CN109125719B - 一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物及其应用 - Google Patents
一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，该免疫原性组合物包括免疫量的猪圆环病毒3型抗原、免疫量的猪圆环病毒2型new基因亚型抗原以及药学上可接受的载体。该免疫原性组合物具有良好的免疫原性，一次免疫即能完全保护猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型的混合感染。
Description
技术领域
本发明属于兽药领域，具体涉及一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物及其应用。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定而发现，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases， PCVAD)，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，肺炎,猪皮炎和肾病综合征和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。
临床上，随着PCV2疫苗的普遍应用，在免疫压力下，PCV2的变异速度加快，一类介于PCV2b与PCV2d之间的新的基因亚型的毒株开始流行，这类病毒特征是ORF2基因中存在突变或经不同基因亚型的 ORF2基因之间重组而来。由于该新的PCV2基因亚型毒株的流行，其抗原与现有的基因亚型之间存在差异，而现有的商品化疫苗均以PCV2a 或PCV2b为疫苗株来制备的，不能对最新流行的PCV2毒株进行完全的保护。
在一起猪的繁殖障碍病例中，分离到一株病毒基因组为2.0kb的圆环病毒，经后续试验证实，其与已知的圆环病毒无论在核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞75％的基因组核苷酸序列的同源性， Cap蛋白具有＞70％的氨基酸序列的同源性，据此可以肯定这是一种新的猪圆环病毒(PCV3)。
当初早在1985年由PCV2导致的系统疾病就已经以零星状态爆发，由于未能重视，导致九十年代末大规模爆发该疾病，而新的猪圆环病毒在PNDS和繁殖障碍方面具有与PCV2相似病原学特性，PCV2和PCV3 之间蛋白同源性很低，使用PCV2疫苗交叉保护不能对PCV3进行有效预防。
新的猪圆环病毒与PCV2混合感染进一步加重临床上PCV感染的复杂情况，因此针对该新临床疫情制备新的免疫原性组合物，对猪场疾病控制十分重要。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种预防和/或治疗猪圆环病毒混合感染的免疫原性组合物，该免疫原性组合物能对猪圆环病毒2型和3型的混合感染提供有效的保护，显示出显著的免疫特性。
本发明的一个目的在于提供一种预防和/或治疗不同猪圆环病毒混合感染的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含免疫量的猪圆环病毒3型抗原、免疫量的猪圆环病毒2型抗原以及药学上可以接受的载体。
本发明的一个目的在于提供一种预防和/或治疗不同基因亚型的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型混合感染的免疫原性组合物。
本发明的一个目的在于提供一种预防和/或治疗不同地域来源的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型混合感染的免疫原性组合物。
本发明的一个目的在于提供上述免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒相关疾病的药物中的应用。
本发明首次采用目前新的猪圆环病毒3型免疫原性蛋白抗原和猪圆环病毒2型新的基因亚型毒株免疫原性蛋白抗原，制备预防和/或治疗猪圆环病毒感染的免疫原性组合物，不仅能对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的感染或混合感染进行免疫保护，还能针对不同基因亚型猪圆环病毒2型毒株进行保护。
本发明的免疫原性组合物，能针对不同地域来源的猪圆环病毒3型毒株、猪圆环病毒2型毒株混合感染提供完全保护，具有广谱的保护能力。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
“猪圆环病毒3型”为基因组2.0kb的圆环病毒，其与已知的圆环病毒无论是核苷酸还是氨基酸序列的同源性均小于50％，是一种新的猪圆环病毒，其能与多种病原混合感染引起猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。
“猪圆环病毒2型new基因亚型”是指一种新的PCV2基因亚型，其在ORF2基因中存在突变或经不同基因亚型的ORF2基因之间重组而来，具有PCV2b的标签序列，但在遗传进化分析中组成一个独立分支，猪只感染该基因亚型的毒株后出现的临床表征有：持续性高温，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点。
本发明涉及一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物包括免疫量的猪圆环病毒3型 Cap蛋白抗原、免疫量的猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白抗原以及药学上可接受的载体；其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原为猪圆环病毒3型Cap蛋白或重组有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体，所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白抗原为猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白或重组有所述猪圆环病毒2型Cap蛋白基因的活载体。
本发明的免疫原性组合物经一次免疫，其中的抗原成分就能针对各自的病原产生完全保护，保护猪只预防和抵抗对于猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的混合感染。
本发明的免疫原性组合物能针对猪圆环病毒3型和不同基因亚型的猪圆环病毒2型的混合感染产生完全保护。
本发明的免疫原性组合物能保护猪只对不同地域来源的猪圆环病毒3型病毒和猪圆环病毒2型病毒的混合感染进行完全保护。
术语“免疫原性组合物”指含有猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型病毒的免疫反应。
