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KR20220003586A - Cd19를 표적화하는 유전공학적으로 조작된 t 세포를 사용한 b 세포 악성종양의 동종이계 세포 요법 - Google Patents

Cd19를 표적화하는 유전공학적으로 조작된 t 세포를 사용한 b 세포 악성종양의 동종이계 세포 요법 Download PDF

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KR20220003586A
KR20220003586A KR1020217038948A KR20217038948A KR20220003586A KR 20220003586 A KR20220003586 A KR 20220003586A KR 1020217038948 A KR1020217038948 A KR 1020217038948A KR 20217038948 A KR20217038948 A KR 20217038948A KR 20220003586 A KR20220003586 A KR 20220003586A
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KR
South Korea
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cells
car
cell
leu
population
Prior art date
Application number
KR1020217038948A
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마크 벤튼
토니 호
데메트리오스 칼라이치디스
이웰리나 모라와
조나단 알렉산더 테렛
Original Assignee
크리스퍼 테라퓨틱스 아게
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Filing date
Publication date
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Abstract

B 세포 악성종양을 치료하는 데 사용하기 위한, CD19에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하고, 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 B2M 유전자, 또는 이 둘 모두를 함유하는, 유전공학적으로 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 집단이 개시된다.

Description

CD19를 표적화하는 유전공학적으로 조작된 T 세포를 사용한 B 세포 악성종양의 동종이계 세포 요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 제62/840,913호의 출원일의 우선권을 주장하고, 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR) T 세포 요법은 인간 악성종양을 치료하는 데 사용되는 입양 T 세포 치료제이다. CAR T 세포 요법은 재발성/불응성 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma; NHL) 및 소아 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia; ALL)에서 지속적 관해를 포함하여 엄청난 임상적 성공을 이끌었지만, 승인된 제품은 자가이며, 환자-특이적 세포 수집 및 제조를 필요로 한다. 이 때문에 일부 환자는 치료를 기다리는 동안 질환 진행 또는 사망을 경험하였다. 따라서, 개선된 CAR T 세포 치료제에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 개시는, 적어도 부분적으로, 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하고 파괴된 TRAC 유전자 및 B2M 유전자를 갖는 유전공학적으로 조작된 T 세포(예를 들어, CTX110 세포, TC1 세포로도 알려짐)를 사용하는 형질전환 FL 또는 DLBCL과 같은 B 세포 악성종양에 대한 동종이계 세포 요법의 개발을 기초로 한다. 본원에 개시된 동종이계 CAR-T 세포 요법은 특정 환자에서 완전 반응 및 긴 반응 지속성을 포함하여, 본원에 개시된 B 세포 악성종양을 갖는 인간 환자에서 치료 효능을 나타냈다. 또한, 본원에 개시된 동종이계 CAR-T 세포 요법은 장기간의 CAR-T 세포 확장 및 주입 후 지속성을 포함하여, 인간 환자에서 요망되는 약동학적 특징을 나타냈다.
따라서, 본 개시의 일부 양태는 인간 환자에서 B-세포 악성종양을 치료하기 위한 방법으로서, (i) B-세포 악성종양을 갖는 인간 환자가 림프구제거 치료를 받는 단계; 및 (ii) 단계 (i) 후에 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단계 (i)는 단계 (ii)의 약 2 일 내지 7 일 전에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 동종이계이다.
유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 (a) 파괴된 T 세포 수용체 알파 불변(T cell receptor alpha constant; TRAC) 유전자, (b) CD19에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산으로서, CAR은 서열번호 51에 기재된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 52에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD19 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고, 핵산은 파괴된 TRAC 유전자에 삽입되는, 핵산, 및 (c) 파괴된 베타 2-마이크로글로불린(β2M) 유전자를 포함하는 T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약 1×107 개 내지 약 1×109 개 CAR+ T 세포의 용량으로 인간 환자에게 투여된다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약 1×107 개 CAR+ T 세포의 용량으로 인간 환자에게 투여된다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약 3×107 개 CAR+ T 세포의 용량으로 인간 환자에게 투여된다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약 1×108 개 CAR+ T 세포의 용량으로 인간 환자에게 투여된다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약 3×108 개 CAR+ T 세포의 용량으로 인간 환자에게 투여된다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약 1×109 개 CAR+ T 세포의 용량으로 인간 환자에게 투여된다. 임의의 경우에, 용량 당 인간 환자에게 투여되는 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 최대 7×104 개 TCR+ T 세포/㎏을 함유한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)에서 림프구제거 치료는 3 일 동안 매일 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 500 ㎎/㎡ 내지 750 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드를 인간 환자에게 공동투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 단계 (i)에서 림프구제거 치료는 3 일 동안 매일 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 500 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드를 인간 환자에게 공동투여하는 것을 포함한다. 다른 예에서, 단계 (i)에서 림프구제거 치료는 3 일 동안 매일 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 750 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드를 인간 환자에게 공동투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i) 전에, 인간 환자는 다음 특징 중 하나 이상을 나타내지 않는다: (a) 임상 상태의 유의한 악화, (b) 91% 초과의 포화 수준을 유지하기 위한 보충용 산소에 대한 요구, (c) 비조절성 심장 부정맥, (d) 혈관수축제 보조가 필요한 저혈압, (e) 활동성 감염, 및 (f) 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
일부 구현예에서, 단계 (i) 후 및 단계 (ii) 전에, 인간 환자는 다음 특징 중 하나 이상을 나타내지 않는다: (a) 활동성의 비조절성 감염; (b) 단계 (i) 전의 임상 상태와 비교하여 임상 상태의 악화; 및 (c) 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
본원에 개시된 임의의 방법은 (iii) 단계 (ii) 후에 급성 독성의 발생에 대해 인간 환자를 모니터링하는 단계; 및 (iv) 급성 독성을, 발생 시, 관리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)는 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단을 투여한 후 적어도 28 일 동안 수행될 수 있다. 예시적인 급성 독성은 종양 용해 증후군(tumor lysis syndrome; TLS), 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome; CRS), 면역 이펙터 세포-관련 세포독성 증후군(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome; ICANS), B 세포 무형성증(B cell aplasia), 혈구탐식성 림프조직구증(hemophagocytic lymphohistiocytosis; HLH), 혈구감소증(cytopenia), 이식편 대 숙주병(graft-versus-host disease; GvHD), 고혈압, 신부전증, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, B 세포 악성종양은 비-호지킨 림프종이다. 예로는 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma; DLBCL), MYC 및 BCL2 및/또는 BCL6 재배열이 있는 고등급 B 세포 림프종, 형질전환 여포성 림프종(follicular lymphoma; FL), 또는 3b 등급 FL가 포함되지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 예에서, DLBCL은 상세불명(NOS)의 DLBCL이다. 일부 예에서, B 세포 악성종양은 불응성 및/또는 재발성이다.
일부 구현예에서, 인간 환자는 플루오로데옥시글루코스 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography; PET)-양성인 적어도 하나의 측정 가능한 병변을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 환자는 하나 이상의 차수의 선행 항암 요법을 받은 적이 있다. 일부 예에서, 인간 환자는 둘 이상의 차수의 선행 항암 요법을 받은 적이 있다. 예시적인 선행 항암 요법은 항-CD20 항체, 안트라사이클린-함유 요법, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 인간 환자는 불응성 또는 재발성 형질전환 FL을 갖고, DLBCL로의 형질전환 후 질환에 대해 적어도 하나의 차수의 화학요법을 받은 적이 있다. 다른 예에서, B 세포 악성종양은 불응성이고, 인간 환자는 마지막 요법에서 진행성 질환을 갖거나, 요법의 적어도 2 회 사이클 후에 안정 질환을 가지며, 안정 질환의 지속 기간은 최대 6 개월이다. 추가의 다른 예에서, 인간 환자는 선행 자가 조혈 줄기 세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation; HSCT)에 실패했거나 선행 자가 HSCT에 부적격이다. 대안적으로 또는 추가로, 인간 환자는 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단을 이용한 치료 후 추가적인 항암 요법을 받는다.
본원에 개시된 임의의 방법에서, 인간 환자는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다:
(a) 동부 협력 종양 학회(Eastern Cooperative Oncology Group; ECOG) 수행 상태 0 또는 1을 가짐;
(b) 적절한 신장, 간, 심장 및/또는 폐 기능;
(c) 선행 유전자 요법 또는 변형된 세포 요법 없음;
(d) 항-CD19 항체를 포함하는 선행 치료 없음;
(e) 선행 동종이계 HSCT 없음;
(f) 뇌척수액으로부터 검출 가능한 악성 세포 없음;
(g) 뇌 전이 없음;
(h) 선행 중추 신경계 장애 없음;
(i) 불안정 협심증, 부정맥 및/또는 심근경색 없음;
(j) 비조절성 감염 없음;
(k) 면역억제 요법이 필요한 면역결핍 장애 또는 자가면역 장애 없음; 및
(l) 인간 면역결핍 바이러스, B 형 간염 바이러스, 또는 C 형 간염 바이러스에 의한 감염 없음.
본원에 개시된 임의의 방법에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포에 의해 발현된 항-CD19 CAR은, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD19 scFv인 세포외 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산은 파괴된 TRAC 유전자에서 결실 부위에 삽입된다. 일부 예에서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 파괴된 β2M 유전자는 서열번호 9 내지 서열번호 14에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 90%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는다. 예를 들어, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 70%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나; 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 B2M 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나; 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 30%는 검출 가능한 수준의 CAR을 발현한다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 99.5%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 70%는 검출 가능한 수준의 B2M 표면 단백질을 발현하지 않는다. 특정 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 85%는 검출 가능한 수준의 B2M 표면 단백질을 발현하지 않는다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 CAR을 발현한다. 특정 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 70%는 검출 가능한 수준의 CAR을 발현한다.
특정 예에서, 본원에 개시된 임의의 방법에서 사용하기 위한 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 CTX110 세포이다.
본원에 개시된 임의의 방법에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 정맥내 주사를 통해 인간 환자에게 투여된다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 동결보존 용액에 현탁될 수 있다.
또한, B-세포 악성종양을 치료하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물로서, 본원에 개시된 임의의 유전공학적으로 조작된 T 세포(예를 들어, CTX110 세포)의 집단을 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라, 본원에 개시된 바와 같은 B-세포 악성종양을 치료하는 데 사용되는 의약을 제조하기 위한 유전공학적으로 조작된 T 세포의 용도가 본 개시의 범위 내에 있다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 하기 설명에서 기술된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 하기 도면 및 여러 구현예의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 편집 8 일 후 인간 일차 T-세포, TRAC-/B2M-CD19CAR+T 세포(TC1)의 일련의 유세포 분석 플롯이다. 그래프는 TRAC 및 B2M의 감소된 표면 발현을 보여준다. TCR/MHC I 이중 녹아웃(knockout) 세포는 고수준의 CAR 전이유전자를 발현한다(하단 패널). 정제 비드를 갖는 TC1 세포의 음성 선택은 TCR 양성 세포의 감소를 야기한다(우측 패널).
도 2는 TRAC-/B2M-CD19CAR+T 세포(TC1)의 TRAC 및 B2M 유전자좌에서 달성된 높은 편집율을 도시한 그래프이다. 유전자 편집의 기능적 산출물인 TCR 및 MHCI의 표면 발현을 측정하고, y-축 상에 편집 백분율로서 플롯팅하였다. 고효율(예를 들어, 50% 초과)의 부위-특이적 통합 및 TRAC 유전자좌로부터 CAR의 발현을 검출하였다. 이들 데이터는 TRAC-/B2M-/항-CD19CAR+T 세포의 생성에 대하여 50% 초과의 효율을 입증해 준다.
도 3은 TRAC-/β2M-CD19 CAR+ T 세포(TC1)를 이용한 처리 후 NOG Raji 마우스에서 종양 부피(mm3)의 통계적으로 유의한 감소(p = 0.007)를 도시한 그래프이다.
도 4는 처리를 제공받지 않은 NOG Raji 마우스에 비해 TC1 세포로 처리된 NOG Raji 마우스의 생존 증가를 나타내는 생존 곡선 그래프이다.
도 5는 1 일차에 처리를 제공받지 않은 대조 마우스에 비해 4 일차에 TC1 세포로 처리된 NOG Raji 마우스의 생존 증가를 나타내는 생존 곡선 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 마우스에서 TC1 세포의 지속성 및 항-종양 활성을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 6a는 TC1 세포가 NOG Raji 마우스에서 지속되는 것을 나타내는 일련의 유세포 분석 플롯이다. 도 6b는 TC1 세포가 대조(비처리 NOG Raji 마우스 또는 NOG 마우스)에 비해 TC1로 처리된 NOG Raji 마우스에서 비장 Raji 세포를 선택적으로 근절시킨다는 것을 나타내는 그래프이다. 효과는 대조에 비해 TC1로 처리된 NOG Raji 마우스에서 감소된 비장 질량으로서 도시되어 있다.
도 7은 지속적인 비장 TC1 세포가 TC1로 처리된 2 마리의 독립적인 NOG Raji 마우스에서 편집되는 것을 나타내는 일련의 유세포 분석 플롯이다.
도 8은 1 일차에 처리를 제공받지 않은 대조 마우스에 비해 4 일차에 TC1 세포로 처리된 NOG Nalm6 마우스의 생존 증가를 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 플롯이다.
도 9는 처리를 제공받지 않은 대조 마우스에 비해 상이한 농도의 TC1을 이용한 처리 후 산재성 Nalm6 B-세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL)을 보유하는 마우스의 생존 증가를 보여주는 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 10은 TC1 세포를 이용한 처리 후 산재성 Nalm6 B-세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL) 종양 모델의 종양 세포 확장에서 통계적으로 유의한 억제를 도시한 그래프이다.
도 11은 방사선 후 TC1 세포 또는 다양한 대조 세포(PBMC 또는 전기천공(EP) T 세포)로 처리된 건강한 마우스, 또는 방사선만 제공받은 마우스("RT 단독")의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 12는 도 18에서 처리된 마우스의 체중 변화의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 13은 방사선 후 저용량(2×107 개) 또는 고용량(4×107 개)의 TC1 세포, 또는 비편집 T 세포로 처리된 건강한 마우스, 또는 방사선만을 제공받은 마우스("비히클-RT")의 카플란-마이어 생존 플롯이다.
도 14는 방사선 조사되지 않고 세포가 투여되지 않은 마우스("비히클-비 RT") 외에, 도 20에서 처리된 마우스의 체중 변화의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 15는 6 명의 상이한 공여체로부터의 말초 혈액 세포의 비편집 CD8+ T 세포 서브세트 중 CD27+CD45RO- 세포의 백분율을 보여주는 막대 그래프이다.
도 16은 TCRαβ+ 세포의 고갈 전 및 후의 TC1 세포에 대한 TCRαβ 및 B2M 발현의 유세포 분석 결과를 제공한 것이다.
도 17은 유전자 편집 후 TCR- 및 MHC I-(B2M)에 대한 단백질의 손실 백분율, 및 TC1 생산의 개별 플롯으로부터 편집된 TC1 세포에서 항-CD19 CAR을 발현하는 세포의 백분율의 그래프이다.
도 18은 편집 전 및 후 6명의 상이한 공여체로부터의 T 세포 집단에서 PD1+(상단 좌측), LAG3+(상단우측), TIM3+(하단 좌측) 또는 CD57+(하단 우측)의 백분율을 보여주는 그래프를 제공한 것이다.
도 19는 TC1 세포 또는 비편집 T 세포와 함께 상이한 비율로 공배양되는 경우 CD19-양성 세포주(Nalm6; Raji; 및 K562-CD19) 및 CD19-음성 세포(K562)의 세포 용해의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 20은 T-세포 배지(혈청 + IL2 + IL7; 완전 배지), 혈청을 함유하지만 IL2 또는 IL7 사이토카인이 없는(5% 혈청, 사이토카인 없음), 또는 혈청 또는 사이토카인이 없는(혈청 없음, 사이토카인 없음) 배지의 존재에서 배양되는 경우 생존 TC1 세포의 수를 보여주는 그래프이다. 세포를 유전자 편집 후 지시된 날에 계수하였다. ± SD로 표시된 3 개 로트의 평균 값.
도 21은 림프구제거 후 CD19+ 악성종양을 갖는 인간 대상체에게 투여된 CTX110 세포(TC1 세포로도 알려짐)를 평가하기 위한 임상 연구 설계를 도시한 개략도이다.
분화 클러스터 19(Cluster of Differentiation 19; CD19)는 백혈병 전구 세포에서 검출 가능한 항원 결정자이다. 인간 및 뮤린 아미노산 및 핵산 서열은 공공 데이터베이스, 예컨대, GenBank, UniProt 및 Swiss-Prot에서 확인될 수 있다. 예를 들어, 인간 CD19의 아미노산 서열은 UniProt/Swiss-Prot 수탁 번호 P15391로서 확인될 수 있고, 인간 CD19를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 NM_001178098에서 확인될 수 있다. CD19는, 예를 들어, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병 및 비-호지킨 림프종을 포함하는 대부분의 B 계통 암에서 발현된다. 이는 또한 B 세포 전구세포의 초기 마커이다. 예를 들어, 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]을 참조한다.
본 개시는 B 세포 악성종양에 대한 동종이계 CAR-T 세포 요법을 제공한다. CAR-T 세포 요법은 항-CD19 CAR을 발현하고 파괴된 TRAC 유전자 및 B2M 유전자를 갖는 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단을 포함하고, 항-CD19 CAR을 코딩하는 핵산은 TRAC 유전자 유전자좌로 삽입되고, 이에 의해 TRAC 유전자의 발현을 파괴한다. 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포는 건강한 공여체로부터 수득된 모 T 세포를 이용하여 제조된다. 따라서, 환자 자신의 T 세포로부터 CAR-T 세포를 제조하기 위해 진단과 치료 사이에 적어도 3 주 간격이 필요한 자가 CAR-T 요법과 달리, 본 CAR-T 요법은 진단 직후 표적 B 세포 악성종양을 갖는 환자에게 이용 가능하다. 동종이계 CAR T 요법은 진단 직후 치료를 용이하게 하기 위해 치료 부위에 저장되고 입력될 수 있다. 동종이계 항-CD19 CAR T 요법의 즉각적인 이용 가능성은 자가 CAR-T 세포가 환자 자신의 세포로부터 제조될 때 필요할 수 있는 화학 요법을 연결할 필요성을 없앤다. 본원에 개시된 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포 요법은 특정 환자에서 완전 반응 및 긴 반응 지속성을 포함하여, 본원에 개시된 B 세포 악성종양을 갖는 인간 환자에서 치료 효능을 나타냈다. 또한, 본원에 개시된 동종이계 CAR-T 세포 요법은 장기간의 CAR-T 세포 확장 및 주입 후 지속성을 포함하여, 인간 환자에서 요망되는 약동학적 특징을 나타냈다.
따라서, 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 B2M, 및 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 서열번호 39에 의해 인코딩되는, 서열번호 40)을 총괄하여 포함하는 T 세포와 같은 유전공학적으로 조작된 면역 세포의 집단을 사용하여 인간 환자에서 B-세포 악성종양을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 항-CD19 CAR을 인코딩하고 선택적으로 프로모터 서열 및 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 핵산은 예를 들어, TRAC 유전자에서 서열 번호 26의 세그먼트를 대체할, 파괴된 TRAC 유전자 유전자좌에 삽입될 수 있다. 인간 환자는 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 투여 전에 림프구제거 치료를 받는다.
I. 항-CD19 CAR T 세포
B 세포 악성종양을 치료하는 데 사용하기 위한 항-CD19 CAR T 세포(예를 들어, CTX110 세포)가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 항-CD19 CAR T 세포는 항-CD19 CAR을 발현하고 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 B2M 유전자, 또는 이들의 조합을 갖는 인간 T 세포이다. 특정 예에서, 항-CD19 CAR T 세포는 항-CD19 CAR을 발현하고, 파괴된 내인성 TRAC 및 B2M 유전자를 갖는다.
(i) 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)
본원에 개시된 T 세포와 같은 유전공학적으로 조작된 면역 세포는 CD19에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)(항-CD19 CAR)를 발현한다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 요망되지 않는 세포, 예를 들어, 암 세포와 같은 질환이 있는 세포에 의해 발현되는 항원을 인식하고 이에 결합하도록 조작된 인공 면역 세포 수용체를 지칭한다. CAR 폴리펩티드를 발현하는 T 세포는 CAR T 세포로 지칭된다. CAR은 T-세포 특이성 및 반응성을 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대하여 재유도하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR-T 세포에 항원 가공과 관계없이 항원을 인식하여, 그에 의해 주요 종양 회피 기전을 우회하는 능력을 제공한다. 더욱이, T-세포에서 발현되는 경우, CAR은 유리하게는 내인성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄와 이량체화하지 않는다.
다양한 세대의 CAR이 존재하며, 이의 각각은 상이한 성분을 함유한다. 1 세대 CAR은 힌지 및 막관통 도메인을 통하여 항체-유래 scFv를 T-세포 수용체의 CD3제타(ζ 또는 z) 세포내 신호전달 도메인에 연결시킨다. 2 세대 CAR은 공동자극 신호를 제공하기 위해 추가의 공동-자극 도메인, 예를 들어, CD28, 4-1BB(41BB) 또는 ICOS를 혼입한다. 3-세대 CAR은 TCR CDRζ 쇄와 융합된 2 개의 공동자극 도메인(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB, ICOS, 또는 OX40의 조합)을 함유한다(Maude et al., Blood. 2015; 125(26):4017-4023; Kakarla and Gottschalk, Cancer J. 2014; 20(2):151-155). 임의의 다양한 세대의 CAR 작제물이 본 개시의 범위 내에 있다.
일반적으로, CAR은 표적 항원(예를 들어, 항체의 단쇄 단편(scFv) 또는 다른 항체 단편)을 인식하는 세포외 도메인 및 T-세포 수용체(TCR) 복합체(예를 들어, CD3ζ)의 신호전달 도메인 및 대부분의 경우에 공동-자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다(Enblad et al., Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505). CAR 작제물은 세포외 도메인과 세포내 도메인 사이의 힌지 및 막관통 도메인, 뿐만 아니라 표면 발현을 위한 N-말단에서의 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 예는 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(서열번호 30) 및 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열번호 31)를 포함한다. 다른 신호 펩티드가 사용될 수 있다.
항-CD19 CAR은 CD19에 특이적인 항-CD19 단쇄 가변 단편(scFv), 및 이어서 세포내 공동-자극 도메인(예를 들어, CD28 공동자극 도메인) 및 CD3ζ 신호전달 도메인에 융합된 힌지 도메인 및 막관통 도메인(예를 들어, CD8 힌지 및 막관통 도메인)을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 항-CD19 CAR을 구축하는 데 사용하기 위한 예시적인 성분은 하기 제공된 서열 표에서 찾아볼 수 있다.
(a) 항원 결합 세포외 도메인
항원-결합 세포외 도메인은 CAR이 세포 표면에서 발현될 때 세포외액에 노출되는 CAR 폴리펩티드의 영역이다. 일부 예에서, 신호 펩티드는 세포 표면 발현을 용이하게 하기 위해 N-말단에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv, 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)(어느 한 배향)을 포함할 수 있음)일 수 있다. 일부 예에서, VH 및 VL 단편은 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 링커는, 일부 구현예에서, 가요성을 위한 글리신 및 세린의 스트레치뿐만 아니라, 부가된 가용성을 위한 글루타메이트 및 리신의 스트레치를 갖는 친수성 잔기를 포함한다. scFv 단편은 scFv 단편이 유래된 모 항체의 항원-결합 특이성을 보유한다. 일부 구현예에서, scFv는 인간화된 VH 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, scFv의 VH 및/또는 VL 도메인은 완전 인간이다.
