단백질은 약물로서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 백신으로서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위해서 제공되고; 자돈은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지류에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위해서 제공되고; 자돈은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 제공되고; 상기 동물은 돼지류이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 제공되고; 상기 동물은 돼지이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 제공되고; 상기 동물은 자돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 제공되고; 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 제공되고; 상기 동물은 모돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위해서 제공되고; 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 돼지류이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 돼지이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 자돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 모돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 돼지류이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 돼지이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 자돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 모돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도시키는데 사용을 위해 제공된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 돼지류이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 돼지이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 자돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 모돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위해 제공되고; 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
바람직하게, 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 동물에게 근육내로 또는 피내로 투여된다.
바람직하게, 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 동물에게 다른 항원과 함께 투여되고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
바람직하게, 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 동물에게 다른 항원과 함께 투여되고; 상기 다른 항원은 PCV3 ORF2 항원이 아니고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
바람직하게, 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 동물에게 다른 항원과 함께 투여되고; 상기 다른 항원은 PCV3 항원이 아니고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 자돈을 임신한 모돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 자돈을 임신한 모돈이고; 자돈은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 모돈이고; 상기 추가 고려의 단백질 또는 상기 추가 고려의 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여된다.
바람직하게 상기 동물은 모돈이고; 상기 추가 고려의 단백질 또는 상기 추가 고려의 조성물은 오직 상기 모돈에게 2회 투여된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 자돈이고; 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 자돈이고; 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 오직 상기 자돈에게 1회 투여된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 모돈이고; 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여되고; 상기 사용은 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여 이전 또는 그 동안에 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 모돈이고; 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여되고; 상기 사용은 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여 이전 또는 그 동안에 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 모돈이고; 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 모돈에게 오직 2회 투여되고; 상기 사용은 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여 이전 또는 그 동안에 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 자돈이고; 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여되고; 상기 사용은 상기 동물 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여 이전 또는 그 동안에 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 자돈이고; 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여되고; 상기 사용은 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여 이전 또는 그 동안에 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 동물은 자돈이고; 상기 자돈에게 오직 1회 투여되고; 상기 사용은 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여 이전 또는 그 동안에 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 사용에서 동물에게 투여는 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 단일, 1회 샷 투여 또는 단일, 1회 용량 투여로 이루어진다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 사용에서 동물에게 투여는 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 다수-샷 또는 다수-용량 용법으로 이루어진다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 사용에서 동물에게 투여는 상기 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 이중 샷 투여; 또는 이중 용량 투여로 이루어진다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 동물에게 투여는 병독성 돼지 써코바이러스에 노출의 적어도 1주 또는 2주 또는 3주 이내에 일어난다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물이 제공되고 동물은 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하의 자돈이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 추가 고려의 단백질은 임의의 상기 사용을 위한 것이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 추가 고려의 단백질은 상기 언급된 둘 이상의 사용의 사용을 위한 것이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 상기 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위한 것이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 제2 항원은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여 전에 동물에게 투여된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 제2 항원은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여와 동일한 시간에 동물에게 투여된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 제2 항원은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여와 동일한 시간 및 동일한 조성물로 동물에게 투여된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 제2 항원은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여와 동일한 시간 및 상이한 조성물로 동물에게 투여된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 임의의 상기 사용을 위해 제공되고, 제2 항원은 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물의 투여 이후에 동물에게 투여된다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위해 제공되고, 단백질은 돼지에게 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위해 제공되고, 단백질은 돼지에게 오직 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위해 제공되고, 단백질은 돼지에게 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위해 제공되고, 단백질은 돼지에게 오직 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위해 제공되고, 단백질은 돼지에게 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위해 제공되고, 단백질은 돼지에게 오직 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위해 제공되고, 단백질은 돼지에게 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위해 제공되고, 단백질은 돼지에게 오직 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 제공되고;
면역원성 조성물의 1회 용량은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
추가 고려의 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 1회 용량의 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
또한 본 명세서는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 추가 고려의 면역원성 조성물이 제공되고;
면역원성 조성물의 오직 1회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
추가 고려의 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 면역원성 조성물의 1회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
또한, 추가 고려의 단백질 또는 추가 고려의 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 제공되고;
면역원성 조성물의 2회 용량은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도의 경감를 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
추가 고려의 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 2회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
또한, 추가 고려의 면역원성 조성물은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 제공되고;
면역원성 조성물의 오직 2회 용량은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
추가 고려의 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 2회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
바람직하게, 임의의 상기 언급된 사용에서, 상기 임상 징후 또는 증상은 평균 1일 체중 증량의 감소 및 폐사로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게, 임의의 상기 언급된 사용에서, 상기 임상 징후 또는 증상은 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제, 및 PCV3 바이러스혈증으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게, 임의의 상기 언급된 사용에서, 상기 임상 징후 또는 증상은 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생 또는 생산으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게, 임의의 상기 언급된 사용에서, 상기 임상 징후 또는 증상은 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 배출이거나 또는 그를 포함한다.
본 발명은 하기 조항의 세트를 통해서 이제 설명될 것이다. 참조의 편이를 위해서, 이들 조항의 세트는 조항 세트 A, 조항 세트 B 등으로 표시된다. 각 조항 세트의 개시는 본 발명에 동등하게 적용가능하다. 유사하게, 각 조항 세트의 개시는 모든 다른 조항 세트에 동등하게 적용가능하다:
조항 세트 A:
조항 세트 A - 본 발명은 하기 번호매김된 조항 세트 (조항 세트 A)를 통해 이제 설명될 것이다. 이 조항 세트의 개시는 본 발명에 동등하게 적용가능하다. 유사하게 이 조항 세트의 개시는 다른 조항 세트의 각각에 동등하게 적용가능하다.
1. 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질; 및
용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 또는 발현 벡터, 및 면역조절제 또는 이의 임의 조합을 포함하는 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
2. 조항 1의 조성물에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
3. 조항 1의 조성물에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제를 포함한다.
4. 조항 1-3 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 상기 PCV3 ORF2는 바람직하게 그룹 a1, b1 또는 b2 유래이다 ([Fux et al., "Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct group of virus strains", Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3] (참조로 본 명세서에 편입)의 아형분류 지정법 사용; 예를 들어, 표 4 참조).
5. 조항 1-3 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:1과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
6. 조항 1-5 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 PCV3 ORF2 단백질이다.
7. 조항 6의 조성물에 있어서, 발현 벡터는 배큘로바이러스이다.
8. 조항 1-7 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV2 ORF2 단백질을 더 포함한다.
9. 조항 8의 조성물에 있어서, PCV2 ORF2 단백질은 PCV2 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 발현으로부터 유래한다.
10. 조항 9의 조성물에 있어서, 발현 벡터는 배큘로바이러스이다.
11. 조항 1-10 중 어느 하나의 조성물에 있어서,추가 돼지 병원체의 추가 항원을 더 포함한다.
12. 조항 11의 조성물에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원은 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원을 포함한다.
13. 조항 1-12 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재한다.
14. 조항 1-12 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질 또는 총 PCV2 및 PCV3 ORF2 단백질은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재한다.
15. 조항 1-14 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 보강제는 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고, 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함한다.
16. 조항 1-15 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 보강제를 포함하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 당 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 존재한다.
17. 조항 1-16 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 면역조절제는 인터루킨(들), 인터페론(들), 또는 다른 사이토카인(들), 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 또는 불완전 프로인트 보강제와 유화된 KLH (KLH/ICFA)를 포함한다.
18. 조항 1-17 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 약 1 ㎍/mL 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들), 또는 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제(들)를 포함한다.
19. 조항 1-18 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 항생제(들)는 젠타미신을 포함한다.
20. 조항 1-19 중 어느 하나의 조성물에 있어서, (i) PCV3 ORF2 단백질, (ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함한다.
21. 조항 20의 조성물에 있어서, 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가지고, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정된다.
22. 조항 20 또는 21의 조성물에 있어서, BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI가 처리된 세포 배양물 유래이고/이거나, 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유하고/하거나, 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유한다.
23. 조항 1-22 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 단일 용량 또는 1회 샷 투여를 위해 제제화 및/또는 포장되고, 다수-용량 용법이 아니다.
24. (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법으로서, 조항 1-23 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
25. 조항 25의 방법에 있어서, 동물은 돼지류이다.
26. 조항 25의 방법에 있어서, 돼지류는 돼지 또는 자돈이다.
27. 조항 26의 방법에 있어서, 돼지 또는 자돈은 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하이다.
28. 조항 26의 방법에 있어서, 투여는 병독성 돼지 써코바이러스에 노출의 적어도 1주 또는 2주 또는 3주 이내에 일어난다.
29. 조항 24-28 중 어느 하나의 방법에 있어서, 투여는 단일, 1회 샷 투여; 또는 단일, 1회 용량 투여를 포함하고; 다수-샷 또는 다수-용량 용법이 아니다.
30. 조항 24-29 중 어느 하나의 방법에서 조항 1-23 중 어느 하나의 조성물의 용도; 또는 (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조에서 사용을 위하거나, 또는 (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유도하는 방법에서 사용을 위한, 단독으로 또는 조합하여, 조항 1-23 중 어느 하나의 조성물의, PCV3 ORF2 단백질의 용도.
31. 조항 1-23 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 조성물을 제조하는 방법으로서, 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 PCV3 ORF2 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
32. 조항 31의 방법에 있어서, 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
33. 조항 32의 방법에 있어서, 불활성화는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함한다.
34. 조항 25의 방법에 있어서, 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함한다.
35. 조항 26의 방법에 있어서, 아지리딘 화합물은 BEI를 포함한다.
36. PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
37. 조항 36의 재조합 벡터에 있어서, 상기 PCV3 ORF2는 바람직하게 그룹 a1, b1 또는 b2 유래이다 ([Fux et al., "Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct group of virus strains", Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3] (참조로 본 명세서에 편입)의 아형분류 지정법 사용; 예를 들어, 표 4 참조).
38. 조항 36의 재조합 벡터에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
39. 조항 36-38 중 어느 하나의 재조합 벡터에 있어서, 재조합 벡터는 배큘로바이러스이다.
40. 조항 39의 재조합 벡터에 있어서, 재조합 벡터는 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 포함한다.
조항 세트 B:
조항 세트 B - 본 발명은 하기 번호매김된 조항의 세트 (조항 세트 B)를 통해서 이제 설명될 것이다. 이 조항 세트의 개시는 본 발명에 동등하게 적용가능하다. 유사하게 이 조항 세트의 개시는 다른 조항 세트의 각각에 동등하게 적용가능하다.
1. 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질, 바람직하게 항원성 PCV3 ORF2 단백질 (PCV3 ORF2 항원)을 포함하는 조성물.
2. 조항 1의 조성물에 있어서, 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 면역조절제, 및/또는 이의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 수의학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
3. 조성물, 특히 조항 1 또는 2의 조성물에 있어서, 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질; 및 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 또는 발현 벡터, 면역조절제 및/또는 이의 임의 조합을 포함하는 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
4. 조항 1 내지 3 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
5. 조항 1 내지 4 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제를 포함한다.
6. 조항 1 내지 5 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3은 PCV3a 및 PCV3b로 이루어진 군에서 선택된다.
7. 조항 1 내지 6 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3은 PCV3의 임의의 계통발생 분기군이거나 또는 PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 및 PCV3c로 이루어진 군에서 선택된다.
8. 조항 1 내지 7 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2는 그룹 a1, b1 또는 b2 유래이다.
9. 조항 1 내지 8 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:1과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
10. 조항 1-9 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
11. 조항 1 내지 10 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 재조합 PCV3 ORF2 단백질이다.
12. 조항 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 PCV3 ORF2 단백질이다.
13. 조항 12의 조성물에 있어서, 발현 벡터는 배큘로바이러스이다.
14. 조항 1 내지 13 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV3 ORF2이다.
15. 조항 1 내지 14 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게 항원성 PCV2 ORF2 단백질 (PCV2 ORF2 항원)을 더 포함한다.
16. 조항 15의 조성물에 있어서, PCV2 ORF2 단백질은 PCV2 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 발현 유래이다.
17. 조항 16의 조성물에 있어서, 발현 벡터는 배큘로바이러스이다.
18. 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 더 포함한다.
19. 조항 18의 조성물에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원은 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원, 또는 이의 조합을 포함한다.
20. 조항 1 내지 19 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재한다.
21. 조항 1 내지 20 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질 또는 총 PCV2 및 PCV3 ORF2 단백질은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재한다.
22. 조항 2 내지 21 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고, 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함한다.
23. 조항 2 내지 22 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 보강제를 포함하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 당 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 존재한다.
24. 조항 2 내지 23 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 면역조절제는 인터루킨(들), 인터페론(들), 또는 다른 사이토카인(들)을 포함한다.
25. 조항 1 내지 24 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들), 또는 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제(들)를 포함한다.
26. 조항 1 내지 25 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 항생제(들)는 젠타미신을 포함한다.
27. 조항 1 내지 26 중 어느 하나의 조성물에 있어서, (i) PCV3 ORF2 단백질, (ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함한다.
28. 조항 27의 조성물에 있어서, 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가지고, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정된다.
29. 조항 27 또는 28의 조성물에 있어서, BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI가 처리된 세포 배양물 유래이고/이거나, 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유하고/하거나, 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유한다.
30. 조항 1 내지 29 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 조성물의 단일 용량 또는 1회 샷 투여를 위해 제제화 및/또는 포장되고, 다수-용량 용법이 아니거나; 또는 상기 조성물은 조성물의 다수-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장된다.
31. 조항 1 내지 30 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 조성물은 면역원성 조성물이다.
32. 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 약물로서 사용을 위한 것이다.
33. 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 백신으로서 사용을 위한 것이다.
34. 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물에 있어서, (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한 것이다.
35. 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한 것이고, 상기 동물은 바람직하게 돼지이다.
36. 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 돼지, 특히 바람직하게 임신 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는 방법에서 사용을 위한 것이다.
37. 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 자돈에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 질환을 감소 또는 예방시키는 방법에서 사용을 위한 것이고, 자돈은 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
38. 조항 37에 따른 사용을 위한 조성물로서, 조성물이 투여된 상기 모돈은 상기 모돈이 특히 상기 자돈을 임신하나 동안 면역원성 조성물이 투여된 모돈이거나, 또는 교배전 미경산돈이다.
39. 조항 32 내지 38항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 조성물에 있어서, 상기 조성물은 근육내로 또는 피내로 투여되어야 한다.
40. 조항 36 내지 39 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기 모돈에게 근육내로 또는 피내로 투여되어야 한다.
41. (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유도시키는 방법으로서, 조항 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
42. 조항 41의 방법에 있어서, 동물은 돼지류이다.
43. 조항 42의 방법에 있어서, 돼지류는 돼지 또는 자돈이다.
44. 조항 42 또는 43의 방법에 있어서, 돼지류는 모돈이다.
45. 조항 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 면역화하는 방법.
46. 상기 동물에서 적어도 하나의 병원체에 의해 초래된 임상 질환에 대해 돼지를 면역화시키는 방법으로서, 상기 방법은 조항 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 면역원성 조성물은 감염의 임상 징후를 야기시키는데 실패하지만 상기 적어도 하나의 병원체의 병원성 형태에 대해 동물을 면역화시키는 면역 반응을 유도시킬 수 있다.
47. 조항 46의 방법에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체는 PCV3이다.
48. 모돈에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 조항 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 조성물을 상기 모돈에게 투여하는 단계를 포함한다.
49. 자돈에서 PCV3에 의한 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상을 감소 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 조항 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 조성물을 모돈에게 투여하는 단계, 및 상기 자돈이 상기 모돈에 의해 포유되게 하는 단계를 포함한다.
50. 조항 49의 방법에 있어서, 상기 모돈은 특히 상기 자돈을 임신한 모돈, 또는 교배전 미경산돈이다.
51. 조항 49 또는 50의 방법에 있어서, 조항 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 조성물을 상기 자돈을 임신한 모돈에게 투여하는 단계, 상기 모돈이 상기 자돈을 출산하게 하는 단계, 및 상기 자돈이 상기 모돈에 의해 포유되게 하는 단계를 포함한다.
52. 자돈에서 PEDV에 의한 감염으로 초래된 임상 징후 및/또는 임상 증상을 감소시키는 방법으로서, 자돈은 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
53. 조항 45 내지 52 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 상기 백신 또는 약학 조성물은 상기 모돈에게 근육내로 또는 피내로 투여된다.
54. 조항 45 내지 53 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 상기 백신 또는 약학 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여된다.
55. 조항 45 내지 54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 상기 백신 또는 약학 조성물은 상기 모돈에게 점막으로 2회, 바람직하게 비내로 2회 투여된다.
56. 조항 32-40 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 조성물 또는 조항 41 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 임상 징후는 평균 1일 체중 증량의 감소 및 폐사로 이루어진 군에서 선택된다.
57. 조항 32-40 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 조성물 또는 조항 41 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 임상 징후는 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 배출로 이루어진 군에서 선택된다.
58. 조항 32 내지 40 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 조성물 또는 조항 41 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 임상 증상은 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제, 및 PCV3 바이러스혈증으로 이루어진 군에서 선택된다.
59. 조항 32 내지 40 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 조성물 또는 조항 41 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 임상 증상은 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생 또는 생산으로 이루어진 군에서 선택된다.
60. 조항 32 내지 40 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 조성물 또는 조항 41 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 돼지 또는 자돈은 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하이다.
61. 조항 60의 방법에 있어서, 투여는 병독성 돼지 써코바이러스에 노출의 적어도 1주 또는 2주 또는 3주 이내에 일어난다.
62. 조항 32 내지 41 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 조성물 또는 조항 42 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 투여는 조성물의 단일, 1회 샷 투여; 또는 단일, 1회 용량 투여를 포함하고; 다수-샷 또는 다수-용량 용법이 아니거나; 또는 투여는 단일, 1회 샷 투여; 또는 단일, 1회 용량 투여로 이루어지고; 다수-샷 또는 다수-용량 용법이 아니거나; 또는 투여는 조성물의 다수-샷 또는 다수-용량 용법을 포함하거나; 또는 투여는 조성물의 2-샷 또는 2-용량 용법을 포함하거나 또는 투여는 조성물의 2-샷 또는 2-용량 용법으로 이루어진다.
63. 조항 42-55 중 어느 하나의 방법에서 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물의 용도; 또는 (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유도하기 위하나 조성물의 제조에서 사용을 위하거나, 또는 (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대해 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유도하는 방법에서 사용을 위한, 단독으로 또는 조합하여, 조항 1 내지 31 중 어느 하나의 조성물의, PCV3 ORF2 단백질의 용도.
64. 조항 1 내지 31 중 어느 하나에 따른 조성물을 제조하는 방법으로서, 배양 곤출 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 PCV3 ORF2 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
65. 조항 64의 방법에 있어서, 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
66. 조항 65의 방법에 있어서, 불활성화는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함한다.
67. 조항 66의 방법에 있어서, 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함한다.
68. 조항 67의 방법에 있어서, 아지리딘 화합물은 BEI를 포함한다.
69. PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
70. 조항 69의 재조합 벡터에 있어서, PCV3 ORF2는 그룹 a1, b1 또는 b2 유래이다.
71. (i) 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질, 파보바이러스(PPV) 단백질 및 임의로 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 단백질 및 (ii) 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 면역조절제, 및/또는 이의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
72. 조항 71의 조성물에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
73. 조항 71 또는 72의 조성물에 있어서, PPV 단백질은 PPV VP2 캡시드 단백질이다.
74. 조항 71 내지 73 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PRRSV 단백질은 PRRSV ORF4, ORF5, ORF6, 또는 ORF7이다.
75. 조항 73 또는 74의 조성물에 있어서, PPV 단백질 및/또는 PRRSV 단백질은 벡터에서 발현된다.
76. 조항 71 내지 75 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 조성물은 돼지류에게 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물이다.
77. 조항 76의 조성물에 있어서, 돼지류는 미경산돈 또는 모돈이다.
78. 조항 76 또는 77의 조성물에 있어서, 투여는 교배/수정 이전, 임신 이전, 임신 동안 또는 수유 동안이다.
79. 조항 76-78 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 면역원성 조성물은 0.1 ㎍ 내지 150 ㎍, 바람직하게 0.25 ㎍ 내지 75 ㎍, 보다 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 37.5 ㎍, 보다 더 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 15 ㎍, 가장 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 6 ㎍의 PCV3, PPV 및/또는 PRRSV 항원을 포함한다.
80. 조항 76-79 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 면역원성 조성물은 근육내로 투여된다.
81. (i) 배큘로바이러스 시스템으로 발현된 적어도 2 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 PCV3 ORF2 재조합 단백질, 및 (ii) 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 또는 발현 벡터, 면역조절제 및/또는 이의 임의 조합을 포함하는 수의학적으로 허용가능한 담체의 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량을 돼지류에게 비경구 또는 피하로 투여하는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스 3 (PCV3)에 대해 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발하는 방법.
82. 조항 81의 방법에 있어서, 돼지류는 자돈, 돼지 또는 모돈, 또는 교배전 미경산돈이다.
83. 조항 81 또는 조항 82의 방법에 있어서, 돼지류는 약 1주령 또는 2주령 또는 3주령 또는 7-28 또는 7-22 또는 14-22 또는 16-22 또는 21+/- 5일령이다.
84. 조항 81 내지 83 중 어느 하나의 방법에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
85. 조항 81 내지 84 중 어느 하나의 방법에 있어서, PCV3 ORF2는 PCV3의 임의의 계통발생 분기군이거나 또는 군 PCV3a, PCV3a1, PCV3b, PCV3b1, 또는 PCV3b 유래이다.
86. 조항 81 내지 85 중 어느 하나의 방법에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
87. 조항 81 내지 86 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량은 PCV2 ORF2 단백질 또는 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 더 포함한다.
88. 조항 87의 방법에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원은 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원, 또는 이의 조합을 포함한다.
89. 조항 81 내지 88 중 어느 하나의 방법에 있어서, 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체(적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고, 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함한다.
90. 조항 81 내지 89 중 어느 하나의 방법에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재한다.
91. 조항 87의 방법에 있어서, PCV3 ORF2 단백질 또는 총 PCV2 및 PCV3 ORF2 단백질은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재한다.
92. 조항 81 내지 91 중 어느 하나의 방법에 있어서, 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 보강제를 포함하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 당 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 존재한다.
93. 조항 82 내지 92 중 어느 하나의 방법에 있어서, 면역조절제는 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인을 포함한다.
94. 조항 81 내지 93 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량은 약 1 ㎍/ml 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들), 또는 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제를 더 포함한다.
95. 조항 84의 방법에 있어서, 항생제는 젠타미신을 포함한다.
96. 조항 81 내지 95 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량은 (i) PCV3 ORF2 단백질, (ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함한다.
97. 조항 96의 방법에 있어서, 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가지고, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정된다.
98. 조항 96 또는 97의 방법에 있어서, BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI가 처리된 세포 배양물 유래이고/이거나, 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유하고/하거나, 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유한다.
99. 조항 81 내지 98 중 어느 하나의 방법에 있어서, 방법은 임신 모돈 또는 자돈에서 PCV3 또는 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV) 감염으로 초래된 임상 징후 또는 질환을 감소 또는 예방하는 단계를 더 포함한다.
100. 조항 99의 방법에 있어서, 자돈에서 임상 징후 또는 질환의 감소 또는 예방은 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량이 투여된 모돈에 의해 자돈을 포유하는 단계를 포함한다.
101. 조항 99의 방법에 있어서, 자돈에서 임상 징후 또는 질환의 감소 또는 예방은 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량을 임신 모돈에게 투여하는 단계를 포함한다.
102. 조항 101의 방법에 있어서, 모돈이 자돈을 출산한 후에 모돈이 자돈을 포유하는 단계를 더 포함한다.
103. 조항 99 내지 102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 임상 징후는 평균 1일 체중 증량의 감소, 폐사, 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생, 생산 또는 배출, 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제 또는 PCV3 바이러스혈증이다.
104. 조항 81 내지 103 중 어느 하나의 방법에 있어서, 비경구로 또는 피하로 투여하는 단계는 근육내 또는 피내이다.
105. 조작된 FG 루프를 포함하는 비-천연 발생 PCV3 ORF2 단백질로서, FG 루프는 3개 이하의 양으로 하전된 아미노산을 포함한다.
106. 조항 105의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, FG 루프는 2개의 양으로 하전된 아미노산을 포함한다.
107. 조항 105의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, FG 루프는 하나의 양으로 하전된 아미노산을 포함한다.
108. 조항 105의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, FG 루프는 양으로 하전된 아미노산이 결여된다.
109. 조항 105의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, FG 루프는 아르기닌 및 리신 잔기가 결여된다.
110. 조항 105의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, FG 루프는 아르기닌, 리신, 및 히스티딘 잔기가 결여된다.
111. 조항 105의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, FG 루프는 QPFSYH, LSRGF, 또는 MASGF를 포함한다.
112. 조작된 C-말단 연장을 포함하는 비-천연 발생 PCV3 ORF2 단백질.
113. 조항 112의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, C-말단 연장은 약 1 내지 약 10, 약 5 내지 약 20, 또는 약 10 내지 약 30 아미노산을 포함한다.
114. 조항 112의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, C-말단 연장은 약 1 내지 약 10, 또는 약 5 내지 약 20, 또는 약 10 내지 30 아미노산, 약 50 내지 약 200 아미노산, 약 60 내지 약 190 아미노산, 약 70 내지 약 180 아미노산, 약 80 내지 약 170 아미노산, 약 90 내지 약 160 아미노산 또는 약 100 내지 약 150 아미노산을 포함한다.
115. 조항 112의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, C-말단 연장은 상이한 캡시드 단백질 유래의 C-말단 아미노산을 포함한다.
116. 조항 115의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, C-말단 연장은 PCV2 캡시드, BFDV 캡시드, 또는 CaCV 캡시드로부터의 C-말단 아미노산을 포함한다.
117. 조항 112의 PCV3 ORF2 단백질에 있어서, C-말단 연장은 EFNLKDPPLN, PK, 또는 QFAPNNPSTEFDYETGRQL을 포함한다.
118. FG 루프 내 하나 이상의 아르기닌, 리신, 또는 히스티딘 아미노산을 비-양으로 하전된 아미노산으로 치환시키는 단계를 포함하는, 자가 조립 PCV3 ORF2 캡시드 단백질을 제조하는 방법.
119. 단백질의 C-말단에 아미노산 잔기를 첨가 또는 삽입하는 단계를 포함하고, PCV3 ORF2 캡시드 단백질의 자가-조립을 증강시키는 방법.
120. 조항 118의 방법에 있어서, 1 내지 10, 또는 약 5 내지 약 20, 또는 약 10 내지 약 30 아미노산, 약 50 내지 약 200 아미노산, 약 60 내지 약 190 아미노산, 약 70 내지 약 180 아미노산, 약 80 내지 약 170 아미노산, 약 90 내지 약 160 아미노산 또는 약 100 내지 약 150 아미노산을 첨가 또는 삽입하는 단계를 포함한다.
121. 조항 119의 방법에 있어서, 상기한 캡시드 단백질 유래 아미노산을 첨가 또는 삽입하는 단계를 포함한다.
122. 조항 121의 방법에 있어서, 첨가 또는 삽입된 아미노산은 PCV2 캡시드, BFDV 캡시드, 또는 CaCV 캡시드 유래이다.
123. 조항 121의 방법에 있어서, 첨가 또는 삽입된 아미노산은 EFNLKDPPLN, PK, 또는 QFAPNNPSTEFDYETGRQL을 포함한다.
124. 단일 투여로부터, PCV3 및/또는 이의 임상 증상에 대한 면역 반응 또는 보호 면역 반응을 유발시키는 양으로, 조항 105 내지 117 중 어느 하나의 PCV 단백질 또는 조항 118 내지 123 중 어느 하나의 방법으로 생산된 단백질, 및 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 또는 발현 벡터, 면역조절제 및/또는 이의 임의 조합을 포함하는 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
125. 조항 124의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7에 의해 코딩된다.
126. 조항 124 또는 125의 조성물에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
127. 조항 124 내지 126 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게 항원성 PCV2 ORF2 단백질 (PCV2 ORF2 항원), 또는 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 더 포함한다.
128. 조항 127의 조성물에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원은 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원, 또는 이의 조합을 포함한다.
129. 조항 124 내지 128 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고, 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함한다.
130. 조항 124 내지 129 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재한다.
131. 조항 124 내지 130 중 어느 하나의 조성물에 있어서, PCV3 ORF2 단백질 또는 총 PCV2 및 PCV3 ORF2 단백질은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재한다.
132. 조항 124 내지 131 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 보강제를 포함하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 당 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 존재한다.
133. 조항 125 내지 132 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 면역조절제는 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인을 포함한다.
134. 조항 105 내지 117 중 어느 하나의 PCV 단백질 또는 조항 118 내지 123 중 어느 하나의 방법으로 생산된 단백질을 함유하고 발현하는 벡터.
135. 조항 134의 벡터에 있어서, PCV 단백질은 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7에 의해 발현된다.
136. 조항 134 또는 135의 벡터에 있어서, 벡터는 배큘로바이러스이다.
137. 조항 125 내지 133 중 어느 하나의 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 PCV3 ORF2 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
138. 조항 137의 방법에 있어서, 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 더 포함한다.
139. 조항 138의 방법에 있어서, 불활성화는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함한다.
140. 조항 139의 방법에 있어서, 이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함한다.
141. 조항 140의 방법에 있어서, 아지리딘 화합물은 BEI를 포함한다.
조항 세트 C:
조항 세트 C - 본 발명은 하기 번호매김된 조항의 세트 (조항 세트 C)를 통해 이제 설명될 것이다. 이러한 조항 세트의 개시는 본 발명에 동등하게 적용가능하다. 유사하게 이러한 조항 세트의 개시는 다른 조항 세트의 각각에 동등하게 적용가능하다.
1. 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질로서, 상기 단백질은 PCV3 ORF2 단백질 또는 이의 기능적 항원성 변이체이다.
2. 조항 1에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질이다.
3. 조항 1 또는 조항 2에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 PCV3 ORF2의 기능적 항원성 변이체이다.
4. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 항원성 변이체이다.
5. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 바이러스-유사 입자 (VLP)의 수율을 더 높게 할 수 있다.
6. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 웨스턴 블롯 분석으로 결정가능한 바와 같이 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 VLP의 수율을 더 높게 할 수 있다.
7. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 더 적은 양으로 하전된 아미노산 잔기를 갖는다.
8. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 갖는다.
9. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 및/또는 K 잔기 및/또는 H 잔기의 하나 이상의 치환을 포함한다.
10. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 및/또는 K 잔기의 하나 이상의 치환을 포함한다.
11. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 또는 H 잔기 및 모든 K 잔기의 치환을 포함한다.
12. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프에 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 적어도 S 및/또는 H 및 임의의 K의 Q 또는 P 또는 F 또는 S로의 치환을 포함한다.
13. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH 내 모티프 SKKK의 QPFS로의 치환 또는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH 내 모티프 KKKH의 QPFS로의 치환을 포함한다.
14. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩가능하다.
15. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩된다.
16. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ IN No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고, 바람직하게 상기 연장은 전부이거나 또는 써코바이러스과 바이러스 유래 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 연장의 적어도 일부분은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 대체한다.
17. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 100개 아미노산 길이이다.
18. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 50개 아미노산 길이이다.
19. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이다.
20. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이고; 상기 연장은 서열 VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR의 전부 또는 일부를 포함한다.
21. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이고; 상기 연장은 서열 VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR의 전부를 포함한다.
22. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩가능하다.
23. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩된다.
24. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 재조된 재조합 단백질이다.
25. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 배큘로바이러스 발현된 단백질이다.
26. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3은 PCV3a 및 PCV3b로 이루어진 군에서 선택된다.
27. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3은 PCV3의 임의의 계통발생 분기군이거나 또는 PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 및 PCV3c로 이루어진 군에서 선택된다.
28. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2는 바람직하게 그룹 a1, b1 또는 b2 유래이다 ([Fux et al., "Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct group of virus strains", Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3] (참조로 본 명세서에 편입)의 아형분류 지정법 사용; 예를 들어, 표 4 참조).
29. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:1과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
30. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:6과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
31. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:7과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
32. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나 단백질은 재조합 단백질이다.
33. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이거나; 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이고, 상기 단백질은 FG 루프에 하나 이상의 치환을 갖는다.
34. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이거나; 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이고, 상기 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 갖는다.
35. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 단백질이다.
36. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 배큘로바이러스 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 단백질이다.
37. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
38. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
39. 전술한 조항 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
40. 전술한 조항 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 발현 숙주.
41. 전술한 조항 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 배큘로바이러스 발현 숙주.
42. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법.
43. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터를 발현하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법.
44. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 재조합 벡터를 발현하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법.
45. 단백질의 발현을 야기시키도록 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법.
46. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 발현 숙주를 형질감염시키는 단계, 및 단백질의 발현을 야기시키도록 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법.
47. 단백질의 발현을 야기시키도록 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법.
48. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법.
49. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 불활성화제는 발현된 단백질의 충분한 수준이 획득되었을 때 사용된다.
50. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제는 발현된 단백질의 충분한 수준이 획득되었을 때 사용된다.
51. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함한다.
52. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서,
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계, 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함하고; 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 갖는다.
53. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴 클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함하고; 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가지고, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정된다.
54. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서,을 제조하는 방법으로서, 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
55. 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법에 있어서; 방법은 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
56. 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서; 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함한다.
57. 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서; 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함하고; 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함한다.
58. 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법에 있어서; 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함하고; 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함하고; 아지리딘 화합물은 BEI를 포함한다.
59. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법으로 수득가능한 단백질.
60. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법으로 수득가능한 단백질을 포함하는 조성물.
61. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법으로 수득가능한 조성물.
62. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
63.전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 및 수의학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
64. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재한다.
65. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 포함하는 조성물에 있어서,조성물은 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 및/또는 면역조절제 중 어느 하나 이상을 포함한다.
66. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합 중 어느 하나 이상이다.
67. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함한다.
68. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고, 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드 중 하나 이상을 포함한다.
69. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함한다.
70. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 조성물의 약 50 ㎍ 내지 약 2000의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 중 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 조성물의 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 조성물의 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 약 1 ㎎의 양으로 존재한다.
71. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 면역조절제를 포함한다.
72. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 면역조절제를 포함하고; 면역조절제는 인터루킨(들), 인터페론(들), 또는 다른 사이토카인(들) 중 어느 하나 이상이다.
73. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 항생제(들)를 포함한다.
74. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 항생제(들)를 포함하고; 항생제(들)는 젠타미신을 포함한다.
75. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 항생제(들)를 포함하고; 조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들)를 포함한다.
76. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 항생제(들)를 포함하고;조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제(들)를 포함한다.
77. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 항원을 포함한다.
78. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 항원을 포함하고; 상기 추가 항원은 PCV3 ORF2 항원이 아니다.
79. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 항원을 포함하고; 상기 추가 항원은 PCV3 항원이 아니다.
80. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 포함한다.
81. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 돼지 병원체의 항원을 더 포함하고, 상기 병원체는 PCV2, PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원 중 어느 하나 이상이다.
82. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 돼지 병원체의 항원을 더 포함하고, 상기 조성물은 PCV2의 항원, PRRSV의 항원 및 PPV의 항원 중 하나 이상을 더 포함한다.
83. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함한다.
84. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 PCV2 ORF2 단백질이다.
85. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 재조합 PCV2 ORF2 단백질이다.
86. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질이다.
87. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재한다.
88. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 단일 용량 또는 1회 샷 투여를 위해 제제화 및/또는 포장된다.
89. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 다수-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장된다.
90. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 2-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장된다.
91. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있다.
92. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 10 용량을 함유한다.
93. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 50 용량을 함유한다.
94. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 100 용량을 함유한다.
95. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 200 용량을 함유한다.
96. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 250 용량을 함유한다.
97. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 포함하고; PCV2 항원은 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질이고; 단백질 또는 PCV3 ORF2 단백질 및 PCV2 ORF 단백질의 조합된 총량은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재한다.
98. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 염을 포함한다.
99. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 불활성화된 바이러스 벡터 및/또는 세포 배양물 상청액을 포함한다.
100. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 불활성화된 바이러스 벡터 및 세포 배양물 상청액을 포함한다.
101. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 (i) 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함한다.
102. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 (i) 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함하고; BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI가 처리된 세포 배양물 유래이고/이거나, 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유하고/하거나, 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유한다.
103. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물이다.
104. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제; 및 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 추가 항원을 포함하는 면역원성 조성물이다.
105. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합된다.
106. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 담체, 희석제 또는 부형제; 및 추가 항원과 혼합된다.
107. 약물로서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
108. 백신으로서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
109. 동물에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
110. 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
111. 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
112. 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
113. 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
114. 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
115. 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
116. 동물에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
117. 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
118. 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
119. 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
120. 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
121. 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
122. 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
123. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
124. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지류이다.
125. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
126. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이다.
127. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
128. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이다.
129. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
130. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
131. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물로서 상기 동물은 돼지류이다.
132. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
133. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이다.
134. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
135. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이다.
136. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
137. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
138. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지류이다.
139. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
140. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이다.
141. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
141. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이다.
142. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
143. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
144. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지류이다.
145. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
146. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이다.
147. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
148. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이다.
149. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
150. 전술한 조항 중 어느 하나에 따라 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 동물에게 근육내로 또는 피내로 투여된다.
151. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 다른 항원과 함께 상기 동물에게 투여되고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
152. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 다른 항원과 함께 상기 동물에게 투여되고; 상기 다른 항원은 PCV3 ORF2 항원이 아니고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
153. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 다른 항원과 함께 상기 동물에게 투여되고; 상기 다른 항원은 PCV3 항원이 아니고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
154. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈을 임신한 모돈이다.
155. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈을 임신한 모돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
156. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 1따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여된다.
157. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 오직 상기 모돈에게 2회 투여된다.
158. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여된다.
159. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 오직 상기 자돈에게 1회 투여된다.
160. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여되고; 상기 사용은 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안에 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
161. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여되고, 상기 사용은 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
162. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 모돈에게 오직 2회 투여되고; 상기 사용은 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
163. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여되고, 상기 사용은 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
164. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여되고, 상기 사용은 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
165. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 자돈에게 오직 1회 투여되고; 상기 사용은 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
166. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 사용에서 동물에게 투여는 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 단일, 1회 샷 투여 또는 단일, 1회 용량 투여로 이루어진다.
167. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 사용에서 동물에게 투여는 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 다수-샷 또는 다수-용량 용법으로 이루어진다.
168. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 사용에서 동물에게 투여는 상기 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 이중 샷 투여; 또는 이중 용량 투여로 이루어진다.
169. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 동물에게 투여는 병독성 돼지 써코바이러스에 노출의 적어도 1주 또는 2주 또는 3주 이내에 일어난다.
170. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 동물은 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하의 자돈이다.
171. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 조성물은 전술한 조항 중 어느 하나의 사용을 위한 것이다.
172. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질은 전술한 조항 중 어느 하나의 사용을 위한 것이다.
173. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 조성물은 전술한 조항 중 어느 하나의 사용을 위한 것이다.
174. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전에 동물에게 투여된다.
175. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여와 동일한 시간에 동물에게 투여된다.
176. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여와 동일한 시간 및 동일한 조성물로 동물에게 투여된다.
177. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여와 동일한 시간 및 상이한 조성물로 동물에게 투여된다.
178. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 벡터, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주, 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 후 동물에게 투여된다.
179. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
180. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 오직 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
181. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
182. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 오직 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
183. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
184. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 오직 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
185. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
186. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 오직 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
187. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 1회 용량은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 1회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
188. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감사키기 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 오직 1회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 1회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
189. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 2회 용량은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 2회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
190. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 오직 2회 용량은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 2회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
191. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 용도에 있어서, 상기 임상 징후 또는 증상은 평균 1일 체중 증량의 감소 및 폐사로 이루어진 군에서 선택된다.
192. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 용도에 있어서, 상기 임상 징후 또는 증상은 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제, 및 PCV3 바이러스혈증으로 이루어진 군에서 선택된다.
193. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 용도에 있어서, 상기 임상 징후 또는 증상은 미라화 태아의 발생 또는 생산으로 이루어진 군에서 선택된다.
194. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 용도에 있어서, 상기 임상 징후 또는 증상은 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 배출이거나 또는 이를 포함한다.
조항 세트 D:
조항 세트 D - 본 발명은 하기 번호매겨진 조항의 세트 (조항 세트 D)를 통해서 이제 설명될 것이다. 이러한 조항 세트의 개시는 본 발명에 동등하게 적용가능하다. 유사하게, 이 조항 세트의 개시는 다른 조항 세트의 각각에 동등하게 적용가능하다.
1. 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질로서, 상기 단백질은 PCV3 ORF2 단백질의 기능적 항원성 변이체이다.
2. 조항 1에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질이다.
3. 조항 1 또는 조항 2에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 PCV3 ORF2의 치환 및/또는 연장을 포함한다.
4. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 항원성 변이체이다.
5. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 바이러스-유사 입자 (VLP)의 수율을 더 높게 할 수 있다.
6. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 웨스턴 블롯 분석으로 결정가능한 바와 같이 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 VLP의 수율을 더 높게 할 수 있다.
7. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 소수의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 갖는다.
8. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 갖는다.
9. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 및/또는 K 잔기 및/또는 H 잔기의 하나 이상의 치환을 포함한다.
10. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 및/또는 K 잔기의 하나 이상의 치환을 포함한다.
11. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 또는 H 잔기 및 모든 K 잔기의 치환을 포함한다.
12. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프에 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 적어도 S 및/또는 H 및 임의의 K의 Q 또는 P 또는 F 또는 S로의 치환을 포함한다.
13. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH 내 모티프 SKKK의 QPFS로의 치환 또는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH 내 모티프 KKKH의 QPFS로의 치환을 포함한다.
14. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩가능하다.
15. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩된다.
16. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고, 바람직하게 상기 연장은 전부이거나 또는 써코바이러스과 바이러스 유래 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 연장의 적어도 일부분은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 대체한다.
17. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 100개 아미노산 길이이다.
18. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 50개 아미노산 길이이다.
19. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이다.
20. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이고; 상기 연장은 서열 VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR의 전부 또는 일부를 포함한다.
21. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이고; 상기 연장은 서열 VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR의 전부를 포함한다.
22. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩가능하다.
23. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩된다.
24. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 재조된 재조합 단백질이다.
25. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 배큘로바이러스 발현된 단백질이다.
26. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3은 PCV3a 및 PCV3b로 이루어진 군에서 선택된다.
27. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3은 PCV3의 임의의 계통발생 분기군이거나 또는 PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 및 PCV3c로 이루어진 군에서 선택된다.
28. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2는 바람직하게 그룹 a1, b1 또는 b2 유래이다 ([Fux et al., "Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct group of virus strains", Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3] (참조로 본 명세서에 편입)의 아형분류 지정법 사용; 예를 들어, 표 4 참조).
29. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:1과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
30. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:6과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
31. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:7과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
32. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이다.
33. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이거나; 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이고, 상기 단백질은 FG 루프에 하나 이상의 치환을 갖는다.
34. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이거나; 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/지거나, 단백질은 재조합 단백질이고, 상기 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단을 갖는다.
35. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 단백질이다.
36. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 배큘로바이러스 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 단백질이다.
37. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
38. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
39. 전술한 조항 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
40. 전술한 조항 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 발현 숙주.
41. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된1 배큘로바이러스 발현 숙주.
42. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
43. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터를 발현시키는 단계를 포함한다.
44. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 재조합 벡터를 발현시키는 단계를 포함한다.
45. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 단백질의 발현을 야기시키도록 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
46. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
47. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 단백질의 발현을 야기시키도록 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
48. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
49. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 불활성화제는 발현된 단백질의 충분한 수준이 획득되었을 때 사용된다.
50. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제는 발현된 단백질의 충분한 수준이 획득되었을 때 사용된다.
51. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함한다.
52. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함하고; 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 갖는다.
53. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 벡터의 뉴클레오티드 서열로 배큘로바이러스 발현 숙주를 형질감염시키는 단계 및 단백질의 발현을 야기시키도록 배지에서 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함하고; 단백질의 발현 후 배지는 (i) 상기 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분을 포함하고; 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 가지고, 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정된다.
54. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
55. 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 방법은 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
56. 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함한다.
57. 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함하고; 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함한다.
58. 배양 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 방법은 배큘로바이러스의 불활성화 단계를 포함하고; 불활성화 단계는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함하고; 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함하고; 아지리딘 화합물은 BEI를 포함한다.
59. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법으로 수득가능한 단백질.
60. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법으로 수득가능한 단백질을 포함하는 조성물.
61. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 방법으로 수득가능한 조성물.
62. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
63.전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 및 수의학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
64. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 2 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 4 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 8 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재한다.
65. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 포함하는 조성물에 있어서, 조성물은 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 및/또는 면역조절제 중 어느 하나 이상을 포함한다.
66. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합 중 어느 하나 이상이다.
67. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함한다.
68. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고, 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드 중 하나 이상을 포함한다.
69. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함한다.
70. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 담체, 희석제 또는 부형제는 보강제를 포함하고; 보강제는 조성물의 약 50 ㎍ 내지 약 2000의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 중 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 조성물의 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 조성물의 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 조성물의 약 1 ㎎의 양으로 존재한다.
71. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 면역조절제를 포함한다.
72. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 면역조절제를 포함하고; 면역조절제는 인터루킨(들), 인터페론(들), 또는 다른 사이토카인(들) 중 어느 하나 이상이다.
73. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 항생제(들)를 포함한다.
74. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 항생제(들)를 포함하고; 항생제(들)는 젠타미신을 포함한다.
75. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 항생제(들)를 포함하고; 조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들)를 포함한다.
76. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 항생제(들)를 포함하고;조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제(들)를 포함한다.
77. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 항원을 포함한다.
78. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 항원을 포함하고; 상기 추가 항원은 PCV3 ORF2 항원이 아니다.
79. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 항원을 포함하고; 상기 추가 항원은 PCV3 항원이 아니다.
80. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 포함한다.
81. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 돼지 병원체의 항원을 더 포함하고, 상기 병원체는 PCV2, PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원 중 어느 하나 이상이다.
82. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 추가 돼지 병원체의 항원을 더 포함하고, 상기 조성물은 PCV2의 항원, PRRSV의 항원 및 PPV의 항원 중 하나 이상을 더 포함한다.
83. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함한다.
84. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 PCV2 ORF2 단백질이다.
85. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 재조합 PCV2 ORF2 단백질이다.
86. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 더 포함하고; PCV2 항원은 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질이다.
87. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재한다.
88. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 단일 용량 또는 1회 샷 투여를 위해 제제화 및/또는 포장된다.
89. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 다수-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장된다.
90. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 2-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장된다.
91. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있다.
92. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 10 용량을 함유한다.
93. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 50 용량을 함유한다.
94. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 100 용량을 함유한다.
95. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 200 용량을 함유한다.
96. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 제형으로 존재하고; 상기 제형은 더 많은 양의 상기 조성물을 함유하는 용량으로부터 전달되고, 상기 조성물의 제형은 상기 용기로부터 전달될 수 있고; 상기 용기는 상기 조성물의 적어도 250 용량을 함유한다.
97. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 PCV2의 항원을 포함하고; PCV2 항원은 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질이고; 단백질 또는 PCV3 ORF2 단백질 및 PCV2 ORF 단백질의 조합된 총량은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 2 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 4 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 8 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재한다.
98. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 염을 포함한다.
99. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 불활성화된 바이러스 벡터 및/또는 세포 배양물 상청액을 포함한다.
100. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 불활성화된 바이러스 벡터 및 세포 배양물 상청액을 포함한다.
101. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 (i) 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함한다.
102. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 (i) 단백질, (ii) 상기 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함하고; BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI가 처리된 세포 배양물 유래이고/이거나, 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유하고/하거나, 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유한다.
103. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물이다.
104. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제; 및 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 추가 항원을 포함하는 면역원성 조성물이다.
105. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합된다.
106. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 담체, 희석제 또는 부형제; 및 추가 항원과 혼합된다.
107. 약물로서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
108. 백신으로서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
109. 동물에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
110. 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
111. 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
112. 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
113. 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
114. 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
115. 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
116. 동물에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
117. 돼지류에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
118. 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
119. 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
120. 자돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
121. 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
122. 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
123. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
124. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지류이다.
125. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
126. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이다.
127. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
128. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이다.
129. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위하거나 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
130. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
131. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지류이다.
132. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
133. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이다.
134. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
135. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이다.
136. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
137. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
138. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
139. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
140. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이다.
141. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
141. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이다.
142. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
143. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
144. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지류이다.
145. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지이다.
146. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이다.
147. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
148. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이다.
149. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 임신 모돈, 미경산돈 또는 교배전 미경산돈이다.
150. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 동물에게 근육내로 또는 피내로 투여된다.
151. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 동물에게 다른 항원과 함께 투여되고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
152. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 다른 항원과 함께 상기 동물에게 투여되고; 상기 다른 항원은 PCV3 ORF2 항원이 아니고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
153. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 다른 항원과 함께 상기 동물에게 투여되고; 상기 다른 항원은 PCV3 항원이 아니고, 바람직하게 다른 병원체는 돼지 병원체에 대한 항원이다.
154. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈을 임신한 모돈이다.
155. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈을 임신한 모돈이고; 자돈은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 한다.
156. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여된다.
157. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 오직 상기 모돈에게 2회 투여된다.
158. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여된다.
159. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 오직 상기 자돈에게 1회 투여된다.
160. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여되고, 상기 사용은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
161. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여되고, 상기 사용은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
162. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 모돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 모돈에게 오직 2회 투여되고; 상기 사용은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
163. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여되고; 상기 사용은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
164. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 자돈에게 1회 투여되고; 상기 사용은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
165. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 자돈이고; 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물은 상기 자돈에게 오직 1회 투여되고; 상기 사용은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전 또는 그 동안 상기 동물에게 임의의 다른 PCV3 항원의 투여를 포함하지 않는다.
166. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 사용에서 동물에게 투여는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 단일, 1회 샷 투여 또는 단일, 1회 용량 투여로 이루어진다.
167. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 사용에서 동물에게 투여는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 다수-샷 또는 다수-용량 용법으로 이루어진다.
168. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 사용에서 동물에게 투여는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 이중 샷 투여; 또는 이중 용량 투여로 이루어진다.
169. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 동물에게 투여는 병독성 돼지 써코바이러스에 노출의 적어도 1주 또는 2주 또는 3주 이내에 일어난다.
170. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 동물은 자돈 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하의 자돈이다.
171. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질은 전술한 조항 중 어느 하나의 사용을 위한 것이다.
172. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질은 전술한 조항 중 둘 이상의 사용의 사용을 위한 것이다.
173. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 조성물은 전술한 조항 중 어느 하나의 사용을 위한 것이다.
174. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 전에 동물에게 투여된다.
175. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여와 동일한 시간에 동물에게 투여된다.
176. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여와 동일한 시간 및 동일한 조성물로 동물에게 투여된다.
177. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여와 동일한 시간 및 상이한 조성물로 동물에게 투여된다.
178. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 제2 항원은 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물의 투여 후 동물에게 투여된다.
179. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
180. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 오직 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
181. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
182. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 오직 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
183. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
184. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 오직 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
185. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
186. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 돼지의 백신접종을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 단백질은 돼지에게 오직 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재한다.
187. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 1회 용량은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 1회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
188. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 오직 1회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 1회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
189. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 2회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 백신접종 방볍에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 2회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
190. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 오직 2회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 2회 용량 중 항원성 성분이고;
바람직하게 단백질은 면역원성 조성물의 1회 용량 중 적어도 2 ㎍의 양으로 존재하고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이다.
191. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 용도에 있어서, 상기 임상 징후 또는 증상은 평균 1일 체중 증량의 감소 및 폐사로 이루어진 군에서 선택된다.
192. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 용도에 있어서, 상기 임상 징후 또는 증상은 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제, 및 PCV3 바이러스혈증으로 이루어진 군에서 선택된다.
193. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 용도에 있어서, 상기 임상 징후 또는 증상은 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생 또는 생산으로 이루어진 군에서 선택된다.
194. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 용도에 있어서, 상기 임상 징후 또는 증상은 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 배출이거나 또는 이를 포함한다.
조항 세트 E - 본 발명은 하기 번호매겨진 조항의 세트 (조항 세트 E)를 통해서 이제 설명될 것이다. 이 조항 세트의 개시는 본 발명에 동등하게 적용가능하다. 유사하게 이 조항 세트의 개시는 다른 조항 세트의 각각에 동등하게 적용가능하다.
1. 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질로서, 상기 단백질은 PCV3 ORF2 단백질의 기능적 항원성 변이체이다.
2. 조항 1에 따른 단백질에 있어서, 상기 PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질이다.
3. 조항 1 또는 조항 2에 따른 단백질에 있어서, 상기 단백질은 PCV3 ORF2의 치환 및/또는 연장을 포함한다.
4. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질에 비해 바이러스-유사 입자 (VLP)의 수율을 더 높게 할 수 있다.
5. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 갖는다.
6. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No. 1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프 내 하나 이상의 치환을 가지고, 이들 치환은 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 FG 루프의 모티프 SKKKH의 S 잔기 및/또는 K 잔기 및/또는 H 잔기의 하나 이상의 치환을 포함한다.
7. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 갖는다.
8. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1에 의해 코딩되는 단백질의 말단 SVL 서열을 넘어서 연장되는 C-말단부를 가지고; 상기 연장은 1 내지 30개 아미노산 길이이고; 상기 연장은 서열 VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR의 전부 또는 일부를 포함한다.
9. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체는 SEQ ID No.1, 2, 5, 6 또는 7의 전부 또는 일부에 의해 코딩가능하다.
10. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질에 있어서, 상기 기능적 항원성 변이체 단백질은 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10의 서열과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
11. 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
12. 조항 11의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 배큘로바이러스 발현 숙주.
13.조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질을 제조하는 방법으로서, 단백질의 발현을 야기시키도록 제12항의 배큘로바이러스 발현 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
14. 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질 및 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
15. 조항 14에 따른 조성물에 있어서, 조성물은 면역조절제를 포함한다.
16. 백신으로서 사용을 위한 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 조항 14 내지 15 중 어느 하나에 따른 조성물.
17. 돼지에서 PCV3에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법에서 사용을 위한, 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 조항 14 내지 15 중 어느 하나에 따른 조성물.
18. 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 조항 14 내지 15 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 동물은 돼지류이다.
19. PCV3에 대해 동물을 면역화시키는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지류이다.
20. 동물에서 PCV3 바이러스 발현을 감소 또는 제거 또는 폐기시키는 방법에서 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물에 있어서, 상기 동물은 돼지류이다.
21. 동물에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는데 사용을 위한, 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 조성물.
22. 동물에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한, 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질 또는 조항 14 내지 15 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 동물은 돼지류이다.
23. 조항 22에 따른 사용을 위한, 단백질 또는 조성물로서, 상기 임상 징후 또는 증상은 평균 1일 체중 증량의 감소, 폐사, 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제, PCV3 바이러스혈증, 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생 또는 생산, 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 배출로 이루어진 군에서 선택된다.
24. 조항 16 내지 23 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 단백질 또는 조성물로서, 사용에서 동물에게 투여는 상기 단백질 또는 상기 조성물의 단일, 1회 샷 투여 또는 단일, 1회 용량 투여로 이루어진다.
25. 조항 16 내지 23 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 단백질 또는 조성물로서, 사용에서 동물에게 투여는 전술한 조항 중 어느 하나에 따른 상기 단백질 또는 상기 조성물의 이중 샷 투여; 또는 이중 용량 투여로 이루어진다.
26. 조항 16 내지 25 중 어느 하나에 따른 사용을 위한, 단백질 또는 조성물로서, 상기 단백질 또는 상기 조성물은 상기 동물에게 근육내로 또는 피내로 투여된다.
27. 돼지에서 PCV3 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고/시키거나 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한, 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질로서, 단백질은 돼지에게 오직 1회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재하고, 상기 항원성 단백질은 PCV3 ORF2 단백질 또는 이의 기능적 항원성 변이체이고, 바람직하게 상기 이의 기능적 항원성 변이체은 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질이고; 바람직하게 상기 돼지는 자돈이고, 바람직하게 상기 자돈은 15주령 이하이다.
28. 돼지에서 PCV3 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고/시키거나 돼지의 백신접종에서 사용을 위한 단일 PCV3 항원으로서 사용을 위한, 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질로서, 단백질은 돼지에게 오직 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물에 존재하고, 상기 항원성 단백질은 PCV3 ORF2 단백질 또는 이의 기능적 항원성 변이체이고, 바람직하게 상기 이의 기능적 항원성 변이체는 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질이고; 바람직하게 상기 돼지는 모돈 또는 교배전 미경산돈이다.
29. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 오직 1회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 1회 용량 중 항원성 성분이고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이고;
상기 단백질은 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질이고;
상기 항원성 단백질은 PCV3 ORF2 단백질 또는 이의 기능적 항원성 변이체이고;
바람직하게 상기 이의 기능적 항원성 변이체는 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질이다.
30. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 오직 1회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 1회 용량 중 항원성 성분이고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이고;
돼지는 자돈이고, 바람직하게 상기 자돈은 15주령 이하이고;
상기 단백질은 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질이고;
상기 항원성 단백질은 PCV3 ORF2 단백질 또는 이의 기능적 항원성 변이체이고;
바람직하게 상기 이의 기능적 항원성 변이체는 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질이다.
31. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 오직 2회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 2회 용량 중 항원성 성분이고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이고;
상기 단백질은 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질이고;
상기 항원성 단백질은 PCV3 ORF2 단백질 또는 이의 기능적 항원성 변이체이고;
바람직하게 상기 이의 기능적 항원성 변이체는 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질이다.
32. 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위한 면역원성 조성물로서;
면역원성 조성물의 오직 2회 용량이 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키기 위해 백신접종 방법에서 돼지에게 투여되고;
백신접종 방법에서 돼지에게 면역원성 조성물의 2회 용량의 투여는 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서 면역원성 조성물의 2회 용량 중 항원성 성분이고;
단백질은 돼지에서 PCV3 감염으로 인한 임상 징후 또는 임상 증상의 중증도를 경감시키는 백신접종 방법에서의 항원성 성분이고;
돼지는 모돈 또는 교배전 미경산돈이고;
상기 단백질은 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 항원성 단백질이고;
상기 항원성 단백질은 PCV3 ORF2 단백질 또는 이의 기능적 항원성 변이체이고;
바람직하게 상기 이의 기능적 항원성 변이체는 조항 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 단백질이다.
33. 조항 29-32 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 면역원성 조성물로서, 상기 임상 징후 또는 증상은 평균 1일 체중 증량의 감소, 폐사, 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제, PCV3 바이러스혈증, 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생 또는 생산, 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 배출로 이루어진 군에서 선택된다.
34. 조항 29-33 중 어느 하나에 따른 사용을 위한 면역원성 조성물로서, 상기 단백질 또는 상기 조성물은 상기 동물에게 근육내로 또는 피내로 투여된다.