术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由免疫原性组合物提供的保护性免疫力可通过测量例如受试动物的临床征兆如健康产仔的减少、死胎数量的增加、受试动物总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
本发明所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原、猪圆环病毒2型Cap 蛋白抗原可以是重组表达的Cap蛋白亚单位抗原，其表达体系可以为原核表达系统、真核表达系统，也可以是通过人工合成的合成肽抗原；或者可以是重组有所述猪圆环病毒Cap蛋白基因的活载体。
“亚单位抗原”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的抗原。它比全病毒抗原引起副反应的可能性小。
“合成肽抗原”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的抗原。
“活载体”指的是非致病微生物通过基因工程的方法使之携带并表达某种抗原或抗原决定簇的基因，产生免疫原性，非致病微生物可以是细菌和病毒，病毒活载体常作为载体的病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、火鸡疱疹病毒、腺病毒、伪狂犬病毒、反转录病毒、慢病毒；细菌活载体可以是减毒沙门菌、卡介苗、减毒单核细胞李氏杆菌、减毒霍乱弧菌、减毒志贺氏菌、乳酸球菌、芽胚乳酸杆菌、高氏链球菌。
作为本发明的一种实施方式，在本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白为序列SEQ.ID NO.1编码的蛋白，所述猪圆环病毒2型new基因亚型 Cap蛋白为SEQ.ID NO.2编码的蛋白。
本发明的免疫原性蛋白免疫原性好，一次免疫就可提供完全保护。
作为本发明的一种实施方式，在本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白其编码基因具有SEQ.ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列，所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白其编码基因具有SEQ.ID NO.2所示的核苷酸序列或其简并序列。
作为本发明的一种实施方式，在本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为≥20μg/ml；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白含量为≥20μg/ml。
本发明的免疫原性组合物中，当抗原含量低至20μg/ml也能刺激免疫系统产生免疫反应，对猪只产生完全保护。
作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap 蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap 蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml。
作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明的含猪圆环病毒3 型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型 Cap蛋白抗原含量为20μg/ml～50μg/ml；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白含量为20μg/ml～50μg/ml。
作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明的含猪圆环病毒3 型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型 Cap蛋白抗原含量为30μg/ml～50μg/ml；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白含量为30μg/ml～50μg/ml。
在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原含量还可以选自20μg/ml～30μg/ml，30μg/ml～100μg/ml，或50μg/ml～ 100μg/ml含量范围。
在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒2型new基因亚型 Cap蛋白抗原含量还可以选自20μg/ml～30μg/ml，30μg/ml～100μg/ml，或50μg/ml～100μg/ml含量范围。
在本发明的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原含量和所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白抗原含量可以独立地选自各自上述任一含量范围。
作为本发明的一种实施方式，在本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述重组有猪圆环病毒3型Cap 蛋白基因的活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒、或重组腺病毒；所述重组有所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因的活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒、或重组腺病毒。
作为本发明的一种实施方式,在本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因和所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因重组于同一个活载体，所述活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒、或重组腺病毒。
本发明的活载体免疫原性组合物因为兼具有灭活疫苗和活疫苗的优点，在免疫效力上可以保证能够对猪进行保护，且其免疫效力更强，可以不添加佐剂。
作为本发明的一种实施方式，本发明含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及金属盐；或MontanideTM Gel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述佐剂为MontanideTMGel。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所需的量。待施用的佐剂的精确的量将根据多种因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