본원에 개시된 CAR 폴리펩티드의 항원-결합 세포외 도메인은 CD19(예를 들어, 인간 CD19)에 특이적이다. 일부 예에서, 항원-결합 세포외 도메인은 CD19에 결합할 수 있는 scFv 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 항-CD19 scFv는 서열번호 51의 것들과 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 서열번호 52의 것들과 동일한 경쇄 CDR을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함할 수 있다. 동일한 VH 및/또는 VL CDR을 갖는 2 개의 항체는 동일한 접근법(예를 들어, 당분야에 공지된 바와 같은 카바트(Kabat) 접근법, 코티아(Chothia) 접근법, AbM 접근법, 콘택트(Contact) 접근법, 또는 IMGT 접근법, 예를 들어, bioinf.org.uk/abs/을 참조)에 의해 결정하는 경우 이들의 CDR이 동일하다는 것을 의미한다. 일부 예에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 51의 VH 및/또는 서열번호 52의 VL을 포함한다. 특정 예에서, 항-CD19 scFv는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
(b) 막관통 도메인
본원에 개시된 항-CD19 CAR 폴리펩티드는 막을 가로지르는 소수성 알파 헬릭스일 수 있는 막관통 도메인을 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 막관통 도메인은 이를 함유하는 CAR의 안정성을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 바와 같은 CAR의 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인일 수 있다. 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인일 수 있다. 추가의 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8 및 CD28 막관통 도메인의 키메라이다. 다른 막관통 도메인은 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다. 한 가지 특정 예에서, 항-CD19 CAR에서 막관통 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CD8α 막관통 도메인이다.
(c) 힌지 도메인
일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CAR의 세포외 도메인(항원 결합 도메인 포함)과 막관통 도메인 사이에, 또는 CAR의 세포질 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치할 수 있다. 힌지 도메인은 폴리펩티드 쇄에서 막관통 도메인을 세포외 도메인 및/또는 세포질 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 힌지 도메인은 CAR, 또는 이의 도메인에 가요성을 제공하도록, 또는 CAR, 또는 이의 도메인의 입체 장해를 방지하도록 기능을 할 수 있다.
일부 구현예에서, 힌지 도메인은 최대 300 개의 아미노산(예를 들어, 10 개 내지 100 개의 아미노산, 또는 5 개 내지 20 개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 힌지 도메인(들)은 CAR의 다른 영역에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인일 수 있다. 다른 힌지 도메인이 사용될 수 있다.
(d) 세포내 신호전달 도메인
본원에 개시된 임의의 항-CD19 CAR 작제물은 수용체의 기능적 말단인 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ξ, 및 선택적으로 하나 이상의 공동-자극 도메인)을 함유한다. 항원 인식 후에, 수용체는 클러스터링되고, 신호는 세포로 전달된다.
CD3ξ는 T 세포 수용체 복합체의 세포질 신호전달 도메인이다. CD3ξ는 세 개(3)의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하며, 이는 T 세포가 동족 항원과 결합된 후 활성화 신호를 T 세포로 전달한다. 많은 경우에, CD3ξ는 완전 적격인 활성화 신호가 아니라 일차 T 세포 활성화를 제공하고, 이는 공동-자극 신호전달을 필요로 한다. 일부 예에서, 본원에 개시된 항-CD19 CAR 작제물은 서열번호 38의 아미노산 서열을 가질 수 있는 CD3ξ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD19 CAR 폴리펩티드는 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, CD28 및/또는 4-1BB의 공동-자극 도메인은 CD3ξ에 의해 매개된 일차 신호전달과 함께 완전 증식/생존 신호를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD28 공동-자극 분자, 예를 들어, 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 CAR은 4-1BB 공동-자극 분자, 예를 들어, 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 예에서, 본원에 개시된 항-CD19 CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 38) 및 CD28 공동-자극 도메인(예를 들어, 서열번호 36)을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 당분야에 공지되거나 본원에 개시된 CAR을 발현하는 유전공학적으로 조작된 T 세포를 생산하는 데 사용될 수 있는 하나보다 많은 적합한 CAR을 포괄한다는 것이 이해되어야 한다. 예는, 예를 들어, 제WO 2019/097305A2호로 공개된 2018년 5월 11 일에 출원된 국제 출원 제PCT/IB2018/001619호, 및 2019년 5월 10일에 출원된 국제 출원 제PCT/IB2019/000500호에서 찾아볼 수 있으며, 각각의 상기 선행 출원의 관련 개시는 본원에서 언급되는 목적 및 주제에 대하여 본원에 참조로 포함된다.
특정 예에서, 본원에 개시된 항-CD19 CAR은 서열번호 39의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하기 제공된 서열 표를 참조한다.
본원에 개시된 유전공학적으로 조작된 T 세포에서, 항-CD19 CAR의 코딩 서열, 및 선택적으로 항-CD19 CAR(서열 표에 제공된 EF1a 프로모터와 같은 프로모터)의 발현을 위한 조절 서열을 포함하는 핵산은 관심 게놈 유전자좌에 삽입될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 내인성 TRAC 유전자 유전자좌에 삽입되고, 이에 의해 TRAC 유전자의 발현을 파괴한다. 특정 예에서, 핵산은 TRAC 유전자에서의 단편, 예를 들어, 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편을 대체할 수 있다.
(ii) TRAC 및 B2M 유전자의 녹-아웃
본원에 개시된 항-CD19 CAR-T 세포는 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 B2M 유전자, 또는 이들의 조합을 추가로 가질 수 있다. TRAC 유전자좌의 파괴는 T 세포 수용체(TCR)의 발현의 손실을 초래하고 이식편 대 숙주병(GvHD)의 확률을 감소시키도록 의도된 반면, β2M 유전자좌의 파괴는 주요 조직적합성 복합체 I형(MHC I) 단백질의 발현의 결여를 야기하며 숙주 거부의 확률을 감소시킴으로써 지속성을 향상시키도록 의도된다. 항-CD19 CAR의 첨가는 CD19-발현 종양 세포로 변형된 T 세포를 유도한다.
본원에서 사용되는 용어 "파괴된 유전자"는 인코딩된 유전자 산물의 활성을 실질적으로 감소시키거나 완전히 없애도록 야생형 대응물에 비해 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 삽입, 결실, 또는 뉴클레오티드 치환 등)을 함유하는 유전자를 지칭한다. 하나 이상의 돌연변이는 비-코딩 영역, 예를 들어, 프로모터 영역, 전사 또는 번역을 조절하는 조절 영역; 또는 인트론 영역에 위치할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 돌연변이는 코딩 영역(예를 들어, 엑손)에 위치할 수 있다. 일부 예에서, 파괴된 유전자는 코딩된 단백질을 발현하지 않거나 실질적으로 감소된 수준으로 발현한다. 다른 예에서, 파괴된 유전자는 기능적이지 않거나 실질적으로 감소된 활성을 갖는 돌연변이된 형태로 인코딩된 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 파괴된 유전자는 기능성 단백질을 인코딩하지 않는 유전자이다. 일부 구현예에서, 파괴된 유전자를 포함하는 세포는 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 검출 가능한 수준으로(예를 들어, 항체에 의해, 예를 들어, 유세포 분석에 의해) 발현하지 않는다(예를 들어, 세포 표면에서). 검출 가능한 수준의 단백질을 발현하지 않는 세포는 녹아웃 세포로 지칭될 수 있다. 예를 들어, β2M 단백질이 β2M 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 세포 표면에서 검출될 수 없는 경우 β2M 유전자 편집을 갖는 세포는 β2M 녹아웃 세포로 간주될 수 있다.
일부 구현예에서, 파괴된 유전자는 야생형 대응물에 비해 돌연변이된 단편을 포함하는 것으로 기술될 수 있다. 돌연변이된 단편은 결실, 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 파괴된 유전자는 야생형 대응물에 존재하는 단편의 결실을 갖는 것으로 기술될 수 있다. 일부 예에서, 결실된 단편의 5' 말단은 본원에 개시된 것들과 같은 설계된 가이드 RNA에 의해 표적화된 유전자 영역 내에 위치할 수 있고(표적내 서열로 알려짐), 결실된 단편의 3' 말단은 표적화된 영역을 벗어날 수 있다. 대안적으로, 결실된 단편의 3' 말단은 표적화된 영역 내에 위치할 수 있고, 결실된 단편의 5' 말단은 표적화된 영역을 벗어날 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 항-CD19 CAR-T 세포에서 파괴된 TRAC 유전자는 결실, 예를 들어, TRAC 유전자 유전자좌의 엑손 1에서의 단편의 결실을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 파괴된 TRAC 유전자는 TRAC 가이드 RNA TA-1의 표적 부위인 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편의 결실을 포함한다. 하기 서열 표를 참조한다. 일부 예에서, 서열번호 26의 단편은 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산으로 치환될 수 있다. 이러한 파괴된 TRAC 유전자는 서열번호 39의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항-CD19 CAR-T 세포에서 파괴된 B2M 유전자는 CRISPR/Cas 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 일부 예에서, 하기 서열 표에 제공된 B2M gRNA가 사용될 수 있다. 파괴된 B2M 유전자는 서열번호 9 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
(iii) 동종이계 요법을 위한 예시적인 항-CD19 CAR-T 세포 집단
또한, 본원에 개시된 임의의 항-CD19 CAR(예를 들어, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD19 CAR) 및 또한 본원에 개시된 바와 같은 파괴된 TRAC 유전자 및/또는 파괴된 B2M 유전자를 발현하는 본원에 개시된 항-CD19 CAR-T 세포를 포함하는 유전공학적으로 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포, 예컨대, 인간 T 세포)의 집단이 제공된다. 일부 예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 파괴된 TRAC 유전자 및 B2M 유전자를 갖는 CD19-관련 T 세포인 CTX110 세포이다. 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산은 서열번호 26의 자리에서 파괴된 TRAC 유전자에 삽입될 수 있고, 이는 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산으로 치환되고, 이에 의해 TRAC 유전자의 발현을 파괴할 수 있다. CTX110 세포에서 파괴된 TRAC 유전자는 서열번호 39의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
CTX110 세포는 표적화된 유전자(TRAC 및 B2M 유전자)를 파괴하는 CRISPR/Cas9(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/CRISPR 연관 단백질 9) 기법, 및 항-CD19 CAR 작제물을 전달하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 형질도입을 이용하여 생체외 유전자 변형을 통해 생산될 수 있다. CRISPR-Cas9-매개 유전자 편집은 두 개의 가이드 RNA(sgRNA)를 포함한다: TRAC 유전자좌를 표적화하는 TA-1 sgRNA(서열번호 18), 및 β2M 유전자좌를 표적화하는 B2M-1 sgRNA(서열번호 20). 본원에 제공된 임의의 gRNA 서열에 대하여, 명시적으로 변형을 나타내지 않는 것들은 비변형 서열과 임의의 적합한 변형을 갖는 서열 둘 모두를 포괄하는 것을 의미한다.
CTX110 세포의 항-CD19 CAR는 항-CD19 단쇄 항체 단편(scFv, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함할 수 있음), 및 이어서 CD28의 세포내 공동-신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 36) 및 CD3ζ 신호전달 도메인(예를 들어, 서열번호 38)에 융합된 CD8 힌지 및 막관통 도메인(예를 들어, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는)으로 구성된다. 특정 예에서, CTX110 세포에서 항-CD19 CAR은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CTX110 세포 집단의 적어도 30%는 검출 가능한 수준의 항-CD19 CAR을 발현한다. 예를 들어, CTX110 세포의 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%은 검출 가능한 수준의 항-CD19 CAR을 발현한다.
일부 구현예에서, CTX110 세포 집단의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않을 수 있다. 예를 들어, CTX110 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 100%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않는다.
대안적으로 또는 추가로, CTX110 세포 집단의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않을 수 있다. 예를 들어, CTX110 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 100%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 TRAC 표면 단백질을 발현하지 않는다. 특정 예에서, CTX110 세포의 90% 초과(예를 들어, 99.5% 초과)는 검출 가능한 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 상당 비율의 CTX110 T 세포 집단이 하나보다 많은 유전자 및/또는 단백질을 발현하지 않는 특정 비율의 세포를 야기하는 하나보다 많은 유전자 편집을 포함할 수 있다.
예를 들어, CTX110 세포 집단의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 두 개의 표면 단백질을 발현하지 않을 수 있는데, 예를 들어, 검출 가능한 수준의 β2M 및 TRAC 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, CTX110 T 세포의 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 100%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 TRAC 및 B2M 표면 단백질을 발현하지 않는다. 또 다른 예에서, CTX110 세포 집단의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 TRAC 및 B2M 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, CTX110 T 세포의 집단은 본원에 기재된 편집일 수 있는 하나보다 많은 유전자 편집(예를 들어, 하나보다 많은 유전자에서)를 포함할 수 있다. 예를 들어, CTX110 T 세포의 집단은 TA-1 TRAC gRNA를 사용하여 CRISPR/Cas 기법을 통해 파괴된 TRAC 유전자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, CTX110 세포는 비변형 T 세포에 비해 TRAC 유전자에서 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, CTX110 T 세포는 TRAC 유전자에서 단편 AGAGCAACAGTGCTGTGGCC(서열번호 26)의 결실을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 서열번호 39)으로 치환될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, CTX110 세포의 집단은 B2M-1의 gRNA를 사용하여 CRISPR/Cas9 기법을 통해 파괴된 β2M 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 CTX110 세포는 서열번호 9 내지 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 β2M 유전자에서 인델을 포함할 수 있다. 특정 예에서, CTX110 세포는 ≥ 30% CAR+ T 세포, ≤ 50% B2M+ 세포, 및 ≤ 30% TCRαβ+ 세포를 포함한다. 추가의 특정 예에서, CTX110 세포는 ≥ 30% CAR+ T 세포, ≤ 30% B2M+ 세포, 및 ≤ 0.5% TCRαβ+ 세포를 포함한다.
또한, 본원에 언급된 주제 및 목적에 대하여 각각의 관련 개시가 참조로 포함되는 제WO 2019/097305A2호, 및 제WO2019215500호를 참조한다.
(iv) 약학적 조성물
일부 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 유전공학적으로 조작된 항-CD19 CAR T 세포, 예를 들어, CTX110 세포의 집단, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 또한 본원에 개시된 바와 같은 인간 환자에서 암 치료에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 다른 문제 또는 합병증이 없이 대상체의 조직, 기관 및/또는 체액과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여형을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 상용성인, 용매, 분산매, 코팅물, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 지칭한다. 조성물은 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 산 부가 염 또는 염기 부가 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Berge et al., (1977) J Pharm Sci 66:1-19]을 참조한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 염을 추가로 포함한다. 약학적으로 허용되는 염의 비-제한적 예는 산 부가 염(무기산(예를 들어, 염산 또는 인산), 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 또는 타르타르산 등을 갖는 폴리펩티드의 유리 아미노 기로부터 형성됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유리 카복실기와 형성된 염은 무기 염기(예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드), 또는 유기 염기, 예컨대, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 또는 프로카인 등으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 약학적 조성물은 동결보존 용액(예를 들어, CryoStor® C55)에 현탁된 유전공학적으로 조작된 항-CD19 CAR-T 세포(예를 들어, CTX110 세포)의 집단을 포함한다. 본 개시에 사용하기 위한 동결보존 용액은 또한 아데노신, 덱스트로스, 덱스트란-40, 락토비온산, 수크로스, 만니톨, 완충제, 예컨대, N-)2-하이드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄설폰산)(HEPES), 하나 이상의 염(예를 들어, 칼슘 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 포타슘 바이카보네이트, 포타슘 포스페이트 등), 하나 이상의 염기(예를 들어, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드 등), 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 동결보존 용액의 성분은 멸균수에 용해될 수 있다(주사용 품질). 임의의 동결보존 용액은 혈청을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다(일상적인 방법으로는 검출 불가).
일부 예에서, 동결보존 용액(예를 들어, 혈청을 실질적으로 함유하지 않는)에 현탁된 CTX110 세포와 같은 유전공학적으로 조작된 항-CD19 CAR-T 세포의 집단을 포함하는 약학적 조성물이 보관 바이알에 넣어질 수 있다.
선택적으로 본원에 개시된 바와 같은 동결보존 용액에 현탁될 수 있는 또한 본원에 개시된 바와 같은 유전공학적으로 조작된 항-CD19 CAR T 세포(예를 들어, CTX110 세포)의 집단을 포함하는 본원에 개시된 임의의 약학적 조성물은 추후 사용을 위해 T 세포의 생존율 및 생활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 환경에서, 예를 들어, 세포 및 조직의 저장을 위해 흔히 적용되는 조건 하에 저장될 수 있다. 일부 예에서, 약학적 조성물은 -135℃ 이하에서 액체 질소의 기체상에 저장될 수 있다. 세포가 이러한 조건 하에 소정 기간 동안 저장된 후 외관, 세포수, 생존율, %CAR+ T 세포, %TCR+ T 세포, 및 %B2M+ T 세포에 대하여 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
II. 유전공학적으로 조작된 면역 세포의 집단
당분야에 공지된 임의의 적합한 유전자 편집 방법은, 예를 들어, 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease; ZFN), 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease; TALEN), 및 RNA-가이드 CRISPR-Cas9 뉴클레아제(CRISPR/Cas9; 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 연관 9(Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats Associated 9))를 사용하는 뉴클레아제-의존성 표적화된 편집이 본원에 개시된 유전공학적으로 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포, 예컨대, CTX110 세포)를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 특정 예에서, 유전공학적으로 조작된 면역 세포, 예컨대, CTX110 세포는 공여체 주형으로서 아데노-연관 바이러스 벡터(AAV)를 사용함으로써 상동성 재조합과 조합하여 CRISPR 기술에 의해 생산된다.
(i) CRISPR-Cas9-매개 유전자 편집 시스템
CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 편집에 사용되는 RNA-가이드 DNA-표적화 플랫폼으로 용도가 변경된 원핵생물의 자연 발생적 방어 메커니즘이다. 이는 DNA의 절단을 표적화하기 위해 DNA 뉴클레아제 Cas9, 및 두 개의 비코딩 RNA, crisprRNA(crRNA)와 전사활성화 RNA(tracrRNA)에 의존한다. CRISPR은, 예를 들어 원핵생물을 감염시키거나 공격한 바이러스에 의해 세포에 이전에 노출된 외래 DNA와 유사성을 갖는 DNA의 단편(스페이서 DNA)을 함유하는 박테리아 및 고세균의 게놈에서 발견된 DNA 서열의 패밀리인 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부의 약어이다. 이러한 DNA 단편은 후속하는 공격 동안 예를 들어 유사한 바이러스로부터의 재도입 시 유사한 외래 DNA를 검출하고 파괴시키도록 원핵생물에 의해 사용된다. CRISPR 유전좌위의 전사는 외래 외인성 DNA를 인식하고 절단할 수 있는 Cas(CRISPR 연관) 단백질과 회합하고 이를 표적화하는 스페이서 서열을 포함하는 RNA 분자의 형성을 야기한다. CRISPR/Cas 시스템의 많은 유형 및 클래스가 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Koonin et al., (2017) Curr Opin Microbiol 37:67-78] 참조).
crRNA는 전형적으로 표적 DNA에서 20 개의 뉴클레오티드(nt) 서열과 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성을 통해 CRISPR-Cas9 복합체의 서열 인식 및 특이성을 유도한다. crRNA에서의 5' 20 nt의 서열의 변경은 특이적 유전자좌로의 CRISPR-Cas9 복합체의 표적화를 허용한다. 표적 서열 뒤에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)라 칭해지는 특이적 짧은 DNA 모티프(서열 NGG를 가짐)가 있으면 CRISPR-Cas9 복합체는 crRNA의 처음 20 nt에 일치하는 서열을 함유하는 DNA 서열에만 결합한다.
TracrRNA는 crRNA의 3' 말단과 혼성화되어 RNA-이중체 구조를 형성하고, 이는 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 결합되어, 이후 표적 DNA를 절단할 수 있는 촉매 활성 CRISPR-Cas9 복합체를 형성한다.
CRISPR-Cas9 복합체가 표적 부위에서 DNA에 결합되면, Cas9 효소 내의 두 개의 독립적인 뉴클레아제 도메인은 각각 PAM 부위의 상류에 DNA 가닥의 하나를 절단하여, 이중-가닥 파손(DSB)을 남기고, 여기서 DNA의 가닥 둘 모두는 염기 쌍에서 종료한다(블런트 말단).
특이적 표적 부위에서의 DNA의 CRISPR-Cas9 복합체의 결합 및 부위-특이적 DSB의 형성 후, 다음의 핵심 단계는 DSB의 복구이다. 세포는 DSB를 복구하기 위한 두 개의 주요 DNA 복구 경로를 이용한다: 비상동성 말단 연결(NHEJ) 및 상동성-지정 복구(HDR).
NHEJ는 비분열 세포를 포함하는 대부분의 세포 유형에서 고도로 활성으로 보이는 강력한 복구 메커니즘이다. NHEJ는 오류 발생이 쉽고, 흔히 DSB의 부위에서 1 개의 뉴클레오티드 내지 수백 개의 뉴클레오티드의 제거 또는 부가를 발생시킬 수 있긴 하지만, 이러한 변형은 전형적으로 20 nt 미만이다. 생성된 삽입 및 결실(인델)은 유전자의 코딩 또는 비코딩 영역을 파괴할 수 있다. 대안적으로, HDR은 고충실도로 DSB를 복구하기 위해 내인성으로 또는 외인성으로 제공된 상동성 공여체 DNA의 긴 스트레치를 이용한다. HDR은 분열 세포에서 오직 활성이고, 대부분의 세포 유형에서 비교적 낮은 빈도로 생긴다. 본 개시의 많은 구현예에서, NHEJ는 복구 오페란트로서 이용된다.
(a) Cas9
일부 구현예에서, Cas9(CRISPR 연관 단백질 9) 엔도뉴클레아제는 본원에 개시된 바와 같은 유전공학적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위한 CRISPR 방법에 사용된다. 다른 Cas9 동족체가 또한 사용될 수 있지만, Cas9 효소는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래일 수 있다. 야생형 Cas9가 사용될 수 있거나, Cas9의 변형된 버전(예를 들어, Cas9의 진화된 버전, 또는 Cas9 오쏠로그 또는 변이체)이 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, Cas9는 C-말단 및 N-말단 SV40 대형 T 항원 핵 국소화 서열(NLS)을 포함하도록 조작된 스트렙토코쿠스 피오게네스-유래 Cas9 뉴클레아제 단백질을 포함한다. 생성된 Cas9 뉴클레아제(sNLS-spCas9-sNLS)는, 재조합 이. 콜라이 발효에 의해 생성되고 크로마토그래피에 의해 정제된 162 kDa 단백질이다. spCas9 아미노산 서열은 본원에서 서열번호 55로 제공된 UniProt 수탁 번호 Q99ZW2로서 확인될 수 있다.
(b) 가이드 RNA(gRNA)
본원에 기재된 바와 같은 CRISPR-Cas9-매개 유전자 편집은 가이드 RNA 또는 gRNA의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는 "gRNA"는 특정 표적 서열에서 유전자 편집을 위해 TRAC 유전자 또는 β2M 유전자 내의 특정 표적 서열로 Cas9를 유도할 수 있는 게놈-표적화 핵산을 지칭한다. 가이드 RNA는 편집을 위한 표적 유전자 내의 표적 핵산 서열, 및 CRISPR 반복 서열에 혼성화하는 적어도 하나의 스페이서 서열을 포함한다.
TRAC 유전자를 표적화하는 예시적인 gRNA는 서열번호 18 또는 서열번호 22에 제공된다. 하기 서열 표를 참조한다. 또한, 본원에 언급된 주제 및 목적에 대하여 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO 2019/097305A2호를 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 14(GRCh38: 염색체 14: 22,547,506-22,552,154; Ensembl; ENSG00000277734)에 위치한 TRAC 유전자 서열을 이용하여 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, TRAC 게놈 영역 및 Cas9를 표적화하는 gRNA는 TRAC 게놈 영역에서 파손을 형성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 TRAC 유전자 내의 인델을 생성시킨다.