본 명세서의 임의 구현예의 실시에서, 본 개시 전반에서 논의되는 본 발명의 PCV3 단백질에서, 본 발명은 본 발명의 PCV3 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 함유하는 벡터, 예컨대 배큘로바이러스 벡터 (배큘로바이러스 발현 시스템을 통해 PCV2 ORF2 캡시드 단백질을 발현하기 위한 그의 방법 및 재료는 본 명세서에 개시된 바와 같은 이러한 PCV3 ORF2 야생형 또는 돌연변이체 캡시드 단백질을 비롯하여, 바람직하다면 하나 이상의 돼지 병원체의 하나 이상의 단백질을 포함하여, 이를 본 발명의 조성물에 포함시키기 위해서, PCV3 ORF2 캡시드 단백질을 발현시키도록 본 발명의 실시에서 적용할 수 있으므로 그에 인용된 문헌과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는, EP 2460821 A2 참조), 및 예컨대 벡터로 관련 세포를 감염 또는 형질감염시켜서, 본 발명의 이러한 돌연변이형 PCV3 단백질을 제조 또는 발현하는 방법 (예를 들어, 벡터가 배큘로바이러스라면, 관련 세포는 곤충 또는 Sf 세포 또는 Sf+ 세포일 수 있고; 그에 인용되는 문헌과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는 EP 2 460 821 A2를 참조함)을 포괄한다. 발현 또는 생산 이후에, 예를 들어, 고체를 분리하고 가용성 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 액체 또는 상청액을 유지시키고 상청액을 여과하여서, 단백질을 회수 또는 단리하는 것이 유리하다. 가용성 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 상청액을 유리하게 BEI, 예컨대 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI로 불활성화시켜서 배큘로바이러스를 불활성화시킨다. 보강제, 유리하게 약 1 ㎎ 또는 약 20% v/v의 카르보폴 또는 카르보폴 971이 또한 조성물에 첨가된다. 단일 용량 또는 다수 용량으로 약 1 mL 또는 약 2 mL의 용량 중 약 2, 4, 8 또는 16 ㎍의 조성물의 용량은 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하의 돼지 또는 자돈에게 투여된다.
본 개시는 단지 예시 목적으로 제공되고 임의 방식으로 본 개시를 제한하려는 의도가 아닌, 하기 실시예에서 더욱 예시될 것이다. 분자 클로닝 기술 (예컨대, 제한없이, DNA 삽입부, 플라스미드, 및 재조합 바이러스 또는 식물 벡터의 구축)은 그 개시가 참조로 편입되는, J. Sambrook 등 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989), 및 미국 특허 제8,865,183호에 기술된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수행되었다.
본 발명 및 이의 장점을 상세히 기술하였지만, 다양한 변화, 치환, 및 변경은 첨부된 청구항에 정의된 바와 같이 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에서 만들어질 수 있다는 것을 이해해야 한다.
본 발명은 단지 예시 목적을 제공되고 임의 방식으로 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예에서 더욱 예시될 것이다.
실시예
본 명세서에 제시되는 실시예에서, 주요 데이터는 그 주요 데이터를 분석하는 요약 표에 더하여 포함되었다. 임의의 현장 시험에 따라서, 결과는 각 동물에서 정확하게 동일하지 않고, 또한, 하나 이상의 이례적인 결과가 존재할 수 있다. 그러나, 요약표는 주요 데이터의 분석을 표시한다는 것을 이해해야 한다. 분석 결과는 본 발명의 효과적임을 보여준다.
실시예 1
PCV3 ORF2의 확인 및 클로닝, 및 BaculoG/PCV3 ORF2의 생산 및 정제
PCV3 ORF2 코딩 서열 (SEQ ID NO:1)은 KT869077 ORF2 서열 (참조: 참조로 본 명세서에 편입되는 [Fan et al., "Complete Genome Sequence of a Novel Porcine Circovirus Type 3 Strain, PCV3/CN/Hubei-618/2016, Isolated from China, Genome Announc 2017 Apr 5(15) e00100-17, Apr 13. doi: 1 genomeA.00100-17]; 또한, SEQ ID NO: 4; 역시 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제10,450,351호)을 함유하는 합성 유전자로부터 PCR을 통해서 클로닝하였고 5' BamHI 및 3' NotI 제한효소 부위를 이용하여 배큘로바이러스 전달 플라스미드 pVL1393 (Invitrogen)에 결찰시켰다. BamHI/NotI 제한효소 단편은 또한 5' BamHI 부위 및 PCV3 ORF2 출발 코돈 사이에 직접적으로 코작 공통 서열 (GCCACC)을 함유하였다. 폴리헤드론 프로모터의 제어 하에 PCV3 ORF2 코딩 서열을 함유하는 재조합 배큘로바이러스는 선형화된 배큘로바이러스 DNA 및 전달 플라스미드 pVL1393-PCV3 ORF2로 Sf9 곤충 세포 (스포돕테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda))의 공-형질감염을 통해서 생성시켰다. 최종 재조합 배큘로바이러스, BaculoG/PCV3 ORF2는 Sf9 곤충 세포에서 증폭시켰고 이후에 제한 희석 클로닝을 통해서 정제하였다. 참조로 본 명세서에 편입되고, 본 명세서에 개시된 바와 같은 PCV3 ORF2 단백질에 대한 코딩 서열과, 그에 인용된 문헌과 함께, EP 2460821 A2의 방법을 또한 언급한다 (임의의 돌연변이체 또는 변이체 또는 변형된 PCV3 ORF2 단백질, 특히 SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 또는 10을 제조하기 위해 적용되는 전술한 방법 포함).
PCV3 ORF2 코딩 서열 (SEQ ID NO:1)은 KT869077 ORF2 서열을 함유하는 합성 유전자로부터 PCR을 통해서 클로닝하였고 5' BamHI 및 3' NotI 제한효소 부위를 이용하여 배큘로바이러스 전달 플라스미드 pVL1393에 결찰시켰다. BamHI/NotI 제한효소 단편은 또한 5' BamHI 부위 및 PCV3 ORF2 출발 코돈 사이에 직접적으로 코작 공통 서열 (GCCACC)을 함유하였다. 폴리헤드론 프로모터의 제어 하에 PCV3 ORF2 코딩 서열을 함유하는 재조합 배큘로바이러스는 선형화된 배큘로바이러스 DNA 및 전달 플라스미드 pVL1393-PCV3 ORF2로 Sf9 곤충 세포 (스포돕테라 프루지페르다)의 공-형질감염을 통해서 생성되었다. 최종 재조합 배큘로바이러스, BaculoG/PCV3 ORF2는 Sf9 곤충 세포에서 증폭시켰고 이후에 제한 희석 클로닝으로 정제하였다.
실시예 1A, 1B, 1C
PCV3 ORF2 및 이의 돌연변이체 또는 변이체 (FG 루프 돌연변이, FG 루프 돌연변이 및 C-말단에 연장 또는 첨가)의 확인 및 클로닝, 및 BaculoG/PCV3 ORF2 및 이의 돌연변이체 또는 변이체의 생산 및 정제 (FG 루프 돌연변이, FG 루프 돌연변이 및 C-말단에 연장 또는 첨가), 및 이의 용도
실시예 1A : PCV3 ORF2 단백질 of SEQ ID NO: 4의 PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터, 배큘로바이러스 벡터에 클로닝하였다 (실시예 1 참조, 배큘로바이러스 발현 시스템을 통해서 PCV2 ORF2 캡시드 단백질을 발현하기 위한 그의 방법 및 재료로서 그에 인용되는 문헌들과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는, EP 2 460 821 A2 참조) (본 발명의 조성물에서 이것을 포함하는 것이 바람직할 때, 하나 이상의 돼지 병원체의 하나 이상의 단백질은 또한 벡터 시스템 예컨대 배큘로바이러스 시스템을 사용해 발현될 수 있거나, 또는 불활성화된 병원체 예컨대 불활성화된 바이러스, 예를 들어 PRRSV 또는 박테린 또는 박테리아 배양물의 상청액일 수 있음). 세포는 벡터, 배큘로바이러스 벡터로 감염 또는 형질감염된다 (실시예 1, 실시예 2 참조, 그에 인용된 문헌과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는, EP 2 460 821 A2 참조; SF+ (스포돕테라 프루지페르다) 세포는 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 돼지 써코바이러스 3 ORF2 유전자 2에 대한 코딩부를 함유하는 재조합 배큘로바이러스로 대략 0.076의 MOI로 감염 또는 형질감염됨).
단백질의 발현 또는 생산 후에, 단백질은 예를 들어, 고체를 분리하고 가용성 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 액체 또는 상청액을 보유하고 상청액을 여과시켜서, 회수 또는 단리된다. 가용성 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 상청액은 유리하게, BEI, 예컨대 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI로 불활성화되어서 배큘로바이러스를 불활성화시킨다. 보강제, 유리하게 약 1 ㎎ 또는 약 20% v/v의 카르보폴 또는 카르보폴 971이 또한 첨가되어 조성물을 만든다 (예를 들어, 실시예 2 참조, 플라스크는 28℃ ± 2℃에서 대략 100 rpm에서 일정하게 교반하면서 7일 동안 인큐베이션된다. 세포 및 배지는 무균적으로 2 x 1 L 원심분리 병에 전달되고 세포는 15,000 x g으로 20분 동안 4℃에서 펠렛화된다. 최종 상청액은 0.2 ㎛에서 여과되고 4℃에서 저장된다; 불활성화된 배큘로바이러스 PCV3 ORF2 항원, 800 mL; 카르보폴 971P (0.5% 스톡 용액) 보강제, 200 mL; 총 1000 mL 또는 1 L).
2 ㎍, 4 ㎍, 8 ㎍ 또는 16 ㎍의 PCV3 ORF2 항원을 1 mL 또는 약 2 mL 총 부피에 함유하는 조성물의 단일 용량 (즉, 1회 샷 또는 단일 투여)이 돼지의 그룹에 투여된다 (예를 들어, 그룹 당 6마리 돼지). 돼지 또는 자돈의 그룹은 15주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 6주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 3주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 2주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 1주령 이하이다. 돼지의 그룹은 수정-전, 모돈이다. 예를 들어, 시기와 관련하여, 단일 용량의 투여는 바로 아래 논의된 다수 용량 용법의 하기 언급된 투여 중 하나이다. 단일 투여로부터, 돼지 그룹의 각각은 PCV3 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상에 대한 면역력, 예를 들어, 보호 면역력, 및/또는 PCV3 감염 또는 이의 발생 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상의 감소 또는 경감 또는 예방을 입증한다.
2 ㎍, 4 ㎍, 8 ㎍ 또는 16 ㎍의 PCV3 ORF2 항원을 1 mL 또는 2 mL 총 부피에 함유하는 조성물을 적어도 1주만큼 떨어져서, 다수 용량 용법, 즉 2회 샷 또는 2회 단일 투여 (예를 들어, 프라임 및 부스트)로 돼지의 그룹에게 투여한다 (예를 들어, 그룹 당 6마리 돼지). 돼지 또는 자돈의 그룹은 15주령 이하이다 (2주령 또는 3주령에 제1 투여 및 3주령 또는 4주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 6주령 이하이다 (2주령 또는 3주령에 제1 투여 및 3주령, 4주령 또는 5주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 3주령 이하이다 (7일령 내지 14일령에 제1 투여, 14일령 내지 21일령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 2주령 이하이다 (1주령에 제1 투여 및 2주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 1주령 이하이다 (3일 또는 4일 및 7일에 투여). 돼지의 그룹은 수정-전, 모돈이다 (수정-전 4주 내지 6주에 제1 투여 및 수정-전 2주 내지 4주에 제2 투여). 다수 투여로부터, 돼지의 그룹의 각각은 PCV3 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상에 대한 면역력, 예를 들어 보호 면역력, 및/또는 PCV3 감염 또는 이의 발생 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상의 감소 또는 경감 또는 예방을 입증한다.
실시예 1B : SEQ ID NO: 8의 PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 핵산 분자 (FG 루프 중 4 돌연변이; PCV3 ORF2 단백질의 FG 루프는 PCV2의 것으로 치환됨 (SKKK -> QPFS))를 벡터, 배큘로바이러스 벡터에 클로닝하였다 (실시예 1 참조, 또한 배큘로바이러스 발현 시스템을 통해서 돌연변이형 PCV2 ORF2 캡시드 단백질을 발현하기 위한 그의 방법 및 재료로서 그에 인용되는 문헌과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는 EP 2 460 821 A2 참조) (이것이 본 발명의 조성물에 포함되는 것이 바람직한 경우에, 하나 이상의 돼지 병원체의 하나 이상의 단백질은 또한 벡터 시스템 예컨대 배큘로바이러스 시스템을 사용해 발현될 수 있거나, 또는 불활성화된 병원체 예컨대 불활성화된 바이러스, 예를 들어, PRRSV 또는 박테린 또는 박테리아 배양물의 상청액일 수 있음). 세포는 벡터, 배큘로바이러스 벡터로 감염 또는 형질감염된다 (실시예 1, 실시예 2 참조, 그에 인용되는 문헌과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는 EP 2 460 821 A2 참조; SF+ (스포돕테라 프루지페르다) 세포는 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 돌연변이형 돼지 써코바이러스 3 ORF2 유전자 2에 대한 코딩부를 함유하는 재조합 배큘로바이러스로 대략 0.076의 MOI로 감염 또는 형질감염됨).
돌연변이형 단백질의 발현 또는 생산 이후에, 돌연변이형 단백질은 예를 들어, 고체를 분리하고 가용성 돌연변이형 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 액체 또는 상청액은 보유하고 상청액을 여과하여, 회수 또는 단리된다. 가용성 돌연변이형 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 상청액은 유리하게 BEI, 예컨대 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI로 불활성화되어서 배큘로바이러스를 불활성화시킨다. 보강제, 유리하게 약 1 ㎎ 또는 약 20% v/v의 카르보폴 또는 카르보폴 971이 또한 첨가되어 조성물을 만든다 (참조: 예를 들어, 실시예 2, 플라스크는 28℃ ± 2℃에서 대략 100 rpm에서 일정하게 교반하면서 7일 동안 인큐베이션된다. 세포 및 배지는 무균적으로 2 x 1 L 원심분리 병으로 옮겼고 세포는 15,000 x g로 20분 동안 4℃에서 펠렛화시킨다. 최종 상청액은 0.2 ㎛로 여과시키고 4℃에서 저장한다; 불활성화된 배큘로바이러스 돌연변이형 PCV3 ORF2 항원, 800 mL; 카르보폴 971P (0.5% 스톡 용액) 보강제, 200 mL; 총 1000 mL 또는 1 L). 돌연변이체와 수득된 VLP (가용성 돌연변이형 PCV3 ORF2 단백질)의 양은 SEQ ID NO: 4의 천연 서열로부터 수득된 VLP의 양에 비해 크다.
2 ㎍, 4 ㎍, 8 ㎍ 또는 16 ㎍의 돌연변이형 PCV3 ORF2 항원을 1 mL 또는 약 2 mL 총 부피에 함유하는 조성물의 단일 용량 (즉, 1회 샷 또는 단일 투여)은 돼지의 그룹에 투여된다 (예를 들어, 그룹 당 6마리 돼지). 돼지 또는 자돈의 그룹은 15주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 6주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 3주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 2주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 1주령 이하이다. 돼지의 그룹은 수정-전, 모돈이다. 예를 들어, 시기와 관련하여, 단일 용량의 투여는 바로 아래에 논의된 복수 용량 용법의 하기 언급된 투여 중 하나이다. 단일 투여로부터, 돼지의 그룹의 각각은 PCV3 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상에 대한 면역력, 예를 들어 보호 면역력, 및/또는 PCV3 감염 또는 이의 발생 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상의 감소 또는 경감 또는 예방을 입증한다.
2 ㎍, 4 ㎍, 8 ㎍ 또는 16 ㎍의 돌연변이형 PCV3 ORF2 항원을 1 mL 또는 약 2 mL 총 부피에 함유하는 조성물의 적어도 1주만큼 떨어진, 다수 용량 용법, 즉 2회 샷 또는 2회 단일 투여 (예를 들어, 프라임 및 부스트)가 돼지의 그룹에 투여된다 (예를 들어, 그룹 당 6마리 돼지). 돼지 또는 자돈의 그룹은 15주령 이하이다 (2주령 또는 3주령에 제1 투여 및 3주령 또는 4주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 6주령 이하이다 (2주령 또는 3주령에 제1 투여 및 3주령, 4주령 또는 5주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 3주령 이하이다 (7일령 내지 14일령에 제1 투여, 14일령 내지 21일령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 2주령 이하이다 (1주령에 제1 투여 및 2주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 1주령 이하이다 (3일 또는 4일 및 7일에 투여). 돼지의 그룹은 수정-전, 모돈이다 (수정-전 4주 내지 6주에 제1 투여 및 수정-전 2주 내지 4주에 제2 투여). 다수 투여로부터, 돼지의 그룹의 각각은 PCV3 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상에 대한 면역력, 예를 들어 보호 면역력, 및/또는 PCV3 감염 또는 이의 발생 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상의 감소 또는 경감 또는 예방을 입증한다.
실시예 1C : (a) FG 루프에 4 돌연변이; PCV2의 것으로 치환된 PCV3 ORF2 단백질의 FG 루프 (SKKK -> QPFS) 및 천연 PCV3 ORF2 코딩 서열에서 중지 코돈의 제거에 의한 C-말단의 30 아미노산 연장 - 중지 코돈의 제거에 의한 말단 연장, 즉, 천연 PCV3 ORF2 단백질 C-말단에서 "SVL" 이후, VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR의 첨가 (SEQ ID NO: 8 및 9 참조)를 갖는 돌연변이형 PCV3 ORF2 단백질; 및 (b) 천연 PCV3 ORF2 코딩 서열에서 중지 코돈의 제거에 의해 C-말단의 30 아미노산 연장 - 중지 코돈의 제거에 의한 말단 연장, 즉, 천연 PCV3 ORF2 단백질 C-말단에서 "SVL"이후에, VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR의 첨가 (SEQ ID NO:9 참조)를 갖는 돌연변이형 PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 핵산 분자는, 각각이 벡터, 배큘로바이러스 벡터에 클로닝되었다 (실시예 1 참조, 또한 배큘로바이러스 발현 시스템을 통해서 돌연변이형 PCV2 ORF2 캡시드 단백질을 발현하기 위한 그의 방법 및 재료로서 그에 인용되는 문헌과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는 EP 2 460 821 A2 참조) (이것이 본 발명의 조성물에 포함되는 것이 바람직할 때, 하나 이상의 돼지 병원체의 하나 이상의 단백질은 또한 벡터 시스템 예컨대 배큘로바이러스 시스템을 사용해 발현될 수 있거나, 또는 불활성화된 병원체 예컨대 불활성화된 바이러스, 예를 들어 PRRSV 또는 박테린 또는 박테리아 배양물의 상청액일 수 있음). 세포는 (a) 또는 (b)를 코딩하는 벡터, (a) 또는 (b)를 코딩하는 배큘로바이러스 벡터로 감염 또는 형질감염된다 (실시예 1, 실시예 2 참조, 그에 인용되는 문헌과 함께, 참조로 본 명세서에 편입되는 EP 2 460 821 A2 참조; SF+ (스포돕테라 프루지페르다) 세포는 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 돌연변이형 돼지 써코바이러스 3 ORF2 유전자 2에 대한 코딩부를 함유하는 재조합 배큘로바이러스로 대략 0.076의 MOI로 감염 또는 형질감염됨).
돌연변이형 단백질 (a) 또는 (b)의 발현 또는 생산 이후에, 돌연변이형 단백질은 각각이 예를 들어 고체를 분리하고 가용성 돌연변이형 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 액체 또는 상청액을 유지하고 상청액을 여과시켜서 회수 또는 단리된다. 가용성 돌연변이형 단백질 (예를 들어, VLP)을 함유하는 상청액은 유리하게 BEI, 예컨대 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI로 불활성화되어서 배큘로바이러스를 불활성화시킨다. 보강제, 유리하게 약 1 ㎎ 또는 약 20% v/v의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 또한 첨가하여 조성물을 만든다 (예를 들어, 실시예 2 참조, 플라스크는 28℃ ± 2℃에서 대략 100 rpm으로 일정하게 교반하면서 7일 동안 인큐베이션된다. 세포 및 배지는 2 x 1 L 원심분리 병으로 무균적으로 옮기고 세포는 15,000 x g로 20분 동안 4℃에서 펠렛화된다. 최종 상청액은 0.2 ㎛ 여과하고 4℃에서 저장한다; 불활성화된 배큘로바이러스 돌연변이형 PCV3 ORF2 항원, 800 mL; 카르보폴 971P (0.5% 스톡 용액) 보강제, 200 mL; 총 1000 mL 또는 1 L). 각 돌연변이체로 수득된 VLP (가용성 돌연변이형 PCV3 ORF2 단백질)의 양은 SEQ ID NO: 4의 천연 서열로부터 수득된 VLP의 양에 비해 크다. FG 루프 돌연변이 및 연장부를 갖는 돌연변이체 (b)로부터 수득된 VLP (가용성 돌연변이형 PCV3 ORF2 단백질)의 양은 FG 루프 돌연변이체 또는 변이체 단독 또는 연장부 단독으로부터 수득된 VLP의 양에 비해서 클 수 있다.
2 ㎍, 4 ㎍, 8 ㎍ 또는 16 ㎍의 돌연변이형 PCV3 ORF2 항원 (a) 또는 (b)를 1 mL 또는 약 2 mL 총 부피에 함유하는 조성물의 단일 용량 (즉, 1회 샷 또는 단일 투여)이 돼지의 그룹에 투여된다 (예를 들어, 그룹 당 6마리 돼지). 돼지 또는 자돈의 그룹은 15주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 6주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 3주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 2주령 이하이다. 돼지 또는 자돈의 그룹은 1주령 이하이다. 돼지의 그룹은 수정-전, 모돈이다. 예를 들어, 시기와 관련하여, 단일 용량의 투여는 바로 아래 논의되는 다수 용량 용법의 하기 언급된 투여 중 하나이다. 용량의 (a) 또는 (b) 각각의 단일 투여로부터, 돼지 그룹의 각각은 PCV3 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상에 대한 면역력, 예를 들어 보호 면역력, 및/또는 PCV3 감염 또는 이의 발생 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상의 감소 또는 경감 또는 예방을 입증한다.
2 ㎍, 4 ㎍, 8 ㎍ 또는 16 ㎍의 돌연변이형 PCV3 ORF2 항원 (a) 또는 (b)를 1 mL 또는 약 2 mL 총 부피에 함유하는 조성물의 적어도 1주만큼 떨어진, 다수 용량 용법, 즉 2회 샷 또는 2 단일 투여 (예를 들어, 프라임 및 부스트; 또는 동일 돌연변이체, 즉, 프라임 및 부스트는 둘 모두 (a) 또는 둘 모두 (b)이고, 프라임 및 부스트는 동일한 용량의 양임)가 돼지의 그룹에 투여된다 (예를 들어, 그룹 당 6마리 돼지). 돼지 또는 자돈의 그룹은 15주령 이하이다 (2주령 또는 3주령에 제1 투여 및 3주령 또는 4주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 6주령 이하이다 (2주령 또는 3주령에 제1 투여 및 3주령, 4주령 또는 5주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 3주령 이하이다 (7일령 내지 14일령에 제1 투여, 14일령 내지 21일령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 2주령 이하이다 (1주령에 제1 투여 및 2주령에 제2 투여). 돼지 또는 자돈의 그룹은 1주령 이하이다 (3일 또는 4일 및 7일에 투여). 돼지의 그룹은 수정-전, 모돈이다 (수정-전 4주 내지 6주에 제1 투여 및 수정-전 2주 내지 4주에 제2 투여). (a) 또는 (b)의 다수 투여로부터, 돼지의 그룹의 각각은 PCV3 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상에 대한 면역력, 예를 들어 보호 면역력, 및/또는 PCV3 감염 또는 이의 발생 및/또는 이의 임상 징후 또는 증상의 감소 또는 경감 또는 예방을 입증한다.
실시예 2
연구를 위한 BaculoG/PCV3 ORF2 항원의 생산
1 L의 다수의 항원은 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터 (BaculoG/PCV3 ORF2 Clone 4B4-2E12 Pre-MSV p8)의 제어 하에 돼지 써코바이러스 3 ORF2 유전자 2를 함유하는 재조합 배큘로바이러스로 대략 0.076의 MOI에서 SF+ (스포돕테라 프루지페르다) 세포를 감염시켜 3 L 스피너 플라스크에서 생산시켰다. 플라스크는 28℃ ± 2℃에서 대략 100 rpm에서 일정하게 교반하면서 7일 동안 인큐베이션시켰다. 세포 및 배지는 2 x 1L 원심분리 병에 무균적으로 옮겼고 세포는 15,000 x g로 20분 동안 4℃에서 펠렛화시켰다. 최종 상청액은 0.2 ㎛에서 여과시키고 4℃에 저장하였다.
표 1 -PCV3 ORF2 불활성화된 배큘로바이러스 백신의 제제
Figure pct00002
실시예 3
제왕절개 초유 박탈 돼지에서 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3)에 대한 원형 백신의 효능 평가
실시예의 목적은 제왕절개 초유 박탈 (CDCD) 돼지에서 원형 PCV3 백신의 효능을 평가하고, 1차 및 2차 결과 변수의 정의를 포함한 CDCD 돼지에서 PCV3에 대한 챌린지 모델을 개발하며, 감염성 분자 클론의 감염도를 확인하는 것이다.
이러한 연구는 향후 연구를 위한 잠재적 챌린지 물질로서 전체 바이러스 및 PCR 양성 조직 균질물 (둘 모두 Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU VDL)에서 제공)의 사용을 평가하기 위해 디자인되었다. 또한, 돼지에서 PCV3 감염성 클론의 구제는 향후 챌린지 모델 연구를 위한 추가 선택안을 제공하게 될 것이며 따라서 연구 디자인에 편입시켰다. 원형 백신이 이용가능하였으므로, 그들은 챌린지 모델의 더 강력한 평가를 제공하기 위해 포함되었다.
표 2-연구 디자인
Figure pct00003
총 54마리 돼지가 사용되었다. 동물은 5개 처리 그룹 (n=8-12/그룹) 및 하나의 엄격 통제 그룹 (n=6)으로 임의추출하였다. 동물은 3개 사육장에 수용하였다. 7일령에, 돼지는 PCV2가 접종되었다. D0에, 3주령에, 돼지는 ISA 207VG가 보강된 PCV3 ORF2 발현 벡터 구성체, 카르보폴이 보강된 PCV3 ORF2 발현 벡터 구성체, 또는 위약 (벡터 구성체에 대한 대응 대조군)이 백신접종되었다. 돼지는 대략 5주령에 이동시켰다. D21에, 6주령에, 돼지는 전체 바이러스 또는 조직 균질물로 챌린지되었다. 면역자극제 (IFA/KLH)가 챌린지 물질이외에도 투여되었다. 본 명세서에서 사용되는, 면역 자극제의 역할은 보강제가 아니라, 챌린지 증강제였다. 직장 온도, 체온, 혈청, 전혈, 비강 면봉, 및 분변 면봉을 연구 전반에서 주기적으로 수집하였다. 샘플은 공동으로 검사하였다. 동물은 표 2에 기술된 바와 같이 D49 또는 D63에 안락사되었다. 다수의 신선하고 고정된 조직을 수집하였고 평가하였다.
감염성 클론 구성체로 조사를 위해서, 총 6마리 돼지가 사용되었다. 동물은 3개 그룹 (n=2/그룹)으로 임의추출되었고 단일 사육장에 수용하였다. 동물이 대략 5주령인 D14에, 그들은 3종 감염성 클론 구성체 중 하나로 접종되었다. 접종은 간내에서 (초음파-유도) 수행되었다. 또한, 그룹 9의 동물은 근육내로 접종되었다. 직장 온도, 체중, 혈청, 비강, 및 분변 샘플은 연구 전반에서 주기적으로 수집되었다. 샘플은 클론이 복제될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서 qPCR을 통해서 검사되었다. 동물은 D49에 안락사시켰다. 다수의 신선하고 고정된 조직은 바이러스혈증이 있는 동물에서만 수집하였고 평가를 위해 운송되었다.
연구를 위한 사건 일정은 표 3에 표시된다.
표 3
Figure pct00004
실험 백신 (BaculoG/PCV ORF2)은 위약-대응 대조군과 비교하였다. 처리는 표 4에 요약되어 있다.
표 4
Figure pct00005
백신은 D0에 근육내로 목의 우측면 (2 mL)에, 귀의 기저부와 어깨 지점 사이의 중간에, 적절한 크기의 멸균 바늘 및 시린지를 사용해 투여되었다. 시판 PCV2 백신 (Circoflex, serial# 3091134A)은 제조사의 설명서에 따라서 모든 동물에게 투여되었다.
전체 바이러스 챌린지: 챌린지 물질은 사용전까지 -70℃ ± 10℃에 저장되었다. 챌린지 직전에, 물질은 37℃에서 해동하였고 미희석된 채로 사용되었다. 용량은 총 2 mL이었다 (1 mL IN/ 1 mL IM). D21에, 각각의 돼지는 1 mL의 바이러스 수확물을 비내로 그리고 1 mL을 근육내로 받았다. 챌린지 물질의 근육내 투여는 바이러스 수확물을 목의 좌측에, 귀의 기저부와 어개 지점 사이 중간에, 적절한 크기의 멸균 바늘 및 시린지를 사용해 주사하여 수행되었다. 챌린지 물질의 비내 투여는 비강 팁 오토마이저를 5 cc 루어락 시린지에 부착하여 수행하였다. 챌린지 지속 기간은 28일이었다. 물질의 통상적인 배양은 혈액 한천 플레이트 상에 37℃에서 혐기성 및 호기성으로 48시간 동안 수행하였다. 성장이 관찰되지 않았고 검사는 만족할 만한 것으로 간주되었다. 물질은 마이코플라스마의 존재에 대해서 PCR을 통해 검사하였고; 오염은 확인되지 않았다. PCV3 qPCR 결과는 6.6 log10 게놈 카피수/mL (Cq = 23.58)였다. 심층 시퀀싱은 DNA 및 RNA 프로세싱을 사용해 샘플 (MiSeq_127)에 대해 완료되었다. 시퀀싱은 PCV3의 회복을 일으키지 않았다.
PCV3 PCR 양상 조직 균질물에 의한 챌린지. 챌린지 물질은 사용까지 -70℃ ± 10℃에서 저장하였다. 챌린지 직전에, 물질은 37℃에서 해동하였고 미희석된 채로 사용하였다. 용량은 총 2 mL (1 mL IN/ 1 mL IM)이었다. D21에, 각 돼지는 1 mL의 바이러스 수확물을 비내로 그리고 1 mL을 근육내로 받았다. 챌린지 물질의 근육내 투여는 바이러스 수확물을 목의 좌측에, 귀의 기저부와 어깨 지점 사이의 중간에, 적절한 크기의 멸균 바늘 및 시린지를 사용해 주사하여 수행하였다. 챌린지 물질의 비내 투여는 비강 팁 오토마이저를 5 cc 루어락 시린지에 부착시켜 수행하였다. 챌린지의 지속기간은 28일이었다. 물질의 통상적인 배양은 혈액 한천 플레이트 상에 37℃에서 혐기성 및 호기성으로 48시간 동안 수행되었다. 성장이 관찰되지 않았고 검사는 만족할 만한 것으로 간주되었다. 물질은 마이코플라스마의 존재에 대해 PCR을 통해 검사하였고; 오염이 확인되지 않았다. PCV3 qPCR 결과는 9.1 log10 게놈 카피수/mL (Cq = 14.82)이었다. DNA 및 RNA 프로세싱을 사용하여 샘플 (MiSeq_127)에 대해 심층 시퀀싱을 완료하였다. 시퀀싱은 완전한 PCV3 게놈의 회복을 일으키지 않았다 (PCV3 GB MG564174.1에 대해 99% nt).
표 5는 동물에게 제공된 면역자극제를 기술한다.
표 5
Figure pct00006
D14에, 그룹 7 및 8의 돼지는 간 초음파 유도 주사를 통해 감염시켰고 - 림프절은 접종되지 않았다. 챌린지를 위해서, 1 mL의 물질을 튜버큘린 시린지로 빨아들이고 멸균된 22 g x 1.5 인치 바늘에 부착시켰다. 바늘은 간 내에 3개의 상이한 면적으로 유도시켰다. 대략 300 mL을 각 위치에 투여하였다.
그룹 9의 돼지는 상기 기술된 바와 같은 접종물을 투여하였다. 또한, 그들은 총 3 mL의 물질; 우측 목 근육계에 1.5 mL의 물질 및 좌측 목 근육계에 1.5 mL의 물질이 근육내로 주사되었다. 챌린지 이후에, 돼지에게 0.5 mL의 바이트릴을 목의 근육계에 투여하였다. 그룹 7 (돼지 1 및 2)는 재-원형화된 게놈을 갖는 물질을 투여하였다. 그룹 8 (돼지 3 및 4)는 이량체화된 플라스미드가 투여되었다. 그룹 9 (돼지 5 및 6)는 형질감염 세포 배양 수확물을 투여하였다. 표 6은 연구에서 사용된 포함/배제 기준을 보여준다.
표 6
Figure pct00007
돼지는 실험 단위였다. 우리 및 처리로 돼지의 임의 추출은 통계학자 또는 피지명자가 수행하였다. 연구의 시작 이전에, 이용가능한 돼지, 동배자 정보, 및 수용 설비 셋업을 사용해 동배자 내에서 무작위로 처리를 지정하였다. 12마리 내지 14마리 돼지 범위의 총 4 동배가 그룹 1-6에 포함되었다. 3마리 돼지와 총 2 동배가 그룹 7-9에 포함되었다. 데이터 수집 또는 실험실 어세이 수행과 관련된 인원은 연구 전반에서 그룹으로 돼지 배정에 대해 맹검이었다. 데이터 수집에 관여되지 않는 개체에 의해 처리제가 투여되었다. 이 연구에서 동물의 사용이 승인되었다. 적절한 바닥 및 사육 공간은 허용가능한 동물 축산 관행에 따라서 제공되었다. 돼지는 사료 및 물의 적절한 공급을 위한 접근을 보장하고 동물의 일반 건강을 결정하기 위해 매일 관찰되었다. 동물은 연구의 종료까지 시설에 도착시 수의사 감독 하에 있었다. 연구의 지속 기간 전반에 동물에게 처리제를 투여하였다. 연구 전반에 돼지는 하기의 약용 사료를 공급받았다: UltraCare 100 Medicated (Lot#7Nov03); UltraCare 240 Medicated (Lot#8Jun25); UltraCare 500 Medicated (Lot#8Aug30); 또는 Lean Metrics CEPS Medicated (Lot#08Nov14). 동물은 D46에 소각된 동물 #13을 제외하고 연구 결론 이후에 렌더링을 통해 처분되었다.
모든 돼지는 D1에서 D12에 일반 건강에 대해 매일 관찰되었다. 이상은 관찰되지 않았다. D13에 시작하여 연구 종료까지 계속하여, 모든 돼지는 표 7에 기술된 바와 같은 임상 징후의 존재에 대해서 매일 관찰되었다.
표 7
Figure pct00008
온도 수집일에, 각 동물의 체온은 마이크로칩 (Destron Fearing LifeChip®, bio-Thermo Technology) 및 Allflex 온도계 (Model number RS420-45, serial no. C088 26001)를 사용해 수집되었다. 데이터는 ℉로 기록하였다. 통계 분석을 위해서, 데이터는 교정된 기준치였다. 발열은 104 ℉ 초과의 온도로서 정의되었다. 체중 수집일에, 체중은 보정 저울을 사용해 킬로그램으로 기록되었다.
혈액 수집일에, 정맥 전혈은 적절한 크기의 멸균 Vaccutainer® 바늘, Vaccutainer® 바늘 홀더, 및 혈청 분리기 튜브 (SST)를 사용해 각 돼지로부터 전대정맥을 통해 수집하였다. 혈액은 손으로 전달되었고 혈청은 적어도 연구 번호, 연구일, 및 동물 ID가 표지된 2개 스크류-캡 저온 바이알 및 하나의 5 mL Falcon 튜브에 부었다. 저온 바이알의 혈청 샘플은 -70℃ ± 10℃에 저장하였고 Freezerworks 전자 관리 시스템을 통해 추적되었다. 혈청은 PCV3의 존재에 대해 qPCR을 통해 검사되었다. 5 mL Falcon 튜브를 ELISA 검사를 위해 옮겼다.
면봉 샘플은 돼지로부터 수집되었다. 분리, 멸균, 면봉 (Fisher catalog no. 23-400-111 또는 유사)을 사용하여 동물의 직장에서 분변 샘플 또는 한쪽 코구멍에서 비강 샘플을 수득하였다. 샘플 채취시에, 각 면봉은 1.0 mL의 최소 필수 배지 (SAFC cat#62892-1000M3056)를 함유하는 튜브에 위치시켰다. 배지의 튜브를 제조하였고 사용 전에 4℃에 저장하였다. 사용 후에, 튜브는 최소 동물 ID, 연구 번호 및 일자를 표지하였다. 튜브는 -70℃ ± 10℃에 저장하였고 수집일에 전달하였으며 통상의 방법을 사용해 처리하였다. 처리된 물질은 적어도 연구 번호, 연구일, 및 동물 ID가 표지된 바이알에 저장하였다. 샘플은 -70℃ ± 10℃에 저장하였고 Freezerworks 전자 관리 시스템을 통해 추적하였다. 샘플은 qPCR을 통해 검사하였다.
그룹 7-9의 동물은 D49에 검시하였다. 그룹 1-6의 동물은 D49 또는 D63에 안락사시켰다. 검시 시점에, 거시적 병변은 검시 보고서 기록 상에 기속되었다. 연구 조사자 또는 피지명자는 대뇌 (장기의 1/2), 소뇌 (장기의 1/2), 뇌간 (장기의 1/2), 폐 (부폐엽 또는 병변 영역의 1 단면), 심장 (2 단면), 신장 (1 단면), 간 (1 단면), 비장 (1 단면), 편도선 (1/2 장기), 소장 (3 단면), 결장 (2 단면), 및 림프절 (표면 서혜부, 기관기관지, 장골, 장간막, 위간간막, 및 회맹부)의 포르말린-고정 조직 샘플을 수집하였다. 모든 고정된 조직을 1:10 비율의 고정 조직 대 포르말린이 존재하도록 10% 완충 포르말린 용액을 함유하는 하나의 용기에 위치시켰다. 각 돼지에 대해서, 상기 열거된 단면의 복제 샘플을 하기 윌 팩 백에 수집하였다; 1 - 대뇌, 소뇌, 뇌간; 2 - 폐, 심장, 신장, 간, 비장, 3 - 림프절 및 편도선, 4 - 소장 및 결장. 신선한 조직을 함유하는 백 및 고정된 조직의 병은 적어도 연구 번호, 연구일, 및 동물 ID가 표지되었다. 모든 신선한 조직은 D49 또는 D63에 운반되었다. 바이러스혈증이 qPCR을 통해서 검출되지 않았으므로 동물 1 및 2 (그룹 7); 4 (그룹 8); 또는 5 및 6 (그룹 9)에서 조직을 수집하지 않았다는 것을 언급한다.
최종 혈액은 D63에 하기 동물에서 수집하였다: 57 및 55 (그룹 6); 53, 50, 46, 및 44 (그룹 5); 41, 37, 35, 및 33 (그룹 4). 돼지는 혈액 수집 전에 깊이 마취시켰다. 혈액은 SST 튜브에 수집하였고 수집일에 전달하였다. 혈청은 원심분리를 통해서 응괴로부터 분리시켰고 적어도 연구 번호, 연구일, 및 동물 ID가 표지된 50 mL 원심분리 튜브에 부었다. 혈청 샘플은 FreezerWorks 전자 관리 시스템을 통해 추적하였다. 각 동물에서 수집된 혈청의 절반을 전달하였다.
데이터의 통계 분석은 SAS 버전 9.2 또는 그 이상 (SAS, Cary, North Carolina/USA, SAS Institute, Inc.)을 사용해 수행하였다. 처리 그룹에 따른 데이터 목록 및 요약 통계학은 적절하다면, 모든 변수에 대해 생성되었다. 그룹 1-5로부터의 바이러스혈증 데이터는 각 동물에 대한 이원 결과 (존재/부재)로 이분하였고 그룹 및 일수에 따라 중앙 PCR 값을 그래프화하였다. 영향받은 동물의 비율은 처리 그룹 간 피셔의 정확 비교로 분석하였다; 0.01 미만의 p-값을 유의한 것으로 간주하였다. 그룹 1-5의 분변 및 비강 배출 데이터는 각 동물에 대해 이원 결과 (존재/부재)로 이분하였고 그룹 및 일에 따른 중앙 PCR 값을 그래프화하였다. 영향받은 동물의 비율은 처리 그룹 간 피셔의 정확 비교로 분석하였다; 0.01 미만의 p-값을 유의한 것으로 간주하였다. 일에 따른 그룹 4 및 5에 대한 영향받은 동물의 비율은 윌콕슨 (Wilcoxon) 검정으로 분석하였다. 직장 온도 및 체중은 기준치 조정된 혼합 모델을 사용해 분석하였다. 그룹 및 일에 따른 최소-제곱을 기록한다. 일에 따른 그룹 비교를 분석하였다; 0.01 미만의 p-값을 유의한 것으로 간주하였다.
프로토콜에 3가지 수정이 존재하였다. 첫째로, 작은 크기의 돼지로 인해서, 감염성 클론 물질의 접종에 대한 프로토콜을 변형하였다. 두번째로, PCR 결과를 기반으로 그룹 7, 8, 9의 돼지에 대해 추가의 채혈일을 첨가하였다. 첨가된 날은 D36, D42, 및 D49를 포함하였다. 또한, 검시일은 D42 대신에 D49에 수행하였다. 세번째로, 연구 조사자는 동물에게 가해지는 추가 스트레스로 인해서 체중 및 온도는 D0에 수집되지 않아야 하고 혈액은 D7에 수집되지 않아야 한다고 권고하였다.
바이러스혈증은 연구 전반에서 임의의 6마리의 엄격 통제 동물에서 검출되지 않았다 (그룹 6). 그룹에 따른 바이러스혈증의 빈도 분포는 하기 표 8에 제시된다. 그룹 1-5에 대한 일에 따른 그룹 중앙 log10 PCV3 DNA 게놈 카피수/mL은 도 4에 제시된다.
비-백신접종 돼지에서, 전체 바이러스 (WV) 챌린지 물질에 노출 결과로 100% 동물에서 바이러스혈증이 야기되었다 (그룹 3). 이들 동물에서 바이러스혈증은 D28 내지 D42에 처음 관찰되었고 오프-테스트 시점 (D49)에 모든 동물에 존재하였다. 대조적으로, 바이러스혈증은 전체 바이러스 챌린지에 노출된 백신접종된 동물의 94% (15/16)에서 예방되었다 (p<0.001). 바이러스혈증이 관찰된 1마리의 백신접종된 동물 (#14)은 그룹 1에 있었고 오직 D49에 검출가능한 바이러스혈증을 가졌다.
비-백신접종된 돼지에서, 조직 균질물 (TH) 챌린지 물질에 노출 결과로 동물의 100%에서 바이러스혈증이 야기되었다 (그룹 5). 이들 동물에서 바이러스혈증은 D22에 처음 관찰되었고 (모든 동물에서) 오프-테스트의 시점 (D49)에 모든 동물에서 존재하였다. 추가 2주 동안 유지된 4마리 동물 (#53, 50, 46, 및 44)은 D63에 검시 시점에 검출가능한 수준의 바이러스혈증을 가졌다. 대조적으로, 바이러스혈증은 조직 균질물 챌린지에 노출된 백신접종된 동물의 42% (5/12)에서 예방되었다 (p=0.0373). 바이러스혈증이 되는 7마리 백신접종된 동물 중에서, 오직 1마리 동물 (#40)은 D22 내지 D49에 바이러스혈증을 가졌다. 바이러스혈증은 나머지 6마리 백신접종된 동물에서 D35 내지 D49에 일어났다. 표 8은 처리 그룹에 따른 혈청 중 PCV3 DNA 검출의 빈도를 보여준다.
표 8
Figure pct00009
연구의 감염성 클론 부분에 그룹 당 오직 2마리 동물만이 포함되었으므로, 동물 및 일에 따른 미가공 데이터는 표 9에 표시된다. PCV3 DNA는 그룹 7 및 8 둘 모두의 동물에서 검출되었지만, 그룹 9에서는 오직 1마리 동물에서만 검출되었다. 오직 1마리 동물 (#3; 그룹 8)은 연속 주 동안 바이러스혈증이 발생되었다. 흥미롭게도, 바이러스혈증은 D28까지 시작되지 않았다.
표 9 - 동물 및 일수에 따른 Log10 PCV3 DNA 게놈 카피수/ML
Figure pct00010
임상 징후가 백신접종 이후 D12 (수송일)까지 임의 동물에서 관찰되지 않았다. 연구 전반에서, 오직 2마리 동물 (#13, 그룹 1; #59, 그룹 6)은 계속되는 이상이 있었다. 3마리 추가 동물이 산발적 이상을 갖는 것으로 관찰되었다.
동물 #13 (그룹 1)은 현저한 갈비뼈 및 등뼈를 갖는 것으로 관찰되었고 D13 및 D14에 도착 직후에 먹지 않았다 (2의 신체 상태 점수). D23에, 동물은 출혈 이후에 둔해졌다. D28에, 동물은 좌측 뒷다리를 절뚝거리는 것으로 확인되었다. 이 동물은 D46에 폐사된 것으로 확인되었다. 폐사 시기에 육안 검사는 두개골 복부 폐엽에 무기폐의 다병소 영역이 동반된 섬유성 흉막염 및 섬유성 심낭염이 밝혀졌다. 총 병변을 기반으로, 폐사는 전신 박테리아 감염에 속발성이었다. 폐사는 아마도 PCV3 DNA가 연구 동안 임의 시점에 이 동물로부터의 혈청에서 검출되지 않았으므로 백신접종 또는 챌린지와 관련이 없는 것인 듯하다.
동물 #59 (그룹 6)는 D32 내지 D43에 우측 뒷다리를 절뚝거리는 것으로 관찰되었고 D44 내지 D49에 뒷다리가 뻣뻣한 것으로 확인되었다. 이 동물은 엄격 통제 그룹이었으므로, 임상 징후는 백신접종 또는 챌린지와 관련이 없었다. 이들 추가 동물은 산발적 임상 징후를 갖는 것으로 관찰되었다. 동물 #14 (그룹 1)는 현저한 갈비뼈 및 등뼈를 갖는 것으로 관찰되었고 D13에 AMVC에 도착 직후에 먹지 않았다 (2의 신체 상태 점수). 또한, 동물은 D16 및 17에 거친 털 외피를 갖는 것으로 확인되었다. 임상 징후가 챌린지 전에 시작되었고 백신접종 이후 13일까지 존재하지 않았으므로, 징후는 백신접종 또는 챌린지하지 않는 어린 연령에 CDCD 동물의 이동과 연관된 것으로 여겨진다. 동물 #11 (그룹 1)은 D19에 우울/무기력 (1의 신경학 점수)을 갖는 것으로 관찰되었다. 이 동물이 연구 전반에서 바이러스혈증의 증거를 갖지 않았으므로, 임상 징후가 챌린지와 연관되었을 가능성은 없다. 동물 #5 (그룹 9)는 D19에 식욕의 경미한 감소 (1의 신체 상태 점수)와 함께 우리 동료와 비교하여 약간 야윈 것으로 관찰되었다. D15에 이 동물에서 일시적 바이러스혈증이 검출되었으므로, 임상 징후는 감염과 연관되었을 것이다. 그러나, 임상 징후는 이전 공개물 [25]과 일관적이지 않았고 일시적이었다.
분변 배출은 연구 전반에서 임의의 6마리 엄격 통제 동물에서 검출되지 않았다 (그룹 6). 그룹에 따른 분변 배출의 빈도 분포는 표 10에 표시된다. 그룹 1-5에 대한 일에 따른 분변 샘플 중 그룹 중앙 log10 PCV3 DNA 게놈 카피수/mL은 도 5에 표시되어 있다.
표 10 - 분변 샘플 중 그룹에 따른 PCV3 DNA 검출 빈도
Figure pct00011
비-백신접종 돼지에서, 전체 바이러스 챌린지 물질에 노출 결과 동물의 88%에서 배출이 야기되었다 (그룹 3). 이들 동물에서 분변 배출은 D35 내지 D49에 처음 관찰되었다. 대조적으로, 분변 배출은 전체 바이러스 챌린지에 노출된 백신접종된 동물의 75% (12/16)에서 예방되었다 (p=0.0101 (그룹 1 vs 3); p=0.1189 (그룹 2 vs 3)). 전체로, 백신접종된 동물에서 배출은 산발적이었고 진짜 감염과 비일관적인 것으로 보였다.
비-백신접종 돼지에서, 조직 균질물 챌린지 물질에 노출 결과 동물의 100%에서 분변 배출이 야기되었다 (그룹 5). 이들 동물에서 분변 배출은 다수 동물이 D22 및 다시 D35-49에 분변 중 PCV3의 검출가능한 양을 갖는 것과 이상성이었다. 분변 배출은 백신접종된 동물의 92%에서 관찰되었다. 그러나, 비-백신접종된 동물과 달리, 배출은 제2 피크없이 D22 및 D23에 가장 우세하였다.
PCV3 DNA는 그룹 7-9의 동물에서 수집된 임의의 분변 샘플에서 검출되지 않았다.
비강 배출은 동물 #59를 제외하고 연구 전반에서 임의의 엄격 통제 동물 (그룹 6)에서 검출되지 않았다. PCV3 DNA가 오직 D15에 검출되었고 모든 다른 샘플 (혈청, 분변)은 음성이었으므로, 이것은 아마도 거짓 양성일 것이다. 그룹 1-5에 대한 일에 따른 분변 샘플 중 그룹 중앙 log10 PCV3 DNA 게놈 카피수/mL은 도 6에 표시되어 있다 (* 동물 #59 중 비강 검출은 거짓 양성으로 여겨짐).
비-백신접종 돼지에서, 전체 바이러스 챌린지 물질에 노출 결과 동물의 88%에서 비강 배출이 야기되었다 (그룹 3). 이들 동물에서 비강 배출은 D35 내지 D49에 처음 관찰되었다. 대조적으로, 비강 배출은 전체 바이러스 챌린지에 노출된 백신접종된 동물의 94% (15/16)에서 예방되었다 (p=0.0014 (그룹 1 vs 3); p=0.0101 (그룹 2 vs 3)). 양성으로 간주되는 1마리의 백신접종 동물 (#19, 그룹 2)은 오직 D49에 PCV2 검출되었다.
비-백신접종 돼지에서, 조직 균질물 챌린지 물질에 노출 결과 동물의 100%에서 비강 배출이 야기되었다 (그룹 5). 이들 동물에서 비강 배출은 다수 동물이 D22 및 다시 D35-49에 비공에서 PCV3의 검출가능한 양을 갖는 것과 이원성이었다. 비강 배출은 백신접종된 동물의 100%에서 관찰되었다. 그러나, 비-백신접종된 동물과 달리, 비강 배출은 제2 피크없이 D22 및 D23에 대부분의 동물에서 존재하였다. 산발적 배출은 D28 이후에 오직 2마리 동물에서만 확인되었다.
그룹 당 오직 2마리 동물이 연구의 감염성 클론 부분에 포함되었고, 동물 및 일에 따른 미가공 데이터는 표 11에 표시된다. PCV3 DNA는 접종 후 다음날 (D15)에 5/6 동물 및 D16-D21에 접종에도 불구하고 모든 동물에서 검출되었다. 오직 1마리 동물 (#4; 그룹 8)이 D21 이후에 비강 면봉에서 검출가능한 PCV3 DNA를 가졌다.
표 11 - 그룹 7-9에 대한 동물 및 일수에 따른 비강 면봉 중 Log10 PCV3 DNA 게놈 카피수/mL
Figure pct00012
연구일에 따른 기준치 조정된, 최소 제곱 그룹 평균 직장 온도 (℉)는 도 7에 표시된다. 그룹 6에 대한 데이터는 분석이 모델-기반이었고 그룹 6의 동물이 별도 사육장에 수용되었으므로 도면에 포함되지 않는다. 그룹 및 일에 따른 미가공 데이터 및 기술 통계는 이 연구와 연관된 통계 보고서에서 확인할 수 있다. 백신접종 상태와 무관하게 그룹 1-3에서 편차가 관찰되지 않았다. 조직 균질물로 챌린지된 백신접종 동물 (그룹 4)은 챌린지 기간 동안 비-백신접종된 챌린지 동물 (그룹 5)와 비교하여 유의하게 더 낮은 온도를 가졌다 (p=0.0021).
연구 전반에서 동물은 발열로 간주되지 않았다 (104℉ 초과의 온도를 가짐).
기준치-조정된, 그룹 최소 제곱 평균 체중 (kg)은 도 7에서 그룹 1-5에 대해 표시된다. 모든 그룹에 대한 미가공 데이터 및 기술 통계는 이 연구와 연관된 통계 보고서에서 확인할 수 있다. 챌린지 물질 또는 백신접종 상태와 무관하게 그룹 간에 편차는 관찰되지 않았다 (p>0.1).
이 연구의 제1 목적은 CDCD 돼지에서 PCV3에 대한 챌린지 모델을 개발하고 제1 및 제2 결과 변수를 정의하는 것이었다. 2종 챌린지 물질, 조직 균질물, 및 전체 바이러스를 평가하였다. 조직 균질물에 노출된 동물의 100%가 챌린지 24시간 이내에 바이러스혈증이 되었고 검출가능한 비강 및 분변 배출을 가졌으므로, 물질은 고 감염성으로 간주되었다. PCV3 바이러스혈증의 발생 및 분변 및 비강 경로에 의한 배출은 PRRSV, PCV2 및 PPV를 포함한, 다른 병원체가 본래 조직에 대해 수행된, 통상의 배양, 심층 시퀀싱, 및 특이적 PCR 어세이를 통해서 검출되지 않았으므로 공-감염을 요구하는 것으로 보이지 않았다.
전체 바이러스 물질은 동물의 100%에서 바이러스혈증 및 동물의 88%에서 비강 및 분변 배출을 야기하였고 그러므로 감염성으로 간주된다. 그러나, 바이러스혈증은 챌린지 후 14일에 일어났고; 조직 균질물과 비교하여 상당히 더 느렸다. 가설은 지연이 챌린지 물질의 바이러스 존재와 관련된다는 것이다. 특히, 조직 균질물 및 전체 바이러스의 Cq 값은 각각 14.82 및 23.58이었고, 조직 균질물이 전체 바이러스와 비교하여 더 높은 양의 PCV3 DNA를 함유하였다는 것을 시사한다.
현장에서 본래 PCV3 사례 보고는 모돈에서 번식 실패 및 PDNS였으므로 [3], CDCD 돼지의 감염으로 PDNS를 야기할 수 있다고 가정하였다. 그러나, 챌린지 물질에 노출 이후에 PDNS (또는 다른 임상 질환) 또는 발현의 외적 증거는 없었다. 조직 균질물이 고량의 바이러스를 함유하였고 바이러스혈증의 개시가 24시간 이내였기 때문에, PCV3 단독으로 CDCD 돼지의 감염이 PDNS를 야기시킬 가능성은 없다. 그러므로, 현재 이용가능한 데이터를 기반으로, 바이러스혈증은 CDCD 돼지 모델을 사용하여 향후 연구에서 사용을 위한 가장 적합한 1차 매개변수인 것으로 보인다. 또한, 분변 및 비강 배출이 각각 감소되었고 2차 매개변수로서 사용할 수 있었다. 생물학적으로 유의한 편차는 체온 또는 체중에서 관찰되지 않았고; 이들 매개변수는 아마도 향후 연구에서 유용하지 않을 것이다. 다른 매개변수 (혈청학, 조직병리학)가 보고서 생성 시점에 평가되지 않았으므로, 이들은 추가 매개변수를 제공할 수 있다.
연구의 제1 목적은 2종의 상이한 보강제를 사용하여 백신 원형의 초기 평가를 도입시켰다. 이러한 연구는 3주령 돼지에게 투여된 배큘로바이러스-발현된 PCV3 ORF2 항원의 1회 근육내 용량은 전체 바이러스로 챌린지 이후에 바이러스혈증, 비강 배출, 및 분변 배출을 예방하는 예비 데이터를 제공한다. 그룹 1 및 2의 동물에서 배출 또는 바이러스혈증이 전혀 또는 거의 검출되지 않았으므로, 다른 것에 비해 한 보강제를 선호한다는 강력한 결론을 내릴 수 없었다. 그룹 3 및 4의 데이터는 챌린지 물질이 더 높은 양의 PCV3 DNA를 함유할 때 백신의 효능이 감소한다는 것을 시사한다. 그러므로, 백신접종을 압도하지는 않을 것이지만 감염을 야기하는 챌린지 용량의 확립은 향후 효능 연구에 유용할 수 있다.
단일 공-감염 모델에서 PCV3 백신접종의 효능을 평가하기 위해서, CDCD 돼지는 PCV2에 대해 7일령에 백신접종되었다. 캡시드 아미노산 구조의 편차를 기반으로 (2종 바이러스 간 cap 유전자 내 26% 아미노산 동일성 [2]), 교차-보호가 존재하지 않을 것이라고 가정하였다. 이 연구의 결과를 기반으로, PCV2 백신접종이 PCV3 바이러스혈증을 예방하는 것으로 보이지 않았으므로, PCV2 백신접종이 임상 질환의 결여에서 임의 역할을 가질 가능성은 없는 듯하다.
이 연구의 제2 목적은 외부 협력자가 생성한 감염성 분자 클론의 감염도 및 백신 디자인 그룹이 생성한 내부 분자 클론의 감염도를 확인하는 것이었다. 흥미롭게도, 감염성 클론 물질로 CDCD 돼지의 간내 접종은 그 결과로 챌린지 이후 7일 동안 검출가능한 비강 배출을 야기시켰다. 일시적 바이러스혈증이 복제가 발생되는 비강 상피로 바이러스의 분포를 초래했다고 가정된다. 항원 특이적 시약을 사용한 비강 조직의 추가 연구 및 평가는 이러한 가정을 확인할 필요가 있을 것이다. 동물 #3에서 D28 내지 49에 다시 바이러스혈증이 왜 검출되었는지는 알지 못한다. 아마도 더 많은 수의 동물이 사용되었다면, 바이러스혈증의 검출은 더 많은 비율의 동물에서 발생되었을 것이다. 다수의 주 동안 바이러스혈증의 발생이 동물 #3을 진짜로 감염시켰다는 것을 시사하지만, 감염은 무증상이었다. 이러한 결과는 PCV3 감염성 클론에 의한 통상의 4주령 돼지의 감염이 PDNS를 야기했다는 최근의 공개물과 일치되지 않는다 [25].
3주령 돼지에게 투여된 배큘로바이러스-발현된 PCV3 ORF2 항원의 1회 근육내 용량은 감염성으로 간주된, 조직 균질물 챌린지 물질로 챌린지 이후에 바이러스혈증, 비강 배출, 및 분변 배출을 예방하였다. 조사 연구 또는 효능 연구의 합리적인 기대에서, 바이러스혈증은 백신접종 평가를 위한 주요 매개변수로서 사용될 수 있다. 정식 허가된 제품과 연관된 향후 중심 연구를 위해서, 상이한 주요 매개변수 (조직 또는 임상 질환 내 PCV3 항원의 검출)가 요구될 것이다. 감염성 클론 물질로 CDCD 돼지의 접종은 1마리 동물에서 바이러스혈증 및 다수 동물에서 비강 배출을 야기시켰다. 그러나, 임상 징후는 관찰되지 않았다.
실시예 4
그룹 1에 투여된 백신
"돼지 써코바이러스 백신, 3형, 변형된 생 배큘로바이러스 벡터"로서 지정된 백신은 하기 절차에 의하였다. 1 L의 다수 항원은 3 L 스피너 플라스크에서 SF+ (스포돕테라 프루지페르다) 세포를 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에서 돼지 써코바이러스 3 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 배큘로바이러스에 의해 대략 0.076의 MOI로 감염시켜서 생산하였다. 플라스크는 28℃ ± 2℃에서 대략 100 rpm으로 일정하게 교반하면서 7일 동안 인큐베이션시켰다. 세포 및 배지는 2 x 1L 원심분리 병에 무균적으로 옮겼고 세포는 15,000 x g으로 20분 동안 4℃에서 펠렛화시켰다. 최종 상청액은 0.2 ㎛로 여과하였고 4℃에 저장하였다. 물질은 표 12에 표시된 바와 같이 50% ISA207 VG와 제제화하였다. 백신은 최종 용기에 분배 후 멸균성 검사를 만족할만하게 완료하였다. 마우스 안전성은 돼지에게 물질을 주기 전에 수행하지 않았다.