作为本发明的一种实施方式，本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述佐剂含量为5～20V/V％。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物中，所述佐剂含量为10V/V％。
本发明的免疫原性组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine) (例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)MontanideTMGel。
尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/ 癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
优选地，本发明选用的佐剂为MontanideTMGel。
本发明免疫原性组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素 2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
可以根据本发明的免疫原性组合物制备成口服剂型或非口服剂型。
优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
本发明还涉及上述免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒相关疾病的药物中的应用，其中，所述猪圆环病毒相关疾病为由PCV2 和猪圆环病毒3型单独感染或它们混合感染导致的相关疾病。
作为本发明的一种实施方式，所述制备预防和/或治疗猪圆环病毒相关疾病的药物中的应用为，制备预防和/或治疗断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应的药物中的应用。
本发明所用术语“猪圆环病毒相关疾病”用于指由猪圆环病毒3型和 2型混合感染引起的疾病。非穷举性包括，断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，但不限于此。
术语“预防和/或治疗”在涉及猪圆环病毒3型和2型混合感染时是指抑制猪圆环病毒3型和2型的复制、抑制猪圆环病毒3型和2型的传播或防止猪圆环病毒3型和2型在其宿主体内定居，以及减轻猪圆环病毒 3型和2型感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和 /或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
本发明还涉及上述免疫原性组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒混合感染的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备预防和/或治疗猪圆环病毒混合感染的药物中的应用中，所述PCV2基因亚型为PCV2a、PCV2b、 PCV2d、PCV2new基因亚型。
本发明的免疫原性组合物能针对不同PCV2基因亚型以及PCV3提供有效，扩大了疫苗的应用范围，能对PCV2不同基因亚型和PCV3的单独感染和混合感染进行预防和/或治疗。
本发明的免疫原性组合物具有良好的免疫原性，其不仅能预防猪圆环病毒相关疾病，还能减轻已经感染了猪圆环病毒的猪只的临床表征，也即具有治疗作用。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪圆环病毒3型的分离鉴定
1、病料来源
在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加 9.4％，受孕率降低了1.2％，木乃伊胎增加8.2％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现出厌食，呈多灶性丘疹，斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2相关流产的症状一致。虽然在母猪中观察到的总体临床表现以及流产症状与猪圆环病毒2 型导致的繁殖障碍疾病一致，但所有母猪的不同组织，包括肾、淋巴结、肺、皮肤以及死胎，通过免疫组化和定量PCR对PCV2、PRRSV、PPV、 CSFV、猪肺炎支原体检测均为阴性。为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。
2、病毒株的分离与培养
将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液；组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液；上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤，滤液在PK15细胞上传代，于37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，于37℃培养5日。收获含病毒的培养液，培养液经2次冻融后，收获病毒。
3、PCR及测序分析鉴定病毒种属
取以上步骤的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用圆环病毒种属特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR 扩增出2000bp目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列和氨基酸序列同已经报道过的其他圆环病毒的同源性都少于50％，而根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒属中同一种的病毒应该具有＞ 75％的基因组核苷酸序列的同源性，Cap蛋白具有＞70％的氨基酸序列的同源性，据此可以肯定，它是一种新的猪圆环病毒，也是目前猪体上发现的第三种圆环病毒。
实施例2pET28a-PCV3-Cap表达载体的构建
1、PCV3病毒DNA的提取
质粒提取试剂盒购自天根生物；T4DNA Ligase购自BioLab； pET28a质粒购自Novagen；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。
按照病毒DNA提取试剂盒说明书，取0.2ml猪圆环病毒3型病毒液于无菌1.5ml离心管中，加0.4ml VB于病毒液中，旋涡混匀，室温静置10分钟。加0.45ml AD buffer于病毒液中，用力混匀。将VB柱放入2ml收集管中，取0.6ml上述混合了试剂的病毒液加入VB柱中，14000g离心1分钟，再将剩余的上述混合了试剂的病毒液加入VB柱中， 14000g离心1分钟，弃掉2ml收集管，将VB柱放入新的2ml收集管中，加入0.4ml W1buffer，14000g离心30秒，再加0.6ml Wash buffer 于VB柱，14000g离心30秒，然后不加buffer再空置离心3分钟，将该VB柱放入新的1.5ml EP管中，加入50μl RNase free water置于膜中央，静置3分钟，14000g离心1分钟，EP管中离心下来的液体即为猪圆环病毒3型病毒DNA基因组溶液。