β2M 유전자를 표적화하는 예시적인 gRNA는 서열번호 20 또는 서열번호 24에 제공된다. 하기 서열 표를 참조한다. 또한, 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO 2019/097305A2호를 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 15(GRCh38 좌표: 염색체 15: 44,711,477-44,718,877; Ensembl: ENSG00000166710)에 위치한 β2M 유전자 서열을 이용하여 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, β2M 게놈 영역 및 RNA-가이드 뉴클레아제를 표적화하는 gRNA는 β2M 게놈 영역에서 파손을 형성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 방해하는 β2M 유전자 내의 인델을 생성시킨다.
II형 시스템에서, gRNA는 또한 tracrRNA 서열로 불리는 제2 RNA를 포함한다. II형 gRNA에서, CRISPR 반복 서열 및 tracrRNA 서열은 서로 혼성화되어 이중체를 형성한다. V형 gRNA에서, crRNA는 이중체를 형성한다. 두 시스템 모두에서, 이중체는 부위-지정 폴리펩티드에 결합하고, 그에 따라 가이드 RNA와 부위-지정 폴리펩티드는 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산은 부위-지정 폴리펩티드와의 결합으로 인해 복합체에 대한 표적 특이성을 제공한다. 따라서 게놈-표적화 핵산은 부위-지정 폴리펩티드의 활성을 유도한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 각각의 가이드 RNA는 이의 게놈 표적 서열에 상보적인 스페이서 서열을 포함하도록 설계된다. 문헌[Jinek et al., Science, 337, 816-821 (2012) and Deltcheva et al., Nature, 471, 602-607 (2011)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 단일-분자 가이드 RNA이다.
이중-분자 가이드 RNA는 두 가닥의 RNA 분자를 포함한다. 제1 가닥은, 5'에서 3' 방향으로, 선택적인 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열 및 최소 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 제2 가닥은 최소 tracrRNA 서열(최소 CRISPR 반복 서열에 상보적인), 3' tracrRNA 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함한다.
II형 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA("sgRNA"로 지칭됨)는, 5'에서 3'방향으로, 선택적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 배열, 3' tracrRNA 서열 및 선택적 tracrRNA 연장 서열을 포함한다. 선택적 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 추가 기능(예를 들어, 안정성)을 제공하는 요소를 포함할 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복부와 최소 tracrRNA 서열을 연결하여 헤어핀 구조를 형성한다. 선택적 tracrRNA 연장부는 하나 이상의 헤어핀을 포함한다. V형 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA는, 5'에서 3' 방향으로, 최소 CRISPR 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함한다.
"표적 서열"은 PAM 서열에 인접한 표적 유전자에 있으며, Cas9에 의해 변형될 서열이다. "표적 서열"은 PAM-가닥 및 상보적 비-PAM 가닥을 함유하는 이중-가닥 분자인 "표적 핵산"에서 소위 PAM-가닥에 있다. 당업자는 gRNA 스페이서 서열이 관심 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 위치한 상보적 서열에 혼성화된다는 것을 인식한다. 따라서, gRNA 스페이서 서열은 표적 서열의 RNA 등가물이다.
예를 들어, TRAC 표적 서열이 5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3'(서열번호 26)인 경우, gRNA 스페이서 서열은 5'-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3'(서열번호 19)이다. 또 다른 예에서, β2M 표적 서열이 5'-GCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3'(서열번호 27)인 경우, gRNA 스페이서 서열은 5'-GCUACUCUCUCUUUCUGGCC-3'(서열번호 21)이다. gRNA의 스페이서는 혼성화(즉, 염기 쌍형성)를 통해 서열-특이적 방식으로 관심 표적 핵산과 상호작용한다. 따라서, 스페이서의 뉴클레오티드 서열은 관심 표적 핵산의 표적 서열에 따라 달라진다.
본원의 CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서 서열은 시스템에 사용된 Cas9 효소에 의해 인식 가능한 PAM의 5'에 위치한 표적 핵산의 영역에 혼성화하도록 설계된다. 스페이서는 표적 서열과 완벽하게 일치하거나 불일치를 가질 수 있다. 각각의 Cas9 효소는 표적 DNA에서 인식하는 특정 PAM 서열을 갖는다. 예를 들어, 에스. 피오게네스는 표적 핵산에서, 서열 5'-NRG-3'을 포함하는 PAM을 인식하며, 여기서 R은 A 또는 G를 포함하고, N은 임의의 뉴클레오티드이고, N은 스페이서 서열에 의해 표적화된 표적 핵산 서열의 3' 바로 옆에 있다.
일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 20 개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 20 개 미만의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 20 개 초과의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 적어도 5 개, 10 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 30 개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 최대 5 개, 10 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 30 개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 PAM의 첫 번째 뉴클레오티드의 5' 바로 옆에 20 개의 염기를 갖는다. 예를 들어, 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'을 포함하는 서열에서, 표적 핵산은 N에 대응하는 서열일 수 있으며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이고, 밑줄 표시된 NRG 서열은 에스. 피오게네스 PAM이다. 예는 서열번호 15 내지 서열번호 17로서 제공된다.
본원에 개시된 가이드 RNA는 crRNA에서 스페이서 서열을 통해 임의의 관심 서열을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자에서 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열 사이에 상보성 정도는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자에서 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열은 100% 상보성이다. 다른 구현예에서, 표적 유전자에서 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열은 최대 10 개의 불일치, 예를 들어, 최대 9 개, 최대 8 개, 최대 7 개, 최대 6 개, 최대 5 개, 최대 4 개, 최대 3 개, 최대 2 개, 또는 최대 1 개의 불일치를 함유할 수 있다.
본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 gRNA의 비-제한적 예는 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 각각의 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO 2019/097305A2호, 및 제WO2019/215500호에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 gRNA 서열에 대하여, 명시적으로 변형을 나타내지 않는 것들은 비변형 서열과 임의의 적합한 변형을 갖는 서열 둘 모두를 포괄하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 임의의 gRNA에서 스페이서 서열의 길이는, 또한 본원에 개시된 임의의 표적 유전자를 편집하는 데 사용되는 CRISPR/Cas9 시스템 및 성분에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 상이한 세균 종으로부터의 상이한 Cas9 단백질은 다양한 최적의 스페이서 서열 길이를 갖는다. 따라서, 스페이서 서열은 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 26 개, 27 개, 28 개, 29 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 또는 50 개 초과의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 18 개 내지 24 개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 19 개 내지 21 개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 20 개 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20 개 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있는 sgRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20 개 미만의 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20 개 초과의 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 17 개 내지 30 개의 뉴클레오티드를 갖는 다양한 길이의 스페이서 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 우라실을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 하나 이상의 우라실을 포함할 수 있다. 예를 들어, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 1 개 내지 8 개의 우라실 잔기, 예를 들어, sgRNA 서열의 3' 말단에 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 또는 8 개의 우라실을 포함할 수 있다.
임의의 sgRNA를 포함하여 본원에 개시된 임의의 gRNA는 변형되지 않을 수 있다. 대안적으로, 이는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드 및/또는 변형 백본을 함유할 수 있다. 예를 들어, sgRNA와 같은 변형 gRNA는, 5' 말단, 3' 말단, 또는 이 둘 모두에 위치할 수 있는 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 하나보다 많은 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템과 사용될 수 있다. 각각의 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 시스템이 하나보다 많은 표적 핵산을 절단하도록 상이한 표적화 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 Cas9 RNP 복합체 내에서 활성 또는 안정성과 같은 동일하거나 상이한 성질을 가질 수 있다. 하나보다 많은 가이드 RNA가 사용되는 경우, 각각의 가이드 RNA는 동일하거나 상이한 벡터에서 인코딩될 수 있다. 하나보다 많은 가이드 RNA의 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이하다.
하나보다 많은 적합한 Cas9 및 하나보다 많은 적합한 gRNA가 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 당분야에 공지되거나 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 방법은 당분야에 공지된 Cas9 효소 및/또는 gRNA를 포함한다. 예는 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 각각의 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO 2019/097305A2호, 및 제WO2019/215500호에서 찾아볼 수 있다.
(ii) T 세포로의 CAR 작제물 전달을 위한 AAV 벡터
본원에 개시된 바와 같은 항-CD19 CAR 작제물을 인코딩하는 핵산은 아데노-연관 바이러스(AAV)를 사용하여 세포로 전달될 수 있다. AAV는 숙주 게놈에 부위 특이적으로 통합되어 CAR과 같은 전이유전자를 전달할 수 있는 작은 바이러스이다. 역위 말단 반복부(ITR)는 AAV 게놈 및/또는 관심 전이유전자에 측접하여 존재하고, 복제 기원으로서 작용한다. 또한 AAV 게놈에는, 전사될 때 표적 세포로의 전달을 위해 AAV 게놈을 캡슐화하는 캡시드를 형성하는 rep 및 cap 단백질이 존재한다. 이러한 캡시드의 표면 수용체는 AAV 혈청형을 부여하며, 이는 캡시드가 어느 표적 기관에 주로 결합할지를 결정하여 AAV에 의해 가장 효율적으로 감염될 세포를 결정한다. 현재 12 개의 인간 AAV 혈청형이 알려져 있다. 일부 구현예에서, CAR-코딩 핵산을 전달하는 데 사용되는 AAV는 AAV 혈청형 6(AAV6)이다.
아데노-연관 바이러스는 여러 이유로 유전자 요법에 가장 흔히 사용되는 바이러스 중 하나이다. 첫째, AAV는 인간을 비롯한 포유류에 투여 시 면역 반응을 유발하지 않는다. 둘째, AAV는 특히 적절한 AAV 혈청형 선택을 고려할 때, 표적 세포로 효과적으로 전달된다. 마지막으로, AAV는 게놈이 통합 없이 숙주 세포에서 지속할 수 있으므로 분열 세포와 비분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있는 능력을 갖는다. 이러한 특성으로 인해 AAV는 유전자 요법에 이상적인 후보물질이다.
항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산은 숙주 T 세포에서 관심 게놈 부위로 삽입되도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 게놈 부위는 안전한 정착 유전자좌에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 의해 운반될 수 있는 공여체 주형을 통해)은 유전공학적으로 조작된 T 세포에서 TRAC 유전자를 파괴하고 CAR 폴리펩티드를 발현하기 위해 TRAC 유전자 내의 위치에 삽입될 수 있도록 설계될 수 있다. TRAC의 파괴는 내인성 TCR의 기능 상실로 이어진다. 예를 들어, TRAC 유전자의 파괴는 본원에 기재된 것들과 같은 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 TRAC 게놈 영역을 표적화하는 하나 이상의 gRNA로 생성될 수 있다. TRAC 유전자 및 표적 영역에 특이적인 임의의 gRNA, 예를 들어, 본원에 개시된 것들이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
일부 예에서, TRAC 유전자의 게놈 결실 및 CAR 코딩 세그먼트로의 치환은 상동성 지정 복구 또는 HDR에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 일부일 수 있는 공여체 주형을 사용하여). 일부 구현예에서, TRAC 유전자에서의 파괴는 본원에 개시된 것들과 같은 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 TRAC 게놈 영역을 표적화하는 하나 이상의 gRNA로 CAR 코딩 세그먼트를 TRAC 유전자로 삽입함으로써 생성될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 공여체 주형은 CAR에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 일부 예에서, CAR-코딩 서열은, 예를 들어, CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 TRAC 유전자에서 관심 게놈 위치에 효율적인 HDR이 가능하도록 두 개의 상동성 영역에 의해 측접될 수 있다. 이러한 경우에, 표적 유전자좌에서 DNA의 두 가닥 모두 표적 유전자좌에 특이적인 gRNA에 의해 가이딩된 CRISPR Cas9 효소로 절단될 수 있다. 이후, HDR이 발생하여 이중-가닥 파손(DSB)을 복구하고 CAR을 코딩하는 공여체 DNA를 삽입한다. 이러한 발생이 정확하게 일어나기 위해, 공여체 서열은 TRAC 유전자와 같은 표적 유전자에서 DSB 부위를 둘러싸는 서열에 상보적인 측접 잔기로 설계된다(이하, "상동성 아암"). 이러한 상동성 아암은 DSB 복구를 위한 주형으로서 작용하여, 본질적으로 오류가 없는 메커니즘의 HDR을 가능하게 한다. 상동성 지정 복구(HDR)의 속도는 돌연변이와 절단 부위 사이의 거리의 함수이므로, 중복되거나 가까운 표적 부위를 선택하는 것이 중요하다. 주형은 상동성 영역에 의해 측접된 추가 서열을 포함할 수 있거나, 게놈 서열과 상이한 서열을 함유할 수 있으므로, 서열 편집이 가능하다.
대안적으로, 공여체 주형은 DNA의 표적 위치에 대해 상동성 영역을 갖지 않을 수 있으며, 표적 부위에서의 절단 후 NHEJ-의존성 말단 연결에 의해 통합될 수 있다.
공여체 주형은 단일-가닥 및/또는 이중-가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여체 서열의 말단은 당업자에게 알려진 방법에 의해(예를 들어, 핵외 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 선형 분자의 3' 말단에 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 추가되고/되거나, 한쪽 또는 양쪽 말단에 자기-상보성 올리고뉴클레오티드가 결찰된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al., (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하는 추가의 방법은 말단 아미노기(들)의 추가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드간 연결의 사용을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
공여체 주형은, 예를 들어, 복제 기원, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 또한, 공여체 주형은 네이키드 핵산으로서 도입되거나, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입되거나, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여체 주형은, 일부 구현예에서, 내인성 프로모터 부근(예를 들어, 하류 또는 상류)의 부위에 삽입될 수 있고, 이에 따라 이의 발현이 내인성 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 다른 구현예에서, 공여체 주형은 CAR 유전자의 발현을 제어하기 위해 외인성 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 프로모터는 EF1α 프로모터이다. 다른 프로모터가 사용될 수 있다.
게다가, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 인코딩하는 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수도 있다.
유전공학적으로 조작된 면역 세포(예를 들어, 본원에 개시된 T 세포)를 제조하기 위해, 적합한 공급원으로부터의 T 세포와 같은 면역 세포, 예를 들어, 건강한 공여체 또는 CAR-T 세포 요법이 필요한 환자일 수 있는 인간 공여체로부터의 혈액 세포가 수득될 수 있다. CTX110 세포는 하나 이상의 건강한 인간 공여체로부터의 혈액 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 건강한 공여체 세포로부터의 제조는 의도치 않게 악성 림프종/백혈병 세포를 형질도입할 위험을 최소화하고 잠재적으로 CAR T 세포의 기능을 향상시킬 수 있다. CRISPR 시스템의 성분(예를 들어, Cas9 단백질 및 gRNA), 선택적으로 AAV 공여체 주형은 통상적인 접근법을 통해 숙주 면역 세포로 전달될 수 있다. 일부 예에서, Cas9 및 gRNA는 전기천공에 의해 숙주 면역 세포로 전달될 수 있는 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)를 형성할 수 있다. 선택적으로, AAV 공여체 주형은 RNP 복합체와 동시에 면역 세포로 전달될 수 있다. 대안적으로, RNP 및 AAV 공여체 주형의 전달은 순차적으로 수행될 수 있다. 일부 예에서, T 세포는 유전자 편집 성분의 전달 전에 활성화될 수 있다.
유전자 편집 성분 및 선택적으로 공여체 주형의 전달 후, 세포는 시험관내에서 회수되고 확장될 수 있다. 유전자 편집 효율은 항-CD19 CAR의 녹-인 및 표적 유전자(예를 들어, TRAC, B2M 또는 둘 모두)의 녹-아웃을 확인하기 위한 일상적인 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 예에서, TCRαβ+ T 세포는 제거될 수 있다. CTX110 세포와 같은 본원에 개시된 유전공학적으로 조작된 면역 세포의 제조를 위한 추가 정보는 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 관련 개시가 참조로 포함되는 미국 특허 출원 제62/934,991호에서 찾아볼 수 있다.
III. B 세포 악성종양의 동종이계 CAR-T 세포 요법
일부 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 CTX110 T 세포와 같은 임의의 유전공학적으로 조작된 항-CD19 CAR T 세포의 집단을 이용하여 B 세포 악성종양을 갖는 인간 환자를 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 동종이계 항-CD19 CAR T 세포 요법은 두 단계의 치료를 포함할 수 있다: (i) 적합한 인간 환자에게 하나 이상의 용량의 하나 이상의 림프구제거제를 제공하는 것을 포함하는 컨디셔닝 요법(림프구제거 치료), 및 (ii) 본원에 개시된 바와 같은 CTX110 T 세포와 같은 동종이계 항-CD19 CAR T 세포의 집단을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 요법(동종이계 항-CD19 CAR T 세포 요법).
(i) 환자 집단
인간 환자는 진단, 치료 또는 요법이 요망되는 임의의 인간 대상체일 수 있다. 인간 환자는 임의의 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 환자는 성인(예를 들어, 적어도 18 세인 사람)이다. 일부 예에서, 인간 환자는 50 ㎏ 이상의 체중일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 환자는 아동일 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료하고자 하는 인간 환자는 B 세포 악성종양을 갖거나 가질 것으로 의심되거나 가질 위험이 있는 인간 환자일 수 있다. B 세포 악성종양을 가질 것으로 의심되는 대상체는 B 세포 악성종양의 하나 이상의 증상, 예를 들어, 설명불가 체중 감소, 피로, 야간 발한, 숨가쁨 또는 분비샘 비대를 보일 수 있다. B 세포 악성종양에 대한 위험이 있는 대상체는 B 세포 악성종양에 대한 위험 인자, 예를 들어, 면역계 저하, 연령, 남성 또는 감염(예를 들어, 엡스테인-바르 바이러스 감염) 중 하나 이상을 갖는 대상체일 수 있다. 항-CD19 CAR T 세포(예를 들어, CTX110T 세포) 치료가 필요한 인간 환자는 일상적인 의학적 검사, 예를 들어, 신체 검사, 검사실 검사, 생검(예를 들어, 골수 생검 및/또는 림프절 생검), 자기 공명 영상(MRI) 스캔, 또는 초음파 검사에 의해 확인될 수 있다.
본원에 기재된 방법을 이용하여 치료될 수 있는 B 세포 악성종양의 예는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), MYC 및 BCL2 및/또는 BCL6 재배열이 있는 고등급 B 세포 림프종, 형질전환 여포성 림프종(FL), 3b 등급 FL, 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 리히터 형질전환을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 예에서, B 세포 악성종양은 DLBCL, 예를 들어, 고등급 DLBCL 또는 상세불명(NOS)의 DLBCL이다. 일부 예에서, B 세포 악성종양은 형질전환 FL 또는 3b 등급 FL이다. 일부 예에서, 인간 환자는 플루오로데옥시글루코스 양전자 방출 단층촬영(PET)-양성인 적어도 하나의 측정 가능한 병변을 갖는다.
일부 구현예에서, 치료하고자 하는 인간 환자는 DLBCL을 갖고, 직장주변 종괴, 후복막 종괴, 미만성 림프절(LN), 용해성 병변, 편도 병변, 또는 이들의 조합을 나타낸다. 대안적으로 또는 추가로, 인간 환자는 골수 확산을 가질 수 있다. 다른 예에서, 인간 환자는 골수 확산이 없다.
일부 구현예에서, 치료하고자 하는 인간 환자는 형질전환 FL을 갖는다. 이러한 인간 환자는 미만성 LN을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 인간 환자는 골수 확산을 가질 수 있다. 다른 예에서, 인간 환자는 골수 확산이 없을 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료하고자 하는 인간 환자는 치료 후 재발하였고/재발하였거나 치료에 내성이 되었고/되었거나 치료에 반응하지 않았던 인간 환자일 수 있다. 본원에서 사용되는 "재발된" 또는 "재발"은 완전 반응 기간 후에 재발생한 본원에 개시된 것들과 같은 B 세포 악성종양을 지칭한다. 진행성 질환은 질환이 마지막 평가(예를 들어, 안정 질환 또는 부분 반응) 후 악화될 때의 경우를 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료 중에 진행이 일어난다. 일부 구현예에서, 치료 후 재발이 일어난다. 반응 부족은 일상적인 의료 행위에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 치료하고자 하는 인간 환자는 하나 이상 차수의 선행 항암 요법을 받았던 인간 환자일 수 있다. 일부 예에서, 인간 환자는 두 개 이상 차수의 선행 항암 요법, 예를 들어, 화학요법, 면역요법, 수술, 또는 이들의 조합을 받은 적이 있을 수 있다. 일부 예에서, 선행 항암 요법은 항-CD20 항체 요법, 안트라사이클린-함유 요법, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 인간 환자는 불응성 B 세포 악성종양을 갖는다. 본원에서 사용되는 "불응성"은 치료에 반응하지 않거나 내성이 되는 본원에 개시된 것들과 같은 B 세포 악성종양을 지칭한다. 불응성 B 세포 악성종양을 갖는 인간 환자는 마지막 요법에서 진행성 질환을 갖거나, 적어도 2 회 사이클의 요법 후에 안정 질환을 가지며, 안정 질환의 지속 기간은 최대 6 개월(예를 들어, 최대 5 개월, 최대 4 개월, 또는 최대 3 개월 또는 최대 2 개월 또는 최대 1 개월)이다. 일부 예에서, 인간 환자는 선행 자가 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)을 받은 적이 있을 수 있고, 이에 대한 반응을 보이지 않았거나(실패) 약간의 반응을 달성한 후 진행 또는 재발했을 수 있다. 다른 예에서, 인간 환자는 선행 자가 HSCT에 적격이지 않았을 수 있다.
인간 환자는 환자가 본원에 개시된 바와 같은 컨디셔닝 요법(림프구제거 치료) 및/또는 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포 요법을 받는 데 적격인지 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 림프구제거 치료에 적격인 인간 환자는 다음 특징 중 하나 이상을 나타내지 않는다: (a) 임상 상태의 유의한 악화, (b) 90% 초과의 포화 수준을 유지하기 위한 보충용 산소에 대한 요구, (c) 비조절성 심장 부정맥, (d) 혈관수축제 보조가 필요한 저혈압, (e) 활동성 감염, 및 (f) 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성. 또 다른 예에서, 치료 요법에 적격인 인간 환자는 다음 특징 중 하나 이상을 나타내지 않는다: (a) 활동성의 비조절성 감염; (b) 림프구제거 치료 전의 임상 상태와 비교하여 임상 상태의 악화; 및 (c) 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
인간 환자는 이러한 스크리닝 결과에 기초하여 컨디셔닝 요법 및/또는 치료 요법으로부터 스크리닝되고 배제될 수 있다. 예를 들어, 인간 환자가 다음 배제 기준 중 하나 이상을 충족하는 경우, 인간 환자는 컨디셔닝 요법 및/또는 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포 요법에서 배제될 수 있다: (a) 동부 협력 종양 학회(ECOG) 수행 상태 0 또는 1을 가짐; (b) 적절한 신장, 간, 심장 및/또는 폐 기능; (c) 선행 유전자 요법 또는 변형된 세포 요법 없음; (d) 항-CD19 항체를 포함하는 선행 치료 없음; (e) 선행 동종이계 HSCT 없음; (f) 뇌척수액으로부터 검출 가능한 악성 세포 없음; (g) 뇌 전이 없음; (h) 선행 중추 신경계 장애 없음; (i) 불안정 협심증, 부정맥 및/또는 심근경색 없음; (j) 비조절성 감염 없음; (k) 면역억제 요법이 필요한 면역결핍 장애 또는 자가면역 장애 없음; 및 (l) 인간 면역결핍 바이러스, B 형 간염 바이러스, 또는 C 형 간염 바이러스에 의한 감염 없음.