표 12 - 백신 제제 - ISA207 VG 보강제
Figure pct00013
실시예 5
그룹 2 및 4에 투여된 백신
그룹 2 및 4에 투여된 백신: 제조 방법 - "돼지 써코바이러스 백신, 3형, 변형된 생 배큘로바이러스 벡터"로서 지정된 백신은 그룹 1에 대해서 상기 기술된 바와 같은 방법으로 생산하였다. 상청액은 표 13에 표시된 바와 같은 20% 카르보폴로 제제화하였다. 백신은 최종 용기에 분배 후 멸균성 검사를 만족할만하게 완료하였다. 마우스 안전성은 돼지에게 물질을 놓기 전에 수행하지 않았다.
표 13 - 백신 제제 - 카르보폴 보강제
Figure pct00014
실시예 6
그룹 3 및 5에 투여된 백신
"변형된 생 배큘로바이러스 벡터"로 지정된 백신은 제품-대응 위약이다. 이것은 하기 절차에 따라 제조되었다. 0.5 L의 다수 항원은 1 L 스피너 플라스크에서 SF+ (스포돕테라 프루지페르다) 세포를 삽입부를 함유하지 않는 재조합 배큘로바이러스에 의해 대략 0.1의 MOI로 감염시켜서 생산하였다. 플라스크는 28℃ ± 2℃에서 대략 100 rpm으로 일정하게 교반하면서 4일 동안 인큐베이션시켰다. 세포 및 배지는 1 L 원심분리 병에 무균적으로 옮겼고 세포는 10,000 x g로 20분 동안 4℃에서 펠렛화하였다. 최종 상청액은 0.2 ㎛에서 여과하였고 4℃에 저장하였다. 물질은 표 14에 표시된 바와 같이 20% 카르보폴로 제제화하였다. 백신은 최종 용기에 분배 후 멸균성 검사를 만족할만하게 완료하였다. 마우스 안전성은 돼지에게 물질을 놓기 전에 수행하지 않았다.
표 14 - 위약 제제 - 카르보폴 보강제
Figure pct00015
도 10은 챌린지 물질로 사용된 PCV3 PCR 양성 조직 균질물에 대한 서열 정보를 도시한다.
pCR-BluntII-TOPO-PCV3 감염성 클론 플라스미드는 Integrated DNA Technologies (IDT)에서 주문한 2,000 염기쌍 PCV3 게놈 (KT869077) gBlock으로부터 생성시켰다. gBlock을 pCR-BluntII-TOPO 벡터에 결찰시켰고 Stbl2 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 감염성 클론 플라스미드를 증폭시켰고 Stbl2 이. 콜라이의 1 L 확장물로부터 제조사의 추천 절차에 따라 Qiagen CompactPrep Maxi-DNA 정제 키트를 사용해 정제하였다. pCR-BluntII-TOPO-PCV3 Clone 3624-046.06 Lot# 3718-038은 멸균 PBS pH7.4 Life Technologies Gibco Cat#10010-023 Lot# 1967438에 총 4 mL 중 400 ㎍/mL의 플라스미드의 최종 농도로 희석하였다. 희석된 플라스미드는 멸균 백신 병에 분취하였고 -20℃에 저장하였다.
실시예 7
PCV3 챌린지 모델의 개발
PCV3은 전세계 돼지 개체군에서 출현한 질환이고 임상 질환과 이의 잠재적 상관성에 기인하여서 PCV3 백신의 개발에 대한 관심을 야기시켰다. 원형 백신을 평가하기 위해서, 챌린지 모델의 개발이 필요하였다.
하기 표 및 도에 도시된 바와 같이, 실시예 7은 돼지에서 PCV3에 대한 챌린지 모델을 개발하기 위해 수행된 연구를 반영한다. 특히, 특히, 제왕절개, 초유 박탈 ("CDCD") 돼지를 사용하였다.
연구는 향후 연구를 위한 잠재적 챌린지 물질로서 전체 바이러스 PCR 양성 조직 균질물의 사용을 평가하도록 디자인되었다. 또한, 돼지에서 PCV3 감염성 클론의 구제는 향후 챌린지 모델 연구를 위한 추가 선택안을 제공하였고 그러므로 연구 디자인에 편입되었다.
실험 과정 동안 이용가능한 임의의 원형 백신은 챌린지 모델의 더 강력한 평가를 제공하기 위해 포함되었다.
PCV3은 임상 물질로부터 단리되었다. 바이러스 단리는 실시간 qPCR 투과 전자 현미경 및 적합한 항체를 사용한 면역형광 어세이를 통해 확인하였다. 단리된 바이러스 수확물은 PCV1, PCV2, PRRSV, SIV, 돼지 코로나바이러스를 포함한 다른 바이러스가 없는 것으로 확인되었다. 제공된 바이러스 수확물은 순수 배양이었다. 순도는 차세대 시퀀싱을 사용해 확인하였다.
전체 PCV3 게놈은 전체 PCV3의 완전한 합성을 통해 적합한 플라스미드 벡터로 클로닝되었다.
게놈 서열을 확인하였고 게놈은 플라스미드 효소 분해로 절단시켰다. 이어서 게놈은 재결찰시켜서 밀폐된 공유 원형 PCV3 게놈을 생성시켰다.
원형화된 PCV3 게놈을 적합한 세포주에 형질감염시켜서 감염성 바이러스를 구제하였다. 구제된 바이러스 및/또는 원형화된 게놈은 돼지에 접종되었다. 원형화된 게놈은 초음파 유도되어 간 및 서혜부 림프절에 전달되었다.
두번째 반복에서, 플라스미드는 2개 카피의 PCV3 게놈을 함유한 것을 생성시켰다. 이량체 PCV3을 함유하는 정제된 플라스미드의 충분량을 챌린지 모델 개발 및 병원성/병독성 연구에서 사용을 위해 만들었다.
qPCR로 결정된 높은 역가 PCV3을 함유하는, 조직 및 유체를 포함한, 임상 물질을 생성시켰다. 임상 물질은 PCV1, PCV2, PRRSV, SIV, 및/또는 돼지 코로나바이러스를 포함한, 다른 돼지 바이러스가 없는 것으로 확인되었다.
임상 물질은 PCV3 챌린지 모델을 개발하고 병원성/병독성 연구를 위해 사용되었다. 동물 연구는 다양한 접종 경로를 사용해 바이러스의 확산 및 병원성을 평가하기 위해 수행되었다. 특히, 평가되는 다른 경로 이외에도, PCV3 바이러스 수확물 및/또는 높은 역가 조직 균질물을 임신 40일에 모돈 자궁의 한쪽 뿔에 접종하였다. PCV3은 접종된 뿔 중 태아로 확산되고 미접종 자궁 뿔을 평가하였다. PCV3 감염의 결과로서 미라의 발생을 평가하였다.
챌린지 모델은 백신 후보물의 평가를 위한 기초를 형성시키는데 사용되었다.
PCV3 연구로부터의 샘플은 사전-스크린 PCR 및 혈청학, 챌린지 모델 및 감염성 클론에 대한 PCR, 백신 연구를 위한 혈청학을 포함하여, 검사되었다.
어세이의 검출 한계, 감도 및 특이도가 수행되었다.
백신 후보는 상이한 보강제 조합에서 평가되었다. 백신 후보는 예를 들어, 배큘로바이러스 발현된 PCV3 ORF2 및 플라스미드에서 발현된 PCV3 게놈 (핵산 백신)을 포함하였다. 혈청학을 백신 연구를 위해 수행하였다.
표 15는 제품 투약 및 동물 사육 방법에 관한 것이다. 특히, 표 15는 그룹에 따라 평가된 동물을 보여준다. 특히, 동배자, 특정 동물, 그들의 백신접종 여부, 그들이 있었던 사육장 및 그들이 있었던 터브를 확인하였다.
표 15
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
하기 데이터는 동물 대상체의 바이러스혈증 데이터 및 이의 분석에 관한 것이다.
표 16에 표시된 바와 같이, qPCR 혈청을 사용해 측정되고 log 게놈 카피수/mL로 표시된 바이러스혈증 값은 선택 연구일에 동물의 그룹에 따라 표시된다.
표 16
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
표 17은 평가 전반에서 다양한 날에 다양한 동물 그룹 각각에 대한 기술 통계를 표시한다. 동물의 수, 평균 바이러스혈증 값, 표준 편차를 비롯하여, 최소, 1/4 분위수, 중앙값, 3/4 분위수, 및 최대 바이러스혈증 값이 표시된다.
표 17
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
도 11은 7일부터 49일까지 그룹 1-5에 대한 중앙 PCR 값을 도시한다.
도 12는 7일부터 49일까지 그룹 7-9에 대한 중앙 PCR 값을 도시한다.
표 18은 그룹 1-5에 대한 바이러스혈증 결정 결과를 표시한다.
표 18
Figure pct00026
표 18의 데이터에 대한 P-값의 비교를 표 19에 표시한다.
표 19
Figure pct00027
하기 데이터는 동물 대상체에서 qPCR 분변을 사용해 측정된 분변 배출 데이터 (즉, log 게놈 카피수/mL) 및 이의 분석에 관한 것이다.
표 20에 표시된 바와 같이, qPCR 분변을 사용해 측정되고 log 게놈 카피수/mL로 표시되는 분변 배출 값은 선택 연구일에 동물 그룹에 따라 표시된다.
표 20
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
표 21은 평가 전반에서 다양한 날에 다양한 동물 그룹 각각에 대한 기술 통계를 표시한다. 동물의 수, 평균 분변 배출 값, 표준 편차를 비롯하여, 최소, 1/4 분위수, 중앙값, 3/4 분위수, 및 최대 분변 배출 값이 표시된다.
표 21
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
도 13은 7일부터 49일까지 그룹 1-5의 분변 배출에 대한 중앙 PCR 값을 도시한다.
표 22는 그룹 1-5에 대한 분변 배출 결정 결과를 표시한다.
표 22
Figure pct00035
표 22의 데이터 (분변 배출 결정)에 대한 P-값의 비교가 표 23에 표시된다.
표 23
Figure pct00036
그룹 4 및 5에 대한 P-값의 직접 비교 (즉, 윌콕슨 검정)는 표 24에 표시된다.
표 24
Figure pct00037
하기 데이터는 동물 대상체에서 qPCR 비강을 사용해 측정된 비강 배출 데이터 (즉, log 게놈 카피수/mL) 및 이의 분석에 관한 것이다.
표 25에 표시된 바와 같이, qPCR 비강을 사용해 측정되고 log 게놈 카피수/mL로 표시되는 비강 배출 값은 선택 연구일에 동물 그룹에 따라 표시된다.
표 25
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
표 26은 평가 전반에서 다양한 날에 다양한 동물 그룹의 각각에 대한 기술 평균을 표시한다. 동물 수, 평균 비강 배출 값, 표준 편차를 비롯항, 최소, 1/4 분위수, 중앙값, 3/4 분위수, 및 최대 비강 배출 값이 표시된다.
표 26
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
도 14는 7일부터 49일까지 그룹 1-5의 비강 배출에 대한 중앙 PCR 값을 도시한다.
표 27은 그룹 1-5에 대한 비강 배출 결정의 결과를 표시한다.
표 27
Figure pct00045
표 27의 데이터 (비강 배출 결정)에 대한 P-값의 비교는 표 28에 표시된다.
표 28
Figure pct00046
그룹 4 및 5에 대한 P-값의 직접 비교 (즉, 윌콕슨 검정)는 표 29에 표시된다.
표 29
Figure pct00047
하기 데이터는 동물 대상체에서 측정된 직장 온도 (℉) 데이터 및 이의 분석에 관한 것이다.
표 30에 표시된 바와 같이, 화씨로 측정된 직장 온도 값은 다수의 연구일에 동물 그룹에 따라 표시된다.
표 30
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
표 31은 평가 전반에서 다양한 일에 다양한 동물 그룹의 각각에 대한 기술 통계를 표시한다. 동물의 수, 평균 직장 온도 값, 표준 편차를 비롯하여, 최소, 1/4 분위수, 중앙값, 3/4 분위수, 및 최대 직장 온도 값이 표시된다.
표 31
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
도 15는 평가의 14일 내지 49일에 그룹 1-6에 대한 산술 평균 직장 온도 값을 표시한다.
표 32-41은 그룹 1-3에 대한 직장 온도 값의 혼합 모델 분석을 표시한다.
표 32
Figure pct00055
표 33
Figure pct00056
표 34
Figure pct00057
표 35
Figure pct00058
표 36
Figure pct00059
표 37
Figure pct00060
표 38
Figure pct00061
표 39
Figure pct00062
표 40
Figure pct00063
Figure pct00064
표 41
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
표 42-51은 그룹 4-5에 대한 직장 온도 값의 혼합 모델 분석을 표시한다.
표 42
Figure pct00080
표 43
Figure pct00081
표 44
Figure pct00082
표 45
Figure pct00083
표 46
Figure pct00084
표 47
Figure pct00085
표 48
Figure pct00086
표 49
Figure pct00087
표 50
Figure pct00088
표 50 -계속
Figure pct00089
표 51
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
표 52에 표시된 바와 같이, 동물의 직장 온도에 대한 그룹 및 일에 따른 최소-제곱 평균 분석이 표시된다.
표 52
Figure pct00097
Figure pct00098
도 16은 그룹 1-5에 대한 그룹 및 일에 따른 최소-제곱 평균 온도 값을 도시한다.
표 53은 직장 온도와 관련된 데이터에 대한 P-값의 비교를 표시한다.
표 53
Figure pct00099
Figure pct00100
표 54-63은 그룹 1-3에 대한 기준치로부터의 변화 및 직장 온도와 관련된 혼합 모델 분석을 표시한다.
표 54
Figure pct00101
표 55
Figure pct00102
표 56
Figure pct00103
표 57
Figure pct00104
표 58
Figure pct00105
표 59
Figure pct00106
표 60
Figure pct00107
표 61
Figure pct00108
표 62
Figure pct00109
Figure pct00110
표 63
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
표 64-71은 그룹 4-5에 대한 기준치로부터의 변화 및 직장 온도와 관련된 혼합 모델 분석을 표시한다.
표 64
Figure pct00120
표 65
Figure pct00121
표 66
Figure pct00122
표 67
Figure pct00123
표 68
Figure pct00124
표 69
Figure pct00125
표 70
Figure pct00126
Figure pct00127
표 71
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
Figure pct00131
표 72는 그룹 및 일에 따른 (기준치 조정된) 최소-제곱 평균 직장 온도의 데이터의 표이다.
표 72
Figure pct00132
Figure pct00133
도 17은 그룹 1-5에 대한 그룹 및 일에 따른 (기준치 조정된 최소-제곱) 동물의 평균 직장 온도를 예시하는 선 도표이다.
표 73은 다양한 그룹 (1-5)에 대한 P-값의 비교를 표시한다.
표 73
Figure pct00134
하기 데이터는 동물 대상체에서 측정된 체중 (kg) 데이터 및 이의 분석에 관한 것이다.
표 74에 표시된 바와 같이, 킬로그램으로 측정된 체중 값은 선택 연구일에 동물 그룹에 따라 표시된다.
표 74
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
표 75는 평가 전반에 다양한 날에 다양한 동물 그룹의 각각에 대한 기술 통계를 도시한다. 동물의 수, 평균 체중 값, 표준 편차를 비롯하여, 최소, 1/4 분위수, 중앙값, 3/4 분위수, 및 최대 체중 값이 표시된다.
표 75
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
도 18은 14일부터 49일까지 그룹 1-6에 대한 산술 평균 체중 값을 도시한다.
표 76-84는 체중 (kg)에 대한 그룹 1-3에 대한 혼합 모델 분석을 표시한다.
표 76
Figure pct00141
표 77
Figure pct00142
표 78
Figure pct00143
표 79
Figure pct00144
표 80
Figure pct00145
표 81
Figure pct00146
표 82
Figure pct00147
표 83
Figure pct00148
표 84
Figure pct00149
표 84-계속
Figure pct00150
Figure pct00151
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
표 85-94는 체중 (kg)에 대한 그룹 4-5의 혼합 모델 분석을 도시한다.
표 85
Figure pct00157
표 86
Figure pct00158
표 87
Figure pct00159
표 88
Figure pct00160
표 89
Figure pct00161
표 90
Figure pct00162
Figure pct00163
표 91
Figure pct00164
표 92
Figure pct00165
표 93
Figure pct00166
Figure pct00167
표 94
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
Figure pct00171
표 95는 그룹 및 일에 따른 체중 최소-제굽 평균에 대한 데이터를 도시한다.
표 95
Figure pct00172
Figure pct00173
도 19는 그룹 1-5에 대한 그룹 및 일에 따른 체중 (최소-제곱) 평균을 도시하는 선 그래프이다.
표 96은 체중에 대한 P-값의 그룹 비교이다.
표 96
Figure pct00174
표 97-106은 기준치로부터의 변화에 대한 체중 (kg)에 대한 그룹 1-3의 혼합 모델 분석을 표시한다.
표 97
Figure pct00175
표 98
Figure pct00176
표 99
Figure pct00177
표 100
Figure pct00178
표 101
Figure pct00179
표 102
Figure pct00180
표 103
Figure pct00181
표 104
Figure pct00182
표 105
Figure pct00183
표 106
Figure pct00184
Figure pct00185
Figure pct00186
표 107-117은 기준치로부터의 변화에 대한 체중 (kg)에 대한 그룹 4-5의 혼합 모델 분석을 표시한다.
표 107
Figure pct00187
표 108
Figure pct00188
표 109
Figure pct00189
표 110
Figure pct00190
표 111
Figure pct00191
표 112
Figure pct00192
표 113
Figure pct00193
표 114
Figure pct00194
표 115
Figure pct00195
표 116
Figure pct00196
표 117
Figure pct00197
표 118은 그룹 및 일에 따른 (기준치 조정) 체중에 대한 최소-제곱 평균의 데이터를 표시한다.
표 118
Figure pct00198
도 20은 그룹 및 일에 따른 (기준치 조정) 체중에 대한 최소-제곱 평균의 데이터를 도시한 선 그래프이다.
표 119는 다양한 그룹 (1-5) 기준치 조정 체중에 대한 비교 P-값의 표이다.
표 119
Figure pct00199
실시예 8
PCV3 생물과정
감염은 배큘로바이러스 씨드, BaculoG/PCV3 ORF2 Pre-MSV를 통해서 수행되었다. 표적 MOI는 0.1이었고 최종 계산된 MOI는 0.1이었다.
감염 매개변수는 표 120에 표시된다.
표 120
Figure pct00200
생물반응기 유체는 10 L 생물용기에 무균적으로 수확하였고, 8 x 1 L 원심분리 병에 분배하였으며, 10,000 x g로 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 맑은 유체를 10 L 생물용기에 무균적으로 수집하였고 0.8/0.2 ㎜ 필터를 통해서 새로운 10 L 생물용기에 여과해 넣었고 최종 여과된 수확물은 4℃에 저장하였다.
10가지 상이한 불활성화 조건은 표 121에 표시된 바와 같이 5 mM 이원성 에틸렌이민 (BEI)에서 37℃에 72시간 동안 조사하였다. 샘플은 pH (표 122) 및 PCV3 ORF2 가용성을 모니터링하기 위해 채취하였다.
표 121
Figure pct00201
도 24는 72시간에 불활성화 이미지를 도시한다.
표 122
Figure pct00202
도 25는 불활성화 후 - BaculoG/PCV3 ORF2 항원에 대한 불활성화 조건의 웨스턴 비교를 도시한다.
도 26은 PCV3 ORF2 형광 도트 블롯을 도시한다.
이러한 연구로부터, 낮은 수준의 PCV3 ORF2가 스피너에서의 작업과 유사한 생물반응기로부터 생산되었고 감염 동력학은 파종 하에서 약하다고 시사한다. 200 mM의 MgCl2이 관찰된 PCV ORF2 손실에 대해 더 큰 효과를 가질 수 있지만, 각 조건이 가용성 ORF2에 대해 최소 영향을 가졌으므로 불활성화 이후에 생물반응기 수확에서 PCV3 ORF2의 최소 손실이 존재하였다. 9일 동안 4℃에서 저장된 수확 유체 중에서 PCV3 ORF2의 손실은 없었다.
실시예 9
불활성화된 배큘로바이러스-발현된 PCV3 ORF2 백신으로 제왕절개 초유 박탈 돼지의 백신접종
이 연구는 3주령 돼지에게 투여되었을 때 실험 불활성화 배큘로바이러스-발현된 PCV3 ORF2 백신을 평가하였다. 임의추출, 맹검, 백신접종-챌린지 연구는 D0에 22일령인 50마리 제왕절개, 초유 박탈 ("CDCD") 돼지를 사용해 수행하였다. 돼지는 동배로 차단하였고 동일한 우리에 수용된 동배와 함께 처리 그룹으로 임의추출하였다. D0에, 돼지는 제품-대응 위약의 대조군 제품 또는 실험 백신을 근육내로 받았다. 돼지는 일반 건강에 대해 매일 관찰되었고, 혈액은 혈청전환을 평가하기 위해 수집되었다. 모든 돼지는 (PCR을 통해 PCV3에 양성으로 검사된) 조직 균질물로 백신접종 후 14일에 챌린지되었고 4주 후에 검시되었다. 임상 관찰은 연구 오프-테스트 (D42)까지 챌린지 후 매일 수행하였고, 혈액은 바이러스혈증 (PCR에 의한 PCV3)을 평가하기 위해 매주 수집되었다. 검시 시에, 내부 장기는 총 병변에 대해 평가되었고, 조직은 조직병리학적 평가를 위해 수집되었다. 조직학 슬라이드를 염색하였고, RNAScope로 평가하였고, 채점하였다.
연구 전반에서, 데이터의 수집 또는 실험실 어세이의 수행에 관여되는 임의 인원은 돼지에 처리 배정을 알지 못하였다. 처리제는 임의 데이터 수집에 관여하지 않는, 연구 조사자가 투여하였다.
각각 대조군 및 백신 그룹에서 20마리 동물의 사용은 돼지 써코바이러스에 대한 사전 백신접종-챌린지 처가 연구와 일관된다. 여분의 동물은 챌린지 전에 CDCD 돼지의 자연 감소를 고려하여 포함시켰다.
돼지는 동배로 차단하였고 처리에 무작위로 지정하여 개별 돼지를 실험 단위로 만들었다.
SAS 버전 9.4를 사용해 모든 임의추출을 수행하였다. 6마리 (7 동배자) 또는 8마리 (1 동배자) 돼지의 동배자가 이용되었다. 처리 그룹에 임의추출을 위해서, SAS에서 RANUNI 함수를 사용해 각 돼지에 대해 임의 변량을 생성시켰다. 다음으로 돼지 ID는 동배자 및 변량 값을 기반으로 분류하였다. 각 동배자 내에서, 최소 변량값을 갖는 3마리 (또는 8마리 돼지와 동배에 대해 4마리) 동물은 T01로 지정하였고, 나머지는 T02로 지정하였다. 백신접종 시기 동안, 돼지는 3개 사육장에서 육추기를 사용해 육추기당 3마리 또는 4마리 돼지로, 가능한 정도까지 동배와 수용하였다. 챌린지 시기 동안, 8마리 돼지의 동배자를 제외하고, 2개 사육장 중 하나에서, 우리 당 한 동배로, 동배자와 돼지를 사육하였다. 8마리 동배의 동배자를 2개 우리에서 사육하였는데, 우리 내에서, 각각 6마리 및 2마리 동배자였다. 챌린지 사육을 위해서, 동배자에 대한 무작위 변량을 생성시키고, 변량 값으로 분류하고, 사육장-우리 조합에 대해 분류된 순서를 지정하여, 사육장 및 사육장 내 우리에 임의추출하였다.
백신접종 시기: 대략 3주령인 25마리 제왕절개 초유 박탈 (CDCD) 돼지는 배큘로바이러스 발현된 PCV3 ORF2 백신 또는 위약 대응 대조군 백신으로 백신접종하였다. 바이러스 역가는 6.76 x 106 TCID50/mL로 결정되었다. 불활성화된 항원은 20% 카르보폴로 제제화하였고 최종 용기에 분배하였다. 음성 대조군으로서 사용된 위약은 음성 대조군 배큘로바이러스로부터 불활성화된 항원과 동일한 방식으로 제조되었다. 백신 또는 위약은 각 동물에게 근육내로 투여되었다. 분만 시 (C-단면; -22일)에 모든 돼지로부터 제대혈을 수집하였다. 혈청을 분리하였고 PCR을 통해서 PCV3 DNA 및 PCV2 DNA에 대해 검사하였다. 모든 샘플은 PCV3 및 PCV2 둘 모두에 대해 음성이었다. D-2에, 모든 돼지는 혈청 수집을 위해 채혈된 다음에 PCV2 Ingelvac CircoFLEX®가 백신접종되었다. 모든 혈청 샘플은 PCR을 통해서 PCV3 및 PCV2 둘 모두에 대해 음성이었고 엠. 하이오뉴모니아에 (M. hyopneumoniae) 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대해 혈청음성이었다.
챌린지 시기: 모든 동물은 백신접종 후 14일에 PCV3 양성 조직 균질물을 챌린지하였다 (1 mL은 비내로 그리고 1 mL은 근육내로). 1 ㎎ KLH/mL을 함유하는 불완전 프로인트 보강제 (ICFA)에 유화된 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)은 챌린지 전 2일 및 이후 2일에 근육내로 투여되었다 (표 123). 챌린지를 위해 사용된 조직 균질물은 qPCR 및 심층 시퀀싱을 통해 외래 작용제에 대해 스크리닝되었다. 동물은 42일에 안락사되었다. 검시 시에, 다수의 조직을 수집하였다. 이들은 뇌, 심장, 신장, 폐, 비장, 대장, 편도선, 기관기관지 림프절 (TBLN), 장간막 림프절 (MLN), 및 외부 장골 림프절 (ILN)을 포함하였다.
표 123 - 연구 디자인
Figure pct00203
표 124는 동물을 PCV3에 챌린지 시키는데 사용된 조직 균질물을 기술한다.
표 124
Figure pct00204
표 125는 연구에서 사용된 돼지에 관한 정보를 제공한다.
표 125
Figure pct00205
모든 50마리 돼지는 상기 요약된 요건을 충족하였고, 연구 조사자는 오직 건강한 동물이 연구에 포함되었다는 것을 보장하기 위해서 D-2에 건강 검사를 수행하였다.
연구 시작 이후에, 돼지는 연구의 결과를 방해하게 되는 손상, 질병 또는 폐사의 경우에만 제거시켜야 했다. 2마리 돼지는 백신접종 시기 동안 제거되었고, 5마리 돼지는 챌린지 시기 동안 제거되었다.
돼지 #5 (백신접종 그룹)는 D6에 식욕 부진이 관찰되었고 우울해졌으며; 그 돼지는 D6에 안락사시켰고 연구에서 제거하였다. 검시는 간 표면이 얼룩덜룩하고 간 및 비장 상에서 황달 피부, 피하 근막, 및 피브린이 밝혀졌고 좌측 정점 폐엽이 붕괴되었다. 사체는 퇴비화하여 처분하였다.
돼지 #4 (백신접종 그룹)는 안락사시켰고 약한 신체 상태 및 양쪽 뒷다리의 절뚝거림때문에 D14에 챌린지 전에 연구에서 제거하였다. 총 병변이 검시 시에 관찰되지 않았다. 사체는 소각하여 처분하였다.
바이러스혈증: 바이러스혈증은 PCR을 통해 PCV3 양성 결과로서 정의되었다 (사이클 임계치 (Ct) 값 <37, 이 연구에 대해 게놈 당량 4.697 로그). 백신접종 및 대조군 동물에서 챌린지 후 바이러스혈증은 qPCR을 통해서 평가하였다. 모든 대조군 돼지는 챌린지 시기 동안 각 샘플채취 시점에 바이러스혈증이었다 (표 126). 3마리 백신접종 돼지는 35.6 내지 36.7 (≥ 37의 음성에 대한 컷-오프)의 Ct-값으로 D7에 양성 결과를 가졌고, 이것은 모든 백신접종 돼지가 챌린지-전, D12에 음성이었음을 고려하면 아마도 거짓 양성 결과를 의미할 것이다. 챌린지 이후에, 2마리 백신접종 돼지는 바이러스혈증이 되지 않았다. 백신접종 돼지의 최대 91%가 바이러스혈증이된데 반해서, 혈 중 바이러스 존재량 (게놈 카피수)은 대조군과 비교하여 각 챌린지-후 시점에 백신접종에서 대략 로그만큼 유의하게 감소되었다 (P≤0.0050) (도27).
표 126 - 처리 및 일수에 따른 PCV3 바이러스혈증 돼지의 빈도 및 백분율
Figure pct00206
일반 건강 관찰: 모든 돼지는 D14까지 D-2로부터 일반 건강에 대해 매일 관찰되었고 백신접종 후 2시간 내지 4시간에 추가 관찰되었다. 돼지 #5 (백신접종 그룹)가 인도적인 이유로 연구에서 제거되기 전에 식욕 부진 및 우울이 관찰되었을 때 D6까지 백신접종 후 임상 징후는 보이지 않았다. D8에, 돼지 #12 (백신접종 그룹), #15 (위약 그룹), #36 (백신접종 그룹), 및 #38 (위약 그룹)은 탈장이 관찰되었다. D9에, 돼지 #4 (백신접종 그룹)는 VRI에 수송 전에 벽과 피더 사이에 갇혀서 발견되었고; VRI에서 돼지는 D14에 챌린지 전에 연구에서 제거되기 전 D11에 양쪽 뒷다리 절뚝거림으로 진행되는 부은 우측 뒷다리의 절뚝거림이 발견되었다.
챌린지-후 폐사율: D42에 오프-테스트 이전에 챌린지-후 폐사 또는 안락사된 돼지를 검시하였다. 2마리 대조군 돼지 (위약 그룹) 및 3마리 백신접종 돼지 (백신접종 그룹)는 챌린지 시기 동안 폐사 또는 안락사되었다. 돼지 #7 (백신접종 그룹)은 D26에 폐사된 채로 발견되었다. 검시 관찰은 울혈성 수막 혈관 및 확대된 ILN이었다. 돼지 #2 (백신접종 그룹)는 D30에 폐사된 채로 발견되었다. 검시 발견은 만성-활도성 섬유화 및 섬유성 심낭염 및 두개 복부 폐렴을 포함하였다. 돼지 #19 (백신접종 그룹)는 D31에 폐사된 채로 발견되었다. 돼지는 성장 실패를 시사하는 육안적 검시 병변없이 작게 관찰되었다. 돼지 #49 (위약 그룹)는 소량의 백색 삼출물이 동반된 신장의 폐 울혈의 총 병변을 수반하고 사전 임상 징후없이 D35에 폐사된 채로 발견되었다. 돼지 #15 (위약 그룹)는 D40에 인도적 이유로 안락사시켰다. 돼지는 혼수상태 및 패들링이 발견되었다. 검시는 중등도 뇌수종 및 수막 혈관의 미만성 울혈을 밝혀주었다. 이전에 돼지는 7일 동안 운동실조였고 4일 전에 우울해졌다. 추가로, 돼지는 D35에 중증 호흡기 징후 (압도적)를 가졌고 안락사 전 10일 동안 신체 상태가 저하되었다.
챌린지-후 2시간 내지 4시간에 시작하여 챌린지 시기 동안 매일, 모든 돼지는 표 127에 기술된 바와 같이 PCV3-연관 임상 징후에 대해 1일 1회 관찰되었다.
표 127
Figure pct00207
임상 징후는 D21 내지 D40에 발생되었는데 대부분 경증 우울증 (신경학적) 및 호흡수의 약한 증가가 동반되었다 (표 128). 설사 및 피부염은 챌린지 시기 동안 관찰되지 않았다.
표 128
Figure pct00208
체중: 모든 돼지는 백신접종 전, 챌린지 전, 챌린지 후 1주, 및 검시 전에 칭량되었다. 백신 그룹에 대한 최소 제곱 평균 체중은 각 시점에 수치적으로 (유의하지 않게) 더 무거웠다 (표 129).
표 129
Figure pct00209
체온: 체온은 피내 마이크로칩에서 및 그에 의해 자가-보정 직장 온도계를 통해서 측정하였다. 온도는 기준치를 확립하기 위해서 챌린지 이전, 다음으로 챌린지-후 2시간 내지 4시간, 및 D20까지 1일 1회로 3회 측정하였다. 처리 그룹에 대한 평균 온도는 각각의 수집일에 1 ℉ 이내였다 (도 28).
총 병변 평가: 챌린지-후, 모든 돼지는 폐사 시점에 또는 계획된 오프-테스트 (D42)에 검시되었다. 연구 조사자는 모든 주요 장기 시스템의 사후 평가를 수행하였다. 림프절 (기관기관지, 외부 서혜부, 장간막), 신장, 심장, 및 폐에 대한 특별한 병리학적 설명이 포함되었다 (표 130).
표 130
Figure pct00210
검시 시에 매우 소수의 병변이 관찰되었다. 심장, 신장, 또는 피부 (피부염)에서 병변이 보이지 않았다. 폐의 다병소 울혈이 3마리 백신접종 돼지에서 확인되었고, 이들 중 1마리는 폐사되었다. 설명은 병변이 최소 (1%)로서 확인되었다. 병변의 균형은 확대된 림프절, 10/25 대조군 돼지 및 14/23 백신접종 돼지였다.
조직 수집 및 조직학적 채점: 검시 시에, 연구 조사자는 뇌 (소뇌), 심장 (영향받은 영역, 달리 좌우 심실의 횡단면), 신장 (횡단면), 폐 (영향받은 영역, 달리 부폐엽), 비장 (횡단면), 대장, 소장, 편도선, 기관기관지 림프절 (TBLN), 장간막 림프절 (MLN), 및 서혜부 림프절 (ILN)을 수집하였다. 돼지로부터의 모든 조직은 충분량의 10% 완충 포르말린 용액이 채워진 용기에 보관되었다. 10% 완충 포르말린 용액 중 24시간 후에, 조직은 70% 에탄올로 옮겼고 ISU VDL에서 조직학적 슬라이드 제조를 위해 제출하였다. 조직 샘플은 통상의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 위해 처리되었다. 각각의 H&E 슬라이드는 병변의 존재 또는 부재로서 채점하였다. 이상이 확인되면, 표 131에 따른 중증도 점수와 함께 형태학적 진단의 간략한 설명이 제공되었다.
표 131
Figure pct00211
조직학적 병변은 임의 돼지의 편도선, TBLN, mLN, 또는 비장에서 관찰되지 않았다. 대부분의 모든 돼지는 ILN의 적어도 경증의 조직학적 병변을 가졌다 (표 132).
전체로, 뇌 (표 133), 신장 (표 134), 심장 (표 135), 및 폐 (표 136)의 조직학적 병변은 일반적으로 경증이었고 오직 2/25 대조군 돼지가 장, 하나의 소장 (표 137) 및 하나의 대장 (표 138)의 조직학적 병변을 가졌다. 뇌의 조직학적 병변을 갖는 2마리 돼지는 수막염 (#15 [위약 그룹] 화농성 및 림프구성 수막뇌염 및 #7 [백신접종 그룹] 박테리아 만성 활동성 수막염)의 총 병변을 동반하여 연구 동안 폐사된 것으로 확인되었다. 위약 그룹의 4마리 돼지 및 백신접종 그룹의 2마리 돼지는 2개 조직에 병변을 가졌다. 전체로, 대조군의 92%는 조직학적 병변을 가졌고, 백신접종 돼지의 87%는 조직학적 병변을 가졌다 (표 139).
표 132 - 서혜부 림프절 조직학적 병변 중증도의 빈도
Figure pct00212
표 133 - 뇌 조직학적 병변 중증도의 빈도
Figure pct00213
표 134 - 신장 조직학적 병변 중증도의 빈도
Figure pct00214
표 135 - 심장 조직학적 병변 중증도의 빈도
Figure pct00215
표 136 - 폐 조직학적 병변 중증도의 빈도
Figure pct00216
표 137 - 대장 조직학적 병변 중증도의 빈도
Figure pct00217
표 138 - 소장 조직학적 병변 중증도의 빈도
Figure pct00218
표 139 - 그룹에 따른 조직학적 병변의 빈도
Figure pct00219
챌린지 후 백신접종 및 위약 동물의 조직에서 바이러스 복제는 RNAScope를 사용해 평가하였다. RNAscope는 바이러스 mRNA의 특이적 태그화 및 가시화를 가능하게 한다. RNAscope는 바이러스가 살았는지 또는 죽었는지 여부와 무관하게 바이러스의 유전 물질을 확인하는, PCR 또는 면역조직화학과 반대로 조직에서 복제하는 바이러스를 검출한다. 조직은 표적 프로브가 세포 내에서 바이러스 복제 부위에 접근할 수 있도록 고정시키고 투과시켰다. 다음으로 PCV3 표적 RNA 상에서 서로의 밀접한 근접부 내에 위치되도록 PCV3 RNA 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브의 쌍을 혼성화시켰다. mRNA의 검출은 PCV3 바이러스가 복제되고 단순히 PCV3 유전 물질을 검출하는 것이 아님을 의미한다. 이것은 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브의 쌍을 인식하는 신호 증폭 분자 (SAM)의 혼성화가 후속되었다. 비-특이적 반응에서, 2개 프로브는 서로의 옆에 위치되지 않아서 SAM과 그들 혼성화를 방지한다. SAM은 그들 자체가 효소에 접합된다. 제자리 혼성화 어세이에서 처럼, 신호는 발색 기질을 사용한 후에 슬라이드의 명시야 현미경 검사로 검출된다. PCV3 RNAscope 어세이를 위한 슬라이드는 염색, 판독되었고, 표 140에 따라 채점되었다.
표 140 - RNAScope 채점 규모
Figure pct00220
PCV3 복제의 증거가 임의 돼지의 대뇌/소뇌의 임의 단면에서 관찰되지 않았다. 거의 모든 대조군 돼지가 신장 (표 141), 심장 (표 142), 대장 (표 143), 및 소장 (표 144)에서 적어도 경도의 PCV3 RNAScope 염색을 가졌는데 반해서 오직 1마리의 백신접종 돼지만이 각각의 4개 조직에 경도의 염색을 가졌고, 3마리 다른 돼지는 신장에 경도의 염색을 가졌다.
모든 대조군 돼지는 경도 내지 중등도의 비장 염색을 가졌고 (표 145) ILN (표 146) 및 폐 (표 147)에 경도 내지 중증도의 염색을 가졌다. 대조적으로, 6마리의 백신접종 돼지는 임의 조직에서 RNAscope 염색을 갖지 않았다 (챌린지 시기에 폐싸된 3마리 돼지의 것 포함). 돼지에 의한 최대 RNAscope 염색에서 살피면, 대조군의 48%는 중증 점수를 가졌고 나머지 52%는 중간 정도였으며, 백신접종 돼지의 오직 9%만이 중증 점수를 갖고 17%는 중간 점수를 갖는 것과 비교되었다. 모든 대조군 돼지는 PCV3 바이러스가 복제되는 적어도 하나의 조직을 가졌지만 백신접종 돼지의 71%는 복제되는 PCV3 바이러스를 갖는 적어도 하나의 조직을 가졌다 (표 148). 연구의 유의한 결과는 RNAScope를 사용해 조직을 평가할 때 대조군 및 백신간 편차이다 (표 149). RNAscope는 살아있는지 또는 죽었는지 여부와 무관하게 유전 물질을 확인하는, PCR 또는 면역조직화학과 대조적으로 조직에서 복제 바이러스를 검출한다. 특히, 모든 대조군 돼지는 경도 내지 중등도의 비장 염색 및 경도 내지 중증도의 ILN 및 폐의 염색을 가졌다. 대조적으로, 6마리 백신접종 돼지는 임의 조직에서 RNAscope 염색을 갖지 않았다. 백신접종 동물로부터의 모든 조직은 감염의 유의한 예방을 입증하였다.
표 141 - 신장 RNAScope 점수의 빈도
Figure pct00221
표 142 - 심장 RNAScope 점수의 빈도
Figure pct00222
표 143 - 대장 RNAScope 점수의 빈도
Figure pct00223
표 144 - 소장 RNAScope 점수의 빈도
Figure pct00224
표 145 - 비장 RNAScope 점수의 빈도
Figure pct00225
표 146 - 서혜부 림프절 RNAScope 점수의 빈도
Figure pct00226
표 147 - 폐 RNAScope 점수의 빈도
Figure pct00227
표 148 - RNAScope 점수의 빈도
Figure pct00228
표 149 - RNAScope 조직 결과의 통계적 비교
Figure pct00229
연구는 백신접종 기간 동안 PCV3에 대해 혈청음성으로 남아있는 대조군 돼지를 기반으로 타당하였다. 임상 질환은 우울의 임상 징후 (신경학적) 및 챌린지-후 7일 내지 26일에 호흡수의 증가, 폐사율, 체중 증량, 바이러스혈증, 총 병변, 미시적 병변, 및 RNAScope 결과로 입증되었다.
데이터의 통계 분석은 SAS 버전 9.4 (SAS, Cary, North Carolina/USA, SAS Institute, Inc.)를 사용해 수행하였다. 처리 그룹에 따른 데이터 목록 및 요약 통계는 적절하다면, 모든 변수에 대해 생성되었다.
검시, 조직병리학, 임상 관찰, 발열 및 PCV3 RNAScope 평가 경우에, 데이터 분석 방법은 평가 중인 변수에 대한 데이터의 분포에 의존하여 가변적이었다. 일반적으로, 데이터는 예방 분율 (PF) 및 피셔의 정확 검정, 및/또는 완화 분율 (MF)에 대해 하기 기술된 방법을 사용하여 분석되었다. 일부 변수의 경우에, 거의 모든/모든 반응은 하나의 범주에 속하였고 따라서 분석을 수행하지 않았다. 폐사율은 MF 분석을 수행하지 않은 것을 제외하고, 유사하게 분석하였다. 임상 관찰 경우에, 이상 임상 관찰이 있는 둘 이상의 날의 사례 정의는 영향받은 동물을 확인하는데 사용되었다. 추가적으로, 이상 임상 관찰의 수 및 지속 기간은 MF 방법을 이용해 평가하였다. 발열 경우, 기준치보다 1도 이상의 온도 값을 갖는 동물은 개별 날에 발열로 확인하였다.
PF 및 피셔의 정확 방법을 사용해 분석된 데이터는 이미 이원화하지 않았으면, 각 동물에 대해 이원 결과 (예를 들어, 정상/이상)로 이분하였다. 이원 데이터는 빈도 분포를 통해 그룹에 따라 요약하였다. 또한, 이원 데이터 경우에, 상대 위험 (RR)을 추산하였고 95% 신뢰 구간 (CI)은 SAS 절차 PROC FREQ에서 코크란-맨텔-핸젤 (Cochran-Mantel-Haenszel) 방법을 사용해 계산하였다. 다음으로 RR 및 연관 CI는 표시를 위해 PF 규모 (1 - RR)로 번역되었다. PROC FREQ 분석을 위해서, 동배 기반 계층화를 이용하였다. 통계적 유의성은 RR에 대한 95% CI가 0을 포함하지 않으면 결론내렸다. MF 방법은 부트스트랩 분포를 기반으로 MF에 대한 95% 신뢰 구간을 구축하는데 이용되는 최고 밀도 간격의 계층화된 부트스트랩 접근법을 이용하였다. 계층화는 동배를 기반으로 하였다. 통계적 유의성은 0이 신뢰 구간에 없으면 결론내렸다.
바이러스혈증 데이터는 챌린지-후 각 시점에 그룹 바이러스혈증 분포 (정량적)를 비교하기 위해서 일반화 프라드만 검정 (동배에 대해 차단)을 사용해 분석하였다. 0.05 미만의 P-값이 통계적으로 유의하다고 간주된다.
백신접종-전 (-2일) 체중은 그룹 (고정 효과), 동배자 (무작위 효과), 및 잔여와 선형 혼합 모델을 사용해 분석하였다. 최소-제곱 평균을 추산하였고 그룹 비교는 P-값을 통해 평가하였다. 95% 신뢰 구간이 적절하게 구축되었다. 챌린지 시기 체중 (12일, 21일, 42일)은 그룹, 일, 및 그룹별 일 상호작용 (고정 효과), 챌린지 사육장 및 챌린지 사육장 내 우리 (무작위 효과) 및 동물 수준에 대한 반복 측정을 나타내는 비구조적 공분산과 선형 혼합 모델을 사용해 분석하였다.++최소-제곱 평균을 추산하였고 그룹 비교는 연구일에 따라 P-값을 통해 평가하였다. 평균 1일 체중 증량은 고정 효과 조항의 선형 대조를 사용해 추산하고 평가하였다. 95% 신뢰 구간이 적절하게 구축되었다. 0.05 미만의 P-값이 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
실험 불활성화된 배큘로바이러스-발현된 PCV3 ORF2 백신은 ILN, 비장, 및 폐에서 발견되는 복제 바이러스를 유의하게 예방하였고, 모든 조직에서 발견된 복제 PCV3 바이러스의 양의 중증도를 유의하게 완화시켰다. 백신은 챌린지 시기 이후에 체중의 수치적 증가 이외에도, 또한 폐사율, 임상 징후, 총 병변, 및 조직학적 병변을 수치적으로 감소시켰다. 이들 데이터는 임상적으로 관련된 질환을 입증하여, 임상 사진을 RNAscope 평가를 통한 조직 중 복제 PCV3 바이러스의 증거와 상관지었다.
챌린지 시기 동안 폐사된 2마리 대조군 돼지; 양쪽 돼지의 검시 시에 잠정 진단은 제안되지 않았다. 2마리 돼지로부터의 ILN, 비장 및 폐 조직은 PCV3의 존재의 중등도 또는 중증도 증거를 가졌고, 신장, 심장, 대장, 및 소장은 1의 PCV3 RNAscope 점수를 가졌다. 대조적으로, 챌린지-후 폐사된 3마리 백신접종 돼지는 어린 CDCD 돼지에 일반적인, 성장 실패 또는 박테리아 패혈증의 잠정 진단을 가졌다. 이러한 진단은 모든 조직에 음성인 RNAscope 결과에 의해 뒷받침되어서, 챌린지-후 폐사된 백신접종 돼지는 PCV3으로 인한 폐사로 간주되지 않는다.
임상 징후 평가, 14/25 (56%) 대조군 돼지는 11/23 (48%) 백신접종 돼지와 비교하여 챌린지-후 임상 관찰을 가졌다. 임상 징후의 제한된 발생은 써코바이러스의 실험실 평가로부터의 예상과 일관된다. 이러한 연구 동안 임상 관찰은 PCV2에 대한 실험실 챌린지 모델에서 조직학적으로 확인된 것과 유사하다.
이러한 동일한 경향이 체중에서 관찰되었다; 최소 제곱 평균 체중은 오프-테스트 시 대조군에 비해서 백신접종의 경우에 0.92 kg 더 무거워서, 더 양호한 전체 건강 (수분공급 및 식욕)을 의미한다. 백신접종 돼지의 최대 91%가 바이러스혈증이 되었지만, 혈중 바이러스의 존재량 (게놈 카피수)은 대조군과 비교했을 때 각 챌린지-후 시점에 대략 로그만큼 유의하게 감소되었다 (P≤0.0050; 도 28). 오프-테스트 시 총 평가 동안 및 조직학적 조사 동안 소수 병변이 확인되었다. 대부분의 거시적 병변은 확대 림프절 (10/25 대조군 돼지 및 14/23 백신접종 돼지)이었고, 대부분의 미시적 병변은 ILN의 경증 병변이었다.
RNAScope는 복제 또는 사멸과 무관하게 바이러스의 유전 물질을 확인하는 PCR 또는 면역조직화학과 대조적으로 조직 중 복제 바이러스를 검출한다. 특히, 모든 대조군 돼지는 비장의 경도 내지 중등도 염색 및 ILN 및 폐의 경도 내지 중증도 염색을 가졌다. 대조적으로, 6마리 백신접종 돼지는 이므이 조직에서 RNAScope 염색을 갖지 않았다. 백신접종 동물로부터의 모든 조직은 (예방 분율 및 가설 검정 분석을 통해) 감염의 유의한 예방을 입증하였고, ILN, 비장, 및 폐는 또한 완화 분율을 통해 중증도의 감소를 입증하였다.
혈청학 결과는 모든 날에 모든 샘플에 대해 음성이었다. 이것은 백신접종 및 챌린지 간 짧은 창에 기인할 수 있다.
실험 불활성화된 배큘로바이러스-발현된 PCV3 ORF2 백신은 ILN, 비장, 및 폐에 존재하는 복제 바이러스를 유의하게 예방하였고, 모든 조직에서 발견되는 복제 PCV3 바이러스의 양의 중증도를 유의하게 완화시켰다. 또한 백신은 챌린지 시기 이후에 체중의 수치적 증가 이외에도, 폐사율, 임상 징후, 총 병변, 및 조직학적 병변을 수치적으로 감소시켰다. 이러한 데이터는 임상적으로 관련된 질환을 입증하여 임상 사진을 RNAscope 평가 및 채점과 상관지었다. 취합하여, 실험 배큘로바이러스-발현된 사멸 PCV3 ORF2 백신은 PCV3에 대해 효과적인 것으로 확인되었다.
실시예 10
분만 모돈에서 PCV3의 번식 연구
백신접종 시기: 46마리의 교배전 미경산돈 (≥5개월령)을 이 연구에서 사용하였다. 모든 어미는 하기 병원체에 대해 qPCR을 통해서 백신접종 전에 바이러스혈증이 없는 것을 스크리닝하였다: PCV3, PCV2, 비정형 돼지 페스티바이러스 (APPV), 전염성 위장염 바이러스 (TGEV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 및 돼지 파보바이러스 (PPV). 동물은 또한 인플루엔자 A 및 엠. 하이오뉴모니아에에 혈청음성으로 확인되었다.
미경산돈은 이 연구를 위해 3개 처리 그룹으로 나누었다: r=PCV3에 대한 비-노출 및 비-챌린지 (NTX), PCV3에 챌린지와 위약 수령, 및 PCV3에 챌린지와 PCV3 ORF2 백신의 백신접종. 미경산돈은 그들의 처리 그룹 (우측 목에 근육내로 2 mL)을 기반으로 D0 및 D21에 백신접종되었다. NTX 처리 그룹의 미경산돈은 위약 백신을 투여받았고 다른 처리 그룹의 미경산돈과 분리하여 수용하였다. 발정 동기화는 17일부터 30일까지 그들 사료 중 MATRITM (altrenogest)의 투여를 수행하였다. 30일에, P.G. 600® (혈청 고나도트로핀 [PMSG] 및 융모막 고나도트로핀)은 모든 미경산돈에게 투여되었다. 동물은 발정 동안 평가되었고 35일 내지 42일에 교배되었다. 36마리 모돈은 D77 (임신 D35)에 임신이 확인되었고 이 연구에서 사용되었다 (표 150).
표 150 - 처리 그룹 및 연구 디자인
Figure pct00230
챌린지 시기: 위약 및 백신 처리 그룹의 모든 동물은 임신 40일에 PCV3 양성 조직 균질물로 챌린지되었다. PCV3 조직 균질물은 각 동물에게 2 mL을 각각 근육내 및 비내로 투여되었다. 1 ㎎ KLH/mL을 함유하는 불완전 프로인트 보강제 (ICFA)에 유화된 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)은 챌린지 전 2일 및 챌린지 후 2일에 투여되었다. 챌린지에 사용된 조직 균질물은 qPCR 및 심층 시퀀싱을 통해서 외래원에 대해 스크리닝되었다.
바이러스혈증: 혈청은 연구 전반에서 모돈으로부터 수집되었고 바이러스혈증에 대해서 qPCR을 통해 평가되었다 (표 151 및 도 28 참조). 표 151의 윗줄에서 굵은 표시의 숫자는 각 연구일을 표시한다. 표 151에서 굵은 표시되지 않은 숫자는 PCV3의 게놈 카피수/mL의 측정된 수치에 상응한다.
표 151 - D83 (임신 40일)에 챌린지된 미경산돈의 바이러스혈증
Figure pct00231
백신 그룹의 3마리 돼지는 D110에 바이러스혈증을 보였다. D103 및 D117에 바이러스혈증의 부재는 이러한 판독이 바이러스 복제를 억제하는 쪽으로 백신 효과 또는 거짓 양성이었다는 것을 의미할 수 있다. 유사하게, 2마리 비-챌린지 NTX 모돈 중 1마리는 D110에 바이러스혈증을 보였다. NTX 동물은 별도로 사육하였고 D103 및 D117에 바이러스혈증의 부재는 이들 판독이 거짓 양성일 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 모든 위약 모돈은 챌린지 이후에 바이러스혈증을 보였고 분만일까지 계속 바이러스혈증을 가졌다. 전체적으로, 모돈의 바이러스혈증 데이터는 백신이 모돈에서 바이러스 복제를 방해할 수 있다는 것을 의미한다.
임상 징후: 모든 미경산돈은 분만하였다. 분만 시에, 자돈은 건강, 미라, 약한-탄생, 사산, 및 자기분해로서 채점되었다. 분만 후 처음 3일에 분쇄되어 발생된 임의 폐사가 또한 기록되었다. 영향받은 미라의 백분율은 도 30에 도시된다. 백신 및 위약 그룹의 1마리 모돈 각각은 분만하지 않았다.
도 30에 따라서, 위약 그룹과 비교하여 백신 그룹에서 미라의 수의 분명한 감소가 존재한다. NTX 그룹에서 2마리 모돈 중 1마리는 단일 미라를 가졌고 양쪽 모돈은 1마리 사산 자돈을 가졌다.
PCV3은 생식기 질환으로 광범위하게 여겨진다. 번식 연구에서, 모돈은 PCV3 챌린지의 효과를 평가하기 위해 백신접종, 부스터접종되고, 교배되었다. 실험적 불활성화된 배큘로바이러스-발현된 PCV3 ORF2 백신은 모돈에서 바이러스 복제를 거의 완전히 방해하는 것으로 나타난다. 게다가, 분만 시에, 백신접종된 모돈은 미라의 수가 4% 미만으로 감소하였다. 이러한 감소는 돼지 생산자에게 상당한 경제적 영향을 가질 수 있다.
실시예 11
증강된 바이러스-유사 입자 조립을 위한 FG 루프 내 PCV3 ORF2 돌연변이체의 제조
많은 써코바이러스 캡시드 서열은 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) 캡시드 및 구조 데이터가 이용가능한 2개 서열, 돼지 써코바이러스 2형 (PCV2) 캡시드 및 부리와 깃털 질환 바이러스 (BFDV) 캡시드와 정렬시켰다. 구조 데이터와 정렬의 평가는 PCV2 및 BFDV 간 캡시드 아미노산 서열의 분기성에도 불구하고, 분해된 구조가 매우 유사하다는 것을 밝혀주었다. 이것은 써코바이러스 캡시드의 구조는 그들 서열 분기성에도 불구하고 유사할 수 있음을 시사한다 (도 31 및 32).
추가로, PCV3 캡시드는 PCV3 캡시드의 5-폴드 계면에 위치된 FG 루프에 다량의 양전하를 함유한 유일하게 정렬된 써코바이러스 서열이었다. 이 영역 내 대량의 양전하는 바이러스-유사 입자 (VLP)에서 예상되는 바와 같이, 핵산의 존재없이 반발력을 일으킬 수 있다. 그러므로, 이러한 루프 내 리신 및 히스티딘은 PCV2 캡시드로부터의 아미노산으로 돌연변이되었다 (도 32). 이러한 서열은 PCV3 ORF2 FG (SEQ ID NO: 6)라고 불린다.
서열은 Genscript에서 합성하였고 PCV3 ORF2 발현 및 VLP로의 조립의 평가를 위해 재조합 배큘로바이러스에 클로닝된다.
실시예 12
증강된 VLP 조립을 위해 C-말단의 연장 및 천연 중지 코돈 중 PCV3 ORF2 돌연변이체의 제조
실시예 13에 기술된 구조 데이터와 정렬의 평가는 PCV3 캡시드가 정렬된 임의의 써코바이러스 캡시드 서열의 가장 짧은 C-말단 서열을 갖는다는 것을 더 개시하였다. PCV2 및 BFDV 캡시드 단백질의 C-말단은 캡시드로부터 멀리 돌출된다. PCV3 캡시드 C-말단의 짧은 소수성 성질은 캡시드에 매장된 C-말단을 야기시킬 수 있고 핵산의 존재없이 VLP 불안정성을 초래할 수 있다. 그러므로, PCV3 캡시드 단백질에 대한 천연 중지 코돈은 돌연변이되었고 C-말단은 바이러스 서열 내 다음 중지 코돈까지 연장되었다 (도 33). 이러한 서열은 PCV3 ORF2 PC (SEQ ID NO: 7)라고 한다.
서열은 Genscript에서 합성하였고 PCV3 ORF2 발현 및 VLP로의 조립의 평가를 위해 재조합 배큘로바이러스에 클로닝된다.
실시예 13
CDCD 돼지에서 돌연변이형 PCV3 ORF2 후보로부터의 챌린지 데이터
백신접종 시기: 대략 3주령의 25마리 제왕절개 초유 박탈 (CDCD) 돼지는 증강된 발현 배큘로바이러스 PCV3 ORF2 백신 또는 위약 대응 대조군 백신으로 백신접종된다. 제대혈은 분만 시에 모든 돼지로부터 수집된다 (C-단면; D-22). 혈청을 분리하였고 PCV3 DNA 및 PCV2 DNA에 대해 PCR을 통해서 검사하였다. D-2에, 모든 돼지는 혈청 수집을 위해 채혈되고 나서 PCV2 Ingelvac CircoFLEX®가 백신접종된다.
챌린지 시기: 모든 동물은 백신접종 후 14일에 PCV3 양성 조직 균질물로 챌린지된다. 1 ㎎ KLH/1 mL을 함유하는 불완전 프로인트 보강제 (ICFA)에 유화된 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)은 챌린지 전 2일 및 챌린지 후 2일에 투여된다 (표 152). 챌린지에 사용되는 조직 균질물은 외래원에 대해 qPCCR 및 심층 시퀀싱을 통해 스크리닝된다. 동물은 42일에 안락사된다. 검시 시에, 뇌, 심장, 신장, 폐, 비장, 대장, 편도선, 기관기관지 림프절 (TBLN), 장간막 림프절 (MLN), 및 외부 장골 림프절 (ILN)을 포함한 다수의 조직을 수집한다.
표 152 - 연구 디자인
Figure pct00232
실험실 시기
바이러스혈증: 백신접종 및 대조군 동물에서 챌린지 후 바이러스 혈증은 qPCR로 평가된다. 챌린지 후에, 모든 대조군 돼지는 바이러스혈증이다. 바이러스혈증 존재량 (게놈 카피수/mL)은 백신접종에서 완전히 저지된다.
임상 징후: 챌린지 후에 백신접종 및 위약 동물의 조직에서 바이러스 복제는 RNAScope를 사용해 평가된다. RNAScope는 바이러스 mRNA를 특이적으로 태그하고 가시화할 수 있게 하는 최근에 이용가능한 기술이다. RNAScope는 살았는지 또는 사멸되었는지와 무관하게 바이러스의 유전 물질을 확인하는 PCR 또는 면역조직화학과 반대로 조직에서 복제되는 바이러스를 검출한다. 조직은 표적 프로브가 세포 내 바이러스 복제의 부위를 접근할 수 있도록 고정되고 투과된다. 다음으로 PCV3 RNA 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브 쌍은 PCV3 표적 RNA 상에서 서로의 밀접한 근접부 내에 위치되도록 혼성화된다 (메신저 RNA의 검출은 단순히 PCV3 유전 물질의 검출이 아닌 PCV3 바이러스의 복제를 의미함). 이것은 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브의 쌍을 인식하는 신호 증폭 분자 (SAM)의 혼성화가 후속된다. 비-특이적 반응에서, 2개 프로브는 서로 옆에 위치되지 않고 SAM과 그들 혼성화를 방지한다. SAM은 그들 자체가 효소에 접합된다. 제자리 혼성화 어세이에서 처럼, 신호는 발색 기질과 이어서 슬라이드의 명시야 현미경 검사의 사용으로 검출된다. PCV3 RNAscope 어세이를 위한 슬라이드를 염색하고 염색된 슬라이드를 판독하고 채점한다 (표 153).