2、Cap基因扩增
根据Cap基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表1。
表1猪圆环病毒3型Cap基因扩增引物
| PCV3-Cap-F | CCA CAG AAG GCG CTA TGT C |
| PCV3-Cap-R | CCG CAT AAG GGT CGT CTT G |
将PCR产物送Invitrogen公司测序，根据测序结果对Cap基因进行密码子优化，优化后的Cap基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
3、表达载体构建
优化后Cap基因送苏州泓迅生物科技股份有限公司进行全序列合成，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒和分子伴侣质粒pG-Tf2 共转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，确定合成序列正确，阳性克隆即为pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2表达菌株 pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)。
实施例3猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达
将实施例2中制备的pET28a-PCV3-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3) 菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中，同时LB培养基中含有5-10ng/ml四环素用于分子伴侣蛋白的诱导表达，接种量为1％(V/V)，于37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，于28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(PBS组分：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调节pH至7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎菌体，超声破碎后的裂解液离心取上清。表达产物中可溶性目的蛋白含量较高，表达量可达菌体蛋白总量的25％，内毒素含量为0.28×105EU/ml。
实施例4大肠杆菌表达猪圆环病毒3型Cap蛋白内毒素清除
1.5ml离心管中加入0.5ml待处理的含可溶性Cap蛋白的上清溶液和终浓度为1％(v/v)的曲拉通X-114(Triton X-114)(加入量5μl)，涡旋振荡。涡旋振荡混匀的样品在冰上放置5分钟。样品冷却后，离心管立即放入37℃水浴中温浴5min，使得产生新的两相。然后，把样品在37℃温度条件下离心60s。离心过后，目的蛋白将留在上层，而含有内毒素的非离子表面活性剂将会以油滴的形状残留在离心管底部，分离两相。上述整个去除内毒素的操作循环3次。最终的纯化产物经测定，蛋白纯度没有降低，内毒素含量下降为0.008×105EU/ml；同时，通过 200KV透射电镜，放大倍数60000倍，观察经5％磷钨酸负染、固定于喷碳的铜网上的PCV3病毒样颗粒，结果显示大量的病毒样颗粒，且大小均匀，呈现为空心粒子状态。
实验结果表明Triton X-114能够清除重组蛋白中残留的内毒素，且对蛋白的纯度没有影响；同时，也没有影响PCV3病毒样颗粒的形成及稳定形态。
实施例5猪圆环病毒2型的分离鉴定
1、病料来源
在国内一免疫商品化PCV2疫苗的猪场,零星出现母猪流产、木乃伊胎增加的现象。受影响的母猪表现出厌食症状，在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，与PCV2相关流产的症状一致。通过免疫组化和定量PCR检测，PCV2阳性。在免疫PCV2商品化疫苗后依然从发病猪组织中检测到PCV2，原因值得深究，为进一步查清原因，选取各组织病料进行病原分离。
2、病毒株的分离与培养
将病料以1：10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液；组织悬液经反复3次冻融后，于12000r/min离心15min，收集上清液；上清液再经0.22μm滤膜滤器过滤，滤液在PK15细胞上传代，于37℃培养1h，替换加入含2％犊牛血清的DMEM培养液，于37℃培养5日。收获含病毒的培养液，经2次冻融后，收获病毒。
3、PCR及测序分析鉴定病毒
取以上步骤收获的病毒培养物，用核酸提取试剂盒提取病毒样品的核酸，使用PCV2特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果显示，PCR扩增出1.7kb目的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，序列测定结果进行遗传进化分析。结果显示该病毒株全基因组序列同已经报道过的其他PCV2的同源性都少于96％，氨基酸序列少于94％，进一步的全基因组序列分析表明该毒株介于PCV2b与PCV2d之间，ORF2基因中存在突变或经不同基因亚型的ORF2基因之间重组而来，经遗传进化分析确定，其属于一个新的PCV2基因亚型。
实施例6 pET28a-PCV2-Cap表达载体的构建
1、PCV2病毒DNA的提取
质粒提取试剂盒购自天根生物；T4 DNA Ligase购自BioLab； pET28a质粒购自Novagen；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。
按照病毒DNA提取试剂盒说明书，参照实施例2方法取0.2ml新的猪圆环病毒2型病毒液提取DNA基因组。
2、猪圆环病毒2型Cap基因扩增
根据Cap基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表2。
表2猪圆环病毒2型Cap基因扩增引物
| PCV2-Cap-F | CCCATGCCCTGAATTTCCA |
| PCV2-Cap-R | CAGCGCACTTCTTTCGTTTTCAG |
将PCR产物送Invitrogen公司测序，结果显示与现有技术中的PCV2 的Cap蛋白氨基酸序列相比，Cap基因编码的氨基酸序列在52～64位、 106～108位、131～137位发生基因突变或重组，根据测序结果对Cap 基因进行密码子优化，优化后的Cap基因序列如序列表SEQ ID NO.2 所示。
3、表达载体构建