(ii) 컨디셔닝 요법(림프구제거 요법)
본원에 개시된 치료 방법에 적합한 임의의 인간 환자는 대상체의 내인성 림프구를 감소시키거나 고갈시키기 위해 림프구제거 요법을 제공받을 수 있다.
림프구제거는 내인성 림프구 및/또는 T 세포의 파괴를 지칭하며, 이는 일반적으로 면역이식 및 면역요법 전에 사용된다. 림프구제거는 방사선 조사 및/또는 화학요법에 의해 달성될 수 있다. "림프구제거제"는 대상체에게 투여될 때 내인성 림프구 및/또는 T 세포를 감소시키거나, 고갈시키거나, 제거할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 림프구제거제는 림프구의 수를 상기 제제의 투여 전 림프구의 수에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구제거제는 대상체에서 림프구의 수가 검출 한계 미만이 되도록 림프구의 수를 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 적어도 1 개(예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이상)의 림프구제거제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구제거제는 림프구를 특이적으로 사멸시키는 세포독성제이다. 림프구제거제의 예는, 제한 없이, 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 벤다무스틴, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 다카르바진, 멜팔란, 독소루비신, 빈블라스틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 이리노테칸, 에탑사이드 포스페이트, 미톡산트론, 클라드리빈, 데닐류킨 디프티톡스, 또는 DAB-IL2를 포함한다. 일부 예에서, 림프구제거제는 저선량 조사를 동반할 수 있다. 컨디셔닝 요법의 림프구제거 효과는 일상적인 관행을 통해 모니터링될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 림프구제거제, 예를 들어, 플루다라빈 및 사이클로포스파미드를 포함하는 컨디셔닝 요법을 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 치료하고자 하는 인간 환자는 컨디셔닝 단계에서 적합한 기간(예를 들어, 1 일 내지 5 일) 동안 다회 용량의 하나 이상의 림프구제거제를 제공받을 수 있다. 환자는 림프구제거 기간 동안 매일 1 회 림프구제거제 중 하나 이상을 제공받을 수 있다. 일례에서, 인간 환자는 2 일 내지 4 일(예를 들어, 3 일) 동안 매일 약 20 ㎎/㎡ 내지 50 ㎎/㎡(예를 들어, 30 ㎎/㎡)의 플루다라빈 및 2 일 내지 4 일(예를 들어, 3 일) 동안 매일 500 ㎎/㎡ 내지 750 ㎎/㎡(예를 들어, 500 ㎎/㎡ 또는 750 ㎎/㎡)의 사이클로포스파미드를 제공받는다. 특정 예에서, 인간 환자는 3 일 동안 매일 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 500 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드를 제공받을 수 있다. 다른 특정 예에서, 인간 환자는 3 일 동안 매일 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 750 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드를 제공받을 수 있다.
인간 환자는 이후 본원에 개시된 바와 같은 림프구제거 요법 후 적합한 기간 내에 CTX110 세포와 같은 임의의 항-CD19 CAR T 세포를 투여받을 수 있다. 예를 들어, 인간 환자는 항-CD19 CAR+ T 세포(예를 들어, CTX110 세포)를 투여하기 약 2 일 내지 7 일(예를 들어, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일) 전에 하나 이상의 림프구제거제를 받을 수 있다. 일부 예에서, 인간 환자는 림프구제거 요법 후 약 4 일 내지 5 일 이내에 항-CD19 CAR+ T 세포(예를 들어, CTX110 세포)를 투여받는다.
CTX110 세포와 같은 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포는 미리 제조될 수 있고 치료 부위에 저장될 수 있기 때문에, 본원에 개시된 바와 같은 림프구제거 요법은 인간 환자가 본원에 개시된 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포 요법에 적합한 것으로 확인된 후 짧은 기간 내에(예를 들어, 2 주 이내에) B 세포 악성종양을 갖는 인간 환자에게 적용될 수 있다. 예를 들어, 림프구제거 요법의 첫 용량(예를 들어, 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 500 ㎎/㎡ 또는 750 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드)은 인간 환자가 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포 요법에 적합한 것으로 확인된 후 2 주 이내에(예를 들어, 10 일 이내, 9 일 이내, 8 일 이내, 7 일 이내, 6 일 이내, 5 일 이내, 4 일 이내, 3 일 이내, 2 일 이내, 또는 그 미만) 인간 환자에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 림프구제거 요법은 인간 환자가 치료에 적합한 것으로 확인된 후 24 시간 내지 72 시간 이내에(예를 들어, 24 시간 이내에) 인간 환자에게 수행될 수 있다. 이어서, 환자는 림프구제거 치료 후 2 일 내지 7 일(예를 들어, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7일) 이내에 CAR-T 세포를 투여받을 수 있다. 이는 지연(예를 들어, 치료 세포의 제조로 인한 지연) 없이 질환 진단 및/또는 환자 확인 후에 본원에 개시된 바와 같은 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포, 예컨대, CTX110 세포로 인간 환자를 적시에 치료할 수 있게 한다. 특정 예에서, 환자는 입원 치료 중에 치료를 제공받을 수 있다. 특정 예에서, 환자는 통원 치료 중에 치료를 제공받을 수 있다.
임의의 림프구제거 단계 전에, 인간 환자는 환자가 림프구제거 치료에 적격인지의 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 특징에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 림프구제거 전, 림프구제거 치료에 적격인 인간 환자는 다음 특징 중 하나 이상을 나타내지 않는다: (a) 임상 상태의 유의한 악화, (b) 90% 초과의 포화 수준을 유지하기 위한 보충용 산소에 대한 요구, (c) 비조절성 심장 부정맥, (d) 혈관수축제 보조가 필요한 저혈압, (e) 활동성 감염, 및 (f) 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
림프구제거 후, 인간 환자는 환자가 항-CD19 CAR T 세포, 예컨대, CTX110 세포를 이용한 치료에 적격인지의 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 특징에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 항-CD19 CAR T 세포 치료 전 및 림프구제거 치료 후, 항-CD19 CAR T 세포 치료에 적격인 인간 환자는 다음 특징 중 하나 이상을 나타내지 않는다: (a) 활동성의 비조절성 감염; (b) 림프구제거 치료 전의 임상 상태와 비교하여 임상 상태의 악화; 및 (c) 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
(iii) 항-CD19 CAR T 세포의 투여
항-CD19 CAR T 세포를 투여하는 것은 요망되는 효과(들)가 생성될 수 있도록 요망되는 부위, 예컨대, 예컨대, 종양 부위에 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 적어도 부분적인 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 또한 본원에 개시된 바와 같은 인간 환자로의 본원에 개시된 바와 같은 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단(예를 들어, CTX110 세포)의 배치(예를 들어, 이식)를 포함할 수 있다. 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단은 이식된 세포 또는 세포의 성분의 적어도 일부가 생존 가능한 상태로 유지되는 대상체에서 요망되는 위치로의 전달을 야기하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에게 투여한 후 세포의 생존 기간은 몇 시간, 예를 들어, 24 시간만큼 짧은 것에서부터 며칠, 수주 또는 수개월까지, 수년 또는 심지어 대상체의 일생, 즉, 장기간 생착만큼까지 길 수 있다. 특정 예에서, 환자는 입원 치료 동안 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단(예를 들어, CTX110 세포)을 제공받을 수 있다. 특정 예에서, 환자는 외래 치료에서 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단(예를 들어, CTX110 세포)을 제공받을 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 일부 양태에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 유효량은 전신 투여 경로, 예컨대, 복강내 또는 정맥내 경로를 통해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단은 전신 투여되며, 이는 표적 부위, 조직, 또는 기관에 직접 투여되는 것이 아니라, 세포 집단의 투여를 지칭하는 전신으로 투여되며, 따라서 대신에 대상체의 순환계에 들어가 신진대사 등의 유사한 과정을 거치도록 투여되는 것을 지칭한다. 적합한 투여 방식은 주사, 주입, 점적주입, 또는 섭취를 포함한다. 주사는, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 심실내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 내척수내, 및 흉골내 주사와 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 경로는 정맥내이다.
유효량은 의학적 질병(예를 들어, B 세포 악성종양)의 적어도 하나 이상의 징후 또는 증상을 예방하거나 완화하는 데 필요한 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 양을 지칭하고, 요망되는 효과를 제공하기에 충분한, 예를 들어, 의학적 질병을 갖는 대상체를 치료하기에 충분한 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 양과 관련된다. 유효량은 또한, 질환의 증상의 발생을 예방하거나 지연시키거나, 질환의 증상의 경과를 변경하거나(비제한적으로 예를 들어, 질환의 증상의 진행을 늦춤), 질환의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 경우에, 적절한 유효량은 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다.
유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 유효량은 CD19에 결합하는 CAR을 발현하는 세포(CAR+ 세포)를 약 1×107 개의 CAR+ 세포 내지 약 1×109 개의 CAR+ 세포, 예를 들어, 약 1×107 개의 세포 내지 약 1×109 개의 세포로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 유효량은 적어도 1×107 개의 CAR+ CTX110 세포, 적어도 3×107 개의 CAR+ CTX110 세포, 적어도 1×108 개의 CAR+ CTX110 세포, 적어도 3×108 개의 CAR+ CTX110 세포, 또는 적어도 1×109 개의 CAR+ CTX110 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 유효량은 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 용량, 예를 들어, 약 1×107 개의 CTX110 세포 내지 약 1×109 개의 CTX110 세포를 포함하는 용량을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항-CD19 CAR T 세포 요법의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 전부, 일례로서 CD19의 수준이 유리한 방식으로 변경(예를 들어, 적어도 10% 감소)되거나, B 세포 악성종양의 다른 임상적으로 허용되는 증상 또는 표시가 개선되거나 호전되는 경우, 항-CD19 CAR T 세포 요법(예를 들어, CTX110 세포 포함)은 "효과적"인 것으로 간주된다. 효능은 또한, 입원에 의해 평가되는 바와 같이 대상체가 악화되거나 의료 개입이 필요하지 않은 것(예를 들어, B 세포 악성종양의 진행이 중단되거나 적어도 느려짐)에 의해 측정될 수 있다. 이들 적응증을 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 인간 환자에서 B 세포 악성종양의 임의의 치료를 포함하며, (1) 질환 억제, 예를 들어 증상의 진행을 정지시키거나 늦춤; 또는 (2) 질환 완화, 예를 들어 증상의 퇴행을 유발함; 및 (3) 증상의 발생 가능성을 예방하거나 낮춤을 포함한다.
항-CD110 CAR T 세포의 각 투여 후, 인간 환자는 급성 독성, 예컨대, 종양 용해 증후군(TLS), 사이토카인 방출 증후군(CRS), 면역 이펙터 세포-관련 세포독성 증후군(ICANS), B 세포 무형성증, 혈구탐식성 림프조직구증(HLH), 혈구감소증, 이식편 대 숙주병(GvHD), 고혈압, 신부전증, 또는 이들의 조합에 대해 모니터링될 수 있다.
인간 환자가 하나 이상의 급성 독성 증상을 나타낼 때, 인간 환자는 독성 관리를 받을 수 있다. 급성 독성의 하나 이상의 증상을 나타내는 환자에 대한 치료는 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, CRS의 증상(예를 들어, 심장, 호흡기 및/또는 신경학적 이상)을 나타내는 인간 환자는 항-사이토카인 요법을 투여받을 수 있다. 또한, CRS의 증상을 나타내지 않는 인간 환자는 항-CTX110 CAR T 세포의 증식을 촉진하기 위해 항-사이토카인 요법을 투여받을 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, 인간 환자가 하나 이상의 급성 독성 증상을 나타낼 때, 인간 환자의 치료는 종료될 수 있다. 환자가 유해 사례(AE)의 하나 이상의 징후를 나타내는 경우, 예를 들어, 환자가 비정상적 검사 소견을 갖고/갖거나 환자가 질환 진행의 징후를 보이는 경우 환자 치료가 또한 종료될 수 있다.
본원에 기재된 동종이계 항-CD19 CAR T 세포 요법(예를 들어, CTX110 세포를 포함하는)은 또한 조합 요법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항-CD19 CAR T 세포 치료 방법은 B 세포 악성종양을 치료하기 위해, 또는 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 효능을 향상시키기 위해 및/또는 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단의 부작용을 줄이기 위해 다른 치료제와 병용될 수 있다.
IV. B 세포 악성종양의 동종이계 CAR-T 세포 요법을 위한 키트
본 개시는 또한 B 세포 악성종양을 치료하기 위한 방법에서 본원에 기재된 바와 같은 항-CD19 CAR T 세포, 예컨대, CTX110 세포의 집단의 용도를 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 하나 이상의 림프구제거제를 포함하는 제1 약학적 조성물, 및 임의의 핵산 또는 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단(예를 들어, 본원에 기재된 것들)을 포함하는 제2 약학적 조성물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 유전공학적으로 조작된 CAR-T 세포, 예컨대, CTX110 세포를 포함하는 키트는 치료 부위에 저장되고 입력되어 진단 후 인간 환자의 신속한 치료를 가능하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 포함되는 설명서는 인간 환자에서 의도된 활성을 달성하기 위해 대상체에게 제1 약학적 조성물 및/또는 제2 약학적 조성물을 투여하는 설명을 포함할 수 있다. 키트는 인간 환자가 치료를 필요로 하는지의 여부를 확인하는 데 기초하여 치료에 적합한 인간 환자를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 설명서는 치료를 필요로 하는 인간 환자에게 제1 약학적 조성물 및 제2 약학적 조성물을 투여하는 설명을 포함한다.
본원에 기재된 항-CD19 CAR T 세포, 예컨대, CTX110 T 세포의 집단의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투약 일정, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 서브-유닛 용량일 수 있다. 본 개시의 키트에 제공된 설명서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면 설명서이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단이 대상체에서 T 세포 또는 B 세포 악성종양을 치료, 발병 지연, 및/또는 완화시키는 데 사용된다는 것을 지시한다.
본원에 제공된 키트는 적합한 패키징에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 보틀, 병, 및 가요성 패키징 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한, 흡입기, 비강 투여 장치, 또는 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 약학적 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본원에 개시된 바와 같은 항-CD19 CAR-T 세포, 예컨대, CTX110T 세포의 집단이다.
키트는 선택적으로 완충제 및 설명적 정보와 같은 추가 구성요소를 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반적인 기술
본 개시의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 당분야의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986; Immobilized Cells and Enzymes ㎕RL Press, (1986; and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)]와 같이 문헌에 충분히 설명되어 있다.
추가 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 다음의 특정 구현예는 어떤 식으로든 나머지 개시의 제한이 아니라 단지 예시적인 것으로 해석되어야 한다. 본원에 언급된 목적 또는 주제에 대하여 본원에 인용된 모든 간행물은 참조로 포함된다.
실시예 1 : CD19 표적화 동종이계 CAR-T 세포의 제조.
CD19에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 동종이계 T 세포를 본원에 참조로 포함되는 미국 공개 제US 2018-0325955호에 기재된 바와 같이 건강한 공여체 말초 혈액 단핵 세포로부터 제조하였다. 간략히, 일차 인간 T 세포를 먼저 TRAC(AGAGCAACAGTGCTGTGGCC(서열번호 26)) 및 B2M(GCTACTCTCTCTTTCTGGCC(서열번호 27))를 표적화하는 Cas9 또는 Cas9:sgRNA 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로 전기천공하였다. TRAC 유전자좌에서 DNA 이중 가닥 파손을 키메라 항원 수용체(CAR) 카세트에 측접하는 TRAC 유전자좌에 우측 및 좌측 상동성 아암을 함유하는 AAV6-전달 DNA 주형(서열번호 56)으로 상동성 지정 복구에 의해 복구하였다. CAR은 CD19에 특이적인 뮤린 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv), CD8 힌지 영역 및 막관통 도메인 및 CD3z를 포함하는 신호전달 도메인 및 CD28 신호전달 도메인을 포함하였다. CAR의 아미노산 서열, 및 이를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 40 및 서열번호 39에 기재되어 있다. 본 실시예에 사용된 gRNA는 다음 스페이서 서열을 포함한다: TRAC gRNA 스페이서(AGAGCAACAGUGCUGUGGCC(서열번호 19)); 및 B2M gRNA 스페이서(GCUACUCUCUCUUUCUGGCC(서열번호 21)). TRAC-/β2M-/항-CD19 CAR+ T 세포를 포함하는 세포의 집단은 본원에서 "TC1 세포" 또는 "CTX110 세포"로 지칭된다.
CRISPR/Cas9 편집 기술에 의해, 이식편 대 숙주병(GVHD)을 유의하게 손상시키는 것을 목표로 하는, 건강한 공여체로부터의 인간 일차 T-세포에서 TCR 표면 발현이 약 98% 감소된 TCRα 유전자(TRAC)의 불변 영역에서 높은 빈도의 녹아웃이 달성되었다. 환자에서 지속성을 증가시켜 잠재적으로 효능을 전반적으로 증가시키는 것을 목표로 하는, β-2-마이크로글로불린(B2M) 유전자의 높은 빈도의 녹아웃이 또한 얻어질 수 있다. TRAC/B2M 이중 녹아웃 빈도는 임의의 후속 항체-기반 정제 또는 농축 없이 T 세포의 약 80%에서 수득되었다. B2M 유전자의 녹아웃과 함께 AAV6-전달 공여체 주형을 사용하여 상동성-지정 복구에 의해 생성된, 파괴된 TRAC 유전자좌 내로부터 CD19-특이적 CAR을 발현하는 인간 T 세포가 고효율로 일관되게 생산되었다. CAR의 이러한 부위-특이적 통합은 CD3+CAR+ 세포의 잠재적인 결과에 대해 보호하여, GVHD의 위험을 더 감소시키는 동시에 또한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전달 메커니즘과 관련된 삽입 돌연변이유발의 위험을 감소시킨다. 이러한 조작된 동종이계 CAR-T 세포는 CD19-의존성 T-세포 사이토카인 분비 및 강력한 CD19-특이 적 암 세포 용해를 나타낸다.
동종이계 항-CD19 CAR-T 제제(도 1)의 생산은 효율적인 편집을 나타냈다(예를 들어, 50% 초과의 TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+T 세포 효율)(도 2).
실시예 2 : NOG 마우스의 피하 Raji 인간 버킷 림프종 종양 이종이식 모델에서 CAR-T 세포의 효능을 결정하기 위한 용량 증대 연구.
NOG 마우스에서 피하 Raji 인간 버킷 림프종 종양 이종이식 모델에 대한 CD19 표적화 CAR-T 세포의 효능을 Translational Drug Development, LLC(스코츠달리, AZ)에 의해 사용된 방법을 이용하여 평가하였다. 간략히, 12 마리의 5 주령 내지 8 주령 암컷 CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 5 일 내지 7 일 전에 무-병원체 조건 하에 유지되는 통풍 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 1 일차에 마우스는 5×106 개 Raji 세포/마우스의 피하 접종을 제공받았다. 마우스를 추가로 표 1에 나타낸 바와 같은 3 개의 처리군으로 나누었다. 8 일차에(Raji 세포의 접종 7 일 후), 처리군 2 및 처리군 3은 표 1에 따른 단일의 200 ㎕ 정맥내 용량의 TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+ 세포(TC1)를 제공받았다.
[표 1]
Figure pct00001
종양 부피 및 체중을 측정하고, 종양 부피가 500 ㎣ 이상일 때 개별 마우스를 안락사시켰다.
18 일차까지, 데이터는 비처리 마우스에 비해 TC1 세포에 반응하여 종양 부피의 통계적으로 유의한 감소를 보여준다(도 3). 종양 부피에 대한 효과는 용량-의존적이었으며(표 2); 더 높은 용량의 TC1 세포를 제공받은 마우스는 더 낮은 용량의 TC1 세포를 제공받거나, 처리를 제공받지 않은 마우스와 비교할 때 유의하게 감소된 종양 부피를 보였다. 또한, 처리군에서 생존의 증가가 관찰되었다(표 2).
[표 2]
Figure pct00002
실시예 3 : NOG 마우스의 정맥내 산재성 모델에서 CD19 표적화 CAR-T 세포의 효능 평가.
TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+ 세포(TC1)의 효능을 추가로 평가하기 위해, 산재성 마우스 모델을 이용하였다.
정맥내 산재성 Raji 인간 버킷 림프종 종양 이종이식편 모델
NOG 마우스에서 Raji 인간 버킷 림프종 종양 세포주를 사용한 정맥내 산재성 모델(산재성 모델)을 이용하여 TC1의 효능을 추가로 입증하였다. Translations Drug Development, LLC(스코츠달리, AZ)에 의해 사용되고 본원에 기재된 방법을 이용하여 산재성 모델에서 TC1의 효능을 평가하였다. 간략히, 24 마리의 5 주령 내지 8 주령 암컷 CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 5 일 내지 7 일 전에 무-병원체 조건 하에 유지되는 통풍 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 연구 시작 시, 마우스를 표 9에 나타낸 바와 같은 5 개의 처리군으로 나누었다. 1 일차에 그룹 2 내지 그룹 5는 0.5×106 개 Raji 세포/마우스의 정맥내 주사를 제공받았다. 산재성 질환을 모델링하기 위해 마우스에게 정맥내로 접종하였다. 8 일차에(Raji 세포의 주사 7 일 후), 처리군 3 내지 처리군 5는 단일의 200 ㎕ 정맥내 용량의 TC1 세포를 제공받았다(표 3).
[표 3]
Figure pct00003
연구의 과정 동안, 마우스를 매일 모니터링하고, 체중을 주 2 회 측정하였다. 유의한 종점은 주변-이환까지의 시간이었으며, T-생착의 효과도 또한 평가하였다. 동물 사망 백분율 및 사망까지의 시간을 연구에서 모든 그룹에 대하여 기록하였다. 마우스를 빈사 상태에 도달하기 전에 안락사시켰다. 마우스는 하기의 기준 중 하나 이상이 충족되었다면, 빈사로 규정될 수 있으며, 희생될 수 있다:
1 주가 넘는 기간 동안 20% 이상의 체중 감소 지속;
종양으로 정상적인 생리학적 기능, 예컨대, 섭식, 음수, 운동성 및 배뇨 및 또는 배변 능력 저하;
과도한 체중 감소(20% 초과)로 이어지는 장기간 과도한 설사; 또는
지속적인 천명 및 호흡 장애.
또한, 탈진, 척추 후만, 마비/부전마비, 복부 팽창, 궤양, 농양, 발작 및/또는 출혈과 같은 임상적 관찰에 의해 규정되는 바와 같은 장기간 또는 과도한 통증 또는 장애가 존재했다면, 동물을 빈사 상태로 간주하였다.
피하 이종이식편 모델(실시예 2)과 유사하게, 산재성 모델은 도 4에 나타낸 바와 같이 TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+ 세포(TC1)로 처리된 마우스에서 통계적으로 유의한 생존 이점을 드러냈다, p<0.0001. 산재성 모델에서 생존에 대한 TC1 처리의 효과도 또한 용량 의존적이었다(표 4).
[표 4]
Figure pct00004
제2 실험을 상기 기술된 정맥내 산재성 모델을 사용하여 시행하였다.
1 일차에 그룹 2 내지 그룹 4의 마우스는 0.5×106 개 Raji 세포/마우스의 정맥내 주사를 제공받았다. 산재성 질환을 모델링하기 위해 마우스에게 정맥내로 접종하였다. 4 일차에(Raji 세포의 주사 3 일 후), 처리군 2 내지 처리군 4는 표 5에 따른 단일의 200 ㎕ 정맥내 용량의 TC1 세포를 제공받았다.