표 153 - RNAScope 채점 규모
Figure pct00233
PCV3 복제의 증거가 임의 돼지의 대뇌/소뇌의 임의 단면에서 관찰되지 않는다. 거의 모든 대조군 돼지는 신장, 심장, 대장, 및 소장에서 적어도 경도의 PCV3 RNAscope 염색을 갖는다. 1마리 돼지를 제외하고, 다른 백신접종 돼지는 평가된 조직에서 임의의 염색을 보이지 않는다.
실험적 불활성화된 증강된 발현 배큘로바이러스 PCV3 ORF2 백신은 ILN, 비장, 및 폐에서 바이러스 복제를 유의하게 방지하고, 모든 조직에서 발견되는 복제 PCV3 바이러스 양의 중증도를 유의하게 완화시킨다. 백신은 또한 챌린지 시기 이후에 체중의 수치적 증가이외에도, 폐사율, 임상 징후, 총 병변, 및 조직학적 병변이 수치적으로 감소된다. 취합하면, 실험적 증강된 발현 배큘로바이러스 PCV3 ORF2는 PCV3에 대해 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 14
번식 모델에서 돌연변이형 PCV3 ORF2 후보로부터의 챌린지 데이터
백신접종 시기: 46마리 교배전 미경산돈 (≥5개월령)이 이 연구에 사용된다. 모든 어미는 하기 병원체에 대해 qPCR을 통해서 백신접종 후 바이러스혈증이 없다는 것을 다음의 Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU-VDL)에서 스크리닝한다: PCV3, PCV2, 비정형 돼지 페스티바이러스 (APPV), 전염성 위장염 바이러스 (TGEV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 및 돼지 파보바이러스 (PPV). 동물은 또한 ISU-VDL가 확인한 바와 같이 인플루엔자 A 및 엠. 하이오뉴모니아에에 대해 혈청음성으로 확인된다.
미경산돈은 그들 처리 그룹을 기반으로 D0 및 D21에 백신접종된다. NTX 미경산돈은 위약 백신이 투여된다. 17일부터 30일까지 그들 사료 중 MATRITM (altrenogest)의 투여로 발정 동기화를 수행한다. 30일에, P.G.600이 모든 미경산돈에게 투여된다. 동물은 발정을 평가하고 35일 내지 42일에 교배된다. 36마리 모돈이 D77일 (임신 D35)에 임신이 확인되어 이 연구에 사용된다 (표 154).
표 154 - 처리 그룹을 표시한 연구 디자인
Figure pct00234
챌린지 시기: 모든 돼지는 임신 40일에 PCV 양성 조직 균질물로 챌린지된다. 1 mg KLH/1 mL을 함유하는 불완전 프로인트 보강제 (ICFA)에 유화된 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)을 챌린지 전 2일 및 챌린지 후 2일에 투여한다. 챌린지에 사용되는 조직 균질물은 qPCR 및 심층 시퀀싱을 통해 외래원에 대해 스크리닝되었다.
실험실 시기
바이러스혈증: 혈청은 연구 전반에서 모돈으로부터 수집되고 바이러스혈증에 대해서 qPCR을 통해 평가된다.
백신접종된 미경산돈은 챌린지 후 임의 데이터 시점 샘플에서 바이러스혈증을 보이지 않는다. 모든 NTX 및 위약 미경산돈은 챌린지 후 1주에 시작된 바이러스혈증을 보이고 챌린지 후 3주 내지 5주 동안 계속 바이러스혈증을 보인다. 전체적으로, 모돈의 바이러스혈증 데이터는 백신이 모돈에서 바이러스 복제를 방지할 수 있다는 것을 의미한다.
임상 징후: 모든 미경산돈은 분만하게 된다. 분만 시에, 자돈은 건강, 미라, 약한-탄생, 사산 및 자가분해로서 채점된다. 분만 후 처음 3일 안에 분쇄되어 발생되는 임의의 폐사율이 또한 기록된다.
위약 그룹과 비교하여 백신 그룸에서 미라의 총 수의 분명하고 유의한 감소가 존재한다. 사산 및 약하게 태어난 자돈의 유사한 감소가 위약 및 NTX 그룹과 비교하여 백신 그룹에서 관찰된다. 추가로, 조직으로부터의 RNAScope 데이터는 NTX 및 위약 그룹 유래의 조직과 비교했을 때 백신접종 모돈 및 자돈의 조직에서 바이러스 복자의 완전한 방지까지의 유의한 감소를 의미한다.
PCV3은 생식 질환으로 광범위하게 여겨진다. 번식 모델에서,모돈은 PCV3 챌린지의 효과를 평가하기 위해 백신접종, 부스터접종, 및 교배된다. 백신접종 (모돈 및 이의 자돈)은 또한 검사된 조직에서 바이러스 복제의 감소 또는 제거를 보인다. 실험적 불활성화 증강된 발현 배큘로바이러스 PCV3 ORF2 백신은 모돈에서 바이러스 복제를 거의 완전하게 방지하는 것으로 나타난다. 게다가, 분만 시에, 백신접종 모돈은 미라 수의 유의한 감소를 가졌다. 이러한 감소는 돼지 생산자에 대한 상당한 경제적 영향을 가질 수 있다.
PPV와 조합된 PCV3
WO2018/083156을 참조하고, 이의 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다.
이 연구의 목적은 실시예에 기술된 바와 같이, 특히 WO2018/083156의 실시예 1 및 2에 따라서 생산된 서브유닛 돼지 파보바이러스 백신 (이하 "IVP2"라고 함)과 함께 사용될 때, 본 명세서에 개시된 PCV3 백신 (연구 백신 제품 1 (이하 "IVP1"이라고 함))에 대한 면역성의 개시를 평가하는 것이고, IVP1 및 IVP2의 이러한 혼합물은 또한 이하에서 "IVP2/IVP1"이라고 한다.
이 연구는 PCV3 및 PPV에 혈청음성인 60마리 제왕절개, 초유 박탈 (CDCD) 돼지를 포함하고, 이 중에서 30마리는 IVP2/IVP1의 혼합물로 백신접종되고 30마리 (대조 그룹)는 3주령 (즉, 0 연구일 (D0))에 멸균 희석제 (주사용 물)를 받고, 이어서 D14에 PCV3의 병독성 챌린지를 받는다.
IVP2/IVP1의 백신접종은 PCV3 혈청학, 바이러스혈증 및 RNAscope에 양성인 돼지에서 유의한 증가를 야기시킨다. D42까지, IVP2/IVP1 그룹의 모든 돼지는 PCV3에 대해 혈청학적으로 양성이지만, 대조 그룹에서 유의하게 적은 돼지가 양성이다.
주요 결과 매개변수의 평가 시에, IVP2/IVP1의 백신접종은 백신접종에서 바이러스혈증을 유의하게 감소 및/또는 방지한다. 더 나아가서, H&E 염색으로 결정된 조직학적 병변의 전체 수준은 병변 평가의 적어도 하나의 범주 내에서 중등도 내지 중증도 점수를 갖는 돼지가 유의하게 더 많게 대조군에서 더 중증인데 반해서, 상당히 더 적은 수의 백신접종 돼지가 중등도 병변 점수를 갖고, 중증인 것은 없다. 보다 중요하게, 바이러스 특이적 RNAScope 염색으로 결정된 조직학적 수준에서, 백신은 제한없이 심장, 신장, 폐, 장, 및 신경 조직을 포함한 조직에서 바이러스 복제를 예방 또는 감소시킬 수 있다.
결론적으로, IVP2와 함께 사용된 IVP1은 백신접종 후 14일에 병독성 PCV3으로 챌린지되었을 때 3주령 CDCD 돼지의 효과적인 활동성 면역화를 제공한다.
실시예 16
PPV 및 PRRSV와 조합한 PCV3
WO2018/083156 및 WO2012/110489를 참조하고, 이의 개시를 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
이 백신접종-챌린지 연구의 목적은 5개월령 내지 6개월령 미경산돈에서 본 명세서에 개시된 PCV3 백신 및 상기 기술된 (실시예 15, WO2018/083156 참조) 파보바이러스 서브유닛 백신 IVP2 (상기 기술된 바와 같은 IVP1/IVP2)와 WO2012/110489의 실시예에 기술된 PRRS mLV 백신 (수탁번호 ECACC 11012502로 유럽 생물자원 센터 (European Collection of Cell Cultures (ECACC)에 기탁된 상기 PRRS mLV) (이하 "IVP3"라고 하고 혼합물은 "IVP1/IVP2/IVP3"이라고 함)의 연합 사용에 대한 데이터를 제공하는 것이다.
27마리 미경산돈은 이전 PCV3 질환 이력 또는 백신접종없이 PCV3에 음성으로 이전에 검사된 무리로부터 기원한다. 미경산돈은 D0에 백신접종받고 D21에 부스터 접종받은 n=9의 3개 처리 그룹으로 임의추출된다: T1 음성 대조군, T2 IVP1/IVP2/IVP3, T3 비-처리 대조군 미경산돈 (NTX)으로서, 각 그룹은 별도루 사육된다.
미경산돈을 백신접종하고, 교배하여 임신시킨다. 대략 임신 40일 (dG)에, 모든 미경산돈은 PCV3 챌린지 균주 (본 명세서에 기술된 바와 같음)로 접종된다. 미경산돈은 동기화 및 교배 동안 (D35-D70)을 제외하고 매주 채혈하고, 혈청을 검사한다.
미경산돈이 분만할 수 있게 하고 동배자는 미라, 사산, 및 약하게 태어난 자돈에 대해 조사된다. 전체적으로, 백신접종된 미경산돈 및 모돈은 대조군 또는 NTX 그룹과 비교했을 때 유의하게 더 적은 수의 미라, 사산, 및 약하게 태어난 동배자가 보이지 않았다.
바이러스혈증에 대해 조사했을 때, 대조군과 대조적으로, T2 미경산돈은 챌린지 후 바이러스혈증의 완전한 방지를 보인다. 결론적으로, 조합 백신 IVP1/IVP2/IVP3은 40dG에서 태아의 PCV3 감염 및 바이러스혈증의 예방에서 효과적이다.
조직학적으로, T2 미경산돈은 챌린지 후 핵신 조직에서 바이러스 복제를 예방할 수 있다. PCV3의 유의한 바이러스 복제 및 그에 의한 임상 징후는 대조군 미경산돈/모돈 및 동배자에서 관찰된다. 이것은 세포 및 조직에서 복제 바이러스 mRNA를 검출하는 바이러스 RNAScope 어세이 및 H&E 염색을 사용해 가시화된다. 결론적으로, 조합 백신 IVP1/IVP2/IVP3은 40dG에 미경산돈, 모돈 및 태아의 임상 징후 PCV3 감염을 예방하는데 효과적이다.
* * *
따라서 본 발명의 바람직한 구현에에서 상세하게 설명하였지만, 이의 많은 분명한 변형이 본 발명의 범주 또는 정신을 벗어나지 않고 가능하므로 상기 기술에서 기재된 특정한 상세 설명에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. <120> Porcine Circovirus Type 3 (PCV3) Vaccines, and Production and Uses Thereof <130> BI 19-AH009 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 645 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 1 atgagacaca gagctatatt cagaagaaga ccccgcccaa ggagacgacg acgccacaga 60 aggcgctatg ccagaagacg actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca 120 aagaaatact ccacaatgaa cgtcatatcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg 180 cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ctgcaattac ctttgaatat 240 tataagatac taaaaatgaa agttacactc agccctgtaa tttctccggc tcagcaaaca 300 aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg 360 ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc actcgtaaag ttatgacttc taaaaaaaaa 420 cacagccgtt acttcacccc caaaccactt ctggcgggaa ctaccagcgc tcacccagga 480 caaagcctct tctttttctc cagacccacc ccatggctca acacatatga ccccaccgtt 540 caatggggag cactgctttg gagcatttat gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc 600 tacggcacca aagaagtttg gattcgttac aagtccgttc tctga 645 <210> 2 <211> 134448 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 2 gaattctacc cgtaaagcga gtttagtttt gaaaaacaaa tgacatcatt tgtataatga 60 catcatcccc tgattgtgtt ttacaagtag aattctatcc gtaaagcgag ttcagttttg 120 aaaacaaatg agtcatacct aaacacgtta ataatcttct gatatcagct tatgactcaa 180 gttatgagcc gtgtgcaaaa catgagataa gtttatgaca tcatccactg atcgtgcgtt 240 acaagtagaa ttctactcgt aaagccagtt cggttatgag ccgtgtgcaa aacatgacat 300 cagcttatga ctcatacttg attgtgtttt acgcgtagaa ttctactcgt aaagcgagtt 360 cggttatgag ccgtgtgcaa aacatgacat cagcttatga gtcataatta atcgtgcgtt 420 acaagtagaa ttctactcgt aaagcgagtt gaaggatcat atttagttgc gtttatgaga 480 taagattgaa agcacgtgta aaatgtttcc cgcgcgttgg cacaactatt tacaatgcgg 540 ccaagttata aaagattcta atctgatatg ttttaaaaca cctttgcggc ccgagttgtt 600 tgcgtacgtg actagcgaag aagatgtgtg gaccgcagaa cagatagtaa aacaaaaccc 660 tagtattgga gcaataatcg atttaaccaa cacgtctaaa tattatgatg gtgtgcattt 720 tttgcgggcg ggcctgttat acaaaaaaat tcaagtacct ggccagactt tgccgcctga 780 aagcatagtt caagaattta ttgacacggt aaaagaattt acagaaaagt gtcccggcat 840 gttggtgggc gtgcactgca cacacggtat taatcgcacc ggttacatgg tgtgcagata 900 tttaatgcac accctgggta ttgcgccgca ggaagccata gatagattcg aaaaagccag 960 aggtcacaaa attgaaagac aaaattacgt tcaagattta ttaatttaat taatattatt 1020 tgcattcttt aacaaatact ttatcctatt ttcaaattgt tgcgcttctt ccagcgaacc 1080 aaaactatgc ttcgcttgct ccgtttagct tgtagccgat cagtggcgtt gttccaatcg 1140 acggtaggat taggccggat attctccacc acaatgttgg caacgttgat gttacgttta 1200 tgcttttggt tttccacgta cgtcttttgg ccggtaatag ccgtaaacgt agtgccgtcg 1260 cgcgtcacgc acaacaccgg atgtttgcgc ttgtccgcgg ggtattgaac cgcgcgatcc 1320 gacaaatcca ccactttggc aactaaatcg gtgacctgcg cgtctttttt ctgcattatt 1380 tcgtctttct tttgcatggt ttcctggaag ccggtgtaca tgcggtttag atcagtcatg 1440 acgcgcgtga cctgcaaatc tttggcctcg atctgcttgt ccttgatggc aacgatgcgt 1500 tcaataaact cttgtttttt aacaagttcc tcggtttttt gcgccaccac cgcttgcagc 1560 gcgtttgtgt gctcggtgaa tgtcgcaatc agcttagtca ccaactgttt gctctcctcc 1620 tcccgttgtt tgatcgcggg atcgtacttg ccggtgcaga gcacttgagg aattacttct 1680 tctaaaagcc attcttgtaa ttctatggcg taaggcaatt tggacttcat aatcagctga 1740 atcacgccgg atttagtaat gagcactgta tgcggctgca aatacagcgg gtcgcccctt 1800 ttcacgacgc tgttagaggt agggccccca ttttggatgg tctgctcaaa taacgatttg 1860 tatttattgt ctacatgaac acgtatagct ttatcacaaa ctgtatattt taaactgtta 1920 gcgacgtcct tggccacgaa ccggacctgt tggtcgcgct ctagcacgta ccgcaggttg 1980 aacgtatctt ctccaaattt aaattctcca attttaacgc gagccatttt gatacacgtg 2040 tgtcgatttt gcaacaacta ttgtttttta acgcaaacta aacttattgt ggtaagcaat 2100 aattaaatat gggggaacat gcgccgctac aacactcgtc gttatgaacg cagacggcgc 2160 cggtctcggc gcaagcggct aaaacgtgtt gcgcgttcaa cgcggcaaac atcgcaaaag 2220 ccaatagtac agttttgatt tgcatattaa cggcgatttt ttaaattatc ttatttaata 2280 aatagttatg acgcctacaa ctccccgccc gcgttgactc gctgcacctc gagcagttcg 2340 ttgacgcctt cctccgtgtg gccgaacacg tcgagcgggt ggtcgatgac cagcggcgtg 2400 ccgcacgcga cgcacaagta tctgtacacc gaatgatcgt cgggcgaagg cacgtcggcc 2460 tccaagtggc aatattggca aattcgaaaa tatatacagt tgggttgttt gcgcatatct 2520 atcgtggcgt tgggcatgta cgtccgaacg ttgatttgca tgcaagccga aattaaatca 2580 ttgcgattag tgcgattaaa acgttgtaca tcctcgcttt taatcatgcc gtcgattaaa 2640 tcgcgcaatc gagtcaagtg atcaaagtgt ggaataatgt tttctttgta ttcccgagtc 2700 aagcgcagcg cgtattttaa caaactagcc atcttgtaag ttagtttcat ttaatgcaac 2760 tttatccaat aatatattat gtatcgcacg tcaagaatta acaatgcgcc cgttgtcgca 2820 tctcaacacg actatgatag agatcaaata aagcgcgaat taaatagctt gcgacgcaac 2880 gtgcacgatc tgtgcacgcg ttccggcacg agctttgatt gtaataagtt tttacgaagc 2940 gatgacatga cccccgtagt gacaacgatc acgcccaaaa gaactgccga ctacaaaatt 3000 accgagtatg tcggtgacgt taaaactatt aagccatcca atcgaccgtt agtcgaatca 3060 ggaccgctgg tgcgagaagc cgcgaagtat ggcgaatgca tcgtataacg tgtggagtcc 3120 gctcattaga gcgtcatgtt tagacaagaa agctacatat ttaattgatc ccgatgattt 3180 tattgataaa ttgaccctaa ctccatacac ggtattctac aatggcgggg ttttggtcaa 3240 aatttccgga ctgcgattgt acatgctgtt aacggctccg cccactatta atgaaattaa 3300 aaattccaat tttaaaaaac gcagcaagag aaacatttgt atgaaagaat gcgtagaagg 3360 aaagaaaaat gtcgtcgaca tgctgaacaa caagattaat atgcctccgt gtataaaaaa 3420 aatattgaac gatttgaaag aaaacaatgt accgcgcggc ggtatgtaca ggaagaggtt 3480 tatactaaac tgttacattg caaacgtggt ttcgtgtgcc aagtgtgaaa accgatgttt 3540 aatcaaggct ctgacgcatt tctacaacca cgactccaag tgtgtgggtg aagtcatgca 3600 tcttttaatc aaatcccaag atgtgtataa accaccaaac tgccaaaaaa tgaaaactgt 3660 cgacaagctc tgtccgtttg ctggcaactg caagggtctc aatcctattt gtaattattg 3720 aataataaaa caattataaa tgtcaaattt gttttttatt aacgatacaa accaaacgca 3780 acaagaacat ttgtagtatt atctataatt gaaaacgcgt agttataatc gctgaggtaa 3840 tatttaaaat cattttcaaa tgattcacag ttaatttgcg acaatataat tttattttca 3900 cataaactag acgccttgtc gtcttcttct tcgtattcct tctctttttc atttttctcc 3960 tcataaaaat taacatagtt attatcgtat ccatatatgt atctatcgta tagagtaaat 4020 tttttgttgt cataaatata tatgtctttt ttaatggggt gtatagtacc gctgcgcata 4080 gtttttctgt aatttacaac agtgctattt tctggtagtt cttcggagtg tgttgcttta 4140 attattaaat ttatataatc aatgaatttg ggatcgtcgg ttttgtacaa tatgttgccg 4200 gcatagtacg cagcttcttc tagttcaatt acaccatttt ttagcagcac cggattaaca 4260 taactttcca aaatgttgta cgaaccgtta aacaaaaaca gttcacctcc cttttctata 4320 ctattgtctg cgagcagttg tttgttgtta aaaataacag ccattgtaat gagacgcaca 4380 aactaatatc acaaactgga aatgtctatc aatatatagt tgctgatatc atggagataa 4440 ttaaaatgat aaccatctcg caaataaata agtattttac tgttttcgta acagttttgt 4500 aataaaaaaa cctataaata ttccggatta ttcataccgt cccaccatcg ggcgcggatc 4560 cgccaccatg agacacagag ctatattcag aagaagaccc cgcccaagga gacgacgacg 4620 ccacagaagg cgctatgcca gaagacgact attcattagg aggcccacag ctggcacata 4680 ctacacaaag aaatactcca caatgaacgt catatccgtt ggaacccctc agaataacaa 4740 gccctggcac gccaaccact tcattacccg cctaaacgaa tgggaaactg caattacctt 4800 tgaatattat aagatactaa aaatgaaagt tacactcagc cctgtaattt ctccggctca 4860 gcaaacaaaa actatgttcg ggcacacagc catagatcta gacggcgcct ggaccacaaa 4920 cacttggctc caagacgacc cttatgcgga aagttccact cgtaaagtta tgacttctaa 4980 aaaaaaacac agccgttact tcacccccaa accacttctg gcgggaacta ccagcgctca 5040 cccaggacaa agcctcttct ttttctccag acccacccca tggctcaaca catatgaccc 5100 caccgttcaa tggggagcac tgctttggag catttatgtc ccggaaaaaa ctggaatgac 5160 agacttctac ggcaccaaag aagtttggat tcgttacaag tccgttctct gagcggccgc 5220 tgcagatctg atcctttcct gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa 5280 atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc 5340 tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa 5400 gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa 5460 ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg 5520 atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag 5580 ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc 5640 atcgatcgtg tcatctggga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct 5700 gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca 5760 ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac 5820 atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt 5880 aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt 5940 tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt 6000 cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt 6060 tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc 6120 gtttgtgttt tgttttgtaa taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta 6180 tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct 6240 tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa 6300 ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta 6360 attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct 6420 gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac 6480 acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc 6540 ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc 6600 ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct 6660 ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg 6720 accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg 6780 tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca 6840 gacatcgatg gtggtggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt 6900 ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc 6960 accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg 7020 ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt 7080 gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta 7140 ttgtaaagag attgtctcaa gctcggatcc cgcacgccga taacaagcct tttcattttt 7200 actacagcat tgtagtggcg agacacttcg ctgtcgtcga cgtacatgta tgctttgttg 7260 tcaaaaacgt cgttggcaag ctttaaaata tttaaaagaa catctctgtt cagcaccact 7320 gtgttgtcgt aaatgttgtt tttgataatt tgcgcttccg cagtatcgac acgttcaaaa 7380 aattgatgcg catcaatttt gttgttccta ttattgaata aataagattg tacagattca 7440 tatctacgat tcgtcatggc caccacaaat gctacgctgc aaacgctggt acaattttac 7500 gaaaactgca aaaacgtcaa aactcggtat aaaataatca acgggcgctt tggcaaaata 7560 tctattttat cgcacaagcc cactagcaaa ttgtatttgc agaaaacaat ttcggcgcac 7620 aattttaacg ctgacgaaat aaaagttcac cagttaatga gcgaccaccc aaattttata 7680 aaaatctatt ttaatcacgg ttccatcaac aaccaagtga tcgtgatgga ctacattgac 7740 tgtcccgatt tatttgaaac actacaaatt aaaggcgagc tttcgtacca acttgttagc 7800 aatattatta gacagctgtg tgaagcgctc aacgatttgc acaagcacaa tttcatacac 7860 aacgacataa aactcgaaaa tgtcttatat ttcgaagcac ttgatcgcgt gtatgtttgc 7920 gattacggat tgtgcaaaca cgaaaactca cttagcgtgc acgacggcac gttggagtat 7980 tttagtccgg aaaaaattcg acaccacaac tatgcacgtt cgtttgactg gtacgccgtc 8040 ggcgtgttaa catacaagtt gctaaccggc ggccgacacc catttgaaaa aagcgaagac 8100 gaaatgttgg acttgaatag catgaagcgt cgtcagcaat acaatgacat tggcgtttta 8160 aaacacgttc gtaacgttaa cgctcgtgac tttgtgtact gcctaacaag atacaacata 8220 gattgtagac tcacaaatta caaacaaatt ataaaacatg agtttttgtc gtaaaaatgc 8280 cacttgtttt acgagtagaa ttctacgtgt aacacacgat ctaaaagatg atgtcatttt 8340 ttatcaatga ctcatttgtt ttaaaacaga cttgttttac gagtagaatt ctacgtgtaa 8400 agcatgatcg tgagtggtgt taataaaatc ataaaaatta ttgtaaatgt ttattattta 8460 aaaacgattc aaatatataa taaaaacaat ctacatctat ttcttcacaa tccataacac 8520 acaacaggtc catcaatgag tttttgtctt tatccgacat actatgtgca tgtaacaaat 8580 caaatacatc ttttaaattt ttatacacat ctttacattg tctaccaaaa tctttaataa 8640 ccctataaca aggaaaagac ttttcttctt gcgtggtttt gccgcgcaga tattgaaata 8700 aaatgtgcat gcacgacaac ttgtgtttac taaaatgctc cttgcctata ccgcaaaacc 8760 ggccatacat ttcggcgatt acacgcggac aattgtacga ttcgtctacg tgtaaacgat 8820 catcataatc actcttgcgc aaacgaataa attttttcac cgcttccgac aaacgaggca 8880 ccaattcggc gggcacgctt cgatacatta ttctgtgcac ataagttacc acacaaaatt 8940 tattgtacca ccatccgaca acgtcgttat tagggttgaa cacgttggcg atgcgcagca 9000 gtttcccgtt tctcatgaaa tattcaaagc ggcccaaaat aatttgcaag caatccaaca 9060 tgtcttgaga aatttctcgt tcaaaattgt tcaaagagaa tatctgccat ccgttttgaa 9120 cgcgcacgct gacgggaacc accgcatcga tttgctccaa cacttcacgg acgttatcgt 9180 cgatgcccat cgtttcgctg gtgctgaacc aatgggaaag gctcttgatg gaatcgcccg 9240 cgtctatcat cttgaccgct tcgtcaaagg tgcaactgcc gctcttcaaa cgccgcatag 9300 cggtcacgtc ccgctctatg cacgacatac cgtttacgta cgattctgat aggtattcct 9360 gaactatacg gtaatggtga tacgactcgc catacacgtc gtgcacctca ttgtatttag 9420 cataataatt gtaaattatt aactttgcag cgagagacat gttgtcagta aagcggtgct 9480 aggctcaata atactgatgt acaggcacgc gtgctattta tatataattt cgcaaggagg 9540 ggagctgtta tcggttgcta ttattaaaga atggccgtct gtttttatca caagcttggc 9600 agcctcaacc atgaagcgtc gtcattgtaa attaaattct ctgcctcaag aattatttga 9660 caagattgtc gagtatttat ctttatctga ttactgcaat ttggtgcttg tctgtaaaag 9720 accttctagt aaatataacg tgatatttga tagtactaat caccaacatt tgaaaggcgt 9780 gtacaaaaag acagacgtgc aaataacaag ctacaacgaa tacatcaact gtatttgcaa 9840 cgaactgaga caagacgaat tctatgccaa atcatcatgg attgcgagta tttgcggtca 9900 ccagagagcg acaattttta gtgtaacaaa taaacaagta gaaatgaaat atcatttgta 9960 taatatagca attgtggaaa gtgaagattg caacggattt tacccatttg agccaacgcg 10020 cgattgttta atatgcaaac aaaaaaacca atgtcctcgt aattcattta ttgtttcgtt 10080 gtgtaaatat ttagaaaaac aaaatgtaca atcaaacttt atatattatt tatacgaaat 10140 aaatacataa taataactat tatacatgtt tttattttac aatacttcct gtataacctc 10200 tctaactaca ttaggagtac aatccacgtc aattacacgt ttagctattt ttctaatttt 10260 gtaatgttta tcgtagagtt tttcgttaat acattgaata gccaacaagg gatttgggtg 10320 cacaccgtca tagagtactt ccatgtcgtc ttcaaagcgc atttttcgct tgcgaaaatg 10380 ccgctcttgg cccaaaacaa aagcgagttt gatgcggtcg tcgatgcgtt ccgaaaatac 10440 ggccaaatgc tggtgtttgg tgatgtcgcg cggaaacgtc accgtgccat ttttgctttc 10500 cgccacgacg gcggttttca atttttcggc cgactgcagc atgttaagtt tggcgtcgag 10560 ttcgtgcaaa cgcaattcaa actgctcaaa cctgttgccc acctcgttct tgaacgtctc 10620 gtgggtgacc ataaattttt cgctgtttgc attcagtttc tttacatgtt ttaaaacaga 10680 ttcaatcttg tcgcgcaaat catcacgctc gccttcagtt tgaatgtgca gcaacgcgtt 10740 gcttttgttg gcaaaattta accgcatcaa aatttccaac aacccgtgct tggtcgcgaa 10800 caatgcgccc aacgagttga gatcgcgttt ggatctctgt ttgtgaaaaa caatttcgtt 10860 taaatggtaa acttgatcgc cgtcccaatt gcaatcaagt atgtcgtcgt gcgcaatttc 10920 aagacctttg caaaaatcta tcacattgta gcattttgcg ttcgtgtcgc tgtgcacgta 10980 tctgtacttg aaactgtgcg tgttgcattt gaatgagtcc catttaacga tgtgcgacca 11040 ttgttgggcg tttatgtggt actttttgta gtcgtctgca ttgaaccgat cttcggcggc 11100 gatggcgtcg ttgtcgttgt caccggacca catccaccag ttccataacc aggatagcat 11160 tgctttagct tgtctagcaa ttcctttgtt atacaacgag aaaatttcgt tcccttataa 11220 ttatagctgt acggtgcgcg tatttgtttg ttaacgttac aaaaaatatc cctgtccacg 11280 tccggccaat actgcaacgt gagcgcgtcc aagtttgaat cttgcatatg cggaacgtac 11340 aaacgtacgg cctctctcac acaatgcgca aaactgcccg gctgaatgta atcactgtcc 11400 aactttgcag gtttctcgaa agccttgtac cgatgcacgc gaacattttg agcggacgtg 11460 attttaaact tgtcggtgaa ttttaaccac aaatgaaatc cacggttgcc ggtatacatg 11520 actcttgaca cgttctcttc cgtgtaaaac aacagaaacg ccgtggcgcc aatgtaaatt 11580 ttcagcatta aatcgtgttc gtcaacataa tttttgtaat cggcgtctac gacccattcc 11640 ctgccgccgc cgtcgtccaa cggtttgacg tgcacgtcgg acactttgtt ttgcacaata 11700 taactataca attgtgcgga ggtatcaaaa tatctgtcgg cgtgaatcca gcgcgcgttg 11760 accgtcatga acgcgtactt gcggctgtcg ttgtacgcaa tggcgtccca catcatgtcg 11820 acgcgcttct gcgtataatt gcacactaac atgttgccct ttgaacttga cctcgattgt 11880 gttaattttt ggctataaaa aggtcaccct ttaaaatttg ttacataatc aaattaccag 11940 tacagttatt cggtttgaag caaaatgact attctctgct ggcttgcact gctgtctacg 12000 cttactgctg taaatgcggc caatatattg gccgtgtttc ctacgccagc ttacagccac 12060 catatagtgt acaaagtgta tattgaagcc cttgccgaaa aatgtcacaa cgttacggtc 12120 gtcaagccca aactgtttgc gtattcaact aaaacttatt gcggtaatat cacggaaatt 12180 aatgccgaca tgtctgttga gcaatacaaa aaactagtgg cgaattcggc aatgtttaga 12240 aagcgcggag tggtgtccga tacagacacg gtaaccgccg ctaactacct aggcttgatt 12300 gaaatgttca aagaccagtt tgacaatatc aacgtgcgca atctcattgc caacaaccag 12360 acgtttgatt tagtcgtcgt ggaagcgttt gccgattatg cgttggtgtt tggtcacttg 12420 tacgatccgg cgcccgtaat tcaaatcgcg cctggctacg gtttggcgga aaactttgac 12480 acggtcggcg ccgtggcgcg gcaccccgtc caccatccta acatttggcg cagcaatttc 12540 gacgacacgg aggcaaacgt gatgacggaa atgcgtttgt ataaagaatt taaaattttg 12600 gccaacatgt ccaacgcgtt gctcaaacaa cagtttggac ccaacacacc gacaattgaa 12660 aaactacgca acaaggtgca attgcttttg ctaaacctgc atcccatatt tgacaacaac 12720 cgacccgtgc cgcccagcgt gcagtatctt ggcggaggaa tccatcttgt aaagagcgcg 12780 ccgttgacca aattaagtcc ggtcatcaac gcgcaaatga acaagtcaaa aagcggaacg 12840 atttacgtaa gttttgggtc gagcattgac accaaatcgt ttgcaaacga gtttctttac 12900 atgttaatca atacgttcaa aacgttggat aattacacca tattatggaa aattgacgac 12960 gaagtagtaa aaaacataac gttgcccgcc aacgtaatca cgcaaaattg gtttaatcaa 13020 cgcgccgtgc tgcgtcataa aaaaatggcg gcgtttatta cgcaaggcgg actacaatcg 13080 agcgacgagg ccttggaagc cgggataccc atggtgtgtc tgcccatgat gggcgaccag 13140 ttttaccatg cgcacaaatt acagcaactc ggcgtagccc gcgccttgga cactgttacc 13200 gtttccagcg atcaactact agtggcgata aacgacgtgt tgtttaacgc gcctacctac 13260 aaaaaacaca tggccgagtt atatgcgctc atcaatcatg ataaagcaac gtttccgcct 13320 ctagataaag ccatcaaatt cacagaacgc gtaattcgat atagacatga catcagtcgt 13380 caattgtatt cattaaaaac aacagctgcc aatgtaccgt attcaaatta ctacatgtat 13440 aaatctgtgt tttctattgt aatgaatcac ttaacacact tttaattacg tcaataaatg 13500 ttattcacca ttatttacct ggtttttttg agaggggctt tgtgcgactg cgcacttcca 13560 gcctttataa acgctcacca accaaagcag gtcattattg tgccaggacg ttcaaaggcg 13620 aaacatcgaa atggagtctg ttcaaacgcg cttatgtgcc agtagcaatc aatttgctcc 13680 gttcaaaaag cgccagcttg ccgtgccggt cggttctgtg aacagtttga cacacaccat 13740 cacctccacc accgtcacca gcgtgattcc aaaaaattat caagaaaaac gtcagaaaat 13800 atgccacata atatcttcgt tgcgtaacac gcacttgaat ttcaataaga tacagtctgt 13860 acataaaaag aaactgcggc atttgcaaaa tttgctaaga aaaaagaacg aaattattgc 13920 cgagttggtt agaaaacttg aaagtgcaca gaagaagaca acgcacagaa atattagtaa 13980 accagctcat tggaaatact ttggagtagt cagatgtgac aacacaattc gcacaattat 14040 tggcaacgaa aagtttgtaa ggagacgttt ggccgagctg tgcacattgt acaacgccga 14100 gtacgtgttt tgccaagcac gcgccgatgg agacaaagat cgacaggcac tagcgagtct 14160 gctgacggcg gcgtttggtt cgcgagtcat agtttatgaa aatagtcgcc ggttcgagtt 14220 tataaatccg gacgagattg ctagtggtaa acgtttaata attaaacatt tgcaagatga 14280 atctcaaagt gatattaacg cctattaatt tgaaaggtga ggaagagccc aattgcgttg 14340 agcgcattac cataatgcca tgtattttaa tagatactga gatctgttta aatgtcagat 14400 gccgttctcc ttttgccaaa ttcaaagtat tgattattgt agatggcttt gatagcgctt 14460 atattcaggc taccttttgt agcattagcg atagtgtaac aattgttaac aaatctaacg 14520 aaaagcatgt aacgtttgac gggtttgtaa ggccggacga tgaaggtaca acaatgcctt 14580 atgtcattgg accattatat tctgtcgacg ctgctgtcgc cgaccgtaaa gtgaaggacg 14640 tggtggattc aattcaaaac caacagacaa tgttaaaagt atttattaac gaggctaatg 14700 tgtataacaa atggaatatg cttaaaggtt taatttataa taataacaat gaatctgttt 14760 tagtaaaata atgtagtaaa atttataaag gtagataaaa attataatat taataaaaaa 14820 aataatgtta ctaaatgggt tcctgcgtta aattatttta cgggtagaca gctattaact 14880 attttattta tttttaaatt taaataaatg tattgttaga aaattgtgtt gttttattag 14940 tataacgaaa aaatacatga cataaaccgc ttccaatttt ggtcacacaa actcttgtgt 15000 ggatagttta cgtaatgagt taaataggcg ggcagttgtc cgctaaacgt gtcggtggtc 15060 aagtagatgt gcattaattt acgacaaccc aaagcggggc cgcttatgtc aagtattttt 15120 ttcacaaaat tggtaatggt ttcgttttgt tccttgtaca aacacatgtc ggtgtgatcg 15180 ttgacgcacg agttgtacga ttccgccggc aggttggcaa acaagcgctt gagatgcttg 15240 agtctgcgtt caattttata atcaaacttg ttggtgaaaa tgtctttcag caagcacatt 15300 aactggtcgt tcaaaacgcg ctgcaacgac gacaccaaca catgatattc gtttccaaaa 15360 agcgaaaaat ttttgatgca gcggtccgcg ttgaagggtc gtttcataat gcgcacgttg 15420 acaaaaaaca cgttgaaaga cagcggggct gtggttattt taacgccgtt gtcggtatac 15480 tcgtcgacgc cgtctgcgct tgttatgtca atttgtagcg caaatctaac caaatcaaac 15540 tcatcgttgt actgtgtctt tatgcatttt atatggcggt ttaagtgcaa gttgatttgg 15600 ccgtttaatc tataggctcc gttttgataa catttcagca ctaccaacgg atccgacatg 15660 taaacttgac gcgttagcac gtccaattca gcgtaatgtt ggtcgacgca tttttgtaaa 15720 ttagtttgca ggttgcaaaa catttttgcg caaaagccgt aatagtcaaa atctatgcat 15780 tttaatgcgc ttctgtcgtc gtcaatatgg catgtcacgg ctgcgcctcc agttaacacg 15840 aataaaccgc cgttttcgca aactacggct tcgaaacaat ctttgataaa tgccaacttt 15900 gctttagcca caattttatc gcgcaggcga tcttcaatat cctttgtcgt aatataaggt 15960 aggacgccaa gatttagttg attcaacaaa cgttccataa tgaatagcgg cgacgcaaca 16020 cgactacact gttcaaatgc gcacgcaaaa caaacccttg caactttatt tgccaatcgt 16080 aatcacagta gtttttacga gtacgccatc gcgtttgtaa gcacattgct ttttaaaaat 16140 aatttaaatt taatgaccgc gtgcaatttg atcaactcgt tgatcaactt tgaactcaac 16200 atgtttggta aaagtttatt gctaaatgga tttgttaatt tctgcattgc taacagcgac 16260 ggggttacga ttcaacataa aatgttaacc aacgtgttaa gttttttgtt ggaaaaatat 16320 tattaaaaat aaataaataa acttgttcag ttctaattat tgttttattt tttataaaat 16380 aatacaattt tatttataca ttaatacttt ggtatttatt aatacaatta tttacaatac 16440 tttatttaca ctataatact ttatttacat tagtactaaa ttaatactaa attacgctaa 16500 tactaaatta atactttata taatcaaaaa taatacttta tataatactt tctaatcatc 16560 ataaacgggt aatagttttt tctcttgaaa tttacgctgc aactcttcgc taaaacacat 16620 gggcggtgga gtgggagcgg gtggagtagg agtccttacg ggtttgatgg gcgacagttc 16680 tctggacttg cggaacagct tgggcgaaag cgtcggcgtg cgccgactaa tgatttcttc 16740 atccggcaac ggaggctcgc acattgtgca cgcgtccggt gaggtacaca aaactttctt 16800 gggcacgctg tacaccggct tgggcacgct atatgtgttg ccaaaataga actcgttgtg 16860 gttgccgaac ggagacgatg ggtgtgaaga cggcgatggc tgtgaagaca agtccgaagg 16920 cgcgataaaa gatgaaagtg tttctgaaac cgaagtggtg gtagaagtgg tagaaggcgg 16980 gtgcgttacg gcaaccacgc tgctgctatt tctgccttcg gagaccactt ccagcaatct 17040 agagttactc tctcgttctt cgcggcgata gtcaatgtcg caataatgtt cataagatgc 17100 cttttcggct tcggcgcgcc ttttcatgta tatgttgtga cgcatctcct ttaactgcac 17160 gtacaaattc cagcattgca cagccagtat cgtaagcacg cccattatga ttacgggata 17220 attttgatta aacacggtcg gctcgtgatc gcttacaatc gctcggcaca tgatgcattt 17280 tttgtaaatg ttcacataca cacagttttg gctcaaggtt tcggtatttg cgtagtcaat 17340 ttccagatac acgatagagt tccagcacat tgattccaaa tcgtagtgac gatataaaac 17400 atctagcgcc ggtagatgac catttttgaa cacgtagatt tgaaacgcgg caaacagcat 17460 ccaacacagc ccagtgatca cgtttaccat aatacacgtg atagcgacgt aaaagttttc 17520 tttcgcattg aaatttacat ttgtgtttga agagctgctg cgatttttcg tccacacgat 17580 aatcttccat ataaaataaa acatgtaaaa taatatccac atgccgaacg ccagcattat 17640 cggtatagat agattgataa ccgattgctt tccttcaatt tccagcaaaa acgcgtatct 17700 gctgtctatc actcccatta tagataacac aaacactatc agatatgcta ataataatga 17760 ggcattaagc ccgaattgta aaactgcagt gattttattt aacattttga atatttaatt 17820 caacaactaa gtaatggcaa tatgtatcga gtactgatcg tgtttttcct gttcgtgttt 17880 ctttatatag tgtaccagcc cttttatcag gcatacttgc atatcggaca tgcccaacaa 17940 gattacaatg acacgttgga cgataggatg gattacattg aatccgtaat gcgtagaagg 18000 cactacgtgc cgattgaagc gttgcccgca atcaggtttg atactaatct cggcacgttg 18060 gccggtgaca cgattaaatg catgtcggtg cctttgtttg ttagtgacat tgacctgccg 18120 atgtttgatt gtagtcagat atgcgataac ccgtctgcgg cgtatttctt tgtcaacgaa 18180 acggatgtgt ttgtggtcaa cggccacaga ctgacggtgg gcggatactg ctccactaat 18240 agtttgcccc gcaactgtaa tcgcgagacg agcgtcattt taatgagtct caatcagtgg 18300 acgtgcatag ccgaggaccc gcgttactat gcgggcacag ataacatgac gcaactcgca 18360 ggcagacaac actttgaccg cattatgccc ggacagagtg ataggaacgt cctgtttgac 18420 cgattactag gccgagaggt gaacgtgacc actaacacgt ttcgccgcag ctgggacgag 18480 ttgctggagg acggcactag gcggttcgaa atgcgctgca acgcccgaga taacaacaat 18540 aatctcatgt ttgttaatcc gcttaatccc ctcgagtgtc tcccgaacgt gtgcactaac 18600 gttagcaacg tgcacaccag tgttagaccc gtatttgaaa cgggagagtg tgactgcggc 18660 gacgaagcgg tcacgcgtgt tacgcacatt gtgccggggg acaggacctc tatgtgtgcc 18720 agcattatag atggcctgga taaaagtacg gcatcatata gatatcgcgt agagtgcgtt 18780 aatctgtaca cctctattct aaattattct aataacaaat tgttatgtcc cagtgacact 18840 tttgatagta acacggacgc agcttttgcc tttgaagtgc ccggctccta ccctttatcg 18900 cgcaacggca tcaacgagcc aacttatcgc ttttatcttg ataccagatc tcgagttaat 18960 tacaatgacg tcagagggca gttatcttaa ttgtgataac acaaacaata agtcatttaa 19020 atgttacgtc agtagttagt atataagccg tacatgttgg cttgcaaatt cagtcaatat 19080 caggctttta tcatggacgg tgtaaagctg ctagggacgt gcgcgctaat aattttgtta 19140 tcgacgacga gtacagttgt cgggcgtgac cgtatcacgt ttacgccgat agaagatagc 19200 gcaggcctca tgtttgaacg catgtacggc ttgcgacatc atacagacga cagatttgtg 19260 tttgtgaaaa aattcaattt tgtttcggtg ctgcaagagc tcaataatat caaatctaaa 19320 attgaattat atgaagcgca agtttcaact tgcacaaacg tcagacaaat aaaacagaac 19380 agatcgagta tcatcaaagc tcgcattgaa aatcagctgc agtttttgac gcaactaaac 19440 aaaaatctca tcacatactc tgtggaaagc agcattttaa gcaacgacgt gctggacaac 19500 atcgatctgg aatatgacga cagcggtgag tttgacgttt acgacgaata cgaacagcct 19560 tcgcattgga gcaacatgac tgtatccgac gcgcaagctt tgctccgaaa cccgcccaaa 19620 gacagagtaa tgtttttgga catggttacc accagcgacg tgagcagcaa atacgaagaa 19680 tacataaact gcattgtgag caaccgtacc gttgaaaacg agtgcatgtt tttagccaac 19740 atgatgaacg tgctcaacga caaattggac gacgcagcag ctttggccaa gatgctggag 19800 cgaatagtaa aacaaacgcg aaagaacaaa ctcaacatct ccaacacggt tatagacgac 19860 gacacgctgc taacggaaat gaaaaaatta acacaaactt tatacaacca aaaccgcgtg 19920 tgggtagtgg attttaacaa ggacatgaat agttatttcg atttgtcgca agcgtataaa 19980 ttgcatttat atgttgattt aaacacggtc attatgttta ttaccatgcc attgttaaaa 20040 tccaccgccg tttcgtttaa tttgtatcgc gtcatgacgg tgcctttttg caggggcaaa 20100 atgtgtctgc ttatcatttc gggcaatgaa tactttggga ttacagacag caaaaactat 20160 tatgtgcccg tatctgataa ctttagacaa gattgccaag agtttacggg ctacaatgag 20220 tttttgtgtc ccgaaactga gccgattgcc actatgaact cgaaagtgtg cgagattgaa 20280 atgtttatgg gtcgatatag cgacgacgtg gacaacatgt gcgacattag ggtggccaat 20340 tataatccca aaaaagctta cgtgaacact ttaatagact accgaaaatg gttgtacatt 20400 tttccaaaca cgaccgtgtc cgtccactat tattgtcacg acgcgcttgt agaagttgat 20460 acaaaagttt cgcccggcgt tggtgttatg ttttcgacta tggcgcaaac gtgttcgatt 20520 agaataacgt atgatgtgac cataactgta gattcgcgat tttatgtcag ccattcaact 20580 acatactggc ctaaaaagaa atttaatttt aacaactaca tcgaccaaat gttgcttgaa 20640 aaagcgacca ccagttttat accgactgtt gacaatttta cccggcccgt tttattgcaa 20700 cttcctcata aatttcacat taaagattac acatcgacgc cccatcattt tttccatcag 20760 tctaaaattt acaccaacag cgcggcgccc gacgaagact cgcaagacga cagtaatacc 20820 accgtggtaa ttatcgctat tgtcgctgca atgatcctat tctgtggatt attgttattt 20880 ttgttttgct gtataaaaaa acggtgtcat caatcaaata acgtggttgt gcaatacaaa 20940 aataacaatg aatttgtcac aatttgcaat aatttagaag acaatcgagc atacattaat 21000 ttacctaatg aatacgatag cgatgatatg ccaaaaccat tgtacccttt acttggcttt 21060 aatgatgatt tgttaaaaga tgataaacct gtgttgtacc ctatgattat agaaagaata 21120 aaataaaaca tgtataattg aaataaatat attatttaat aaaatgtttt ttatttatat 21180 actattttct attacatatt ccaatgcaca caaatgttta atggctatca gttttaattt 21240 tactaattcg tctaaacaaa aattattcac ttgctgtttt tcatccattt gacatatggc 21300 gtttataaat aattcgctgt gttttatgaa cgaatcgtaa accgctgcct gggccttcag 21360 cacggtcggc gcattgtatt tttgggtaaa gtacgcaata tttttagtca aacacagaga 21420 ttttaaatct ttttcattta tatccaagtc ggaacaatcg tatacaaaat ctagcttttc 21480 actttcgggc gcgcccagat actggtttac gagttcgagc tgctccactt ggcctttgat 21540 atcggccgct atgcacaaca ttttgtcgat tgcagtttca ttgtttttaa cataataatt 21600 tttaactttt ttattttgca atttaatcaa actatttaaa ttcgcttgac ctttcttaca 21660 aagcgcagtt aatatgcaag acattttgac ttataataaa aaacaaaact tttatatatt 21720 catttattgt tcaataataa caaatattcc aggcttaaaa gctaacgaat agggcttttc 21780 ggtaattttc ttattattca tgtccgtcat ctgcatctct ttgccgtact tgacgccgtc 21840 aatggtgccc atcatgtaca ttttaatctc ctccgaaggt ccgtctattt tgtccatttc 21900 gaacaatcta tcaaaatctt caacgctcat tctctgcata tcaagaggaa cgtttctgat 21960 ctttccggtg gcgtaaattg atccgttgtt gtcacggttg attatgtaaa accgacgaat 22020 caacatgtcg cgctcgctag ttttgttctt atccggcaaa tgaatgcaca cgtttggttc 22080 catcttcaaa ggaaaatcgc tttgcaagtg tttttgcaaa atgttgccaa atatattgtt 22140 gtgtttgtga atgtctccgt attgaatgct aaaaaactgg ccaaagttgc ttttggcacg 22200 ttttatggtt ccaaagtcgg aaaaccaaaa tccgcagggc ttgccctgca ctcttggacc 22260 gatggtgtac gtagtcttgc cgttggccgg ctccaacacc acgatatttt tatcgggctc 22320 gggatacaac ttgtcttccc attcgtgcaa actgttcaaa ttagacagtc gacaaaattc 22380 gtttttcaaa aatctgcctt cgaaacaact acaattcagt attgaaaagt tgcctcgttt 22440 cacattaatc gccatctgct cctgccacaa catcttcgtc aactcgtgtg gctccaattg 22500 aatggacgac ggcgtaaaat agcacattac gcccgtttcg tcgtgtttca cgttaaaagc 22560 gccgctgttg tacggcacca gctgctggtc ctcaccacct tccgatcttt cccgcttcgg 22620 ctggttgtcg tcgctgctcg aatatccatc gccaatcttg cgtttagttg ccatgctacc 22680 gacgtgcgct gtctgctgtg gttcaagtct aattgaagtg tttcacagaa tataagatat 22740 ataataaata tggacgactc tgttgccagc atgtgcgtag acaacgcgtt tgcgtacact 22800 actgacgatt tattgaaaaa tattcctttt agtcattcca aatgcgcccc tttcaagcta 22860 caaaattaca ccgttttgaa gcggttgagc aacgggttta tcgacaagta tgtggacgtg 22920 tgctctatca gcgagttgca aaagtttaat tttaagatag atcggctaac caactacata 22980 tcaaacattt tcgagtacga gtttgtagtt ttagaacacg atttgtccac agtgcacgtc 23040 attaacgccg aaacaaaaac caaactgggc catataaacg tgtcgctaaa ccaaaacgac 23100 gcaaacgtgc tcattttgac cgtaacttta acgagctaaa atgaacgagg acacgccccc 23160 gttttatttt atcagcgtgt gtgacaactt tcgcgacaac accgccgaac acgtattcga 23220 catgttaata gaaagacata gttcgtttga aaattatccc attgaaaaca cggcgtttat 23280 taacagcttg atcgttaacg ggtttaaata caatcaagtt gacgatcacg ttgtgtgcga 23340 gtattgcgaa gcagaaataa aaaattggtc cgaagacgag tgtattgaat atgcacacgt 23400 aaccttgtcg ccgtattgcg cgtatgctaa caagatcgcc gagcgtgaat cgtttggcga 23460 caacattacc atcaacgctg tactagtgaa agaaggcaaa cccaagtgtg tgtacagatg 23520 catgtccaat ttacagtcgc gtatggatac gtttgttaac ttttggcctg ccgcattgcg 23580 tgacatgatt acaaacattg cggaagcggg acttttttac acgggtcgcg gagacgaaac 23640 tgtgtgtttc ttttgcgact gttgcgtacg tgattggcat actaatgaag acacctggca 23700 gcgacacgcc gccgaaaacc cgcaatgtta ttttgtattg tcggtgaaag gtaaagaatt 23760 ttgtcaaaac tcaattactg tcactcacgt tgataaacgt gacgacgaca atttaaacga 23820 aaacgccgac gacattgagg aaaaatatga atgcaaagtc tgtctcgaac gccaacgcga 23880 cgccgtgctt atgccgtgtc ggcatttttg cgtttgcgtt cagtgttatt ttggattaga 23940 tcaaaagtgt ccgacgtgtc gtcaggacgt caccgatttt ataaaaatat ttgtggtgta 24000 ataaaatggt gttcaacgtg tactacaacg gctattatgt ggaaaaaaaa ttctccaagg 24060 agtttttaat tcatattgcg cctgatttga aaaacagcgt cgactggaac ggcagcacgc 24120 gcaaacagct gcgcgttcta gacaagcgcg cctacaggca ggtgttgcac tgcaacggca 24180 gatactactg gcccgatggc acaaagtttg tctctcatcc gtacaacaaa tctattcgca 24240 cgcacagcgc aacagtcaaa cggaccgaca gctcgcatcg attaaaaagc cacgtggtcg 24300 acaaacgacc gcgccgctct ttagattctc ctcgcttgga cggatatgtt ttggcatcgt 24360 cgcccatacc acacagcgac tggaatgaag aactaaagct gtacgcccag agccacggct 24420 acgacgacta cgacgacaat ttagaagatg gcgaaatcga cgaacgtgac tctttaaaaa 24480 gtttaaataa tcatctagac gacttgaatg tattagaaaa acaataaaac atgtattaaa 24540 aataataata ataaaactat attttgtaat atataatgta ttttatttaa aaattgtcta 24600 ttccgtagtt gagaaagttt tgtcttgact tcataactct cttctccata ttctgcagct 24660 cgtttacgtt ttttgtgacg cttttaattt tctcaaaatg ctggctgtca atagttattt 24720 tttgcttttg tctattaatt tcttccaatt gagattttaa atctcgctga gattgagatg 24780 cgttgtaatt ccttgagaac atcttgagaa aacatacaga tgaggtaaaa cagcatcttt 24840 tatccaaatt aggagttaat tattattcat ttgtatcgcg accatttgct cgtacacatc 24900 ttccataaaa tggttatttt tattgcgata agtgttggca ttgacatttt gcaaatgtcg 24960 taggttaaag gggcaaatgg gctgcgtggc cgataaaaga ttccagttca acaatccctc 25020 ttcgcccccg tttaacttga aaatggcgct acacgtttct acgctatcgt gttcctgttg 25080 agtggcgcac ggttcgacca gtatcatctt gtgatatgcg gttttgacat tcatgtgcaa 25140 cggaataact tgcgggtcat cgcattcgtc ggaattaagc tttaaatggc gtccgtatgc 25200 tttccaaagt ttttcgtcgt cgaaccgcgg cactgcttgc aagtcgacgc ggggaaacgg 25260 cgctctgtac aaaacgccta aattcaaaaa ctgattgcat tgttgcagct ctgtccaatc 25320 gacgcgattt ttgtaatttt gaaacagcat caggttgaac gccgcgctgg cgcgcacgtt 25380 tgtaatcact gtgtaattga tcagcttgtg ccaatactgg gcattgaaat tttcttcaaa 25440 ctcatttcta aactctggat gcgcaaacat gtgtctaatg tagtacgcgg gcggggcgtt 25500 gaacgcagtc catttgtcaa tacacttcca gtctgaatgt aacgtgttca ccaaaccggg 25560 atattcgtca aacacgagca tgtgatccga ccacggtatg ctgtgggcga tcaattttag 25620 ttcttgcacg cggccttcgc gtaagcaata caaaatgagc gcgtcgctga tcttgacaca 25680 gtcttgcatg tacgcggaca aattaacgtt ttccatacag ctcacattgt ttattagcgc 25740 cgtgttcaag tgtttgtatt tggacacata atcgtagttg atgtactgtt taatgggttc 25800 ttgaaaccat tcttttagta gtatgtgact ggccactatg cgtttccaat ttaatttgtg 25860 tgcgtatttt tgctgcaccg acaacgagag gttattgtaa tttttggata tttcttccat 25920 gtccaacaag tccccaaacg cgagtataaa atcttgcgtc aaaaattttt gctcagacac 25980 caacgaccag atcaaatgtg atttaaacct gttggcgatt gttatcgaca acggcgaaat 26040 tgaaataatt ttccaatcca acttgttgcg aaacacgtga ataaaatcga cgcgtccgta 26100 acattcgcgc gatatgcgct tccaaaacgt gtcatcttgc aaattaagca aatagacacg 26160 attgttggga gatttgacgg ccaattcaat tatttttata tattcttttt gctttaaagc 26220 gcgttgtagc acttgggttg gagccatgtc gactgaagct ccacgctgtt tgaagcaagg 26280 tgaccgtttt ggtcggcatg ttcaaacgtc gattacatgt ttgctttgca tcaaaatggc 26340 gtaattaatt aagaaacaac atgaaagcca tctgcatcat tagcggcgat gttcatggaa 26400 aaatttattt tcaacaagaa tcagcgaatc aaccgcttaa aattagcggc tatttgttaa 26460 atttgcctcg aggtttgcac ggctttcacg tgcacgaata tggcgacacg agcaacggtt 26520 gcacgtcggc cggtgagcac tttaatccca ccaatgagga ccacggcgct cccgatgctg 26580 aaattaggca tgttggcgac ttgggcaaca taaaatcggc tggctacaat tcactgaccg 26640 aagtaaacat gatggacaac gttatgtctc tatatggccc gcataatatt atcggaagaa 26700 gtttggtcgt gcacacggac aaagacgatt tgggccttac cgatcatccg ttgagcaaaa 26760 caaccggcaa ttctggcggc cgtttgggat gcggaataat tgccatatgt aaatgatgtc 26820 atcgttctaa ctcgctttac gagtagaatt ctacgtgtaa aacataatca agagatgatg 26880 tcatttgttt ttcaaaactg aactcaagaa atgatgtcat ttgtttttca aaactgaact 26940 ggctttacga gtagaattct acttgtaacg catgatcaag ggatgatgtc atttgttttt 27000 caaaaccgaa ctcgctttac gagtagaatt ctacttgtaa aacataatcg aaagatgatg 27060 tcatttgttt tttaaaattg aactggcttt acgagtagaa ttctacttgt aaaacacaat 27120 cgagagatga tgtcatattt tgcacacggc tctaattaaa ctcgctttac gagtaaaatt 27180 ctacttgtaa cgcatgatca agggatgatg tattggatga gtcatttgtt tttcaaaact 27240 aaactcgctt tacgagtaga attctacttg taacgcacga tcaagggatg atgtcattta 27300 tttgtgcaaa gctgatgtca tcttttgcac acgattataa acactaatca aataatgact 27360 catttgtttt caaaactgaa ctcgctttac gagtagaatt ctacttgtaa aacacaatca 27420 agggatgatg tcattataca atgatgtcat ttgtttttca aaactaaact cgctttacga 27480 gtagaattct acgtgtaaaa cacaatcaag ggatgatgtc atttactaaa ataaaataat 27540 tatttaaata aaaatgtttt tattgtaaaa tacacattga ttacacgtga catttacgat 27600 ggcgaacaat aatttcactt tttatattag gacacgacgt gtatatagga aagcttaagc 27660 gtttcaataa agccatggcg tacacgctaa gcttgcccag cttgcggctc tttgaaatct 27720 gtagttttcg gggagtaccg tcgttcttca gtgccacata cgtcaacttg cgatcgtaca 27780 ctttataata cgtgttgtag ttattttttt ccagaaattc cctcataaag caatccttgg 27840 ataaagtttt tgatccgtac agttggccac accggtccat gcacaggtac acacacgtga 27900 tggcgttttg aatgacgatg cgatttctgt caacggcaac gcgcttgaat atggtgtcga 27960 cgttgtccga ttcaatggtt ccgtaaacag ctccgtctgg atttactgcc aaaaactgcc 28020 ggttaataaa cagctggccg ggaatagacg tgcccgtgat gtgtgtcagc agagctgagc 28080 agtcagccat agaggctaga gctacaagtg ccagcaagcg atacatgatg aactttaatt 28140 ccccacagca aactggcgct tttatataaa aatttgggcc atttttggcg attagataat 28200 ttttgaagat tagataatat tgagattagt taataatttg tgtgattaga taacttttta 28260 gggtattgcg cattataaat caaggtcgag ttgtataaac tgctctggcg tgtaaaactg 28320 cagacttaag ttttttgcaa acactcggtc tgaatcgcta aaatctttct gaccggtggt 28380 tagattaatt cggccagccg cgtcgcccac ataaaaagat tgttccttgt caatatgcgt 28440 aaactgtttg gccatctcgc gccacattcc cgtgtcgggc tttcgatgct catccttgtt 28500 gggcgacaca taaaacgata tgggcacgcc agtagctttt ttaatattct ctaatttata 28560 taataaatcg ctcgctttga ttttgccgga acctaaatgg gcttggttcg taaaaacaac 28620 taaatcgtag cctaattcgt acaaacgctt tagcttgtgt gcgcacggaa ggagctgcca 28680 gtcgtctggg ttttttggaa atttggaccg tgtctttgag ctaattagcg tgccgtccaa 28740 atcaaaagcc gcaattttgg ttcttttagc gccgtcatga accgcgtacg catacaaatc 28800 gggctgctgt aacgtccaca tggtgaatgc atcttactca aagtccatca attcgtacgc 28860 gtttgtgtcc aggtcgggcg ttgaaaaatt gtagcttgcc attagatcgg atagcgattc 28920 aaattttgta agcgtttgta gcgcacgttt ggcatcttgt ttaaaattac acgacgacag 28980 acagtaaaaa tattcctcga taagcatgac tacacccata tcactgttta agtgctcgac 29040 gtagttgttg catgttatgt cgcgtgtgcc gcgatacgcg tgatttcggt gaaaatcaca 29100 ccacaaccag tcggcgtgcg tgtaacaaag tcgacagcga aacaatttat cgttttccaa 29160 aaaatttaaa tactcgacag ttttgcagct tagattccgc gtttgattca ccttaaaatc 29220 gtcgtcagcc tctataatct cgggcaacag cttgccttgt tgccccatcg tatcgatcac 29280 ctcccccaag tggcccggtg ttatattaag tcgtttaaaa tcatttattg cttcctgcac 29340 gtcggcctgg taatttttga ccacgggcgt ggaaatcaat tgccgttgaa gggaaataat 