优化后Cap基因送苏州泓迅生物科技股份有限公司进行全序列合成，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒和分子伴侣质粒pG-Tf2 共转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，确定合成序列正确，阳性克隆即为pET28a-PCV2-Cap/pG-Tf2表达菌株 pET28a-PCV2-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)。
实施例7猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达
将实施例6中制备的pET28a-PCV2-Cap/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3) 菌株参照实施例3进行蛋白诱导表达。表达产物中可溶性目的蛋白含量较高，表达量可达菌体蛋白总量的50％，内毒素含量为0.26×105EU/ml。
实施例8大肠杆菌表达Cap蛋白内毒素清除
将实施例7表达的含可溶性Cap蛋白的上清溶液参照实施例4进行内毒素清除。经测定，蛋白纯度没有降低，内毒素含量下降为0.008×105EU/ml；同时，通过200KV透射电镜，放大倍数60000倍，观察经5％磷钨酸负染、固定于喷碳的铜网上的PCV2病毒样颗粒，结果显示大量的病毒样颗粒，且大小均匀，呈现为空心粒子状态。
结果表明Triton X-114能够清除重组蛋白中残留的内毒素，且对蛋白的纯度没有影响；同时，也没有影响PCV2病毒样颗粒的形成及稳定形态。
实施例9猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型免疫原性组合物的制备
将按实施例4纯化的猪圆环病毒3型Cap蛋白、实施例8纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白按比例混合后缓缓加入到水溶性佐剂Gel佐剂 (法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌 12min，混匀。免疫原性组合物的具体配方见表3。
表3含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原免疫原性组合物配比
实施例10含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原免疫原性组合物免疫原性试验
将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪60头随机分成12组，5头/组，免疫实施例9制备的猪圆环病毒 3型、2型免疫原性组合物。第1～2组免疫组合物1，第3～4组免疫组合物2，第5～6组免疫组合物3，第7～8组分别免疫组合物4，第9～ 10组分别免疫原性组合物5、组合物6，第11～12组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，第1组、第3组、第5组、第7 组、第9组、第11组攻毒猪圆环病毒3型SG株(Porcine Circovirus type 3，StrainSG，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO： V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学)，105.0TCID50/头，第2组、第4组、第6组、第8组、第10组、第12组攻毒猪圆环病毒2型HH3株(Porcine Circovirus type 2，Strain HH3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO： V201726，保藏日期为2017年6月4日，保藏地址：中国武汉·武汉大学)，105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表4。
表4含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物免疫原性试验结果
结果显示，含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物一次免疫仔猪后，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照组仔猪攻毒后全部发病。表明本发明提供的含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物具有很好的保护效力。且本发明不同含量的含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物免疫攻毒后在猪体内均不能检测到病毒，这说明当免疫本发明的免疫原性组合物后，即便野毒感染了免疫的猪只，也不会对猪的发育生长、进食增肥产生影响。
实施例11含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原免疫原性组合物广谱性保护试验
将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪100头随机分成20组，5头/组，第13～22组免疫实施例9制备的免疫原性组合物1，第23～32组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，攻毒对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，第13组、第23组用新近从中国河南省分离的猪圆环病毒2a基因亚型HN06株强毒株攻毒；第14组、第24组用新近从中国江苏省分离的猪圆环病毒2b基因亚型JS04株强毒株攻毒；第 15组、第25组用新近从中国吉林省分离的猪圆环病毒2d基因亚型JL13 株强毒株攻毒；第16组、第26组用新近从中国重庆市分离的猪圆环病毒2new基因亚型CQ14株强毒株攻毒；第17组、第27组用新近从中国广东省分离的猪圆环病毒2new基因亚型GD15株强毒株攻毒；第18 组、第28组用新近从中国河南省分离的猪圆环病毒3型HN12株强毒株攻毒；第19组、第29组用新近从中国江苏省分离的猪圆环病毒3型 JS08株强毒株攻毒；第20组、第30组用新近从中国吉林省分离的猪圆环病毒3型JL11株强毒株攻毒；第21组、第31组用新近从中国重庆市分离的猪圆环病毒3型CQ04株强毒株攻毒；第22组、第32组用新近从中国广东省分离的猪圆环病毒3型GD05株强毒株攻毒；攻毒剂量为105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表5～6。
表5含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物针对PCV2感染广谱性保护试验结果
结果显示，第23～27组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒2型病毒；而第13～17组免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各脏器组织进行PCR检测，均显示 PCV2阴性。实验结果表明本发明提供的含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物一次免疫，即可对猪只针对不同地域来源、不同基因亚型的猪圆环病毒2型攻毒提供有效的、完全免疫保护，且从各脏器组织中不能检出攻毒的PCV2。