[표 5]
Figure pct00005
다시, 산재성 모델은 도 5에 나타낸 바와 같이 TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+ 세포(TC1)로 처리된 마우스에서 통계적으로 유의한 생존 이점을 드러냈다, p=0.0016. 산재성 모델에서 생존에 대한 TC1 처리의 효과도 또한 용량 의존적이었다(표 6).
[표 6]
Figure pct00006
TC1 처리에 대한 비장 반응의 평가
Raji 주사 2 주 내지 3 주 후에 마우스로부터 비장을 수집하고, 조직을 비장에서의 TC1 세포의 지속성 및 Raji 세포의 근절에 대하여 유세포 분석에 의해 평가하였다.
비장을 C 튜브 내의 3 ㎖의 1X DPBS CMF로 옮기고, MACS 옥토(Octo) 분리기(Dissociator)를 사용하여 분리하였다. 샘플을 100 마이크론 스크린을 통해 15 ㎖ 코니컬 튜브 내로 옮기고, 원심분리하고(1700 rpm, 5 분, 브레이크와 함께 ART), 구아바(Guava) PCA를 사용한 계수를 위하여 1 ㎖의 1X DPBS CMF 중에 재현탁시켰다. 골수를 원심분리하고, 구아바 PCA를 사용한 계수를 위하여 1 ㎖의 1X DPBS CMF 중에 재현탁시켰다. 세포를 유세포 분석 염색을 위하여 1X DPBS CMF 중에 10 × 106 개 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다.
시편(50 ㎕)을 1 ㎖의 1X 팜 라이즈(Pharm Lyse)에 첨가하고, 실온(RT)에서 10 분 내지 12 분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 원심분리한 다음, 1X DPBS CMF로 1 회 세척하였다. 샘플을 50 ㎕의 1X DPBS 중에 재현탁시키고, RT에서 10 분 내지 15 분 동안 인간 및 마우스 트루스테인(TruStain)과 인큐베이션시켰다. 샘플을 1 ㎖의 1X DPBS CMF로 1 회 세척하고, 염색을 위하여 50 ㎕의 1X DPBS CMF 중에 재현탁시켰다. 표면 항체를 첨가하고, 세포를 RT에서 암소에 15 분 내지 20 분 동안 인큐베이션시킨 다음, 1 ㎖의 1X DPBS CMF로 세척하였다. 그 다음, 샘플을 유세포 분석기에서의 획득을 위하여 125 ㎕의 1X DPBS CMF 중에 재현탁시켰다. 세포를 하기의 표면 항체 패널로 염색하였다:
[표 7]
Figure pct00007
세포 집단을 정면 대 측면 산란에 기초하여 전자 게이팅(Pl = 총 백혈구)에 의해 결정하였다. Thermo Fisher로부터의 울트라 콤프 비즈(Ultra Comp Beads)를 사용하여 초기 기기 설정 시에 하나의 채널로부터 또 다른 채널로의 넘침을 해결하기 위한 보상을 수행하였다. 각 튜브에서 10,000 개의 CD45+ 사건을 수집하도록 유세포 분석기를 설정하였다. 유세포 분석 데이터 획득을 FACSCantoll™ 유세포 분석기를 사용하여 수행하였다. 데이터를 BO FACSDiva™ 소프트웨어(버전 6.1.3 또는 8.0.1)를 사용하여 획득하였다. 유세포 분석 데이터 분석은 각 세포 유형에 대한 상대 백분율을 측정하기 위해 생성된 그래프 표현인 플로우 사이토그램(Flow Cytograms)의 형태로 존재했다.
본 실시예는 TC1 세포 처리 후에, 치료적으로 유익한 TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+ 세포가 비장에서 지속되며, Raji 세포를 조직으로부터 선택적으로 근절시키는 것을 보여준다(도 6a). 또한, TC1 세포를 이용한 처리는 Raji 유도된 세포 질량의 증가를 나타내지 않는다(도 6a). 추가로, 도 7은 TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+ 세포로 처리된 마우스의 비장 내의 남아 있는 인간 세포가 CD8+라는 것을 보여준다. 이들 CD8+ T 세포는 또한 CD3 음성인데, 이는 이러한 모델에서 지속적인 T 세포가 TCR/CD3 음성으로 존재하고, 이에 따라 편집된다는 것을 증명한다.
정맥내 산재성 Nalm-6 인간 급성 림프아구성 백혈병 종양 이종이식편 모델
NOG 마우스에서 Nalm-6 인간 급성 림프아구성 백혈병 종양 세포주를 사용한 정맥내 산재성 모델(산재성 모델)을 사용하여 TC1의 효능을 추가로 입증하였다. Translations Drug Development, LLC(스코츠달리, AZ)에 의해 사용되고 본원에 기재된 방법을 이용하여 산재성 모델에서 TC1의 효능을 평가하였다. 간략히, 24 마리의 5 주령 내지 8 주령 암컷 CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 5 일 내지 7 일 전에 무-병원체 조건 하에 유지되는 통풍 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 연구 시작 시, 마우스를 표 14에 나타낸 바와 같은 5 개의 처리군으로 나누었다. 1 일차에 그룹 2 내지 그룹 4의 마우스는 0.5×106 개 Nalm6 세포/마우스의 정맥내 주사를 제공받았다. 산재성 질환을 모델링하기 위해 마우스에게 정맥내로 접종하였다. 4 일차에(Nalm6 세포의 주사 3 일 후), 처리군 2 내지 처리군 4는 표 8에 따른 단일의 200 ㎕ 정맥내 용량의 TC1 세포를 제공받았다.
[표 8]
Figure pct00008
연구의 과정 동안, 마우스를 매일 모니터링하고, 체중을 상기 기술된 바와 같이 주 2 회 측정하였다
Raji 정맥내 산재성 모델(상기)과 유사하게, Nalm6 모델은 또한 도 8에 나타낸 바와 같이 TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+ 세포(TC1)로 처리된 마우스에서 통계적으로 유의한 생존 이점을 나타냈다, p=0.0004. Nalm6 산재성 모델에서 생존에 대한 TC1 처리의 효과도 또한 용량 의존적이었다(표 9).
[표 9]
Figure pct00009
실시예 4 : NOG 마우스의 정맥내 산재성 모델에서 CD19 표적화 CAR-T 세포 효능의 추가 평가.
본 연구의 목적은 NOG 마우스에서 Nalm6-Fluc-GFP 급성 림프아구성 백혈병 종양 세포주에 대한 다중 용량 수준에서 항-CD19 CAR+ T 세포의 항-종양 활성을 평가하는 것이었다. 산재성 질환을 모델링하기 위해 마우스에게 정맥내로 접종하였다. 유의한 종점은 주변-이환까지의 시간이었다. 산재성 질환의 진행을 모니터링하기 위해 생물발광 영상화를 수행하였다.
간략히, 6 주령 암컷 CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 5 일 내지 7 일 전에 무-병원체 조건 하에 유지되는 통풍 마이크로아이솔레이터 케이지에 수용하였다. 1 일차에 마우스는 5×104 개 Nalm6-Fluc-GFP(Nalm6-Fluc-Neo/eGFP-­Puro; Imanis Life Sciences(로체스터, MN)) 세포/마우스의 정맥내 접종을 제공받았다. Nalm6-Fluc-GFP 세포를 접종한 후 삼(3) 일차에, 마우스를 처리군으로 나누고, 표 10에 지시된 바와 같이, TRAC-/B2M-/항-CD19 CAR+ T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 투여하였다. 관심 영역(ROI) 값을 캡처하고, 보고하였다. 체중을 일일 2 회 측정하고, 생물발광을 4 일차(Nalm6-Fluc-GFP 세포 접종 3 일후)에 시작하여 67 일차까지 주 2 회, 74 일차에 시작하여 연구 종료까지 주 1 회 측정하였다. 생물발광을 측정하기 위해 마우스에게 200 ㎕의 D-루시페린 150 m㎎/㎏을 복강내 주사하였다. 연구 시작 시에 동역학 영상을 촬영하고, 필요에 따라 전반에 걸쳐 최적의 후속 D-루시페린 용량 및 노출 시간을 결정하여 마우스를 영상화하였다. 소프트웨어 버전 1.2.0(Spectral Instruments Imaging Inc.; 투손, AZ)을 구비한 AMI 1000 영상화 기기를 사용하여 발광 신호(개방 방출)를 캡처함으로써 마우스를 영상화하였다.
[표 10]
Figure pct00010
개별 마우스를 주변-이환(높은 종양 부담(예를 들어, 운동성 부족, 척추 후만, 저활동성)을 시사하는 임상 징후 또는 1 주가 넘는 기간 동안 지속되는 20% 이상의 체중 감소) 시에 안락사시켰다. 마우스를 빈사 상태에 도달하기 전에 안락사시켰다. 연구는 최종 마우스가 장기 생존자로서 안락사되었을 때 99 일차에 종료되었다.
도 9는 비처리 마우스에 비해 상이한 용량의 TC1 세포를 제공받은 마우스의 연장된 생존을 나타낸 것이다. 도 10은 최고 용량의 TC1 세포(12×106 개 세포/마우스)를 제공받고 도 9에 나타낸 바와 같이 최장 생존을 야기한 마우스에서 저수준에서 검출 불가 수준까지의 생물발광을 나타낸 것이다. 74 일차에 4 마리의 마우스 모두에서 생물발광이 검출되었는데, 이는 처리군에서 종양 세포 확장을 지시하는 것이다.
전반적으로, 이러한 결과는 TC1 세포의 단일 주사가 치사량의 Nalm6 B-ALL 세포를 투여받은 마우스의 생존을 연장시킬 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 연장된 생존은 TC1 세포의 저용량, 중간 용량 및 고용량 사이에 관찰되는 단계적 생존 반응에 따라 용량 의존적이다.
실시예 5 : 동종이계 CD19 표적화 CAR T 세포를 투여받은 마우스에서 이식편 대 숙주병의 분석.
이식편 대 숙주병(GvHD)을 유발하는 비편집 인간 T 세포와 TC1 세포 둘 모두의 가능성을 평가하기 위해 마우스에서 연구를 실시하였다. 200 cGy로 전신 조사한 후, NOG 암컷 마우스에게 비편집 인간 T 세포 또는 TC1 세포를 단일 정맥내 서방형 볼루스 주사로 투여하였다. 방사선 단독(그룹 1) 또는 방사선과 함께 단일 용량 투여의 PBMC(그룹 2), 전기천공 T 세포(그룹 3) 또는 TC1 세포(그룹 4) 후 최대 119 일 동안 동물을 추적하였다. 세포를 1 일차에 방사선 후 대략 6 시간째에 투여하였다. 표 11은 그룹 및 연구 설계를 요약한 것이다.
[표 11]
Figure pct00011
연구의 종점은 생존, GvHD 증상의 출현 속도, 및 체중 측정이었다.
처리 후 처음 30 일 동안 그룹 1(12 마리 중 3 마리), 그룹 2(6 마리 중 6 마리) 및 그룹 3(6 마리 중 2 마리)에서 사망이 관찰되었다(도 11). 그룹 4(TC1 세포)의 모든 동물은 예정된 부검까지 생존하였다(도 11). 그룹 1, 그룹 2 및 그룹 3의 빈사 상태 동물은 GvHD의 발병과 일치하는 체중 감소 및/또는 임상 관찰을 경험했다(경증 내지 중증의 오한, 경증 내지 중등도의 쇠약, 경증 내지 중증의 척추 후만, 심한 체중 감소, 경증 내지 중증 탈모, 중증 저활동성, 중등도 호흡 곤란, 및 증증 빈호흡). 그룹 1 및 그룹 4의 동물, 및 그룹 3의 빈사 상태가 아닌 동물은 방사선 후 약간의 체중 감소를 경험했는데, 이는 연구 과정 동안 개선되었다(도 12). 주목할 만한 임상 관찰은 기록되지 않았다.
이 연구는 비편집 인간 PBMC가 모든 동물의 방사선 조사된 NOG 마우스(그룹 2)에서 세포 투여 후 2 주 내지 3 주 후의 개시로 치명적인 GvHD를 유도한다는 것을 입증해 주었다. 대조적으로, TC1 세포(그룹 4)를 제공받은 마우스는 이들 동물에 투여된 세포의 수가 더 많았음에도 불구하고(마우스 당 6×106 개 PBMC와 비교하여 마우스 당 3×107 개 TC1 세포), 연구(119 일) 동안 GvHD가 발병하지 않았다. 방사선 조사 절차는 모든 그룹에서 일시적인 체중 감소를 유도하고, 비편집 PBMC를 제공받지 않은 모든 그룹에서 회복되었다.
GvHD를 유발하는 비편집 인간 T 세포와 TC1 세포 둘 모두의 가능성을 평가하기 위해 이차 연구를 추가로 실시하였다. 구체적으로, NOD/SCID/IL2Rγnull(NSG) 암컷 마우스에게 전신 조사(200 cGy, 160 cGy/min의 총 조사 선량; 표적화된 LDR0/140R) 후 단일 정맥내 서방형 볼루스 주사의 비편집 인간 T 세포 또는 TC1 세포를 투여하였다. 본 연구의 종점은 생존, GvHD 증상의 출현 속도, 및 체중 측정이었다. 조직병리학을 또한 수집된 모든 조직에 대해 수행하였다. 적절한 경우, 유세포 분석 및 면역조직화학(IHC)에 의해 마우스 혈액 및 조직에서 노출을 평가하였다.
세포를 표 12에 기재된 바와 같이 정맥내 서방형 볼루스를 통해 단일 용량으로 투여하였다.
[표 12]
Figure pct00012
검증된 전임상 소프트웨어 시스템(Provantis)을 사용하여 동물을 체중별로 처리군으로 무작위 배정하였다. 본 연구의 큰 규모로 인해, 투여 및 부검 활동은 9 일에 걸쳐 시차를 두었다. 편차를 최소화하기 위해, 대조군 및 TC1 그룹(그룹 4 및 그룹 5)의 동물들에게 동일한 날에 투여하고 부검하였다. 모든 그룹에 대해 연구 85 일차에 부검을 수행하였다.
비편집 인간 T 세포(그룹 3)를 제공받은 모든 동물에 대하여 14 일차 개시와 함께 사망이 관찰되었다(도 13). 비편집 인간 T 세포(그룹 3)를 제공받은 모든 마우스는 29 일차까지 사망으로 확인되었거나 예정되지 않은 안락사가 진행되었다. 이들 동물의 임상 징후는 GvHD의 발병과 일치하고, 약해진 털, 경증 내지 중증의 활동성 감소, 척추 후만, 경증 내지 중증의 마름, 및 호흡률 증가를 포함하였다. 적혈구, 헤모글로빈, 혈소판, 백혈구 및 망상적혈구 수의 감소를 포함하여, 비편집 인간 T 세포(그룹 3)를 제공받은 마우스의 안락사에서 혈액학 매개변수의 현저한 변화가 관찰되었다. 그룹 3 동물의 간, 폐, 신장, 비장 및 흉선에서 최소 내지 중등도의 염증이 관찰되었다. 괴사는 흔히 이러한 조직의 염증을 동반하였다. 이러한 결과는 GvHD의 발병과 일치했다. 또한, 대퇴골 및 흉골 골수에서 경증 내지 중증의 저세포성도 대부분의 그룹 3 동물에서 나타났는데, 이는 전신 조사의 효과에 기인한 것으로 보인다. 이는 다른 모든 그룹의 12 주와 비교하여 조기 부검일(방사선 후 2 주 내지 4 주)로 인해 이러한 그룹에서만 관찰되었을 가능성이 있다. GvHD의 존재와 일치하여, 그룹 3 동물의 면역조직화학적 분석은 검사된 모든 조직(신장, 간, 비장, 폐, 피부 및 소화관)에서 인간 CD45P+P 세포의 존재를 나타냈다. 다른 그룹의 모든 동물들은 예정된 부검까지 생존했다.
또한, 그룹 1, 그룹 2, 그룹 4 또는 그룹 5에서는 유의한 체중 감소가 관찰되지 않았다(도 14). GvHD를 나타낼 가능성이 있는 것으로 여겨지는 적어도 두 가지 증상의 관찰을 특징으로 하는 GvHD와 일치하는 주목할 만한 임상 관찰은 이들 그룹에서 기록되지 않았다. 그룹 4 및 그룹 5의 몇몇 동물들은 연구 내내 약해진 털, 경증 내지 중등도의 활동성 감소 및/또는 약간의 마름과 같은 증상을 나타냈다. 이러한 증상들은 종종 GvHD와 관련이 있지만, 이들은 드물게 관찰되고, 일시적이고, 짧은 기간이고, 일부 방사선 조사된 대조 동물(그룹 2)에서도 보였기 때문에 TC1-관련인 것으로 보이지 않았다.
전반적으로, 이러한 두 가지 연구 결과는 TC1 세포가 이식편 대 숙주병을 유도하지 않는다는 것을 확인시켜 주었다.
실시예 6 : 동종이계 CD19 표적화 CAR T 세포의 발달 로트의 제조 및 특성규명
표준 백혈구분반술 절차를 통해 수득된 건강한 공여체 말초 혈액 단핵 세포로부터 임상 연구 용도의 TC1 세포를 제조하였다. 단핵 세포를 T 세포에 대해 농축시키고, 항-CD3/CD28 항체-코팅 비드로 활성화시킨 다음, CRISPR-Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체로 전기천공하고, CAR 유전자-함유 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터로 형질도입하였다. 변형된 T 세포를 세포 배양에서 확장시키고, 정제하고, 현탁액으로 제형화하고, 동결보존하였다.
세포를 변형시키기 전에, 6 개의 상이한 건강한 공여체로부터 T 세포를 다양한 세포 표면 마커의 발현에 대해 평가하였다. CD8+ 서브세트 내의 CD27+CD45RO- T 세포는 이전에 항-CD19 CAR T 세포 요법으로 치료될 때 만성 림프구성 백혈병(CLL)에서 완전 반응과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(Fraietta et al., Nat Med, Vol. 24(5): 563-571, 2018). 따라서, 6 개의 상이한 공여체의 CD8+ 서브세트 내의 CD27+ CD45O-T 세포의 비율을 유세포 분석에 의해 평가하였다. 간략히, 1×106 개 세포를 음성 대조군으로서 Fab-비오틴 또는 IgG-비오틴 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충액으로 세척하고, 마우스 항-IgG와 함께 인큐베이션하여 과잉의 일차 항체를 포획하였다. 세포를 다시 세척하고, 이차 항체의 전체 패널(CD8, Biolegend: 카탈로그 # 300924, CD45RO, Biolegend: 카탈로그 # 304230, CD27, Biolegend: 카탈로그 # 560612) 및 생존율 염료와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 마지막으로 염색 완충액으로 세척하고, 유세포 분석기에서 실행하여 다양한 염색된 집단을 포획하였다. 도 15는 이들의 CD8+ 서브세트 내에서 CD27+CD45RO- T 세포의 수준을 나타낸 것이다. 동종이계 CAR-T 제조는 관심 공여체의 CD8+ 분획에서 높은 CD27+CD45RO- 세포와 같은 유리한 특징을 갖는 공여체 입력 물질의 선택을 가능하게 한다.
보다 구체적으로, 18 세 내지 40 세 남성 공여체의 류코팩을 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 단리하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 분리, 농축 및 활성화 후, 세포를 Cas9 뉴클레아제 단백질, TRAC sgRNA(서열번호 26) 또는 B2M sgRNA(서열번호 27)를 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체로 전기천공하였다. TRAC 및 B2M 리보뉴클레오단백질 복합체를 전기천공 전에 합하였다. 전기천공 후, 항-CD19 CAR(서열번호 40)을 인코딩하는 공여체 주형(서열번호 54)을 포함하는 새로 해동된 rAAV를 세포에 첨가하고, 세포를 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 배양물에서 확장시키고, 3 일 내지 4 일마다 rhIL-2 및 rhIL-7로 보충하였다. 모니터링을 위해 설정된 세포는 TCR 패널(CD5, CD4, CD8, TCRαβ, B2M 및 CD45)을 사용하여 T 세포 동일성 및 유전자 편집에 대해 시험하였다. T 세포 동일성이 확인되면, 세포를 비오틴-접합 항-TCRαβ 항체 및 항-비오틴 비드와 인큐베이션함으로써 TCRαβ 고갈을 수행하였다. 고갈된 세포를 회수하고, 투여용으로 제형화하였다. 생성된 세포 집단은 0.5% 미만의 TCRαβ+ 세포를 가졌다. 도 16은 정제 전 및 후의 TCRαβ+ 세포의 분석을 나타낸 것이다.
TC1 세포의 8 개의 발달 로트를 T 세포 동일성에 대해 시험하였다. 8 개의 시험된 로트로부터의 평균 결과는 B2M의 84.58% 녹-아웃(즉, 15.42% B2M+ 세포)을 나타냈고, 세포의 99.98%는 TCR-(즉, 0.2% TCR+), 및 항-CD19 CAR의 약 50% 녹-인이었다(도 17).
또한, T 세포 편집 전 및 후에 공여체에서 고갈 및 노화 마커를 평가하였다. 구체적으로, PD1+, LAG3+, TIM3+ 및 CD57+ 세포의 백분율을 전체 T 세포 집단으로부터 결정하였다. 마커의 발현을 다음 이차 항체를 사용하여, 상술된 바와 같이, 유세포 분석에 의해 평가하였다: 마우스 항-PD1 PeCy7, Biolegend, 카탈로그 # 329918; 마우스 항-TIM3BV421, Biolegend, 카탈로그 #345008; 마우스 항-CD57 PerCp Cy5.5, Biolegend, 카탈로그 # 359622; 및 마우스 항-LAG3 PE, Biolegend, 카탈로그 # 369306. 도 18은 고갈 또는 노화 마커가 게놈 편집 후 전체 T 세포 집단의 15% 이상 증가한 적이 전혀 없었다는 것을 나타낸다.
또한, TC1 세포의 3 개의 상이한 로트에 의한 선택적 사멸을 시험관내에서 평가하였다. 구체적으로, TC1 세포를 CD19-양성 세포주(K562-CD19; Raji; 및 Nalm6) 또는 CD19-음성 세포주(K562)와 함께 인큐베이션하였다. 사멸을 약 24 시간 후에 유세포 분석 기반 세포독성 검정을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 표적 세포를 5 μM efluor670(Thermo Fisher Scientific, 월섬, MA)로 표지하고, 세척하고, 다양한 비율의 TC1 또는 대조 T 세포를 갖는 공동배양물(0.1:1 내지 4:1의 T 세포 대 표적 세포)에서 밤새 인큐베이션하였다(50,000 개 표적 세포/웰; 96-웰 U-바닥 플레이트[Corning, 턱스베리, MA]). 다음 날, 웰을 세척하고, 배지를 1:500 희석의 5 ㎎/㎖ 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Thermo Fisher Scientific, 월섬, MA)을 함유하는 200 ㎕의 새로운 배지로 교체하여 사멸/죽은 세포를 계산하였다. 마지막으로, 25 ㎕의 CountBright 비드(Thermo Fisher Scientific)를 각 웰에 첨가한 다음, Novocyte 유세포 분석기(ACEA Biosciences, 샌디에이고, 캘리포니아)를 사용하여 유세포 분석에 의해 세포를 분석하였다. Flowjo 소프트웨어(v10, Flowjo, 애실랜드, OR)를 사용하여 유세포 분석 데이터 파일(fcs 파일)을 분석하였다. TCRαβ+ T 세포(비편집 세포)를 대조로서 사용하였다. TC1 세포는 비편집 T 세포보다 더 높은 비율로 CD19-양성 세포를 효율적으로 사멸시켰고, CD19-음성 세포는 비편집 T 세포와 공동배양했을 때보다 많지 않은 TC1 세포의 존재에서 저수준의 세포 용해를 나타냈다(도 19).