29400 tcgtggtgtg ggtatcggcc gcctgttgca caattccacc agcggtggag gcaagggcgc 29460 attcacagca accgttgtca tttataagta atagtgtaaa aatgcaaata ttcatcaaaa 29520 cattgacggg caaaaccatt accgccgaaa cggaacccgc agagacggtg gccgatctta 29580 agcaaaaaat tgccgataaa gaaggtgtgc ccgtagatca acaaagactt atctttgcgg 29640 gcaaacaact ggaagattcc aaaactatgg ccgattacaa tattcagaag gaatctactc 29700 ttcacatggt gttacgatta cgaggagggt attaataata acaataataa aaaccattaa 29760 atatacataa aagtttttta tttaatctga catatttgta tcttgtgtat tatcgctaac 29820 cattaaaagt gctggagcca cagtgttgcg gcgagtcttt atagaagatc gttgtttggc 29880 tggaactgag cttttccttt tcctgctgcc gctaatggga gtgggcacgt actctgtagt 29940 agacggtgca acgggcaact tgagcgctac cgtcttaaat ttggccatac ttttagtgat 30000 gaaatcgcgc gttaacactt cgtcgtaaat gttacttagc agaggcgcaa cattgtgatt 30060 aaatgtctcg tttaacaagc tgtaaaactc cgaataaagc ttatcgcgca tttcgcagct 30120 ctccttcaat tctgccaaat ttgcgttggt aagcaccaca gtctgtcttt ttttgctcgc 30180 tggaattgct gcgttctcgc ttgaagacga cgatgtcgat cggtcggcca tttttttgcc 30240 cagcttttca gtgtgatcaa aaatgaacac aaaatctgcc aattcgggct tgtttttcac 30300 caaatcccac atggccgggc tactaggcca ctcgggctgc ttgatcttag tgtaccaact 30360 gttaaacaaa atgtatttat tgttgttaat cactttcttc ttgcgtttgg acattttgcg 30420 ttcgtcttgc atgacaggca ccacgttaag gatatagtta atgttctttc tttccaagaa 30480 atttacaata acggccagct ggtccatgtt ggatttgttg taagagctcg attccagttt 30540 attcaacagc ttttcatttt tgcacacggc cgcagtctcc ggagattgtt gctccggcac 30600 gtttaccatg tttgcttctt gtaaaccttt gaaacaaccc gtttgtattc ttgatgatat 30660 atttttttaa tgcccaacaa cctggcaatt cgtttgtgat gaagacacac cttacgcttc 30720 gaacatttgt cggtgattac tgtgaaatgg cctaaattag ctcttatata ttcttttata 30780 cgctcaaacg acacgatgtc caacatgtgc gcgcagacgt tttctgtgtt catcgtgtgc 30840 ttgagcgtgt tgatggcttc cctgaacagc gcttgtattt cgctgcgagt caagcagtcc 30900 gaatcacacc cgcctaagtg cgtgcaattt ttggggggca tcgttgtcta tctttttcag 30960 agtggcgtag aaaaagtcct gcaattgcct attatcaaaa cgcgccttga cgctgcgcac 31020 aaaatcaaaa aattcaatgt aattgctgta atcgtacgtg atcagttgtt tgtcgttcat 31080 ataattaaag tatttgttga gcggcacgat ggccaggctg cgcgctattt cgcaattgaa 31140 gcgtcgcggt tttaacatta tacggtagtc attgccaaac gtgcccggca acaacttcac 31200 ggtgtacgtg ttgggtttgg cgttcacgtt aatcaagttg ccgcgcacga cgcctacgta 31260 tatcaaatac ttgtaggtga cgccgtcatc tttccattgt aacgtaaatg gcaacttgta 31320 gatgaacgcg ctgtcaaaaa accggccagt ttcttccaca aactcgcgca cggctgtctc 31380 gtaaactttt gcgtcgcaac aatcgcgatg acctcgtggt atggaaattt tttctaaaaa 31440 agtgtcgttc atgtcggcgg cgggcgcgtt cgcgctccgg tacgcgcgac gggcacacag 31500 caggacagcc ttgtccggct cgattatcat aaacaatcct gcagcgtttc gcattttaca 31560 tatttgacac ttaaaaaatt gcgcacacga gcaccatcgt ttgataccta attgcaacta 31620 tttacaattt atcagtttac gttgaacccg ttttaatttt ttagatccgt ccttgttcag 31680 ttgcaagttg actaaatgac aaaatttttc ggttctgcaa aaccgccctt gtctgttcca 31740 cccgttgtat ttgaaaaaac tttttttcac gcggcgacaa ctgcttgtat aatattgccc 31800 aatgtaaaca tgcaaaattt tgttactctc gtcaaaacag cggttggcgt tccattccat 31860 aattttttta ttatttatca acgatggcca ttgtaaattg tcgtcattta tacgcatcat 31920 atgatttaac aaaagctttt cgtatagcgg aacttcaatt cccttggaac atttttcaaa 31980 cgataattta atttgtttct cggttggcag catttcatgc ttgattaaca atcgcctgac 32040 ttttatagcc acgtttatgt ctttgcacag caaatgtggg ttgtcgacaa tgtaatagtg 32100 caaagcattt gttacggcaa atgcgtagtt tgatttgacg acgccctttt tcttgacggg 32160 cattgcggct tttaaaatta cttgcaagca ttgtacgaat acctctttgt gtttaaacaa 32220 taatatggac aaacatcggc gaaacaattt gtaataatta tgaaatccca aattgcaggt 32280 tttaaacttc tttgttactt gttttataat aaataaaatt tgctgaccca tgtctgcgcc 32340 cacaacttta attaaccatt tgtgcgcata ttgattgtct cgttgttccc aaccggaaaa 32400 ttgattgatc tcgagccacc ggcattggtc gtttgatacc gtcgttaacg ccgacgctcc 32460 tgcctgtttg attacgggtt ctaaaagacg aaacagcagc gtaaatttgt ttttgcgtcg 32520 gtagtatttt ggcaggcaat aatcaaaaaa atccgtaagc aattctctgc atctattaat 32580 attcgttgcg tacgaatcga gtttttcaaa aattactttg tttgtatgaa aataacgttt 32640 gggcttctca caataataat cttcgttgta gaacagaaac ggtttgcgag aattggcacg 32700 tttgtccatg attggctcag tgtaacgatt gattcaaatc aaaattgaca acacgtttgc 32760 cgtaatgtgc accggttcgc acacgtttgc cgcgtatgta atccatgttt atttcgctgt 32820 cgcaattgat tacacgattg tgttgggcgg cgcgttttat tgaatttagg cgacgcgtcg 32880 acaactccaa aggattgtaa agcgcagatt tttccagagt aaacgagttt aagtggccac 32940 cgttgaacca ttccagagcc acgattgtgt acagcaaaaa gaatatttct ttgtcgacgt 33000 tttcaaacgc aaacttgttt tttaggcaat agtagtaaaa ttttaacgaa ttgtataaat 33060 aaaacataaa attgccattt ttaaagtaaa attctacatc cgtgacgaac aaaaggttta 33120 ctattttgtt ctccaacaag tgtgccaatt ttcttaagta caccattgaa tttttgtcgt 33180 cgtccatctc gatcaacaac acgtacggcg ttttggaatt taaaattatt ctaaaatttt 33240 cctgttgcaa cgattccaca gcgtccgacc aatatgacgc tgccacctct agacagatgt 33300 atttcttgga aaacacgtgt cgtttgataa cctcgctgat ggacgtgatc gattgtaaat 33360 acttttcaaa cgtcgcgtct tcccaaccac gcaccgacac gggcgctgtc gtgtcgggct 33420 gatgtttgaa atccaaacca ctctgaatta acttggttgt gattcgtatg ctcaactgtt 33480 gacccaacgt gtagtgatct tcgtaggcgc gctcccacat cacgttacac acaaatttga 33540 cgagatcatc aacgtctttc tgttgcaaaa ttcgccgcaa acgcgccaca tcgcccttgt 33600 accaccgatc tcggcacaca agctgtagca tttttaaatc gtgatcgctc aagctattaa 33660 ttctggttag atttatatag tcgtcaatat cctcgggcgt ggtttgcgtc atgtctgtaa 33720 aacgtgcaaa atcaaacatt tttatgttgt agtcgaatct aacaaatcca tcggcgttca 33780 cttgcacttc gcgctttaca aaacgaggta gcgtgtaatc gaacccgttt aaatagattg 33840 cgtacaaaac cagcacttca tcttccagtt tgcacgcttg cggcaaaaat tgtgtggtgt 33900 gctccaaccg ggtgacaaac atgactatgg aaaataacgc ggaattcaac agacgactag 33960 agtacgtggg cacgatcgcc acaatgatga aacgaacatt gaacgtttta cgacagcagg 34020 gctattgcac gcaacaggat gcggattctt tgtgcgtgtc agacgacacg gcggcctggt 34080 tatgcggccg tttgccgacc tgcaattttg tatcgttccg cgtgcacatc gaccagtttg 34140 agcatccaaa tccggcgttg gaatatttta aatttgaaga aagtctggcg caacgccaac 34200 acgtgggccc gcgttacacg tacatgaatt acacgctttt taaaaacgtc gtggccctca 34260 aattggtcgt gtacacgcgc acgctacaag ctaacatgta cgcggacggg ttgccgtatt 34320 ttgtgcaaaa tttttcagaa acaagctaca aacatgttcg tgtgtatgtt agaaaacttg 34380 gtgcgataca agtagcgaca ttatcagttt acgaacaaat tattgaagat acaataaatg 34440 aactcgtcgt caatcacgtt gattagataa tgtccgtgtt aaatgtgata tcttagatta 34500 cgagcgcgca ataaccatag tttaatcgaa gagaatagcc gtcgccacaa tggataatta 34560 caaattgcaa ttgcaagaat tttttgacca agcgcccgac aacgacgatc ccaactttga 34620 acatcaaacg cccaatctat tggcgcatca gaaaaaaggc atacagtgga tgattaacag 34680 agaaaaaaac ggccggccca acggcggcgt gcttgccgac gacatgggac tcggcaaaac 34740 gctctctgtg ctaatgttaa tcgcaaaaaa caactctcta caattgaaaa ctctaatagt 34800 gtgtcctttg tctttaatca atcattgggt aaccgaaaac aagaagcata atttaaattt 34860 taacatttta aagtattaca aatctttgga tgccgacacg tttgagcatt accacattgt 34920 ggtgaccacg tacgacgttt tattggcaca tttcaaattg atcaaacaaa ataaacagtc 34980 aagtctgttt tcaacccgct ggcatcgagt tgttctagat gaagcgcata ttatcaaaaa 35040 ctgcaagacg ggcgtgcaca acgccgcgtg cgctttgacc gcaacaaacc gatggtgcat 35100 taccggcaca ccgatccaca acaagcattg ggacatgtac tcgatgatta attttttgca 35160 atgtcgtcct tttaacaatc caagagtgtg gaaaatgtta aataaaaaca acgactctac 35220 aaatcgcata aaaagtatta ttaaaaaaat tgttttaaaa cgcgacaaat ctgaaatttc 35280 ttctaacatt cctaaacaca cggttgagta tgtacatgtt aattttaatg aagaagaaaa 35340 aacgttgtac gataaattaa agtgtgaatc ggaagaggcg tatgtgaagg ctgtggcagc 35400 gcgtgaaaac gaaaacgcac taagccgatt gcagcaaatg cagcacgtgt tatggctaat 35460 actgaaattg aggcaaatct gctgccaccc gtatttggcc atgcacggta aaaatatttt 35520 ggaaacaaac gactgtttta aaatggatta tatgagcagc aagtgcaaac gagtgctcga 35580 cttggtagac gacattttga acacaagcaa cgacaagata atattggttt cgcaatgggt 35640 ggaatattta aaaatatttg aaaacttttt taaacaaaaa aacattgcta cgttaatgta 35700 cacgggccaa ttaaaagtgg aagacaggat tttggccgag acgacattca atgatgctgc 35760 caatactcaa catcgaattt tgctgctttc cattaagtgc ggcggcgtcg ggttaaactt 35820 aataggcgga aaccacattg taatgttgga gcctcattgg aacccgcaaa ttgaattgca 35880 ggcgcaagac cgaatcagtc gtatgggaca aacaaaaaac acgtacgtgt acaagatgct 35940 aaatgtggaa gacaacagca tcgaaaaata cattaaacaa cgccaagaca aaaagattgc 36000 gtttgtcaac acggtctttg aagagactct gctcaattac gaagacatta aaaaattttt 36060 caacttgtag ctggtaagtc gtcatgaaca cccgatatgc tacttgctat gtttgcgacg 36120 agttggtgta cttgtttaag aaaacgttta gtaacatgtc cccttcggcc gctgcgtttt 36180 accaacggcg catggccatt gttaaaaacg gtatcgtgct gtgcccacgt tgttcgtcgg 36240 aactaaaaat tggcaacggc gtttcgattc caatttaccc ccaccgcgct caacaacatg 36300 cacgacggtc gcgttaagac gcaagcgctt cgagttttgg cccgctcgct acctccgctg 36360 tacgactcga ccgtcgatcg acacggctgc aaggtgttca cggtgcggcg ctacaacaga 36420 cgcgtaatcg actttgcggg cattcgcaac aaaacgctgg aaatcattaa aacggataga 36480 aacttgccgc tcaacacaga atgcaatgtg aaagttgtcg acagtgcatg catgcgttgc 36540 agaaaaagtt tcgcagttta ccccgccgtt acctatctgc attgcggaca ttcgtgtctg 36600 tgcaccgact gcgacgaaac ggtaaacgtg gacaacacgt gtcctaaatg taaaagcggc 36660 attagatata aattaaaata caaaactttg taacatgttg ccctacgaaa tggtgattgc 36720 cgtgttggtt tacttgtcgc cggcgcagat tctaaattta aaccttcctt ttgcatacca 36780 aaaaagtgtg ctgtttgcca gcaactctgc aaaagttaac gaacgcatca ggcggcgagc 36840 gcgtgacgac aacgacgacg acccctattt ttactacaaa cagttcataa agattaattt 36900 tttaactaaa aaaataataa atgtttataa taaaactgaa aagtgtatta gagcgacgtt 36960 tgatggtcgg tatgtggtta cacgcgacgt tttaatgtgc tttgtaaaca agagttatat 37020 gaagcaattg ctgcgcgagg ttgacactcg cattacacta cagcaacttg ttaaaatgta 37080 tagtccagaa tttggttttt atgtaaatag caaaattatg tttgtgttaa ctgaatcggt 37140 gttggcgtct atttgtttaa aacactcgtt cggcaaatgc gagtggttgg acaaaaatat 37200 aaaaactgtg tgtttacaat taagaaaaat ttgtattaat aataagcaac attcgacatg 37260 tctatcgtat tgattattgt catagttgta atatttttaa tatgtttttt gtacctatca 37320 aatagcaata ataaaaatga tgccaataaa aacaatgctt ttattgatct caatcccttg 37380 ccgctcaatg ctacaaccgc tactactacc actgccgttg ctaccaccac taccaacaac 37440 aacaacagca tagtggcctt tcggcaaaac aacattcaag aactacaaaa ctttgaacga 37500 tggttcaaaa ataatctctc atattcgttt agccaaaaag ctgaaaaggt ggtaaatccc 37560 aatagaaatt ggaacgacaa cacggtattt gacaatttga gtccgtggac aagcgttccg 37620 gactttggta ccgtgtgcca cacgctcata gggtattgcg tacgctacaa caacaccagc 37680 gacacgttat accagaaccc tgaattggct tacaatctca ttaacgggct gcgcatcatt 37740 tgcagcaaac tgcccgatcc gccgccgcac caacaagcgc cctggggccc ggtcgccgat 37800 tggtaccatt tcacaatcac aatgcccgag gtgtttatga acattaccat tgtgctaaac 37860 gaaacgcagc attacgacga agctgcgtcc ctcacgcgtt actggctcgg cttgtatctg 37920 cccacggccg tcaactcgat gggctggcac cggacggcag gcaactcaat gcgcatgggt 37980 gtgccctaca cgtacagtca aatgttgcgc ggatattcat tggcgcaaat taggcaagag 38040 cagggaatac aagaaatcct aaacacgatc gcgtttccgt acgtgactca aggcaacggc 38100 ttgcacgtcg attcgatata catcgatcac attgacgtgc gcgcttacgg ctatttgata 38160 aattcatact ttacgtttgc ctattacacg tactattttg gagacgaggt aatcaacacg 38220 gtgggtttga cgagagccat cgaaaacgtg ggcagtcccg agggagttgt ggtgccaggc 38280 gtcatgtctc gaaacggcac gttgtactcc aacgtgatag gcaactttat tacgtatccg 38340 ttggccgtcc attcggccga ttactccaaa gtgttgacca aactttcaaa aacatattac 38400 ggttcggttg tgggcgtaac gaataggttg gcttactacg aatccgatcc cacaaacaac 38460 attcaagcgc ccctgtggac catggcgcgg cgcatttgga atcggcgcgg cagaattatc 38520 aactataatg ccaacacggt gtcgtttgag tcgggtatta ttttgcaaag tttgaacgga 38580 atcatgcgca tcccgtcggg caccacgtcc acgcagtcgt tcagaccgac cattggccaa 38640 acggctatag ccaaaaccga cacggccggc gccattttgg tgtacgccaa gtttgcggaa 38700 atgaacaatt tgcaatttaa atcgtgcacg ttgttctacg atcacggcat gttccagcta 38760 tattacaaca ttggcgtgga accaaactcg ctcaacaaca caaacgggcg ggtgattgtg 38820 ctaagcagag acacgtcggt caacaccaac gatttgtcat ttgaagcgca aagaattaac 38880 aacaacaact cgtcggaagg caccacgttc aacggtgtgg tctgtcatcg cgttcctatc 38940 acaaacatca acgtgccttc tctgaccgtt cgaagtccca attctagcgt cgaactagtc 39000 gagcagataa ttagttttca aacaatgtac acggccacgg cttcggcctg ttacaaatta 39060 aacgtcgaag gtcattcgga ttccctgaga gcttttagag ttaattccga cgaaaacatt 39120 tatgtaaacg tgggcaacgg cgttaaagcc ctgtttaatt atccctgggt aatggtcaaa 39180 gaaaataaca aagtgtcttt catgtcggct aacgaagaca ctactatacc atttagcgtt 39240 ataatgaatt ccttcacctc tatcggcgaa ccagctttgc aatactctcc atcaaattgc 39300 tttgtgtatg gaaacggttt caaattgaac aacagcacgt ttgatttaca atttattttt 39360 gaaattgtgt aattatattt agggagaatg tgatattcaa aagactgact gttaacacaa 39420 aagactgata ttgttgttgt tacaaaatag ataataaaac aaaaaataaa ttaaatatta 39480 tttatttatt aaactgttta attttaatgc taacgcgtac aaatcacgct gttccgacgt 39540 ggacatggaa ttgcgcagaa aagtcttgat agtgtcgatt tcttcgccgt catccacttc 39600 catatatttg atttcttcct cgatttgcat ttccaagttt gcgtattctt gcaaataata 39660 atctagtcgt tgggcgacct cgccaatttt aaataataca ttatccgaca ccaaatgcca 39720 gcgagtgact gtgcgctcca tcatcctggc actttttaat gtgaatatta aaaggttgtt 39780 gcatatatat cgttaaacgt ttatgtttac tttcacgtta gctcgtttca ttgatgtaaa 39840 catttagttt tataacagcg tcggtaattt tattttttaa agtaaacaga ccaaaatcaa 39900 aggtgtcttc gacaggtacg attattttcc cattgacact gttttcgtgc acagatataa 39960 ttttatcacc gtttattatt ttgcccaaac acacgtactc gtttcttctc aagccaacta 40020 tttctaaaca attcactttt ctattatcgt gtacgcaatt aaaagtaaac gaagcgctac 40080 aattgtcgta ttctattaca attctgcggc atttataaaa tttattaatg ttgacgcaaa 40140 ttccatgcag cgcatccatt tcgtactgca aatgcggcgc aattaaaaaa tttcctcgtc 40200 gttgttaaca atcttgggcg ctaaaaagca cgccaacacg cccacgtctt taatgcaata 40260 ttccaatttg aacggcagtt cctcggacat gtatattgtc acggtgggcg ccaaaggagc 40320 ggctttagca aaatgacaca agtaatcgcc cgcaaaagtg tgcgttacgg tttgctttgc 40380 tttgagaacg gaaaagtttt cgttgtccgc gctcatctgc acgtccgccg agccaatgtc 40440 gccatttgct ctaaactgca gacccttctt ggaacacgac acaataatat cgtggtcgaa 40500 ttgcgtcatg tctttgcaca cctgcgcaaa ctcgacgctc gacatgtgga cgacgcaatc 40560 gtaatcgcta tccggaattc ccaaatgttc cacgtcgatg cacatcaact tgagcgtgta 40620 cgtgcagatt ctattgtcgt tgttgaacac gaacgccatc acatcgccct gatcttccgc 40680 tttcatcagt acagagctgc gctcgttaac gcatttgaca attttactta aactgtttat 40740 ggacacgttg agcggcacgt tgcggtcaca tctatatttt ttgaaaccct cggcgtgtag 40800 ttgcaacgac acgagcgcga catgcgaggt gtccataacc tgcatgctta cgcctcgatt 40860 atcacaatca aaagtagcgt gcggcagcag atccttaaaa gtttccacca gcctcttcaa 40920 aactgcgccg gttttaaatt ccgcttcgaa catttttagc agtgattcta attgcagctg 40980 ctctttgata caactaattt tacgacgacg atgcgagctt ttattcaacc gagcgtgcat 41040 gtttgcaatc gtgcaagcgt tatcaatttt tcattatcgt attgttgcac atcaacaggc 41100 tggacaccac gttgaactcg ccgcagtttt gcggcaagtt ggacccgccg cgcatccaat 41160 gcaaactttc cgacattctg ttgcctacga acgattgatt ctttgtccat tgatcgaagc 41220 gagtgccttc gactttttcg tgtccagtgt ggcttgtttt aataaattct ttgaaaatat 41280 tgtcgggtgt attattaaat agcatgtatg gtatgttgaa gatgggataa cgcttggcgt 41340 gcgggtcgtc atgatttcca ccgcgcacca catatttgcg ctcaatttta tcaaaattgg 41400 actggcgaga caaaaacgag acgggcgaca ggcatatttg ggcgtgcgta ccatcttcgg 41460 ccatccactc ggtcaggtct tcgctgcggt taaacacacc tttctgaccg tgaatgccac 41520 atatttttat tccttccaaa tcgttggtgg acgtgactat gactatttta agcataacgt 41580 tgtcgccgtt aaccaccatg ctggcgtcga gtttttcaat tttttgattt ttaatttgtc 41640 taaagtaaac gtacactttg taaacgttaa aattgccgtt ggtgcacgtt tcaattttgt 41700 accgtcggcc gtcgtacacc caattaatct ttgcgttgct caccaacaca ccggccatgt 41760 acagcacaag tccgtcgtct agcgcaacgt aatttttgtc gctactattc gtaaacttta 41820 ctaaacacga ctgcttgggg ccgaccacaa gcttgccctt caatttgttc actttgttgt 41880 tgtataaaca aatgggcagc gcaatgtgcg gaatgtacgg atcttcggcg gtcatgagtt 41940 tattgtctcg caccaacgtc cacaatttaa acattttatt gttgagcaaa atggacttgt 42000 ttaccgccac agagtagcca tttggtaaac ccgatacgca attttcctct ttgtactcaa 42060 acacgggcat ggcattcttt agattggtta gggacacaat caatttgggt acgggcgtgg 42120 tatgaaataa atgtataaaa ttacgataat aatactgctc caacttggac atgagcgatt 42180 tgacgtcatc gttttctacg atcgtacact gaataatggg attatagtat atagaatgtt 42240 tatagtggta ttcgtagggt gtcaacaata cgttaatgtc ggcttcgttg ttcacccgca 42300 actttttttt gatgcatatc attccttcgt gatgattaac gtaaagtatt ctgtctgtaa 42360 tcttcaattc gatgggcgcc atgtttcttt tcatagtgta cacgataaac gacgtgtttg 42420 attttaaaca ttttaaattt gtgggtctat cattaaacgc gatcagcaac gagtcgtctt 42480 gaacgtcgtt gaggtcgtcc acgaacgcga ccagattgtg ttttagcaaa tattgaaatt 42540 tttgcgcaac catttcgtag tccacgttgg gcaaacatgc gttgcggcaa aggaaaaact 42600 ttttgcccgc cacggtcatt tcgccgtgaa aaaaactgcc aataaatttc acaaaatcct 42660 ttttttgctt caacattttc tggcgcatgc tgtcgttggt gattcgcgcc acctcgttgc 42720 cgacgcgata ttttaacacg ggcaacgaaa tttcaatatt gttattgctg ctgttgtcct 42780 gttgattggg aaagactttg cgttgcttgc taaaagtttt cgatacgcaa tatatgagac 42840 gcccgttgac tatacaatcg acaatctttt tcgactcttt gttgtacaag acgctttgaa 42900 ttttacgacg cttgttcgcc accgtgtacg cgtcgtcgtc ggccgtcttg tcgagaactc 42960 gttgatagtt ttgcaaaatt gtcgaagtta ataacagttc tatcaaatag gcgtgcttgt 43020 atacaatttt gttggccaaa ctgtctatag aatagtttat gtcgtgattc ataataattt 43080 ttatgtgttc cacgagttgt tgcttgtgaa gcgtgttgta ttcgaagaga aaatcgagcg 43140 gtttccattt gccgctgttg gccagatatg tttccagcac agaatttaaa tcttccgtca 43200 ctacgtaatc gctagcgtac acgtctcgag caaacaggac gtcgtcttgt ttgtcgtaaa 43260 ctagttggat tgcgcgattg atgtgcttct cttgatccac gttgccgtac aaaaacatgc 43320 gtttgcaatg tttggcgtat agcttgtcgt agaaattgtg caccaaaacg ttgttgttca 43380 tcattatgtt gggaaaactc aaaaatctgc cgtccagcat aaaagttccg ttaatattgt 43440 tgtttgcgtc gacatcgtcc gtttctctaa attgcttgtc taagcgcgtg ccgaatataa 43500 cgggcacaca tttatgcatt acgcaactga gctgttcatt aagagcgcaa cacaaataag 43560 acttgcgttc ttgaatagcg caaaaaagca tacgttcatt gctgtttgta gcgcaatcaa 43620 aagtatattt taatttgtat ttattttcaa ttctatcgta caactcgttg aaatcttgaa 43680 ccacgtccgt catcgtgaag cgattactgc gcactaatta tgtctaaacg tgttcgtgaa 43740 cggtcggttg tttcggatga aacggccaaa cgcattcgac aaaacgaaca ctgtcatgcc 43800 aaaaatgaat cttttttggg gttttgcaac ttggaagaaa ttgattatta tcaatgttta 43860 aaaatgcaat acgttccgga ccaaaagttt gacaacgatt ttattttaac agtgtacaga 43920 atggccaacg tggtgacgaa acaagttaga ccgtataaca gtatcgacga aaagcaccat 43980 tacaacacgg tgcgtaacgt gttgatttta ataaaaaatg cgcgtttagt gcttagtaat 44040 agtgtcaaaa agcaatacta tgacgatgtg ttaaaattga aaaaaaatac agacttggaa 44100 tcgtacgatc cattgattac ggtcttttta caaattggcg aatctgtaaa tgaagaaata 44160 caaaaactca gaaaagcttt ggtcaatttt tttactaata aacccgacaa gtcggatata 44220 aacaacccag atgtagtttc gtatcaattt atttttggca gagtacaaaa attgtataac 44280 agggcaatta aacaaaaaac taaaactata attgtaaaac gtcctacaac tatgaacaga 44340 attcaaatag attggaaaac tctttccgaa gacgaacaaa aaatgactag acaagaaatt 44400 gccgaaaaaa ttgtaaagcc ttgttttgag caatttggca ctatattaca catatacgta 44460 tgtcctttaa aacacaaccg aattattgtc gagtatgcaa actcagagtc ggtacaaaaa 44520 gccatgactg taaatgacga cactcgattt acagttacag agttttccgt ggttcagtac 44580 tacaacgtgg ccaaaacaga aatggtgaac cagcgaattg acataataag caaggacatt 44640 gaggatttaa gaaacgcttt aaaatcttac acataaatta aaatatcgaa caaaggaaaa 44700 aaacaattgt aacaaaaata atttacatta aaatttacaa gtttttttct agtgtcgtac 44760 ttttttacaa tgcgtctgtt gtccgtcgag cattgcaaac atattgtgga cggcgcaaaa 44820 tagcaaacaa aaggcacgtc cgcgctctcc cacgctattc taaaacgatg aatccatatt 44880 aatttttcat tgtcgccaaa cgtcgctccg ctggcctcct tccaataaca aatactcaga 44940 aacacaaaca tgtacaattg ctgtcgcggc gttaattgtc gctgtttttc caaatagtct 45000 attatgggaa acaaacactt gtcacaacac aaatactcgt taattgtcac aaccgacaag 45060 cacatttggc aaaatgcgtc gcaatttttg tacggacgag attctatgcg aagttcgttg 45120 tccatgacgt cttgggtcca ctttttcaac aagacacttt tatatttgtg atttgtacaa 45180 ctttggtacg tgttagagtg tttttgataa gctttgataa gtttaaaact gttggagtaa 45240 ggccacgtca ttatgttctg caccttttgt ttaaaagaca gaaattacta tatgttcaaa 45300 ctatttaaag attattggcc aacgtgcacg acagaatgcc agatatgtct tgagaaaatt 45360 gacgataacg ggggcatagt ggcaatgccc gacactggca tgttaaactt ggaaaagatg 45420 tttcacgaac aatgtattca gcgttggcgt cgcgaacata ctcgagatcc ctttaatcgt 45480 gttataaaat attattttaa ctttccccca aaaacactag aggagtgcaa cgtgatgctt 45540 cgagaaacta aagggtttat aggcgatcac gaaattgatc gcgtttacaa acgcgtttat 45600 caacgcgtta cacaggaaga cgccctggac attgaactcg attttaggca tttttttaaa 45660 atgcaatcat gacgaacgta tggttcgcga cggacgtcaa cctgatcaat tgtgtactga 45720 aagataattt atttttgata gataataatt acattatttt aaatgtgttc gaccaagaaa 45780 ccgatcaagt tagacctctg tgcctcggtg aaattaacgc ccttcaaacc gatgcggccg 45840 cccaagccga tgcaatgctg gatacatcct cgacgagcga attgcaaagt aacgcgtcca 45900 cgtaacaatt attcagatcc cgataacgaa aacgacatgt tgcacatgac cgtgttaaac 45960 agcgtgtttt tgaacgagca cgcgaaattg tattatcggc acttgttgcg caacgatcaa 46020 gccgaggcga gaaaaacaat tctcaacgcc gacagcgtgt acgagtgcat gttaattaga 46080 ccaattcgta cggaacattt tagaagcgtc gacgaggctg gcgaacacaa catgagcgtt 46140 ttaaagatca tcatcgatgc ggtcatcaag tacattggca aactggccga cgacgagtac 46200 attttgatag cggaccgcat gtatgtcgat ttaatctatt ccgaatttag ggccattatt 46260 ttgcctcaaa gcgcgtacat tatcaaagga gattacgcag aaagcgatag tgaaagcggg 46320 caaagtgtcg acgtttgtaa tgaactcgaa tatccttgga aattaattac ggcgaacaat 46380 tgtattgttt ctacggacga gtcacgtcag tcgcaataca tttatcgcac ttttcttttg 46440 tacaatacag tcttgaccgc aattcttaaa caaaacaatc cattcgacgt aattgccgaa 46500 aatacttcta tttcaattat agtcaggaat ttgggcagct gtccaaacaa taaagatcgg 46560 gtaaagtgct gcgatcttaa ttacggcggc gtcccgccgg gacatgtcat gtgcccgccg 46620 cgtgagatca ccaaaaaagt ttttcattac gcaaagtggg ttcgaaatcc caacaagtac 46680 aaacgataca gcgagttaat cgcgcgccaa tcagaaaccg gcggcggatc tgcgagttta 46740 cgcgaaaacg taaacaacca gctacacgct cgagatgtgt ctcaattaca tttattggat 46800 tgggaaaact ttatgggtga attcagcagt tattttggtc tgcacgcaca caacgtgtag 46860 catcgccagt atttaacagc tgacctattt gttaaacaag cattcttatc tcaataattg 46920 gtccgacgtg gtgacaattg tatccacaat catgaaaaaa gtagcgcttg gaaaaattat 46980 cgaaaacaca gtagaaagca aatataaaag caacagtgtg tcgtcgtcat tgtcaacggg 47040 cgccagtgca aaattgagtt taagcgaata ttacaaaact tttgaagcaa ataaagtggg 47100 ccagcacact acgtacgacg tggtcggcaa gcgagattac acgaaatttg acaaattggt 47160 gaaaaaatat tgacatgctg cgatcaatca tgcgacgttt caagagtaca aacaatctca 47220 gcaaaaaacc ctccgattat tatgtagtgt tatgtccaaa gtgttatttt gtgacgtcgg 47280 ccgaagtgag cgtggctgaa tacatagaaa tgcataaaaa ttttaacacg aaattcgccg 47340 atcggtgccc taacgatttt attgtgacca actctaaaag ttggaataat catgaaaatt 47400 gttctgccct attttaccct ctgtgttaat aaagtttgtt gtttgtattt tgtggtttta 47460 tttatttacg ctagatattg ggtttaaggt tcttagaaat agagttgtat tttccctacc 47520 aaaagggatt tgagcttcat ataaatacaa ttttcgctcg acaagcggtt tatttcactc 47580 ggaggtatta tatcaggcag tcgaacgtgc gcgatgaaac atcccgttta cgctagatat 47640 ttggagtttg atgatgtagt gttagatttg actagtttaa tatttttaga gtttgataac 47700 gctcaaaatg aagagtacat tatttttatg aatgtaaaaa aggcgtttta caaaaacttt 47760 cacattactt gtgatttgtc gcttgaaacg ctgaccgtgt tggtgtacga aaaagctcgc 47820 ctaattgtga aacaaatgga gtttgagcag ccgccaaact ttgttaattt tatcagtttc 47880 aacgcgaccg acaacgacaa ctccatgata atagacttgt gttccgacgc gcgcataatc 47940 gtggccaaga agctgacgcc cgacgaaacg tatcatcagc gcgtgtccgg atttttggat 48000 tttcaaaaac gtaactgcat acctcggccc ccaatcgagt cggacccaaa agtgcgagac 48060 gccttggatc gtgaactaga aataaaacta tacaagtaga aaaaaattaa tttattaata 48120 gttgtaataa ttatcttcgt cctcatcttc gctggtgtca taatgcggtg gtgtgtttgt 48180 gttttgtttt aatcgtttgc gcgtcgacac cacttcgccg ataggaaatt ttttggattt 48240 cgcattaaat gcccgcttag cgacgcgccg tttacgacta ctaaacatgt tgacgcgctc 48300 gtcgtcttca gtgtcataat ccgtgctagt gttttcgttg ttattttcta tgagacgatc 48360 gtttgattta gttttcgtag aattgtccgc gttatcgtcg ctttcgtcga tgtcgtccct 48420 aactatctcg taggcggctt tgcgcggaat ccaagaattt tgcaatgtat ctattttaac 48480 gtacttttct tcgagcgctt ttctagcttt atgcatagca atgtcttcgt cgccgccgtt 48540 cattttatga tactttgtaa acgtctcgac gaataacttt ttggcgcgag gaggcatttt 48600 ttcattgtat aacatatcgg gaatttgata cattgtaatt agaattaagc aagttcgtct 48660 tcggttgtac tgtattcggt ttctgtatct gtagtggaat cctctgtact agtagtagtg 48720 tcgctattgt tggcgtcagg ccttggctgc catttaccgt ctatcaacat gtattttttc 48780 ctaacagcac aacatgctag cttggtagct atctgtgtcg acttatattt ttgtaaacta 48840 cgatcgtaga atttttcaaa tatcctctta ccgttatagg gaaggttttg ataatattta 48900 ggcaacatat caataaaaga caatataaaa actttgtgtt tgtgttttat ttatcacata 48960 aaatggacgt ctggcaagaa tcacaaccaa tattagtgtt ttttttctta cattacgaga 49020 ttcaacttga tactaaaatt aattattaat taaattaaat taaattttga agcatttttt 49080 cgctatcgtt ttcagactca aaattatcga cgctatcgct atgaaaagcg taatatttgt 49140 tggctttgag atattctata ttttgctcat ttttaacaat aaacacgcga ctcttttcgt 49200 cgcgtctcac cataacaccg tttttacaaa tggaaatgta tttgtaaaac ggcaacagag 49260 cgtcgcgagt ttttttaagt aacagctttt gctccgctgt ggcggccaca aatattttta 49320 cgggcccgtc gtaattaatg tttaaattaa aatttttaag tcgacgctcg cgcgacttgg 49380 tttgccattc tttagcgcgc gtcgcgtcac acagcttggc cacaatgtgg tttttgtcaa 49440 acgaagattc tatgacgtgt ttaaagttta ggtcgagtaa agcgcaaatc ttttttaaat 49500 aatagtttct aattttttta ttattcagcc tgctgtcgtg aataccgtat atctcaacgc 49560 tgtctgtgag attgtcgtat tctagccttt ttagtttttc gctcatcgac ttgatattgt 49620 ccgacacatt ttcgtcgatt tgcgttttga tcaacgactt gagcagagac acgttaatca 49680 actgttcaaa ttgatccata ttaactatat caacccgatg cgtatatggt gcgtaaaata 49740 tattttttaa ccctcttata ctttgcactc tgcgttaata cgcgttcgtg tacagacgta 49800 atcatgtttt cttttttgga taaaactcct actgagtttg acctcatatt agaccctcac 49860 aagttgcaaa acgtggcatt ttttaccaat gaagaattta aagttatttt aaaaaatttc 49920 atcacagatt taaagaagaa ccaaaaatta aattatttca acagtttaat cgaccaatta 49980 atcaacgtgt acacagacgc gtcggtgaaa aacacgcagc ccgacgtgtt ggctaaaatt 50040 atcaaatcaa cttgtgttat agtcacagat ttgccgtcca acgtgtttct caaaaagttg 50100 aagaccaaca agtttacaga cactattaat tatttaattt tgccccactt tattttgtgg 50160 gatcacaatt ttgttatatt tttaaacaaa gctttcaatt ctaaacatga aaacaatctg 50220 gttgacattt cgggcgctct gcagaaaatc aaacttacac acggtgtcat caaagatcag 50280 ttgcagagca aaaacgggta cgcggtccaa tacttgtact cgacgtttct caacacggcc 50340 tcgttctacg ccaacgtgca atgtttaaat ggtgtcaacg aaattatgcc gccgcggagc 50400 agcgtaaagc gctattatgg acgtgatgtg gacaacgtgc gtgcatggac cacgcgtcat 50460 cccaacatta gccagctgag tacgcaagtc tcggacgtcc acattaacga gtcatctacc 50520 gactggaatg taaaagtggg tctgggaata tttcccggcg ctaacacaga ctgcgacggt 50580 gacaaaaaaa ttattacatt tttacccaaa cctaattccc taatcgactc ggaatgcctt 50640 ttgtacggcg accctcggtt taatttcatt tgctttgaca aaaaccgttt gtcgtttgtg 50700 tcacaacaaa tttattattt gtacaaaaat attgacgcaa tggaggcgtt gtttaaatct 50760 acaccattgg tttacgcgct gtggcaaaaa cataaacatg agcagtttgc acagaggcta 50820 gagatgttgt tgcgtgattt ttgcttaatt gccagttcaa acgctagtta tttacttttt 50880 aaacagctta cacagctcat agctaacgaa gaaatggtgt gcggagatga agaaatattc 50940 aatttaggcg gccaatttgt agacatgatt aaaagcggtg ctaaaggcag tcaaaatctg 51000 attaaaagca cgcaacaata ccgacagact ttaaatacag atattgaaac tgtgtcttca 51060 cgagccacca ccagtttaaa tagttacata tcttctcaca ataaggtaaa agtgtgtggc 51120 gccgacatat atcataacac ggttgtgtta cagagcgtgt ttattaaaaa taactatgtt 51180 tgttacaaaa acgacgaacg tacaatcatg aatatttgcg ctttgccctc tgagtttctg 51240 tttccagaac atttgctcga catgttcatt gaatgataat ataaatagag cgcatttgat 51300 tgcatgcaat cagtgtttta ttaattttag agcaacatgt acgataaatt tatgatctat 51360 cttcacttga atgggctgca cggagaagca aaatactaca aatatttaat gtctcaaatg 51420 gattttgaaa atcaagtagc cgatgaaatc aagcggtttt gtgaaactcg tctgaaaccg 51480 gcaatcagtt gcaacacttt aactgcggaa agtctcaata cgctcgtaga cagcgtagtc 51540 tgcaaaaatg gactgttaaa tccttacgcc aaagaagtac agtttgcttt gcaatatctt 51600 tttgacgatg acgaaatatc caaacgagat caagatggct ttaaactatt tttattacat 51660 aattatgaca ggtgtgaaaa tatggaagaa tattttttaa ttaacaattt tagcatagca 51720 gactacgaat ttgaagacat gtttgaaatt gttcgtattg attgtagaga tctgttatta 51780 cttcttgcta aatataatat gtaattaaaa ttttgtttgt tttattaaaa tcctggatta 51840 aaaaatgacg aataatttga tttgcgtgca cgccaacaag attcttcgtc attatgatca 51900 atgcgtgcat caagtttatg cttttgtaat tggcttctga ccactttagc catttgagcg 51960 tatctgcatt cgtcgtctag agtttcaaac accagatcgg cgcaattata aaatccttca 52020 cccacgggat ctatgcgctg ccaacgcaca tacattacaa attgatttga cctgtacggt 52080 attactacgg gtatagaata gactagactg ttgtcacata atgaatcgcc cggatttgga 52140 attaaatttg aatcgttacc acctatgtat tctaattcgt tccaagttat tggattgcga 52200 cgatcccagt ttgatttagt aataaacact tcaaaataac tgggctcgtg tatggctgtt 52260 ggacaaaaat gaacattcat ctgataaacc ggttgatagc gatttaaata tagcgtattt 52320 ggcctccagt tgttaaaagg ttcgtccatt ccgcttttat caccaaacac agaattgcga 52380 tcgtttgaac cggcaccgca aagtgtgtgc ggcacaaccc tttgttcgat taggtcaaaa 52440 tcgtcataat taggaccggc cacagccgcg tattccatat actgttgaaa catgtattgc 52500 gctgtggaag cggccgcccc ggattctaaa tcgagagctc gatatttata atagactgat 52560 ttgtaagcat tgcggcacgc ggcgtcggga atgttatcgc cattgtcggg ccaataaaag 52620 tttccatctt taaaacattt atattgacgg gccgtcggca cggacaaata gccgtgagag 52680 cgcactgccg gcgcgtgaat cgcagcaaac aatgcaatta ataatgcaat cattatgatt 52740 atacttatag aacactaatc ggaataataa ccgctgtcgt aatcttggtc aaaaacgtta 52800 tgttgaaaca taataacacc ttacagtaac atacaataaa acaacatagt atcgtatata 52860 attataaact ttattttttc attttataca aacaaaattt atacgtattg ttagcacatt 52920 gagtgtcatt ttcgctgtct gaactatcac aatcatcgtc atcatcatca tcattgtcat 52980 cgtcgtcgtc acgtttgcgt ttgacactgc attttttttg gttaattttc actaacactg 53040 gttcttttcg atcgtacaat tgattctgca tgtacttttg catgatcgcg gtaaaacact 53100 ttgcaatttt atccttttgt tcgtcgccaa atatttccag caactcgttc ataaatgtgc 53160 acaaaatgcc catgtgtttt atccagctga ttcgcatttt cactggatcg aacaaacgca 53220 aggggtacgc tttttctgtt accttgcctt cgatgtctat caaaaggtac gggatacgat 53280 ctccgttgcc gggcacaaaa tccgtgcctt tgttaaccaa aatttctcta caatgcctag 53340 ccaccgtaat cacgcgtctt ttgggtgacg gaccctcatt atcgtcagtt gatttgcgtt 53400 ttttgcccgg gttatcgtta taggtcatac taaagctgta gtcggtcaac gattttgatt 53460 tggcaaactc atcatagtat tcataaaaac tagtctgtaa actttgcaaa catttgtcca 53520 tgtccaaatg acgcaatatt tgttccactg ccgtcctaaa cgcgattctc ataaaaacgg 53580 gcatatcctt tttaactaac caacccttgt atacgatttt attctcactg ttgagatagc 53640 aatatttttt cttttttaat agtattaaaa ctttcattaa attttcaaat gccattttgt 53700 aaccgtccgt gaatgagtta ttaacgcgtg tctcaacatg tgtgcatatt tgttttaatg 53760 tgtcggtttc gttggatatt tcgttatagt taaatgtggg caaaacaaat gtagaatctg 53820 tgtcgccgta cacaacttta aaagtgatgc tgcccagatt gaatttttct aaaatctcag 53880 ggtcgttgct caaaccttca atcagagaaa tggccagccg caactgattg cgaccaactc 53940 tagtgatgta gtttgcaagc actttgtaaa aaatgccata ataaccgtat atgctattgg 54000 cggtgcgctt cacggaattt tgtttttgat cgtacagatc gtacaagaat gccgattcgc 54060 tttgattgtc gcgattcttt ttaaatttgc acctttcgct taacaatttt aatagcaatt 54120 taacaactat tgcacgcgaa ttgtggttca aatacacgtt gccgtcttcg cataaaatta 54180 aattggacaa acaagcacaa atggctatca ttatagtcaa gtacaaagaa ttaaaatcga 54240 gagaaaacgc gttcttgtaa atgcctgcac gaggttttaa cactttgccg cctttgtact 54300 tgaccgtttg attggcgggt cccaaattga tggcatcttt aggtatgttt tttagaggta 54360 tcaattttct tttgagatta gaaatacccg ctgcggcttt gtcggctttg aattggcccg 54420 atattattga cagatcgttt ttgttaaaaa aatacgggtc aggctcctct ttgccggtgc 54480 tctcgttaat gcgcgtgttt gtgatggctg cgtaaaagca cgccacgcta atcaaatgcg 54540 aaatattaca tatcacgtcg tctgtacaca aacgatgcaa tatacattgc gaatatacag 54600 aatcggccat tttcaatttg acaaacaatt ttatcggcaa catgcaatcc tgcacgttgt 54660 acttggcaat cacgtccagc cgtcgagtgt tgtacatctt gaccatttcg gtccaaggca 54720 aatcgatttt gttttcaccc aaatagtaac tactgattgt gttcaattga aagttttcaa 54780 ctttatgctg attagaatcg ctgctgaaaa atttatacaa atcaatgtga atgtaatagt 54840 taaaataata cgtgtccact ttgttgccca acttgtttat aaacagcttt gtcgtcggcg 54900 ccgcagccgg caaatcgtaa cgctttaata gcattttggt tttattcaat cgtccaagta 54960 tatagggcag atcaaatacg tctccgttaa aatccaaaat cacatcggga tttgtaattt 55020 ttatcatgtc aaaaaacgct gtaatcatgt cgatttcatt ttgaaacatg accacatacg 55080 tgtcatcgtc ataggtctct ggaatctggg tcggcagctt gtgatacata aaacaaaatt 55140 ttgcatactc gtcgtttttg tacaccacaa atcctataga cattatgcaa tcaaccgatg 55200 ctttcgacat gttgtggccg tccgaatgag tctcaatgtc atagcacgac aaaacgggca 55260 tgatgccgct ggttaaagtc atttcatcga ccaactcaaa gtcttcatta aaatgttgca 55320 aattaaacat gcgcgtcgtc gatccaccga catagttatt ttggcagcgt tgtgttttct 55380 tgaatcgcat ataggcgcct tccacaaacg gcgtttgcat gtgtacgcga ttaacgttgt 55440 gaagaaactt gtccaaacac gccgcgttgt ccgatggcgc tgctttgttt ctttcgtatt 55500 taatcacgtt tatcttgttc aaataatttc cttccacgcc cggcgccaca aacgtggtgt 55560 agctgatgca cttgttgcgg caagacggaa atatgtgctt gtcgtagcat tgtttgtaag 55620 aatacaaatt tagttttact ttaaagtaaa actgcagcac tcgttctttg atatttgtat 55680 tacaaaatgc aaacaagcaa ccttgttttt catcgtaatg caaacgaatg atacgaaacg 55740 tatcggctga agtaatattg aattctcctg gttttgcata ttctgcaaag cgcgttttga 55800 gttcattgta aggatatatt ttcattttta aatatgcagc gatggcccaa atatggaggc 55860 acagacgtca acacgcgcac tgtacacgat ttgttaaaca ccataaacac catgagtgct 55920 cgaatcaaaa ctctggagcg gtatgagcac gctttgcgag agattcacaa agtcgttgta 55980 attttgaaac cgtccgcgaa cacacatagc tttgaacccg acgctctgcc ggcgttgatt 56040 atgcaatttt tatcggattt cgccggccga gatatcaaca cgttgacgca caacatcaac 56100 tacaagtacg attacaatta tccgccggcg cccgtgcccg cgatgcaacc accgccaccg 56160 cctcctcaac cccccgcgcc acctcaacca ccgtattaca acaattatcc gtattatccg 56220 ccgtatccgt tttcgacacc gccgccaaca cagccgccag aatcgaacgt cgcgggcgtc 56280 ggcggctcgc aaagtttgaa tcaaatcacg ttgactaacg aggaggagtc tgaactggcg 56340 gctttattta aaaacatgca aacgaacatg acttgggaac ttgttcaaaa tttcgttgaa 56400 gtgttaatca ggatcgtacg cgtgcacgta gtaaacaacg tgaccatgat taacgttata 56460 tcgtctataa cttccgttcg aacattaatt gattacaatt ttacagaatt tattagatgc 56520 gtataccaaa aaacaaacat acgttttgca atagatcagt atctgtgcac taacatagtt 56580 acgtttatag atttttttac tagagtcttt tatttggtga tgcgaacaaa ttttcagttc 56640 accacttttg accaattgac ccaatactct aacgaacttt acacaagaat tcaaacgagc 56700 atacttcaaa gcgcggctcc tctttctcct ccgaccgtgg aaacggtcaa cagcgatatc 56760 gtcatttcaa atttgcaaga acaattaaaa agagaacgcg ctttgatgca acaaatcagc 56820 gagcaacata gaattgcaaa cgaaagagtg gaaactctgc aatcgcaata cgacgagttg 56880 gatttaaagt ataaagagat atttgaagac aaaagtgaat tcgcacaaca aaaaagtgaa 56940 aacgtgcgaa aaattaaaca attagagaga tccaacaaag aactcaacga caccgtacag 57000 aaattgagag atgaaaatgc cgaaagattg tctgaaatac aattgcaaaa aggcgatttg 57060 gacgaatata aaaacatgaa tcgccagttg aacgaggaca tttataaact caaaagaaga 57120 atagaatcga catttgataa agattacgtc gaaaccttga acgataaaat tgaatcgttg 57180 gaaaagcaat tggatgataa acaaaattta aaccgggaac taagaagcag catttcaaaa 57240 atagacgaaa ctacacagag gtacaaactt gacgccaaag atattatgga actcaaacag 57300 tcggtatcga ttaaagatca agaaattgcc atgaaaaacg ctcaatattt agaattgagt 57360 gctatatatc aacaaactgt aaatgaatta actgcaacta aaaatgaatt gtctcaagtc 57420 gcgacaacca atcaaagttt atttgcagaa aatgaagaat ctaaagtgct tttagaaggc 57480 acgttggcgt ttatagatag cttttatcaa ataattatgc agattgaaaa acctgattac 57540 gtgccgattt ctaaaccaca gcttacagca caagaaagta tatatcaaac ggattatatc 57600 aaagattggt tgcaaaaatt gaggtctaaa ctgtcaaacg ccgacgttgc caatttgcaa 57660 tcagtttccg aattgagtga tttaaaaagt caaataattt ctattgtacc acgaaatatt 57720 gtaaatcgaa ttttaaaaga aaattataaa gtaaaagtag aaaatgtcaa tgcagaatta 57780 ctggaaagtg ttgctgtcac aagtgctgta agcgctttag tacagcaata tgaacgatca 57840 gaaaagcaaa acgttaaact tagacaagaa ttcgaaataa aattaaacga tttacaaaga 57900 ttattggagc aaaatcagac tgattttgag tcaatatcag agtttatctc acgagatccg 57960 gctttcaaca gaaatttaaa tgacgagcga ttccaaaact tgaggcaaca atacgacgaa 58020 atgtctagta aatattcagc cttggaaacg actaaaatta aagagatgga gtctattgca 58080 gatcaggctg tcaaatctga aatgagtaaa ttaaacacac aactagatga attaaactct 58140 ttatttgtta aatataatcg taaagctcaa gacatatttg agtggaaaac tagcatgctt 58200 aaaaggtacg aaacgttggc gcgaacaaca gcggccagcg ttcaaccaaa cgtcgaatag 58260 aattacaaaa atttatattc attttcatct tcgtcatact tcaacagtcc caacacgttc 58320 atgttgtgat tctcgccgtt ttcgacagtt acgtaaatag ttactttgat taaattatct 58380 tccagcagca ttgagatttg attgaaatcc gcacatagct tttgtagcga atccgcttct 58440 ttttttttat ttgtgttgac gtagaaaaca gatttgttcc atttgcccaa gtcggaagag 58500 gtagaacagt catccgaatc ggcaatgttc aactcgtcgc ttttaaactg cacaataaac 58560 ttgttatcgc ccatgtcatt ttcttccaat tcgcttttta acacatttac attgtacgaa 58620 gcaacgtgtt tgttcgatcg actaatgttg atctttgcgt ttgtgcaatt ttgcaaattt 58680 gaatatgctt cgctttcttt agcctcgcac aattcgatgc gcgtagagtt gaccacgttc 58740 caattcatgt acacgtttga tccattaaaa atttgttgac actttatact gtaaatggta 58800 aagatttggt tttcattgtc ttttaaatat ttaaacacct cattgatgtc gtcagacccc 58860 tttatattgt tcttgaatag atttattagt gttttcgcat tgacagaaca ttccacttga 58920 accacgtcgg gatcgtcgtt gagatttttg tacacaacct caaaaacaac tttgtacaaa 58980 ccgctgttga ttttcttgta gataaatttg tactttacaa taatattgac gccatcttca 59040 ttttcaaaat gtttgttagt caaatagtcg ctcatggggg ttgcagtttc aatttccatt 59100 tcacattctt tgtattcgtt gatctgaatc atttgactaa actttgtttt cacataattt 59160 aaactaatgt catagcactt gccttcttcc atgtctttga aagattgcga atcgccgtag 59220 tattcttgaa ttttgttgtc ggacattatt cgaaaagtgt aatggtattc attatcgata 59280 ctcaacgtca ttttgctcat caatttacca ctaatccttt tgtaattttc tctaatcttc 59340 ttggggctac tggccatagc catgcgtttt ataagcggct caccgctact ttctccagac 59400 aaagatcttt tggtcgccat attgctgttg tcgatatgtg ggaatctatc cgatggcaaa 59460 tactgaatgg cgacgaaatc gaagtgtcgc cagagcaccg ttcgttagcg tggagggagt 59520 tgattataaa cgtggccagc aacacgccgc tcgacaacac gttcagaaca atgtttcaaa 59580 aagccgattt tgaaaatttc gactacaaca cgccgattgt gtacaattta aaaacaaaaa 59640 ctttaacaat gtacaacgag agaataagag cggctctgaa cagacccgtc cgatttaacg 59700 atcaaacggt caatgttaat attgcgtacg tatttttgtt ctttatttgt atagttttgc 59760 tgagcgtgtt ggccgtcttt ttcgacacaa acattgcgac cgacacgaag agtaaaaatg 59820 ttgcagcaaa aattaaataa actcaaagat ggtttgaaca cgttcagcag caagtcggtg 59880 gtttgcgctc gctcaaaatt atttgacaaa cgcccaacgc gcagacctag atgttggcga 59940 aaactatcag agatcgacaa aaagtttcac gtttgccgac acgttgacac gtttttggat 60000 ttgtgcggcg gaccgggcga gtttgccaac tataccatgt cgttgaaccc gctttgcaaa 60060 gcgtatggcg tcacgttgac aaacaactcg gtgtgcgtgt acaaaccgac agtgcgcaaa 60120 cgcaaaaatt tcacaaccat tacggggccc gacaagtcag gcgacgtgtt tgataaaaat 60180 gttgtatttg agattagcat caagtgtggc aacgcgtgcg atctggtgtt ggcagatggc 60240 tcggttgacg ttaatggacg cgaaaacgaa caagaacgtc tcaactttga tttgatcatg 60300 tgcgagacgc agctaatttt aatttgcctg cgtcccggcg gcaattgcgt tttaaaagtt 60360 ttcgacgcgt ttgaacacga aacgatccaa atgctaaaca agtttgttaa ccatttcgaa 60420 aaatgggttt tatacaaacc gccttcttct cggcctgcca attccgaacg ctatttaatt 60480 tgtttcaata aattagttag accgtattgt aacaattatg tcaacgagtt ggaaaaacag 60540 tttgaaaaat attatcgcat acaattaaaa aacttaaaca agttgataaa cttgttgaaa 60600 atataacgtg tgtataaaaa gccagcggct tcaaatcagg catcattcaa catggattcg 60660 ctagccaatt tgtgcttgaa aaccctgcct tacaagtttg agccgcctaa gtttttacga 60720 acaaaatatt gcgacgcatg tcgctacaga tttttaccaa aattttctga tgaaaaattt 60780 tgtggacaat gcatatgcaa catatgcaac aatccaaaaa atatagattg tccatcatca 60840 tatatatcga aaattaaacc gaagaaagaa aacaaagaaa tatatattac cagcaacaag 60900 tttaataaaa cgtgcaaaaa cgaatgtaat caacaatcaa accggagatg tttaatttcc 60960 tattttacaa atgaaagttg taaagagctc aattgttgtt ggtttaataa aaactgttac 61020 atgtgtttgg aatataaaaa gaatttatac aatgtaaatt tgtatacgat tgatggtcat 61080 tgtccttcgt ttaaagccgt ttgtttttca tgtataaaaa gaatcaaaac gtgccaagtt 61140 tgcaatcaac ctttattgaa aatgtacaaa gagaagcaag aagagcgttt gaagatgcag 61200 tcgctgtacg caacgttggc cgatgtagat ttaaaaatat tagacattta cgatgtcgac 61260 aattattcta gaaaaatgat attgtgtgct caatgtcata tatttgcacg ctgtttttgt 61320 accaatacca tgcaatgttt ttgtcctcga cagggttata agtgtgaatg tatatgccga 61380 cgatctaaat attttaaaaa taatgtattg tgtgttaaaa gtaaagcggc ttgttttaat 61440 aaaatgaaaa taaaacgtgt tccaaaatgg aagcatagtg tagattatac tttcaaaagt 61500 atatacaagt taataaatgt ttaattttaa ggatattgtt atggaataaa ctataaaatg 61560 aatttgatgc aatttaattt tttgatactt tccacagacg gtagattcag aacgatggca 61620 aacatgtcgc tagacaatga gtacaaactt gaattggcca aaacggggct gttttctcac 61680 aataacctga ttaaatgtat aggctgtcgc acgattttgg acaagattaa cgccaagcaa 61740 attaaacgac acacgtattc gaattattgc atatcgtcaa ccaacgcgtt gatgttcaat 61800 gaatcgatga gaaaaaaatc atttacgagt tttaaaagct ctcggcgtca gtttgcatca 61860 caatccgtgg tcgttgacat gttggctcgt cgcggcttct attattttgg caaagccggc 61920 catttgcgtt gttccggatg ccatatagtt tttaaatata aaagcgtaga cgacgcccaa 61980 cgccggcaca aacaaaattg caagtttctc aacgcaatag aagactattc cgtcaatgaa 62040 caatttggca aactcgatgt tgcggaaaaa gaaatactgg ctgccgattt gattcctccg 62100 cggctaagcg ttaaaccttc ggcgccgccc gccgaaccgc taactcaaca ggtctccgaa 62160 tgcaaagttt gttttgatag agaaaaatcg gtgtgtttca tgccgtgccg tcacctggct 62220 gtgtgcacgg aatgttcgcg tcggtgcaag cgttgttgtg tgtgcaacgc aaaaattatg 62280 cagcgcatcg aaacattacc tcagtaaaca ttgcaaacga ctacgacatt ctttaaaaat 62340 aagctatata taaatattgc attgtatgac aaaaaaatta ttaacctact gcaaagtaaa 62400 acttgtaaaa ggcttttcaa aaaaatttgc gagtttattt tgtcgctgcg tcgtgtcgca 62460 tctaagcgac gaagacgaca gcgacggtga tcgctattat cagtataata acaattgtaa 62520 tttcatatac ataaatattg taaaataaaa gacatattat tgtacataat gttttattgt 62580 aattaaatta atacaccaat ttaaacacat gttgatgttg ttgtgaataa tttttaaatt 62640 tttacttttt tcgtcaaaca ctatggcgtt gctttcgatt agttttttcg ttagcatttc 62700 atctaaaaaa tcaaactgtt tgcccggcgc gtttagggat tctatggtgt agtcgggcgt 62760 gtcgctgttt agatattggt ccacttcgcg cattatgtcc aagacgttgt tctgcaaatg 62820 aatgagcttt gtcaccacgt ccacggacgt gttcatgttt cttttttgaa aactaaattg 62880 caacaattgt acgtgtccac tatacaattc ggcttaatat actcgtcggc gcaatcgtat 62940 ttgcaatcca atttcgtgtt caacaaattg gtgatgatat ctttgaacgt gcacgttttc 63000 aatttgtcct tatcggccaa cgcaagtttc aattcgctct gtaaagtttc taaaattttg 63060 tctttattgt tgtcaaattc gtgcgtgttg cgttccaacc acaatttgaa cggctcgtcg 63120 acaaaaatgc tgcgcaacac ctcgtacaac tgtctgccta acgtgtacac ttgctcgtat 63180 tctttcatgc tgacctcttt gctaacgtac attactaaaa aatctacaag tattttcaaa 63240 catttgtaat aggcgacgta ttttgattta agttttaaac cgtccaccgt gtattcgtcc 63300 acgttcgcat cgaccacttt tcgattatta tcgccgcttg ttgccggcgc gtcggcctgt 63360 tcggttttaa ctatatccgg ttcaatattt aaagtttcaa aagatttaat ggcattcata 63420 aaatcatctt