表6含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物针对PCV3感染广谱性保护试验结果
结果显示，第28～32组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒3型病毒；而第18～22组免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常，通过各脏器组织进行PCR检测，均显示PCV3阴性。实验结果表明本发明提供的含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物可对猪只针对不同地域来源的猪圆环病毒3型攻毒提供有效的、完全免疫保护，且从各脏器组织中不能检出攻毒的PCV3株。表明，本发明提供的免疫原性组合物具有广谱的免疫原性，对于流行的猪圆环病毒3型、2型野毒均能提供完全保护。且当免疫本发明的免疫原性组合物后，即便野毒感染了免疫的猪只，也不会对猪的发育生长、进食增肥产生影响。
实施例12含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物混合感染保护试验
将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪20头随机分成4组，5头/组。第33组免疫实施例9制备的免疫原性组合物1，第34组免疫实施例9制备的免疫原性组合物5，第35 组免疫实施例9制备的免疫原性组合物6，第36组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，对照组接种DMEM培养基2ml/头。免疫后28日进行攻毒，所有组攻毒猪圆环病毒3型SG株和猪圆环病毒2型HH3株混合病毒液，攻毒剂量为105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化结果进行判定，具体结果见表7。
表7含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物混合感染保护试验结果
结果显示，第36组攻毒对照组攻毒后均不同程度出现体温升高 40.5℃以上，持续5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化；第33组免疫组攻毒后无异常临床症状，剖检各组织器官也无异常；而第34组、第35组免疫组不能有效阻止PCV2、PCV3 的混合感染，依然呈发病状态。实验结果表明本发明提供的含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物一次免疫就可对猪只针对PCV2、PCV3 联合攻毒提供有效的、完全免疫保护。
实施例13含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物应用试验
在国内一商品化猪场，与历史平均值相比，出现母猪死亡率增加 9.8％，受孕率降低了1.2％，木乃伊胎增加8.6％的现象。临床表现上，受影响的母猪表现厌食，呈多灶性丘疹，斑点和表面皮炎的症状。在流产的窝中含有不同胎龄的木乃伊化胎儿，将具有临床表现症状的母猪中选取32头怀孕母猪随机分成两组A组、B组，16头/组，A组为免疫原性组合物接种组，A组免疫实施例9制备的免疫原性组合物1，B组为空白对照组。免疫组注射免疫原性组合物2ml/头，空白对照组接种 DMEM培养基2ml/头。统计两组母猪产子情况，结果见表8。
表8免疫组和空白对照组母猪产子统计结果
结果显示，免疫组母猪产子无异常，生产健康仔猪，平均11.7头/ 窝，健康率高达99.5％，而空白对照组出现明显的木乃伊胎及弱仔猪情况，生产健康仔猪平均6.9头/窝，健康率59.0％，其中还有三头母猪出现流产情况，全窝木乃伊胎，免疫组和空白对照组差异显著。
表8的结果证明了本发明含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物对感染猪圆环病毒的母猪有着良好的免疫保护作用，且能针对已经感染了PCV的母猪进行保护，即具有治疗作用。
同时，对B组对照组所产仔猪分别隔离按窝饲养，13窝分成两组 B1组(包括B-1窝至B-11窝，除B-5窝因全窝木乃伊胎不计外，共10 窝仔猪)、B2组(包括B-12至B-16窝，除B-14窝和B-16窝因全窝木乃伊胎不计外，共3窝仔猪)，B1组吃母乳之前免疫实施例9制备的免疫原性组合物1，B2组为空白对照组。免疫组注射免疫原性组合物 2ml/头，空白对照组接种DMEM培养基2ml/头。连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测进行判定，具体结果见表9。
表9含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物对仔猪的免疫保护试验
结果显示，免疫组仔猪无异常临床症状，随机剖检各组织器官也无异常，通过剖检猪只各脏器组织进行PCR检测，均显示PCV3、PCV2 阴性，而空白对照组仔猪均不同程度出现体温升高40.5℃以上，持续5 天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓等临床症状，部分猪只死亡，剖检均出现不同程度肺实变、淋巴肿大、肾有坏死点的病理变化，通过各脏器组织进行PCR检测，可再次分离到猪圆环病毒3 型和猪圆环病毒2型病毒。
由于PCV在猪群中是可以通过垂直传播的，因此表9的结果证明了本发明含猪圆环病毒3型、2型抗原免疫原性组合物对混合感染猪圆环病毒3型和2型的仔猪有着良好的免疫保护作用，且能针对已经混合感染了PCV3和PCV2病毒的仔猪进行保护，即具有治疗作用，保护率为100％。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司 斯澳生物科技（苏州）有限公司
<120> 一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型
<400> 1
atgcgtcacc gtgctatctt ccgtcgtcgt ccgcgtccgc gtcgtcgtcg tcgtcaccgt 60
cgtcgttacg ctcgtcgtaa actgttcatc cgtcgtccga ccgctggtac ctactacacc 120
aaaaaatact ctaccatgaa cgttatctct gttggtaccc cgcagaacaa caaaccgtgg 180
cacgctaacc acttcatcac ccgtctgaac gaatgggaaa ccgctatctc tttcgaatac 240
tacaaaatcc tgaaaatgaa agttaccctg tctccggtta tctctccggc tcagcagacc 300