세 명의 특정 공여체로부터 생산된 TC1 세포를 또한 사용하여 사이토카인 및/또는 혈청의 부재에서 성장을 평가하였다. 구체적으로, TC1 세포를 14 일 동안 완전 T 세포 배지에서 성장시켰다. 0 일에, 배양으로부터의 세포를 완전 T-세포 배지(X-VIVO 15(Lonza, 바젤, 스위스), 5% 인간 AB 혈청(Valley Biomedical, 윈체스터, VA), IL-2(Miltenyi, 베르기슈 글라트바흐, 독일) 및 IL-7(Cellgenix, 프라이버그, 독일) 함유)(완전 배지), 혈청을 함유하지만 IL-2 또는 IL-7 사이토카인이 없는(5% 혈청, 사이토카인 없음), 또는 혈청 또는 사이토카인이 없는(혈청 없음, 사이토카인 없음) 배지에서 성장시켰다. 세포를 사이토카인 및/또는 혈청의 제거 후 최대 35 일 동안 상기와 같이 계수하였다. 사이토카인 및/또는 혈청의 부재에서 TC1 세포의 결과는 관찰되지 않았다(도 20).
투여를 위해, TC1 세포를 동결보존 용액(CryoStor CS-5)에 재현탁시키고, 6 mL 주입 바이알에 공급하였다. 총 용량은 하나 이상의 바이알에 포함되어 있었다. 각 바이알의 주입을 해동 20 분 이내에 수행하였다.
실시예 7 : 재발성 또는 불응성 B 세포 악성종양이 있는 대상체에서 동종이계 CRISPR-Cas9 조작된 T 세포(CTX110)의 안전성 및 효능에 대한 I 상, 개방-표지, 다기관, 용량 증대 및 코호트 확대 연구.
CTX110은 CRISPR-Cas9(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부/CRISPR 연관 단백질 9) 유전자 편집 성분(단일 가이드 RNA 및 Cas9 뉴클레아제)을 사용하여 생체외에서 유전자 변형된 동종이계 T 세포를 포함하는 CD19-관련 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포이다. 변형은 T 세포 수용체(TCR) 알파 불변(TRAC) 및 베타-2마이크로글로불린(B2M) 유전자좌의 표적화된 파괴, 및 아데노-연관 바이러스 발현 카세트를 통한 TRAC 유전자좌로의 항-CD19 CAR 전이유전자의 삽입을 포함한다. 항-CD19 CAR(서열번호 40)은 서열번호 47을 포함하는 항-CD19 단쇄 가변 단편, 서열번호 32의 CD8 막관통 도메인, 서열번호 36의 CD28 공동-자극 도메인, 및 서열번호 38의 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다.
본 연구에서, 적격인 인간 환자는 림프구제거(LD) 화학요법 후 CTX110의 정맥내(IV) 주입을 제공받았다.
연구 집단
용량 증대 및 코호트 확대는 B 세포 악성종양이 있는 성인 대상체를 포함하였다. 대상체를 질환 조직학에 기초하여 독립적인 용량 증대 그룹에 배정하였다. 등록된 성인 대상체는 상세불명(NOS)의 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), MYC 및 BCL2 및/또는 BCL6 재배열이 있는 고등급 B 세포 림프종, 형질전환 여포성 림프종(FL), 3b 등급 FL 또는 CLL의 리히터 형질전환을 포함하여 비-호지킨 림프종(NHL)의 하위유형으로 선택된 대상체들을 포함하였다.
연구 목적 및 타당성
1 상 용량 증대 연구의 목적은 재발성 또는 불응성 B 세포 악성종양이 있는 대상체에서 항-CD19 동종이계 CRISPR-Cas9 조작된 T 세포(CTX110 세포)의 안전성 및 효능을 평가하는 것이었다.
재발성/불응성 B 세포 악성종양이 있는 환자에 대한 결과는 기록상 좋지 않다. 그러나, 이러한 환경에서 자가 CAR T 세포 요법의 사용은 이전의 치료 옵션이 완화적이었을 때 완전 및 지속적 반응을 야기하였다(June et al., (2018) Science, 359, 1361-1365; Maus and June, (2016) Clin Cancer Res, 22, 1875-1884; Neelapu et al., (2017) N Engl J Med, 377,2531-2544; Schuster et al., (2019) N Engl J Med, 380, 45-56; Schuster et al., (2017) N Engl J Med, 377, 2545-2554). 자가 CAR T 세포 요법은 환자-특정 세포 수집 및 제조를 필요로 한다. 불행히도, 일부 환자는 백혈구분반술을 받을 후보가 아니거나 치료를 기다리는 동안 질환의 진행 또는 사망을 겪게 된다. CTX110과 같은 동종이계의 바로 입수 가능한 CAR T 세포 제제는 즉각적인 가용성의 이점을 제공하고, 제조 변동성을 줄이며, 개별 대상체 제조 실패를 막을 수 있다.
또한, 여러 차례의 화학요법으로 치료를 받은 환자는 고갈되거나 노화된 표현형을 갖는 T 세포를 가질 수 있다. 자가 CAR T 세포 요법으로 치료를 받은 만성 림프구성 백혈병(CLL)이 있는 환자의 낮은 반응률은 부분적으로 고갈된 T 세포 표현형에 기인한다(Fraietta et al., (2018) Nat Med, 24, 563-571; Riches et al., (2013) Blood, 121, 1612-1621). 동종이계 접근법은, 건강한 공여체로부터의 화학요법-미경험 T 세포로 시작함으로써, 자가 제제에 비해 CAR T 요법의 일관성과 효능을 증가시킬 수 있다.
동종이계 CAR T 세포의 사용에 대한 주요 난제는 이식편 대 숙주병(GvHD)의 위험이었다. CRISPR Cas9 유전자-편집 기술은 신뢰할 수 있는 다중 셀룰러 편집을 가능하게 한다. CTX110 제조 공정은 CAR 작제물의 도입을 상동성 재조합을 통해 TRAC 유전자좌의 파괴에 결합시킨다. AAV-전달 DNA 공여체 주형 및 HDR을 사용한 TRAC 게놈 유전자좌에서 CAR의 전달 및 정확한 삽입은 렌티바이러스 및 레트로바이러스 형질도입 방법을 사용한 유전적 물질의 무작위 삽입과 대조된다. TRAC 유전자좌에서 CAR 유전자 삽입은 CAR을 발현하는 거의 모든 세포에서 TCR의 제거를 초래하는데, 이는 GvHD의 위험을 최소화한다. 또한, 건강한 공여체 세포로부터의 제조는 의도치 않게 악성 B 세포를 형질도입할 위험을 없앤다(Ruella et al., (2018) Nat Med, 24, 1499-1503). 재발성/불응성 B 세포 악성종양을 가진 대상체에서 최초 인간 시험은 이러한 CRISPR-Cas9-변형 동종이계 CAR T 세포 접근법으로 CTX110의 안전성뿐만 아니라 효능을 평가하는 것을 목표로 한다.
CD19-관련 유전자 변형 동종이계 T-세포 면역요법제인 CTX110은 건강한 공여체의 세포로부터 제조되고; 따라서, 결과적으로 제조된 세포는 각 대상체에게 신뢰할 수 있는 품질의 일관된 최종 제품을 제공하도록 의도된다. 또한, CTX110의 제조는, AAV 및 상동성-지정 복구(HDR)를 이용하여 TRAC 부위에서 CAR의 정확한 전달 및 삽입을 통해, 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터의 무작위 삽입과 관련된 위험을 제기하지 않는다.
목적
일차 목적, 파트 A(용량 증대): 권고되는 파트 B 용량을 결정하기 위해 재발성 또는 불응성 B 세포 악성종양이 있는 대상체에서 다양한 림프구제거제와 조합하여 CTX110의 용량 증대에 대한 안정성 평가.
일차 목적, 파트 B(코호트 확대): 객관적 반응률(ORR)에 의해 측정하는 경우, 재발성 또는 불응성 B 세포 악성종양이 있는 대상체에서 CTX110의 효능 평가.
이차 목적(파트 A 및 파트 B): CTX110의 효능, 안전성 및 약동학의 추가 특성규명.
탐색적 목적(파트 A 및 파트 B): 임상 반응, 내성, 안전성, 또는 약력학적 활성을 지시하거나 예측할 수 있는 CTX110과 관련된 게놈, 대사 및/또는 단백질체 바이오마커의 확인.
종점
일차 종점
● 파트 A: 용량-제한 독성으로 규정되는 유해 사례의 발생률.
● 파트 B: 독립 중앙 방사선과 검토에 의해 결정하는 경우, 악성 림프종에 대한 루가노 반응 기준(Cheson et al., (2014) J Clin Oncol, 32, 3059-3068)에 따라 완전 반응(CR) + 부분 반응(PR)으로 규정되는 객관적 반응률(ORR).
루가노 분류는 림프종 대상체에서 영상을 평가하는 표준화된 방법을 제공한다. 이는 진단 CT에 대한 종양 부담의 방사선학적 평가 및 FDG-친화성 조직학용 F18 FDG-PET에 대한 대사 평가로 구성된다(표 13 및 표 14 참조).
[표 13]
Figure pct00013
[표 14]
반응 평가를 위한 루가노 기준.
각 추적 시점에, PET-기반 반응 및 CT-기반 반응은 하기 규정에 따라 이루어진다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
이차 종점(용량 증대 및 코호트 확대)
효능
● 반응/관해 기간(중앙 판독/평가). 반응/관해의 기간은 객관적인 반응 사건을 가졌던 대상체에 대해서만 보고된다. 이는 객관적인 첫 반응과 질환 진행일 또는 임의 원인으로 인한 사망 사이의 시간으로 계산된다.
● 무진행/무사건 생존(중앙 판독/평가). 무진행 생존(PFS) 및 무사건 생존은 CTX110 주입일과 질환 진행일 또는 임의의 원인으로 인한 사망 사이의 차이로 계산된다. 진행되지 않았고 데이터 컷오프 일에 여전히 연구 중인 대상체는 이들의 마지막 평가일에 검열된다.
● 전체 생존. 전체 생존은 CTX110의 첫 투여일과 임의 원인으로 인한 사망 사이의 시간으로 계산된다. 데이터 컷오프 일에 살아 있는 대상체는 살아 있는 것으로 알고 있는 이들의 마지막 날짜에 검열된다.
안전성
● AE 및 임상적으로 유의한 검사실 결과 이상의 빈도 및 중증도.
약동학
● 시간 경과에 따른 혈중 CTX110 수준.
탐색적 종점(용량 증대 및 코호트 확대)
● 조직 중 CTX110 수준(예를 들어, 골수, CSF, 및/또는 종양 조직에서 CTX110의 트래피킹은 프로토콜-특정 샘플링에 따라 수집된 임의의 샘플에서 평가될 수 있음).
● 혈액 및 기타 조직 중 사이토카인의 수준.
● 항-CTX110 항체의 발생률.
● 시간 경과에 따른 B 세포 및 면역글로불린의 수준.
● CTX110 증식, CRS 및 반응에 대한 항-사이토카인 요법의 영향.
● CTX110 요법 후 자가 또는 동종이계 HSCT의 발생률.
● 후속 항암 요법의 발생률 및 유형.
● 완전 반응/관해까지의 시간.
● 후속 요법 없이 첫 생존.
● 기타 게놈, 단백질, 대사 또는 약력학적 종점.
연구 설계
이는 재발성 또는 불응성 B 세포 악성종양이 있는 대상체에서 CTX110의 안전성 및 효능을 평가하는 개방-라벨, 다기관, 1상 연구이다. 본 연구는 용량 증대(파트 A) 및 이어서 코호트 확대(파트 B)의 두 파트로 나뉘어진다.
파트 A는 다음 NHL 하위유형 중 하나를 갖는 성인 대상체에서 코호트 A에서 CTX110의 용량 증대를 조사한다: DLBCL NOS, MYC 및 BCL2 및/또는 BCL6 재배열이 있는 고등급 B 세포 림프종, 3b 등급 FL, 또는 형질전환 FL.
연구의 용량 증대 파트에서, 코호트 A(500 ㎎/㎡)에 비해 증가된 용량의 사이클로포스파미드(750 ㎎/㎡)를 조사하기 위해 코호트 A와 유사한 NHL 집단이 있는 1 개의 추가 코호트(코호트 B)를 추가하였다. 코호트 B의 대상체를 CTX110 주입 후 CAR T 세포 확장에 대한 림프구의 더 긴 억제 효과를 조사하기 위해 증가된 용량의 사이클로포스파미드로 처리하였다(표 15 참조).
[표 15]
Figure pct00017
본 연구는 용량 증대(파트 A) 및 이어서 코호트 확대(파트 B)의 두 파트로 나뉘어진다. 연구의 두 파트 모두가 스크리닝, 치료, 및 추적의 3 가지 주요 단계로 이루어질 것이다. 연구 개요의 개략도는 도 21에 나타나 있다.
평가 일정은 표 16 및 표 17에 제공되어 있다.
단계 1 - 치료에 대한 적격성을 결정하기 위한 스크리닝(최대 14 일).
단계 2 - 림프구제거(LD) 화학요법 및 CTX110 주입(1 주 내지 2 주). LD 화학요법의 개시와 CTX110의 주입 둘 모두 전에, 대상체의 임상적 적격성이 재확인되어야 한다.
단계 2A - LD 화학요법:
코호트 A: 3 일 동안 일일 플루다라빈 30 ㎎/㎡ 및 사이클로포스파미드 500 ㎎/㎡의 공동-투여.
코호트 B: 3 일 동안 일일 정맥내(IV) 플루다라빈 30 ㎎/㎡ 및 사이클로포스파미드 750 ㎎/㎡의 공동-투여.
단계 2B - CTX110 주입:
코호트 A(NHL 서브세트): 림프구제거(LD) 화학요법(3 일 동안 일일 정맥내[IV] 플루다라빈 30 ㎎/㎡ 및 사이클로포스파미드 500 ㎎/㎡)을 CTX110 주입의 적어도 48 시간 전에(그러나 7 일 이하) 완료하였다(용량 수준[DL] 1로부터의 용량 증대).
코호트 B(더 높은 LD 화학요법 용량): LD 화학요법(3 일 동안 1 일 IV 플루다라빈 30 ㎎/㎡ 및 사이클로포스파미드 750 ㎎/㎡])을 CTX110 주입의 적어도 48 시간 전에(그러나 7 일 이하) 완료하였다(용량 수준[DL] 2로부터의 용량 증대).
단계 3 - 추적(마지막 CTX110 주입 후 5 년).
용량 증대와 코호트 확대 둘 모두에 대해, 대상체는 CTX110 주입 후 28 일 동안 연구 장소에 근접해 있어야 한다(즉, 1 시간 이동 시간). 이러한 급성 독성 모니터링 기간 동안, 대상체는 사이토카인 방출 증후군(CRS), 신경독성 및 GvHD를 포함하는 유해 사례(AE)에 대해 일상적으로 평가될 것이다. 독성 관리 지침은 연구 프로토콜에 제공된다. 용량 증대 동안, 모든 대상체는 CTX110 주입 후 처음 7 일 동안, 또는 로컬 규정 또는 현장 관행에 의해 요구되는 경우 더 오래 입원할 것이다.
급성 독성 모니터링 기간 후, 대상체는 후속적으로 CTX110 주입 후 최대 5 년 동안 신체 검사, 정기 검사 및 영상 평가, 및 AE 평가를 수행될 것이다. 본 연구의 완료 후, 대상체는 장기 안전성 및 생존을 평가하기 위해 추가 10 년 동안 별도의 장기 추적 연구에 참여해야 할 것이다.
LD 화학요법은 임의의 하기 징후 또는 증상이 있는 경우 지연될 것이다:
● 연구원에 따라 LD 화학요법과 관련된 AE의 잠재적 위험을 증가시키는 임상 상태의 유의한 악화.
● 91% 초과의 포화 수준을 유지하기 위한 보충용 산소에 대한 요구.
● 새로운 비조절성 심장 부정맥.
● 혈관수축제 보조가 필요한 저혈압.
● 활동성 감염: 치료에 반응하지 않는 세균, 진균, 또는 바이러스에 대한 양성 혈액 배양.
● 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
[표 16]
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[표 17]
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림프구제거의 목표는 주입 후 유의한 CAR T 세포 확장을 가능하게 하는 것이다. 상이한 용량에 걸친 플루다라빈 및 사이클로포스파미드로 이루어진 LD 화학요법은 여러 자가 CAR T 세포 시험에서 성공적으로 이용되었다. LD 화학요법의 이용에 대한 타당성은 조절 T 세포 및 '사이토카인 싱크'로서 작용하는 면역계의 다른 경쟁 요소를 제거하여 인터류킨 7(IL-7) 및 인터류킨 15(IL-15)와 같은 사이토카인의 이용 가능성을 향상시키는 것이다(Dummer et al., (2002) J Clin Invest, 110, 185-192; Gattinoni et al., (2005) J Exp Med, 202, 907-912). 추가로, 미경험 T 세포의 총 개수가 특정 임계값 미만으로 감소할 때 미경험 T 세포가 증식하고 기억-유사 T 세포로 분화되기 시작하는 것으로 상정된다(Dummer et al., (2002) J Clin Invest, 110, 185-192). 코호트 A는 액시카브타겐 실루셀의 등록 임상 시험에 사용된 용량과 일치하는 용량으로 사이클로포스파미드(500 ㎎/㎡) 및 플루다라빈(30 ㎎/㎡)을 사용할 것이다. 코호트 B는 증가된 강도의 림프구제거가 동종이계 CAR T 세포 산물의 확장을 촉진할 수 있는지 평가하기 위해 더 높은 용량의 사이클로포스파미드(750 ㎎/㎡)를 사용할 것이다. 이러한 범위(총 > 120 ㎎/㎏ 또는 3 g/㎡) 내의 사이클로포스파미드의 용량은 혈액 악성종양에서 이전의 CAR T 세포 요법 연구에서 사용된 바 있다(Brentjens et al., (2011) Blood, 118, 4817-4828; Kochenderfer et al., (2015) J Clin Oncol, 33, 540-549; Turtle et al., (2016) Sci Transl Med, 8, 355ra116). 더 높은 강도의 LD 화학요법의 일부로 사용될 때, 증가된 용량의 사이클로포스파미드는 개선된 효능과 관련이 있다(Hirayama et al., (2019) Blood, 133, 1876-1887).
CTX110 주입은 임의의 다음 징후 또는 증상이 있는 경우 지연되어야 한다:
● 새로운 활동성의 비조절성 감염.
● 연구원의 의견으로, 대상체를 독성 위험의 증가에 두는 LD 화학요법의 시작 전과 비교하여 임상 상태의 악화.
● 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
CTX110 용량
CTX110 세포는 CAR+ T 세포의 수에 기초하여 균일한 투약 방식을 이용하여 IV 투여된다. 시작 용량은 3×107 개 CAR+ T 세포이며, 이는 KYMRIAH®(5×108 개 총 CAR T 세포) 및 YESCARTA®(2×106 ㎏, 최대 2×108 개 CAR T 세포)를 포함하는 NHL에 대해 현재 승인된 자가 CAR T 세포의 용량보다 대략 1 log 낮은 것이다.
용량 증대
용량 증대는 표준 3+3 설계를 이용하여 수행될 것이다. CAR+ T 세포에 기초한 CTX110의 다음 용량은 코호트 A에 대한 DL1로 시작하여 본 연구에서 평가될 수 있다. 안전성 검토 위원회(Safety Review Committee; SRC)가 코호트 A에서 DL2의 안전성을 평가하고 확인한 후에만 후속 코호트 B를 개방/등록하고 DL2로부터 용량 증대를 시작할 수 있다. 연구의 용량 한계가 7×104 개 TCR+ 세포/㎏이기 때문에, 연구는 대상체 체중이 60 ㎏ 이상인 경우 코호트 A 및/또는 코호트 B에서 DL4로 진행될 수 있다(표 18 참조).
[표 18]
Figure pct00023
DLT 평가 기간을 CTX110 주입으로 시작하여 28 일 동안 지속하였다. 각 코호트의 처음 3 명의 대상체는 시차를 둔 방식으로 처리될 것이며, 이에 따라 두 번째 및 3 번째 대상체는 이전 대상체가 DLT 평가 기간을 완료한 후에만 CTX110을 제공받게 될 것이다. 후속 용량 수준 또는 동일한 용량 수준의 확장에서, 최대 3 명의 대상체의 코호트가 등록되고 동시에 투여될 수 있다.
대상체는 DLT를 위해 평가될 CTX110를 제공받아야 한다. 대상체가 CTX110 주입 전에 언제든지 연구를 중단하면, 대상체는 DLT를 위해 평가되지 않을 것이며, 대체 대상체는 중단된 대상체와 동일한 용량 수준으로 등록될 것이다. DLT-평가 가능 대상체가 잠재적 DLT의 징후 또는 증상을 갖는 경우, DLT 평가 기간은 DLT가 표명되기 전에 개선 또는 해소가 가능하도록 프로토콜-지정 윈도우에 따라 연장될 것이다.
독성을 CRS(Lee 기준), 신경독성(ICANS, 면역 이펙터 세포-관련 신경독성 증후군 기준 및 CTCAE v5.0), 및 GvHD(Mount Sinai 급성 GVHD 국제 컨소시엄[MAGIC] 기준)를 제외하고는 국립 암 연구소의 유해 사례 공통 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Event; CTCAE)에 따라 등급을 매기고 기록하였다.
DLT는 명시된 기간(발병 시간에 대해)을 초과하여 지속되는 DLT 평가 기간 동안 발생하는 임의의 다음 사건으로 규정될 것이다:
● 스테로이드-불응성인 2 등급 이상의 GvHD(예를 들어, 스테로이드 치료 3 일 후 진행성 질환[예를 들어, 1 ㎎/㎏/일], 7 일 후 안정 질환, 또는 치료 14 일 후 부분 반응).
● DLT 기간 중 사망(질환 진행으로 인한 경우 제외).
● 연구원의 판단에 따라 임상적으로 유의하고 72 시간 이내에 개선되지 않는 임의의 3 등급 또는 4 등급 독성.
● 하기는 DLT로 간주되지 않을 것이다:
○ 72 시간 이내에 2 등급 이하까지 개선된 3 등급 또는 4 등급 CRS.
○ 14 일 이내에 2 등급 이하까지 개선된 3 등급 또는 4 등급 신경독성(예를 들어, 뇌병증, 착란).
○ 3 등급 또는 4 등급 발열.
○ 혈소판감소증의 환경에서 출혈(50×109/ℓ 미만의 혈소판 수치); 호중구감소증의 환경에서 기록된 세균 감염 또는 발열(1000/mm3 미만의 절대 호중구 수치).
○ 3 등급 또는 4 등급 저감마글로불린혈증.
○ 7 일 이내에 2 등급 이하로 해소된 3 등급 또는 4 등급 폐 독성. 지지 요법으로부터의 체액 과부하로 인해 삽관된 대상체의 경우, 이는 14 일까지 연장될 수 있다.
○ 14 일 이내에 2 등급 이하까지 개선된 3 등급 또는 4 등급 간 기능 연구.
○ 21 일 이내에 2 등급 이하까지 개선된 3 등급 또는 4 등급 신부전증.
○ 3 등급 또는 4 등급 혈소판감소증 또는 호중구감소증은 후향적으로 평가될 것이다. 적어도 6 명의 대상체가 주입된 후, 대상체의 50% 이상이 장기간 혈구감소증을 갖는 경우(즉, 주입 후 28 일 넘게 지속), 용량 증대는 SRC 평가가 있을 때까지 보류될 것이다.
CTX110과 개연성 있는 인과 관계가 없는 AE는 DLT로 간주되지 않을 것이다.
독성 관리
대상체는 CTX110 주입 후 적어도 28 일 동안 면밀히 모니터링되어야 한다. 자가 CAR T 세포 요법으로 유의미한 독성이 보고되었으며, 연구원은 프로토콜 지침에 따라 모든 유해 사례를 순향적으로 모니터링하고 처리해야 한다.