tttgctttgg cgtggtcaat ggtaaatcta tcgaggagtt gtcgtccgtg 63480 tgctcttcgg gcacgctgtt cagacgtaac gtaatctttt tgggatcgtc ttcatcgggt 63540 atcaaatcgg ctttaatttt attagaattg agcaacgaca tggtggtcgc ttgtaaattt 63600 aataaattaa ttaaagactg aaattgtata ttgcacaaat ttattttcat ttttattgat 63660 cttactatta atacgctggc agttggtatg cttcatccat ttttgtgact agaaaatttg 63720 ctaaaaaact gagctcgtcc tgtgttaaaa cgttgtcgtc cacgaatcta tgcaatgtaa 63780 atgttacact gacattgttt aacaatgcat gtattaaaaa atcaacctgt cgcctactga 63840 gtttattaga agagtcgacc gtttctacta gtttgtagat tttgttattt tcaatttcat 63900 tgtttaaaaa catgttaact actcgtttga gtttaagcga aaaatccttg tccggataga 63960 cttgttcgca cagccaattg ctaagagtgg ttttgaccac ggacaccttg gtggtgaacg 64020 tcgtcgattt gaccagttcg gtgaaaaagt ttttcattaa attggacatt ttaacaaaca 64080 cttatcaatc tattgagctg gtatttttgt ttagaatcgc atcaagcgct tgctcgatct 64140 ccaatttttt tcggacgctc ttagctttat gactcggtat gtcttctacg gtagactcgg 64200 tgttcttact tataatggcc gggctgacga taataaacac gagaaacaat atgagcagat 64260 acaaaaagat gctgttttcc tttttgtcat acactaggct aaatatggcc agtgcgccca 64320 acaacaaata taaattcatt tttattccct tactctattc gttgcgatag tacaacaacg 64380 attctcccga cgaaccggac gaattgcgat tatgctgcgc gtcgtcgtcg tcgttgttgt 64440 tctcctcttc gctgctcgtt tcgtctaaac ctatattgta tttgttcaag taatgtttgg 64500 tgcttgcgga ggattcgtgg ttcattaatt tggccacttt ttgtaaaggc acgccgctat 64560 tgtataggtt actgctcaaa taatgtctta tcatgttgct gcgcggccgt tccatctcga 64620 cgcccgactc ttcaaggagt cgcctgaaat ctttgaaggg cgtcgaggtg tttttagata 64680 tttgcaaaat ggtcgggttt cgtgaataaa tctcgcgtgc caattccaac ggtttcattt 64740 tgatgttgtt gagtgtgtta ttacgactgc gttttcgctt taaattaatc gtgtcgctgt 64800 gcagttttcc tcttttaatt agcacgttga gatcgtccac gctgagttgg cgcgcttcgt 64860 tgattcgcat acccgtccct aacatgatgc aaaacactat cgcgccccta attagaccgc 64920 ggtcgtgaac ataatcgctg ttgagcattt taattttatc attaataaaa tttaatatgg 64980 tatctattac gtttttaagc attaaattct tttccttttc cctgatattt ttgagctcct 65040 tgtcgcgcgg cagcataacc atgcggggaa ttttgtattc gggcaagttc atcatgttgg 65100 tgtaaaagtt tatagtcaac tgtagtgttt ctttggtgac cgagcgaagt tcgagcatgc 65160 gcctgcacag ttcttgggga tcaatgagaa gtgtttggtt ttctatcgag tcaaactcct 65220 tgtccaacga gtacgacatg tcttccaggt gaacatcgtc taccgagcag tacacaattt 65280 taatgaatcg agacttgtaa ctttttaaag tggtgggcgc aaacggtttg gggaacatgt 65340 acttgctcca cagactgttg tttttcacct cgtcgggcgt gcatcgttgc cgatcggtgg 65400 ccaaatcgaa cacggactcg aaccggggag cggattgaat ttttattttc caagaattaa 65460 aattgttttc gttgcgaaca ttaaaaccgt tcattgtggt taatcaaatt tattaaaaac 65520 aaaaggagaa tcggtgtcaa tactatccga atattgttgt tgttctctta atattacgaa 65580 ataatatatt acatacagca gtaagaataa agctataaaa gcgactacac taattaaaat 65640 tataattccc gccgacacgt tgctcgtcgt gttgtcatag cccaccatgt cgtttattgg 65700 cattttgtga acgggctcgc taaattgttg cggttcgctg gcagtatcgt cgttgagcgc 65760 caatttcaac gggatgtatt ccaccttttc gtggttgccc aaccgatagt agggcacgtc 65820 caaattcatg tttacaactt atttgctaac aggaatttat gcaacaaaag tggtttggct 65880 ttgatgagac gcaatttgaa atacttgctg catttacgct taagattgta ttccatgcgg 65940 gcggcggtct tgtagtcgta cgcgctcgcg ctgtgataca cgagccgtaa attggttgcg 66000 ttgcgcaaac acttggcgcc ttgtttgttc gaatgctgtt ttatgcgtct gttaagattg 66060 ctcgtgatgc ccgtgtacaa ttttccattg tcttgccgca gaatgtacac gcaccacacc 66120 ttgttggtgt acagagtcgt cgccatgatt atgcagtgcg ccctttcgtg ttcggccgag 66180 tggcgttagg cgcagccgcg gcaataatcg cgttggcgtc cttgttgtaa tttatttgtt 66240 gaaaaataaa acgtcttaga gtttcgtttt ggaacgccaa ttcggtcaag ctctcctggc 66300 aagcgctttt ggtcaaatga gcggccggcg aattgaccgc gttggcggcc gacgttaaga 66360 aggtggcgtt ctggaacatg ctgggctgct tgccggctcg cgtcgccagc tcggccatgt 66420 aattgaatat gttggcagac gcagatagcg gcgccaaaaa cgcaacgttc tcttttaaac 66480 tcatgactcg cgccctgttt ttttcgttca gcacgtagtg gtagtaatcg ccgccgccgg 66540 caaacagatc gtcaatcacg gcgttgatca gatcgttgat catgttgatg tgcggaaagc 66600 gacgcgactc gactgcgctc tgtatgtttg gcggcagagt ggcgtgcttg agcaacagag 66660 tcatgtaatt gttggccagc tgctgattga aaggtaacgg aatgggaatg ttgcacgtca 66720 ccgcttccgc caccatgtac tggacggcca gactgagttg tttggcggcc tcggccaaag 66780 cgtctttgcc caacatatca gcgccaccgt tgtaaaactt ttgcgcgtac gccggcagcg 66840 aatttagcac aaacgatggc tgaaatatat ttgaatcgct cgacagggac tcggccgcgt 66900 tgctctgtcc caactctttt tgcaaccgaa tcaggtggcg tatcatggtt tcctccgatt 66960 caaaccgctt taccacgttt acgctgattg ggttcgtgtc gatgcacatg tcacgaatag 67020 tgtttataaa aagaatcatg agaggactaa gttctgacat gtcattgcac ctgtaatatc 67080 taataatctt ttgaacaaaa tccacacatt tgttgtacca aatagattca ccggcgtcga 67140 gcgtcggttc tttgctcttg ttgtacggtg caatcgctac cgagtttgtg ctgttgctgc 67200 ggctcgtgta atccatcctg ttgtcgcgcg tggcgacggt cgtaggcacc gtcgccggcg 67260 gcacgtaccc gggcgcgttg taagtttgcg cgctggtgaa tatggccgtt gccggattag 67320 agggatacct cagcggcgga ggggtgttgt aataaaaatt gccacgttca tctgtcatac 67380 tttttatttg tactcttatg attacaaaac tcaatatacg gattacttat aatatagttg 67440 ttgtgacaaa aaagcgataa taaaattaac aaaattatca acaagttaat catggaaaat 67500 ttttcaacgt tgaataacaa caacaaaatg gcgcaggtca acagcaccgt ttgaaaactg 67560 acgcgccgac acaaaatgct ttcgcaattt ctaaaagcca cattaaacga attttcacct 67620 ttgatataat cacgcagttc ttttttacaa cattcgtcgc acaaaattaa cacctttata 67680 atgaggccgt cggtgtgtat cgtttgaaat gtccgcggtt gactgcctgg atgaaattca 67740 aacgagtacc cagtggacac gtgtatctgt gcaaaataat gggctaatat cgaggcgccc 67800 gtttttttaa cctttacttt tgatatttta ataacattaa tgttgttatt tgcgtaatca 67860 gagtttttat tgtggtgatc atcgtacaaa taatgaagca acagttcact atcgtattta 67920 atcttgttta gcgttgtcaa gtttttgttt cttaggcgtt ggagcgtctc cgtcgtcgat 67980 attttcttcg aaatcgagtc caacaacgtc ggcgtttcct tcttgctcat cgatagcggc 68040 ggcggaggcg gcctctccgt cgtcgtcatt ctcggtttct acagtgcgtt tgggcgacga 68100 cgtgtgtaca gcagcgtccg tcttactatt atcggaccgc caaatttttg tttgaaataa 68160 catttggccc ttgttcaact ttatttcggc gcagttaaac attattgcat taagatcata 68220 ttcgccgttt tgcaccaaat tgcacaaaac accatagttg ccgcacgaca ctgtagaata 68280 ggcgtttttg tacaacaatc tgagttgcgg cgagctagcc accttgataa tatgggcgcc 68340 aacgccccgt ttttttaagt aatattcgtc ttcaattata aaatctagta cgttttcatc 68400 ttcactgttg atttgggcgt tcacgatgat gtctggcgta atgttgctca tgcttgccat 68460 ttttcttata atagcgttta ctttaatgta tttggcaatt tattttgaat ttgacgaaac 68520 gactttcacc aagcggctcc aagtgatgac tgaatatgtg aagcgcacca acgcagacga 68580 acccacaccc gacgtaatag gctacgtgtc ggatattatg caaaacactt atattgtaac 68640 gtggttcaac accgtcgacc tttccaccta tcacgaaagc gtgcatgatg accggattga 68700 aatttttgat ttcttaaatc aaaaatttca acctgttgat cgaatcgtac acgatcgcgt 68760 tagagcaaat gatgaaaatc ccaacgagtt tattttgagc ggcgacaagg ccgacgtgac 68820 catgaaatgc cccgcatatt ttaactttga ttacgcacaa ctaaaatgtg ttcccgtgcc 68880 gccgtgcgac aacaagtctg ccggtcttta tcccatggac gagcgtttgc tggacacgtt 68940 ggtgttgaac caacacttgg acaaagatta ttctaccaac gcgcacttgt atcatcccac 69000 gttctatctt aggtgttttg caaacggagc gcacgcagtc gaagaatgtc cagataatta 69060 cacgtttgac gcggaaaccg gccagtgtaa agttaacgaa ttgtgtgaaa acaggccaga 69120 cggctatata ctatcatact ttccctccaa tttgctcgtc aaccagttta tgcagtgcgt 69180 aaatgggcgc cacgtggtgg gcgaatgccc cgcgaataaa atatttgatc gcaacttaat 69240 gtcgtgcgtg gaagcgcatc cgtgcgcgtt taacggcgcc ggacacacgt acataacggc 69300 cgatatcggc gacacgcaat atttcaaatg tttgaataat aacgagtcac aactgataac 69360 gtgcatcaac cggatcagaa actctgacaa ccagtacgag tgttccggcg actccagatg 69420 catagattta cccaacggta cgggccaaca tgtattcaaa cacgttgacg acgatatttc 69480 gtacaacagt ggccaattgg tgtgcgataa ttttgaagtt atttccgaca tcgaatgtga 69540 tcaatcaaac gtgtttgaaa acgcgttgtt tatggacaaa tttagattaa acatgcaatt 69600 cccaactgag gtgtttgacg gcaccgcgtg cgtgccagcc accgcggaca atgtcaactt 69660 tttacgttcc acgtttgcca ttgaaaatat tccaaaccat tatggcatcg acatgcaaac 69720 ctccatgttg ggcacgaccg aaatggttaa acagttggtt tccaaagatt tgtcgttaaa 69780 caacgacgcc atctttgctc aatggctttt gtatgcgaga gacaaagacg ccatcgggct 69840 taacccgttc accggcgagc ctatcgactg ttttggagac aacttgtacg atgtgtttga 69900 cgctagacgc gcaaacattt gtaacgattc gggaacgagc gttttaaaaa cgctcaattt 69960 tggcgatggc gagtttttaa acgtattgag cagcacgctg accggaaaag atgaggatta 70020 tcgccaattt tgtgctatat cctacgaaaa cggccaaaaa atcgtagaaa acgaacattt 70080 tcagcgacgt atattgacaa atatactaca gtcggacgtt tgtgccgacc tatatactac 70140 actttaccaa aaatatacta cactaaactc taaatatact acaactccac ttcaatataa 70200 ccacactctc gtaaaacggc ccaaaaatat cgaaatatat ggggcaaata cacgtttaaa 70260 aaacgctacg attccaaaaa acgctgcaac tattccgccc gtgtttaatc cctttgaaaa 70320 ccagccaaat aacaggcaaa acgattctat tctacccctg tttaaccctt ttcaaacgac 70380 cgacgccgta tggtacagcg aaccaggtgg cgacgacgac cattgggtag tggcgccgcc 70440 aaccgcacca cctccaccgc ccgagccaga accagagcca gaacccgagc cagaacccga 70500 gccagagtta ccgtcaccgc taatattaga caacaaagat ttattttatt catgccacta 70560 ctcggttccg tttttcaagc taaccagttg tcatgcggaa aatgacgtca ttattgatgc 70620 tttaaacgag ttacgcaaca acgttaaagt ggacgctgat tgcgaattgg ccaaagacct 70680 atcgcacgtt ttgaacgcgt acgcttatgt gggcaatggg attggttgta gatccgcgta 70740 cgacggagat gcgatagtgg taaaaaaaga agccgtgcct agtcacgtgt acgccaacct 70800 gaacacgcaa tccaacgacg gcgtcaaata caaccgttgg ttgcacgtca aaaacggcca 70860 atacatggcg tgtcccgaag aattgtacga taacaacgaa tttaaatgta acatagaatc 70920 ggataaatta tactatttgg ataatttaca agaagattcc attgtataaa cattttatgt 70980 cgaaaacaaa tgacatcatt ccggatcatg atttacgcgt agaattctac ttgtaaagca 71040 agttaaaata agccgtgtgc aaaaatgaca tcagacaaat gacatcatct acctatcatg 71100 atcatgttaa taatcatgtt ttaaaatgac atcagcttat gactaataat tgatcgtgcg 71160 ttacaagtag aattctactc gtaaagcgag tttagttttg aaaaacaaat gagtcatcat 71220 taaacatgtt aataatcgtg tataaaggat gacatcatcc actaatcgtg cgttacaagt 71280 agaattctac tcgtaaagcg agttcggttt tgaaaaacaa atgacatcat ttcttgattg 71340 tgttttacac gtagaattct actcgtaaag tatgttcagt ttaaaaaaca aatgacatca 71400 ttttacagat gacatcattt cttgattatg ttttacaagt agaattctac tcgtaaagca 71460 agtttagttt taaaaaacaa atgacatcat ctcttgatta tgttttacaa gtagaattct 71520 actcgtaaag cgagtttagt tttgaaaaac aaatgacatc atctcttgat tatgttttac 71580 aagtagaatt ctactcgtaa agcgagttta gttttcaaaa acaaatgaca tcatcccttg 71640 atcatgcgtt acaagtagaa ttctactcgt aaagcgagtt gaattttgat tacaaatatt 71700 ttgtttatga tagcaagtat aaataaccga acaaagttaa atttttttca tttacttgtc 71760 accatgtttc gaatataccc taataacaca actgtgcccg gttgtttagt gggtgacatt 71820 attcaagttc gttataaaga tgtatcacat attcgctttt tgtcagatta tttatctttg 71880 atgcctaacg ttgcgattgt aaacgaatat ggacctaaca accagttagt aataaaacgc 71940 aaaaacaaat cgctgaaaag cttgcaagat ttgtgtctgg acaaaatagc cgtttcgctc 72000 aagaaacctt ttcgtcagtt aaaatcgtta aatgctgttt gtttgatgcg agacattata 72060 ttttcgctgg gtttaccaat tatttttaat ccggctttgc tacaaagaaa agtgccgcag 72120 cgcagcgtgg gatatttcat gaattcaaaa ttggaaaggt ttgccaattg tgatcggggt 72180 catgtcgttg aagagaaaca attgcagagt aatttgtata tagattattt ttgtatgatt 72240 tgtggtttaa atgtttttaa aataaaagaa taacaattta cacattgttt tattacatgg 72300 ataatgttgt ttgtttgaca ttaaaggtta tcatggtgca atgattaata ataaaacaat 72360 attatgacat tattttcctg ttattttaca atataaaatc acaccaattg tgcaaagttt 72420 tattatttgt ttgtcgacgg tcgaggggtc agcggcgtgt gcaacaataa aaaacatgaa 72480 gctgttaaca attttgattt tattttattc attttttatg aatttgcaag cgctaccaga 72540 ttaccatcaa gcaaataggt gtgtgttgct gggaactcgc attggatgga acgatgacaa 72600 tagccaagat cccaacgtat attggaaatg gtgttaaata aaagtgaata tattttttat 72660 aaaatttttt atttaaaatt ccaagtaatc cctgcaaaca ttaaacactg taggtatttt 72720 taaatcttgc cacatgcgaa caacgcacgg cctgtcgtcg aacaccgcta ttacattata 72780 ttttcctctg atatagttgt taaacaattt taattttaat aaataatctt tacaagtatc 72840 gtctgaaggc ctcataaaca atttatatga tttaatatca aaatactttt caatccagtt 72900 tcgagtgggc tgttcacaaa ttacgcttct cccgctcata aacacgataa ttgcgtcgtg 72960 gcaatttgcc aaatacttaa cgcaagtaat aacgtctaag cgggcttcat cttgagcaac 73020 tctattatca aaatcataaa acgatctatt tgtgggcaaa gctactgtac cgtctaaatc 73080 acataataca gcgcggggaa atttgtcgcc gacaggaacg taatattcga aattatttac 73140 ctttagaaac tttttatatt gctttttaat agtttctgga tttaatggaa atttatcaga 73200 gcgtttataa ttgcgttcaa gagccgtttc caaagaaacg tccatcaaac gcgttaaaaa 73260 atggtaatta tgcgttgcgg ccattttttg ccacatgtcc accgattgag tgttcaaatt 73320 agtgtcgctg acaaccacgt tggcaccaca ttttgcggct tttaaaaact gttcaatgca 73380 cattttggta atttgttctt ctttagtttg tctacatttc cgcgattggt tatagaaagc 73440 gttcagtttt gtataatcgc cgtttaaaaa caacttaacg cgcacgtcgt ctctgttgat 73500 ttctgtatag ccttttaaac ttttggcata cgtgcttttg cccgaacccg aaatgcctat 73560 caacaccaac aattgttttg aagaaggcaa tttaattgtt ggagcaagtt tattatttaa 73620 tgcctgctta gtcgatacaa attttataat atttttgatc attttaattt tttcaggctc 73680 ggttaatttt aaaaattcgc tctccacatc gatcgtttgt gctttacgac atctgtacgc 73740 taaacatttc cacggcaaag tttgcaccag ttcgttgaaa cgctgttgat tcaaagtcaa 73800 acccgacacc ataatattta ttgtagactc gttggtgaac gtgtttctag catcaacgta 73860 cggtttaatg acacttttta aatgcgggaa aagagctaga aagtcatcgt gttcgccatt 73920 tataacaagc tgcgccaatt tagtaggatt ttcagcacgg ctctgatttt tgtgcatgtt 73980 caaatacacg tcgcttttaa tcttgcatag tggcgcgttg tttttatcgt aaactacaaa 74040 tccttcttcc aaatttttca actgggccgc gtgttcgaca cattcttgca cagacgtaaa 74100 ctcgtaacat ttggggtatt tgcaaaacgg caaattggaa cagtaaaaat aatcgcccgt 74160 ttcgttgttt ctgcttgcca aataccacaa cgttggctgt tcatcgtaaa cggttacaat 74220 tctgttgtgt ttgcttgtta actcaaacat gtgagtcgac gcgcagtcta aatattcgtt 74280 acacaacgct tgaaattgat tgtgggcctc gtcaagttga agagcttgca aaactaaacg 74340 tttaaacgtc acgtctgaca cgcaaaggtt ttctgcaaaa gcacttcctc gggtgctggc 74400 atgccattcg ccgttgtact tgtagatttt aattaaactt ccgtcgattt tttcgtaaaa 74460 cttaaaattc tccttcgatt ggaacagttt gtgatgagca tcttcgccgc cgatattttg 74520 tagcaattct tgaaaattaa agaaacgatc gaaagaacgc gacacaacgg cgtacgtgcg 74580 gctgttaaga attaaaccgc gacattccac gaccacagga tgatctcgat cgcgttcaaa 74640 cgattcgtaa ttaagaacca tcaaatcgtg ttcggtataa tttttaattt tgactttaaa 74700 cttgtcacaa agatttttca ctccgccgtt tgcaagtaga cgcgaaacgt gcaacatgat 74760 tgctgtttaa taatgcatac caatgctaaa ctgtctatta tataaagtgc agtgataact 74820 ttgttatcaa cgcgttcgat gccgacatat ataaacgcaa tgtaacagtt tttgctagta 74880 ccatcgcata caacattatg aatacaaggg gttgtgttaa taataataaa atgatattta 74940 tgaatgcttt gggcttgcaa cctcaaagta aattgaaaat tattgcacat aaaatactag 75000 aaaaatgtaa acgtgacgcg tacacgcgtt tcaagggcgt aaaggcgatc aagaatgaac 75060 taaaaacata caatcttacg ttgcaacaat acaacgaggc gctcaatcag tgcgctttaa 75120 acgatagccg atggcgcgac acaaataatt ggcatcacga tattgaagaa ggtgtgaaaa 75180 taaacaagag acatatatat agagttaatt ttaattctaa aacccaagaa attgaagaat 75240 attattacat taaagtagaa tgttatgtaa acagttaatt aatctacatt tattgtaaca 75300 tttgtggtaa tagtggcgtt ggttatacat ttatatgatt gtaatgttgt gtactcgttt 75360 tgtaataaat ttttgtgttt aatcaattca atatttttat ttgataaaac cttattttcg 75420 ctactcaatt tggcgttttt agacgcaagt tttgcgtaat cgtcattgag cgattttagc 75480 gccttttcag ttgtaattcg tttcagttgc aattctttaa aagatttatg catgttgttg 75540 tagtcgcttt taattttgtc taacttttct tgcatagaaa cgcttgtttg ttgtaatttg 75600 tctaaatcta attgttgttt aatgttgagc tgcgtttgtt cggcaatgtc tacctgtagt 75660 ttttttagta tcgcttgtgc ttcagacagc atagtgtcgt cggcatttgc gttgttgtct 75720 tctgcgtcgt ccaacagact tttttcaaac aacacactgg ccaaagaggc cgcatcaaaa 75780 ttagcgttta ttttattcca ttgtgcgaca ctcgacgcgc tgcatttaat cacatccaca 75840 acgtttcggt ttacgctgta aacgttgaaa tgcaaacttt caaccctaca caagggacat 75900 ggtacttttt ttcgttttct aatcttgcgt atacacattg agcataattg atgtttgcac 75960 gtgtctagtt ctaatacggg tattatagtc aatctgtcta ttggttgcag aaaataattt 76020 ttaatttctg caaccgaaaa acaaatgttg cattgcaatt taacaaactc catttttaga 76080 cggctattcc tccacctgct tcgcctgcaa caccaggcgc aggacctgcc actgcgccgc 76140 cgcccagagt agcgttagga tttgctcttg gtataaagtc gttgcgcaaa aagttgtttt 76200 ctgaattgat tatttggtat cccaaaaaca gcggaacgta cgtcgggtat tcttcgtatc 76260 cgctaagcgt tctgtccagc tcacgtgtgt cgccttcaaa tttcaaaacg tttctaattt 76320 gcaaacgatt gggttgactt ctcataatgt cactgcttct tatcgggttg tacaactcgg 76380 ggccgtcggg cacagacgcg accagacccg tttcgtcaat tatacacgtg gcgcaatttc 76440 taaacctcaa ttcctccgtg tcgatttgca agtactcggg cgctactgcg cgtcgaatca 76500 aattttgcaa aaatccactg taattgttaa ataattgatc gccagcaccg cctcgaagcg 76560 ctcgggcgtt ggtcacgtca aagaaacgca attcgtctcg cgacacccgc gaacaaaacg 76620 tgttcgggtt tgtggtgtcc agaatgcttt ttgtagttgc gtaaacgctg tgtataacgc 76680 gttgcgtgtt gcttgtgaaa ccttcggtat attttagatt gtcgcatata gtgttaactg 76740 cgttttcgtt gttatatatc aaatgaaaga ttagctgttc ggcttgcatc atactgttta 76800 gattaaacac gtcttggtaa ttggttgcgc ttggaattaa aattcgcttg atacctcttt 76860 ctttatttcc aactaaatgc ctagcgatcg tcattttgaa ttgattgtcg tcttcgtcga 76920 aaatgggcaa aaccattttt gacattttaa aacgttttat gaggtggttg ttgcaaataa 76980 accatccatc gtcatgatac gcgtcgggcg aacacggcga tttgtatgtt atgcacgcgt 77040 cgaacgacac gatggacgcg aaaatgcagc gattaactct catttgtcgc ggcgccatac 77100 ccacgggcac tagcgccata ttgttgccgt tataaatatg gactacggcg attttgtgat 77160 tgagaaagaa atctcttatt caataaattt tagccaagat ttgttgtata aaattttaaa 77220 ttcttatatt gttcctaatt attcgctggc acaacaatat ttcgatttgt acgacgaaaa 77280 cggctttcgc actcgtatac ctattcagag cgcttgcaat aacataatat caagcgtgaa 77340 aaagactaat tccaaacaca aaaaatttgt ttattggcct aaagatacca acgcgttggt 77400 gccgttggtg tggagagaaa gcaaagaaat caaactgcct tacaagactc tttcgcacaa 77460 cttgagtaaa ataattaaag tgtacgttta ccaacacgat aaaattgaaa tcaaatttga 77520 acatgtatat ttttcgaaaa gtgacattga tctatttgat tccacgatgg cgaacaagat 77580 atccaaactg ctgactttgt tggaaaatgg ggacgcttca gagacgctgc aaaactcgca 77640 agtgggcagc gatgaaattt tggcccgcat acgtctcgaa tatgaatttg acgacgacgc 77700 gcccgacgac gcgcagctaa acgtgatgtg caacataatt gcggacatgg aagcgttaac 77760 cgacgcgcaa aacatatcac cgttcgtgcc gttgaccacg ttgattgaca agatggcccc 77820 tcgaaaattt gaacgggaac aaaaaatagt gtacggcgac gacgcgttcg acaacgcgtc 77880 cgtaaaaaaa tgggcgctca aattggacgg tatgcggggc agaggtctgt ttatgcgcaa 77940 tttttgcatt attcaaaccg acgatatgca attctacaaa accaaaatgg ccaatctgtt 78000 tgcgctaaac aacattgtgg cctttcaatg cgaggttatg gacaaacaaa agatttacat 78060 tacagatttg ctgcaagtgt ttaaatacaa atacaacaat cgaacacagt acgaatgcgg 78120 cgtgaacgcg tcatacgcta tagatccggt gacggccatc gaatgtataa actacatgaa 78180 caacaacgtg caaagcgtca cgttgaccga cacttgcccc gcaattgaat tacggtttca 78240 gcaatttttt gatccaccgc tacagcagag caattacatg accgtgtccg tggacgggta 78300 tgtcgtgctc gacaccgagt tgagatacgt caaatataaa tggatgccaa caaccgagtt 78360 agagtatgac gccgtgaata agtcgtttaa cacactcaat gggccattga acggtctcat 78420 gattttaacc gacttgccgg agttactgca cgaaaacatt tacgaatgtg taatcacgga 78480 cacgacaata aacgtgttga aacatcgtcg cgaccgaatc gtgccaaatt aaagcacgtt 78540 aagcggatac aacgggcagt ccgagctgtt aaagtcaata caaccatcgt taacaaacga 78600 atacgcattg ttgtgacagc tgaggatata aaaaggaata gagaagtaat tgcaatgaaa 78660 tatcccgtta caattccacg gcacagcgta tgttgctcga gttctatcag ttgcacacaa 78720 cggcctaaga aaatttatta atgcttcatt tgtatctata ttagaaggat aatacatagg 78780 ttcgcccaaa ggactgggag aaggcggcgg cgaaggtgta ggtgtaggag gaataggaga 78840 aggcggcggc gaaggtgtag gtgttggagg aataggagaa ggcggcggcg aaggtgtagg 78900 tgtaggagga ataggagaag gtggaggtgt aggtgtaggt gttggaggta taggtgttgg 78960 aggaggtgta ggtgtaggtg ttggaggtat aggtgttgga ggaggtgtag gcgaaggtgg 79020 agaaggtgta ggagtaggtg gaggtgtagg taacggtaca attggtggag atgtaggtgg 79080 tggtacaatt ggtggatttg gatacaattc ctgaatgtcg tctaatattt ttaaagttaa 79140 taaaattatt ataaataaat ttaatattat tattattatt attatcacaa taatgtacca 79200 catgttgctt aaatataaaa attaaacaaa gaatgttgta ttattgcaaa tttaacaatt 79260 ttttgtattc tccccatgtc atgcgttcgt aatgagcggg cggtttttta tttctttgta 79320 tccacttgta atcgttaatg tggttgtgaa aagtcatact gacgtaggcc attaaatttt 79380 tcatgagcat attatttgac acaactgcaa catctgcgcc tgccgtttct tgctggtacg 79440 aatcgacaaa cgtaatgtct gtgccgtatt tttctttgtc aagtgcaatt tctataagct 79500 caatgtggta aatgatgaaa cctttgacgt tcatataatg atcgcggcac atggcgcact 79560 gtagtatgaa aaatacgttg taaaatagca ccttcattgt tttcaactgc tgcatgacaa 79620 aatctaaact gcttttgtct cgcgtataca ccatatcgtc gatgatgaga ctgagaaagt 79680 gcatggtgtc ccatatggta gtaaacgtgt aagtaaaact cttgggctgg cacgaacgca 79740 aattgagttc tgtggttttg tccataaatt ctatgcgaaa ctgttgcaag tccatgtcgg 79800 gggatgcgtt aatggcccat tcgatcaact gctgcacctc gtacttttga atgtctttgt 79860 atttcatcaa acacgcaaaa tggtataagt aagttgcttg cgaagacaac agtttggtga 79920 ggtgcgtcga tttagaggct cgcaaaaggt ctatgagacg aaacgaatac aacagatagc 79980 tgtctttgta acgagaaaaa agcggcgtca gcggtatcat ggcgactagc aaaacgatcg 80040 tgctgtactt gtgtcaggcg ccggccacag cgtcgttgta cgttagcgca gacacggacg 80100 ccgacgagcc tattatttat ttcgaaaata ttacagaatg tcttacggac gaccaatgcg 80160 acaagtttac ttattttgct gaactcaaac aggagcaagc cttatttatg aaaaaagtat 80220 acaaacactt ggtgcttaaa aacgagggtg cttttaacaa acaccacgta ttgttcgatg 80280 caatgattat gtataagaca tatgtgcatt tggtcgacga gtctgcgttc ggaagcaacg 80340 ttatcaacta ttgcgaacag tttatcacgg ccatttttga aatttttacg ctcagcagta 80400 aaatcgtcgt ggccgtgccc gtcaattggg aaaacgataa tttaagtgta cttttgaaac 80460 atttgcacaa cctaaatctc attggaattg aaattgtaaa ttaaaacaaa tcatgtgggg 80520 aatcgtgtta cttatcgttt tgctcatact gttttatctt tattggacga atgcattaaa 80580 tttcaattcc ttaaccgagt cgtcgcccag tttagggcag agcagcgact cggtggaatt 80640 agacgagaac aaacaattaa acgtaaagct gaataacggc cgggtggcca acttgcgcat 80700 cgcacacggc gataataaat tgagccaagt gtatattgcc gaaaaaccgc tatctataga 80760 cgacatagtc aaagagggct ccaacaaggt gggcactaac agcgtttttc tgggcaccgt 80820 atacgactat ggaatcaaat caccaaacgc ggccagcaca tctagtaatg taaccatgac 80880 gcgcggcgcc gcaaactttg atatcaagga attcaagtcc atgtttatcg tattcaaggg 80940 tgtgacgccc actaaaactg tagaggacaa tggcatgttg cgattcgaag tcgacaacat 81000 gattgtgtgt ttgatcgacc ccaacacggc gccgctgtcc gaacgagagg tgcgcgaatt 81060 gcgcaaatct aattgcactt tggtgtacac aagaaacgcg gcagctcagc aagttttatt 81120 ggaaaataac tttaccgtca ttaatgctga acaaaccgcc tatctcaaaa actataaatc 81180 atacagagaa atgaattaat aaaacaaaaa gtctatttat ataatatatt atttattaac 81240 atacaaaatt tggtacacta gtgttcaaat cgtttctgtt caacgccatt gtcatgttat 81300 aaaacacatt tgtagtttta ttgtaattat ttttaaattt atttttaatt tgctgtaata 81360 aaacttgttc attaaataca aaagactttg aactacttgc gtttatattc tttttataat 81420 tgtactgaac aaacgagggg tgcaaaaagt ttttcaaatg ctgcacggca atacctatca 81480 tctcctccat tttgtcctct cctattgtaa tagtggcact gcgcaccgtt ttaatgttta 81540 gaatgtaaat gagcgcatac agcggactat tgttggtgct caagcacatt aggttgtgct 81600 tatgcatagg gtcgttgctc agcagcgttt tgtatactac aaagcccgtt ttggggtcgc 81660 gtctgtacat tagtacgtgc gacaaaaaca aacgcaccgg cgtcacaagc gactcgtaat 81720 acatgctttc tatcggaaac tgtttggact tgatgtgttc gtacacggag ccggcaaact 81780 tgacgctgtc tacaaactta tggttcgtgt aaacaatcaa aaatctgtct tgtacaccgt 81840 cgtcataatc gtccacgtac agcggcttgt tgttaacaat taacattttg tagttggctt 81900 catactttag cagcccttgg tattttctgc tcttggaatc gctcttgctc gaatcggcat 81960 gcttcttaaa gtacgactcg ctgcattgtt tcaactcgtt gatagtgtac aactgcgagt 82020 tgagtttgct cacttccttg tcgctcgttt ccttgttgga ctctccgctg tggttgtcat 82080 cgtcaaactt gtgcatcaac accaaatagt ccaacagctc aaaaaacgac gacttgcccg 82140 aacccggttc gccgggcatg taaatagcct tctttccgta atctacggga atggccaaac 82200 tagcggcgaa atgcatcaac ataatcgcgt tcgcgtgatt aaaattggtg aagcgtttaa 82260 agtacaaata gccttcgaca atctttttca aataattgta cgagtactcc ttcaagtcca 82320 ctttggacat gatgatgcgc atgtagaatc gagtcagcca agtgggcaaa tcgtccgtgc 82380 tgcgcgccaa tatgattttg tcccaccaca cattgtactt cttcaagatc attaacgcgt 82440 cggcgtggtg cgtgtaaaat ttggaaatgt tatccgattc ttcaaactga acatcgggtt 82500 cacgtgcaac atcatcgcgc aattcggtta aaaacaaacg tttatcatta aacttgtcca 82560 tcaacatgtc gacatattcg attttgtgaa ttgttcgata caagtactga ataattttgt 82620 tgtgttcttt ggaaaaaaac tctccgtgtt ggttaacaaa ttcgctgttc gtgcgaatca 82680 acgtggtcga cacgtacgtt ttgttagtaa aaattagcat ccaaatcaat tcgctcaatt 82740 ctgcatcgtt accgaacatg tccgccatca agcagacttt tagcgctttt ctattgatct 82800 ttattttctt gtagcatttg cattttggtc gagatcccga taccgttgac cgacacggtt 82860 tgcattttag gttgtgcaac atgtcggaaa ccctgttctt gtttacgtac agagcgagcg 82920 taatcagatt ttcatcgtcc aaattccaca aatcgcgaaa caggttgttt aacgcgactc 82980 gcatatcggc ttggcatgtg ttgcaattgc ccatgtagtt aactatggcc gtgttagttt 83040 ttagcatttt tacatctcgg cacattttgg cgatgtgata agttctataa atgctgagct 83100 cgtcggcgct agtagatagc atgtaattaa acgcgtcctc gggcaaatac ttttcgtcgg 83160 tgggcttctt gaatgtctgc ggcaacgtgg tgcccaacaa aaatggacag ctcgaatgaa 83220 agctgttggt gaacacgttg tacacaccgt gcgttgtcaa gtacaagtat ttccaattgt 83280 taaattttat gttgctcaac ttgtaacaat tgcttttggt caatttgaat aggtcatcct 83340 ctttctttac aatttgataa tgtttgccgt tgaaaaccaa attgactccg gtcactacgt 83400 tttccaattt tctaaagaat cctttacaca caatgtcagg cggcaagttt agcgccatca 83460 cattctcgta cgtgtacgcc cacaattcat cgtgatccaa aatttcgttt ttagccgact 83520 gagtcaaata tatcatgtag tgtatgccaa aataatagcc caacgatacg cacaatttgg 83580 tatcgtcaaa gtcaaaccaa tgattgcagg ccctattaaa cactattttc tcttgttttt 83640 tgtaaggctc acatcgcttc aaagcttcat tcaaagcttc tttgtcgcag gcaaataatg 83700 attcacacaa aagttccaaa aacagtttga tgtcggtttc tctgtacgag aaattttcgt 83760 tcttggtcaa tatcttccac agtacataga ttaaaaaatc aaaattttta aatttgcttt 83820 tttcaaagta ttgttgtaga aggtttggat cgttggctcg ttcgtgggtc gccaaaactt 83880 taaccatgtt ctcgtgaatt gctataagcc ccaaattgat ttgcgtttga atgtagtctg 83940 cattttcgct gctcgccgat ataatgggta cgatgcgcgg ttttctggaa cgcgtgtcgc 84000 tcaagtccac gtcgtttttg tcaaaattgt tgttctcgaa cactctgagg cttttgaggt 84060 tgacgttgac gatatgcttg tacttgggca ccgtaatgca ttcctccaaa ttaatgtcgt 84120 ccctaatgta attgaaaaaa tttttatccg aattgaccag ctcgccatta actttgcacg 84180 tggccacagt gccgtcggcc attttgagta taaacaagtc ttcgtgagaa tcgtcaaact 84240 tggtttttcc atttacaaac agcgtttgcg gcggatcgtg attcgtgcgc aggctgagct 84300 cgacgttgag aaaacattta gggtcaaaca caaacaaatc cacagggcct agttttttgt 84360 tgtgtatgat tggtatcgtg ggttcgatga caattccaaa ttttatattt aaaaacagct 84420 gccatccgtt aaaagagaaa gcttgctttt tgggccagtt gggccaataa tagtaatcgc 84480 ccgcttgcac gcatttgtta atgtatccag ggtcggtgct cttgaaaaaa tcttcaaaat 84540 taatatactt ttgtatgatg tcatagtgct tcttcaaaat gaaaggtttt acaaaaatgc 84600 aaaaatcgtt actttccaac acccagtcgt ggccgtctaa tgtttgagct gcgtgtttct 84660 ctgcaggttc ttcggtgtct tcgcaagatg cgcccatgtc gtgtttcgcg cacggaccgt 84720 taaagttgtt tctaattgtg tttaagaact gttgaaagtt gttgacgtac tcaaacaatc 84780 tacgtgttcc tgttcgcgtg tttctaatga ttaaatgatt tgcatcttgc aagttgttaa 84840 tctcgtacgt tttgtcttga ggcacgtttt tcaaaaaaaa ttgtaaaatg ttgtcaatca 84900 tgttggctat cgtgtttgta cttttcgtgt taatttattt aataatttcg atcaaaaatc 84960 accatccatt cttacataga atagaaacgc taatacaaga tttcaacaac acattgttgt 85020 ttggcgcgta tgtacagatt tacgatttaa gcacgcccgc ccgcaccgaa cgattgttta 85080 ttattgcgcc cgaaaatgtg gtgttgtata attttaacaa aacgctctat tattacttgg 85140 actcggcgaa cgtgttttgt cccaacgagt ttagcgtgac cacgttcacg caatccacta 85200 ttaaaacgat caacgagacg ggaatatatg ccaccgcatg cacgccggtc agcagcttga 85260 cgctaattga acattttgca acattaaaaa ataacgtgcc cgatcacacg ctcgttctcg 85320 atgtggtcga ccaacagatt cagttttcaa tactcgacat tatcaattat ttgatttaca 85380 atggctacgt ggatttgttg gccgaataac gcgtatatag acgcttgtac gttcatcgta 85440 gtaatcattt taatacattt gattgaacta aacatacatc tgcaatgggt gaaagagtca 85500 ctaaattttg caatggaaaa cggcgataaa gaagacagcg acaatgaata gagtttatat 85560 ttttatttaa taaaatattg ttcgtaatcc ataatgtttt gtattatttc attgtgataa 85620 tgttcccaat cttgcacggg ggtggggcat cgtttgactt tgacgtagaa atcgtacgcg 85680 tagttattag ttggcagatc gtcgacaagt gtgatcgact tgaaaaagtt tacattttta 85740 tcgctcaaat atttaattac aatttttggc gatttgggta tattgttgtc ggatcgatga 85800 ttgtgaatgt caaaaacaaa tttattttca atgaaacgct tttttaaatt gtaatctaca 85860 atagcgttgt gtgaattttg aactaaatca gagcgttctt cttgaacggt ggaaccttcg 85920 ctgataatga tatcaaaata gccttccaaa tcgacgtctc gcatcgagtg tgctacatga 85980 tctctactgc catacgacca caagactaaa acgcaaccca tctcgtgcaa ctcctgcaag 86040 ctgtcataca caaacggatc tcgaatctca acttgctcct cttcggttat gagagtgctg 86100 tccaaatcaa acacgaccac gtgcggaaat ccccacgtca aagattcgct tttgagagag 86160 accactttgt agtgtggcaa tagaaaccat tctttaagaa acgaatacat tggcggtttg 86220 ttgctaagca cgcacatgtg gcccaacact ggcgttttga atgcgcgttt aatattgtgc 86280 ctgatgtcgc gcatgtcgtc ggcgggcgct ttgaatattt gcatacagta attgtaattg 86340 ttttctatga tcttgcacag ctgcgggtcg ttgcaaaatt gaaatattac atattcaaaa 86400 aatttatact tttcaaagcc aaggtatttg aggtcggcgt actcgcttaa aacgagaaca 86460 tgtcgtttga tgatggcgtc gttaaggcgc aaacagatcc atttgctttg aagcgaggag 86520 gccataatgt acaaaaatgg accagttacg ccttatttaa actgtttaaa gagtttcgta 86580 taaacaaaaa ctactctaaa ctaatagatt tcttaacaga aaattttccc aacaacgtca 86640 aaaacaaaac gttcaacttt tcgtctaccg gccatctgtt tcactcgttg cacgcgtacg 86700 tgcccagcgt cagtgatttg gtgaaagagc gcaaacaaat tcgattgcag acagaatatt 86760 tggcaaagct gttcaacaac acaataaacg atttcaaact gtacactgag ctgtacgagt 86820 ttatcgaacg gaccgaaggc gtcgattgct gttgtccgtg ccagctattg cacaagagtc 86880 tactcaacac caaaaattac gtggaaaact taaattgcaa actgtttgac ataaagccgc 86940 ccaaatttaa aaaaaaacct tttgacaaca ttctttacaa gtattcccta aattacaaaa 87000 gtttgttgtt gaaaaataag gaaaaacata ccagcactgg gtgtacacgc aaaaagaaaa 87060 tcaaacacag gcaaatattg aatgataaag ttatttattt acaaaacagt aataaaaata 87120 aactatttga gcttagcggg cttagtttaa aatcttgcag acatgatttt gtaacagtcg 87180 aaagccaaac gagggcaggc gacgaaatcg cttcgttcat tcgctactgt cggctgtgtg 87240 gaatgtctgg ttgttaatag tagcgtgttc tgtaacttcg gcgacctgtc gatgaacggc 87300 tcctggatct tctgtatgtg cggggtctac ccgggcggcg tctgtaaccc gagcttctgc 87360 gcctgcgtgt cgaaccatat gtggtaccgg ttgaagaacg gcgacggcga cgataaacca 87420 tgtttaaatt gtgtaattta tgtagctgta atttttacct tattaatatt ttttacgctt 87480 tgcattcgac gactgaactc ccaaatatat gtttaactcg tcttggtcgt ttgaattttt 87540 gttgctgtgt ttcctaatat tttccatcac cttaaatatg ttattgtaat cctcaatgtt 87600 gaacttgcaa ttggacacgg catagttttc catagtcgtg taaaacatgg tattggctgc 87660 attgtaatac atccgactga gcgggtacgg atctatgtgt ttgagcagcc tgttcaaaaa 87720 ctctgcatcg tcgcaaaacg gaatttcggt accgctgttg atgtattgtt gcggctgcaa 87780 catttgtatc ttttcgccgc gctcgatcaa caattcttca agagtggtgc gtttgtcgcg 87840 ctgtaaagcc acgttttgta acagcactat tttcgcatat ctcataatcg gactgttgaa 87900 acagcgtgca aacgacgacc gcataatatc gacggtcgtc aagtcgattg tggtcgaagg 87960 catctccaac agagatcgca cggcgtccaa cagcgtgtcc gtttgaacct gcgtcatttg 88020 cggtctgcac gtgtagtcgt caaacgtggt ttcgagcagt ttgaacaacg aatgatactt 88080 ttccgatcgc agcaaaaata tcatggtcat gaccacgtcg ctgattttgt attctgtaga 88140 actggtgctg ttcaacgaat agtgatggat tagtttgcga gcagcatttc tgtatcggcg 88200 catgttgatc aactcttcgg aaggctgcgc gggcgcggcg gcgttggctc gcgcaaacaa 88260 atttattacg ggacgcggcg taggctgcgc ggacgctggc gcggcgacga cgtccgcgtt 88320 tcccgccgcg tactgagacg ctatggcagc gttgttattt aaaattgtgt tttgcgattt 88380 gcgagccacg tgcatcataa aatttatcaa cacgtcggtg ttcaactgca cgctttgatg 88440 ttcgtcgcag agcaaaggaa atagctgggg ccatatcgcc aattgcatag gctcgtctat 88500 ttttaaccgc aatttgttta tttccaaata caacgcgata gcgctcatcg tgaccgacga 88560 cgcacactta ctctgtaact atcacttgga tcgtgttgtc gtaaacgctt cccaaaaagt 88620 ctaacacgtt gaccgtttcg attctattca acttaattgt ggacgcgttg gcttgcatcg 88680 gttccaacag actgcgcgct ccgacagatt gagtagacaa aatttttaaa ctttccgtct 88740 tattgggcgt aatgtcgttg attaacaacg acgcagccgt ttgagaggcc gcagtgttga 88800 tggtttgcaa catgtcgacg gccgccattt gcgtttgcgc cgaaggtctt gctggcggcc 88860 tgttgcggcg gtttcttcgt gcttgcgaca tgttgtcgtc agtgtccata tcggtatcat 88920 ttattgaagc aatcatggtt gagttcgata agcagagata tttcgttgtc caattggtac 88980 ttggtaatga tgtgccttat aaatgtttcg ggcacaatca tttctgtcat tagcacgtta 89040 caaatatcta ttttgatcaa tttcaattta tgaattaaca gattaatgtt ttcgtccgag 89100 tacttgctca tgatgaaacg acaaacgttg cggagttcca actccgctac cggatacgct 89160 ttgttgggca aactctctaa atagtgtctc aaataaaagc cgatcaatac ggtggacgct 89220 attttgttaa cctttttcat tttagtattg cggcccattt ctatcatgaa gtttttaaac 89280 ggtagcaaca gcctgtctcc gttagcaaca gtggagcagc cgttgcattg cgcgctcaaa 89340 atactcaaca cgcgctcgtg atcttcttgg cgcaatccga cggttgcttt tttgcattct 89400 ttgacaaatg gcacgcacat gtcgcgtttc gtgtacaaag aatacgcttt gtcgcaaatc 89460 aagttataga aaaattgcac aaatatctgc gtaatcaagt tgttttcgtt aataatgtca 89520 ctttcgtttt tgtaatcggt tcgaagcaac acgtacaaca tcagaggcat gccgaacatg 89580 ggtcttaaaa aaatgtccca accattttgc aagcccgcgt cgagggtgct cagcgaggac 89640 gccaagtatt tgcatttgca ctcaaaacat tgaattttgt ttgcgggctt gcacgactga 89700 cacatgatcg catccacgtc gggtgccggc gtcggattgt aatatttttg caagtattgc 89760 ataatggtcc taaaatgggg tacctgtttg ataaactcgt cgcgcaaaaa tatcgaaaaa 89820 atgtttttta cattgtgtat gttgtctgtg ttgttggctt gattctcaaa actactcttt 89880 atggaaacaa tacatttgtt aaattctgtg aaaaaagtaa gacctttact gtccacgatc 89940 aagctttggt tgaaatattt tgaaaataaa aaacacaacg aatcgatttc atcttgtaac 90000 aattgcgctt caaaacacac gttttcaaag cggtcgtaaa tgttaaacct taaactgtat 90060 tgtaatctgt aagcgcacat ggtgcattcg atataacctt ataatatgaa cgattccaat 90120 tctctgttga ttacgcgttt ggcagcgcaa atactgtcca gaaacatgca aacggtggat 90180 gtgattgttg acgacaaaac gctcagtttg gaagaaaaaa tagacacgtt gaccagcatg 90240 gtgttggctg taaatagccc gccgcaatcg ccgccgcggg taacatccag cgacctggcc 90300 gcatcgatca ttaaaaataa cagcaaaatg gtgggcaacg attttgaaat gcgatacaac 90360 gtgttgcgta tggccgtcgt ttttgttaag cattatccca agtattacaa cgagacgacc 90420 gccggtttag ttgccgaaat agaaagtaat ctgttgcaat atcaaaatta tgtaaaccaa 90480 ggcaattatc agaacattga gggttacgat agtttattaa ataaggcgga agagtgttat 90540 gttaaaattg atagactatt taaagagagc attaaaaaaa tcatggacga cacggaagcg 90600 ttcgaaagag aacaggaagc ggagagattg agggccgaac aaactgccgc aaacgctctt 90660 ctggagaggc gagcgcagac gtccgcagac gatgtcgtta atcgtgccga cgccaatatt 90720 cccacggcat ttagcgatcc gcttccaggc cccagcgcgc cgcggtacat gtacgaaagt 90780 tcagagtcgg acacgtacat ggaaaccgcc cgacgtaccg ccgaacatta caccgatcag 90840 gacaaagact acaacgcggc gtacactgcc gacgagtaca attccctggt caagacggtt 90900 cttttgcgtt taatcgaaaa ggcgctggcc actctaaaaa atcggttgca cataacaact 90960 attgatcaat tgaaaaagtt tagagattat ctgaatagcg atgctgatgc tggagaattt 91020 caaatatttt taaaccagga agattgtgtg atactgaaaa atttgtcaaa tttagcgtca 91080 aagtttttca acgttcgttg cgtggccgac acgttagagg taatgttgga agcgcttcgc 91140 aataatattg agttggtgca gcctgaaagc gatgccgtac ggcgaatagt cataaaaatg 91200 acgcaagaaa ttaaagattc gagcacgccg ctgtacaaca ttgccatgta caaaagcgat 91260 tatgacgcca taaaaaacaa aaacattaaa accttgttcg acttgtacaa cgacaggctg 91320 ccaatcaatt tcttggacac gtccgcaacc agtccagttc gcaaaacttc cggcaagaga 91380 tctgcggaag acgacttgtt gccgactcgc agcagcaaac gtgccaatag acccgaaatt 91440 aatgtaatat cgtcagaaga cgagcaggaa gatgatgacg ttgaagatgt cgactacgaa 91500 aaagaaagta aacgcagaaa attagaagac gaagattttc tcaaattaaa agcattagaa 91560 tttagcaagg acattgtcaa cgaaaagctt caaaaaatta ttgtggtcac cgacggtatg 91620 aaacggctgt acgaatactg caactgcaaa aattctttag agactttacc gagcgccgct 91680 aactatggca gcttgctcaa aaggctaaac ctgtacaatc tcgatcatat cgaaatgaat 91740 gtaaattttt acgagttgct gtttccattg acactgtaca atgacaatga taacagtgac 91800 aaaacgcttt ctcatcaatt ggtaaattac atatttttgg ccagtaacta ttttcaaaac 91860 tgcgctaaaa acttcaacta tatgcgcgaa acttttaacg tgtttggccc gtttaaacaa 91920 atcgacttta tggtcatgtt tgttataaaa tttaactttt tatgcgacat gcgtaatttt 91980 gccaaattaa tcgacgagct ggtgcccaac aaacagccca acatgagaat tcacagcgtg 92040 ttggtcatgc gggataaaat tgttaaacta gcttttagta atttacaatt tcaaaccttt 92100 tcaaagaaag acaagtcgcg caacacaaaa catttgcaaa gactaataat gttgatgaac 92160 gcaaactaca atgttatata ataaaaaatt ataaaatatt tttaattttt atttatattc 92220 agtacattta cacatattaa catattgttt atacaaattc ttataatcat tatgatttaa 92280 attgaattgt tgtctaaaca aattaaacac tttattaaac aataactttt cgttgtaatt 92340 ttttactttg cacatgttat aacaaaaaat taaaattttc atcatgtctg atttgtctat 92400 ggcgtcacag ttgcttttaa tgtaatcgca agttaaccac tcaaaaggac ccttttctat 92460 ttttaatttg tttaaatctt tataatcaga cttcagtttg taaattagat ttccacatcg 92520 aataataaat ccttccagcg ggctttgggg aaacattaaa gacttgaaat ttaacctttc 92580 tacaaaatcg ttgtacaaat atttgtgaca cggaatagta ttaaacccca cgttagtcaa 92640 caactcttgc gcctccacaa agggcacaaa ctccccgccg tataattgaa tttcgtaagc 92700 gtagtatttc aaactctctt tctggtccac gtagttaatt acgttaatgg gtgtcgtttt 92760 tgcgtcgtct ttccaaccca ttaattcgcc gtagacaata aaaccgtcat tgaaccgcgc 92820 ctgaagcgat cgcatgcacg tttctaaatc ttttcgaatg cggtaataat tcataaaatt 92880 gccgtccggt ctgtaagtgt ttcttgaccc gtacgtaatt ttattttggt tgcaaatgat 92940 tctgaaatta caaccgtcca acttttcttg aacaataatt tctttgtcgg ccaacgtacc 93000 ttttttacct tgatctagat gcgacacaga tggataaatt tgatacacaa ttttattctc 93060 atcttcgggc attacgggtc cgcgttcatt taacgcgtac atgacaatgt tgtggcgaat 93120 gtcggtgcgc tccggcggtt ctggcacgtg gtgcagtctg tcctgcaatt gttgcttcca 93180 ttgttgaaaa tattcggtcc attcttgttg atactcgccg cgttgcatga gttttacgta 93240 cagttttaaa agtttgacat tctttacaaa taacgttaga gtttcgtcga ttttgtatcc 93300 tccattattt ttgtttaaat ccaatacatt taaatcgttc actaccagtt gattgttttt 93360 atccatcgta atttttatct catcgcccac gttgaacaac atgtttaaaa ttttggtgga 93420 tttcggcgca cgtttataat ctaaataata ttcaacgtac acgtaattga acatgagctg 93480 caacaatcct ttggcattgt tcaaaatttt gtatctcatc aaagtataaa taattttcac 93540 catcgacacc gtcatcaact tggttacaaa ctcgtacaat tgcaagtttt caataccgta 93600 tttgtcttta aaatcttcac gtttactgaa catgcttaat tcgggagatt ttccagtcaa 93660 aatgccaatt aatcccgtgt acaagtcaac gtatttgaca tcgttgcccg attcatcttt 93720 tgcatgtcga tttttcaaaa gctctttatt gtcgataaat ttttcaaagg tctctcgatc 93780 acatttagtg taaatatggt agtcagtgtc gctgctttcg accgcgtatc ccttggcatg 93840 gctgcccgta tcaatgcaaa tgtacaccat gttagaatgt gctgcttact gtgcctgtat 93900 caagccttat atacctcaaa atatttcaca tttttgcatc atcgtaaaat atacatgcat 93960 ataattgtgt acaaaatatg actcattaat cgatcgtgcg ttacaagtag aattctactg 94020 gtaaagcaag ttcggttgtg agccgtgtgc aaaacatgac atcataacta atcatgttta 94080 taatcatgtg caaaatatga catcatccga cgattgtgtt ttacaagtag aattctactc 94140 gtaaagcgag tttaaaaatt ttgtgacgtc aatgaaacaa cgtgtaatat tttttacaat 94200 atttaagtga aacattatga cttccaataa ttttgtggat gtggatacgt ttgcaagaca 94260 attgattaca gataaatgta gtgctctaat caaaagtgcg gatctgttgc cggcaaacat 94320 tttagagatt gtagagaagg ccagagacaa gtattttgag gagccaactc aaaaaaacta 94380 tgaatacatt aaaaaattat ttttacgaac aaaatatatg gacgattcga tagattataa 94440 agattttaac agacgcatcc tattgatagt ttttaaattc gctttaaaca agagcaccaa 94500 ctactttcca tcgtacaaag agatcatcga ggtggccatt aaacgtttaa acaaaattaa 94560 ccccgattta aagagttctc cgcgcgcaat gcttcagcat tacaatgaat gtttggaaaa 94620 tctagacaat ccagtcacgg acgaacatca tttgttaaca tttggaaaag aagttgctac 94680 aaaaatattt atcgaagcgt ttgaatacag ttacaccaac actaatgcca tcagcatgga 94740 caaaacagat gaatttgatt ttattaaacc ggcattgaaa cctttgccag atgcaagacc 94800 gccatcgctt ttggccaacg tgatgaacga acgtaaaaga aaattacaaa acaccaactc 94860 aacggcaaaa tgtttgctac cagcaccacc gccacaattg cgtaaacttg aaaaaaagaa 94920 tcatttattg cctttgtttt ctttgtaatt atattgttgc atttctattt ctaatatcat 94980 agttttctaa taaagtagtt tcatattttt gtttttgtac agtaattgtt tcttggttta 95040 acaagatcac aaccaataac ataaagaata acacaatcat aacaaaaatt aaaaagccgc 95100 atactactag aacaaattct ttaattagcg atcggtttct atttacaaat tggccgagct 95160 gatcgccttc agtcggcgag ttgtgggctt ggatgatgtc gacgatattg ttgccggcgc 95220 gaccgcctgt cgctctcgat ataatgtcgg ccgccgtcgg tttcatgatg tgcttaacta 95280 caaataatag ttgtacttga cgggcgtcac cgtgatgccg ctgctaaaac ctccgtccgt 95340 taagacgcgt tgcgttacaa aattaatgtt tgtccgatta gcgtagtcgg aataatcaaa 95400 cgtgttgggc ggactaaaat cgggcatgtt gatgggcaca atgccgctgg agctgatagc 95460 aatgctgtcg ttcttgcaaa acagccgaat ttttttgtag ggctctgctt tattcggcgc 95520 agacgacacc atctggtcaa agttgttcaa ttttatgatt acgttgggta ccaattgata 95580 ggggaaaatt attttctgga acattttgac aaagtccaca accgtttggc tatagtcggg 95640 aatgccgagc aaagactgcg cctgtttaat gtatttgaga ctggagcggt ttactgtagc 95700 gcaattggat ggcacgtcgc ccttcataag ccggcgcgtt ctctcccaat tcaatttgtt 95760 gtacaaatta tcaatctcct cgtgcggcag attgattaca tagcgcgcgg gctgtttgcg 95820 atattgaaag atgcaaaaaa tgcgtttcaa cgacaatatc ttcaccatgg tggacgtttc 95880 cagattgaaa cataacaaaa agtcattgct ttccaccaat tctttaaaat gagacagcgg 95940 aatttcacaa gcgatcggtc gcaaattgct ttttattgga ggcggaacgc tttgaccgtt 96000 gcggtttttt agtaacgcgc tgcacgcaga ttgcatgtcc gtttcgggat acgtaaactc 96060 gatgggacat ttggggtttt catggtgaac gatcatagtg ttgcaataaa acaagttgtt 96120 ggtcaggagc acgctaaaaa cacgcgtttc gcccgcaccg atttcggtga tgggtaccaa 96180 cgggttccag tagactatgg tggcggacgc tgtttttttt ggcgatcgac tgtctatgtt 96240 aacatcatgc tcgtgcctgt acactagcac agaattgaat tttggaaatt gttttttgtc 96300 aatgtacaac cggtcgtcgt ctgtgggcac gtacacgatc aagttttcga ttaatttgtt 96360 gcctacgtcg ctttgcggtt ccaccaaatt gtgagggaac gcaaaaaagc gatcgctaat 96420 acaaacttga atctgaaacg ggcactccat cgtgatgtat atgtcttact tcattagact 96480 ttagattatt ttaatttgtg aactcgtacc gtattcaata gggtgtcggg cacgtaattg 96540 taatggtaaa acagatcctg ttgaacacgt gcgttgttca ctacgattga aatgcaaaaa 96600 tacatcaagt acataaacac tatgattaga aaggtagcag acagaaaata tttcatcttt 96660 aaatcttatg ctagttgaat aaaatacata gtacttttat acgtttattt atatttgttt 96720 tctttgttat aaccgtaatt gtaaaacttg tgatcgtgct cgccaggcat aatttctttg 96780 cacatcagct tgcgaatata tgtgacatct tcgtacaccg atttcttgat gttaccatcg 96840 tgaagcgttg tcggcttgag aggtttgcgg tcgttgttgt aaaaattttg caccgaataa 96900 ttatccatag tgcagcacag gcaatgtcac tgatgcatat gctttaattt tttattgcat 96960 tcagttatta tatgatttaa taaacgtaca caatagcacg tttatcggtt aaagataact 97020 ttcaatatat aaaagtgttt gaattgcgag accgtcaaca taacgtttat caacgcgatg 97080 actaaacgac aatttgcttt gctgtttgtg tggcaccacg acaaccaatt tgtttgcaac 97140 acggacgaat acccgttttg gcacaacatt gaataccatg cacggcgcta taaatgcatc 97200 gttttgtact gtgtggaaaa cgacggatcg ctacaactgc ccgtttgcaa aaacataaat 97260 ctcataaatt ataaaaaagc gtatcctcat tattatggaa actgtgttga cagtatagtg 97320 aaacgtgctg gcaaaattga ttatatgaaa gtaactgcaa tgttaaaccc ccacctgttg 97380 gacgtcgcgt acaattattt gctgttgatg gacatggatt gtgtggtgca aagcgtgcaa 97440 tggaaacaat tgtcaaccga cacgtattgt