aaaaccatgt tcggtcacac cgctatcgac ctggacggtg cttggaccac caacacctgg 360
ctgcaggacg acccgtacgc tgaatcttct acccgtaaag ttatgacctc taaaaaaaaa 420
cactctcgtt acttcacccc gaaaccgctg ctggctggta ccacctctgc tcacccgggt 480
cagtctctgt ctttcttctc tcgtccgacc ccgtggctga acacctacga cccgaccgtt 540
cagtggggtg ctctgctgtg gtctatctac gttccggaaa aaaccggtat gaccgacttc 600
tacggtacca aagaagtttg gatccgttac aaatctgttc tgtaa 645
<210> 2
<211> 702
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒2型new基因亚型
<400> 2
atgacctacc cgcgtcgtcg ttaccgtcgt cgtcgtcacc gtccgcgttc tcacctgggt 60
cagatcctgc gtcgtcgtcc gtggctggtt cacccgcgtc accgttaccg ttggcgtcgt 120
aaaaacggta tcttcaacac ccgtctgtct cgttctttcg gttacaccgt tgttacctct 180
accgttaccc cgccgtcttg ggctgttgac atgatgcgtt tcaacatcaa cgacttcctg 240
ccgccgggtg gtggttctaa cccgcgttct gttccgttcg aatactaccg tatccgtaaa 300
gttaaagttg aattcttcgc tcgttctccg atcacccagg gtgaccgtgg tgttggttct 360
tctgctgtta tcctggacga caacttcgtt aacaaaacca acgctctgtc ttacgacccg 420
tacgttaact actcttctcg tcacaccatc acccagccgt tctcttacca ctctcgttac 480
ttcaccccga aaccggttct ggactctacc atcgactact tccagccgaa caacaaacgt 540
aaccagctgt ggctgcgtct gcagaccacc ggtaacgttg accacgttgg tctgggtacc 600
gctttcgaac actctatcta cgaccaggct tacaacatcc gtgttaccat gtacgttcag 660
ttccgtgaat tcaacctgaa agacccgccg ctgaacccgt aa 702
Claims (10)
1.一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物包括免疫量的猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原、免疫量的猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白抗原以及药学上可接受的载体；其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原为猪圆环病毒3型Cap蛋白或重组有所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的活载体，所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白抗原为猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白或重组有所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因的活载体；所述猪圆环病毒3型Cap蛋白为SEQ.ID NO.1编码的蛋白，所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白为SEQ.ID NO.2编码的蛋白。
2.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为≥20μg/ml；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白含量为≥20μg/ml。
3.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白含量为20μg/ml～100μg/ml。
4.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为20μg/ml～50μg/ml；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白含量为20μg/ml～50μg/ml。
5.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白含量为30μg/ml～50μg/ml；所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白含量为30μg/ml～50μg/ml。
6.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白基因和所述猪圆环病毒2型new基因亚型Cap蛋白基因重组于同一个活载体，所述活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒、或重组腺病毒。
7.根据权利要求1所述的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂为Gel佐剂；所述佐剂含量为5～20V/V％。
8.根据权利要求7所述的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物，其中，所述佐剂含量为10V/V％。
9.根据权利要求1～8任一项所述的含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物在制备预防猪圆环病毒相关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述猪圆环病毒相关疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪的皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。
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