하기 일반 권고 사항이 CD19-관련 자가 CAR T 세포 요법에 대한 선행 경험에 기초하여 제공된다:
● 발열은 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 가장 흔한 초기 증상이지만; 대상체는 또한 첫 출현으로서 쇠약, 저혈압, 또는 착란을 경험할 수 있다.
● CRS의 진단은 검사실 값이 아닌 임상 증상에 기초해야 한다.
● CRS-특정 관리에 반응하지 않는 대상체에서, 항상 패혈증 및 내성 감염을 고려한다. 대상체는 진균 또는 바이러스 감염뿐만 아니라 내성 또는 응급 세균 감염에 대해 지속적으로 평가되어야 한다.
● CRS, 혈구탐식성 림프조직구증(HLH), 및 종양 용해 증후군(TLS)은 CAR T 세포 주입 후 동시에 발생할 수 있다. 대상체는 모든 질병의 징후 및 증상에 대해 일관되게 모니터링되고 적절하게 관리되어야 한다.
● 신경독성은 CRS 발병 시, CRS 해소 동안 또는 CRS의 해소 후에 발생할 수 있다. 신경독성의 등급화 및 관리는 CRS와 별개로 수행될 것이다.
● 토실리주맙은 지시 시간으로부터 2 시간 이내에 투여되어야 한다.
CTX110의 안전성 프로파일은 연구 전반에 걸쳐 계속 평가될 것이며, 연구원은 잠재적인 CTX110-관련 독성의 확인 및 관리에 관한 새로운 정보로 정기적으로 업데이트될 것이다.
주입 반응
일시적 발열, 오한 및/또는 메스꺼움을 포함하여 자가 CD19-관련 CAR T 세포 시험에서 주입 반응이 보고되었다. 아세트아미노펜(파라세타몰) 및 디펜히드라민 하이드로클로라이드(또는 또 다른 H1-항히스타민)는 주입 반응이 발생하는 경우 필요에 따라 CTX110 주입 후 6 시간마다 반복될 수 있다. 대상체에게 아세트아미노펜에 의해 완화되지 않는 발열이 계속되는 경우, 필요에 따라 비스테로이드성 항-염증약이 처방될 수 있다. 전신 스테로이드는 생명을 위협하는 응급 상황을 제외하고 투여되지 않아야 하는데, 그 이유는 이러한 개입은 CAR T 세포에 해로운 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
열성 반응 및 감염 예방
감염 예방은 면역저하 환경에서 B 세포 악성종양이 있는 환자에 대한 제도적 치료 표준에 따라 이루어져야 한다. 열성 반응의 경우, 감염에 대한 평가가 개시되어야 하고, 대상체는 항생제, 수액, 및 치료 의사에 의해 의학적으로 지시되고 결정되는 다른 지지 요법으로 적절하게 관리되어야 한다. 발열이 지속되면 대상체의 의학적 관리 전반에 걸쳐 바이러스 및 진균 감염이 고려되어야 한다. 대상체에게 CTX110 주입 후 패혈증 또는 전신성 균혈증이 생기는 경우, 적절한 배양 및 의학적 관리가 개시되어야 한다. 추가로, 주입 후 30 일 이내에 CTX110 주입 후 발열의 임의의 경우에 CRS를 고려해야 한다.
종양 용해 증후군(TLS)
CAR T 세포 요법을 제공받은 대상체는 TLS의 위험이 증가한다. 대상체는 LD 화학요법의 시작에서부터 CTX110 주입 후 28 일까지 검사실 평가 및 증상을 통해 TLS에 대해 면밀히 모니터링되어야 한다. 모든 대상체는 스크리닝 동안 및 LD 화학요법의 개시 전에 예방적 알로푸리놀(또는 페북소스타트와 같은 비-알로푸리놀 대체물), 및 증가된 경구/IV 수액요법을 제공받아야 한다. 예방 조치는 CTX110 주입 후 28 일 이후 또는 TLS의 위험이 지나면 중단될 수 있다.
부위는 기관의 치료 표준 대로 또는 게시된 지침에 따라 TLS를 모니터링하고 치료해야 한다(Cairo and Bishop, (2004) Br J Haematol, 127, 3-11). 라스부리카제의 투여를 포함한 TLS 관리는 임상적으로 지시될 때 즉시 시작되어야 한다.
사이토카인 방출 증후군(CRS)
CRS는 자가 CD19-관련 CAR T 세포 요법으로 보고된 주요 독성이다. CRS는 표적 항원의 CAR 관여에 반응한 면역계의 과활성화에 기인하며, 이로 인해 신속한 T 세포 자극 및 증식으로부터의 다중-사이토카인 상승이 발생한다(Frey et al., (2014) Blood, 124, 2296; Maude et al., (2014) Cancer J, 20, 119-122). 사이토카인이 방출될 때, 심장, 위장관(GI), 신경계, 호흡기(호흡곤란, 저산소증), 피부, 심혈관(저혈압, 빈맥), 및 체질(발열, 경직, 발한, 거식증, 두통, 권태, 피로, 관절통, 메스꺼움, 및 구토) 증상, 및 검사실 검사(응고, 신장, 및 간) 이상을 포함하여, CRS와 관련된 다양한 임상 징후 및 증상이 발생할 수 있다.
CRS 관리의 목표는 CTX110의 항종양 효과에 대한 잠재력을 보존하면서 생명을 위협하는 후유증을 예방하는 것이다. 증상은 일반적으로 자가 CAR T 세포 요법 후 1 일 내지 14 일 후에 발생하지만, 동종이계 CAR T 세포에 대한 증상 발병의 시기는 완전히 정의되지 않았다.
CRS는 검사실 사이토카인 측정이 아니라 임상적 출현에 기초하여 확인되고 치료되어야 한다. CRS가 의심되는 경우, 게시된 지침(Lee et al., (2014) Blood, 124, 188-195)으로부터 적합한 표 19의 권고 사항에 따라 등급화 및 관리가 수행되어야 한다. 원래의 Lee CRS 등급 기준이 개발된 이후, CAR T 세포 요법을 사용하는 의사는 CRS의 출현 및 시간 경과에 대해 추가 이해를 얻게 되었다. 최근 미국 혈액 및 골수 이식 학회(American Society for Blood and Marrow Transplantation; ASBMT) 합의 기준(Lee et al., (2018) Biol Blood Marrow Transplant)은 등급화가 저혈압 및/또는 저산소증을 동반한 발열의 존재에 기초해야 하고, 기타 말단 기관 독성은 지지 요법으로 별도로 관리되어야 한다고 권고했다. 따라서, 이러한 프로토콜에서 신경독성은 상이한 척도(표제 "면역 이펙터 세포-관련 세포 독성 증후군(ICANS)(Immune Effector Cell-Associated Neurotoxicity Syndrome (ICANS))"의 섹션 참조)를 사용하여 등급화되고 관리될 것이며, CRS 관리의 맥락에서 말단 기관 독성은 간 및 신장계만을 지칭한다(Penn 등급화 기준(Porter et al., (2018) J Hematol Oncol, 11, 35)에서와 같이). 스폰서는 CTX110 및 기타 CAR T 세포 요법에 대한 임상 경험에 기초하여 ASBMT 합의 제안을 반영하기 위해 CRS 등급화 기준 및 독성 관리 알고리즘을 수정하는 것을 정할 수 있다.
[표 19]
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[표 20]
Figure pct00025
CRS 기간 동안 전반에 걸쳐, 대상체는 해열제, IV 수액, 및 산소로 이루어진 지지 요법을 제공받아야 한다. 2 등급 이상의 CRS(예를 들어, 저혈압, 수액 반응 없음, 또는 보충용 산소요법이 필요한 저산소증)를 경험하는 대상체는 지속적인 심장 원격측정 및 맥박 산소측정기로 모니터링되어야 한다. 3 등급 CRS를 경험한 대상체의 경우, 심장 기능을 평가하기 위해 심전도 수행을 고려한다. 3 등급 또는 4 등급 CRS의 경우, 집중 치료 지지 요법을 고려한다. 저산소증으로 인한 것이 아닌 신경독성(예를 들어, 발작)으로 인한 기도 보호를 위한 삽관은 4 등급 CRS로서 포함되지 않아야 한다. 유사하게, CRS의 다른 징후(예를 들어, 저산소증) 없이 신경독성으로 인한 장기간 삽관은 4 등급 CRS로 간주되지 않는다. 연구원은 증상(발열, 저혈압, 저산소증)이 유사하기 때문에 중증 CRS의 경우 기저 감염의 가능성을 항상 고려해야 한다. CRS의 해소는 발열(38℃ 이상의 체온), 저산소증, 및 저혈압의 해소로 규정된다(Lee et al., (2018) Biol Blood Marrow Transplant).
면역 이펙터 세포-관련 세포독성 증후군(ICANS)
자가 CD19-관련 CAR T 세포 요법으로 신경독성이 관찰되었다. 이는 CRS 발병 시, CRS의 해소 동안, 또는 CRS의 해소 후에 발생할 수 있으며, 이의 병리생리학은 불분명하다. 최근 ASBMT 합의는 추가로 CRS와 관련된 신경독성을, 내인성 또는 주입된 T 세포 및/또는 다른 면역 이펙터 세포의 활성화 또는 관여를 초래하는 임의의 면역 요법 후 CNS를 동반한 병리 과정으로 특성규명되는 장애인 면역 이펙터 세포-관련 신경독성 증후군(ICANS)으로 정의했다(Lee et al., (2018) Biol Blood Marrow Transplant). 징후 및 증상은 점진적일 수 있으며, 실어증, 의식 수준의 변화, 인지 능력 장애, 운동성 저하, 발작, 및 뇌부종을 포함할 수 있다. ICANS 등급화는 이전에 자가 CAR T 세포 시험에 사용된 CAR T 세포-요법-관련 독성(CARTOX) 연구 그룹 기준에 기초하여 개발되었다(Neelapu et al., (2018) N Engl J Med, 377, 2531-2544). ICANS는 ICE(면역 이펙터 세포-관련 뇌병증) 평가 도구로도 불리는 수정된 평가 도구를 이용함으로써 의식 수준, 발작의 존재/부재, 운동성 소견, 뇌부종의 존재/부재의 평가, 및 신경학적 도메인의 전반적인 평가를 통합한다(표 21 참조).
임의의 새로 발병된 신경독성의 평가는 임상적으로 지시된 바와 같이 신경학적 검사(ICE 평가 도구 포함, 표 22), 뇌 MRI, 및 CSF 검사(요추 천자를 통한)를 포함해야 한다. 뇌 MRI가 가능하지 않은 경우, 모든 대상체는 뇌내 출혈을 배제하기 위해 비-조영 CT를 받아야 한다. 뇌파도가 또한 임상적으로 지시됨에 따라 고려되어야 한다. 중증인 경우에 기도 보호를 위해 기관내 삽관이 요해질 수 있다.
CTX110 주입 후 적어도 21 일 동안 또는 신경학적 증상의 해소 시(연구원이 항발작약이 유해한 증상에 기여하는 것으로 간주하지 않는 한) 모든 대상체에서 비-진정, 항-발작 예방(예를 들어, 레베티라세탐)이 고려되어야 한다. 2 등급 이상의 CRS를 경험하는 대상체는 지속적인 심장 원격측정 및 맥박 산소측정기로 모니터링되어야 한다. 중증 또는 생명을 위협하는 신경학적 독성의 경우, 집중 치료 지지 요법이 제공되어야 한다. 신경과 상담은 항상 고려되어야 한다. 혈소판과 응고병증의 징후를 모니터링하고, 뇌내 출혈의 위험을 줄이기 위해 혈액 제제를 적절하게 수혈해야 한다. 표 21은 신경독성 등급화를 제공한 것이고, 표 23은 관리 지침을 제공한 것이다.
3 일 넘게 활발한 스테로이드 관리를 제공받는 대상체의 경우, 장기간 스테로이드 사용으로 중증 감염의 위험을 완화하기 위해 항진균 및 항바이러스 예방 조치가 권고된다. 항균 예방 조치에 대한 고려도 제공되어야 한다.
[표 21]
Figure pct00026
[표 22]
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ICE 평가는 스크리닝 시, 1 일차에 CTX110의 투여 전, 및 2 일차, 3 일차, 5 일차, 8 일차 및 28 일차에 수행될 것이다. 대상체가 CNS 증상을 경험하는 경우, ICE 평가는 증상이 해소될 때까지 대략 2 일마다 계속 수행되어야 한다. 편차를 최소화하기 위해, 가능할 때마다 ICE 평가의 관리에 익숙하거나 훈련된 동일한 연구 직원이 평가를 수행해야 한다.
[표 23]
Figure pct00028
발열의 환경 또는 화학요법 후 발생할 수 있는 두통은 비특이적인 증상이다. 두통만으로는 ICANS의 징후가 아닐 수 있으며, 추가 평가가 수행되어야 한다. 상태악화 및 근육 손실로부터 초래된 쇠약 또는 균형 문제는 ICANS의 정의에서 배제된다. 유사하게, 관련 부종의 존재 또는 부재에서 뇌내 출혈은 이들 대상체에서 응고병증으로 인해 발생할 수 있으며, 또한 ICANS의 규정에서 배제된다. 이들 및 다른 신경독성은 CTCAE v5.0에 따라 포착되어야 한다.
B 세포 무형성증
B 세포 무형성증이 발생할 수 있으며, 다음 면역글로불린 G 혈액 수치에 의해 모니터링될 것이다. IV 감마글로불린은 기관 치료 기준에 따라 임상적으로 유의한 저감마글로불린혈증(전신 감염)의 경우에 투여될 것이다.
혈구탐식성 림프조직구증(HLH)
HLH는 자가 CD19-관련 CAR T 세포를 이용한 치료 후 보고되었다(Barrett et al., (2014) Curr Opin Pediatr, 26, 43-49; Maude et al., (2014) N Engl J Med, 371, 1507-1517; Maude et al., (2015) Blood, 125, 4017-4023; Porter et al., (2015) Sci Transl Med, 7, 303ra139; Teachey et al., (2013) Blood, 121, 5154-5157). HLH는 활성화된 T 세포로부터의 사이토카인 생산이 과도한 대식세포 활성화를 초래하는 CAR T 세포의 주입 후 염증 반응의 결과인 임상 증후군이다. HLH의 징후 및 증상은 발열, 혈구감소증, 간비장비대, 고빌리루빈혈증을 동반한 간 기능장애, 유의하게 감소된 피브리노겐을 동반한 응고병증, 및 페리틴 및 C-반응성 단백질(CRP)의 현저한 상승을 포함할 수 있다. 신경학적 결과가 또한 관찰되었다(Jordan et al., (2011) Blood, 118, 4041-4052; La Ros
Figure pct00029
e, (2015) Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 190-196).
CRS 및 HLH는 중복되는 임상적 특징 및 병리생리학를 갖는 유사한 임상 증후군을 지닐 수 있다. HLH는 아마도 CRS 발병 시 또는 CRS가 해소될 때 발생할 것이다. CRS의 다른 증거가와 함께 또는 없이 설명불가 상승된 간 기능 검사 또는 혈구감소증이 있는 경우 HLH가 고려되어야 한다. CRP와 페리틴의 모니터링은 진단을 돕고 임상 경과를 규정할 수 있다.
HLH가 의심되는 경우:
● 피브리노겐을 포함한 응고 매개변수를 자주 모니터링한다. 이러한 검사는 평가 일정에 지시된 것보다 더 빈번하게 수행될 수 있으며, 빈도는 검사실 결과에 기초하여 관리되어야 한다.
● 피브리노겐은 출혈 위험을 줄이기 위해 100 mg/dL 이상 유지되어야 한다.
● 응고병증은 혈액 제제로 교정되어야 한다.
● CRS와의 중복을 감안할 때, 대상체는 또한 표 19의 CRS 치료 지침에 따라 관리되어야 한다.
혈구감소증
때때로 주입 후 28 일 이상 지속되는 3 등급 호중구감소증 및 혈소판감소증이 자가 CD19-관련 CAR T 세포 제제로 치료를 받은 대상체에서 보고되었다(Kymriah USPI, 2017; Yescarta USPI, 2017). 따라서, CTX110을 제공받는 대상체는 그러한 독성에 대해 모니터링되고 적절하게 지지되어야 한다. 장기간 호중구감소증이 있는 임의의 대상체의 경우 항균 및 항진균 예방 조치가 고려되어야 한다.
G-CSF는 CRS의 위험이 지나간 CTX110 주입 21 일 후 4 등급 호중구감소증의 경우에 고려될 수 있다.
이식편 대 숙주병
GvHD는 동종이계 HSCT의 환경에서 보이며, 수용자(숙주)를 외래로 인식하는 면역적격 공여체 T 세포(이식편)의 결과이다. 후속 면역 반응은 수용체를 공격하도록 공여체 T 세포를 활성화시켜 외래 항원-보유 세포를 제거한다. GvHD는 동종이계 HSCT로부터의 시간과 임상적 증상 둘 모두에 기초하여 급성, 만성 및 중복 증후군으로 나뉜다. 급성 GvHD의 징후는 반구진 발진; 담즙울혈로 이어지는, 작은 담관의 손상으로 인한 황달을 동반한 고빌리루빈혈증; 메스꺼움, 구토 및 거식증; 및 묽은 또는 혈성 설사 및 경련성 복통을 포함할 수 있다(Zeiser and Blazar, (2017) N Engl J Med, 377, 2167-2179).
제안된 임상 연구를 뒷받침하기 위해, 모든 제안된 임상 용량 수준을 적어도 10 배 초과하는 2 회 용량으로 면역저하된 마우스에서 비임상 우수 실험실 관리 기준(GLP)-준수 GvHD 및 내약성 연구를 수행했다. 또한, TRAC 유전자좌에서 CAR 삽입의 특이성으로 인해, T 세포는 CAR+와 TCR+ 둘 모두일 가능성이 매우 낮다. 나머지 TCR+ 세포는 최종 생성물에서 0.5% 미만의 TCR+ 세포를 달성하도록 항-TCR 항체 컬럼에서 면역친화성 크로마토그래피에 의해 제조 공정 동안 제거된다. 모든 용량 수준에 대해 7×104 개 TCR+ 세포/㎏의 용량 한계가 부과될 것이다. 이러한 한계는 홑배수일치 공여체와 함께 SCT 동안 심각한 GvHD를 유발할 수 있는 동종이계 세포의 수에 대하여 게재된 보고서에 근거하여 1×105 개 TCR+ 세포/㎏의 한계보다 낮다(Bertaina et al.,(2014) Blood, 124, 822-826). 이러한 특정 편집, 정제 및 엄격한 제제 방출 기준을 통해, CTX110 이후 GvHD의 위험은 낮아야 하지만 실제 발생률은 알려져 있지 않다. 대상체는 CTX110 주입 후 급성 GvHD의 징후에 대해 면밀히 모니터링되어야 한다. 잠재적인 증상의 시기는 알려져 있지 않다. 그러나, CAR T 세포 확장이 항원-유도이고 TCR-세포에서만 발생할 가능성이 있다는 점을 감안할 때, TCR+ 세포의 수가 주입된 수보다 현저하게 증가할 가능성은 낮다.
GvHD의 진단 및 등급화는 표 24에 개략된 바와 같이 게재된 기준(Harris et al., (2016) Biol Blood Marrow Transplant, 22, 4-10)에 기초해야 한다.
[표 24]
Figure pct00030
전체 GvHD 등급은 가장 중증의 표적 기관 침범에 기초하여 결정될 것이다.
● 0 등급: 1 기 내지 4 기의 임의의 기관 없음.
● 1 등급: 간, 상부 GI 또는 하부 GI 침범 없이 1 기 내지 2 기 피부.
● 2 등급: 3 기 발진 및/또는 1 기 간 및/또는 1 기 상부 GI 및/또는 1 기 하부 GI.
● 3 등급: 0 기 내지 3 기 피부 및/또는 0 기 내지 1 기 상부 GI와 함께, 2 기 내지 3 기 간 및/또는 2 기 내지 3 기 하부 GI.
● 4 등급: 0 기 내지 1 기 상부 GI와 함께 4 기 피부, 간, 또는 하부 GI 침범.
감염 및 약물 반응과 같이 GvHD를 모사할 수 있는 잠재적인 혼동 요인은 배제되어야 한다. 치료를 시작하기 전이나 직후에 확인을 위해 피부 및/또는 GI 생검이 얻어져야 한다. 간 침범의 경우, 임상적으로 가능하다면 간 생검이 시도되어야 한다. 모든 생검의 샘플(들)이 또한 병리학 평가를 위해 중앙 검사실로 보내질 것이다. 샘플 제조 및 전달에 대한 세부 사항은 검사실 설명서에 포함되어 있다.
급성 GvHD의 관리를 위한 권고사항은 표 25에 요약되어 있다. 시험의 종료 시 대상체간 비교 가능성을 허용하기 위해, 연구원은 대상체를 위험하게 할 수 있는 특정 임상 시나리오를 제외하고 이러한 권고사항을 따라야 한다.
[표 25]
Figure pct00031
GvHD가 더 중증인 대상체의 경우에 이차 요법을 시작하기 위한 결정이 더 빨리 내려져야 한다. 예를 들어, 이차 요법은 GvHD의 점진적 발현으로 3 일 후, 지속성 3 등급 GvHD로 1 주 후, 또는 지속성 2 등급 GvHD로 2 주 후에 지시될 수 있다. 이차 전신 요법은 고용량의 글루코코르티코이드 치료를 견딜 수 없는 대상체에서 더 이르게 지시될 수 있다(Martin et al., (2012) Biol Blood Marrow Transplant, 18, 1150-1163). 이차 요법의 선택 및 개시 시기는 치료하는 연구원의 임상적 판단 및 로컬 관행에 기초하여 결정될 것이다.
불응성 급성 GvHD 또는 만성 GvHD의 관리는 기관 지침에 따를 것이다. 항-감염 예방 조치는 면역억제제(스테로이드 포함)로 대상체를 치료할 때 로컬 지침에 따라 시행되어야 한다.
저혈압 및 신부전증
CAR T 세포 요법으로 저혈압 및 신부전증이 보고되었으며, 기관 진료 지침에 따라 정상 식염수 볼루스의 IV 투여로 치료되어야 한다. 적절한 경우 투석이 고려되어야 한다.
연구 적격성
포함 기준
본 연구에 참여할 자격이 있는 것으로 간주되려면, 대상체는 하기 나열된 포함 기준을 충족해야 한다(선택 사항으로 표시되지 않는 한).
1. 18 세 이상 및 체중 50 ㎏ 초과(선택 사항).
2. 프로토콜-요구 연구 절차를 이해하고 준수할 수 있으며, 서면 사전 동의 문서에 자발적으로 서명할 수 있음.
3. 하기 B 세포 악성종양 중 하나로 진단됨:
조직학적으로 확인된 B 세포 NHL: DLBCL NOS, MYC 및 BCL2 및/또는 BCL6 재배열이 있는 고등급 B 세포 림프종, 형질전환 FL, 또는 3b 등급 FL.
● 로컬 병리검사실로부터 종양 조직의 확인(마지막 재발/진행[등록 3 개월 이내]으로부터의 보관 조직 또는 스크리닝 동안 생검).
● 루가노 기준(루가노 기준 5 점 척도에서 점수 4 점 또는 5 점)에 의해 규정된 바와 같이, 플루오로데옥시글루코스 양전자 방출 단층촬영(PET)-양성인 적어도 1 개의 측정 가능 병변. 이전에 방사선 조사된 병변은 방사선 요법 완료 후 진행이 기록된 경우에만 측정 가능한 것으로 간주될 것이다.