tttgagccgt tttacgactc tcaaattaaa 97500 tggttgtacg cgcccaaaag cggacaaagt tttgatagtt atcttgaaaa ctatgcaact 97560 ctaattcgag tcaaacaagt gcagcaacat cgaaaagaat taatactgca ttgtgtggat 97620 tttcttacaa tgaaagcaaa tgacaatttt atggtgttca aaaattatat taacatgatt 97680 ataaaagtgt atttgcaatt ttacaattac agatttccca tcaattttga ggacaacacg 97740 atgaaacctt gtgtaaattt aacttttaga cgtggcggca gttggaaaac tcaactgcaa 97800 cccgtatgca attatgttta caaaagtaaa aatatgccaa aatttattaa ataaaacaaa 97860 ttaatttaaa caagcgtttt tattgacaat actcacattt gatattattt ataatcaaga 97920 aatgatgtca tttgttttca aaattgaact ggctttacga gtagaatttt acttgtaaaa 97980 cacaatcaag aaatgatgtc atttttgtac gtgattataa acatgtttaa acatggtaca 98040 ttgaacttaa tttttgcaag ttgataaaca tgattaatgt acgactcatt tgtttgtgca 98100 agttgataaa cgtgattaat atatgactca tatgtttgtg caaaaatgat gtcatcgtac 98160 aaactcgctt tacgagtaga attctacttg taacgcatga tcaagggatg atgtcatttg 98220 tttttttaaa attcaactcg ctttacgagt agaattctac ttgtaaaaca caatcgaggg 98280 atgatgtcat ttgtagaatg atgtcatttg tttttcaaaa ccgaactcgc tttacgagta 98340 gaattctact tgtaacgcaa gatcggtgga tgatgtcatt ttaaaaatga tgtcatcgta 98400 caaactcgct ttacgagtag aattctacgt gtaaaacacg attacagcac ttcgtagttg 98460 tatcgaaaat tgttcaatgg ctctttgtta atgtcgtaat tgattaatat gtcgtacaat 98520 ttggcggcgt tgtgtttgca cacgaccgtt tttagttctt gaaacatttt ttcgtgtatg 98580 tttagcatgt tgtatttcag agtgcgatgt gtaatgctgg tgacgagcat caaaatgata 98640 aaatctaaag cggctaattt gtaatcccgt tcatacgctc tgtaatcgcc aacaactctg 98700 tggccagatc tttttagatt ttgacaggcg ttatggtacg aattgataat atttactata 98760 gtttctcttg ttatcggttt gtcgattaaa ctgttaacaa acatcacgtt gcccaagcgc 98820 gacggtttag acaccgactt gttttttgtc tgttcaaatt tgtacaaatt aaaaacgctc 98880 atagactggt cgtcaggcag tgtgtcgtta tacaaacaaa atggtaaaac gtttaattcg 98940 acaaacgacg agcacattaa agtttgttgg ctgttaacgt cctggggatg taaactgtta 99000 ttcataacgt aacacacttc aatgtcggaa tgcttgtttt caaatttgtc cttgtctaca 99060 gtttcaatgg tgattgagcg aggtttgagt ttattttgta aattcatttg gatattttca 99120 atatggtata ccaccgacac gttgtgagcc agcgatcctt gattggtttt aatcatattc 99180 aaaatattca tgatatggtt gaaaaaagag tctgtcaaaa cgtttgtgtc gttgttaaat 99240 atcgctttcc agggtttact gttgcgtgac tcaacgacgg ccgtgtaaca taacaagcgc 99300 gccagttgca tgtgcgacaa cttaatgtta tcaatgtcgg tgatgtttgg caccagattt 99360 tcattgccgt cttccagtag cgtgctcagt tcggtcgagt agttattcaa cgatcgattg 99420 tgcgattcaa acaagtttac tatcgcaggt tgtacatagt tttttatgtc gtcaaattga 99480 attatatcga tcttgtcctt gttctccagc ataaacgaca aattttttag gtcgaattta 99540 atatttggcg cgttttcgtt ggactttttg taatttaaca acatcgccaa cagtttgtgt 99600 aactcgccgt tagcttgatc tttgctaaac agtttattgg tagcgtaatt cacgttgtcg 99660 ttcaaaaaca gcaactcgtt gatgatcatt ttttgtaaaa gcgcgtactt gctcatgttg 99720 acagaatctc ttacatttca gttgtaaacg cgtctgtaca aattggccat gcgattcgga 99780 atgcacacgg ggatcgtgcg agccagtgcc gtttggcgaa atagcatttt ttcatagccg 99840 ctcgaacaat cgcacgcgtc cggcgaaaat tgcaccgtgt tcaaattcat attcaaccgg 99900 ccgtcgttgc atagataagg cctcggtgtt cccgtatcgt ccaccaagtc tctgtacgtg 99960 ctcacgcatg tttgagacac gacaaaatct ccgccggcgg agaaaacgtg aaccaagccc 100020 agtgcgggat cgcattctat caagtccgga gcctgcgcgt ttaccaaagc gtcggaggcg 100080 ttgcaaaagc catcctggca ggtcaactcg tttgcagcgc tggagatcac gcagttgtct 100140 ctacactgct gatccgtcac gcacggtaac cggttcaatg aacaatctac gcctcgattg 100200 cgctgaaacg taaaatttaa cggcggcgct tccaactcgt taatgtgcat gtatgcatct 100260 tgcaaaataa atttttgaac aaatttaaac gtgtacatgt acacgattag tataattacc 100320 agtagaataa gtatttgcca aaagttcaac atgatcgtct taactgagtg tgaaaagcgt 100380 ggtgtgacgc acgaaatgac tggttgcgca aaaaataaac cggggtctat ataactcggc 100440 gtcgaccgcg ttcattttta ccgtcatgca tctgacggct aatgtattgc tcgttcctaa 100500 cgcgctcaaa aagcgggacg tgaaatacat ttataatacc tatttgaaaa attacagtgt 100560 aattgaaggt gtgatgtgtt gcaatggcga ttgtttggcc gtggtggtgt tggaccgaaa 100620 tcagctgcaa aacacggaca tggaagtgtt ggagagttta gaatacacta gtgacaacat 100680 tgaactgtta tgcgaaaaaa tatgtgtgat agttgataat tacgacaagt attaccaaaa 100740 aaattgtgta taaataaaat accaaatttt attatatcat tttgttttat ttaataatta 100800 aagaatacaa cgccacatct attcctagta caacaaataa tttgattatt atttttgagt 100860 gcacattaaa aaataacaaa cagtgtaaaa atactacaga ataatacaat acataaatat 100920 tatagtaaat agctgcaatt ttgatagcgt aatttatact ttgatatttt tcaacgtaca 100980 acgttaaatg ttgatacgca ttattcacaa ataacaaaat ttttctaata tgccatttgt 101040 ccgcaattgt ttttgcgata tcaaagcctt tttcaaacaa ttgaaaaatt gcaaacaaaa 101100 ccacgtacat gacgttatac atagtgttaa agtttttaca taacaattct ataatgaaga 101160 aaattgctaa acacggcatg agcgcgcaca taatcgcgtt ggccgcaaat atctcgtacg 101220 tacaaaaata ctcggacatt ctccaataag taaaatgcat tttgctatta tactgttgtt 101280 tcttctagtg attattgcaa tagtgtacac gtatgtagac ttgatagatg tgcaccatga 101340 agaggtgcgt tatcctatta cggtttttga caacacacgc gcgccgctta ttgaaccgcc 101400 gtccgaaata gtaatcgaag gcaatgcaca cgaatgtcac aaaactttga cgccgtgctt 101460 cacacacggc gattgcgatc tgtgccgcga aggattagcc aactgccagt tgtttgacga 101520 agatacaata gtcaagatgc gtggagatga cggccaagaa cacgagacgc ttattcgagc 101580 gggagaagcg tactgcttgg ctttggatcg agaacgcgcc cgatcgtgta accccaacac 101640 gggtgtgtgg ttgttggccg aaactgaaac tggtttcgct cttttgtgca actgcttacg 101700 gcccggactt gttacgcagc tcaacatgta cgaagactgc aacgtgcccg tgggctgcgc 101760 gcctcacggc cgtatcgaca atatcaacag cgcttcgatc cggtgcgtgt gcgacgacgg 101820 gtacgtgagc gactataacg ccgacaccga aactccgtat tgccgtccgc gcaccgtgcg 101880 cgacgtaatg tacgacgaga gtttttttcc gcgggcgcca tgcgcagacg gccaagttcg 101940 tctggatcat ccggcgctca atgattttta ccgcagacac tttagactcg aagacatttg 102000 cgtgatcgac ccttgctcgg tggacccgat tagcgggcaa cgcacatcgg gacgcttatt 102060 tcaccaacca accgtaaatg gtgtgggaat caacggatgc aattgtccgg ccgatgacgg 102120 gttactgccc gtgtttaatc gacacaccgc cgacacgggc atggttagac aaagcgaccg 102180 caccgtcgcg aacgcttgct tgcagccgtt taacgtgcac atgttatcgt tgcgtcatgt 102240 ggattacaaa tttttctggg gccgcagcga ccacaccgag tttgccgacg cggacatggt 102300 gtttcaagcg aatgtcaacc aactcagtca cgaacggtat cgagcgattt tgtactcgtt 102360 gctcgagtcg cacccggacg taacagaaat cgtaacagtc aacatgggtg tcatgaaaat 102420 ttccgtgtca tacgatacca cattgaaaaa tatactatta ccatcttctg tttttaggct 102480 atttagattt aaagaaagtg gcactgctca gccggtatgc ttctttccag gcgtaggacg 102540 gtgcataacc gtcaattccg attcgtgcat caggcgacac gctggtggtc aagtgtggac 102600 cgcagaaacg ttcaccaact cgtggtgtgt actgagtcgt gaaggtacgc atataaaagt 102660 ttggagtcgc gcgtcacgat atccacgcgg agacgcgcct gcagcgttaa gattgcgcgg 102720 cttctttctg aacaacgatc gcgaacgaaa cacaataaga gcggtcacta caggcgacat 102780 gacccaaggg caacaaatag acgcattaac ccaaatactt gaaacttacc ccaactactc 102840 tgtataacaa catgagcatt ttaaaagttg tagaagcgtg cgatttggca cacacttttt 102900 tgaaattggg ttatttattt agggccaaga cttgtttgga tatcgcttta gataatttgg 102960 aactattgcg tcgaaagact aacataaaag aagtggcagt catgttaaac aagaaaacta 103020 cagagtgttt gcaattgaaa cgaaaaatag ataaaaaaat tgcacaacgt gttttaataa 103080 aaatttacac tatcaaatga tgacatcata acgggttcaa tattctgtgt gcaaaaataa 103140 atgacatcat atttcaaact tgttttacgc gtaaaattct actggtaaaa caagtttgag 103200 atatgatgtc atcatcacaa ataatagtat gtaataaaat aaacatattt gtgtgtaaat 103260 ataatttatt acaaataaat tttacattga atcaatctgt cttcgtgttt gttgtaaggt 103320 cttcgaatct tgtgtttcag cccctcggga tggtcaaaat gcgccgtagt aattgttaat 103380 ggatctttca acgatttttt gcccatggcg agtgtgacaa acgcggccac gacaaacagc 103440 aggataatca gtttcatggt gttctatatt tgacaatata tgggtcgctt ctaaatcacc 103500 ttgtccccaa aagcctcttt tatagttttt tagaacacgt tgtgtattcc aacagtaatt 103560 gttccatctc tttcaacagc cattcagcat ccggtcgttg actgtaatca tgctgaatta 103620 atttacaaac aatttcggtc aatttaggat ggccttggga taaacttgcc ggcatttgct 103680 gtacattgtt tctaaagtta gttagcgtag tttcgcgttc caaagcagtc ttgaagggca 103740 ttatcaattc gaataaaaca atgcccaaac tatacatgtc atttttgggg gtgtacactt 103800 ttttgatttg ttctggtgca gcgtacaaag ttatattttg agggttgttt ttgataaacg 103860 ttttgtatag actgccaaac atgccgccca catacaaatc aaagtcgggc ccagtcatga 103920 aaatatcttc gggattaata ttgtggtgca cgatatttac ggaatgaatc gctttcacgg 103980 cgctcaccaa atcaacaaac ttgctaatat aaaagccaaa atccgccgga actttaatgt 104040 tggtctttgc aaaagtttgc aaattgcgtt gtttcaaata gtcgctcaac atgtactcgt 104100 ttagaggcga cgcaaaatat atgcggtgct gccgcggatt caaataaacc aattgttcgg 104160 gtttcatggt atacagttaa gtgttaacgc gtcactaaat tcagacacga gcgcacgccc 104220 tatatacata caatttatcg cacaagatgc ttaacgcgat ctgtttataa actaaaacgc 104280 actgcaataa attttagcaa gcatttgtat ttaatcaatc gaaccgtgca ctgatataag 104340 aattaaaaat gggtttgttt gcgtgttgca caaaatacac aaggctgtcg accgacacaa 104400 aaatgaagtt tccctatgtt gcgttgtcgt acatcaacgt gacgctgtgc acctacaccg 104460 ccatgttggt gggatacatg gtaacattca atgactccag cgaattgaaa tatttacaat 104520 actggttgct gttgtcgttt ttgatgtccg tggtgctaaa cgctccgact ctgtggacga 104580 tgctcaaaac cacagaagcc catgaagtaa tttacgaaat gaagctgttc cacgccatgt 104640 actttagtaa cgtgctgttg aattatgtgg tgtttttgga caatcaaatg ggtacaaatt 104700 ttgtttttgt taacaattta attcactgtt gtgtactttt tatgatattt gttgaattgc 104760 ttatcctgtt gggccacaca atgggcacgt acacggatta tcaatatgtc aaatcgtgtt 104820 atatggttat attgtttgtt tcagttatga gtgttactat tgttatgggt ttagagtgtt 104880 tgaaaacgaa actaattgat aacagtttga tgtttaacgc gtttgtgtgc gctttgtaca 104940 ttgtgattgc aataatgtgg tctttaaaaa ataatttgac tagttattac gtttcaaatt 105000 tacaaagtat tcaagttgtt ccgttttcat acaacgatcc gccgccaccg ttctctaaca 105060 ttgtaatgga tgacataaaa aataaaaaat aatttataaa aatgtttttt attctttcac 105120 aattctgtaa attctaaaca aaaaatataa atacaaactt attatgttgt cgtctaaata 105180 aacatcaatt tgtaaatctg gacacctatt catatcattg atattacagt ctactataca 105240 acaattaaaa ctaaccaaat tatctttaca acaattaaag caattaaaac aatttaaata 105300 atcttcattg tcgtcgtata agtttatttg cactgtagac ggtgttacac agcgatccat 105360 tcgacgttcg tgttcgatca actttctcgc caacttgtac cataaaaatt gtttggacaa 105420 aaagttttcc aacaatggta acggccaatt caacgtgacg atgcgcacgt cctcgggtat 105480 gcatttgtta aaaaacacac agctcgcttt accaaacgaa agcaaaggta ctaaatatgg 105540 cgccattggc tgatttgtta ttccaagata attacaaata aactgatccg tcgtggggtg 105600 ataactggca ggtgtcagct ttaaataatc ttcaacgttg ttgtcgcgca aaagtctgca 105660 ttttacacgc gttgttaatc ccacgacttt tgcatgtaaa atcggatcca aatactgcag 105720 aatcgtgtct ataatttcta atggtaaacg tatgcgtttt gctcgtgggc gctttgtaac 105780 gctcgacatc ctaataacaa ctaacacaaa actaaaatga tactcaatat attgctttta 105840 cagttcatct ttaggtttaa actgtgcgtt tatcgcgttg agcaagtcgc cgttatcggc 105900 atcaatctcc caagcaaaca ggccgcccaa tttatttcgg tcgacatatt taacttttcc 105960 taacacagag tcgacgctgt caaacgaaat caaatcacct ttacttttat cgaaaacgta 106020 cgacgcttga gcggcgctgt caaacgtgta cacataattg ttgagatctt tttgaatttg 106080 acgataatct acaacaccgt cctcccacgt gcccgacacc ggcccgttgc cagtgccgga 106140 aaaatagttg tcattcgtat aatttgttac gccggtccag ccgcggccgt acatggcgac 106200 gcccacaatt attttgttgg gatcgacgcc ttgtttcagt aacgcatcga cagcgtagtg 106260 tgtagtgtat agctcttccg agttccaact tggcgcgtag actgttgttt ggtagcccaa 106320 atccgtgttt gaccaagccc ctttaaaatc gtaactcatg agaaatattt tgcctaatga 106380 cttttgcgct tcggcgtagt ttaccacggc aatcttgtcg taacccgcgc ttatagcgct 106440 tgttaattcg taaaccctgc cggtttgcgc ttcgaggtcg tctagcattg cgcgcagctc 106500 ctccaacaac aaaatgtatg ttttggcgtc acgctccgca tcgcccaacg acgggttagc 106560 ccctttgccg cccggaaact cccaatcgat gtctacaccg tcaaagaatt tccacacttg 106620 cagaaattcc ttaaccgaat ctacaaaaac gtttcttttt tcaacatcgt gcataaaata 106680 aaatgggtct gatagagtcc agcctcctat tgaaggaaga atttttaaat gggggtttgc 106740 taattttgcc gccatcaact gtccaaaatt gcctttatac ggctcgttcc aagcggacac 106800 acctttttgg ggtttttgta cggcggccca cggatcgtga atggcaactt tgaaatcttc 106860 gcgtcccttg cacgatcttt gcaaagattc aaagcttccg ggtatcgttt tgagggcgtc 106920 gtttattcca tcgccgccgc agatgggtat gaaaccatac aacaagtgtg ataaatttgg 106980 caagggaact ttgtctacgg gaaagttgcg cccgtacaca ccccactcaa caaagtacgc 107040 agcgacaatt ttatcctctc tcctgccagg tttgttgttt tccagccatg tgtattcgag 107100 cggtgccaga tggccgccgt cggtgtctgc gactttgacc aacacgggat cgctcacgga 107160 acagccgtcc tcattgcaaa gtttgacacg catgttaaat tgcccgctca caagaacttt 107220 aatggtagcc cttttacttt cggcgtcgcc tttccatacc tgctgctcgt caaacaacac 107280 gtacgctatg tcgccaatgt cgccgttcca gacgttccaa ctgacttgaa cgtcgacttg 107340 ttctttaggc tttattaaat tttcgtaagc ggtggcctcg taatttattt ctacgagcgc 107400 ataattgcga tcggcccaat cgatcaccgg cgtgccggga atcgcgttag aaacggcgac 107460 caaccacaaa acgtttaaca atttgtacaa cattttaatt tatcttaatt ttaagttgta 107520 attattttat gtaaaaaaat gaacaaaatt ttgttttatt tgtttgtgta cggcgttgta 107580 aacagcgcgg cgtacgacct tttgaaagcg cctaattatt ttgaagaatt tgttcatcga 107640 ttcaacaaag attatggtag cgaagttgaa aaattgcgaa gattcaaaat tttccaacac 107700 aatttaaatg aaattattaa taaaaaccaa aacgattcgg ccaaatatga aataaacaaa 107760 ttctcggatt tgtccaaaga cgaaactatc gcaaaataca caggtttgtc tttgcctatt 107820 cagactcaaa atttttgcaa agtaatagtc ctagaccagc caccgggcaa agggcccctt 107880 gaattcgact ggcgtcgtct caacaaagtc actagcgtaa aaaatcaggg catgtgtggc 107940 gcctgctggg cgtttgccac tctggctagt ttggaaagtc aatttgcaat caaacataac 108000 cagttgatta atctgtcgga gcagcaaatg atcgattgtg attttgtcga cgctggctgt 108060 aacggcggct tgttgcacac agcgttcgaa gccatcatta aaatgggcgg cgtacagctg 108120 gaaagcgact atccatacga agcagacaat aacaattgcc ttatgaactc caataagttt 108180 ctagttcaag taaaagattg ttatagatac attaccgtgt acgaggaaaa acttaaagat 108240 ttgttacgcc ttgtcggccc tattcctatg gccatagacg ctgccgacat tgttaactat 108300 aaacagggta ttataaaata ttgtttcaac agcggtctaa accatgcggt tcttttagtg 108360 ggttatggtg ttgaaaacaa cattccatat tggaccttta aaaacacttg gggcacggat 108420 tggggagagg acggattttt cagggtacaa caaaacataa acgcctgtgg tatgagaaac 108480 gaacttgcgt ctactgcagt catttattaa tctcaacaca ctcgctattt ggaacataat 108540 catatcgtct cagtagctca aggtagagcg tagcgctctg gatcgtatag atcttgctaa 108600 ggttgtgagt tcaagtctcg cctgagatat taaaaaactt tgtaatttta aaaattttat 108660 tttataatat acaattaaaa actatacaat tttttattat tacattaata atgatacaat 108720 ttttattatt acatttaata ttgtctatta cggtttctaa tcatacagta caaaaataaa 108780 atcacaatta atataattac aaagttaact acatgaccaa acatgaacga agtcaattta 108840 gcggccaatt cgccttcagc catggaagtg atgtcgctca gactggtgcc gacgccgcca 108900 aacttggtgt tctccatggt ggttatgagg ttgctttttt gttgggcaat aaacgaccag 108960 ccgctggcat ctttccaact gtcgtgatag gtcgtgttgc cgatggtcgg gatccaaaac 109020 tcgacgtcgt cgtcaattgc tagttccttg tagttgctaa aatctatgca ttgcgacgag 109080 tccgtgttgg ccacccaacg cccttctttg tagatgctgt tgttgtagca attactggtg 109140 tgtgccggcg gattggtgca cggcatcagc aaaaacgtgt cgtccgacaa aaatgttgaa 109200 gaaacagagt tgttcatgag attgccaatc aaacgctcgt ccaccttggc cacggagact 109260 atcaggtcgt gcagcatatt gtttagcttg ttgatgtgcg catgcatcag ctcaatgttc 109320 attttcagca aatcgttttc gtacatcagc tcctcttgaa tatgcatcag gtcgcctttg 109380 gtggcagtgt ctccctctgt gtacttggct ctaacgttgt ggcgccaagt gggcggccgc 109440 ttcttgactc ggtgctcgac tttgcgttta atgcatctgt taaacttgca gttccacgtg 109500 tttttagaaa gatcatatat atcattgtca atcaaacagt gttcgcgtgt caccgactcg 109560 gggttatttt tgtcatcttt aatgagcaga cacgcagctt ttatttggcg cgtggtgaac 109620 gtagactttt gtttgagaat catactcacg ccgtctcgat gaagcacagt gtccacggtc 109680 acgttgatgg ggttgccctc agcgtccaaa atgtatacct ggcactcgtc cgtgtcgtcc 109740 tggcactcga gcctgctgta cattttcgaa gtggaaatgc cgcatcgcca cgatttgttg 109800 cacgtgtggt gcgcaaagtg attgttattc tgccgcttca ccaactcttt gcctttgacc 109860 cactggccgc ggccctcgtt gtcgcgaaaa cagtcgtcgc tgtcactgcc ccaacggtcg 109920 atcagctctt cgcccacctc gcactgctgc ctgatgctcc acataagcaa atcctctttg 109980 cccacattca gcgttttcat ggtttcttcg acgcgtgtgt tgggatccag cgagccgccg 110040 ttgtacgcat acgcctggta gtaccccttg tagccgataa tcacgttttc gttgtagtcc 110100 gtctccacga tggtgatttc cacgtccttt tgcagcgttt ccttgggcgg ggtaatgtcc 110160 aagtttttaa tcttgtacgg acccgtcttc atttgcgcgt tgcagtgctc cgccgcaaag 110220 gcagaatgcg ccgccgccgc caaaagcaca tataaaacaa tagcgcttac catcttgctt 110280 gtgtgttcct tattgaagcc ttggtgtgac tgatttacta gtagcattga ggcatcttat 110340 atacccgacc gttatctggc ctacgtgaca caaggcacgt tgttagatta ataatcttat 110400 ctttttatct taattgataa gattattttt atctggctgt tataaaaacg ggatcatgaa 110460 cacggacgct cagtcgacat cgaacacgcg caacttcatg tactctcccg acagcagtct 110520 ggaggtggtc atcattacca attcggacgg cgatcacgat ggctatctgg aactaaccgc 110580 cgccgccaaa gtcatgtcac cttttcttag caacggcagt tcggccgtgt ggaccaacgc 110640 ggcgccctcg cacaaattga ttaaaaacaa taaaaattat attcatgtgt ttggtttatt 110700 taaatatctg tcaaattaca atttaaataa taaaaagcgt cctaaagagt attacaccct 110760 taaatcgatt attagcgact tgcttatggg cgctcaaggc aaagtatttg atccgctttg 110820 cgaagtaaaa acgcaactgt gtgcgattca ggagagtctc aacgaggcta tttcgatttt 110880 gaacgttcat agcaacgatg cggccgccaa cccgcctgcg ccagacatta acaagttgca 110940 agaactgata caagatttgc agtctgaata caataaaaaa attaccttta ccactgatac 111000 aattttggag aatttaaaaa atataaagga tttaatgtgc ctgaataaat aataataagg 111060 gttttgtacg atttcaacaa tgaacttttg ggccacgttt agcatttgtc tggtgggtta 111120 tttggtgtac gcgggacact tgaataacga gctacaagaa ataaaatcaa tattagtggt 111180 catgtacgaa tctatggaaa agcatttttc caatgtggta gacgaaattg attctcttaa 111240 aacggacacg tttatgatgt tgagcaactt gcaaaataac acgattcgaa cgtgggacgc 111300 agttgtaaaa aatggcaaaa aaatatccaa tctcgacgaa aaaattaacg tgttattaac 111360 aaaaaacggg gtagttaaca acgtgctaaa cgttcaataa acgcttatca ctaagttaat 111420 atactaaaaa tcacatagtc actacaatat ttcaaaatat gaagccgacg aataacgtta 111480 tgttcgacga cgcgtcggtc ctttggatcg acacggacta catttatcaa aatttaaaaa 111540 tgcctttgca ggcgtttcaa caacttttgt tcaccattcc atctaaacat agaaaaatga 111600 tcaacgatgc gggcggatcg tgtcataaca cggtcaaata catggtggac atttacggag 111660 cggccgttct ggttttgcga acgccttgct cgttcgccga ccagttgttg agcacattta 111720 ttgcaaacaa ttatttgtgc tacttttacc gtcgtcgccg atcacgatca cgctcacgat 111780 cacgctcgcg atcacgttct cctcattgca gacctcgttc gcgctctcct cattgcagac 111840 ctcgttcgcg atctcggtcc cggtctagat cgcggtcacg ttcatcgtct cccaggcgag 111900 ggcgtcgaca aatattcgac gcgctggaaa agattcgtca tcaaaacgac atgttgatga 111960 gcaacgtcaa ccaaataaat ctcaaccaaa ctaatcaatt tttagaattg tccaacatga 112020 tgacgggcgt gcgcaatcaa aacgtgcagc tcctcgcggc gttggaaacc gctaaagatg 112080 ttattttgac cagattaaac acattgcttg ccgagattac agactcgtta cccgacttga 112140 cgtccatgtt agataaatta gctgaacaat tgttggacgc catcaacacg gtgcagcaaa 112200 cgctgcgcaa cgagttgaac aacaccaact ctattttgac caatttagcg tcaagcgtca 112260 caaacatcaa cggtacgctc aacaatttgc tagccgctat cgaaaactta gtaggcggcg 112320 gcggcggtgg caattttaac gaagccgaca gacaaaaact ggacctcgtg tacactttgg 112380 ttaacgaaat caaaaatata ctcacgggaa cgctgacaaa aaaataagca tgtccgacaa 112440 aacaccaaca aaaaagggtg gcagccatgc catgacgttg cgagagcgcg gcgtaacaaa 112500 acccccaaaa aagtctgaaa agttgcagca atacaagaaa gccatcgctg ccgagcaaac 112560 gctgcgcacc acagcagatg tttcttcttt gcagaacccc ggggagagtg ccgtttttca 112620 agagttggaa agattagaga atgcagttgt agtattagaa aatgaacaaa aacgattgta 112680 tcccatatta gatacgcctc ttgataattt tattgtcgca ttcgtgaatc cgacgtatcc 112740 catggcctat tttgtcaata ccgattacaa attaaaacta gaatgtgcca gaatcagaag 112800 cgatttactt tacaaaaaca aaaacgaagt cgctatcaac aggcctaaga tatcgtcttt 112860 taaattgcaa ttgaacaacg taattttaga cactatagaa actattgaat acgatttaca 112920 aaataaagtt ctcacaatta ctgcacctgt tcaagatcaa gaactaagaa aatccattat 112980 ttattttaat attttaaata gtgacagttg ggaagtacca aagtatatga aaaaattgtt 113040 tgatgaaatg caattggaac ctcccgtcat tttaccatta ggtctttaga tttggtaagg 113100 ctagcacgtc gacatcatgt ttgcgtcgtt gacctcagag caaaagctgt tattaaaaaa 113160 atataaattt aacaattatg tgaaaacgat cgagttgagt caagcgcagt tggctcattg 113220 gcgttcaaac aaagatattc agccaaaacc tttggatcgt gcagaaattt tacgtgtcga 113280 aaaggccacc aggggacaaa gcaaaaatga gctgtggacg ctattgcgtt tggatcgcaa 113340 cacagcgtct gcatcgtcca actcgtccgg caacatgtta caacgaccag cgcttttgtt 113400 tggaaacgcg caagaaagtc acgtcaaaga aaccaacggc atcatgttag accacatgcg 113460 cgaaatcata gaaagtaaaa ttatgagcgc ggtcgttgaa acggttttgg attgcggcat 113520 gttctttagc cccttgggtt tgcacgccgc ttcgcccgat gcgtattttt ctctcgccga 113580 cggaacgtgg atcccagtgg aaataaaatg tccgtacaat taccgagaca cgaccgtgga 113640 gcagatgcgt gtcgagttgg ggaacggcaa tcgcaagtat cgcgtgaaac acaccgcgct 113700 gttggttaac aagaaaggca cgccccagtt cgaaatggtc aaaacggatg cgcattacaa 113760 gcaaatgcaa cggcagatgt atgtgatgaa cgcgcctatg ggcttttacg tggtcaaatt 113820 caaacaaaat ttggtggtgg tttctgtgcc gcgcgacgaa acgttctgca acaaagaact 113880 gtctacggaa aacaacgcgt acgtggcgtt tgccgtggaa aactccaact gcgcgcgcta 113940 ccaatgcgcc gacaagcgac ggctttcatt caaaacgcac agctgcaatc acaactatag 114000 tggtcaagaa atcgatgcta tggtcgatcg cggaatatat ttagattatg gacatttaaa 114060 atgtgcgtac tgtgatttta gctcagacag tcgggaaacg tgcgattctg ttttaaaacg 114120 cgagcacacc aactgcaaaa gttttaactt gaaacataaa aactttgaca atcctacata 114180 ctttgattat gttaaaagat tgcaaagttt gctaaagagt caccacttta gaaacgacgc 114240 taaaacactt gcctattttg gttactattt aactcataca ggaaccctga agaccttttg 114300 ctgcggatcg caaaactcgt cgcccaccaa acacgatcat ttaaacgact gtgtatatta 114360 tttggaaata aaataaacct ttatattata tataattctt ttatttatac atttgtttat 114420 acaattttat ttacgacaaa tattgactcg ttgttcagaa agtttaataa gcttgtcaat 114480 ttcttcggct tgcaaagggc tgccaacgcg ttcgttttga atgcgcgtaa tccggtttac 114540 ggtattgttg gcgcgaacaa taaactcctc aactggcaaa ttaacaattt tgtttgcgta 114600 ctcattgtgc actgcggcca ggttttgtag aatgttttcg ggaaaaatgg caattctatt 114660 aaatttgaca tgtttttgat tgtatacata gttttgatat tcttccagcg taggatattt 114720 gtttaaactc ttgacgcatt caatgtacaa tttgtgcagt gacaaaattc tgttaaaatc 114780 caaacgagaa catttctcaa aagttatttc ttgaccgttg aaatgtacac tttgcaattg 114840 tttcaataaa ctgtcgtaaa aagtttttcc ttcttcaagc acaaacgcgg ggcgcatcgt 114900 gttatctaca acgcttatgt acttgtcaaa atcttcaatt atatgataga aatacaaata 114960 tctctccgcg tttatggacg tgtcgtttaa aacatgttcg tcaacaactc cgttatgatt 115020 tactttcaaa aatttcaaat cttgcaaagc gtccgcgttg gtcaacttgt tgataataaa 115080 tttgtctttg cattcaaacg ctctgtttgc aatccactcc acagcgtcca aaacggacat 115140 gcgtttaaac atgttgatac gttttagaca atacgctcgt ttttttaccg cctcaacgtt 115200 cacgtccgtg tagtcgcacc attgcaggat ttgcaacatg tcctcggcaa aatgcgcgaa 115260 ctgccgcagc ttttcctttc caaaatgttg attgtcgtgt ttaaaaagca acgttgaaat 115320 ttccgagaca taccacaaag ccgtgggcaa ttttactttg atcagcggct ccatagccag 115380 gttgctgaac ccgatcatgc attccgtgtt gttaatgcgg taaatgacat agcgtttaaa 115440 gtagtccttt acattatcgt caatgtattc tgcgtcgttt atgtgcttgt acagcaaata 115500 gtacataagg cccgcgttaa acgcgacctt tttagcgtca aaatacgtgc acgccaacac 115560 gtaatcgttg tattcgtcga attgctcgtt gggcactatg gcgcccgtaa aagggcgtct 115620 gctgcgcggt gacaaacgcg ttccatgctg aatcaactgc ttcaaacttt ccaaattata 115680 acaatattca attgaatttt taatctcttt attttggctc cataaaagag gaaactcgag 115740 tcggctttta aacttggtca aactgccctg aattgtttca aacaagttgt aatgtgttaa 115800 caatatggcc ggcacaccgc tatcgttggc taaaatacaa tcggggaatc gaatattttc 115860 tacgttgctg taatcgtacg cttcgtcgtc gtcgttggca acaacatcgt cggtttcggc 115920 gtccacgctc gctaacttgt tctgatagtg taaatttttc attacatcaa aagcgtatga 115980 cttgttgcga ttgtgcaaat aatttatggc cgtgctaatg gtgctgtcga taattttatc 116040 aaaattgaga acatcggcgt tatacaacgt tttataaaat tctgttgact tgaacgtgtt 116100 tacaaactca tttttatttt taatctggtc aaaattcata ctagaattgt tagtttgttt 116160 gatttcgctg aatagccgct ggcggagacg cttcagcttg tccacctcgt ttaacacgtt 116220 ggcgtccgtc ggcatggaat tgataaattt gaaccgaaca aaagacagca gttcatcttt 116280 tttcgatata aaattttcgg ttgtaatgat atcgtagtta aattctttgg ttaaattgac 116340 ccattcgacc atttcatcgt tgcgataaat cttgcagtcc gagttgttga caaacgccga 116400 ggcaacggac aaatcaatct gttccgtgtt attattgatg gcataaaaca caatgcgttc 116460 gaaactaaac ggtttttcgt ttagcaaatt tttgcaaacg tttgcctcat ttttggaaat 116520 ttggccgtcg gtcaccatgt acaaaagttt caacttgccg tcgagcaagt ttatattctt 116580 gtgaatccac tttatgaatt cgctgggcct ggtgtcagta ccctcgccat tgcggcgcaa 116640 ataacgactc ttgacgtctc cgatttcttt ttggcggcaa taagcactcc aatgcaaata 116700 caaaactttg tcgcaactac tgatgttttc gatttcattc tgaaattgtt ctaaagtttg 116760 taacgcgttc ttgttaaagt aatagtccga gtttgtcgac aaggaatcgt cggtggcgta 116820 cacgtagtag ttaatcatct tgttgattga tatttaattt tggcgacgga tttttatata 116880 cacgagcgga gcggtcacgt tctgtaacat gagtgatcgt gtgtgtgtta tctctggcag 116940 cgcgatagtg gtcgcgaaaa ttacacgcgc gtcgtaacgt gaacgtttat attataaata 117000 ttcaacgttg cttgtattaa gtgagcattt gagctttacc attgcaaaat gtgtgtaatt 117060 tttccggtag aaatcgacgt gtcccagacg attattcgag attgtcaggt ggacaaacaa 117120 accagagagt tggtgtacat taacaagatt atgaacacgc aattgacaaa acccgttctc 117180 atgatgttta acatttcggg tcctatacga agcgttacgc gcaagaacaa caatttgcgc 117240 gacagaataa aatcaaaagt cgatgaacaa tttgatcaac tagaacgcga ttacagcgat 117300 caaatggatg gattccacga tagcatcaag tattttaaag atgaacacta ttcggtaagt 117360 tgccaaaatg gcagcgtgtt gaaaagcaag tttgctaaaa ttttaaagag tcatgattat 117420 accgataaaa agtctattga agcttacgag aaatactgtt tgcccaaatt ggtcgacgaa 117480 cgcaacgact actacgtggc ggtatgcgtg ttgaagccgg gatttgagaa cggcagcaac 117540 caagtgctat ctttcgagta caacccgatt ggtaacaaag ttattgtgcc gtttgctcac 117600 gaaattaacg acacgggact ttacgagtac gacgtcgtag cttacgtgga cagtgtgcag 117660 tttgatggcg aacaatttga agagtttgtg cagagtttaa tattgccgtc gtcgttcaaa 117720 aattcggaaa aggttttata ttacaacgaa gcgtcgaaaa acaaaagcat gatctacaag 117780 gctttagagt ttactacaga atcgagctgg ggcaaatccg aaaagtataa ttggaaaatt 117840 ttttgtaacg gttttattta tgataaaaaa tcaaaagtgt tgtatgttaa attgcacaat 117900 gtaactagtg cactcaacaa aaatgtaata ttaaacacaa ttaaataaat gttaaaattt 117960 attgcctaat attattttgt cattgcttgt catttattaa tttggatgat gtcatttgtt 118020 tttaaaattg aactggcttt acgagtagaa ttctacgcgt aaaacacaat caagtatgag 118080 tcataatctg atgtcatgtt ttgtacacgg ctcataaccg aactggcttt acgagtagaa 118140 ttctacttgt aatgcacgat cagtggatga tgtcatttgt ttttcaaatc gagatgatgt 118200 catgttttgc acacggctca taaactcgct ttacgagtag aattctacgt gtaacgcacg 118260 atcgattgat gagtcatttg ttttgcaata tgatatcata caatatgact catttgtttt 118320 tcaaaaccga acttgattta cgggtagaat tctacttgta aagcacaatc aaaaagatga 118380 tgtcatttgt ttttcaaaac tgaactcgct ttacgagtag aattctacgt gtaaaacaca 118440 atcaagaaat gatgtcattt gttataaaaa taaaagctga tgtcatgttt tgcacatggc 118500 tcataactaa actcgcttta cgggtagaat tctacgcgta aaacatgatt gataattaaa 118560 taattcattt gcaagctata cgttaaatca aacggacgtt atggaattgt ataatattaa 118620 atatgcaatt gatccaacaa ataaaattgt aatagagcaa gtcgacaatg tggacgcgtt 118680 tgtgcatatt ttagaaccgg gtcaagaagt gttcgacgaa acgctaagcc agtaccacca 118740 atttcctggc gtcgttagtt cgattatttt cccgcaactc gtgttaaaca caataattag 118800 cgttttgagc gaagacggca gtttgctcac gttgaaactc gaaaacactt gttttaattt 118860 tcacgtgtgc aataaacgct ttgtgtttgg caatttgcca gcggcggtcg tgaataatga 118920 aacgaagcaa aaactgcgca ttggagctcc aatttttgcc ggcaaaaagc tggtttcggt 118980 cgtgacggcg tttcatcgtg ttggcgaaaa cgaatggctg ttaccggtga cgggaattcg 119040 agaggcgtcc cagctgtcgg gacatatgaa ggtgctgaac ggcgtccgtg ttgaaaaatg 119100 gcgacccaac atgtccgtct acgggactgt gcaattgccg tacgataaaa ttaaacagca 119160 tgcgctcgag caagaaaata aaacgccaaa cgcgttggag tcttgtgtgc tattttacaa 119220 agattcagaa atacgcatca cttacaacaa gggggactat gaaattatgc atttgaggat 119280 gccgggacct ttaattcaac ccaacacaat atattatagt taaataagaa ttattatcaa 119340 atcatttgta tattaattaa aatactatac tgtaaattac attttattta caatcatgtc 119400 aaagcctaac gttttgacgc aaattttaga cgccgttacg gaaactaaca caaaggttga 119460 cagtgttcaa actcagttaa acgggctgga agaatcattc cagcttttgg acggtttgcc 119520 cgctcaattg accgatctta acactaagat ctcagaaatt caatccatat tgaccggcga 119580 cattgttccg gatcttccag actcactaaa gcctaagctg aaaagccaag cttttgaact 119640 cgattcagac gctcgtcgtg gtaaacgcag ttccaagtaa atgaatcgtt tttaaaataa 119700 caaatcaatt gttttataat attcgtacga ttctttgatt atgtaataaa atgtgatcat 119760 taggaagatt acgaaaaata taaaaaatat gagttctgtg tgtataacaa atgctgtaaa 119820 cgccacaatt gtgtttgttg caaataaacc catgattatt tgattaaaat tgttgttttc 119880 tttgttcata gacaatagtg tgttttgcct aaacgtatac tgcataaact ccatgcgagt 119940 gtatagcgag ctagtggcta acgcttgccc caccaaagta gattcgtcaa aatcctcaat 120000 ttcatcaccc tcctccaagt ttaacatttg gccgtcggaa ttaacttcta aagatgccac 120060 ataatctaat aaatgaaata gagattcaaa cgtggcgtca tcgtccgttt cgaccatttc 120120 cgaaaagaac tcgggcataa actctatgat ttctctggac gtggtgttgt cgaaactctc 120180 aaagtacgca gtcaggaacg tgcgcgacat gtcgtcggga aactcgcgcg gaaacatgtt 120240 gttgtaaccg aacgggtccc atagcgccaa aaccaaatct gccagcgtca atagaatgag 120300 cacgatgccg acaatggagc tggcttggat agcgattcga gttaacgctt tggcagtcac 120360 ggtcagcgtt ttgatggcga tcacgttgag cgagtgcact aacgcggctt tgtaagtctc 120420 tcccaacatg cgcacggtca cgcgccgagt cgtgctaagc aacatgtgtt tcatggccgg 120480 aatgagagaa gtgttaattt ttttcaacat gcttttaaac ccggacatta gcatatcaaa 120540 gccaatgtcc gtagcaatac cgaaaacgag cgcgtaatct tccaaaaacg atgttataat 120600 tgactccaag tcttggtcgc tgattgaacg gtcgagcgcc tcgaaatgtt cgacacgtgc 120660 acgttcgtta ccgcggtaat tgtatgcgat cggagtttta gtaaagccgg tttcggccgt 120720 gtacgtgatc tggacgggcg acccgttgac gatcatgccc aaatcgttta gtgttggatt 120780 tttgttaaaa agtttttcaa attccaagtc tgtggcgtta tcgcgcacgc tgcgccattg 120840 cgctagtatt gcgttggagt ccacgttggg tcgtggcggt agtatgctgg aaggcgcttt 120900 gtaatcaaaa tcgcgcagtt cgctaaaaat gttgttggcc agcattttga aagtgacaaa 120960 gatcgtgtcg cccagcacga atccgatgag cgattcccac catctaaacg aacaaccgcc 121020 gttgaatagc tctctgccga aacgtcgaca gtaggcttcg ttgaattcgc ctttaaagcg 121080 ttcgggaaac aaggggtcgg gatcgggccg aacgttaaaa gccggcacat cgtccacgcc 121140 catgatcgtg tgttcttcgg tgcgcaagta tgggctgtta aagtacattt tggacagcga 121200 gtccactaag atgcatttgt tgtcgagcgt gtatctaaac tcggcagact gaacttgggt 121260 ttcggcgcct tcacgcatgg ccgccgccct gtccaggtgg tagcacgcgg gctgcgcgta 121320 acccacgcta gtctcggagg tctgcgtgta catgaacggc gtcgtgttgg acacgacgcc 121380 ggtttcgtga aacggatagc agctcatgct ttcacacccg cgcttgctga aagccagttt 121440 gacggccagc gctttgtcgg ccaatttcgg cggcacataa taatcgtcgt cacttgacgc 121500 gggacgcagc gtgtagtcga ttagtatatg cggaaacctg gtgcgccatc tcgaaataaa 121560 ctcgagacga tgcatatgta tggcatacct actggcatta gttaaatcga cggctgttaa 121620 aaccgccatg ttatatagga cttaaaataa acaacaatat ataatgaaat atttattaga 121680 ttatattata gcaatacatt tacatttatt ataacaatac tttttattta atctgattat 121740 attataacga tacattttta tttagacatt gttatttaca atattaatta actttttata 121800 catttttaaa tcataatata taatcatttc gttgtgcatt tcaaagcttt tgatagcttc 121860 aaagtaatac atgaatttag agtattcagg aaaatgataa acgttggtaa acccgcattt 121920 ggtacaatat aacacgggat ttttataata cagtttagtt tttttacaca atttgcaata 121980 gttgttagtt gtaggtttca aaggaaacgt gattgcgccg tccaatacct gggtaaactt 122040 tttgacttta acagtggcaa acacggttcc tttgataccc gaaaatcggt tgtcttgcag 122100 agcggccatc atttcgcttg gctcttgaag tataaaacag ttgacgtcat ccaccacgtc 122160 gggtctggtg cacatgcttc ggtagcgctg caacactata ttggtgtatg tttccctgag 122220 aacgagaccg ccggtggtgc taagatcgat tgtttgaatg cgctcgttgg gctctttgtg 122280 atttcgaatt atgcgccgaa ttatttcaaa cactttgcag ttgtgatcgt caattctcaa 122340 ttctttaact tccgtcgtgt gctctaaact tacagggaaa atgtattggt aaaaaaacct 122400 ctctctggct aaatagctga ggtcgaccaa attgatagaa ggatatattt cgtacgaggt 122460 ttttggaacg ttgtgatata gatagcattt ttgacagcag atgtctatgc ggtcaggatc 122520 gtccaacggc ttttcgatgt gaaccacaac atacaaaaac cattcgcgcg tgttgtcttt 122580 gaatctataa ttgcaagtgg tgcatcgcga atcgctcatg tgctccatag tcttcttgta 122640 tttcacaggc ctgcttgcaa atttgcccgt catgcgcata tctttgctgt ttatgtagcc 122700 cataatgtaa ttggtggaaa attttagcgt ggctttcatg atgtcgcgtt ctaaatcgct 122760 catgaaatgc atacgtagat cgcgctcttg tttgaaatcc agtttgtcgc tgtacgcggg 122820 caaaccttca aacttgttcc caaactcggg cggcacaaaa tatccatctt ttctgttgac 122880 gactggtttt ttacttacaa tgctgctgtg ctccaacggc ttggccggag aggtgcgcgt 122940 aggctgttta ggcggagaga tgcgcgtagg tggtttgatg ttagattttg gcggcggacg 123000 aacaggcgac ggcggcgagt tggcggcagg cgctggcaaa gatttggcac gacccttgcc 123060 cccggtcctt ggcgcgtcaa aaatgttatt ctctcgaaaa aaacggttca ttgtaactgt 123120 tagttagcac tcagaaatca acacgatact gtgcacgttc agccatcgag aggctttata 123180 tatggaaacc ttatctatag agataagatt gtatatgcgt aggagagcct ggtcacgtag 123240 gcactttgcg cacggcacta gggctgtgga ggggacaggc tatataaagc ccgtttgccc 123300 aactcgtaaa tcagtatcaa ttgtgctccg gcgcacacgc tcgcttgcgc gccggatagt 123360 ataagtaatt gataacgggc aacgcaacat gataagaacc agcagtcacg tgctgaacgt 123420 ccaggaaaat ataatgacgt caaactgtgc gtcatcgcca tattcgtgcg aggcaacgtc 123480 cgcttgcgca gaagctcaac aggtaatgat cgataacttt gttttctttc acatgtacaa 123540 cgccgacata caaattgacg caaagctgca atgcggcgtg cgctcggccg cgtttgcaat 123600 gatcgacgat aaacatttgg aaatgtacaa gcatagaata gagaataaat ttttttatta 123660 ctatgatcaa tgtgccgaca ttgccaaacc cgaccgtctg cccgatgacg acggcgcgtg 123720 ctgtcaccat tttatttttg atgcccaacg tattattcaa tgtattaaag agattgaaag 123780 cgcgtacggc gtgcgtgatc gcggcaatgt aatagtgttt tatccgtact tgaaacagtt 123840 gcgagacgcg ttgaagctaa ttaaaaactc ttttgcgtgt tgttttaaaa ttataaattc 123900 tatgcaaatg tacgtgaacg agttaatatc aaattgcctg ttgtttattg aaaagctgga 123960 aactattaat aaaactgtta aagttatgaa tttgtttgta gacaatttgg ttttgtacga 124020 atgcaatgtt tgtaaagaaa tatctacgga tgaaagattt ttaaagccaa aagaatgttg 124080 cgaatacgct atatgcaacg cgtgctgcgt taacatgtgg aagacggcca ccacgcacgc 124140 aaaatgtcca gcgtgcagga catcgtataa ataagcacgc aacgcaaaat gagtggtggc 124200 ggcaacttgt tgactctgga aagagatcat tttaaatatt tatttttgac cagctatttt 124260 gatttaaaag ataatgaaca tgttccttca gagcctatgg catttattcg caattacttg 124320 aattgcacgt ttgatttgct agacgatgcc gtgctcatga actatttcaa ttacttgcaa 124380 agcatgcaat tgaaacattt ggtgggcagc acgtcgacaa acattttcaa gtttgtaaag 124440 ccacaattta gatttgtgtg cgatcgcaca actgtggaca ttttagaatt tgacacgcgc 124500 atgtacataa aacccggcac gcccgtgtac gccacgaacc tgttcacgtc caatccccgc 124560 aagatgatgg ctttcctgta cgctgaattt ggcaaggtgt ttaaaaataa aatattcgta 124620 aacatcaaca actacggctg cgtgttggcg ggcagtgccg gtttcttgtt cgacgatgcg 124680 tacgtggatt ggaatggtgt gcgaatgtgt gcggcgccgc gattagataa caacatgcat 124740 ccgttccgac tgtatctact gggcgaggac atggctaagc actttgtcga taataatata 124800 ctaccgccgc acccttctaa cgcaaagact cgcaaaatca acaattcaat gtttatgctg 124860 aaaaactttt acaaaggtct gccgctgttc aaatcaaagt acacggtggt gaacagcact 124920 aaaatcgtga cccgaaaacc caacgatata tttaatgaga tagataaaga attaaatggc 124980 aactgtccgt ttatcaagtt tattcagcgc gactacatat tcgacgccca gtttccgcca 125040 gatttgcttg atttgctaaa cgaatacatg accaaaagct cgatcatgaa aataattacc 125100 aagtttgtga ttgaagaaaa ccccgctatg agcggtgaaa tgtctcgcga gattattctt 125160 gatcgctact cagtagacaa ttatcgcaag ctgtacataa aaatggaaat aaccaaccag 125220 tttcctgtca tgtacgatca tgaatcgtcg tacatttttg tgagcaaaga ctttttgcaa 125280 ttgaaaggca ctatgaacgc gttctacgcg cccaagcagc gtatattaag tattttggcg 125340 gtgaatcgtt tgtttggcgc cacggaaacg atcgactttc atcccaacct gctcgtgtac 125400 cggcagagtt cgccgccggt ccgtttgacg ggcgacgtgt atgttgttga taagaacgaa 125460 aaagtttttt tggtcaaaca cgtgttctca aacacggtgc ctgcatatct tttaataaga 125520 ggtgattacg aaagttcgtc tgacttgaaa tcccttcgcg atttgaatcc gtgggttcag 125580 aacacgcttc tcaaattatt aatccccgac tcggtacaat aatatgattt acactgatcc 125640 cactactggc gctacgacta gcacagacgc gccgtccaca aactatttaa acaggctaac 125700 tccaaacatg ttcttgacca tcttggctgt agtagtaatt attgctttaa taattatatt 125760 tgttcaatct agcagtaatg gaaacagctc ggggggtaat gtacctccaa acgccctggg 125820 gggttttgta aatcctttaa acgctaccat gcgagctaat ccctttatga acacgcctca 125880 aaggcaaatg ttgtagataa gtgtataaaa aatgaaacgt atcaaatgca acaaagttcg 125940 aacggtcacc gagattgtaa acagcgatga aaaaatccaa aagacctacg aattggctga 126000 atttgattta aaaaatctaa gcagtttaga aagctatgaa actctaaaaa ttaaattggc 126060 gctcagcaaa tacatggcta tgctcagcac cctggaaatg actcaaccgc tgttggaaat 126120 atttagaaac aaagcagaca ctcggcagat tgccgccgtg gtgtttagca cattagcttt 126180 tatacacaat agattccatc cccttgttac taattttact aacaaaatgg agtttgtggt 126240 cactgaaacc aacgacacaa gcattcccgg agaacccatt ttgtttacgg aaaacgaagg 126300 tgtgctgctg tgttccgtgg acagaccgtc tatcgttaaa atgctaagcc gcgagtttga 126360 caccgaggct ttagtaaact ttgaaaacga caactgcaac gtgcggatag ccaagacgtt 126420 tggcgcctct aagcgcaaaa acacgactcg cagcgatgat tacgagtcaa ataaacaacc 126480 caattacgat atggatttga gcgattttag cataactgag gttgaagcca ctcaatattt 126540 aactctgttg ctgaccgtcg aacatgccta tttacattat tatattttta aaaattacgg 126600 ggtgtttgaa tattgcaaat cgctaacgga ccattcgctt tttaccaaca aattgcgatc 126660 gacaatgagc acaaaaacgt ctaatttact gttaagcaaa ttcaaattta ccattgaaga 126720 ttttgacaaa ataaactcaa attctgtaac atcagggttt aatatatata attttaataa 126780 ataattaaat aatatacaat gtttttatta attatatttt taatattaat taaagtatta 126840 atatttaaaa aaatgaatca aattcatcta aagtgtcaca gcgataaaat ttgtcctaaa 126900 gggtattttg gcctcaacgc cgatccctat gattgcacgg cgtattatct gtgtccgcat 126960 aaagtgcaaa tgttttgcga attaaatcac gaatttgact tggactccgc cagctgcaag 127020 cctatcgtgt acgatcacac gggcagcggg tgtacggctc gcatgtatag aaacttgtta 127080 ctatgaagag cgggtttcca gttgcacaac actattatcg atttgcagtt cgggacataa 127140 atgtttaaat atatcgatgt ctttgtgatg cgcgcgacat ttttgtaggt tattgataaa 127200 atgaacggat acgttgcccg acattatcat taaatccttg gcgtagaatt tgtcgggtcc 127260 attgtccgtg tgcgctagca tgcccgtaac ggacctcgta cttttggctt caaaggtttt 127320 gcgcacagac aaaatgtgcc acacttgcag ctctgcatgt gtgcgcgtta ccacaaatcc 127380 caacggcgca gtgtacttgt tgtatgcaaa taaatctcga taaaggcgcg gcgcgcgaat 127440 gcagctgatc acgtacgctc ctcgtgttcc gttcaaggac ggtgttatcg acctcagatt 127500 aatgtttatc ggccgactgt tttcgtatcc gctcaccaaa cgcgtttttg cattaacatt 127560 gtatgtcggc ggatgttcta tatctaattt gaataaataa acgataaccg cgttggtttt 127620 agagggcata ataaaagaaa tattgttatc gtgttcgcca ttagggcagt ataaattgac 127680 gttcatgttg gatattgttt cagttgcaag ttgacactgg cggcgacaag atcgtgaaca 127740 accaagtgac tatgacgcaa attaatttta acgcgtcgta caccagcgct tcgacgccgt 127800 cccgagcgtc gttcgacaac agctattcag agttttgtga taaacaaccc aacgactatt 127860 taagttatta taaccatccc accccggatg gagccgacac ggtgatatct gacagcgaga 127920 ctgcggcagc ttcaaacttt ttggcaagcg tcaactcgtt aactgataat gatttagtgg 127980 aatgtttgct caagaccact gataatctcg aagaagcagt tagttctgct tattattcgg 128040 aatcccttga gcagcctgtt gtggagcaac catcgcccag ttctgcttat catgcggaat 128100 cttttgagca ttctgctggt gtgaaccaac catcggcaac tggaactaaa cggaagctgg 128160 acgaatactt ggacaattca caaggtgtgg tgggccagtt taacaaaatt aaattgaggc 128220 ctaaatacaa gaaaagcaca attcaaagct gtgcaaccct tgaacagaca attaatcaca 128280 acacgaacat ttgcacggtc gcttcaactc aagaaattac gcattatttt actaatgatt 128340 ttgcgccgta tttaatgcgt ttcgacgaca acgactacaa ttccaacagg ttctccgacc 128400 atatgtccga aactggttat tacatgtttg tggttaaaaa aagtgaagtg aagccgtttg 128460 aaattatatt tgccaagtac gtgagcaatg tggtttacga atatacaaac aattattaca 128520 tggtagataa tcgcgtgttt gtggtaactt ttgataaaat taggtttatg atttcgtaca 128580 atttggttaa agaaaccggc atagaaattc ctcattctca agatgtgtgc aacgacgaga 128640 cggctgcaca aaattgtaaa aaatgccatt tcgtcgatgt gcaccacacg tttaaagctg 128700 ctctgacttc atattttaat ttagatatgt attacgcgca aaccacattt gtgactttgt 128760 tacaatcgtt gggcgaaaga aaatgtgggt ttcttttgag caagttgtac gaaatgtatc 128820 aagataaaaa tttatttact ttgcctatta tgcttagtcg taaagagagt aatgaaattg 128880 agactgcatc taataatttc tttgtatcgc cgtatgtgag tcaaatatta aagtattcgg 128940 aaagtgtgca gtttcccgac aatcccccaa acaaatatgt ggtggacaat ttaaatttaa 129000 ttgttaacaa aaaaagtacg ctcacgtaca aatacagcag cgtcgctaat cttttgttta 129060 ataattataa atatcatgac aatattgcga gtaataataa cgcagaaaat ttaaaaaagg 129120 ttaagaagga ggacggcagc atgcacattg tcgaacagta tttgactcag aatgtagata 129180 atgtaaaggg tcacaatttt atagtattgt ctttcaaaaa cgaggagcga ttgactatag 129240 ctaagaaaaa caaagagttt tattggattt ctggcgaaat taaagatgta gacgttagtc 129300 aagtaattca aaaatataat agatttaagc atcacatgtt tgtaatcggt aaagtgaacc 129360 gaagagagag cactacattg cacaataatt tgttaaaatt gttagcttta atattacagg 129420 gtctggttcc gttgtccgac gctataacgt ttgcggaaca aaaactaaat tgtaaatata 129480 aaaaattcga atttaattaa ttatacatat attttgaatt taattaatta tacatatatt 129540 ttatattatt tttgtctttt attatcgagg ggccgttgtt ggtgtggggt tttgcataga 129600 aataacaatg ggagttggcg acgttgctgc gccaacacca cctcctcctc ctcctttcat 129660 catgtatctg tagataaaat aaaatattaa acctaaaaac aagaccgcgc ctatcaacaa 129720 aatgataggc attaacttgc cgctgacgct gtcactaacg ttggacgatt tgccgactaa 129780 accttcatcg cccagtaacc aatctagacc caagtcgcca actaaatcac caaacgagta 129840 aggttcgatg cacatgagtg tttggcccgc aggaagatcg ctaatatcta cgtattgagg 129900 cgaatctggg tcggcggacg gatcgctgcc gcgacaaact gttttttcta cttcatagtt 129960 gaatccttgg cacatgttgg ttagttcggg cggattgtta ggcaacaagg ggtcgaatgg 130020 gcaaatggta acatccgact gatttagatt ggggtcttga cgacaagtgc gctgcaataa 130080 caagcaggcc tcggcgattt ctccggcgtc tttaccttgc acataataac ttccgccggt 130140 gttattgatg gcgttgatta tatcttgtac tagtgtggcg gcgctaaaca agaaatagcc 130200 gccggtggcc aagagtatgc ccgttcctcc tacttttaag ctttgcatgt aactatgtag 130260 acgggggttt tgctgcagtg cgttttgaac accttcgggc gtgcgcacgt tggtttccgg 130320 gaagttttgt ttgactgcat tggatcgcgt ctgcttggtg tggtaattaa agtctggcac 130380 gttgtccacg cgccgcaatt ggctcaatga gtttatttga gggtctgaaa tgccctgaaa 130440 tactccgcgt atgttgggga catcattgtt acgagtaatt ctgtttatgt ctgaagtgct 130500 cacaaactgg ttgttagata gttgatagcc cggctgaaat ctgttgtttc caatgttgcg 130560 tacactgggc gcgttgagca catttgtgaa accggcggga gtgcttgtta aaagacgcgt 130620 attatcagta ataaaactgg cctgattagg atacaattta ttgactgcgc gaagatttga 130680 aaaaaaactc attttaaagc aaacttattt aataaatata tcacagtaaa ggttttgcaa 130740 aactgccgtc gtcaatacaa cacggcagcg gcgtcatgtt ggtaaaatct aatcttctcc 130800 ttgctttaga ttctgggcga gaaggcgcat ttgttgtgta agttatttcg acgtctgcat 130860 tatttgttgt gtaaggtatc tcgacgtatg aagcaacttt aacattgtta taattttttt 130920 taaatattga tgcgctccac ggcgcgcgtt gatacggatg atatctctcc attgtatgat 130980 cgctaaattt atataccgtt tcaataaata tgttaaaacc caacatgtta attataatat 131040 tcataatagt ttgtttgttt tcaataatta tttttactgt tttgaaatct aaaagaggtg 131100 acgatgacga atcagacgac gggttcagtt gctataacaa accaattgga gtaaattttc 131160 cgcatcctac tagatgtgac gctttctaca tgtgtgtcgg tttaaatcaa aaattagagt 131220 taatctgccc tgaaggattt gaatttgatc cagatgttaa aaattgtgtt cctatatcag 131280 attatggatg taccgctaac caaaactaaa aataaaataa aatttatata gattaatgaa 131340 ataaaattta tatagattaa taaaataaaa tttatttaat atattatact atttatatta 131400 tttacaacac ttaacgtcta gacataacag tttgtaactt agaaactaaa tcagagttac 131460 tgcgctcaaa ctctgaaaat ttggcttgag actcggccac ctgcttacgc aattgttctt 131520 gcagattatt cacagtcgat tgcaactctt ctgatttctt ggtagattct tgcaagtcat 131580 agtttgcctt ttgtaaatct aattcggcga cagcatgctt gtgtttaagc ataatgtagt 131640 cgctgtttaa catggtcatt ttatgttcaa cttggctggt cttggctcgc agctcggaca 131700 gttctttttg caattgctcc acatagttca agtccgtggt gtgattgttg accgtgttat 131760 tttctaaaag ctcgcgccaa tgctgtttga tggaatcctg gttacgagtg acgttaatgg 131820 gcataaattc tacatacccg tgcttattgt acacgcgaca atctgatgaa gtagcgctgc 131880 aaaaacattt gtacacagaa ttgtccataa ttatcttgac ataacacttg aaacacacag 131940 catggttaca atgaatcgaa gtcacaaacg aggaatttac gtttttagtg tctttaaaag 132000 tagtaaaaca aatattacac gaaacctcta cttcttcttc gggttctgat tgctgctgct 132060 gctgctgctg cggctgcgga gactgcggcg aggcaaacaa atctggcgac tgtggtatta 132120 cgtaattcgg cgaataagat ggactataag tgggagacct tggggcaatc tcattcatca 132180 gctgagcctc aagatctaaa cctcgttgca gagccctctg cgcagctgtc tccgacgcaa 132240 tgttatcctg gtactgctgg gcagtgatgt cgggaaaccg ttcacgatcc acattttcac 132300 tattaattag tatgacgtca tcctcttgac ttaatagcgg atcgtcattg ctaatgttaa 132360 cctgaccgtg cacgtaatac gtgacaccct gacgatggta ggtgcgcgtc aacggctcgt 132420 tgacgttccc gataatctgc acgttttctt cgctgacacg ctgctcctga cgccgctcct 132480 gacggcgatg gctgcgactg cttgaagacg gctggctgcg actgcttgaa gacggctggg 132540 cttcgggaga tgttgtaaag ttgatgcggc gacggctgag agacagcctg tggcggcggc 132600 tgctgctggg agtggcggcg ttgatttggc gactcatggc tgggctggta ggatactgtt 132660 cactaggctg tgaggcttga actgtgctta cgagtagaac ggcagctgta tttatactgt 132720 ttatcagtac tgcacgactg ataagacaat agtggtgggg gaacttgcca ggcaaaaatg 132780 aacttttttg taatgcaaaa aagttgatag tgtagtagta tattgggagc gtatcgtaca 132840 gtgtagacta ttctaataaa atagtctacg atttgtagag attgtactgt atatggagtg 132900 tcaggcaaaa gtgaactttt ttgcattgca aaaaaattca ttttaaattt atcatatcac 132960 aggctgcagt ttctgttatc tgtcccccac tcaggcgtgc agctataaaa gcaggcactc 133020 accaactcgt aagcacagtt cgttgtgaag tgaacacgga gagcctgcca ataagcaaaa 133080 tgccaaggga caccaacaat cgccaccggt ctacgccata tgaacgtcct acgcttgaag 133140 atctccgcag acagttgcaa gacaatttgg acagcataaa cccccgagac agaatgcaag 133200 aagaacaaga agaaaacctg cgctatcaag tgcgtagaag gcagcgtcaa aaccagctcc 133260 gctccataca aatggaacag cagcgaatga tggcggaatt aaacaacgag ccggtgatta 133320 attttaaatt tgagtgtagt gtgtgtttag aaacatattc ccaacaatct aacgatactt 133380 gtcctttttt gattccgact acgtgcgacc acggtttttg tttcaaatgc gtcatcaatc 133440 tgcaaagcaa cgcgatgaat attccgcatt ccactgtgtg ctgtccattg tgcaataccc 133500 aggtaaaaat gtggcgttcc ttaaagccta acgctgttgt gacgtgtaag ttttacaaga 133560 aaactcaaga aagagttccg cccgtgcagc agtataaaaa cattattaaa gtgctacaag 133620 aacggagcgt gattagtgtc gaagacaacg acaataattg tgacataaat atggagaatc 133680 aggcaaagat agctgctttg gaagctgaat tggaagaaga aaaaaatcac agtgatcaag 133740 tagcttctga aaaccgacag ctgatagaag aaaatactcg tctcaatgaa cagattcaag 133800 agttgcagca tcaggtgagg acattggtgc cgcaacgtgg cattacggtt aatcagcaaa 133860 ttggccgtga cgacagtgcg ccagccgagc tgaacgagcg ttttcgctca cttgtctatt 133920 cgactatttc agagctgttt attgaaaatc gcgttcatag tattcaaaat tatgtttatg 133980 ccggaacttc tgctgctagt tcatgtgatg taaatgttac tgttaatttt gggtttgaaa 134040 attaatgtga tatgaaatgt atatataaaa atgatggaat aaataataaa catttttata 134100 ctttttatgt tttttttatt tcatgtgatt aagaaacttt taagatggat agtagtaatt 134160 gtattaaaat agatgtaaaa tacgatatgc cgttacatta tcaatgtgac aataacgcag 134220 ataaagacgt tgtaaatgcg tatgacacta tcgatgttga ccccaacaaa agatttataa 134280 ttaatcataa tcacgaacaa caacaagtca atgaaacaaa taaacaagtt gtcgataaaa 134340 cattcataaa tgacacagca acatacaatt cttgcataat aaaaatttaa atgacatcat 134400 atttgagaat aacaaatgac attatccctc gattgtgttt tacaagta 134448 <210> 3 <211> 296 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 3 Val Arg Arg Glu Ser Pro Lys His Arg Trp Cys Phe Thr Ile Asn Asn 1 5 10 15 Trp Thr Pro Thr Glu Trp Glu Ser Ile Val Glu Cys Gly Gly Ser Ile 20 25 30 Ala Arg Tyr Leu Ile Ile Gly Lys Glu Val Gly Lys Gly Gly Thr Pro 35 40 45 His Leu Gln Gly Tyr Val Asn Phe Lys Asn Lys Arg Arg Leu Ser Ser 50 55 60 Val Lys Arg Leu Pro Gly Phe Gly Arg Ala His Leu Glu Pro Ala Arg 65 70 75 80 Gly Ser His Lys Glu Ala Ser Glu Tyr Cys Lys Lys Glu Gly Asp Tyr 85 90 95 Leu Glu Ile Gly Glu Asp Ser Ser Ser Gly Thr Arg Ser Asp Leu Gln 100 105 110 Ala Ala Ala Arg Ile Leu Thr Glu Thr Ser Gly Asn Leu Thr Glu Val 115 120 125 Ala Glu Lys Met Pro Ala Val Phe Ile Arg Tyr Gly Arg Gly Leu Arg 130 135 140 Asp Phe Cys Gly Val Met Gly Leu Gly Lys Pro Arg Asp Phe Lys Thr 145 150 155 160 Glu Val Tyr Val Phe Ile Gly Pro Pro Gly Cys Gly Lys Thr Arg Glu 165 170 175 Ala Cys Ala Asp Ala Ala Ala Arg Glu Leu Gln Leu Tyr Phe Lys Pro 180 185 190 Arg Gly Pro Trp Trp Asp Gly Tyr Asn Gly Glu Gly Ala Val Ile Leu 195 200 205 Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Val Pro Phe Asp Glu Leu Leu Arg Ile Gly 210 215 220 Asp Arg Tyr Pro Leu Arg Val Pro Val Lys Gly Gly Phe Val Asn Phe 225 230 235 240 Val Ala Lys Val Leu Tyr Ile Thr Ser Asn Val Val Pro Glu Glu Trp 245 250 255 Tyr Ser Ser Glu Asn Ile Arg Gly Lys Leu Glu Ala Leu Phe Arg Arg 260 265 270 Phe Thr Lys Val Val Cys Trp Gly Glu Gly Gly Ile Lys Lys Asp Met 275 280 285 Glu Thr Val Tyr Pro Ile Asn Tyr 290 295 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 4 Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Lys Pro Arg Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Val Arg Arg Lys Leu Phe Ile Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val 35 40 45 Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His 50 55 60 Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr 65 70 75 80 Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro 85 90 95 Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp 100 105 110 Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu 115 120 125 Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr 130 135 140 Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly 145 150 155 160 Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr 165 170 175 Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro 180 185 190 Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile 195 200 205 Arg Tyr Lys Ser Val Leu 210 <210> 5 <211> 2000 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 5 tagtattacc cggcacctcg gaacccggat ccacggaggt ctgtagggag aaaaagtggt 60 atcccattat ggatgctccg caccgtgtga gtggatatac cgggcagtgg atgatgaagc 120 ggcctcgtgt tttgatgccg caggacgggg actggataac tgagtttttg tggtgctacg 180 agtgtcctga agataaggac ttttattgtc atcctattct aggtccggag ggaaagcccg 240 aaacacaggt ggtgttttac gataaacaac tggaccccga ccgagtggga atctattgtg 300 gagtgtggag gcagtatagc gagatacctt attatcggca aagaggttgg aaaaggcggt 360 accccacact tgcaagggta cgtgaatttc aagaacaaaa ggcgactcag ctcggtgaag 420 cgcttacccg gatttggtcg ggcccatctg gagccggcga gggggagcca caaagaggcc 480 agcgagtatt gcaagaaaga gggggattac ctcgagattg gcgaagattc ctcttcgggt 540 accagatcgg atcttcaagc agcagctcgg attctgacgg agacgtcggg aaatctgact 600 gaagttgcgg agaagatgcc tgcagtattt atacgctatg ggcggggttt gcgtgatttt 660 tgcggggtga tggggttggg taaaccgcgt gattttaaaa ctgaagttta tgtttttatt 720 ggtcctccag gatgcgggaa aacgcgggaa gcttgtgcgg atgcggctgc gcgggaattg 780 cagttgtatt tcaagccacg ggggccttgg tgggatggtt ataatgggga gggtgctgtt 840 attctggatg atttttatgg gtgggttcca tttgatgaat tgctgagaat tggggacagg 900 taccctctga gggttcctgt taagggtggg tttgttaatt ttgtggctaa ggtattatat 960 attactagta atgttgtacc ggaggagtgg tattcctcgg agaatattcg tggaaagttg 1020 gaggccttgt ttaggaggtt cactaaggtt gtttgttggg gggagggggg gataaagaaa 1080 gacatggaga cagtgtatcc aataaactat tgattttatt tgcacttgtg tacaattatt 1140 gcgttggggt gggggtattt attgggtggg tgggtgggca gccccctagc cacggcttgt 1200 cgcccccacc gaagcatgtg ggggatgggg tccccacatg cgagggcgtt tacctgtgcc 1260 cgcacccgaa gcgcagcggg agcgcgcgcg aggggacacg gcttgtcgcc accggagggg 1320 tcagatttat atttattatc acttagagaa cggacttgta acgaatccaa acttctttgg 1380 tgccgtagaa gtctgtcatt ccagtttttt ccgggacata aatgctccaa agcagtgctc 1440 cccattgaac ggtggggtca tatgtgttga gccatggggt gggtctggag aaaaagaaga 1500 ggctttgtcc tgggtgagcg ctggtagttc ccgccagaat tggtttgggg gtgaagtaac 1560 ggctgtgttt ttttttagaa gtcataactt tacgagtgga actttccgca taagggtcgt 1620 cttggagcca agtgtttgtg gtccaggcgc cgtctagatc tatggctgtg tgcccgaaca 1680 tagtttttgt ttgctgagct ggagaaatta cagggctgag tgtaactttc atctttagta 1740 tcttataata ttcaaagcta attgcagttt cccattcgtt taggcgggta atgaagtggt 1800 tggcgtgcca gggcttatta ttctgagggg ttccaacgga aatgacgttc atggtggagt 1860 atttctttgt gtagtatgtg ccagctgtgg gcctcctaat gaatagtttt cttctgacat 1920 agcgccttct gtggcgtcgt cgtctccttg ggcggggttt tcttctgaat atagctctgt 1980 gtctcatttt ggtgccgggc 2000 <210> 6 <211> 645 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 6 atgcgccacc gtgctatctt caggcgtagg cctaggccca gaaggaggag gagacaccgc 60 cgtcgttacg ctagacgccg tctgttcatc aggagaccaa ccgccggtac ttactacacc 120 aagaagtact ccactatgaa cgtgatcagc gtcggcaccc cacagaacaa caagccttgg 180 cacgctaacc acttcatcac tcgcctgaac gagtgggaaa ctgccatcac cttcgagtac 240 tacaagatcc tgaagatgaa ggtgaccctg tcccctgtca tcagccccgc tcagcagacc 300 aagactatgt tcggccacac tgctatcgac ctggacggag cctggaccac taacacctgg 360 ctgcaggacg acccctacgc cgaatccagc actaggaagg tcatgaccca gccattctct 420 cactcaagat acttcactcc aaagcctctg ctggctggaa ccacttccgc ccaccctgga 480 cagtctctgt tcttcttctc ccgccccacc ccatggctga acacttacga ccctaccgtg 540 cagtggggtg ccctgctgtg gtctatctac gtccccgaga agactggtat gaccgacttc 600 tacggcacca aggaagtgtg gatcaggtac aagtcagtcc tgtga 645 <210> 7 <211> 735 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 7 atgcgccacc gtgctatctt ccgccgtagg ccaaggccta gacgccgtag gagacaccgc 60 cgtcgttacg ctagacgccg tctgttcatc aggagaccta ccgccggaac ttactacacc 120 aagaagtact ctactatgaa cgtgatctca gtcggtaccc ctcagaacaa caagccatgg 180 cacgctaacc acttcatcac tcgcctgaac gagtgggaaa ctgccatcac cttcgagtac 240 tacaagatcc tgaagatgaa ggtgaccctg tctccagtca tctcacctgc tcagcagacc 300 aagactatgt tcggtcacac tgctatcgac ctggacggcg cctggaccac taacacctgg 360 ctgcaggacg acccctacgc cgaatccagc actaggaagg tcatgacctc caagaagaag 420 cactcaagat acttcactcc caagccactg ctggctggca ccacttctgc ccacccagga 480 cagtccctgt tcttcttctc ccgccctacc ccctggctga acacttacga ccctactgtg 540 cagtggggcg ccctgctgtg gtccatctac gtccctgaga agactggaat gaccgacttc 600 tacggtacca aggaagtctg gatcaggtac aagagcgtgc tggtcaagat caacatcaac 660 ctgactcctc ccgtggctac ttctcgtgtg ccaagcagag ctctgccact gaggttcggt 720 tgcggccacc gttga 735 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 8 Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val 35 40 45 Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His 50 55 60 Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Thr Phe Glu Tyr 65 70 75 80 Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro 85 90 95 Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp 100 105 110 Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu 115 120 125 Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Gln Pro Phe Ser His Ser Arg Tyr 130 135 140 Phe Thr Pro Lys Pro Leu Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly 145 150 155 160 Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr 165 170 175 Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro 180 185 190 Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile 195 200 205 Arg Tyr Lys Ser Val Leu 210 <210> 9 <211> 244 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 9 Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val 35 40 45 Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His 50 55 60 Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Thr Phe Glu Tyr 65 70 75 80 Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro 85 90 95 Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp 100 105 110 Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu 115 120 125 Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr 130 135 140 Phe Thr Pro Lys Pro Leu Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly 145 150 155 160 Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr 165 170 175 Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro 180 185 190 Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile 195 200 205 Arg Tyr Lys Ser Val Leu Val Lys Ile Asn Ile Asn Leu Thr Pro Pro 210 215 220 Val Ala Thr Ser Arg Val Pro Ser Arg Ala Leu Pro Leu Arg Phe Gly 225 230 235 240 Cys Gly His Arg <210> 10 <211> 244 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 10 Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val 35 40 45 Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His 50 55 60 Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Thr Phe Glu Tyr 65 70 75 80 Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro 85 90 95 Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp 100 105 110 Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu 115 120 125 Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Gln Pro Phe Ser His Ser Arg Tyr 130 135 140 Phe Thr Pro Lys Pro Leu Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly 145 150 155 160 Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr 165 170 175 Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro 180 185 190 Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile 195 200 205 Arg Tyr Lys Ser Val Leu Val Lys Ile Asn Ile Asn Leu Thr Pro Pro 210 215 220 Val Ala Thr Ser Arg Val Pro Ser Arg Ala Leu Pro Leu Arg Phe Gly 225 230 235 240 Cys Gly His Arg

Claims (141)

  1. 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 및 면역조절제, 또는 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수의학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것인 조성물.
  3. 조성물로서, 특히, 제1항 또는 제2항에 있어서, 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질; 및 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 또는 발현 벡터, 및 면역조절제 또는 이의 임의 조합을 포함하는 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3은 PCV3의 임의의 계통발생 분기군 또는 분기군의 조합이거나, 또는 PCV3a 및 PCV3b로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3은 PCV3의 임의의 계통발생 분기군이거나, 또는 PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 및 PCV3c로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2는 그룹 a1, b1 또는 b2 유래인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:1과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 재조합 PCV3 ORF2 단백질인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 이의 발현으로부터의 재조합 PCV3 ORF2 단백질인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 발현 벡터는 배큘로바이러스인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 재조합 배큘로바이러스 발현된 PCV3 ORF2인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게 항원성 PCV2 ORF2 단백질 (PCV2 ORF2 항원)을 더 포함하는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, PCV2 ORF2 단백질은 PCV2 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터에 의한 발현에 의한 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 발현 벡터는 배큘로바이러스인 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 더 포함하는 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원은 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재하는 것인 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질 또는 총 PCV2 및 PCV3 ORF2 단백질은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재하는 것인 조성물.
  22. 제2항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실 기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환되거나 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  23. 제2항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍ 의 보강제를 포함하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 당 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하고; 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 존재하는 것인 조성물.
  24. 제2항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역조절제는 인터루킨(들), 인터페론(들), 또는 다른 사이토카인(들)을 포함하는 것인 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 약 1 ㎍/mL 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들), 또는 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제(들)를 포함하는 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항생제(들)는 젠타미신을 포함하는 것인 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, (i) PCV3 ORF2 단백질, (ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함하는 것인 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 갖고 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정되는 것인 조성물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI로 처리된 세포 배양물로부터 유래되고/되거나 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유하고/하거나 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유하는 것인 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 다수-용량 용법이 아닌, 조성물의 단일 용량 또는 1회 샷 투여를 위해 제제화 및/또는 포장되거나; 또는 상기 조성물은 조성물의 다수-용량 용법을 위해 제제화 및/또는 포장되거나, 또는 상기 조성물은 조성물의 이중 용량 또는 2회 샷 투여를 위해 제제화 및/또는 포장되는 것인 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 면역원성 조성물인 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물로서 사용을 위한 것인 조성물.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 백신으로서 사용을 위한 것인 조성물.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대해 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키기 위한 방법에서 사용을 위한 것인 조성물.
  35. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 동물에서 PCV3의 감염으로 초래되는 임상 징후 또는 질환을 감소 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한 것이거나, 또는 동물에서 PCV3의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용을 위한 것이고, 상기 동물은 바람직하게 돼지인 조성물.
  36. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돼지, 특히 바람직하게 임신한 모돈에서 PCV3에 대한 면역 반응을 유도시키는 방법에서 사용을 위한 것인 조성물.
  37. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 자돈에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 질환을 감소 또는 예방시키는 방법에서 사용을 위한 것이고, 자돈은 조성물이 투여된 모돈이 포유해야 하는 것인 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 조성물이 투여된 상기 모돈은 상기 모돈이 특히 상기 자돈을 임신하고 있는 동안 면역원성 조성물이 투여된 모돈이거나, 또는 번식전 미경산돈인 조성물.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 근육내로 또는 피내로 투여되어야 하는 것인 조성물.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 모돈에게 근육내로 또는 피내로 투여되어야 하는 것인 조성물.
  41. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응의 유발 방법.
  42. 제41항에 있어서, 동물은 돼지류인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 돼지류는 돼지 또는 자돈인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 돼지류는 모돈인 방법.
  45. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 면역화 방법.
  46. 동물에서 적어도 하나의 병원체에 의해 초래되는 임상 질환에 대해 돼지를 면역화시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 면역원성 조성물은 감염의 임상 징후를 초래하는데 실패하지만, 상기 적어도 하나의 병원체의 병원성 형태에 대해 동물을 면역화시키는 면역 반응을 유도시킬 수 있는 것인 면역화 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 적어도 하나의 병원체는 PCV3인 방법.
  48. 모돈에서 PCV3에 특이적인 항체의 생산을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 상기 모돈에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 유도 방법.
  49. 자돈에서 PCV3의 감염으로 초래된 임상 징후 또는 임상 증상을 감소 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 모돈에게 투여하는 단계, 및 상기 자돈이 상기 모돈에 의해 포유되게 하는 단계를 포함하는 것인 감소 또는 예방 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 모돈은 특히 상기 자돈을 임신 중인 모돈이거나, 또는 번식전 미경산돈인 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 상기 자돈을 임신 중인 모돈에게 투여하는 단계, 상기 모돈이 상기 자돈을 출산하게 하는 단계, 및 상기 자돈이 상기 모돈에 의해 포유되게 하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  52. 자돈에서 PEDV의 감염으로 초래된 임상 징후 및/또는 임상 증상을 감소시키는 방법으로서, 자돈은 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항의 조성물이 투여된 모돈에 의해 포유되어야 하는 것인 감소 방법.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 상기 백신 또는 약학 조성물은 상기 모돈에게 근육내로 또는 피내로 투여되는 것인 방법.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 상기 백신 또는 약학 조성물은 상기 모돈에게 2회 투여되는 것인 방법.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물 또는 상기 백신 또는 약학 조성물은 상기 모돈에게 2회 점막으로, 바람직하게 2회 비내로 투여되는 것인 방법.
  56. 제32항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 임상 징후는 평균 1일 체중 증량의 감소 및 폐사로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물 또는 방법.
  57. 제32항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 임상 징후는 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 배출로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물 또는 방법.
  58. 제32항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 임상 증상은 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제, 및 PCV3 바이러스혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물 또는 방법.
  59. 제32항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 임상 증상은 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생 또는 출산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물 또는 방법.
  60. 제32항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돼지 또는 자돈은 15주령 이하, 또는 6주령 이하, 또는 3주령 이하, 또는 2주령 이하, 또는 1주령 이하인 조성물 또는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 투여는 병독성 돼지 써코바이러스에 노출의 적어도 1주 또는 2주 또는 3주 이내에 일어나는 것인 방법.
  62. 제32항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투여는 다수-샷 또는 다수-용량 용법이 아닌, 조성물의 단일, 1회 샷 투여; 또는 단일, 1회 용량의 투여를 포함하거나; 또는 투여는 다수-샷 또는 다수-용량 용법이 아닌, 단일, 1회 샷 투여; 또는 단일, 1회 용량 투여로 이루어지거나; 또는 투여는 조성물의 다수-샷 또는 다수-용량 용법을 포함하거나; 또는 투여는 조성물의 2회-샷 또는 2회-용량 용법을 포함하거나; 또는 투여는 조성물의 2회-샷 또는 2회-용량 용법으로 이루어지는 것인 조성물 또는 방법.
  63. (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조에서 사용을 위하거나, 또는 (i) PCV3 및/또는 (ii) PCV2 및 PCV3 및/또는 (iii) PCV3 및 다른 돼지 병원체 및/또는 (iv) PCV3, PCV2 및 다른 돼지 병원체에 대한 면역학적 또는 면역 반응 또는 보호 반응 또는 면역학적 반응을 유도하기 위한 방법에서 사용을 위한, 제42항 내지 제55항 중 어느 하나의 항의 방법에서 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항의 조성물의 용도, 또는 단독으로 또는 병용하여, 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항의 조성물의, PCV3 ORF2 단백질의 용도.
  64. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 제조하는 방법으로서, 배양된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 PCV3 ORF2 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
  65. 제64항에 있어서, 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
  66. 제65항에 있어서, 불활성화는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함하는 것인 제조 방법.
  67. 제66항에 있어서, 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함하는 것인 제조 방법.
  68. 제67항에 있어서, 아지리딘 화합물은 BEI를 포함하는 것인 제조 방법.
  69. PCV3 ORF2 단백질을 코딩하는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  70. 제69항에 있어서, PCV3 ORF2는 그룹 a1, b1 또는 b2 유래인 재조합 벡터.
  71. (i) 돼지 써코바이러스 3형 (PCV3) ORF2 단백질, 파보바이러스(PPV) 단백질 및 임의로 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 단백질, 및 (ii) 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 벡터, 발현 벡터, 및 면역조절제, 또는 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, PPV 단백질은 PPV VP2 캡시드 단백질인 조성물.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 하나의 항에 있어서, PRRSV 단백질은 PRRSV ORF4, ORF5, ORF6, 또는 ORF7인 조성물.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, PPV 단백질 및/또는 PRRSV 단백질은 벡터에서 발현되는 것인 조성물.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 돼지에게 2회 용량으로 투여되는 면역원성 조성물인 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 돼지는 미경산돈 또는 모돈인 조성물.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 투여는 교배/수정 이전, 임신 이전, 임신 동안 또는 수유 동안인 조성물.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역원성 조성물은 0.1 ㎍ 내지 150 ㎍, 바람직하게 0.25 ㎍ 내지 75 ㎍, 보다 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 37.5 ㎍, 보다 더 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 15 ㎍, 가장 바람직하게 0.5 ㎍ 내지 6 ㎍의 PCV3, PPV 및/또는 PRRSV 항원을 포함하는 것인 조성물.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역원성 조성물은 근육내로 투여되는 것인 조성물.
  81. 돼지 써코바이러스 3 (PCV3)에 대해 면역 반응 또는 면역학적 반응 또는 보호 면역 또는 면역학적 반응을 유발시키는 방법으로서, (i) 적어도 2 ㎍ 내지 약 400 ㎍의, 배큘로바이러스 시스템에 의해 발현된 PCV3 ORF2 재조합 단백질, 및 (ii) 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 또는 발현 벡터, 및 면역조절제 또는 이의 임의 조합을 포함하는 수의학적으로 허용가능한 담체의 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량을 돼지에게 비경구로 또는 피하로 투여하는 단계를 포함하는 것인 유발 방법.
  82. 제81항에 있어서, 돼지는 자돈, 돼지 또는 모돈, 또는 교배전 미경산돈인 유발 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 돼지는 약 1주령 또는 2주령 또는 3주령 또는 7-28일령 또는 7-22일령 또는 14-22일령 또는 16-22일령 또는 21+/- 5일령인 유발 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함하는 것인 유발 방법.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2는 PCV3의 임의의 계통발생 분기군 또는 분기군의 조합, 또는 군 PCV3a, PCV3a1, PCV3b, PCV3b1, 또는 PCV3b 유래인 유발 방법.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7과 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인 유발 방법.
  87. 제81항 내지 제86항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량은 PCV2 ORF2 단백질 또는 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 더 포함하는 것인 유발 방법.
  88. 제87항에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원은 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 유발 방법.
  89. 제81항 내지 제88항 중 어느 하나의 항에 있어서, 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실 기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼에 의해 임의 치환 또는 치환되고 상기 라디칼은 2 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함하는 것인 유발 방법.
  90. 제81항 내지 제89항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재하는 것인 유발 방법.
  91. 제87항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질 또는 총 PCV2 및 PCV3 ORF2 단백질은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재하는 것인 유발 방법.
  92. 제81항 내지 제91항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 보강제를 포함하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 당 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 존재하는 것인 유발 방법.
  93. 제82항 내지 제92항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역조절제는 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인을 포함하는 것인 유발 방법.
  94. 제81항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량은 약 1 ㎍/ml 내지 약 60 ㎍/mL의 항생제(들), 또는 약 30 ㎍/mL 미만의 항생제를 더 포함하는 것인 유발 방법.
  95. 제84항에 있어서, 항생제는 젠타미신을 포함하는 것인 유발 방법.
  96. 제81항 내지 제95항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량은 (i) PCV3 ORF2 단백질, (ii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현한 배큘로바이러스의 적어도 일부분, (iii) 상기 PCV3 ORF2 단백질을 발현한 재조합 배큘로바이러스로 감염 또는 형질감염된 세포의 세포 배양물의 일부분, (iv) 불활성화제 또는 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함하는 불활성화제, (v) 소듐 티오술페이트, 또는 불활성화제 또는 BEI와 동등한 양의 소듐 티오술페이트; (vi) 보강제, 또는 카르보폴 또는 카르보폴 971을 포함하는 보강제, 및 (vii) 생리적으로 허용가능한 농도의 포스페이트 염을 포함하는 것인 유발 방법.
  97. 제96항에 있어서, 성분 (i) 내지 (iii)의 약 90%는 1 ㎛ 미만의 크기를 갖고 상기 조성물의 pH는 약 6.5 내지 7.5로 조정되는 것인 유발 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, BEI는 배큘로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI로 처리된 세포 배양물로부터 유래되고/되거나 조성물은 약 2 내지 8 또는 약 5 mM BEI를 함유하고/하거나 조성물은 약 1 ㎎의 카르보폴 또는 카르보폴 971을 함유하는 것인 유발 방법.
  99. 제81항 내지 제98항 중 어느 하나의 항에 있어서, 방법은 임신 모돈 또는 자돈에서 PCV3 또는 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV) 감염으로 초래된 임상 징후 또는 질환을 감소 또는 예방하는 단계를 더 포함하는 것인 유발 방법.
  100. 제99항에 있어서, 자돈에서 임상 징후 또는 질환의 감소 또는 예방은 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량이 투여된 모돈이 자돈을 포유하는 단계를 포함하는 것인 유발 방법.
  101. 제99항에 있어서, 자돈에서 임상 징후 또는 질환의 감소 또는 예방은 단일 샷, 단일 투여 또는 단일 용량을 임신 모돈에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 유발 방법.
  102. 제101항에 있어서, 모돈이 자돈을 출산한 이후에 모돈에 의해 자돈을 포유시키는 단계를 더 포함하는 것인 유발 방법.
  103. 제99항 내지 제102항 중 어느 하나의 항에 있어서, 임상 징후는 평균 1일 체중 증량의 감소, 폐사, 미라, 사산 및/또는 약한 태아의 발생, 출산 또는 배출, 총 병변, 조직학적 병변, 조직 중 PCV3의 복제 또는 PCV3 바이러스혈증인 유발 방법.
  104. 제81항 내지 제103항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비경구로 또는 피하로 투여하는 단계는 근육내 또는 피내인 유발 방법.
  105. 조작된 FG 루프를 포함하는 비-천연 발생 PCV3 ORF2 단백질로서, FG 루프는 3개 이하의 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  106. 제105항에 있어서, FG 루프는 2개의 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  107. 제105항에 있어서, FG 루프는 1개의 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  108. 제105항에 있어서, FG 루프는 양으로 하전된 아미노산이 결여된 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  109. 제105항에 있어서, FG 루프는 아르기닌 및 리신 잔기가 결여된 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  110. 제105항에 있어서, FG 루프는 아르기닌, 리신, 및 히스티딘 잔기가 결여된 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  111. 제105항에 있어서, FG 루프는 QPFSYH, LSRGF, 또는 MASGF를 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  112. 조작된 C-말단 연장을 포함하는 비-천연 발생 PCV3 ORF2 단백질.
  113. 제112항에 있어서, C-말단 연장은 약 1 내지 약 10, 약 5 내지 약 20, 또는 약 10 내지 약 30 아미노산을 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  114. 제112항에 있어서, C-말단 연장은 약 1 내지 약 10, 또는 약 5 내지 약 20, 또는 약 10 내지 30 아미노산, 약 50 내지 약 200 아미노산, 약 60 내지 약 190 아미노산, 약 70 내지 약 180 아미노산, 약 80 내지 약 170 아미노산, 약 90 내지 약 160 아미노산 또는 약 100 내지 약 150 아미노산을 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  115. 제112항에 있어서, C-말단 연장은 상이한 캡시드 단백질로부터의 C-말단 아미노산을 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  116. 제115항에 있어서, C-말단 연장은 PCV2 캡시드, BFDV 캡시드, 또는 CaCV 캡시드로부터의 C-말단 아미노산을 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  117. 제112항에 있어서, C-말단 연장은 EFNLKDPPLN, PK, 또는 QFAPNNPSTEFDYETGRQL을 포함하는 것인 PCV3 ORF2 단백질.
  118. 자가-조립 PCV3 ORF2 캡시드 단백질을 제조하는 방법으로서, FG 루프 내 하나 이상의 아르기닌, 리신, 또는 히스티딘 아미노산을 비-양으로 하전된 아미노산으로 치환시키는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
  119. PCV3 ORF2 캡시드 단백질의 자가-조립을 증강시키는 방법으로서, 단백질의 C-말단에 아미노산 잔기를 첨가 또는 삽입시키는 단계를 포함하는 것인 증강 방법.
  120. 제118항에 있어서, 1 내지 10, 또는 약 5 내지 약 20, 또는 약 10 내지 약 30 아미노산, 약 50 내지 약 200 아미노산, 약 60 내지 약 190 아미노산, 약 70 내지 약 180 아미노산, 약 80 내지 약 170 아미노산, 약 90 내지 약 160 아미노산 또는 약 100 내지 약 150 아미노산을 첨가 또는 삽입시키는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
  121. 제119항에 있어서, 상이한 캡시드 단백질로부터의 아미노산을 첨가 또는 삽입시키는 단계를 포함하는 것인 증강 방법.
  122. 제121항에 있어서, 첨가 또는 삽입된 아미노산은 PCV2 캡시드, BFDV 캡시드, 또는 CaCV 캡시드 유래인 증강 방법.
  123. 제121항에 있어서, 첨가 또는 삽입된 아미노산은 EFNLKDPPLN, PK, 또는 QFAPNNPSTEFDYETGRQL을 포함하는 것인 증강 방법.
  124. 단일 투여로부터, PCV3 및/또는 이의 임상 증상에 대한 면역 반응 또는 보호 면역 반응을 유발시키는 양으로 제105항 내지 제117항 중 어느 하나의 항의 PCV 단백질 또는 제118항 내지 제123항 중 어느 하나의 항의 방법으로 제조된 단백질, 및 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항미생물제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 보강제, 세포 배양 상청액, 안정화제, 바이러스 또는 발현 벡터, 및 면역조절제 또는 이의 임의 조합을 포함하는 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  125. 제124항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  126. 제124항 또는 제125항에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체는 보강제, 면역조절제, 세포 배양 상청액, 바이러스 또는 발현 벡터 또는 이의 임의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  127. 제124항 내지 제126항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게 항원성 PCV2 ORF2 단백질 (), 또는 추가 돼지 병원체의 추가 항원을 더 포함하는 것인 조성물.
  128. 제127항에 있어서, 추가 돼지 병원체의 추가 항원은 PRRSV (돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스) 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테린 항원, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 상청액 항원, 오제스키병 또는 가성공수병 항원, 돼지 인플루엔자 항원, 돼지 열병 항원 (고전 또는 아프리카 또는 이의 조합), 악티노바실러스 플류로뉴모니아에 항원, 에스케리치아 콜라이 항원, 돼지 파보바이러스 (PPV) 항원 또는 파스퇴렐라 멀토시다 항원, 또는 이의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  129. 제124항 내지 제128항 중 어느 하나의 항에 있어서, 보강제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체; 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 폴리알콜 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체; 카보머; 적어도 3개 및 8개 이하의 히드록실 기를 갖는 폴리히드록실화 화합물과 가교된 아크릴계 중합체 (적어도 3개 히드록실의 수소 원자는 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 임의 치환 또는 치환되고, 상기 라디칼은 2개 내지 4개 탄소 원자를 함유하고, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이고 불포화 라디칼은 그 자체가 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있음); 카르보폴; 카르보폴 974P; 카르보폴 934P; 카르보폴 971P; 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 사포닌; Quil A; QS-21; GPI-0100; 유중수 에멀션; 수중유 에멀션; 수중유중수 에멀션; 경질 액상 파라핀 오일 또는 유럽 약전 유형 보강제 기반 에멀션; 이소프레노이드 오일; 스쿠알란; 알켄 또는 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기 함유 알콜(들) 또는 산(들)의 에스테르(들); 식물 오일(들); 에틸 올레에이트; 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트); 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트); 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산(들) 또는 알콜(들)의 에스테르(들); 이소스테아르산 에스테르(들); 비이온성 계면활성제(들); 솔비탄 또는 만니드 또는 글리콜 또는 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 또는 올레산, 또는 이소스테아르산 또는 리시놀산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르(들), 임의로 에톡시화, 언히드로만니톨 올레에이트; 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, Pluronic 제품, RIBI 보강제 시스템; 블록 공중합체; SAF-M; 모노포스포릴 지질 A; 아브리딘 지질-아민 보강제; 이. 콜라이 유래 (아니면 재조합) 열-불안정성 장독소; 콜레라 독소; IMS 1314, 또는 무라밀 디펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  130. 제124항 내지 제129항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질은 0.2 내지 약 400 ㎍/mL, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/mL, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/mL, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/mL, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/mL, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/mL, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/mL, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/mL, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/mL, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/mL, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/mL, 또는 약 1.6 ㎍/mL의 양으로 존재하는 것인 조성물.
  131. 제124항 내지 제130항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCV3 ORF2 단백질 또는 총 PCV2 및 PCV3 ORF2 단백질은 약 0.2 내지 약 400 ㎍/용량, 또는 약 0.3 내지 약 200 ㎍/용량, 또는 약 0.35 내지 약 100 ㎍/용량, 또는 약 0.4 내지 약 50 ㎍/용량, 또는 약 0.45 내지 약 30 ㎍/용량, 또는 약 0.6 내지 약 15 ㎍/용량, 또는 약 0.75 내지 약 8 ㎍/용량, 또는 약 1.0 내지 약 6 ㎍/용량, 또는 약 1.3 내지 약 3.0 ㎍/용량, 또는 약 1.4 내지 약 2.5 ㎍/용량, 또는 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍/용량, 또는 약 1.6 ㎍/용량의 양으로 존재하는 것인 조성물.
  132. 제124항 내지 제131항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 보강제를 포함하거나; 또는 보강제는 조성물의 용량 당 약 250 ㎍/mL의 양으로 존재하거나, 또는 보강제는 용량 당 약 100 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 500 ㎍ 내지 약 5 ㎎의 양으로 존재하거나; 보강제는 용량 당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 ㎎의 양으로 존재하거나; 또는 보강제는 용량 당 약 1 ㎎의 양으로 존재하는 것인 조성물.
  133. 제125항 내지 제132항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역조절제는 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인을 포함하는 것인 조성물.
  134. 제105항 내지 제117항 중 어느 하나의 항의 PCV 단백질 또는 제118항 내지 제123항 중 어느 하나의 항의 방법으로 제조된 단백질을 함유 및 발현하는 벡터.
  135. 제134항에 있어서, PCV 단백질은 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7에 의해 발현되는 것인 벡터.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서, 벡터는 배큘로바이러스인 벡터.
  137. 제125항 내지 제133항 중 어느 하나의 항의 조성물을 제조하는 방법으로서, 배양된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해서 PCV3 ORF2 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
  138. 제137항에 있어서, 배큘로바이러스를 불활성화시키는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  139. 제138항에 있어서, 불활성화는 열 처리 또는 바이러스 불활성화제의 사용을 포함하는 것인 제조 방법.
  140. 제139항에 있어서, 바이러스 불활성화제는 아지리딘 화합물을 포함하는 것인 제조 방법.
  141. 제140항에 있어서, 아지리딘 화합물은 BEI를 포함하는 것인 제조 방법.
KR1020217032822A 2019-04-04 2020-04-06 돼지 써코바이러스 3형 (pcv3) 백신, 및 이의 제조 및 용도 KR20220004967A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962829400P 2019-04-04 2019-04-04
US62/829,400 2019-04-04
PCT/US2020/026930 WO2020206452A1 (en) 2019-04-04 2020-04-06 Porcine circovirus type 3 (pcv3) vaccines, and production and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220004967A true KR20220004967A (ko) 2022-01-12

Family

ID=70680577

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217032822A KR20220004967A (ko) 2019-04-04 2020-04-06 돼지 써코바이러스 3형 (pcv3) 백신, 및 이의 제조 및 용도

Country Status (12)

Country Link
US (3) US11701419B2 (ko)
EP (1) EP3953370A1 (ko)
JP (1) JP2022527627A (ko)
KR (1) KR20220004967A (ko)
CN (1) CN114222579A (ko)
AU (1) AU2020256283A1 (ko)
BR (1) BR112021019859A2 (ko)
CA (1) CA3136141A1 (ko)
CL (1) CL2021002582A1 (ko)
MX (1) MX2021012051A (ko)
WO (1) WO2020206452A1 (ko)
ZA (1) ZA202107428B (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10450351B2 (en) 2015-10-16 2019-10-22 Kansas State University Research Foundation Porcine circovirus type 3 immunogenic compositions and methods of making and using the same
KR20220004967A (ko) * 2019-04-04 2022-01-12 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드 돼지 써코바이러스 3형 (pcv3) 백신, 및 이의 제조 및 용도
CN115028688B (zh) * 2022-04-28 2024-04-16 山东信得科技股份有限公司 PCV3 Cap蛋白抗原肽、抗体及PCV3检测用免疫组化试剂盒

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US3479708A (en) 1968-05-15 1969-11-25 Edson P Foster Felting needle
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
EP0322417A1 (en) 1986-09-08 1989-07-05 Applied Biotechnology, Inc. Empty viral capsid vaccines
ES2026827A6 (es) 1991-03-26 1992-05-01 Ercros Sa Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino.
JP3128133B2 (ja) 1991-06-06 2001-01-29 スティッチティング セントラール ディールゲネースクンディグ インスティトゥート 豚の奇病の原因体であるレリスタドエイジェント、それを含むワクチン組成物、豚の奇病の診断キット及び診断方法
US6042830A (en) 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
AU2508492A (en) 1991-08-26 1993-03-16 David Allen Benfield Sirs vaccine and diagnosis method
AU2696792A (en) 1991-09-16 1993-04-27 David A Benfield Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
JPH07501049A (ja) 1991-10-14 1995-02-02 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー ブタ生殖・呼吸系症候群ワクチン及び診断方法
ATE206455T1 (de) 1994-04-11 2001-10-15 Akzo Nobel Nv Europäische vakzinstämme des fortplanzungs- atmungs-syndromsvirus des schweins
PT732340E (pt) 1995-03-14 2004-09-30 Akzo Nobel Nv Expressao de polipeptidos do virus da sindrome reprodutiva e respiratoria porcina na mesma celula
EP0835930B1 (en) 1996-10-09 2001-01-31 Akzo Nobel N.V. European vaccine strains of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6103526A (en) 1998-10-08 2000-08-15 Protein Sciences Corporation Spodoptera frugiperda single cell suspension cell line in serum-free media, methods of producing and using
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
DK1833992T3 (da) 2004-12-30 2015-06-08 Boehringer Ingelheim Vetmed PCV2-immunogene sammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af sådanne sammensætninger
PT2371383E (pt) 2005-12-29 2015-11-24 Boehringer Ingelheim Vetmed Utilização de uma composição imunogénica de pcv2 para atenuar os sintomas clínicos em porcos
EP2481420B1 (en) 2006-12-15 2019-02-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Single dose anti-PCV2 pig vaccine
BR112013021076B1 (pt) 2011-02-17 2022-11-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (prrsv) de um tipo europeu, seu uso, vacina, método para a preparação destes
US10450351B2 (en) 2015-10-16 2019-10-22 Kansas State University Research Foundation Porcine circovirus type 3 immunogenic compositions and methods of making and using the same
TWI781962B (zh) 2016-11-03 2022-11-01 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 抗豬小病毒疫苗
CN108619503A (zh) 2017-03-24 2018-10-09 华南农业大学 一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN108785667B (zh) 2017-04-28 2021-04-27 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪圆环病毒3型免疫原性组合物、制备方法和应用
CN109125719B (zh) * 2017-06-19 2022-06-14 普莱柯生物工程股份有限公司 一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物及其应用
CN109125720B (zh) 2017-06-19 2021-11-09 普莱柯生物工程股份有限公司 一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物及其应用
CN108159409A (zh) 2017-12-25 2018-06-15 南京大爻网络科技有限公司 一种猪圆环病毒3型Cap蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN108359677A (zh) 2018-02-01 2018-08-03 福建农林大学 提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法
CA3102685A1 (en) * 2018-06-11 2019-12-19 Ceva Sante Animale Vaccination against porcine circoviruses
CN109053896B (zh) * 2018-07-03 2021-08-17 青岛明勤生物科技有限公司 一种猪圆环病毒二价基因工程疫苗
CN108823231B (zh) * 2018-07-09 2022-05-31 荣俊 一种猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法
CN109207441B (zh) 2018-08-12 2022-05-27 扬州大学 重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白及其构建方法与引物
CN109207522B (zh) 2018-08-12 2022-05-27 扬州大学 表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白重组杆状病毒及其构建方法与引物
CN109550045B (zh) 2018-12-26 2023-01-31 哈药集团生物疫苗有限公司 猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗及其制备方法
CN109852622B (zh) 2019-01-18 2022-05-27 南京农业大学 一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用
KR20220004967A (ko) * 2019-04-04 2022-01-12 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드 돼지 써코바이러스 3형 (pcv3) 백신, 및 이의 제조 및 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US20210128712A1 (en) 2021-05-06
CA3136141A1 (en) 2020-10-08
US20240226264A1 (en) 2024-07-11
US20230302113A1 (en) 2023-09-28
CN114222579A (zh) 2022-03-22
AU2020256283A8 (en) 2024-01-11
JP2022527627A (ja) 2022-06-02
MX2021012051A (es) 2022-01-18
AU2020256283A1 (en) 2021-11-18
US11701419B2 (en) 2023-07-18
WO2020206452A1 (en) 2020-10-08
US11896659B2 (en) 2024-02-13
BR112021019859A2 (pt) 2022-02-15
EP3953370A1 (en) 2022-02-16
ZA202107428B (en) 2023-12-20
CL2021002582A1 (es) 2022-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7445375B2 (ja) ブタサーコウイルス３型免疫原性組成物、その製造方法、およびその使用方法
US10799578B2 (en) Vaccine against porcine parvovirus
KR20220031028A (ko) 아프리카 돼지 열병 백신
KR20220004967A (ko) 돼지 써코바이러스 3형 (pcv3) 백신, 및 이의 제조 및 용도
KR20150027836A (ko) 마이코플라스마 히오뉴모니아를 형질전환하기 위한 벡터, 형질전환된 ｍ. 히오뉴모니아 균주, 및 그것의 용도
CN110387355A (zh) 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用
JP7387623B2 (ja) 標的タンパク質を安定して発現できる組換えウイルス
RU2813989C2 (ru) Вакцины против свиного цирковируса 3 типа (pcv3), их производство и применение
Hu et al. Raccoon poxvirus feline panleukopenia virus VP2 recombinant protects cats against FPV challenge
CN109195624B (zh) Hev疫苗
RU2803427C1 (ru) Иммуногенные композиции для иммунизации свиней против цирковируса типа 3 и способы их получения и применения
CN111712575B (zh) 表达外源猫副粘病毒基因的重组病毒载体系统及由其制备的疫苗
TWI361695B (en) Pcv-2 vaccine