4. 다음 코호트-특정 기준에 의해 입증하는 경우 불응성 또는 재발성 질환:
항-CD20 단클론성 항체 및 안트라사이클린-함유 요법을 포함하여 2 개 이상 차수의 선행 요법, 선행 자가 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)에 실패했거나 선행 자가 HSCT에 부적격 또는 거부. 자가 HSCT를 제공받은 대상체는 HSCT-관련 독성으로부터 회복되어야 한다.
● 불응성 질환의 경우, 대상체는 마지막 요법에서 진행성 질환을 갖거나, 요법의 적어도 2 회 사이클 후에 안정 질환을 가져야 하며, 안정 질환의 지속 기간은 최대 6 개월이다.
● 형질전환 FL이 있는 대상체의 경우, 대상체는 DLBCL로의 형질전환 후 질환에 대해 적어도 1 개 차수의 화학요법을 제공받은 적이 있어야 한다.
5. 동부 협력 종양 학회(ECOG) 수행 상태 0 또는 1;
6. LD 화학요법 및 CAR T 세포 주입을 받기 위한 기준을 충족한다.
7. 적절한 기관 기능:
● 신장: 추정 사구체 여과율 > 50 ㎖/min/1.73 m2.
● 간: 아스파르테이트 트랜스아미나제 또는 알라닌 트랜스아미나제 <3×정상 상한치(ULN); 총 빌리루빈 <1.5×ULN(길버트 증후군이 있는 대상체의 경우, 총 빌리루빈 <2 mg/dL).
● 심장: 혈역학적으로 안정하고 심전도에 의한 좌심실 박출율 ≥45%.
● 폐: 맥박 산소 측정기 당 실내 공기의 산소 포화도 >91%.
8. 가임기 여성 대상체(자궁 및 적어도 1 개의 난소가 온전한 무월경, 폐경후 1 년 미만임)는 등록부터 CTX110 주입 후 적어도 12 개월까지 허용되는 피임 방법(들)을 이용하는 데 동의해야 한다.
9. 남성 대상체는 등록부터 CTX110 주입 후 적어도 12 개월까지 효과적 피임법을 이용하는 데 동의해야 한다.
10. 본 연구의 완료 후 추가 장기 추적 연구에 참여하는 데 동의한다.
배제 기준
연구에 참여할 자격이 되려면, 대상체는 하기 나열된 임의의 배제 기준을 충족하지 않아야 한다.
1. 자가 HSCT에 대하여 적격이며, 이에 동의한다.
2. 후술되는 바와 같은 하기 요법을 이용한 치료:
● CAR T 세포를 포함하여 임의의 유전자 요법 또는 유전자 변형된 세포 요법을 이용한 선행 치료.
● 가장 최근의 CD19-관련 치료 후 진행 또는 재발 이후에 CD19 발현이 확인되지 않는 한(면역조직화학 또는 유세포 분석에 의해), CD19-관련 항체, 이중특이적 T 세포 결합체, 또는 항체-약물 접합체를 이용한 선행 치료.
3. 선행 동종이계 HSCT.
4. 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 또는 CTX110 제제의 임의의 부형제에 대해 금기사항 인지.
5. 스크리닝 동안 뇌 전이를 지시하는 뇌척수액(CSF) 또는 자기 공명 영상(MRI)으로부터의 검출 가능한 악성 세포, 또는 악성종양(CSF 또는 영상화)에 의한 중추 신경계(CNS) 침범의 병력.
6. 발작 장애, 뇌혈관 허혈/출혈, 치매, 소뇌 질환, 또는 CNS 침범이 있는 임의의 자가면역 질환의 병력.
7. 스크리닝 전 6 개월 이내의 불안정한 협심증, 임상적으로 유의한 부정맥, 또는 심근 경색.
8. 비조절성의 급성인 생명을 위협하는 세균, 바이러스, 또는 진균 감염.
9. 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1 형 또는 2 형, 활성 B 형 간염 바이러스(HBV) 또는 C 형 간염 바이러스(HCV) 감염의 존재에 대해 양성. 검출 불능 바이러스 부하가 기록된(정량적 중합효소 연쇄 반응[PCR] 또는 핵산 검사에 의해) HBV 또는 HBC 감염의 과거 병력이 있는 대상체는 허용된다. 사전 동의 양식에 서명한 지 30 일 이내에 수행된 감염성 질환 검사(HIV-1, HIV-2, HCV 항체 및 PCR, HBV 표면 항원, HBV 코어 항체)는 대상체 적격성에 대해 고려될 수 있다.
10. 기저 세포 또는 편평 세포 피부 암종을 제외한 이전 또는 동시 악성종양, 충분히 절제된 및 제자리 자궁 경부 암종, 또는 완전히 절제되고 5 년 이상 동안 관해된 이전 악성 종양.
11. 등록 14 일 이내의 방사선 요법.
12. 등록 14 일 이내 또는 5 반감기 중 더 긴 기간 내에 전신 항종양 요법 또는 연구용 제제 사용. 1) 등록 후 3 반감기 이내에 금지된 선행 억제/자극 면역 체크포인트 분자 요법, 및 2) 스크리닝 전 30 일 이내에 금지된 리툭시맙 사용은 예외이다.
13. 스테로이드 및/또는 기타 면역억제 요법을 필요로 하는 일차 면역결핍 장애 또는 활동성 자가면역 질환.
14. 연구에 참여하는 대상체의 능력을 방해할 수 있는 유의한 정신 장애 또는 기타 의학적 질병의 진단.
15. 임신 또는 수유 중인 여성.
통계적 방법
샘플 크기
연구의 용량 증대 파트에서 샘플 크기는 평가된 용량 수준 및 코호트의 수 및 DLT의 발생에 따라 대략 6 명 내지 54 명의 대상체가 될 것이다.
연구가 코호트 확대로 진행되면, 최적의 Simon 2-단계 설계가 이용될 것이다. 각 코호트에 대한 샘플 크기는 특정 적응증에 대한 효과 정도의 추정에 좌우될 것이다.
코호트 A의 확장을 위해, 첫 단계에 최대 30 명의 대상체가 등록될 것이다. 전체 분석 세트에서 처음 30 명의 대상체 중 10 명 이상이 객관적 반응을 달성하면, 연구는 두 번째 단계에 추가 47 명의 대상체(총 77 명)를 포함시키도록 등록을 확대할 것이다. 77 명의 대상체의 마지막 샘플 크기는 CTX110을 이용한 45%의 ORR과 26%의 ORR(재발성/불응성 DLBCL이 있는 환자에서 표준 구조 요법에 대해 추정된 ORR) 사이의 차이에 대한 검정에 90%의 검정력(α = 0.05, 2-측 검정)을 가질 것이다.
코호트 A에서와 같이, 연구의 용량 증대 파트의 완료 시, 코호트 B는 프로토콜 수정 후 코호트 확대를 진행할 수 있다.
지금까지, 이 연구에 참여한 모든 대상체는 14 일 이내에 단계 1(적격성 스크리닝)을 완료했다. 1 명의 대상체가 2 일 이내에 단계 1을 완료했다. 적격성 기준을 충족한 대상체는 단계 1을 완료한 지 24 시간 이내에 림프구제거 요법을 시작했다. 모든 적격 대상체는 스크리닝 기간(단계 1)을 완료하고, 15 일 이내에 LD 화학요법을 제공받았으며, 이때 1 명의 환자가 스크리닝을 완료하고 72 시간 이내에 LD 화학 요법을 시작하였다. 적격 대상체 중 일부는 DLBCL(예를 들어, NOS, 고등급)을 갖고; 그 밖의 대상체는 형질전환 FL 및 리히터 형질전환을 가졌다.
LD 화학요법을 제공받은 모든 대상체는 LD 화학요법 완료 후 2 일 내지 7 일 이내에 DL1 또는 DL2 용량의 CTX110을 제공받는 것으로 진행되었다. 지금까지 이들 환자로부터 얻어진 결과는 하기에 요약되어 있다.
DL1 용량과 DL2 용량 둘 모두의 대상체는 감소된 종양 대사 활성(PET 스캔에서 FDG 흡수) 및/또는 종양 크기 감소를 경험하였다. DL2에서 60 일 넘게 완전 및 지속 반응을 포함하는 용량 의존적 반응이 관찰되었다. 지금까지 치료를 받은 환자는 어떠한 DLT도 나타내지 않았다. 또한, 동종이계 CAR-T 세포 요법은 CAR-T 세포 확장 및 주입 후 지속성을 포함하여, 치료를 받은 인간 대상체에서 요망되는 약동학적 특징을 나타냈다. 용량 의존적 효과는 또한 CTX110 확장과 지속성 둘 모두에서 관찰되었다. DL2의 모든 대상체는 CTX110 확장 및 지속성을 나타냈다. 1 명의 대상체에서 말초 혈액 중 CTX110의 최대 90 배 확장이 관찰되었다. 또한, CTX110 세포의 지속성은 치료 후 적어도 8 일 내지 10 일에 DL2 대상체에서 검출될 수 있으며, 주입 후 최대 28 일까지 검출되었다.
서열 표
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*는 2′-O-메틸 포스포로티오에이트 변형이 있는 뉴클레오티드를 나타냄.
“n”은 5′ 말단에서 스페이서 서열을 지칭함.
기타 구현예
본 명세서에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 개시된 각 특징은 단지 포괄적 시리즈의 동등하거나 유사한 특징의 일례이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남 없이 본 발명의 본질적인 특성을 용이하게 확인할 수 있고, 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명의 다양한 변경 및 수정이 가능할 수 있다. 따라서, 다른 구현예도 청구범위 내에 있다.
균등물
본 발명의 여러 구현예가 본원에 기술되고 예시되었지만, 당업자는 기능을 수행하고/수행하거나 본원에 기술된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 이러한 각각의 변화 및/또는 수정은 본원에 기재된 본 발명의 구현예의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다. 보다 일반적으로, 당업자는 본원에 기재된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것을 의미하고, 실제 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성이 특정 적용 또는 본 발명의 교시(들)가 이용되는 적용에 좌우될 것임을 용이하게 인지할 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 구체적인 본 발명의 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 구현예는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구항 및 이에 대한 균등물의 범위 내에서 본 발명의 구현예는 구체적으로 기술되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시의 창의적 구현예는 본원에 기재된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법이 서로 일치하지 않는 경우, 둘 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 개시의 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전 정의, 참조로 포함된 문서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미보다 우선되는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구항에서 사용되는 단수형 부정 관사는 달리 상반되게 분명히 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용되는 문구 "및/또는"은 이와 같이 결합된 요소, 즉, 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에 별개로 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 다수의 요소들은 동일한 방식으로, 즉, 이와 같이 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, 일 구현예에서, A만(선택적으로 B 이외의 요소 포함); 또 다른 구현예에서, B만(선택적으로 A 이외의 요소 포함); 추가의 또 다른 구현예에서, A와 B 둘 모두(선택적으로 다른 요소 포함) 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용되는 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인, 즉, 다수의 요소들 또는 요소들의 목록, 및, 선택적으로 추가의 나열되지 않은 항목 중 또한 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 포함인 것으로 해석되어야 한다. "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같이 상반되게 분명히 지시되는 용어, 또는 청구항에서 사용되는 경우, "~로 이루어진"만이 다수 요소들 또는 요소들의 목록 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 "~ 중 어느 하나", "~ 중 하나", "~ 중 하나만", 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배제적인 용어가 선행하는 경우에 배제적인 대안(즉, "둘 모두가 아니라 하나 또는 다른 하나")을 지시하는 것으로만 해석되어야 한다. 청구항에 사용되는 "~로 본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 일반적인 의미를 갖는다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용되는, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 문구 "적어도 하나"는, 반드시 요소의 목록 내에 구체적으로 나열되고 요소의 목록의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 포함하는 것은 아니지만, 요소의 목록에서 요소 중 어느 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한 문구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소들의 목록 내에서, 구체적으로 확인된 요소들과 관련이 있든 아니든 간에, 구체적으로 확인된 요소들 이외의 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는, 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 구현예에서, B가 존재하지 않지 않으면서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 A(및 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 구현예에서, A가 존재하지 않지 않으면서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 B(및 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 추가의 또 다른 구현예에서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 A, 및 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 B(및 선택적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
또한, 달리 상반되게 분명히 지시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 행위가 언급되는 순서로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CRISPR THERAPEUTICS AG <120> ALLOGENEIC CELL THERAPY OF B CELL MALIGNANCIES USING GENETICALLY ENGINEERED T CELLS TARGETING CD19 <130> 105965-653962-004WO00 <150> 62/840,913 <151> 2019-04-30 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 aagagcaaca aatctgact 19 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 aagagcaaca gtgctgtgcc tggagcaaca aatctgacta agagcaacaa atctgact 58 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 aagagcaaca gtgctggagc aacaaatctg actaagagca acaaatctga ct 52 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 aagagcaaca gtgcctggag caacaaatct gactaagagc aacaaatctg act 53 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 aagagcaaca gtgctgacta agagcaacaa atctgact 38 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Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 56 <211> 4682 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 56 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct gcggccgcac gcgtgagatg taaggagctg ctgtgacttg ctcaaggcct 180 tatatcgagt aaacggtagt gctggggctt agacgcaggt gttctgattt atagttcaaa 240 acctctatca atgagagagc aatctcctgg taatgtgata gatttcccaa cttaatgcca 300 acataccata aacctcccat tctgctaatg cccagcctaa gttggggaga ccactccaga 360 ttccaagatg tacagtttgc tttgctgggc ctttttccca tgcctgcctt tactctgcca 420 gagttatatt gctggggttt tgaagaagat cctattaaat aaaagaataa gcagtattat 480 taagtagccc tgcatttcag gtttccttga gtggcaggcc aggcctggcc gtgaacgttc 540 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cctcactggg agaccgagta acaatctcct gcagggcaag tcaagacatt 2280 agcaaatacc tcaattggta ccagcagaag cccgacggaa cggtaaaact cctcatctat 2340 catacgtcaa ggttgcattc cggagtaccg tcacgatttt caggttctgg gagcggaact 2400 gactattcct tgactatttc aaacctcgag caggaggaca ttgcgacata tttttgtcaa 2460 caaggtaata ccctccctta cactttcgga ggaggaacca aactcgaaat taccgggtcc 2520 accagtggct ctgggaagcc tggcagtgga gaaggttcca ctaaaggcga ggtgaagctc 2580 caggagagcg gccccggtct cgttgccccc agtcaaagcc tctctgtaac gtgcacagtg 2640 agtggtgtat cattgcctga ttatggcgtc tcctggataa ggcagccccc gcgaaagggt 2700 cttgaatggc ttggggtaat atggggctca gagacaacgt attataactc cgctctcaaa 2760 agtcgcttga cgataataaa agataactcc aagagtcaag ttttccttaa aatgaacagt 2820 ttgcagactg acgataccgc tatatattat tgtgctaaac attattacta cggcggtagt 2880 tacgcgatgg attattgggg gcaggggact tctgtcacag tcagtagtgc tgctgccttt 2940 gtcccggtat ttctcccagc caaaccgacc acgactcccg ccccgcgccc tccgacaccc 3000 gctcccacca tcgcctctca acctcttagt cttcgccccg aggcatgccg acccgccgcc 3060 gggggtgctg ttcatacgag gggcttggac ttcgcttgtg atatttacat ttgggctccg 3120 ttggcgggta cgtgcggcgt ccttttgttg tcactcgtta ttactttgta ttgtaatcac 3180 aggaatcgct caaagcggag taggttgttg cattccgatt acatgaatat gactcctcgc 3240 cggcctgggc cgacaagaaa acattaccaa ccctatgccc ccccacgaga cttcgctgcg 3300 tacaggtccc gagtgaagtt ttcccgaagc gcagacgctc cggcatatca gcaaggacag 3360 aatcagctgt ataacgaact gaatttggga cgccgcgagg agtatgacgt gcttgataaa 3420 cgccggggga gagacccgga aatggggggt aaaccccgaa gaaagaatcc ccaagaagga 3480 ctctacaatg aactccagaa ggataagatg gcggaggcct actcagaaat aggtatgaag 3540 ggcgaacgac gacggggaaa aggtcacgat ggcctctacc aagggttgag tacggcaacc 3600 aaagatacgt acgatgcact gcatatgcag gccctgcctc ccagataata ataaaatcgc 3660 tatccatcga agatggatgt gtgttggttt tttgtgtgtg gagcaacaaa tctgactttg 3720 catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc cccagcccag 3780 gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc ttcaggaatg gccaggttct 3840 gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat tggtggtctc ggccttatcc 3900 attgccacca 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Claims (42)

  1. 인간 환자에서 B-세포 악성종양을 치료하기 위한 방법으로서,
    (i) B-세포 악성종양을 갖는 인간 환자가 림프구제거 치료를 받는 단계; 및
    (ii) 단계 (i) 후에 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단을 인간 환자에게 투여하는 단계로서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은
    (a) 파괴된 T 세포 수용체 알파 불변(T cell receptor alpha constant; TRAC) 유전자,
    (b) CD19에 결합하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)를 코딩하는 핵산으로서, CAR은 서열번호 51에 기재된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 52에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD19 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고, 핵산은 파괴된 TRAC 유전자에 삽입되는, 핵산, 및
    (c) 파괴된 베타 2-마이크로글로불린(β2M) 유전자
    를 포함하는 T 세포를 포함하는, 단계를 포함하고,
    유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약 1×107 개 내지 약 1×109 개 CAR+ T 세포의 용량으로 인간 환자에게 투여되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편의 결실을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 용량 당 인간 환자에게 투여되는 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 최대 7×104 개 TCR+ T 세포/㎏을 함유하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)에서 림프구제거 치료는 3 일 동안 매일 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 500 ㎎/㎡ 내지 750 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드를 인간 환자에게 공동투여하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계 (i)에서 림프구제거 치료는 3 일 동안 매일 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 500 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드, 또는 3 일 동안 매일 약 30 ㎎/㎡의 플루다라빈 및 약 750 ㎎/㎡의 사이클로포스파미드를 인간 환자에게 공동투여하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약 1×107 개, 약 3×107 개, 약 1×108 개, 약 3×108 개, 또는 약 1×109 개 CAR+ T 세포의 용량으로 인간 환자에게 투여되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 전에, 인간 환자는 하기 특징 중 하나 이상을 나타내지 않는, 방법:
    (a) 임상 상태의 유의한 악화,
    (b) 91% 초과의 포화 수준 유지를 위한 보충용 산소에 대한 요구,
    (c) 비조절성 심장 부정맥.
    (d) 혈관수축제 보조가 필요한 저혈압,
    (e) 활동성 감염, 및
    (f) 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)는 단계 (ii)의 약 2 일 내지 7 일 전에 수행되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 후 및 단계 (ii) 전에, 인간 환자는 하기 특징 중 하나 이상을 나타내지 않는, 방법:
    (a) 활동성의 비조절성 감염;
    (b) 단계 (i) 전의 임상 상태와 비교하여 임상 상태의 악화; 및
    (c) 2 등급 이상의 급성 신경학적 독성.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, (iii) 단계 (ii) 후에 급성 독성의 발생에 대해 인간 환자를 모니터링하는 단계; 및 (iv) 급성 독성을, 발생 시, 관리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 (iii)는 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단을 투여 후 적어도 28 일 동안 수행되는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 급성 독성은 종양 용해 증후군(tumor lysis syndrome; TLS), 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome; CRS), 면역 이펙터 세포-관련 세포독성 증후군(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome; ICANS), B 세포 무형성증(B cell aplasia), 혈구탐식성 림프조직구증(hemophagocytic lymphohistiocytosis; HLH), 혈구감소증(cytopenia), 이식편 대 숙주병(graft-versus-host disease; GvHD), 고혈압, 신부전증, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포 악성종양은, 선택적으로 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma; DLBCL), MYC 및 BCL2 및/또는 BCL6 재배열이 있는 고등급 B 세포 림프종, 형질전환 여포성 림프종(transformed follicular lymphoma; FL), 및 3b 등급 FL로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-호지킨 림프종인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, DLBCL은 상세불명(NOS)의 DLBCL인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자는 플루오로데옥시글루코스 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography; PET)-양성인 적어도 하나의 측정 가능한 병변을 갖는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포 악성종양은 불응성 및/또는 재발성인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자는 하나 이상의 차수의 선행 항암 요법을 받은 적이 있는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 인간 환자는 둘 이상의 차수의 선행 항암 요법을 받은 적이 있는, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 선행 항암 요법은 항-CD20 항체, 안트라사이클린-함유 요법, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 인간 환자는 불응성 또는 재발성 형질전환 FL을 갖고, DLBCL로의 형질전환 후 질환에 대한 적어도 하나 차수의 화학요법을 받은 적이 있는, 방법.
  21. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포 악성종양은 불응성이고, 인간 환자는 마지막 요법에서 진행성 질환을 갖거나, 요법의 적어도 2 회 사이클 후에 안정 질환을 가지며, 안정 질환의 지속 기간은 최대 6 개월인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자는 선행 자가 조혈 줄기 세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation; HSCT)에 실패했거나 선행 자가 HSCT에 부적격인, 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자는 유전공학적으로 조작된 T 세포 집단을 이용한 치료 후 추가적인 항암 요법을 받는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 방법:
    (m) 동부 협력 종양 학회(Eastern Cooperative Oncology Group; ECOG) 수행 상태 0 또는 1을 가짐;
    (n) 적절한 신장, 간, 심장 및/또는 폐 기능;
    (o) 선행 유전자 요법 또는 변형된 세포 요법 없음;
    (p) 항-CD19 항체를 포함하는 선행 치료 없음;
    (q) 선행 동종이계 HSCT 없음;
    (r) 뇌척수액으로부터 검출 가능한 악성 세포 없음;
    (s) 뇌 전이 없음;
    (t) 선행 중추 신경계 장애 없음;
    (u) 불안정 협심증, 부정맥 및/또는 심근경색 없음;
    (v) 비조절성 감염 없음;
    (w) 면역억제 요법이 필요한 면역결핍 장애 또는 자가면역 장애 없음; 및
    (x) 인간 면역결핍 바이러스, B 형 간염 바이러스, 또는 C 형 간염 바이러스에 의한 감염 없음.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD19 scFv는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, CD19에 결합하는 CAR은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD19 CAR을 인코딩하는 핵산은 파괴된 TRAC 유전자에서 결실 부위에 삽입되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 파괴된 β2M 유전자는 서열번호 9 내지 서열번호 14에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 동종이계인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 90%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 70%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나; 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 B2M 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나; 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 30%는 검출 가능한 수준의 CAR을 발현하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 99.5%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 70%는 검출 가능한 수준의 B2M 표면 단백질을 발현하지 않는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 85%는 검출 가능한 수준의 B2M 표면 단백질을 발현하지 않는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 CAR을 발현하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단에서 T 세포의 적어도 70%는 검출 가능한 수준의 CAR을 발현하는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 정맥내 주입을 통해 인간 환자에게 투여되는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 동결보존 용액에 현탁되는, 방법.
  40. B-세포 악성종양을 치료하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물은
    (a) 선택적으로 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단편의 결실을 포함하는 파괴된 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자,
    (b) CD19에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산으로서, CAR은 서열번호 51에 기재된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 52에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD19 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고, 핵산은 파괴된 TRAC 유전자에 삽입되는, 핵산, 및
    (c) 파괴된 베타 2-마이크로글로불린(β2M) 유전자
    를 포함하는 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단을 포함하고,
    조성물은 약 1×107 개 내지 약 1×109 개 CAR+ T 세포를 포함하는, 약학적 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 유전공학적으로 조작된 T 세포의 집단은 제1항, 제2항, 제25항 내지 제37항, 및 제39항 중 어느 한 항에 기재된, 약학적 조성물.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 제1항 내지 제24항 및 제38항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한, 약학적 조성물.
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